UNIVERSIDAD DE EXTREMADURA · 2012. 6. 18. · Transfecciones transientes.....113 5.1....

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“REGULACIÓN TRANSCRIPCIONAL POR EL RECEPTOR

DE DIOXINA EN AUSENCIA DE XENOBIÓTICOS”

Memoria de Tesis Doctoral presentada por

Dª María Belén Santiago Josefat

Diciembre 2002

PEDRO M. FERNANDEZ SALGUERO, Profesor Titular del Departamento de Bioquímica y

Biología Molecular y Genética de la Facultad de Ciencias de la Universidad de Extremadura,

CERTIFICA:

Que la presente Tesis Doctoral, titulada “Regulación transcripcional por el receptor de dioxina

en ausencia de xenobióticos”, de la que es autora Dª. María Belén Santiago Josefat ha sido

realizada bajo mi dirección en el Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Genética

de la Universidad de Extremadura.

Que revisada la memoria presentada, el Director del trabajo considera que posee las condiciones

requeridas para un trabajo de Tesis Doctoral. Por todo ello,

AUTORIZA:

Su presentación y defensa pública frente al tribunal designado al efecto de acuerdo con lo

previsto en el Real Decreto 185/1985 de 23 de enero.

Y para que así conste y surta los efectos oportunos, expido el presente certificado en Badajoz a

10 de octubre de 2002.

Fdo. Pedro M. Fernández Salguero

DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR Y GENETICA Unidad de Bioquímica y Biología Molecular Facultad de Ciencias Avenida de Elvas s/n 06080- BADAJOZ ESPAÑA-SPAIN Tel/Phone: 34 924 289300 Ext. 6867 / 34 924 289419 Fax: 34 924 289419

Uni

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a

RREECCOONNOOCCIIMMIIEENNTTOOSS

Para la realización del presente trabajo de Tesis Doctoral hemos recibido la inapreciable

ayuda de diferentes personas, Departamentos e Instituciones. Por ello, deseamos expresar

nuestro agradecimiento:

Al Dr. Gervasio Martín Partido del Departamento de Ciencias Morfológicas y Biología

Celular y Animal de la Universidad de Extremadura por su constante ayuda en microscopía de

fluorescencia.

Al Dr. Alberto Álvarez Barrientos del Centro de Investigaciones Cardiovasculares

(Instituto de Salud Carlos III, Madrid) por la realización de los experimentos de citometría de

flujo incluidos en este trabajo.

A la Dra. Ana Cuenda Méndez del MRC (University of Dundee, Escocia) por

proporcionarnos los vectores de expresión pEGFP y pCMV5.

Al Dr. Dionisio Martín Zanca del Instituto de Microbiología Bioquímica

(CSIC/Universidad de Salamanca) por cedernos amablemente la línea celular Swiss-3T3.

A los Dres. Harry Gelboin y Kris Krausz del National Cancer Institute (NIH, EE.UU.)

por la proteína recombinante y el anticuerpo frente al CYP1A2.

A la Dra. Sara Dallas (University of Texas, EE.UU.) por el anticuerpo frente a LTBP-1.

Al Dr. Richard Pollenz (University of South Florida) por el anticuerpo frente al AhR.

Al Dr. Carlos López Otín de la Universidad de Oviedo por el medio condicionado de la

línea celular HT1080.

A las áreas de Biología Celular y Genética de la Facultad de Ciencias por poner a nuestra

disposición su infraestructura y equipamiento.

A la Junta de Extremadura (Consejería de Educación, Ciencia y Tecnología) y al Fondo

Social Europeo por la dotación de una beca de formación de personal investigador.

Este trabajo ha sido financiado por la Dirección General de Ciencia y Tecnología

DGCYT (1FD97-0934) y la Consejería de Educación, Ciencia y Tecnología de la Junta de

Extremadura (2PR01A092).

AAGGRRAADDEECCIIMMIIEENNTTOOSS

Me gustaría dar las gracias a todas las personas que, de una u otra forma, han

hecho posible la realización de este trabajo:

Al Dr. Pedro Fernández Salguero, por tu dedicación y constancia en la dirección

de este trabajo, por todo lo que he aprendido a tu lado, por la confianza que siempre has

depositado en mí y por tu amistad.

A todos los miembros del área de Bioquímica y Biología Molecular, por todos los

momentos que hemos compartido en estos años y por hacer tan agradable la

convivencia en el laboratorio. A Pedro Macías, por tu ayuda en la realización de algunas

figuras presentes en este trabajo. A Yolanda, por tu generosidad y alegría. A Chari, por

tu cariñoso apoyo. A Pedro Dorado, por tu buen humor y sencillez.

A Lali y a Sonia, mis niñas, porque nada de esto hubiera sido igual sin vosotras al

lado; gracias por hacer del trabajo un lugar donde disfrutar cada día, por todas las

alegrías y problemas compartidos, por vuestro apoyo, confianza y amistad.

A Susana, por mostrarme la libertad de una verdadera amistad; a Toni, por tu

inagotable ternura y generosidad y por ser tan especial como eres; a Juan Antonio, por

tus innumerables encantos. A los tres, por todo lo que me habeis dado y por ser mi

familia en Badajoz durante estos años, gracias de todo corazón.

A Nuria, por tu paciencia con tus amigos becarios, por perdonarnos todo el tiempo

que hemos dejado de compartir y por tu gran sentido de la amistad.

A Javi, Luis, Joaquín y Lola, por todos los buenos momentos que compartimos y

por la risa tan necesaria. A Guadalupe, por ser un ejemplo de coherencia y

determinación.

A Javi, porque, ni mucho menos, todo fue naufragar...

A mis padres y a mi hermano, por apoyarme siempre en todas mis decisiones, por

estar siempre tan cerca de mí y por todo lo que me dais cada día.

AABBRREEVVIIAATTUURRAASS

IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN GGEENNEERRAALL..........................................................................................1

1. Las dioxinas............................................................................................................. 3

2. El receptor de dioxina (AhR) ................................................................................ 4

3. Mecanismo de acción del receptor de dioxina ..................................................... 8

4. Características de AhR y de ARNT.................................................................... 10

4.1. Estructura proteica y dominios funcionales....................................................10

4.2. Regulación de su expresión génica.................................................................12

5. Localización celular.............................................................................................. 13

6. Otros mecanismos que podrían participar en la activación del AhR.............. 15

OOBBJJEETTIIVVOOSS......................................................................................................................17

CCAAPPÍÍTTUULLOO II .....................................................................................................................19

INTRODUCCIÓN ...................................................................................................19

1. Degradación de proteínas .................................................................................... 20

2. Mecanismo de acción del sistema ubiquitina/proteosoma................................ 21

2.1. Conjugación con ubiquitina o ubiquitinación.................................................22

2.2. Degradación por el proteosoma 26S de las proteínas ubiquitinadas ..............24

3. Regulación de la degradación proteica por ubiquitina/proteosoma................ 26

3.1. Regulación general .........................................................................................27

3.2. Regulación específica .....................................................................................27

3.2.1. Regulación por modificación del sustrato. ...............................................27

3.2.2. Regulación por modulación de la ubiquitinación.....................................28

3.2.3. Regulación por “proteínas auxiliares”. ...................................................28

3.2.4. Regulación por ocultación de la señal de degradación. ..........................28

4. Inhibidores del proteosoma ................................................................................. 29

4.1. Inhibidores sintéticos ......................................................................................30

4.2. Inhibidores naturales.......................................................................................30

5. El receptor de dioxina y el proteosoma .............................................................. 31

RESULTADOS .........................................................................................................33

1. 2,3,7,8-tetraclorodibenzo-p-dioxina (TCDD) induce la degradación del

AhR por el proteosoma. ...................................................................................... 34

2. La inhibición del proteosoma induce la translocación nuclear del AhR

en ausencia de xenobióticos................................................................................. 35

3. El AhR translocado al núcleo tras la inhibición del proteosoma es

transcripcionalmente activo................................................................................ 42

4. La inhibición del proteosoma produce un incremento en la expresión

de ARNT. .............................................................................................................. 46

5. La sobre-expresión de ARNT es suficiente para producir la

translocación nuclear de la proteína de fusión EGFP-AhR ............................ 47

6. La inhibición del proteosoma induce la interacción de Sp1 con el

promotor de Arnt ................................................................................................. 49

7. El tratamiento con MG132 induce un aumento en el nivel de

fosforilación de Sp1 en células vivas .................................................................. 52

8. La inhibición de la proteína quinasa C bloquea la unión de Sp1 al

promotor de Arnt ................................................................................................. 53

9. La inhibición de PKC disminuye el incremento en la fosforilación de

Sp1 y la transcripción de Arnt provocado por MG132 .................................... 55

10. La inhibición de PKC bloquea la translocación nuclear del AhR

dependiente de la inhibición del proteosoma .................................................... 56

DISCUSIÓN...............................................................................................................58

CCAAPPÍÍTTUULLOO IIII....................................................................................................................67

INTRODUCCIÓN ...................................................................................................67

1. La super-familia de TGF−β−β−β−β ................................................................................. 68

2. Secreción de TGF-ββββ como un complejo latente ................................................. 69

3. Estructura y expresión de las LTBPs ................................................................. 72

4. Activación del TGF-ββββ latente .............................................................................. 75

5. Enfermedades asociadas a alteraciones en la latencia de TGF-ββββ..................... 78

6. El receptor de dioxina y TGF-ββββ .......................................................................... 79

RESULTADOS .........................................................................................................81

1. Análisis de genes expresados diferencialmente en función de la

presencia o ausencia del AhR ............................................................................. 82

2. Los cultivos de MEFs Ahr-/- presentan mayores niveles proteicos de

LTBP-1 ................................................................................................................. 85

3. La sobre-expresión de Ltbp-1 en MEFs Ahr-/- está regulada a

diferentes niveles.................................................................................................. 86

4. Los niveles de expresion de Ltbp-2, Ltbp-3 y Ltbp-4 no difieren

significativamente en presencia o ausencia de AhR ......................................... 87

5. Los cultivos de MEFs Ahr-/- secretan más cantidad de TGF-ββββ activo y

latente en relación a los cultivos silvestres......................................................... 88

6. La expresión de Ltbp-1 en MEFs no está regulada por TGF-ββββ1111...................... 92

7. Los cultivos de MEFs Ahr-/- presentan una menor actividad

metaloproteinasa-2 (MMP-2) ............................................................................. 93

DISCUSIÓN...............................................................................................................95

CCOONNCCLLUUSSIIOONNEESS...........................................................................................................101

MMÉÉTTOODDOOSS.......................................................................................................................104

1. Cultivos celulares y tratamientos ...................................................................... 105

1.1. Cultivo primario de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) ...................105

1.2. Fibroblastos Swiss-3T3 ................................................................................106

1.3. Células epiteliales Mv 1 Lu (CCL64)...........................................................106

1.4. Tratamientos de los cultivos celulares ..........................................................106

2. Extracción de RNA total .................................................................................... 107

3. Análisis de la expresión de genes....................................................................... 107

3.1. Análisis mediante RT-PCR...........................................................................107

3.1.1. Transcripción Reversa (RT)....................................................................107

3.1.2. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) .........................................108

3.2. Análisis mediante northern-blot ...................................................................109

3.3. Differential Display ......................................................................................111

4. Secuenciación ...................................................................................................... 113

5. Transfecciones transientes................................................................................. 113

5.1. Construcción de vectores de expresión.........................................................113

5.1.1. Construcción del vector pEGFP-AhR.....................................................113

5.1.2. Construcción del vector pCMV5-ARNT..................................................114

5.2. Transfecciones ..............................................................................................114

6. Citometría de flujo ............................................................................................. 115

7. Análisis mediante western-blot .......................................................................... 115

7.1. Preparación de extractos proteicos de cultivos de MEFs .............................115

7.1.1. Extractos citosólicos y totales.................................................................115

7.1.2. Extractos nucleares.................................................................................116

7.2. Medida de la concentración de proteína .......................................................116

7.3. Electroforesis y transferencia a membrana de nitrocelulosa ........................116

7.4. Inmunodetección...........................................................................................117

8. Cambio de movilidad electroforética (Electrophoretic mobility shift

assay, EMSA)...................................................................................................... 118

9. Marcaje in vivo de células con 32PO4H3 e inmunoprecipitación de Sp1 ........ 119

10. Inmunocitoquímica .......................................................................................... 120

11. Bio-ensayo de actividad de TGF-ββββ .................................................................. 121

11.1. Preparación de los medios condicionados ..................................................121

11.2. Ensayo de inhibición de la proliferación celular ........................................121

12. Medida de la actividad gelatinolítica de las metaloproteinasas

(MMPs) secretadas en los medios condicionados por MEFs......................... 122

BBIIBBLLIIOOGGRRAAFFÍÍAA..............................................................................................................124

AABBRREEVVIIAATTUURRAASS

ACT D: actinomicina D

ββββ-ME: beta-mercaptoetanol

BP: benzo[a]pireno

BSA: bovine serum albumin; albúmina de suero bovino

CHX: cicloheximida

DD-PCR: differential display- polymerase chain reaction

DMSO: dimetil-sulfóxido

dNTPs: desoxi-nucleótidos tri-fosfato

DTT: ditiotreitol

EDTA: ethylenediaminetetraacetic acid; ácido etilen-diamino-tetraacético

EGTA: ethylene glycol-bis(β-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid; ácido etilen-glicol-

bis-(β-aminoetil-éter)-N,N,N’,N’-tetraacético

LLnL: N-acetil-leucinil-leucinil-norleucinal

MEFs: mouse embrionic fibroblasts; fibroblastos embrionarios de ratón

MG132: carbobenzoxil-leucinil-leucinil-leucinal

MOPS: 3-[N-Morpholino]propanesulfonic acid; ácido 3-[N-morfolino]propanosulfónico

PBS: phosphate buffer saline; tampón fosfato salino

PCR: polymerase chain reaction; reacción en cadena de la polimerasa

PMSF: phenylmethylsulfonyl fluoride; fluoruro de fenil metil sulfonilo

RT: reverse transcription; transcripción reversa

SDS: sodium dodecyl sulfate; dodecil sultato sódico

SDS-PAGE: sodium dodecyl sulfate-polyacrilamide gel

TCDD: 2,3,7,8-tetraclorodibenzo[p]dioxina

TEMED: N,N,N’,N’-tetrametil etilendiamino

Tris: tris(hidroximetil)aminometano

1

IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN GGEENNEERRAALL

Introducción general

3

1. Las dioxinas

Bajo el término de dioxinas se incluye una clase de hidrocarburos aromáticos

policíclicos (PAHs, Polycyclic Aromatic Hydrocarbons), con estructura casi planar y

con propiedades químicas y físicas muy similares entre sí. Las dioxinas son compuestos

no naturales y altamente tóxicos. Una cantidad significativa de dioxinas tiene su origen

en procesos industriales (234, 258) entre los que se incluyen la combustión de materia

orgánica, la fabricación de pasta de papel y la producción de plásticos como el PVC.

También forman parte de algunos pesticidas, refrigerantes industriales y disolventes y

están presentes en el humo del tabaco. Además, cantidades relevantes de dioxinas

pueden detectarse como resultado de incendios forestales masivos. Debido a su gran

estabilidad química son contaminantes medioambientales persistentes y, dado que son

lipofílicos, tienden a acumularse en el tejido adiposo de los animales.

2,3,7,8-tetraclorodibenzo-p-dioxina, también denominado TCDD o, simplemente,

dioxina, es el miembro prototipo de esta clase de compuestos y el más ampliamente

estudiado. El TCDD es la sustancia cancerígena más potente que se ha utilizado en

animales de experimentación, en los que se ha caracterizado exhaustivamente su efecto

como inductor de tumores. Sin embargo, y tras numerosos estudios, aún no se conoce

con exactitud la sensibilidad humana a TCDD, si bien se estima unas 10 veces menor

que la de roedores. La preocupación social sobre los efectos nocivos de las dioxinas se

vio incrementada en 1976 tras el accidente en Seveso (Italia), en el que la explosión de

una planta química provocó la emisión a la atmósfera y a las fuentes de agua de altos

niveles de TCDD. El efecto más común registrado en la población tras este accidente

fue una erupción cutánea llamada cloracné. Desde entonces, numerosos experimentos

con animales, así como varios estudios epidemiológicos, han demostrado que la dioxina

tiene un amplio espectro de efectos negativos sobre la salud. Un aumento en la

incidencia de distintos tipos de cáncer (hepático, tiroides y fibrosarcomas) y de

malformaciones genéticas ha sido asociado con la exposición a dioxina en regiones de

Vietnam en las cuales se utilizó el agente naranja como desfoliante. De manera

ocasional, surgen alarmas sanitarias por altos niveles de dioxinas en los alimentos. La

más reciente ocurrió en el año 1999 cuando se puso de manifiesto que una partida de


4

aves destinadas al consumo humano había sido alimentada con piensos contaminados

con dioxinas. En animales, los efectos tóxicos relacionados con la exposición a TCDD

resultan en un amplio espectro de alteraciones toxicológicas y patológicas (120). TCDD

es un potente agente teratogénico, que, cuando es administrado a hembras de ratón hacia

la mitad del periodo de gestación, causa el “síndrome del paladar hendido” e

hidronefrosis (50). TCDD también induce la expresión génica de enzimas

destoxificadoras, entre las que se incluyen miembros de la súper-familia de citocromos

P450. Estas proteínas microsomales participan en el proceso inicial de la conversión de

ciertos compuestos lipofílicos a derivados hidrosolubles que puedan ser excretados por

vía renal. Sin embargo, TCDD es un sustrato débil para dichos sistemas de

destoxificación. Esta molécula, al contrario que otros PAHs como benzo[a]pireno (BP),

4-aminobifenil (ABP), 2-amino-1-metil-6-fenilimidazo[4,5-b]piridina (PhIP) o 7,12-

dimetil-benz[a]antraceno (DMBA), no tiene efectos genotóxicos, ya que su

metabolismo no origina derivados epóxidos capaces de unirse covalentemente al DNA.

Resulta sorprendente que diversos PAHs, y en particular TCDD, a pesar de ser

moléculas artificiales, puedan ser reconocidas como ligandos de alta afinidad (K0.5=1-10

nM) por una proteína intracelular denominada receptor de dioxina (AhR, Aryl

hydrocarbon Receptor) (figura 1).

2. El receptor de dioxina (AhR)

El AhR es un factor de transcripción activado por unión de ligando, que media los

efectos biológicos de TCDD a través de su heterodimerización con una segunda

proteína denominada translocador nuclear del AhR (ARNT, Aryl hydrocarbon Receptor

Nuclear Translocator) o factor inducible por hipoxia 1β (HIF1β, Hypoxia-Inducible

2,3,7,8-tetraclorodibenzo-p-dioxina (TCDD)

benzo[a]pireno (BP)

Figura 1. Estructura química de dos de los PAHs que actúan como ligandos de alta afinidad del AhR


5

Factor 1ββββ). La formación de este heterodímero transcripcionalmente activo induce la

expresión de genes diana que codifican para enzimas implicadas en destoxificación,

tanto de la fase I (citocromos P450, CYP450) como de la fase II (transferasas). Los

CYP450 actúan como mono-oxigenasas capaces de metabolizar un amplio espectro de

sustratos, con un bajo nivel de afinidad y una escasa eficiencia catalítica. Sus funciones

van desde la síntesis y degradación de hormonas esteroideas, vitaminas y ácidos grasos

(“endobióticos”) hasta el metabolismo de sustancias exógenas como fármacos,

contaminantes medioambientales y carcinógenos (“xenobióticos”) (211). El hecho de

que las enzimas inducidas por la unión de xenobióticos al AhR tengan actividad

degradativa frente a dichas moléculas, ha conducido a la idea de que esta vía representa

una respuesta metabólica adaptativa que protege al organismo de la exposición a cierta

clase de contaminantes medioambientales. Sin embargo, esta ruta no siempre ofrece

protección. En muchos casos, la inducción de estas enzimas conduce a una

activación/inactivación metabólica de sus sustratos, tanto exógenos como endógenos.

En el caso de sustratos exógenos, la acción de estas enzimas puede, en determinados

casos, convertirlos en compuestos carcinogénicos más potentes y difíciles de eliminar,

incrementando así el riesgo de cáncer. En el caso de sustratos endógenos, la acción de

estas enzimas puede provocar su inactivación, con las consecuencias fisiológicas

adversas que ello pueda conllevar. Aunque los mecanismos que regulan la toxicidad

inducida por las dioxinas no se conocen completamente a nivel molecular, una gran

cantidad de evidencias experimentales indican que se encuentran mediados por el AhR.

Resulta evidente que el AhR surgió en la escala evolutiva mucho antes de la

presencia de estos compuestos policíclicos aromáticos en el medio ambiente. Su

expresión constitutiva en la mayoría de los tipos celulares y la conservación de su

secuencia proteica entre diversos grupos de vertebrados (117), tanto acuáticos como

terrestres, sugieren un papel relevante para el AhR en la fisiología celular. A pesar de

ello, el AhR es considerado un receptor “huérfano” ya que no se conocen ni su ligando

endógeno ni su función fisiológica. Varias evidencias experimentales sugieren que el

AhR puede activarse transcripcionalmente en ausencia de ligando exógeno (42, 179,

314), aunque aún no ha sido descrito si esto ocurre a través de un ligando endógeno no

identificado o si interviene algún otro proceso. El triptófano y otros compuestos que


6

contienen grupos indol (43, 313), metabolitos del ácido araquidónico como lipoxina A4

(48, 267), la bilirrubina (279), el 7-ceto-colesterol (266), algunos flavonoides (54) y

ciertas moléculas presentes en la orina (5) interaccionan con el AhR induciendo la

transcripción del gen diana Cyp1A1. Sin embargo, los bajos niveles, la poca potencia

inductora y la distribución restringida de estos compuestos los hacen candidatos poco

probables como reguladores endógenos del AhR en la mayoría de los tejidos. Así, se ha

propuesto que el AhR pudiera haber evolucionado como parte de un sistema inducible

por unión de sustrato que estuviera encargado de metabolizar sustancias lipofílicas

presentes en la dieta y que TCDD podría estar mimetizando la unión de esas moléculas

al receptor. TCDD induce cambios en la proliferación y la diferenciación de una gran

variedad de tipos celulares (24, 148) por lo que, alternativamente, otra posibilidad es

que TCDD esté mimetizando la acción de un ligando endógeno involucrado en la

regulación de estos procesos celulares.

Las evidencias más claras que relacionan al AhR con funciones fisiológicas

provienen del estudio de ratones “knock-out” para este receptor (Ahr-/-). Estos ratones

no expresan AhR y, por tanto, carecen de la inducción de genes dianas tras el

tratamiento con TCDD. Inesperadamente, se observó que el nivel constitutivo de

algunos de estos genes se encuentra marcadamente disminuido en ausencia del AhR, lo

que de nuevo sugiere que este receptor está implicado en procesos fisiológicos

independientes de la unión de xenobióticos. Los ratones Ahr-/- tienen un desarrollo y un

crecimiento hepático disminuidos, alteraciones en el sistema inmune periférico,

hipertrofia en el músculo cardíaco, hiperplasia e hiperqueratosis en la piel,

hiperproliferación de vasos sanguíneos en el hígado con presencia de fibrosis,

calcificaciones en el útero y deficiencias reproductivas (1, 16, 83, 85, 162, 270). Este

conjunto de observaciones sugieren que el AhR juega un papel relevante en procesos

fisiológicos y organogénicos. El “síndrome del paladar hendido” observado en los

ratones expuestos a TCDD es dependiente del AhR ya que no es observado en los

ratones Ahr-/-. El mecanismo por el cual el AhR media la aparición de este síndrome

podría estar relacionado con una disminución en los niveles de algunos factores de

crecimiento indispensables en el desarrollo embrionario (34). En este sentido, un

fenotipo de “paladar hendido” similar al que provoca TCDD ha sido descrito para


7

ratones que carecen de la expresión de TGF-β3 (Transforming Growth Factor ββββ3)

(139). Desde el punto de visto toxicológico, los ratones Ahr-/- no son susceptibles a la

toxicidad aguda inducida por TCDD ya que, incluso cuando son tratados con una dosis

10 veces superior a la empleada en ratones control, no presentan alteraciones clásicas

como acumulación lipídica en los hepatocitos ni atrofia en la corteza del timo (84). Por

tanto, el AhR media la toxicidad aguda inducida por dioxina en ratón. Por otra parte, la

exposición crónica a PAHs como benzo[a]pireno (BP) conduce a la aparición de

tumores sólo en el caso de ratones que poseen AhR y no en ratones Ahr-/- (276),

aportando una clara evidencia del papel del AhR en carcinogénesis mediada por estos

compuestos xenobióticos.

Uno de los fenotipos más llamativos en los ratones Ahr-/- es una marcada

patología hepática. El hígado de los ratones carentes del AhR es de aproximadamente la

mitad del tamaño que el de los ratones silvestres. Adicionalmente, en el hígado de los

ratones Ahr-/- aparece una acumulación de colágeno que resulta en fibrosis hepática,

fundamentalmente alrededor de las triadas portales (83, 85, 270). También presentan

una mayor proliferación de vasos sanguíneos en la zona portal y en algunas zonas del

parénquima, con bloqueo del sistema portal-sistémico (162). La presencia de fibrosis y

la degeneración hepática incrementa con la edad. El metabolismo del ácido retinoico

hepático también se encuentra alterado, observándose niveles más altos de esta vitamina

y de sus derivados en los ratones Ahr-/- con respecto a los animales silvestres (11). Esto

puede deberse a una deficiencia en la capacidad de los ratones Ahr-/- para catabolizar el

ácido retinoico, proceso que es llevado a cabo por un miembro de la familia de los

citocromos P450 (315). Este aumento en ácido retinoico se produce en paralelo a un

aumento en la actividad de la enzima transglutaminasa de tipo II (TGasa-II), una

proteína inducible por ácido retinoico a través del receptor de ácido retinoico (11). Otra

característica del hígado de los ratones Ahr-/- es la presencia de un nivel proteico

elevado de las formas activas de TGF-β1 y β3, particularmente en las áreas que

presentan una mayor fibrosis (324). Este aumento parece ser debido a una regulación

pos-transcripcional, ya que no se encuentran diferencias a nivel de mRNA.

Adicionalmente, podría estar también mediado por los altos niveles de la actividad

TGasa-II, que convierte la forma latente de estas proteínas en la forma activa. Esta


8

hipótesis se ve apoyada por la observación de que los cultivos primarios de hepatocitos

de ratones Ahr-/- presentan niveles elevados de TGF-β1 activo (324). La familia de

proteínas TGF-β está compuesta por citoquinas que inhiben proliferación celular y

promueven muerte celular por apoptosis. Cabe la posibilidad de que las alteraciones en

la expresión y actividad de TGF-β1 podrían estar implicadas en el menor tamaño del

hígado así como en la existencia de fibrosis hepática en estos ratones. De manera

similar, los fibroblastos embrionarios procedentes de ratones Ahr-/- presentan una tasa

de proliferación celular más baja y una mayor apoptosis en relación a fibroblastos

embrionarios procedentes de ratones silvestres, lo que probablemente sea también

debido a la sobre-producción de TGF-β1 (78).

3. Mecanismo de acción del receptor de dioxina

El receptor de dioxina está presente en la mayoría de tipos celulares del organismo

(232) y, durante la ontogenia, desde el estadio de blastocito hasta la edad adulta (229).

La unión del AhR a sus ligandos produce la activación del receptor, lo que conlleva

cambios en su compartimentalización celular. En ausencia de ligando, la forma latente

del AhR se encuentra asociada a dos moléculas del chaperón HSP90 (Heat Shock

Protein 90) (228, 317), a una molécula de la chaperonina p23 (142) y a una de la

proteína XAP2 (Hepatitis B virus X-Associated Protein 2) (197), también conocida

como ARA9 (AhR-Associated protein 9) (39) o AIP (AhR-Interacting Protein) (180).

Tras la unión del ligando, el AhR se acumula rápidamente en el núcleo celular donde

forma un heterodímero transcripcionalmente activo con ARNT (AhR Nuclear

Translocator) (113). Esta heterodimerización disocia el complejo HSP90-XAP2-p23

del AhR (142). El heterodímero activo AhR/ARNT se une a elementos reguladores

denominados XREs o DREs (Xenobiotics o Dioxin Response Elements) situados en

regiones potenciadoras/promotoras de genes diana, incrementando así la transcripción

de los mismos (256). La secuencia consenso establecida para el XRE es 5’ GCGTG 3’.

Mediante el análisis de bases de datos ha sido posible identificar esta secuencia

consenso en numerosos genes potencialmente regulados por el AhR (163). El

heterodímero AhR/ARNT se une en una relación 1:1 a esta secuencia consenso (65). A


9

la actividad transcripcional de los receptores nucleares del tipo del AhR contribuyen

además co-factores transcripcionales ubicuos. En el caso de AhR/ARNT se ha descrito

que los co-activadores p300/CBP (cAMP response element binding protein (CREB)-

Binding Protein) facilitan la interacción entre el heterodímero AhR/ARNT y los

componentes de la maquinaria basal de transcripción asociados a la caja TATA. Esta

interacción se realiza a través de ARNT (150). También participan el co-activador

RIP140 (Receptor Interacting Protein 140) y varios miembros de la familia SRC

(Steroid Receptor Coactivator) que se unen al AhR en la región rica en glutamina

(160). Algunos de estos factores tienen actividad acetiltransferasa con la que acetilan las

histonas en su extremo N-terminal reduciendo la afinidad entre estas proteínas y el

DNA y, por tanto, las interacciones nucleosoma-nucleosoma (288). Así, la interacción

del complejo AhR/ARNT con estos factores en la región potenciadora provocaría una

remodelación de la cromatina en la zona promotora de los genes diana, lo cual facilitaría

la unión de la maquinaria basal y el inicio de la transcripción por la RNA polimerasa II

(149). En la figura 2 se muestra un esquema del mecanismo de acción propuesto para la

activación transcripcional de genes dependientes del AhR.

Los genes diana para el AhR identificados hasta la fecha codifican para enzimas

implicadas en la destoxificación metabólica, tanto de la Fase I (Cyp1A1, Cyp1A2 y

Cyp1B1) como de la Fase II (NADPH:quinona oxidoreductasa, NqoI; aldehido

deshidrogenesa 4, Aldh4; UDP-glucuronosiltransferasa 1A6, Ugt1a6; glutation-S-

Figura 2. Esquema del mecanismo propuesto para la activación transcripcional por el AhR.


10

transferasa Ya, Gsta1) (256). Recientemente, una nueva isoenzima de citocromo P450

regulable por el AhR ha sido clonada y caracterizada en células de hepatoma de ratón

(250). Se ha descrito también una acción reguladora negativa para el AhR,

proponiéndose que su unión a las secuencias XRE podría impedir estéricamente el

acceso de otros factores de transcripción a sus regiones específicas de interacción en el

promotor de los correspondientes genes diana (98, 238, 309).

4. Características de AhR y de ARNT

4.1. Estructura proteica y dominios funcionales

AhR y ARNT pertenecen a la familia de reguladores transcripcionales con

dominios bHLH/PAS (basic Helix-Loop-Helix/Period[PER]-Aryl hydrocarbon

receptor nuclear translocator[ARNT]-Single minded[SIM]). Este grupo de proteínas

está implicado en el control de procesos fisiológicos tales como embriogénesis,

desarrollo, neurogénesis, ritmo circadiano, metabolismo y la respuesta a hipoxia (52,

104, 120, 316).

Tanto AhR como ARNT poseen un dominio bHLH localizado en el extremo N-

terminal de la proteína (figura 3). La región básica media la unión al DNA mientras que

el dominio HLH es necesario para la dimerización con otras proteínas. Siguiendo hacia

el extremo C-terminal presentan un segmento de homología, denominado PAS, que

también se encuentra en dos proteínas reguladoras de Drosophila melanogaster, PER

(Period, una proteína de ritmo circadiano) y SIM (Single-minded, participa en el

desarrollo del sistema nervioso central). El dominio PAS presenta dos copias de una

repetición degenerada de unos 110 aminoácidos denominadas PAS-A y PAS-B,

separadas entre sí por unos 50 aminoácidos. La región PAS-B contiene parte del

dominio de unión al ligando y un dominio necesario para la interacción del AhR con

HSP90. Estudios recientes de modelización proteica sugieren que el ligando se une

preferencialmente al dominio PAS-B, en concreto a los residuos Leu347 y Ala375

(239). El extremo C-terminal del AhR, de ARNT y de SIM contiene una región rica en

glutamina (Q), similar a los dominios de activación presentes en otros factores de


11

transcripción. Esta región podría interactuar con diversos co-activadores, aún no

completamente caracterizados, para regular el proceso de transactivación.

El AhR por sí mismo presenta baja capacidad de unión al DNA, de modo que los

homodímeros AhR/AhR son transcripcionalmente inactivos (293). La adquisición de la

capacidad transcripcional por parte del AhR requiere de su interacción con ARNT; así,

la forma activa del receptor de dioxina es heterodimérica. Por otro lado, la proteína

ARNT no une TCDD ni tiene la capacidad de heterodimerizar con el AhR si este no se

encuentra unido a ligando. Aunque ARNT también posee un dominio de

transactivación, parece que es el AhR el que aporta esta función dentro del

heterodímero.

Tanto AhR como ARNT poseen una señal de localización nuclear (NLS, Nuclear

Localization Signal) situada en el extremo N-terminal de la proteína. La NLS es

reconocida por dos componentes del complejo que forma el poro nuclear. El AhR

presenta además dos señales de exportación nuclear (NES, Nuclear Export Signal), una

en el dominio bHLH y otra en el dominio PAS-A; ambas ricas en leucina y reconocidas

por la proteína CRM1 (Chromosome Region Maintenance 1) (18, 132).

La capacidad de dimerización de las proteínas bHLH les otorga un potencial

mecanismo de diversidad reguladora. Por ejemplo, diferentes heterodímeros pueden

poseer diferente estabilidad, diferentes afinidades de unión al DNA o diferentes

secuencias de reconocimiento en las regiones promotoras. Esto sugiere que el AhR

podría formar heterodímeros con otras proteínas con dominios bHLH distintas a ARNT,

PAS BASIC

HELIX-LOOP-HELIX

A B

PPER

SSIM

AAhR

AARNT

A B

A B

A B

Figura 3. Estructura esquemáticade varios miembros de la familiade reguladores transcripcionalesbHLH/PAS: AhR y ARNT deratón y SIM y PER de Drosophilamelanogaster. Se indican lasregiones de homología y losdominios funcionales de cadaproteína.

Q

Q

Q


12

generando moléculas reguladoras con propiedades diversas. Por analogía con otros

sistemas de proteínas bHLH, tanto la cantidad absoluta de cada miembro del

heterodímero como sus cantidades relativas podrían influir en el alcance y el tipo de

respuesta que desencadenan. Se ha encontrado que el AhR está generalmente en exceso

con respecto a ARNT (127) y que, por tanto, ARNT podría ser la proteína limitante en

la activación del AhR en algunos tipos celulares.

Los miembros de la familia de factores de transcripción con dominios bHLH/PAS

han sido clasificados en dos categorías. En el grupo I se incluyen AhR,

HIF1α (Hypoxia-Inducible Factor 1αααα) (310), HLF/EPAS1 (HIF-Like

Factor/Endothelial PAS1) (80), SIM (284) y Trachealess (318). Estos reguladores

tienen propiedades comunes tales como la capacidad de unión a HSP90 y la capacidad

de heterodimerización con ARNT, pero carecen de la capacidad de formar

homodímeros activos. Por el contrario, el grupo II, formado por ARNT, ARNT2 y PER,

muestran promiscuidad en la heterodimerización, poseen capacidad de formación de

homodímeros activos y ninguno de ellos se une a HSP90.

4.2. Regulación de su expresión génica

En vertebrados se han identificado dos genes que codifican para el AhR. El

primero se identificó en ratones (79, 233) y ahora se sabe que está presente en la

mayoría de los vertebrados, incluidos los peces, donde es denominado AhR1. Un

segundo gen que codifica para un AhR divergente (AhR2) ha sido también descrito en

peces (117) pero no en mamíferos. Aunque el AhR se expresa constitutivamente, su

nivel proteico varía en función de la especie, del tipo celular y del estadio de desarrollo

(93). La secuencia del promotor del AhR es rica en GC, carece de caja TATA y

contiene al menos 4 sitios potenciales de unión para los factores de transcripción Sp1 y

Sp3, que participan en el control de su expresión basal (87). Poco se sabe acerca de la

regulación transcripcional del gen del AhR. Algunos factores de crecimiento como

PDGF (Platelet-Derived Growth Factor) y FGF (Fibroblastic Growth Factor) inducen

la expresión del AhR (303). El factor de crecimiento TGF-β (Transforming Growth

Factor-ββββ) también regula la expresión del AhR aunque el tipo de regulación es


13

específico de tipo celular (319). Asimismo, parece que una inhibición en la actividad

histona acetilasa de p300 disminuye la expresión del AhR (94). El cDNA obtenido a

partir del mRNA de ratón tiene un tamaño aproximado de 6 kb y codifica para una

proteína de 805 aminoácidos con un peso molecular de 95 kDa (79).

En relación a ARNT, además de la forma identificada inicialmente (248), se ha

encontrado una proteína similar en varias especies animales que ha sido denominada

ARNT2. En roedores, esta segunda proteína presenta un 63% de homología en su

secuencia de aminoácidos con respecto a ARNT (75). A pesar de que Arnt y Arnt2

tienen un patrón de expresión muy diferente, ambas son capaces de interaccionar con el

AhR. Mientras que Arnt se encuentra ampliamente distribuida entre los distintos tejidos,

tanto embrionarios como adultos, la expresión de Arnt2 se limita al cerebro y al riñón

(75, 125). El gen que codifica para ARNT contiene un promotor carente de caja TATA

y tiene una expresión constitutiva. Entre otros elementos reguladores, contiene dos cajas

GC a las cuales se unen constitutivamente los factores Sp1 y, en menor grado, Sp3

(308). En ratón, Arnt codifica para una proteína de 770 aminoácidos con un peso

molecular de 87 kDa.

5. Localización celular

En ausencia de ligando, el AhR se encuentra asociado a las proteínas HSP90, p23

y XAP2. La interacción entre el AhR y HSP90 requiere dos dominios estructurales del

AhR, la región bHLH y el dominio PAS-B (12), el cual media también la interacción

con XAP2 (39). Esta asociación es necesaria para el mantenimiento citoplasmático y la

estabilidad del AhR (143), protegiendo además a este receptor de su degradación por el

proteosoma en ausencia de ligando exógeno (61, 251). La unión a HSP90 mantiene al

AhR en la conformación necesaria para la unión del ligando y limita la entrada del AhR

en el núcleo por bloqueo de la señal de localización nuclear (NLS, Nuclear Localization

Signal) (132).

En ausencia de ligando, la mayor parte de los complejos formados por el AhR y

las proteínas asociadas se localiza en el citoplasma celular, si bien una parte de ellos es

activamente transportada desde el citosol hasta el núcleo en un flujo constante (133,


14

249). Cuando el AhR es activado por la unión de un ligando exógeno se acumula en el

núcleo, con lo que se favorece la formación de heterodímeros activos AhR/ARNT.

Desde un punto de vista mecanístico, la unión del ligando al dominio PAS-B induce un

cambio conformacional que expone la NLS, la cual es reconocida por las importinas α y

β, transportadores solubles que median el paso a través del poro nuclear (6),

transportando el AhR al núcleo. Allí, al interaccionar con ARNT, se liberan del AhR las

HSP90 y las proteínas asociadas (142, 169). Mientras está heterodimerizando con

ARNT y se encuentra unido a las secuencias XRE del DNA el AhR permanece en el

núcleo ya que la secuencia de exportación nuclear (NES, Nuclear Export Signal),

localizada en el dominio bHLH, se encuentra protegida por la interacción proteína-

proteína y no es accesible. Tras la transactivación de los genes diana, el AhR se disocia

de ARNT, con lo que la región NES, ahora accesible, es reconocida por CRM1

(Chromosome Region Maintenance 1) y el receptor es exportado al citosol (132) donde

es ubiquitinado y degradado por el proteosoma (176, 251) (figura 4).

Figura 4. Modelo de transducción de señales mediado por el heterodímero AhR/ARNT mostrandolos cambios en la distribución celular de los componentes tras la activación por unión de ligando.Modificado de Ikuta, T. y col., 2000. J Biochem (Tokyo) 127(3): 503-509.

NLS, nuclear localization signal

XRECYP

CRM1, Chromosome Region Maintenance 1

ARNT

AhR

importina αααα

importina ββββ

TCDD

NES, nuclear export signal HSP90/XAP2/p23


15

Se ha observado que, tanto en presencia como en ausencia de ligando exógeno, la

entrada del AhR en el núcleo está regulada por la NLS (249). Estudios recientes indican

que en la exportación del AhR desde el núcleo hasta el citosol, en ausencia de ligando,

interviene la NES localizada en el dominio PAS-A de la proteína (18). Además, en

ausencia de ligando exógeno, la inhibición de la exportación nuclear del AhR produce la

acumulación del receptor en este compartimento celular, lo que a su vez incrementa las

tasas de transcripción de genes diana (249).

Estudios inmunohistoquímicos han mostrado que ARNT reside mayoritariamente

en el núcleo y que la exposición de las células a TCDD no modifica su distribución

celular (237) ni su nivel de expresión (235). Además, al contrario de lo que se pensó

inicialmente, y por lo que se originó su denominación, ARNT no interviene realmente

en la translocación nuclear del AhR.

En conjunto, los resultados experimentales disponibles permiten sugerir que, ya

que la actividad biológica del AhR está controlada por su asociación a proteínas

presentes en distintos compartimentos celulares, el control de su localización

intracelular puede representar un mecanismo de regulación de su actividad en

condiciones fisiológicas y, por tanto, en ausencia de interacción con xenobióticos.

6. Otros mecanismos que podrían participar en la activación del AhR

Adicionalmente a la existencia de algún posible ligando endógeno aún no

identificado para el AhR, se han propuesto otros mecanismos que, en ausencia de

ligando exógeno, podrían participar en la activación de este receptor. Esta activación

podría estar regulada de forma específica según el proceso fisiológico o el tipo celular

en el que la función del AhR fuera necesaria.

Tanto el AhR como ARNT son proteínas susceptibles de ser fosforiladas en

residuos de treonina, sugiriendo que una quinasa de serina/treonina podría estar

involucrada en la regulación de las funciones de estas proteínas. En concreto, la

estimulación de PKC (Proteín Kinasa C) podría actuar en la activación del AhR

sinergísticamente con la activación por unión de ligando (37, 44, 173). Además,


16

experimentos in vitro sugieren que la fosforilación de ARNT es requerida para la

heterodimerización con el AhR (19).

Recientemente, el grupo de Fuji-Kuriyama ha identificado un gen cuya expresión

es activada por el AhR, y que codifica para una proteína denominada “represor del

AhR” o AhRR (AhR Repressor) (199). Esta proteína, con estructura similar a AhR y

ARNT, es capaz de inhibir la activación del AhR compitiendo con este por la

dimerización con ARNT y formando dímeros AhRR/ARNT capaces de unirse a las

secuencias XRE. No obstante, los complejos AhRR/ARNT son transcripcionalmente

inactivos. Así, el AhRR podría participar en la regulación de la actividad del AhR

mediante un mecanismo de retroalimentación negativa.

Se ha demostrado que el AhR interacciona físicamente tanto con pRB

(retinoblastoma) (95) como con NF-κB (295). Estas proteínas participan en la

regulación del ciclo y en la diferenciación celular en respuesta a citoquinas y factores de

crecimiento, respectivamente. La interacción del AhR con estas rutas de señalización

podría explicar la capacidad de TCDD para alterar proliferación y diferenciación. Del

mismo modo, la ruta de señalización mediada por el AhR interacciona con otras rutas

celulares, incluyendo la respuesta a hipoxia (41) y la señalización a través del receptor

de estrógenos (38) y de los receptores para la hormona tiroidea y el ácido retinoico

(212). Estas interacciones incluyen la competición por factores reguladores comunes

que pudieran estar en concentraciones limitantes así como el establecimiento de

diferentes patrones de interacción proteína-proteína. Este abanico de posibles

mecanismos de activación permitiría al AhR participar en diferentes procesos de

desarrollo y homeostasis celular.

17

OOBBJJEETTIIVVOOSS

Objetivos

18

Gran parte de los estudios realizados sobre el receptor de dioxina en los últimos

años se han centrado en definir su contribución a procesos fisiológicos y al

mantenimiento de la homeostasis celular. La así denominada función endógena del AhR

implica, per se, la existencia de mecanismos moleculares de activación transcripcional

independientes de la interacción con ligandos exógenos.

Con el presente trabajo pretendemos aportar un posible mecanismo de regulación

de la actividad del AhR en ausencia de ligandos exógenos e identificar nuevas rutas de

señalización celular en las que este receptor pudiera estar implicado.

Los objetivos de este estudio son:

1. Analizar la implicación del sistema proteosomal de degradación de proteínas

en la activación del receptor de dioxina en ausencia de xenobióticos (Capítulo

I).

2. Identificar nuevos genes diana regulados por el receptor de dioxina y no

relacionados con el metabolismo de xenobióticos (Capítulo II).

19

CCAAPPÍÍTTUULLOO II

IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN

CAPITULO I. Introducción

20

1. Degradación de proteínas

Los procesos celulares se encuentran regulados, en muchos casos, por cambios en

los niveles de las proteínas reguladoras implicadas. Esta modulación puede ocurrir a

nivel tanto de la síntesis de dichas proteínas como de su degradación. Las células

eucariotas tienen varios sistemas proteolíticos. El primero en descubrirse fue el sistema

lisosomal, un conjunto de proteasas y otras hidrolasas agrupadas en vacuolas limitadas

por una membrana. En principio se pensó que los lisosomas eran el único sistema de

degradación proteica en las células. Sin embargo, estudios posteriores demostraron que

este sistema desempeña un papel minoritario en la degradación de proteínas citosólicas,

ocupándose fundamentalmente de la degradación de proteínas asociadas a membrana y

de proteínas extracelulares internalizadas en la célula por endocitosis (99). Las proteínas

citosólicas pueden ser degradadas por varios sistemas proteolíticos. Las calpaínas son

proteasas citosólicas dependientes de Ca2+ que se activan cuando se produce un daño

celular que aumenta la concentración de este catión (312). Otra familia importante de

proteasas citosólicas son las caspasas, las cuales se activan por una gran variedad de

estímulos tóxicos que generalmente conducen a muerte celular programada (262).

El sistema proteolítico citosólico encargado de la eliminación de la mayor parte de

las proteínas celulares requiere la hidrólisis de ATP y se denomina sistema

ubiquitina/proteosoma. En esta vía de degradación, que actúa bien en el citosol o bien

en la cara citosólica del retículo endoplásmico, las proteínas son en primer lugar

marcadas por la unión covalente o conjugación de múltiples moléculas de ubiquitina

(47, 103). La conjugación de una proteína con ubiquitina conduce a su rápida

degradación por el proteosoma 26S, un complejo proteolítico multi-enzimático

dependiente de ATP de unos 2.5 MDa (51). El proteosoma se encarga de la degradación

de proteínas tanto de corta (t1/2 < 3 horas) como de larga (t1/2 de varias horas o días) vida

media, así como de proteínas mal plegadas, dañadas o mutadas (271). Estudios usando

inhibidores del proteosoma han mostrado que este se encuentra implicado en el

recambio del 80-90% de las proteínas celulares y que este recambio es esencial para

muchos de los procesos regulatorios que ocurren en la célula. Por ejemplo, la progresión

a lo largo del ciclo celular está controlada por la degradación proteosomal de ciclinas y


21

de quinasas dependientes de ciclinas (151). Asimismo, la degradación de factores de

transcripción como c-Jun (297), E2F-1 (126) y β−catenina (2) ocurre a través del

proteosoma y es esencial para la regulación del crecimiento celular y de la expresión

génica. De forma similar, la degradación por el proteosoma de proteínas quinasas como

Src (121) y PKC (174) es crítica para la progresión de ciertas cascadas de transducción

de señales.

Esta vía de degradación también juega un papel muy importante en el desarrollo

de un gran número de enfermedades humanas. Por ejemplo, una incorrecta regulación

en la degradación de la proteína supresora de tumores p53 (185) y del inhibidor de

quinasas dependientes de ciclinas p27 (220) puede promover tumorogénesis. La

degradación proteosomal de IκB, un inhibidor del factor de transcripción NF-κB, es

esencial para el desarrollo de la respuesta inflamatoria (196). Por otro lado, algunas

enfermedades de origen genético como la fibrosis quística (311), el síndrome de

Angelman (145) o el síndrome de Liddle (285) presentan mutaciones que afectan, de

una u otra forma, al correcto funcionamiento del sistema ubiquitina/proteosoma. Este

mecanismo de degradación también ha sido implicado en la patogénesis de varias

enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer (301) y la

enfermedad de Huntington (277). Otros procesos en los que el sistema

ubiquitina/proteosoma juega un papel importante son: presentación antigénica (252),

atrofia muscular (201), regulación metabólica (118, 206), adquisición de memoria de

largo plazo (40), regulación del ritmo circadiano (208) y fotomorfogénesis en plantas

(218).

2. Mecanismo de acción del sistema ubiquitina/proteosoma

La degradación de las proteínas por el sistema ubiquitina/proteosoma es un

mecanismo en dos pasos. En primer lugar, las proteínas deben ser marcadas con una

cadena de ubiquitinas, proceso dependiente de ATP en el que intervienen tres enzimas

distintas denominadas E1, E2 y E3. Una vez marcadas, en una segunda etapa, las

proteínas son degradadas por el proteosoma. En la figura 5 se muestra un esquema de

este mecanismo.


22

2.1. Conjugación con ubiquitina o ubiquitinación

La mayoría, aunque no todos los sustratos del proteosoma son marcados para su

degradación mediante la unión covalente de múltiples moléculas de ubiquitina, una

pequeña proteína de 76 aminoácidos. La conjugación de ubiquitina a la proteína sustrato

es un mecanismo que consta de tres pasos. En el primero, una molécula de ubiquitina es

activada en su residuo de glicina (Gly) C-terminal por la enzima UBA (Ubiquitin-

Activating enzyme) o E1, formando un enlace tiol-éster entre este aminoácido y un

residuo de Cys interno de E1. Este proceso es dependiente de ATP. Una única enzima

E1 cataliza todas las reacciones de ubiquitinación en la célula por lo que la inactivación

de su gen es letal. Tras la activación, la ubiquitina es transferida a un residuo de Cys de

una de las enzimas UBCs (Ubiquitin-Conjugating enzymes) o E2 (al menos 15

diferentes en eucariotas). La enzima E2 correspondiente transfiere ahora la ubiquitina

activada hasta la proteína diana, previamente unida de manera específica a un miembro

de la familia de ligasas de ubiquitina o E3s. La transferencia de la ubiquitina desde E2

puede ser directamente a la proteína sustrato o a través de un intermediario entre la

ubiquitina y la E3 ligasa. La enzima E3 cataliza por tanto el último paso en el proceso

de la unión covalente de la ubiquitina a la proteína sustrato. En sustratos poli-

ubiquitinados la primera molécula de ubiquitina es transferida al grupo ε-NH2 de un

residuo de lisina (Lys) de la proteína diana. Alternativamente, la unión puede también

realizarse a través del residuo N-terminal de la proteína que va a ser degradada (31). En

reacciones sucesivas, una cadena de poli-ubiquitina es sintetizada por transferencias

Figura 5. Esquema de la degradaciónde proteínas por el sistemaubiquitina/proteosoma. La proteínadiana, una vez marcada por poli-ubiquitinación, interacciona con elproteosoma 26S que lleva a cabo sudegradación. Kisselev, A.F. y col., 2001.Chem Biol 8(8): 739-758.


23

consecutivas de moléculas de ubiquitina a la Lys48 de la unidad previa. La proteína

ubiquitinilada resultante es entonces reconocida y degradada por el proteosoma 26S.

Las células eucariotas contienen, probablemente, cientos de enzimas E3 ligasas, y

a ellas se debe la especificidad del proceso de degradación, ya que diferentes E3s

reconocen diferentes señales presentes en las proteínas sustrato. Algunas de estas

señales están presentes en la secuencia de la proteína. La estabilidad de otras proteínas

depende de su estado de oligomerización, de su modificación pos-traduccional (como

fosforilación) o de su asociación con otras proteínas, como las chaperoninas, las cuales

pueden actuar como señales de degradación. Algunos factores de transcripción deben

separarse previamente de sus secuencias dianas en el DNA para ser posteriormente

reconocidos y degradados por el proteosoma. Ocasionalmente, es la enzima E3 ligasa la

que debe ser modificada para ser activa. En la mayoría de los casos una enzima E3

determinada reconoce un grupo de proteínas que contienen motivos estructurales

similares. La enzimas E3 ligasas pueden dividirse al menos en 4 grupos dependiendo de

la estructura o señal de degradación que reconocen:

1. La E3α fue la primera E3 ligasa identificada. Es una proteína de

aproximadamente 200 KDa que reconoce y se une a proteínas sustrato con

residuos “desestabilizantes” en el extremo N-terminal, bien residuos básicos

(tipo 1) o residuos hidrofóbicos (tipo 2). E3α también se une a una E2

específica, E2-14kDa, facilitando la transferencia de la ubiquitina activada desde

E2 hasta la proteína sustrato (247).

2. Las E3 ligasas con dominios HECT (Homologous to E6-AP Carboxil

Terminus); contienen, en el extremo C-terminal, un dominio de 350 residuos con

gran homología con el dominio C-terminal del miembro prototipo de esta

familia, E6-AP (E6-Associate Protein) (130). En este dominio se encuentra el

residuo de Cys al que se une una molécula de ubiquitina activada. En humanos

se conocen unos 20 miembros de esta familia de E3 ligasas (274). El extremo N-

terminal de estas proteínas es muy variable y está implicado en el

reconocimiento específico de las proteínas sustrato (130). Una E3 ligasa

perteneciente a esta familia puede interaccionar con diferentes E2s (274).


24

3. Los complejos SFC se encargan de la degradación de proteínas implicadas en el

control de la transición G1-S del ciclo celular. A diferencia de otras E3s, los

complejos SFC no forman intermediarios tioéster con ubiquitina, actuando

únicamente como “puentes” entre la proteína Cdc34/Ubc3 (una proteína E2) y la

proteína sustrato (226). Los complejos SFC están compuestos por dos proteínas

conservadas evolutivamente, Skp1 y Cdc53/Cul-1, y un componente variable

entre los distintos complejos SFC que es una proteína con un dominio

conservado denominado “caja F” (282). Este último componente es el

responsable de la especificidad en el reconocimiento del sustrato (227) y le da el

nombre al complejo SFC del que forma parte (por ejemplo, SFCCdc4 y SFCGrr1 en

levaduras; SFCSkp2 y SFCβ-TrCP en mamíferos). Aunque hasta el momento no ha

sido identificada ninguna secuencia consenso que pudiera estar conservada entre

los sustratos específicos para cada complejo SFC, parece que su fosforilación es

imprescindible para ser posteriormente reconocido por uno de los complejos

SFC.

4. El complejo de alto peso molecular denominado ciclosoma o APC (Anaphase

Promoting Complex) está formado por al menos 8 subunidades en células de

mamíferos y es requerido para la transición metafase-anafase (322). Las

proteínas sustrato para este complejo E3 ligasa incluyen ciclinas mitóticas y

algunos inhibidores de la transición metafase-anafase y todas ellas contienen una

señal de reconocimiento denominada “caja de destrucción” (292). Una E2

específica, E2-C actúa en coordinación con el ciclosoma para la ubiquitinación

de estas proteínas (124).

2.2. Degradación por el proteosoma 26S de las proteínas ubiquitinadas

El proteosoma 26S es un complejo proteolítico multi-funcional dependiente de

ATP, con un tamaño total de aproximadamente 2.5 MDa, que degrada proteínas poli-

ubiquitinadas convirtiéndolas en pequeños péptidos. Esta estructura contiene un núcleo

central de 20S (720 kDa), encargado de degradar las proteínas, rodeado por dos


25

complejos de 19S (890 kDa), los cuales controlan el acceso al núcleo catalítico (128)

(figura 6).

La partícula 20S presenta una estructura en forma de cilindro formado por 4

anillos, 2 anillos externos α y 2 anillos internos β. A su vez, cada anillo externo está

formado por 7 subunidades α diferentes mientras que cada uno de los anillos internos

está compuesto por siete subunidades β (15). Cada anillo β contiene tres sitios

proteolíticos situados hacia la cara interna del cilindro, de modo que la única manera de

acceder a esta zona es atravesando el canal formado por los anillos α (110). Así, a

diferencia de otros sistemas proteolíticos que presentan sus sitios activos fácilmente

accesibles, en el proteosoma estos sitios se encuentran en una cavidad interna,

evitándose así la destrucción incontrolada de las proteínas celulares. De los seis sitios

proteolíticos del proteosoma (tres en cada anillo β) dos de ellos, localizados en la

subunidad β5, cortan preferentemente después de residuos hidrofóbicos (similar a la

quimiotripsina); otros dos, situados en las subunidades β2 (similar a la tripsina), cortan

después de residuos básicos; los dos sitios catalíticos situados en las subunidades β1

cortan los péptidos preferentemente después de residuos ácidos (68, 215). Todas las

subunidades β activas del proteosoma contienen un residuo de treonina en su extremo

N-terminal, cuyo grupo hidroxilo actúa como un radical nucleófilo capaz de atacar

directamente el enlace peptídico de la proteína sustrato (111). El resto de las

subunidades β intervienen en la interacción de la proteína sustrato con cada una de las

subunidades catalíticas.

Figura 6. Esquema de la organizaciónestructural del proteosoma 26S. La unión dela proteína ubiquitinada se lleva a cabo por lasubunidad reguladora 19S. La estructura 20S,compuesta por dos anillos α y dos β, lleva acabo la proteolisis del sustrato. Kisselev, A.F. ycol., 2001. Chem Biol 8(8): 739-758.


26

Los complejos reguladores 19S aportan especificidad al proteosoma para

proteínas ubiquitinadas y controlan el acceso de los sustratos al núcleo proteolítico.

Cada partícula 19S consta de una base y de una zona de acceso. Esta última, que

contiene al menos nueve polipéptidos, se une a la cadena de poli-ubiquitinas mediante

un enlace covalente y la libera del sustrato. Asimismo presenta una actividad

isopeptidasa o proteasa específica de ubiquitina que rompe la cadena de poli-ubiquitina;

las ubiquitinas resultantes son liberadas y serán reusadas en el marcaje de otras

proteínas para su degradación (165). La base, que se asocia con la partícula 20S,

contiene 8 polipéptidos, seis de los cuales tienen actividad ATPasa. Estos péptidos

interaccionan directamente con los anillos α del núcleo 20S formando una “compuerta”

de acceso a dichos anillos cuya apertura es dependiente de ATP. Adicionalmente, las

ATPasas de la base están también encargadas de desnaturalizar las proteínas y de

conducirlas al interior del núcleo 20S (102).

A diferencia de la gran mayoría de proteasas, las cuales cortan el sustrato en un

solo punto y liberan dos fragmentos, el proteosoma degrada proteínas de forma

procesativa cortando los polipéptidos en varios puntos y generando productos

comprendidos en un intervalo de entre 3 y 22 residuos de longitud, con un tamaño

medio de 6 residuos (146). Los péptidos liberados por el proteosoma son rápidamente

hidrolizados por proteasas citosólicas hasta aminoácidos libres. En determinados tipos

celulares, una parte de estos péptidos son introducidos en el retículo endoplasmático y

transportados hasta la superficie celular unidos a moléculas del tipo I del complejo

principal de histocompatibilidad, donde son expuestos al sistema inmune (252).

3. Regulación de la degradación proteica por ubiquitina/proteosoma

El sistema ubiquitina/proteosoma puede ser potencialmente regulado tanto a nivel

de la ubiquitinación (selección del sustrato) como a nivel de la actividad del proteosoma

(degradación del sustrato). Todos los componentes de este sistema de degradación son

activos de forma constitutiva ya que es requerido para múltiples funciones celulares. Sin

embargo, se han descrito distintos niveles de regulación del proteosoma.


27

3.1. Regulación general

La actividad de los componentes del sistema ubiquitina/proteosoma pueden ser

modulada en diversas condiciones fisiológicas o patológicas. Una de ellas es la

degradación masiva de proteínas que tiene lugar en el músculo esquelético durante el

ayuno prolongado, en una infección severa, durante la acidosis metabólica, en

enfermedades neuromusculares y en la diabetes (168). En estos casos se ha descrito un

aumento en el nivel de proteínas ubiquitinadas así como un incremento en los niveles

del mRNA que codifica para la ubiquitina y para varias subunidades del proteosoma

20S (194). Este incremento en la tasa de degradación de proteínas musculares debido a

un aumento en los niveles de expresión de distintos componentes del proteosoma ha

sido también descrito durante la metamorfosis de insectos (115). Otra circunstancia en

la que se observa regulación del proteosoma es tras el tratamiento con IFN-γ (γ-

interferon). Esta citoquina induce la expresión de genes que codifican para nuevas

subunidades catalíticas del proteosoma 20S, las cuales sustituyen a las subunidades

constitutivas. Las subunidades inducidas llevan a cabo un procesamiento proteolítico de

las proteínas sustrato diferente al de las subunidades constitutivas, generando péptidos

antigénicos con mayor afinidad por las moléculas de clase I del MHC (Major

Histocompatibility Complex) estimulando así la respuesta inmune (91).

3.2. Regulación específica

3.2.1. Regulación por modificación del sustrato.

La ubiquitinación de una proteína puede ser regulada por modificaciones pos-

traduccionales de la misma que la hacen más o menos reconocible por una determinada

enzima E3. La fosforilación es un mecanismo dual que puede marcar la proteína para su

ubiquitinación o, por el contrario, protegerla frente a la misma. Se conocen un gran

número de sustratos que requieren la fosforilación de uno o varios de sus residuos antes

de su ubiquitinación. En levaduras las ciclinas Cln2 (166) y Cln3 (321) y los inhibidores

de quinasas dependientes de ciclinas Sic1 (305) y Far1 (123); en mamíferos la ciclina

D1 (70), el inhibidor de quinasas dependientes de ciclinas p27 (299) y los factores de

transcripción IκBα (32) y β−catenina (257). Opuestamente, la fosforilación de una


28

proteína también puede protegerla de su degradación por el proteosoma; este es el caso

del proto-oncogen c-mos (213) y de la proteína anti-apoptótica Bcl-2 (71).

3.2.2. Regulación por modulación de la ubiquitinación.

La degradación de algunos sustratos específicos puede ser regulada por

modulación de la maquinaria de ubiquitinación. Por ejemplo, se ha mostrado que la

degradación de reguladores mitóticos por APC es dependiente de diferentes activadores

e inhibidores (135, 306).

3.2.3. Regulación por “proteínas auxiliares”.

Algunas proteínas virales se unen a un sustrato celular específico sobre el que

funcionan como un elemento de reconocimiento para una E3. Este marcaje favorece la

ubiquitinación y posterior degradación de la proteína celular. Este es el caso de la onco-

proteína E6 del papilomavirus humano, que interacciona tanto con la E3 E6-AP como

con la proteína celular p53. Esta interacción dispara una rápida degradación de p53 lo

cual evita la inducción de apoptosis y favorece la replicación vírica (268). Un proceso

similar ocurre en el caso del virus de la inmunodeficiencia humana cuya proteína Vpu

se une tanto a β-TrCP (componente de un complejo SCF) como al receptor CD4 en el

retículo endoplasmático de las células T infectadas. Esto activa la ubiquitinación de

CD4 por SCFβ-TrCP y su posterior degradación (187). Un papel similar podrían tener las

moléculas que actúan como chaperones de proteínas mal plegadas o desnaturalizadas. Si

el chaperón es incapaz de devolver a una proteína mal plegada a su conformación

correcta, la expone a una E3 para su ubiquitinación y posterior degradación. Este es el

caso, por ejemplo, del chaperón Hsc70 (17).

3.2.4. Regulación por ocultación de la señal de degradación.

En Saccharomyces cerevisiae, el tipo sexual de las células haploides está

determinado por la presencia de uno de los factores de transcripción MATa1 ó MATα2.

En células haploides, ambos son degradados por ubiquitinación. En células diploides la

heterodimerización entre estos dos factores los protege de la degradación por el

proteosoma ya que las señales de degradación solapan con las señales de interacción

entre ambas proteínas, haciéndolas inaccesibles a la maquinaria de ubiquitinación (136).

Un mecanismo similar de protección frente a la degradación ocurre en la proteína


29

homothorax de Drosophila (4). De forma análoga se ha observado que la unión del

factor de transcripción MyoD a secuencias dianas en el DNA lo protege de la

ubiquitinación (3).

4. Inhibidores del proteosoma

La disponibilidad de inhibidores del proteosoma permite analizar en células

intactas la posible contribución de esta ruta en la degradación de una proteína

determinada. Si la adición de estos inhibidores produce un bloqueo en la degradación de

una proteína esto indicaría que su degradación se lleva a cabo por el proteosoma. En los

últimos años se han desarrollado varios tipos de inhibidores del proteosoma que pueden

entrar en la célula rápidamente e inhibir esta ruta de degradación. Aunque el proteosoma

tiene tres tipos de sitios catalíticos activos, se ha observado que la inactivación de

aquellos sitios con actividad similar a la de la quimiotripsina produce una gran

reducción en la actividad proteosomal (252). Así, la mayor parte de los inhibidores

conocidos, tanto naturales como sintéticos, tienen como diana este sitio catalítico.

Los inhibidores del proteosoma, además de constituir una herramienta útil en el

estudio de las posibles implicaciones fisiológicas de este sistema de degradación, tienen

un apreciable interés por su potencial aplicación en biotecnología y medicina. Por

ejemplo, debido a la capacidad de estos inhibidores de bloquear la activación de NF-κB,

se observó un marcado efecto anti-inflamatorio tras su administración en ratones

modelo para enfermedades inflamatorias (109). Del mismo modo, se está empezando a

estudiar la posible utilización de inhibidores del proteosoma en terapia anti-cancerígena,

tanto por sus efectos sobre los niveles de distintas proteínas implicadas en la progresión

del ciclo celular como por su capacidad de inducir apoptosis de manera selectiva en

células con un alto nivel de proliferación (74). Recientemente, se ha demostrado que la

inhibición del proteosoma bloquea la maduración del virus de la inmunodeficiencia

humana y se ha propuesto la utilización de estos inhibidores como estrategia

farmacéutica para detener la replicación viral (272).


30

4.1. Inhibidores sintéticos

Los inhibidores sintéticos del proteosoma que se usan con más frecuencia son

pequeños péptidos aldehídicos, permeables a la membrana plasmática, tales como

MG132 (carbobenzoxyl-leucinyl-leucinyl-leucinal), MG115 (carbobenzoxyl-leucinyl-

leucinyl-norvalinal) y MG101 o LLnL (N-acetyl-leucinyl-leucinyl-norleucinal). Estos

inhibidores son péptidos análogos de sustrato que forman un complejo hemiacetilo con

los grupos hidroxilos de la treonina N-terminal de las subunidades β, convirtiéndose así

en potentes inhibidores de la actividad del proteosoma. La inhibición de la proteolisis

por este tipo de inhibidores es reversible y desaparece tras la eliminación del inhibidor

del medio de cultivo. Varios de estos péptidos aldehídicos también inhiben la actividad

de ciertas proteasas lisosomales, así como de las calpaínas. MG132 (figura 7) no es sólo

el más potente de este tipo de inhibidores sino también el más selectivo, como muestra

el hecho de que la inhibición de calpaínas y catepsinas requiere una concentración de

MG132 de al menos 10 veces más que la necesaria para inhibir el proteosoma (298).

Recientemente se han desarrollado péptidos que contienen bien derivados de

grupos sulfónicos (26) o bien grupos boronatos (7) en su extremo C-terminal, ambos

con una gran especificidad y potencia de inhibición del proteosoma.

4.2. Inhibidores naturales

La lactacistina, un metabolito de Streptomyces lactacystinaeus, es un inhibidor del

proteosoma altamente específico que actúa de manera irreversible ya que se une

covalentemente a la Thr de los sitios catalíticos del proteosoma (82). En solución acuosa

y pH neutro la lactacistina se convierte en su derivado β-lactona, el cual es la forma

activa de este inhibidor. La catepsina A también puede ser inhibida por β-lactona (219).

Otros compuestos naturales que presentan capacidad de inhibición del proteosoma son:

epoxomicina, derivado de un cepa de Actinomycetes y el más selectivo de todos los

Figura 7. Estructura química del inhibidor sintético del proteosoma MG132.


31

inhibidores del proteosoma conocidos (196); eponemicina, producido por Streptomyces

higroscopicus (195); TMC-95 de Apiospora montagnei (152) y gliotoxina, un miembro

de las toxinas fúngicas (159).

5. El receptor de dioxina y el proteosoma

Como se mencionó anteriormente, el receptor de dioxina (AhR) es un factor de

transcripción activado por la unión de ligando. Tras la activación transcripcional, el

AhR es exportado desde el núcleo hasta el citosol donde es conjugado con ubiquitina y

degradado por el proteosoma. Se ha demostrado que TCDD induce la acumulación del

AhR en su estado ubiquitinado y que, además, la degradación de esta proteína requiere

de la presencia de la enzima E1 (61, 176). Por lo tanto, la interacción con TCDD

reduciría la vida media del AhR por inducción de su ubiquitinación. Este efecto es

inhibido por cicloheximida, por lo que se propone la existencia de una proteína lábil que

podría unirse al AhR activado por ligando y disparar su conjugación con ubiquitina

(177). La degradación del AhR tras su exposición a ligando exógeno podría tener dos

papeles importantes. Por un lado, este proceso podría controlar la duración y magnitud

de la actividad transcripcional del AhR. En este contexto, ha sido propuesto que la

degradación de proteínas involucradas en cascadas de transducción de señales puede

representar un potencial mecanismo de regulación de dichas rutas de señalización

(221). Un segundo mecanismo sugerido es que ya que ARNT está implicado en la

señalización de la respuesta celular frente a hipoxia, el control de la degradación del

AhR podría contribuir al mantenimiento de niveles adecuados de ARNT que aseguren

su disponibilidad para el resto de sus funciones celulares. La importancia del

mantenimiento de los niveles de ARNT se encuentra apoyada por el hecho de que los

ratones Arnt-/- mueren a día 10 de gestación (158). Además, se ha observado que el

recambio proteico del AhR en células no tratadas con ligandos exógenos también

requiere la presencia de la enzima activadora de ubiquitina E1, indicando que en

ausencia de ligando el AhR también es degradado por el sistema ubiquitina/proteosoma

(176). Teniendo en cuenta que en ausencia de ligando exógeno el AhR se encuentra

formando un complejo con HSP90 y XAP2, debe existir un estímulo que disocie este

complejo y promueva la degradación y recambio de este receptor. Esta disociación


32

podría ir acompañada de la activación transcripcional del AhR. Por todo ello, el estudio

molecular de los procesos implicados en la regulación de la actividad transcripcional del

receptor de dioxina, en ausencia de xenobióticos, podría aportar una información

relevante acerca de la contribución de este receptor en desarrollo y en el mantenimiento

de la homeostasis celular.

33

RREESSUULLTTAADDOOSS

CAPITULO I. Resultados

34

1. 2,3,7,8-tetraclorodibenzo-p-dioxina (TCDD) induce la degradación

del AhR por el proteosoma.

Experimentos previos tanto de nuestro laboratorio como de otros grupos habían

demostrado que la estabilidad proteica del receptor de dioxina (AhR) se encuentra

modulada por su ligando, TCDD, tanto in vivo (236) como en cultivos celulares (235).

En ausencia de TCDD, la vida media del AhR es de aproximadamente 28 horas. La

presencia del ligando afecta significativamente la vida media de esta proteína,

reduciéndola hasta las 3-4 horas. Este efecto se encuentra relacionado con la estabilidad

proteica ya que no se observaron cambios en los niveles de mRNA (176). Un tipo

similar de regulación de la estabilidad proteica había sido también observado para el

receptor de estrógenos, otro factor de transcripción activado por unión de ligando y con

un mecanismo de acción similar al del AhR (161). En este caso, la presencia de

estradiol disminuyó la vida media del receptor de estrógenos de 5 días a 3-4 horas (222).

Posteriormente, se demostró que esta reducción podía ser bloqueada por adición del

inhibidor del proteosoma MG132, lo que sugería que la interacción ligando-receptor

provocaba un incremento en su nivel de degradación mediada por el sistema

ubiquitina/proteosoma (210). Con estos datos, nuestro objetivo inicial fue determinar si

la disminución en los niveles proteicos del AhR tras el tratamiento con TCDD se debía

a un aumento en su tasa de degradación y si el sistema ubiquitina/proteosoma estaba

implicado en dicho proceso. En estos estudios utilizamos cultivos primarios de

fibroblastos embrionarios de ratón o MEFs (Mouse Embryonic Fibroblasts). Así,

cultivos sub-confluentes de estas células fueron tratados con DMSO (solvente), con

TCDD o con la combinación de MG132 y TCDD. El efecto de TCDD±MG132 sobre el

nivel proteico de AhR se analizó mediante western-blot en extractos celulares totales de

dichos cultivos. Como se muestra en la figura 8 el tratamiento con TCDD 10 nM

durante 4 horas redujo significativamente el nivel de proteína del AhR con respecto al

nivel presente en las células control (tratadas con DMSO). Si las células son pretratadas

con MG132 8 µM durante 2 horas antes de la adición de TCDD, se observa un bloqueo

parcial en la degradación del AhR inducida por TCDD.


35

Estos datos son consistentes con los posteriormente publicados por otros grupos

en los que se mostró que en ciertas líneas celulares la inhibición del proteosoma

bloqueaba la salida del núcleo del AhR unido a ligando, lo cual inhibe su posterior

degradación por el proteosoma en el citoplasma celular (61, 176).

Estos datos sugieren que la unión de TCDD al AhR regula negativamente la vida

media de esta proteína, probablemente por aumento de su nivel de degradación. Dada

la naturaleza química del inhibidor empleado, estos resultados apuntan al proteosoma

26S como el mecanismo de proteolisis implicado en la degradación del AhR.

2. La inhibición del proteosoma induce la translocación nuclear del

AhR en ausencia de xenobióticos.

Al analizar el proceso de degradación del AhR tras interacción con sus ligandos,

observamos que, en ausencia de ligando exógeno, el tratamiento de los cultivos

celulares de MEFs con dos inhibidores distintos del proteosoma, MG132 y LLnL (N-

acetyl-leucinyl-leucinyl-norleucinal), producía aparentemente la translocación del AhR

desde el citosol al núcleo. En la figura 9 se muestra la expresión del AhR a nivel de

proteína tanto en extractos celulares totales como en extractos citosólicos obtenidos de

MEFs tratados con los compuestos que se indican. Puede observarse que, en

tratamientos de 12 h, los dos ligandos del AhR utilizados, TCDD y benzo[a]pireno

(BP), indujeron la práctica desaparición del AhR de extractos celulares totales.

Sorprendentemente, la inhibición del proteosoma, tanto con MG132 como con LLnL, en

ausencia de xenobióticos, no tuvo efecto sobre el contenido celular total del AhR (panel

ββββ-ACTINA

TCDD −−−− + + MG132 −−−− −−−− +

AhR

Figura 8. La degradación del AhR inducidapor TCDD depende del sistemaubiquitina/proteosoma. Cultivos de MEFsfueron tratados con DMSO (solvente), conTCDD 10 nM durante 4 horas o con MG132 8µM durante 2 horas más 4 horas de tratamientocon TCDD 10 nM. Los niveles proteicos deAhR y β-ACTINA en extractos celulares totalesse determinó mediante western-blot utilizando10 µg de proteína.


36

inferior) pero sí provocó una notable disminución en los niveles citosólicos de esta

proteína (panel superior).

Dado que el AhR es un regulador transcripcional que se distribuye entre el

citosol y el núcleo, estos datos sugieren que la inhibición del proteosoma per se, es

capaz de promover la translocación del AhR desde el citosol hasta el núcleo celular.

Con el fin de definir la localización celular del AhR durante la inhibición del

proteosoma realizamos transfecciones transientes en la línea celular de fibroblastos de

ratón Swiss-3T3 con el plásmido pEGFP-AhR, que codifica para una proteína de fusión

entre la proteína verde fluorescente EGFP y el AhR. De este modo podemos seguir la

distribución del AhR entre citosol y núcleo en presencia y en ausencia de inhibidores

del proteosoma. Una vez transfectados los cultivos, se permitió la expresión de la

proteína de fusión durante 24 horas y se realizaron tratamientos durante 6 horas

adicionales con DMSO, MG132 o LLnL. Como control del proceso de translocación

nuclear los cultivos transfectados se trataron también durante 90 minutos con BP 10

µM. Como controles negativos se realizaron los mismos tratamientos en cultivos

transfectados únicamente con el vector pEGFP. Tras el tratamiento, las células fueron

observadas y fotografiadas en un microscopio de fluorescencia. El resultado de este

experimento se muestra en la figura 10A. Como cabía esperar, dada la condición de

Figura 9. La inhibición del proteosoma conduce a una bajada drástica en los niveles citosólicos del AhR sin alterar su nivel proteico total. Los cultivos se mantuvieron durante 12 horas con DMSO (solvente), BP 10 µM, TCDD 10 nM, MG132 8 µM o LLnL 50 µM. El nivel proteico del AhR en extractos celulares, tanto citosólicos como totales, se determinómediante western-blot utilizando 10 µg de proteína de cada fracción celular.

MG

132

DM

SO

BP

TCD

D

LLnL

Extractos citosólicos

Extractos totales

AhR

AhR


37

ligando de alta afinidad del AhR, el tratamiento con BP indujo una marcada

translocación de la proteína EGFP-AhR desde el citosol al núcleo celular (comparar

paneles E y F). Consistentemente con los resultados obtenidos mediante western-blot

que se muestran en la figura 9, se observó también una clara localización nuclear de la

proteína EGFP-AhR tras el tratamiento con MG132 o con LLnL (comparar paneles E, G

y H). La translocación nuclear de la proteína de fusión pEGFP-AhR no resultó ser

consecuencia de un efecto inespecífico de la proteína verde ya que ni la adición de

ligando exógeno ni de inhibidores del proteosoma produjo cambios en la distribución de

la proteína control EGFP (paneles A a D).

Comprobamos si la proteína de fusión empleada en los experimentos anteriores,

además de responder a estímulos que inducen su translocación al núcleo tenía la

capacidad para activar transcripcionalmente genes diana del AhR. Para ello, decidimos

transfectar cultivos de MEFs Ahr-/- (que carecen de expresión endógena del AhR) con

el plásmido pEGFP-AhR y determinar la expresión de algún gen endógeno regulado por

el AhR e inducible por TCDD y/o BP. En primer lugar tratamos de identificar posibles

genes diana para el AhR en MEFs. Numerosas evidencias experimentales indican que la

respuesta a dioxina presenta una marcada dependencia del tipo celular. De hecho,

algunos de los genes diana para el AhR, que son marcadamente inducidos por dioxina

en tejidos como hígado, pulmón y glándula mamaria (por ejemplo Cyp1A1 y Cyp1B1),

no lo son en líneas de fibroblastos (36, 106) ni en nuestros cultivos de MEFs (resultados

no mostrados). Sin embargo, como puede observarse en la figura 10B el tratamiento de

MEFs procedentes de ratones silvestres tanto con BP como con TCDD produjo a una

notable inducción del citocromo P450 1A2 (CYP1A2), cuya expresión constitutiva a

nivel proteico es prácticamente indetectable. Además, dicha inducción es

completamente dependiente del AhR ya que no se observa en cultivos de MEFs Ahr-/-.

Una vez identificado un gen endógeno inducible en MEFs por activación del AhR,

transfectamos cultivos de MEFs Ahr-/- con el plásmido de fusión pEGFP-AhR y

analizamos la expresión del gen Cyp1a2 mediante western-blot (figura 10C). Mientras

que el nivel basal de la proteína CYP1A2 fue indetectable tanto en MEFs Ahr-/- no

transfectados (calle 1) como en los transfectados pero no tratados con xenobióticos

(calle 3), la expresión de esta proteína resultó claramente inducida en cultivos de MEFs


38

Ahr-/- transfectados con pEGFP-AhR y además tratados durante 6 h con TCDD 10 nM

(calle 2). En conjunto, estos resultados indican que la proteína de fusión EGFP-AhR

puede activar la expresión de un gen endógeno regulable por el AhR y que, por tanto, es

transcripcionalmente activa. En fibroblastos Swiss-3T3 no detectamos expresión de la

proteína CYP1A2 ni de forma constitutiva ni inducida por MG132, lo que sugiere que la

respuesta frente a inhibición del proteosoma podría estar asociada a cultivos primarios

de fibroblastos embrionarios (MEFs).


39

Figura 10. La inhibición del proteosoma, en ausencia de ligando exógeno, induce la translocaciónnuclear de la proteína de fusión pEGFP-AhR. (A) Los cultivos de fibroblastos Swiss-3T3 setransfectaron con el vector control pEGFP (paneles A a D) o con pEGFP-AhR (paneles E a H). Tras latransfección, los cultivos fueron tratados con DMSO (A y E), BP 10 µM (B y F), MG132 8 µM (C y G)o LLnL 50 µM (D y H). (B) El gen diana del AhR Cyp1A2 es inducible en MEFs. Los cultivos de MEFprocedentes de ratones silvestres (Ahr+/+) y Ahr-/- fueron tratados durante 6 h con solvente (DMSO),BP 10 µM o TCDD 10 nM y la expresión del CYP1A2 analizada mediante western-blot utilizando 10µg de los extractos proteicos. La proteína recombinante (r1A2), expresada en el virus vaccinia, fueempleada como control positivo. (C) La proteína de fusión EGFP-AhR, transfectada en MEFs deratones Ahr-/-, induce la expresión del gen diana del AhR Cyp1A2. Cultivos de MEFs Ahr-/- fuerontransfectados con el vector de expresión pEGFP-AhR y tratados con DMSO (calle 3) o con TCDD 10nM (calle 2) durante 6 h. Cultivos de MEFs no transfectados fueron usados como control negativo (calle1). La expresión del CYP1A2 fue analizada mediante western-blot utilizando 10 µg de los extractosproteicos. La proteína recombinante (r1A2), expresada en el virus vaccinia, fue empleada como controlpositivo (calle 4). La expresión de β-ACTINA se empleó como control de carga.

A pEGFP pEGFP-AhR

A

F B

G C

E

H D

MG132

BP

LLnL

DMSO

C B

CYP1A2

DM

SO

BP

TCD

D

DM

SO

BP

TCD

D

r1A

2

Ahr+/+ Ahr-/-

ββββ-ACTINA

CYP1A2

1 2 3 4


40

Considerando que MG132 ha sido descrito como un inhibidor más especifico del

proteosoma 26S que LLnL, seleccionamos dicho compuesto para profundizar en el

mecanismo de activación transcripcional del AhR por inhibición del proteosoma.

Numerosos estudios han mostrado que la inhibición del proteosoma altera los niveles de

reguladores del ciclo celular, induciendo en ocasiones fenómenos de toxicidad y de

muerte celular por apoptosis (181). Por ello, analizamos si el tratamiento con MG132,

en condiciones experimentales similares a las que serán empleadas en experimentos

posteriores afectaba a la viabilidad de los MEFs. Tal como se muestra en la figura 11,

el tratamiento de cultivos de MEFs con MG132 8 µM no afectó significativamente la

viabilidad celular determinada por citometría de flujo analizando la presencia de picos

hipodiploides (contenido en DNA<1) indicativos de apoptosis (panel A). Sólo

tratamientos prolongados (12 h) indujeron un índice apoptótico del 17±3%.

Adicionalmente, el tratamiento de estos cultivos con MG132 no alteró la distribución de

la población celular en las distintas fases del ciclo (panel B). Por tanto, en nuestras

condiciones experimentales, MG132 no alteró de manera significativa el ciclo celular de

los MEFs.

0

20

40

60

80

100

0

20

40

60

80

100

G0/G1 S G2/M

MG132 (h) MG132 (h) 0 3 6 12 0 3 6 12

Apo

ptos

is, %

Porc

enta

je d

e cé

lula

s

Figura 11. El tratamiento con MG132 no afecta significativamente la viabilidad decultivos de MEFs. Cultivos de MEFs fueron tratados con MG132 8 µM durante los tiempos indicados y las células se procesaron para su análisis por citometría de flujo tras tinción conioduro de propidio. (A) Fracción de células apoptóticas obtenida a partir de los picoshipodiploides. (B) Distribución de la población celular en las distintas fases del ciclo.

A B


41

El proceso de activación transcripcional del AhR por xenobióticos es

relativamente rápido, detectándose la expresión de genes diana (como CYP450) a los

60-90 minutos de la unión del ligando al receptor (245). Sin embargo, la activación del

AhR por inhibición del proteosoma, siguiendo un proceso aparentemente más complejo,

sería esperable que fuera más lento en el tiempo. Para analizar el patrón temporal de

activación del AhR por inhibición del proteosoma, tratamos cultivos de MEFs con

MG132 8 µM en periodos de hasta 12 horas y determinamos el nivel del AhR, tanto en

extractos celulares totales como en extractos nucleares, mediante western-blot. Como

puede observarse en la figura 12, los niveles proteicos totales del AhR permanecieron

esencialmente constantes durante el tratamiento con MG132, si bien se observó una

débil caída a las 12 h. El análisis de proteínas constitutivas como β-ACTINA no mostró

cambios significativos en su expresión por inhibición del proteosoma, lo que sugiere

que la disminución en los niveles de AhR a las 12 horas de tratamiento pudiera ser

consecuencia de mecanismos alternativos de degradación proteica no caracterizados en

este estudio (datos no mostrados). El análisis de extractos nucleares de los mismos

cultivos mostró que el tratamiento con MG132 indujo una acumulación marcada y

transiente del AhR en el compartimento nuclear. Este proceso de acumulación fue

progresivo, alcanzando su máximo nivel a las 6 horas de tratamiento para disminuir

hasta niveles próximos a la situación basal a tiempos más largos.

Figura 12. La inhibición del proteosoma induce la acumulación del AhR endógeno en elnúcleo. Cultivos subconfluentes de MEF fueron tratados con MG132 8µM durante los tiempos indicados. El nivel del AhR fue analizado mediante western-blot utilizando 10 µg de extractos totales o nucleares. Como control positivo y negativo se utilizaron extractos nuclearesprocedentes de MEF silvestres y MEF AhR -/- tratados ambos con TCDD 10 nM durante 90 minutos.

Extractos totales

Extractos nucleares

0 3 6 12 MG132 8 µµµµM

Ahr

+/+

Ahr

-/-

1.5 1.5 TCDD 10 nM

AhR

AhR

Tiempo (h)


42

En conjunto, estos datos sugieren que la inhibición del proteosoma conduce a la

translocación y acumulación del AhR en el núcleo en ausencia de xenobióticos.

3. El AhR translocado al núcleo tras la inhibición del proteosoma es

transcripcionalmente activo.

La localización del AhR en el núcleo celular no implica, sin embargo, que se

encuentre en una conformación transcripcionalmente activa. Con el fin de analizar si la

translocación nuclear del AhR estaba acompañada de la formación de heterodímeros

activos AhR/ARNT, capaces de reconocer y de unirse a secuencias reguladoras

características de genes diana, realizamos experimentos de cambio de movilidad

electroforética en gel (EMSA, Electrophoretic Mobility Shift Assay) utilizando

extractos nucleares de MEFs tratados con MG132. Como se observa en la figura 13, los

cultivos de MEF incubados con MG132, mostraron un incremento con el tiempo en la

formación de heterodímeros nucleares AhR-ARNT con capacidad de unión a la

secuencia consenso XRE3 (calles 2 a 5). La especificidad de la hibridación del

heterodímero con la secuencia consenso se confirmó mediante ensayos de competición

con un exceso molar de 100 veces de la secuencia XRE3 no marcada (calle 8), así como

por la adición de anticuerpos anti-AhR y anti-ARNT (calles 9 y 10). Controles

adicionales fueron realizados con extractos nucleares obtenidos de cultivos de MEFs

Ahr-/- (calle 7) y MEF Ahr+/+ (calles 6, 11 y 12) ambos tratados con TCDD durante 90

minutos.

Por lo tanto, la inhibición del proteosoma no sólo promueve la translocación

nuclear del AhR sino que también induce su activación transcripcional y la formación

de heterodímeros AhR/ARNT con capacidad de unión a secuencias consenso XRE3.


43

El siguiente objetivo fue estudiar si este aumento en la capacidad de unión del

heterodímero AhR/ARNT a secuencias consenso se correspondía con un aumento en la

expresión de genes diana del AhR. Basándonos en nuestros resultados previos que

indicaban que el CYP1A2 era inducible por xenobióticos en MEF (figura 10B),

estudiamos mediante western-blot el nivel de expresión de este citocromo tras el

tratamiento con MG132 a distintos tiempos. La inhibición del proteosoma con MG132,

en ausencia de ligandos exógenos, produjo un aumento progresivo en los niveles

Figura 13. La inhibición del proteosoma incrementa la capacidad de unión de losheterodímeros AhR/ARNT a las secuencias XRE3. Los extractos nucleares procedentes decultivos de MEF tratados con MG132 8 µM durante 0 h (calle 2), 3 h (calle 3), 6 h (calle 4) y12 h (calle 5) fueron analizados mediante EMSA utilizando las secuencias XRE3 marcadasradiactivamente. Extractos nucleares procedentes de MEF Ahr+/+ (calle 6) y MEF Ahr-/-(calle 7), ambos tratados con TCDD 10 nM durante 90 minutos, se utilizaron como controlpositivo y negativo, respectivamente. La especificidad de la banda se confirmó mediante lapreincubación de los extractos nucleares de MEF tratados con MG132 durante 6 h o de lostratados con TCDD durante 90 minutos con un exceso molar de 100 veces de la secuenciaXRE3 no marcada (calles 8 y 11, respectivamente) o con 2 µg de anticuerpo anti-AhR (calles 9y 12, respectivamente). Además, los extractos nucleares procedentes de MEF tratados conMG132 durante 6 h se incubaron también con 2 µg de anticuerpo anti-ARNT (calle 10). Lacalle 1 contiene la mezcla de reacción sin extracto nuclear. En los tratamientos con MG132 seutilizaron 10 µg de proteína nuclear y 8 µg en los tratamientos con TCDD. La flecha indica laposición de los complejos AhR/ARNT/XRE3. La sonda libre se muestra en la parte inferior delgel. La incubación de los extractos nucleares de MEF tratados con MG132 durante 6 h con unaIgG pre-inmune no alteró la capacidad de unión de los complejos AhR/ARNT a XRE3.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Sonda libre

XRE frioAnti AHR

Anti ARNT

Extracto


44

estacionarios del CYP1A2, que pasaron en un intervalo de 12 h desde una expresión

basal indetectable (0 horas) hasta un nivel equiparable al obtenido por tratamiento con

TCDD (figura 14A). La inducción del CYP1A2 por tratamiento con MG132 en MEF es

un proceso totalmente dependiente del AhR, ya que los cultivos de MEF Ahr-/- fueron

insensibles a cualquier agente inductor (figura 14B).

Para descartar la posibilidad de que la inducción del CYP1A2 por inhibición del

proteosoma pudiera ser debida a la estabilización de la proteína endógena más que al

aumento en su tasa de transcripción, se analizó, mediante northern-blot, la expresión a

nivel de mRNA de este citocromo en cultivos de MEF tratados con MG132. En la

figura 15 puede observarse que, efectivamente, MG132 indujo la transcripción de este

gen diana en ausencia de xenobióticos. Esta inducción presentó una dependencia con el

tiempo similar a la obtenida a nivel de proteína. El nivel de mRNA del Cyp1A2 en

cultivos de MEFs Ahr -/- no era inducible tras el tratamiento con MG132.

Figura 14. La expresión del gen diana Cyp1A2 es inducida en MEFs a nivel de proteína por elinhibidor del proteosoma MG132 siguiendo una cinética dependiente del tiempo. (A) MEFsprocedentes de ratones silvestres se trataron a los tiempos indicados con MG132 8 µM o con TCDD 10nM durante 6 horas. (B) El mismo tratamiento que en el panel A se realizó en cultivos de MEF Ahr-/-. Elnivel de expresión de las proteínas CYP1A2 y β-ACTINA se midió mediante western-blot empleandoextractos celulares totales. Como control positivo se utilizó la proteína recombinante de ratón (r1A2)expresada en virus vaccinia.

β-ACTINA

CYP1A2

TCD

D

r1A

2

0 3 6 12

MG132 (h)

β-ACTINA

CYP1A2

A

TCD

D

r1A

2

0 3 6 12

MG132 (h)

B


45

Así, la inhibición del proteosoma provoca un aumento en el nivel de activación

transcripcional del AhR que resulta reflejado en su capacidad de unión a secuencias

reguladoras y en la consiguiente inducción de la transcripción de genes diana para este

factor de transcripción.

Dos aspectos de los resultados obtenidos a partir de estos experimentos son

sorprendentes: en primer lugar la existencia de expresión constitutiva del CYP1A2 en

ratones Ahr+/+ a nivel de mRNA pero no de proteína (ver figuras 14A y 15). En

segundo lugar que, a pesar de no haberse observado inducción del CYP1A2 en cultivos

Ahr-/-, ni a nivel de mRNA (figura 15) ni a nivel de proteína (ver figura 14B), el nivel

constitutivo del mRNA de este gen es significativamente mas elevado en MEFs Ahr-/-

que el observado en MEF Ahr+/+. Estos datos sugieren la posible implicación del AhR

como un regulador negativo de la tasa de expresión constitutiva de este gen en MEFs,

así como la existencia de mecanismos pos-transcripcionales de regulación para el

Cyp1A2.

Dado que la activación transcripcional del AhR por inhibición del proteosoma no

implicaba cambios en el contenido celular de esta proteína, decidimos abordar el estudio

de posibles mecanismos potencialmente responsables de este fenómeno y que pudieran

contribuir al cada vez más evidente papel fisiológico de este receptor.

Figura 15. El aumento de la expresión del Cyp1A2 tras la inhibición del proteosoma esconsecuencia de su activación transcripcional dependiente del AhR. Cultivos de MEFssilvestres y MEFs Ahr-/- fueron tratados con MG132 8 µM durante los tiempos indicados ocon TCDD 10 nM durante 6 horas. La expresión del Cyp1A2 y de β-Actina fue analizada pornorthern-blot utilizando 10 µg de RNA total.

Ahr+/+ Ahr-/-

Cyp1A2

β-Actina

0 3 6 12 0 3 6 12

MG132 (h) MG132 (h)

TCD

D

TCD

D


46

4. La inhibición del proteosoma produce un incremento en la expresión

de ARNT.

Con el fin de dilucidar los posibles mecanismos involucrados en la activación del

AhR tras la inhibición del proteosoma, se analizaron en primer lugar los niveles

proteicos de ARNT durante el tratamiento con MG132. Se eligió ARNT como la

alternativa más plausible basándonos en información previa obtenida por otros grupos

de trabajo que mostraban que los niveles nucleares de esta proteína pudieran ser

relevantes en el control de la actividad del AhR (169, 237). En la figura 16 se muestra

el análisis de la expresión de ARNT en cultivos de MEF tratados con MG132 a distintos

tiempos. Como puede observarse, MG132 produjo un incremento transitorio en el nivel

proteico de ARNT, que aumentó durante las 6 primeras horas de tratamiento, para

disminuir posteriormente a tiempos más largos (figura 16A). Esta expresión proteica

fue cuantificada y normalizada por el nivel de expresión de β-ACTINA y los resultados

obtenidos se muestran en la figura 16B. La máxima inducción en la expresión de

ARNT correspondió a 6 horas de tratamiento con MG132, tiempo al cual se produjo

también la máxima activación transcripcional del AhR (ver figuras 12 y 13).

Figura 16. La inhibición del proteosoma induce la expresión de la proteína ARNT.Cultivos de MEFs fueron tratados con MG132 8 µM durante los tiempos indicados. (A) Elnivel de expresión de ARNT y β-ACTINA se midió mediante western-blot utilizando 10 µg delos extractos celulares totales procedentes de dichos cultivos. (B) Análisis cuantitativo de laexpresión de ARNT normalizada por la expresión de β-ACTINA en cada condiciónexperimental.

B

0

1

2

0 3 6 12 MG132 (h)

A

0 3 6 12

MG132 8 µµµµM

ARNT

ββββ-ACTINA

Tiempo (h)


47

La inhibición del proteosoma podría estar alterando los niveles proteicos de

ARNT bien por el aumento de su tasa de transcripción o bien por la inhibición de su

tasa de degradación. Para discriminar entre ambos mecanismos, analizamos la expresión

de Arnt a nivel de mRNA en cultivos de MEF tratados con MG132 mediante RT-PCR.

Como se observa en la figura 17 la expresión de Arnt aumentó transientemente en

función del tiempo de inhibición del proteosoma, mostrando un nivel máximo de

inducción a las 6 h de tratamiento con MG132. Por tanto, el incremento observado en

los niveles de ARNT no parece ser consecuencia de un proceso de estabilización

proteica sino de regulación transcripcional.

Estos resultados indican que tras la inhibición del proteosoma se produce una

inducción de la expresión de Arnt tanto a nivel de mRNA como de proteína.

5. La sobre-expresión de ARNT es suficiente para producir la

translocación nuclear de la proteína de fusión EGFP-AhR

Los resultados obtenidos indicaban que el aumento en la expresión de ARNT

podría ser responsable de la activación del AhR por inhibición del proteosoma. Para

analizar si la sobre-expresión de ARNT, es ausencia de cualquier tratamiento inductor,

podría promover la translocación nuclear del AhR, se realizaron co-transfecciones

transientes en la línea celular Swiss-3T3 utilizando las construcciones pEGFP-AhR y

pCMV5-ARNT. De este modo, pudimos analizar si el aumento en los niveles de ARNT

(pCMV5-ARNT) transloca la proteína de fusión EGFP-AhR al núcleo. Como controles

se utilizaron los plásmidos pEGFP y pCMV5. Como se muestra en la figura 18, la co-

ββββ-Actina

Figura 17. La inhibición del proteosoma induce la transcripción de Arnt. Cultivos de MEFs silvestres fueron tratados con MG132 8 µM durante los tiempos indicados. El nivel de expresión de Arnt y β-Actina se analizó mediante RT-PCR utilizando 7 µg de RNA total y cebadores específicos para cada gen.

0 3 6 12

MG132 8 µµµµM

Arnt

Tiempo (h)


48

transfección de pEGFP tanto con pCMV5 como con pCMV5-ARNT no produjo la

acumulación nuclear de la proteína control EGFP (paneles A y B, respectivamente). De

igual manera, la co-transfección de pEGFP-AhR y pCMV5 (panel C) tampoco resultó

en translocación nuclear del receptor. Sin embargo, como puede observarse en el panel

D se produjo una marcada acumulación nuclear de la proteína de fusión EGFP-AhR

cuando esta fue co-transfectada con el vector de expresión pCMV5-ARNT.

Estos datos son consistentes con los recientemente publicados por otros grupos en

los que muestran que ARNT es necesario y suficiente para la translocación nuclear y la

activación transcripcional del AhR (76). Adicionalmente, apoyan la hipótesis de que los

cambios en la expresión de ARNT inducidos por el inhibidor del proteosoma MG132

tienen un papel relevante en la activación del AhR.

En conjunto, estos resultados sugieren que la activación transcripcional del AhR

observada tras la inhibición del proteosoma en cultivos de fibroblastos embrionarios de

ratón podría deberse, al menos en parte, a la regulación transcripcional de la

expresión de ARNT. Este aumento en expresión conduciría a la acumulación transitoria

de ARNT en el núcleo celular, y a la translocación y acumulación del AhR en este

Figura 18. El incremento en la expresión de ARNT es suficiente para inducir translocación nuclear del AhR. Cultivos de fibroblastos Swiss-3T3 fueron cotransfectados con pEGFP-AhR y pCMV5-ARNT (panel D), se permitió la expresión de las proteínas durante 24 h y se observaron los cultivos bajo un microscopio de fluorescencia. Los panels A, B y C contienen la imagen de las correspondientes cotransfecciones controles: A, pCMV5 y pEGFP; B, pCMV5-ARNT y pEGFP; C, pCMV5 y pEGFP-AhR.

pEGFP-AhR

A

C D

BpCMV5

pCMV5 pCMV5-ARNT

pEGFP


49

compartimento celular. La formación de heterodímeros activos AhR/ARNT puede

conducir finalmente a la activación transcripcional de genes diana.

6. La inhibición del proteosoma induce la interacción de Sp1 con el

promotor de Arnt

La caracterización molecular del promotor del gen que codifica para ARNT en

ratón reveló la existencia de varias regiones ricas en GC, la ausencia de caja TATA y

múltiples sitios de inicio de la transcripción. Estas características son típicas de

promotores de genes denominados “housekeeping”. Entre las secuencias con potencial

regulador encontradas en el promotor de Arnt existen dos cajas GC, un elemento de

respuesta a cAMP, una caja E, un sitio AP-1 y una caja CAAT (308). Experimentos in

vitro utilizando una batería de delecciones del promotor han mostrado que de todos los

elementos reguladores encontrados, las dos cajas GC son las que contribuyen de manera

más relevante a la expresión constitutiva de Arnt. Mediante experimentos de EMSA

(Electrophoretic Mobility Shift Assay) se demostró que el factor que se une

mayoritariamente a las cajas GC es Sp1 y, en menor medida, Sp3 (308). Sp1 y Sp3

pertenecen a una familia de factores de transcripción ubicuos caracterizados por poseer

dominios de unión al DNA altamente conservados y consistentes en tres “dedos de

zinc”. Estos factores regulan procesos celulares tales como proliferación, diferenciación

y apoptosis a través de la interacción con otros reguladores transcripcionales. Diferentes

estudios han mostrado que las funciones reguladoras de Sp1 son dependientes del tipo

celular. Por otro lado, ambas proteínas pueden competir funcionalmente y así, mientras

que Sp1 actúa de manera positiva activando transcripción, Sp3 puede ejercer un efecto

regulador negativo por competición con Sp1 (116). La actividad transcripcional de Sp1

varía en función de numerosas señales intra y extracelulares. Se han descrito dos

mecanismos generales por los que Sp1 regula su actividad: (i) mediante cambios en su

nivel proteico y (ii) por modificaciones pos-traducionales que conducen a cambios en su

capacidad de unión a secuencias reguladoras en el DNA, sin que existan alteraciones en

su nivel proteico. Sp1 puede encontrarse O-glicosilada y además fosforilada, y ambas

modificaciones se han descrito como relevantes en su funcionalidad. La alteración del

nivel de O-glicosilación de Sp1 ha sido asociada con cambios en su estabilidad ya que


50

la disminución en el estado de glicosilación aumenta su susceptibilidad frente a

degradación por el proteosoma (119, 289). La relación entre el nivel de fosforilación de

Sp1 y su actividad como regulador transcripcional es compleja ya que en función del

contexto celular tanto fosforilación como desfosforilación aumentan o disminuyen la

expresión de genes diana. No obstante, esta modificación de la proteína se considera

como un mecanismo esencial en la actividad de Sp1. Considerando que el nivel proteico

de Sp1 se encuentra regulado por el proteosoma, analizamos en primer lugar si la

inhibición de este sistema en cultivos de MEF podría estar induciendo cambios en los

niveles de Sp1. Como se muestra en la figura 19 el tratamiento con MG132 durante un

periodo de hasta 12 h no produjo un incremento significativo en los niveles de expresión

de las dos formas de Sp1 descritas, y que corresponden a péptidos de 95 y 106 kDa.

Como previamente describimos para el AhR (figura 12), la inhibición del proteosoma

indujo la disminución del nivel de proteína de Sp1 a tiempos largos (12 h). Si bien el

mecanismo potencialmente implicado en este fenómeno es desconocido, pudiera estar

relacionado con el que provoca la disminución en los niveles de dicho receptor.

Así, el incremento en la transcripción de ARNT observado durante la inhibición

del proteosoma no es una consecuencia directa de un incremento en los niveles de la

proteína Sp1.

Como se indicó anteriormente, la actividad transcripcional de Sp1 puede estar

regulada pos-traducionalmente en ausencia de cambios en su nivel de expresión. Para

0 3 6 12

Figura 19. La inhibición del proteosoma no incrementa los niveles proteicos de Sp1. Cultivos de MEF fueron tratados con MG132 8 µM durante los tiempos indicados y el nivel de expresión proteico analizado mediante western-blot utilizando 10 µg de proteína y anticuerpos específicos para Sp1 y β-ACTINA. Las flechas indican la localización de las dos formas de Sp1 de 95 y 106 KDa.

Sp1

ββββ-ACTINA

Tiempo (h) MG132 8 µµµµM


51

determinar si el aumento en la expresión de Arnt tras la inhibición del proteosoma

podría deberse a un aumento en la capacidad de Sp1 para unirse su promotor, se

realizaron experimentos de EMSA usando extractos nucleares procedentes de cultivos

tratados con MG132 y las secuencias consenso para Sp1 presentes en el promotor del

gen Arnt de ratón (308). Como se observa en la figura 20 la inhibición del proteosoma

provocó un incremento marcado y transiente en la unión de Sp1 al promotor de Arnt

(calles 2-5), con un máximo a las 6 h de tratamiento con MG132 (calle 4). Esta unión

fue competida por un exceso de sonda no marcada (calle 6) y por un anticuerpo

policlonal anti-Sp1 (calle 7).

Es interesante observar que el tiempo de inhibición del proteosoma al cual se

produjo el máximo nivel de unión de Sp1 al promotor de Arnt, coincide con el momento

de máximo nivel de expresión de Arnt, tal y como mostramos previamente (ver figura

17).

Figura 20. El tratamiento con MG132 provoca un incremento transiente en la capacidadde unión de Sp1al promotor de Arnt. Los cultivos fueron tratados con DMSO (calle 2) o con MG132 8 µM durante 3 h (calle 3), 6 h (calle 4) o 12 h (calle 5). 10 µg de los extractos nucleares procedentes de dichos cultivos fueron analizados por EMSA para determinar sucapacidad de unión a secuencias consenso para Sp1 presentes en el promotor del gen Arnt de ratón. La especificidad de la banda fue comprobada incubando los extractos nucleares deltratamiento con MG132 durante 6 h con un exceso 100 veces molar de la sonda no marcada(calle 6), con 2 µg de anti-Sp1 (calle 7) y con una IgG preinmune (calle 8). La calle 1 contiene la mezcla de reacción sin extracto nuclear. La flecha indica la posición de Sp1 unido a lasonda. La posición de la sonda libre se indica en la zona baja del gel.

Sonda libre

Pre-inmuneAnti-Sp1

Caja GC friaExtracto

1 2 3 4 5 6 7 8


52

Estos datos sugieren que la estimulación de la transcripción de Arnt tras la

inhibición del proteosoma, podría estar regulada por un incremento en la capacidad de

unión de Sp1 a las cajas GC presentes en su promotor.

7. El tratamiento con MG132 induce un aumento en el nivel de

fosforilación de Sp1 en células vivas

El hecho de que la inhibición del proteosoma no afecte los niveles proteicos de

Sp1 pero sí incremente su capacidad de unión al promotor de Arnt, sugiere que otros

procesos, tales como cambios en su nivel de fosforilación, podrían estar regulando la

transcripción de Arnt. Para analizar si el estado de fosforilación de Sp1 resultaba

alterado durante la inhibición del proteosoma, cultivamos MEF en medio sin fosfato y,

durante el tratamiento con MG132, realizamos el marcaje de las proteínas fosforiladas

por la adición de 32PO4H3 al medio de cultivo. De los extractos celulares procedentes de

estos tratamientos, se inmunoprecipitó Sp1 utilizando un anticuerpo específico. El nivel

de fosforilación de Sp1 se determinó mediante SDS-PAGE en los inmunoprecipitados.

Adicionalmente se realizaron análisis de western-blot frente a Sp1 para determinar la

presencia de la proteína total en los extractos. Como se muestra en la figura 21 el

tratamiento con MG132 durante 3 y 6 horas indujo un incremento en los niveles de

fosforilación de Sp1 en relación al nivel presente en cultivos no tratados. Este

incremento no fue consecuencia de un aumento en la cantidad total de Sp1 ya que el

nivel de proteína no varió durante el tratamiento con MG132. Un mecanismo similar al

sugerido en este trabajo para ARNT, se ha puesto de manifiesto analizando el control

transcripcional de reguladores del ciclo celular por Sp1 (23).

De este modo, nuestros datos sugieren que la inhibición del proteosoma provoca

un incremento en la fosforilación de Sp1 lo cual aumenta su capacidad de unión a la

secuencia promotora de Arnt y, como consecuencia, una elevación en la tasa de

transcripción de este gen.


53

8. La inhibición de la proteína quinasa C bloquea la unión de Sp1 al

promotor de Arnt

Se han descrito varias quinasas que podrían estar implicadas en la fosforilación de

Sp1: PKA (cAMP-dependent Protein Kinase) (253), quinasas dependientes de ciclo

celular (23, 89), MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinase) (198) y PKC (Protein

Kinase C) (223, 244). Con el propósito de identificar las posibles quinasas responsables

de la activación de Sp1 por inhibición del proteosoma, hemos analizado el efecto de

distintos inhibidores de quinasas sobre la capacidad de unión de Sp1 al promotor de

Arnt. Así, cultivos de MEF fueron pre-tratados durante dos horas con H-89 (inhibidor

específico para PKA), PD98059 (inhibidor específico para MEK), SB203580 (inhibidor

específico para p38 MAP quinasa) o estaurosporina (inhibidor no específico de PKC) y,

a continuación, co-tratados con MG132 durante 6 horas. De estos cultivos celulares se

obtuvieron extractos nucleares en los que se analizó la capacidad de Sp1 para unirse a

secuencias consenso presentes en el promotor de Arnt. De entre todos ellos,

estaurosporina fue el que produjo un grado de inhibición más significativo, sugiriendo

la participación de PKC en la fosforilación de Sp1 por inhibición del proteosoma (datos

no mostrados). Debido a que estaurosporina no es un inhibidor específico de PKC,

podría ser que otra quinasa estuviera también implicada en la fosforilación de Sp1. Para

determinar más precisamente la contribución de PKC al proceso, realizamos un pre-

tratamiento de 2 horas con el inhibidor específico para PKC GF109203X seguido de un

co-tratamiento de 6 h con MG132. En la figura 22 se muestran los resultados obtenidos

Figura 21. El tratamiento con MG132 incrementa elnivel de fosforilación de Sp1 en cultivos celulares.Cultivos de MEF fueron tratados con MG132 8 µMdurante 3 o 6 horas. La fosforilación de las proteínas serealizó en medio sin fosfato y por la adición de 32PO4H3

durante las dos últimas horas del tratamiento. 400 µg delos extractos celulares fueron inmunoprecipitadosutilizando un anticuerpo específico frente a Sp1. Losinmunoprecipitados se resolvieron en un gel SDS-PAGE al 8% (p/v), se transfirieron a nitrocelulosa yfueron expuestos en una pantalla de radiactividad (IP).La expresión de Sp1 en los extractos fue tambiénmedida mediante western-blot (WB). Las flechasindican la posición de Sp1.

MG132 8 µµµµM

Tiempo (h) 0 3 6

WB

IP


54

analizando por EMSA la capacidad de unión del Sp1 presente en los extractos nucleares

a su secuencia consenso en el promotor de Arnt. Una marcada inhibición en la

capacidad de unión de Sp1 al DNA inducida por tratamiento con MG132 fue observada

con el pre-tratamiento de las células con GF109203X (comparar calles 3 y 4). Como

control adicional, la contribución que el nivel de fosforilación de Sp1 tiene sobre su

capacidad de unión al promotor de Arnt se puso también de manifiesto pre-tratando los

extractos nucleares con fosfatasa alcalina (CIP, calle 5), lo que disminuyó

completamente la unión.

Estos resultados sugieren una posible implicación de PKC en la fosforilación y

activación de Sp1 y, por tanto, en la expresión de ARNT durante la inhibición del

proteosoma en MEF.

Figura 22. La inhibición de PKC disminuye la unión de Sp1 inducida por MG132 alpromotor de Arnt. Cultivos de MEF fueron tratados con DMSO (calle 2), MG132 8 µMdurante 6 h (calle 3) o GF109203X 20 nM durante 2 h más MG132 8 µM durante 6 h (calle 4).Los extractos procedentes del tratamiento con MG132 8 µM durante 6 h fueron tambiénincubados con 5U de CIP durante 60 min a 37 ºC antes de ser usados para el EMSA (calle 5).10 µg de proteína nuclear fueron utilizados para cada ensayo. La calle 1 corresponde a lamezcla de reacción sin extracto nuclear. La flecha indica la posición de Sp1 unido al promotorde Arnt. La posición de la sonda libre se indica en la zona inferior del gel.

Sonda libre

CIP GF109203X

MG132 Extracto

1 2 3 4 5


55

Existen al menos 11 isoformas distintas de PKC. Se ha descrito la existencia de

interacción directa entre alguna de las isoformas de PKC y Sp1. Así, PKC ζ se une y

fosforila la región de dedos de zinc de Sp1 en complejos localizados en el núcleo o en la

zona perinuclear (223). Por otro lado, PKC está también regulada por el proteosoma.

Así, en presencia de ésteres de forbol, una vez que PKC ha sido activada, la proteína es

ubiquitinada y degradada por el proteosoma (141, 174).

9. La inhibición de PKC disminuye el incremento en la fosforilación de

Sp1 y la transcripción de Arnt provocado por MG132

Para determinar si la disminución en la unión de Sp1 al promotor de Arnt que

observamos tras la inhibición de PKC era debida a la disminución del nivel de

fosforilación de este factor de transcripción, realizamos un marcaje con fosfato

radiactivo en los cultivos tratados con GF109203X. Los extractos celulares se

sometieron a inmunoprecipitación con anti-Sp1 y se resolvieron en un gel de SDS-

PAGE. Como se muestra en la figura 23 el nivel de fosforilación de Sp1 inducido por 6

horas de tratamiento con MG132 fue significativamente inhibido en cultivos

previamente tratados con GF109203X.

Además, y de acuerdo con la hipótesis de trabajo planteada, la inhibición de la

fosforilación de Sp1 por GF109203X disminuyó marcadamente el incremento en la

transcripción de Arnt inducida por la inhibición del proteosoma (figura 24). Así, en los

cultivos tratados previamente con GF109203X la inhibición de PKC disminuyó la

Figura 23. La inhibición de PKC disminuye lafosforilación de Sp1 inducida por MG132. Cultivosde MEF fueron tratados con DMSO, MG132 8 µMdurante 6 h o con GF109203X 20 nM 2 h más 6 h decotratamiento con MG132 8 µM. La fosforilación delas proteínas fue marcada en medio sin fosfato por laadicion de 32PO4H3 durante las 2 últimas horas deltratamiento. Los extractos celulares fueroninmunoprecipitados utilizando un anticuerpo anti-Sp1,y la fosforilación fue detectada tal y como se indica enla leyenda de la figura 21.

MG132 GF109203X

--

+-

++


56

inducción de la expresión de Arnt a nivel transcripcional, lo que concuerda con una

menor capacidad de Sp1 para unirse al promotor de Arnt, posiblemente como

consecuencia de su menor nivel de fosforilación.

Estos datos sugieren que el incremento en la expresión de Arnt por MG132

podría estar mediado por fosforilación y activación de Sp1 por PKC.

10. La inhibición de PKC bloquea la translocación nuclear del AhR

dependiente de la inhibición del proteosoma

Para determinar si la actividad de PKC esta involucrada en la translocación

nuclear del AhR por inhibición del proteosoma, transfectamos fibroblastos Swiss-3T3

con el vector de expresión pEGFP-AhR y seguimos la distribución intracelular de la

proteína de fusión en cultivos tratados con MG132 en presencia o en ausencia de

GF109203X (figura 25). Como describimos anteriormente (ver paneles G y H en la

figura 10A), la inhibición del proteosoma por MG132, en ausencia de xenobióticos,

indujo la translocación nuclear del AhR (figura 25, panel D). De acuerdo a la hipótesis

propuesta, la inhibición de PKC por GF109203X bloqueó la translocación nuclear de la

proteína de fusión inducida por MG132 (comparar paneles B, D y F).

Figura 24. La inhibición de PKC bloquea la inducción de la expresión de Arnt por MG132. Cultivos de MEF fueron tratados con DMSO, MG132 8 µM o con GF109203X 20 nM durante 2 h más 6 h de co-tratamiento con MG132 8 µM. De estos cultivos se extrajo el RNA total y se analizó la expresión de Arnt y β-Actina mediante RT-PCR utilizando 7 µg de RNA total..

MG132 GF109203X

--

+-

++

Arnt

ββββ-Actina


57

Estos resultados indican que la inhibición de PKC bloquea la translocación

nuclear de la proteína de fusión EGFP-AhR inducida por la inhibición del proteosoma.

Figura 25. La inhibición de PKCbloquea la translocación nuclearde la proteína de fusión EGFP-AhR inducida por MG132. Fibroblastos Swiss-3T3 fueron transfectados con pEGFP (panelesA, C y E) o con pEGFP-AhR (paneles B, D y F). Después de 24h de expresión de la proteína, loscultivos se trataron con DMSO (Ay B), MG132 8 µM durante 6 h (C y D) o con GF109203X 20 nMdurante 2 h más MG132 8 µM durante 6 h (E y F). Las célulasfueron observadas y fotografiadasen un microscopio defluorescencia.

pEGFP pEGFP-AhR

DMSO

GF109203X MG132

A

F

D

E

C

B

MG132

58

DDIISSCCUUSSIIÓÓNN

CAPITULO I. Discusión

59

El receptor de dioxina fue identificado hace más de tres décadas y en pocos años

se ha caracterizado como una proteína citosólica, altamente conservada en la escala

filogenética y con un nivel de expresión constitutivo a lo largo de la ontogenia.

Numerosos estudios, principalmente por los grupos de Bradfield, Nebert, Hankinson y

Whitlock, pusieron de manifiesto que el AhR está presente en la gran mayoría de los

tejidos de mamíferos, donde tiene un papel de regulador transcripcional.

Sorprendentemente, se observó que este receptor tenía la particularidad de interaccionar

con alta afinidad con un compuesto tóxico, no natural y carcinogénico para numerosas

especies animales, denominado dioxina. A partir de ese momento, el interés por el AhR

aumentó notablemente dadas las implicaciones que su activación podía tener en la

inducción de carcinogénesis humana. La inmensa mayoría de los estudios se llevaron a

cabo activando el receptor con ligandos exógenos (xenobióticos) y analizando después

cambios en la expresión de genes relevantes en metabolismo y destoxificación. Gracias

a este esfuerzo, se propuso un mecanismo molecular de acción del AhR cuya etapa

limitante era la unión del xenobiótico. No pasó desapercibido el hecho de que el

xenobiótico, como ligando artificial, podría estar simplemente “imitando” al ligando

endógeno y natural del receptor. Sin embargo, y a pesar de numerosos intentos, solo

algunas pocas moléculas han sido propuestas como posibles ligandos fisiológicos del

AhR (5, 48). Por ello, este receptor se incluye dentro del grupo de receptores huérfanos,

junto con la familia de PPAR (Peroxisome Proliferator-Activated Receptor), PXR/SXR

(Pregnane-X Receptor/Steroid and Xenobiotic Receptor) y CAR (Constitutive

Androstane Receptor) (320).

Si bien la función del AhR como mediador y regulador de procesos de toxicidad

dependientes de xenobióticos está ampliamente establecida, durante años se ha

especulado sobre su posible implicación en desarrollo, fisiología y homeostasis celular.

Con el establecimiento de técnicas de producción de animales modificados

genéticamente, tres laboratorios independientes mostraron que el AhR es necesario para

un correcto desarrollo hepático (83, 162, 200, 230, 270). Se mostró también su

relevancia en proliferación y diferenciación celular (9, 77, 78, 275), en el

mantenimiento de niveles adecuados de factores de crecimiento (78, 324) y en el control

de la capacidad reproductiva. Todos estos resultados experimentales han permitido


60

consolidar el papel del AhR en fisiología y homeostasis celular en ausencia de

xenobióticos. A pesar de todo ello, aún persiste la incógnita acerca de los mecanismos

implicados en la activación de este receptor en ausencia de ligando exógeno. Con el

presente trabajo pretendemos aportar un potencial mecanismo de activación

transcripcional (capítulo I) y contribuir a la identificación de genes regulados por el

AhR y no relacionados con el metabolismo de xenobióticos (capítulo II).

Desde el punto de vista estructural, el AhR pertenece a la familia de factores de

transcripción con dominios constituidos por región básica/hélice-lazo-hélice (bHLH).

Desde el punto de vista funcional, el AhR necesita internalizarse en el núcleo para ser

transcripcionalmente activo. Sin embargo, y a diferencia de otros reguladores con

estructura bHLH, es imprescindible su heterodimerización con una segunda proteína

nuclear denominada ARNT. Por lo tanto, es el heterodímero AhR/ARNT el que

adquiere actividad transcripcional uniéndose a regiones consenso localizadas en el

promotor de genes diana. En este contexto, cada vez son más las evidencias

experimentales que indican que la distribución núcleo-citoplasmática de los factores de

transcripción constituye en sí misma un mecanismo de regulación de su actividad. Este

tránsito intracelular permitiría las interacciones proteína/DNA y ayudaría al

mantenimiento de niveles adecuados de reguladores transcripcionales en el

compartimento nuclear (14, 240, 241).

La proteolisis mediada por el proteosoma constituye un importante mecanismo de

control de la actividad de proteínas implicadas en numerosos procesos celulares (46, 51,

63). Además, las alteraciones en la actividad del proteosoma se han relacionado con

enfermedades neurodegenerativas e inmunes y con cáncer en humanos (46).

Estudios realizados en el nuestro y en otros laboratorios han mostrado que la

interacción de ligandos de alta afinidad (TCDD y BP) con el AhR inducía su

degradación por el proteosoma una vez que la activación transcripcional de genes diana

había tenido lugar (Santiago-Josefat y col., observaciones no publicadas; 61, 178, 251).

Empleando fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) como sistema modelo,

observamos que en ausencia de ligando exógeno, la inhibición del proteosoma por

derivados peptídicos (MG132 y LLnL) resultaba en la disminución de los niveles

citosólicos del AhR sin cambios significativos en su contenido celular total. Esta


61

disminución del AhR citosólico en condiciones de inhibición del proteosoma se debía a

la translocación del receptor al núcleo, tal y como se mostró marcando el AhR con la

proteína verde fluorescente. La translocación nuclear del AhR por MG132 era

comparable a la obtenida en presencia del ligando exógeno BP. No obstante, la

presencia del AhR en el núcleo no implica que este sea transcripcionalmente activo ya

que se han construido formas constitutivamente nucleares de este receptor incapaces de

activar la expresión de genes diana (193). La funcionalidad del AhR translocado al

núcleo de MEFs por inhibición del proteosoma se puso de manifiesto en primer lugar, in

vitro, al observarse que se producían heterodímeros AhR/ARNT capaces de unirse a la

secuencia consenso del promotor del gen diana Cyp1A1. El AhR translocado al núcleo

por inhibición del proteosoma era también activo con respecto a la inducción de genes

diana. Así, la inhibición del proteosoma indujo la expresión del CYP1A2 a nivel de

proteína en MEFs en ausencia de xenobióticos. Este proceso de inducción del CYP1A2,

no fue consecuencia de estabilización de la proteína ya que también pudo observarse a

nivel de mRNA. Por lo tanto, la inhibición del proteosoma activa el AhR e induce la

formación de heterodímeros nucleares AhR/ARNT capaces de reconocer y unirse a sus

secuencias consenso en la región reguladora de genes diana.

Tres observaciones adicionales resultan interesantes en este conjunto de

resultados. La primera es que la inhibición del proteosoma no activó

transcripcionalmente el AhR endógeno en cultivos de fibroblastos Swiss-3T3, a pesar de

que expresan altos niveles de AhR (302). Este resultado apoya estudios previos que

indican que la señalización mediada por el AhR varía notablemente entre especies

(232), entre cepas de la misma especie (216, 316), entre diferentes tejidos (144, 232) e

incluso entre diferentes líneas celulares (86, 137). Estudios recientes han mostrado que

en líneas celulares derivadas de hepatoma (HepG2 y Hepa1), la inhibición del

proteosoma también provoca la translocación nuclear del AhR en ausencia de

xenobióticos. Sin embargo, en dichas condiciones experimentales no fue posible

detectar la inducción del gen diana Cyp1A1 (283). Estos resultados indican que la

inhibición del proteosoma, al igual que lo observado para la interacción con

xenobióticos, constituye un mecanismo de activación del AhR dependiente del tipo

celular. La segunda observación fue que los MEFs de ratones Ahr-/-, si bien no


62

mostraron inducción del Cyp1A2 a nivel de mRNA por inhibición del proteosoma, sí

presentaron un nivel basal de este mRNA marcadamente superior al de ratones Ahr+/+.

La falta de inducción transcripcional era esperable al ser el Cyp1A2 un gen cuya

expresión es dependiente del AhR. Sin embargo, el mayor nivel basal de mRNA del

Cyp1A2 en MEF Ahr-/- con respecto a los Ahr+/+ sugiere que el AhR podría regular su

expresión constitutiva. La regulación del Cyp1A2 resulta aún más compleja ya que su

expresión constitutiva a nivel de proteína es indetectable en MEFs, aún en presencia de

niveles detectables de mRNA. Otros estudios también han sugerido que la expresión del

Cyp1A2 podría estar regulada pos-transcripcionalmente por mecanismos aún no

totalmente caracterizados (8, 105). Este complejo mecanismo de regulación ha sido

también descrito en MEFs para otro gen diana del AhR, el Cyp1B1 (9). Resulta

interesante indicar que varios genes implicados en desarrollo se encuentran regulados

por silenciamiento traduccional, conteniendo secuencias consenso del tipo “smaug”

(CUGGC) en el extremo 3’ de sus mRNAs (49, 56). Curiosamente, en la región 3’ no

codificante del mRNA del Cyp1A2 existen dos copias perfectas de la secuencia

“smaug”, por lo que un mecanismo de silenciamiento traduccional podría estar

implicado en el control del nivel proteico basal de este gen. La tercera observación fue

que en condiciones basales, y por tanto en ausencia de inhibidor del proteosoma o de

ligando, una cierta fracción del AhR se localizaba en el compartimento nuclear en su

conformación transcripcional activa. Este resultado sugiere, de nuevo, la implicación de

este receptor en procesos celulares endógenos diferentes de la interacción con

xenobióticos y la inducción de genes destoxificadores. La presencia de AhR nuclear en

ausencia de xenobióticos no es exclusiva de MEFs ya que ha sido también descrita en

células HeLa y CV-1 (42, 281). De entre las funciones en las que el AhR podría

participar en ausencia de xenobióticos, se encuentra el control del ciclo celular. Así, se

ha mostrado que la interacción del AhR con retinoblastoma modula la capacidad

proliferativa de las células (95, 242).

Para caracterizar posibles mecanismos por los que la inhibición del proteosoma

pudiera activar transcripcionalmente el AhR, sin afectar su nivel de expresión,

analizamos cambios en la expresión de ARNT. La proteína ARNT no interacciona de

forma exclusiva con el AhR sino que puede heterodimerizar con otros factores de


63

transcripción (293). Con respecto a nuestro estudio, resulta particularmente interesante

su interacción con HIF-1α (Hypoxia-Inducible Factor 1αααα). ARNT se mantiene unido a

HIF-1α en condiciones de hipoxia, induciéndose la disociación del heterodímero y la

posterior degradación proteosomal del propio HIF-1α cuando se alcanzan condiciones

de normoxia (140, 261). Si bien el nivel de ARNT es esencialmente constante en

normoxia (109, 129), éste aumenta e induce la translocación de HIF-1α al núcleo

durante hipoxia (45). Así, la activación de AhR/ARNT por xenobióticos es, en cierto

grado, similar a la de HIF-1α/ARNT por hipoxia. En nuestras condiciones

experimentales, la inhibición del proteosoma en MEFs resultó en un aumento transiente

de los niveles proteicos de ARNT, aumento que también se observó al analizar el

mRNA de este gen. El patrón de expresión de ARNT tras la inhibición del proteosoma

fue además coincidente en el tiempo con el proceso de internalización y activación

transcripcional del AhR. Hasta aquí, podemos sugerir que la inhibición del proteosoma

provoca un aumento en la expresión de ARNT en el núcleo, lo que a su vez resulta en la

estabilización del AhR en este compartimento celular gracias a la formación de

heterodímeros AhR/ARNT. Este proceso podría conducir finalmente a la activación de

genes diana. La relevancia que los niveles de ARNT pueden tener en la activación del

AhR se puso también de manifiesto por el hecho de que el aumento transiente de ARNT

en fibroblastos Swiss-3T3 indujo la translocación nuclear del AhR, de nuevo indicando

que la estabilización del receptor en el núcleo puede regular su actividad

transcripcional. Resultados obtenidos por otros laboratorios también apoyan esta

hipótesis. Así, se ha mostrado que la unión de ARNT al AhR estabiliza este receptor en

el núcleo y contribuye al mantenimiento de niveles adecuados de transcripción (45, 52,

104, 316). Adicionalmente, y de acuerdo a nuestros resultados experimentales, la sobre-

expresión de ARNT indujo la translocación del AhR marcado con EGFP en la línea

celular CV-1 en ausencia de xenobióticos (42). Más aún, este papel de ARNT como

regulador de la actividad transcripcional ha sido también mostrado en células Hep3B, en

las cuales su sobre-expresión activa a HIF-1α en condiciones de normoxia (equivalentes

a la ausencia de ligando en el caso del AhR) (254). Interesantemente, la sobre-expresión

de ARNT no induce translocación nuclear del AhR en células derivadas de hepatoma


64

(283), lo que de nuevo pone de manifiesto la importancia que ejerce el tipo celular sobre

la activación y funcionalidad del AhR. Este conjunto de resultados apoya un mecanismo

en el que la actividad transcripcional del AhR, en ausencia de xenobióticos, se

encontraría regulada por su transporte núcleo/citoplasmático y su estabilización en el

núcleo. El control de los niveles nucleares de ARNT podría dirigir dicho proceso

siguiendo un patrón dependiente del tipo celular. Resulta interesante mencionar que un

mecanismo tal como el que aquí proponemos para el AhR ha sido recientemente

sugerido para explicar el aumento en la actividad transcripcional del receptor de

glucocorticoides por inhibición del proteosoma (67).

Dado que ARNT parece mediar la activación del AhR por inhibición del

proteosoma, abordamos el estudio de posibles mecanismos que pudieran estar

relacionados con el proteosoma y que pudieran conducir a un incremento en su nivel de

expresión. La caracterización del promotor de Arnt en ratón reveló la existencia de

diferentes secuencias consenso para la unión de reguladores transcripcionales. Estudios

de análisis de promotor en los que se realizaron delecciones sucesivas de dichas

secuencias mostraron que dos cajas GC, a las que se unía el factor de transcripción Sp1,

y en menor medida Sp3, eran los principales elementos reguladores implicados en el

mantenimiento del nivel transcripcional de Arnt (308). Por otro lado, Sp1 puede ser

degradado por el proteosoma a través de su extremo N-terminal (290) en un proceso que

implica la unión de la proteína Sug1/p45 (291). En células tumorales de origen humano,

las condiciones que inducen la disminución en el nivel de O-glicosilación de Sp1

activan su degradación proteica (119). En base a esta información, analizamos el efecto

de la inhibición del proteosoma sobre Sp1. En MEFs, la inhibición del proteosoma no

alteró significativamente el nivel de expresión proteica de Sp1. Este regulador

transcripcional es una fosfoproteína cuya actividad se encuentra modulada tanto por

procesos de fosforilación como de desfosforilación. Así por ejemplo, mientras que la

fosforilación mediada por caseína disminuye su actividad de unión al DNA (13), su

desfosforilación por proteína fosfatasa aumenta dicha actividad (60). La inhibición del

proteosoma en MEFs, aún sin aumento sobre el nivel proteico de Sp1, indujo un

aumento significativo en su capacidad de unión a las cajas GC presentes en el promotor

del gen Arnt de ratón, lo que sugiere la activación de un mecanismo alternativo por el


65

que Sp1 pudiera regular Arnt. Con el fin de determinar si la inhibición del proteosoma

podría incrementar la actividad de Sp1 alterando su fosforilación, analizamos los niveles

de Sp1 fosforilado tras marcaje en células vivas e inmunoprecipitación. La inhibición

del proteosoma incrementó la cantidad de proteína Sp1 fosforilada siguiendo un patrón

temporal coincidente con su capacidad de unión al promotor de Arnt y, lo que es más

importante, con el aumento transiente en la expresión de esta última, tanto a nivel de

mRNA como de proteína. El papel de la fosforilación en la activación de Sp1 se vio

además apoyado por el hecho de que la desfosforilación con fosfatasa alcalina inhibió

totalmente su unión al promotor de Arnt. Estos resultados sugieren entonces que un

aumento en la fosforilación de Sp1 podría regular su actividad transcripcional sobre el

promotor de Arnt, resultando en mayores niveles nucleares de esta última proteína.

Diferentes quinasas son las que participan en la fosforilación de Sp1. Entre ellas,

quinasas dependientes de cAMP (253), quinasas de ciclo celular (89), quinasas

activadas por agentes mitogénicos (172, 198) y proteína quinasa C (223, 244). Para

identificar las quinasas que pudieran estar implicadas en la activación de Sp1 utilizamos

una batería de inhibidores específicos para dichas enzimas. La adición del inhibidor de

PKA H-89 o de inhibidores de quinasas mitogénicas PD98059 y SB203580, produjeron

una disminución poco significativa de la unión de Sp1 al promotor de Arnt. Sin

embargo, estaurosporina, un inhibidor no selectivo de PKC produjo una marcada

inhibición de dicho proceso. La contribución de PKC a la activación del AhR por

inhibición del proteosoma se analizó más detalladamente empleando el inhibidor

específico GF109203X. Resulta interesante indicar que PKC, por su parte, constituye

también un sustrato del proteosoma. De este modo, tras ser activada por ésteres de

forbol y una vez que se ha llevado a cabo la fosforilación de las proteínas dianas, PKC

es ubiquitinada y degradada por el proteosoma (138, 141, 174). En MEFs, en presencia

del inhibidor del proteosoma, la adición de concentraciones nanomolares de

GF109203X, produjeron una marcada inhibición de la unión de Sp1 al promotor de

Arnt. Más aún, GF109203X disminuyó sensiblemente el nivel de fosforilación de Sp1 y,

consecuentemente, la transcripción de Arnt. De acuerdo a nuestra hipótesis, según la

cual el aumento de expresión de ARNT regularía la translocación nuclear del AhR,

GF109203X también bloqueó la localización nuclear de la proteína de fusión EGFP-


66

AhR inducida por inhibición del proteosoma. Por lo tanto, este conjunto de resultados

sugieren que la fosforilación de Sp1 dependiente de PKC, podría ser la responsable del

aumento en los niveles de mRNA y de proteína de ARNT. Hasta la fecha se han

descrito al menos 11 isoformas de PKC. En base a la concentración de GF109203X

empleada en este estudio (20 nM), podemos sugerir en primer lugar que el efecto es

específico de PKC ya que la otra quinasa que podría ser potencialmente inhibida, PKA,

posee una K0.5 para este compuesto de 2 µM (296), unas 100 veces superior a la

concentración utilizada. De entre las isoformas de PKC, las denominadas α, β1, ε, δ y

ζ son las únicas descritas cuya actividad puede ser inhibida por GF109203X (188).

Considerando las constantes de afinidad de GF109203X para las distintas isoformas de

PKC (112, 188), cabe la posibilidad de que PKCα (Ki=8.4 nM) y/o PKCβ1 (Ki=18 nM)

pudieran ser las principales isoformas implicadas en la activación de Sp1.

En resumen, a partir de los datos obtenidos en este trabajo, proponemos un

mecanismo para la activación del AhR en ausencia de ligando exógeno que involucra

cambios en la actividad del proteosoma. En este modelo, la inhibición de la capacidad

degradativa del proteosoma podría activar la fosforilación del factor de transcripción

Sp1 por PKC. Esta fosforilación potenciaría la unión de Sp1 a sus secuencias diana

presentes en el promotor de Arnt lo cual incrementaría su tasa de transcripción y su

nivel proteico en el núcleo célular. La sobre-expresión de ARNT conduciría a la

formación de heterodímeros nucleares con el AhR, incrementando así el tiempo de

permanencia de este receptor en dicho compartimento celular. De esta forma, bajo la

inhibición del proteosoma, la mayor parte del AhR celular se encuentra “secuestrado”

en el núcleo. Estos heterodímeros AhR/ARNT, al ser transcripcionalmente activos,

potenciarían la transcripción de genes diana. Adicionalmente a la regulación de la

actividad del proteosoma, un estímulo celular capaz de activar PKC podría

desencadenar una cascada de señales que condujera a la activación del AhR. Así, el

control fisiológico de la actividad quinasa de PKC podría modular respuestas celulares

dependientes del AhR en ausencia de ligando exógeno.

67

CCAAPPÍÍTTUULLOO IIII

IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN

CAPITULO II. Introducción

68

1. La super-familia de TGF-ββββ

El factor de crecimiento transformante beta (TGF-β, Transforming Growth

Factor) pertenece a una super-familia de proteínas secretadas al exterior celular y cuyos

miembros están implicados en la regulación del crecimiento, la diferenciación y la

morfología celulares (190). Estas proteínas son necesarias para un correcto desarrollo

embrionario y para mantener la funcionalidad e integridad de los tejidos adultos. Los

miembros de esta familia incluyen, además de los distintos TGF-βs, las proteínas

morfogenéticas del hueso (BMPs, Bone Morphogenetic Proteins), los factores de

diferenciación y crecimiento (GDFs, Growth and Differentiation Factors) y las

activinas. Las respuestas celulares producidas por estos factores hormonales son muy

diversas y dependen tanto del fenotipo celular como de su estado fisiológico. La

mayoría de dichas respuestas resultan en cambios en la expresión de genes diana. La

acciones biológicas de TGF-β pueden tener lugar de modo autocrino, cuando este actúa

sobre la misma célula que lo sintetiza, o paracrino, cuando lo hace sobre células vecinas

(81). Los miembros de la super-familia de TGF-β actúan como ligandos de receptores

transmembranales situados en la superficie celular. Funcionalmente, estos receptores

consisten en dos proteínas transmembranales denominadas receptores tipo I (TβR-I) y

tipo II (TβR-II). Si bien sólo el receptor tipo II posee en su dominio extracelular el sitio

de unión de TGF-β, ambos receptores tienen un dominio intracelular con actividad

serina/treonina quinasa. La unión del ligando al receptor tipo II induce la migración y

asociación de ambos tipos de receptores en la membrana plasmática, lo que conduce a la

fosforilación del receptor tipo I por parte del receptor tipo II. Esta fosforilación estimula

el dominio con actividad quinasa del receptor tipo I, el cual fosforila a su vez a unos

sustratos citosólicos denominados SMADs. La fosforilación de una cierta proteína

SMAD provoca su heterodimerización con otros miembros de la misma familia y la

internalización del complejo en el núcleo celular donde actuarán como factores de

transcripción regulando expresión génica (189) (figura 26). Entre los genes regulados

por esta ruta en respuesta a TGF-β se encuentran PAI-1 (Plasminogen Activator

Inhibitor 1), IgA (Immunoglobulin type A) y el oncogen c-Fos. En vertebrados existen 7


69

receptores tipo I diferentes, 5 receptores tipo II y 8 proteínas de la familia SMAD. Estos

receptores y proteínas de señalización se asociarán entre ellos dependiendo del ligando

de la super-familia de TGF-β que dispare el proceso desde el medio extracelular. Esta

complejidad funcional se ve acentuada porque una vez en el núcleo, las proteínas

SMADs pueden asociarse a una amplia batería de factores de unión al DNA, así como a

co-activadores o co-represores transcripcionales, ya sean generales y ubicuos o

específicos del tipo y del momento celular. La variabilidad de interacción entre estas

proteínas reguladoras determina la especificidad de unión a distintas secuencias en el

DNA y explica la variedad de efectos producidos por estos factores hormonales en

función del contexto celular (189). Las alteraciones en la señalización celular por TGF-

β se han asociado a diversas enfermedades humanas. Así, las células tumorales

generalmente pierden su respuesta frente a la capacidad inhibitoria de TGF-β (92),

mientras que un aumento en la actividad de TGF-β parece tener un papel relevante

durante la acumulación de matriz extracelular y el desarrollo de fibrosis (29).

2. Secreción de TGF-ββββ como un complejo latente

Se han clonado y caracterizado diversas formas de TGF-β a partir de diferentes

especies, incluyendo TGF-β1, β2 y β3 de mamíferos, TGF-β4 de pollo y TGF-β5 de

Xenopus. Las tres isoformas descritas en mamíferos presentan entre un 72 y un 79% de

homología en su secuencia de aminoácidos. Los TGF-βs son potentes inhibidores de

Figura 26. Ruta de señalización através de los receptores de TGF-ββββ y delas proteínas SMAD. El TGF-βextracelular interacciona con el receptorde TGF-β de tipo II, el cual interaccionay fosforila el receptor tipo I. El receptortipo I activa por fosforilación proteínasdel tipo SMAD, las cualesheterodimerizan, se translocan al núceloy activan expresión génica. Massagué ycol., 1998. Annu Rev Biochem 67: 753-791.


70

proliferación en muchos tipos celulares, especialmente en células de origen epitelial y

endotelial. Así, la sobre-expresión de esta proteína en epitelio de ratón resulta en la

inhibición del crecimiento y la proliferación celular (53). TGF-β es también un

importante factor inmuno-modulador. Los ratones “knock-out” para TGF-β1 mueren

rápidamente después del nacimiento debido a una masiva infiltración de células del

sistema inmune en diferentes tejidos (69), probablemente como consecuencia de la

expresión aberrante de genes del complejo principal de histocompatibilidad (96). Los

ratones deficientes en TGF-β2 y TGF-β3 presentan también numerosas malformaciones

en diferentes órganos, siendo estas mutaciones letales a las pocas horas del nacimiento

(139, 264).

TGF-β tiene un importante papel en la regulación de la síntesis y degradación de

la matriz extracelular. Estimula la síntesis de componentes de matriz como son varios

tipos de colágeno, fibronectina, trombospondina, vitronectina, tenascina y

proteoglicanos (294). Adicionalmente, inhibe la degradación de la matriz extracelular,

ya sea por inhibición de la síntesis de distintas proteasas tales como activadores de

plasminógeno, colagenasas (también llamadas metaloproteinasas) y estromelisina, ya

sea por inducción de ciertos inhibidores de estas proteasas como PAI-1 (Plasminogen

Activator Inhibitor-1) y TIMP-1 (Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-1) (164). La

producción excesiva de TGF-β conduce a situaciones patológicas en las que la

producción de matriz extracelular se encuentra exagerada, fenómeno conocido como

fibrosis. El hígado ha sido probablemente el órgano mejor caracterizado en lo referente

a la influencia de TGF-β sobre el desarrollo de fibrosis. La matriz extracelular que se

acumula en la fibrosis hepática está compuesta principalmente por colágeno de tipo I

(22), que es secretado en su gran mayoría por miofibroblastos diferenciados desde

células estrelladas (90, 108). Numerosos estudios indican que estos fenómenos podrían

tener su origen en la elevación de los niveles de TGF-β (25, 28). La sobre-expresión de

TGF-β en animales experimentales mediante técnicas de transgénesis, apoya la

relevancia de los altos niveles de TGF-β en el desarrollo de fibrosis hepática y en la

inhibición de proliferación celular (263). La asociación entre cambios en los niveles de

esta citoquina y enfermedades humanas ha sido también propuesto. Así, se ha


71

demostrado que la sobre-expresión de TGF-β puede subyacer en enfermedades como la

distrofia muscular de Duchenne (20) y la fibrosis renal glomerulonefrítica (25), mientras

que su deficiencia puede estar relacionada con el desarrollo de arteriosclerosis (191,

192).

TGF-β se encuentra codificado por un mRNA que da lugar a un péptido de 392

aminoácidos. Este péptido dimerizará durante su ruta de secreción al exterior celular.

Una vez en el aparato de Golgi, cada monómero será proteolizado a nivel del residuo

279 para generar la forma activa de TGF-β. Se origina así un fragmento C-terminal

(aminoácidos 280-392) que permanece unido mediante puentes disulfuro por su extremo

N-terminal a un pro-péptido de latencia denominado LAP (Latency Associated Protein).

De este modo, se genera un complejo en el que dos monómeros de TGF-β se asocian a

dos de LAP. Adicionalmente, las Asp82, 136 y 176 de TGF-β se encuentran

glicosiladas en el complejo latente LAP-TGF-β. Dos de estas glicosilaciones contienen

manosa-6-fosfato, un azúcar que en ciertos contextos celulares tiene funciones

reguladoras (243). Como se tratará más adelante, la interacción entre TGF-β y LAP

puede ser rota in vitro mediante el uso de agentes químico-físicos, no afectando este

proceso a la estabilidad del propio TGF-β (33).

Por tanto, TGF-β es secretado hasta la matriz extracelular en forma de dímero, en

el que dos cadenas de pro-TGF-β se asocian entre sí mediante dos puentes disulfuro

(uno en la zona de interacción con LAP y otro dentro del propio TGF-β). Durante el

proceso de secreción, la unión entre TGF-β y LAP será modificada por unas

endoproteasas, de manera que el dímero del pro-péptido LAP permanecerá asociado al

dímero de TGF-β mediante interacciones no covalentes (204). Aunque las formas

maduras de las tres isoformas de TGF-β presentan una alta homología, las secuencias de

los correspondientes pro-péptidos son muy divergentes. El complejo formado por el

dímero de TGF-β asociado al dímero de LAP es denominado “complejo latente

pequeño”. El denominado “complejo latente grande” contiene, además, uno de los

cuatro tipos de proteínas de unión de TGF-β latente. Estas últimas proteínas,

denominadas LTBPs (Latent TGF-β Binding Proteins) se unen al complejo LAP-TGF-

β mediante puentes disulfuro adicionales con LAP (figura 27). Todos los componentes


72

de este complejo se ensamblan en el interior de la célula. Aunque LTBP no confiere

latencia a TGF-β, juega un papel esencial durante el proceso de secreción, localización

y almacenamiento extracelular de TGF-β, existiendo una co-regulación entre la

expresión de ambas proteínas (202). En la mayoría de los tipos celulares estudiados, las

tres isoformas de TGF-β se secretan al medio extracelular en forma de “complejo

latente grande” y, por tanto, en una conformación inactiva (33). Por otro lado, TGF-β

puede adoptar una configuración latente mediante su unión a proteínas expresadas en la

superficie celular tales como proteoglicanos y endoglina (170).

La latencia es uno de los mecanismos más importantes en el control de la

actividad de los factores de crecimiento y, en este sentido, la activación de TGF-β desde

su forma latente puede ser regulada independientemente de su transcripción. Asimismo,

la latencia constituye un mecanismo de regulación de la disponibilidad de TGF-β

activo, limitando su difusión desde las células que lo han secretado y modulando así su

función paracrina y autocrina.

dímero de TGF-β

matriz extracelular

-S-S

-

-S-S

-

-S-S

- Complejo latente pequeño Complejo

latente grande

zona de

bisagra

dímero de LAP

Figura 27. Esquema del complejo LTBP-LAP-TGF secretado. Un dímero de TGF-β se asociaa un dímero de LAP por enlaces no covalentes, dando lugar al “complejo latente pequeño”. Estetetrámero se une a su vez a la región C-terminal de una molécula de LTBP por puentes disulfuropara formar el “complejo latente grande”. LTBP se une a la matriz extracelular por su región N-terminal, probablemente a través de repeticiones del tipo EGF.

TGF-β

TGF-β LAP

LAP

LTBP-1


73

3. Estructura y expresión de las LTBPs

En humano y en ratón se han descrito 4 LTBPs diferentes, LTBP-1, -2, -3, y -4.

Las LTBPs son glicoproteínas de matriz extracelular con un tamaño comprendido entre

120 y 220 kDa. Estas proteínas se agrupan en una misma familia junto con las fibrilinas,

otras proteínas de matriz extracelular. Excepto LTBP-2, todas las demás isoformas de

LTBP han mostrado capacidad de unión al complejo latente pequeño de TGF-β. La

mayoría de las LTBPs secretadas (>90%) no se encuentran unidas a TGF-β, por lo que

se cree que su papel dentro de la matriz extracelular es eminentemente estructural (57).

Las proteínas LTBPs, al igual que las fibrilinas, forman estructuras fibrilares en la

matriz extracelular, asociándose con componentes de la misma tales como fibronectina.

Las proteínas de esta familia poseen dos tipos de motivos estructurales altamente

repetitivos y ricos en cisteínas (figura 28). Uno de estos motivos, que contiene

repeticiones del tipo-EGF (Epidermal Growth Factor), está repetido entre 15 y 20 veces

en los cuatro tipos de LTBPs. En la zona central de las LTBPs, la presencia de un alto

número de estas repeticiones (de 9 a 14) les confiere una estructura helicoidal similar a

la que se encuentra presente en las fibrilinas. Adicionalmente, algunas de estas

repeticiones incluyen una secuencia de unión de Ca2+, lo que se ha propuesto que podría

proporcionar a las LTBPs resistencia frente a proteolisis (73, 246). El otro motivo,

consistente en una secuencia que contiene 8 cisteínas (8-Cys), está presente de 3 a 4

veces en cada una de las moléculas de LTBP (259). El extremo N-terminal de las

LTBPs es la región de unión a la matriz extracelular y presenta dos o tres repeticiones

del tipo-EGF, así como dos copias del dominio de 8-Cys. La incorporación de las

LTBPs a la matriz extracelular se produce por la unión covalente de dicho extremo N-

terminal con proteínas de matriz no claramente identificadas. La formación del enlace

LTBP-matriz requiere la acción de la enzima transglutaminasa de tipo II (214). A

continuación, y hacia el extremo C-terminal, las LTBPs presentan una región rica en

prolina y aminoácidos básicos que actúa a modo de “bisagra”, siendo esta región

también sensible a proteasas (131). El extremo C-terminal de la proteína presenta

repeticiones de 8-Cys y es la zona en la que se produce la unión por puentes disulfuro

de LTBP con el complejo LAP-TGF-β (100) (figura 28).


74

El patrón de expresión de las LTBPs en los diferentes tejidos es muy diferente y

en ocasiones redundante. LTBP-1 está presente en la mayoría de los tejidos adultos

aunque de forma más significativa en corazón, placenta, pulmón, bazo, riñón y

estómago. LTBP-2 se expresa principalmente en placenta, pulmón, hígado y músculo

esquelético. LTBP-3 y -4 tienen un patrón de expresión muy similar entre sí,

encontrándose fundamentalmente en aorta, corazón, intestino delgado y ovarios (101).

Por otro lado, en tejidos embrionarios LTBP-1 y -2 se expresan más que LTBP-3 y -4

(260). La regulación transcripcional de la expresión de las LTBPs es compleja. Al

menos para la LTBP-1 humana, se ha descrito el uso de dos promotores alternativos que

originan dos isoformas distintas de la proteína, denominadas LTBP-1S y LTBP-1L

(figura 28). LTBP-1L contiene un segmento adicional de 346 aminoácidos en su

extremo N-terminal con respecto a LTBP-1S (157). La activación alternativa de dichos

promotores independientes puede permitir un control más preciso de la expresión del

gen en diferentes tejidos o durante momentos concretos del desarrollo. El análisis del

mRNA codificado por el gen de Ltbp-2 también muestra la existencia de dos mRNAs

(203), lo que puede estar relacionado con un extremo N–terminal variable, de manera

similar a lo encontrado para LTBP-1. Se ha propuesto que tales variaciones

estructurales pudieran conferir diferentes afinidades en la interacción entre LTBPs y los

elementos de la matriz (217). Adicionalmente al empleo de promotores alternativos, las

formas LTBP-1, -3 y -4 presentan procesamiento alternativo en varios puntos de sus

mRNAs, provocando considerables variaciones estructurales en sus productos proteicos.

En muchos casos, estas variaciones estructurales resultan en proteínas incapaces de unir

Figura 28. Estructura proteica de lascuatro formas de LTBP presentes enhumanos. Se muestra el procesamientoalternativo de LTBP-1, que origina laforma 1L o 1S. Mangasser-Stephan, K.y col., 1999. Cell Tissue Res 297(3):363-370.


75

el complejo latente pequeño de TGF-β. Hasta el momento no se conoce el papel

biológico de las diferentes formas procesadas alternativamente, si bien se cree que

podrían formar parte de una nueva manera de regulación de la actividad de TGF-β.

4. Activación del TGF-ββββ latente

La forma activa de TGF-β, con capacidad de unión a sus receptores de membrana,

es la forma dimérica de 25 kDa. La activación del TGF-β latente es un mecanismo clave

en el control de la actividad biológica de este péptido (33, 231). Muchos tipos celulares

secretan tanto el complejo latente grande como el pequeño, por lo que los efectos

biológicos de TGF-β dependerán de la capacidad de cada tipo celular para activar estas

distintas formas latentes. En general, la activación de TGF-β se lleva a cabo una vez que

este se encuentra unido a la matriz extracelular vía LTBP. Este proceso de activación

desde el complejo latente grande implica dos pasos: en el primero se lleva a cabo la

liberación del complejo LTBP-LAP-TGF-β desde la matriz por proteolisis, mientras que

en el segundo se produce la activación de TGF-β por ruptura de su interacción con las

proteínas de latencia (figura 29).

La liberación del complejo grande desde la matriz implica la proteolisis de LTBP

en su zona “bisagra”, concretamente entre los dominios responsables de la unión a la

matriz extracelular y al complejo latente pequeño de TGF-β. Esta proteolisis se lleva a

Figura 29. Ruta de secreción y de activación de TGF-ββββ. El complejo LTBP-LAP-TGF-β es secretado desde la célula y almacenado en la matriz extracelular. Cuando el TGF-β es requerido en su forma activa, el complejo latente grande es liberado al medio y el TGF-β activado por ruptura de su interacción con las proteínas de latencia. El TGF-β activo interacciona entonces con sus receptores de membrana en las células diana.

TGasa-II proteasas

activación

matriz extracelular


76

cabo por enzimas de la familia de serina proteasas, incluyendo plasmina, elastasa y

quimasa. La segunda etapa de activación requiere la ruptura de las interacciones no

covalentes entre LAP y TGF-β.

Los métodos de activación de TGF-β in vitro incluyen un pH ácido o básico

extremos, tratamiento con calor y proteolisis enzimática (101, 167, 217). La existencia

de diferentes isoformas tanto de TGF-β como de LTBP y su patrón de expresión

específico de tejido, sugiere que diversos mecanismos fisiológicos pueden estar

participando en la activación del TGF-β latente. Así, la activación de TGF-β latente por

osteoclastos durante la formación del hueso es producida por una acidificación (pH<3)

en el espacio pericelular (27). Aunque se han descrito varios procesos enzimáticos que

pueden activar TGF-β a nivel fisiológico, diferentes estudios indican que la proteolisis

de LAP mediada por plasmina puede constituir el mecanismo más importante (175).

Estudios realizados utilizando co-cultivos de células endoteliales y células de músculo

liso han mostrado que tanto la adición de inhibidores de plasmina como la eliminación

de plasminógeno bloquean el proceso de activación de TGF-β (265). Más aún, en

presencia de anticuerpos inhibidores del activador de plasminógeno uPA (una enzima

que proteoliza el plasminógeno en plasmina), también se bloquea la activación de TGF-

β (107, 153). Se ha sugerido que la acción de plasmina sobre TGF-β probablemente

tenga lugar en la propia membrana de la célula diana, una localización que protege a

esta proteasa de sus inhibidores. La importancia de los residuos de manosa-6-fosfato en

este proceso ha sido también sugerida (66). También se han asociado cambios

conformacionales en LAP inducidos por trombospondina (una proteína de matriz

extracelular secretada por muchos tipos celulares) con la activación de TGF-β (273). En

células epiteliales, que son muy sensibles a inhibición del crecimiento inducido por

TGF-β, se ha sugerido que las integrinas pueden tener también una función relevante en

la activación de este factor de crecimiento (205). Asimismo, la transglutaminasa tipo II,

necesaria para la unión de LTBP a la matriz extracelular, participa también en la

activación de TGF-β en células endoteliales bovinas (154). Recientemente se ha

demostrado que unas proteinasas localizadas en la matriz extracelular, denominadas

metaloproteinasas de matriz (MMPs, Matrix Metalloproteinases), son capaces de


77

activar TGF-β. Las MMPs constituyen una familia de endopeptidasas dependientes de

zinc e implicadas en la remodelación de la matriz extracelular. La actividad de las

MMPs es necesaria para un amplio espectro de procesos fisiológicos, encontrándose

desregulada su expresión en ciertas situaciones patológicas. Dentro de las funciones

fisiológicas en las que participan estas proteasas se incluyen el crecimiento de neuritas,

la migración celular, la elongación del hueso, la angiogénesis, la ovulación, la

menstruación, la implantación del embrión y el procesamiento y presentación de

moléculas antigénicas. Los procesos patológicos en los que están involucradas las

MMPs incluyen el crecimiento y la migración tumoral, la fibrosis, la artritis, el

desarrollo de glaucoma, la cirrosis, la esclerosis múltiple, el lupus y algunas otras (287).

Las MMPs son secretadas como pro-enzimas latentes que serán posteriormente

activadas por mecanismos proteolíticos. Los sustratos de las MMPs incluyen la mayoría

de los componentes de la matriz extracelular como son fibronectina, vitronectina,

laminina, entactina, tenascina y diferentes tipos de colágeno. Cada miembro de la

familia de las MMPs está especializado en la proteolisis de un grupo de moléculas de la

matriz extracelular. El papel de las MMPs, y en particular de la MMP-3 o estromelisina,

en la activación de TGF-β desde el complejo latente pequeño (LAP-TGF-β) ha sido

puesto de manifiesto in vitro empleando vesículas de secreción producidas por

condrocitos (62, 182). En este mismo sistema experimental se ha sugerido que la MMP-

3 pudiera estar también implicada en el procesamiento del complejo latente grande y,

por tanto, en la liberación del TGF-β unido a LAP y LTBP desde la matriz extracelular

(183). En la proteolisis de LTBP-1 se ha mostrado que están implicadas las MMP-9 y

MMP-2 (323), las cuales se denominan también gelatinasa A y B, respectivamente, ya

que son capaces de degradar gelatina. Sorprendentemente, estas dos proteinasas son los

únicos miembros de esta familia que presentan en su estructura un dominio similar al

encontrado en la fibronectina y que potencia su unión a la matriz extracelular. La

regulación de las MMPs es compleja y está controlada por varios mecanismos: a nivel

de mRNA por regulación transcripcional mediada por citoquinas, hormonas y factores

de crecimiento, y a nivel de proteína por la activación proteolítica de las formas latentes

de estas enzimas. La inhibición de sus actividades proteolíticas por inhibidores


78

endógenos (TIMPs, Tissue Inhibitors of Matrix metalloproteinases) constituye un

mecanismo de regulación adicional (207, 224).

5. Enfermedades asociadas a alteraciones en la latencia de TGF-ββββ

La actividad de todos los miembros de la super-familia de TGF-β está sometida a

un estricto control tanto durante el desarrollo embrionario como en los diferentes

procesos fisiológicos en los que participan. Ya que la vida media de la forma activa de

TGF-β en el organismo es de unos pocos minutos (307), y en vista de su potencia

biológica, la latencia de esta molécula es considerada como un mecanismo de

estabilidad y de rápida disponibilidad de su forma activa. Así, la latencia constituye un

punto de control fundamental en la actividad de TGF-β. Una gran cantidad de estudios

en los últimos años han mostrado que la desregulación del balance entre la forma activa

y la forma latente de TGF-β puede conducir a estados patológicos (25).

Así, en diferentes tipos de células tumorales la actividad de TGF-β se encuentra

generalmente aumentada, lo que da lugar a un abanico de efectos que incluyen

disminución en enzimas que degradan matriz extracelular y aumento en el contenido de

proteínas de matriz (184). Adicionalmente, TGF-β también estimula procesos

angiogénicos in vivo, lo que puede estar relacionado con la aceleración del crecimiento

de tumores en sus fases más avanzadas (35). Por tanto, en células normales TGF-β actúa

como un supresor de tumores, de tal modo que mutaciones o alteraciones en su ruta de

señalización pueden contribuir al inicio y desarrollo de la enfermedad (10, 92, 189).

En relación al papel de LTBP en cáncer se ha sugerido que, además de su función

como componente estructural de la matriz extracelular, LTBP contribuye de manera

significativa a la activación de TGF-β, direccionando los complejos latentes hacia la

membrana de la célula diana. A pesar de lo limitado de la información disponible,

parece que la expresión de LTBP en tejido tumoral se encuentra disminuida con

respecto al tejido sano circundante, si bien no se ha podido establecer su relevancia en

relación a la activación de TGF-β en tumores (217). Una enfermedad en la que TGF-β

tiene una contribución bien definida es en fibrosis y, en particular, en las fibrosis


79

hepática, pulmonar y renal. Se ha mostrado que TGF-β estimula a los fibroblastos a

producir proteínas de matriz extracelular, sobre todo colágeno tipo I y fibronectina. En

este sentido, TGF-β se encuentra significativamente aumentado en fibrosis humana (20,

30, 255) y la adición de TGF-β exógeno resulta en el desarrollo de fibrosis en animales

experimentales (263, 278). Coincidiendo con estas observaciones, la aplicación de

anticuerpos inhibidores frente a TGF-β disminuye la progresión de procesos fibróticos

en animales experimentales (97, 300, 325). Todo este conjunto de observaciones

permiten proponer a TGF-β activo como un regulador relevante en fibrosis.

6. El receptor de dioxina y TGF-ββββ

Estudios realizados en los últimos años han mostrado la existencia de interacción

funcional entre el receptor de dioxina (AhR) y TGF-β. Esta interacción es compleja ya

que implica procesos de regulación recíproca entre ambas proteínas. Así, se ha puesto

de manifiesto que TGF-β regula negativamente la expresión del AhR a nivel

transcripcional (72) y que este efecto es dependiente del tipo celular (319). A efectos del

trabajo presentado en esta memoria, es más relevante la regulación de la expresión de

TGF-β por el AhR. La obtención de una línea de ratones carentes de la expresión de

este receptor permitió observar que en ausencia de AhR se produce un menor desarrollo

hepático (83) que otros laboratorios asociaron a alteraciones en el sistema vascular de

este órgano (162). Estudios realizados empleando cultivos primarios de hepatocitos de

ratones Ahr-/- mostraron que estas células poseen una menor capacidad proliferativa, un

aumento en el índice apoptótico y una mayor secreción de TGF-β (324). Más aún, una

fracción inusualmente alta de este TGF-β se encontraba en la forma activa de la proteína

(324). Estudios inmunohistoquímicos revelaron que, en paralelo a la sobre-activación de

TGF-β, se producía un aumento en la acumulación de colágeno hepático, lo que

originaba diferentes grados de fibrosis (83, 230). La sobre-expresión de TGF-β en

ausencia de un AhR funcional no parece ser exclusiva de células adultas ya que se

observó también en fibroblastos embrionarios de ratón. En estas células se detectaron

niveles elevados de TGF-β activo, que parecen estar relacionados con una menor tasa


80

proliferativa y un mayor nivel apoptótico, probablemente como consecuencia del

bloqueo en el ciclo celular a nivel de la transición G2/M (78). Estudios realizados

analizando el metabolismo de ácido retinoico en un contexto Ahr-/- mostraron que, en

ausencia de este receptor, se produce una marcada inducción de la actividad

transglutaminasa de tipo II, una enzima relevante en el anclaje de la forma latente de

TGF-β a la matriz extracelular (11, 214). Por tanto, un amplio conjunto de resultados

experimentales sugieren que el AhR puede participar en el mantenimiento de los niveles

y de la actividad de TGF-β en ratón. Los mecanismos moleculares implicados en dicho

proceso son aún desconocidos.

81

RREESSUULLTTAADDOOSS

CAPITULO II. Resultados

82

1. Análisis de genes expresados diferencialmente en función de la

presencia o ausencia del AhR

Como se indicó en la Introducción General, existen numerosas evidencias

experimentales que muestran que el papel celular del AhR no se limita a la regulación

de procesos de destoxificación de xenobióticos, sino que parece estar además implicado

en el desarrollo de diversas funciones fisiológicas. En este contexto, y como se mostró

en el capítulo anterior, dos observaciones experimentales apoyan dicha hipótesis: en

primer lugar, la existencia de heterodímeros AhR/ARNT transcripcionalmente activos

en el núcleo celular en ausencia de xenobióticos y, en segundo lugar, que el nivel

constitutivo del gen diana Cyp1A2 varía en función de la presencia o ausencia del AhR.

En base a esta información previa, y con el fin de estudiar procesos celulares en

los que pudiera estar implicado el AhR independientemente del metabolismo de

xenobióticos, hemos abordado la identificación y caracterización de genes cuya

expresión se encuentre regulada de manera diferencial entre ratones Ahr-/- y ratones

Ahr+/+ en ausencia de xenobióticos. Para ello hemos utilizado una técnica basada en

PCR y que se denomina DD-PCR (“Differential Display-Polymerase Chain Reaction”)

(171). Esta técnica permite analizar la expresión de un gran número de genes y

comparar las diferencias existentes entre dos o más condiciones distintas (en nuestro

caso la presencia o ausencia del AhR). Los cDNAs utilizados como moldes fueron

sintetizados a partir de RNA total purificado de cultivos de MEFs Ahr+/+ y Ahr-/-. La

PCR posterior se realizó utilizando combinaciones de cebadores aleatorios y cebadores

anclados en el extremo 3’ de los cDNAs tal y como se describe en Métodos. Con las

combinaciones de cebadores que fueron utilizadas en nuestros experimentos, hemos

estimado que se amplificaron alrededor de un 16% de los cDNAs celulares. Cada pareja

de cebadores fue empleada al menos por duplicado y las bandas que presentaban una

diferencia reproducible entre ambos genotipos fueron extraídas del gel, reamplificadas y

utilizadas como sondas en experimentos de northern-blot y RT-PCR para confirmar el

patrón de expresión diferencial. El patrón de expresión diferencial observado en DD-

PCR fue confirmado para 3 de las bandas aisladas, las cuales fueron posteriormente

secuenciadas. Dos de ellas presentaban una débil sobre-expresión en los ratones


83

silvestres con respecto a los Ahr-/- y su secuenciación determinó que codificaban para la

proteína ribosomal L3 (Rpl3; acceso GenBank NM 013762) y para una proteína similar

a la proteína específica de adipocitos 4 (acceso GenBank XM 126072). La tercera banda

que mostraba expresión diferencial entre ambos genotipos fue un producto de unas 650

bp amplificado por la combinación de los cebadores AP-4 (5’

ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTTGT 3’) y ARP-8

(5´ACAATTTCACACA GGATGGTAAAGGG 3’) (figura 30A). En los ensayos de

northern-blot realizados utilizando como sonda la banda extraída de DD-PCR, se

observó una sobre-expresión de unas 2.5 veces en MEFs de ratones Ahr-/- con respecto

a MEFs de los ratones silvestres (figura 30B). La comparación de su secuencia de

nucleótidos en la base de datos BLAST® (Basic Local Alignment Search Tool) mostró

una homología del 97% con la secuencia que codifica para la proteína LTBP-1 (Latent

TGF-β Binding Protein 1) de ratón (acceso GenBank NM 019919). El análisis de la

expresión diferencial de este gen fue también confirmada mediante experimentos de

RT-PCR utilizando cebadores específicos para el mRNA de LTBP-1 (figura 30C). Se

comprobó además que el fragmento específico de Ltbp-1, amplificado por RT-PCR,

hibridaba en northern-blot con la misma banda que la sonda obtenida por DD-PCR

(datos no mostrados).

Estos datos indican que la expresión constitutiva del gen Ltbp-1 en ratón está

sobre-expresada en ausencia del AhR y que, por tanto, este receptor pudiera participar

en la regulación de este gen en ausencia de xenobióticos.


84

Como ya se ha indicado, la desregulación del balance entre las formas latente y

activa de TGF-β ha sido asociada con diversas situaciones patológicas, entre ellas la

progresión tumoral y la fibrosis. LTBP-1 es una proteína de matriz extracelular que se

une al complejo latente pequeño de TGF-β (LAP-TGF-β) para formar el complejo

latente grande. LTBP-1 pertenece a la familia de glicoproteínas fibrilinas/LTBPs. Se

han propuesto al menos dos funciones para las proteínas LTBPs: componentes de la

matriz extracelular (57) y moduladores de la disponibilidad de TGF-β (156). La

similitud y co-localización de las proteínas LTBPs con las fibrilinas sugiere un papel

estructural para las primeras en la formación de la matriz extracelular, asociándose a las

fibras elásticas. Experimentos in vitro utilizando oligonucleótidos anti-sentido que

neutralizan LTBP-1 han mostrado que esta proteína es necesaria para la diferenciación

de células implicadas en la mineralización ósea (57), lo que sugiere un papel estructural

para LTBP-1. Experimentos en cultivos celulares han mostrado que la asociación de

LTBP-1 con la forma latente de TGF-β es importante en al menos dos aspectos de la

Figura 30. (A) Autorradiografía representativa de losexperimentos de DD-PCR realizados. La flecha señala labanda de 650 bp amplificada por los cebadores AP-4 y ARP-8que presenta sobre-expresión en ratones Ahr-/-. (B) Northern-blot de 15 µg de RNA total obtenido de MEFs Ahr+/+ y Ahr-/- utilizando como sonda la banda reamplificada a partir delDD-PCR del panel A. (C) Análisis de la expresión de Ltbp-1mediante RT-PCR utilizando cebadores específicos para estegen. La expresión de β-Actina se utilizó como control de RT-PCR.

+ - + - + - + - + - AhR Ahr+/+ Ahr-/-

Ltbp-1

ββββ-Actina

Ahr+/+ Ahr-/-

B A C

Ltbp-1

28S


85

funcionalidad de esta citoquina. En primer lugar, la unión de LTBP-1 al complejo

latente pequeño de TGF-β facilita su plegamiento y secreción (202). En segundo lugar,

la interacción entre LTBP-1 y la matriz extracelular actúa como un mecanismo

modulador de la activación del TGF-β latente (88, 114, 209, 269). En apoyo de esta

hipótesis, se ha observado que la ausencia de LTBP-3 y LTBP-4 en ratones “knock-out”

para los genes que codifican estas proteínas se encuentra asociada con una reducida

activación del TGF-β latente (55, 286).

Todo ello, unido a la co-regulación de la expresión entre AhR y TGF-β y al

fenotipo de sobre-expresión de TGF-β observado en los ratones Ahr-/-, ha servido de

base para abordar el estudio de LTBP-1 como una proteína que se encuentra regulada

diferencialmente en presencia o ausencia de AhR.

2. Los cultivos de MEFs Ahr-/- presentan mayores niveles proteicos de

LTBP-1

Para analizar si la sobre-expresión de Ltbp-1 a nivel de mRNA en los MEFs Ahr-

/- se correspondía con un aumento en sus niveles proteicos, analizamos la expresión de

esta proteína mediante western-blot en extractos celulares totales. Los cultivos fueron

crecidos durante 72 h después de alcanzar confluencia con el fin de que expresaran

matriz extracelular. Como puede observarse en la figura 31, los niveles de proteína

LTBP-1 detectados en los cultivos pos-confluentes procedentes de ratones Ahr-/- fueron

significativamente superiores a los niveles presentes en los cultivos procedentes de

ratones silvestres.

Ahr+/+ Ahr-/-

LTBP-1 (190 kDa)

ββββ-ACTINA

Figura 31. Los cultivos de MEFs Ahr-/- expresan mayorcantidad de LTBP-1 a nivel de proteína con respecto alos de los ratones silvestres. Cultivos de MEFs Ahr+/+ yAhr-/- fueron crecidos durante 72 horas después dealcanzar confluencia. 15 µg de los extractos proteicos dedichos cultivos fueron analizados mediante western-blotutilizando un anticuerpo específico frente a LTBP-1. Elnivel de expresión de β-ACTINA se utilizó como controlde carga.


86

Dado que LTBP-1 es un componente de la matriz extracelular, y ya que se ha

determinado que su localización en dicha matriz es necesaria para su funcionalidad,

analizamos la presencia de esta proteína en los cultivos de MEFs mediante

inmunocitoquímica. Como se muestra en la figura 32, los cultivos pos-confluentes de

MEFs Ahr-/- presentaron una cantidad significativamente mayor de LTBP-1 asociado a

la matriz extracelular que los ratones silvestres. Adicionalmente, puede observarse que

LTBP-1 aparecía dispuesto en estructuras fibrilares de la matriz extracelular.

Estos datos sugieren que los cultivos de MEFs Ahr-/- expresan mayores niveles

proteicos de LTBP-1 en relación a los niveles expresados por los cultivos procedentes

de ratones silvestres, y que esta sobre-expresión proteica se localiza en estructural

fibrilares de la matriz extracelular.

3. La sobre-expresión de Ltbp-1 en MEFs Ahr-/- está regulada a

diferentes niveles

Con el fin de caracterizar el tipo de regulación transcripcional de Ltbp-1 por el

AhR, tratamos cultivos de MEF Ahr-/- con el inhibidor de la transcripción actinomicina

D y con el inhibidor de la síntesis de proteínas cicloheximida y analizamos su expresión

mediante northern-blot.

Figura 32. Los cultivos de MEFs Ahr-/- presentan mayores niveles de LTBP-1 en estructurasfibrilares en la matriz extracelular en comparación con los presentes en cultivos de MEFs silvestres.La localizacion de LTBP-1 fue determinada mediante inmunocitoquímica en cultivos de MEFs pos-confluentes empleando un anticuerpo específico que reconoce un epítopo de la región bisagra de la proteína.

Cultivos pos-confluentes de MEFs Ahr+/+

Cultivos pos-confluentes de MEFs Ahr-/-


87

Como se observa en la figura 33, el tratamiento con 2 µg/ml de actinomicina D

(ActD) durante 3 h produjo una significativa disminución en el nivel de expresión de

Ltbp-1 con respecto al nivel presente en cultivos no tratados, lo que sugiere un

mecanismo de regulación transcripcional. Por el contrario, el tratamiento con 50 µg/ml

de cicloheximida (CHX) produjo un marcado aumento en los niveles de mRNA de este

gen lo que pudiera implicar la existencia de una proteína represora de vida media corta

y cuya síntesis fuera necesaria para el mantenimiento del nivel de expresión constitutivo

de este gen.

4. Los niveles de expresion de Ltbp-2, Ltbp-3 y Ltbp-4 no difieren

significativamente en presencia o ausencia de AhR

LTBP-1 pertenece a una familia de glicoproteínas las cuales presentan co-

localización en la matriz extracelular así como un patrón de expresión redundante en

algunos tejidos. Por este motivo decidimos analizar la expresión de restantes isoformas

descritas de LTBP en los cultivos de MEFs tanto silvestres como carentes de la

expresión del AhR. Así, la expresión de Ltbp-2, Ltbp-3 y Ltbp-4 fue determinada

mediante northern-blot utilizando sondas específicas para cada mRNA (figura 34). En

el caso de Ltbp-2 se observó una ligera disminución en los niveles de su mRNA en

MEFs Ahr-/- con respecto al nivel observado en los ratones silvestres. Ya que las

Figura 33. Análisis mediante northern-blot de la expresión de Ltbp-1 tras el tratamiento con actinomicina D y cicloheximida. Los cultivos de MEFs Ahr-/- fueron tratados durante los tiempos y con las concentraciones indicadas de actinomicina D y de cicloheximida. 10 µg de RNA total procedentes de dichos cultivos fueron analizados mediante northern-blot utilizando una sonda específica para Ltbp-1. La expresión de β-Actina se utilizó como control de carga.

Tiempo (h)

CHX 50 µµµµg/ml

ActD 2 µµµµg/ml

0 1 3 1 3

ββββ-Actina

Ltbp-1


88

proteínas LTBPs presentan entre sí distintos patrones de regulación transcripcional y

pos-transcripcional no sólo en función del tipo celular sino también del estado de

desarrollo, cabe la posibilidad de que el AhR pudiera intervenir de manera distinta en la

regulación de la expresión de Ltbp-1 y Ltbp-2. En el caso de Ltbp-3 no se observaron

diferencias apreciables en el nivel de su mRNA entre cultivos de MEFs de ambos

genotipos. La expresión de Ltbp-4 a nivel de mRNA fue indetectable por northern-blot

en MEFs.

5. Los cultivos de MEFs Ahr-/- secretan más cantidad de TGF-ββββ activo

y latente en relación a los cultivos silvestres

Se ha descrito que los ratones Ahr-/- expresan en hígado niveles proteicos de

TGF-β1 y TGF-β3 superiores a los que presentan los ratones silvestres (324). Este

hecho ha sido asociado con el menor tamaño de este órgano en los ratones carentes del

AhR ya que TGF-β inhibe proliferación celular y aumenta la tasa de apoptosis,

fenómenos también observados en cultivos primarios de hepatocitos Ahr-/- (324). Sin

embargo, los niveles hepáticos de mRNA tanto de TGF-β1 como de TGF-β3, medidos

por northern-blot, no presentan diferencias apreciables entre ambos genotipos, por lo

que el aumento en la cantidad de proteína pudiera ser debido a un efecto pos-

transcripcional. Dado que LTBP-1 participa no sólo en la disponibilidad sino también

en la activación de TGF-β, cabe la posibilidad de que el incremento en la expresión de

Figura 34. Niveles de expresión de Ltbp-2 y Ltbp-3 en los cultivos de MEFs silvestres (Ahr+/+) y Ahr-/-. 10 µg de RNA total procedente de cultivos de MEFs silvestres y Ahr-/- fueron analizados mediante northern-blot con sondas específicas para Ltbp-2 y Ltbp-3. La expresión de β-Actina se utilizó como control de carga.

Ltbp-2

ββββ-Actina

Ltbp-3

ββββ-Actina

Ahr+/+ Ahr-/- Ahr+/+ Ahr-/-


89

LTBP-1 en MEFs Ahr-/- pudiera afectar a la cantidad de TGF-β latente y/o activo

secretados. Con el fin de caracterizar esta posibilidad cuantificamos el TGF-β activo y

el latente secretado al medio por los cultivos de MEFs Ahr-/- y Ahr+/+.

En primer lugar medimos el nivel del mRNA de TGF-β1 en cultivos de MEFs de

ambos genotipos. Como se muestra en la figura 35, y en paralelo a lo observado en

hígado, no se apreciaron diferencias significativas en los niveles del mRNA de TGF-β1

entre ambos genotipos, por lo que no parece existir una regulación diferencial en la

expresión de TGF-β1 a nivel de transcripción.

La disponibilidad de TGF-β puede estar modulada por cambios en su nivel de

activación aún en ausencia de diferencias en su regulación transcripcional. Por ello,

hemos medido la cantidad de TGF-β, tanto latente como activo, secretado al medio de

cultivo por MEFs Ahr+/+ y Ahr-/-. Este ensayo se basa en la capacidad de los medios

condicionados por MEFs para inhibir la proliferación de la línea celular de referencia

CCL-64. La línea celular CCL-64 fue inmortalizada a partir de epitelio de pulmón de

visón y su capacidad de proliferación es muy sensible a inhibición por TGF-β. De este

modo, el cultivo de las CCL-64 en presencia del medio condicionado por otro tipo

celular provocará cambios en su capacidad proliferativa que pueden asociarse a la

presencia de TGF-β en dicho medio. In vitro, el TGF-β latente puede ser convertido en

su forma activa por procedimientos físico-químicos tales como calentamiento o

acidificación (101). Dentro del diseño experimental empleado, una alícuota de los

medios de cultivo condicionados por MEFs Ahr+/+ y Ahr-/- fue tratada con calor (80ºC

durante 8 minutos) para activar el TGF-β latente y determinar la “actividad total” de

TGF-β. Esta actividad podrá ser entonces comparada con la “actividad nativa” que se

TGF-ββββ1

ββββ-Actina

Ahr+/+ Ahr-/- Figura 35. La expresión de TGF-β1β1β1β1 a nivel demRNA no presenta diferencias significativasentre cultivos de MEFs Ahr+/+ y Ahr-/-. 10 µg deRNA total de los cultivos fueron analizadosmediante northern-blot utilizando una sondaespecífica para TGF-β1. La expresión de β-Actinase analizó como control de carga.


90

obtiene en ausencia de calentamiento (activación). Para confirmar la presencia de TGF-

β en el medio condicionado se utilizó un anticuerpo con la capacidad de neutralizar la

actividad de las isoformas 1 y 2 de ratón (anti-TGF-β). La figura 36 muestra una

representación de los valores de proliferación de las CCL-64 determinados por

incorporación de 3H-timidina en cada una de las condiciones ensayadas. Como puede

observarse, la “actividad nativa” del TGF-β secretado por los MEFs Ahr-/- fue muy

superior al secretado por los Ahr+/+. El medio condicionado por MEFs silvestres, no

obstante, contenía un cierto nivel de TGF-β activo, tal y como puede observarse

comparándolo con respecto a la inhibición inducida por el medio no condicionado. Para

ambos genotipos, la adición de anticuerpo neutralizante frente a TGF-β revirtió el efecto

de inhibición de la proliferación provocado por los medios condicionados. Cuando los

medios fueron tratados con calor antes de ser añadidos a las CCL-64, su efecto inhibidor

de la proliferación aumentó con respecto al observado en los medio sin tratar. Estos

resultados indican que parte del TGF-β liberado al medio de cultivo por los MEFs

estaba en forma latente habiendo sido activado por el tratamiento con calor.

La cuantificación con respecto a una curva estándar de los niveles de TGF-β

secretados por los cultivos de MEFs Ahr+/+ y Ahr-/- (tabla I), en sus formas nativa y

latente, permitió determinar que en el caso de los MEFs silvestres aproximadamente el

70% del TGF-β total liberado correspondía a la forma latente, mientras que en el caso

de los MEFs Ahr-/- el TGF-β latente fue de un 40%. Por otro lado, los MEFs de ratones

Ahr-/- secretaron unas 4 veces más TGF-β activo y unas 2 veces más TGF-β total que

los MEFs de ratones Ahr+/+.

En resumen, los cultivos de MEFs Ahr-/- secretan niveles de TGF-β

significativamente mayores a los secretados por los cultivos de MEFs Ahr+/+, tanto en

lo que se refiere a cantidad total como a la forma activa de esta citoquina.

Adicionalmente, el porcentaje de forma latente en los MEFs silvestres fue mayor que el

encontrado en los MEFs Ahr-/-.


91

Actividad nativa

(pg/ml)

Actividad total

(pg/ml)

MEFs Ahr+/+ 44 ± 0.8 147 ± 42

MEFs Ahr-/- 190 ± 34 314 ± 56

Los niveles de secreción de las formas total y nativa de TGF-β por los cultivos celularesensayados en la figura 36 fueron cuantificados utilizando la curva estándar presentada en elpanel derecho de la misma. Los valores de la tabla representan la media de los niveles de TGF-β y su desviación estándar, normalizados por el número de células presentes en los cultivos deMEFs en el momento de recoger los medios condicionados.

actividad nativa (TGF-β activo)

0

500

1000

1500

2000

2500

anti-TGF-β Ahr+/+ Ahr-/-

- + - + - + - + Ahr+/+ Ahr-/- actividad total

(TGF-β latente+activo)

0 50 100

TGF-β (pg)

3 H-T

imid

ina

(cpm

) curva estándar

medios condicionados - -

Figura 36. Cuantificación de los niveles de TGF-ββββ latente y activo secretado por los cultivos de MEFs silvestres y MEFs Ahr-/-. Ensayo de proliferación de la línea celular CCL-64 creciendo en los medios condicionados de cultivos de MEFs Ahr+/+ y Ahr-/-.

Tabla I. Cuantificación de los niveles de TGF-ββββ total y nativo secretado al medio de cultivo por MEFs procedentes de ratones Ahr+/+ y Ahr-/-


92

6. La expresión de Ltbp-1 en MEFs no está regulada por TGF-β1β1β1β1

Se ha mostrado que la expresión de TGF-β1 y LTBP-1 se encuentra coordinada

tanto a nivel de mRNA como de proteína en células de eritroleucemia humana en

respuesta al tratamiento con PMA (4β-Phorbol 12-Myristate 13-Acetate) (202).

Asimismo, en células fibroblásticas de piel humana, la expresión de TGF-β1 y LTBP-1

ocurre de forma paralela en el tiempo tras la adición de TGF-β1 exógeno a una

concentración de 5 ng/ml (58). Un efecto similar se observa en la línea celular

procedente de cáncer de mama BT-20 tras la adición de 1,25-dihidroxi-vitamina D3

(155). Por el contrario, la adición de TGF-β1 exógeno a las líneas celulares de

osteoblastos MG63, ROS 17/2.8 y UMR-106 sugiere que la expresión de LTBP-1 y

TGF-β1 no está coordinada en estos tipos celulares (58). Debido a esta regulación en

función del tipo celular, analizamos si la sobre-expresión de Ltbp-1 en MEFs Ahr-/-

podría ser consecuencia de que el exceso de TGF-β secretado por estas células estuviera

estimulando la expresión de dicho gen. Para ello, determinamos el nivel del mRNA de

Ltbp-1 en cultivos de MEFs Ahr+/+ y Ahr-/- tratados con 10 ng/ml de TGF-β1 exógeno

(figura 37A). Adicionalmente, se trataron cultivos de MEFs Ahr-/- con 1 µg/ml del

anticuerpo neutralizante frente a TGF-β durante 24 horas e igualmente se determinó la

expresión de Ltbp-1 mediante northern-blot (figura 37B). Como puede observarse, ni la

adición de TGF-β1 exógeno ni de anticuerpo neutralizante provocaron un efecto

significativo en la expresión de Ltbp-1 a nivel de mRNA.

Ltbp-1

Figura 37. El tratamiento de los cultivos de MEFs con TGF-β1β1β1β1 exógeno o con anticuerpo neutralizante para TGF-ββββ no produce cambios significativos en los niveles de expresión de Ltbp-1. Los cultivos de MEFs fueron tratados durante los tiempos indicados con 10 ng/ml de TGF-β1 (A) o con 1 µg de anticuerpo neutralizante frente a TGF-β durante 24 horas (B). La expresión de Ltbp-1 se determinó mediante northern-blot empleando 10 µg de RNA total obtenido a partir de dichos cultivos.

A

0 0.5 3 6 0 0.5 3 6 TGF-ββββ1 (h)

MEFs Ahr+/+ MEFs Ahr-/- MEFs Ahr-/-

anti-TGF-ββββ - +

B

Ltbp-1


93

7. Los cultivos de MEFs Ahr-/- presentan una menor actividad

metaloproteinasa-2 (MMP-2)

Las metaloproteinasas de matriz (MMPs) son proteasas localizadas en la matriz

extracelular e implicadas en la remodelación tisular normal. Alteraciones en la actividad

de las MMPs han sido asociadas a procesos patológicos tales como fibrosis hepática

(134) y carcinogénesis (122). Debido a sus potenciales efectos perjudiciales, la

actividad de las MMPs está estrictamente regulada a varios niveles. A nivel

transcripcional, la expresión de las MMPs se encuentra controlada por citoquinas que

actúan de manera positiva o negativa sobre los elementos reguladores de sus genes. La

actividad de las MMPs puede estar también regulada pos-transcripcionalmente bien por

activación de las correspondientes proenzimas, bien mediante la interacción con

inhibidores específicos (TIMPs, Tissue Inhibitors of matrix Metalloproteinases). Estos

inhibidores pueden unirse al sitio catalítico de la enzima activa o a la pro-enzima,

inhibiendo su actividad o previniendo su activación, respectivamente (21). Diferentes

estudios han demostrado que la adición de TGF-β1 exógeno al medio de cultivo reduce

la actividad de la MMP-2 a través de la inducción de la expresión de TIMP-1 y TIMP-2

(147, 225, 280). Como se mostró anteriormente, los MEFs Ahr-/- secretan al medio de

cultivo cantidades elevadas de TGF-β activo. Con el fin de determinar si existían

diferencias en la actividad MMP-2 entre cultivos de MEFs Ahr+/+ y Ahr-/- hemos

analizado la capacidad gelatinolítica del medio de cultivo secretado por fibroblastos de

ambos genotipos. Como se observa en la figura 38, los cultivos de MEFs Ahr-/-

secretan una menor actividad tanto de la forma latente (72 kDa) como de las formas

intermedia (64 kDa) y activa (62 kDa) de la MMP-2.


94

Para determinar si la disminución en la actividad MMP-2 observada en los

cultivos de MEFs Ahr-/- podía ser consecuencia de la inducción por TGF-β de la

expresión de los inhibidores TIMP-1 y/o TIMP-2, analizamos la expresión de los genes

que codifican para ambos inhibidores mediante RT-PCR. Como se muestra en la figura

39, no se detectaron diferencias significativas en los niveles de los mRNA de TIMP-1 y

TIMP-2 entre los cultivos de MEFs silvestres (Ahr+/+) y Ahr-/-.

Figura 38. El medio condicionado por loscultivos de MEFs Ahr-/- presenta una menoractividad MMP-2 en relación a los cultivossilvestres. Los cultivos de MEFs de ambosgenotipos se crecieron en medio sin suero durante72 horas. La actividad gelatinolítica de los mediosprocedentes de dichos cultivos se analizó medianteun gelatinograma. La cantidad de medio empleadoen cada caso es el equivalente al mismo número decélulas en cultivo. Las flechas indican la posiciónde la pro-MMP-2 (72 kDa), la forma intermedia(64 kDa) y la MMP-2 activa (62 kDa). Lalocalización de MMP-2 se ha confirmado porcomparación con un control estándar compuestopor medio condicionado por la línea HT1080.

Ahr+/+ Ahr-/-

Pro-MMP-2 (72 kDa)Intermedia (64 kDa)

MMP-2 (62 kDa)

Figura 39. Análisis de la expresión de Timp-1 y Timp-2 mediante RT-PCR en cultivos de MEFs silvestres(Ahr+/+) y Ahr-/-. Cultivos de MEF de ambosgenotipos se crecieron en medio libre de suero durante72 h. 1 µg del RNA total aislado de dichos cultivos fueempleado en la amplificación por RT-PCR de losmRNA de ambos genes. El mRNA de β-Actina seamplificó como control de carga y de integridad delRNA empleado.

Timp-1

Timp-2

ββββ-Actina

Ahr+/+ Ahr-/-

95

DDIISSCCUUSSIIÓÓNN

CAPITULO II. Discusión

96

La matriz extracelular es una estructura altamente compleja constituida por un

gran número de componentes distintos. Estos incluyen proteínas estructurales como

colágeno, fibrilinas y fibronectina, y material no estructural como los proteoglicanos. La

matriz extracelular es sintetizada por un gran número de células especializadas,

fundamentalmente fibroblastos, condrocitos, osteocitos y células epiteliales. La mayoría

de los componentes de la matriz están sujetos a un estricto control de su expresión, tanto

a nivel transcripcional como traduccional, siendo también frecuente que se produzcan

modificaciones pos-traduccionales. En los últimos años se ha sugerido la idea de que

muchas de estas proteínas son reconocidas por receptores específicos situados en la

superficie celular. Esta interacción entre componenetes de la matriz y receptores

celulares desencadenaría una cascada de señalización capaz de modificar las funciones

celulares de una manera específica. De hecho, la interacción de una célula con la matriz

extracelular que la rodea controla procesos tan relevantes como el crecimiento, la

diferenciación, la motilidad y los cambios en la morfología celular. Algunas de las

moléculas de la matriz extracelular presentan una alta afinidad de unión a factores de

crecimiento y citoquinas. De este modo, ciertas proteínas de matriz participan en la

activación de la señalización mediada por esos factores así como en el mantenimiento

de una reserva local de los mismos que permita su rápida disponibilidad en momentos

determinados. Varias enfermedades, incluyendo la osteogénesis imperfecta, los

síndromes de Ehlers-Danlos, el síndrome de Marfan y las condrodisplasias han sido

atribuidas a mutaciones en alguna de las proteínas estructurales de la matriz

extracelular. La fibrosis, otra enfermedad asociada a alteraciones en la matriz

extracelular, se produce cuando existe un aumento en la deposición de tejido conectivo

por un desbalance entre la producción y la degradación del mismo.

Algunas citoquinas, entre las que se incluye TGF-β, pueden inducir la expresión

de genes como colágeno y fibronectina. Por otro lado, TGF-β también induce la

expresión de inhibidores de la actividad de algunas proteasas encargadas de degradar la

matriz extracelular. Por todo ello, la sobre-expresión de TGF-β puede conducir a una

situación de fibrosis. La mayoría de las células secretan TGF-β al medio extracelular en

forma de complejo latente, siendo uno de los componentes de dicho complejo un


97

miembro de la familia de las LTBPs. Las proteínas LTBPs presentan una alta homología

con las fibrilinas y se depositan en la matriz extracelular por la acción de la

transglutaminasa tipo II. Así, las LTBPs y las fibrilinas forman parte de una organizada

red micro-fibrilar presente en la matriz extracelular. Dado que una amplia fracción del

TGF-β secretado se encuentra unido a LTBP en la matriz, la liberación proteolítica del

LTBP representa un mecanismo fisiológico de activación de TGF-β latente. Aunque las

proteínas LTBPs fueron inicialmente identificadas como un componente del complejo

latente de TGF-β, actualmente está aceptado que tienen funciones adicionales como son

el ser constituyentes estructurales de la matriz extracelular y reguladores de la

activación de TGF-β.

Los ratones “knock-out” para el receptor de dioxina (Ahr-/-) presentan una

variedad de alteraciones fenotípicas incluyendo un menor tamaño hepático y una

marcada fibrosis en este órgano. Los cultivos primarios de hepatocitos procedentes de

dichos ratones secretan al medio cantidades elevadas de TGF-β, tanto en su forma

latente como activa. En consonancia con estas observaciones, el hígado de los ratones

Ahr-/- presenta fibrosis con deposición de colágeno (83, 230), acumulación de ácido

retinoico e inducción de la actividad de la transglutaminasa tipo II (11). Por tanto, estos

datos sugieren la participación del AhR en el mantenimiento de la fisiología hepática,

probablemente a través del mantenimiento de los niveles de TGF-β.

En este estudio, mediante la utilización de la técnica de “differential display” en

fibroblastos embrionarios de ratón, hemos identificado un gen que se sobre-expresa en

ratones Ahr-/- y que está relacionado con la señalización mediada por TGF-β. Se trata

del gen que codifica para la proteína LTBP-1. La regulación de la expresión de Ltbp-1

por el AhR tiene lugar a través de un mecanismo complejo. Por un lado implica un

proceso de regulación transcripcional ya que la sobre-expresión de Ltbp-1 resulta

inhibida por actinomicina D. Por el otro, parece implicar la participación y la síntesis de

novo de un regulador negativo ya que la adición de cicloheximida aumenta el nivel de

mRNA de Ltbp-1 por encima del observado en MEFs Ahr-/-. El papel del AhR, bien

como regulador negativo directo de la expresión de Ltbp-1 , o bien como inductor de la

expresión de la potencial proteína represora está aún por determinar. La sobre-expresión


98

de Ltbp-1 a nivel de mRNA resulta en una marcada acumulación de esta proteína en

estructuras fibrilares de la matriz extracelular en cultivos de MEFs Ahr-/-. En la línea

celular de fibroblastos de ratón Swiss-3T3 se ha mostrado que la sobre-expresión de la

transglutaminasa de tipo II conduce a una mayor deposición de LTBP-1 en la matriz

extracelular (304). El hecho de que los ratones Ahr-/- presenten una mayor expresión de

esta enzima en hígado, permite sugerir que su potencial sobre-expresión en MEFs

podría contribuir a que el exceso de expresión de LTBP-1 se traduzca en una mayor

acumulación de esta proteína en la matriz extracelular.

Por otra parte, el incremento en la deposición de LTBP-1 en la matriz podría

conducir a un aumento en la activación de TGF-β. El papel de LTBP-1 en la activación

de esta citoquina ha sido previamente sugerido por varios autores (114, 304), si bien el

mecanismo molecular de este proceso no ha sido aún clarificado. Los niveles de TGF-

β total (activo + latente) detectados en MEFs de ratones Ahr-/- se encuentran

significativamente elevados con respecto a los encontrados en MEFs de ratones

silvestres. Sin embargo, este aumento en los niveles del TGF-β total secretado no se

corresponde con una mayor expresión de TGF-β1 a nivel de mRNA. Adicionalmente, el

porcentaje de TGF-β activo presente en los cultivos MEFs Ahr-/- es mayor que el

observado en los MEFs silvestres. Nuestros resultados apoyarían un mecanismo de

estabilización y activación de TGF-β en el que podrían estar involucrados tanto los altos

niveles de LTBP-1 como un previsible aumento de la actividad transglutaminasa tipo II.

Así, estos datos apoyan una doble función de LTBP-1 en relación a TGF-β: estabilizar

esta citoquina en la matriz extracelular y participar en el control de su activación

extracelular.

Recientemente se ha descrito que LTBP-1 es un sustrato para las

metaloproteinasas de matriz MMP-2 y MMP-9, aunque sólo la MMP-2 es capaz de

liberar la forma de LTBP-1 unida a la matriz extracelular (59). Por otra parte, TGF-β

puede regular la actividad de estas proteasas mediante la inducción de la expresión de

inhibidores de las mismas. En el medio de cultivo de MEFs Ahr-/- hemos detectado una

menor actividad de la MMP-2, tanto de la forma pro-MMP-2 como de las formas

activas. Por el contrario, no hemos detectado actividad para la MMP-9. A pesar de ello,


99

no se han detectado cambios en los niveles de TIMP-1 y TIMP-2, por lo que la

regulación de la actividad MMP-2 en ausencia del AhR parece tener lugar por otros

mecanismos. Esta menor actividad degradativa de la MMP-2 podría además contribuir a

la acumulación de LTBP-1 en las fibras de la matriz.

Dado que LTBP-1 juega un importante papel en embriogénesis (209) así como en

la diferenciación de células ES (114), y ya que este estudio está realizado en

fibroblastos embrionarios de ratón de 14.5 días in utero cabe la posibilidad de que las

alteraciones hepáticas e inmunológicas presentes en ratones Ahr-/- puedan ser, al menos

parcialmente, consecuencia de una regulación anómala de los niveles de LTBP-1 y

TGF-β durante el periodo embrionario. En apoyo de esta posibilidad, se ha descrito que

el aumento de fibrosis hepática en ratones Ahr-/- es detectable a los pocos días de

nacimiento (83, 270).

La influencia del AhR en la regulación de los niveles de LTBP-1 y TGF-β puede

ser también relevante en carcinogénesis. Si bien está ampliamente demostrado que el

AhR es totalmente necesario para el desarrollo de tumores inducidos por compuestos no

genotóxicos como dioxina, aún no se conocen las rutas ni los mecanismos implicados en

dichos procesos. La regulación negativa que el AhR parece ejercer sobre LTBP-1 y

TGF-β podría representar un posible mecanismo por el que este receptor induce el

desarrollo de tumores. Según esta hipótesis, la activación del AhR por dioxina

disminuiría tanto la expresión de LTBP-1 como la activación de TGF-β. En estas

circunstancias se podría favorecer la proliferación celular y, últimamente, el crecimiento

tumoral. Si bien no existen hasta el momento resultados experimentales que apoyen esta

hipótesis, su análisis requiere investigación futura.

En conclusión, nuestros resultados sugieren que el fenotipo encontrado en los

ratones Ahr-/- en relación a la señalización por TGF-β podría deberse, al menos en

parte, a una sobre-expresión de Ltbp-1. El incremento de esta proteína en la matriz

extracelular actuaría por una parte estabilizando el TGF-β y por otra contribuyendo

positivamente a su activación. Estos datos son consistentes con los publicados por otros

grupos y aportan una evidencia más acerca del papel de LTBP-1 en los procesos de

almacenamiento y activación de TGF-β. El mecanismo por el que LTBP-1 participa en


100

la activación de TGF-β así como el análisis de la regulación transcripcional de LTBP-1

por el AhR deberán ser analizados en detalle.

101

CCOONNCCLLUUSSIIOONNEESS

Conclusiones

102

1. La inhibición del proteosoma bloquea la degradación del AhR inducida por

xenobióticos.

2. La inhibición del proteosoma, en ausencia de ligando exógeno, induce la

translocación nuclear y la activación transcripcional del AhR en fibroblastos

embrionarios de ratón.

3. La activación del AhR por inhibición del proteosoma puede ser consecuencia de

cambios en la expresión del translocador nuclear ARNT. Adicionalmente, la

sobre-expresión de ARNT es suficiente para inducir la translocación nuclear del

AhR en ausencia de xenobióticos.

4. El nivel de fosforilación de Sp1 y su unión al promotor de Arnt aumentan

durante la inhibición del proteosoma.

5. La inhibición de la actividad proteína quinasa C bloquea la fosforilación de Sp1,

su unión al promotor de Arnt, el aumento de ARNT a nivel transcripcional y la

translocación nuclear del AhR inducido por inhibición del proteosoma.

6. La expresión de LTBP-1 está incrementada a nivel de mRNA en fibroblastos

embrionarios de ratones Ahr-/-. Esta sobre-expresión se pone también de

manifiesto tanto a nivel de la proteína intracelular como de la depositada en la

matriz extracelular.

7. En cultivos de fibroblastos embrionarios Ahr-/- el nivel de secreción de TGF-β,

tanto de la forma activa como latente, es superior al observado en cultivos

silvestres. La fracción de TGF-β activo secretado, con respecto al latente, es

mayor en cultivos que carecen de la expresión del AhR.

Conclusiones

103

8. Los fibroblastos embrionarios carentes de la expresión del AhR presentan una

disminución en la actividad MMP-2 extracelular, sin una inducción apreciable

en la expresión de inhibidores de metaloproteinasas.

104

MMÉÉTTOODDOOSS

Métodos

105

1. Cultivos celulares y tratamientos

1.1. Cultivo primario de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF)

Los fibroblastos embrionarios de ratón se obtienen de embriones a 14.5 días in

utero como se describe a continuación. Una vez sacrificada la hembra, se extraen ambas

ramificaciones del útero conteniendo los embriones. Estos se separan del saco

embrionario y la placenta. En condiciones de esterilidad, se eliminan la cabeza y los

órganos internos y el resto del tejido embrionario es triturado y digerido durante 1 hora

a 37ºC con agitación en PBS1 conteniendo tripsina al 0.25% (p/v). La tripsina se

inactiva por adición de 3 volúmenes de medio de cultivo completo2 y la suspensión

celular se centrifuga brevemente para eliminar el tejido no digerido. El sobrenadante,

que contiene los fibroblastos aislados, se deposita en placas de cultivo pretratadas con

gelatina al 0.1% (p/v). Las células se dejan crecer hasta confluencia en medio de cultivo

completo2 en una atmósfera de CO2 al 5% y 37ºC. Consideramos en este momento los

fibroblastos en pase 0. El medio de cultivo es reemplazado por medio fresco cada 2-3

días. Una vez que la monocapa celular en pase 0 ha alcanzado un 80-90% de

confluencia se aspira el medio de cultivo, se lava con PBS y se incuba en tripsina al

0.05% (p/v)-EDTA 0.5 mM (Gibco BRL) hasta que las células se despegan de la placa.

Tras inactivar la tripsina por adición de 3 volúmenes de medio completo, se toma una

alícuota de la suspensión celular para determinar el número de células utilizando un

hemacitómetro. En este punto los fibroblastos se almacenan en nitrógeno líquido para

un uso posterior (en medio completo conteniendo DMSO al 10% (v/v)) o bien son

crecidos de nuevo en placas de cultivo (en medio completo), considerándose en este

momento en pase 1. Para todos los experimentos se utilizaron fibroblastos en pase 1 ó 2

y a una confluencia aproximada del 80.

El genotipo de los ratones se analiza mediante PCR empleando DNA genómico

obtenido de un fragmento de la cola de los animales adultos. La extracción del DNA

genómico se realiza digiriendo un pequeño fragmento de cola en tampón de extracción

1 PBS: NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM, Na2HPO4 4.3 mM, KH2PO4 1.5 mM, pH 7.2 2 Medio de cultivo completo: Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) suplementado con 10% de suero fetal bovino (v/v), L-glutamina 2 mM, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 µg/ml

Métodos

106

de DNA genómico3 durante 16 h a 55ºC y precipitándose posteriormente el DNA en un

volumen de isopropanol. Tras un lavado en 500 µl de isopropanol al 80% (v/v), el DNA

se deja secar y se resuspende en 200 µl de TE4, de los cuales 2 µl se utilizan como

molde para PCR. Los cebadores utilizados en la reacción de PCR son: 5’

GGCTAGCGTGCGGGTT TCTC 3’ y 5’ CTAGAACGGCACTAGGTAGGTCAGA

3’. Estos cebadores hibridan en secuencias de DNA genómico localizadas hacia los

extremos 5’ y 3’ del lugar en el que se realizó la inserción del gen de resistencia a

neomicina en el alelo mutado del Ahr (83). De este modo, se obtiene un fragmento de

PCR de 1.5 kb en el caso del alelo mutado y de 0.5 kb cuando se trata del alelo silvestre.

1.2. Fibroblastos Swiss-3T3

Esta línea celular inmortalizada procede de fibroblastos embrionarios de ratón. Se

cultiva en medio de cultivo completo2 a 37ºC en una atmósfera al 5% de CO2. Estas

células se expanden y propagan por digestión con tripsina como se indicó

anteriormente. Para almacenarlas en nitrógeno líquido se suplementa el medio de

cultivo con DMSO al 10%.

1.3. Células epiteliales Mv 1 Lu (CCL-64)

Esta línea celular procedente de epitelio de pulmón de visón se cultiva y almacena

en las mismas condiciones que las indicadas para la línea Swiss-3T3 con la excepción

de que tanto el medio de cultivo como el medio de congelación contienen además

piruvato sódico 1 mM.

1.4. Tratamientos de los cultivos celulares

Todos los compuestos utilizados en los tratamientos de los cultivos celulares se

disuelven en dimetil-sulfóxido (DMSO) estéril, excepto LLnL que se disuelve en etanol.

MG132, LLnL, H-89, estaurosporina, actinomicina D y cicloheximida se obtienen de

Sigma; GF109203X, SB203580 y PD98059 de Calbiochem®; TCDD y BP de 3 Tampón de extracción de DNA genómico: Tris-HCl 100 mM pH 8.5, EDTA 5 mM, SDS 0.2 % (p/v), NaCl 200 mM, Proteinasa K 100 µg/ml 4 TE: Tris-HCl 10 mM pH 8.0, EDTA 1 mM

Métodos

107

AccuStandard. Los cultivos controles se tratan con un volumen equivalente del

solvente.

2. Extracción de RNA total

La obtención de RNA total a partir de cultivos celulares se realiza empleando

placas de cultivo de 10 cm de diámetro y el kit RNeasy de QIAGEN siguiendo las

instrucciones del fabricante. Una vez purificado el RNA, se determina su concentración

mediante absorción espectofotométrica a 260nm así como la presencia de proteínas

contaminantes estableciendo la relación A260nm/A280nm.

3. Análisis de la expresión de genes

3.1. Análisis mediante RT-PCR

3.1.1. Transcripción Reversa (RT)

El análisis de la expresión de genes mediante PCR consta de una primera reacción

en la que se sintetizan cDNAs a partir del conjunto de mRNAs celulares. Esto se lleva a

cabo mediante el proceso denominado Transcripción Reversa (RT, Reverse

Transcription). Para ello se toma 1 µg de RNA total en un volumen de 13 µl, se añade 1

µl del cebador oligo-dT 50 µM (Roche) y se eliminan las estructuras secundarias del

mRNA incubando a 65ºC durante 5 min. La muestra se pasa inmediatamente a hielo y

se incuba otros 5 min. A continuación se añaden los siguientes reactivos: 2 µl de

10×tampón de RT5, 2 µl de DTT 100 mM, 1 µl dNTPs 100 mM (cada uno a una

concentración de 25 mM), 0.5 µl de anti-RNasa 20 U/µl (Ambion) y 0.5 µl de

Transcriptasa Reversa M-MLV 100 U/µl (Ambion). La reacción se incuba primero a

42ºC durante 1 h y a continuación a 70ºC durante 15 min. La amplificación del cDNA

se realiza por PCR empleando el producto de la RT como molde, tal y como se describe

a continuación.

5 10×Tampón de RT: Tris-HCl 500 mM pH 8.3, KCl 500 mM, MgCl2 30 mM, DTT 50 mM

Métodos

108

3.1.2. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Para la amplificación por PCR del cDNA correspondiente al gen de interés se

toman 3 µl de la mezcla de RT y se le añaden 5 µl de 10×tampón de PCR6, 1.5 µl de

MgCl2 50 mM, 1 µl de dNTPs 100 mM (cada uno a una concentración de 25 mM), 50

pmoles de cada cebador y 0.5 µl de Taq-polimerasa 5 U/µl (Ecogen), en un volumen

final de 50 µl. En todos los casos el programa de amplificación consiste en una

desnaturalización inicial de 2 min a 94ºC seguida de una repetición de ciclos

consistentes en un paso de desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos, un paso de

hibridación de los cebadores con el molde y un paso de extensión de la cadena naciente.

Una vez completado el número necesario de ciclos, se realiza una extensión final de 5

min a 72ºC. Las condiciones de hibridación y de extensión, el número de ciclos y la

secuencia de los cebadores utilizados en cada experimento se especifican en la tabla II.

La amplificación de β-Actina se realiza como control de la integridad del RNA y se

lleva a cabo empleando las mismas condiciones de PCR que las del gen con el que se

compara. Una vez terminada la amplificación, se toma una alícuota de la reacción, se le

añade tampón de carga para ácidos nucleicos7 y se aplica en geles de agarosa a una

concentración comprendida entre el 1 y el 2% (p/v). La electroforesis se lleva a cabo en

tampón TBE8 que contiene 0.2 µg/ml del agente intercalante fluorescente bromuro de

etidio.

6 10×Tampón de PCR: Tris-HCl 670 mM pH 8.8, (NH4)2SO4 160 mM, Tween-20 0.1% (v/v) 7 5×Tampón de carga para ácidos nucleicos: azul de bromofenol 0.25% (p/v), azul de xileno 0.25% (p/v), glicerol 30% (v/v) 8 Tampón TBE: Tris base 89 mM, ácido bórico 89 mM, EDTA 2 mM, pH 8.3

Métodos

109

Tabla II. Secuencias de los cebadores y condiciones de amplificación para cada gen que ha sido

analizado mediante RT-PCR

3.2. Análisis mediante northern-blot

Las muestras de RNA total, aislado como se indicó previamente, se incuban a

65ºC durante 10 min en 1×tampón de RNA9, 50% (v/v) de formamida y 15% (v/v) de

formaldehído 37% (p/v) en un volumen final de 40 µl. Las muestras se incuban en hielo

durante 5 min y se les añaden 8 µl de 5×tampón de carga para ácidos nucleicos7. A

continuación, los RNAs se separan en un gel de agarosa al 1% (p/v) en 1×tampón de

RNA9 que contiene el 15% (v/v) de formaldehído 37% (p/v). El tampón de

electroforesis contiene 1×tampón de RNA y 15% (v/v) de formaldehído 37% (p/v). El

gel es lavado en agua durante 1 h para eliminar el exceso de formaldehído tras lo cual se

tiñe el RNA sumergiendo el gel en una solución de bromuro de etidio a una

concentración de 0.5 µg/ml. El gel teñido se fotografía para determinar la integridad del

RNA así como la homogeneidad de carga entre las distintas muestras. El exceso de

bromuro de etidio puede ser finalmente eliminado mediante sucesivos lavados en agua.

Posteriormente el RNA se transfiere a membranas de nylon (GeneScreen Plus, Du Pont)

9 1×Tampón de RNA: MOPS 20 mM, acetato sódico 5 mM, EDTA 1 mM, pH 7.0

Nombre del

cebador Secuencia (5’-3’)

Condiciones

de

hibridación

Condiciones

de extensión

Número

de ciclos

ARNT-F CCGAATTCCATGGCGGCGACTACAGCTAACC

ARNT-R ATCGGAACATGACGGACAGCACCTG 65ºC 1 min 72ºC 2 min 38

ACTINA-F GGTCAGAAGGACTCCTATGTGG

ACTINA-R TCCCTCTCAGCTGTGGTGGT - - -

LTBP1-F GGAGTGCTATTATAACCTCAATG

LTBP1-R GGGTCTTGGCATTCATCCAT 58ºC 1 min 72ºC 1 min 33

TIMP1-F CTGGCATCCTCTTGTTGCTA

TIMP1-R AGGGATCTCCAGGTGCACAA 58ºC 1 min 72ºC 1 min 30

TIMP2-F AGACGTAGTGATCAGAGCCA

TIMP2-R GTACCACGCGCAAGAACCAT 58ºC 1 min 72ºC 1 min 30

Métodos

110

mediante transferencia por capilaridad en 20×SSC10 y se fija covalente e

irreversiblemente a la membrana por exposición a luz ultravioleta de 254 nm (UV

Stratalinker 1800, Stratagene). Todas las sondas utilizadas en los northern se han

obtenido mediante amplificación por PCR de un fragmento interno y específico del

cDNA que se quiere detectar utilizando los cebadores indicados en la tabla III. Una vez

sintetizadas, las sondas son marcadas radiactivamente con [α-32P]dCTP (actividad

específica 3000 Ci/mmol) utilizando el método de “random priming” (Ready-to-go

DNA Labelling Kit(-dCTP), Amersham Pharmacia Biotech) y purificadas por

cromatografía. El nivel de marcaje de las sondas se determina empleando un contador

de centelleo con detección de emisión beta (Beckman LS3801). Antes de su uso las

sondas se desnaturalizan para transformarlas en monocatenarias por incubaciones

sucesivas a 100ºC durante 3 min y a 4ºC durante 5 min. Previamente a la adición de las

sondas, las membranas se pre-hibridan a 65ºC durante 2 horas en solución de

hibridación (Rapid-hyb buffer, Amersham Pharmacia Biotech). Pasado este tiempo se

añade la sonda marcada y desnaturalizada y se continúa la incubación durante 4 horas

más a 65ºC. Las membranas se lavan entonces durante 20 min a temperatura ambiente

en 2×SSC y a continuación durante 20 min a 65ºC en 1×SSC conteniendo SDS al 1%.

Seguidamente, se exponen en una pantalla de radiactividad que se analizará en un

sistema Molecular Imager FX (Bio-Rad Laboratories).

10 20×SSC: NaCl 3 M, citrato tri-sódico 0.3 M

Métodos

111

Tabla III. Secuencias de los cebadores y condiciones de amplificación por PCR para la obtención de

las sondas utilizadas en los northern

Nombre del

cebador Secuencia (5’-3’)

Condiciones

de hibridación

Condiciones

de extensión

Número

de ciclos

CYP1A2-F CCAGTGGCAGGTCAACCATGATG

CYP1A2-R GCGCCTAGGCCCACCGATGCCTCGACAATC 70ºC 30 seg 72ºC 1 min 31

TGFβ1-F ATCCTGTCCAAACTAAGGCTC

TGFβ1-R CGTCAAAAGACAGCCACTCAG 58ºC 1 min 72ºC 1 min 30

ACTINA-F GGTCAGAAGGACTCCTATGTGG

ACTINA-R TCCCTCTCAGCTGTGGTGGT 60ºC 1 min 72ºC 1 min 28

LTBP1-F GGAGTGCTATTATAACCTCAATG

LTBP1-R GGGTCTTGGCATTCATCCAT 58ºC 1 min 72ºC 1 min 33

LTBP2-F CACTGCCGTCCTCGGGTGGCT

LTBP2-R GCCATTCTGGCAGAGAGCA 58ºC 1 min 72ºC 1 min 36

LTBP3-F ACACTCACCCAGGACCAGCAT

LTBP3-R GCACTCCAGCAGGTTGCCAT 58ºC 1 min 72ºC 1 min 36

LTBP4-F GGAATTCCAGTGTGATGAGGCAGAGGCAAC

LTBP4-R CGGGATCCCGTGACAGGCTGGCACCATAGA 62ºC 1 min 72ºC 1 min 32

3.3. Differential Display

La técnica de Differential Display-Polymerase Chain Reaction (DD-PCR) está

basada en RT-PCR y permite el análisis y la comparación de la expresión de un gran

número de genes que suponemos varía entre dos condiciones distintas. Para su

aplicación hemos utilizado los cebadores suministrados en el kit “HIEROGLYPH™

mRNA Profile System” (Genomix) y el aparato Genomix LR (Genomix). En primer lugar,

se sintetizan los cDNAs empleando 200 ng de RNA total procedente de cultivos de

MEFs Ahr+/+ y Ahr-/-. Para ello se prepara una reacción de transcripción reversa

utilizando como cebadores distintos APs (Anchored 3’ Primers) los cuales constan de

12 timidinas más una combinación aleatoria de dos nucleótidos que podrían ser

complementarios a los presentes en la región 5’ adyacente a la cola de poli-A del

mRNA (por ejemplo, (dT12)GA, (dT12)GC, (dT12)GG, etc.). Adicionalmente, cada

cebador AP contiene en su extremo 5’ un fragmento de 17 bases del promotor del

bacteriófago T7 (5’ ACGACTCACTATAGGGC 3’), lo que permite la secuenciación

del producto de PCR desde el extremo 3’ del cDNA sin necesidad de clonarlo. La

Métodos

112

mezcla de reacción para la síntesis del cDNA es igual a la ya descrita en el apartado

Transcripción Reversa, con la excepción de que en DD-PCR el oligo-dT es sustituido

por uno de los cebadores APs a una concentración de 0.2 µM. La reacción se incuba

durante 10 min a 25ºC, 60 min a 42ºC y 15 min a 70ºC. A continuación, 2 µl de la

reacción de RT se utilizan como molde para una reacción de PCR. En este caso se

emplea como cebador reverso (hibridará en el extremo 3’) el mismo AP utilizado en la

reacción de RT y como cebador directo (hibridará en un lugar 5’ del sitio de hibridación

del AP) uno cualquiera de los cebadores arbitrarios, denominados ARPs (Arbitrary

Primers). Estos cebadores ARPs constan de una secuencia arbitraria de 10 bases que

hibridará aleatoriamente en el conjunto de cDNAs molde. De modo similar a lo

indicado anteriormente, los cebadores ARPs contienen además un fragmento de 16

bases de M13 reverso (5’ ACAATTTCACACAGCA 3’) en su extremo 5’ para permitir

la secuenciación del producto de PCR obtenido. Se ha estimado que cada combinación

de un cebador AP con uno ARP amplifica un 0.5% del total del mRNA. La reacción de

PCR se realiza en un volumen final de 20 µl utilizando 2 µl del producto de la RT

correspondiente a la que se le añaden 2 µl de 10×tampón de PCR6, 0.6 µl de MgCl2 50

mM, 1.6 µl de dNTPs 250 µM (62.5 µM de cada uno), 2 µl de cada cebador 2 µM (el

mismo AP utilizado en la RT y uno cualquiera de los ARPs), 0.2 µl de Taq-polimerasa

5 U/µl (Ecogen) y 0.25 µl de [α-33P]dATP (actividad específica 3000 Ci/mmol). El

programa de PCR es el siguiente: 95ºC 2 min; 4 ciclos de: 92ºC 15 seg, 46ºC 30 seg,

72ºC 2 min; 25 ciclos de: 92ºC 15 seg, 60ºC 30 seg, 72ºC 2 min y una extensión final a

72ºC de 7 min. Una vez finalizada la PCR se toman 7 µl del producto y se mezclan con

4 µl de tampón de carga para DD-PCR11, la muestra se desnaturaliza a 95ºC durante 2

min y se mantiene en hielo hasta ser aplicada en el gel. El gel se polimeriza al 4.5%

(p/v) empleando un polímero de alta resolución denominado HR-1000™ (Genomyx) en

TBE8 que contiene además 50% (p/v) de urea, 0.08% (p/v) de TEMED y 0.8% (p/v) de

persulfato amónico. La electroforesis se desarrolla a 800V durante 16 horas. Tras la

migración, el gel es lavado, secado y expuesto en primer lugar en una pantalla de

detección radiactiva Kodak que se revelará y analizará en un sistema Molecular Imager 11 Tampón de carga para DD-PCR: formamida 95% (v/v), EDTA 20 mM pH 8.0, azul de bromofenol 0.05% (p/v), azul de xileno 0.05% (p/v)

Métodos

113

FX (Bio-Rad Laboratories). En los casos en los que se observa expresión diferencial, el

mismo gel se expone a una película de rayos X que será revelada con reactivos

químicos. De este modo obtenemos una impresión en relación de tamaño 1:1 entre

película y gel. Una vez detectada una banda que presenta expresión diferencial entre las

distintas condiciones, la película fotográfica se alinea con respecto al gel y se procede a

cortar la banda de interés. Este fragmento de gel se utiliza directamente como molde en

una reacción de PCR idéntica a la realizada en DD-PCR excepto que no se adiciona el

nucleótido marcado radiactivamente. El fragmento amplificado en esta reacción se

purifica y se secuencia utilizando los cebadores T7 y M13 reverso.

4. Secuenciación

La secuenciación de los fragmentos obtenidos mediante DD-PCR se realizó

empleando un secuenciador automático ABI Prism (Applied Biosystems Incorporated) y

didesoxinucleótidos terminadores marcados con sondas fluorescentes en el Servicio de

Secuenciación de la Facultad de Farmacia, Universidad Complutense de Madrid.

5. Transfecciones transientes

5.1. Construcción de vectores de expresión

5.1.1. Construcción del vector pEGFP-AhR

El cDNA que codifica para el AhR de ratón es aislado por RT-PCR basándonos

en la secuencia previamente publicada (79). Los oligonucleótidos cebadores empleados

en PCR son AhR-F1 5´ TGTCGTCTAGAGATGAGCAGCGGCGCCAACATCACC

3´ y AhR-R1 5´ CTGCCAAGCTTTCAACTCTGCACCTTGCTTAGGAATGC 3´ que

contienen los sitios de restricción (subrayados) XbaI y HindIII, respectivamente. El

cDNA sintetizado se digiere con XbaI y HindIII y sus extremos son transformados en

romos empleando la forma Klenow de la DNA polimerasa I en presencia de dNTPs. El

vector conteniendo el gen de la proteína verde fluorescente, pEGFP-C1 (Clontech), es

digerido con HindIII y sus extremos transformados en romos como se indicó

anteriormente. Ambos fragmentos son entonces ligados empleando DNA ligasa del

Métodos

114

bacteriofago T4. De este modo, el cDNA del AhR resulta clonado en fase con la

proteína EGFP. El vector completo ha sido denominado pEGFP-AhR (figura 40).

5.1.2. Construcción del vector pCMV5-ARNT

El cDNA que codifica para el ARNT murino se aisla por RT-PCR a partir de

RNA total empleando los oligonucleótidos ARNT-CF1 5´

CCGAATTCCATGGCGGCG ACTACAGCTAACC 3´ y ARNT-CR1 5´

TGCGGTCGACCACCCCAATAGTTCTA TTCGG 3´ que contienen los sitios para

endonucleasas de restricción (subrayados) EcoRI y SalI, respectivamente. El cDNA

sintetizado se digiere con EcoRI y SalI y se purifica. El vector de expresión pCMV5 es

también digerido con las mismas enzimas y purificado. Ambos fragmentos de DNA son

entonces ligados empleando T4 DNA ligasa. De este modo realizamos un clonaje

unidireccional en el que la orientación del cDNA puede ser definida anticipadamente. El

vector de expresión resultante se denomina pCMV5-AhR (figura 40).

5.2. Transfecciones

Para las transfecciones transientes, las células se plaquean el día antes en placas

de cultivo de 35 mm de diámetro a una densidad de 200.000 células por placa. En todos

los casos se utiliza 1 µg de cada DNA plasmídico y el sistema de transfección basado en

liposomas “LIPOFECTAMINE™ Reagent Plus” (Gibco BRL), siguiendo las

instrucciones del fabricante. La transfección se realiza en medio sin suero (OPTI-

MEM® I Reduced Serum Medium, Gibco BRL) durante 4 h. Transcurrido este tiempo, el

medio es suplementado con suero hasta una concentración final del 10% (v/v) y 12 h

después los cultivos se cambian a medio fresco completo2. Las proteínas se dejan

expresar durante 24 h antes de la realización de los tratamientos. Finalmente, las células

Figura 40. Esquema de los vectores de expresión pEGFP-AhR y pCMV5-ARNT. Ambos vectores son empleados en transfecciones transientes para expresar el AhR marcado con la proteína verde fluorescente o la proteína ARNT, respectivamente.

pCMV5-ARNT7100 bp

pCMV

mARNTAmp

Sal I

Eco RI

pEGFP-AhR7100 bp

pCMV

EGFP

mAhR

kan

Hind III

Métodos

115

son observadas y fotografiadas en un microscopio de fluorescencia (Zeiss) o bien son

lisadas para su análisis mediante western-blot.

6. Citometría de flujo

Los cultivos de MEFs son tratados con DMSO o MG132 8 µM durante 3, 6, ó 12

h. Las células son separadas de las placas de cultivo por adición de tripsina 0.05% (p/v)-

EDTA 0.5 mM (Gibco BRL), lavadas en PBS y fijadas a 4ºC en una solución de etanol

al 70% (v/v). Las muestras son tratadas con 10 µg/ml RNasa a 37ºC durante 30 min. El

contenido total en DNA por célula es determinado en un citómetro de flujo FACScan

(Becton-Dickinson) después de teñirlas durante 15 minutos con 50 µg/ml de ioduro de

propidio a temperatura ambiente y en la oscuridad. Para el análisis de distribución en las

distintas etapas del ciclo celular, sólo se considera la señal procedente de células

individuales (se cuentan 10.000 células por muestra). La fracción de células en proceso

de apoptosis es determinada a partir del área del pico correspondiente a DNA

hipodiploide.

7. Análisis mediante western-blot

7.1. Preparación de extractos proteicos de cultivos de MEFs

7.1.1. Extractos citosólicos y totales

Una vez eliminado el medio de cultivo, la monocapa celular es lavada con PBS1

frío y lisada directamente en la propia placa a 4ºC por adición de tampón de lisis para

extractos proteicos12. El lisado es sometido posteriormente a 2 ciclos de

congelación/descongelación. Para la obtención de extractos citosólicos se centrifuga

dicho lisado a 4ºC y 10.000×g durante 15 min. El sobrenadante de esta centrifugación

constituye el extracto celular citosólico. Para la obtención de extractos proteicos totales

el lisado celular inicial se pasa además por una aguja de 25G varias veces. 12 Tampón de lisis para extractos proteicos: Tris-HCl 50 mM pH 7.5, EGTA 2 mM, EDTA 2 mM, sacarosa 270 mM, β-glicerol-fostato 10 mM, pirofosfato sódico 5 mM, fluoruro sódico 50 mM, Tritón X-100 1% (v/v), ortovanadato sódico 0.1 mM, β-ME 0.1% (v/v), inhibidores de proteasas COMPLETE™ (Roche)

Métodos

116

7.1.2. Extractos nucleares

Los extractos nucleares se obtienen de cultivos de MEFs. Tras los tratamientos,

las placas se lavan con PBS1 frío y las células se recogen a 4ºC en EDTA 10 mM (pH

8.0). Las suspensiones celulares resultantes se centrifugan a 4ºC y 400×g durante 5 min

y los precipitados se resuspenden en el tampón salino hipotónico MDH13. Tras incubar

10 min en hielo, las muestras se homogeneizan a 4ºC aplicando 25 recorridos en un

homogeneizador de vidrio del tipo Dounce. Seguidamente, las células se lisan

añadiendo a cada suspensión el 0.5% (v/v) de nonidet P40 y homogeneizando durante 5

recorridos adicionales. Los lisados son centrifugados a 4ºC y 15.000×g durante 30 s.

Los precipitados resultantes, conteniendo extractos nucleares crudos, se lavan

cuidadosamente en tampón MDH, se centrifugan de nuevo y se resuspenden en el

tampón de baja fuerza iónica HDEK14. Para extraer la proteína nuclear, se incrementa

progresivamente la concentración de KCl hasta 0.4 M, se añade el 10% (p/v) de glicerol

y se incuba a temperatura ambiente durante 30 min con rotación suave. Finalmente, los

extractos son centrifugados a 4ºC y 15.000×g durante 60 min y el sobrenadante

(extracto nuclear) dividido en fracciones y almacenado a -80ºC.

7.2. Medida de la concentración de proteína

La concentración proteica de los distintos extractos fue determinada mediante

colorimetría utilizando el kit “Coomassie Plus Protein assay reagent” (Pierce) y

albúmina de suero bovino como estándar para establecer la recta patrón.

7.3. Electroforesis y transferencia a membrana de nitrocelulosa

De 10 a 15 µg de extractos proteicos se mezclan con el volumen adecuado de

tampón de carga para extractos proteicos15, se incuban a 100ºC durante 5 minutos y se

separan en función de su peso molecular mediante electroforesis16 desnaturalizante en

geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) al 8% (p/v). Tras la electroforesis, las proteínas

13 Tampón MDH: HEPES 25 mM pH 7.9, MgCl2 3 mM, DTT 1mM, PMSF 0.5 mM 14 Tampón HDEK: HEPES 25 mM pH 7.9, EDTA 2 mM, DTT 1 mM, KCl 0.1 M 15 5×Tampón de carga para extractos proteicos: Tris-HCl 62.2 mM pH 6.8, SDS 10% (p/v), glicerol 50% (v/v), azul de bromofenol 0.025% (p/v), β-ME 20% (v/v) 16 Tampón de electroforesis: Tris 25 mM, glicina 190 mM, SDS 0.1% (p/v)

Métodos

117

son transferidas desde el gel a una membrana de nitrocelulosa (Bio-Rad Laboratories)

en tampón de transferencia17 a 100 mA y 4ºC durante 10 h.

7.4. Inmunodetección

Tras la transferencia, las membranas son teñidas con el colorante de unión

reversible Ponceau S18 con el fin de comprobar la eficiencia de la transferencia y la

homogeneidad de carga para las diferentes muestras. Las membranas son entonces

bloqueadas a temperatura ambiente durante 2 h en solución de bloqueo para western-

blot19 e incubadas con el correspondiente anticuerpo primario durante 16 h a 4ºC

empleando la dilución indicada en la tabla IV. Tras 3 lavados de 10 min cada uno en

TBS-T20, las membranas se hibridan durante una hora a temperatura ambiente con el

anticuerpo secundario correspondiente conjugado con la enzima peroxidasa de rábano

(HRP). Las membranas son lavadas de nuevo 3 veces durante 10 min con TBS-T.

Finalmente, se añade el sustrato quimioluminiscente basado en el luminol

“SuperSignal® ULTRA Chemiluminescent Substrate” (Pierce) durante 3 min. Las

bandas correspondientes a las proteínas inmunorreactivas se detectan por su emisión de

quimioluminiscencia utilizando el sistema de análisis de imágenes Molecular Imager

FX (Bio-Rad Laboratories).

Tabla IV. Anticuerpos utilizados en el análisis mediante western-blot

17 Tampón de transferencia: Tris 25 mM, glicina 190 mM, metanol 20% (v/v) 18 Ponceau S: ponceau S 0.5% (p/v), ácido acético 5% (v/v) 19 Solución de bloqueo para western-blot: leche en polvo al 5% (p/v) disuelta en TBS-T20 20 TBS-T: Tris-HCl 50 mM pH 7.5, NaCl 75 mM, Tween-20 0.2% (v/v)

Anticuerpo Procedencia Dilución

rabbit anti-AhR Richard Pollenz 1:750

rabbit anti-CYP1A2 Harry Gelboin 1:2000

rabbit anti-β-ACTINA Sigma A2066 1:1000

goat anti-ARNT Santa Cruz Biotechnology sc-8076 1:1000

rabbit anti-Sp1 (PEP2) Santa Cruz Biotechnology sc-59 1:1000

rabbit anti-LTBP1 S.L. Dallas 1:1000

Métodos

118

8. Cambio de movilidad electroforética (Electrophoretic mobility shift

assay, EMSA)

Los experimentos de EMSA se llevan a cabo empleando extractos nucleares

obtenidos de MEFs y DNA bicatenario conteniendo las secuencias consenso localizadas

en los promotores de los genes de interés. Los cultivos son tratados con DMSO o

MG132 8 µM durante los tiempos indicados en las leyendas de las correspondientes

figuras.

Para analizar la interacción del complejo AhR/ARNT con el promotor del gen

diana Cyp1a1, se utilizan oligonucleótidos que contienen la región de unión

denominada XRE3 (subrayada) (64). Las secuencias 5´ GATCGCGCTCTTC

TCACGCAACTCCGAGCTCA 3´ y 5´ GATCTGAGCTCGGAGTTGCGTGAGAA

GAGCCG 3´ son sintetizadas, hibridadas, marcadas en sus extremos 5´ empleando T4

polinucleótido quinasa y [γ-32P]ATP (actividad específica 6.000 Ci/mmol) y purificadas

por cromatografía. Las reacciones de unión proteína-DNA se realizan en 25 µl de

tampón A21 conteniendo 7 µg (para cultivos tratados con TCDD) ó 10 µg (para cultivos

tratados con MG132) de proteína nuclear y 2.5 µg del competidor no específico poli(dI-

dC)-poli(dI-dC) (Amersham Pharmacia Biotech). Tras una pre-incubación de 20 min a

temperatura ambiente, se añaden 25.000 cpm de la secuencia XRE3 marcada y la

incubación se continua a temperatura ambiente durante otros 20 min. Los complejos

proteína-DNA son separados a temperatura ambiente en geles no desnaturalizantes de

poliacrilamida al 6% (p/v) empleando 1×TBE8 como tampón de electroforesis. Los

geles, una vez secados, se exponen en pantallas de detección radiactiva Kodak y son

analizados empleando un Molecular Imager FX (Bio-Rad Laboratories). En ensayos de

competición, los extractos se pre-incuban durante 20 min a temperatura ambiente con la

secuencia XRE3 no marcada en un exceso molar de 100 veces o con 2 µg de anticuerpo

frente al AhR o a ARNT antes de la adición del DNA marcado. La especificidad de la

inhibición observada en presencia de los anticuerpos se confirma incubando los

extractos nucleares con IgG pre-inmune.

21 Tampón de reacción A: HEPES 20 mM pH 7.9, EDTA 1mM, DTT 1 mM, glicerol 10% (p/v)

Métodos

119

Para analizar la interacción de la proteína Sp1 con el promotor del gen Arnt se

emplean oligonucleótidos que contienen la región consenso para las dos cajas GC

(subrayadas) identificadas en dicho gen (308). Las secuencias 5`

GACTGACCGCGCCCA TAGTTTGGGGCGTGTCTTCTGC 3´ y 5´

GCAGAAGACACGCCCCAAACTATGGGC GCGGTCAGTC 3´ son sintetizadas,

hibridadas y marcadas como se indicó anteriormente. Las reacciones de unión proteína-

DNA se realizan en 25 µl de tampón de reacción B22 conteniendo 10 µg de proteína

nuclear y 2.5 µg del competidor no específico poli(dI-dC)-poli(dI-dC) (Amersham

Pharmacia Biotech). Tras una pre-incubación de 20 min a 4ºC, se añaden 105 cpm de

DNA marcado y la incubación se prolonga por otros 60 min a 4ºC. Los complejos

proteína-DNA se separan durante 3 h a 4ºC en geles no desnaturalizantes de

poliacrilamida al 6% (p/v) empleando 0.5×TBE8 como tampón de electroforesis. Tras su

secado, los geles son expuestos y analizados como se indicó previamente. Los ensayos

de competición son realizados pre-incubando los extractos nucleares durante 2 h a 4ºC

con DNA no marcado en un exceso molar de 100 veces o con 2 µg de anticuerpo anti-

Sp1 antes de la adición del DNA marcado. Se realizan controles negativos pre-

incubando los extractos con IgG pre-inmune en las condiciones indicadas

anteriormente. En experimentos en los que se usan muestras previamente

desfosforiladas, 25 µg de extracto nuclear se incuban durante 60 min a 37ºC con 5 U de

fosfatasa alcalina intestinal de ternera (CIP, New England BioLabs). Tras la reacción, la

enzima se inactiva añadiendo una mezcla compuesta por ortovanadato sódico 3.5 mM,

fluoruro sódico 3.5 mM y β-glicerol-fosfato 35 mM. El extracto así tratado se emplea

entonces en ensayos de EMSA como se indicó anteriormente.

9. Marcaje in vivo de células con 32PO4H3 e inmunoprecipitación de

Sp1

Los cultivos de MEF son tratados con DMSO o MG132 8 µM durante 3 ó 6 h.

Con el fin de disminuir los niveles de fosfato endógeno durante el curso de los 22 Tampón de reacción B: HEPES 20 mM pH 7.5, DTT 0.5 mM, KCl 70 mM, MgCl2 5 mM, ZnCl2 0.1 mM, nonidet P40 0.05% (v/v), glicerol 10% (v/v)

Métodos

120

tratamientos, estos se realizan manteniendo las células en medio D-MEM libre de

fosfato (Gibco BRL) que además contiene 10% (v/v) de suero fetal bovino dializado

(frente a 40 volúmenes de D-MEM libre de fosfato). El marcaje de las proteínas en

proceso de fosforilación se realiza añadiendo 7.5 µCi/ml de 32PO4H3 (actividad

específica 9.000 Ci/mmol) durante las dos últimas horas del tratamiento. Las células se

lisan entonces a 4ºC durante 15 min en tampón IP23 conteniendo PMSF 1 mM,

ortovanadato sódico 1 mM, fluoruro sódico 1 mM, β-glicerol-fosfato 10 mM, DTT 1

mM y la mezcla de inhibidores de proteasas COMPLETE™ (Roche). Los lisados son

centrifugados y se determina la concentración de proteína del sobrenadante. Una

alícuota de 400 µg de proteína de cada muestra es inmunoprecipitada por incubación

con 1 µg de anticuerpo anti-Sp1 a 4ºC durante toda la noche con rotación suave. A

continuación, se añaden a cada muestra 30 µl de proteína A/G agarosa (previamente

equilibrada en tampón IP23) y se incuba a 4ºC durante 60 min con rotación. Las

suspensiones de proteína A/G agarosa se someten a 3 lavados con tampón IP23, se

añaden 4 µl de tampón de carga para extractos proteicos15 y se desnaturalizan por

incubación a 100ºC durante 3 min. Las proteínas se separan entonces mediante

electroforesis desnaturalizante en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) como se indicó

anteriormente. Los geles son transferidos a membranas de nitrocelulosa, las cuales se

exponen en pantallas de detección radiactiva Kodak y se revelan empleando un sistema

Molecular Imager FX (Bio-Rad Laboratories).

10. Inmunocitoquímica

Para analizar la inmunolocalización de LTBP-1 en la matriz extracelular de los

cultivos de MEFs, estos se crecen hasta confluencia y durante 72 h adicionales para

favorecer la secreción y el depósito extracelular de esta proteína. Transcurrido este

tiempo, el medio de cultivo es retirado y la monocapa celular se lava con PBS1 y se fija

en etanol al 95% (v/v) durante 10 min a –20ºC. A continuación se retira el etanol y la

placa se deja secar al aire. Las células son permeabilizadas con 3 lavados de 5 min en

23 Tampón IP: Tris-HCl 50 mM pH 7.5, NaCl 150 mM, nonidet P40 0.5% (v/v).

Métodos

121

PBS-Triton X-100 al 0.05% (v/v). El bloqueo de los sitios inespecíficos donde pudiera

unirse el anticuerpo se realiza durante 30 min a temperatura ambiente en una solución

de bloqueo para inmunocitoquímica24. Transcurrido este tiempo, se añade el anticuerpo

primario diluido 1:50 en solución de bloqueo y se incuba a 4ºC en una cámara húmeda

durante 16 h. Tras 3 lavados de 10 min cada uno en PBS-Triton X-100 al 0.05% (v/v),

se añade el anticuerpo secundario anti-rabbit-TRITC (tetramethylrhodamine

isothiocyanate, Sigma) en solución de bloqueo a una dilución 1:30 y se incuba a

temperatura ambiente durante 1 h. Tras esta incubación, se lava de nuevo en PBS-Triton

X-100 al 0.05% (v/v) 3 veces durante 10 min y las placas se observan y fotografían en

un microscopio de fluorescencia (Zeiss).

11. Bio-ensayo de actividad de TGF-ββββ

Uno de los métodos más ampliamente utilizados para determinar la presencia de

la forma latente y/o activa de TGF-β en una muestra biológica, se basa en el ensayo de

inhibición del crecimiento de la línea celular CCL-64, la cual es muy sensible a

citoquinas como TGF-β.

11.1. Preparación de los medios condicionados

Los cultivos de MEFs son crecidos en medio sin suero (OPTI-MEM® I Reduced

Serum Medium, Gibco BRL) durante 72 h. Transcurrido este tiempo el medio de cultivo

se recoge y centrifuga a 4°C y 500×g durante 15 min. El sobrenadante es suplementado

con BSA y PMSF a concentraciones finales de 100 µg/ml. Estos medios condicionados

son entonces divididos en alícuotas y almacenados a –80ºC hasta su uso.

11.2. Ensayo de inhibición de la proliferación celular

La actividad del TGF-β secretado al medio por MEFs se mide en base a su efecto

inhibidor sobre la proliferación de la línea epitelial de pulmón de visón CCL-64. Estas

células se crecen en placas de 24 pocillos a una densidad de 2.5×104 células/pocillo y se

24 Solución de bloqueo para inmunocitoquímica: BSA 2% (p/v), suero de cabra 10% (v/v)

Métodos

122

deja que se adhieran durante 16 h. Transcurrido este tiempo, la monocapa celular se lava

dos veces en OPTI-MEM® I Reduced Serum Medium (Gibco BRL) y se mantienen

durante 24 h en presencia de los medios condicionados. Antes de ser añadidos a las

células CCL-64, los medios condicionados procedentes de los cultivos de MEFs

Ahr+/+ y Ahr-/-, preparados como se indicó anteriormente, se diluyen con medio fresco

en una relación 1:4. Para determinar la cantidad total de TGF-β en los medios

condicionados, estos son calentados a 80ºC durante 8 min antes de ser diluidos y

añadidos a las CCL-64. En ensayos de inhibición por anticuerpo, el anticuerpo

neutralizante para TGF-β 1D11 (RD Systems) se añade a los medios correspondientes a

una concentración de 1 µg/ml antes de ser diluidos y añadidos a las células CCL-64.

Para cuantificar los niveles de secreción de TGF-β se construye una curva de calibrado

añadiendo a algunos pocillos de CCL-64 cantidades conocidas de TGF-β recombinante

(RD Systems). El efecto de los medios condicionados sobre la capacidad proliferativa de

las CCL-64 se determina midiendo cambios en su capacidad de síntesis de DNA. Para

ello, durante las 2 últimas horas de la exposición a los medios condicionados, se añaden

0.5 µCi de [3H]-Timidina (actividad específica 7 Ci/mmol) por pocillo. Posteriormente,

las células son fijadas durante 1 h por adición directa al medio de 1 ml de metanol:ácido

acético (3:1 v/v). Tras la fijación, las células se lavan 2 veces en metanol al 80% (v/v),

se tripsinizan con 200 µl de tripsina 0.05% (p/v)-EDTA 0.5 mM (Gibco BRL) y se

solubilizan por adición de 200 µl de SDS al 1% (p/v). La cantidad de timidina radiactiva

incorporada por las células CCL-64 se determina en un contador de centelleo (Beckman

LS-3801).

12. Medida de la actividad gelatinolítica de las metaloproteinasas

(MMPs) secretadas en los medios condicionados por MEFs

Para el análisis de la actividad gelatinolítica secretada por los cultivos de MEFs,

estos se crecen en medio OPTI-MEM® I Reduced Serum Medium (Gibco BRL) durante

72 h. Transcurrido este tiempo los medios se centrifugan a 4ºC y 10.000×g durante 15

min. Con el fin de normalizar la actividad metaloproteinasa con respecto al número de

Métodos

123

células presentes en los cultivos, las células se tripsinizan y cuentan en un

hemacitómetro. Una cantidad de medio equivalente al mismo número de células para

cada genotipo, se mezcla con un tampón de carga no reductor25 y se aplica en un gel

desnaturalizante de poliacrilamida (SDS-PAGE) al 8% (p/v) que contiene además 1

mg/ml de gelatina. Una vez terminada la electroforesis, el gel se lava 3 veces durante 20

min cada una en Triton X-100 al 2.5% (v/v) para eliminar el SDS. A continuación, y

con el fin de activar las metaloproteinasas, el gel se incuba en tampón de reacción26 a

37ºC durante 16 h. La localización de las metaloproteinasas se pone de manifiesto

tiñiendo el gel en el colorante azul brillante Coomassie G-25027 (Sigma). De este modo,

las actividades MMPs se detectan como bandas claras (degradación de la gelatina)

sobre un fondo azul (que corresponde a la gelatina no degradada). Como marcadores de

la localización de las MMP-2 y MMP-9 hemos utilizado el medio condicionado por la

línea celular derivada de fibrosarcoma humano HT1080, que secreta cantidades

significativas de estas dos metaloproteinasas.

25 5×Tampón de carga para MMPs: Tris-HCl 62.2 mM pH 6.8, SDS 10% (p/v), glicerol 50% (v/v), azul de bromofenol 0.025% (p/v) 26 Tampón de reacción: Tris-HCl 50mM pH 6.8, NaCl 150 mM, CaCl2 5 mM, NaN3 0.05% (p/v) 27 Azul brillante Coomassie G-250: Coomassie brilliant blue G-250 0.05% (p/v), metanol 25% (v/v), ácido acético 10% (v/v)

124

BBIIBBLLIIOOGGRRAAFFÍÍAA

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