CINTHYA PAOLA FERNÁNDEZ DE LA PEÑA

Electroforesis capilar (EC)

Historia

Arne Tiselius años 30’s: estudio de proteínas séricas

Nobel en 1948

Método de separación basado en la relación carga-tamaño entre los diferentes analitos en la muestra

Campo eléctrico (dc)

Separación de…

Proteínas

Enzimas

Hormonas

Anticuerpos

Ácidos nucleicos

Técnica

Inyección de muestra en solución amortiguadora (tubo o medio de soporte poroso y plano- papel o gel semisólido)

Aplicación de alto voltaje a lo largo del bufferDos electrodos

Generación de un campoImpulsa a los iones cargados a

migrar hacia uno de los electrodos

¿QUÉ ES?

Electroforesis capilar

Separación de moléculas

Carga

Hidrofobicidad

Estereoespecificidad

Tamaño

Ventajas sobre otras técnicas

Facilidad de operación

Bajo costo

Poder de resolución alto

(Magaña, 2010)

Generalidades

Segunda mitad de los 80’s

Produce separaciones de alta velocidad y alta resolución con vol. De muestra de 0.1-10nl

Las especies separadas son eluídas desde un extremo Utilización de detectores cuantitativos (similar a HPLC)

MOVIMIENTO DE IONESVELOCIDADES DE MIGRACIÓN

ALTURA DE PLATOPRINCIPIOS ELÉCTRICOS

FLUJO ELECTROOSMÓTICO

Fundamentos de las separaciones

electroforéticas

Movimiento de iones

Velocidad de migración de un ión dentro de un campo eléctrico se da por:

ν=μeE

μe: Movilidad electroforética

μe: directamente proporcional a la carga iónica del analito e inversamente proporcional a la fricción

Velocidades de migración

ν de migración de un ión depende de la fuerza del campo eléctrico aplicado

Campo eléctrico proporcional a la magnitud del voltaje aplicado, inversamente proporcional a la longitud sobre la que se aplica

ν=μe*V/L

Altura de plato en EC

Las separaciones en EC se describen similares a la cromatografía

N=μeV/2DD: Coeficiente de difusión del soluto

Resolución aumenta c/mayor número de platos

A mayor voltaje, mayor resolución

Principios eléctricos

Capilar: gran longitud, área transversal pequeña= mucho mayor resistencia de la solución interior

Voltajes mucho más altos, enfriamiento efectivo del capilar

Principios eléctricos

Voltajes de 100-500V/cm

Fuentes de potencia de alto voltaje de 10-25kV

Mejoras en ν y mayor resolución

100,000-200,000 platos vs. 5000-20,000 en HPLC

3,000,000 en ECZ o 10,000,000 para separaciones de polinucleótidos EC en gel

Flujo electroosmótico

Doble capa eléctrica en interfase sílice-solución

pH por encima de 3 carga negativa en pared de sílice por ionización de gpos. Silanol

Flujo de perfil plano

Electroferograma: parecido a cromatograma pero con picos más cortos

PREPARACIÓNINYECCIÓN

Muestra

Preparación de muestra

Razones Concentración Control electrolítico Proteínas Interferentes Materia sólida

Muestras biológicas inyectables directamente Orina Plasma (SDS)

Introducción de la muestra

Inyección electrocinética

Extremo del capilar sobre la muestra

Aplicación de voltaje

Migración iónica y FEO

Volumen controlado por duración de la inyección

Introducción de la muestra

Inyección por presión

Extremo del capilar sobre la muestra momentáneamente

Vacío en el extremo del detector

Cambio de presión

O elevando el extremo que contiene la mezcla (hidrodinámica)

Introducción de la muestra

Puntas de microinyección : capilares estirados

Vol. De muestra en pL

Estudio de aa y neurotransmisores de una sola célula

COLUMNACONDICIONES GENERALES

DETECTORESLECTURA

Instrumentación

Columna

Capilar de sílice fundida recubierto de poliimida

10-100μm de diámetro interno y 30-100cm longitud

Lleno con solución amortiguadora

Conecta entre sí dos recipientes con la misma solución amortiguadora y los electrodos de platino

Condiciones generales

Voltaje de 5-30kV (dc) a los dos electrodos

La polaridad generalmente separa cationes, pero se puede invertir para separar aniones

Volumen de muestra en nL

Detectores

Para espectrometría Absorción Fluorescencia Lentes térmicas Raman Quimioluminiscencia Espectrometría de

masas

Para electroquímica Conductividad Potenciometría Amperometría

Detector de flourescencia

Incremento de sensibilidad y selectividad para analitos flourescentes

Rayos láser para enfocar radiación excitadora en el capilar

Bajos límites de detección: 10 zeptomoles o 6000 moléculas

Electroforesis DetecciónElectroforesis

(Magaña, 2010)

Lectura

Separación de fragmentos marcados con fluorescencia

Comparación con un marcador de peso molecular

Fragmentos identificados con diferentes colores

(Magaña, 2010)

ECZEN GEL

ISOTACOFORESISISOELECTROENFOQUE

ELECTROCROMATOGRAFÍA

Tipos de EC

Electroforesis capilar de zona (ECZ)

Método más simple Tamaño y carga (se puede modificar con pH)

Analitos pequeños, Aa y péptidos

Antiinflamatorios215nm1. Naproxeno2. Ibuprofeno3. Tolmetina

(Skoog, 2008)

ECZ-Proteínas

pH: 2.7λ=214nm

22kV10μA

(Skoog, 2008)

Electroforesis capilar en gel

Matriz polimérica + Buffer Efecto tamiz

Tipos de geles Poliacrilamida Agarosa Metilcelulosa Alcohol polivinílico Óxido de polietileno Dextrano Polidimetilacrilamida Polietilenglicol

Isotacoforesis capilar

iso=igualtaco=velocidad

Migración depende de velocidad de c/u hasta formar las bandas

Las más rápidas Cerca de tampón conductor

Las más lentas Atrás tampón terminal

Isoelectroenfoque capilar

Separación de especies anfóteras Aa y proteínas

(Zwitterion)Variación de pH

(gradiente)Cátodo: Base fuerte

(NaOH)Ánodo: ácido fuerte

(H2PO3)Migración hasta

alcanzar pI(Skoog, 2008)

(Skoog, 2008)

Electrocromatografía capilar

Híbrido EC y HPLC80’s columna rellena y capilar electrocinética

micelar

(Skoog, 2008)

•Separación de 16 hidrocarburos policíclicos

•Capilar: 33cm y 75μm

•Fase móvil: Acetonitrilo en borato de sodio 4mM

•Fase estacionaria: Partículas de sílice octadecilsililadas 3μm

MEDICINABIOLOGÍA MOLECULAR

FORENSEDOPAJE

ANÁLISIS DE FÁRMACOS

Aplicaciones

Clínicas

Dos áreas del diagnóstico genético Secuenciación Análisis de fragmentos para

detección cuantitativa de dosis génica

Análisis de enfermedades hereditarias Aumento en la longitud por

número de repetidos Variación de la secuencia

Estudio de enfermedades poligénicas Hemocromatosis hereditaria Fibrosis cística Distrofia muscular de Duchenne-

Becker(Magaña, 2010)

Gene scan

Cuantifica fragmentos de DNA

Determina su tamaño comparación con un marcador de peso (se corre simultáneamente)

Cada muestra marcada con un dye diferente, localizado en el primer

Hasta 3 muestras diferentes en la misma reacción, siendo el dye lo que nos permitirá diferenciarlas

(Magaña, 2010)

Forense

Identificación de individuos: Agresores sexuales Asesinos Restos humanos Desastres naturales Guerras Pruebas de paternidad Linajes reales Análisis antropológicos Migraciones

(Magaña, 2010)

Forense

EC-MS y ECZ

Detección de residuos orgánicos e inorgánicos (parcialmente quemados)

Trazas de pólvora por arma de fuego (no limitante de tiempo)

(Magaña, 2010)

Dopaje

Análisis de orina Testosterona Opiáceos Barbitúricos Benzodiazepinas Anfetaminas Morfina

(Magaña, 2010)

Análisis de fármacos

Amitriptilina

Doxepin

Clorpromacina

Psilocibina

Cocaína

Canabinoides

Isómeros de metanfetaminas

16 drogas básicas en 15min(Magaña, 2010)

Referencias

Lunte, M; Radzik, D. (1996) Pharmaceutical and Biomedical Applications of Capillary Electrophoresis. Pergamon. USA

Magaña, J.; Arenas, M.; Gómez, R. (2009) La electroforesis capilar como una nueva estrategia en la medicina y el diagnóstico clínico. Revista médica de Chile. 137:946-956

Skoog, D.; Holler, J.; Crouch, S. (2008) Principios de análisis instrumental. Sexta edición. Cengage Learning. México

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