Presentación de PowerPoint - Red farmoquimicos...PROYECTO DE REDES TEMÁTICAS UNESP UNISON...

UNIVERSIDAD DE SONORADIVISIÓN DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y DE LA SALUD

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS QUÍMICO-BIOLÓGICAS

“Activida Biológica y productos naturales

de plantas de la etnofarmacopea

sonorense”

Dr. Ramón Enrique Robles ZepedaCuerpo Académico: Biología y Bioquímica

[email protected]

UNIVERSIDAD DE SONORADIVISIÓN DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y DE LA SALUD

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS QUÍMICO BIOLÓGICAS

“ACTIVIDAD ANTIPROLIFERATIVA DE CARDENOLIDOS

DE Asclepias subulata”

CUERPO ACADÉMICO CONSOLIDADO: BIOLOGÍA Y BIOQUÍMICA

Dra. Adriana Garibay Escobar (Líder)

Dra. Olivia Valenzuela Antelo

Dr. Carlos A. Velázquez Contreras

Dr. Eduardo Ruiz Bustos

Dr. Ramón Enrique Robles Zepeda

1) Bioquímica e inmunología de las enfermedades infecciosas y crónico degenerativas de mayor prevalencia regional.

2) Actividad biológica y bioquímica de productos naturales.

LGAC

Ventajas de los productos naturales4

México: 26,500 especies vegetales; 4,000 con uso

medicinal, 56 grupos étnicos

Sonora: 8 grupos étnicos, población 117 mil, 450

plantas medicinales registradas.

Huerta, 1997; Lopéz e Hinojosa, 1988; Ocegueda et al, 2005

Ventajas de los productos naturales

Arterolan: Sintético

Gran diversidad

de estructuras

Historia biológica

Mayor complejidad

Ensamblaje de policétidos

VrtA (NR-PKS)

Hidroxilación

VrtE (citocromo P450)

VrtH (oxidasa flavin dependiente)

Unidades iniciales

VrtB (acil-CoA ligasa)

VrtJ (aldolsa)

VrtI (dioxigenasa)

Ciclización tipo Claisen

VrtG (esterasa)

Ensamblaje y ciclización

VrtC (preniltransferasa)

VrtD (ageranil-PP sintasa)

VrtK (citocromo P450)

O-metilación

VrtF (metiltranferasa)

Bomba de flujo VrtL

Taxol: Natural

Lahlou, M. 2013. The Sucess of Natural Products in Drugs Discovery. Pharmacol. Pharm. 4: 17-31..

Productos naturales

60% de las drogas usadas para

el tratamiento contra el cáncer

han sido aisladas de productos

naturales*

4

Descubrimiento de fármacos de productos naturales

Muestra inicial

bioactiva Concentrado

bioactivo Compuesto

bioactivo puro Nuevo

compuesto Principio

potencial Desarrollo del

candidato

Experimentos de

procesamientoFraccionamiento

biodirigido Determinación

estructuralSAR y derivados

Química medicinal

Identificación de

compuestos

conocidos

Cantidad de compuesto

requerido 1-10 µg 100 g1-10 g1-10 mg

Koehn, F., Carter, G. 2005. The evolving role of natural products in drug discovery. Nat. Rev. Drug. Discov. 4: 206-218.

Mecanismos de

acción

Uso de información

etnobotánica

6

Asclepias subulata

Reino Plantae

Phylum Magnoliophyta

Clase Magnoliopsida

Orden Gentianales

Familia Asclepiadaceae

Género Asclepias

Epíteto subulata

Autor del nombre Decne., 1844

7

Caracterizar químicamente las sustancias con actividad

antiproliferativa derivadas de los extractos metanólicos de

Asclepias subulata, así como determinar los mecanismos de

muerte celular que estas pueden activar in vitro

Objetivos de la Etapa 1

OCH3

OH

O

O

OH OHC

OH

CH3

OO

8

Planta

Obtención del

extracto

metanólico

Fraccionamiento

con solventes

Purificación de

sustancias

Medición de la

actividad

antiproliferativa

Cultivos

celulares

Caracterización

de sustancias

Eventos de

apoptosis

Métodos de investigación9

Resultados del estudio biodirigido10

Extracto o fracción Líneas celulares murinas (IC50*)

M12.C3.F6 RAW 264.7 L929

Extracto metanólico 80.9 ± 1.2a 188.4 ± 1.1b 245. 4 ± 1.1c

Extracto o

fracción

Líneas celulares humanas (IC50*)

HeLa A549 PC-3 LS 180 ARPE-19

Extracto

metanólico

8.7 ± 1.3b 0.38 ± 0.01a 16.3 ±1.2 c 15.6 ±1.3 c 141.0 ±1.2d

*Suffness, y Pezzuto, 1990. Assays related to cancer drug discovery. En Methods in Plant Biochemistry: Assays for Bioactivity. Academic Press, London, 71–133.

Valores IC50 NCI*

Extracto: ≤30 μg/mL

* Concentración inhibitoria del 50%(a-d) Valores significativamente diferentes (p<0.05)

Actividad antiproliferativa del extracto metanólico

10

5

1

4

2

3

8

7

9

6

13

14

12

11

17

16

152'

1'

3'

O

4'

5'

CH36'

OH

O

O

OH OHC19

OH

OH

CH318

OH

20

21

22

O 23O

OCH3

OH

O

O

OH OHC

OH

CH3

OO

10

5

1

4

2

3

8

7

9

6

13

14

12

11

17

16

15

OHC19

OH

CH318

O4'

5'

O

1'

2'

3' OH

OHOH

6'OH

20

21

22

O 23O

CH3

OH

CH3

OO

OH

OHOH

OH

OO

(1) (2)

(3) (4)

Corotoxigenina 3-O-glucopiranósido Desglucouzarina

12,16-dihidroxicalotropina Calotropina

Compuestos caracterizados12

Valores de IC50

Compuesto: ≤4 μg/mL

Compuestos Línea celular IC50*( µM)

RAW 264.7 ARPE-19 A549 LS 180 PC-3

12,16-dihidroxicalotropina ND ND 2.48 ± 1.13a 5.62 ± 2.12a 11.7 ± 2.48b

Calotropina 271.62 ± 2.25e 149.30 ± 2.07d 0.013 ± 0.002a 0.06 ± 0.04b 0.41 ± 0.11c

Corotoxigenina 3-O-

glucopiranósido

ND ND 2.64 ± 0.30 3.15 ± 0.44 6.62 ± 0.42

Desglucouzarina ND ND 0.90 ± 0.02a 6.57 ± 1.34b 9.68 ± 0.58b

Doxorrubicina 0.63 ± 0.08a 1.02 ± 0.12a 1.78 ± 0.12a 6.99 ± 0.21b 3.18 ± 0.31a

* Concentración inhibitoria del 50%

ND: No determinada(a-e) Valores significativamente diferentes (p<0.05)

Actividad antiproliferativa de las sustancias aisladas13

**

*

*

**

** * *

*

*

* *

* *

*

• Externalización de la

fosfatidilserina

Eventos de la apoptosis inducidos por los GC14

• Despolarización de la membrana

mitocondrial

• Activación de la caspasa 3

Activación de la

APOPTOSIS

Los tratamientos se dieron con concentraciones cercanas a la IC50 por 12 horas y se utilizó 100 µM de CAPE como control positivo.

* Significancia estadística con base en comparación con células control (DMSO) para cada condición, p<0.05

• Activación de las caspasas iniciadoras

Eventos de la apoptosis inducidos por los GC15

**

*

*

*

*

*

** *

Caspasa-8 Caspasa-9

UANLUniversidad de

Barcelona

PROYECTO DE REDES

TEMÁTICAS

UNESP

UNISON

Generación del fitofármaco de A. subulata21

Variación de metabolitos secundarios

Abiótico

BióticoHerbívoros

Patógenos

Protección

Temperatura

Nutrientes

pH Metales

pesados

Luz

Humedad

Metabolitos

secundarios • Fármacos

Parásitos

Lahlou, M. 2013. The Sucess of Natural Products in Drugs Discovery. Pharmacol. Pharm. 4: 17-31.

22


San Carlos Bahía de KinoCaborcaHermosillo

HERMOSILLO CABORCA SAN CARLOS BAHÍA DE KINO

Rango de

precipitación100 – 600 mm 0 – 500 mm 100 – 600 mm 200 – 1500 mm

Clima

Muy seco

semicálido

(51.29%)

Muy seco

semicálido

(95.68%)

Muy seco muy

cálido (63.83%)

Muy seco muy

cálido

Compendio de información geográfica municipal de los Estados Unidos Mexicanos, Instituto Nacional de Estadística y Geográfica (2010).

Dirección General Adjunta de Oceanografía, Hidrografía y Meteorología.

23


Método de cuantificación para los GC

de extractos de A. subulata

Corotoxigenina 3-O-

glucopiranósido

µg de compuesto/mg de extracto

Extracto metanólico Extracto etanólico

Hermosillo 0.2573 0.4174

Caborca 0.3429 0.4437

San Carlos 0.3816 0.3946

Bahía de Kino 0.3455 0.4147

25


Calotropina

µg de compuesto/mg de extracto

Extracto metanólico Extracto etanólico

Hermosillo 0.1798 0.3054

Caborca 0.1647 0.2283

San Carlos 0.2088 0.2816

Bahía de Kino 0.1074 0.1367

26


Actividad antiproliferativa de extractos

de A. subulata

Extracto

IC50 ± Desviación estándar (µg/mL)

HeLa LS-180 A549 ARPE-19

Metanólico Hermosillo 1.58 ± 0.01 8.81 ± 0.6 0.38 ± 0.01 248.45 ± 1.99

Etanólico Hermosillo 0.71± 0.08 8.77 ± 1.8 0.29 ± 0.08 89.3 ± 1.12

Metanólico Caborca 1.83 ± 0.1 8.79 ± 3.5 0.36 ± 0.05 306.79 ± 14.50

Etanólico Caborca 0.86 ± 0.1 3.90 ± 0.02 0.23 ± 0.07 143.7 ± 2.19

Metanólico San Carlos 1.21 ± 0.11 10.23 ± 1.6 0.40 ± 0.08 502.48 ± 5.72

Etanólico San Carlos 0.85 ± 0.06 6.76 ± 1.2 0.37 ± 0.07 114.07 ± 1.39

Metanólico Bahía de Kino 1.34 ± 0.54 8.30 ± 1.7 0.62 ± 0.13 94.57 ± 14

Etanólico Bahía de Kino 0.85 ±0.01 7.76 ± 0.2 0.38 ± 0.02 120.45 ± 1.34

Doxorrubicina 3.18±0.02 3.80±0.02 0.96±0.01 1.02 ± .12

27


PCA con los diferentes extractos de A.subulata utilizando

espectrometría de masas

A' - Extracto etanólico Caborca

B' - Extracto etanólico San Carlos

C' - Extracto etanólico Bahia de Kino

D' - Extracto etanólico Hermosillo

E' - Extracto metanólico Caborca

F' - Extracto metanólico San Carlos

G' - Extracto metanólico Bahia de Kino

H' - Extracto metanólico Hermosillo

28

Etanólico Caborca

>C3OGP

>A. antiproliferativa

Università degli Studi di Perugia Dipartamento di Scienze

FarmaceuticheEnero-Julio, 2015

Dra. Maria Carla Marcotullio

21

(López y Hinojosa 1988; Alarcón, 2005; Watson y cols., 2008)

Ibervillea sonorae (wareke)

Diabetes

Cancer

InflammationAnti-

rheumatic

Antibiotic

Arthritis

22

Triterpenos de Ibervillea sonorae con actividad antiproliferativa.

1 (kinoína A), 2 (cucurbitacina IIb).

1 2

23

* 23,24-Dihidrocucurbitacina F

* Hemslecin B (Hemsleya amabilis)

Evaluación de la Actividad Antiproliferativa de Triterpenos de Ibervillea sonorae

Líneas Celulares IC50 (µM)

Compounds A549 HeLa LS-180 RAW 264.7 PC-3 SiHa L-929

KAa 40 ± 5 18 ± 4 - 61.5 ± 5 23.1 ± 2.3 100 (4.1) ND

CIIb b 2.8 ± 0.1 2.3 ± 0.1 9.4 ± 0.2 16.9 ± 0.6 ≤12 34 ± 0.2 ND

CAPEc 72 ± 2 63 ± 1 - 5.5 ± 3 - - 49 ± 5

IC50 representa la media y la desviación estándar (± SD; n = 3) de tres experimentos independientesaKA: kinoína A, bCIIb: Cucurbitacina IIbcCAPE fue utilizado como control positivo, ND: IC50 no determinada a 100 (µM)

(Torres y cols., 2015)24

25

Capacidad Inductora de Apoptosis de Cucurbitacina IIb en HeLa

Tiempo

H

Compuesto a(FITC−/PI−) b(FITC-/PI+) c(FITC+/PI-) d(FITC+/PI+) Total

apoptosis %

24 H CIIb 24.2 ± 1.5 20.6 ± 2.1 7.8 ± 1.4 47.4 ± 3.0 55.5

CAPE 49.3 ± 2.4 25.5 ± 3.3 3.5 ± 0.9 21.7 ± 0.7 25.2

DOXO 2.5 ± 0.9 82.5 ± 4.4 2.3 ± 0.6 12.7 ± 2.7 15

DOXO (doxorubicina hidroclorhídrico) (0.3 µM) and CAPE ( éster fenetílico del ácido caféico) 70 µM fueron usados como control positivo de apoptosis.

a(FITC−/PI−): células viables b(FITC−/PI+): células muertas; c(FITC+/PI+): apoptosis temprana; d(FITC+/PI+): apoptosis tardía.

Evaluación de la Actividad Antitumoral

Establecimiento del Tumor

*10 días post-inyección

*(nu/nu) 4

semanas

1. Tratamiento

2. DMSO control

3. DOXO

CrecimientoV = (L x W2/2)

L= largo de tumor

W= ancho del tumor

(Wang y cols., 2007; Hahn y cols., 2009; Hahn y Akporiaye, 2011)

Antitumor Effect of Cucurbitacins fromIbervilleasonorae in HeLa Xenografts

0 3 6 9 12 150

25

50

75

100

Control

DOXO 1 (mg/kg)

CIIb1 (mg/kg)

CIIb 10 (mg/kg)

KA 1 (mg/kg)

KA 10 (mg/kg)

Days After Treatmen

% of

Tumo

r Dev

elopm

ent

91.

9

62.

6 69.

583.

3 88.

2

Antitumoral Effect of Cucurbitacins fromIbervillea sonorae

ControlDOXO KA KA CIIb CIIb0

25

50

75

100Control

DOXO 1 (mg/kg)

KA 1 (mg/kg)

KA 10 (mg/kg)

CIIb 1 (mg/kg)

CIIb 10 (mg/kg)

Treatments

% of

Tumo

r Deve

lopme

nt

Efecto Antitumoral de Cucurbitacinas de Ibervillea sonorae

28

A n t i t u m o r a l E f f e c t o f T r i t e r p e n s f r o m

Ib e r v i l l e a s o n o r a e i n H e L a X e n o g r a f t s

Control DOXO KA KA CIIb CIIb0

5 0

1 0 0

1 5 0C o n t r o l

D O X O 1 ( m g / k g )

K A 1 ( m g / k g )

K A 1 0 ( m g / k g )

C IIb 1 ( m g / k g )

C IIb 1 0 ( m g / k g )

T r e a t m e n t s

% o

f W

eig

ht

R

ed

uc

tio

n

Efecto Antitumoral de Cucurbitacinas de Ibervillea sonorae

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