EXTRACCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE METABOLITOS …

1

BENEMÉRITA UNIVERSIDAD

AUTÓNOMA DE PUEBLA

Facultad de Ciencias Químicas

Posgrado en Ciencias Químicas

EXTRACCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE

METABOLITOS SECUNDARIOS A PARTIR DE

Bacillus thuringiensis.

TESIS PRESENTADA COMO REQUISITO PARA OBTENER EL

GRADO DE:

MAESTRÍA EN CIENCIAS QUÍMICAS

EN EL ÁREA DE QUÍMICA ORGÁNICA

Presenta:

Q.F.B. Melanie Ramírez Rojano

Director de tesis:

Dra. Estibaliz Sansinenea Royano

FEBRERO 2016

2

R E S U M E N

La búsqueda de microorganismos productores de compuestos biológicamente

activos a partir de diversas fuentes naturales ha sido el fundamento de programas de

investigación en antibióticos durante más de 30 años. Las especies de Bacillus son capaces

de producir un amplio rango de metabolitos secundarios de naturaleza y estructura muy

diferente mostrando un amplio espectro de actividades. Los metabolitos primarios son

aquellos que se producen en la fase exponencial de crecimiento de un microorganismo y

son necesarios para la sobrevivencia del microorganismo. Mientras que los metabolitos

secundarios son moléculas sintetizadas por determinados microorganismos, que se

producen en la fase estacionaria y aunque no son imprescindibles para el microorganismo,

juegan papeles como la protección y supervivencia propia en el ambiente que lo rodea. La

amplia variabilidad estructural de estos compuestos ha atraído la curiosidad de químicos y

las actividades biológicas que poseen estos productos naturales han inspirado a la

industria farmacéutica para buscar nuevas estructuras en cultivos microbianos así como

en plantas. Muchos de los productos microbianos que tienen un gran valor comercial y

económico son metabolitos secundarios.

El objetivo general de este trabajo es la extracción y caracterizacion de metabolitos

secundarios y su purificación a partir de un extracto crudo de un cultivo celular de Bacillus

thuringiensis cepa ELI52. A partir del extracto crudo se han logrado separar, purificar e

identificar cuatro dicetopiperazinas: ciclo(L-Pro-L-Leu), ciclo(L-Pro-L-Val), ciclo(L-Pro-L-

Phe) y ciclo(L-Pro-L-Tyr) utilizando técnicas cromatográficas en columna, TLC y placa

preparativa. Las estructuras de estos compuestos se lograron establecer por métodos

espectroscópicos tales como RMN 1H, RMN 13C, COSY, HSQC y HR-MS.

3

A B S T R A C T

The search for microorganisms producing biologically active compounds from

various natural sources has been the foundation of research programs antibiotics for more

than 30 years. Bacillus species are able to produce a wide range of secondary metabolites

of very different nature and structure showing a broad spectrum of activities. Primary

metabolites are those which occur in the exponential growth phase of a microorganism

and are necessary for the survival of the microorganism. While secondary metabolites are

synthesized by certain microorganisms, and are produced in the stationary phase and

although they are not essential for the organism, they play roles as the protection and

survival in the environment that surrounds they. The wide structural variability of these

compounds has attracted the curiosity of chemists and biological activities of these

natural products have inspired the pharmaceutical industry to find new structures in

microbial cultures and plants. Many microbial products that have great commercial and

economic value are secondary metabolites.

The overall objective of this work is to obtain and purify secondary metabolites

from a crude extract of a cell culture of Bacillus thuringiensis strain ELI52. From the crude

extract has been separated, purified and identified four diketopiperazines: cyclo (L-Pro-L-

Leu), cyclo (L-Pro-L-Val), cyclo (L-Pro-L-Phe) and cyclo (L-Pro-L-Tyr) using chromatographic

techniques such as column, and preparative TLC plates. The structures of these

compounds were successfully established by spectroscopic methods such as NMR 1H,

NMR 13C, COSY, HSQC y HR-MS.

4

Í N D I C E

Página

Abreviaturas 5

1. Introducción 7

2. Antecedentes 9

2.1. Metabolismo secundario: fuente de productos antibactericidas y

antifúngicos 9

2.2. Bacillus thuringiensis como agente de control biológico 14

2.3. Melanina, un pigmento fotoprotector 17

2.4. Dicetopiperazinas 21

3. Objetivos

3.1. Objetivo general 22

3.2. Objetivos particulares 22

4. Discusión de resultados

4.1. Obtención del extracto crudo 23

4.2. Análisis de la solubilidad del extracto crudo 24

4.3. Elucidación del ciclo (L-Pro-L-Leu) 30

4.4. Elucidación del ciclo (L-Pro-L-Val) 37

4.5. Elucidación del ciclo (L-Pro-L-Phe) 45

4.6. Elucidación del ciclo (L-Pro-L-Tyr) 50

4.7. Prueba de la actividad antibacteriana de los compuestos obtenidos 60

5. Conclusiones 62

6. Desarrollo experimental

6.1. Diagrama general de trabajo 64

6.2. Materiales y métodos 65

6.3. Extracción de metabolitos secundarios de B. thuringiensis cepa ELI52 66

6.4. Purificación y caracterización de los compuestos obtenidos de B.

thuringiensis 67

6.4.1. Purificación y caracterización del ciclo (L-Pro-L-Leu) 68

6.4.2. Purificación y caracterización del ciclo (L-Pro-L-Val) 70

6.4.3. Purificación y caracterización del ciclo (L-Pro-L-Phe) 72

6.4.4. Purificación y caracterización del ciclo (L-Pro-L-Tyr) 74

6.4.5. Purificación y caracterización del ciclo (L-Pro-L-Tyr) 76

6.5. Prueba de la actividad antibacteriana de los compuestos obtenidos 78

7. Referencias 79

5

A B R E V I A T U R A S

°C Grados centígrados

Bt Bacillus thuringiensis

CDCl3 Cloroformo deuterado

cm Centímetros

COSY Correlation SpectroscopY (Espectroscopía de

correlación)

DCPs Dicetopiperazinas

DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

DMF Dimetilformamida

DMSO Dimetilsulfóxido

HRMS Espectrometría de masas de alta resolución

HSQC Heteronuclear Singular Quantum Coherence

Hz Hertz

IR Infrarrojo

J Constante de acoplamiento

K. pneumoniae Klebsiella pneumoniae

L Litro

L. monocytogenes Listeria monocytogenes

LB Luria Bertani

MHz Megahertz

min Minutos

mL Mililitro

6

p.f punto de fusión

ppm Partes por millón

Rf Retention factor (Factor de retención)

RMN 13C Resonancia Magnética Nuclear de 13C

RMN 1H Resonancia Magnética Nuclear de 1H

RMN Resonancia Magnética Nuclear

rpm Revoluciones por minuto

Shigella spp Shigella sin especie

TLC Thin Layer Chromatography (cromatografía en capa

fina)

TSB Tripticaseine Soy Broth (caldo de tripticaseína de

soya)

V. cholerae Vibrio cholerae

V. parahemoliticus Vibrio parahemolitycus

Desplazamiento químico (ppm) RMN

7

1. I N T R O D U C C I Ó N

La biotecnología emplea la biología, la microbiología, la química y otras áreas, con

gran uso en agricultura, farmacia, ciencia de los alimentos, ciencias forestales y medicina.

A partir de estas áreas se pudo descubrir nuevos fármacos de diferente origen, como son

del mundo marino, de plantas o de animales, que tienen capacidad terapéutica en

enfermedades ya conocidas o nuevas.

Por otro lado, varios estudios han demostrado que ciertos patrones de uso

indiscriminado de los antibióticos que están actualmente en uso provocan la aparición

continua de organismos resistentes a estos antibióticos. Esta resistencia antibiótica

demanda que se haga un renovado esfuerzo para buscar agentes antibacterianos

efectivos contra las bacterias patógenas resistentes a los antibióticos actuales, por ello, la

búsqueda de microorganismos productores de compuestos biológicamente activos a

partir de diversas fuentes naturales ha sido el fundamento de programas de investigación

en antibióticos durante más de 30 años.

Dentro de todos los microorganismos, concretamente dentro de las bacterias, el

género Bacillus, es capaz de producir un amplio rango de metabolitos secundarios de

naturaleza y estructura muy diferente mostrando un amplio espectro de actividades. Estos

metabolitos incluyen antibióticos, pigmentos, toxinas, promotores de crecimiento y otros

compuestos bioactivos y están diseñados para capacitar a la bacteria para sobrevivir en su

ambiente natural. Esta amplia variabilidad de estructuras y actividades de los compuestos

secundarios expande el potencial de la importancia industrial y biotecnológica del género

Bacillus con sus especies relacionadas.

8

Nuestro grupo de investigación aisló una bacteria de Bacillus thuringiensis de un

suelo de Mérida Yucatán que mostró una coloración marrón en placas de cultivo en

crecimiento. Se pudo comprobar que esta cepa llamada ELI52 producía melanina, que es

un agente fotoprotector lo cual fue corroborado por un IR comparado con la melanina

estándar. El interés en esta cepa llevó a realizar varios estudios de antagonismo contra

varias bacterias dando una fuerte actividad antagónica e inhibitoria contra bacterias muy

importantes a nivel hospitalario. Por ello se sospechó que esta cepa podía tener

metabolitos secundarios con actividad biológica, por lo que se propuso extraer y purificar

metabolitos secundarios de esta cepa e identificarlos por diferentes técnicas

espectroscópicas.

Por lo que en este trabajo se propuso la extracción de metabolitos secundarios y su

purificación a partir de un extracto crudo de un cultivo celular de Bacillus thuringiensis

cepa ELI52. A partir del extracto crudo se han logrado separar, purificar e identificar

cuatro dicetopiperazinas: ciclo(L-Pro-L-Leu), ciclo(L-Pro-L-Val), ciclo(L-Pro-L-Phe) y ciclo(L-

Pro-L-Tyr) utilizando técnicas cromatográficas en columna, TLC y placa preparativa. Las

estructuras de estos compuestos se lograron establecer por métodos espectroscópicos

tales como RMN 1H, RMN 13C, COSY, HSQC y HR-MS.

9

2. A N T E C E D E N T E S

La biotecnología se refiere a toda aplicación tecnológica que utilice sistemas biológicos

y organismos vivos o sus derivados para la creación o modificación de productos o

procesos para usos específicos. Las aplicaciones de la biotecnología son numerosas y entre

las diferentes biotecnologías se encuentra la Biotecnología roja que se aplica a la

utilización de biotecnología en procesos médicos. Algunos ejemplos son el diseño de

organismos para producir antibióticos, el desarrollo de vacunas y nuevos fármacos, los

diagnósticos moleculares, las terapias regenerativas y el desarrollo de la ingeniería

genética para curar enfermedades a través de la terapia génica.

2.1 Metabolismo secundario: fuente de productos antibactericidas y antifúngicos

Por definición, los metabolitos primarios son aquellos que se producen en la fase

exponencial de crecimiento de un microorganismo y son necesarios para la sobrevivencia

del microorganismo. Mientras que los metabolitos secundarios son moléculas sintetizadas

por determinados microorganismos, que se producen en la fase estacionaria y aunque no

son imprescindibles para el microorganismo, juegan papeles como la protección y

supervivencia propia en el ambiente que lo rodea. Sus características son:

No son necesarios para el crecimiento del microorganismo que los produce. En estado

natural, sus funciones se hallan ordenadas a la supervivencia de la especie, pero

cuando los microorganismos que los producen se desarrollan en cultivo puro, los

metabolitos secundarios no desempeñan esa misión.

Generalmente se producen como mezclas de productos muy relacionados

químicamente entre sí.

Cada uno de estos productos es producido por un grupo muy reducido de

organismos.

La producción puede perderse fácilmente por mutación espontánea (degeneración de

la raza), por lo que son muy importantes las técnicas de conservación de estos

microorganismos.

10

De todos los productos tradicionales obtenidos por fermentación, los más

importantes para la salud humana son los metabolitos secundarios. Donde se incluyen,

además de los antibióticos, ciertas toxinas, alcaloides, factores de crecimiento vegetal y

pigmentos.

Kossel en 1891, definió los metabolitos secundarios por exclusión, es decir aquellos

que no pertenecían a los metabolitos primarios, provocando una fuerte crítica que aún

hoy en día no cesa. Actualmente el concepto aceptado, es que los metabolitos primarios

son compuestos químicos provenientes de organismos vivos (plantas, microorganismos o

animales) que son vitales para su funcionamiento mientras que los secundarios son

compuestos prescindibles. Estos metabolitos secundarios tienen gran diversidad

estructural y cada uno de los compuestos es producido por un número pequeño de

especies. 1

Por muchos años, el metabolismo secundario fue ignorado; el estudio de este tipo de

metabolismo no esencial se dejó para los científicos de las industrias y los químicos

académicos. Hoy en día la situación es diferente. La amplia variabilidad estructural de

estos compuestos ha atraído la curiosidad de químicos y las actividades biológicas que

poseen estos productos naturales han inspirado a la industria farmacéutica para buscar

nuevas estructuras en cultivos microbianos así como en plantas. Muchos de los productos

microbianos que tienen un gran valor comercial y económico son metabolitos

secundarios.

La exploración de la diversidad microbiana y la cantidad de metabolitos secundarios

producidos por bacterias ha llevado a considerarlos como una fuente importante de

productos naturales con propiedades biológicas como antibacterianos, antifúngicos,

antitumorales, hipocolesterolémicos, inmunosupresores, antiparasitarios, herbicidas e

insecticidas, entre otros. Los metabolitos secundarios son definidos como sustancias de

bajo peso molecular, que no se producen en la vía metabólica primaria y que no juegan un

papel fundamental en las funciones primarias o de crecimiento2. A diferencia de los

metabolitos primarios, los cuales son comunes en todos los sistemas biológicos, los

11

metabolitos secundarios, son química y taxonómicamente diversos, presentando

funciones desconocidas3.

Los metabolitos secundarios son aquellos compuestos orgánicos sintetizados por el

organismo que no tienen un rol directo en el crecimiento o reproducción del mismo y se

producen en la fase estacionaria de crecimiento. A diferencia de lo que sucede con los

metabolitos primarios, la ausencia de algún metabolito secundario no le impide la

supervivencia y son producidos en la fase exponencial de crecimiento (Figura 1).

Figura 1: Curva de crecimiento bacteriano

Los metabolitos secundarios mejor conocidos son los antibióticos, se producen en

la fase estacionaria. Para que se produzca el metabolito secundario, primero hay que

asegurar unas condiciones óptimas durante la fase exponencial. Como mecanismo de

defensa, la producción de metabolitos secundarios no se produce inmediatamente

después de la conclusión de la fase exponencial. Primero, al comienzo de la fase

estacionaria, deben hacerse resistentes a sus propios antibióticos. Se sabe que el paso de

fase exponencial a fase estacionaria se produce cuando algún nutriente del medio es

limitante. Suele tratarse de C, N o P. Al faltar algunos de estos factores, se altera la

producción de metabolitos primarios y se originan inductores de enzimas que darán lugar

a metabolitos secundarios.

12

En la siguiente figura 2 se muestra la interconexión existente entre el metabolismo

primario y secundario, en este caso los metabolitos secundarios se dividen a grandes

rasgos y considerando únicamente los grupos de mayor importancia en tres grupos:

compuestos terpénicos, compuestos fenólicos y compuestos con nitrógeno.

Figura 2. Interconexión existente entre el metabolismo Primario y Secundario.

Las relaciones existentes entre estas rutas y los grupos de metabolitos secundarios son las siguientes:

Los compuestos terpenoides se biosintetizan por las rutas MEP o MVA.

Los compuestos fenólicos por la ruta del ácido siquímico.

Los compuestos de nitrógeno fundamentalmente provienen de los aminoácidos

aromáticos y/o alifáticos.

13

En la figura 3 se muestra de manera más detallada los metabolitos secundarios y las

rutas metabólicas que le dan origen. Sin embargo, en este caso ya se detallan algunos

ejemplos de grupos de metabolitos:

Figura 3. Detalle de algunos metabolitos secundarios

Las especies de Bacillus son capaces de producir un amplio rango de metabolitos

secundarios de naturaleza y estructura muy diferente mostrando un amplio espectro de

actividades. Estos metabolitos incluyen antibióticos, pigmentos, toxinas, promotores de

crecimiento y otros compuestos bioactivos y están diseñados para capacitar a la bacteria

para sobrevivir en su ambiente natural.4 En general estos metabolitos sirven como: armas

competitivas usadas contra otras bacterias, hongos, amebas, plantas e insectos, agentes

transportadores de metales, efectores de simbiosis, hormonas sexuales y factores de

diferenciación. 5 Esta amplia variabilidad de estructuras y actividades de los compuestos

secundarios expande el potencial de la importancia industrial y biotecnológica del género

Bacillus con sus especies relacionadas.6

14

Bacillus thuringiensis es una bacteria privilegiada, ya que produce esporas como

mecanismo de sobrevivencia, forma cristales proteínicos que tienen una importante

función insecticida y además en sus fases de crecimiento cuenta con una fase estacionaria

(en la que produce la espora y el cristal) en donde se produce el metabolismo secundario,

como los metabolitos que se observan en la Figura 4.

H2N NH

HN

O

O

OH

OH

NH2

OH OH OH

NH2

O NH2

Zwittermicina A

OH

HO

O OH

acido 3,4-dihidroxibenzoico (3,4-DHB)

NH

NH

O

OH

OH

O

OH

OH

O

HO COOH

O

HN

HN

Petrobactina

NH

HN

O

O

OH

NH

HN

O

O

O

NH

HN

OO

NH2

ONH

O

O

O NH2

NH

N

Kurstakina

N

N

N

NO

CH2

HO OH

NH2

O

OH2C

OH

OH

OH

OCOOH

HOOC

OH

OPO3H2

OH

-Exotoxina (Thuringiensina)

O O

O

O

O

O

HN

HN

O OH

OH

NH

O

O

NH

O

OH

OHNH

HN

O

O

HO

HO

Bacillibactina

Figura 4: Metabolitos secundarios encontrados en B.thuringiensis.

2.2 Bacillus thuringiensis como agente de control biológico

Se estima que anualmente los insectos plaga ocasionan pérdidas del 20 al 30% de la

producción total de algunos cultivos y para controlar este problema los métodos de

control de plagas han sido dominados por el uso de insecticidas químicos sintéticos. Sin

embargo, el uso indiscriminado de éstos ha seleccionado el desarrollo de altos niveles de

resistencia en las plagas blanco, alta mortalidad en insectos benéficos y contaminación en

15

el medio ambiente. En un intento por disminuir estos problemas, los gobiernos, la

industria y los científicos han tenido que desarrollar métodos de control de plagas más

compatibles ambientalmente, que deben cumplir con ciertos requisitos como ser

altamente tóxicos para el organismo blanco, tener la capacidad de ser producidos en masa

a escala industrial y tener una vida media larga.

Para el control de insectos y evitar la diseminación de enfermedades, se han usado los

insecticidas orgánicos sintéticos como métodos químicos de combate de plagas. Sin

embargo, las múltiples propiedades que hacen esos productos utilizables (larga acción

residual y toxicidad para un amplio espectro de organismos) han provocado serios

problemas ambientales, como la contaminación del ambiente, la pérdida de efectividad

de los insecticidas y la reducción de la biodiversidad entre otros.

Entre los agentes de control biológico destacan las bacterias entomopatógenas. En los

últimos años se han desarrollado los bioinsecticidas basados en la bacteria Bacillus

thuringiensis, cuya actividad insecticida se basa en la producción de cristales tóxicos para

los insectos. 7,8

Bacillus thuringiensis fue aislado por primera vez por el bacteriólogo japonés Ishiwata

en 1901, a partir de larvas del lepidóptero Bombyx mori. Fue descrita y nombrada por

Berliner en 1911 quien aisló de larvas enfermas de Ephestia kuehniella, recogidas en

Thüringen, Alemania.8 Bacillus thuringiensis es una bacteria Gram-positiva, aerobia

estricta, que durante su ciclo de vida presenta dos fases principales: Crecimiento

vegetativo, donde las bacterias se duplican por bipartición, y Esporulación, donde al

terminarse los nutrientes del medio comienza a esporular como un mecanismo de

sobrevivencia.8

16

Figura 5: Microscopia de contraste de fase en donde se observan las esporas y cristales de B.thuringiensis

B. thuringiensis es una bacteria grampositiva, cuyo hábitat principal es el suelo, donde

es considerado parte de la población bacteriana zimógena9, aunque también ha sido

aislada de superficies de plantas, cadáveres de insectos y polvo de productos

almacenados. Es una bacteria usada como el ingrediente activo para la agricultura en los

insecticidas biológicos y para el control de vectores de enfermedades como son los

mosquitos y moscas negras en el caso de la variedad israelensis. Su ciclo de vida es simple.

Cuando los nutrientes y las condiciones ambientales son suficientes para crecer, las

esporas germinan produciendo células vegetativas que crecen y se reproducen por fisión

binaria. Las células continúan multiplicándose hasta que uno o más nutrientes, como los

azúcares, aminoácidos u oxígeno se vuelven insuficientes para continuar su crecimiento

vegetativo. Bajo esas condiciones, la bacteria esporula produciendo una endospora y un

cuerpo parasporal o cuerpo de inclusión (cristal) en donde radica su actividad

bioinsecticida. Estos cristales están constituidos de las denominadas -endotoxinas o

proteínas Cry, que se liberan sólo bajo lisis celular y se encuentran codificadas en

plásmidos extracromosomales que se pueden replicar independientemente. Se han

encontrado -endotoxinas activas contra insectos lepidópteros (mariposas), coleópteros

(escarabajos), dípteros (mosquitos), himenópteros (hormigas), ácaros y también contra

otros invertebrados como nematodos, gusanos planos y protozoarios.8

17

2.3 Melanina, un pigmento fotoprotector.

Las melaninas son pigmentos hidrofóbicos negativamente cargados, de alto peso

molecular que contienen compuestos fenólicos y/o indólicos polimerizados.10 Las

melaninas son producidas por muchos organismos. Entre los biopolímeros, las melaninas

son únicas en muchos aspectos. Algunos biopolímeros esenciales (proteínas, ácidos

nucléicos y los hidratos de carbono) han sido químicamente bien caracterizados utilizando

metodologías analíticas establecidas. Por el contrario, no hay métodos en la actualidad

disponibles que permitan determinar de una manera precisa las características químicas

de la melanina. 11

De hecho, estos pigmentos son insolubles en un amplio rango de solventes y pH, como

también difíciles de purificar como resultado de su heterogeneidad estructural. La

melanina de mamíferos existe en dos formas distintas: la eumelanina que va de color

marrón a negra, y la feomelanina que va de amarillo a naranja (Figura 6). La melanina

obtenida de la sepia (Sepia officinalis) contiene más de 98% de eumelanina y por tanto es

usada como material estándar en el análisis de la melanina negra. Consecuentemente, la

información que se tiene de las diferentes melaninas proviene de los análisis de sus

productos de degradación y de los análisis espectroscópicos. Característicamente las

melaninas son de color oscuro, insolubles en líquidos acuosos u orgánicos, resistente a

ácidos concentrados y susceptible de blanquearse con agentes oxidantes.11

Las melaninas generadas a partir de 3,4-dihidrofenilalanina (L-DOPA) por las

fenoloxidasas son referidas como eumelaninas, las cuales son negras o marrones. Las

melaninas de color amarillo son feomelaninas e incorporan cisteína con L-DOPA. Las

melaninas de color marrón derivadas del ácido homogenístico por la tirosinasa son

llamadas piomelaninas. Las melaninas formadas del acetato son típicamente negras o

marrones y son referidas como dihidroxinaftalen melaninas.

18

S

HN O

NH2

OH

OH

S

NOH

O

N

HO

O HO

O S

N OH

H2N

O OHFeomelanina

NH

NH

OH

OO

O

OH

OHO

HO

O

O

OH

NH

OH

O

Eumelanina

NH

OH

OH

5,6-dihidroxiindol monomero de los polímeros de neuromelanina

O

O

CO2H

Benzoquinoacetatomonomero de la piomelanina

Figura 6: Estructuras químicas de la A) feomelanina y la B) eumelanina

Las melaninas confieren resistencia a la luz UV ya que absorben un rango amplio del

espectro electromagnético y previenen el daño fotoinducido. Consecuentemente las

melaninas son comercialmente usadas en cremas fotoprotectoras y en gafas de sol. La

melanina protege a varios organismos de la luz UV, solar o radiación gamma. Una

producción incrementada de melanina está relacionada con una resistencia mayor del

organismo a la radiación.11

El uso de B. thuringiensis como insecticidas está limitado tal y como ya se ha

mencionado debido a que las esporas y toxinas son inactivadas por la radiación solar.

Varias formulaciones se han mostrado inestables en condiciones de campo y rápidamente

pierden sus actividades biológicas. Varios intentos para proteger a B. thuringiensis del

daño por radiación UV bajo condiciones de campo han rendido limitado éxito. Se han

desarrollado diferentes formulaciones con la adición de varios protectores químicos

contra la luz UV; sin embargo, estos protectores químicos tienen un efecto negativo en el

medio ambiente.

19

Liu y colaboradores han reportado que la producción de melanina por varios

microorganismos, los protege al daño oxidativo causado por la luz UV y por la radiación

ionizante atrapando los radicales libres. Por lo cual, la melanina se ha clasificado como un

agente fotoprotector natural lo que llevó a estos investigadores a proteger a Bacillus

thuringiensis de la radiación UV con melanina producida por estreptomicetos. Esto eliminó

el uso externo de agentes externos fotoprotectores no amigables con el medio ambiente y

resultó en formulaciones de B. thuringiensis estables,12 demostrando que la melanina es un

excelente agente fotoprotector.

En cambio, Saxena y colaboradores obtuvieron mutantes que producen melanina de

diferentes subespecies de B. thuringiensis pues ellos consiguieron las mutantes después

de tratar a B. thuringiensis con rondas sucesivas de radiación UV. Aunque comparadas con

sus cepas parentales, estas mutantes mostraron mayor resistencia a la luz UV, algunas de

ellas perdieron genes que codifican para las toxinas Cry.13

Patel y colaboradores también consiguieron mutantes después de varias rondas

sucesivas de tratar a B. thuringiensis con luz UV.14 Por otro lado Hoti y Balaraman han

conseguido mutantes mediante mutagénesis química o agentes mutagénicos químicos, ya

que ellos consiguieron aislar una mutante de B. thuringiensis productora de melanina

después de mutagénesis química e incluso detectaron L-DOPA en el medio de cultivo

indicando que la síntesis de la melanina era vía L-DOPA.15 Vilas-Boas y colaboradores,

utilizaron etil metano sulfonato como agente químico mutagenizante para obtener la

mutante productora de melanina.16

Nuestro grupo de investigación aisló una bacteria de Bacillus thuringiensis de un suelo

de Mérida Yucatán que mostró una coloración marrón en placas de cultivo en crecimiento.

Se pudo comprobar que esta cepa llamada ELI52 producía melanina, que es un agente

fotoprotector10 lo cual fue corroborado por un IR comparado con la melanina estándar

(Figura 7).17

20

Figura 7: El espectro de IR del pigmento producido por la cepa de Bt ELI52 y la melanina estándar.

El interés en esta cepa llevó a realizar varios estudios de antagonismo contra varias

bacterias dando una fuerte actividad antagónica e inhibitoria contra bacterias muy

importantes a nivel hospitalario (Figura 8). Por ello se sospechó que esta cepa podía tener

metabolitos secundarios con actividad biológica, por lo que se propuso extraer y purificar

metabolitos secundarios de esta cepa e identificarlos por diferentes técnicas

espectroscópicas.

Figura 8. Ensayo de inhibición de extracto crudo ELI52 contra diferentes bacterias.

a b

c d

21

2.4 Dicetopiperazinas

Las dicetopiperazinas son compuestos relativamente simples que se encuentran en la

naturaleza.18 Son dipéptidos cíclicos obtenidos por condensación de dos aminoácidos y

aislados de microorganismos, esponjas y de tejidos y fluidos corporales. Pueden incluso

ser parte de otras estructuras más complejas en una variedad de microorganismos.

Poseen diferentes actividades biológicas tal como, antitumoral, antifúngico y

antibactericida, y además tienen la habilidad de unirse a una amplia variedad de

receptores por lo que estas estructuras se vuelven atractivas para el descubrimiento de

nuevos compuestos como agentes terapéuticos. Son pequeños bloques heterocíclicos

conformacionalmente restringidos en los cuales la diversidad puede ser introducida hasta

en seis posiciones, la estereoquímica puede ser controlada hasta en cuatro posiciones y

son estables a la proteólisis.19 Son importantes en el descubrimiento de nuevos fármacos

debido a que tiene una estructura rígida la cual imita la conformación preferencial de los

péptidos y contiene aminoácidos restringidos embebidos dentro de la estructura sin tener

las propiedades físicas no deseadas.20 Estos esqueletos moleculares teniendo diferentes

grupos sustituyentes han vencido una de las limitaciones de los agentes medicinales

convencionales que es la típica planalidad encontrada en ellos. Estas moléculas

quiralmente enriquecidas son fácilmente sintetizadas a partir de -aminoácidos

disponibles utilizando reacciones relativamente sencillas y han sido usados como núcleos

para construir librerías en química combinacional. 21,22

Las dicetopiperazinas han sido aisladas individualmente o como mezclas de los

sobrenadantes de cultivos de microorganismos diversos como son, P. aeruginosa, P.

fluorescens, P. putida, P. alcaligenes, Proteus mirabilis, Enterrobacter agglomerans, Vibrio

vulnificus, y Citrobacter freundii. El hecho de estar presentes en diversos organismos ha

llevado a pensar que incluso están involucradas en señales de quorum sensing, que son

señales que ocurren entre células en una ecología química y es la forma de comunicación

(lenguaje químico) entre las células para saber qué ocurre afuera de ellas. 23,24

22

3. O B J E T I V O S

3.1 Objetivo general.

Extracción, purificación y caracterización de metabolitos secundarios a partir de un cultivo

bacteriano de Bacillus thuringiensis.

3.2 Objetivos particulares.

• Obtener un extracto crudo del caldo de cultivo de B. thuringiensis.

• Realizar pruebas de solubilidad al extracto crudo.

• Purificar mediante cromatografía en columna los diferentes metabolitos

secundarios.

• Caracterizar mediante técnicas de espectroscopia cada uno de estos metabolitos

secundarios.

• Probar la actividad antibacteriana de los diferentes metabolitos secundarios contra

bacterias muy importantes como lo son: Vibrio cholerae, Vibrio parahemolyticus,

Shigella, Klebsiella pneumoniae y Listeria monocytogenes.

23

4. D I S C U S I Ó N D E R E S U L T A D O S

4.1 Obtención del extracto crudo

Siguiendo la metodología descrita en la sección de materiales y métodos se ocupó

como medio de cultivo estándar el TSB, el cual contiene un buen porcentaje de nutrientes

esenciales para el microorganismo como lo son la peptona de caseína al 17%, peptona de

soya al 3%, dextrosa al 2.5%, cloruro de sodio al 5% y fosfato dipotásico al 2.5%, los cuales

le aportan una buena cantidad de nutrientes a la bacteria.

La incubación de la cepa ELI52 se llevó a cabo bajo condiciones de esterilidad, en dos

matraces de 500 mL se agregaron 250 mL de medio de cultivo TSB (cada uno), para que la

bacteria encuentre la aireación necesaria para su crecimiento en presencia de oxígeno, se

mantuvieron en agitación a 175 rpm, por 7 días a 29°C. Transcurrido este tiempo, el caldo

se centrifugó por 10 min a 6000 rpm, para que las células vegetativas se separaran del

caldo de cultivo y éste estuviera libre de células.

Cada 500 mL de caldo de cultivo libre de células se extrajeron en volúmenes de 3: 1

(disolvente: cultivo) con acetato de etilo, cloruro de metileno y acetona obteniendo los

siguientes rendimientos de extracto:

Tabla 1. Rendimientos de extracción.

Extracción Rendimiento

Acetato de etilo 100 mg/L Cloruro de metileno 10 mg/L Acetona 50 mg/L

24

En base a los resultados obtenidos en la tabla anterior, se observa que la extraccion

con acetato de etilo da mejores rendimientos, por lo que se continuó con este disolvente

para obtener más extracto crudo.

4.2 Análisis de la solubilidad del extracto crudo

El extracto crudo (Figura 9) tiene una consistencia viscosa, de color café obscuro y

olor desagradable, al cual se le realizaron pruebas de solubilidad con diferentes

disolventes (Tabla 2), demostrando que el extracto es de naturaleza polar. Este

experimento se realizó en viales con 10 mg de extracto en cada uno y 2 mL de disolvente,

agitando de vez en cuando y reposando por 8h.

Figura 9. Extracto crudo de ELI52

Tabla 2. Comportamiento de la solubilidad del extracto crudo

Disolvente Solubilidad

Hexano Insoluble

Benceno Insoluble

Acetonitrilo Precipita polvo, poca solubilidad (turbidez)

Dietil éter Poca solubilidad (turbidez)

Cloroformo Poca solubilidad (turbidez)

Acetato de etilo Mediana solubilidad (turbidez)

Diclorometano Soluble

Piridina Mayor solubilidad (turbidez)

Acetona Precipita sólido, poca solubilidad (turbidez)

Etanol Mayor solubilidad (turbidez)

Metanol Soluble

DMF Mayor solubilidad (turbidez)

DMSO Soluble

Agua Aglomerado, poca solubilidad (turbidez)

25

Posteriormente cada una de estas muestras fueron filtradas y eluidas con diversos

sistemas en placas TLC para observar el contenido de bandas, y así observar si había algo

de interés. Para esto se utilizaron sistemas desde Hexano: Acetato de etilo, hasta

Diclorometano: metanol.

Se observó que las muestras mayormente disueltas (en DMF, diclorometano,

metanol, DMSO y piridina (carriles del 1 al 5) fueron las que mostraron mayor

concentración y corrimiento en placa TLC desde un sistema diclorometano: acetato de

etilo 8:2 (Figura 10a). Posteriormente, se utilizaron diversos sistemas más polares,

encontrando el sistema óptimo de corrimiento el cual fue diclorometano: metanol 9:1,

pues toda la muestra corría, y no se quedaba en el punto de aplicación (Figura 10b). En

esta figura se observa que la muestra disuelta en diclorometano (carril 1) solubiliza toda la

muestra y en placa tiene un comportamiento más diferenciable en cuanto al bandeo, pues

las otras muestras quedaban de forma barrida en la placa en comparación con la muestra

disuelta en diclorometano.

Figura 10. De izquierda a derecha: Punto 1. Diclorometano, punto 2. DMF, punto 3. Metanol, punto 4. DMSO, punto 5. Piridina. a) diclorometano: acetato de etilo 8:2. b) diclorometano: metanol 9:1

Como se puede observar en la figura 10, hay una gran complejidad del extracto crudo,

por ello se le realizaron espectros de RMN de 1H (Figura 11) y RMN de 13C (Figura 12).

26

Figura 11. RMN

1H de extracto crudo de la cepa ELI52 a 500 MHz

Figura 12. RMN

13C de extracto crudo de la cepa ELI52 a 125 MHz

27

En estos espectros se puede observar la gran complejidad del extracto crudo tal y

como se preveía del corrimiento en TLC. Esto representaba un reto para la purificación,

debido a esto, se comenzó con una placa preparativa de (20 cm X 13 cm) la cual se corrió

en Diclorometano: metanol 9:1, posteriormente al revelarla, se observó que no se había

separado de la misma manera que en TLC, por ello se corrió una segunda vez con

diclorometano: metanol 9:1 (Figura 13).

Figura 13. Extracto crudo en placa preparativa

Esta placa se reveló en longitud de onda larga (365 nm) y corta (254 nm), en la corta

se observó barrida por lo tanto fue difícil separar las bandas, mientras que en la longitud

larga se pudo apreciar que ciertas bandas presentaban fluorescencia de color azul, verde y

naranja, por lo tanto, cada una de estas bandas se mantuvo por una noche en

diclorometano, posteriormente fueron filtradas y evaporadas para su análisis por RMN,

dando resultados poco interesantes para RMN.

Debido a estos resultados, se pensó que la concentración era muy pequeña, que no

había una buena separación y además que había pérdida de extracto crudo, por lo que

realizó una columna cromatográfica de gel de sílice en donde se utilizaron diversos

sistemas como eluyentes (tabla 3).

28

Tabla 3. Análisis del extracto crudo por columna cromatográfica

Cantidad Solvente Polaridad

1 100 ml Hexano

2 100 ml Hexano: acetato de etilo 95:5 4 100 ml Hexano: acetato de etilo 75:25 5 100 ml Hexano: acetato de etilo 50:50 6 100 ml Hexano: acetato de etilo 30:70 7 100 ml Hexano: acetato de etilo 20:80 8 100 ml Acetato de etilo 9 100 ml Acetato de etilo: diclorometano 95:5 10 100 ml Acetato de etilo: diclorometano 90:10 11 100 ml Acetato de etilo: diclorometano 80:20 12 100 ml Acetato de etilo: diclorometano 70:30 13 100 ml Acetato de etilo: diclorometano 60:40

14 100 ml Acetato de etilo: diclorometano 50:50 15 100 ml Acetato de etilo: diclorometano 40:60 16 100 ml Acetato de etilo: diclorometano 30:70 17 100 ml Acetato de etilo: diclorometano 20:80 18 100 ml Acetato de etilo: diclorometano 10:90

19 100 ml Diclorometano 20 100 ml Acetato de etilo: acetona 95:5 21 100 ml Acetato de etilo: acetona 90:10 22 100 ml Acetato de etilo: acetona 80:20

23 100 ml Acetato de etilo: acetona 70:30 24 100 ml Acetato de etilo: acetona 60:40 25 100 ml Acetato de etilo: acetona 1:1 26 100 ml Acetato de etilo: acetona 40:60 27 100 ml Acetato de etilo: acetona 30:70

28 100 ml Acetato de etilo: acetona 20:80 29 100 ml Acetato de etilo: acetona 10:90 30 100 ml Acetona

31 100 ml Acetona: metanol 95:5


33 100 ml Acetona: metanol 80:20 34 100 ml Acetona: metanol 70:30





39 100 ml Acetona: metanol 20:80 40 100 ml Acetona: metanol 10:90

29

Para poder discernir que sistemas podían tener compuestos interesantes y por lo

tanto, por donde se debía de comenzar, como una prueba de exclusión se utilizaron las

pruebas biológicas contra bacterias (antibiogramas) como Micrococcus luteus,

staphylococcus aureus, staphylococcus saprophyticus, Bacillus cereus entre otros,

observándose que las fracciones que bajaban con los sistemas de acetato de etilo:

acetona mostraban inhibición, aunque menor que el efecto del extracto crudo (Figura 14).

Figura 14. Prueba de antibiograma del extracto crudo purificado con acetato de etilo: acetona.

Posteriormente se realizó otra columna cromatográfica en donde los sistemas

eluyentes utilizados fueron los siguientes:

Tabla 4. Columna con acetato: acetona como eluyentes

Cantidad Solvente Polaridad

1 300 mL Hexano 2 200 mL Acetato de etilo 3 100 mL Acetato de etilo: acetona 95:5 4 200 mL Acetato de etilo: acetona 90:10 5 100 mL Acetato de etilo: acetona 85:15 6 100 mL Acetato de etilo: acetona 80:20

De esta columna se analizó tubo a tubo el bandeo por TLC, obteniendo los siguientes

productos:

Ac/Ac

30

4.3 Elucidación del Ciclo (L-Pro-L-Leu) (3S,8aS)-hexahidro-3-

isobutilpirrolo[1,2-a]pirazin-1,4-diona.

Extracto crudo

Purificación por columna

AcOEt:Acetona, 95:5

1

HN

N

O

OH

Esquema 1. Obtención del producto 1

El compuesto 1 se obtuvo a partir de la elución de la columna cromatográfica con 100 mL

de acetato de etilo: acetona 95:5, se observó una banda con un factor de retención (Rf) =

0.40 y una más por encima de ella aunque muy tenue, por lo que, al observar la pureza, se

realizó una RMN de 1H y 13C.

El análisis del espectro de RMN de 1H para el compuesto 1 fue el siguiente: El

primer hidrógeno que se asignó fue el de la amina, que por efecto de electronegatividad

se desplaza a campo bajo, por esta razón, se integró para un hidrógeno, además, es una

señal ancha y simple (características principales de grupos NH y OH) lo que demuestra que

no está acoplándose con ningún hidrógeno. Otras dos señales muy bien definidas son los

dos dobles que se encuentran en 1.0 ppm, que muestran multiplicidad doble lo cual indica

que se está acoplando con otro hidrógeno próximo, además integran para 3H permitiendo

corroborar que son los hidrógenos de dos metilos de un isopropilo.

En el espectro de RMN de 13C se pudieron observar la presencia de 11 carbonos, dos

de ellos con un desplazamiento de 170 y 166 ppm, lo cual sugiere la presencia de dos

carbonilos. Posteriormente se obtuvieron los espectros de 2D COSY y HSQC, así como el

DEPT. Se le realizó espectrometría de masas de alta resolución por FAB y con todos estos

datos se realizó un análisis para la elucidación estructural del compuesto 1.

Del análisis de la espectrometría de masas de alta resolución por FAB se pudo

observar una m/z de 211.1444 encontrada para una fórmula molecular de

[C11H18N2O2+H]+, en la cual primeramente se determinó el número de insaturaciones con

la siguiente fórmula:

31

U= 4

U=(n° C * 2 + 2) - n° H

2 En donde:

U= número de insaturacionesn° C = número de Carbonosn° H = número de Hidrógenos

Y teniendo en cuenta que por cada Nitrógeno se aumenta 1C y 1H, la fórmula sustituida

queda de la siguiente manera:

U=(13* 2 + 2) - 20

2

El análisis del espectro de RMN de 1H para el compuesto 1 fue el siguiente (Figura 15):

32

Fig

ura

15

. Esp

ectr

o d

e R

MN

de

1 H d

e 5

00

MH

z d

el c

om

pu

esto

1

HN

N

O OH

34

56

12

9

8

7

10

12

11

13

33

Se observa en 4.13 ppm una señal doble de dobles que integra para un hidrógeno y se

asignó como H-6. En 4.01 ppm se observa una señal doble de dobles que integra para un

hidrógeno y se asignó como H-9. Ambos están acoplándose con los dos hidrógenos

diasterotópicos adyacentes.

Esto genera controversia y una dificultad para la correcta asignación, por ello, se

utilizó un espectro 2D de RMN COSY (figura 16), el cual permitió hacer una correcta

asignación, donde se observó que la señal doble de dobles en 4.13 ppm se acopla con los

hidrógenos H- 5a y H- 5b y que la señal doble de dobles en 4.01 ppm se acopla con los

hidrógenos H-10a y H-10b.

Figura 16. Espectro 2D de RMN COSY de 500 MHz del compuesto 1

También se observa la señal simple en 5.80 ppm asignado al H-8 del grupo amino el

cual no se está acoplando con otro hidrógeno, posteriormente se asigna como H-11 a la

señal múltiple en 1.73 ppm que se está acoplando con ambos metilos H-12 y H-13, los

cuales son señales dobles en 1.0 ppm y en 0.95 ppm respectivamente. Se observa que

HN

N

O

OH

34

56

129

8

7

101211

13

34

este H-11 en 1.73 ppm se acopla con un hidrógeno más, el cual es el H-10 en 2.07 ppm,

pero de éste se espera un acoplamiento geminal que también puede observarse,

asignando así a la señal múltiple H-10a en 1.55 ppm y a la señal múltiple H-10b en 2.07

ppm, se observa que ambos hidrógenos se acoplan con la señal doble de dobles en 4.01

ppm asignando inequívocamente al H-9. Se observa que el H-6 en 4.13 ppm se acopla con

dos hidrógenos los cuales muestran acoplamiento entre ellos mismos, lo que permite

asignar al H-5a como un múltiple en 2.35 ppm y al H-5b como un múltiple en 2.12 ppm

por su acoplamiento geminal, por último, se asignó al H-3 como una señal múltiple en 3.54

ppm acoplado con el H- 4b como una señal múltiple en 2.05 ppm y con el H- 4a como una

señal múltiple en 1.91 ppm, los cuales al pertenecer a un ciclo y al no ser una molécula

plana, muestran desplazamientos diferentes, además el H-3 en 3.54 ppm al estar unido a

un átomo de nitrógeno le jala densidad electrónica y por ello es que está más desplazado.

Para una correcta asignación del espectro de RMN de 13C se utilizó un espectro 2D de

RMN HSQC para la asignación de carbono (figura 17):

Figura 17. Espectro 2D de RMN HSQC de 500 MHz del compuesto 1

HN

N

O

OH

34

56

129

8

7

101211

13

35

Debido a este espectro, se pudo asignar cada hidrógeno con su respectivo carbono, y

como se muestra señalado en rojo en el espectro, se observa que el átomo de carbono 4

en 22.7 ppm corresponde a los 2 hidrógenos H-4a y H-5b, el átomo de carbono 5 en 28.1

ppm corresponde a los hidrógenos geminales H-5a y H-5b, y que el átomo de carbono 10

en 38.6 ppm corresponde al H-10a y el H-10b, corroborando así, la asignación correcta de

cada uno.

Con estos datos se pudo asignar correctamente el espectro de RMN de 13C (figura 18):

Figura 18. Espectro de RMN de 13

C a 125 MHz del compuesto 1

En 166.1 ppm y 170.1 ppm se pueden apreciar los carbonos C-1 y C-7

respectivamente, los cuales son los carbonilos de la molécula, en 59.0 ppm se encuentra

el C-6 el cual es un CH, en 53.3 ppm el C-9 el cual es un CH, en 45.5 ppm el C-3 el cual es

un CH2, en 38.6 ppm el C-10 el cual es un CH2, en 28.1 ppm el C-5 el cual es un CH2, en

HN

N

O

OH

34

56

129

8

7

101211

13

36

24.7 ppm el C-11 el cual es un CH, en 23.2 el C-12 el cual es un CH3, en 22.7 ppm el C-4 el

cual es un CH2 y en 21.2 ppm el C-13 el cual es un CH3.

Posteriormente para observar el tipo de carbono se realizó un espectro de RMN DEPT -

135 (figura 19):

Figura 19. Espectro de RMN DEPT- 135

En este espectro se pueden observar las señales negativas para CH2 y positivas para

CH y CH3, lo que corrobora que la asignación de carbono e hidrógeno es correcta.

El compuesto 1 tenía un aspecto cristalino por lo que, se buscaron sistemas

adecuados para cristalizar este compuesto y esto fue posible mediante una mezcla de

diclorometano: hexano con lenta evaporación, se obtuvo un pequeño cristal. Su difracción

de rayos X (figura 20) corroboró la estructura propuesta para esta molécula e indicó la

HN

N

O

OH

34

56

129

8

7

101211

13

37

configuración absoluta de los centros estereogénicos, observando que son (6S, 9S). Se

determinó que el compuesto 1 es el compuesto L-Prolina-L-Leucina.

Figura 20. Difracción de rayos X del compuesto 1

4.4 Elucidación del Ciclo (L-Pro-L-Val) (3S,8aS)-hexahidro-3-

isopropilpirrolo[1,2-a]pirazin-1,4-diona.

HN

N

O

O

Extracto crudo


AcOEt:Acetona, 90:10

2


El compuesto 2 se obtuvo a partir de la elución de la columna cromatográfica con 200

mL de acetato de etilo: acetona 90:10, se observó una banda azul intensa con un factor de

retención (Rf) = 0.45, por lo que, al observar la pureza, se le realizó de una manera muy

similar al anterior compuesto una RMN de 1H y 13C.

Basándose en el compuesto 1, el análisis fue similar en este segundo compuesto; el

primer hidrógeno que se asignó fue el de la amina, que por efecto de electronegatividad

HN

N

O

O

ciclo(L-Pro-L-Leu)

(s)

(s)

38

U= 4

se desplaza a campo bajo, por esta razón, se integró para 1H. El número de carbonos fue

de diez y las señales que se observaban en ambos espectros eran muy similares al

compuesto 1. Por lo que la elucidación estructural se procedió de la misma manera.

Se obtuvo la espectrometría de masas de alta resolución por FAB observándose una

m/z de 197.1284 encontrada para una fórmula molecular de [C10H16N2O2+H]+, en la cual

primeramente se determinó el número de insaturaciones con la siguiente fórmula:

U=(n° C * 2 + 2) - n° H

2

U=(12* 2 + 2) - 18

2

Posteriormente mediante la espectrometría de masas por impacto electrónico, se

obtuvo el siguiente espectro (figura 21):

Figura 21. Espectro de masas por impacto electrónico del compuesto 2

Ion

molecular

Pico base

39

Por lo que se propone la siguiente fragmentación (Esquema 3):

HN

N

O

O

196

-43 HN

N

O

O

153

-28 HN

N

O

O

128

-57 NH2

NH2

O 74

Esquema 3. Fragmentación por impacto electrónico del compuesto 2

De esta manera la comparación de los picos más representativos es la siguiente:

Tabla 5. Comparación de los picos calculados y propuestos

Picos calculados Picos propuestos

196 196 Ion molecular 154 153 pico base 125 128 70 74

El análisis del espectro de RMN de 1H para el compuesto 2 fue el siguiente:

40

Fig

ura

21

. Esp

ectr

o d

e R

MN

de

1 H d

e 5

00

MH

z d

el c

om

pu

esto

2

HN

N

O OH

34

56

12

9

87

10

11

12

41

En este espectro se observan las dos señales dobles que integran para tres hidrógenos, se

encuentran en 1.0 ppm y en 0.90 ppm y se acoplan con la señal doble de séptuples en

2.69 ppm, la cual integra para un hidrógeno, razón por la que muestran esta multiplicidad,

esto permite asignar inequívocamente a los hidrógenos 11 (en 1.0 ppm), 12 (en 0.90 ppm)

y 10 (en 2.69ppm). También se observa en 3.94 ppm una señal doble de dobles y 4.09

ppm una señal doble, ambas integran para un hidrógeno, estos son hidrógenos de los dos

centros estereogénicos además están acoplándose con los 2 hidrógenos adyacentes que

son diasterotópicos el H-5 y el H-10, en comparación con el compuesto 1 (figura 22a) se

observa una diferencia en el hidrógeno 9 respecto al compuesto 2 (figura 22b):

Figura 22. Comparación del H-9 del compuesto 1 (a) y compuesto 2 (b)

Esta comparación, permitió diferenciar que se trataba de dos compuestos diferentes

a pesar de la similitud de ambos espectros, el hidrógeno 9 del compuesto 2 muestra una

señal doble en 3.94 ppm que indica que se está acoplando a un hidrógeno, mientras que

el hidrógeno 9 del compuesto 1 es una señal doble de dobles que indica que se acopla a

dos hidrógenos diasterotópicos.

Posteriormente siguiendo la misma metodología de elucidación; se continuó con un

espectro 2D de RMN COSY para observar los acoplamientos entre cada hidrógeno (figura

23):

a) b)

HN

N

O

OH

34

56

129

87

10

11

12

HN

N

O

OH

34

56

129

8

7

101211

13

42

Figura 23. Espectro 2D de RMN COSY del compuesto 2

En este espectro se asigna como H-10 a la señal múltiple en 2.69 ppm que se está

acoplando con ambos hidrógenos con señales dobles H-11 en 1.0 ppm y H-12 en 0.90

ppm, posteriormente se observa que este H-10 se acopla con un hidrógeno más, el cual es

el H-9 como una señal doble en 3.94 ppm, posteriormente se observa una señal doble en

4.09 ppm que es el H-6 el cual se acopla con dos hidrógenos los cuales muestran

acoplamiento entre ellos mismos, lo que permite asignar al H-5a como una señal múltiple

en 2.41 ppm y al H-5b como señal múltiple en 2.01 ppm por su acoplamiento geminal, por

último, se asignó al H- 4b en 1.88 ppm como señal múltiple y el H- 4a en 1.94 ppm como

señal múltiple y al H- 3b en 3.66 ppm y el H- 3a en 3.53 ppm, los cuales al pertenecer a un

ciclo y al no ser una molécula plana, muestran desplazamientos diferentes.

Posteriormente se realizó un espectro 2D de RMN HSQC para la asignación correcta

de carbono (figura 24):

HN

N

O

OH

34

56

129

87

10

11

12

43

Figura 24. Espectro 2D de RMN HSQC del compuesto 2

Con este espectro, se pudo asignar cada hidrógeno con su respectivo carbono, y

como se muestra señalado en rojo en el espectro, se observan los hidrógenos geminales

H-5a y H-5b, correspondientes al carbono 5 en 28.5 ppm y se observan los hidrógenos H-

4a y 4b y H-3a y 3b, acoplándose con su carbono correspondiente C-4 en 22.4 ppm y C-3

en 45.1 ppm.

Con estos datos se pudo asignar correctamente el espectro de RMN de 13C

asignado (figura 25):

HN

N

O

OH

34

56

129

87

10

11

12

44



Este espectro, el cual se resolvió con el HSQC, muestra la diferencia con el compuesto

1, el cual tiene un carbono de más en 24.7 ppm. De esta manera se corroboró que se

trataba de 2 compuestos diferentes.

Posteriormente para corroborar el tipo de carbono se realizó un espectro de RMN

DEPT -135 (figura 26):

HN

N

O

OH

34

56

129

87

10

11

12

45

Figura 26. Espectro de RMN DEPT- 135 del compuesto 2

En este espectro se pueden observar las señales negativas para CH2 y positivas para

CH y CH3, así se corrobora que la asignación de carbono e hidrógeno es la correcta.

4.5 Elucidación del Ciclo (L-Pro-L-Phe) (3S,8aS)-3-benzil-

hexahidropirrolo[1,2-a]pirazin-1,4-diona.

HN

N

O

O

Extracto crudo



3


HN

N

O

OH

34

56

129

87

10

11

12

46


mL de acetato de etilo: acetona 90:10, se observó una única banda con un factor de

retención (Rf) = 0.60, por lo que al observar la pureza, se procedió al mismo análisis que

para los compuestos anteriores.

Se obtuvo el espectro de RMN 1H en donde destacaba en 7.2 ppm un múltiple

característico de un grupo fenilo y la mayor parte de señales similares a los espectros

anteriores. En el espectro de RMN 13C se observaban doce señales de las cuales dos eran

intensas (en la región de los compuestos aromáticos). De forma similar se procedió a la

elucidación estructural del compuesto 3.

Se le realizó espectrometría de masas de alta resolución por impacto electrónico

observándose una m/z de 244.1177 encontrada para una fórmula molecular de

[C14H16N2O2]+, en la cual primeramente se determinó el número de insaturaciones con la

siguiente fórmula:

U=(n° C * 2 + 2) - n° H

2

U=(16* 2 + 2) - 18

2

U= 8



47

Figura 27. Espectro de masas por impacto electrónico


HN

N

O

O

M 244

HN

NH

O

O

110

-82

O28

HN

N

O

O

154

-44

-154

91

-90



Ion

molecular

Ion tropilio

Pico padre

48



244.213 Ion molecular

154.118 154

107.083 110

91.087 Ion tropilio

28.033 Pico padre

El análisis del espectro de RMN de 1H para el compuesto 3 fue el siguiente (Figura 28):

Como característica principal se observa en 7.2 ppm un grupo de señales que se

caracterizan por pertenecer a grupos fenilo, los cuales al integrar corroboran los cinco

hidrógenos, los cuales indican una sustitución ipso en el anillo, la primera integración para

un hidrógeno, fue el de la amina, que por antecedentes en los productos obtenidos, es un

hidrógeno similar, posteriormente se observan dos grupos de señales doble de dobles, en

donde se observa una inversión del desplazamiento entre el H-6 y el H-9 con respecto a

las moléculas anteriores (figura 29):

Figura 29. Comparación de los compuestos. (a) Compuesto 3 y (b) Compuesto 1

Esta inversión surge debido a que el compuesto 3 ahora tiene como sustituyente un

grupo fenilo y por ello se observa una desprotección electrónica en el H-9 desplazado a

4.28 ppm, con diferencia al H-9 del compuesto 1 desplazado en 4.01 ppm.

En el espectro de RMN de 1H también se puede observar una señal bien definida en

2.77 ppm un doble de dobles, en el cual se asignó al H-10, el cual se trata de un hidrógeno

diasterotópico, que se acopla con el hidrógeno del carbono estereogénico H-9. Todos los

HN

N

O OH

1´

2¨

10

3´

4´56́

´9

87

12

34

56

49

demás hidrógenos se encuentran como señales múltiples las cuales se resolvieron

mediante un espectro 2D de RMN COSY (figura 30):


En este espectro se observa el acoplamiento del H-6 en 4.08 ppm con ambos

hidrógenos diasterotópicos del anillo de la prolina H-5a y 5b (señales múltiples en 2.34

ppm y 2.03 ppm respectivamente), también se observa el acoplamiento geminal de

ambos, se observan dos acoplamientos más, que se asignan como H-3 en 3.60 ppm

acoplado con el H-4 en 1.90 ppm, que pertenecen a los hidrógenos del ciclo-prolina y

debido a esto, se diferencian entre ellos.

Por último, se observa el acoplamiento del hidrógeno H-9 en 4.28 ppm con el

hidrógeno H-10b (señal doble de dobles) en 2.77 ppm, y con una señal múltiple, que por

deducción se asignó como H-10a en 3.64 ppm, de igual manera se observa el

acoplamiento geminal de ambos.

Posteriormente se realizó un espectro HSQC en el que se determinó la correlación de

los hidrógenos con sus respectivos carbonos (figura 31):


Lo más destacable de este espectro, además de la asignación de todos los carbonos,

es que se observa encerrado en los cuadros en rojo que los hidrógenos geminales H-5a y

5b y los hidrógenos geminales H-10a y 10b están correctamente asignados en el espectro

de hidrógeno, ya que correlacionan para el mismo carbono cada uno de ellos, y se observa

que los hidrógenos H-3a y 3b y H-4a y 4b tienen un ligero desplazamiento entre ellos,

cada uno correlaciona con su propio carbono, además el H-3 se asigna en 3.6 ppm y al H-4

en 1.9 ppm debido a que el hidrógeno H-3 está directamente unido a un átomo de

nitrógeno, el cual está jalando densidad electrónica en este hidrógeno adyacente.

50

Con estos datos se pudo asignar correctamente el espectro de RMN 13C (figura 33):



En este espectro se observan los carbonilos C-7 y C-1 desplazados en 169.3 ppm y

165.0 ppm como los compuestos anteriores, y de manera destacable se observan los

carbonos del fenilo, C-3´,5´ en 129.3 ppm, los carbonos C- 2´,6´ en 129.0 ppm y el carbono

C-1´ en 135.8 ppm, los demás carbonos de la molécula permanecen con el mismo

desplazamiento que los compuestos anteriores.

Por último, para corroborar el tipo de carbono se realizó un espectro de RMN DEPT

(figura 34):


En este espectro se confirmó la asignación correcta de los carbonos orto, meta y para

son CH, igual que los carbonos C-6 y C-9, los carbonos negativos definidos como CH2,

corroboran la asignación correcta de los carbonos C-3, C-10, C-5 y C-4.

4.6 Elucidación del Ciclo (L-Pro-L-Tyr) (3S,8aS)-3-(4-hidroxibenzil)-

hexahidropirrolo[1,2-a]pirazin-1,4-diona.

HN

N

O

O

Extracto crudo



4

HO


51


mL de acetato de etilo: acetona 85:15, se observó una única banda con un factor de

retención (Rf) = 0.65, se procedió al mismo análisis que para los compuestos anteriores.

Se obtuvo el espectro de RMN 1H en donde destacaba en aproximadamente 7.0 ppm

un par de señales dobles, sistema característico de un grupo fenilo sustituido en para y la

mayor parte de señales similares a los espectros anteriores. En el espectro de RMN 13C se

observaban 12 señales de las cuales dos eran intensas (en la región de aromáticos). De

forma similar se procedió a la elucidación estructural del compuesto 4.

Se le realizó espectrometría de masas de alta resolución por impacto electrónico

observándose una m/z de 260.1161 encontrada para una fórmula molecular de

[C14H16N2O3], en la cual primeramente se determinó el número de insaturaciones con la

siguiente fórmula:

U=(n° C * 2 + 2) - n° H

2

U=(16* 2 + 2) - 18

2

U= 8



Figura 35. Espectro de masas por impacto electrónico del compuesto 4


52

HN

N

HO

O

O

260

-17 HN

N

O

O

243

- 91 HN

N

O

O

152

- 28

HN

N

O

O

124

- 15 HN

NH

O

O

109

- 40NH2

NH2

O69





260 260 Ion molecular 244 243 154 152 pico padre 125 124 107 109 70 69

El análisis del espectro de RMN de 1H para el compuesto 4 fue el siguiente:

En el espectro se observa un par de señales dobles en 7.0 ppm sistema

característico de un grupo fenilo sustituido en para y cada señal doble integra para 2H,

posteriormente se asignó al H-8 que corresponde a la amina secundaria en 5.7 ppm

debido a la similitud de los compuestos anteriores; principalmente del compuesto 3 (L-

Pro- L-Phe), en el cual se puede apreciar que el espectro es muy similar en cada señal,

excepto en aproximadamente 3.6 ppm (figura 37):

53

Figura 37. Ampliación en 3.6 ppm de los espectros de RMN 1H de a) 3 (L-Pro-L-Phe) y de

b) 4 (L-Pro-L-Tyr)

Como se puede observar el compuesto 3 tiene una integración de 3H, los cuales

corresponden a un hidrógeno geminal 10a y a los hidrógenos 3a y 3b, mientras que en el

compuesto 4 se observa la integral para 4H, dos de ellos corresponden a los hidrógenos 3a

y 3b en 3.60 ppm y uno al hidrógeno geminal 10a en 3.48 ppm (asignados correctamente

en espectro COSY), observando que 1 hidrógeno sobra en esta integración, lo que indica

que probablemente aquí se encuentra el hidrógeno 7’ del grupo OH.

Para resolver los acoplamientos de cada hidrógeno de la molécula, se realizó un espectro

COSY (figura 38):

54


En este espectro se observa el acoplamiento del H-6 (señal doble de dobles en 4.10

ppm) con ambos hidrógenos diasterotópicos del anillo de la prolina H-5a (señal múltiple

en 2.34 ppm) y 5b (señal múltiple en 1.96 ppm), también se observa el acoplamiento

geminal de ambos, se observan dos acoplamientos más, que se asignan como H-3 (señales

múltiples en 3.60 ppm) acoplado con el H-4 (señales múltiples en 2.0 ppm), ambos son

hidrógenos del ciclo-prolina y se diferencian entre ellos como H-3a, H-3b y H-4a y H-4b. Se

observa el acoplamiento del hidrógeno H-9 (señal doble de dobles en 4.23 ppm) con el

hidrógeno H-10b (señal doble de dobles en 2.74 ppm), y con H-10a (señal doble de dobles

en 3.48 ppm), de igual manera se observa el acoplamiento geminal de ambos. Finalmente

como lo más importante en este compuesto, se observa que el hidrógeno 7’ del grupo OH

se acopla con los hidrógenos H3´-H5´.

55

Posteriormente se realizó un espectro HSQC en el que se determinó la correlación de

los hidrógenos con sus respectivos carbonos (figura 39):


Como se observa encerrado en los cuadros punteados en azul, los hidrógenos

geminales H-5a y 5b y los hidrógenos geminales H-10a y 10b están correctamente

asignados en el espectro de hidrógeno, pues correlacionan para el mismo átomo de

carbono C-5 en 28.4 ppm y C-10 en 35.9 ppm, y se observa que los hidrógenos H-3a y 3b

correlaciona con el C-3 en 45.3 ppm y H-4a y 4b correlacionan con el C-4 en 22.5 ppm.

Con estos datos se pudo asignar correctamente el espectro de RMN 13C (figura 40):

56



En este espectro se pueden observar doce carbonos de la molécula, pero para poder

elucidar a los carbonos cuaternarios, se muestra una comparación con el compuesto 3

(figura 41):

57

Figura 41. Comparación de los compuestos 4 con 3

Esta comparación resultó muy útil para observar el comportamiento de los carbonos del

compuesto 4 con un grupo hidroxi sustituido en posición para en el grupo fenilo, como se

puede observar, los carbonilos se encuentran desplazados de manera similar en cada

compuesto, en cambio, se puede observar que el C1’ se desplaza a campo bajo, debido a

que el grupo OH mete densidad al anillo.

Por último, para observar los tipos de carbonos de la molécula se realizó un espectro

de RMN DEPT (figura 42):

58


El compuesto 4 no tiene ningún CH3 por ello es que se diferencian los CH2 hacia abajo

y los CH hacia arriba, lo que indica la correcta asignación de cada átomo de carbono.

Este compuesto 4 identificado como L-Pro- L-Tyr; tiene un estado físico sólido en

forma de polvo. Sin embargo, este compuesto se logró identificar en otra columna

cromatográfica, eluída con 100 mL de acetato de etilo: acetona 80:20 con un Rf= 0.65,

como un cristal blanco, el cual al principio se trató como si fuera otro compuesto diferente

del 4, el cual se denominó como compuesto 5. Se le realizaron todas las espectroscopías

que para los compuestos anteriores.

La espectrometría de masas de alta resolución por impacto electrónico señaló una masa

de 260.1165 con una fórmula molecular C14 H16N2O3, con ocho insaturaciones, la cual era

idéntica al compuesto 4.

59

El espectro de RMN de 1H también resultó igual al compuesto 4, excepto por una señal

ancha en 6.15 ppm que correspondía al grupo OH del compuesto, señal que no estaba en

el espectro de RMN de 1H del compuesto 4.

La otra diferencia radica en la integración en 3.60 ppm que en el compuesto 4 es

de cuatro hidrógenos y para éste compuesto, en la misma región, es de tres hidrógenos,

como era lógico de prever (figura 44):

Figura 44. Comparación de los compuestos 5 con 4

Estos datos indican que ambos compuestos son lo mismo, se trata de la misma

estructura pero con formas de cristalización diferente, lo cual explica porque uno es polvo

y el otro es cristal. Un mismo compuesto puede cristalizar con más de una estructura. Se

trata de la misma molécula pero se apila en el espacio de varias formas distintas creando

estructuras cristalinas diferentes. Se les llama polimorfos y al fenómeno polimorfismo y es

de vital importancia.

El término multidisciplinar “polimorfismo”, del griego poli (varios) y morfos (formas),

indica la diversidad de un fenómeno, hecho u objeto. En el mundo de la química aparece

por primera vez cuando Mitscherling en 1882, durante el estudio de arseniatos y fosfatos,

observó que composiciones idénticas cristalizaban con diferentes formas. Ello llevó a

sospechar en principio y a demostrar más tarde que algunas especies químicas son

capaces de agruparse en el espacio de forma variada, con lo que originan fases cristalinas

con propiedades diversas en cada caso. Por lo que si un fármaco presenta dos o más

polimorfos, se debe a que a pesar de que son identidades químicamente idénticas pueden

dar compuestos físicamente diferentes y consecuentemente las características que

derivan de su estructura en estado sólido también difieren. Tales propiedades son de tipo

60

físico (dureza, densidad, conductividad eléctrica o térmica), fisicoquímico (adsorción,

estabilidad, punto de fusión), químico (reactividad, estabilidad, solubilidad, superficie

específica), tecnológico (piezoelectricidad, magnetismo, refracción, reflexión y absorción

de la luz), farmacológico (biodisponibilidad, inefectividad, toxicidad, contraindicaciones,

efectos secundarios), etc. El ejemplo más conocido de polimorfismo es el del carbón, el

cual puede existir en forma de grafito o como diamante.

4.7 Prueba de actividad antibacteriana de los compuestos

obtenidos.

El objetivo inicial de este trabajo fue la extracción de compuestos a partir de un

extracto crudo, en el cual, sus componentes eran desconocidos, además, se partió de

purificar aquella fracción en la que usando acetona al 100% mostraba una inhibición

contra bacterias, aunque no con la misma magnitud de inhibición en la que inhibía el

extracto crudo proveniente de la extracción con acetato de etilo.

Así que, con estos cuatro compuestos obtenidos, incluidos los polimorfos (4 y 5), los

cuales no son los únicos en el extracto crudo, se realizaron pruebas de resistencia o

sensibilidad (antibiogramas) con bacterias importantes a nivel hospitalario. Tal es el caso

de las bacterias Vibrio parahemolyticus (causante de gastroenteritis), Vibrio cholerae

(causante del cólera), Klebsiella pneumoniae (causante de infecciones en tracto urinario,

neumonía, e infecciones nosocomiales), Listeria monocytogenes (causante de la listeriosis,

abortos, meningoencefalitis y meningitis) y Shigella spp (causante de la disentería). Cabe

mencionar que los tratamientos de erradicación se llevan a cabo con fármacos como la

ciprofloxacina que son del grupo de las fluoroquinolonas, tetraciclinas y cloranfenicol. Lo

que demuestra que estas bacterias son difíciles de inhibir y es la razón por la que hay una

constante búsqueda de nuevos fármacos para el tratamiento de estas infecciones.

61

Se realizó un ensayo, en donde se observó que el compuesto 2 (ciclo (L-Pro-L-Val)),

inhibió a la mayoría de las bacterias sin necesidad de mezclar con otros compuestos como

se observa en la figura 46 encerrado en rojo:

Figura 46. Pruebas de inhibición del compuesto 2. a) V. parahemolitycus, b) V. cholerae, c) K. pneumoniae, d)

L. monocytogenes, e) Shigella spp.

Posteriormente, algo importante es que los compuestos 4 (polvo) y 5 (cristal), los

cuales son polimorfos, muestran diferentes comportamientos en cuanto a la inhibición,

tanto solos como en mezcla (tabla 10):

Tabla 8. Antagonismo de los compuestos 4 y 5:

Producto Vibrio parahemolyticus

Vibrio cholerae

Klebsiella pneumoniae

Listeria monocytogenes

Shigella

4 0.55 0.20 0.55 0.40 0.30 5 0.30 0.40 0.40 R 0.30

4 + 5 0.30 0.20 0.40 0.20 0.20

R= resistente, Halo de inhibición medido en cm.

Se puede observar en la tabla 8, que el compuesto 4 tiene más actividad

antagónica en la mayoría de las bacterias (mostrado en rojo), incluso se puede observar

que el compuesto 5 no tiene actividad con una bacteria (mostrado en azul) y utilizadas en

mezcla el efecto es el indeseado mostrando antagonismo y no sinergismo, efecto que no

se observó en la mayoría de las mezclas de los otros compuestos. Este dato concuerda con

los datos de la literatura en donde los polimorfos pueden tener diferente actividad

biológica.

62

5. C O N C L U S I O N E S

Se obtuvo un extracto crudo a partir de un cultivo de B. thuringiensis cuyo análisis

espectroscópico por RMN de 1H y 13C mostró una gran complejidad de

composición.

Se realizaron las pruebas de solubilidad, mostrando una alta polaridad de los

compuestos.

A pesar de esta gran complejidad, se encontraron los sistemas adecuados para la

separación de cinco productos puros mediante cromatografía en columna.

Por medio de todas las técnicas espectroscópicas y espectrométricas se pudieron

identificar los cinco compuestos elucidando su estructura. Estos compuestos son

dicetopiperazinas (DCP) que tienen una gran contribución en el campo de la

medicina y la agricultura.

63

Se pudo obtener la difracción de rayos X de una de ellas confirmando su estructura

y estableciendo su configuración absoluta como (S,S).

El compuesto L-Pro-L-Tyr presentó dos formas diferentes (polimorfos) uno en

forma de polvo y otro en forma de cristal.

Se comprobó mediante antibiogramas que estos compuestos tienen actividad

antibacteriana contra bacterias de gran interés médico como lo son V. cholerae, V.

parahemolitycus, Klebsiella pneumoniae, Shigella spp y L. monocytogenes.

El compuesto L-Pro-L-Val presentó mayor actividad antagónica que los demás

compuestos.

Se observó que los polimorfos 4 y 5 presentan diferente actividad antagónica

comprobando que el polimorfismo afecta las propiedades farmacéuticas.

64

6. D E S A R R O L L O E X P E R I M E N T A L

6.1 Diagrama general de trabajo

Inocular caldo TSB con Bacillus thuringiensis

cepa ELI52

Incubar a 29°C / 7 días / 200rpm

Centrifugar a 6000rpm / 10 min

Extraer el caldo con acetato de etilo en

relación 3: 1

Concentrar la fase orgánica

Analizar la solubilidad Analizar mediante

cromatografía en capa fina

Purificar en columna cromatográfica

Analizar las fracciones purificadas

65

6.2 Materiales y métodos

La esterilidad en el proceso de inoculación se aseguró en una campana de flujo laminar

AYSPEL-aparatos modelo CFL-A2. La incubación se mantuvo en incubadora con agitación

orbital AYSPEL-aparatos modelo INO 5-50. La centrifugación celular se llevó a cabo en

centrífuga Hettich ZENTRIFUGEN modelo EBA 20.

Los espectros de RMN de 1H, 13C, COSY, HSQC y DEPT se determinaron en espectrómetro

Bruker Advance Ultrashield 500MHz, utilizando cloroformo deuterado (CDCl3) como

disolvente y tetrametilsilano (TMS) como referencia. Los valores de los desplazamientos

químicos ( ) se encuentran en partes por millón (ppm) respecto al TMS y las constantes de

acoplamiento (J) en Hertz (Hz). Para indicar la multiplicidad de las señales en espectros de

1H se utilizan las abreviaturas: (s) simple, (d) doble, (t) triple, (m) múltiple, (dd) doble de

dobles, (dt) doble de triples, (ddd) doble de dobles de dobles, (ddt) doble de dobles de

triples, (dc) doble de cuádruples, (sa) señal ancha.

La espectrometría de masas de alta resolución se realizó en espectrómetros de masas Jeol

JMS- 700 mediante ionización por electrospray (ESI), con trampa de iones y detector de

tiempo de vuelo (TOF).

Los puntos de fusión se determinaron en los aparatos Barnstead/Electrothermal 9100,

utilizando tubo capilar abierto.

Los Rayos X se realizaron en el difractometro Gemini Atlas, Xcalibur

66

6.3 Extracción de metabolitos secundarios de B. thuringiensis cepa

ELI52

A partir de una placa de LB, con crecimiento bacterial de 24 horas de la cepa ELI 52 de

Bacillus thuringiensis, se tomó una colonia con asa bacteriológica para inocular 1L en total

de medio de cultivo TSB en cuatro matraces de 500 mL (250 mL por matraz) y se incubó

con agitación a 175 rpm durante 7 días a 29°C. Posteriormente el cultivo se centrifugó a

6000 rpm por 10 min para separar las células vegetativas del sobrenadante. El cultivo

bacteriano libre de células se extrajo con 3 volúmenes de acetato de etilo. Los extractos se

evaporaron a presión reducida a 40°C y el residuo fue concentrado con cloruro de

metileno. A este concentrado (200 mg/L) se le realizaron pruebas de solubilidad con

solventes como hexano, benceno, acetonitrilo, dietil éter, cloroformo, acetato de etilo,

cloruro de metileno, piridina, acetona, etanol, metanol, DMF, DMSO y agua. Fue corrido

con diversos sistemas en una cromatografía en capa fina (TLC) y se le realizó espectros de

RMN de 1H y 13C.

67

6.4 Purificación y caracterización de los compuestos obtenidos de

B. thuringiensis

El extracto crudo se agregó a una columna cromatográfica (4 cm diámetro x 15 cm largo).

En el proceso de separación se utilizaron sistemas desde hexano hasta metanol. El sistema

de solventes óptimo de purificación fue acetato de etilo: acetona con gradientes de 95: 5,

90:10, 85:15 y 80:20. Las fracciones primeramente se analizaron mediante cromatografía

de capa fina recolectando las bandas similares y evaporándolas para su posterior análisis

por espectroscopia.

Los productos que presentaron mayor pureza en TLC se mantuvieron en un sistema de

cristalización cloruro de metileno: hexano para su análisis de cristalografía de Rayos-X.

68

6.4.1 Purificación y caracterización del Ciclo (L-Pro-L-Leu)

Extracto crudo


AcOEt:Acetona, 95:5

1

HN

N

O

OH

El compuesto (Ciclo (L-Pro-L-Leu). (3S,8aS)-hexahidro-3-isobutilpirrolo[1,2-

a]pirazin-1,4-diona) 1 se obtuvo de un extracto crudo (400mg) mediante purificación en

columna de gel de sílice con eluyente acetato de etilo: acetona, 95:5. A continuación se

describen sus características.

Rendimiento 0.30% (1.2 mg, 0.00570 mmol)

Aspecto Cristal blanco

Punto de fusión 155.6 oC

FAB-HRMS calculado [C11H18N2O2+H]+ 211.1447

FAB-HRMS encontrado [C11H18N2O2+H]+ 211.1444

En las siguientes tablas se describen los espectros de RMN de 1H y 13C.

HN

N

O

OH

34

56

129

8

7

101211

13

69

RMN 1H (500 MHz, CDCl3)

(ppm)

Señal

Grupo

J (Hz)

5.80 1H, s NH-8

4.13 1H, dd CH-6 8.1

4.01 1H, dd CH-9 9.5, 3.5

3.54– 3.61 2H, m CH2-3

2.35 1H, m CHaHb-5

2.12 1H, m CHbHa-5

2.07 1H,m CHbHa-10

2.05 1H, m CHbHa-4

1.91 1H,m CHaHb-4

1.73 1H,m CH11

1.55 1H, m CHaHb-10

1.0 3H, d CH3-12 6.6

0.95 3H, d CH3-13 6.6

RMN 13C (125 MHz, CDCl3)

(ppm)

Grupo

170.1 C-7

166.1 C-1

59.0 C-6

53.3 C-9

45.5 C-3

38.6 C-10

28.1 C-5

24.7 C-11

23.2 C-12

22.7 C-4

21.2 C-13

70

6.4.2 Purificación y caracterización del Ciclo (L-Pro-L-Val)

HN

N

O

O

Extracto crudo



2

El compuesto (Ciclo (L-Pro-L-Val). (3S,8aS)-hexahidro-3-isopropilpirrolo[1,2-

a]pirazin-1,4-diona) 2 se obtuvo de un extracto crudo (400 mg) mediante purificación en






FAB-HRMS calculado [C10H16N2O2+H]+ 197.1290

FAB-HRMS encontrado [C10H16N2O2+H]+ 197.1284


HN

N

O

OH

34

56

129

87

10

11

12

71


(ppm)

Señal

Grupo

J (Hz)

5.88 1H, s NH-8

4.09 1H, dd CH-6 7.4

3.94 1H, dd CH-9 13.7

3.66 1H, m CHbHa-3

3.53 1H, m CHaHb-3

2.69 1H, ds CH-10 7.0, 2.6

2.41 1H,m CHaHb-5

2.01 1H, m CHbHa-5

1.94 1H,m CHaHb-4

1.88 1H,m CHbHa-4

1.0 3H, d CH3-11 7.0

0.90 3H, d CH3-12 7.0


(ppm)

Grupo

170.0 C-7

164.8 C-1

60.3 C-9

58.8 C-6

45.1 C-3

28.5 C-5

28.3 C-10

22.4 C-4

19.3 C-12

16.0 C-11

72

6.4.3 Purificación y caracterización del Ciclo (L-Pro-L-Phe)

HN

N

O

O

Extracto crudo



3

El compuesto Ciclo (L-Pro-L-Phe), (3S,8aS)-3-bencil-hexahidropirrolo[1,2-a]pirazin-

1,4-diona 3 se obtuvo de un extracto crudo (400mg) mediante purificación en columna de

gel de sílice con eluyente acetato de etilo: acetona, 87:13. A continuación se describen sus

características.




EI-HRMS calculado [C14H16N2O2]+ 244.1212

EI-HRMS encontrado [C14H16N2O2]+ 244.1177


HN

N

O

OH

1´

2¨

10

3´4´

5 6́´ 9

87

1 2 34

56

73


(ppm)

Señal

Grupo

J (Hz)

7.29 5H, m Ph-Phe

5.60 1H, s NH-8

4.28 1H, dd CH-9 10.8, 2.8

4.08 1H, dd CH-6 7.5

3.64 1H, m CHaHb-10

3.62 1H, m CHaHb-3

3.57 1H, m CHbHa-3

2.77 1H,dd CHbHa-10 14.5, 10.8

2.34 1H, m CHaHb-5

2.03 1H,m CHbHa-5

1.99 1H,m CHaHb-4

1.91 1H, m CHbHa-4


(ppm)

Grupo

169.3 C-7

165.0 C-1

135.8 C-1’

129.3 C-3’, C-5’

129.0 C-2’, C-6’

127.5 C-4’

59.1 C-6

56.1 C-9

45.4 C-3

36.7 C-10

29.6 C-5

22.5 C-4

74

6.4.4 Purificación y caracterización del Ciclo (L-Pro-L-Tyr)

HN

N

O

O

Extracto crudo



4

HO

El compuesto (Ciclo (L-Pro-L-Tyr).(3S,8aS)-3-(4-hidroxibencil)-hexahidropirrolo[1,2-

a] pirazin-1,4-diona) 4 se obtuvo de un extracto crudo (400mg) mediante purificación en




Aspecto Polvo blanco


EI-HRMS calculado [C14H16N2O3]+ 260.1161

EI-HRMS encontrado [C14H16N2O3]+ 260.1161


HN

N

O

O

HOH

1´

2¨

10

3´4´

5 6́´ 9

87

12 3

456

75


(ppm)

Señal

Grupo

J (Hz)

7.07 2H, d CH3’, CH5’ 8.4

6.8 2H, d CH2’,CH6’ 8.4

5.76 1H, s NH-8

4.23 1H, dd CH-9 10.2, 3.5

4.10 1H, dd CH-6 7.5

3.65 1H, m CHaHb-3

3.57 2H, dt CHbHa-3, OH 10.4, 3.0

3.48 1H,dd CHaHb-10 14.6, 3.5

2.74 1H,dd CHbHa-10 14.6, 10.2

2.34 1H, m CHaHb-5

2.02 1H,m CHaHb-4

1.96 1H,m CHbHa-5

1.91 1H, m CHbHa-4


(ppm)

Grupo

169.6 C-7

165.2 C-1

155.4 C-1’

130.3 C-3’, C-5’

127.2 C-4’

116.1 C-2’, C-6’

59.1 C-6

56.12 C-9

45.4 C-3

35.9 C-10

28.4 C-5

22.5 C-4

76

6.4.5 Purificación y caracterización del Ciclo (L-Pro-L-Tyr)

HN

N

O

O

Extracto crudo



5

HO

El compuesto (Ciclo (L-Pro-L-Tyr).(3S,8aS)-3-(4-hidroxibencil)-hexahidropirrolo[1,2-

a] pirazin-1,4-diona) 5 se obtuvo de un extracto crudo (400mg) mediante purificación en





Punto de fusión 139.0°C

HRMS calculado [C14H16N2O3]+ 260.1161

HRMS encontrado [C14H16N2O3]+ 260.1165


77


(ppm)

Señal

Grupo

J (Hz)

7.08 2H, d CH-3’, CH-5’ 8.4

6.8 2H, d CH-2’,CH-6’ 8.4

6.15 1H, sa OH

5.76 1H, s NH-8

4.23 1H, dd CH-9 10.1, 3.5

4.09 1H, dd CH-6 7.9

3.63 1H, m CHaHb-3

3.57 1H, dt CHbHa-3 10.4, 3.0

3.49 1H,dd CHaHb-10 14.5, 3.5

2.75 1H,dd CHbHa-10 14.5, 10.1

2.34 1H, m CHaHb-5

2.00 1H,m CHaHb-4

1.96 1H,m CHbHa-5

1.91 1H, m CHbHa-4


(ppm)

Grupo

169.6 C-7

165.2 C-1

155.4 C-1’

130.3 C-3’, C-5’

127.2 C-4’

116.1 C-2’, C-6’

59.1 C-6

56.2 C-9

45.4 C-3

35.9 C-10

28.3 C-5

22.5 C-4

78

6.5 Prueba de la actividad antibacteriana de los compuestos

obtenidos

Esta prueba se determinó a partir de antibiogramas realizados en placas de agar LB, con

sensidiscos impregnados de cada uno de los compuestos, en la siguiente tabla se muestra

la sensibilidad de las bacterias a los compuestos obtenidos solos y en combinación:

Producto Vibrio parahemolyticus

Vibrio cholerae

Klebsiella pneumoniae

Listeria monocytogenes

Shigella

1 0.30 0.35 0.45 R 0.20 1 + 2 0.50 0.45 0.60 0.40 0.40 1 + 3 0.45 0.20 0.45 0.40 0.20 1 + 4 0.40 0.45 0.20 R 0.20 1 + 5 0.20 0.35 0.45 0.20 0.20

2 0.60 0.60 0.50 0.45 0.35 2 + 3 0.30 0.30 0.30 0.20 0.30 2 + 4 0.20 0.60 0.35 0.45 0.35 2+ 5 0.20 0.50 0.40 0.45 0.35

3 0.40 0.35 R 0.20 0.30 3 + 4 0.20 0.20 0.20 R 0.20 3 + 5 0.20 0.45 0.20 0.20 0.40

4 0.55 0.20 0.55 0.40 0.30 5 0.30 0.40 0.40 R 0.30

4 + 5 0.30 0.20 0.40 0.20 0.20

R= resistente, Halo de inhibición medido en cm.

En donde:

1. L-Pro-L-Leu

2. L-Pro-L-Val

3. L-Pro-L-Phe

4. L-Pro-L-Tyr (polvo)

5. L-Pro-L-Tyr (cristal)

7. R E F E R E N C I A S

79

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