UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA SUR

ÁREA DE CONOCIMIENTOS DE CIENCIAS DEL MAR DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE BIOLOGÍA MARINA

TESIS

EXTRACCIÓN, CARACTERIZACIÓN Y ANÁLISIS DE LA ACTIVIDAD ANTICOAGULANTE

DE LOS POLISACÁRIDOS SULFATADOS DEL ALGA CAFÉ

HYDROCLATHRUS CLATHRATUS (C. AGARDH) M.A. HOWE

QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: BIÓLOGA MARINA

PRESENTA

ILSE SÁNCHEZ LOZANO

DIRECTOR: DR. IVÁN MURILLO ÁLVAREZ

LA PAZ, BAJA CALIFORNIA SUR, 2013.

A mis padres y hermano

Elementos de mi formación,

fuente de inspiración

y mi apoyo desde siempre.

Los amo.

AGRADECIMIENTOS

A mi director de tesis, el Dr. Jesús Iván Murillo Álvarez por aceptarme como su

estudiante y guiarme en el desarrollo de este trabajo, y al Dr. Mauricio Muñoz

Ochoa, por dar a los tesistas siempre su apoyo, tiempo y ayuda. Por la

convivencia y sus enseñanzas les agradezco enormemente

A mis revisores, el Dr. Rafael Riosmena Rodríguez, el Dr. Juan Manuel López

Vivas y la M. en C. Erika Torres Ochoa, por sus buenos concejos y tiempo.

A mis padres, por todo el apoyo incondicional, el afecto, los regaños, ser todo un

ejemplo a seguir y haberme impulsado a crecer, a dar siempre más de mí y dejar

de lado las excusas. Por su muestra de fortaleza y enseñanzas, los amo. A mi

hermano, un gran hombre del que siempre estaré orgullosa y me ha motivado a

dar más. Gracias por ser la principal influencia de mi persona y estar a mi lado.

¡Te adoro, tú!

A mi familia, en especial a mis abuelitos, por el cariño. A mis tíos Angélica, Alfredo

y mi primas, Monse, Samy y Mely, por todo el apoyo desde el inicio de esta etapa

en mi formación. A la señora Rosa Amelia y su familia, por siempre estar al

pendiente de mí.

A mis maestros, de quienes aprendí y disfruté durante toda la carrera. A mis

amigos, Laura, Abraham, Pablo, Pao Soto y Fernando R. B. a quienes considero

ya como hermanos, por apoyarnos, reír, sufrir y aprender juntos, estoy orgullosa

de ustedes. Gracias por el cariño, los regaños, el afecto, aguantarme y dejarme

acércame y aprender de ustedes.

A mis compañeros del laboratorio de productos naturales de CICIMAR, Bernardo

(por ser tan ¡Super!), Valeria (mi biologuesco amor), Araceli (el oráculo de la

sabiduría del mundo mundial), Fany, Miguel, Ana y Dania, por su amistad, apoyo y

compañía en esta travesía y las siguientes.

A mis amigos Galle (Galletita) y Mario, Ale Mendicuti (Alce), Ale Hirales, Isis (Chibi

Sheep), Hugo y Leo, por sacarme un poco de la rutina con risas, bromas, LoL y

algo de bulling. Y en especial a Alejandro Plata (Bamboo), por todo el amor, afecto

y apoyo incondicional, muchas gracias por estar a mi lado y hacerme tan feliz.

A Naica y Julieta, por ser mi compañía incondicional 24/7, las amo.

Al mar, el cielo y la tierra, que con su enorme belleza despiertan en mi la

curiosidad, me impulsan a explorar y adentrarme más en el mundo natural. Me

siento afortunada de poderlos contemplar.

Y finalmente, gracias a la vida, que me ha enseñado que para conseguir algo se

debe dar algo del mismo valor a cambio, perseverancia y esfuerzo.

ÍNDICE

Índice de tablas……………………………………………………………...

Índice de figuras…………………………………………………………….

Resumen……………………………………………………………………..

Abstract……………………………………………………………………....

1. Introducción…………………………………………………….…....

2. Antecedentes………………………………………………………..

2.1 Generalidades de los fucoidanos…………………….…

2.2 Funcionamiento y estructura de la heparina…………..

2.3 Mecanismos de coagulación sanguínea…………….…

3. Descripción de Hidroclatrhus clathratus……………………….…

4. Justificación……………………………………………………….....

5. Hipótesis……………………………………………………………..

6. Objetivos……………………………………………………………..

7. Materiales y métodos…………………………………………….…

7.1 Recolección…………...………………………………….…

7.2 Obtención de extractos………………………………….…

7.3 Determinación de azúcares totales………………………

7.4 Fraccionamiento……………………………………………

7.5 Análisis de actividad anticoagulante……………………..

7.6 Determinación de ácidos urónicos……………………….

i ii iii iv 1 4 4 6 7 11 13 15 15 16 16 18 20 22 24 25

7.7 Determinación de fucosa………………………………….

7.8 Espectofotometría de infrarrojo…………………………..

8. Resultados…………………………………………………………...

9. Discusión…………………………………………………………….

10. Conclusión…………………………………………………………..

11. Referencias………………………………………………………....

25 26 26 34 37 37

i

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla I. Forma en que fueron unidos los eluatos obtenidos del

extracto MM0417 CArp, dando lugar a seis fracciones….....

5

Tabla II. Porcentaje relativo del contenido de azúcares totales en los

extractos de H. clathratus obtenidos con agua fría y

caliente……………………………………………………………

27

Tabla III. Muestra los tiempos y coeficientes de coagulación, además

del rendimiento para los extractos MM0417F,

MM0417CArp y MM0417C obtenidos de H. clathratus……..

28

Tabla IV. Muestra el tiempo de coagulación en los ensayos TP y

TTPa de las seis fracciones del extracto MM0417CArp……

30

Tabla V. Muestra el rendimiento y el coeficiente de coagulación en

las pruebas TP y TTPa de las fracciones obtenidas a partir

del extracto MM0417CArp……………………………………...

30

ii

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Representación estructural del fucoidano obtenido del

extracto del alga café L. saccharina………………………..

5

Figura 2. Representación estructural del pentasacárido con

potencial anticoagulante de la heparina (Flórez, 1997)….

7

Figura 3. Representación de la cascada de coagulación sanguínea

por las vías intrínseca y extrínseca (Modificado de:

Flórez, 1997)…………………………………………………..

9

Figura 4. Muestra del alga estudiada Hydroclathrus clathratus

(Guiry y Guiry, 2013)………………………………………….

13

Figura 5. Ubicación geográfica del área de recolección,

Balandra………………………………………………………..

17

Figura 6. Diagrama de flujo de la obtención de los tres extractos

principales de Hydroclathrus clathratus…………………….

21

Figura 7. Diagrama del fraccionamiento del extracto MM0717

CArp…………………………………………………………….

22

Figura 8. Tiempo de la formación del coágulo (s) en los ensayos

TP y TTPa para los extractos MM0417F, MM0417CArp y

MM0417C obtenidos de H. clathratus…………………….

27

Figura 9. Tiempo de la formación del coágulo (s) en los ensayos

TP y TTPa para las fracciones obtenidas a partir del

extracto MM0417CArp………………………………………..

29

Figura 10. Porcentaje de fucosa, azúcares totales y ácidos urónicos

contenidos en las fracciones de MM0417CArp……………

31

Figura 11. Espectro de infrarrojo de la fracción MM0417CArp

CC1F3. El pico ubicada en la banda 833.73 demuestra

un grado de sulfatación característico de los

polisacáridos sulfatados……………………………………...

33

iii

RESUMEN

Los polisacáridos sulfatados contenidos en algas cafés, también llamados

fucoidanos, son metabolitos secundarios que han demostrado una gran cantidad

de actividades biológicas en los campos de la farmacéutica. Con el propósito de

conocer la actividad anticoagulante de Hydroclathrus clathratus (C. Agardh) M.A.

Howe, se aislaron los polisacáridos sulfatados de esta alga recolectada en

Balandra, Baja California Sur. El material algal fresco se lavó con agua corriente y

se secó al sol. Se pesaron 100 g de H. clathratus y fueron secuencialmente

extraídos, utilizando agua a los 25 y 80°C. El extracto con agua caliente fue

precipitado con una adición d cetilpiridium al 10%. El precipitado se fraccionó por

cromatografía de intercambio iónico en DEAE-celulosa. La columna fue eluída con

NaCl (0.5M, 1.0M, and 2.0M). Finalmente se obtuvieron seis fracciones, las cuales

fueron se sometieron a pruebas anticoagulantes, usando los ensayos de tiempo

de protombina y protombina parcial activada. La fracción tres, eluida con NaCl a

1.0M fue la más activa, incrementando el tiempo de la prueba TP y TTPa >300 s.

El espectro de infrarrojo mostró absorción en las bandas características de un

fucoidano (3450, 1730, 1640, 1250, 1130, 1040, 840, 580 cm-1). La banda a los

1730 cm-1 es característica de los grupos acetil, y la banda a los 840 cm-1,

sugieren una substitución de residuo de azúcar, posiblemente, C-4-0-SO3 o C-4-

O-COCH3.

iv

ABSTRACT

In search for bioactive polysaccharides from seaweeds, acetyl fucoidan was

isolated from Hydroclathrus clathratus (C. Agardh) M.A. Howe. Specimens were

collected in Balandra, Baja California Sur. Fresh material was washed with tap

water, sun dried and milled. One hundred grams of dried H. clathratus were

sequentially extracted ith distilled water at 25 and 80°C. The hot water extract was

precipitated by addition of 10% cetylpyrimidinium chloride to yield 3.673 f of

brownish power. The precipitated was fractionated bye ion exchange

chromatography over DEAE-cellulose. The column was eluted with aqueous NaCl

(0.5M, 1.0M, and 2.0M). At the end, six fractions were evaluated as anticoagulant

agents using the prothrombin time and activated partial thromboplastin time.

Fraction 3 eluted with NaCl 1.0M was the most active increasing the normal TP

and TTPa values at >300 s. The infrared spectrum of fraction 3 showed

characteristic absorption bands of fucoidanos (3446, 1730, 1639, 1230, 1030, 833,

580 cm-1). Band at 1730 cm-1 was assigned to an acetyl group, while the band at

840 cm-1, suggest the substitution patter of the sugar residue to be mainly, C-4-0-

SO3 or C-4-O-COCH3.

1

1. INTRODUCCIÓN

Los polisacáridos sulfatados forman una clase de macromoléculas biológicas con

estructuras diversas que representan variadas propiedades fisicoquímicas. Éstos

poseen estructuras diversas que representan variadas propiedades fisicoquímicas

que varían de acuerdo al largo de la cadena polisacárida, el peso de la molécula y

los parámetros estructurales (Talarico, 2008; Bo et al., 2008; Marcel et al., 2011).

Las capacidades metabólicas y fisiológicas de los organismos marinos que

les permiten sobrevivir en un hábitat complejo les brindan un gran potencial para

producir metabolitos únicos que no se encuentran en ambientes terrestres. Los

organismos marinos, en particular los invertebrados sésiles han sido reconocidos

como una fuente potencial para el desarrollo de compuestos farmacéuticos (Moo

et al, 2009).

El término fucoidano se refiere a los polisacáridos sulfatados producidos

como metabolitos secundarios de todas las algas, se encuentran principalmente

constituidos por L-fucosa y grupos éster sulfatados. Estos polisacáridos se

encuentran en la pared celular, además de espacios intercelulares (Marcel et al,

2011), mientras que a los polisacáridos sulfatados que provienen de animales,

principalmente invertebrados marinos, se les llama fucanos (Holtkamp et al, 2009).

Los fucoidanos se están presentes en muchos órdenes de algas,

principalmente en las alga cafés (Phaeophyceae), como en el orden de las

2

Fucales y Laminariales, además de Chordariales, Dictyotales, Dictyosiphonales,

Ectocarpales y Scytosiphonales (Berteau y Mulloy, 2003).

Fisiológicamente, algunos estudios han demostrado la existencia de una

correlación entre el contenido de fucoidanos y la profundidad a la que se

encuentran las algas, siendo que mientras más cercanas estén a la superficie,

éstas contienen una mayor cantidad de polisacáridos sulfatados. Además, los

fucoidanos juegan un rol en la organización de la pared celular, y pueden estar

relacionados con la vinculación entre alginatos y celulosa, además de encontrarse

relacionados con la morfogénesis del embrión de las algas (Berteau y Mulloy,

2003).

El potencial bioactivo y las propiedades de los fucoidanos depende de la

especie del alga, la composición de la molécula, la densidad, distribución, las

uniones de los sulfatos y la purificación del compuesto (Marcel et al., 2011). La

composición de los fucoidanos cambia además, el proceso de extracción del

compuesto, la temporada en que el alga es recolectada y las condiciones

climáticas (Berteau y Mulloy, 2003).

El método de extracción de los polisacáridos resulta ser crucial, pues de él

depende la actividad biológica específica del extracto (Marcel et al., 2011). Las

principales técnicas de extracción suelen ser mediante etanol, uso de agua

caliente y fría, digestión enzimática, fermentación, digestión proteolítica, hidrólisis

ácida, o la combinación de algunos de estos tratamientos. Estos polisacáridos se

3

encuentran mayormente constituidos por L-fucosa, y pueden llegar a representar

el 40% del peso seco de las paredes celulares (Jeon et al., 2008; Berteau y

Mulloy, 2003).

El interés más reciente en polisacáridos sulfatados se centra en el beneficio

del potencial biológico de los fucoidanos en humanos como antitumorales,

antinflamatorios, antivirales, antitrombóticos, anticoagulantes y antioxidantes

(Marcel et al., 2011).

Los medicamentos con efectos antitrombóticos han sido bastante utilizados

en las terapias cardiovasculares, siendo la heparina el anticoagulante más

comercial. Esta biomolécula contiene un glucosoaminoglicano altamente sulfatado,

es obtenida mediante procesos químicos a partir de protoglicanos presentes en la

mucosa intestinal de cerdos y pulmones de animales bovinos, encontrándose en

baja concentración. El potencial anticoagulante de la heparina es logrado

mayormente por la potencialización de la antitrombina y el cofactor II de la

heparina (Pereira et al., 2002; Athukorala et al., 2006).

Las actividades anticoagulantes y antitrombóticas de las fracciones de

fucoidanos aumentan con el incremento del peso molecular y el contenido en

sulfatos que estas posean. Además, las fracciones en cuales el patrón nativo de

sulfatación se encuentra intacto resultan tener una mayor actividad que aquellas

que poseen el mismo peso molecular pero no el mismo grado de sulfatación

(Berteau y Mulloy, 2003).

4

En el siguiente trabajo, se realizó una extracción de polisacáridos sulfatados

del alga café Hydroclathrus clathratus (C. Agardh) M.A. Howe, a temperaturas de

25 y 80°C. Se realizarán las pruebas de contenidos de azúcares totales además

de ensayos TP y TTPa anticoagulantes con la finalidad de identificar el mejor

extracto para su fraccionamiento y estudio.

2. ANTECEDENTES

2.1 Generalidades de los fucoidanos

En el este de Asia, las algas marinas son usadas como una fuente de recursos

minerales, vitamínicos y fibras dietéticas. Por lo cual son altamente recetadas

como un suplemento alimenticio para el mantenimiento de la salud (Preeprame et

al., 2001).

El primer aislamiento de un polisacárido sulfatado a partir de un alga café

(Fucus vesiculosus) se realizó en el año de 1913, por Kylin. Desde ese momento

se han extraído una gran cantidad de fucoidanos con grandes variantes en su

composición química. Además de fucosa y sulfatos, los fucoidanos también están

constituidos de otros monosacáridos, como manosa, galactosa, glucosa y xilosa,

ácidos urónicos, grupos acetilo y algunas proteínas, las cuales le proporcionan

una estructura distinta a los fucoidanos de cada especie de alga (Bo et al., 2008).

Los polisacáridos sulfatados muestran una gran diversidad estructural entre

las diferentes especies. En la figura 1 se muestra esquemáticamente un fucoidano

5

obtenido del alga Laminaria saccharina. Esta estructura se encuentra

principalmente constituido por (13) α-L-fucopiranosa, con sulfatación en el C-4 y

en ocasiones en C-2 (Tutor et al, 2011).

Figura 1. Representación estructural del fucoidano obtenido del extracto del alga café L. saccharina.

En 1913, se reportó el primer aislamiento de un polisacárido sulfatado

proveniente de un alga café, posteriormente se reveló que éstas poseen una

mayor actividad anticoagulante que las algas rojas o verdes (Berteau y Mulloy,

2003; Athukorala et al., 2006).

Muchos estudios realizados han demostrado que la actividad anticoagulante

puede estar relacionada con el contenido de sulfatos y la posición, el peso

molecular y la composición del azúcar. Los grupos que poseen un alto contenido

de sulfatos presentan un mayor efecto anticoagulante, sin embargo se han

6

realizado estudios que demuestran que el peso molecular no influye tanto en la

actividad como el grado de sulfatación (Bo et al., 2008).

2.2 Funcionamiento y estuctura de la heparina

Los proteoglucanos se encuentran conformados por moléculas glucoproteicas

encontradas en el tejido conjuntivo. Estas moléculas están formadas por unidades

repetitivas de un disacárido derivado de aminoazúcar, además de contener al

menos un grupo carboxilo o sulfato cargado negativamente. Los principales

proteoglucanos son la heparina, el ácido urónico, el condrotín sulfato, ácido

hialurónico, el queratansulfato y heparán sulfato.

Estructuralmente, la heparina está constituida por una secuencia alternada

entre un ácido urónico y un α-D-glucosamina, unidos por un enlace glucosídico 1

4 (Figura 2). Algunos de los enlaces de la glucosamina se encuentran N-

acetilados, mientras que las demás están sulfatados. Además, la molécula

contiene radicales sulfato en parte de los ácidos idurónicos (C2) y en algunas

glucosaminas (C6). Las glucosaminas sulfatadas presentan además grupos

sulfato en los carbonos 3 y 6, dando a la molécula un carácter ácido (Flórez,

1997).

7

Figura 2. Representación estructural del pentasacárido con potencial anticoagulante de la heparina (Flórez, 1997).

La actividad anticoagulante de la heparina reside en una secuencia de

pentasacáridos encontrada irregularmente distribuida a lo largo de la cadena. Su

función anticoagulante se debe a que esta molécula actúa sobre la antitrombina III,

uniéndose y cambiando un cambio en la conformación estructural, acelerando la

velocidad de la antitrombina III para inactivar principalmente la trombina y los

factores Xa y IXa (Flórez, 1997).

2.3 Mecanismos de coagulación sanguínea

Al dañarse un vaso sanguíneo se inicia un proceso de reducción de pérdida de

sangre llamado hemostasia, el cual ocurre de forma secuencial con la

participación de factores vasculares, plaquetarios y plasmáticos (Figura 3) (Garrido

et al, 2006). A grandes rasgos, el proceso comienza con la activación de las

plaquetas o trombocitos, los cuales se adhieren a la zona lesionada de la pared

vascular, uniéndose al tejido conectivo endotelial debido a la secreción del factor

de von Willebrand, y comienzan la formación de un tapón compuesto por

8

trombocitos, deteniendo así el sangrado. Posteriormente, la enzima trombina se

encarga de formar un polímero de fibrina, el cual se incorpora al tapón, formando

un coágulo (Koolman y Röhm, 2004).

La coagulación sanguínea se lleva a cabo mediante varias reacciones,

donde la más importante es la conversión enzimática catalizada por una proteína

plasmática, la trombina del fibrógeno soluble (factor I), en un polímero de fibrina el

cual se depositará en el tapón primario. Por otro lado, la trombina (factor IIa) es

una serina proteinasa que hidroliza la molécula de fibrógeno y libera péptidos

pequeños, dejando accesibles algunos sitios de unión para la molécula de fibrina

dejando que se agreguen espontáneamente entre sí. Al final, se crea la formación

de una red covalente por acción de la tranglutaminasa (factor XIII) estabilizando de

este modo el tapón (Koolman y Röhm, 2004).

9

Figura 3. Representación de la cascada de coagulación sanguínea por las vías intrínseca y extrínseca (Modificado de: Flórez, 1997).

Generalmente, la trombina se encuentra presente en la sangre como una

proenzima inactiva. La protombina por su parte, pude ser activada mediante dos

mecanismos desencadenados por daños de la pared vascular. En estas dos vías

se forman cascadas de reacciones enzimáticas en donde las proenzimas inactivas

son transformadas proteolíticamente en proteinasas activas, y estas, a su vez,

activan a la proenzima siguiente. Algunas de las reacciones requieren además, de

10

factores proteicos adicionales, fosfolípidos aniónicos o iones de Ca2+ (Koolman y

Röhm, 2004).

La vía exógena, también llamada extravascular, se lleva a cabo cuando la

tromboplastina tisular (factor III), una proteína de membrana presente en las capas

más profundas de la pared vascular, activa al factor VII de la coagulación. Su

forma activa (VIIa) favorece autocatalíticamente su formación y libera a los

factores activos IXa y Xa. El factor IXa produce una mayor cantidad de factor Xa

con ayuda de fosfolípidos aniónicos y Ca2+. Éste último factor, apoyado por el

factor Va, lleva a la liberación final de la trombina activa (Koolman y Röhm, 2004).

Por otro lado, la vía endógena o intravascular se desencadena por los

factores por la liberación del factor tisular o factor III, el cual es liberado por los

tejidos como consecuencia de un traumatismo (Garrido et al, 2006). Además,

intervienen los factores XIIa, IXa, XIa y Xa (Koolman y Röhm, 2004.).

En ambas vías es necesaria la presencia de trombocitos activados, puesto

que en la superficie de éstos se llevan a cabo varias reacciones. En el complejo

protombinasa, los factores Xa y II, ayudados por iones de Ca2+ y fosfolípidos

aniónicos, se unen a la membrana de los trombocitos. Para que esta unión se

lleve a cabo, es necesario que los factores II y X contengan el aminoácido no

proteico –carboxil-glutamato (Gla), cuyos residuos se forman debido a la

carboxilación prostraduccional de los factores en el hígado. Estos residuos se

encuentran localizados en dominios especiales, los cuales generan el contacto

11

con los iones de Ca2+, además los factores VII y IX se encuentran unidos a la

membrana fosfolipídica por los residuos de Gla (Koolman y Röhm, 2004).

Además de transformar el fibrinógeno en fibrina, la trombina activa lleva a

su propia formación de manera indirecta, debido a que cataliza la formación de los

factores V y VII. La trombina también cataliza la activación del factor XIII,

desencadenando de esta manera la formación de la red de fibrina (Koolman y

Röhm, 2004).

3. DESCRIPCIÓN DEL ALGA

Hydroclathrus clathratus se caracteriza principalmente por su forma de red.

Inicialmente tiene forma globosa, y posteriormente se conforma por un irregular y

complejo arreglo de agujeros de distintos tamaños, a menudo cortados en

láminas; algo gruesa y resbaladiza, unida por un grupo de rizoides a lo largo de la

superficie inferior (Figura 4). Las perforaciones de la superficie son desde 1 mm de

diámetro hasta más de 3 cm. La distancia entre las perforaciones es generalmente

menor a 2 mm. El talo es menor a 200 µm en algunos casos y en otros llega a ser

mayor a 900 µm (Norris, 2010).

La médula tiene hasta más de 6 capas, con una pared delgada. Las células

medulares son ovoides o subesféricas y carecen de color, llegando a medir de 60

a 320 µm alrededor del hueco. La corteza se constituye de una a dos paredes de

12

células pigmentadas, las cuales miden entre 6 y 7.5 µm por 7 y 17 µm. La capa

superficial, en sección transversal con las papilas, tiene células convexas con un

tamaño de entre 10 y 15 µm (Norris, 2010).

Los esporangios pluriloculares son de 5 a 7 µm por 10 a 12 µm, en 2 a 3

hileras de 3 a 4 lóculos. Los soros se encuentran en un arreglo irregular,

usualmente cercanos a los mechones de pelo. Los soros crecen separados y

están dispersos, posteriormente se extienden y fusionan, cubriendo muchas veces

una gran parte de la superficie (Norris, 2010).

Habita generalmente sobre rocas en zonas de aguas poco profundas,

llegándose a encontrar hasta una profundidad de 2 m. ocasionalmente es epífita o

se encuentra enredada en otras algas (Norris, 2010; Britton y Millspaugh, 1920).

Se encuentra en climas templados, cálidos y tropicales, distribuyéndose en

países como Ecuador, Chile, Hawái, China, Japón, Vietnam, las Bermudas y

desde Florida hasta Brasil, algunas partes de Europa y África. En México se

encuentra en el Golfo de California, desde el noreste de la Isla Tiburón hasta

Bahía de Los Ángeles, de Bahía Concepción a Bahía de La Paz. En las costas del

pacífico mexicano se puede encontrar desde el sur de California hasta Laguna Ojo

de Liebre (Mendoza-González y Mateo-Cid, 1986; Pacheco-Ruíz y Zertruche-

Gonzáles, 1996).

13

Figura 4. Muestra del alga estudiada Hydroclathrus clathratus (Guiry y Guiry, 2013).

4. JUSTIFICACIÓN

Según datos publicados por la Secretaría de Salud, en México mueren alrededor

de 67,000 personas anualmente por causas relacionadas a trombosis arteriales,

coronarias y cerebrales, y se considera que hay alrededor de 15,000 muertes por

trombo embolismo venoso. Mientras que en Estados Unidos, la trombosis es

considerada como la causante más común de decesos, pues mueren alrededor de

14

dos millones de personas anualmente por trombosis arterial o venosa (Martínez y

Quintana, 2005).

La heparina es el fármaco más utilizado para el tratamiento de

enfermedades trombóticas, sin embargo su uso puede llegar a tener algunas

complicaciones. Además de que este se encuentra en bajas concentraciones, se

ha reportado incidencia en la presencia de priones debido a que la heparina es

extraída del intestino de cerdos y el pulmón de algunos bovinos. Por estas razones

se ha llevado a la búsqueda de un medicamento más seguro para la población,

que además, provea de una mayor cantidad de extracto, reduciendo los costos de

la obtención (Pereira et al., 2002). Los anticoagulantes utilizados como

medicamento traen consigo una serie de problemas asociados a su uso

prolongado, como lo es la osteoporosis, la cual se observa, generalmente después

de tres meses de uso, debido a que la heparina induce a la reabsorción ósea

acelerada (Trejo, 2004).

Las reacciones adversas asociadas a la formación de complejos inmunes

son el síndrome de trombocitopenia trombosis y trombosis cutánea. Además de

que la unión de la heparina con el factor plaquetario 4, pude llegar a la inducción

de la formación de autoanticuerpos. Los complejos inmunes son capaces de

activar a las plaquetas, provocando un estado de hipercoagulabilidad (Trejo,

2004).

15

Otro de los problemas con el uso de a heparina están involucrados con el

desarrollo de alopecia y malformaciones congénitas. Además, está la necrosis

cutánea, la cual puede ocurrir luego de 3 a 8 días de uso, se debe a que cuando el

anticoagulante se consume en altas dosis al iniciar la terapia, se actúa sobre las

proteínas anticoagulantes vitamina k-dependientes, como la proteína C, las cuales

tienen una menor vida media que los factores de coagulación. Debido a esto, se

llega a un estado de hipercoagubilidad paradójico, con trombosis de los vasos

pequeños y necrosis cutánea por isquemia (Trejo, 2004).

5. HIPÓTESIS

Los polisacáridos sulfatados extraídos del alga café Hydroclathrus clathratus

poseen la actividad anticoagulante potencial para ser utilizada como fármaco.

6. OBJETIVOS

Objetivos generales

Evaluar el potencial del alga Hydroclathrus clathratus como fuente de

polisacáridos sulfatados con actividad anticoagulante.

Objetivos particulares

16

Extracción, purificación y caracterización estructural de fracciones de

polisacáridos sulfatados del alga café Hydroclathrus clathratus.

Realizar pruebas de TP y APTT para conocer el tiempo de coagulación por

la vía externa e interna de la hemostasia.

7. MATERIAL Y MÉTODOS

7.1 Recolección

El alga H. clathratus fue recolectada en Balandra (110°18’15” N y 24°12’20” O),

Baja California Sur (Figura 5), el 12 de junio de 2004. Esta alga fue extraída en la

zona intermareal con ayuda de buceo libre y fue llevada al laboratorio de química

de algas marinas, en CICIMAR, donde se limpió con agua corriente y se liberó de

materiales externos al alga. Posterior a esto, se dejó secar al sol durante dos días.

La identificación se llevó a cabo en la Escuela Nacional de Ciencias

Biológicas del Instituto Politécnico Nacional.

17

Figura 5. Ubicación geográfica del área de recolección, Balandra.

18

7.2 Extracción

Se pesaron 100 g de la muestra, y se les agregó 1 L de agua destilada a

una temperatura de entre 23 y 25°C. La muestra estuvo con agitación continua

durante 4 horas, y posterior a este tiempo de agitación, se filtró sobre un lienzo

limpio (Figura 6).

F. El filtrado obtenido se centrifugó a 3000 rpm (1700 xg) durante 30

minutos, manteniendo la temperatura de la centrífuga a 5°C. Posteriormente, se

descartó el sedimento y el sobrenadante recuperado se precipitó con 20 mL de

cloruro de cetil-piridium al 10% y se dejó reposar durante 6 h. El precipitado se

recuperó mediante centrifugación a 1700 xg durante 30 min. Se descartó el

sobrenadante y el pelet se resuspendió en 850 mL de cloruro de cetil-piridium al

0.05% y se dejó en reposo durante 24 h.

El precipitado se recuperó mediante centrifugación (5°C, 1700 xg), y éste se

resuspendió en 700 mL de 2M NaCl:EtOH (10:1.5), y precipitado con 2100 mL de

etanol absoluto, dejándolo reposar durante 24 h, y recuperándose posteriormente

mediante centrifugación. El pelet obtenido se puso a secar en la estufa eléctrica a

una temperatura de 50°C. El extracto seco se colocó en un vial y se le etiquetó

con la clave MM0417 F

C. Por otro lado, al residuo de la primera filtración, se le agregó 1 L de agua

destilada y se volvió a realizar la extracción, esta vez a 80°C, con agitación

continua durante 3 h. La mezcla fue posteriormente filtrada sobre un lienzo limpio

19

y centrifugada por 30 min (5°C. 1700 xg). El sobrenadante fue precipitado en 20

mL de solución de cloruro de cetil-piridium (CPC) al 10% y se reposó durante 24 h.

El precipitado se recuperó mediante centrifugación (5°C, 1700 xg por 30

min), y éste se resuspendió en 710 mL de solución al 0.05% de CPC, dejándose

reposar durante 24h a temperatura ambiente y recuperándose mediante

centrifugación (5° C, 1700 xg por 30 min). El precipitado obtenido se resuspendió

en 697 mL de NaCl al 2M, manteniéndose con agitación constante durante 18 h

posteriores a las cual se precipitó nuevamente con 2.1 L de etanol absoluto, y se

dejó reposar por 20 h. El precipitado se recuperó mediante centrifugación (5° C.

1700 xg), y se secó en la estufa eléctrica por 18 h a una temperatura de 50° C. El

extracto seco se colocó en un vial y se le dio la clave MM0417 CN.

El extracto seco fue resuspendido en 200 mL de agua destilada a

temperatura ambiente durante 15 h. Posteriormente, suspensión se trató con

ultrasonido y baño de agua caliente (50° C) durante 5 h, después se centrifugó por

30 minutos (5° C. 1700 xg). El sobrenadante se precipitó con tres volúmenes de

alcohol etílico y se dejó en reposo durante 24 h.

El precipitado se recuperó mediante centrifugación durante 30 minutos (5°

C. 1700 xg). El precipitado obtenido se dejó secar en la estufa eléctrica a 55° C

durante 6 h, mientras que el sobrenadante fue descartado. A esta fracción seca se

le colocó en un vial, y se le denominó MM0717 CArp.

20

C.1. Al sobrenadante obtenido del primer precipitado de la extracción con

CPC al 10%, se le volvió a precipitar con 1650 mL de etanol absoluto, y se dejó

reposar durante 18 h. Posteriormente se centrifugó (1700 xg, 5° C, 30 min), y el

sólido obtenido se secó con una estufa eléctrica durante 18 h a 50° C. El extracto

seco se colocó en un vial y se le dio la clave MM0417 CN.

7.3 Determinación de azúcares totales

Para conocer la cantidad de azúcares totales (Dubois, 1996) se colocaron

100 µL de cada fracción en un tubo de ensaye, al que posteriormente se le

agregaron 900 µL de agua destilada. A éstos se les agregó una solución de fenol-

ácido sulfúrico al 5% y se leyó el resultado a una longitud de onda a 490 nm. Este

ensayo se realizó primero para los extractos; posteriormente se sometieron todas

las fracciones obtenidas a esta prueba.

21

Fig

ura

6.

Dia

gra

ma d

e f

lujo

de la o

bte

nció

n d

e los t

res e

xtr

acto

s p

rincip

ale

s d

e H

ydro

cla

thru

s c

lath

ratu

s.

22

7.4 Fraccionamiento

Se suspendieron 1.4 g del extracto MM0417CArp en 30 mL de agua

destilada, disueltos con ayuda de un sonicador durante 8 h a 50° C. A esta mezcla

se le agregaron 45 g de DEAE celulosa y se colocó en un embudo Buchner de 95

mm de diámetro (Figura 7).

Figura 7. Diagrama del fraccionamiento del extracto MM0717 CArp.

La mezcla fue eluída con 500 mL de NaCl al 0.5M, 600 mL de NaCl al 1M y

600 mL de NaCl al 2M, obteniéndose 18 eluatos a distintas concentraciones.

Posteriormente, los eluatos fueron unidos según la Tabla I.

23

Tabla I. Forma en que fueron unidos los eluatos obtenidos del extracto MM0417 CArp,

dando lugar a seis fracciones.

Eluato Clave

1 -4 MM0417CArp CC1F1

5-8 MM0417CArp CC1F2

9-10 MM0417CArp CC1F3

11-15 MM0417CArp CC1F4

16 MM0417CArp CC1F5

17-18 MM0417CArp CC1F6

Las fracciones unidas fueron dializadas en una membrana de celulosa

SpectraPor (Spectrum Medical Industries, Inc.) de 45 mm con un volumen de 6.4

mL/cm de 12000 a 14000 daltons. El proceso de diálisis fue en contra de agua

destilada por 48 h.

Posteriormente, las fracciones fueron precipitadas con tres volúmenes de

etanol y dejadas en reposo a 4° C durante 4 h. Después, se centrifugó cada una

de ellas durante 20 min (5° C. 1700 xg), se recuperó el sólido de cada fracción y

se colocó en la estufa eléctrica a 55° C durante 24 h.

24

7.5 Ensayos de actividad anticoagulante

La actividad anticoagulante de los seis extractos (MM0417CArpCC1F1-

MM0417CArpCC1F6) se observó mediante la realización de ensayos de tiempo de

protombina (TP) y tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA), utilizando

plasma sanguíneo humano.

El plasma sanguíneo se obtuvo a partir de la extracción de 9 mL de sangre

de un donante anónimo. Esta muestra se colocó en un tubo de ensaye con 1 mL

de citrato de sodio al 3.5% y se centrifugó por 10 minutos, se recuperó el plasma

y se almacenó a -18° C.

En la prueba TP se agregaron 4 ml de agua destilada al recipiente del

ensayo. Posteriormente se colocaron a baño maría un tubo con 100 μL de plasma

y otro con 10 μL de la prueba del extracto incubada a una temperatura de 37° C

por un minuto. El control se realizó tomando 100 μL de plasma y 200 μL de la

prueba TP, incubada previamente a 37° C por 10 min., posterior a ese tiempo se

midió el tiempo de formación del coágulo.

Para el ensayo TTPa, se mezclaron 100 μL de plasma humano citrado y se

mezcló con 10 μL del extracto obtenido incubado a 37° C por un minuto.

Posteriormente se le agregaron 100 μL del reactivo de TTPa y se incubó a 37° C

durante 3 min posteriores a los cuales se agregaron 100 μL de CaCl2 al 0.25%, y

fue a partir de ese momento que se midió el tiempo de formación del coágulo.

25

La formación del coágulo se inspeccionó visualmente en todas las pruebas,

y éstas fueron realizadas por duplicado.

7.6 Determinación de ácidos urónicos

La determinación de ácidos urónicos se realizó mediante el método

propuesto por Blumenkanta y Asboe (1973). Se colocó 1 mL de cada fracción (100

μL mL -1) en agua con hielo por 30 s. Posteriormente se adicionaron 6 mL de

borato de sodio al 0.0125 M en H2SO4 y se dejó enfriar en agua con hielo 1 min,

posterior al cual se colocó a baño maría a 100°C durante 5 min. Terminando este

tiempo, la mezcla se colocó nuevamente en agua con hielo por 1 min y finalmente

se le agregararon 100 μL de 3-fenil al 0.15% en hidróxido de sodio al 0.5%. La

absorbancia fue medida a 520 nm, con un tiempo no mayor a 5 min. La

concentración de ácidos urónicos se obtuvo al interpolar la absorbancia de cada

fracción con una curva estándar realizada con ácido galacturónico. Las

determinaciones fueron realizadas por duplicado, calculando el promedio y la

desviación estándar.

7.7 Determinación de fucosa

La concentración de fucosa fue determinada por el método colorimétrico

propuesto por Dische (1955). En este ensayo se coloca 1 mL de cada fracción

disuelta en agua (100 μL mL -1) en un tubo de ensayo, enfriado dentro de un

contenedor con hielo. Se agregaron 4.5 mL de una mescla de 100 mL de agua

destilada con 600 mL de ácido sulfúrico. Después de enfriarse por 1 min se

26

transfirió a un baño de agua a 100°C durante 10 min, posteriormente se dejó

enfriar a temperatura ambiente. Se agregaron 100 μL de cisteína al 3% y se dejó

reposar por 30 min para finalmente medir a absorbancia a 396 y 427 nm. La

absorbancia de la fucosa se calculó mediante la ecuación: Afucosa= A396 nm – A427 nm.

La concentración de la fucosa fue determinada por la interpolación en una curva

estándar realizada con L-fucosa. Las determinaciones fueron realizadas por

duplicado, calculando el promedio y la desviación estándar.

7.8 Espectrofotometría de infrarrojo

Para la caracterización de las fracciones obtenidas a partir de las seis

muestras de extracto de Hydroclathrus clathratus se realizaran espectros de

infrarrojo, utilizando bromuro de potasio como soporte. A cada espectro se le

adicionaran repeticiones a una resolución de 4 cm-1 en el rango espectral de 400-

4000 cm-1.

8. RESULTADOS

Los tres extractos obtenidos en un inicio de H. clathratus (MM0417F,

MM0417C) fueron analizados con ensayos de contenido de azúcares totales. Se

encontró una mayor concentración promedio de azúcares en el extracto obtenido

con agua caliente, y aunque se encontró cierta cantidad de azúcares en el extracto

con agua fría, éste fue 4 veces menor en comparación (Tabla II).

27

Tabla II. Porcentaje relativo del contenido de azúcares totales en los extractos de H.

clathratus obtenidos con agua fría y caliente.

Extracto Porcentaje de contenido de azúcares

MM0417 Frío 2.18

MM0417 Caliente 9.0

Las pruebas anticoagulantes realizadas para los extractos F, CN y CArp

demuestran que para el ensayo TP doblaron el tiempo de coagulación del blanco

(13 s), siendo más activa la fracción MM0417CArp (Figura 8), con un coeficiente

de coagulación de 5.5 . Mientras que para los ensayos de TTPa no se mostró

alguna diferencia entre los tres extractos, puesto que la formación del coaguló se

observó después de los 300 s, aumentando nueve veces el tiempo de coagulación

del blanco, el cual se formó a los 33 s.

Figura 8. Tiempo de la formación del coágulo (s) en los ensayos TP y TTPa para los extractos

MM0417F, MM0417CArp y MM0417C obtenidos de H. Clathratus.

0

50

100

150

200

250

300

350

MM0417F MM0417CArp MM0417CN Blanco

Fo

rmació

n d

el

co

ág

ulo

(s)

Extracto de H. clathratus

TP promedio

TTPa promedio

28

El mayor rendimiento fue de 6.7591 y se obtuvo en el extracto MM0417F.

En cuanto a los ensayos anticoagulantes se encontró que los tres extractos

obtuvieron un coeficiente de coagulación de 9.09 en la prueba TTPa; no siendo el

mismo caso para el ensayo TP, puesto que el mayo coeficiente de coagulación se

encontró en el extracto MM0417CArp, con un tiempo de coagulación promedio de

71.5. Debido a que este último presentó una mayor actividad anticoagulante, se

procedió a realizar el fraccionamiento de éste (Tabla III).

Tabla III. Muestra los tiempos y coeficientes de coagulación, además del rendimiento para

los extractos MM0417F, MM0417CArp y MM0417C obtenidos de H. clathratus.

Extracto

TP (s)

Coeficiente de

coagulación

TTPa

(s)

Coeficiente de

coagulación

Rendimiento

MM0417F 33.5 2.57 >300 9.09 6.7591

MM0417CArp 71.5 5.5 >300 9.09 2.1221

MM0417CN 50.5 3.88 >300 9.09 1.396

Blanco 13 ----- 33 ------- -----

Las seis fracciones resultantes del extracto MM0417CA (Tabla I), se

analizaron con ensayos anticoagulantes. En la figura 9 se observa que todas las

fracciones presentaron el mismo tiempo de coagulación para el ensayo TTPa

(>300 s) aumentando el tiempo de coagulación del blanco (33 s).

29

0

50

100

150

200

250

300

350

Fo

rmació

n d

el

co

ág

ulo

(s)

Fracciónes de H. clathratus

TP promedio

TTPa promedio

Figura 9. Tiempo de la formación del coágulo (s) en los ensayos TP y TTPa para las fracciones obtenidas a partir del extracto MM0417CArp.

Para el ensayo TP, se mostró una variación en el tiempo de coagulación de

las seis fracciones, siendo cinco las que lograron doblar el tiempo de coagulación

del blanco (13 s). La mayor actividad se encontró en la fracción MM0417CA

CC1F3 (>300 s), seguida por la fracción CC2F4 con un promedio de 228 s y la

fracción CC1F5, cuya formación del coágulo se observó a los 164 s, mientras que

la fracción CC1F1, aunque logró prolongar la coagulación a un promedio de 21.17

s, ésta no dobló el tiempo de coagulación del blanco (Tabla IV)

30

Tabla IV. Muestra el tiempo de coagulación en los ensayos TP y TTPa de las seis

fracciones del extracto MM0417CArp.

Fracción TP (s) TTPa (s)

MM0417CA CC1F1 21.17 >300

MM0417CA CC1F2 38.515 >300

MM0417CA CC1F3 >300 >300

MM0417CA CC1F4 228 >300

MM0417CA CC1F5 164 >300

MM0417CA CC1F6 54.83 >300

Blanco 13 33

En la tabla V se observa que el coeficiente de coagulación en el ensayo

TTPa fue de 9.09 en las seis fracciones. Mientras que la fracción con mayor

coeficiente de coagulación en las pruebas TP se encontró en la CC1F3,

aumentando 23 veces el tiempo de coagulación, además, en este misma fracción

se encontró un mayor rendimiento.

Tabla V. Muestra el rendimiento y el coeficiente de coagulación en las pruebas TP y TTPa

de las fracciones obtenidas a partir del extracto MM0417CArp.

Fracción Coeficiente de coagulación TP

Coeficiente de coagulación TTPa

Rendimiento

MM0417CA CC1F1 1.62 9.09 0.0854

MM0417CA CC1F2 2.96 9.09 0.0384

MM0417CA CC1F3 23.07 9.09 0.257

MM0417CA CC1F4 17.53 9.09 0.0536

MM0417CA CC1F5 12.61 9.09 0.057

MM0417CA CC1F6 4.217 9.09 0.0143

31

En la Figura 10 se muestra que en la fracción CC1F3 se encontró un mayor

porcentaje de fucosa, seguidas por la fracción F2 y F1; mientras que en las

fracciones F4, F5 y F6 no se encontró contenido de fucosa. En las seis fracciones

se encontró contenido de ácidos urónicos, siendo la fracción F1 y F2 las que

contuvieron un mayor porcentaje, mientras que la fracción F3 fue la que menor

proporción de éste compuesto contuvo. Finalmente, el porcentaje de azúcares

encontrados en las fracciones fue más alto en las fracciones F1 y F2,

encontrándose el mínimo en la fracción F6. Además, se muestra que la menor

cantidad de ácidos urónicos se encuentra en la fracción F3, la cual por el contrario,

demuestra tener un mayor porcentaje de fucosa. Por otro lado, la fracción F1 con

un mayor porcentaje de ácidos urónicos, contienen un mínimo contenido de

fucosa.

Figura 10. Porcentaje de fucosa, azúcares totales y ácidos urónicos contenidos en las fracciones

de MM0417CArp.

0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0

MM0417CA CC1F1

MM0417CA CC1F2

MM0417CA CC1F3

MM0417CA CC1F4

MM0417CA CC1F5

MM0417CA CC1F6

Porcentaje

Fra

cció

nes d

e H

. c

lath

ratu

s

Porcentaje defucosa

Porcentaje deazúcares

Porcentaje deácidosurónicos

32

El espectro de infrarrojo de la fracción MM0417CA F3 (Figura 11), muestra

bandas de absorción en 3446 cm-1 es atribuida al enlace del grupo hidroxilo,

mientras que las señales observadas a los y 1358.7 cm-1 corresponden los

enlaces carboxilo. La existencia de grupos sulfato se puede constatar con la

presencia de las bandas 1247.3 y 602.5 cm-1, mientras que la banda en 811.24

cm-1 indica sulfato en posición ecuatorial. La banda que se encuentra en 1031.2

cm-1 es atribuida a la presencia de un anillo de azúcar, mientras que la banda en

900 cm-1 es un indicador de un polisacárido (Manoj et al., 2013, Bo et al., 2008).

33

4000

450

3500

3000

2500

2000

1500

1000

500

100 7980828486889092949698

cm-1

%T

3446

.1

2939

.5

1639

833.

73

973.

62

1230

.7

1030

.3

909.

35

580.

43

1385

.7

Fig

ura

11. E

sp

ectr

o d

e infr

arr

ojo

de la f

racció

n M

M0

417C

Arp

CC

1F

3.

El pic

o u

bic

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n la b

anda

83

3.7

3 d

em

uestr

a u

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o d

e

sulfata

ció

n c

ara

cte

rístico d

e los p

olis

acári

dos s

ulfata

dos.

34

9. DISCUSIÓN

En la realización de este estudio se encontró que H. clathratus posee actividad

anticoagulante, siendo en primera instancia, el extracto MM0417CArp el que

mostró una mayor actividad. Aunque las en las pruebas de TTPa los resultados

fueron los mismos para los tres extractos (>300 s) lo que denotó un cambio en el

potencial del extracto obtenido con agua caliente fueron los ensayos TP, ya que

en esta prueba el tiempo de coagulación fue mayor (50 s). Las diferencias entre el

tiempo de coagulación pueden deberse a que la actividad anticoagulante que tiene

un polisacárido está determinada por el grado de sulfatación en la cadena, y se

tiene registrado que para H. clathratus la cantidad de sulfatos es mayor cuando los

polisacáridos se obtienen de una extracción con agua caliente (Berteau y Mulloy,

2003; Awar et al, 2009).

Awar y colaboradores en el 2009 reportaron que el extracto caliente de H.

clathratus posee un mayor contenido de fucosa, galactosa y xilosa, mientras que

los extractos obtenidos con agua fría contienen una mayor cantidad de ácido

glucurónico y galacturónico. Sin embargo, la extracción con agua caliente no

puede considerarse como el mejor método para la obtención de fucoidanos. En el

mismo trabajo realizado por Adwar et al, se realizó también la extracción de

polisacáridos del alga Padina pavonia. En este caso el porcentaje relativo de

fucosa para P. pavonia fue mayor con la utilización de agua fría, mientras que con

el agua caliente se obtuvo un mayor porcentaje de ácidos glucurónicos.

35

Demostrando de este modo que las características del alga en cada especie llevan

a la obtención de distintos resultados bajo un mismo método de extracción (Bo et

al., 2008).

En cuanto al tiempo de coagulación de las fracciones se obtuvo que

MM0417CArp tuvo la mayor actividad en las pruebas TP y TTPa, elevando a >300

s el tiempo de coagulación en el ensayo TP. Además, fue esta fracción la que

contuvo un mayor porcentaje de fucosa. Los fucoidanos en general, han

demostrado tener una gran capacidad anticoagulante, siendo las fracciones más

activas fracciones más activas aquellas que contienen un nivel más alto de

sulfatación (Trejo, 2004; Shanmugam y Mody, 2000). Además, las diferencias

entre los tiempos de coagulación entre ambas pruebas pueden deberse a que

éstas analizan distintas vías de coagulación, implicando distintos factores a los

que pueden no ser afines los polisacáridos extraídos (Pereira et al., 2002).

De igual manera, las diferencias de las actividades anticoagulantes entre

las fracciones obtenidas para ambas pruebas pueden deberse al método de

extracción, puesto que este método obtiene compuestos con un distinto peso

molecular, dando así diferentes propiedades en la estructura. Además, no se

puede descartar que esta alga pueda tener una mayor actividad anticoagulante de

lo que se obtuvo en este trabajo, puesto que debe de tomarse en cuenta que la

formación de los metabolitos secundarios dependen de las necesidades

fisiológicas del alga, las cuales reporta Matsubara et al en el 2010, están dadas

36

por las condiciones oceánicas como temperatura, nutrientes, y estrés, además de

la época del año en que ésta es recolectada y periodo de reproducción. Lo cual da

una posibilidad de encontrar diferencias en las estructuras y los potenciales

activos de los fucoidanos que se encuentran en un alga de la misma especie en

diferentes periodos de recolección.

La posición de los grupos sulfato tiene un rol importante en la actividad

biológica del fucoidano. Uno de los métodos más utilizados para determinar la

posición del sulfato es la espectroscopia de infrarrojo, la cual muestra que la

mayoría de los grupos sulfato se encuentra en posición axial y el resto en posición

ecuatorial, de acuerdo a una banda a los 824 cm-1 y un desnivel a los 820 cm-1 en

el espectro (Bo et al., 2008). En cuanto a la caracterización estructural de las

fracciones, en la figura 11 se pueden observar bandas características de un

polisacárido sulfatado (banda a los 833.73 cm-1).

De igual manera que lo reportado por Manoj et al. 2013, quienes trabajaron

con los espectros de infrarrojo para las algas cafés Sargassum tenerrimum,

Sargassum wightii, Turbinaria conoides, Turbinaria ornata y Padina

tetrastromatica, se encontró que H. clathratus presenta una banda en 909 cm-1, la

cual resulta ser característica de los fucoidanos. Además, se observaron bandas

en 1230 y 580 cm-1, las cuales indican la presencia de grupos sulfato ésteres,

mientras que el pico encontrado en la banda 1639 corresponde a grupos hidroxilo

37

y carboxilo (Silva, et al., 2005). La banda encontrada a 1030 corresponde a un

anillo de azúcar como lo reporta Muñoz en el 2006.

Finalmente, se tiene entendido que los polisacáridos sulfatados existentes

en H. clathratus tienen un amplio potencial anticoagulante, puesto que una de las

fracciones logró inhibir el tiempo de formación del coágulo de una forma similar a

la heparina (F3), mientras que el resto, tuvieron un potencial anticoagulante

sumamente alto sólo para la prueba TTPa.

10. CONCLUSIONES

El alga Hydroclathrus clathratus demostró tener fucoidanos con actividad

anticoagulante. Aunque sólo una de las fracciones obtenidas mostró una actividad

similar a la de la heparina para las pruebas TP y TTPa, ésta fue la fracción que

mostró un mayor rendimiento. Podría proponerse la fracción MM0417CArp CC1F3

como un candidato a ser un fármaco, sin embargo, aún falta la realización de

purificación del extracto y pruebas de citotoxicidad.

11. REFERENCIAS

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