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UDO Agrcola

VOLUMEN 4 ENERO-DICIEMBRE 2004 NMERO 1

Revista Cientfica de la Escuela de Ingeniera

Agronmica de la Universidad de Oriente

ISSN 1317 - 9152 Depsito Legal pp200102Mo1203

UNIVERSIDAD DE ORIENTE

Autoridades Rectorales

Rector: Pedro Jos Mago Herminson

Vice-Rector Acadmico: Milena Bravo

Vice-Rector Administrativo: Manuel Funes Ariza

Secretario: Esteban Obando

Autoridades del Ncleo Monagas

Decano: Jos Isaac Jimnez Tiamo

Coordinador Acadmico: Toms Rodrguez

Coordinador Administrativo: Irma Prez

Director Escuela de Ingeniera Agronmica: Vctor Alejandro Otahola Gmez

Jefe Departamento de Agronoma: Roxana Ramrez de Bolatre

Jefe Departamento de Ingeniera Agrcola: Luis Daniel Andrico

Jefe Departamento de Economa Agrcola: Nieves Josefina Chauran

Impreso en la Comisin de Investigacin del Ncleo de Monagas de la Universidad de Oriente

Volumen 4 Enero-Diciembre 2004 Nmero 1

REVISTA CIENTFICA UDO AGRCOLA

Revista de la Escuela de Ingeniera Agronmica del Ncleo de Monagas de la Universidad de Oriente

La REVISTA CIENTIFICA UDO AGRICOLA, es una publicacin arbitrada de la Escuela de Ingeniera Agronmica de la Universidad de Oriente cuya periodicidad es de al menos un volumen por ao y distribucin gratuita. La Revista publica artculos cientficos originales e inditos en Ciencias Agrcolas que enfoquen aspectos de agronoma, botnica, entomologa, fitopatologa, suelos, ingeniera agrcola, gentica y mejoramiento de plantas, ecologa, biotecnologa, sociales, economa, etc. Tambin podrn publicarse avances de trabajos, notas tcnicas, cartas con opiniones o comentarios debidamente argumentados y reseas de libros. Excepcionalmente sern publicadas revisiones bibliogrficas o monografas, a solicitud del Consejo Directivo. La Revista no se hace responsable de los conceptos y opiniones emitidos por los autores de los trabajos publicados en la misma.

Los autores debern enviar original y dos copias de sus artculos en papel tamao carta, escrito en idioma castellano o ingls, a doble espacio. Para facilitar la edicin tambin debern enviar los trabajos en un diskette 3 , transcritos en Microsoft Word 6,0 o posteriores, con tipo de letra Times New Roman nmero 12 y mrgenes de 2 cm en todos los lados. Los trabajos tambin podrn ser enviados a la siguiente direccin de correo electrnico: [email protected].

Abreviatura recomendad para citas bibliogrficas: UDO Ag. La Revista Cientfica UDO Agrcola esta indexada y publicada a texto completo en Bioline International

System, Canad (http://www.bioline.org.br/cg/) e ndice y Biblioteca Electrnica de Revistas Venezolanas de Ciencia y Tecnologa (REVENCYT) Cdigo RVR037. Fundacite Mrida, Venezuela (http://150.185.136.100/scielo.php?script=sci_serial&pid=1317-9152&lng=es&nrm=iso y http://www.revencyt. ula.ve/revencyt/verifica.php?nombre=Revista UDO Agrcola).

Adicionalmente est indexada en Electronic Sites of Leading Botany, Plant Biology and Science Journals, Oklahoma, Estados Unidos. (http://www.e-journals.org/botany/#R) y Portal de Revistas de la Biblioteca de la Facultad de Agronoma, Universidad de la Repblica, Montevideo, Uruguay (http://www.biblioteca.fagro.edu.uy/revistas/prodvege.php).

EDITORIAL

Parece que fue ayer cuando sali la Revista Cientfica UDO Agrcola, pero ya han transcurridos cuatro aos ininterrumpidos publicndose. La tarea no ha sido fcil, pero se ha logrado gracias a todos los autores que han sometido sus artculos para que la Revista de la Escuela de Ingeniera Agronmica de la Universidad de Oriente divulgue los resultados de sus investigaciones y gracias tambin a los revisores y rbitros que gentilmente nos han hecho llegar sus comentarios acerca de los artculos que se les ha dado para su revisin, muchas gracias porque esta es una labor encomiable y no remunerada en trminos econmicos pero si en su aspecto acadmico. Por otra parte, quisiramos agradecer a los profesores de la Facultad de Ciencias Biolgicas y Agropecuarias de la Universidad Veracruzana en Mxico por el arbitraje de algunos artculos de este volumen. Un agradecimiento especial a la Comisin de Investigacin del Ncleo Monagas por la publicacin impresa de la Revista.

Los Editores

Revista Cientfica UDO Agrcola

Volumen 4, N 1, 2004

Comit Editorial

Editores Principales Jess Rafael Mndez Natera

Vctor Alejandro Otahola Gmez

Editores Asociados Departamento de Agronoma: Nilda Alcorcs de Guerra Departamento de Ingeniera Agrcola: Amrico Hossne

Departamento de Economa: Beatriz Febres

Consejo de rbitros, 2004

Amrico Hossne Departamento de Ingeniera Agrcola, Escuela de Ingeniera Agronmica, Ncleo de Monagas, Universidad de Oriente, Venezuela.

Atilano Nuez Calcao Programa Tecnologa de Alimentos, Escuela de Zootecnia, Ncleo de Monagas, Universidad de Oriente, Venezuela.

Atilio Higuera Moros Facultad de Agronoma, La Universidad del Zulia, Venezuela Aurora Espinoza Programa Tecnologa de Alimentos, Escuela de Zootecnia, Ncleo de Monagas,

Universidad de Oriente, Venezuela. Carlos Gonzlez Gndara Facultad de Ciencias Biolgicas y Agropecuarias, Universidad Veracruzana, Tuxpan.

Veracruz, Mxico. Dorian Rodrguez Postgrado Fitopatologa, Decanato de Agronoma. Universidad Centro Occidental

Lisandro Alvarado, Venezuela Editor Rivas Instituto Nacional de Investigaciones Agrcolas, Maturn, Monagas, Venezuela. Jess Rafael Cedeo Instituto de Investigaciones Agropecuarias, Ncleo de Monagas, Universidad de

Oriente. Venezuela Jos Jimnez Tiamo Departamento de Agronoma, Escuela de Ingeniera Agronmica, Ncleo de Monagas,

Universidad de Oriente. Jos Manuel Maruri Garca Facultad de Ciencias Biolgicas y Agropecuarias, Universidad Veracruzana, Tuxpan.

Veracruz, Mxico. Juan B. Pineda Postgrado Fitopatologa, Decanato de Agronoma. Universidad Centro Occidental

Lisandro Alvarado, Venezuela Julio Csar Gonzlez Crdenas Facultad de Ciencias Biolgicas y Agropecuarias, Universidad Veracruzana, Tuxpan.

Veracruz, Mxico. Luis Alberto Hermoso Gallardo Laboratorio de Clonacin y Gentica Vegetal, Facultad de Ciencias, Universidad

Central de Venezuela. Luis H. Gmez Gil Departamento de Economa Agrcola y Ciencias Sociales, Escuela de Ingeniera

Agronmica, Ncleo de Monagas, Universidad de Oriente. Maria Juana Perez Martinez

Recursos Agroecologicos-CENIAP. Instituto Nacional de Investigaciones Agrcolas (INIA), Maracay, Aragua, Venezuela

Maribel Ramrez Villalobos Facultad de Agronoma, La Universidad del Zulia. Venezuela Norca Mogolln de Moiss Unidad de Biotecnologa, Posgrado de Horticultura, Decanato de Agronoma.

Universidad Centro Occidental Lisandro Alvarado, Venezuela Pablo Elorza Martnez Facultad de Ciencias Biolgicas y Agropecuarias, Universidad Veracruzana, Tuxpan.

Veracruz, Mxico. Zenaida Lozano Prez Laboratorio de Qumica de Suelos, Instituto de Edafologa, Facultad de Agronoma,

Universidad Central de Venezuela, Maracay, Venezuela

Revista UDO Agrcola 4 (1): 1-20. 2004 1

Fijacin biolgica de nitrgeno

Biological Nitrogen Fixation

Juliana Mayz-Figueroa

Universidad de Oriente, Ncleo de Monagas, Laboratorio de Rizobiologa, Campus Juanico, Maturn, Estado Monagas. Email: [email protected].

RESUMEN

Esta revisin es acerca de los organismos fijadores de nitrgeno, viviendo libres o en asociacin con plantas terrestres. Se discute su hbitat, morfologa y los aspectos fisiolgicos; se incluyen, la ubicacin de las estructuras involucradas en la Fijacin Biolgica de Nitrgeno, los mecanismos de proteccin de la nitrogenasa, las vas metablicas de incorporacin del nitrgeno fijado y los compuestos nitrogenados transportados va xilema o floema. Adems, se citan gneros y especies de organismos o sistemas fijadores que se localizan en el territorio de Venezuela, indicando el colector y el herbario de referencia. Palabras Clave: Fijacin Biolgica de Nitrgeno, Microorganismos de vida libre, Asociaciones, Nitrogenasa.

ABSTRACT

This review is about nitrogen-fixing organisms, free-living or living in association with terrestrial plants. Their habitat,

morphology and physiological aspects are discussed; location of the involved structures in the Biological Nitrogen Fixation, mechanisms of nitrogenase protection, metabolic routes of fixed nitrogen incorporation and nitrogen compounds transported via xylem or phloem are included. In addition, genus and species of organisms or fixing-systems located in the states of Venezuela countryside are mentioned, jointly with the collector and the reference herbarium. Key Words: Biological Nitrogen Fixation, Free-living microorganisms, Associations, Nitrogenase.

INTRODUCCIN

El Nitrgeno (N) es un elemento necesario en la composicin de protenas, cidos nucleicos y otros componentes celulares, siendo as una molcula esencial para el crecimiento de todos los organismos. En la atmsfera el N ocupa aproximadamente el 80%, existiendo en la forma NN; sin embargo, el N2, debido al triple enlace entre los dos tomos de nitrgeno, que hace a la molcula casi inerte, no puede ser aprovechado por la mayora de las formas vivientes, sino slo por un pequeo grupo de microorganismos altamente especializados, que incluyen algas, bacterias y actinomicetes. Para ser utilizado en el crecimiento, este debe ser primero reducido y luego fijado (combinado) en la forma de iones amonio (NH4+) o nitrato (NO3-). El proceso a travs del cual esos microorganismos reducen el nitrgeno hasta una forma utilizable es conocido como Fijacin Biolgica de Nitrgeno (FBN por sus siglas en espaol). El proceso puede ser llevado a cabo por los microorganismos en vida libre o en simbiosis con plantas, y el mismo no slo permite usar el nitrgeno atmosfrico sino tambin revertir o

reducir la degradacin del suelo (Allan y Graham, 2002; Parsons, 2004).

La FBN es mediada por el complejo

nitrogenasa, presente en los organismos fijadores, el cual cataliza la conversin del N2 a NH4+ bajo la reaccin general: N2 + 10H+ + 8e- + nMgATP 2NH4+ + H2 + nMgADP + nPi (n 16). Esta requiere de grandes cantidades de poder reductor y energa (ATP), y la reduccin obligada de protones con un mnimo de 1 mol of H2 producido por mol de N2 reducido (Halbleib y Luden, 2000). La actividad del complejo enzimtico puede ser mermada por el oxgeno, de tal manera que los organismos fijadores poseen mecanismos (e.j. alta tasa respiratoria, compartamentalizaciones o proteccin conformacional) que les permiten mantener bajas concentraciones de ste a fin de mantener la enzima funcionando (Ureta y Nordlund, 2002; Lee et al., 2004).

Organismos involucrados en la FBN

Entre los microorganismos involucrados en la FBN se encuentran: bacterias, algas verde-azules

Mayz-Figueroa. Fijacin biolgica de nitrgeno


(cianobacterias) y actinomicetes, los cuales pueden fijar el nitrgeno viviendo libremente o formando asociaciones.

Microorganismos de Vida Libre

Bacterias

Las bacterias fijadoras de nitrgeno son componentes importantes del suelo y requieren una fuente de energa qumica si no son fotosintticas, las cuales a su vez utilizan la energa de la luz solar.

Entre las bacterias de vida libre pueden encontrarse: anaerbicas obligadas o facultativas (e.j. Clostridium pasteurianum, Klebsiella spp., Desulfovibrio sp.), aerbicas obligadas (e.j. Azotobacter spp., Beijerinckia sp.) y fotosintticas (bacterias prpuras sulfurosas y no sulfurosas, y bacterias verdes sulfurosas) (Allan y Graham, 2002).

Las bacterias aerbicas dependen fuertemente de las condiciones de humedad, oxgeno y materia orgnica, y las anaerbicas son predominantes en suelos anegados donde existen las condiciones de humedad y materia orgnica, pero el suministro de oxgeno est restringido. La FBN en los suelos tropicales con las condiciones requeridas de humedad, temperatura y materia orgnica es generalmente alta. Se reporta que el nmero de bacterias fijadoras de nitrgeno es particularmente elevado en la zona adyacente a la raz (rizsfera), debido a la liberacin de compuestos orgnicos que le sirven como nutrimento (Dugan 2004).

Las bacterias aerbicas emplean dos mecanismos de proteccin de la nitrogenasa: la proteccin respiratoria, donde se produce una elevada tasa respiratoria a expensas de un alto consumo de carbono y energa, manteniendo as una concentracin intracelular de oxgeno baja; y la proteccin conformacional, en la cual la nitrogenasa cambia su disposicin a una forma reversible inactiva (Robson y Postgate, 1980; Segura y Espn, 1998).

Cianobacterias

Las Cianobacterias tienen una amplia distribucin y ocupan un gran rango de habitas al igual que las bacterias, que incluyen suelo y agua, tanto de regiones tropicales y templadas como de climas extremos (Herrero et al. 2001), Presentan una gran diversidad morfolgica, desde unicelulares hasta

multicelulares filamentosas y con o sin la presencia de heterocistos. Stanier y Cohen-Bazire (1977), las describen como fotoautotrficas, fijadoras de CO2 a travs del Ciclo de Calvin y carentes de 2-oxoglutarato deshidrogenasa. En las cianobacterias, el amonio es incorporado en esqueletos carbonados (2-oxoglutarato) a travs del ciclo de la glutamina sintetasa-glutamato sintasa para la biosntesis de glutamato y compuestos nitrogenados derivados (Herrero et al., 2001).

Los heterocistos (Figura 1) son clulas especializadas, distribuidas a lo largo o al final del filamento (cianobacterias multicelulares filamentosas), los cuales tienen conexiones intercelulares con las clulas vegetativas adyacentes, de tal manera que existe un continuo movimiento de los productos de la fijacin de nitrgeno desde los heterocistos hacia las clulas vegetativas y de los productos fotosintticos desde las clulas vegetativas hacia los heterocistos (Todar, 2004).

Debido a la sensibilidad de la enzima nitrogenasa al oxgeno, las cianobacterias tienen como mecanismos de proteccin, la separacin en espacio o en tiempo de los mecanismos fotosintticos y de fijacin de nitrgeno. Algunas algas filamentosas como Nostoc y Anabaena, tienen la nitrogenasa confinada a los heterocistos, los cuales carecen del

Figura 1.a. Imagen de contraste de fase de filamentos

de Nostoc punctiforme, mostrando heterocistos (flechas).

b. Imagen epifluorescente de los filamentos mostrados en la Figura a. (Meeks y Elhai, 2002).



fotosistema II liberador de oxgeno y rodeados de una pared glicolipdica gruesa que reduce la difusin de ste hacia las clulas, cualquier oxgeno que difunde hacia los heterocistos es rpidamente reducido por hidrgeno; as, la fijacin de nitrgeno est espacialmente y metablicamente separada del proceso fotosinttico; las algas unicelulares (e.j. Gloeocapsa) y las filamentosas sin heterocistos (e.j. Trichodesmium), presentan los dos procesos separados en tiempo; de tal manera que la nitrogenasa slo ocurre en el perodo de oscuridad. Sin embargo, algunas cianobacterias como mantienen la fijacin de nitrgeno durante el perodo de luz, a expensas de una elevada tasa respiratoria, mecanismo similar al presentado por las bacterias aerbicas (Capone et al., 1997; Herrero et al., 2001; Omoregie et al., 2004; Todar, 2004). Actinomicetes

Los actinomicetes son bacterias filamentosas Gram positivas, comunes en el suelo, especialmente en suelos de elevado pH y poca humedad. Se les considera como organismos intermedios entre los hongos y las bacterias, formadores de micelios (Lechevalier y Lechevalier, 1979; Huss, 1990).

Frankia es un gnero del grupo de los actinomicetes, cuya especie F. alni, se ha reportado como fijadora de nitrgeno tanto en vida libre como en asociacin con algunas angiospermas (no leguminosas). Las especies de Frankia son de crecimiento lento en cultivo y requieren de medios especializados para su crecimiento, presentan hifas ramificadas y septadas con vesculas y esporangios. Los esporangios multiloculares e irregulares en forma se localizan terminal, lateralo intercalarmente en las hifas, cuyas esporas no resistentes al calor sirven probablemente como agentes de propagacin. La actividad de la nitrogenasa ha sido asociada con las vesculas, las cuales pueden formarse lateral o terminalmente en las hifas y bajo condiciones de deficiencia de nitrgeno. Cada vescula est rodeada por una multicapa lipdica que probablemente funciona como una barrera para la difusin de oxgeno. Estudios estructurales en cultivo han mostrado que el grosor de la capa lipdica aumenta en respuesta a un incremento de la concentracin de oxgeno, a fin de evitar la inactivacin de la nitrogenasa (Silvester et al., 1990; Nalin et al., 2000; Todar, 2004).

Asociaciones Asociaciones no simbiticas

Bacterias-Filsfera Varias bacterias fijadoras de nitrgeno pueden colonizar la filsfera, trmino usado por algunos investigadores para referirse a la superficie adaxial y abaxial de la hoja, y por otros a la hoja completa, incluyendo el ambiente interno. Se ha observado que las bacterias ms abundantes en las hojas son las pigmentadas (e. j. Methylobacterium mesophilicum, Pseudomonas syringae), a las cuales se les ha atribuido una mejor adaptacin a los rayos solares (Sundin y Jacobs, 1999; Hirano y Upper, 2000). Las especies de Beijerinckia y Azotobacter son comnmente encontradas en cultivos; y se ha reportado su efecto benfico en el crecimiento de las plantas (Ching-Hong, 2001; Lindow y Brandl, 2003). Sin embargo, no est clara la forma en que las plantas se benefician y posiblemente se ha atribuido el beneficio a la absorcin radical de compuestos nitrogenados, los cuales una vez excretados por las bacterias en las hojas, llegan a la raz por lavado. Bacterias-Rizsfera Hiltner en 1904 observ por primera vez la acumulacin de microorganismos en la zona radical y propuso el trmino rizsfera. Los exudados radicales, conformados por substancias diversas crean alrededor de las races (rizsfera) un ambiente nutricional enriquecido que favorece el crecimiento bacteriano. Smith (1976) y Martin y Kemp (1980) reportan la presencia de carbohidratos y aminocidos, y sealan que la composicin y cantidad de exudados vara con la especie presente y las condiciones abiticas, tales como agua y temperatura. La relacin que se establece entre las bacterias y las plantas puede ser favorable, perjudicial o neutra. Dentro de las relaciones favorables se encuentra la asociacin con bacterias fijadoras de nitrgeno; entre estas, especies de Azospirillum1, Enterobacter, Klebsiella, Pseudomonas y Burkholderia (Estrada et al., 2001). Las bacterias 1 Identificado en suelos de la Gran Sabana por Andrade y

Cuenca (1998).

b



fijadoras de nitrgeno pueden ser categorizadas dentro del grupo de las rizobacterias promotoras del crecimiento (PGPR, por sus siglas en ingls), al ejercen un efecto benfico sobre el crecimiento de las plantas. La primera especie aislada fue Azospirillum lipoferum (para entonces nombrada como Spirillum lipoferum) en Holanda en 1925 (BeijerincK, 1925) y de la cual en la actualidad se reconocen 7 especies: A. brasilense, A. lipoferum, A. amazonense, A. halopraeferans, A. irakense, A. largimobile y A. doebereinerae (Tarrand et al.,1978; Magelhaes et al., 1983; Reinhold et al., 1987; Khammas et al., 1989; Sly y Stackebrandt, 1999; Eckert et al., 2001); desde entonces ha sido aislada de varias especies cultivadas y silvestres y de varios tipos de suelo. Por muchos aos se consider que el efecto benfico de las bacterias fijadoras de nitrgeno slo provena de la utilizacin por las plantas del amonio excretado; as existen numerosas publicaciones que prueban tal efecto (Mirza et al., 2001; Becker et al., 2002); sin embargo, se ha encontrado que esta bacterias tambin producen fitohormonas (auxinas, giberelinas y citocininas) que afectan favorablemente el desarrollo de las plantas, particularmente de la raz (Persello-Cartieaux et al., 2003). Ms recientemente se ha reportado que las bacterias fijadoras de nitrgeno incrementan la capacidad radical de absorcin de nitrato, indirectamente como una consecuencia de la estimulacin del desarrollo radical y directamente por estimulacin del sistema transportador del compuesto (Mantelin y Touraine, 2004). Asociaciones simbiticas

Rhizobia-Leguminosas Rhizobium Frank 1889, el gnero tipo de la Familia Rhizobiaceae Conn 1998, est representado por bacterias de forma bacilar, Gram negativas, habitantes del suelo, que tienen la capacidad de formar ndulos en varias leguminosas y en Parasponia spp. (e. j. P. andersonii, P. rigida). Esta relacin simbitica es controlada genticamente tanto por la planta como por la bacteria y ocurre a travs de una secuencia de estados de desarrollo que culminan en el establecimiento de una simbiosis efectiva: el ndulo fijador de nitrgeno. El primer nombre dado a las bacterias de los ndulos de las races de las leguminosas fue Phytomyxa, el cual lo propuso Schroeter en 1886, considerando la relacin de estas bacterias con los hongos mucosos. Sin embargo, en 1970, la Comisin Judicial del Comit Internacional

de Nomenclatura Bacteriana (Opinin 34) aprob como nombre genrico Rhizobium FranK 1889 (nombre conservado) en vez de Phytomyxa Schroeter 1886 (nombre prioritario). Esto se hizo en base a que el nombre RhIzobium, tiene la ventaja de enfatizar la importancia agronmica de las bacterias de los ndulos de las races (rhiza: raz, bius: vida, Rhizobium: vida en las races) y a su vez guarda tributo a la extensa literatura publicada con ese nombre (Mayz, 1997). Actualmente, adems de Rhizobium, existen otros gneros de bacterias fijadoras de nitrgeno: Ensifer (Casida, 1982), Bradyrhizobium (Jordan 1982), Azorhizobium (Dreyfus et al., 1988) y Mesorhizobium (Jarvis et al., 1997). Weir (2004) hace una revisin exhaustiva de la taxonoma actual de los rizobia. El enigma de las leguminosas fue aclarado cuando Hellriegel y Wilfarth en 1888 probaron la fijacin de nitrgeno en plantas noduladas, esto fue seguido por el aislamiento de la primera bacteria de los ndulos por Beijerinck ese mismo ao. En 1932, Fred y colaboradores publicaron una monografa que ha recorrido el mundo, donde revisaron y analizaron la informacin existente sobre la simbiosis; sus consideraciones tuvieron una profunda influencia en la prctica y teora subsiguientes. Para las dcadas posteriores y hasta la actualidad los avances tecnolgicos han permitido estudios ms detallados y por lo tanto un mejor conocimiento y entendimiento de la simbiosis leguminosas-rizobia. Para que se establezca la relacin simbitica deben ocurrir las siguientes etapas: 1. multiplicacin de las bacterias en la rizsfera, 2. colonizacin de la rizsfera, 3. adsorcin de las bacterias a la raz, 4. ensortijamiento de los pelos radicales, ocurre en las races cuando la infeccin es va pelos radicales y en algunas donde acontece va unin races laterales-raz principal, 5. formacin de los hilos o zonas intercelulares de infeccin, 6. crecimiento del hilo de infeccin hacia las clulas corticales o invasin directa de las mismas, y 7. diferenciacin tisular y desarrollo del ndulo (Figura 2). Los cambios morfolgicos y fisiolgicos que ocurren a nivel de los puntos de desarrollo nodular van acompaados de seales moleculares inducidas por genes propios del proceso (genes Nod) (Mayz, 1997; Perret et al., 2000; Gonzlez y Marketon, 2003; Gage, 2004).

El tipo y estructura nodular es dependiente de la planta hospedera, as se tienen:



a. ndulos determinados, en los cuales la actividad meristemtica cesa temprano en su formacin y su aspecto final resulta del alargamiento de las clulas, este tipo de desarrollo origina ndulos esfricos o globosos (Figura 3A), que pueden organizarse alrededor de la raz para formar los denominados ndulos en collar (Figura 3B) (Hirsch, 1992; Mayz, 1997).

b. ndulos indeterminados, los cuales presentan un meristema persistente, que puede producir ndulos ramificados o coraloides, puesto que constantemente se aaden nuevas clulas a la parte distal del ndulo; de tal manera que todos los estados de desarrollo estn as representados, debido a que ocurre un gradiente de formacin desde la parte distal, a la proximal en el punto de unin a la raz. Este tipo de desarrollo da lugar a ndulos elongados o cilndricos (Figura 3C) y ramificados o coraloides (Figura 3D) (Hirsch, 1992; Mayz, 1997). La utilizacin del nitrgeno atmosfrico en la simbiosis, requiere de la

integracin de las vas metablicas de la fijacin (bacteroides) y de la asimilacin (planta hospedera) del nitrgeno. La bacteria emplea compuestos carbonados oxidables suplidos por la planta para su metabolismo y desarrollo y para la sntesis de ATP y del poder reductor usados en la reaccin de fijacin catalizada por la nitrogenasa, la cual genera el nitrgeno asimilable (NH4+), que es metabolizado en las clulas nodulares a amidas o ureidos, que luego son exportados va xilema al resto de la planta, donde son usados (Mayz, 1997).

El primer producto de la reaccin de fijacin es NH3 (amonaco), pero este es rpidamente protonado, formndose NH4+, lo cual es favorecido por el pK (9,25) de la reaccin, de tal manera que amonio es la especie predominante a los pHs fisiolgicos y la que toma parte en las reacciones de asimilacin (Sprent y Sprent, 1990).

Figura 2. Invasin de pelos radicales por Rhizobium sp. (A) rizobia (rh) coloniza la rizsfera y se adhiere al pelo radical (r). (B) Factores Nod inducen el ensortijamiento del pelo radical y permiten la penetracin bacteriana al centro de infeccin (ci). El ncleo del pelo radical (n) precede el crecimiento del hilo de infeccin (it). (C) El hilo de infeccin alcanza la base del pelo radical (it), an acompaado del ncleo (n) (D) El pelo radical (r) se ramifica (rit) cerca del primordio nodular formado por las clulas corticales en divisin. (E) Los bacteroides (b) son liberados desde el hilo de infeccin (it) y forman simbiosomas (s) donde se acumulan grnulos de poly--hidroxibutarato (phb) rodeados por la membrana peribacteroidal (pb). Otras abreviaturas: c, corteza; d, vacuola digestiva; ep, epidermis; ed, endodermis (Perret et al., 2000).



El amonio es un inhibidor de la sntesis de nitrogenasa, por lo que es imperativa su rpida asimilacin; en el citosol de las clulas infectadas, ste es asimilado en cido glutmico, en cuya reaccin interviene la enzima octamrica ATP dependiente glutamina sintetasa o GS, y donde se forma glutamina, la cual puede ser exportada o usada para restaurar el cido glutmico, a travs de una reaccin con el cido 2-oxoglutrico (proveniente del ciclo de los cidos tricarboxlicos) catalizada por la enzima monomrica NADH dependiente glutamato sintasa, tambin denominada glutamina-2-oxoglutarato aminotransferasa o GOGAT (Sprent y Sprent, 1990; Ortega et al., 2004).

Las leguminosas simbiticas pueden ser

separadas en dos grupos de acuerdo a los productos exportados desde los ndulos: las exportadoras de amidas (asparagina, glutamina) (Figura 4) y las exportadoras de ureidos (alantona y cido alantoico)

(Figura 5). El primer grupo incluye varias especies de regiones templadas, entre estas Lupinus subcarnosus, Pisum sativum y Medicago sativa y el segundo varias especies tropicales, tales como Glycine max, Phaseolus vulgaris y Vigna unguiculata (Scott et al., 1976; Miflin y Habash, 2002; Harrison et al., 2003).

Cianobacterias-Hongos (Lquenes), Briofitas, Helechos, Angiospermas, Gimnospermas

Las cianobacterias se asocian simbiticamente con representantes de las cuatro principales divisiones filogenticas de las plantas terrestres: briofitas (musgos, hepticas y antocerotas), helechos, gimnospermas y angiospermas; adems, se asocian con hongos para formar los lquenes y con organismos marinos (Meeks y Elhai, 2002). Esta revisin se centra en las asociaciones de cianobacterias con plantas terrestres.

Figura 3. Formas nodulares presentes en algunas especies de leguminosas. 1. Vigna unguiculata, 2. Desmodium canum, 3. Centrosema brasilianum, 4. Cannavalia ensiformis, 5. Indigofera hirsuta, 6. Cajanus cajan, 7-8. Crotalaria retusa, 9. Gliricidia sepium (Mayz, 1997).



Figuara 4. Sntesis de asparagina en ndulos de Lupinus sp. 1. glutamina sintetasa, 2. glutamato sintasa, 3. aspartato

aminotransferasa, 4. asparagina sintetasa, 5. fosfoenol piruvato carboxilasa (Scott et al., 1976).

Figura 5. Sntesis de los ureidos alantona y cido alantoico. 1. glutamina sintetasa, 2. glutamato sintasa,

3. aspartatp aminotransferasa, 4. aminotransferasas, 5. inosina monofosfato deshidrogenasa, 6. nucleosidasas, nucleotidasas, 7. xantina deshidrogenada, 8. urato oxidasa (uricasa), 9. alantoinasa, 10. fosfoenol piruvato carboxilasa (Mayz, 1997).



Lquenes

Los lquenes son asociaciones simbiticas entre un hongo (micobionte) y una cianobacteria (fotobionte o cianobionte). La cianobacteria ms frecuente en los lquenes es Nostoc (Meeks y Elhai, 2002; Oksanen et al., 2004). Los lquenes viven en varias superficies: suelos, rboles, rocas y paredes, a menudo son los primeros en establecerse en el ambiente, constituyendo la nica vegetacin en ambientes extremos. Su aspecto es variable: de hojas (folioso, Figura 6), de costra (crustoso, Figura 7) o de arbusto (fruticoso, Figura 8) (Purvis, 2000).

Figura 6. Parmotremma stuppeum (Amstrong, 2004)2

Figura 7. Caloplaca saxicola (Silverside, 2002)3

La anatoma de los lquenes vara desde muy simple hasta compleja (Per, 2001; Brodo et al., 2001):

2 Parmotrema stuppeum (Taylor) Hale, colectada en el

estado Mrida por Lpez 353 (VEN). 3 Caloplaca saxicola (Hoffm.) Nordin, colectada en el

estado Mrida por Lpez 464 (VEN) y Marcano et al. 197 (VEN).

Figura 8. Teloschistes chrysophthalmus (Armstrong,

2001)4

a. El talo hommero presenta una estructura uniforme donde estn distribuidas las clulas del alga, penetradas por las hifas del hongo (Figura 9).

b. El talo hetermero con una sola especie de alga

(liquen bipartito), exhibe capas delimitadas e identificables: la corteza superior, la capa fotobintica que contiene las clulas del alga, la mdula, donde se alojan las hifas del hongo y la corteza inferior (Figura 10).

c. En el talo hetermero donde se presentan dos

especies de algas (liquen tripartito), la cianobacteria est confinada a estructuras especiales o cefalopodios que pueden sobresalir en la superficie superior o inferior del liquen, o permanecer internamente, y el alga verde est localizada en la corteza superior (Figura 11).

En la asociacin, la cianobacteria debe ser

capaz de llenar los requerimientos bioqumicos y de desarrollo del hongo. La funcin del fotobionte en el talo es de proporcionar compuestos nitrogenados y carbohidratos (polioles y glucosa), donde alrededor del 80% o ms de los productos fotosintticos son liberados e inmediatamente absorbidos por el micobionte, mientras que el hongo le suministra proteccin, agua y minerales (Hill, 2001; Schofield et al., 2003).

4 Teloschistes chrysophthalmus (L.) Norm. Colectado en el

estado Mrida por Vareschi 233 (VEN) y Lpez 441(VEN).



Cianobacterias-Briofitas (musgos, hepticas y antocerotas)

Los musgos (e.j., Sphagnum spp.)5, hepticas

(e.j: Marchantia spp.)6 y antocerotas (e.j Anthoceros spp., Notothylas spp. y Phaeoceros spp.) forman asociaciones simbiticas con especies de cianobacterias, siendo las especies de Nostoc las ms frecuentemente encontradas (e.j. N. ellipsosporum y N. punctiforme) (Adams, 2000; Wong y Meeks, 2002).

Las colonias de la cianobacteria se alojan en

cavidades especiales (domatias) localizadas en la parte ventral del gametofito (Figura 12), donde ocurre el intercambio de compuestos nitrogenados y carbohidratos (Vance et al., 1998; Costa et al., 2001). Los heterocistos proporcionan los productos nitrogenados a las clulas vegetativas de la planta, y en turno reciben los productos fotosintticos. Se asume que existen mecanismos reguladores (probablemente genes) que controlan la diferenciacin y el patrn de distribucin de los heterocistos en las cianobacterias simbiticas, a fin de optimizar la fijacin de nitrgeno y por ende la simbiosis (Yoon y Golden, 2001).

Cianobacterias-helechos (Azolla)

Azolla (Figura 13) es un helecho acutico que forma una simbiosis permanente y hereditaria con la cianobacteria Anabaena azollae, cuya relacin mutualstica es la nica conocida en la naturaleza entre una pteridofita y una procariotica diazotrfica Esta asociacin fue descrita por primera vez por el cientfico alemn Eduard Strasburger en 1873. En 5 Sphagnum meridense (Hampe) Mll. Hal. Bolvar:

Steyermark y Wurdack 383 (MO); Trujillo: Griffin et al. 1129 (MO); Sphagnum sparsum Hampe Bolvar: Steyermark et al. 109321 (MO), Mrida: Griffin y Lpez PV-922 (MO); Sphagnum tenerum Sull. & Lesq. ex Sull. Bolvar: Liesner 19159 (MO); Sphagnum recurvum P. Beauv. Bolvar: Steyermark et al. 128356 (MO); Sphagnum sancto-josephense H.A. Crum & Crosby Trujillo: Dorr et al. 5055 (MO, NY); Sphagnum magellanicum Brid. Amazonas: Steyermark 129570 (MO); Sphagnum ornatum H.A. Crum Amazonas: Buck 10628 (MO, NY), Bolvar: Boom 9333 (MO, NY); Sphagnum perichaetiale Hampe Amazonas: Steyermark 107519 (MO), Bolvar: Liesner 19951 (MO).

6 Marchantia polymorfa L. Colectada en el estado Mrida: Pittier 12894(MO), Marchantia chenopoda L. colectada en el Distrito Federal: Agostini et al. 81 (MO).

Figura 9. Talo Hommero (Per, 2001)

Figura 10. Talo hetermero (Per, 2001)

Figura 11. Talo hetermero con cefalopodios

(Per, 2001)



Venezuela se han identificado algunas especies: e.j. A. filiculoides7 y A. carolliniana8.

Azolla es usado como fertilizante verde y como alimento para animales en China y Vietnam, y algunas regiones de frica desde hace mucho tiempo y ms recientemente como un biofiltro de aguas servidas (Carrapio, 2002; van Hove y Lejeune, 2002).

El endosimbionte se aloja en la cavidad del

lbulo dorsal cloroflico de la hoja bilobada (Fig. 14),

7 Mrida: Barclay 9628 (MO). 8 Amazonas: Liesner y Carnevali 22784 (MO), Portuguesa:

Liesner y Gonzlez 12698; Zulia: Liesner y Gonzlez 13188 (VEN).

donde adems se localizan tricomas que intervienen en el transporte de substancias. En esta asociacin ocurre un intercambio de compuestos desde la cianobacteria hacia el hospedero (compuestos nitrogenados) y en va contraria (productos fotosintticos).

Cianobacterias-Angiospermas

Todas las especies de Gunnera (Figura 15) forman asociaciones simbiticas con Nostoc (particularmente con N. punctiforme) (Figura 16), siendo la nica angiosperma conocida por formar este tipo de asociacin. Las cianobacterias se localizan intracelularmente (Figura 17) en las glndulas ubicadas en la base del pecolo (Figura 18) donde ocurre el intercambio de compuestos: nitrogenados desde el alga y fotosintticos desde la planta (Benson y Margulis, 2002). Las glndulas se abren al exterior a travs de varios canales y las clulas que las conforman se separan ligeramente en la base de los canales, formando una cavidad (Bergman et al., 1992). Las especies de Gunnera (alrededor de 40) se distribuyen principalmente en el Hemisferio Sur, y se consideran originarias de Suramrica (Wanntorp y Wanntorp, 2003). G. pittierana es autctona en el Parque Nacional Henry Pittier (Venezuela).

Cianobaterias- Gymnospermas (Ccadas)

El grupo de las ccadas (e.j. Cycas, Zamia,

Bowenia) forma asociaciones simbiticas con cianobacterias (siendo las ms comunes Nostoc spp, Spirulina sp. Oscillatoria sp., Anabaena spp., Rivularia sp. y Calothrix sp.) proporcionando un ambiente estable al alga a cambio del nitrgeno fijado; en esta alianza las cianobacterias son endosimbiontes de algunas races (races coraloides o parecidas a corales), las cuales se caracterizan por tener un crecimiento apogeotrpico o hacia la superficie del suelo (Figura 19) (Medeiros y Stevenson, 2004; Thoumire, 2004). Cycas revoluta es comn en parques y jardines del pas (Figura 20).

El proceso de colonizacin de las races

precoraloides envuelve mecanismos de accin y reaccin de ambos organismos. El alga penetra a travs de la epidermis hacia la zona cianobacterial (Figura 21), producindose cambios permanentes que conducen a la transformacin de las races precoraloides en races coraloides simbiticas (Figura 19) (Lindblad y Costa, 2002).

Figura 12. Seccin del talo de Anthoceros

punctatus, mostrando los domatia (flechas) con colonias de Nostoc punctiforme (Wong y Meeks, 2002).

Figura 13. Talo de Azolla sp. (van Hove y Lejeune,

2002).



Fig. 16. Fotomicrografa en microscopio de luz del

corte transversal del tallo de G. chilense, mostrando las colonias de Nostoc (S.U., 2004).

Figura 15. Planta de Gunnera magellanica (Rai

et al., 2000).

Figura 14. Lbulo dorsal (a) de la hoja de Azolla filiculoides (b), mostrando la cavidad (c), donde se localiza el

endosinbionte Anabaena azollae (Carrapico, 2002).

b

a

c



Despus de la reduccin del nitrgeno hasta amonio, ste es incorporado en glutamina por glutamina sintetasa, luego el grupo amida es transferido a la posicin alfa del -cetoglutarato, producindose glutamato, reaccin catalizada por la glutamato sintasa; sin embargo, el anlisis de la savia xilemtica ha revelado que los compuestos nitrogenados transportados varan en algunas especies; as en Macrozamia, Lepidozamia y Encephalartos se ha encontrado glutamina y citrulina, mientras que en Bowenia y Cycas, glutamina y cido glutmico (Lindblad y Costa, 2002).

Fisiologa del Intercambio de compuestos en las asociaciones con cianobacterias

Durante la simbiosis de las cianobacterias con otros organismos, ocurren cambios estructurales y fisiolgicos que conducen al intercambio apropiado

Figura 17. Fotomicrografa en microscopio de

transmisin del corte transversal del tallo de G. chilense, mostrando la infeccin intracelular por Nostoc (S. U., 2004).

Figura 18. Tallo de G. chilensis mostrando las

glndulas en la base de los pecolos (S.U., 2004).

Figura 20. Cycas revoluta. copyright Geoff

Stein, 1997 (VCE, 2004)

Figura 21. Seccin transversal de una raz

coraloide mostrando la zona cianobacterial (CZ), traqueidas (Xy), corteza externa (OC) e interna (IC) y peridermis (Pd ) (Medeiros y Stevenson, 2004).

Figura 19. Races precoraloides (PC) y coraloides (C)

de Cycas circinalis, donde se muestra la cianobacteria como endfito () (Medeiros y Stevenson, 2004).



de compuestos entre el cianobionte y el hospedero (Figura 22).

En el caso de localizaciones extracelulares del

alga como en los lquenes, el contacto ntimo de las hifas con los heterocistos permite el trfico de substancias, desconocindose el mecanismo exacto de intercambio. Se ha encontrado que en los cianolquenes bipartitos (hongo-alga) ocurre el movimiento de productos fotosintticos desde el cianobionte al micobionte, siendo principalmente glucosa, la cual es convertida a manitol (no producido, ni consumido por el alga) en el hongo, posiblemente una estrategia para el secuestro de carbohidratos. Como causa de esta liberacin de glucosa se ha considerado la reduccin de la sntesis de polisacridos para la formacin de las paredes celulares. El alga permanece independiente en cuanto a sus requerimientos y produccin de carbohidratos. En los lquenes con cefalopodios o tripartitos no se ha encontrado o existe poco movimiento de carbohidratos desde el cianobionte al micobionte, considerndose que la fuente de carbohidratos es el ficobionte (alga verde) asociado ya que la cianobacteria no fotosintetiza. La glucosa liberada origina un pool de glucano, el cual sirve como

reservorio, siendo la fuente a utilizar por el cianobionte. En el caso de localizaciones intracelulares como en briofitas (musgos, hepticas y antocerotas), helechos (Azolla), angiospermas (Gunnera) y gimnospermas (ccadas), se seala la posibilidad de que el cianobionte pierda su capacidad fotosinttica y que el C provenga de las partes fotosintticas del hospedero hacia el tejido simbitico como sacarosa o procedente de la degradacin de los polisacridos que estn normalmente presentes en el muclago de las cavidades o ndulos donde habita la cianobacteria. La fijacin y transferencia de nitrgeno desde el cianobionte al hospedero ocurre en todas las simbiosis, siendo los heterocistos, los sitios de fijacin y de las primeras reacciones de asimilacin. El N puede existir en las clulas en las formas NH4+ o NH3 que puede difundir a travs de las membranas o ser reciclado por las clulas a travs de un sistema transportador de amonio, devolvindolo desde el espacio periplsmico conjuntamente con un protn. En los lquenes el amonio liberado, es asimilado va glutamato deshidrogenasa, pero en las otras asociaciones se presenta la va glutamato sintasa-glutamato sintetasa. El transporte de nitrgeno desde los tejidos simbiticos hacia las otras partes del hospedero se hace en forma de aminocidos. En los

Figura 22. Intercambio de compuestos en las asociaciones con cianobacterias. N2 asa: nitrogenasa, GDH: glutamato

deshidrogenada, GS-GOGAT: va glutamato cintasa-glutamato deshidrogenada, H: heterocistos, V: clulas vegetativas (Rai et al., 2000).



lquenes tripartitos, se ha demostrado el transporte de alanina desde el cefalopodio hacia el resto del talo; en Azolla, se transportan desde las cavidades en las hojas hacia el pice del tallo los compuestos glutamato, glutamina, amonio y un derivado de glutamato; en Gunnera, asparagina es el compuesto principal exportado a travs del floema desde las glndulas al resto de la planta y en las ccadas una mezcla de aminocidos es liberada en el xilema desde las races coraloides, principalmente citrulina en Zamiaceae y glutamina en las otras familias (Rai et al., 2000).

Frankia-Angiospermas La ocurrencia de Frankia en el interior de los ndulos de algunas plantas fue reportada por Woronin en 1866, quien describi las hifas y vesculas como pertenecientes a un hongo parsito, ms tarde correctamente identificadas como pertenecientes al actinomicete Frankia. (Becking, 1974, Lechevalier y Lechevalier 1979), pero no fue sino hasta 1978 cuando pudo ser aislado. Este actinomicete forma ndulos (actinorizas) o races laterales modificadas con lbulos hasta de 5 cm de longitud (Figura 23) y fija nitrgeno en ocho familias de dicotiledneas: Betulaceae9, Casuarinaceae, Coriariaceae, Datiscaceae, Elaeagnaceae, Myricaceae10, Rhamnaceae11 y Rosaceae12. Como consecuencia, estas plantas son capaces de crecer en suelos pobres e intervenidos (Verghese y Misra, 2002), siendo as tiles en la recuperacin de suelos y reforestacin.

En el proceso simbitico y de formacin de

los ndulos se presentan variaciones determinadas por el hospedero, que incluyen la va de infeccin (en 9 Alnus acuminata subs. acuminata Kunth ha sido

colectada en el estado Mrida: Hahn y Grifo 3509(MO); Alnus acuminata var. ferruginea (Kunth) Regel colectada en la Cordillera de los Andes por Pittier 13239 (VEN).

10 Morella pubescens (Humb. & Bonpl. ex Willd.) Wilbur, 2001 ha sido colectada en los estados Barinas: Croat 74592 (MO), Lara: Liesner et al. 7939, Mrida: Liesner 13849 (MO), Yaracuy: Trujillo y Ponce 18275 (MO), Trujillo: Trujillo et al. 18370 (MO). y Distrito Federal: Gentry et al. 41263 (MO).

11 Rhamnus acuminata Maguire & Steyerm 1989. Colectada en el estado Amazonas: Maguire et al. 42496 (MO); Rhamnus sipapoenis Steyerm. Maguire y Politi 28656(MO).

12 Prunus moritziana Koehne colectada en los estados Mrida: Hahn y Grifo 3341 (MO) y Yaracuy: Smith V10001.

algunas especies la infeccin es va pelos radicales, e.j. Casuarina, Morella (Myrica), y en otras procede intercelularmente, e.j. Discaria, Dryas, Ceanothus, la morfologa y anatoma de los ndulos y en la diferenciacin de Frankia en el desarrollo nodular (Benson y Silvester, 1993; Huss, 1990, 1999). La formacin del primordio nodular (Figura 24) se inicia en el periciclo, donde se originan races laterales modificadas de forma lobular con clulas infectadas en la corteza. Frankia penetra los pelos radicales curvados o intercelularmente hacia la corteza, donde ocurren divisiones celulares limitadas que dan lugar a la formacin del prendulo; al mismo tiempo, en las clulas del periciclo opuestas al protoxilema se suceden divisiones mitticas que conducen a la formacin de las races laterales modificadas o ndulos; al prendulo se le considera como un rgano simbitico paralelo, desde donde progresan las hifas hacia el primordio del ndulo (Laplaze et al., 2000; Obertello, 2003). Los lbulos presentan un meristema apical y Frankia existe como un micelio vegetativo con presencia de vesculas donde es protegida y funciona la nitrogenasa; tal resguardo es dado por la elevada concentracin de cidos grasos; sin embargo, en Casuarina y Allocasuarina, no se forman vesculas, dado el cambio de composicin de las paredes celulares, las cuales se hacen ms hidrofbicas y menos permeables al oxgeno despus de la infeccin (Verghese y Misra, 2002).

Durante la simbiosis, el microsimbionte

obtiene la energa de la planta hospedera a travs de compuestos carbonados; se considera que Frankia por carecer de enzimas glicolticas, obtiene el carbono de lpidos (Verghese y Misra, 2002); sin embargo,

Figura 23. Ndulos de Alnus sp. mostrando la

estructura multilobulada. Copyright Lundquist, P.O. (Allan y Graham, 2002).



algunos investigadores han reportado el transporte de sacarosa va floema hacia los ndulos (Parsons y Sunley, 2001). Como en los otros sistemas simbiticos el compuesto de nitrgeno metabolizado es NH4+ a travs de la va GS/GOGAT, ATP/NADPH dependientes, que produce glutamina y luego glutamato en los ndulos; los aminocidos aspartato y asparagina son subsecuentemente metabolizados por enzimas amido y amino transferasas (AAT) y sintetasas (AS) (Figura 25). El compuesto nitrogenado transportado va xilema desde los ndulos vara entre los hospederos; as, se ha encontrado citrulina en Alnus sp. (Wheeler y Bond, 1970) y Casuarina equisetifolia (Walsh et al., 1984), arginina en Casuarina cunninghamiana (Sellstedt y Atkins, 1991), y glutamina y asparagina en Myrica (Fig. 25), Hippophae, Ceanothus y Elaeagnus (Huss, 1990; Parsons, 2004).

CONCLUSIONES

Los microorganismos fijadores de nitrgeno de vida libre, abarcan una gama morfolgica que va desde los organismos unicelulares como las bacterias y algunas cianobacterias, hasta multicelulares como las cianobacterias filamentosas y los actinomicetes, que habitan diferentes ambientes, incluyendo los extremos, todos procariticos; comprendiendo as

microorganismos pertenecientes a los Dominios Archaea y Bacteria, los cuales pueden formar asociaciones con organismos pertenecientes al Dominio Eucaria. Estas asociaciones pueden ser de tipo no simbitico, ocurriendo principalmente en la filsfera o la rizsfera de algunas plantas, o de tipo simbitico, dndose en briofitas (musgos, hepticas y antocerotas), helechos (Azolla), gimnospermas (ccadas) y angiospermas (Gunnera, leguminosas y Parasponia) y en zonas de la planta que incluyen la raz, el tallo y las hojas. Una caracterstica comn de los microorganismos involucrados en la FBN, es la presencia del sistema enzimtico nitrogenasa, que les permite la reduccin del nitrgeno molecular (NN) atmosfrico hasta la forma asimilable NH4+. Esta enzima puede funcionar a cabalidad en los microorganismos viviendo en forma libre o asociados, excepto en las asociaciones de rizobia con leguminosas o Parasponia, donde la sntesis de la enzima es compartida; es decir su accin depende de los dos organismos involucrados. La actividad es susceptible a las concentraciones de oxgeno de la atmsfera circundante, de tal manera que los organismos, bien aislados o asociados han adoptado mecanismos que le permiten la proteccin de la actividad de la misma, mecanismos que incluyen: proteccin respiratoria, conformacional y la compartamentalizacin.

Fig. 24. Infeccin y desarrollo nodular (Obertello, 2003).



Bien sea de vida libre o asociados los organismos se benefician de la FBN, al poder utilizar el nitrgeno del aire como fuente del elemento, e incorporarlo en compuestos esenciales para su crecimiento y desarrollo. En general la va de metabolizacin es la glutamato sintasa/glutamato sintetasa (GS/GOGAT), excepto en los lquenes, donde el amonio es asimilado va glutamato deshidrogenada. Los compuesto transportados va xilema o floema son aminocidos, principalmente glutamina o sus derivados aminas, amidas o ureidos formados por reacciones de aminacin y desaminacin.

En Venezuela, estn representados todos los

organismos y asociaciones fijadoras de nitrgeno, siendo un potencial casi inexplorado; est en nuestras manos jugar un papel en este contexto.

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Control de la oxidacin y la contaminacin en el cultivo in vitro de fresa (Fragaria X ananassa Duch.)

Control of oxidation and contamination of strawberry (Fragaria X ananassa Duch.) cultivated in vitro.

Maria Claudia Snchez-Cuevas* y Jos Luis Salaverra

Laboratorio de Biotecnologa, Departamento de Agronoma, Escuela de Ingeniera Agronmica, Ncleo de Monagas, Universidad de Oriente, Maturn. E-mail:[email protected]. *Autor para correspondencia

RESUMEN

La fresa es cultivada en casi todo el mundo, no solamente por sus caractersticas digestivas y tnicas, sino por el valor nutritivo de sus frutos, fuente importante de folato, vitamina C, fibra, potasio, flavonoides, antocianidina, fitoqumicos y antioxidantes. Las experiencias de la micropropagacin en fresas indican que las vitroplantas son ms uniformes, presentan un mayor nmero de estolones, tienen una mayor sobrevivencia en el campo y el rendimiento de frutos se incrementa en un 24% que las plantas propagadas por el mtodo tradicional. Es indispensable evitar la contaminacin con microorganismos para lograr xito en el establecimiento, incubacin y manipulacin del tejido in vitro, ya que stos pueden destruir los explantes, retrasar su desarrollo al competir con ellos o generar modificaciones en el medio que afectan negativamente su sobrevivencia y desarrollo. La contaminacin puede provenir del tejido vegetal o ser introducida durante la manipulacin del tejido. En los primeros intentos por establecer explantes de fresa in vitro se observ una alta contaminacin por hongos y bacterias, a ms del ennegrecimiento de algunos cultivares. En el presente trabajo se evalu el efecto del tiempo de inmersin (10, 20 y 30 min) y tres concentraciones (10, 20 y 30%) de cloro comercial (5,25% de hipoclorito de sodio) en la desinfeccin de explantes de fresa cv. Fresno. El tratamiento 20 min en cloro comercial al 20% mostr la menor contaminacin y la mayor sobrevivencia de los explantes, y mayor formacin de brotes. La oxidacin de los explantes del cv. Aiko fue completamente eliminada con la adicin de cisteina (4 g/l) en presencia de luz, permitiendo la sobrevivencia del 100% de los explantes. Palabras clave: Fresa, cultivo de tejidos, contaminacin, oxidacin, desinfeccin

ABSTRACT Strawberry is cultivated all around the world, not only for its digestive and tonic properties, but because of the nutritional value of its fruits, important source of folate, vitamin C, fiber, potassium, flavonoids, antocianidin, phytochemicals and antioxidants. Prior experiences with strawberry micropropagation indicate that vitroplants are more uniform, produce higher number of runners, have better survival in the field, and the fruit yield increases in 24% than plants propagated by the traditional method. It is necessary to avoid the contamination with microorganisms in order to achieve success in the establishment, incubation and manipulation of the tissue in vitro, since contaminants can destroy the explants, delay their development by competing with them or generate changes in the culture medium that negatively affect their survival and growth. Contamination can come from the explant or can be introduced during the manipulation of plant tissue. In the initial attempts to introduce strawberry plants to in vitro conditions, a high contamination by fungi and bacteria was observed, besides tissue blackening in some cultivars. In the present work, disinfection of the strawberry explants cv. Fresno was done by means of immersion of the shoots in the plant crown in commercial chlorine (sodium hypoclorite, 5.25%) for different time intervals (10, 20 and 30 min) and various chlorine concentrations (10, 20 and 30%). The best treatment was 20% chlorine with a 20 min immersion time, which better reduced the contamination, allowing a greater survival of the explants and a higher shoot formation. The treatment that reduced more efficiently tissue oxidation was cystein (4 g/l) with light, which allowed 100% explant survival. Key words: Strawberry, tissue culture, contamination, tissue oxidation, disinfection.

INTRODUCCIN

La fresa, una planta pequea de la familia Rosaceae, se cultiva en Venezuela en pequeas plantaciones, con una produccin baja a pesar de la

gran demanda que siempre ha tenido, tanto para el consumo fresco como para el uso industrial. Las condiciones agroecolgicas del Municipio Caripe del estado Monagas son aptas para el desarrollo del cultivo: altitud de 1100 msnm, temperatura promedio

Snchez-Cuevas y Salaverra. Control de la oxidacin y la contaminacin en el cultivo in vitro de fresa


anual de 25 C y una precipitacin media anual de 1200 mm En esta zona se produjeron cerca de 200 tn de fresa entre 1972 y 1974, pero actualmente la produccin ha disminuido drsticamente debido a la escasez de material importado de siembra, a que las variedades sembradas no son las ms adecuadas y a que existen plagas que afectan negativamente al cultivo (vila, 1986). La planta de fresa se propaga exclusivamente en forma asexual, por lo que existe gran diseminacin de virus, micoplasmas, nemtodos y hongos. Estos problemas se han agudizado por la dificultad de detectar estos patgenos ya que muchas plantas enfermas son asintomticas, a la introduccin de cultivares susceptibles, al intercambio internacional y a las nuevas tcnicas de siembra (Boxus et al., 1977).

Las plantas de fresa procedentes de cultivo de tejidos producen mayor nmero de estolones que las plantas propagadas por los mtodos tradicionales (Boxus et al., 1984), son ms uniformes y sobreviven ms en el campo (Swartz y Lindstrom, 1986). Experiencias llevadas a cabo en Venezuela sealan que las plantas micropropagadas poseen un excelente vigor y una ptima produccin de estolones y frutos en el campo (FUSAGRI, 1984).

Los explantes para el cultivo de tejidos de fresa pueden provenir de la corona o de los estolones, aunque es ms fcil la extraccin y la desinfeccin de los explantes de los estolones (Villegas, 1990). La alta pubescencia de los tejidos y su contacto directo con el suelo inducen una alta contaminacin de los explantes, especialmente cuando stos son extrados de plantas provenientes del campo (Villalobos y Prez, 1979). Estos contaminantes pueden ocasionar la muerte de los tejidos, competir con ellos o modificar el medio (Mroginski y Roca, 1991). Existen diversas tcnicas para el control de la contaminacin in vitro, tales como el uso de fungicidas y antibiticos en la planta madre, el explante y/o el medio de cultivo; sin embargo, no se recomienda la adicin de antibiticos al medio para controlar la contaminacin bacteriana porque no son efectivos en la mayora de los casos (Pierik, 1987), aunque algunos autores sealan que su adicin es necesaria cuando el tejido tiene infecciones sistmicas (Phillips et al., 1981). Ocasionalmente ocurre el ennegrecimiento del tejido, con posterior necrosis del explante. Para evitarlo se sugiere disminuir la intensidad de la luz, agregar antioxidantes al medio y el explante, subcultivar con frecuencia, incrementar las sales de calcio, reducir el nivel de nitrato en el medio y sumergir el explante en

medio lquido por un da (Swartz y Lindstrom, 1986).

El objetivo de este trabajo fue evaluar procedimientos de desinfeccin superficial con hipoclorito de sodio y el uso de antioxidantes durante el establecimiento in vitro de explantes de fresa, para controlar la contaminacin y el ennegrecimiento de los tejidos de los cv. Fresno y Aiko.

MATERIALES Y MTODOS

Los explantes fueron extrados de plantas procedentes de siembras comerciales ubicadas en La Guanota y San Agustn, Municipio Caripe del estado Monagas. Las yemas extradas de la corona, de unos 5 mm de longitud, fueron lavadas tres veces, durante 5 min, con agua corriente y unas gotas de jabn lquido lavaplatos. Las yemas del cv Fresno fueron sumergidas en alcohol 70% durante 10s, despus en una solucin de cloro comercial (5,25% de hipoclorito de sodio) en tres concentraciones (10, 20 y 30%), durante tres perodos de inmersin (10, 20 y 30 min) y finalmente se lavaron tres veces con agua destilada estril. Los explantes, constitudos por el domo meristemtico y 2 3 primordios foliares, se sembraron en tubos de ensayo en 10ml del medio nutritivo de Boxus (1977), y se incubaron a una temperatura de 24 2 C y un fotoperodo de 12 hr luz. El diseo experimental utilizado fue completamente aleatorizado en arreglo factorial 3 x 3, con 10 repeticiones. La evaluacin de los porcentajes de contaminacin, sobrevivencia y nmero de brotes se realiz 20 das despus del establecimiento del ensayo.

En el ensayo de antioxidantes, los explantes

del cv. Aiko fueron desinfectados con una solucin de cloro comercial (5,25% de hipoclorito de sodio) al 20% durante 20min. A cada explante se le agreg, previo a la siembra, los antioxidantes: cistena (4 g/l), cido ctrico (150 mg/l) + cido ascrbico (150 mg/l) o polivinilpirrolidona (5 y 10%). Los explantes sembrados en el medio de Boxus (1977) fueron sometidos a oscuridad completa o a 12 hr/luz y 12 hr/oscuridad. Cada tratamiento estaba compuesto por 16 explantes, en un diseo estadstico completamente aleatorizado con 4 repeticiones. Las diferencias entre los porcentajes de sobrevivencia, evaluada 8 das despus de la siembra, se realizaron mediante la prueba de Sokal y Rohlf.



RESULTADOS Y DISCUSIN

En la evaluacin de contaminacin se observ que a medida que se aumentaron la concentracin de cloro comercial y el tiempo de inmersin, la contaminacin de los explantes disminuy (Figura 1). Los menores porcentajes de contaminacin se obtuvieron con 20 y 30% de cloro comercial y perodos de inmersin de 20 y 30 min. En el tratamiento con 30% de cloro y 30 min de inmersin,

a pesar de no haber habido contaminacin, la sobrevivencia fue de tan solo el 50%, lo que indica que este tratamiento fue txico para los explantes. El mayor porcentaje de sobrevivencia se obtuvo con el tratamiento compuesto por cloro 20% y 20 min de inmersin.

A los 20 das despus de la siembra (DDS), el tratamiento de cloro comercial al 20% registr el

Figura 1. Efecto de la concentracin de cloro comercial (5,25% hipoclorito de sodio) y el tiempo de inmersin en los

porcentajes de contaminacin y sobrevivencia de los explantes de fresa, 20 das despus de la siembra. Barras con la misma letra no difieren estadsticamente entre si ( 0,05)



mayor nmero de brotes por explante, sin diferencias significativas con la mxima dosis (Figura 2). Estos resultados indicaron que el mejor comportamiento de los explantes se obtuvo al desinfectarlos con cloro comercial al 20% durante 20min. Otros investigadores tambin han utilizado cloro para desinfectar tejidos de fresa. Dodds y Roberts (1985) recomiendan desinfectar con 10% de cloro (0,5% de hipoclorito de sodio), mientras que Bhojwani y Razdan (1983) sealaron que una concentracin de 0,3 a 0,6% de hipoclorito de sodio durante 15min a 30min es suficiente para descontaminar la mayora de los tejidos. Tambin se ha recomendado tener cuidado con la dosis del desinfectante y el tiempo de inmersin seleccionados, pues todos los desinfectantes son txicos para el tejido. Otro factor a tomar en cuenta es la pubescencia del tejido. Villalobos y Prez (1979) sealaron que, si el tejido es pubescente, debe hacerse un prelavado con detergente o etanol 70% durante 30s para romper la tensin superficial y hacer la superficie ms accesible a la accin de los agentes desinfectantes. Otros autores han utilizado exitosamente el cloro en cultivos en los que la contaminacin y la fenolizacin del tejido dificultan el establecimiento de los explantes (Romero, 2000a; Romero, 200b).

La aplicacin de antioxidantes tuvo un efecto muy marcado en la sobrevivencia de los explantes de fresa cv Aiko. Los mejores resultados se obtuvieron con el tratamiento de cistena (4 g/l) en

presencia de luz, seguidos por el control con luz, cistena (4 g/l) sin luz y la mezcla de cido ascrbico y cido ctrico (AC + AA) sin luz, en los cuales se observ un 50% de sobrevivencia (Figura 3). La cistena, de acuerdo con George y Sherrington (1984), no previene la oxidacin, sino que acta en la rpida remocin de cualquier quinona que se forma. Adems, como es un aminocido, pudo haber inducido un rpido desarrollo de los explantes al ofrecer nitrgeno orgnico rpidamente disponible para suplir sus requerimientos. Los explantes tratados con polivinilpirrolidona (PVP) en dosis de 5% (con y sin luz) y 10% sin luz no sobrevivieron, as como los que no recibieron antioxidante alguno y permanecieron en la oscuridad (control sin luz). Estos resultados contrastan con los obtenidos por Snchez-Cuevas y otros (2001), quienes lograron obtener los mejores resultados de sobrevivencia de 80% de explantes de pimentero, libres de oxidacin, con la adicin de PVP (0,5 y 1,0 g/l) en presencia de luz.

De acuerdo con Davies y Creasy, citados por

George y Sherington (1984), las enzimas involucradas en la biosntesis y la oxidacin de fenoles se incrementan con la luz, por lo que es conveniente mantener los explantes en la oscuridad unos das antes de pasarlos a una intensidad lumnica baja.

En este experimento, los resultados indicaron

Figura 2. Efecto de la concentracin de cloro y del tiempo de inmersin en el nmero de brotes formados en

explantes de fresa cv Fresno, 20 das despus de la siembra. Barras con la misma letra no difieren estadsticamente entre si ( 0,05)



que la sobrevivencia de los explantes disminuy en ausencia de luz, con o sin la adicin de antioxidantes, excepto en los explantes que recibieron la adicin de AC + AA. As mismo, a pesar de George y Sherrington (1984) indican que en pices de Malus la adicin de la poliamida PVP fue esencial para la sobrevivencia de los explantes, al remover los componentes fenlicos, en fresa la mortalidad de los explantes fue muy alta cuando se aadi PVP, probablemente porque las concentraciones empleadas hayan sido muy altas. Por ltimo, no es frecuente observar oxidacin de tejidos en fresa y son pocos los cultivares que presentan ennegrecimiento (Villalobos y Prez, 1979).

CONCLUSIONES

La alta contaminacin por hongos y bacterias de los explantes, generada por la procedencia de las plantas directamente del campo, el contacto directo de las yemas con el suelo por su ubicacin en la corona (cuello de la planta) y por la gran pubescencia del tejido de fresa, fue controlada efectivamente con la inmersin de los explantes en una solucin de cloro 20% durante 20 min. Concentraciones ms altas o perodos de inmersin mas prolongados causaron necrosis en el tejido. El tratamiento de los explantes con cloro 20% y 20 min de inmersin indujeron la

mayor formacin de brotes (1,8 brotes). La oxidacin fenlica de los tejidos de fresa

cv Aiko se redujo con la adicin de cistena (4 g/l) directamente al explante antes de la siembra, manteniendo el tejido en presencia de luz.

AGRADECIMIENTOs

Se agradece el financiamiento de esta investigacin al Consejo de Investigacin de la Universidad de Oriente.

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Figura 3. Efecto de la presencia o ausencia de luz y de los antioxidantes Cisteina, cido ctrico (AC) + cido ascrbico

(AA) y polivinilpirrolidona (PVP) en la sobrevivencia de explantes de fresa cv Aiko. Barras con la misma letra no difieren estadsticamente entre si ( 0,05)



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Evaluacin de cinco tratamientos fitosanitarios en la produccin de plntulas de cedro rosado (Acrocarpus fraxinifolius Wight & Arn) en etapa de semillero en Tuxpan, Veracruz, Mxico

Evaluation of five agricultural treatments in the production of pink cedar (Acrocarpus fraxinifolius Wight &

Arn) at the nursery stage in Tuxpan, Veracruz, Mxico

Pablo Elorza-Martnez* y Jos Manuel Maruri-Garca

Facultad de Ciencias Biolgicas y Agropecuarias de la Universidad Veracruzana, Campus Tuxpan, Carretera Tuxpan-Tampico km. 7.5 S/

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