1

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Secretaría de Investigación y posgrado

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

Programa de Doctorado en Ciencias Químico-Biológicas

Determinación de la cigocidad del gen RHD T e s i s

Que como parte de los requisitos para obtener el Grado

de Doctor en Ciencias Quimicobiológicas

Presenta

Fany Rosenfeld Mann

Directores de tesis

Dr. Luis A. Jiménez Zamudio

Dra. Elba Reyes Maldonado

México, D.F. Enero 2009

2

EL PRESENTE TRABAJO FUE REALIZADO EN EL SERVICIO DE

HEMATOLOGÍA PERINATAL DEL INSTITUTO NACIONAL DE

PERINATOLOGIA DE LA SECRETARIA DE SALUD, BAJO LA

DIRECCIÓN DE LOS DOCTORES LUIS A. J IMENEZ ZAMUDIO Y

ELBA REYES MALDONADO.

DERIVA DEL PROTOCOLO DE INVESTIGACIÓN CON

REGISTRO 212250-07241 DEL PROPIO INSTITUTO, SIENDO EL

INVESTIGADOR RESPONSABLE EL DR. HÉCTOR A. BAPTISTA

GONZÁLEZ.

3

Mi agradecimiento y consideración para:

Dr. Héctor A. Baptista González y QBP. Rocío Trueba Gómez

Por el gran aprendizaje y las emocionantes discusiones que hemos tenido

a lo largo del tema del Rh

Dra. Elba Reyes Maldonado

Dr. Luis A. Jiménez Zamudio

Dra. Ethel García Latorre

Dra. Margarita Sotelo Ort iz

Dr. Aarón Domínguez López

Dr. Fausto Sánchez

Biol. Georgina Coeto Barona

M en C. Carmen Acuña González

Dr. Arturo Barrón González

M en C Maribel Acosta

QFB. Jazmin I. Cruz Reyes

QFB. Carmen Santamaría Hernández

M en C Higinio Estrada Juárez

M en C Luisa Bermejo Martínez

Lic. Psic. Isaac Cohen Shiver

Al Inst ituto Nacional de Perinatología de la Secretaría de Salud.

Al Servicio de Medicina Transfusional y Banco de Sangre de la Fundación

Medica Sur.

A la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del IPN .

i

ÍNDICE

Índice i

Abreviaturas ii

Índice de figuras iii

Índice de tablas iv

Resumen v

Abstract vii

I. Introducción 1

Antecedentes 4

Planteamiento del problema 25

Justificación 26

Hipótesis 26

Objetivo 26

II. Material y métodos 27

Análisis estadístico 35

III. Resultados 36

IV. Discusión 41

V. Conclusiones 44

VI. Bibliografía 45

ii

INDICE DE ABREVIATURAS

3’-UTR 3’- Región 3`no traducida del inglés 3´untranslated región 5’-UTR 5’-Región 5´no traducida del inglés 5´untranslated región Br-Er Bromuro de etidio Del Deleción Dia /Dib Antígenos Diegoa /b de la proteína Diego EHRN Enfermedad hemolítica del Recién Nacido Fc(γR1) Receptor 1γ de la fracción cristalizable de la los anticuerpos FRET Transferencia de energía de resonancia fluorescente Fya/Fyb Antígenos Duffy a/b de la proteína Duffy GPI Glicosilfosfatidilinositol ISBT Sociedad internacional de transfusión sanguínea del inglés

Internacional Society of Blood Transfusion IV Intravenosa K/k Antígenos Kell/cellano de la proteína Kell Kb Kilobase KDa Kilodaltons Kpa/Kpb Antígenos Penny/Rautenberg de la proteína Kell pb Pares de bases PCR-RFLP Reacción en cadena de la polimerasa con patrón de la longitud de

enzimas de restricción PCR-SSP PCR alelo específica RhAG Proteína RhAG RHAG, RHBG, RHCG Genes de las glicoproteínas asociadas al Rh, RhAG, RhBG y RhCG RHCE Gen RHCE RhCE Antígenos o proteínas C,c,E y e RHD Gen RHD RhD Antígeno o proteína D RHDψ Pseudogen Phi del RHD SMP1 Proteína pequeña de membrana 1, del inglés small membrane

proteína 1 SNP Polimorfismos de un solo nucleótido, del inglés Single nucleotide

polymorphism TAE Amortiguador Tris acetato y etilen diamino tetracetato TBE Amortiguador Tris, borato y etilen diamino tetracetato THE-1B Elemento humano tipo transposón

iii

INDICE DE FIGURAS

Figura 1. Reacción de aglutinación en tubo. 3

Figura 2. Orientación opuesta de los genes RhD y RHCE, enfrentados en su posición 3`

9

Figura 3. Evolución de los genes RH 10

Figura 4. Mecanismo de pérdida total del gen RHD 11

Figura 5. Organización cromosómica de las cajas Rhesus 12

Figura 6. Mecanismo del pseudogen RHDψ.

13

Figura 7. Mecanismo de conversión de los genes RH en cis. 14

Figura 8. Estructuras moleculares en europeos con haplotipo D negativo y Del

14

Figura 9. Complejo molecular Rh 16

Figura 10 Estructura molecular de las proteínas RHD y RHCE 16

Figura 11 Cambios en aminoácidos en la proteína Rh condicionan la presencia de RhD débil, D parcial y Del

17

Figura 12 Representación de los genes homocigotos RHD negativo y positivo

19

Figura 13 Representación de los genes homocigoto RHD negativo y

heterocigoto RHD positivo.

20

Figura 14 Representación de los genes RHD negativo en ambos

padres.

20

Figura 15 Guía para el estudio de la embarazada RhD negativo 21

Figura 16 Valoración de la calidad del DNA genómico

29

Figura 17 Observación de la fluorescencia en un sistema computarizado y diagrama de operación del termociclador

31

Figura 18 Picos de fusión de la región 3´UTR Exón 10 RHD.

39

Figura 19 Picos de fusión de la región intron3-exon4 RHD.

40

Figura 20 Curvas de amplificación del exón 7 RHD.

40

iv

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1 Frecuencia de RhD negativo en diferentes poblaciones 3

Tabla 2 Nomenclatura numérica de la Sociedad Internacional de la Transfusión Sanguínea (ISBT)

6

Tabla 3 Polimorfismos en la secuencia codificante de los genes RHD y RHCE

8

Tabla 4 Nomenclaturas del sistema Rh utilizadas en la literatura 18

Tabla 5 Prevalencia de mujeres Rh negativo e isoinmunización al RhD

22

Tabla 6 Fenotipos RhD positivo con la cigocidad más probable en individuos blancos y negros

23

Tabla 7 Frecuencia de fenotipos Rh

24

Tabla 8 Secuencias de los iniciadores y sondas utilizadas para la amplificación de las regiones del gen RHD y cajas RH

28

Tabla 9 Condiciones de amplificación de las reacciones 33

Tabla 10 Distribución de la población estudiada por grupo Rh 34

Tabla 11 Distribución de la población estudiada por grupos ABO y Rh

36

Tabla 12 Fenotipos Rh de los sujetos de estudio 36

Tabla 13 Fenotipos Rh de los sujetos de estudio 37

v

RESUMEN

El estudio de la cigocidad RHD en las parejas de mujeres RhD negativo tiene importancia clínica para consejo genético pregestacional y gestacional en familias con historia de Enfermedad hemolítica del recién nacido. El objetivo fue identificar la condición de cigocidad del gen RHD en sujetos RhD positivo, por PCR-RFLP tradicional, y PCR en tiempo real en familias residentes en el Valle de México, así como determinar la concordancia de la cigocidad del gen RHD entre el fenotipo del sistema Rh y las pruebas moleculares Material y Métodos. Estudio de casos y controles, transversal y descriptivo. Los casos se integraron por familias donde la madre es RhD negativo y su pareja RhD positivo y al menos un hijo biológico evaluado. Los controles fueron familias con ambos padres RhD positivo y al menos un hijo estudiado. Se determinó al fenotipo del Rh (D,C,c,E,e) y las secuencias específicas del gen RHD (3´ UTR exón 10, exón 7, intron4-exón 4/RHDψ por PCR en tiempo real y cajas RH por PCR-RFLP). Resultados. Se evaluaron 228 individuos, 122 padres y 106 hijos pertenecientes a 61 familias (61 madres y 61 padres). Se constituyeron 28 familias de casos con 44 hijos y 33 familias de controles con 62 hijos. Los fenotipos RhD positivo más frecuentes de la población estudiada fueron CcDee (33.2%), CCDee (24.1%) y CcDEe (23.0%). La concordancia de la cigocidad paterna (61 sujetos) comparando la obtenida por la frecuencia génica de Heiken y el estudio de las cajas Rhesus fue de 0.88 en homocigotos (DD) y de 1.0 en hemicigotos (Dd) con un valor de Phi 0.875. La concordancia entre la cigocidad paterna con base al estudio familiar y de las cajas Rhesus fue de 1.0 con un valor de Phi 1.0. La condición de cigocidad en las parejas tanto de mujeres RhD negativo (casos) y positivo (controles) tuvo una distribución igual, de 0.611 y 0.612 respectivamente. Padres homocigotos del 55.7% y hemicigotos del 44.3%. La condición de cigocidad de los hijos fue estadísticamente significativa entre los grupos de estudio (P<0.05). Una limitante del estudio es que no identifica los otros mecanismos moleculares de la condición RhD negativo, solo el mecanismo de deleción génica, el principal en individuos de origen caucásico, el estudio del pseudogen RHDΨ que no identificó ningún caso en los sujetos de estudio y la amplificación de regiones del gen RHD, que se presentó en todos los 187 casos de RhD positivos y en 5 de los 41 sujetos RhD negativo, lo cual permitió disminuir los falsos positivos en condición homocigota, cuyo mecanismo molecular es por la ausencia de caja híbrida. Conclusiones. Se obtuvo concordancia de 1.0 entre el estudio familiar y el de las cajas Rhesus tanto en homo como hemicigotos. La concordancia entre el estudio basado en la frecuencia génica y el de las cajas Rhesus fue también de 1.0 en hemicigotos y disminuyo a 0.88 en homocigotos.

vi

ABSTRACT

The study of couples in RHD cigocidad of RhD negative women is important for clinical genetic counseling pregestational and gestational in families with a history of hemolytic disease of the newborn. The objective was to identify the status of the gene RHD cigocidad subjects RhD positive, traditional PCR-RFLP and real-time PCR in families residing in the Valley of Mexico, as well as determining the consistency of the RHD gene cigocidad between phenotype Rh system and molecular tests. Material and Methods. Case-control study, transverse and descriptive. The cases were composed of families where the mother is RhD negative and RhD positive and your partner at least one biological child evaluated. Controls were families with both parents RhD positive and at least one child studied. We determined the phenotype of Rh (D, C, c, e, e) and specific sequences of the gene RHD (3 'UTR exon 10, exon 7, exon intron4-4/RHDψ by real-time PCR and PCR boxes RH -RFLP). Results. We evaluated 228 individuals, 122 parents and 106 children belonging to 61 families (61 mothers and 61 fathers). Families were 28 cases with 44 children and 33 families with 62 children of controls. The most frequent positive RhD phenotypes of the population studied were CcDee (33.2%), CCDee (24.1%) and CcDEe (23.0%). The paternal line of cigocidad (61 subjects) obtained by comparing the frequency of gene Heiken and studying Rhesus boxes was 0.88 homozygote (DD) and 1.0 in hemicigotos (DD) with a value of Phi 0875. The correlation between paternal cigocidad based study of family and Rhesus boxes was 1.0 with a value of 1.0 Phi. The status of the couples in cigocidad both RhD negative women (cases) and positive (control) had an equal distribution of 0.611 and 0.612 respectively. Homozygote parents of 55.7% and 44.3% of hemicigotos. Cigocidad status of the children was statistically significant between the study groups (P<0.05). One limitation is that the study does not identify the molecular mechanisms of the condition RhD negative, only the mechanism of gene deletion, the principal individuals of Caucasian origin, the study of pseudogen RHDΨ not identified any cases in the study subjects and amplification of the RHD gene, which was presented in all 187 cases of RhD positive and 5 of the 41 subjects RhD negative, allowing reduce false positives in homozygous condition, whose molecular mechanism is the lack of hybrid box. Conclusions. Correlation was obtained between 1.0 and family study of the boxes in Rhesus as homo hemicigotos. The correlation between the study based on the frequency of the gene and Rhesus boxes was also 1.0 hemicigotos and fell to 0.88 homozygote.

1

I. INTRODUCCION

Grupos sanguíneos

Los antígenos de los grupos sanguíneos son estructuras químicas (carbohidratos

unidos a lípidos o lipoproteínas y proteínas) polimórficas hereditarias, expuestas en la

superficie de la membrana eritrocitaria, así como en otros tejidos y líquidos del

organismo. Se han identificado alrededor de 300 determinantes antigénicos de grupos

sanguíneos, la gran mayoría pertenecen a alguno de los 29 sistemas reconocidos y los

restantes (aproximadamente 40 antígenos), forman parte de las series y las

colecciones. (Reid, 2004)

Un sistema de grupo sanguíneo consiste en uno o más antígenos que comparten

características en común como su estructura química, la localización en la membrana,

controlados por un gen o genes estrechamente relacionados con escasa o nula

recombinación entre ellos, los cuales han sido clonados y secuenciados y con herencia

independiente (por ejemplos ABO, Rh, Duffy, MNS) . Las colecciones contienen a los

antígenos que tienen alguna relación bioquímica, serológica o genética pero sin cumplir

cabalmente las condiciones de un sistema, entre ellos el antígeno i, Lewis c, Lewis d.

Las series corresponden a antígenos que no reúnen los requisitos anteriores, se

clasifican en series de baja incidencia con <1% (serie 700) por ejempo los grupos Batty,

Christiansen y Biles y de alta incidencia con >99% (serie 900), Langereis, August y

Antón comprendidos en este grupo. (Daniels 2004)

Los antígenos eritrocitarios y los anticuerpos antieritrocitarios tienen importancia clínica

porque causan reacciones transfusionales, enfermedad hemolítica aloinmune del recién

nacido (EHRN), anemias hemolíticas autoinmunes, defectos de membrana y se han

asociado con diversas enfermedades. (Mohandas, 2005)

En términos generales, se han identificado los diversos eventos moleculares que dan

lugar a la expresión de los diferentes antígenos eritrocitarios, como son: (Reid 2003).

Conversión o recombinación de genes: MNS, Rh, Chido/Rodgers.

2

Duplicación de un exón: Gerbich.

Deleción de un gen, exón o nucleótido: ABO, MNS, Rh, Kell, Duffy, Dombrock,

Gerbich.

Inserción de uno o más nucleótidos: Rh, Colton.

Substitución de un nucleótido (SNP): La mayoría de los grupos sanguíneos:

RhC/c, RhE/e, Kell/cellano (K/k), Penny/Rautenberg (Kpa/Kpb), Duffya/Duffyb

(Fya/Fyb), Diegoa/Diegob (Dia/Dib)

El primer sistema sanguíneo descrito por Landstainer en 1901, fue el ABO, como

resultado de la mezcla de eritrocitos y sueros de diferentes sujetos sanos, los grupos

sanguíneos restantes se han identificado a partir de entidades clínicas como la EHRN,

las reacciones hemolíticas a la transfusión, así como mediante la inmunización de

animales de experimentación con eritrocitos humanos, el uso de anticuerpos

monoclonales y por las técnicas de biología molecular, que han permitido la

identificación de los polimorfismos, la caracterización de su expresión en tejidos

específicos y la relación entre la estructura y la función. (Denomme, 2004)

Los antígenos de los sistemas Rh y ABO, son de importancia central en el campo de la

inmunohematología clínica. Su identificación es obligada en toda actividad relacionada

con el empleo terapéutico de sangre y sus componentes (NOM .

Los seres humanos se pueden clasificar serológicamente como Rh positivo o Rh

negativo, por medio de la presencia o ausencia de la reacción de aglutinación que se

observa cuando una solución de eritrocitos se enfrenta con anticuerpos anti-D

policlonales, monoclonales o mezcla de ellos (Figura. 1) (Mollison, 1993)

La identificación del antígeno D puede algunas veces ser problemático, porque: 1) El

antígeno D se define por múltiples epítopes conformacionales, algunos cambios en el

gen RHD pueden ocasionar cambios en la secuencia de aminoácidos de la proteína D

que alteren el nivel de expresión o la estructura y epítopes de dicha proteína. 2)

Numerosos métodos (placa, en tubo, fase sólida, columnas en gel) y reactivos (mezcla

de monoclonales, solo IgG, o IgM, policlonales), tratamiento de eritrocitos con enzimas)

3

se han empleado comúnmente con diferentes sensibilidad para la detección de

variantes D. (Westhoff, 2007b)

Figura 1. Reacción de aglutinación en tubo. Derecha. Reacción de aglutinación positiva y negativa respectivamente, por el método tradicional de aglutinación en tubo, nótese el fondo claro y el botón celular íntegro en la reacción positiva y el fondo turbio rojo sin aglutinación en la reacción negativa. Izquierda. Reacción en la técnica moderna en gel, en la reacción positiva se aprecia una banda en la parte superior de la columna y la negativa en el fondo de la columna.

La prevalencia de los individuos RhD negativo varía según el origen étnico y la mezcla

de poblaciones por efecto de la migración, siendo desde casi nula en población

indígena mesoamericana, hasta 25% en el grupo vasco (tabla 1). (Mollison 1993, AABB 2005).

Tabla 1 Frecuencia de RhD negativo en diferentes poblaciones.

Población Frecuencia (%)

Vascos 25

Caucásicos 15

Negros-africanos 8

Asiáticos <1

Mestizo-venezolanos 7

Mestizo-argentinos 10

Indígenas

mesoamericanos

<1

Mestizo-mexicanos

Valle de México

3

INPer 4.9

4

I.1. ANTECEDENTES

Historia y presente del Sistema Rh y Enfermedad Hemolítica del Recién Nacido

Esta se puede dividir cronológicamente en 4 etapas:

a) Diagnóstico

La primera observación fue realizada en 1609 por una partera francesa Louyse Bour

Geois, quien describió lo que les afligía a unos gemelos, esto actualmente corresponde

a uno con hidrops fetalis y al otro con kernÍcterus; luego en 1932, Diamond, Blackfan y

Baty denominan “Eritroblastosis fetal” al cuadro de eritroblastosis, anemia e ictericia en

recién nacidos pero sin conocer la causa. En 1938 Darrow, propone un mecanismo

inmune como responsable de la hemólisis de los eritrocitos fetales y neonatales. Un año

después Levine y Stetson, demostraron el mecanismo fisiopatológico de la EHRN en

un bebe muerto con hidrops cuya madre presentó una reacción hemolítica después de

haber recibido la sangre de su esposo, proponiendo que tanto la muerte fetal como la

reacción hemolítica, eran consecuencia de la sensibilización materna producida por un

antígeno en los eritrocitos fetales heredado del padre, y ausentes en la madre, el suero

materno aglutinó el 80% de los hematíes probados. En 1940 Landstainer y Wiener,

producen anticuerpos en conejos y cobayos contra eritrocitos del mono Rhesus los que

aglutinaron al 85% de los hematíes de los individuos en Nueva York, al que

denominaron Factor Rh.

Se identificaron los otros 4 antígenos del Rh (C, c, E y e) y se propusieron los

mecanismo hereditarios de este sistema. En 1943 Fisher propuso la existencia de tres

genes y Wiener, Race y Sanger en 1951, la de un solo gen con diversos alelos (Race y

Sanger 1975).

En 1957 Kleihauer y Betke, demostraron la presencia de eritrocitos fetales en la

circulación materna.

5

b) Tratamiento

En 1946, Wallerstein realizó la primera exanguineotransfusión con sangre Rh negativo,

como tratamiento postnatal de la EHRN. En 1956 Bevis, introdujo el estudio

espectrofotométrico de las bilirrubinas en líquido amniótico para valorar la severidad de

la enfermedad hemolítica y, en 1962 Liley, efectuó la primera transfusión intrauterina

como medida de tratamiento prenatal. (Linares, 1986)

c) Prevención

En los años sesentas Finn y Clarke en Liverpool, Gorman, Freda y Pollack en Nueva

York y Bowman en Winnipeg, Canadá, investigaron la aplicación de la gammaglobulina

Anti-D para evitar la isoinmunización al RhD, la fase experimental se realizó con

voluntarios masculinos RhD negativo (prisión de Sing Sing) a los que se les

administraron vía IV 5 mL de sangre RhD positivo, y después se les aplicó suero

hiperinmune Anti-Rh humano. Posteriormente se administró a mujeres RhD negativo

que habían tenido hijos incompatibles RhD positivo, evitando así la enfermedad fetal y

neonatal en embarazos posteriores. (Frigoletto 1982)

d) Diagnóstico molecular

A través de estudios de Southernblot y PCR Colin et al en 1991, demostraron la

existencia de dos genes que participan en la expresión de los antígenos Rh.

En la actualidad varios grupos de investigadores en el mundo, entre los que se

encuentran Wagner y Flegel, en Alemania, han contribuido a aclarar las bases

moleculares de los polimorfismos identificados en diversas variantes alélicas de los

genes Rh, que incluyen al síndrome Rh null, así como la posibilidad de detectar el Rh

fetal en circulación materna, la determinación de la cigocidad de diferentes antígenos

Rh, incluyendo por supuesto, el RHD (Daniels 2004) hasta finalmente poder realizar el

diagnóstico preimplantación. (Seeho, 2005)

En los últimos 10 años, el avance en el estudio molecular de los grupos sanguíneos y

en particular del Rh, avanzó vertiginosamente, permitiendo incorporarlos como

6

herramienta para el estudio clínico. Este conocimiento se ha aplicado en el estudio de

los antígenos débilmente expresados, de la cigocidad al RhD, el rastreo de donadores

antígeno negativo, la solución de las discrepancias ABO y Rh así como en el

quimerismo postransplante. También ha permitido aplicarse en los terrenos de la

identificación, pruebas de paternidad, migración de poblaciones, medicina forense o

estudios antropológicos (Reid 2003).

El sistema sanguíneo Rh (ISBT 004) es el más complejo y polimórfico, a la fecha se han

identificado al menos 49 antígenos, algunos de ellos de muy alta frecuencia hasta otros

con presencia en muy pocos individuos. (Daniels, 2004). Esta variabilidad antigénica no está

representada por la diversidad serológica (Tabla 2)

Tabla 2. Nomenclatura numérica de la Sociedad Internacional de la Transfusión Sanguínea (ISBT) de los

antígenos del sistema Rh, las casillas vacías corresponden a antígenos obsoletos.

Genes RH

Son dos los genes RH estrechamente ligados: el RHD y el RHCE, localizados en el

cromosoma 1, en el brazo corto en la región 34 y la banda 11 (1p34.11).(Logdberg 2005)

Constan de 10 exones y comparten una organización exón/intrón similar, cada uno con

una extensión aproximada de 60 kpb (RHD, 57295 pb y RHCE 57831 pb) y en

orientación opuesta (figura 2), enfrentados en su posición 3’. Tienen muy alta homología

(96%) (Okuda 2000), están separados por el gen SMP1 (small membrane proteína 1) de 7

exónes con 30,000 pb, sin relación funcional. Se han reportado más de 170 formas

7

alélicas de ambos genes. El gen RHD está flanqueado en ambos extremos por unas

secuencias también de alta homología (98.6%), llamadas cajas Rhesus, rió arriba

(ascendente) y rió debajo (descendente) de aproximadamente 9000 pb, con la misma

orientación. Cada una de las cajas Rhesus tiene una región idéntica de 1463 pb, que es

la región de ruptura a través de entrecruzamiento desigual en la deleción del gen RHD,

que forma una secuencia híbrida llamada caja Rhesus híbrida, principal mecanismo de

la población caucásica RhD negativo (Wagne y Flegel 2000).

Todos lo exones son menores a 200 bp, con excepción de los exones terminales 3’ del

RHD y SMP1 (Wagner y Flegel 2000, Flegel 2007).Cada uno de los genes produce un transcrito de

1251 pb que codifica para las proteínas RhD y RhCE de 417 residuos de aminoácidos

cada una y un peso molecular de 30Kd. (Cherif-Zahar 1994)

Homología de RHD y RHCE (Mouro 1993, Simsek 1994, Storry 2004)

El exón 1 de RHD es idéntico al exón 1 de RHCE alelo c.

El exón 2 del RHD es igual al exón 2 del RHCE alelo C.

El alelo C tiene una inserción de 109 pb en el intrón 2 no presente en el alelo c ni en D.

Los exones 1 y 2 del RHCE codifican la expresión C/c. 6 polimorfismos, 2 silentes y 4

con cambio de sentido: E1: C48G (Cys16Trp), E2: A178C (Ile60Leu), E2: G203A

(Ser68Asp), E2: T307C (Ser103Pro).

El exón 5 codifica la expresión E/e.: E5: C676G (Pro226Ala)El intrón 4 del RHCE es 600

pb más grande que el del RHD:

Los exones 4, 5 y 6 del RHD son críticos para los epítopes: D1, D2, D5, D6-7 y D8

(Wagner y Flegel 2000).

Existen de uno a varios polimorfismos de un solo nucléotido en los 10 exónes de ambos

genes. En la Tabla 3 se muestran los polimorfismos comunes entre los genes RHD y

RHCE, se observan mayores diferencias en los exónes 7 y 10 entre ambos genes

(Dibman 2003). Se han encontrado variantes para ambos genes, dos para RHD y cuatro

para RHCE (www. ExPasy.ch/).

8

Tabla 3. Polimorfismos en la secuencia codificante de los genes RHD y RHCE, se acotan las principales diferencias de nucleótidos en los 10 exónes de ambos genes.

EXÓN 4 5 6

Nucleótido 487-635 636-801 802-939

Cantidad de pb 166 138

Substitución 594 602 667 676 697 712 733 744 787 800 916 932

RHD A C T G G G G C G A G A

RHC T G G C A C T A T A G

RHc T G G C A C T A T A G

RHE T G G C C A C T A T A G

RHe T G G G C A C T A T A G

EXON 7

Nucleótido 940-

1073

pb 134

Substitució

n

941 96

8

97

4

97

9

98

5

98

6

98

9

99

2

102

5

104

8

105

3

105

7

105

9

106

0

106

1

RHD G C G A G G A A T G C G A G C

RHC T A T G C A C T C C T T G A A

RHc T A T G C A C T C C T T G A A

RHE T A T G C A C T C C T T G A A

RHe T A T G C A C T C C T T G A A

EXÓN 1 2 3 4

Nucleótido 1-

148

149 -

335

336-

486

487-

635

pb 148 187 151 149

Substitución 48 150 178 201 203 307 361 380 383 455 505 509 514 544 577

RHD G T A G G T T T A A A T A T G

RHC C T A G G T A C G C C G T A A

RHc G C C A A C A C G C C G T A A

RHE C A A C G C C G T A A

RHe C A A C G C C G T A A

9

Existen tres genes RH relacionados: RHAG, RHBG y RHCG, localizados en el brazo

corto del cromosoma 6, en la región 21 y la banda 1 (6p21.1), el primero con 10

exones, 13 alelos, que genera la proteína RhAG (Rh50) de 407 aminoácidos, cuyo

papel es esencial en la expresión de las proteínas RhD y RhCE, y al parecer es un

canal de gas. Las proteínas RhBG y RhCG no se expresan en los eritrocitos se

localizan principalmente en hígado y en riñón, dos órganos especializados en la génesis

y excreción de amonio. Por comparación genómica y su predicción estructural se ha

podido deducir la posible función de las proteínas RhAG (transporte) y Rh (estructural).

El gen RHAG-LIKE codifica para las proteínas Rhag like, están presente en

Caenorhabditis elegans (nemátodo) y Geodia cydonium (esponja marina), estas

proteínas son similares a las transportadoras de amonio de bacterias y levaduras.(Westhoff

2004)

Figura 2. Orientación opuesta de los genes RhD y RHCE, enfrentados en su posición 3`. El gen RHD está flanqueado a la derecha y a la izquierda por unas secuencias de nucleótidos llamados cajas Rhesus (b).

EXÓN 8 9 10

Nucleótido 1074-1153 1154-1227 1228-1251

Cantidad de pb 80 74 24

Substitución 1193 1358

RHD A C

RHC T -

RHc T -

RHE T -

RHe T -

10

Evolución de los genes RH

La mayoría de los mamíferos poseen solo un gen Rhesus, cuya posición corresponde al

gen RHCE. El gen RHD se originó de la duplicación del gen RH ancestral durante la

evolución de los mamíferos. Una deleción del RHD ocurrió durante la evolución de los

homínidos, como resultado de la recombinación de las cajas Rhesus 5´ y 3´, entonces

se originó el fenotipo Rh negativo en el hombre moderno (Flegel 2007).

La duplicación del gen Rhesus original (ancestral) se piensa que ocurrió durante la

evolución de los primates dando lugar a los genes RHCE y RHD en los humanos. De

acuerdo a la comparación con otras especies (ratón, monos del nuevo y viejo mundo),

el RHD es un gen duplicado, mientras que el RHCE, debido a su proximidad a SMP1

(evolutivamente más conservado), es el gen ancestral y ocupa su lugar.(Flegel 2007)

Probablemente la inversión de la orientación del gen RHD ocurrió en este evento y las

cajas Rhesus fueron los instrumentos para la duplicación (Figura 3).(Wagner y Flegel 2002)

Figura 3. Evolución de los genes RH. Durante la evolución de los mamíferos el gen ancestral RH origino a los genes RHCE y este por duplicación al gen RHD. La deleción del gen RHD dio lugar al fenotipo Rh negativo.

Fuente : Flegel WA. 2007, The Genetics of the Rhesus Blood Groups System. Arztebl;104:651-7.

11

RhD negativo

Cuando menos existen dos mecanismos moleculares para explicar la condición de Rh

negativo. Uno es la deleción total o parcial de gen RHD. La deleción del RHD, es el

mecanismo predominante en sujetos de origen étnico caucásico. Es una condición

homocigota con la ausencia del gen RHD. El punto de ruptura se localiza en la región

de identidad en las cajas del Rh (1463 pb) y se explica por un entrecruzamiento

desigual con otros elementos de alta homología (THE-1B, L2 repetitivo) Figura 4.

El otro mecanismo es la pérdida de expresión del gen RHD por diferentes mutaciones.

En este segundo grupo, el gen RHD, al menos en parte, está presente, pero su

expresión fenotípica no ocurre. Un caso ejemplar, es el mecanismo mediante el cual los

sujetos de origen étnico negro-africano RhD negativo pierden la expresión del RhD la

que puede ser por al menos tres caminos distintos: la deleción del gen RHD (43 %), la

formación del un pseudogen RHD o gen Rhψ (43 %) y finalmente la formación de un

gen híbrido RHD-CE-D: asociado al haplotipo Cde (15 %) (Singleton 2000, Wagner 2003).

En otro grupo de sujetos fenotípicamente RhD negativo con la formación del gen

híbrido, se tienen diversas opciones como es el gen híbrido RHD-CE-Ds, el haplotipo:

(C)ces o los fenotipos: VS, cm c anormal, e anormal, pero sin D. (

Figura 4. Mecanismo de pérdida total del gen RHD por entrecruzamiento anormal de la caja Rh (b) por su alta homología, dando por resultado la caja híbrida Rh y la eliminación del gen RHD.

12

Fuente: Wagner FF y Flegel WA. 2000 RHD gene deletion occurred in the Rhesus box. Blood:95

(12):3662-8.

Cajas Rhesus

La Caja RH inicial (5’ RHD) tiene una extensión de 9142 bp y termina

aproximadamente 4900 bp de la región del codón de inicio 5´ del RHD. La caja RH final

(3’ RHD) es de 9145 bp y termina 104 bp después del codón de paro del RHD.

Las cajas RH abrazan exactamente la parte de RHD con homología a RHCE. La

porción central de ambas cajas Rhesus contienen casi completo un elemento humano

tipo transposón (THE-1B). Sin embargo, el marco de lectura abierto usualmente se

encuentra en el elemento THE-1B el cual es eliminado debido a varios cambios de

nucleótidos que ocurren en paralelo en las cajas Rhesus, incluyendo una mutación sin

sentido en el codón 4 (Figura 5).

5´ 3´

Figura 5. Organización cromosómica de las cajas Rhesus. La extensión física de la caja Rhesus inicial (5´RHD) es de 9145pb (barra negra). Cerca del 63% de la secuencia de nucleótidos de las cajas son de ADN repetitivo, los tipos de familias de repetición se indican con el resto de colores. La homología entre las cajas Rhesus inicial y final es del 98.6%, con una región de identidad de 1463 pb (flechas horizontales), hay solo una inserción de 4 pb (al inicio de la región tigger3). Una isla CpG (en L1MC3 MER20) esta localizada en la posición 3´ de la caja Rhesus final (3´RHD) adyacente a la región del promotor del SMP1.

Generación de la caja Rh híbrida

Por la alta homologìa de las cajas Rhesus hay un entrecruzamiento desigual de las

mismas condicionando la deleción del gen RHD. El sitio de ruptura se encuentra

localizado en la región de identidad de 1463 pb, situada entre las posiciones 5701 y

7163 que es casi completamente idéntica. Las diferencias son:

Caja Rh inicial (12T) vs final/híbrida (16T): Diferencia de 4 bp T en una zona

de polyT.

13

Caja RH final vs inicial/híbrida: T/C en la posición 5732, en la región de

identidad.

Entrecruzamiento desigual con otros elementos de alta homología (THE-1B, L2

repetitivo) (Wagner & Flegel 2000).

La prevalencia de sujetos Rh negativo es ~ 15% en población caucásica, bajo el

mecanismo de deleción RHD es del 99-100 %, variante DELs es 0.30 %, gen RHD no

expresado es de 0.01 % y por alelo híbrido RHD-CE-D 0.05 %. (Wagner y Flegel 2001)

Rh negativo en negro africano

En individuos de origen negro-africano el Rh D negativo puede ocurrir por 3

mecanismos:

Deleción del gen RHD (43-56 %), pseudogen RHDψ (26.2-52.3 %) y gen híbrido

RHDCes: asociado al haplotipo Cde (15.5-17.3 %).

El mecanismo del pseudogen RHDψ es una mutación en la que ocurre una inserción de

37 pb de repetición de los últimos 19 nucleótidos del intrón 3 y los primeros 18

nucleótidos del exón 4 al exón 4, (que es por consiguiente 37 pb mas grande) del gen

RHD, que produce un corrimiento del marco de lectura que da como resultado un codón

de paro en el exón 6 condicionando la no expresión de la proteína D (Figura 6) (Singleton el

al 2000).

14

Figura 6. Mecanismo del pseudogen RHDψ. Consiste en la inserción de 37 pb de una secuencia de repetición entre el intrón3 y el exón 4 en el exón 4 del gen RHD que da como resultado un codón de paro en el exón 6 condicionando la no expresión de la proteína D.

El tercer mecanismo es la conversión de los genes RH en cis (Figura 7).

(A) Los genes RHD y RHCE están orientados en sentido inverso.

(B) La formación de una horquilla en el cromosoma permite la estrecha proximidad de

los segmentos homólogos en la misma orientación de ambos genes, permitiendo la

conversión del gen en evento in cis.

(C) Al eliminarse la horquilla se produce un gen híbrido RHD-CE-D, para este caso se

introduce la secuencia de los exones 4 a 7 del gen RHCE al gen RHD. No

permitiéndose la expresión de la proteína RhD.

Se han identificado un gran número de genes híbridos que condicionan la no expresión

del RhD, con diferentes haplotipos siendo todos con fenotipo RhD negativo o Del (Figura

8) .(Wagner et al 2001)

Figura 7. Mecanismo de conversión de los genes RH en cis. Los genes RHD y RHCE están orientados en sentido opuesto (A), Al formarse la horquilla ambos genes se encuentran muy próximos, facilitando la conversión de segmentos homólogos (B) al eliminarse la horquilla queda un gen hibrido (C).

15

Figura 8. Estructuras moleculares en europeos con haplotipo D negativo y Del. Cada exón está indicado por una caja, los polimorfismos en intrones y promotor investigados se muestran como círculos. Los símbolos color blanco indican la presencia de la secuencia RHD específica. Los símbolos color negro no poseen la secuencia RHD predicha en los resultados por PCR-SSP. Los exónes 1,2 y 8 se muestran en gris, porque los alelos son iguales en el RHD y algunos alelos RHCE. Tanto el panel A como el B demuestran la presencia de genes RH híbridos.

Proteínas Rh

Las proteínas RhD y RhCcEe que portan los antígenos D y C, c, E y e respectivos se

expresan en la membrana de los eritrocitos en asociación con otras proteínas (RhAG,

LW, CD47, Glicoforina B, Duffy y Banda 3). Por la interacción con proteínas del

citoesqueleto, espectrina, proteína 4.2 y anquirina, el complejo Rh contribuye a

mantener las propiedades mecánicas de la membrana. Interactúan dos moléculas de

Rh con dos de RhAG para formar un tetrámero, el cual se une firmemente al

citoesqueleto. Las proteínas RhAG portan los N glicanos de ABH (Sistema ABO y

Sistema H) Figura 9 (Le Van Kim 2006).

Por su homología (20-40%) con las proteínas transportadoras de amonio presentes en

levaduras, bacterias y algunas plantas (alga verde), se piensa que es un canal de

transporte de gas para amonio (Javelle 2007).

16

Figura 9. Complejo molecular Rh. Interacción de las proteínas integrales (Rh, banda 3, CD47, RhAG, GPC) con las proteínas del citoesqueleto (anquirina, espectrina, banda 4.2, 4.1, actina) en la membrana celular del eritrocito.

Fuente: Le Van Kim C, Colin Y & Cartron JP. 2006, Rh proteins: Key structural and functional components

of the red cell membrane. Blood Reviews; 20:93-110.

Las proteínas Rh están presentes en el 3% de las unidades formadoras de brotes

eritroides (BFU-E) y en el 68% de las unidades formadoras de colonias de la serie

eritrocitaria (CFU-E), así como en todos los eritrocitos maduros. Son detectadas a partir

de la sexta semana de vida intrauterina. (Ref)

Las proteínas de membrana RhD y RhCE son de tipo III, altamente hidrofóbicas y no

glicosiladas ni fosforiladas (Moore 1982 y 1987), por análisis de hidropatía se dedujo que estas

presentan varios cruces por la membrana, y sus grupos amino y carboxilo terminales

son de localización intracitoplásmicos, están formadas por 417 aminoácidos, la proteína

madura pierde el primer aminoácido (Met), 12 segmentos transmembranales, 6 asas

extracelulares y 7 intracelulares Los primeros 47 aminoácidos del lado amino terminal

de ambas proteínas son idénticas. (Avent 1990 y 1992). RhD y RhCcEe difieren por la

expresión de las asas exofaciales 3, 4 y 6. Son diferentes en 34-37 residuos de

aminoácidos dependiendo del alelo presente. La proteína D tiene 5 residuos de cisteína

y la RhCcEe, dos, que dan lugar a 2 y 3 sitios de palmitolación (Cys-Leu-Pro)

respectivamente en el límite del citosol y la bicapa lipídica, que permiten su

estabilización en la membrana celular (Figura 10).(Le Van Kim et al 2005)

La expresión anormal de los antígenos D, C, c, E y e pueden ser causados por

mutaciones sin sentido en los genes RHD o RHCE, pero frecuentemente involucran el

intercambio de material genético entre ambos genes RH. (Daniels 2002)

17

Mutaciones en el gen RHD pueden condicionar la debilidad de expresión de la proteína

D, en forma de D débil, D parcial y Del, los cambios de los aminoácidos en el D débil y

Del no se producen en los epítopes externos, de tal forma que los que poseen estos

fenotipos no producen Anti-D por transfusión ni por embarazo, pero los D parciales sí,

ya que hay modificaciones en los epítopes externos (Figura 11). (Westhoff 2007a)

Figura 10. Estructura molecular de las proteínas RHD y R. Lado izquierdo. Proteínas RhD y RhCcEe con los polimorfismos circulados y los sitios de palmitolación, la proteína Rh CcEe tiene una cisteína en la posición 330 en vez de tirosina que da lugar al tercer sitio de palmitolación de la proteína RhCcEe. Lado derecho se señalan los cambios de aminoácidos en la proteína C/c y E/e

Figura 11. Cambios en aminoácidos en la proteína Rh condicionan la presencia de RhD débil, D parcial y Del. Los círculos negros denotan los cambios, los epitopes externos del RhD débil y del Del se mantienen sin cambios.

18

En la tabla 4 se muestran los ocho haplotipos Rh derivados del haplotipo cDe primitivo

que se generaron de una serie de eventos de duplicación, mutaciones puntuales y

recombinaciones.(Carritt 1997, Flegel 2000) Los haplotivos RhD positivo se presentan en color

amarillo y en verde los RhD negativo. La frecuencia de estos haplotipos varía en las

diferentes poblaciones. Las primeras dos nomenclaturas están basadas según el

mecanismo genético propuesto por cada autor, la tercera nomenclatura es numérica (1

a 5) dependiendo de la presencia (+) o ausencia (-) de los antígenos, y la más reciente

y actual, es también numérica, los primeros tres dígitos corresponden al sistema

sanguíneo y los siguientes tres números a los antígenos de dicho sistema, esta

nomenclatura se utiliza para todos los sistemas de grupos sanguíneos.

Tabla 4. Nomenclaturas del sistema Rh utilizadas en la literatura.

Las primeras dos bajo el mecanismo genético propuesto por los autores y las otras dos son nomenclaturas numéricas. Los números negativos indican la ausencia del antígeno.

Cigocidad al RhD

La determinación de la condición del estado de cigocidad del RhD ha planteado

dificultades tanto en el laboratorio, como su aplicación en la clínica.

Debido a que no existe un antígeno antitético del RhD no es posible determinar con

exactitud y precisión la condición de cigocidad por métodos serológicos.

Fisher/Race

1943

Wiener

1951

Rosenfield

1962

ISBT

CDe R1 1,2,-3,-4,5 004--001,002,005

cDE R2 1,-2,3,4,-5 004--001-003,004

CDE Rz 1,2,3,-4,-5 004--001,002,003

,cDe Ro 1,-2,-3,4,5 004--001,004,005

,cde ,r -1,-2,-3,4,5 004--004,005

Cde ,r’ -1,2,-3,-4,5 004--002,005

,cdE ,r” -1,-2,3,4,-5 004--003,004

CdE ,ry -1,2,3,-4,-5 004--002,003

19

Las técnicas de laboratorio utilizadas han sido la hemoaglutinación en tubo del fenotipo

Rh, que es la prueba más difundida y evaluada, seguida por otras técnicas aplicables

solamente a nivel experimental, como son la determinación de la densidad del antígeno

D mediante citometría de flujo o pruebas de electroforesis de proteínas (Westernblot),

entre otras más.

Mediante el empleo de la técnica de hemoaglutinación en tubo para identificar el

fenotipo de los antígenos más comunes del sistema Rh (D, C, c, E y e), nos permite

inferir el genotipo del individuo pero no establecer con certeza su condición de

hemicigoto u homocigoto en el gen RHD, se ha validado en población sajona y permite

con cierto grado de certeza establecer cuál es la probabilidad de cigocidad en el sujeto.

El problema clínico que se presenta comúnmente, es el de aquella mujer Rh negativo,

con pareja sexual Rh positivo, que desea saber cuál es la probabilidad de que tenga un

hijo Rh negativo y así evitar los problemas relacionados con la isoinmunización materna

que ponen en riesgo al feto y el recién nacido, así se puede enfrentar a la posibilidad

de tener hijos RhD negativo, dependiendo de la ausencia o modificación o presencia y

cigocidad del gen RHD paterno (Figuras12, 13 y 14).

Figura 12. Representación de los genes homocigotos RHD negativo y positivo. Uno de los padres RHD negativo y el otro RHD positivo homocigoto, 100% hijos RHD positivo heterocigotos. Los cuadros blancos corresponden a los exónes del gen RhD, los verdes son las cajas Rhesus, los cuadros rosa al gen SMP1 y los azules el gen RHCE.

20

Figura 13. Representación de los genes homocigoto RHD negativo y heterocigoto RHD positivo. Uno de los padres RHD negativo y el otro RHD positivo heterocigoto, 50% hijos RHD positivo heterocigotos y 50% RHD negativo

Figura 14. Representación de los genes RHD negativo en ambos padres. Ambos padres RHD negativo, 100% hijos RHD negativo

La estimación de la probabilidad de la hemicigocidad del alelo D, es útil en la asesoría

de las parejas con riesgo de ser portadores de un hijo con enfermedad hemolítica

isoinmune por Anti-D. Una alta probabilidad de hemicigocidad paterna promueve la

determinación del Rh fetal por métodos de amplificación del ADN. Una alta probabilidad

de homocigocidad requiere de una estrecha monitorización para valorar daño fetal y la

posible intervención terapéutica.

Por otro lado el determinar el RHD fetal permite tomar la decisión de la profilaxis con

gamaglobulina anti D prenatalmente solo si el feto es RhD positivo y evitando su

aplicación innecesaria si es RhD negativo en una madre no isoinmunizada al RhD

(Figura 15)

21

Figura 15. Guía para el estudio de la embarazada RhD negativo.

Enfermedad hemolítica del recién nacido (EHRN)

La hiperbilirrubinemia y la EHRN por anticuerpos antieritrocitarios, continúa siendo una

de las primeras 10 o 15 causas de morbilidad neonatal en nuestro medio, aunque su

prevalencia se haya modificado en la última década. Debido por un lado a la reducción

en la tasa de fecundidad para la República Mexicana, que pasó de más de 7 hijos por

mujer a menos de 3, entre 1960 y el año 2000. Otras variables que han influido son una

mejor infraestructura en el estudio inmunohematológico de la gestante, así como de las

acciones normativas que se han implementado en términos de uso terapéutico de la

sangre, la mejoría en las prácticas de atención obstétrica y la prevención con la gama-

globulina anti-D (Baptista 2000, Baptista Radillo, 2006).

La enfermedad hemolítica isoinmune del feto y el recién nacido se debe a una reacción

de citotoxicidad mediada por anticuerpos IgG (Ig1 e Ig3), producidos por la madre contra

los antígenos eritrocitarios fetales de herencia paterna, los cuales cruzan la placenta por

Sistema Rh• Cigocidad del

RHD paterno

• Identificación del

RHD fetal en sangre

materna

No

isoinmunizada

Isoinmunizada

Valorar daño

fetal si es RHD

positivo

Evitar la

aplicación

innecesaria de

la γglobulina

Anti-D

Escenario clínico

Embarazada RhD

negativo isoinmunizada

Anti-D 1:32

Conyuge RhD positivo

D/D D/d

Estrecha monitorización

para valorar daño fetal

y la posible intervención

terapéutica

Determinación del RHD

fetal por métodos de

amplificación del ADNd/d

D/d

22

su unión y transporte con el receptor neonatal Fc (FcRn) pH dependiente hacia la

circulación fetal (Klein y Anstee 2005) y ocasionan hemólisis fetal o neonatal de grado variable

que ocurre principalmente por mecanismos extravasculares, los eritrocitos

sensibilizados con anticuerpos son capturados por las células del sistema fagocítico

mononuclear, a través de la unión del Fc de los anticuerpos con los receptores de

Fc(γR1) de los fagocitos. (Mollison 1993, Oski 1984). Las consecuencias (dependiendo de la

severidad) incluyen anemia por destrucción (bazo e higado), hipoxia, acidosis, aumento

de la eritropoyesis, primero medular y luego extramedular (bazo higado),

hiperbilirrubinemia de predeminio indirecto, hipoalbuminemia, hipoprotrombinemia,

trombocitopenia, hipertensión portal, edema hasta anasarca, insuficiencia placentaria,

insuficiencia cardiaca congestiva, daño neurológico y hasta la muerte si no es tratado

oportunamente. (Baptista 1999)

La hemólisis Los anticuerpos antieritrocitarios se originan por dos mecanismos

principales, la hemorragia feto-placentaria y la transfusión incompatible. (Mollison 1993). Sin

intervención, se isoinmunizarán 1-2 % en la etapa prenatal, 5-15 % al nacimiento y del

3-6 % posterior a un aborto. Cerca del 25 % de sus hijos fallecerán en la etapa

perinatal. La tasa de mortalidad perinatal es del 0.33 %. A pesar del subregistro en los

reportes hospitalarios, la prevalencia de la isoinmunización al RhD disminuyó de entre

9.1-10.3 a 1.4 casos por 1000 nacimientos. (Urbaniak 1998). Se desconoce su prevalencia

en México (Baptista 2001).

La frecuencia de Rh negativo en una población de pacientes del Instituto Nacional de

Perinatologìa de los años 1982 a 1995, osciló entre 4.5 al 5%. En cuanto a su condición

de isoinmunización al RhD, encontramos que varió según el año, del 9.4 al 20.7%,

aunque es claro que tiene un sesgo, pues en aquellos años se reclutaron pacientes con

esta condición, pero al separar por quinquenios ocurrió entre 11.7 y 14.1% (Tabla 5).

(Baptista 2001).

Tabla 5. Prevalencia de mujeres Rh negativo e isoinmunización al RhD entre los años 1982 a 1995.

Años por quinquenios 1982-1985 1986-1990 1991-1995 Total

Pacientes de primera vez 20,898 40,958 38,193 100,049

Pacientes Rh negativo y porcentaje 1065 (5.0) 2052 (5.0) 1740 (4.5) 4857 (4.85)

Pacientes isoinmunizadas y porcentaje 150 (14.1) 276 (13.4) 203 (11.7) 629 (13.0)

23

A partir del fenotipo Rh, se puede inferir la cigocidad más probable del RhD, el origen

étnico es importante dado que modifica sustancialmente la probabilidad de la condición

de cigocidad (Tabla 6). (Walker 1990).

En la tabla 7 se muestran las frecuencias fenotípicas, Rh positivo, condición más

probable de cigocidad y Rh negativo así como el tamaño muestral en diferentes

estudios realizados en población mexicana, excepto la primera columna que es en

población sueca, que es la referida por ser un estudio de familias. La frecuencia

fenotípica de la mayoría está en los fenotipos R1R1, R1R2 y R1r, excepto en el estudio

de Lisker, para fenotipo R1r y RhD negativo por ser un estudio realizado en población

Tabla 6. Fenotipos RhD positivo con la cigocidad más probable en individuos blancos y negros

Blancos

(%)

Negros

(%)

Blancos Homocigoto

(%)

Blancos Hemicigoto

(%)

Negros Homocigoto

(%)

Negros Hemicigoto

(%)

CcDee R1r

31.1

8.8

10 90 59 41

R1Ro 3.4 15.0

Ror´ 0.2 1.8

CCDee R1R1

17.6

2.9

91 9 81 19

R1r´ 1.7 0.7

ccDEe R2r

10.4

5.7

10 90 63 37

R2Ro 1.1 9.7

ccDEE R2R2

2.0

1.3

87 13 99 1

R2r” 0.3 <0.1

CcDEe R1R2

11.8

3.7

89 11 90 10

R1r” 0.8 <0.1

R2r´ 0.6 0.4

ccDee Ror

3.0

22.9

6 94 46 54

RoRo 0.2 19.4

24

indígena, con menor mezcla con poblaciones extranjeras. La frecuencia de Rh D

negativa difiere significativamente entre la población caucásica y la mexicana.

La condición de cigocidad varía con respecto a la frecuencia de la población RhD

negativo, se aprecia claramente si se compara el estudio sueco vs cualquiera de los

estudios en mexicanos de la tabla, es más alta la condición de hemicigocidad al RHD

en poblaciones con mayor frecuencia de individuos RhD negativo.

Tabla 7. Frecuencia de fenotipos Rh, condición de RhD positivo y negativo, la cigocidad RhD más probable (alrededor de 90% o más) en diferentes estudios en población mexicana.

Fenotipo Heiken

1966

n 8297

Lisker

1980

n 2616

Quintanar

1999

n

Grunbaum

1980

n 1212

Baptista

1993

n 177

Tiburcio

1978

n 474

Long

1991

n 619

Duval

2007

N 8266

RhD positivo

n (%)

7009 (84.5)

2608

(99.7)

(96.6)

1170

(96.5)

162

(91.5)

431

(91.0%)

570

(92.1)

5707

CCDee (R1R1) 21.3 28.3 26.4 27.7 26.0 25.5 23.9 27.5

CcDEe (R1R2) 17.9 37.2 26.6 27.0 20.3 23.7 22.3 25.9

CcDee (R1r) 40.4 6.8 17.7 18.4 27.1 26.7 27.1 24.4

ccDEe (R2r) 14.8 5.3 7.5 7.8 7.9 12.8 14.4 10.4

Codee (R2R2) 3.6 14.0 6.9 7.2 7.3 6.5 6.5 6.2

CCDEe (R1Rz) 0.06 4.4 3.8 3.9 0.1 2.3 2.3 2.6

ccDee (Ror) 1.8 0.7 1.6 1.6 0.1 2.5 2.8 1.8

CcDEE (R2Rz) 0.06 2.4 3.8 4.0 <0.1 0 0.5 1.1

CCDEE (RzRz) 0 0.8 2.3 2.4 <0.1 0 0.2 0.1

RhD negativo

n (%)

1288

(15.5)

8

(0.3)

(3.4)

42

(3.5)

15

(8.5)

43

(9.0)

49

(7.9)

2559

,ccddee (rr) 96.0 100 84.4 76.1 93.3 93.0 91.8 92.5

Ccdee (rr´) 2.6 0 5.2 4.8 0 4.7 8.2 4.6

,ccddEe (rr´´) 1.4 0 0 4.8 6.7 2.3 0 2.2

CcdEe (r´r´´) 0 0 5.2 0 0 0 0 0.5

CCdee (r´r´) 0 0 5.2 0 0 0 0 <0.1

,ccdEE (r´´r´´) 0 0 0 4.8 0 0 0 <0.1

CCdEE (ryry) 0 0 0 9.5 0 0 0 0.1

Homocigoto 43.0 87.2 72.3 72.2 61.7 58.0 55.7 63.4

Hemicigoto 57.0 12.8 27.7 27.8 38.3 42.0 44.3 36.6

Se compara con el estudio de referencia de Heiken, noten diferencias en la frecuencia de Rh D negativos entre las poblaciones, sueca (segunda columna), indígena (tercera columna) contra el resto de estudios. La heterocigocidad al RHD es mayor en poblaciones con mayor frecuencia de RhD negativo.

25

I.2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA La isoinmunización materno-fetal al Rh es aún un problema clínico que hay que

abordar, a pesar del gran éxito medico que tuvo la prevención con la gammaglobulina

Anti-D, que pudo reducir las tasas de morbimortalidad neonatal pero no erradicar la

enfermedad hemolítica del recién nacido mediada por anticuerpos anti-D.

El conocer el estado de cigocidad RHD que posee el padre: a) Ayuda a predecir junto

con un grupo de pruebas diagnósticas a tomar las acciones necesarias de tratamiento

del feto enfermo, b) Brindar asesoría genética antes de la concepción cuando la madre

esta isoinmunizada y c) Identificar el RHD fetal por métodos no invasivos.

Debido a que existe un alto grado de homología con el gen RHCE, la selección de los

oligonucleótidos para la reacción de amplificación debe ser cuidadosamente diseñada.

• Se han utilizado las diferencias principales entre ambos genes para tal efecto. 1. Una secuencia presente en la región 3´ no traducida del exón 10 del RHD,

que no está presente en el RHCE. 2. Una diferencia de 600 pb en el tamaño del intrón 4 entre RHD (600 pb) y

RHCE (1200pb). 3. Múltiples diferencias entre el exón 7 de ambos genes. 4. La caja Rhesus híbrida está presente solo en Rh D negativo por el

mecanismo de deleción.

• Las cajas Rhesus presentes únicamente a ambos lados del gen RHD.

• Rh D parciales, que poseen ciertos exones reemplazados por los exones

equivalentes del RHCE, por lo que es necesario realizar PCR multiplex de dos o

más regiones.

• Presencia del pseudogen RHD ψ en el 67% de negros africanos RhD negativo,

en el 24% de los afro americanos RhD negativo y en el 17% de surafricanos y

personas mezcladas RhD negativo, que tienen el gen completo pero inactivo con

el inserto de 37 pb entre el intrón 3 y el exón 4, por tal motivo, se busca la

amplificación de la región que contiene el inserto.

• En orientales y algunos caucásicos europeos han encontrado polimorfismos en la

caja Rh híbrida del Rh D negativo.

26

I.3. JUSTIFICACIÓN

La validación de una prueba diagnóstica molecular para definir la condición de

cigocidad en sujetos Rh positivo, permitirá obtener información confiable para

proporcionar consejo pregestacional o prenatal a mujeres RhD negativo isoinmunizadas

y por consiguiente, mejorar la calidad de la atención médica.

PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN.

¿Cuál es la eficacia en la determinación del genotipo RHD con el empleo del PCR en

tiempo real y convencional en comparación con el estándar de oro hemaglutinación

(fenotipo), en la identificación de la cigocidad del RHD de los individuos RhD positivo?

I.4. OBJETIVOS E HIPOTESIS

HIPÓTESIS

La concordancia entre la prueba fenotípica y la determinación del genotipo del RHD,

presenta una correlación igual o mayor a 0.95.

OBJETIVO GENERAL

Identificar la condición de cigocidad en el gen RHD en sujetos RhD positivo,

mediante el empleo de PCR en tiempo real y PCR-RFLP tradicional, en familias

residentes en el Valle de México.

OBJETIVOS PARTICULARES

Determinar la concordancia de la cigocidad del gen RHD por la determinación del

fenotipo del sistema Rh y las pruebas moleculares del gen RHD.

Validar la determinación del genotipo como prueba diagnóstica en la identificación

del gen RHD en la descendencia de las mujeres Rh negativo con parejas Rh positivo.

27

II. MATERIAL Y MÉTODOS

1. Diseño: Estudio de casos y controles, transversal y descriptivo.

2. Población: Los casos se integraron por familias en donde la madre es RhD negativo

y su pareja RhD positivo y al menos un hijo biológico evaluado. Los controles fueron

familias en donde ambos padres son RhD positivo y al menos un hijo estudiado. La

muestra se obtuvo de dos sitios, un grupo de familias de una escuela en el Distrito

Federal y un grupo de mujeres Rh negativo y sus familias del Instituto Nacional de

Perinatología.

3. Variable de estudio: Pruebas serológicas : Grupo sanguíneo ABO, RhD, fenotipo

Rh. Pruebas moleculares: 3´UTR Exon 10 RHD, secuencia específica del exón 7 RHD,

secuencia del intrón 3-exón 4 RHD y RHDψ, amplificación y corte con Pst1 de las cajas

Rhesus.

Variable independiente: Tabla de frecuencias de cigocidad (Heiken 1966).

Variables dependientes: Grupo sanguíneo RhD, cigocidad basada en el estudio

familiar, genotipo del RHD por PCR-RFLP convencional y en tiempo real.

4. Criterios de inclusión, exclusión y eliminación:

Criterios de inclusión - Familias residentes de la ciudad de México y área

metropolitana con fenotipo Rh identificado y DNA almacenado.

Criterios de exclusión - Personas con antecedente de transfusión de eritrocitos en los

últimos tres meses. Familias donde el padre es RhD negativo.

Criterios de eliminación - Muestras sanguíneas sin el fenotipo completo o DNA

insuficiente, inadecuado o no identificado apropiadamente.

5. Métodos.

1. Los participantes del estudio bajo consentimiento informado del Protocolo de

Investigación, fueron identificados y obtenidas las muestras sanguíneas (dos tubos

de 2.7 mL con EDTA) de una vena del antebrazo.

2. Se les efectuó el estudio fenotípico de los antígenos Rh (D, C, c, E y e) mediante el

método de aglutinación en tubo y sistema en gel DIANA empleando reactivos

28

hemoclasificadores comerciales para RhD una mezcla de anticuerpos monoclonales

y control del Rh con la misma matriz que los anticuerpos (Immunocor Gamma,

Houston, Texas), a partir de sangre anticoagulada con EDTA. Se utilizaron

anticuerpos monoclonales específicos para el restante de antígenos (Gamma

Biologicals). Se observaron, interpretaron y registraron los resultados.

3. Se dedujo la cigocidad de acuerdo a la frecuencia génica reportada en el trabajo de

Heiken y Rasmuson considerado como estándar de oro (Tabla 8).

Tabla 8. Cigocidad más probable al RHD de acuerdo a la frecuencia génica

4. Se extrajo el DNA de los individuos a partir de los leucocitos de sangre

con EDTA (tres alicuotas) y se almacenaron en el Banco de DNA del Servicio de

Hematología del INPer con un equipo comercial High Pure PCR Template

Preparation Kit (Roche, Mannheim, Alemania), que permite el aislamiento de DNA

genómico de doble cadena a partir de diferentes tipos de muestras biológicas. Este

método de extracción aporta diversas ventajas frente a las técnicas clásicas:

aislamiento de forma rápida, obtención de DNA de buena calidad, libre de

inhibidores de DNA polimerasa, sin emplear laboriosos pasos de extracción con

solventes orgánicos y con menor manipulación de la muestra. Las células son lisadas

mediante una incubación corta con proteinasa K en presencia de un agente

caotrópico (guanidina-HCl 6M), urea 10mM, Tris-HCl 10 mM y triton X100 20%, el

cual inactiva todas las nucleasas. Los ácidos nucleicos se unen selectivamente a un

Fenotipo

Cigocidad más probable en base a la frecuencia génica

D/D ó D/d

CCDee (R1R1) Homocigoto

CcDEe (R1R2) Homocigoto

CcDee (R1r) Hemicigoto

ccDEe (R2r) Hemicigoto

ccDEE(R2R2) Homocigoto

CCDEe (R1Rz) Homocigoto

ccDee (Ror) Heterocigoto

CcDEE (R2Rz) Homocigoto

29

filtro de fibra de vidrio especial. EL DNA unido es purificado por una serie de pasos

de lavado y centrifugación que eliminan componentes celulares contaminantes. Se

ha incluido un amortiguador de remoción de inhibidores de Heparina que permite su

aplicación en muestras con hasta 100 U/mL de Heparina. Finalmente el DNA es

eluído de la columna con 200mL de una solución salina de baja concentración a pH

8.0 (Tris EDTA) obteniendo DNA genómico de alto peso molecular. Todos los pasos

de la extracción se realizan a temperatura ambiente.

5. Las alícuotas de DNA identificadas numéricamente fueron almacenadas

en un apartado para Banco de DNA en los ultracongeladores (-70ºC) del Servicio de

Hematología Perinatal del Instituto Nacional de Perinatología.

6. La calidad del DNA extraído se verificó por electroforesis horizontal

utilizando geles de agarosa al 1.5% con bromuro de etidio (0.5 g/mL) (Sambrook et

al, 1989). El corrimiento electroforético se llevó a cabo en la cámara Horizon 58 (Life

Technologies, Paisley, Escocia) a 65 volts durante 30 minutos con amortiguador TBE

0.5x (500 mM de Tris-HCl, 60 mM de ácido bórico y 83 mM de EDTA). Como control

negativo se usaron todos los reactivos, pero sin DNA, para determinar una posible

fuente de contaminación del material obtenido. Finalmente, los geles fueron

fotografiados con el sistema de captura AlphaImager utilizando el software

AlphaView versión 1.0.1.10 (Alpha Innotech, California, EUA). Figura 16.

7. La pureza (Relación 260/280nm) y concentración del DNA (260nm) se

valoró utilizando un espectrofotómetro ACTGene, EUA. (Sambrook et al, 1989).

Figura 16. Valoración de la calidad del DNA genómico. Se ejemplifica un gel de agarosa al 2%, teñido con

Br-Et (0.5 g/mL). Cada carril corresponde a una muestra proveniente del banco de DNA.

30

8. Se amplificaron secuencias específicas del gen RHD de los sujetos de estudio: a)

Región 3´no traducida del exón 10 del gen RHD por PCR en tiempo real con sondas

de hibridación como formato de detección, b) Región del exón 7 del RHD por sondas

de hidrólisis Taqman, c) Búsqueda del pseudogen RHDΨ con sondas de hibridación

y d) Caja híbrida por método tradicional de PCR y luego se cortó el amplificado (caja

Rhesus río abajo y caja Rhesus híbrida, con este diseño no se puede amplificar la

caja río arriba) con la enzima Pst-I, que cortará en dos sitios en la caja río abajo y en

tres sitios en la híbrida.

Se realizaron las amplificaciones por PCR en tiempo real utilizando el LightCycler II TM

(Roche Molecular Systems, Somerville, NY) Figura 17., es un sistema que consiste en

la integración de un fluorómetro y un termociclador que combina ciclos rápidos de PCR,

con una monitorización de la fluorescencia en tiempo real que va aumentando conforme

aumenta el número de copias de la secuencia de ADN amplificado, valorándose

gráficamente el producto de amplificación.

La reacción se lleva a cabo en capilares de borosilicato, es calentado por aire, y

distribuido por un ventilador, permitiendo una alta velocidad de reacción y con ello, la

especificidad. El gráfico (eje x ciclos y eje y fluorescencia) que se obtiene, es de tipo

sigmoidal. La fluorescencia se detecta en diferentes canales ópticos (530, 560, 610,

640, 670 y 705 nm). Los formatos de detección de los fluorocromos son: a) SyberGreen

1- Este fluorocromo con tres anillos aromáticos se une al surco menor del ADN de

doble cadena, la luz fluorescente verde se detecta a 530 nn en la fase de elongación, b)

Sondas de hibridización (HybProbe)- Contienen dos sondas, la F1 con el fluorocromo

del donador (fluoresceína) que se une por la parte 5¨, y la sonda F2 con el fluorocromo

aceptor (rojo 640 NHS éster ó 705), que se une a la parte 3´ y bajo el principio de

FRET, se detecta en la fase de alineamiento, emitiendo fluorescencia (del fluróforo

receptor) cuando hibridan, c) Sondas de hidrólisis (Taqman). Contiene una sola sonda

con un fluorocromo reportero con un apagador (quencher) se detecta en la fase de

31

elongación y d) sondas sencillas de hibridación que se detectan en fase de

alineamiento.

Figura 17. Observación de la fluorescencia en un sistema computarizado y diagrama de operación del termociclador.

Componentes, condiciones y programación de las reacciones de amplificación

(Tablas 9 y 10).

A. Región 3´ no traducida del exón 10 gen RHD

1. Componentes de la PCR: 6.0 μL H2O grado BM, 0.8 μL MgCl2 3mM, 0.4 μL primer

sentido, 0.4 μL primer antisentido, 0.2 μL sonda ancla Fit-PO4, 0.2 μL sonda

sensora Red LightCycler 640nm, 1.0 μL mezcla de reacción LightCycler FastStart

DNA Master HybProbe (Taq pol, dNTP´s, buffer) y 1.0 μL DNA (20-50 ng).

2. Condiciones de reacción: Fue programado a 45 ciclos de desnaturalización a

95°C durante 10 segundos, seguidos de alineación a 61°C por 10 segundos y

posteriormente extensión a 72°C durante 15 segundos.

3. Programa de detección: Se aplicó un ciclo de curvas meeting a 95°C durante 20

segundos, seguidos de 40°C por 20 segundos y 80°C, cero segundos, con una

detección contínua de fluorescencia.

B. RHDψ (intrón3-exón4) ttactgggttttattgcagACAGACTACCACATGAAC

1. Componentes de la PCR: 5.75μL H2O grado BM, 0.8 μL MgCl2 3mM, 0.4 μL primer

sentido, 0.4 μL primer antisentido, 0.2 μL sonda ancla o donadora (FL), 0.2 μL,

sonda sensora o receptora (LC NHS 640), 1.0 μL mezcla de reacción LightCycler

32

FastStart DNA Master HybProbe, 0.25 μL LightCycler Uracil-DNA glicosilasa (2 U/

μL) y 1 μL de DNA.

2. Condiciones de reacción: Fue programado a 45 ciclos de desnaturalización a

95°C durante 10 segundos, seguidos de alineación a 64°C por 10 segundos y

posteriormente extensión a 72°C durante 12 segundos.

3. Programa de detección: Se aplicó un ciclo de curvas meeting a 95°C durante 20

segundos, seguidos de 58°C por 20 segundos y 80°C, cero segundos, con una

detección continúa de fluorescencia.

C. Exón 7 RHD

1. Componentes de la PCR: 5.65μL H2O grado BM, 0.5μL primer sentido, 0.5μL

primer antisentido, 0.1 μL sonda de hidrólisis Taqman, 0.25μL UDG y 1.0 μL de

DNA.

2. Condiciones de reacción: Fue programado a 40 ciclos de desnaturalización a

95°C durante 10 segundos, seguidos de alineación a 58°C por 30 segundos y

posteriormente extensión a 72°C durante 1 segundo, fase de enfriamiento a 40°C

durante 30 segundos, con una detección sencilla de fluorescencia.

D. Amplificación convencional y corte con Pst1 de las cajas Rhesus

1. Componentes de la PCR: Expand High Fidelity PLUS PCR System, dNTPPack,

Roche®, 50.0 μL Buffer, 2.37 μL MgCl2, 0.5 μL dNTP, 1.0 μL oligonucleotido de

sentido (RHw rez7), 1.0 μL oligonucleotido de antisentido (RHwrnb31), 0.2 μL Taq

pol de alta fidelidad, 0.25 μL Uracil-DNA glicosilasa (UDG) y 15.0 μL H2O + DNA

concentración 50-100 ng para un volumen final de 25 μL de reacción.

2. Condiciones de reacción: 1 ciclo de desnaturalización inicial a 94ºC por 2 min,

40 ciclos de desnaturalización a 94ºC por 30 seg, alineación a 65ºC por 30 seg y

extensión a 68ºC por 5 min, luego 1 ciclo a 68ºC por 10 minutos y enfriamiento a 4

ºC

3. Corte con Pst1: 2.5μL buffer, 1.0μL Pst1 1U, 6.5 μLH2O y 15.0 μL producto de la

amplificación para obtener un volumen de reacción de 25.0 μL, el cual es incubado

a 37ºC, luego se toman 15 μL de la digestión los que se mezclan con 1.0 μL de

33

buffer de corrimiento, para ser sometidos a electroforesis en gel de agarosa al 1%

con BrEt, para ser visualizadas y comparadas con el marcador de tamaño molecular

(DNA Molecular Weight Marker XVI (0.25-3.09Kpb, Roche®) con un marcador de

tamaño molecular (DNA Molecular Weigh Marker XII, Roche®) que genera 15

fragmentos desde 50 a 750 bp con una banda final de 2642 pb. y las reacciones

digeridas de los controles DD, Dd y dd como parte del control de calidad.

Tabla 9, Secuencias de los iniciadores y sondas para la amplificación de las secuencias del gen RHD

PCR-RFLP Amplicón y fragmentos Diseño

Caja natural río abajo e híbrida Oligonucleótido Sentido (rez7) 5´CCTGTCCCCATGATTCAGTTACC3´ Oligonucleótido Antisentido (rnb31) 5´CCTTTTTTGTTTGTTTTTGGCGGTGG3´ Enzima Pst 1

3030 pb 567, 179, 397 y 1887 pb en caja híbrida. 744, 397 y 1887 pb en caja Rhesus natural río abajo.

Wagner FF & Flegel WA. Blood 2000;95(12):3662-8.

PCR Tiempo real Amplicón Diseño

3´UTR Exón10 RHD Oligonucleótido Sentido 5´TCTCACTGTTGCCTGCATT Antisentido 5´TCTAGCCTGGGTGACAGAGTA Sonda 1 5´LC640-GACTTTGCTGTCATGAGCGTTTCTCACGTA--PH Sonda 2 5´CCAGTGCCTGCGAACATTGG—FL

321 pb Lo D et al N Engl J Med1998;339:1734-8, modificado por TIB- MOLBIOL

Intrón 3-Exón 4 RHD ψ Oligonucleótido Sentido 5´ CAGAGGATGCCGACACTCA 3´ Antisentido 5´TCTGCTCAGCCCAAGTAGGA3´ Sonda 1 5´ LC640- Sonda 2 5´

275/238 pb Modificación de Singleton por TIBMOLBIOL

Exón 7 RHD Oligonucleótido Sentido 5´CTCCATCATGGGCTACAA 3´ Antisentido 5´CCGGCTCCGACGGTATC 3´ Sonda 5´ 6FAM-AGCAGCACAATGTAGATGATCTCTCCA—TMR

90 pb Legler et al Tranfusion and Apheresis Science 2002;27:217-23.

PCR-RFLP Amplicón y fragmentos

Diseño

Caja natural rio abajo e híbrida Oligonucleótido Sentido (rez7) 5´CCTGTCCCCATGATTCAGTTACC3´ Antisentido (rnb31) 5´CCTTTTTTGTTTGTTTTTGGCGGTGG3´ Enzima Pst 1

3030 pb 567, 179, 397 y 1887 pb en caja híbrida. 744, 397 y 1887 pb en caja Rhesus natural río abajo.

Wagner FF & Flegel WA 2000, Blood;95:3662-8

34

Tabla 10. Condiciones de las reacciones de amplificación

El oligonucleótido de sentido (rez7) reconoce la región de identidad de las cajas RH

superior, inferior e híbrida. El oligonucleótido de antisentido (rnb31) reconoce solo la

caja RH inferior y la híbrida. Se pueden identificar las cajas amplificadas por la digestión

enzimática con Pst1, que corta la caja RH híbrida en cuatro bandas (1887,567, 397 y

179 pb) y la caja RH inferior en tres bandas (1887, 746 y 397 pb), cuando se tienen

ambas cajas (hemicigotos) se generan cinco bandas (1887, 746, 567, 397 y 179).

En cada una de las reacciones de amplificación en tiempo real realizadas se incluyeron

muestras control conocidas DD, Dd y dd, así como una muestra blanco de agua, como

parte del control de calidad.

Las muestras de DNA con resultados negativos, fueron estudiadas con una

amplificación de una secuencia específica del gen de albúmina.

La tabla muestra las secuencias de los oligonucleótidos (primers) y sondas, tamaño de

los amplicones y las referencias del diseño molecular y en la tabla se describen las

condiciones de reacción.

Desnaturali-

zación inicial

Desnaturalización Alineamiento Extensión Ciclos Curvas de fusión

(1 ciclo)

3´UTR

Exón 10

95°C 10 min 95°C 10seg 61°C 10seg 72°C 15seg 45 95ºC/10 seg, 40 ºC/20

seg y 85 ºC/0seg

RH ψ 95°C 10 min 95°C 10seg 64°C 10seg 72°C 12seg 45 95ºC/0 seg, 58 ºC/1

min y 80 ºC/0seg

Exón 7 95°C 10 min 95°C 10seg 58°C 30seg 72°C 1seg 40 No

Cajas Rh 94°C 2 min 94°C 30 seg 65°C 30 seg 68°C 5 min 40 No

35

ANALISIS ESTADÍSTICO

Los resultados de los estudios de laboratorio de los sujetos analizados fueron

almacenados en una hoja electrónica tabular, que generó una base de datos. Se

establecieron los estratos de los grupos para cada variable para ser analizados en un

programa estadístico SPSSv12.

Se obtuvo la estadística descriptiva de la población total y por grupo de estudio. Se

estableció la concordancia entre la cigocidad establecida por la frecuencia génica y la

obtenida por el estudio familiar mediante la prueba de Phi. De igual manera se evalúo la

concordancia entre la cigocidad basada en frecuencia genotípica y la obtenida por el

estudio familiar con la cigocidad basada en los estudios moleculares.

Se evaluó mediante la metodología de pruebas diagnosticas la capacidad de

identificación de cigocidad en la descendencia.

Se aplicaron los criterios para determinar el genotipo más probable a partir del fenotipo

identificado (1.- sin conocer los fenotipos paternos, a través de la tabla de frecuencias

del Rh de Heiken y Rasmuson y 2.- conociendo los fenotipos de padres e hijos). Se

correlacionaron el fenotipo y los genotipos para valorar el grado de concordancia entre

ambos métodos por el análisis de Phi y, para valorar la frecuencia esperada contra la

observada en los grupos de estudio, se aplicó la prueba X2.

36

III.- RESULTADOS

Serológicos

Se evaluaron 228 individuos, 122 padres y 106 hijos pertenecientes a 61 familias (61

madres y 61 padres). Se constituyeron 28 familias de casos y 33 familias de controles.

En la Tabla 11 se muestra la distribución de la población RhD positivo y negativo, 187

(82.0%) sujetos fueron RhD positivo (33 madres, 61 padres y 93 hijos) y 41 (18.0%)

fueron RhD negativo (28 madres y 13 hijos).

De los 106 hijos evaluados, 44 correspondieron al grupo de casos, de estos 33 fueron

RhD positivo y 11 RhD negativo. El grupo control estuvo conformado por 62 hijos, de los

cuales 60 fueron RhD positivo y 2 RhD negativo.

Tabla 11. Distribución de la población estudiada por RhD

Familia (228)

Positivo n/% (187/82.0)

Negativo n/% (41/18.0)

Hijo (106)

93 (87.7)

13 (12.3)

Madre (61)

33 (54.1)

28 (45.9)

Padre (61)

61 (100.0)

En el estudio del grupo sanguineo ABO, la distribución obtenida fue con predominio del

grupo O (64.9%), seguido del grupo A (24.1 %), grupo B (9.6%) y finalmente AB (1.8

%). Al comparar su distribución de acuerdo con la condición del Rh, no hubo diferencias

(Tabla 12).

Tabla 12 Distribución de la población estudiada por grupo ABO y Rh

Grupo ABO (228)

Positivo (187/82.0)

Negativo (41/18.0)

O (147/64.5)

121 (64.1)

26 (57.8)

A (55/24.1)

44 (24.5)

11(28.

B (22/9.6)

19 (9.9)

3 (11.1)

AB (4/1.8)

3 (1.5)

1 (2.2)

37

Se realizó la identificación de los fenotipos del sistema Rh, los resultados obtenidos se

muestran en la Tabla 13, donde se observa que los fenotipos más frecuentes fueron

CcDee con 62 casos, CCDee 45 casos, CcDEe 43 casos y ccddee 36 casos, los demás

fenotipos se encontraron con menor frecuencia. Los fenotipos hemicigotos (D/d) se

muestran en casillas amarillas, de acuerdo a la tabla de frecuencias génicas de

Heiken.y Rasmuson.

Tabla 13. Fenotipos Rh de los sujetos de estudio

Con los resultados obtenidos del estudio de fenotipificación del sistema Rh y tomando

en consideración la tabla de frecuencias génicas de Heiken y Rasmuson (Tabla 8), se

estableció la probabilidad de la cigocidad paterna (28 casos y 33 controles) y a través

del estudio por familia.

Fenotipo

Madre

n61

n (%)

Padre

n61

n (%)

Hijos

n106

n (%)

Total

n228

n (%)

RhD positivo 33 61 93 187

CCDee (R1R1) 15 (45.4) 14 (23.0) 16(17.2) 45(24.1)

CcDEe (R1R2) 7 (21.2) 19 (31.1) 17(18.3) 43 (23.0)

CcDee (R1r) 6 (18.1) 15 (24.6) 41 (44.0) 62(33.2)

ccDEe (R2r) 2 (6.1) 6 (9.9) 8 (8.6) 16 (8.6)

ccDEE(R2R2) 2 (6.1) 3(4.9) 5(5.4) 10 (5.3)

CCDEe (R1Rz) 1 (3.1) 1 (1.6) 1(1.1) 3(1.6)

ccDee (Ror) 0 3 (4.9) 4(4.3) 7(3.7)

CcDEE (R2Rz) 0 0 1(1.1) 1(0.5)

Homocigoto 25(75.8) 37(60.7) 40(43.0) 102(54.5)

Hemicigoto 8(24.2) 24(39.3) 53(57.0) 85(45.5)

RhD negativo 28 0 13 41

,ccddee (rr) 26 (92.9) 0 10 (77.0) 36(87.8)

Ccdee (rr´) 0 0 1(7.7) 1( 2.4)

CcdEe (r´r´´) 2 (7.1) 0 2 (15.3) 4 (9.8)

38

La cigocidad paterna por grupo de estudio y de acuerdo con la frecuencia génica para

el grupo de estudio, fue de 10 (35.7%) hemicigotos y 18 (64.3%) homocigotos, mientras

que para el grupo de los controles se obtuvieron 14 hemicigotos (42.4%) y 19 (57.6%)

homocigotos, sin diferencia estadísticamente significativa (t exacta de Fisher 0.611).

Para la cigocidad paterna por grupo de estudio y en relación con el estudio familiar,

para el grupo de casos se obtuvieron 14 (50.0%) hemicigotos y 14 (50.0%)

homocigotos; mientras que para el grupo de los controles fueron 14 (42.4%)

hemicigotos y 19 (57.6%) homocigotos, también mostró la misma distribución de la

cigocidad, en el cual tampoco se obtuvo diferencia significativa (t exacta de Fisher

0.612). La razón de momios de la cigocidad de los padres por frecuencia génica fue de

OR 1.3 (0.47-3.73) y de OR 0.75 (0.26-2.1) por estudio familiar.

Para el caso de las frecuencias del RhD de los hijos de los casos estudiados (33

positivos y 11 negativos) y de los controles (60 positivos y 2 negativos) se obtuvo una

frecuencia diferente de RhD negativo y significativamente mayor (p 0.0015) para el

grupo de casos, explicable por ser hijos de madres RhD negativo; mientras que para los

controles se obtuvo la frecuencia esperada (alrededor del 3%).

Moleculares

En todos los 187 sujetos RhD positivo se obtuvo amplificación de las cuatro secuencias

del gen RHD estudiadas (3´UTR exón 10, exón 7 e intron3-exón4/RHDΨ, Cajas

Rhesus). Mientras que en 32 de los 41 casos (0.78) RhD negativo solo amplificaron las

cajas Rh híbridas de forma homocigota (mecanismo de deleción en sujetos RhD

negativo). En 5 individuos (8.2%) amplificaron una o más de las secuencias estudiadas,

en los 5 casos se identificó una caja Rh natural descendente y una caja híbrida

(mecanismo mixto en sujetos Rh negativo). En ningún caso se identificó la presencia del

pseudogen RHDΨ (segundo mecanismo y de alta prevalencia en negroafricanos de

RhD negativo).

39

Se identificaron 3 casos en donde la cigocidad no concordó con la tabla de frecuencias

génicas, pero si con el estudio familiar y en concordancia completa con el estudio de

las cajas Rh.

La concordancia obtenida entre la cigocidad paterna con base en la frecuencia génica y

el estudio de las cajas Rhesus, fue del 0.88 en homocigotos y de 1.0 en hemicigotos

con un valor de Phi de 0.875.

Asimismo, la concordancia obtenida entre la cigocidad paterna con base al estudio

familiar y de las cajas Rhesus fue de 1.0, tanto para los fenotipos homocigotos como

hemicigotos, con un valor de Phi de 1.0.

En otras palabras cuando una mujer RhD negativo y conyuge RhD positivo acuden a un

consejo genético, al conocer el fenotipo de ambos, esto nos ayudará a conocer la

probabilidad de tener un hijo RhD negativo, ya que si por fenotipo es homocigoto, y no

se cuenta con el estudio familiar, podremos tener un 12% de falla en la estimación de la

cigocidad, es decir que siendo el padre hemicigoto con la posibilidad de tener 50% de

hijos RhD negativo lo determinamos como homocigoto, sin la posibilidad de tener hijos

RhD negativo (falso positivo).

Las figuras muestran algunos ejemplos de las curvas de amplificación y los picos de

fusión de los ensayos efectuados en los sujetos de estudio.

Figura No. 18 Picos de fusión de la región 3´UTR Exón 10 RHD. Se aprecia el producto de amplificación

específico para cada muestra evaluada con una Tm de 71°C.

40

Figura No. 19 Picos de fusión de la región intron3-exon4 RHD. Se aprecia solo un producto de

amplificación (el tipo silvestre) por cada sujeto estudiado a una Tm de 68.2°C.

Figura No. 20 Curvas de amplificación del exón 7 RHD. Se observa la curva de amplificación de cada

DNA estudiado comenzando a partir del ciclo 24-25.

41

IV.- DISCUSION

Los ensayos basados en PCR han sido utilizados por diversos autores para determinar

la cigocidad del RHD. La prueba es de gran valor al estudiar una pareja de mujer RhD

negativa isoinmunizada con Anti-D y cónyuge RhD positivo. El riesgo de afección de un

feto es del 100% si el padre es homocigoto (D/D) y del 50% si es hemicigoto (D/d).

Inicialmente los métodos se basaron en la amplificación de sitios polimórficos que están

genéticamente ligados a la ausencia del gen RHD. Se mostró que unidades repetidas

pequeñas (STR) de las formas (AC)n (GCAC)n en el intrón 2 pueden ser usadas para

definir si el padre con fenotipo ccDee tiene el genotipo cDe/cde o cDe/cDe. (Kemp 1999).

Los fragmentos SphI que abarcan los exones 4 a 7 del gen RH se presentan en 4 tipos

de bandas diferentes que corresponden a la distribución y segregación de los

haplotipos Rh comunes (Huang 1996).

Anteriormente, la determinación de la cigocidad se realizaba a través de la utilización

de la prueba de desequilibrio de enlace, la cual permitía determinar la correlación

fenotipo-genotipo de manera directa con base en un análisis estadístico. Adicional a lo

anterior, posteriormente, se identificaron polimorfismos en secuencias de repetición en

el intrón 8 de los genes RHD y RHCE; ambos conteniendo 5 unidades de repetición de

5 pb (AAAAT)n. Las 5 repeticiones en ambos genes, fueron identificados

exclusivamente en donadores japoneses sin el gen RHD (Fujiwara 1999).

Todas estas pruebas utilizadas con anterioridad dependían del cálculo del desequilibrio

de enlace y por consiguiente, son abordajes indirectos.

También es posible dosificar directamente el gen RHD por PCR convencional (de punto

final), comparando la intensidad del producto amplificado contra un gen de

referencia(Chan 2001). Este fundamento se aplicó en la técnica de electroforesis capilar,

que ya ha sido utilizada para evaluar el gen RH (Cossu 1996). Finalmente se describió un

método por PCR en tiempo real en el cual las secuencias específicas amplificadas del

RHD se pueden cuantificar en relación con un gen de referencia. (Chiu 2001). Estos

métodos no permiten identificar otros mecanismos implicados en la condición de RHD

negativo, como el pseudogen RHDψ y otros alelos aberrantes.

42

Desde que se definió la organización genómica del locus RHD y se identificó el sitio

preciso de la deleción del gen (Wagner 2000), se pudieron desarrollar métodos basados en

PCR-RFLP y PCR tiempo real. La cigocidad por el método de PCR-RFLP descrita por

Wagner y Flegel 2000, también puede ser afectada por la presencia del pseudogen ψ o

por mecanismo híbrido. Correlaciona en todos los casos cuando los hemicigotos (la

parte RhD negativa heredada) derivan del mecanismo por deleción. Se tiene un reporte

del análisis de cigocidad por PCR en tiempo real (Araujo), pero nuestro grupo no lo pudo

reproducir. Una perspectiva es identificar la cigocidad por esta metodología para hacer

esta prueba accesible a la clínica, por ser un método rápido, sensible, confiable, sin

manipulación del DNA y menor riesgo de contaminación, hacen que esta técnica se

perfile como una herramienta necesaria en el área del diagnostico clínico y la

investigación.

No se puede definir la cigocidad RHD por las amplificaciones de los segmentos del gen

estudiados por PCR en tiempo real porque no fueron cuantificados los DNA obtenidos

de los sujetos de estudio, ni comparados con un gen constitutivo de una o dos copias,

pensamos que podríamos diferenciarlos en la fase donde comienzan las

amplificaciones pero esto no fue posible.

Por los estudios referidos en la literatura, se concluye que pueden usarse

indistintamente las pruebas que identifican la cigocidad RHD a través de PCR

cuantitativo de los métodos que determinan la caja híbrida (PCR-RFLP, PCR alelo

específica ), dando los mismos resultados, (van der Shoot considerando que ambos

tienen la limitante de no identificar otros mecanismos de generación de fenotipo RhD

negativo, de ahí que sea importante considerar la etnicidad de los individuos a estudiar,

pero se pueden tener valores predictivos positivos y negativos muy altos cuando la

población estudiada es de origen blanco europeo.(Waner 2002).

43

Concordancia entre los diferentes métodos de estimación de la cigocidad RHD.

Autor Frecuencia

génica

Estudio

familiar

Estudio

Molecular

Danes 72 ND 95.8

Fany 61 100 100

Chiu 46 ND 100

44

V. CONCLUSIONES.

1. La condición de cigocidad al RHD se distribuye de manera simétrica en las

parejas de mujeres RhD negativo y positivo.

2. La identificación de la cigocidad de la pareja RhD positivo se debe efectuar

mediante la combinación de estrategias de acuerdo a la situación clínica.

La determinación simultánea del fenotipo Rh y la identificación molecular

de la cigocidad son herramientas útiles en el asesoramiento genético

perinatal, sobre todo en las formas homocigotos del RHD, para valorar

casos en que aparentemente tienen la condición homocigota y por

consiguiente el 100% de los hijos serán RhD positivo que son hemicigotos

que tienen la posibilidad del 50% de engendrar hijos RhD negativos que no

serán afectados por ese silencioso proceso llamado isoinmunización

materna.

3. Si una pareja con mujer RhD negativo y pareja RhD positivo que por

fenotipo es más probable que sea homocigoto tiene un error en la

identificación de la cigocidad del 12%, a diferencia de la condición

hemicigota en la que tiene una probabilidad del 100% de tal condición.

4. El estudio molecular permite conocer con más precisión esta condición,

sobre todo en las formas homocigotos del RHD, para valorar casos en que

aparentemente tienen la condición homocigota y por consiguiente el 100%

de los hijos serán RhD positivo que son hemicigotos que tienen la

posibilidad del 50% de engendrar hijos RhD negativos que no serán

afectados por ese silencioso proceso llamado isoinmunización materna.

45

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