ULTIMO DE PLÁSMIDOS.docx

7/17/2019 ULTIMO DE PLÁSMIDOS.docx

http://slidepdf.com/reader/full/ultimo-de-plasmidosdocx 1/7

UNIVERSIDAD RICARDO PALMA

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICASESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DEBIOLOGÍA

EVOLUCIÓN

Pérdida de los l!s"idos GLO # GLO$ e% réli&as deEscherichia coli or 'al(a del a)e%(e i%d*&(or

Autores:

Cajachagua Pucuhuaranga Cindy Lee

Cuya Huisaraime Fiorella Lisset

Justo Arevalo Santiago

Ramirez Alvarez Abel

Ricalde ontoya Jorge Luis

Pro!esor:

orales ondo"edo #ictor Ra$l

Lima% Per$% Abril del &'()

I. INTRODUCCIÓN



Las bacterias, como todos los seres vivos, exhiben mecanismos biológicos,que las facultan para adecuarse a diversos cambios ambientales. De estamanera si las condiciones son desfavorables estos pueden generarresistencia, una expresión natural de la evolución y genética bacteriana

(Mallén. 2001, Cabreraet al.

2007), uno de los mecanismos deresistencia a antibióticos que presenta la bacteria es la mediada por losplásmidos R que pueden transferirse por conugación (Mallén. 2001). De lamisma manera si las bacterias no se encuentran ante situaciones de estréstienden a perder facultades, un eemplo de ello es la pérdida de plásmidosal no ser estimuladas por los inductores.

Los plásmidos son unidades de !D" extracromosómico de tama#o variableque se replican de forma autónoma y autoregulada, se encuentran enbacterias $ram positivas y negativas, en levaduras y en algunos tipos dehongos y pueden contener hasta el %&' del material genético celulartotal(Fernández .2010).Durante cierto tiempo se consideró que los

plásmidos eran elementos genéticos accesorios para la bacteria,actualmente se sabe que aunque no parecen ser absolutamenteindispensables para el crecimiento de la bacteria en laboratorio, condicionade forma esencial su capacidad para sobrevivir en su hábitat natural, paracompetir con otras bacterias, y para su interacción con plantas (Monne!o""oz # $ea%er 1&&', 1&&).

La importancia de este trabao radica en que se podrá tener una referenciade la persistencia o no del plásmido $() en las generaciones bacterianasque se originaran a partir de una bacteria, en el caso de que persista elplásmido $() se podrá determinar hasta que generación persiste y si esque ha sufrido alguna modi*cación .+n el otro caso en el cual el plásmidodee de manifestarse se podrá hacer un seguimiento y poder determinar enqué generación deo de expresarlo.

II. O*+TIO-

O*+TIO +N+R/!

+valuar la perdida de los plásmidos p$L y p$L- en réplicas deEscherichia colien un medio sin el inductor.

-p$L es un plásmido utiliado en biotecnolog/a como un marcador de genes deorganismos modi*cados genéticamente, entre los más importantes es el $() tieneforma circular.

O*+TIO- +-+CIFICO-

Determinar el n0mero de réplica hasta el cual se conservan losplásmidos p$L 1 p$L-Determinar por medio del transaminador si la concentración de losplásmidos p$L y p$L- varia en los replicas realiadas.

III. /NT+C+D+NT+-



Ine3a, F. (1&47) en su trabao sobre la inmoviliación células deEscherichia coli, portadoras de p2$3&%, comparó la estabilidad y laexpresión de genes plasm/dicos en diversas condiciones de cultivo, elanálisis estad/stico de las respectivas cinéticas de pérdida del plásmidorevela una mayor estabilidad en células inmoviliadas en presencia deox/geno puro.

oe, !. # Ra56en, . (1&&) sugieren modelos matemáticos para laestimación de las tasas de pérdida de plásmido en las poblaciones debacterias que se multiplican por *sión binaria. La tasa de pérdida deplásmido se de*ne como la probabilidad de que en una división delindividuo portador de plásmido se pueda dar una hia libre de plásmido yuna hia que lleve el plásmido. La unidad de tiempo es en consecuencia eltiempo de interdivisión para los individuos que llevan el plásmido.

oe, !. (1&&). )robó dos métodos para la estimación de las tasas depérdida de plásmidos en datos obtenidos de experimentos 4transferencia de

serie5 de estabilidad tradicionales. +l primer método se basa en lasuposición de que el plásmido no inhibe el crecimiento de su huésped,mientras que el segundo método toma las diferencias en el tiempo deinterdivisión de las células libres de plásmido y de las que llevan elplásmido. +n los casos en los que la tasa de pérdida es alta y el plásmido noeercer una fuerte inhibición del crecimiento, las estimaciones parecen muy*ables. 6uando la tasa de pérdida de plásmido es peque#a y el plásmidoeerce inhibición de crecimiento a su an*trión, el dise#o experimental seconvierte en no *able.

-538, M. # do"89a M. (1&&4). 6onstruyeron 7arios plásmidosderivados de p8luescript de varios tama#os para estudiar los efectos del

tama#o del plásmido multicopia en la aptitud bacteriana y la pérdida deplásmido. 6lones bacterianos 2ransformados y no transformados secultivaron en medio con o sin ampicilina. La aptitud bacteriana 4medida porla tasa de crecimiento5, la presencia o ausencia del plásmido, y el n0merode copias del plásmido se evaluaron durante subcultivos sucesivos. +nmedio selectivo 4medio m/nimo o caldo Luria más ampicilina5, el clontransformado con el plásmido más grande 4p8luescript con un inserto de9&&& pb5 ten/a una fase de latencia signi*cativamente más largo que todoslos otros clones. +n medios no selectivos, la tasa de pérdida de plásmidodurante subcultivos sucesivos fue mayor en el clon con el inserto másgrande. +l clon con el inserto más grande aparece un n0mero de copias del

plásmido inferiores a los clones con una peque#a inserción o no inserción enabsoluto. la pérdida de plásmido en la forma de inestabilidad segregacionaly la reducción del n0mero de copias del plásmido en entornos no selectivosson importantes para la comprensión de la evolución de las !sociaciones deplásmidos: bacterias y la apreciación del potencial de alterar laspropiedades genéticas de un clon mantenido o sub:cultivados en un medioestándar.

!lo: . (200;). +studia la pérdida del poder patógeno en Agrobacteriumtumefaciens. Las cepas patógenas de A. tumefaciens contienen un plásmidoinductor de tumores 42i5 que determina en primera instancia lapatogenicidad de una cepa, ya que la enfermedad se desencadena cuando

determinados genes de este plásmido 2i son transferidos al genoma delhuésped. +stos genes codi*can las enimas requeridas para la s/ntesis de



*tohormonas que se sobreexpresan en la célula vegetal provocando unincremento en la división celular 4hiperplasia5 y en el tama#o de células4hipertro*a5 dando lugar al fenotipo tumor. La pérdida del poder patógenose relacionó con la pérdida del plásmido 2i o con mutaciones en uno o variosgenes del plásmido 2i requerido para la infección.

Fre8, . (200<). Los plásmidos tienen un impacto fundamental en laproductividad. (actores relacionados son el n0mero de copias del plásmido,la estabilidad del plásmido estructural y la estabilidad segregacional delplásmido. +sta 0ltima relacionada con la conservación de un plásmido. Ladivisión exitosa de plásmidos en las células hias es un problema central ensistemas de expresión dependientes de plásmidos. Los plásmidos sonsiempre una carga metabólica para las células, lo que conduce a unapreferencia de células libres de plásmido durante cultivos. La fórmula essimple; la aparición de la libre plásmido células signi*ca una cantidadreducida de producto recombinante. )or lo tanto diferente se hacenesfueros para asegurarse de que cada célula hia tiene al menos un

plásmido para comenar, y que la cantidad de células libres de plásmidos enunos cultivos es tan bao como sea posible, en el meor de cero. +lmecanismo de la replicación del plásmido tiene una in<uencia importanteen segregación de estabilidad plásmido.

I. M/T+RI/!+- = M>TODO-

/la5en3o de lá5do

%. =embrar una asada de la cepa bacteriana en >ml 6aldo Luria ?antibióticos requeridos. @ncubar por una noche a condiciones óptimas.

3. 6entrifugar a A&&& R)B por C minutos a 2 ambiente, eliminar elsobrenadante.

C. Resuspender el pellet en 3>& El de buFer )% y transferir a un tubo demicrocentr/fuga.

G. !gregar 3>& El de buFer )3 y meclar invirtiendo > veces.>. !gregar C>& El de buFer "C, meclar inmediatamente invirtiendo >

veces. 6entrifugar por %& minutos a %C&&& R)B.H. Llevar el sobrenadante a una columna de spin, centrifugar por % minuto

a %C&&& R)B y descartar el l/quido.I. !gregar >&& El de buFer )8 a la columna y centrifugar a %C&&& R)B por

% minuto. Descartar el l/quido.

A. !gregar I>& El de buFer )+ a la columna y centrifugar a %C&&& R)B por% minuto. Descartar el l/quido.

9. Repetir la centrifugación para eliminar el exceso de buFer )+.%&.6olocar un tubo de microcentr/fuga limpio en la columna y agregar >& El

de buFer +8. Bantener por % minuto y centrifugar a %C&&& R)B por %minuto.

%%.Realiar electroforesis en gel de agarosa para veri*car los resultados.

/5:l?"a"@n del Aen de la :ro3eBna %erde 6ore"en3e (F)/5:l?"a"@n del Aen de la :ro3eBna %erde 6ore"en3e (F)

%. )reparar la mecla para la )6R!%%;

!gua libre de nucleasas 3A,I>ul%&x 2aq buFer 4"JG53=G >ul



3mB d"2) >ul%&uB )rimer ( %ul%&uB )rimer R %ul>uKul 2aq D"! polimerasa &.3>ul3>mB Bg6l3 HulBuestra p$L Cul

3. 6olocar la mecla en el termociclador y programar de la siguiente forma;C> ciclos.

)re:)6R 9G6 por 3)6R 9G6 por %&>>6 por C&I36 por %)ost:)6R I36 por %&

C. Realiar electroforesis horiontal en gel de agarosa al %' en buFer 2!+!9 a %&& voltios por C& minutos.

G. 6olorear por 3& minutos en una solución de 8romuro de etidio!3&.>. bservar al transiluminador, la presencia de una banda de A>&pb

aproximadamente, muestra un resultado positivo.

+le"3roore :ara re"ono"er :lá5do

%. )reparar gel de agarosa al %' en buFer 2!+!9.3. 6argar la cantidad de pocillos deseada con la muestra; loading buFer 3ul

? Hul de muestra.C. 6argar un pocillo con marcador; 3ul de loading buFer ? 3ul de marcador

de %Mb.G. 7eri*car la correcta conexión de la cámara electroforética a la fuente de

poder. 6orrer a %&& voltios por C& minutos.>. Retirar el gel y sumergirlo por 3& minutos en una solución de 8romuro de

etidio!3&.H. Retirar el gel y realiar la lectura en el transiluminador.

Ob3en"@n de Escherichia coli "o5:e3en3e

%. =embrar en 3,>ml de 6aldo Luria!%& una asada de Escherichia coli cepaJ8 %&% N:%3 e incubar a CI6 durante toda la noche.

3. 6entrifugar a A&&&rpm por C minutos.C. Desechar el sobrenadante y agregar %,>ml de 6a6l3 &,%B helado.G. 6onservar en hielo por %& minutos.>. 6entrifugar a A&&& rpm por C minutos.

H. Desechar el sobrenadante y agregar %ml de 6a6l3 &,%B helado.I. Bantener las bacterias competentes en congelación.

Tranor5a"@n ba"3erana

%. 6olocar un eppendorf en hielo y agregar lo siguiente; 3>& El de 6a6l3 &,%B. C& El de bacterias competentes. 3 El de p$L.

3. @ncubar a G36 por >& segundos.C. @nmediatamente colocar en hielo por 3 minutos.G. !gregar 3>&ul de 6aldo Luria!%& e incubar a CI6 por C& a H& minutos.

>. =embrar con espátula de DrigalsMy %>&ul en !gar Luria!%& ? !mpicilina ?!rabinosa. @ncubar a CI6 por 3G horas.



H. La presencia de colonias con <uorescencia verde al ser vista a través deltransiluminador indicarán una transformación exitosa.

. CRONOR/M/ D+ /CTIID/D+-

/CTIID/D+- /RI! M/=O

1E;0 1E1;

1<

1'

1

17 1& 21 2;

%. Recopilación de información 3. )reparación de medios y

autoclavar materiales.

C. =iembra de la Escherichiacoli cepa J8 %&% N:%3 encaldo luria con arabinosa yampicilina.

G. !islamiento bacteriano.>. !mpli*cación de la $().

=iembra de Escherichia colicepa J8 %&% N:%3.

H. 6orrida electroforética.I. =embrar cepa de Escherichia

coli cepa J8 %&% N:%3 encaldo luria.

A. btención de Escherichia colicompetente.

9. 2ransformación bacteriana.

%&.Resultados de bacterias

transformadas.%%.)rimera réplica en; a5 2uboscon arabinosa y b5 2ubos sinarabinosa.

%3.(otos de cepas en eltransiluminador.

%C.=egunda réplica en; a5 2uboscon arabinosa y b5 2ubos sinarabinosa(otos de cepas en eltransiluminador.

%G.2ercera réplica en; a5 2ubos

con arabinosa y b5 2ubos sinarabinosa(otos de cepas en eltransiluminador.

I. R+F+R+NCI/- I!IORGFIC/-

%. oe, !. Ra56en, .%99H.=uggestions as to OuantitativeBeasurements of )lasmid Loss. )lasmid CH, article "P &&G3. pp. %>CQ%>9.



3. oe, !.%99H.+stimation of )lasmid Loss Rates in 8acterial )opulationsith aReference to the Reproducibility of =tability +xperiments.)lasmid CH, article "P &&GC. pp. %H%Q%HI.

C. Cabrera C.@5ez R. HJAa /. 3&&I. La resistencia de bacterias aantibióticos, antisépticos y desinfectantes una manifestación de losmecanismos de supervivencia y adaptación. 6olombia Bédica. 7ol. CA" 3, 3&&I 4!bril:Sunio5.

G. Fre8, . 3&&G.)lasmid 6opy "umber and )lasmid =tability. !dv

8iochem+nginK8iotechnol AH; GIQA3.>. Fernández M.3&%&. +ntorno $enético de TUlactamasas de +spectro

+xtendido en +nterobacterias. Vniversidad de =alamanca.H. Ine3a, F. %9AI. !nálisis de la cinética de pérdida del plásmido

recombinante p2$3&% en células de Escherichia coli libres einmoviliadas. Vniversidad de Burcia.

I. !lo: . 3&&C. 6aracteriación molecular de la pérdida del poderpatógeno en Agrobacterium tumefaciens. Departamento de)rotección 7egetal y 8iotecnolog/a. Vniversitat de 7alencia.

A. MonneE!o""oz, =. K $ea%er, R.$. %99>. )lasmids in<uencegroth of rhiobia in the rhiosphere of clover. =oil biol biochem. 3I;%&&%:%&&G.

9. MonneE!o""oz, = . K $ea%er, R.$. %99H. +Fect of drought stresson survival of clover rhiobia W%G:3 and its plasmid:cured derivativesin soil. !ppl =oil +col. C;%CI:%GA.

%&.Mallén M. 3&&%.Resistencias a nuevos antimicrobianos en patronessépticos. Vniversidad 6omplutense de Badrid.

%%.-538, M. do"89a M. %99A. 8acterial *tness and plasmid loss; the

importance of culture conditions and plasmid sie. 6an. S. Bicrobiol.

GG; C>%.C>>.

ULTIMO DE PLÁSMIDOS.docx

Documents

Transcript of ULTIMO DE PLÁSMIDOS.docx