DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ORGÁNICA FACULTAD DE CIENCIAS UNIVERSIDAD DE CÁDIZ
MEMORIA DEL PERIODO DE INVESTIGACIÓN
ESTUDIO FITOQUÍMICO DE THAPSIA VILLOSA VAR VILLOSA
que presenta el Ldo. D. JUAN JOSÉ RUBAL LOBO para optar al Diploma de Estudios Avanzados
PUERTO REAL, SEPTIEMBRE 2003
INDICE 1-Introducción
1.1-Los productos naturales o metabolitos secundarios............................3
1.2-La familia de las umbelíferas...............................................................5
1.2.1-Descripción............................................................................5
1.2.2-Importancia de las umbelíferas..............................................6
1.3-El género Thapsia................................................................................6
1.3.1-Descripción............................................................................6
1.3.2-Taxonomía del género Thapsia.............................................7
1.4-Thapsia villosa var villosa.................................................................... 7
1.5-Objetivos...............................................................................................8
2-Antecedentes
2.1-Taxonomía de Thapsia villosa............................................................13
2.2-Usos populares y medicinales de Thapsia villosa..............................14
2.3-Compuestos previamente aislados....................................................15
2.4-El metiltioacrilato, el metiltiopropionato y el acrilato...........................22
3-Materiales y métodos
3.1-Material Biológico...............................................................................27
3.2-Extracción y aislamiento.....................................................................27
3.3-Técnicas Instrumentales.....................................................................28
4-Resultados
4.1- Aislamiento........................................................................................33
4.2-Descripción de los compuestos aislados............................................34
5-Conclusiones.....................................................................................................51
6-Bibliografía........................................................................................................55
7-Anexo de espectros..........................................................................................59
1.Introducción
Juan J. Rubal Estudio fitoquímico de Thapsia villosa
3
1.1 LOS PRODUCTOS NATURALES O METABOLITOS SECUNDARIOS
Los compuestos orgánicos aislados de organismos vivos pueden dividirse
en dos grupos, los metabolitos primarios, también llamados principios esenciales
- hidratos de carbono, lípidos, proteínas y nucleótidos -, comunes a todos los
seres vivos y cuya función es conocida; y los metabolitos secundarios, también
llamados productos naturales.
Los productos naturales tienen una distribución restringida en la
naturaleza, un determinado producto natural puede encontrarse en un grupo de
individuos normalmente relacionados; muchas de las veces estos individuos
pertenecen a un mismo género. Frecuentemente se encuentran casos en que
una sustancia orgánica se aísla exclusivamente de una única especie.
Si hay que destacar la producción de productos naturales en algún
organismo, sin duda hay que hacerlo en el reino vegetal. Debido a la escasísima
o nula movilidad de las plantas, han sido éstas las que más productos naturales
y con más diversas funciones han desarrollado, las plantas son capaces de
estimular o inhibir el crecimiento de otras plantas, de atraer insectos para la
polinización, de producir insecticidas, de producir sustancias con actividad “anti-
feedant”, etc. Aunque no siempre se conocen las funciones de los productos
naturales, éstos juegan un papel muy importante en la sociedad humana puesto
que poseen un amplio rango de actividades.
La historia de la humanidad ha estado ligada desde sus inicios al uso de
las plantas; se han encontrado que actúan como insecticidas, herbicidas,
repelentes, venenos, etc. No cabe duda que la aplicación más extendida, y la
que despierta mayor interés por su enorme importancia, es la medicinal. Se tiene
constancia del uso de extractos vegetales para curar enfermedades desde la
antigüedad. Un ejemplo es el árbol de las fiebres o quino – Cinchona officinalis –
usado por civilizaciones precolombinas para el tratamiento de la malaria; el
responsable de la actividad es un compuesto llamado quinina que no fue aislado
hasta el siglo XIX . Otro ejemplo es el uso extensivo de la corteza del sauce
blanco –Salix alba– a partir del siglo XVIII para bajar la fiebre, durante 100 años
se usó sin conocer al compuesto responsable; la salicilina. La salicilina fue
modificada por la empresa Bayer para mejorar su actividad. Primero se hidrolizó
el glucósido y se oxidó a ácido la posición bencílica dando lugar al ácido
Introducción
4
salicílico, tras estudiar la relación estructura actividad y en vista del sabor
amargo del ácido salicílico y salicilato inicialmente empleados se acetiló el
hidroxilo dando lugar al ácido acetilsalicílico más conocido hoy en día como
aspirina.
Figura 1.1
Hasta el siglo XIX no se comenzaron aislar los principios activos, éstos
se describían mediante la fórmula molecular y algunas propiedades químicas
básicas como la acidez.
En el siglo XX, para restar importancia a la dependencia de la fuente
natural se creo la necesidad de sintetizar los productos naturales, para ello es
necesario determinar sus estructuras. Primero se caracterizaron mediante
degradación, utilizando reacciones como la ozonólisis que permitía detectar la
presencia de dobles enlaces. En la segunda mitad del siglo XX se produce un
gran cambio en la química de productos naturales; aparecen las cromatografías
como técnicas de separación, se extiende el estudio de productos naturales a los
organismos marinos y se introducen en el laboratorio las técnicas espectros-
cópicas: IR, UV, RMN y EM.
Hoy en día los productos naturales siguen conservando una gran
importancia. A pesar del desarrollo de la medicina moderna, según la OMS la
O
NHO
H OHO
OH
OH OOH
H
OH
OHO
HO
OHO
O
O
Quinina
Salicilina
Ácido salicílico Ácido acetilsalicílico
Juan J. Rubal Estudio fitoquímico de Thapsia villosa
5
medicina tradicional aún cubre las necesidades sanitarias de un 80% de la
población mundial.
En la actualidad el estudio de productos naturales va encaminado al
“screening” o rastreo programado: estudio de la actividad potencial de extractos
de fuentes naturales, aislamiento de sustancias que se consideren responsables
de dicha actividad y ensayos programados de otras actividades y toxicidad.
Todo ello de forma paralela a la síntesis de las mismas sustancias y de análogos
estructurales que permitan estudios de relación estructura-actividad (QSAR,
“Quantitative Structure-Activity Relationship”)
1.2 LA FAMILIA DE LAS UMBELÍFERAS
La familia de las umbelíferas, también conocida como la familia del perejil
o de la zanahoria, comprende unas 3000 especies repartidas en 300 géneros.
Es posible encontrarlas en cualquier lugar del planeta pero la mayoría se
encuentran en zonas templadas del hemisferio Norte, sobre todo en zonas de
clima mediterráneo
1.2.1 DESCRIPCION
Algunas especies son arbustos o pequeños árboles que viven en
Sudamérica y el Pacífico Sur, pero la mayoría de umbelíferas son plantas
herbáceas anuales, bianuales o perennes. El tallo es articulado en nudos o
entrenudos portando hojas alternas y
en su mayoría divididas. La
característica más sobresaliente de la
familia es la inflorescencia en forma
de umbela, simple o compuesta. Una
umbela es un grupo de flores que
nacen de un mismo punto del tallo y
se elevan a una altura similar. La
palabra umbela proviene del latín Figura 1.2
Umbelas de Ferula Communis
Introducción
6
“umbellula” (diminutivo de “umbra”, sombra) que significa sombrilla. Las umbelas
pueden presentar una forma semiesférica como Ferula communis o plana como
la zanahoria (Daucus carota).
Las flores son bastante uniformes dentro de la familia, generalmente son
blancas o amarillas y pequeñas. Los frutos poseen una morfología característica
para cada género y especie por lo que se utilizan como carácter clave.
1.2.2 IMPORTANCIA DE LAS UMBELIFERAS
El hecho de poseer inflorescencias tan atractivas en forma de umbela
hizo que esta familia fuera la primera en ser reconocida como grupo de plantas.
Esta distinción ocurrió a finales del siglo XVII, en 1672 Robert Morrison publicó y
dirigió el primer estudio sistemático sobre este grupo de plantas.
El impacto de las umbelíferas no se restringe a su interés botánico. Los
griegos y romanos ya conocían estas plantas y su potencialidad; se cita que
Sócrates murió envenado por cicuta (Conium Maculatum), los romanos
empleaban Ferula assafoetida y el anís (Pimpinela anissum) como aromati-
zantes y remedio medicinal. En la actualidad las umbelíferas siguen siendo
importantes, los géneros Eryngium, Astrantia, Myrrhis, Aciphylla, Bupleurum y
Heracleum se usan como plantas ornamentales, anís y comino como especias,
perejil, apio y zanahoria se cultivan como hortalizas, etc.
1.3 EL GENERO THAPSIA
Perteneciente a la familia de las umbelíferas, es un pequeño género
nativo de la zona mediterránea. Su nombre fue dado por Plinio en recuerdo de la
isla de Thapsos donde abundaba Thapsia garganica, la especie más conocida
del género.
1.3.1 DESCRIPCION
Son plantas herbáceas perennes, su raíz es axonomorfa, y en algunos
casos napiforme. Los tallos son gráciles o robustos, glabros y con abundantes
restos fibrosos foliares en las bases. Las hojas inferiores son 1 a 4 pinnasectas,
Juan J. Rubal Estudio fitoquímico de Thapsia villosa
7
las superiores a menudo quedan reducidas a la vaina. Las umbelas son
compuestas, generalmente sin brácteas, las centrales mayores que las laterales
que en la mayor parte de los casos resultan ser estériles. El fruto es de contorno
elíptico con cuatro alas amplias.
1.3.2 TAXONOMIA DEL GENERO THAPSIA
El número de especies que componen este género depende mucho de la
fuente consultada, tres especies según Flora Europaea(2) (Thapsia garganica,
Thapsia maxima y Thapsia villosa), diecinueve nombres reconocidos por el IPNI
(Internacional Plant Names Index) y seis según Flora Ibérica(1) que es la
publicación más reciente. Las seis especies que componen el género según
Flora Ibérica son: Thapsia garganica, Thapsia villosa, Thapsia nitida, Thapsia
gymnesica, Thapsia minor y Thapsia transtagana. Esta diferencia en la
clasificación se basa en:
• Thapsia garganica y Thapsia transtagana se consideraban la misma
especie. Estudios quimiotaxonómicos(3) establecen que son dos especies
muy similares en cuanto a morfología, pero con diferente distribución
geográfica y composición química.
• Thapsia gymnesica(1) es la especie más recientemente descrita del
género (1991), es endémica de las Islas Baleares y Flora Europea la
consideraba intermedia entre Thapsia villosa y Thapsia garganica.
• Thapsia minor se consideraba una variedad de Thapsia villosa.
• Thapsia nitida es un basiónimo de Thapsia maxima, actualmente se
establece que existen 2 variedades(4).
Las plantas del género Thapsia son mayormente diploides, poseen todas
2n=22 cromosomas. La excepción es Thapsia villosa cuyo numero de
cromosomas es 2n=22, 33, 44, 66. e incluso 2n=11(5,6)
1.4 THAPSIA VILLOSA VAR VILLOSA
Conocida popularmente como zumillo o cañeja, es una hierba perenne de
70-190 cm de altura. Su tallo es robusto, 5-25 mm de diámetro. Las hojas
Introducción
8
basales presentan una vaina de 20-80 mm de anchura, muy desarrollada con un
peciolo hirto o velloso que rara vez es glabro. Las hojas son 1 a 3 pinnasectas
con los segmentos oblongos, divisiones de último orden de 8-32 mm de anchura,
tanto el haz como el envés son vellosos. Las umbelas tienen entre 9 y 29 radios
de 6 a 12 cm, subsemiesféricas a globosas sin bracteolas con 18-43 flores. Los
pétalos son ovobados, de un amarillo intenso, los frutos son elípticos de 9-15 x
6-11 cm, de color pardo a castaño, alas de 2-4 mm de anchura de amarillentas a
pardas. Posee 2n = 66 cromosomas. Se localiza en España, Portugal, Sur de
Francia y Noroeste de Marruecos.
Fig 1.3 T. villosa Fig 1.4 Hoja basal Fig 1.5 Frutos
1.5 OBJETIVOS
La especie Thapsia villosa var villosa ha sido usada por sus propiedades
medicinales como por otros usos, esto hace que la especie posea interés
etnológico.
Aunque esta especie fue estudiada en la década de los ochenta, nos
proponemos un estudio más detallado motivado por:
El gran interés que han despertado las especies de este género con el
aislamiento de sustancias con un actividad muy contrastada, caso de la
tapsigargina.
El gran debate que existe en la clasificación de las distintas especies de
este género, que exige una cooperación estrecha entre el trabajo de
Juan J. Rubal Estudio fitoquímico de Thapsia villosa
9
aislamiento de sustancias y los estudios de morfología botánica y
caracterización genética del material.
La disponibilidad de equipos y técnicas de resonancia magnética nuclear
que nos permitan llegar a metabolitos que en su momento no pudieron
ser detectados.
Los objetivos son:
• Hacer un estudio de los metabolitos secundarios presentes en Thapsia
villosa var villosa.
• De entre los compuestos aislados seleccionar aquellos que puedan tener
algún tipo de actividad biológica para la realización de ensayos
biológicos.
2.Antecedentes
Juan J. Rubal Estudio fitoquímico de Thapsia villosa
13
2.1 TAXONOMÍA DE THAPSIA VILLOSA
Thapsia villosa es la especie morfológicamente más compleja del género
Thapsia. En este género se distinguen distintas subespecies y variedades, las
cuales a su vez presentan formas intermedias que dificultan su identificación.
En la bibliografía botánica existe mucha confusión en la determinación
taxonómica de Thapsia villosa y especies relacionadas. Atendiendo a la
composición química de distintas muestras identificadas inicialmente como
Thapsia villosa según Flora Europea, un grupo de investigación danés(7)
establece que existen cinco tipos repartidos en dos grupos I y II. En la tabla 2.1
se resume la aportación a la quimiotaxonomía.
Tabla 2.1 Los cinco quimiotipos de Thapsia villosa
La diferencia entre ambos grupos viene dada por la presencia de
tapsigarginas y fenilpropanoides en el grupo II y tapsanos en el grupo I. También
se diferencian en los constituyentes volátiles de los frutos, los frutos del grupo I
contienen acetato de geranilo, los del grupo ll limoneno y metileugenol.
Grupo I Grupo II
Tipo: 1 2 3 4 5
Número de cromosomas: 22 22 44 44 66
Constituyentes de la raíz:
Tapsigarginas + +
Eslovanolidas +
Fenilpropanoides + +
Germacranos + + + + +
Tapsanos + + +
otros Guaianos +
Constituyentes volátiles de los frutos:
Limoneno + +
Metileugenol + +
Acetato de geranilo + + +
Antecedentes
14
El tipo I se correspondería en otras clasificaciones a Thapsia villosa var
minor(8) o Thapsia minor (1); el tipo 2 con Thapsia laciniata(8) y el tipo 5 con
Thapsia villosa var villosa(1).
El profesor Pujadas, en Flora Ibérica(1), hace la clasificación botánica
más actualizada de este género. En este caso Thapsia villosa comprende tres
variedades: Thapsia villosa var villosa, Thapsia villosa var dissecta y Thapsia
villosa var platyphyllos. El IPNI (Internacional Planta Name Index,
http://www.ipni.org) reconoce igualmente 3 variedades: Thapsia villosa, Thapsia
villosa var laciniata y Thapsia villosa var platyphyllos, aunque en este caso se
limita a la recolección de la bibliografía reconocida por esta organización.
Llama la atención que Flora Ibérica no haga referencia alguna a Thapsia
laciniata o Thapsia villosa var laciniata. Según Arán & Mateo(9) los especimenes
de T. villosa tipo 2 no se corresponden con Thapsia villosa var laciniata, sino que
esos especimenes serían en realidad Thapsia villosa var dissecta.
2.2 USOS MEDICINALES Y POPULARES DE THAPSIA VILLOSA. ACTIVIDAD BIOLÓGICA
Al igual que el resto de especies del género Thapsia, la resina de su raíz
se usa en forma de emplasto para combatir afecciones pulmonares, catarros y
dolores reumáticos, así mismo también se usa como purgante violento y
vomitivo(1). En la comarca ilerdense de La Segarra se utiliza la resina de la raíz
para combatir la sarna(1).
El uso medicinal, aunque quizás sea el más importante, no es el único y
se publicado que es una de las especies más usadas para la pesca en Castilla-
La Mancha y en la Comunidad de Valencia(10), también se ha descrito el uso de
los frutos de Thapsia villosa como sustituto del comino(11).
Hasta ahora los únicos compuestos con los que se relaciona actividad
biológica aislados en Thapsia villosa son las tapsigarginas que han demostrado
ser un importante liberador no citotóxico de histamina e inhibidores selectivos
de la ATPasa-Ca2+, por lo que impiden llevar a cabo la regulación de la
concentración de Ca2+ en la célula provocando la muerte de ésta(12).
Actualmente existen investigaciones dirigidas a buscar la selectividad frente a
células malignas para provocar la apoptosis selectiva de éstas(13). Análogos de
Juan J. Rubal Estudio fitoquímico de Thapsia villosa
15
las tapsigarginas, donde se sustituyen los ésteres naturales del compuesto por
aminas aromáticas, provocan una apotosis selectiva en las células cancerosas
de próstata(13).
Las eslovanolidas han sido ensayadas mediante test de irritación y de
liberación de histaminas, en ambos casos el resultado fue negativo(14).
2.3 COMPUESTOS PREVIAMENTE AISLADOS
Los tipos de compuestos encontrados con anterioridad en Thapsia villosa
son fenilpropanoides y sesquiterpenos. De estos últimos es fecuente encontrar
ejemplos de esqueletos germacrano, tapsano y guayanos, siendo las sustancias
más atractivas a priori dos tipos de guiainolidas: eslovanolidas y tapsigarginas.
2.3.1 FENILPROPANOIDES Los fenilpropanoides se aíslan de las raíces de los dos quimiotipos de T.
villosa del grupo II. Todos ellos presentan oxidadas las posiciones 3, 4 y 5 del
anillo aromático, y funciones éster en las posiciones 1 y 2 de la cadena.
Tabla 2.2 Fenilpropanoides de T. villosa
2.3.2 GERMACRANOS Este tipo de compuestos se encuentra en quimiotipos de los dos grupos
de T. villosa. Se aíslan en las raíces y en las umbelas de T. villosa var minor, que
se corresponde con el quimiotipo 1, y en las raíces de T. villosa var villosa,
que se corresponde con el quimiotipo 5. Todos estos compuestos presentan
oxidadas (hidroxilo o éster) las posiciones 6 y 8 del esqueleto y dobles enlaces
o/y epóxidos en las posiciones 1-10 y 4-5; ocasionalmente presentan oxidada la
posición C-12 del isopropilo
(1) R1 = Ang R2 = H R3 = Ang
(2) R1 = Ang R2 = Ang R3 = H
(3) R1 = Ang R2 = H R3 = Ac
OO
OOR1
O
O
OR2OR3
(4) R1 = Ac R2 = Ang R3 = H
Antecedentes
16
(5) R = Ang
(6) R = p-Coum
(7) R = Fer
OR
OH (8) R = Sen
(9) R1 = Ang R2 = H OR1
OR2O
(10) R1 = Ang R2 = Ac
OH
OHO
OAng
(11)
(12) R1 = H R2 = Ang R3 = H OR2
OR1
OR3
(13) R1 = H R2 = Ang R3 = Ang
OAng
OAcO
O
(12)
Tabla 2.2 Germacranos de T. villosa
2.3.3 GUAIANOS SIN FUNCIÓN LACTONA
Este tipo de compuestos se aísla de las raíces de T. villosa quimiotipo 2,
que por algunos autores(7) se hace coincidir con T. laciniata.
La característica más notable de este grupo de compuestos es la posición
C-11, correspondiente a la unidad isopropilo, oxidada. Otro hecho a destacar es
la presencia en dos de los casos de ésteres aromáticos, una característica que
no aparece en las guaianolidas y que sólo tiene como ejemplo uno de los germa-
cranos vistos en el apartado anterior y tres de los tapsanos que veremos poste-
riormente. Los ésteres aromáticos se aíslan sólo de especimenes del grupo l.
Juan J. Rubal Estudio fitoquímico de Thapsia villosa
17
OH
(15)
(16) R = Sen
(17) R = p-Coum
OH
OH
R
(18) R = Fer
Tabla 2.3 Guaianos de T. villosa
2.3.4 TAPSIGARGINAS
Las tapsigarginas son un tipo de guaianolida característica del género
Thapsia, que presentan un sistema polioxidado. Se encuentran en las raíces de
los quimiotipos del grupo II. Son más abundantes en el quimiotipo 4 que en el 5;
en éste último, Thapsia villosa var villosa, se aíslan preferentemente
eslovanolidas, como veremos más abajo.
O
O
OH
OAcR1O
OH
OR2AngO
(19) R1 = Ang R2 = Sen
(20) R1 = Ang R2 = 2-Me-But
(21) R1 = Oct R2 = 2-Me-But
(22) R1 = 6-Me-Oct R2 = Sen
(23) R1 = 6-Me-Oct R2 = 2-Me-But
(24) R1 = 5-Me-Hex R2 = 2-Me-But
(25) R1 = Sen R2 = Sen
(26) R1 = Ang R2 = But
(27) R1 = iVal R2 = But
(28) R1 = iVal R2 = 2-Me-But
Antecedentes
18
(29) R = Sen
O
O
OH
OAc
OH
ORAngO
H
(30) R = 2-Me-But
Tabla 2.4 Tapsigarginas de T. villosa
2.3.5 ESLOVANOLIDAS Estas guaianolidas pro-azuleno, menos oxidadas que las anteriores, se
aíslan de las raíces de T. villosa del quimiotipo 5. La característica fundamental
de este grupo de compuestos es que su calentamiento provoca una fácil
transformación en unidades azuleno que confieren a las disoluciones colores
azules intensos.
(31) R1 = Ac R2 = 2-Me-But
(32) R1 = Ac R2 = Sen
(33) R1 = H R2 = 2-Me-But
O
O
O
O
R1O O O
OR2
(34) R1 = H R2 = Sen
Tabla 2.5 Eslovanolidas de T. Villosa
2.3.6 TAPSANOS
Este esqueleto de sesquiterpeno fue aislado por primera vez desde la
Thapsia villosa. Los tapsanos se encuentran en raíces de T. villosa de los
quimiotipos del grupo I
El esqueleto tapsano es un sistema bicíclico 6-5 y los seis carbonos
restantes se encuentran como unidades de un carbono en distintas posiciones
Juan J. Rubal Estudio fitoquímico de Thapsia villosa
19
del sistema. Respecto a otros sesquiterpenos, podemos decir que carece de
unidad isopropilo y que posee una unidad gem-dimetilo sobre uno de los
carbonos del anillo de seis. También merece ser destacada la frecuente
presencia de un anillo furano conteniendo una unidad hemiacetal y la detección
de un dímero diacetal.
CHO
OAc
(35)
OR
(36) R = Fer
(37) R = H
OH
OSen
(38)
OH
OSen
O
(39) R = Ac
(40) R = H
O
OH (41)
O
OH
OR
(42) R = Ang
(43) R = Sen
(44) R = p-Coum
(45) R = Fer
O
OH
OR
(46) R = Sen (47) R = Ang
(48) R = Tig O
OH
AngO
(49)
O
O
O OAng
SenO
(50)
Tabla 2.5 Tapsanos de T. villosa
Antecedentes
20
En la siguiente tabla se detalla la procedencia de cada compuesto y su
referencia bibliográfica.
Número Fuente Parte Referencia (1) T. villosa var villosa Raíces 15 (2) T. villosa var villosa Raíces 16 (3) T. villosa var villosa Raíces 16 (4) T .villosa var villosa Raíces 16
(5) T. villosa avr villosa
T. minor Raíces 17
(6) T .minor Raíces 17 (7) T. minor Raíces 17 (8) T. minor Raíces 17
(9) T. villosa var villosa
T. minor Raíces 17
(10) T. villosa var villosa
T. minor Raíces 17
(11) T. minor Umbelas 17 (12) T. minor Raíces 18 (13) T. minor Raíces 18
(14) T. villosa var villosa
T. minor Raíces 17
(15) T. laciniata Raíces 19 (16) T. laciniata Raíces 20 (17) T. laciniata Raíces 20 (18) T. laciniata Raíces 20
(19) T. villosa var villosa
T. villosa tipo 4 Raíces 21
(20) T. villosa var villosa
T. villosa tipo 4 Raíces 21
(21) T. villosa var villosa
T. villosa tipo 4 Raíces 21, 16
(22) T. villosa var villlosa T. villosa tipo 4
Raíces 21
(23) T. villosa var villosa T. villosa tipo 4
Raíces 21
(24) T. villosa var villosa T. villosa tipo 4
Raíces 21
Juan J. Rubal Estudio fitoquímico de Thapsia villosa
21
Tabla 2.6 Compuestos, procedencia y referencias.
Número Fuente Parte Referencia
(25) T. villosa var villosa T. villosa tipo 4
Raíces 21
(26) T. garganica Raíces 21
(27) T. garganica Raíces 21
(28) T. villosa var villosa Raíces 21, 16
(29) T. villosa var villosa Raíces 21
(30) T. villosa var villosa Raíces 21
(31) T. villosa var villosa Raíces 14
(32) T. villosa var villosa Raíces 14
(33) T. villosa var villosa Raíces 14
(34) T. villosa var villosa Raíces 14
(35) T. minor Raíces 24
(36) T. laciniata Raíces 25
(37) T. laciniata Raíces 25
(38) T. minor Raíces 25
(39) T. minor Raíces 24
(40) T. minor Raíces 24
(41) T. laciniata Raíces 25
(42) T. laciniata Raíces 19
(43) T. minor Raíces 22
(44) T. minor Raíces 23
(45) T. minor Raíces 23
(46) T. minor Raíces 23
(47) T. villosa tipo 3 Raíces 26
(48) T. villosa tipo 3 Raíces 26
(49) T. minor Raíces 23
(50) T. minor Raíces 23
Antecedentes
22
2.4 El METILTIOACRILATO, EL METILTIOPROPIONATO Y EL ACRILATO
No existen precedentes de que los ésteres metiltiopropionato y acrilato
hayan sido aislados formando parte de productos naturales.
El metilitoacrilato, aunque es bastante infrecuente si ha sido aislado
formando parte de productos naturales. Ha sido aislado en los musgos
Balatiopsis rosea(27) e Isotachis japonica(28), como éster aromático; del tunicado
Aplidium uouo(29) en los sesquiterpenos Uomanina A y B: y también en plantas
del género Petasites (Compositae) en las especies Petasites formosanus(30),
Petasites formosanus var kitamura(31) y en Petasites japonicus(32). Los
compuestos de Petasites que contiene el metiltioacrilato son sesquiterpenos del
tipo eremofilano; se han aislado varios derivados de este tipo y los dos más
representativos de esta familia conteniendo el metiltioacrilato son:
Estos compuestos han sido estudiados y se han determinado que poseen
actividad biológica. La iso-S-Petasina, al igual que las tapsigarginas, bloquea el
canal del Ca2+ (34). La S-Petasina es capaz de inhibir la secreción de testosterona
en ratas(35).
2.4.1 ORIGEN BIOGENÉTICO DEL METILTIOPROPIONATO Y DEL ACRILATO.
El resto 3-metiltiopropanoico (MTP) proviene del metabolismo de la
metionina(36):
MtaO
O
MtaO
O
iso-S-Petasina S-Petasina
ác. 4-metilsulfanil-2-oxobutanoico
ác. 3-metiltiopropiónico
metionina
aminotransferasaS
NH2O
OHS
OO
OH
S
O
OH
CO2
Juan J. Rubal Estudio fitoquímico de Thapsia villosa
23
El MTP se considera precursor del DMSP (Dimetilsulfopropionato) que es
su análogo metilado en el S. El DMSP es una molécula que presenta múltiples
funciones en las plantas, es un osmolito, un crioprotector y un donador de
metilo(38). Además el DMSP por ruptura enzimática genera en algas marinas
DMS (dimetilsulfuro) y ácido acrílico(37):
El acrilato presenta propiedades antimicrobianas y es tóxico para el
propio organismo que lo genera, por ello éste se almacena como DMSP y se
libera en caso necesario como mecanismo de defensa. Este mismo sistema
actúa como antioxidante puesto que el acrilato es capaz de capturar radicales
hidroxilo y otras formas reactivas de oxígeno.
El sistema DMSP/DMS contribuye al ciclo natural del azufre. El DMS
generado se incorpora a la atmósfera, mecanismos de oxidación atmosférica
transforman DMS a sulfatos. Recientemente se ha considerado el ciclo del
azufre como el responsable, al menos en el mismo nivel que los cambios en la
concentración de CO2, en el efecto invernadero y su influencia el clima global y
los ciclos hidrológicos(38).
S O
O
+HO
O
DMSP
DMSPliasa Me2S
3.Materiales y métodos
Juan J. Rubal Estudio fitoquímico de Thapsia villosa
27
3.1 MATERIAL BIOLÓGICO:
Se recolectaron raíces de Thapsia villosa var villosa en mayo del 2002 en
la Sierra de San Cristóbal (El Puerto de Santa María). Las plantas se
encontraban en floración. Un espécimen se encuentra depositado en el
Departamento de Ciencias y Recursos Agrícolas y Forestales, Escuela Técnica
Superior de Ingenieros Agrónomos y Montes, Universidad de Córdoba, número
de pliego COA 31092 (Profesor A. Pujadas).
3.2 EXTRACCIÓN Y AISLAMIENTO
Extracción: Se extrajeron 100 g de raíces con diclorometano en un Soxhlet durante 6
horas. Se evaporó el disolvente en un rotavapor para dar un residuo aceitoso
(13,5 g). El extracto se fraccionó mediante cromatografía en columna en gel de
sílice usando como eluyente mezcla de hexanos y acetato de etilo en gradiente
con polaridad creciente dando lugar, después de análisis por CCF, a siete
fracciones.
Cromatografía en Capa Fina (CCF):
Se usaron cromatofolios de gel de sílice sobre base de aluminio, Kiesegel
60 HF254 Merk con espesor de 0,20 mm y con indicador fluorescente.
Las cromatografías se siguieron mediante visualización bajo luz UV (365
y 254 nm), y posterior tratamiento con reveladores. El revelador más usado fue
el CAM, disolución de 4 g de Ce(SO4)2 y 100 g de (NH4)6Mo7O24.H2O en una
mezcla de 100 mL de H2SO4 conc y 900 mL de agua.
Los eluyentes usados fuero hex/AcOEt y hex/acetona, en todos los casos
la polaridad se expresa como la proporción del disolvente más polar.
Materiales y métodos
28
Cromatografía en Columna:
Para las columnas se utilizó gel de sílice Kieselger 60 (63 a 200 µm) de
Merck. Las columnas se eluyeron a presión atmosférica o con sobrepresión de
nitrógeno.
Cromatografía Líquida de Alta Eficacia (HPLC):
Se utilizaron aparatos Merck-Hitachi L-6270 y L-7100, equipados con
columnas de gel de sílice LiChrosorb Si 60 con relleno de 7 µm y dimensiones
de 1 x 25 cm. El detector empleado fue índice de refracción.
Los eluyentes utilizados en este caso fueron mezclas en distintas propor-
ciones de hexano/acetato de etilo.
Disolventes para cromatografía.
En cromatografía, se utilizaron disolventes de grado técnico destilados.
En el caso del HPLC los disolventes fueron previamente filtrados
3.3 TÉCNICAS INSTRUMENTALES
Resonancia Magnética Nuclear: Para la realización de los espectros se emplearon los aparatos: Varian
Gemini 300 (300 MHz para 1H y 75 MHz para 13C), Varian Inova 400 (400 MHz
para 1H y 100 MHz para 13C) y Varian Inova 600 (600 MHz para 1H y 150 MHz
para 13C)
Los espectros se realizaron utilizando como disolvente cloroformo deu-
terado, tomando como referencia las señales residuales del disolvente, 7,27 ppm
(singlete) para 1H y 77,0 ppm (pico central del triplete) para 13C.
Los valores de los desplazamientos químicos se indican en δ (ppm) y las
constantes de acoplamiento en Hertzios (Hz). La asignación de 1H y 13C se
representa en tablas ordenadas por la posición de los protones en el esqueleto
Materiales y métodos
29
carbonado indicando la multipilicidad de las señales y sus constantes de
acoplamiento.
Espectrometría de Masas: Los espectros de masas de baja resolución se realizaron en un
espectrómetro Voyager GCMS/Thermoquest con rango de masas 1-1000. Todos
se realizaron por impacto electrónico y con la técnica gases-masas, inyectán-
dose las muestras en modo “SPLIT” (partición de muestra).
Para los espectros de masas de alta resolución se empleó un
espectrómetro VG Autospec-Q. Para todos se utilizó el impacto electrónico
(70 eV). La introducción de la muestra se realizó con una sonda directa para
sólidos.
Espectroscopia Infrarroja:
Los espectros de infrarrojo se realizaron en un espectrofotómetro de
transformada de Fourier Genesis Series FTIR de Mattsob. Los valores aparecen
en cm-1. Las medidas fueron realizadas mediante el depósito en película (film)
líquida o sólida sobre pastillas de NaCl.
Actividad Óptica ([α]D):
Las medidas se hicieron en un polarímetro Perkin-Elmer 241 con lámpara
de sodio (589 nm). La concentración y el disolvente utilizado se expresan entre
paréntesis.
4.Resultados
Juan J. Rubal Estudio fitoquímico de Thapsia villosa
33
4.1 AISLAMIENTO Se han aislado cinco nuevos compuestos denominados B, D, E, F y H,
junto con los ya conocidos Thapsivillosina C (G), 6-O-Acetil-8-angeloilshiromodiol
(A) y 6-O-Acetil-8-O-angeloildiepoxytovarol (C) procedentes de las raíces de
Thapsia villosa var villosa. Es la primera vez que los ésteres metiltiopropanoato
y acrilato se aíslan formando parte de un producto natural.
El extracto se separó mediante cromatografía en columna empleando
como eluyente mezclas éter de petróleo/AcOEt de polaridad creciente. Se
realizaron siete reuniones (1 a 7) tras el análisis de las fracciones recogidas,
mediante cromatografía en capa fina.
A O
O
O
O
O
1
2
3 45
67
8
910
12
13
11
14
15
1'2' 3'
4'
5'
1''2''
H
B O
O
O
O
O
1
2
3 45
67
8
910
12
13
11
14
15
1' 2' 3'
4' 5'
1''2''
H
C
O
OO
O
O
OH
H1
2
2 4 4
67
11
12
13
8
9
14
15
1'2'
3'
4'
1''
2''
10 5'
D
O
OO
O
O
OS
H
H1
2
2 4 4
67
11
12
13
8
9
14
15
1'2' 3' 4'
1''
2''
10
E
O
O
O
O
O
O O
OO
O1
53 8
10
11
12 13
14
15
1'2' 3'
H
HH
2
6 7
9H
H
F
O
O
O
O
O
O O
OO
O
S1
53 8
10
11
12 13
14
15
1'2'
3'
H
HH
2
6 7
9
G H
O
O
O
O
OHOH
O
OO
OO
O
1
5
3 8
11
13
14
15
910
67
2
4
12
H
O
O
O
O
O
O O
OO
OS
1
53 8
10
11
12 13
14
15
1'2'
3'
H
HH
2
6 7
9
Resultados
34
En la siguiente tabla se detallan los eluyentes empleados para el
aislamiento de cada compuesto y las cantidades aisladas de cada uno de ellos.
Fracción (masa) Compuesto Separación Cantidad A Ep/AcOH 10% (CC) 500 mg
4 (1,3 g) B Ep/Acetona 5% (CC) 17 mg
5 (4,3 g) C Ep/AcOH 20% (CC) 2,5 g
D Ep/AcOH 20% (CC) 250 mg
E Ep/AcOH 40% (HPLC) 0,1 mg
F Ep/AcOH 20% (CC) 28 mg 6 (4,0 g)
G Ep/AcOH 20% (CC) 15 mg
7 (260 mg) H Ep/AcOH 40% (CC)
Ep/Acetona 20% (CC) 7 mg
4.2 DESCRIPCIÓN DE LOS COMPUESTOS AISLADOS 4.2.1 Compuesto B 4.2.1.1- Descripción:
El EM muestra un ión molecular a 378 correspondiente a una fórmula
molecular C22H34O5. El espectro de 1H-RMN a 25º C
muestra unas señales muy anchas y poco definidas, al
igual que en el 13C-RMN donde algunos carbonos
muestran señales muy anchas y con baja intensidad,
este problema se resuelve realizando los espectros a una
temperatura de -40º C.
El doblete a δH = 2,90 (δc = 66,5) se corresponde con el protón de un
epóxido que en el COSY da una correlación con la señal doblete de δH = 4,87
(δc = 79,8) correspondiente a un protón en α a un éster, este protón tiene
correlación en el COSY con la señal doblete a 1,40 ppm (δc = 47,2) que a su vez
se acopla con un protón con δH =1,90 (δc = 25,8) y éste último se acopla con los
dobletes a δH = 0,90 (δc = 21,5) y δH = 1,20 (δc = 21,4), lo que implica la
existencia de un isopropilo mostrando la siguiente estructura parcial:
OO
O
O
O
1
2
3 45
67
8
910
12
13
11
14
15
1' 2' 3'
4' 5'
1''2''
H
OO
Juan J. Rubal Estudio fitoquímico de Thapsia villosa
35
La señal doble doblete a δH = 5,43 (δc = 72,5) correspondiente a un protón
en α a un grupo éster se acopla con las señales a 2,70 y 1,90 ppm correspon-
dientes ambas a un mismo carbono (δC = 39,5); esto genera la siguiente estruc-
tura parcial:
La señal doblete a δH = 5,30 (δc = 129,0) correspondiente a un carbono
olefínico se acopla con las señales a 2,30, 2,10 y 1,80 ppm, ésta última señal
corresponde a un grupo metilo en posición alílica. La señal a δH = 2,30 se acopla
a su vez con las señales a 2,10 y 1,20 ppm, correspondiendo ambas señales a
un mismo carbono (δC = 38,2). La estructura parcial queda de la siguiente
manera:
Mediante el estudio del espectro HMBC (5 Hz) se observa que el H-1
correlaciona con C-9, el H-3 con C-4, el H-15 con C-4 y H-7 con C-9, lo que nos
lleva a que uniendo los trozos la estructura sea la siguiente:
Aunque no se observa acoplamiento alguno mediante el COSY entre H-7
y H-8, si se observa en el HMBC una correlación entre H-7 y C-9, lo que nos
permite justificar la estructura.
Los ésteres unidos a la estructura son un acetato y un tiglato. El acetato
se corresponde con la presencia de un singlete que integra para tres protones a
1,92 ppm (δc = 20,8) y con una pérdida de 60 unidades en el espectro de masa.
El tiglato se origina una señal qq a 6,83 ppm (δc = 137,4), un metilo doblete a
O
H H
HH
HH
O
O1
2
3 45
67
8
9
10
12
11
14
15 OR
R
Resultados
36
1,80 ppm (δc = 14,6) y un metilo singlete ancho a 1,82 ppm (δc = 12,0), así
mismo en el espectro de masas el pico de intensidad relativa 100 con m/z = 83
corresponde a:
La posición de los ésteres se establece en base al HMBC, en el que se
observa una correlación de H-8 con C-1’ y de H-6 con C-1’’.
4.2.1.2- Datos experimentales:
νmax (film), cm-1: 2950, 2870, 1742, 1708, 1258, 1231, 1138, 1024.
Actividad óptica:
[α]D25= - 37,50º (c 0,20; CHCl3)
EIMS m/z (int.rel.):
378 [M+] (2,0), 318 [M-AcOH]+ (2,0), 278 (20), 263 (18), 93 (40), 83 (100), 55
(82).
Desplazamientos de 1H-RMN y 13C-RMN: (600 y 150 MHz, -40ºC)
1H m J (hz) 13C 1H m J (hz) 13C
1 5,30 d J1-2=11,8 129,0 12 0,90 d J2-13=6,5 21,5 2 2,36 m - 24,5 13 1,10 d J3-12=6,5 21,4
3 2,10 1,20
m m - 38,2 14 1,10 s - 23,0
4 - - - 58,5 15 1,75 s - 16,6 5 2,90 d J5,6= 6,5 66,5 1’ - - - 167,0 6 4,70 d J6,5= 6,5 73,8 2’ - - - 128,3
7 1,36 d J7,8=10,3 47,2 3’ 6,83 qq J3’-4’=6,9 J3’-5’=1,5 137,4
8 5,43 dd J8-9α=13,0 J8-9β=5,7 72,5 4’ 1,82 s - 12,6
9α 2,70
dd
J9α-8=13,0 J9β-9α=5,7
5’ 1,80 d J5’-3’=6,9 14,6
9β 1,90 m - 39,5
1’’ - - - 170,3 10 - - - 130,1 2’’ 1,92 s - 20,82
11 1,90 m - 25,8
O
Juan J. Rubal Estudio fitoquímico de Thapsia villosa
37
4.2.2 Compuesto A 4.2.2.1- Descripción:
El compuesto A presenta un espectro de 1H y 13C muy similar al del
compuesto B, al igual que este último los espectros se
realizan a -40º C y la diferencia con el B es la naturaleza
del éster en la posición C-8, en éste caso un angelato,
caracterizado por un qq a δH = 6,04, un metilo doblete a
1,95 ppm y un metilo singlete ancho a δH = 1,80.
4.2.2.2- Datos experimentales
νmax (film), cm-1: 2953, 2869, 1743, 1714, 1648, 1456, 1370, 1235, 1159, 1040.
Actividad óptica:
[α]D25= - 63,65º (c 0,4; CHCl3)
Desplazamientos de 1H-RMN y 13C-RMN: (600 y 150 MHz, -40ºC)
1H m J (hz) 13C 1H m J (hz) 13C 1 5,26 d J1-2=11,8 128,9 12 0,82 J2-13=6,5 21,3 2 2,30 m - 24,3 13 1,05 J3-12=6,5 21,2
3 2,10 1,20 m -
- 38,1 14 1,10 - - 22,80
4 - - - 59,3 15 1,70 - - 16,4 5 2,87 d J5,6= 6,9 66,3 1’ - - - 165,5 6 4,80 d J6,5= 6,9 73,7 2’ - - - 127,1
7 1,30 d J7,8=10,3 46,9 3’ 6,04 qq J3’-4’=6,9 J3’-4’=1,1 139,0
8 5,40 dd J8-9α=13,0 J8-9β=5,7 71,9 4’ 1,80 s - 20,4
9α dd J9α-8=13,0 J9β-9α=5,7
5’ 1,95 d J5’-3’=6,9 15,5
9β 1,90 - - 39,4
1’’ - - - 170,0 10 - - - 129,9 2’’ 1,90 s - 20,6
11 1,90 m - 25,7 0,82 J2-13=6,5 21,3
OO
O
O
O
1
2
3 45
67
8
910
12
13
11
14
15
1'2' 3'
4'
5'
1''2''
H
Resultados
38
4.2.3 Compuesto D 4.2.3.1- Descripción: La fórmula molecular, C21H32O6S, se determinó mediante análisis
elemental y fue confirmada mediante HREIMS. El
espectro de 13C-RMN muestra señales correspon-
dientes a dos grupos carbonilos, 170,4 y 135,6
ppm y a un doble enlace, 153,5 y 112,9 ppm.
En el espectro de 1H-RMN las señales a
3,08 ppm (δc = 61,5) y 3,16 ppm (δc = 66,6)
corresponden ambas con H de epóxidos, al no existir correlación en el COSY
entre estas señales se deduce que existen dos epóxidos en la molécula.
Del análisis del COSY se deducen las siguientes secuencias de correla-
ción y las consiguientes estructuras parciales:
La señal de 4,89 ppm (δC = 73,2) junto con la de 5,66 ppm (δC = 66,3)
resultan ser hidrógenos en α a un grupo éster visto el desplazamiento de su
correspondiente carbono
La señal de los protones del metilo a 1,26 ppm muestra correlación en el
HMBC con los carbonos a 66,6, 58,8 y 36,5 ppm lo que nos permite unir el
primer trozo con el tercero. Así mismo, el metilo a 1,45 ppm muestra correlación
en el HMBC con los carbonos a 61,4, 58,7 y 42,5 ppm lo que nos permite unir el
O
OO
O
O
OS
H
H1
2
2 4 4
67
11
12
13
8
9
14
15
1'2' 3' 4'
1''
2''
10
O
H H
OO
3,16 4,89 1,60 1,841,13
0,95(66,6) (73,2)
(23,2)
(21,5)
5,662,23
1,85(42,5)
(69,3)
3,081,45
2,07(23,82)
1,26
2,17(36,58)
HH
HH O
(61,4)
H
(26,5)(48,5)
Juan J. Rubal Estudio fitoquímico de Thapsia villosa
39
segundo trozo con el tercero. La estructura se cierra finalmente con la
correlación entre δH = 1,60 y δc = 42,5. Los ésteres unidos a la molécula son un
acetato y un metiltioacrilato. El acetato se corresponde con un singlete a 1,92
ppm (δc = 21,0). El metiltioacrilato se caracteriza por la presencia de un singlete
correspondiente al –SMe a δH = 2,38 (δc = 19,6) y dos dobletes a δH = 5,80 (δc =
112,9) y δH = 7,05 (δc = 153,1). La constante de acoplamiento entre estos dos
dobletes de 10 Hz indica que el doble enlace tiene una configuración Z.
La localización de los ésteres se hace a través del HMBC, el H-5
correlaciona con el carbono a δc = 170,4 correspondiente al acetato, y el H-8
correlaciona con el carbono a δc = 165,6 correspondiente al metiltioacrilato.
4.2.3.2- Datos experimentales:
νmax (film), cm-1: 2960, 1740, 1698, 1558, 1387, 1235, 1161, 992, 796.
Actividad óptica:
[α]D25= - 18,34º (c 0,24; CHCl3)
EIMS m/z (int.rel.):
412 [M]+ (1), 235 [M-HOAc-C4H5O2S]+ (1), 195 [M-HOAc-C3H7-C4H6O2S]+ (4),
193 (2), 163 (4), 149 (5), 101 [C4H5OS]+ (100).
HREIMS m/z (calculada):
412,1905 (412,1920).
Análisis elemental: C (teórico) H (teórico) S (teórico) 60,81 (61,14) 7,845 (7,82) 7,972 (7,77)
Resultados
40
Desplazamientos de 1H-RMN y 13C-RMN: (400 y 100 MHz, 25ºC)
4.2.4 Compuesto C:
4.2.4.1- Descripción: Este compuesto muestra espectros de RMN muy similares al compuesto
anterior, salvo en lo que se refiere a las señales del
éster de la posición C-8 que en este caso se trata de
angelato, caracterizado por un qq a δH = 6,07, un
metilo dq a δH = 1,95 y un metilo singlete ancho a
1,85 ppm.
4.2.4.2- Datos experimentales:
νmax (film), cm-1:
2960, 2871, 1744, 1715, 1457, 1387, 1236, 1159, 1192, 1040.
Actividad óptica:
[α]D25= - 9,41º (c 0,17; CHCl3).
1H m J (hz) 13C 1H m J (hz) 13C
1 3,08 d 10,4 61,5 12 1,13 d J12-13 = 6,5 23,2 2α 1,45 m - 13 0,95 d J13-12 = 6,5 21,5
2β 2,07 dt J3α,2α = 14,6 J2α-3α=3,4
23,8 14 1,45 s - 22,4
3α 2,17 dt J3α,2β = 13,2 J3α-2α=3,4 15 1,26 s - 17,2
3β 1,26 m - 36,6
1’ - - - 165,6 4 - - - 58,8 2’ 5,80 d J2’,3’ = 10,0 112,9 5 3,16 d J5-6=6,8 66,6 3’ 7,05 d J3’,2’ = 10,0 153,1
6 4,89 dd J6,5=6,8 J6,7=1,0 73,2 SCH3 2,38 s - 19,6
7 1,60 d J7,11 = 8,7 48,5 1’’ - - - 170,4
8 5,66 dd J8-9α = 12,2 J8-9β = 5,8 69,3 2’’ 1,92 s - 21,0
9α 2,23 t J9α-8=12,2
9β 1,85 dd J9β-8 = 5,8 J9β-9α = 13,7
42,5
10 - - - 58,7
11 1,84 m - 26,5
O
OO
O
O
OH
H1
2
2 4 4
67
11
12
13
8
9
14
15
1'2'
3'
4'
1''
2''
10 5'
Juan J. Rubal Estudio fitoquímico de Thapsia villosa
41
Desplazamientos de 1H-RMN y 13C-RMN: (400 y 100 MHz, 25ºC)
4.2.5 Compuesto F:
4.2.5.1- Descripción:
La fórmula molecular se estableció por análisis elemental y se confirmó
por HREIMS, C25H34O10S (526,1860), nueve
insaturaciones. El IR muestra la presencia
bandas de grupos carbonilo a 1791 y 1738
cm-1, la primera señal corresponde a una
γ-lactona.
En el 1H-RMN a 25º C aparecen
señales anchas centradas en 2,6 y 2,8 ppm, sus respectivos carbonos presentan
también señales anchas de intensidad baja. Este comportamiento nos llevó a
realizar los espectros de RMN a -50º C quedando solucionado el problema.
El 13C-RMN muestra señales de cinco grupos carbonilos, dos carbonos
pertenecientes a un doble enlace y cinco carbonos oxigenados. Si consideramos
cinco carbonilos, un doble enlace y una lactona suman 7 insaturaciones, lo que
1H m J (hz) 13C 1H m J (hz) 13C
1 3,10 d 10,6 60,9 12 1,16 d J12-13 = 6,6 23,4 2α 1,50 m - 13 0,97 d J13-12 = 6,6 21,4
2β 2,08 dt J3α,2α = 14,6 J2α-3α= 3,3
23,4 14 1,47 s - 22,5
3α 2,17 dt J3α,2β = 13,5 J3α-2α=3,3 15 1,28 s - 16,8
3β 1,30 m - 36,0
1’ - - - 166,0 4 - - - 58,4 2’ - - - 127,5 5 3,15 d J5-6=6,9 65,8 3’ 6,07 138,8
6 4,93 dd J6,5=6,9 J6,7=1,0 72,9 4’ 1,85 m J4’-3’=1,45 20,4
7 1,63 d J7,11 = 9,5 48,2 5’ 1,95 dq J3’-5’=7,32
J3’-4’=1,45 15,6
8 5,64 dd J8-9α = 12,0 J8-9β = 5,4 68,8 1’’ - - - 169,5
9α 2,23 t J9α-8=12,0 2’’ 1,93 s - 20,5 9β 1,89 m J9α-9β=12,0 42,3
10 - - - 58,2 11 1,85 m - 26,3
O
O
O
O
O
O O
OO
O
S1
53 8
10
11
12 13
14
15
1' 2'
3'
H
HH
2
6 7
9
Resultados
42
llevaría a que tenemos un compuesto con dos ciclos, además del correspon-
diente a la lactona.
El COSY muestra las siguientes correlaciones:
Aparentemente parece que existe un anillo de cuatro miembros, pero el H
a 5,60 ppm se corresponde con un carbono olefínico (δC = 126,0), el no aparecer
otro protón olefínico está de acuerdo con la existencia de acoplamiento alílico
entre las señales en 3,10 y 5,60 ppm, por tanto tenemos un anillo de cinco, así
pues el otro anillo es un anillo de siete, un carbono cuaternario lo completaría en
el esquema anterior.
El espectro de 1H-RMN muestra señales de tres acetatos, que unidos a la
presencia de la lactona suman cuatro ésteres, queda un éster sin determinar en
la molécula.
El HMBC está de acuerdo con que se coloque la lactona entre los
carbonos C-6 y C-7; el H-6 aparece a 4,83 ppm y su carbono a 75,4 ppm. Así
mismo, mediante el HMBC se colocan los grupos acetato en C-2, C-10 y C-11 y
el éster restante sobre C-8. La estructura de este éster se dedujo desde las
señales en 1H-RMN, dos metilenos centrados en 2,60 y 2,80 ppm acoplados
entre ellos y un metilo a 2,10 ppm que no acopla con los metilenos. Este metilo
se corresponde con un SMe que muestra correlación en HMBC con el C-3’’.
Estas correlaciones nos llevan a deducir que se trata del metiltiopropionato, éster
que se describe aquí por primera vez formando parte de un producto natural.
4,83 3,60 5,803,105,60
5,70 3,42 2,60 1,96
(126,0)
(79,4) (44,5)
(65,7)(75,4)
(50,1)
(49,6) (48,2)
OR
O R
OR
Juan J. Rubal Estudio fitoquímico de Thapsia villosa
43
4.2.5.2 Datos experimentales:
νmax (film), cm-1:
2960, 1740, 1698, 1558, 1387, 1235, 1161, 992, 796.
Actividad óptica:
[α]D25= -40º (c 0,13, CHCl3)
EIMS m/z (int.rel.):
466 [M-HOAc]+ (1), 244 (16), 226 [M-HOAc-C4H8O2S]+ (100), 173 (42).
HREIMS m/z (calculada):
526,1860 (526,1873)
Análisis elemental C (teórico) H (teórico) S (teórico) 57,35 (57,02) 6,639 (6,51) 6,20 (6,09)
Desplazamientos de 1H-RMN y 13C-RMN: (600 y 150 MHz, -50ºC)
1H m J (hz) 13C 1H m J (hz) 13C
1 3,42 dd J1,5=7,8 J1,2=2,1 50,09 13 1,60 s - 20,30
2 5,70 m - 79,37 14 1,24 s - 26,94 3 5,60 m - 126,05 15 1,90 d J15,3=1 17,31 4 - - - 149,56 1’ - - - 170,14 5 3,10 m - 49,56 2’ 2,60 m - 34,08
6 4,83 dd J6,5=11,72 J6,7=9,5 75,40 3’ 2,80 m - 28,34
7 3,60 dd J7,6=9,7 J7,8=10,74 48,25 SMe 2,13 s - 15,309
8 5,80 td J8,7=11,23=J8,9
J8,9β=2,7 65,73 (C-2)-OCOCH3 - - - 170,7
9β 2,60 dd J9β,9α=13,54 J9β,8=2,7 (C-2)-OCOCH3 2,03 s s 21,0
9α 1,96 dd J9α,9β=13,54 J9α,8=11,17
44,5
(C-10)-OCOCH3 - - - 170,7
10 - - - 79,73 (C-10)-OCOCH3 2,02 s s 21,2 11 - - - 77,79 (C-11)-OCOCH3 - - - 170,0 12 - - - 173,90 (C-11)-OCOCH3 2,10 s s 22,3
Resultados
44
4.2.6 Compuesto H: 4.2.6.1 Descripción:
Este compuesto se diferencia del anterior en la naturaleza del éster sobre
C-8, en este caso es un metiltioacrilato.
El MTA queda caracterizado en 1H-RMN por un singlete correspondiente
al –SMe a 2,38 ppm (δc = 19,6) y dos dobletes a 5,80 ppm (δc = 112,9) y 7,05
ppm (δc = 153,1).
4.1.6.2 Datos experimentales:
νmax (film), cm-1:
2921, 1790, 1733, 1566, 1371, 1240, 1155, 1019, 797.
Actividad óptica:
[α]D25= -24,5º (c 0,25, CHCl3)
EIMS m/z (int.rel.):
464 [M-HOAc]+ (2), 422 [M-C4H6O3]+ (5), 226 [M-3HOAc-C4H6O2S]+ (54), 101
[C4H5OS]+ (100).
HREIMS m/z (calculada):
464,1500[M-HOAc]+ (464,1505).
Análisis elemental C (teórico) H (teórico) S (teórico) 57,11 (57,24) 6,171 (6,15) 6,307 (6,11)
O
O
O
O
O
O O
OO
OS
1
53 8
10
11
12 13
14
15
1'2'
3'
H
HH
2
6 7
9
Juan J. Rubal Estudio fitoquímico de Thapsia villosa
45
Desplazamientos de 1H-RMN y 13C-RMN: (400 y 100 MHz, 25ºC)
4.2.7 Compuesto E: 4.2.7.1 Descripción:
Al igual que el anterior este compuesto se diferencia del compuesto F en
el éster situado en C-8 que en este caso se
trata de acrilato, el acrilato se corresponde en el 1H-RMN por tres dobletes de dobletes a 6,00
(J = 10 y 17 Hz), 6,40 (J = 17 y 1 Hz ) y 5,88
ppm (J = 10 y 1 Hz). Los valores de la constan-
tes de acoplamiento nos permiten deducir la
estructura -CH=CH2, por el desplazamiento de
las señales esta unidad etileno es α a un carbonilo, lo que nos confirma la
presencia del éster acrilato que se describe aquí por primera vez formando parte
de un producto natural.
1H m J (hz) 13C 1H m J (hz) 13C
1 3,33 dd J1,2=2,2 J1,5=8 51,87 13 1,62 s - 20,58
2 5,77 m - 79,65 14 1,38 s - 26,35 3 5,63 m - 126,64 15 1,95 d J15,3=1,1 17,38 4 - - - 149,48 1’ - - - 164,80 5 3,10 m - 50,12 2’ 5,76 d J2’,3’=10,26 112,28
6 4,83 dd J6,5=11,9 J6,7=9,7 76,1 3’ 7,10 d J3’-2’=10,26 153,5
7 3,68 dd J7,6=9,89 J7,8=10,99 48,25 SMe 2,42 s - 19,25
8 5,73 td J8,7=11,15 =J8, 9 J8,9β=2,8 65,73 (C-2)-OCOCH3 - - - 170,2
9β 2,62 dd J9β,9α=15,38 J9β,8=2,75
(C-2)-OCOCH3 2,03 s - 21,2
9α 2,14 dd J9α,9β=15,38 J9α,8=11,17
44,91 (C-10)-OCOCH3 - - - 170,4
10 - - - 80,56 (C-10)-OCOCH3 2,03 s - 20,9 11 - - - 78,08 (C-11)-OCOCH3 - - - 169,9 12 - - - 173,72 (C-11)-OCOCH3 2,1 22,0
O
O
O
O
O
O O
OO
O1
53 8
10
11
12 13
14
15
1'2' 3'
H
HH
2
6 7
9H
H
Resultados
46
4.2.7.2 Datos experimentales:
νmax (film), cm-1:
2921, 2861, 1790, 1737, 1238, 1098.
Desplazamientos de 1H-RMN y 13C-RMN: (600 y 150 MHz, 25ºC)
4.2.8 Compuesto G:
4.2.8.1 Descripción:
El espectro IR muestra una señala 3.444 cm*1 correspondiente a grupos
hidroxilos y una señal a 1.790 cm*1
correspondiente a una γ-lactona.
En 13C-RMN hay señales atribui-
bles a cuatro carbonilos, siete carbonos
oxigenados y dos dobles enlaces
El 1H-RMN está de acuerdo con la
presencia de cuatro ésteres y una lactona y con los cinco carbonos oxigenados
correspondientes, esto implica que la molécula debe de contener dos grupos
hidroxilo. Los ésteres que conforman la molécula son un acetato caracterizado
por un singlete a 1,87 ppm, un angelato caracterizado por un qq a 6,07 ppm, un
1H m J (hz) 13C 1H m J (hz) 13C
1 3,38 dd J1,2=2,2 J1,5= 8,1 51,42 13 1,62 s - 20,50
2 5,74 m - 79,46 14 1,32 s - 26,86 3 5,61 m - 126,6 15 1,93 d J15,3=1,1 17,28 4 - - - ? 1’ - - - ?
5 3,10 m - 50,09 2’ 6,06 dd J=10,31 J=17,3 128,07
6 4,79 dd J6,5=11,78 J6,7=9,57 76,03 3’ 6,40 dd J=17,3
J=1,47
7 3,66 dd J7,6=10,68 J7,8=10,68 48,44 3’ 5,88 dd J=10,3
J=1,47
131,67
8 5,80 td J8,7=11,04=J8, 9α J8,9β=2,58 65,97 (C-2)-OCOCH3 - - - ?
9β 2,60 dd J9β,9α=15,46 J9β,8=2,58 (C-2)-OCOCH3 2,03 s - 22,3
9α 2,06 dd J9α,9β=15,46 J9α,8=11,04
44,9 (C-10)-OCOCH3 - - - ?
10 - - - ? (C-10)-OCOCH3 2,02 s - 22,3 11 - - - ? (C-11)-OCOCH3 - - - ?
12 - - - ? (C-11)-OCOCH3 2,02 s - 22,3
H
O
O
O
O
OHOH
O
OO
OO
O
1
5
3 8
11
13
14
15
910
67
2
4
12
Juan J. Rubal Estudio fitoquímico de Thapsia villosa
47
2-metilbutirato caracterizado por un doblete a 1,11 ppm, un triplete a 0,85 ppm y
un multiplete a 2,30 ppm, el último éster, un octilo, se corresponde con una señal
ancha a 1,30 ppm, un triplete a 2,30 ppm, superpuesto al multiplete del 2-
metilbutirato, y un triplete a 0,85 (solapado con el del 2-metilbutirato). El 13C-
RMN y el DEPT confirman la naturaleza de los ésteres.
4.2.8.2 Datos experimentales:
νmax (film), cm-1:
3444, 2930, 1790, 1739, 1719, 1237, 1149, 1085, 1042.
Actividad óptica:
[α]D25= -17,14º (c 0,28, CHCl3)
Desplazamientos de 1H-RMN y 13C-RMN: (400 y 100 MHz, 25ºC)
Posición 1 2 3 6 8
δ 1H 4,30 5,45 5,60 5,68 5,60
Posición 9β 9α 13 14 15
δ 1H 3,04 2,30 1,46 1,38 1,85
Posición 1 2 3 4 5 6 7
δ 13C 57,5 77,7 76.8 141.5 130.4 84.1 78,5
Posición 8 9 10 11 12 12 14 15 δ 13C 66,1 38,2 84.7 78,6 175,7 16,2 23.2 12,9
Octilo: 1H: 2,3, 1,6, 1,3, 0,9.
13C: 172,5, 34,2, 26,1, 29,0, 31,0, 31,6, 24,8, 14,0.
Angelato: 1H: 6,07, 1,97, 1,90. 13C: 167,0, 127,4, 138.6, 16,3, 20,6.
2-Metilbutirato: 1H: 2,27, 1,72, 1,40, 1,11, 0,85. 13C: 175,3, 41,3, 28,9, 11,6, 15,8.
Acetato: 1H: 1,87. 13C: 170,6, 23,0.
5.Conclusiones
Conclusiones
51
5 CONCLUSIONES
• El estudio fitoquímico de Thapsia villosa var villosa ha revelado la presen-
cia de cinco nuevos metabolitos.
OO
O
O
O
1
2
3 45
67
8
910
12
13
11
14
15
1' 2' 3'
4' 5'
1''2''
H
B
O
OO
O
O
OS
H
H1
2
2 4 4
67
11
12
13
8
9
14
15
1'2' 3' 4'
1''
2''
10
C
O
O
O
O
O
O O
OO
O1
53 8
10
11
12 13
14
15
1'2' 3'
H
HH
2
6 7
9H
H
E
O
O
O
O
O
O O
OO
O
S1
53 8
10
11
12 13
14
15
1'2'
3'
H
HH
2
6 7
9
F
O
O
O
O
O
O O
OO
OS
1
53 8
10
11
12 13
14
15
1'2'
3'
H
HH
2
6 7
9
H
• Dos de los nuevos metabolitos, C y H, presentan un resto metiltioacrilato,
un éster poco frecuente aislado anteriormente sólo de seis especies, de
las cuales tres son plantas superiores.
• El metabolito F contiene el resto éster metiltiopropionato que por primera
vez se ha aislado formando parte de un producto natural. Su origen está
en el metabolismo de la metionina.
• El metabolito E está esterificado con acrilato. Al igual que el metiltiopro-
pionato, es la primera vez que se aísla formando parte de un producto
natural. Parece ser que su origen se encuentra en la descomposición del
metiltiopropionato y se ha encontrado que existen algas que se defienden
mediante la liberación de acrilato.
6-Bibliografía
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7-Anexo de espectros
Anexo de espectros
59
0255075100125150175
0.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.5 Espectro de 13C (150 MHz) y 1H (600 MHz) del compuesto A a -40º C
Juan J. Rubal Estudio fitoquímico de Thapsia villosa
60
0255075100125150175
0.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.5 Espectro de 13C (150 MHz) y 1H (600 MHz) del compuesto B a -40º C
Anexo de espectros
61
0255075100125150175200
1.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.5 Espectro de 13C (100 MHz) y 1H (400 MHz) del compuesto C a 25º C
Juan J. Rubal Estudio fitoquímico de Thapsia villosa
62
102030405060708090100110120130140150160170180190
Espectro de 13C (100 MHz) y 1H (400 MHz) del compuesto D a 25º C
Anexo de espectros
63
0102030405060708090100110120130
1.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.0
5.906.006.106.206.306.40
Espectro de 13C (150 MHz) y 1H (600 MHz) del compuesto E a 25º C
Juan J. Rubal Estudio fitoquímico de Thapsia villosa
64
0102030405060708090100110120130140150160170180190
Espectro de 13C (150 MHz) y 1H (600 MHz) del compuesto F a -50º C
Anexo de espectros
65
0102030405060708090100110120130140150160170180
0.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.5 Espectro de 13C (100 MHz) y 1H (400 MHz) del compuesto G a 25º C
Juan J. Rubal Estudio fitoquímico de Thapsia villosa
66
102030405060708090100110120130140150160170180
1.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.5 Espectro de 13C (100 MHz) y 1H (400 MHz) del compuesto H a 25º C