Tema 7 Biosensores - Alumnos

Biosensores“Instrumentos analíticos que

transforman procesos biológicos en señales eléctricas u ópticas y permiten su cuantificación”

Detector biológico Transductor

Aparato medidor

Membrana olfatoria

Célula nerviosa

muestra

Cerebro

La nariz como biosensor

Analito (sustrato)

Elemento biológico de detección

Transductor

Procesador de la señal

Señal

Biosensores

Elemento detector que responde al sustrato que se está midiendo es biológico en su naturaleza

Capa delgada de material biológico activo en contacto con transductor eléctrico

Transductor convierte cambio observado (físico/químico) en señal cuantificable

Señal electrónica con magnitud proporcional a concentración de un compuesto específico

Especificidad y sensibilidad de sistemas biológicos con poder informático de microprocesador

Nature, 1967

Ann NY Acad Sci, 1962

etanol

azucares

urea

creatina

ácido láctico

ácido glutámicofosfato

colesterol

penicilinas

paracetamol

aspirina

TNT

aminoácidos

El analito o sustratocualquier sustancia consumida o producida en un proceso biológico

El componente biológico

Interacción con el sustrato altamente específica

Evitando interferencias de otras sustancias

Catalización de la reacción (más común)Unión selectiva al sustrato

Otros componentes que contienen enzimas como:

Microorganismos (levaduras y bacterias)Material tisular (plátano o hígado)

AnticuerposÁcidos nucleicos

El componente biológico

VENTAJAS

Alta especificidadDiscriminación

Detección en mezclas complejas EstructuraConcentraciones

Sin tratamiento previo

Métodos de inmovilización

Componente biológico siempre en contacto íntimo con el transductor

Unión covalente o no covalenteMembrana delgada recubriendo superficie

de detecciónDistancia entre lugar de reacción y lugar

donde ocurre la transducción eléctrica

Adsorción a la superficie (más simple)Microencapsulación (membranas)Atrapamiento (matriz de gel, pasta o

polímero)Unión covalente (enlaces químicos entre

componente biológico y transductor)Entrecruzamiento (agente bifuncional)

Factores de rendimiento

SelectividadCaracterística más importanteDiscriminación entre sustratosFunción del componente biológico

SensibilidadNormalmente rango sub-milimolar

(10-3 M)Casos especiales fentomoles (10-15

M)

PrecisiónAlrededor de ± 5 %

Factores de rendimiento

Naturaleza de la soluciónpHTemperaturaFuerza iónica

TiempoTiempo de respuesta más largo que

sensores químicos (30 seg)Tiempo de recuperación (pocos

minutos)Vida útil por inestabilidad del

material biológico (días a meses)

BIOSENSORES• Utilizan la especificidad de los procesos biológicos:

– Enzimas x Sustratos– Anticuerpos x Antígenos– Lectinas x Carbohidratos– Complementariedad de ácidos nucleicos.

• Ventajas:– Reutilización– Menor manipulación– Menor tiempo de ensayo– Repetitividad

• Tipos y usos mas comercializados:1. Tiras colorimétricas2. Electroquímicos:

• Potenciométricos: Glucosa, Lactato, Glicerol, Alcohol, Lactosa, L-aminoácidos,

Colesterol• Amperométricos: Glucosa, Sacarosa, Alcohol

3. Ópticos: BIAcore: Ag proteicos.

Propiedades de un buen Biosensor

BIOSENSORES1. Control de metabolitos críticos durante las operaciones quirúrgicas.2. Consultas y Urgencias Hospitalarias:

– Obvia análisis caros y lentos en laboratorios centrales– Acelera la diagnosis y el comienzo del tratamiento– Menor riesgo de deterioro de la muestra

3. Diagnóstico Doméstico:• Ensayos de Embarazos• Control de Glucosa en diabéticos

4. Aplicaciones in vivo:– Páncreas artificial– Corrección de niveles de metabolitos– Problemas : Miniaturización y Biocompatibilidad

5. Aplicaciones Industriales, militares y medio ambientales:– Alimentación– Cosmética– Control de Fermentaciones – Controles de Calidad– Detección de Explosivos– Detección de gases nerviosos y/o toxinas biológicas– Control de polución.

TIPOS DE BIOSENSORES1. BIOSENSORES ELECTROQUÍMICOS

– Amperométricos: Determinan corrientes eléctricas asociadas con los electrones involucrados en procesos redox

– Potenciométricos: Usan electrodos selectivos para ciertos iones

– Conductimétricos: Determinan cambios en la conductancia asociados con cambios en el ambiente iónico de las soluciones

2. BIOSENSORES TERMOMÉTRICOS

3. BIOSENSORES PIEZOELÉCTRICOS

4. BIOSENSORES ÓPTICOS

– De onda envanescente

– Resonancia de plasma superficial

5. BIOSENSORES CELULARES

6. INMUNOSENSORES

UNIDADES FUNCIONALESDE UN BIOSENSOR

Electrodo dereferencia

4.328

S

P

Transductor AmplificadorReactor

Electrodo dereferencia

4.328

S

P

Transductor AmplificadorReactor

Material biológico + Analito Analito unido

(Máxima respuesta electrónica posible) x (Concentración del analito)

(Constante de semisaturación) + (Concentración del analito)

Respuesta electrónica =

Respuesta biológica

Respuesta Electrónica

Cinéticas de reacción en biosensores

Biosensores Electroquímicos Amperométricos

electrodo de oxígeno


electrodo de oxígenoReacciones redox catalizadas por

enzimas

Voltaje constante entre dos electrodos

Corriente debida a la reacción de los electrodos

Electrodo de Oxígeno

En este principio se basa el primer y más sencillo biosensor

Determinación de glucosa

Electrodo de oxígeno de Clark

Electrodo de Oxígeno

(A) Disco de resina epoxy(B) Cátodo de platino en el centro de un saliente. (C) Ánodo de plata en forma circular(D) Anillo de goma que sostiene un papel espaciador empapado en un electrolito y una membrana de polytetrafluoroethylene que separa los electrodos de la mezcla de reacción.

DETERMINACIÓN DE GLUCOSA

Glucosa + O2 -gluconolactona + H2O2

CH2OH

HH

H

H OH

OH

OH

O

OH

H

CH2OH

HH

H

H OH

OH

OH

O

O

H2O2

O2

GlucosaOxidasa

La glucosa se determina por la disminución de la concentración de oxígeno molecular disuelto cuando la glucosa oxidasa cataliza la reacción redox

DETERMINACIÓN DE GLUCOSA

Entre el cátodo central de platino y el ánodo circundante de plata se aplica un potencial de 0.6 voltios.

El circuito se cierra con solución saturada de KCl.

El oxígeno molecular disuelto se reduce en el cátodo de platino.

Se liberan electrones y se produce corriente eléctrica que se puede medir.

Cátodo (Pt)

Anodo (Ag)

Puente de KCl

O2 + 2H2O + 2e- H2O2 + 2OH-

2H2O2 + 2e- 2OH-

4Ag 4Ag+ + 4e-

4Ag+ + 4Cl- 4AgCl

4e-

- +

Electrodo de oxígeno

0,6-0,7v

Glucosa-oxidasaInvertasa

Ele

ctro

do

Glucosa

D-gluconolactonaH2O2

Sacarosa

FructosaGlucosa

O2

glucosa

sacarosa

tiempo

respuesta

fluj

o

DETERMINACIÓN DE SACAROSA

DETERMINACION DELA FRESCURA DEL PESCADO


Tras la muerte, los nucleótidos del pescado sufren una serie de reacciones de degradación progresiva:

ATP > ADP > AMP > IMP > HxR > Hx > Xantina > Acido úrico

(HxR + Hx ) x 100

ATP + ADP + AMP + IMP + HxR + HxK =

La acumulación de inosina e hipoxantina respecto de los nucleótidos es un indicador del tiempo que hace que el pez murió y de sus condiciones de

conservación, por tanto, de su frescura.


BIOSENSOR: xantina-oxidasa y nucleósido-fosforilasa inmovilizadas sobre una membrana de triacilcelulosa de un electrodo de oxígeno

HxR + P Hx + Ribosa P

Hx + O2 Xantina + H2O2

Xantina + O2 Acido úrico + H2O2

nucleósidofosforilasa

Xantinaoxidasa

Xantinaoxidasa

K < 20 El pescado puede ser comido crudo20 > K < 40 El pescado debe ser cocinadoK > 40 Pescado no apto para el consumo

Los nucleótidos se podrían determinar utilizando el mismo electrodo y muestra, pero añadiendo nucleotidasa y adenosín-deaminasa


ATP > ADP > AMP > IMP > HxR > Hx > Xantina > Acido úrico

(HxR + Hx ) x 100

ATP + ADP + AMP + IMP + HxR + HxK =

Ensayo simple para determinar de forma segura y fiable la frescura del pescado, que tiene gran importancia para la industria.La determinación de frescura en las inspecciones sería completamente subjetiva.


Ventaja:Fáciles de fabricar.

Desventajas:Reacción dependiente de concentración de

oxígeno. Ambientes anaerobios.

Otros procesos redox. Oxidación/reducción de vitamina C. Interferencia.

Sustitución del oxígeno por otras sustancias.

sustrato+

enzima (oxidada)

producto+

enzima (reducida)

reacción enzimática

enzima (reducida)+

mediador (oxidado)

enzima (oxidada)+

mediador (reducido)

reacción enzimática

mediador (reducido)mediador (oxidado)

+e-

reacción electrodo

La reacción mediada por el biosensor está compuesta por

tres procesos redox

Mecanismos redox para diferentes configuraciones de biosensores amperométricos

Oxidasas más especfíicas para el reactivo a oxidar

Rápidas velocidades de transferencia de electrones

Capacidad para ser regenerados fácilmente

Retenibles en membrana biocatalítica

No reaccionar con otras moléculas, incluyendo oxígeno molecular

Mediadores redox en

biosensores amperométrico

s

Mediadores redox en

biosensores amperométrico

s

Tetracianoquinodimetano aceptor parcial de electrones

Ferroceno, tetratiofulvaleno y N-metil fenazinio donantes parciales de electrones

Hidroquinona y ferrocianuro mediadores solubles

Biosensor que detecta concentración de glucosa en sangre.

Construido y vendido para el control de los enfermos diabéticos.

Área de detección dispositivo con electrodo de un solo uso

Deposición sobre una tira de plástico. Consta de electrodo de referencia Ag/AgCl y electrodo de carbono con glucosa oxidasa y mediador de ferroceno

Ambos electrodos cubiertos con tejido hidrofílico. Paso de moléculas de diferente tamaño, difusión homogenea, evita evaporación desigual

Duración 6 meses

Detección 2-25 mM en una gota de sangre

Resultado en 30 segundos

Miniaturización

Posible por la capacidad del pirrol para polimerizar mediante oxidaciones electroquímicas en condiciones suficientemente suaves como para atrapar enzimas y mediadores sin desnaturalizarlos

Microelectrodo glucosa/lactatoSe puede recubrir la superficie de pequeños electrodos polimerizando pirroles junto con biocatalizadores y mediadores, utilizando métodos de microfabricación de microprocesadores, e incluso disponiendo varios sensores en los mismos

Biosensores Electroquímicos

PotenciométricosDeterminan cambios en la

concentración de iones concretos


PotenciométricosUsan electrodos selectivos para

ciertos iones

Electrodos ion-selectivos. pHmetro

Baratos

Determinación de varios analitos

Mayor velocidad

Muy poca muestra

Necesidad de compensación de la temperatura

Biosensores Potenciométricos

Biosensor Potenciométrico

Detectan cambios en conductividad eléctrica causados por alteraciones

en la concentración de iones


Conductimétricos


Conductimétricos

En muchos procesos biológicos se producen cambios en concentraciones iónicas

Estos cambios pueden ser usados por biosensores que detecten cambios en la conductividad eléctrica

Sensor de Urea

NH2CONH2 +3H2O

2HN 4 + + HCO3- + OH-

Ureasa

Ureasa inmovilizada

Cirugía renal y diálisis

Reacción provoca gran cambio en concentración iónica

Sensor de Urea

Un campo alternante entre dos electrodos permite la determinación de los cambios en conductividad, evitando procesos electroquímicos no deseados

Electrodos dispuestos para ocupar mínimo espacio

0.1 y 10 mM de urea

Sensor de Urea

NH2CONH2 +3H2O

2HN 4 + + HCO3- + OH-

Ureasa

Otros ejemplos:amidasas,decarboxilasas,esterasas,fosfatasas ynucleasas.

Biosensores Termométricos

“Sensores bioquímicos y TELISA”

La producción de calor es una propiedad general de muchas reacciones enzimáticasBase de los biosensores calorimétricos o

térmicos

Biosensor termométrico

Biosensor termométricoLos cambios ambientales no afectan a los cambios de temperatura detectados

Reacción confinada en dispositivos termoaislados (a) Precisa un aislamiento correcto

La corriente del analito pasa a través de un intercambiador de calor (b)

Biosensor termométricoLa reacción tiene lugar en un pequeño reactor (c)

La diferencia en temperatura del analito que entra y el producto que sale es determinada por los termistores interconectados (d)

Diferencia habitual de una fracción de grado centígrado

Diferencias de hasta 0.0001ºC

Reacciones usadas en biosensores termométricos


Poco éxito comercial en comparación con otros biosensores

Ventajas:

Se puede acoplar fácilmente varias reacciones en un único reactor

Producir reacciones que actúan sobre los productos de la reacción principal

Coinmovilizando otras enzimas

Introduciendo más reactivos en la corriente a analizar


Detector de Lactato

La sensibilidad a lactato se incrementa por coinmovilización de lactato deshidrogenasa con lactato oxidasa

Reciclaje de productos de la primera reacción del sustrato

lactato oxidasalactato + O2 -----------------------> piruvato + H2O

lactato deshidrogenasapiruvato + NADH + H+ --------------------------> lactato + NAD+


Más ventajas:

Puede utilizarse células viables

Uso de células viables inmovilizadas en un reactor, no sólo para producir bioconversiones, sino para controlar la presencia de un sustrato metabolizable en la corriente a analizar

Análisis de la presencia de materiales tóxicos en una muestra, ya que afecta la tasa metabólica de las células inmovilizadas sobre un determinado sustrato


Más ventajas:

Puede acoplarse a un inmunoensayo enzimático

ELISA termométrico o TELISA

Mezcla antígeno no marcado (analito) y antígeno marcado enzimáticamente en concentraciones conocidas junto con un reactor en el que se ha depositado una capa de inmunoadsorbente

Aumento en cantidad de antígeno no marcado desplaza al antígeno marcado de la unión a la capa del reactor por competición

La cantidad de antígeno marcado que queda en el reactor se puede determinar por adición a la corriente que pasa por él del sustrato de la enzima que marca el antígeno y midiendo la cantidad de calor en la reacción enzimática

Biosensores Piezoeléctricos

“Narices bioelectrónicas”

Biosensor de fibra óptica para lactato

•Detecta cambios en la en la concentración de oxígeno determinando la reducción de la fluorescencia de un fluorocromo (quenching)

Biosensor de célula óptica para albúmina sérica

•Detecta la absorción de luz a 630 nm que pasa a través de la célula detectora.

•Se evalúa el cambio de amarillo a azul verdoso del verde de bromocresol cuando se une a la albúmina sérica a pH 3.8

•Respuesta lineal a la albúmina en un intervalo de 5 a 35 mg/cm3

Biosensores Ópticos

1) Detección de Vapores:• Ensayo sólido colorimétrico que detecta vapor de

alcohol utilizando alcohol-oxidasa, peroxidasa y 2,6-diclorindofenol sólidos dispersados sobre placas de TLC (cromatografía en capa fina) de celulosa microcristalina transparente.

2) Tiras colorimétricas de un solo uso:• Los más utilizados: análisis de sangre y orina.• Control de la glucemia en diabéticos

- Glucosa oxidasa, peroxidasa de rábano y un cromógeno que cambia el color al ser oxidado

Cromógeno (2H) + H2O2----(peroxidasa)--->colorante + 2H2O


3) Reacciones luminiscentes:• Utilización de luciferasa• Detecta la presencia de microorganismos en orina al

liberar ATP en su destrucción

Luciferina + ATP----(luciferasa)---> oxiluciferina + CO2 + AMP + ppi + luz


Onda evanescente

• Se basa en un fenómeno conocido como reflexión interna total de fluorescencia, que consiste en la absorción y emisión de fotones.


Onda evanescente• En este sensor una radiación que viaja a

través de una guía de ondas por reflexión interna total crea un campo electromagnético denominado campo evanescente, que puede penetrar una determinada distancia desde la superficie dependiendo del ángulo de incidencia en la interfase y la longitud de onda de la radiación de excitación.


Onda evanescente• Cualquier interacción molecular que

se produzca en este campo (como la unión de un analito a un receptor inmovilizado en la superficie de la guía de ondas) produce cambios en las características de la luz que se propaga por la guía de ondas que pueden medirse y relacionarse con la concentración de analito.


Onda evanescente

• Es necesario utilizar marcaje con moléculas con propiedades fluorescentes.

• Permite una detección directa, rápida y selectiva del analito.

Biosensores ópticos de onda evanescente

Menor índice de refracción >

Mayor índice de refracción >

“Un haz de luz será reflejado en su totalidad cuando incida sobre una superficie transparente presente entre dos medios, cuando proceda del medio con mayor índice de refracción y cuando el ángulo de incidencia sea mayor que un valor critico”




“En el punto donde se produce la reflexión, se induce un campo electromagnético que penetra en el medio que tiene menor índice de refracción”“Este campo es denominado onda evanescente y decae exponencialmente con la distancia de penetración, desapareciendo tras unos pocos nanómetros”




“La onda evanescente decae exponencialmente con la distancia de penetración, desapareciendo tras unos pocos nanómetros” “La profundidad a la que penetra depende del índice de refracción, de la longitud de onda de la luz utilizada y puede ser controlada con el ángulo de incidencia.




“La onda evanescente puede interaccionar a su vez con el medio, provocando un campo electromagnético que puede volver al medio con mayor índice de refracción, dando lugar a cambios en la luz que continúa a lo largo de la guía de ondas.”

Inmunosensor de onda evanescente

Especialmente indicados para inmunoensayos:

•No es necesario separar el resto de los componentes de una muestra clínica

•La onda solo penetra hasta el complejo antígeno anticuerpo

•Se excitan fluorocromos unidos a la superficie mediante la onda evanescente, y la luz emitida por ellos volverá a la fibra óptica

•La cantidad de muestra necesaria es mínima

Biosensores ÓpticosResonancia de plasmones

superficiales

• Los plasmones son oscilaciones colectivas de los electrones de conducción de un metal.

• La resonancia de plasmones superficiales es un fenómeno óptico que ocurre cuando una luz polarizada se dirige desde una capa de mayor índice de refracción (un prisma) hacia una de menor índice de refracción, que en este caso es una capa metálica, de oro o de plata, que se sitúa entre el prisma y la muestra.


superficiales

• La luz que incide en la interfase entre el metal y el prisma provoca la excitación de un plasmón superficial para un determinado ángulo de incidencia de dicha luz, llamado ángulo de resonancia.


superficiales

• El ángulo de resonancia depende fuertemente del índice de refracción del medio colindante a la lámina metálica, por lo que las variaciones que se produzcan en el mismo van a ser detectadas como cambios del ángulo de resonancia y este cambio es proporcional a la concentración.


superficiales

• La unión de los analitos al elemento de reconocimiento supone un cambio de índice de refracción sobre la superficie del metal y, como consecuencia, un desplazamiento del ángulo de resonancia.


superficiales

• Esto permite realizar medidas directas en tiempo real, sin marcaje, así como el análisis de muestras complejas sin purificación previa.

Resonancia de plasma superficial

“Si la superficie del cristal está recubierta por una capa metálica (oro, plata, paladio) los electrones de su superficie pueden oscilar en resonancia con los fotones generando un onda de plasma superficial y amplificando el campo evanescente en la cara mas alejada del metal”


“Si la capa de metal es lo suficientemente delgada como para permitir al campo evanescente penetrar hasta la superficie opuesta, el efecto será muy dependiente del medio adyacente al metal”


“Este fenómeno sucede sólo cuando la luz incide con un ángulo específico, el cual depende de la frecuencia, el grosor de la capa metálica y el índice de refracción del medio que se encuentra inmediatamente sobre la superficie metálica”


“La producción de esta resonancia de plasma superficial absorbe parte de la energía de la luz reduciendo la intensidad de la luz reflejada internamente”


“Los cambios que suceden en el medio provocados por interacciones biológicas pueden ser apreciados detectando los cambios de intensidad de la luz reflejada o el ángulo de resonancia”

Cambio en la absorción por efecto de la resonancia de plasma superficial

“Detección de la gonadotropina coriónica humana (hCG) mediante un anticuerpo unido a la superficie del biosensor: La unión causa un cambio en el ángulo de resonancia”


•Permiten detectar partes por millón•Un análisis típico requiere 50µl de muestra y tarda 5 a 10 minutos•Puede utilizarse con DNA y RNA.

Biosensores celulares

• Las células microbianas, como biocatalizadores, poseen ciertas ventajas sobre las enzimas purificadas cuando se usan en biosensores:

• Baratos

• Vida media más larga

• Menos sensibles a inhibición, al pH y a temperatura

• Capacidad autorregenerativa


• Desventajas:

• Más lentos en respuesta

• Más lentos en velocidad de recuperación

• Menor selectividad

• Fácilmente disgregables

• Condiciones más suaves


•Muy útiles cuando se requieren varios pasos o la presencia de coenzimas

•Células vivas o muertas

Inmunosensores

Tipos de inmunosensores

Nanobiosensores en el Campo de la Medicina

Nanobiosensores en urgencias

Nanobiosensores en la consulta

Tema 7 Biosensores - Alumnos

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