Post on 08-Apr-2016
Bacterias anaerobiasIdentificaciónLiliana Fernández CanigiaLab. Domecq y LafageHospital Alemán
lfcanigia@labdl.com.ar
Carrera de especialistas- Universidad de San Luis- Agosto 2013
Cultivo de anaerobios: Limitaciones técnicas
Bacterias fastidiosasRequerimientos culturales
especiales◦Atmosfera (<1% O2)◦Nutrientes◦Tiempo de desarrollo◦Metabolismo (algunos inactivos)
Cultivo de anaerobios: Muestra
Características macroscópicas: aspecto, olor pútrido, fluorescencia, granos de “azufre”, etc
Observación microscópica: flora polimicrobiana, leucocitos, orienta terapia empírica, etc.
Diagnóstico microbiológico:Medios
Medios sólidos (placa) NO selectivos: (Agar base enriquecido Brucella, Columbia, Schaedler, etc)◦ Agar Base + Vit K (1 mg/ml) + Hemina (5
mg/ml) + sangre lacada al 5% (BHKA)Medios sólidos (placa) selectivos:
◦ BHKA + AKA (30 a 50 µg/ml)◦ BHKA + VAN (5 µg/ml)◦ Otros: BE, AYH, etc
Medios líquidos: Resguardo (“Backup”)◦ Caldo BHI, tioglicolato suplementado con
cisteína, Vit K y hemina:
Diagnóstico microbiológico:Cultivo
Utilizar medios frescos, recientemente preparados o pre-reducidos
Procesar rápidamenteEvaluar qué microorganismos
buscamos para elegir el medio: suplementos específicos
Cultivo de anaerobios: Atmósfera
Métodos para generar atmósfera anaerobia: ◦ Mezcla de gases: Se utiliza una mezcla compuesta por
5-10% H2, 5-10% CO2 y 80 a 90% de N2, ◦ Generadores comerciales: Hay diferentes sistemas
comerciales: Con catalizador (Gas Pack, BBL; Anaerobic Gas generator,
Oxoid): BH4Na y ácido cítrico y una tableta de HCO3Na para generar H2 y CO2
Sin catalizador : mezcla de reactivos que fijan el O2 y generan CO2. Activados con agua: Anaerocult, Merck; Britania. Activan al contacto con el aire: Anaerogen, Oxoid; Key Scientific, Mitsubishi; Genbox, Biomerieux
Cultivo de anaerobios: Atmósfera
Sistemas de incubación: a) Jarras anaerobiasb) Cámara anaerobiac) Bolsas anaerobias
Cultivo de anaerobios: Incubación - Controles
Incubación:◦ al menos 48 hs a 35-37ºC, hasta 5 a 7 días. ◦ Atmósfera anaerobia (< 1% O2)
Control de anaerobiosis◦ Indicadores de Ox-Red: resarzurina, azul
de metileno ◦ Recuperación de anaerobios estrictos: F.
nucleatum, BGN pigmentados, etc.
Cultivo de anaerobios: Generadores comerciales
Bacterias anaerobiasIdentificación: Gram-negativos y positivos
Identificación de Anaerobios: Consideraciones clínicas y de diagnóstico
Infecciones polimicrobianas (> 5 mo)
Sensibilidad a los antimicrobianos relativamente predecible
Tratamiento basado en drenaje y debridamiento
Infecciones mediados por toxinasTiempo de respuesta del
laboratorio
Identificación de Anaerobios: Identificamos?
Infecciones severas por anaerobios (bacteriemias, osteomielitis, empiemas, abscesos hepáticos, de cabeza y cuello, actinomicosis, etc)
Reconocimiento del foco primarioSensibilidad no tan predecible y
asociada a especie (Bacteroides fragilis multirresistentes aislado de bacteriemia. Wareham et al. CID, 2005:40)
Asociación de especie a factores de virulencia (Porphyromonas gingivalis asociada a periodontitis, B. fragilis enterotoxigenico asociados a bacteriemia)
IDENTIFICACION DE BACTERIAS ANAEROBIAS: Identificamos?
Fines epidemiológicos Estudios de patogenicidad Descripción de nuevos patógenos Asociación a infecciones Resistencia antibiótica
Identificación de Anaerobios: Estrategia
Identificación presuntiva
Identificación definitiva: Métodos moleculares
Identificación de Anaerobios: Identificación presuntiva
Características macroscópicas
Características microscópicas
Pruebas básicas, rápidas especies (pruebas bioquímicas convencionales y enzimas preformadas)
Identificación de Anaerobios: Identificación definitiva
Mayor número de pruebas convencionales y/o enzimáticas
Métodos comercialesCromatografía Gas-líquidoMétodos moleculares: genómica y proteómica
Descripción macroscópica
Coloración de Gram
Prueba de toleranciaal oxígeno (CA)
Procedimiento a seguir con cada colonia:
CULTIVO DE ANAEROBIOS: Identificación
CULTIVO DE ANAEROBIOS: ¿Qué es la prueba de tolerancia al Oxígeno? (Control aerobio)
Subcultivo en agar chocolate de la colonia en estudio
Incubación en atmósfera AEROBIA enriquecida en CO2 (lata con vela) a 37ºC, 24 a 72 hs.
Hacer por lo menos dos veces con cada colonia y al menos 3 con cocos gram-positivos y microcolonias en general.
Identificación de Anaerobios: Pruebas especialesDiscos de potencia especial: Vc 5 ug, Co
30 ug, Kana 1000 ug (bgn)Desarrollo en SPS (5%) y sensibilidad al
metronidazol (10µg) (cgp) (P. anaerobius)
Desarrollo en bilis con discos o pastillasProducción de Indol (spot) CAMP reversa (C. perfringens)Producción de lipasa y lecitinasa (bgn y
bgp esporulados)
1- Bacilos gram negativos: Discos potencia especial :Vc 5µg+ Cs 10µg + Ka 1000 µgIndolBilisNitratoEsculinaCatalasa
Gram
TablasEspecíficas
4- Cocos gram positivos:
Vc 5µg+ Cs 10µg SPS Metronidazol (5µ)
3- Cocos gram negativos:
Vc 5µg+ Cs 10µg NitratoFluorescencia (UV)
2- Bacilos gram positivos:No esporulados:
CatalasaNitratoIndol
Esporulados:GlucosaCAMP reversa GelatinaUreaLipasa LecitinasaIndol
IDENTIFICACION PRESUNTIVA
IDENTIFICACION DE BACTERIAS ANAEROBIAS Pruebas básicas
Caldo BHI con extracción
SIM u otros medios para anaerobios
Spot
Pastillas OxgallDesarrollo en
caldoDiscos
preparados
Indol Bilis
IDENTIFICACION DE BACTERIAS ANAEROBIAS Pruebas básicas
No requieren el desarrollo del microorganismo (no se incuban en anaerobiosis)
Son pruebas rápidasRequieren mucho inóculoPuede haber variabilidad entre métodos
Enzimas preformadas
IDENTIFICACION DE BACTERIAS ANAEROBIAS Pruebas básicas
Sistemas de identificación rápida◦Sustratos cromogénicos (Pastillas
DIATABS)◦Sistemas comerciales: API ZYM, RAPID
ID ANA II, Rapid ID32A, etc.◦Sustratos fluorogénicos: 4-metil-
umbeliferona derivados (SIGMA)
Enzimas preformadas
IDENTIFICACION DE BACTERIAS ANAEROBIASPruebas básicas
Desarrollo en Púrpura de bromo-cresol, verde timol u otro indicador(incubación en anaerobiosis)
Difícil de ver punto final: agregado de colorante posterior y/o lectura de pH
El microorganismo tiene que ser fuerte/moderado fermentador
El microorganismo debe desarrollar bien en el medio que se utiliza
Control de pureza Los azúcares son caros
Fermentación de azúcares
Identificación de Anaerobios: Patrones de discos de potencia especial
Microorganismo Vc Kn Co Bi SPS MTZGram-negativos R1 R V R
Bacteroides grupo fragilis y géneros relacionados
R R R R
Prevotella spp. R RS S/R S
Porphyromonas spp. S R R S
Fusobacterium spp.2 R S S S
Bacteroides grupo ureolyticus3 R S S S
Veillonella spp. R S S
Gram-positivos S4 V R
Cocos gram-positiivos S V R S RS,5 S
Clostridium spp. S SR R
1- Porphyromonas spp. son Van S. 2- Nitrato negativo, 3- incluye Campylobacter spp. 4- Algunas cepas de lactobacillus y la mayoría de Clostridium inocum R a vancomicina 5µg). 5- Peptostreptococcus anaerobius S. Adaptada de: Jousimies-Somer HR, et al. Anaerobic Baberiology Manual, 6th edition. 2002
1- Bacilos gram negativos: Discos potencia especial :Vc 5µg+ Cs 10µg + Ka 1000 µgDesarrollo en BilisIndolNitratoEsculinaCatalasa (15%)Enzimas preformadasUrea
Gram
TablasEspecíficas
IDENTIFICACION PRESUNTIVA
Bacilos gram-negativos: Discos de potencia especial
Bacteroides grupo fragilis y géneros relacionados: Parabacteroides, Alistipes, Odoribacter
CoVc
Kn Bi
Prevotella spp.PigmentadasNo pigmentadas
Taxo
nom
ía d
e la
s bac
teria
s an
aero
bias
Género (especie tipo)
Morfolog.
Sensible a Movilidad
Pigmento
Des. 20%bilis
Catalasa
Indol
Nitrato
Ferm. H.
carbono
Vc Kn Co
Bacteroides sensu stricto (B. fragilis)
corto R R R - - + - v - +
Alistipes (A. putredinis)
corto R R R - v v v v - +
Odoribacter (O. splanchnicus)
pleom. R R R - - v v + - v
Porphyromonas (P. asaccharolytica)
v S R R - + - v v - v
Parabacteroides (P. distasonis)
corto R R R - - + v - - +
Tannerella (T. forsythia)
pleom. R S S - - - v - - -
Prevotella (P. melaninogenica)
c-b R v v - v - - v - +
Fusobacterium (F. nucleatum)
v R S S - - v - v - v
Leptotrichia (L. buccalis)
v R S S - - - v - - +
Dialister (D. pneumosintes)
cocoide R S v - - - - - - -
Selenomonas (S. sputigena)
curvo R S v + - - - + + +
Sutterella (S. wadworthensis)
recto R S S - - v - v v -
Bilophila (B. wadsworthia)
recto R S S - - + + + + -
Desulfovibrio (D. desulfuricans)
curvo R S R + + v v v v -
Campylobacter(C. curvus)
curvo R S S + - v - - + -
Anaerobiospirillum (A. succiniproducens)
espiral, largo
R S v + - v - - - +
29
Bacteroides grupo fragilis: B. fragilisMorfología: cocobacilo gram-negativos, pueden ser
capsulados.Características culturales: Anaerobio aerotolerante, desarrolla en 15 a 20 hs en agar sangre sin suplementos. Identificación:
◦ Discos de potencia especial: ColistinR, KanaR, VanR .◦ Desarrolla en Bilis al 20%◦ Sacarolíticos
Otras características: Resistencia a -lactámicos y otros antianaeróbicos- Infecciones abdominales y bacteriemias
27/04/2023 L. Fernández Canigia 30
Bacteroides grupo fragilisB. fragilisB. thetaoiotaomicronB. vulgatusB. nordiiB. salyersiae
Parabacteroides: P. goldsteinii – P distasonis – P. merdae , P. gordonii, P. johnsonii.Int J Syst Evol Microbiol (2006)
Könönen E., Wade W., Citron D. en Manual of Clinical Microbiology 10 ed. Versalovic, Carrol, Funke, Jorensen J, Landry M., Warnock D. 2011
B. caccaeB. uniformisB. ovatusY … total 23
ESPECIES!
Bacteroides fragilis
B. thetaiotaomicron
Porphyromonas spp.Co
VcKn
Bi
asacarolíticas
Bacilos gram-negativos: Discos de potencia especial
Otros Bacilos gram-negativos (Bilis v)
Fusobacterium spp. (Bilis v)
CoVc
KnBi
Variable
Bilis S
nucleatum
Bacilos gram-negativos: Discos de potencia especial
Otros BGN Anaerobios (asacarolíticos) Campylobacter spp. /Bacteroides ureolyticus
Identificación rápida de Bacteroides grupo fragilis (VcR, KR, CoR, BiR)
Microorganismo Catalasa Indol Esculina -fuco l-arabinosa
B. fragilis + - + + -B. caccae -+ - + + +P. distasonisa + - + - +-
P. merdaea - - + - -B. vulgatus -+ - + + +B. thetaiotaomicronb + + + + +a- P. distasonis es -glucuronidasa negativa y catalasa positiva, P. merdae es -glucuronidasa positiva y catalasa negativa. b- otras especies productoras de indol son B. grupo fragilis : ej B. ovatus y B. uniformis y también Odoribacter splanchnicus que es asacarrolítico
Adaptada de: Jousimies-Somer HR, et al. Anaerobic Baberiology Manual, 6th edition. 2002-Könönen E., Wade W., Citron D. en Manual of Clinical Microbiology 10 ed. Versalovic, Carrol, Funke, Jorensen J, Landry M., Warnock D. 2011
Identificación rápida de Prevotella spp. NO pigmentadas (VcR, KR, CoR/S, BiS)
Microorganismo In Esculina -NAG -fuco -xyl Colistin
P buccae - + - - + SP. oris - + + + + RP. heparinolyticaa + + + + + R/SP. zoogleoformansa - + + + + R/SP. dentalisb - + + - V R/SP. grupo oralisd - + + + - R/SP. enoecac - V + + - RP. biviac - - + + - RP. disiens - - - - - R/S
a- Colonias se adhieren al agar, forma una masa viscosa en caldo. b- Prevotella dentalis forma colonias como gotas, c- P. enoeca es esculina variable y se aisla de cavidad oral, P. bivia es negativa, y ubicua (especialmente tracto genital), d- P. oralis, P. buccalis, P. veroralis y P. oulorum.
Adaptada de: Jousimies-Somer HR, et al. Anaerobic Baberiology Manual, 6th edition. 2002
Identificación rápida de Fusobacterium spp. (VcR, KS, CoS, BiV – Nitrato NG)
Microorganismo In Lip Esculina Oxgall ONPG Gram
F. nucleatum + - - - - Extremos fusiformes
F. necrophorum + + - - - Pleomórficos
F. varium + -+ - + - Bac.regulares
F. mortiferum - - -+ + + Pleomórficos, formas
redondeadas
Adaptada de: Jousimies-Somer HR, et al. Anaerobic Baberiology Manual, 6th edition. 2002
Identificación a nivel de grupo de microorganismos gram-positivos anaerobios
Microorganismo Vc Kn Co SPS Metro Esporo Lec/lip
Cocos gram-positivos S V R RS S - NC
Peptostreptococcus anaerobius S R R S S - NC
Clostridium spp S SR R NC + + V
Bacilos gram-positivos no esporulados
S ND R NC V - NC
Vc: vancomicina 5µg, Kn: kanamicina 1000 µg, Co: colistin 10 µg, Metro: metronidazol 10µg), Esporo: test de esporulación, Lec/lip: lecitinasa/lipasa, NC: no corresponde, ND: no determinado
Gram
TablasEspecíficas
4- Cocos gram positivos:SPS Metronidazol (5 µg)GlucosaLactosaADHPYRUREAFAL
IDENTIFICACION PRESUNTIVA
IDENTIFICACIÓN PRESUNTIVA GÉNEROV5µ
Co10µ
SPS5%
MTZ10µ O2
COCOS G (+) S R RS S S
GRAM POSITIVOS
Peptostreptococcus anaerobius (S) Parvimonas micra Peptococcus niger Finegoldia magna
Anaerococcus spp.Peptoniphilus spp.Gallicola spp.Murdochiella spp.
SPS = S
P. anaerobius
Gentileza Mirta Litterio, H. Garrahan
Gram
TablasEspecíficas
2- Bacilos gram positivos:
No esporulados: CatalasaNitratoIndol
Esporulados:Glucosa CAMP reversa Gelatina UreaLipasa LecitinasaIndol Enzimas
IDENTIFICACION PRESUNTIVA
Clostridium septicum
Clostridium perfringens
Bacilos gram-positivos esporulados (esporos rara vez se observan en materiales clínicos).
Sacarolítico y proteolítico. Inmóvil
Exotoxinas: colagenasas, hialuronidasas
Toxina (fosfolipasa C o lecitinasa): Dermonecrótica y hemolítica
L. Fernández Canigia27/04/2023
Streptococcus agalactiae
Clostridium perfringens
CAMP reversa (E:95%)
Lecitinasa Lipasa
Bacilos gram-positivos no esporulados
No esporulados◦ Actinomyces ◦ Propionibacterium◦ Eubacterium ◦ Bifidobacterium◦ Lactobacillus◦ Mobiluncus
Actinomyces israelii
Identificación en microbiología
Fenotipo Genotipo Patrón de proteínas
5495
.054
17.9
4470
.0
6264
.1
1083
5.4
7274
.5
7122
.5
4736
.2
9589
.7
7828
.2
8021
.2
8847
.6
8369
.5
1025
9.6
1005
1.3
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
4x10
Inte
ns. [
a.u.
]
5000 6000 7000 8000 9000 10000 m/z
Tesis doctoral- Liliana Fernández Canigia 49
P. intermedia/nigrescens◦ Identificación por
electroforesis de enzimas multilocus (MDH y GDH (Shah y Garbia 1992)
◦ SDS page, PCR, oligonucleotidos
Pigmento marrón a negro Vc R, CoS, KnR, BiS- In+, Lip +
P. intermedia- P. nigrescens- P. pallens- P. aurantiaca -P. falsenii
Cultivo en agar Brucella suplementado con hemina vitamina K y sangre
Gingivitis de la embarazada Diferentes grados de
enfermedad periodontal Otras infecciones odontógenas Infecciones de cabeza y cuello,
pulmonares, tracto genital, abdominales, PyPB
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Posición filogenética de especies del género Prevotella y su relación con Bacteroides y Porphyromonas. Árbol filogenético realizado con neighbor-joining utilizando secuencias de ARNr 16S. Shah et al. (2009)
P. falsenii (2009)P. aurantiaca (2010)
IDENTIFICACION: CONCLUSIONESBuena observación micro y macroscópicaSiempre hacer pruebas básicas de entrada
(patrones de sensibilidad de discos de antibióticos con potencia especial)
Utilizar pruebas no dependientes de cultivo como enzimas preformadas (inóculo alto)
Asegurarse buen desarrollo en pruebas de crecimiento.
La mayoría de las situaciones clínicas pueden resolverse con identificación fenotípica aunque sólo lleguemos a nivel de grupo o género.