Post on 16-Mar-2020
UNIVERSIDAD DE SONORADIVISIÓN DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y DE LA SALUD
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS QUÍMICO-BIOLÓGICAS
“Activida Biológica y productos naturales
de plantas de la etnofarmacopea
sonorense”
Dr. Ramón Enrique Robles ZepedaCuerpo Académico: Biología y Bioquímica
Robles.zepeda@unison.mx
UNIVERSIDAD DE SONORADIVISIÓN DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y DE LA SALUD
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS QUÍMICO BIOLÓGICAS
“ACTIVIDAD ANTIPROLIFERATIVA DE CARDENOLIDOS
DE Asclepias subulata”
CUERPO ACADÉMICO CONSOLIDADO: BIOLOGÍA Y BIOQUÍMICA
Dra. Adriana Garibay Escobar (Líder)
Dra. Olivia Valenzuela Antelo
Dr. Carlos A. Velázquez Contreras
Dr. Eduardo Ruiz Bustos
Dr. Ramón Enrique Robles Zepeda
1) Bioquímica e inmunología de las enfermedades infecciosas y crónico degenerativas de mayor prevalencia regional.
2) Actividad biológica y bioquímica de productos naturales.
LGAC
Ventajas de los productos naturales4
México: 26,500 especies vegetales; 4,000 con uso
medicinal, 56 grupos étnicos
Sonora: 8 grupos étnicos, población 117 mil, 450
plantas medicinales registradas.
Huerta, 1997; Lopéz e Hinojosa, 1988; Ocegueda et al, 2005
Ventajas de los productos naturales
Arterolan: Sintético
Gran diversidad
de estructuras
Historia biológica
Mayor complejidad
Ensamblaje de policétidos
VrtA (NR-PKS)
Hidroxilación
VrtE (citocromo P450)
VrtH (oxidasa flavin dependiente)
Unidades iniciales
VrtB (acil-CoA ligasa)
VrtJ (aldolsa)
VrtI (dioxigenasa)
Ciclización tipo Claisen
VrtG (esterasa)
Ensamblaje y ciclización
VrtC (preniltransferasa)
VrtD (ageranil-PP sintasa)
VrtK (citocromo P450)
O-metilación
VrtF (metiltranferasa)
Bomba de flujo VrtL
Taxol: Natural
Lahlou, M. 2013. The Sucess of Natural Products in Drugs Discovery. Pharmacol. Pharm. 4: 17-31..
Productos naturales
60% de las drogas usadas para
el tratamiento contra el cáncer
han sido aisladas de productos
naturales*
4
Descubrimiento de fármacos de productos naturales
Muestra inicial
bioactiva Concentrado
bioactivo Compuesto
bioactivo puro Nuevo
compuesto Principio
potencial Desarrollo del
candidato
Experimentos de
procesamientoFraccionamiento
biodirigido Determinación
estructuralSAR y derivados
Química medicinal
Identificación de
compuestos
conocidos
Cantidad de compuesto
requerido 1-10 µg 100 g1-10 g1-10 mg
Koehn, F., Carter, G. 2005. The evolving role of natural products in drug discovery. Nat. Rev. Drug. Discov. 4: 206-218.
Mecanismos de
acción
Uso de información
etnobotánica
6
Asclepias subulata
Reino Plantae
Phylum Magnoliophyta
Clase Magnoliopsida
Orden Gentianales
Familia Asclepiadaceae
Género Asclepias
Epíteto subulata
Autor del nombre Decne., 1844
7
Caracterizar químicamente las sustancias con actividad
antiproliferativa derivadas de los extractos metanólicos de
Asclepias subulata, así como determinar los mecanismos de
muerte celular que estas pueden activar in vitro
Objetivos de la Etapa 1
OCH3
OH
O
O
OH OHC
OH
CH3
OO
8
Planta
Obtención del
extracto
metanólico
Fraccionamiento
con solventes
Purificación de
sustancias
Medición de la
actividad
antiproliferativa
Cultivos
celulares
Caracterización
de sustancias
Eventos de
apoptosis
Métodos de investigación9
Resultados del estudio biodirigido10
Extracto o fracción Líneas celulares murinas (IC50*)
M12.C3.F6 RAW 264.7 L929
Extracto metanólico 80.9 ± 1.2a 188.4 ± 1.1b 245. 4 ± 1.1c
Extracto o
fracción
Líneas celulares humanas (IC50*)
HeLa A549 PC-3 LS 180 ARPE-19
Extracto
metanólico
8.7 ± 1.3b 0.38 ± 0.01a 16.3 ±1.2 c 15.6 ±1.3 c 141.0 ±1.2d
*Suffness, y Pezzuto, 1990. Assays related to cancer drug discovery. En Methods in Plant Biochemistry: Assays for Bioactivity. Academic Press, London, 71–133.
Valores IC50 NCI*
Extracto: ≤30 μg/mL
* Concentración inhibitoria del 50%(a-d) Valores significativamente diferentes (p<0.05)
Actividad antiproliferativa del extracto metanólico
10
5
1
4
2
3
8
7
9
6
13
14
12
11
17
16
152'
1'
3'
O
4'
5'
CH36'
OH
O
O
OH OHC19
OH
OH
CH318
OH
20
21
22
O 23O
OCH3
OH
O
O
OH OHC
OH
CH3
OO
10
5
1
4
2
3
8
7
9
6
13
14
12
11
17
16
15
OHC19
OH
CH318
O4'
5'
O
1'
2'
3' OH
OHOH
6'OH
20
21
22
O 23O
CH3
OH
CH3
OO
OH
OHOH
OH
OO
(1) (2)
(3) (4)
Corotoxigenina 3-O-glucopiranósido Desglucouzarina
12,16-dihidroxicalotropina Calotropina
Compuestos caracterizados12
Valores de IC50
Compuesto: ≤4 μg/mL
Compuestos Línea celular IC50*( µM)
RAW 264.7 ARPE-19 A549 LS 180 PC-3
12,16-dihidroxicalotropina ND ND 2.48 ± 1.13a 5.62 ± 2.12a 11.7 ± 2.48b
Calotropina 271.62 ± 2.25e 149.30 ± 2.07d 0.013 ± 0.002a 0.06 ± 0.04b 0.41 ± 0.11c
Corotoxigenina 3-O-
glucopiranósido
ND ND 2.64 ± 0.30 3.15 ± 0.44 6.62 ± 0.42
Desglucouzarina ND ND 0.90 ± 0.02a 6.57 ± 1.34b 9.68 ± 0.58b
Doxorrubicina 0.63 ± 0.08a 1.02 ± 0.12a 1.78 ± 0.12a 6.99 ± 0.21b 3.18 ± 0.31a
* Concentración inhibitoria del 50%
ND: No determinada(a-e) Valores significativamente diferentes (p<0.05)
Actividad antiproliferativa de las sustancias aisladas13
**
*
*
**
** * *
*
*
* *
* *
*
• Externalización de la
fosfatidilserina
Eventos de la apoptosis inducidos por los GC14
• Despolarización de la membrana
mitocondrial
• Activación de la caspasa 3
Activación de la
APOPTOSIS
Los tratamientos se dieron con concentraciones cercanas a la IC50 por 12 horas y se utilizó 100 µM de CAPE como control positivo.
* Significancia estadística con base en comparación con células control (DMSO) para cada condición, p<0.05
• Activación de las caspasas iniciadoras
Eventos de la apoptosis inducidos por los GC15
**
*
*
*
*
*
** *
Caspasa-8 Caspasa-9
UANLUniversidad de
Barcelona
PROYECTO DE REDES
TEMÁTICAS
UNESP
UNISON
Generación del fitofármaco de A. subulata21
Variación de metabolitos secundarios
Abiótico
BióticoHerbívoros
Patógenos
Protección
Temperatura
Nutrientes
pH Metales
pesados
Luz
Humedad
Metabolitos
secundarios • Fármacos
Parásitos
Lahlou, M. 2013. The Sucess of Natural Products in Drugs Discovery. Pharmacol. Pharm. 4: 17-31.
22
Variación de metabolitos secundarios
San Carlos Bahía de KinoCaborcaHermosillo
HERMOSILLO CABORCA SAN CARLOS BAHÍA DE KINO
Rango de
precipitación100 – 600 mm 0 – 500 mm 100 – 600 mm 200 – 1500 mm
Clima
Muy seco
semicálido
(51.29%)
Muy seco
semicálido
(95.68%)
Muy seco muy
cálido (63.83%)
Muy seco muy
cálido
Compendio de información geográfica municipal de los Estados Unidos Mexicanos, Instituto Nacional de Estadística y Geográfica (2010).
Dirección General Adjunta de Oceanografía, Hidrografía y Meteorología.
23
Variación de metabolitos secundarios
Método de cuantificación para los GC
de extractos de A. subulata
Corotoxigenina 3-O-
glucopiranósido
µg de compuesto/mg de extracto
Extracto metanólico Extracto etanólico
Hermosillo 0.2573 0.4174
Caborca 0.3429 0.4437
San Carlos 0.3816 0.3946
Bahía de Kino 0.3455 0.4147
25
Variación de metabolitos secundarios
Calotropina
µg de compuesto/mg de extracto
Extracto metanólico Extracto etanólico
Hermosillo 0.1798 0.3054
Caborca 0.1647 0.2283
San Carlos 0.2088 0.2816
Bahía de Kino 0.1074 0.1367
26
Variación de metabolitos secundarios
Actividad antiproliferativa de extractos
de A. subulata
Extracto
IC50 ± Desviación estándar (µg/mL)
HeLa LS-180 A549 ARPE-19
Metanólico Hermosillo 1.58 ± 0.01 8.81 ± 0.6 0.38 ± 0.01 248.45 ± 1.99
Etanólico Hermosillo 0.71± 0.08 8.77 ± 1.8 0.29 ± 0.08 89.3 ± 1.12
Metanólico Caborca 1.83 ± 0.1 8.79 ± 3.5 0.36 ± 0.05 306.79 ± 14.50
Etanólico Caborca 0.86 ± 0.1 3.90 ± 0.02 0.23 ± 0.07 143.7 ± 2.19
Metanólico San Carlos 1.21 ± 0.11 10.23 ± 1.6 0.40 ± 0.08 502.48 ± 5.72
Etanólico San Carlos 0.85 ± 0.06 6.76 ± 1.2 0.37 ± 0.07 114.07 ± 1.39
Metanólico Bahía de Kino 1.34 ± 0.54 8.30 ± 1.7 0.62 ± 0.13 94.57 ± 14
Etanólico Bahía de Kino 0.85 ±0.01 7.76 ± 0.2 0.38 ± 0.02 120.45 ± 1.34
Doxorrubicina 3.18±0.02 3.80±0.02 0.96±0.01 1.02 ± .12
27
Variación de metabolitos secundarios
PCA con los diferentes extractos de A.subulata utilizando
espectrometría de masas
A' - Extracto etanólico Caborca
B' - Extracto etanólico San Carlos
C' - Extracto etanólico Bahia de Kino
D' - Extracto etanólico Hermosillo
E' - Extracto metanólico Caborca
F' - Extracto metanólico San Carlos
G' - Extracto metanólico Bahia de Kino
H' - Extracto metanólico Hermosillo
28
Etanólico Caborca
>C3OGP
>A. antiproliferativa
Università degli Studi di Perugia Dipartamento di Scienze
FarmaceuticheEnero-Julio, 2015
Dra. Maria Carla Marcotullio
21
(López y Hinojosa 1988; Alarcón, 2005; Watson y cols., 2008)
Ibervillea sonorae (wareke)
Diabetes
Cancer
InflammationAnti-
rheumatic
Antibiotic
Arthritis
22
Triterpenos de Ibervillea sonorae con actividad antiproliferativa.
1 (kinoína A), 2 (cucurbitacina IIb).
1 2
23
* 23,24-Dihidrocucurbitacina F
* Hemslecin B (Hemsleya amabilis)
Evaluación de la Actividad Antiproliferativa de Triterpenos de Ibervillea sonorae
Líneas Celulares IC50 (µM)
Compounds A549 HeLa LS-180 RAW 264.7 PC-3 SiHa L-929
KAa 40 ± 5 18 ± 4 - 61.5 ± 5 23.1 ± 2.3 100 (4.1) ND
CIIb b 2.8 ± 0.1 2.3 ± 0.1 9.4 ± 0.2 16.9 ± 0.6 ≤12 34 ± 0.2 ND
CAPEc 72 ± 2 63 ± 1 - 5.5 ± 3 - - 49 ± 5
IC50 representa la media y la desviación estándar (± SD; n = 3) de tres experimentos independientesaKA: kinoína A, bCIIb: Cucurbitacina IIbcCAPE fue utilizado como control positivo, ND: IC50 no determinada a 100 (µM)
(Torres y cols., 2015)24
25
Capacidad Inductora de Apoptosis de Cucurbitacina IIb en HeLa
Tiempo
H
Compuesto a(FITC−/PI−) b(FITC-/PI+) c(FITC+/PI-) d(FITC+/PI+) Total
apoptosis %
24 H CIIb 24.2 ± 1.5 20.6 ± 2.1 7.8 ± 1.4 47.4 ± 3.0 55.5
CAPE 49.3 ± 2.4 25.5 ± 3.3 3.5 ± 0.9 21.7 ± 0.7 25.2
DOXO 2.5 ± 0.9 82.5 ± 4.4 2.3 ± 0.6 12.7 ± 2.7 15
DOXO (doxorubicina hidroclorhídrico) (0.3 µM) and CAPE ( éster fenetílico del ácido caféico) 70 µM fueron usados como control positivo de apoptosis.
a(FITC−/PI−): células viables b(FITC−/PI+): células muertas; c(FITC+/PI+): apoptosis temprana; d(FITC+/PI+): apoptosis tardía.
Evaluación de la Actividad Antitumoral
Establecimiento del Tumor
*10 días post-inyección
*(nu/nu) 4
semanas
1. Tratamiento
2. DMSO control
3. DOXO
CrecimientoV = (L x W2/2)
L= largo de tumor
W= ancho del tumor
(Wang y cols., 2007; Hahn y cols., 2009; Hahn y Akporiaye, 2011)
Antitumor Effect of Cucurbitacins fromIbervilleasonorae in HeLa Xenografts
0 3 6 9 12 150
25
50
75
100
Control
DOXO 1 (mg/kg)
CIIb1 (mg/kg)
CIIb 10 (mg/kg)
KA 1 (mg/kg)
KA 10 (mg/kg)
Days After Treatmen
% of
Tumo
r Dev
elopm
ent
91.
9
62.
6 69.
583.
3 88.
2
Antitumoral Effect of Cucurbitacins fromIbervillea sonorae
ControlDOXO KA KA CIIb CIIb0
25
50
75
100Control
DOXO 1 (mg/kg)
KA 1 (mg/kg)
KA 10 (mg/kg)
CIIb 1 (mg/kg)
CIIb 10 (mg/kg)
Treatments
% of
Tumo
r Deve
lopme
nt
Efecto Antitumoral de Cucurbitacinas de Ibervillea sonorae
28
A n t i t u m o r a l E f f e c t o f T r i t e r p e n s f r o m
Ib e r v i l l e a s o n o r a e i n H e L a X e n o g r a f t s
Control DOXO KA KA CIIb CIIb0
5 0
1 0 0
1 5 0C o n t r o l
D O X O 1 ( m g / k g )
K A 1 ( m g / k g )
K A 1 0 ( m g / k g )
C IIb 1 ( m g / k g )
C IIb 1 0 ( m g / k g )
T r e a t m e n t s
% o
f W
eig
ht
R
ed
uc
tio
n
Efecto Antitumoral de Cucurbitacinas de Ibervillea sonorae