TecnologiasReproducen Ovinos[1]

Estado del arte de las tecnologías reproductivas avanzadas en ovinos.

Prof. H William Vivanco Mackie.BS, MS, PhDIngeniero ZootecnistaConsultor, reproducción y genética animalLa Rosas 255 El Remanso de La Molina, Lima 12, Perú[email protected]

I. Introducción:

La utilización de “artificios” en la reproducción de los animales domésticos tiene diversos objetivos tales como el control de enfermedades transmisibles por la copula, facilitar el manejo, etc., pero el más importante objetivo es sin lugar a dudas el de incrementar la tasa reproductiva ( obtener el máximo numero posible de crías) de animales selectos y a la más temprana edad posible para lograr la masiva diseminación de genes favorables ( genes responsables de alta productividad) en la población de animales productores y lograr el máximo progreso genético por unidad de tiempo al reducir el intervalo generacional.

La inseminación artificial (IA), la inducción de ovulación múltiple para la producción de embriones “in vivo” y subsecuente lavado y transferencia de embriones (MOET) y la recolección de ovocitos (OPU) subsecuente maduración y fertilización “in vitro” y el cultivo de embriones “in vitro” hasta el estadio transferible (IVP), son hoy “biotecnologías reproductivas” de uso cada vez mayor no solo en el ámbito de investigación sino también comercialmente. Otras tecnologías tales como la clonación y la transgenesis están aun en etapa de desarrollo.

El siguiente grafico, ilustra los efectos en el progreso genético de las poblaciones ganaderas del uso de la inseminación artificial y transferencia embrionaria (ya sea por MOET o por IVP) y en comparación con el sistema de monta natural.

mailto:[email protected]

II. Revisión de las principales tecnologías reproductivas en ovinos:

1. La Inseminación Artificial (IA):

A. El estado actual de la tecnología de inseminación artificial en el ovino. Áreas que requieren solución y mayor desarrollo tecnológico.

A pesar de que la reproducción del ovino ha sido tal vez la mas estudiada ya que se ha usado el ovino como modelo para muchos estudios de funciones reproductivas, esto no se ha traducido en avances tecnológicos al ritmo suficiente, contrariamente a lo que ha sucedido en el vacuno. La razón fundamental esta tal vez en las barreras anatómicas (por ejemplo tortuosidad y estrechez del lumen cervical de las ovejas) y funcionales (por ejemplo alta susceptibilidad al "shock frío" de los espermatozoides ovinos) encontradas en el ovino pero también probablemente debido a la falta de atractivo económico para inversiones en el desarrollo tecnológico.

Entre todos los avances realizados en las ultimas décadas en el área de inseminación artificial ovina, paradójicamente (ya que ahora es el método bajo escrutinio), la inseminación laparoscopia es el avance más importante. Esta tecnología ha permitido un dramático incremento (alrededor de 10 veces mas) en el numero de borregas inseminadas por eyaculado, ha hecho factible el uso de semen congelado con aceptables niveles de fertilidad y la utilización de sincronización del celo dentro de programas de inseminación artificial sin afectar la fertilidad.

Otros avances han contribuido en cierta medida a la optimización del manejo reproductivo en programas de inseminación ovina, tales como la utilización del "efecto de hembra en celo" para mantener reproductivamente activos a los carneros durante todas las estaciones, la utilización del "efecto del macho" para estimular actividad estral y ovulación en las hembras, el uso de melatonina para avanzar la estación reproductiva, el desarrollo de la sincronización del celo y la inducción de la actividad ovárica en el anestro, etc.En el área de conservación seminal a pesar de la enormidad de trabajos efectuados en este campo, aun no se dispone de un método de congelación de semen que permita la inseminación cervical con semen congelado y que resulte en un aceptable nivel de fertilidad ni tampoco se ha logrado conservar satisfactoriamente el semen a temperatura ambiental ( como se ha logrado para el vacuno). Tanto el semen ovino refrigerado como congelado pueden ser aplicados solo por laparoscopia si se desean niveles satisfactorios de fertilidad.

Indudablemente una de las barreras más grandes es la imposibilidad de atravesar la cervix con la pipeta de inseminación y depositar el semen al final de la cervix o el inicio

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del útero. Esto demanda que las dosis de inseminación para la inseminación cervical sean de altísima concentración espermática (100 millones de espermatozoides motiles) y de bajo volumen. Los métodos de preservación seminal (congelamiento, refrigeración, etc.) usando altas concentraciones (baja dilución) espermáticas no han sido exitosos, de allí la necesidad del uso de inseminación laparoscopica que permite la utilización de semen de más alta dilución ( 10 millones de espermatozoides motiles por dosis).

Afortunadamente, después de un largo periodo de rodeos sin salida, recientemente muy importantes descubrimientos hechos por los investigadores de la Universidad de Sydney y anunciados por C. Maxwell en el Symposium sobre Reproducción en Rumiantes Domésticos realizado en Colorado Springs, Estados Unidos, en Junio de 1998, han dado nuevas luces sobre los fenómenos relacionados con la inseminación con semen congelado ovino lo cual permitirá un reenfoque de los programas de desarrollo tecnológico en esta área. Los más importantes descubrimientos de Maxwell y colaboradores son:

Esta demostrado que el proceso de congelamiento seminal causa la espontánea reacción del acrosoma del espermatozoide, o sea el espermatozoide ha sufrido el proceso de capacitación prematuramente por lo tanto su tiempo de vida en el tracto reproductivo es muy inferior al del semen no congelado lo cual demanda que el semen congelado sea inseminado muy próximo al momento de la ovulación.

El uso de inhibidores de la respiración del espermatozoide (por ejemplo rotenona o rodamina 123) incrementa grandemente la habilidad de los dilutores para preservar la vida espermática e incrementa la fertilidad del semen congelado.

Los efectos negativos del congelamiento seminal sobre la fertilidad del semen son debidos mayormente (además de su efecto en la prematura capacitación) a que afecta la actividad de las mitocondrias y desnaturaliza el DNA y a que incrementa la perdida espermática por retroflujo hacia la vagina.

Mas del 70% de los espermatozoides inseminados se pierde por "retroflujo" hacia la vagina después del servicio, esto se observa en la misma intensidad o mayor aun para el caso de la inseminación intrauterina laparoscopica. Es mas marcada cuando se inseminan mayores volúmenes y cuando se insemina semen congelado.

Estos hallazgos sugieren cambios en el momento de inseminación de acuerdo al tipo de semen, la necesidad de estabilizar membranas celulares en el espermatozoide para reducir o controlar la capacitación prematura, ensayar nuevas formas de preservación seminal haciendo uso de diferentes inhibidores de la respiración y metabolismo, evaluar formas de prevención del daño a las mitocondrias, reducir la perdida espermática por retroflujo (tal vez la utilización de relajantes uterinos, bloqueo de oxitocina, tapones cervicales).

Es evidente que una nueva y excitante etapa para el desarrollo tecnológico de la inseminación artificial ovina ha comenzado. Los instrumentos y los métodos analíticos de mayor precisión y sofisticación que se disponen hoy en día, la enorme riqueza de información y la gran facilidad de comunicación para intercambio de la información, la

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revaloración del rol de los pequeños rumiantes en la economía de los países en desarrollo y desarrollados, debe traducirse en mas frecuentes éxitos en la solución de las limitaciones y en el desarrollo de mas avanzados y efectivos métodos para la inseminación artificial y otras tecnologías reproductivas en ovinos.

B. Aspectos técnicos de la IA en ovinos:

a) El semen, su producción, manejo y preservación:

. a.1. Factores que afectan la producción seminal y sus características:

La producción del semen y sus características esta afectada por factores genéticos y ambientales ( Desjardins C. , 1981). En carneros varias condiciones hereditarias asociadas con defectos testiculares, espermatogenesis anormal y morfología espermática anormal han sido encontradas; estas condiciones son mayormente controladas por un solo par de genes (Foote, R.H., 1974). Con respecto a la "calidad " del eyaculado el componente genético es relativamente pequeño con baja heredabilidad ( Rollinson, 1955), sin embargo en estudios con mellizos idénticos Bane (1954) colecto evidencia de que varias características del comportamiento reproductivo eran altamente heredables. La heredabilidad del tamaño testicular en carneros es alrededor de 0.4 ( Land y Lee, 1976) y existe una alta correlación entre tamaño testicular y producción total de espermatozoides (Foote, et al. 1970). La circunferencia escrotal en carnerillos esta altamente correlacionada con ritmo de crecimiento ( Kilgour y Blockey, 1980; r=0.28 a 0.42) y con peso vivo ( Vivanco H.W., 1988; r= 0.53 a 0.83). Los cambios estacionales en la secreción de LH y/o testosterona en carneros están también influenciados por la raza ( Schanbacher y Lunstra, 1976). Hay una variable respuesta de la pituitaria a las inyecciones de GnRH entre diferentes razas de carneros ( Stelmasiak, et al.; 1977). Muchos tipos de anormalidades espermáticas han sido descritas y algunas son de carácter hereditario, estas pueden ser tanto anormalidades primarias (por ejemplo anormalidades acrosomicas) como secundarias (anormalidades de la cola). ( Johanson, 1960; Fechheiner, 1970). Los parámetros de mayor importancia descritos en los estudios de calidad seminal incluyen el volumen seminal, motilidad y concentración espermática y se observa una gran variación entre razas en estos parámetros. La interacción significativa entre raza y ambiente es típica en la mayoría de estudios ( Vivanco H. W., 1983).

La edad de los animales influencia la producción seminal siendo las características mayormente influenciadas el volumen seminal y la concentracion espermatica, no así la motilidad ( Vivanco H.W., 1988).

Diversos factores ambientales pueden afectar la producción espermática y calidad seminal en carneros, la nutrición es uno de los factores más importantes. Los carneros pueden aparentemente tolerar un considerable rango de ingestión energética y proteica sin mostrar mayores efectos en la calidad seminal ( Tilton et al., 1964). Sin embargo, un bajo nivel energético ha sido identificado como uno de los factores que puede reducir la producción espermática sobre todo en animales en crecimiento. En general también hay un efecto positivo de la suplementacion proteica sobre las características seminales y la

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fertilidad de los carneros pero aparentemente el efecto de la suplementacion puede variar de acuerdo al estado nutricional previo ( Kadirov et al., 1974; Oldham et al., 1978; Sutherland y Martin, 1980).

El manejo de los animales para la producción seminal y los métodos de colección son los factores más importantes que afectan la producción y calidad seminal. la colección por electroeyaculacion ofrece una considerable variación en calidad seminal entre carneros y entre colecciones del mismo carnero ( Tiwari y Sahni, 1977), en comparación con la vagina artificial. Sin embargo también han sido observadas diferencias en la calidad de semen dependiendo del tipo de vagina artificial utilizada para la colección del semen de los carneros ( Burov, 1974).

La frecuencia de colección del semen afecta significativamente la calidad del eyaculado. En general hay una reducción en el volumen y concentración espermática pero un incremento en la motilidad del espermatozoide a medida que se incrementa la frecuencia de colección seminal (Bearden y Fuquay, 1980).

Diferencias observadas entre anos en la producción y calidad seminal son prácticamente al azar y son explicadas por variaciones en clima y disponibilidad de alimentos especialmente en sistemas pastoriles. Los efectos de los meses , si es que no están ligados a efectos estacionales, son también bastante arbitrarios y dependen mayormente de influencias de la región geográfica y reflejan variaciones climáticas. Las interacciones de razas con meses en características seminales denotan la diferente capacidad adaptativa de las diferentes razas a los diferentes medio ambientes (Vivanco, 1983; 1988).

Entre todas las especies domesticas, la fertilidad en los carneros es particularmente afectada por las altas temperaturas ambientales. La calidad del eyaculado y la capacidad del testículo para producir andrógenos es afectada por altas temperaturas corporales producidas por altas temperaturas ambientales u otras causas (Hafez, 1980). Estudios comparando razas introducidas y locales en ambientes tropicales demuestran una producción seminal pobre para todas las razas durante los meses más calurosos del ano, pero además en las razas introducidas se observo una marcada disminución del libido (Tiwari y Sahni, 1976; Sinha et al. 1980). La motilidad del semen se ve significativamente afectada a alturas sobre 3,800 m.s.n.m.( Vivanco, et al., 1985).

En general cualquier tipo de "stress" (climático, de manejo, psicológico, nutricional, etc.) afecta la producción y calidad del semen debido a la relación "stress" - eje hipotalamico hipofiseal- ACTH - glucocorticoides- LH-andrógenos- libido- espermatogenesis (Moberg, 1984 ).

Los ovinos son caracterizados como especie de reproducción estacional. En regiones temperadas sin embargo, los carneros generalmente permanecen sexualmente activos a través con ciertas variaciones no muy marcadas en el nivel de actividad mas debida a variaciones de temperatura o disponibilidad de alimentos durante estaciones que a factores relacionados con fotoperiodo ( Hulet y Shelton, 1980; Vivanco, 1983). En latitudes mas extremas los carneros experimentan una casi total reducción de la actividad

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sexual en ciertos periodos del ano. Pelletier y Ortavant (1975) y Lincoln y Short (1980); plantearon que el fotoperiodo producía cambios en el sistema que gobierna la secreción tónica de gonadotropinas siendo por lo tanto responsable de la transición de actividad sexual a quiescencia. Lincoln et al. (1980) sugirió que la respuesta al fotoperiodo en al carnero involucra una interrelación entre la actividad secretora de la glándula pineal y un establecido ritmo circadiano en el cerebro. La hormona involucrada en esta interrelación es la melatonina que es secretada por la pineal en proporciones variables entre el día y la noche. Inyecciones de melatonina a intervalos apropiados imita los efectos normalmente inducidos por los cambios en duración del día ( Turek y Campbell, 1979). Una gran cantidad de trabajos han sido efectuados sobre el uso de la melatonina para regular la actividad reproductiva de los carneros desarrollándose protocolos para su aplicación ( Hanif M. y Williams H.Ll.; 1988; Fitzherald J.A. et al.; 1988) pero su practicidad y efectividad no han sido del todo satisfactorias. El uso de fotoperiodo artificial imitando días cortos por un mes y alternado con días largos por otero mes mantuvo los carneros con producción constante de semen todo el año, la misma respuesta fue obtenida reemplazando los días largos por un tratamiento de 7 horas de luz, 8 horas de obscuridad, 1 hora de luz, 8 horas de obscuridad. Este "flash" de una hora de luz debía darse a las 15-16 horas desde el amanecer (Lindsay D.R. y Thimonier, J. 1988). No hay duda de que la manipulación del fotoperiodo puede ser usada exitosamente para la mantencion de la actividad reproductiva de carneros todo el ano, sin embrago su practica es muy costosa, demanda instalaciones especiales, consumo de energía, mano de obra, etc. En LambXL en Nueva Zelanda nosotros usamos manipulación de fotoperiodo en carneros durante una de las operaciones de transferencia de embriones fuera de estación , las complicaciones de manejo nos indujeron a cambiar de estrategia en las siguientes operaciones fuera de estación. Encontramos que simplemente exponiendo los carneros a ovejas ovariectomizadas y estrogenizadas (con celo inducido) por lo menos una vez por semana mantiene el libido , la producción seminal y la fertilidad durante todo el ano, nuestros resultados de fertilidad con semen fresco usado en ovejas superovuladas fue el mismo durante el otoño y la primavera ( Greaney et al. 1991).

a.2 Manejo y preservación del semen ovino:

La mayor proporción de los factores que determinan el nivel de fertilidad obtenible con la inseminación artificial ocurren en el intervalo desde la colección seminal hasta el momento de la inseminación de la dosis de semen ya sea fresco o preservado.

Uno de los más importantes factores que requiere de un manejo atinado es la temperatura seminal. A la colección la temperatura del semen es de alrededor de 38°C , si el semen se mantiene a esa temperatura las células espermáticas manifestaran su máxima motilidad y actividad metabólica y consecuente acumulación de ácido láctico y otros residuos metabólicos, ocurrirá así mismo un agotamiento de los substratos energéticos, un rápido cambio de pH y la muerte espermática. cualquier incremento de temperatura exacerbara esta condición y si la temperatura llega a 50°C se producirán danos estructurales irreversibles. Si por el contrario la temperatura seminal es súbitamente bajada sin añadir

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ningún protector contra el "shock frío", las células espermáticas sufrirán igualmente danos estructurales irreversibles y muerte.

El semen debe ser pre-diluido (por lo menos 1:1) inmediatamente después de la colección (la dilución final a efectuarse una vez determinada la concentración y tasa de dilución deseada), con el fin de controlar los cambios de pH, incluir agentes protectores del shock frio y de la contaminación y reducir la alta concentración espermática. La temperatura debe ser llevada a un nivel menor que no estimule intensamente el metabolismo y que no produzca "shock frío", por lo general se recomienda una temperatura de pre dilución de 30°C. Desde la pre dilución hasta el momento de conservación del semen o de su uso los cambios de temperatura deben ser unidireccionales, es decir si el semen por ejemplo será conservado por refrigeración a 4°C, la temperatura bebe bajar todo el tiempo desde los 30 grados de pre-dilución hasta los 4 de refrigeración y no experimentar subidas y bajadas, los cambios "sube y baja" de temperatura son la mayor causa de danos estructurales durante el manejo del semen. La misma unidireccionalidad pero en sentido contrario debe observarse cuando se restablece la temperatura después de la conservación y antes de la inseminación. ( ver figuras 2 y 3).

En adición a las precauciones con respecto a la temperatura del semen y el rápido control del pH y la contaminación, es muy sabido que el semen debe ser protegido del contacto con materiales tóxicos, desinfectantes, gases, radiación solar y luz directa. Evitar así mismo la formación de peróxidos de hidrogeno evitando sacudir el semen y la formación de espuma o burbujas (Bearden y Fuquay, 1980).

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El manejo del semen desde su colección hasta su uso debe tener como máximo objetivo el mantenimiento de la capacidad fertilizante del espermatozoide. Esto se logra mediante la reducción "reversible" de la motilidad y actividad metabólica espermática. Para ello usualmente se reduce la temperatura seminal o se usan varios agentes para el control del pH y el metabolismo o se aplica una combinación de las dos alternativas. Como consecuencia se logran métodos de conservación espermática a temperatura ambiental (también llamado semen fresco), refrigeración y congelamiento. Para incrementar al máximo el numero de ovejas a ser inseminadas por eyaculado se incrementa el volumen del eyaculado y se reduce consecuentemente la concentración por unidad de volumen hasta llegar al máximo posible sin que se afecte la fertilidad. Ambos objetivos (preservación de la capacidad fertilizante del espermatozoide y maximización del numero de hembras a ser servidas con un eyaculado) son alcanzados mediante la adición de "dilutores". Los dilutores deben: proveer nutrientes (mayormente substratos energéticos) que son importantes solo si el semen se va ha conservar por cierto tiempo y no si se usa inmediatamente después de la colección. Proveer sustancias protectoras contra en "shock frío" solo si el semen se va a refrigerar y si se va a congelar adicionar además sustancias "crioprotectoras". Proveer un sistema "buffer" o tampón para prevenir cambios bruscos en pH (esto es importante en todos los casos aun cuando el semen va a ser usado rápidamente después de la colección. Proveer un ambiente isotónico para evitar "shock osmótico" (esto también es importante en todos los casos). Contener agentes antimicrobianos para controlar el desarrollo de gérmenes (importante en todos los casos).

a.2.1 Semen fresco para uso inmediato después de la colección:

El uso de semen fresco es muy difundido en la inseminación artificial del ovino. Las inseminaciones con semen fresco se hacen ya sea con: i) Semen puro ( sin diluir, añadir solo el antibiótico diluido en un buffer fosfato o citrato para proveer al semen con una concentración de 100 mil u.i de penicilina y 100 mil ug de dihidroestreptomicina por 100 ml) inmediatamente después de la colección. En este caso

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la dosis de inseminación es de 0.05 ml. El semen puro se mantiene en un baño Maria a 30°C desde la colección hasta su uso. Todo el equipo debe estar a la misma temperatura del semen y el ambiente (sala de inseminación) no debe bajar de 25°C. Este tipo de semen es muy usado para la inseminación cervical. ( Calle R y Vivanco H. W., 1976).

ii) Semen diluido. El dilutor no requiere contener nutrientes y/o protectores celulares, solo debe contener un buen sistema tampón y debe ser isotónico con el semen. El cuadro 6 ofrece las formulas de diferentes soluciones tampón para dilución del semen. En el Perú por muchos anos se uso como dilutor de semen fresco simplemente la secreción vaginal de borregas en celo con muy buenos resultados ( Pezo-Gonzáles, 1967). En LambXL y la ATC hemos usado exitosamente leche uperizada (esterilizada al vapor o "UHT") . La temperatura recomendada para trabajar con semen diluido fresco es también de 30°C , debiendo el dilutor, el semen y todo el equipo mantenerse a dicha temperatura. La sala de inseminación debe estar mínimo a 23- 25°C. Para las inseminaciones con semen puro o diluido fresco, la colección de semen de los carneros debe de hacerse de acuerdo al ritmo de uso del semen. Debe evitarse la espera o demora entre colección y dilución, es decir este sistema es "literalmente" para uso inmediato del semen. Si se mantiene el semen "esperando a ser inseminado" a una temperatura de 30°C, se estará incrementando la concentración de ácido láctico muy rápidamente y afectando la motilidad y vida espermática. En los casos de demora entre colección e inseminación se deberá usar mas bien semen refrigerado o enfriado. El cuadro 7 ofrece resultados obtenidos en el Perú para inseminaciones cervicales a gran escala hechas con semen fresco .

Cuadro 6. Composición de algunas soluciones tampón usadas para la dilución del semen de carnero y su uso como semen fresco.

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Componente PBS (1)(solución fosfato salino)

CBS (1)(solución citrato salino)

Solución TRIS

(2)

Solución TEST(3)

fosfato de sodio 2.0 gr

fosfato de potasio 0.2 grAgua doblemente destilada en alambique de vidrio s.c.p. 100.00 cc s.c.p. 100.00cc s.c.p. 100.00cc s.c.p. 100.00ccCitrato de sodio deshidratado 2.0 grTRIS (hidroximetil aminometano) 3.605 gr 0.8849 grAcido cítrico monohidratado 2.024 grDextrosa (glucosa a -D(+)) 9.9 gr 1.0 grTES-N-TRIS (hydroximetil) metil-2-amino etano-ácido sulfonico 4.9751 grFructosa 1.488 grPenicilina 100,000 u.i 100,000 u.i 50,000 u.i 50,000 u.iSulfato dihidroestreptomicina 100,000 ug 100,000 ug 0.050 gr 0.050 grFuentes: (1) Bearden y Fuquay , 1980. (2) Vivanco et al., 1983. (3) Nelson E., 1982.

a.2.2) Semen enfriado o refrigerado:

La reducción de la temperatura del semen produce la reducción concomitante de la actividad metabólica y de la motilidad, aumentando la vida media del espermatozoide desde la colección seminal hasta la inseminación. La motilidad se detiene totalmente a los 5°C pero se puede restituir si se eleva nuevamente la temperatura al nivel normal y siempre y cuando no se hayan producido danos estructurales al espermatozoide en el proceso de enfriamiento ("shock frío"). El espermatozoide ovino es muy susceptible al "shock frío". El rango mas critico durante la refrigeración es el de los 15°C a los 4°C por ello el sistema mas recomendado de preservación seminal ovina en refrigeración es a 15°C. No es recomendable bajar la temperatura hasta los 4°C a no ser que se requiera usar el semen mas allá de las 15 horas de colectado. La protección del espermatozoide ovino del "shock frío" se logra mediante la adición de yema de huevo al dilutor (del 14 al 20 % V/V) . La yema de huevo contiene lipoproteínas protectoras de las membranas celulares y sustancias que preservan la motilidad ( Watson y Martin, 1973) pero también contiene un factor toxico que afecta al acrosoma y que se manifiesta a elevadas concentraciones de yema de huevo en el dilutor. Shannon (1972) encontró una cierta reducción de la

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fertilidad cuando el dilutor usado era a base de yema de huevo. Por ello el dilutor preferido para refrigeración o enfriamiento del semen a 15°C es el dilutor de leche, la inclusión de yema de huevo solo se recomienda si el semen será conservado a temperaturas mas bajas de refrigeración (4°C) o de congelamiento. El dilutor de leche no se debe usar para refrigeración a 4°C o para congelamiento si es que no se le añade un crioprotector como glicerina por ejemplo.

Cuando se usa dilutores de leche no esterilizada (leche entera o descremada cruda o pasteurizada) es necesario calentar la leche a baño Maria a 95°C por 10 minutos para destruir la enzima lactenin que es toxica al espermatozoide (Rodríguez, 1968; Dauzier et al 1954; Salamon, 1962; Jones, 1969). Una vez calentada se enfría hasta 30°C para hacer la dilución y luego se somete al enfriamiento hasta la temperatura de almacenaje. La leche UHT no necesita tratamiento de calentamiento. La adición de catalasa ( regulador de la producción de peróxidos) no ha mostrado ser de beneficio en dilutores de leche mientras que si es benéfica en dilutores con yema de huevo ( Colas et al., 1968). Los dilutores de leche a 15°C han demostrado ser más eficientes que los de yema de huevo, Colas y Courot (1977), obtuvieron 66.4% de nacimientos con inseminaciones cervicales hechas con semen diluido con dilutor de yema de huevo y 75.4% de nacimientos para dilutor de leche, observación hecha sobre un numero de 895 ovejas inseminadas. El periodo de preservación del semen enfriado a 15°C es de 14 a 16 horas con porcentajes de nacimiento para inseminación cervical (una inseminación por celo) de 65 a 75% (Colas y Courot, 1977).

El semen refrigerado a 4°C se usa cuando se quiere conservar el semen por mas de 16 horas. El máximo tiempo de preservación en refrigeración debe ser de 24 horas. Después de las 24 horas se observa una dramática perdida de capacidad fertilizante aun cuando la motilidad sea buena, esto debido probablemente a cambios en la estructura del acrosoma.

La concentración espermática por dosis de semen para inseminación cervical en borregas con celo natural con semen enfriado o congelado es de 100 a 150 millones de espermatozoides motiles. Si las borregas son de celo sincronizado, debido probablemente a modificaciones en el transporte espermático u otros factores que afectan la vida del espermatozoide en el tracto reproductivo de ovejas tratadas con progesterona o progestagenos ( Quinlivan y Robinson, 1968; Hawk y Conley, 1971; Colas et al., 1973) , la concentración espermática por dosis tiene que ser incrementada a 200 millones o más (Colas y Courot, 1977).

El volumen de la dosis de inseminación cervical con semen diluido, enfriado o refrigerado es de 0.1 a 0.2 ml. Es muy importante mantener el volumen al mínimo (lo cual resulta en alta concentración por unidad de volumen de la dosis), mayores volúmenes bajan la fertilidad ( Allison y Robinson, 1971; Colas et al., 1973). Recientemente Gillan y Maxwell, 1998 informaron sobre mayor perdida de semen por reflujo hacia la vagina cuanto mayor el volumen inseminado. Esto es uno de los factores más difíciles de compatibilizar ya que por otro lado la sobrevivencia espermática durante la preservación y manipulación es mas baja cuanto mayor sea la concentración de la dosis ( Amir et al., 1973; Mainpouya, 1973).

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La concentración espermática por dosis de semen enfriado o refrigerado puede ser dramáticamente reducida cuando se emplea inseminación laparoscopica intrauterina. Trabajos iniciales de inseminación laparoscopica recomendaban entre 25 y 40 millones de espermatozoides motiles inseminados por oveja, hoy en día se ha reducido la concentración hasta 10 y 15 millones de espermatozoides motiles por dosis. El volumen normalmente inseminado es de 0.25 ml repartidos en los 2 cuernos o inseminados en un solo cuerno uterino. Reciente evidencia de re-flujo seminal a la vagina directamente proporcional al volumen de la dosis inseminada (Gillan y Maxwell C. 1998) sugeriría reducir aun más el volumen de la dosis. El promedio de fertilidad obtenida con inseminación laparoscopica intrauterina con semen refrigerado es de alrededor de 75% con rangos que varían de 30 a 90% ( Maxwell et al., 1983; Vivanco et at., 1985; Davis et al; 1986). Hay una relación directa entre la concentración de espermatozoides motiles en la dosis y el porcentaje de fertilidad, Martin y Watson (1976), demuestran que cuando se reduce la concentración espermática por debajo de 25 millones de espermatozoides motiles por dosis la fertilidad se ve comprometida y si la operación se hace más vulnerable a cualquier otro factor que comprometa los resultados.

El cuadro 8 muestra la composición de los dilutores más usados para el enfriamiento o refrigeración del semen. Las soluciones tampón referidas en dicho cuadro son aquellas cuyas formulaciones han sido dadas en el cuadro 6.

El ritmo de enfriamiento depende del dilutor usado. Para dilutor de leche y para el TEST-yema de huevo se diluye a 30°C y se enfría con "chaqueta de agua" ( frasco del semen diluido inmerso en vaso con agua a determinada temperatura) a 30°C en el refrigerador calibrado a la temperatura de refrigeración ( ya sea 15°C o 4°C) que se desea alcanzar. Cuando se usa el TRIS, el semen puro se coloca en baño Maria a 25°C por 5 minutos, luego a 23°C por 10 minutos y luego a 20°C por 10 minutos, se hace la dilución a 20°C luego se enfría en chaqueta de agua a 20°C introducida en refrigeradora calibrada a 4°C ( Vivanco y Valera, 1980; Vivanco y Alarcón, 1987).

Cuadro 7. Porcentaje de ovejas que parieron sobre total de ovejas inseminadas por el método cervical con semen fresco, puro o diluido, en las praderas alto andinas del Perú.

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Localidad Ano Numero de borregas inseminadas

Numero de borregas que parieron

% de borregas paridas

Chuquibambila, Puno

1943 500 224 44.81

Puno-Sur 1943 9,000 2,970 33.0Hda Laive-Junín 1943 100 73 73.0 Hda Laive-Junín 1944 4,500 1,755 39.0Hda Urcunimuni-Puno 1947 280 168 60.0Juliaca-Puno 1955 90 81 90.0Juliaca-Puno 1955 500 325 65.0Servicio IA Banco Agropecuario

1960 70,000 52,668 75.24

1961 75,000 56,265 75.021962 73,000 56,706 77.681963 75,000 60,982 81.311964 75,000 56,797 75.73

Fuente: Pezo Gonzáles N. (1967) Los resultados corresponden a 2 rondas de inseminación. Todas las ovejas que retornaron al celo después de la primera inseminación fueron re-inseminadas. En promedio un 25% a 32% de las ovejas recibieron 2 servicios.

Cuadro 8. Algunos dilutores empleados para la conservación del semen ovino por enfriamiento (15°C) o refrigeración (4°C).

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Leche (1) Citrato-yema (2)

TEST-yema(3)

TRIS-yema(4)

Leche entera o descremada, calentada a 95°C por 10 minutos o leche UHT sin calentar

100.00 ml -

Solución tampón TEST 80.00 mlSolución tampón TRIS 67.2 mlAgua doblemente destilada

12.8 ml

Solución tampón Citrato salino

80.00 ml

Yema de huevo 20.0 ml 20.0 ml 20.0 mlPenicilina 100,000 u.i * * *Estreptomicina 100,000 ug * * *

*antibiótico ya incluido en la solución buffer o tampónFuente: (1) Rodríguez, C. 1968. (2) Modificado de Bearden y Fuquay, 1980. (3) Vivanco H W y Valera, 1980.; Nelson E. 1982. (4) Vivanco H.W. y Alarcón V. 1987.; Alarcón V. 1984.

a.2.3) Semen congelado:

La utilización de semen congelado da una gran flexibilidad al empleo de la inseminación y posibilita el comercio internacional del semen. La mayor limitación del uso de semen congelado en ovinos es la baja fertilidad obtenida con la inseminación cervical usando semen congelado. La gran mayoría de los resultados han sido muy pobres entre 25 y 35% de concepción ( Salamon y Visser, 1971; 1974; Fukui y Roberts, 1975). Sin embrago, dependiendo del nivel de fertilidad que sea factible de aceptar como económicamente eficiente, nuestro método de congelamiento para inseminación cervical podría considerarse como satisfactorio, ya que nosotros obtuvimos 59% de fertilidad con semen congelado inseminado por vía cervical en ovejas ( Vivanco H. W. y Alarcón V., 1987). Los resultados del ensayo se muestran en el cuadro 9.

La reducción de la temperatura seminal por debajo de los 4°C enfrenta el problema de la cristalización del agua intra y extra celular causando danos estructurales con ruptura celular por el aumento de volumen del agua al cristalizarse y por aumento de la presión osmótica intracelular al aumentarse la concentración de sales en las fracciones de agua intracelular que aun no se cristalizaron. (Bearden y Fuquay, 1980). El rango mas critico

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es de los O°C a los - 20°C, sin embargo, aun se producen danos por cristalización de los - 20 a los - 75°C. Por lo tanto ningún método de congelamiento puede detenerse sino hasta pasar los - 75°C. Los protocolos mas recomendados de congelamiento bajan la temperatura muy lentamente (2 a 4hrs) de los + 15°C hasta los + 4°C para evitar el “shock frío” y luego bajan la temperatura muy rápidamente ( 3 a 9 minutos) de los + 4 °C a los - 75 °C para evitar la prolongada exposición del semen a temperaturas de cristalización, debajo de los -75°C se puede pasar muy bruscamente hasta la temperatura final que puede ser de - 79°C si se usa hielo seco o - 196°C si se usa nitrógeno liquido. La tasa de congelamiento es afectada por la relación volumen superficie por lo que es más recomendable ya sea congelar el semen en pellets de bajo volumen o en pajillas de 0.25 ml o menos. (Bearden y Fuquay, 1980). Tan importante como la tasa de congelamiento es la tasa de descongelamiento. El descongelamiento debe ser rápido para evitar cristalización durante es descongelamiento. Baños Maria de 37°C a 40°C por 30 segundos o de 75°C por 2 segundos son los mas recomendados ( Nelson, E. 1982; Tung Yung Lin, 1980).

La adición de glicerina al semen antes del congelamiento decrece el punto de congelamiento del agua al mezclarse la glicerina con el agua lo que reduce la cristalización y los cambios osmóticas bruscos, la glicerina también deshidrata parcialmente la célula espermática reduciendo aun más el riesgo de cristalización del agua dentro de la célula. Otros agentes crioprotectores usados son el dimetilsulfoxido, etilenglicol y sacáridos ( Bearden y Fuquay, 1980).

Hill et al. (1959) demostraron que en el congelamiento del semen del carnero a -79°C niveles de glicerina de 3.5 a 7.0% mantuvieron satisfactoriamente la motilidad post descongelamiento; niveles de 14% decrecieron la motilidad. La mayoría de protocolos de congelamiento de semen de carnero recomiendan niveles finales de glicerina no mas altos del 7%, niveles menores del 3.5% son inefectivos para proteger contra los danos del congelamiento ( Watson y Martin, 1975; Colas y Brice, 1975; Colas, 1974; Fukui y Roberts, 1975; Dupenko, 1980) . La adición de la glicerina al semen en la mayoría de los métodos de congelamiento se hace en forma lenta; normalmente el semen se diluye a la mitad de la dilución total en un primer dilutor carente de glicerina y luego se añade el segundo dilutor conteniendo el doble de la concentración final de glicerina, esto sin embargo no es estrictamente necesario existiendo métodos que usan una sola dilución directamente con dilutor glicerinado tal como el caso de congelación en pellets ( Maxwell, et.al.1984). La yema de huevo necesaria para proteger el daño estructural del acrosoma debe estar el los dilutores para congelamiento en un nivel del 15 al 20% máximo; niveles muy altos afectan la motilidad y fertilidad (Smirnov et al.,1978). Recientemente Gillan y Maxwell C.(1998) encontraron que la congelación del semen de carneros a pesar de todos los aditivos convencionales (crioprotectores, yema de huevo, etc.) produce capacitación prematura del espermatozoide debido a espontánea reacción del acrosoma, produce también desnaturalización del DNA y afecta las mitocondrias y sugiere se investiguen otros protectores celulares para lograr la estabilización de las membranas.

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Numerosos métodos de congelamiento del semen de ovino han sido publicados, Graham et al.(1976) hacen una revisión de todos los métodos publicados hasta 1975. Las inseminaciones efectuadas por vía cervical con semen congelado usaron dosis de una concentración de 100 millones de espermatozoides motiles al momento de la inseminación (post descongelamiento) lo cual por lo general requirió alrededor de 200 millones de espermatozoides motiles por dosis al momento del congelamiento. El volumen de la dosis varia con la forma de congelamiento. La forma más común de congelamiento fue en pellets de 0.1 a 0.2 ml (Salamon y Visser, 1971; 1974; Visser y Salamon, 1973; 1974; Fukui y Roberts, 1975; Firth, 1977; Maxwell et al., 1984). Nosotros el la Universidad Agraria de La Molina, Perú, congelamos en ampolletas de 1.0 ml conteniendo cada ampolleta 3 dosis de inseminación de 0.2 ml cada una ( Vivanco H.W y Alarcón, 1987) también en pellets de 0.1 ml y en pajillas de 0.25 ml ( Vivanco H.W. y Varela J., 1980). El desarrollo de la inseminación artificial intrauterina por laparoscopia ( Maxwell et al.,1983; Vivanco et al., 1985; Davis et al.,1986) permitió el incremento sustancial de la tasa de dilución del semen congelado, siendo muy común en la actualidad usar pajuelas de 0.25ml conteniendo un mínimo de 15 millones de espermatozoides motiles después del congelamiento (alrededor de 25 a 30 millones de espermatozoides motiles antes de la congelación). Los resultados con la inseminación laparoscopica intrauterina de semen congelado son variables pero en general considerados satisfactorios. Evans G. (1991) informa sobre el promedio de fertilidad de inseminaciones efectuadas con semen congelado por vía laparoscopica intrauterina en Australia en el periodo 1989-1990 involucrando 268,300 ovejas inseminadas, encontrando que la fertilidad fluctuó entre 15% y 92% con un promedio general de 62%. Una de las mayores fuentes de variación ha sido la variación entre carneros. Butler y Maxwell (1988) en Western Australia (estudiando comportamiento del semen congelado de 110 carneros inseminando intrauterinamente por laparoscopia) encuentra un rango de fertilidad de los carneros que vario de 20 a 80% con una fertilidad media de 60-70%. Eppleston y Maxwell (1994) en New South Wales, Australia encontraron que el porcentaje de ovejas que parieron vario entre 46 a 77% dependiendo del carnero donante del semen congelado , con un promedio general de 57%, la distribución normal de la fertilidad de los carneros del trabajo de Eppleston y Maxwell (1994) se muestra en el grafico 4.

Cuadro 9. Porcentaje de ovejas Corriedale en praderas alto andinas del Perú que preñaron y que parieron como resultado de inseminación artificial vía cervical con semen congelado.Ovejas inseminadas Ovejas

preñadas (%)Ovejas que parieron (% )

Gestación promedio en días

Proporción Macho:hembra

34 20 (58.82) 19 (55.88) 149.9 .47: .53

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Fuente: Vivanco H.W. y Alarcón V., 1987

Numero de carneros

Figura 4. % de fertilidad del semen congelado de carneros inseminado en forma intrauterina por laparoscopia

El semen congelado en la primavera ( fuera de estación reproductiva) ha mostrado ser de más baja fertilidad que el semen congelado en otoño. ( Colas y Courot, 1977). El semen una vez congelado no parece perder su viabilidad con el correr del tiempo. Semen que fue congelado en la estación reproductiva y que fue descongelado luego de varios anos mostró el mismo nivel de viabilidad y fertilidad que el semen congelado y usado en la misma estación ( Patt y Nath, 1969; Salamon y Visser 1974; Colas y Brice 1976).

b) La inseminación

b.1. Momento oportuno para la inseminación:

Los espermatozoides de carnero tienen una vida fértil de 30 a 48 horas después de ser colocados en el tracto reproductivo femenino. La vida fértil de los ovocitos es de alrededor de 16 horas desde la ovulación (Bearden y Fuquay,1980). El celo en la oveja dura de 24 a 36 horas, siendo mas corto en borreguillas, la ovulación ocurre normalmente

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24 a 26 horas desde el inicio del celo (Hunter y Nichol, 1983) sin embargo Hulet y Shelton (1980) mencionan que la variación puede ser desde 11 horas antes del fin del celo hasta 7 horas después del fin del celo, esto puede ser debido a que el momento de ovulación y la ocurrencia misma de la ovulación están afectados por el nivel de "stress" (Moberg, 1984). La capacitación espermática (proceso necesario para darle competencia fertilizante al espermatozoide) dura alrededor de 8 horas ( Bearden y Fuquay, 1980). Los espermatozoides capacitados tienen una vida muy corta, son frágiles, muestran un alto grado de actividad flagelar y experimentan agotamiento metabólico, por ello, a pesar de que el transporte espermático desde la cervix al oviducto es muy rápido (menos de 8 minutos), una vez que los espermatozoides alcanzan la zona caudal del istmo del oviducto son secuestrados en esa región (para evitar su capacitación prematura) hasta que muy poco antes de la ovulación la acción local de hormonas ováricas y una poderosa estimulación adrenergica desencadenan contracciones ístmicas llevando los espermatozoides a la zona ampular donde se capacitan y transforman en células hiperactivas. El secuestramiento en el istmo puede durar hasta 18 horas. (Hunter y Nichol, 1983). Los eventos fisiológicos descritos explican la razón por la que el semen fresco (con acrososma intacto) poder ser inseminado con relativa anticipación (temprano en el celo) sin mayor detrimento de la fertilidad, en cambio, el semen refrigerado y sobre todo el semen congelado tiene que ser inseminado más próximo al momento de la ovulación ya que hay evidencia (Gillan y Maxwell, 1998) de que el semen congelado ha sido ya capacitado (reacción de acrosoma) en el proceso de congelamiento. En general se recomienda que el momento de inseminación con semen fresco (ya sea por vía cervical o laparoscopica) en ovejas con celo natural sea efectuado óptimamente 6 a 8 horas antes del momento de ovulación lo que equivale a alrededor de 16 a 18 horas desde el inicio del celo, en forma practica, animales detectados en celo en la mañana son inseminados en la tarde del mismo día, animales detectados en celo en la tarde se inseminan la mañana siguiente ( Calle y Vivanco, 1976; Bearden y Fuquay, 1980).

El momento oportuno para la inseminación con semen refrigerado y congelado en ovejas de celo natural y por inseminación cervical fue inicialmente recomendado también para ser efectuado entre 15 y 17 horas luego de la detección del celo ( Colas y Courot, 1977). Nosotros (Vivanco y Alarcón, 1987) inseminamos alrededor de las 20 horas en el experimento referido en el cuadro 9. La evidencia de que el espermatozoide ya esta capacitado cuando se trata de semen congelado sugiere que el momento de inseminación debe hacerse mas cerca del momento de ovulación. En un pequeño ensayo en LambXL, Nueva Zelanda (Vivanco, 1990, datos no publicados) inseminando ovejas superovuladas intrauterinamente por laparoscopia con semen congelado a diferentes intervalos desde el celo obtuvimos 25% de fertilidad para el semen inseminado a las 12 horas de la detección del celo y 81.8% de fertilidad para las ovejas inseminadas a las 20 horas desde la detección del celo, lo cual concuerda con los hallazgos de Gillan y Maxwell, (1998).

El estro y la ovulación pueden ser inducidos o sincronizados (por diversas razones de manejo) en las ovejas mediante tratamientos hormonales durante la estación reproductiva o fuera de la estación reproductiva. Las inseminaciones se pueden hacer sobre celos detectados a los mismos intervalos ya descritos para ovejas con celo natural y de acuerdo al tipo de semen usado, sin embargo, uno de los principales usos de la

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sincronización de celos es con el objeto de poder realizar inseminaciones a "tiempo fijo" luego del fin del tratamiento de sincronización para reducir costos de mano de obra, carneros marcadores y movimiento de animales, sobre todo cuando se trata de rebaños de miles de animales a ser inseminados, por lo que numerosos trabajos han sido conducidos para determinar el momento adecuado de la "inseminación a tiempo fijo" en ovejas sincronizadas.

En ovejas sincronizadas durante la estación reproductiva con dos inyecciones del análogo de prostaglandina F2 alfa (cloprostenol) a intervalos entre inyecciones ya sea de 8, 11 o 14 días se encontró que en promedio solo mostraron celo entre el 66 al 82% de las ovejas tratadas y el celo ocurrió entre las 40 a las 64 horas después de la segunda inyección, pero prácticamente todas las ovejas ovalaron, por lo que la recomendación en ovejas sincronizadas con prostaglandina es de usar detección de celo de todas maneras, inseminar al momento recomendable ya descrito para ovejas detectadas y a las ovejas que no mostraron celo hasta las 56 hrs de la segunda inyección inseminarlas a las 56 horas y re-inseminarlas si muestran celo después de la inseminación (Farnie y Wales, 1977). En ovejas sincronizadas con progestagenos y PMSG inyectado a la remoción del progestageno el momento fijo de inseminación recomendado ya sea con semen fresco o congelado ( Colas y Courot, 1977; Vivanco et al, 1985 y Maxwell, 1983) o para inseminación cervical ( Colas y Courot, 1977) o laparoscopica ( Vivanco et al, 1985; Maxwell, 1983) ha sido de 55 a 60 horas después de la remoción del progestageno. Boland et al., (1978) encontró que en promedio las ovejas sincronizadas con progestageno mas PMSG ovulan a las 70 horas de la remoción del progestageno, este intervalo puede acortarse en hasta 12 horas con el uso de CIDR en lugar de progestagenos y esta también influenciado por el nivel de la dosis y el momento de administración del PMSG al final del tratamiento de sincronización pudiendo acortarse en hasta 12 horas si el PMSG se administra 24 horas antes de la remoción del progestageno o CIDR y es mas corto aun para ovejas en tratamiento superovulatorio ( Walker et al., 1989). La nueva evidencia con respecto al estado de capacitación prematura del semen congelado sugiere que este tiempo fijo de inseminación sea más cercano al momento de ovulación para el caso de semen congelado.

En todos los casos de sincronización usando dispositivos vaginales para tratamiento con progestagenos o progesterona el método de inseminación artificial más recomendado es el de la vía intrauterina por laparoscopia y no por vía cervical ya sea que se trate de semen fresco, refrigerado o congelado ya que inseminaciones cervicales en celos sincronizados con progestagenos resultan en menor fertilidad la cual puede estar relacionada a la ocurrencia de secreciones y reacciones vaginales causadas por las esponjas o CIDRs o a otros factores. Recientemente Chimeneau et al. (1998) ha encontrado en cabras que son tratadas repetidamente con progestagenos un gradual incremento en el intervalo entre la remoción de la esponja y el celo y una gradual disminución de la fertilidad, esto no ha sido todavía demostrado en ovejas pero es lógico asumir que se presente un fenómeno similar.

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b.2. La detección del celo:

Las ovejas cuando están separadas del macho no muestran muy claramente signos externos del celo. Por lo que es necesario usar machos marcadores del celo que llevan un "chaleco marcador" o llevan el pecho pintado y que son carneros a los que se les ha prevenido de alguna forma que puedan depositar un eyaculado fértil en la hembra. Los carneros vasectomizados o los carneros castrados ("capones") inyectados o implantados con testosterona son los que se usan mas frecuentemente ya que producen eyaculados sin espermatozoides, mejor aun si a estos se les ha cambiado la posición de la abertura prepucial para evitar también que haya copula previniendo en esa forma la transmisión de enfermedades vía comulación. El uso de "mandiles pecto-ventrales" que cubren todo el vientre y la parte posterior del pecho del carnero es también otro método para prevenir la comulación. Tanto la desviación peniana-prepucial como los mandiles permiten usar carneros enteros como marcadores pero es mas seguro si se trabaja con machos vasectomizados o con capones. La proporción recomendada de machos marcadores depende de la concentración de ovejas por unidad de superficie y de la proporción de ovejas que se espera entren en celo por día lo cual es función del tipo de celos ( natural o sincronizados). En praderas al pastoreo y con celos naturales la proporción recomendada de marcadores sobre borregas es del 3 al 4%. Esto puede ser reducido al 1 o 2% si las borregas están en áreas más pequeñas o confinadas. La proporción de ovejas que se espera entren en celo natural diariamente es de 6 % de la población total, si esto no se esta logrando quiere decir que la nutrición no debe estar optima o hay algún factor de "stress" afectando el rebano o los carneros marcadores no están trabajando o las pinturas o crayolas de los chalecos no son lo suficientemente frescas para dejar las marcas. Si se trata de celos sincronizados la proporción de carneros marcadores requeridos se eleva considerablemente requiriéndose un 10% sobre la población de hembras sincronizadas para una fecha especifica. Normalmente se aconseja que la introducción de machos marcadores en rebaños no sincronizados se haga 17 a 18 días antes de la fecha programada de inseminación de tal manera que las ovejas no sean inseminadas al celo inducido por el efecto de macho (que produce cuerpos luteos de vida muy corta) sino al siguiente celo a no ser que las ovejas sean tratadas con progestageno antes de la introducción de los machos en cuyo caso se pueden inseminar al celo inducido por el efecto del macho. Los machos marcadores deben ser reemplazados periódicamente (cada 15 días) para evitar agotamiento y el rebano debe ser observado dos veces al día para separar a las ovejas marcadas y asignalarlas a los grupos de inseminación.

b.3 La inseminación propiamente dicha:

La inseminación cervical a la que nos hemos referido en todo este articulo se refiere a la "inseminación cervical superficial" ya que la pipeta de inseminación penetra solo hasta topar con el primer anillo cervical (figura 5), el método es muy simple y no invasivo, simplemente se introduce un especulo (7.5 pulgadas de largo x 1 pulgada de diámetro) a la vagina para visualizar la entrada de la cervix ayudados por una linterna frontal o incorporada al especulo y una vez localizada la cervix se introduce la pipeta (de 12

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pulgadas de largo y 1/8 de pulgada de diámetro) la cual para mejor manipulación tiene la punta doblada, hasta sentir resistencia del primer anillo cervical y se deposita el semen descargando la jeringa o pistoleta conectada a la pipeta ( Morrant y Dun , 1960; Calle y Vivanco, 1976).

Debido a la barrera natural ofrecida por las características anatómicas de la cervix uterina de la borrega, la inseminación cervical profunda o intrauterina-transcervical (llegando al útero a través de la vagina) requiere de artificios o métodos no convencionales, el pasaje a través de la cervix ha sido intentado en diversas formas tratando de forzar el pasaje de catéteres o incluso envolviendo cortes de la pared vaginal ( Fukui y Roberts, 1976; Morant and Dun, 1960; Bruckerell, B; 1989 (The Guelp System for Transcervical A I); todos estos sistemas producen dolor en el animal, son muy laboriosos, de gran riesgo para la vida de las ovejas y de practicidad y ética cuestionables aun cuando sus autores reclamen resultados comparables a la inseminación laparoscopica.

La inseminación intrauterina depositando el semen directamente en la porción superior de los cuernos uterinos fue aplicada inicialmente vía laparotomía ventral exteriorizando los cuernos uterinos y aplicando el semen usando una pipeta de vidrio con la punta en aguja hecha al fuego, el método fue usado para fertilizar ovejas superovuladas (Boland y Gordon, 1978), obviamente este método solo podía justificarse en cierta forma para experimentación con ovejas superovuladas . Una evolución del método sin embargo fue la aplicación del mismo principio (deposición del semen directamente en la parte superior del cuerno uterino) pero por vía laparoscopica (Maxwell et al., 1983). Nosotros en nuestra primera inseminación laparoscopica en el Perú (Vivanco et al., 1985) usamos en lugar de pipetas de vidrio pipetas plásticas de inseminación de vacunos a las cuales adherimos en una de las puntas una aguja hipodérmica de 21gx1/2" (este mismo concepto fue desarrollado posteriormente por los franceses produciendo los "aspics" comercialmente), en dicho ensayo inseminamos 980 ovejas sincronizadas con esponjas de progesterona (30 gr) hechas por nosotros y PMSG producido también por nosotros, el semen fue semen Corriedale congelado (pellets) importado de Australia, se obtuvo 46% de ovejas paridas y un promedio de 1.39 corderos por borrega que parió. Desde esos inicios de la inseminación laparoscopica a la fecha la técnica en si no ha variado pero se tienen ahora productos comerciales estandarizados tanto para la sincronización del celo, laparoscopia, instrumental de inseminación, etc. y se han definido con mas precisión los requerimientos de semen (numero de espermatozoides por dosis), momento de inseminación, etc., dando como resultado una técnica eficiente y que en promedio produce alrededor de 75% de fertilidad tanto con semen fresco o congelado (Evans, G. 1991). La figura 6 muestra el diagrama esquemático de la inseminación laparoscopica. Los recientes hallazgos de Gillan y Maxwell C. (1998) como mencione anteriormente identifican áreas de investigación y desarrollo que al resolverse sin duda resultaran en mayor eficiencia de la inseminación artificial ovina.

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2. Transferencia embrionaria en ovinos

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A. El estado actual de la tecnología de transferencia de embriones en el ovino. Áreas que requieren solución y mayor desarrollo tecnológico

El principal objetivo de la transferencia embrionaria es el incremento de la tasa reproductiva de las hembras en forma similar al rol de la inseminación artificial en el aumento de la tasa reproductiva de los machos. El incremento de la tasa reproductiva de las hembras permite utilizar al máximo las madres de alto valor genético como instrumento de mejora genética.

La transferencia embrionaria en ovinos es una tecnología reproductiva bastante exitosa y de uso muy común en programas de introducción de genotipos exóticos en diferentes ambientes. El desarrollo de métodos efectivos de sincronización del ciclo estral del ovino, el desarrollo de la laparoscopia que permite el uso de la inseminación intrauterina y la recolección y transferencia laparoscopica de embriones, el desarrollo de métodos mas adecuados de inducción de superovulacion y el manejo reproductivo fuera de estación han contribuido grandemente a llevar la transferencia embrionaria a niveles de eficiencia que justifican su aplicación económica en los programas de mejoramiento genético ovino.

Son sin embargo aun limitantes que se deben resolver las respuestas superovulatorias variables y el relativo bajo numero de embriones obtenidos por recolección.

B. Aspectos técnicos de la transferencia embrionaria en ovinos:

a) Control del ciclo estral y sincronización del celo; el momento de inseminación artificial en las dominantes con respecto al celo sincronizado.

Los tratamientos en donantes deben ser efectuados en días específicos del ciclo estral, esto requiere que el ciclo estral de las donantes sea controlado, por otro lado, si los embriones serán transferidos frescos ( no congelados), las donantes y recipientes deberán tener los ciclos estrales sincronizados de manera que el embrión sea transferido a un ambiente intrauterino similar al de la donante. En el caso de embriones congelados si las operaciones de transferencia embrionaria de los embriones congelados se requieren efectuar en un numero determinado de recipientes al mismo tiempo, dichas recipientes deberán tener el celo sincronizado para recibir embriones de una determinad edad al mismo tiempo. El control del ciclo y sincronización del celo son también ayudas de manejo para facilitar las operaciones de inseminación artificial de donantes y la recolección de embriones.

El ciclo estral de la oveja dura 16 a 17 días, la longitud del estro receptivo en la borrega es de 24 a 36 horas, el pico ovulatorio de LH se produce entre las 4 y 6 horas de iniciado el estro y la ovulación ocurre a las 20-24 horas del pico ovulatorio de LH ( Bearden y

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Fuquay, 1980). La figura 7, muestra la secuencia de los diferentes eventos fisiológicos del ciclo estral de la oveja.

La sincronización del celo se logra afectando y controlando la vida funcional del cuerpo luteo del ovario ya sea mediante la inducción de luteolisis (solo durante la estación reproductiva) aplicando protaglandina F2 alfa o sus análogos durante el diestro (por ejemplo una inyección de 50 a 100 ug de cloprostenol) entre los 9 días del celo si se conoce la fecha del celo anterior o dos inyecciones a un intervalo de 7 días si no se conoce la fecha del celo anterior ( Willadsen, S.M., 1979; Baril et al. 1993), o mediante la inducción de una fase luteal artificial lograda en base a la aplicación vía pesarios intravaginales de progesterona (por ejemplo CIDR-G,) o progestagenos (como F.G.A, M.A.P, Norgestomet) para imitar la fase luteal del ciclo estral . La progesterona y progestagenos pueden administrase también en forma de inyecciones diarias o como implantes subcutáneos pero es menos practico. En la oveja 10 a 12 días de tratamiento son suficientes. ( Corteel et al., 1988; Crosby et al.,1991; Ainsworth y Wolynetz, 1982).

Tratamientos prolongados de progesterona o progestagenos están asociados con menor fertilidad por lo que es más recomendado usar tratamientos cortos (Corteel et al., 1988).

Los progestagenos son mucho más potentes y efectivos que la progesterona. En LambXL y la ATC los programas de sincronización usando CIDR (progesterona) en donantes

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tenían que utilizar 2 CIDR por borrega, reemplazando la primera a los 8 días después de la inserción del primer CIDR y antes de iniciar las inyecciones de gonadotropinas de lo contrario muchas ovejas presentaban signos de celo aun estando con el CIDR insertado debido a la marcada baja en el nivel de progesterona en la sangre a partir del día 8 después de la inserción. Cuando se reemplaza el CIDR el día 8 este problema queda resuelto restableciéndose un alto nivel de progesterona. En el caso de recipientes, en que no se usan altos niveles de gonadotropinas, con un solo CIDR por oveja es suficiente. La ventaja de los CIDRs estriba en que son más fáciles de aplicar y el porcentaje de perdidas de CIDRs es muy bajo comparado al de las esponjas vaginales de progestagenos. Así mismo se observa menos incidencia de adherencias vaginales, hemorragias, secreciones pútridas, etc. en el caso de CIDR que de esponjas.

La concentración del principio activo varia de acuerdo al producto usado y la estación y edad determina que concentración es la mas adecuada. El cuadro 10 muestra las concentraciones por producto y su uso recomendado.

Cuadro 10. Algunos productos usados para la inducción de fase luteal en ovejas.Sustancia Producto comercial concentración uso recomendadoProgesteronapesario vaginal

CIDR_G 40 gr Ovejas adultas, borreguillas

M.A.Ppesario vaginal

Repromap 60 mg Ovejas adultas, borreguillas

F.G.Apesario vaginal

Chronogest 30 mg Ovejas adultas fuera de estación

F.G.Apesario vaginal

Chronogest 40 mg Ovejas adultas, borreguillas en estación reproductiva

Norgestomet, implante subcutáneo en la base de la oreja

Crestar 3mg Ovejas jóvenes y adultas, cabras

A la remoción del pesario vaginal, el cuerpo luteo ha regresionado por efecto de la progesterona exógena y se suceden las fases del pro-estro, el estro y la ovulación en la secuencia normal pero con ciertas variaciones en la duración de algunos eventos fisiológicos. El intervalo de tiempo desde la remoción del pesario vaginal o suspensión del tratamiento con progesterona/progestagenos a la presentación del celo receptivo es la característica mas afectada y es mas corto en el caso de CIDR en comparación a los progestagenos existiendo además variaciones en la duración de este intervalo entre los

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progestagenos (cuadro 11). El intervalo desde la terminación del tratamiento progestacional y el inicio del celo esta también influenciado por el uso de gonadotropinas al final de la fase luteal artificial, el tipo , dosis y momento de aplicación de gonadotropinas antes de la suspensión del tratamiento de progesterona/progestagenos, siendo mas corto cuando se aplican gonadotropinas que cuando no , cuando la actividad de LH en la gonadotropina es mas elevada, cuando la dosis de gonadotropina es mas elevada y cuando la aplicación de la gonadotropina se hace con mayor anticipación a la finalización del tratamiento progestacional. (Walker, S.K. et al. 1989).

Cuadro 11. Intervalo desde el fin de tratamiento progestacional hasta el inicio del celo receptivo y ovulación en la borrega dependiendo del producto usado para la inducción de la fase luteal artificialProducto Intervalo promedio desde

la finalización del tratamiento hasta el inicio del celo receptivo

Intervalo promedio desde la finalización del tratamiento hasta el momento de ovulación

Progesterona, CIDR, pesario vaginal 27 hrs 51 hrs

Norgestomet, Crestar, implante subcutaneo 30 hrs 55 hrs

F.G.A., Chronogest, esponja vaginal

38 hrs 63 hrs

M.A.P, Repromap, esponja vaginal

45 hrs 69 hrs

Fuente: LambXL y ATC, resultados 1987-1994; Walker et al., 1989.

Es importante notar que el intervalo entre el pico ovulatorio de LH y el momento de ovulación es prácticamente una constante fisiológica de una duración de 20 horas en la borrega ( Cognie et al.,1987; Jabbour et al. 1991). El intervalo entre el momento de inicio del celo y el pico ovulatorio de LH es también casi constante en animales que no han recibido ningún tratamiento superovulatorio, sin embargo en animales tratados con gonadotropinas este intervalo (normalmente de 4 a 6 horas) es más variable ya que esta influenciado por el nivel de estrógeno producido y por el nivel de "stress" que se haya impuesto.

La adopción de inseminaciones a "tiempo fijo" con miras a reducir costos de mano de obra se basan en los tiempos promedios desde la suspensión de los tratamientos progestacionales a la ovulación y normalmente se hacen entre 6 y 8 horas antes del momento esperado de ovulación. El momento de inseminación debe ser aun más cercano al momento de ovulación cuando se trata de semen congelado. Personalmente yo no uso "inseminación a tiempo fijo" en mis programas, ya que la variación individual en el intervalo desde la finalización del tratamiento progestacional a la iniciación del celo

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receptivo es muy grande, mucho más aun cuando interacciona con la dosis y tipo de gonadotropinas usadas. La variación es mucho más marcada si los regímenes hormonales son deficientes. En LambXL luego de muchos anos de experimentación alcanzamos a lograr un régimen hormonal que nos dio distribuciones mas predecibles pero aun así continuamos usando inseminaciones en base a celo detectado. En promedio el intervalo de inicio de celo después de la remoción de los CIDR en ovejas donantes tratadas con gonadotropinas para superovulacion en los programas de transferencia embrionaria en LambXL y la Australian Texel Corporation (ATC) mostraron la tendencia referida en el cuadro 12.

Cuadro 12. Típica distribución del inicio del celo desde la remoción del CIDR en ovejas tratadas para superovulacion en LambXL y la ATC durante el otoño.Hora de detección de celo después de la remoción del CIDR(8 AM del día cero)

Intervalo desde la remoción del CIDR a la detección del celo

% de ovejas en celo al momento de la detección

% acumulativo de ovejas en celo

Momento de la inseminación intrauterina laparoscopicabasada en la hora de presentación del celo

Momento esperado de ovulación

Eventual momento de inseminación si se hubiera hecho a "tiempo fijo"a las 48 horas después de la remoción de CIDR

8 PM, día 0 12 hrs 2.5 % 2.5% 8 AM, día 1 8 PM, día 1 8 AM día 2

8 AM, dia 1 24 hrs 30.0 % 32.5% 5 PM , dia 1 8 AM, dia 2 8 AM dia 2

Medio Dia, dia 1

28 hrs 60.0 % 92.5% 8 PM, dia 1 Medio Dia, dia 2

8 AM dia 2

8 PM, dia 1 36 hrs 5.0% 95.0% 8 AM, dia 2 8 PM , dia 2 8 AM dia 2

8 AM, dia 2 48 hrs 2.5% 100.0% 5 PM, dia 2 8 AM, dia 3 8 AM dia 2

Como se aprecia en el cuadro 12, una inseminación a "tiempo fijo" a las 48 horas de la remoción del CIDR que es lo que se usa tradicionalmente (Vallet y Baril, 1990; Brevion et al., 1992) hubiera sido 12 horas después de la ovulación para el primer grupo, justo al momento de ovulación para el segundo grupo, 4 horas antes de la ovulación para el grupo en celo a medio dia, 12 horas antes de la ovulación para el cuarto grupo y al inicio del celo (24 horas antes de la ovulación) para el ultimo grupo. Por lo que antes de decidir en usar un "tiempo fijo de inseminación" mas optimo es primero aconsejable conocer la propia distribución de celos del régimen hormonal que uno usa. En este caso el "tiempo fijo" hubiera sido mas optimo a 36 horas desde la remoción del CIDR. Debe tenerse en cuenta que el "tiempo o momento fijo" de inseminación optimo para vejas no superovuladas no es igual al momento fijo optimo para ovejas superovuladas pues los

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niveles de estrógenos, numero de folículos a ovularse, etc. modifican totalmente los intervalos observados en ovejas no superovuladas.

En recipientes bajo régimen de CIDR y que reciben entre 200 a 500 u.i. (unidades internacionales) de PMSG al momento de la remoción del CIDR, el pico de actividad estral se presenta a las 36 horas (alrededor del 50% de la población) de la remoción y un 25 a 35% entra en celo a partir de las 48 horas pero por lo menos un 15 a 20% de los animales muestran celo a las 24 horas de la remoción, este porcentaje de celos tempranos se incrementa si la aplicación del PMSG se hace 24 horas antes de la remoción del CIDR.

Tanto en LambXL como en la ATC se uso siempre carneros vasectomisados con chalecos marcadores para la detección de celos tanto en ovejas donantes como recipientes. El uso de machos marcadores tiene la ventaja adicional de estimular secreción de LH como consecuencia del efecto de macho (ver Cognie Y. 1990) lo que favorece la maduración folicular y ovulación. Los programas de "tiempo fijo" de inseminación o de uso de recipientes a tiempo fijo para transferencia son muy riesgosos y solo deben ser utilizados cuando se conoce bien la distribución de celos de la población para el régimen y estación en la cual se trabaja.

b) Estimulación de la superovulacion:

Muchos trabajos de investigación se han publicado en relación a regímenes de estimulación hormonal para superovulacion en ovinos. Los tratamientos más simples han sido los basados en una sola inyección de PMSG (debido a su larga vida media) de alrededor de 1500 a 2000 u.i, variando de acuerdo a razas y edades, aplicada 48 horas antes de la suspensión del tratamiento progestacional (Armstrong y Evans, 1983; Armstrong et al., 1983). Los resultados con PMSG fueron muy variables y se observo alta incidencia de folículos no ovulados lo cual esta ligado a baja fertilización y pobre "calidad " de embriones tal como veremos mas adelante. Otros tratamientos ensayados incluyeron HAP ( extracto de pituitaria anterior de equino) y HMG ( gonatotropina menopausica humana) con resultados variables (Moore y Eppleston, 1979; Schiewe et al., 1985;). La purificación y disponibilidad comercial de FSH de pituitarias de porcino ( FSH-P; Folltropin V; Stimufol; Super -Ov) y ovino ( Embryo-S; Ovagen) marcaron la iniciación de nuevas estrategias superovulatorias. Las inyecciones de FSH se efectúan mayormente en dosis repetidas cada 12 horas (debido a la corta vida media de la FSH) ya sea en niveles constantes o decrecientes, iniciándose por lo general 3 días antes de la suspensión del tratamiento progestacional, siendo la ultima inyección dada ya sea al momento de la suspensión del tratamiento progestacional o 12 horas mas tarde (Maxwell et al., 1990). Los niveles de tratamiento varían entre razas. Usando los tradicionales " mg Unidades Armour" ( un miligramo Armour es una unidad de actividad biológica correspondiente a 10-14 ug de hormona FSH pura) , los regímenes para ovinos usados en LambXL y la ATC emplearon en promedio 25 a 28 mg Armour para Finnish Landrace, 30 a 32 mg Armour para Texel de origen finlandés y 34 mg Armour para Texel de origen danés.

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Algunos autores han encontrado una perdida de sensitividad (o desarrollo de refractoriedad) con disminución en respuesta ovulatoria en ovejas sometidas a repetidos tratamientos superovulatorios con FSH de origen porcino debido a la aparición de anticuerpos anti pFSH (Remy et al., 1991) y mencionan que esta disminución no ha sido observada cuando las ovejas han recibido tratamientos sucesivos con FSH de origen ovino ( Baril et al., 1992). Nosotros en LambXL y la ATC hemos tratado cada oveja 7 veces al ano por hasta 6 anos consecutivos con FSH mayormente de origen porcino y no hemos observado disminución alguna en la tasa ovulatoria, el numero de previos tratamientos no tuvo efecto significativo en la tasa de ovulación como se aprecia mas adelante en el cuadro 21.

Otro de los puntos de gran discusión en el mundo científico ha sido el referente a la forma de aplicar el FSH ( inyecciones constantes o decrecientes) siendo más recomendable inyecciones decrecientes ( Torres S. et al., 1987) y al nivel de contaminación de LH presente en la fuente de FSH. Numerosos trabajos preconizaron el uso de determinada relación LH/FSH, mientras más bajo el nivel de LH mejor (ver revisión por Maxwell et al., 1990; Chupin D. et al., 1987). Nuevos productos en el mercado ( por ejemplo Ovagen) prácticamente no contienen LH y Folltropin-V tiene un nivel máximo de 5%. Sin embargo, cuando se usan estos productos bajos en nivel de LH como única droga para la superovulacion, la respuesta es bastante pobre ( McMillan W. H. y Hall, D.R.H. 1990) y peor aun si hay factores que causen "stress" en los animales. Esto indujo la introducción "paradojica" de PMSG en los tratamientos basados en FSH de bajo nivel de contaminación de LH , es decir se introdujo un producto de alta actividad de LH para combinarse con tratamiento de FSH pura o de baja contaminación de LH. Los primeros ensayos recomendaron administración del PMSG a la primera inyección de FSH lo cual no incremento substancialmente los resultados (McMillan W. H. y Hall, D.R.H 1990; Greaney K. B. et al., 1991; Rangel-Santos R, 1991; ver también el cuadro 15 mas adelante) . Una estrategia más satisfactoria fue la de inyectar PMSG 48 horas antes de la terminación del tratamiento progestacional, en combinación con dosis repetidas de FSH o una sola dosis de FSH al momento de la aplicación de PMSG (Maxwell y Wilson, 1989).

Otras estrategias han incluido la aplicación (además del tratamiento superovulatorio al final del diestro inducido) de una dosis de FSH temprano ("priming") en el ciclo durante la fase luteal ( 4 días después de la inserción del CIRD ) imitando el pico en FSH que se produce en forma natural en la fase temprana del diestro, esta practica fue preconizada por los distribuidores de FSH sin embargo nuestros resultados usando esta estrategia fueron contraproducentes. El uso de GnRH al momento del celo dio resultados variables (Walker, S.K. et al., 1989; Rangel-Santos R, 1991), nuestros experimentos en LambXL no resultaron en mejora significativa de los diversos parámetros (cuadro 13), sin embargo dado a que nuestros ensayos sobre uso de GnRH se hicieron antes de que llegáramos a un régimen gonadotropico optimo, pensamos que su efecto debe ser estudiado nuevamente dentro de nuestra nueva estrategia de superovulacion. Nuestros experimentos en el uso de vacunación contra inhibina en animales superovulados, tuvo efecto solo en animales jóvenes (cuadro 14) y ensayos de vacunación contra esteroides sexuales en ovejas superovuladas (Rangel-Santos, R., 1991) tampoco resultaron en incrementos

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sustanciales. Nuestros ensayos con Neutra PMSG en ovejas tratadas con PMSG tampoco resultaron en mejoras significativas ( Vivanco H. W. et al., 1992).

Cuadro 13. Efecto de la inyección de GnRH al momento del inicio del celo sobre los diferentes parámetros medidos en ovejas superovuladas

GnRH * ControlN Promedio ± SE N Promedio ± SE

No de ovulaciones/oveja 65 3.96 ± 0.28 (a) 68 3.55 ± 0.28 (a)

No de Folículos no eclosionados/oveja 65 0.69 ± 0.13 (a) 68 0.69 ± 0.13 (a)

Tasa de recoleccion % 40 63.81 ± 4.73 (a) 39 57.37 ± 4.79 (a)

Tasa de fertilización % 38 84.70 ± 5.40 (a) 34 81.60 ± 5.97 (a)

% embriones de calidad transferible 34 89.37 ± 4.98 (a) 34 83.86 ± 0.28 (a)

Embriones transferibles/oveja 38 2.12 ± 0.26 (a) 29 1.54 ± 5.50 (a)

* 1 ml Fertagyl ( Intervet, Holland) al momento de detección del celoPromedios con igual letra en paréntesis no son diferentes estadísticamente (p>0.05)Fuente: LambXL. 1991.

Cuadro 14. Efecto de la vacunación contra inhibina en la producción de embriones transferibles por oveja Finnish Landrace bajo tratamiento superovulatorio.

Embriones transferibles por oveja programada n Promedio

Ovejas adultas, vacunadas 31 10.48 (a)

Ovejas adultas, control 33 10.06 (a)

Borreguillas, vacunadas 37 10.78 (a)

Borreguillas, control 29 7.00 (b)

Fuente: ATC.1993.

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c) La nueva estrategia hormonal usada en LambXL y la ATC:

La gran variabilidad en las respuestas a los tratamientos superovulatorios es considerada como el factor más limitante de la transferencia embrionaria en todas las especies. Después de varios anos de experimentación, en los anos 1992 y 1993 en LambXL y durante nuestros trabajos en la ATC en 1993 y 1994, modificamos totalmente la estrategia construyendo hipótesis basadas en una observación más minuciosa de la fisiología del ciclo ovárico y estral. En primer lugar, es conocido que es la FSH y no la LH la que es necesaria para desarrollar los folículos primarios (Driancourt, M.A. y Fry R.C., 1988; Driancourt, M.A. et al. 1993) por lo que planteamos que el reclutamiento de folículos del grupo de folículos sensitivos a gonadotropina y su desarrollo tiene que estar basado en la utilización de FSH con muy bajo nivel o completamente libre de contaminación de LH. La utilización de inyecciones de PMSG al momento de la primera inyección de FSH (tal como era recomendada por algunos investigadores (McMillan W.H. y Hall, D.R.H.1990) y que fuera adoptada por nosotros inicialmente (cuadro 15) estaría induciendo una maduración y/o luteinizacion folicular muy temprana. Una vez que el foliculo alcanza cierto grado de desarrollo es que hay un cambio de dependencia del foliculo de FSH hacia LH (Draincourt, M.A y Fry R.C, 1988; Driancourt, M.A. et al. 1993), por lo tanto la inyección de una fuente de LH debería hacerse al final del periodo de desarrollo folicular, es decir prácticamente a la 6ta inyección de FSH. La fuente de LH debe imitar la secreción pulsátil o incremento gradual de LH que se observa en el pro estro y no producir una especie de pico que estaría mas bien imitando el pico ovulatorio, por ello es mejor usar PMSG y en bajo nivel y no HCG , o LH directamente o GnRH como fue usado por otros autores (Wright, R. W. et al., 1981; Chupin D. et al., 1987; Walker, S.K. et al., 1989). Nosotros probamos esta hipótesis (imitar nivel creciente de LH durante el pro-estro) en un pequeño ensayo para observar las tendencias (cuadro 16), confirmando nuestra expectativa de mejores resultados si el PMSG se aplica al momento de la remoción del tratamiento progestacional. Es conocido que la aplicación exógena de FSH y PMSG decrecen la secreción endógena de FSH y los pulsos endogenos de LH (Bevers, M.M. et al., 1988) , el pico ovulatorio de LH sin embargo, ya que es producido como respuesta a los altos niveles de estrógeno que se generan en el pro estro e inicio del estro y que son aun más altos en el caso de superovulacion ( Jabbour H.N., et al., 1986) tendría menos chance de ser bloqueado por el tratamiento exógeno de gonadotropinas. Todo esto sugiere que una vez que uno inicia el tratamiento superovulatorio uno debe desestimar los niveles endogenos de FSH y proporcionar apoyo de FSH exógeno todo el tiempo. Los tratamientos tradicionales de superovulacion sin embargo están basados en la aplicación de un determinado numero fijo de inyecciones de FSH aplicadas todas durante el diestro (antes de remover el tratamiento progestacional), poniendo la ultima dosis al momento de suspender el tratamiento progestacional o máximo 12 horas después, esto esta privando de FSH a los folículos en la fase mas critica de su desarrollo ( el pro-estro), las inyecciones de FSH deben continuar hasta que la donante inicia el celo receptivo. Nosotros probamos nuestra hipótesis comparando donantes que fueron inyectadas con FSH hasta el inicio del celo inclusive, hasta 12 horas antes del inicio del celo (no inyectadas al momento de la detección) y otras que recibieron la ultima inyección 12 horas después de la remoción del progestageno y no

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volvieron a ser inyectadas y que entraron en celo después de 24 y 36 horas de la ultima inyección de FSH. Los resultados se muestran en el cuadro 17.

Cuadro 15 . Promedio de producción de embriones transferibles por oveja donante (Ovejas Danish Texel de 1.5 anos de edad) obtenido para algunos regímenes hormonales ensayados en LambXL el periodo 1990-1992.*

FSH-P :34 mg Armour, 7 inyecciones decrecientes

OVAGEN: 15.2 ml en 7 inyecciones decrecientes, 300u.i PMSG a la primera inyección de Ovagen

FOLLTROPIN: 12.8 ml en 7 inyecciones decrecientes, 100 u.i PMSG a la primera inyección de Folltropin

No de ovejas tratadas 14 54 100

No de ovejas operadas

13 (92%) 47 (87 %) 85 (85%)

Embriones transferibles por oveja operada ± SD

4.0 ± 3.08 2.6 ± 5.2 4.45 ± 3.1

Embriones transferibles por oveja tratada ± SD

3.71 ± 2.8 2.3 ± 5.0 3.78± 2.65

* CIDR removida a la 6ta inyección Fuente: LambXL

Cuadro 16. Efecto de la aplicación de PMSG a diferentes tiempos en relación al inicio del tratamiento con FSH y la terminación del tratamiento progestacional en ovejas Romney Marsh superovuladas con Folltropin-V*

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200 u.i PMSG al inicio del tratamiento con FSH

200 u.i PMSG a la 6ta inyección de FSH al momento de remoción del CIDR

100 u.i al inicio del tratamiento con FSH y 100 u.i a la 6ta inyección de FSH al momento de remoción del CIDR

N Promedio ± SD

N Promedio ± SD

N Promedio ±SD

Intervalo remoción del CIDR al inicio del celo Hrs 5 21.6 ± 9.90 5 25.6 ± 9.90 5 19.2 ± 9.90

Ovulaciones por Oveja

5 3.6 ± 1.88 5 9.6 ± 1.88 5 7.6 ± 3.9

Tasa de recolección %

4 76.3 ± 30.80 5 54.8 ± 52.67 5 88.3 ± 59.04

Tasa de fertilización %

4 93.8 ± 72.16 4 100.0 ± 72.16 5 90.9 ± 64.03

Embriones transferibles por oveja operada

4 3.0 ± 0.72 4 7.0 ± 1.63 5 5.4 ± 3.49

Embriones transferibles por borrega tratada

5 2.4 ± 0.64 5 5.6 ± 1.47 5 5.4 ± 3.49

Porcentaje de embriones transferibles

4 100.0 ± 72.16 4 100.0 ± 72.16 5 80.0 ± 64.03

*régimen: Cidr-In dia cero, PMSG en los momentos señalados, Folltropin-V: 2.8,2.8,1.4,1.4,1.0,1.0 ml, CIDR-removida, continuacion 0.8 ml Folltropin cada 12 hrs hasta el comienzo del celo (exclusive).Fuente: LambXL 1991.

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Cuadro 17. Efecto de la continuación de las inyecciones de FSH hasta el momento del inicio del celo en ovejas Texel superovuladas con Ovagen.

Inyectadas con Ovagen hasta el momento de presentación del celo inclusive

suspensión de las inyecciones de Ovagen al momento del inicio del celo

suspensión de las inyecciones de Ovagen al momento del inicio del celo

Numero fijo de inyecciones, ultima inyección 12 hrs después de remoción del CIDR

Intervalo entre ultima inyección de Ovagen y el inicio del celo

0 hrs 12 hrs 12 hrs 24 hrs

Numero total de inyecciones

8 7 8 8

Intervalo remoción del CIDR al inicio del celo

12 hrs 12 hrs 24 hrs 36 hrs

N Prom.±SD N Prom.±SD N Prom.±SD N Prom.± SD

Numero total de embriones transferibles por oveja tratada

19 3.4±0.6 (a) 24 1.1±0.3 (b)

43 1.3±0.3 (b)

6 0.3±0.3 (b)

Letras diferentes entre paréntesis indican diferencia significativa (P£ 0.05)Fuente: LambXL 1991.

Como producto de todos estos ensayos que confirmaron nuestra hipótesis reformulamos nuestra estrategia definiendo nuestro régimen de 1992 en adelante en la siguiente forma:

Nuestro régimen en LambXL y ATC aplica el PMSG al final del tratamiento progestacional y sigue aplicando FSH, no importa cuantas dosis se requieran, hasta que la donante es marcada en celo ( si es encontrada en celo al momento de la detección ya no

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recibe mas FSH). Estos cambios en la estrategia de tratamientos hormonales constituyeron uno de los más importantes avances en nuestro programa de transferencia embrionaria. El porcentaje de ovejas que entraron en celo y que ovularon después del tratamiento se elevo de un 80-85% a prácticamente 100% y el numero de embriones producidos por donante prácticamente se duplico, no mostró ninguna variación en respuesta entre estaciones, todas las razas respondieron satisfactoriamente así como fue efectivo tanto en adultas como en borreguillas de primer celo ( ver cuadros 18, 19 y 20).

Cuadro 18. Resultados obtenidos en la ATC durante las estaciones de primavera y otoño aplicando la nueva estrategia superovulatoria. Todas las razas confundidas (Danish Texel, Finnish Texel, Finnish Landrace)

Primavera 1993 Otoño 1994N Promedio ± SD N Promedio ± SD

No de ovulaciones/oveja 1544 10.16 ± 5.63 1190 9.45 ± 5.71

Tasa de recolección % 1385 77.02 ± 26.70 1139 76.10 ± 30.11

Tasa de fertilización % 1363 94.27 ± 16.89 1089 90.87 ± 23.81

Embriones transferibles por oveja tratada 1596 6.30 ± 5.23 1213 6.13 ± 5.39

Porcentaje de embriones de calidad transferible 1339 85.55 ± 25.12 1039 88.27 ± 22.79

Fuente: ATC.

Cuadro 19. Comportamiento de ovejas donantes en diferentes parámetros de la superovulacion y transferencia de embriones de acuerdo a la raza durante la estación reproductiva (otoño) usando la nueva estrategia de tratamiento hormonal Razas Danish Texel Finish Texel Finnish LandraceVariables N Promedio± SD N Promedio ± SD N Promedio± SD

No de CL/oveja donante 523 7.1± 4.1 433 11.0 ± 5.5 234 11.9 ± 7.0

Tasa de colección (%) 508 78.0± 30.8 415 72.9 ± 29.1 216 77.7 ± 30.0

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Tasa de fertilidad (%) 480 90.7± 24.0 407 93.2 ± 20.4 202 86.5 ± 28.7

Embriones transferibles/donante 536 4.7± 3.97 438 7.0 ± 5.4 239 7.8 ± 7.0

Porcentaje de embriones transferibles sobre embriones totales

458 88.0± 23.18 393 90.0 ± 20.4 188 85.1 ± 26.0

Fuente: Australian Texel Corporation (ATC), Resultados Otoño 1994.

Cuadro 20. Comportamiento de borreguillas de primer celo nacidas en Nueva Zelanda en la primavera de 1992 y usadas como donantes superovuladas en la estación de otoño de 1993 en Australia ( 7 meses de edad) bajo la nueva estrategia de tratamiento hormonal.

Danish Texel Finnish Texel Finnish LandraceN Promedio ± SD N Promedio± SD N Promedio±

SDNo de ovulaciones por borreguilla 42 6.71 ± 27 9.3 ± 12 6.16 ±

Tasa de recolección % 37 74.08 ± 28.63 25 64.38 ± 32.76 9 75.11 ± 34.25

Tasa de fertilización % 37 95.27 ± 11.70 24 96.70 ± 10.78 8 100.00 ± 0.00

Embriones transferibles por borreguilla tratada 45 4.02 ± 3.71 27 5.55 ± 4.01 12 4.00 ± 3.74

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Porcentaje de embriones de calidad transferible 37 85.93 ± 22.49 24 94.00 ± 20.46 8 86.45 ±

18.00Fuente: ATC. 1993.

El régimen hormonal se aplico en forma consecutiva por 4 veces durante la estación reproductiva (otoño) y 3 veces en la primavera cada ano (sin mayores diferencias entre estaciones). La estrategia de óptimos resultados para nosotros consistió en: Insertar el CIDR e inyectar prostaglandina F2 alfa (día cero), reemplazo de CIDR (día 8), inyecciones de FSH (decreciente) cada 12 horas día 8, 9 y 10; remocion del CIDR a la 6ta inyeccion de FSH, aplicacion de PMSG al momento de la remocion del CIDR, introduccion de machos vasectomisados marcadores al momento de remocion del CIDR, observacion de celos cada 6 a 12 horas, continuacion de inyecciones de FSH (al mismo nivel del de la inyeccion dada al momento de la remocion del CIDR) cada 6 a 12 horas a todas las donantes no marcadas en celo . suspensión de FSH a las ovejas encontradas marcadas en celo. Inseminación intrauterina laparoscopica con semen fresco ( mínimo 50 millones de espermatozoides motiles por oveja, optimo de 75 a 80 millones) inseminando en ambos cuernos uterinos, 8 a 12 horas después de la detección de celo. Recolección de embriones 7 días después del inicio del celo. Inyección de prostaglandina al momento de recolección de los embriones, repetición de prostaglandina si la donante no entro en celo hasta 5 días después de la inyección de prostaglandina inyectada al momento de la recolección, inserción de CIDR para la siguiente ronda de transferencia 7 a 9 días después de la recolección de embriones. aplicación de otra dosis de prostaglandina a las donantes que recibieron el CIDR sin haber entrado en celo desde la recolección anterior. Repetición del ciclo descrito.

Esta nueva estrategia aplicada mayormente a Texel y Finnish Landrace (ver resultados cuadro 19), la usamos también para ovinos Ramboullet, Romney, y Merino con muy buenos resultados y pensamos que es un nuevo patrón de superovulacion a ser usado no solo en ovinos sino en otros rumiantes.

d) Factores que afectan la producción de embriones transferibles:

El cuadro 21 muestra los resultados del análisis de cerca de 9 mil superovulaciones hechas en LambXL durante 6 anos, lo que constituye talvez la más grande cantidad de información en transferencia embrionaria ovina a nivel mundial. Los resultados están expresados como porcentaje de la variación corregida total que es explicado por el efecto del factor especifico analizado.

En nuestra población y bajo nuestras condiciones de manejo y regímenes hormonales, el numero de ovulaciones o tasa de ovulación estuvo afectado en forma altamente

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significativa por la raza de las donantes dentro de cada ano analizado (ver también cuadro 22 ), el intervalo entre la remoción del CIDR y el inicio del celo ( intervalo muy corto ovulación pobre, intervalo medio ovulación alta, intervalo largo ovulación pobre), la estrategia hormonal de la superovulacion (ver también Cuadros 15 y 16) , la granja ( en LambXL teníamos 5 granjas en lugares diferentes y manejadas por diferentes personas), la "calidad del cuerpo luteo" ( animales mostrando cuerpos luteos de aspecto diferente del normal tienen bajo numero de ovulaciones), presencia de folículos de mas de 5 mm al momento de la recolección de embriones ( mayor numero de folículos estrogenicos y no eclosionados presentes al momento de la recolección, menor tasa de ovulación. Este factor fue responsable del 65% de la variación observada en tasa de ovulación), el inseminador ( ciertos inseminadores, probablemente los que aplicaban mayor "stress" en los animales afectaban la tasa de ovulación). Ninguno de los siguientes factores analizados afecto la tasa de ovulación: el intervalo entre inicio del celo y el momento de ovulación, la estación reproductiva y el numero de veces que la donante recibió anteriormente tratamientos hormonales y fue operada (esto ultimo indica que en nuestro caso no existió refractoriedad a los tratamientos hormonales).

La tasa de recolección de embriones ( numero de embriones colectados en relación al numero de ovulaciones registradas) esta afectada en forma significativa por la raza de la donante dentro de cada ano, el intervalo desde la remoción del CIDR hasta la presentación del celo (siguiendo la misma tendencia referida para el caso de tasa de ovulación), el régimen hormonal para la superovulacion, las granjas donde se mantuvieron los animales, la estación del ano, el numero de veces que la oveja fue sometida a tratamientos y operaciones anteriormente (ver también figura 8), la "calidad de cuerpo luteo" (misma tendencia que la referida para tasa de ovulación, y fue el factor que más explico la variabilidad total observada en tasa de recolección, siendo responsable de 34% de la variación total observada), la presencia de folículos de mas de 5mm de diámetro al momento de la colección ( mas folículos menor tasa de recolección), el cirujano haciendo la recolección. Los factores analizados que no afectaron la tasa de recolección fueron: el inseminador, la técnica de colección de embriones, el intervalo del inicio del estro a la inseminación, la edad del embrión, el embriólogo.

Los factores que afectan en forma significativa la tasa de fertilización ( numero de embriones recolectados en relación al numero total de embriones mas ovocitos no fertilizados recolectados) son: el intervalo desde la remoción del CIDR hasta el inicio del celo (siguiendo la misma tendencia descrita para los otros factores, explicando 35% de la variación), el régimen hormonal de superovulacion, el numero de veces que la donante fue tratada y operada anteriormente (este factor fue el que más afecto la fertilidad, explicando 43% de la variancia, ver también figura 9). Los factores analizados y que no afectaron la tasa de fertilidad fueron: la raza de la donante dentro de cada ano, la granja, la estación del ano, la calidad del cuerpo luteo, la presencia de folículos de mas de 5mm, el inseminador, el carnero usado.

Los factores que afectan en forma significativa la tasa de embriones de calidad transferible ( numero de embriones transferibles o de buena calidad sobre el numero total de embriones recolectados) son: la raza de la donante dentro de cada ano (fue el factor

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que más afecto esta variable, explicando 30% de la variancia), el intervalo desde remoción del CIDR hasta el inicio del celo ( misma tendencia que la ya descrita), el régimen hormonal de superovulacion, la calidad del cuerpo luteo, el numero de folículos de mas de 5 mm en diámetro presentes al momento de la recolección ( mas folículos, menos calidad transferible del embrión), el intervalo del inicio del celo al momento de inseminación ( en la misma tendencia ya descrita), la edad del embrión ( menor edad, menor calidad transferible), el embriólogo ( probablemente debido a diferencias en apreciación de la calidad de los embriones). No hubo efecto significativo de las granjas, estación del ano, numero de tratamientos y operaciones anteriores y de carneros.

Es importante anotar que algunos factores pueden ser significativos en otras condiciones o para otras poblaciones, por ejemplo en nuestro caso no encontramos efecto del método de recolección de embriones y de cirujanos en la tasa de colección, esto refleja que todos nuestros métodos estaban optimizados y nuestros técnicos estaban al mismo nivel de experiencia, esto puede no ser cierto en otras poblaciones. Es también muy importante señalar que a pesar de la gran cantidad de detalle que se registro, tomándose en cuenta

prácticamente todo parámetro medible, el coeficiente de determinación del modelo (R2) fue solo de 14 a 24 % dependiendo del factor analizado lo cual indica que existen una serie de factores que influyen los resultados y que no han podido ser medidos, probablemente la mayoría de efectos son debidos a complejas interacciones entre todos los factores.

Cuadro 21. Factores que afectan los diversos parámetros de la transferencia embrionaria en el ovino. Valores expresados como proporción de la varianza corregida total observada para cada característica que es explicada por el respectivo factor analizado. Factores

Variables

Tasa de ovulación

Tasa de Recolección

Tasa de Fertilización

Porcentaje de embriones transferibles

Raza de donante dentro de ano 8.90 26.41 NS 29.90

Intervalo remoción del CIDR al estro

11.37 6.60 34.94 15.96

régimen hormonal1.35 1.86 11.93 4.04

Granja 2.36 7.64 NS NS

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Estación del ano NS 1.21 NS NS

Numero de tratamientos y operaciones previas

NS 4.19 43.03 NS

Calidad del Cuerpo Luteo 10.02 33.57 NS 17.90

Presencia de folículos de mas de 5mm

65.26 12.57 NS 12.36

Intervalo inicio de celo a momento de Inseminación

NS NS 7.88 7.37

Inseminador 0.51 NS NS -

Método de colección de embriones

- NS - -

Carnero - - NS NS

Edad de embrión - NS - 7.37

Embriólogo - NS - 10.16

Cirujano - 4.69 - -

Numero de observaciones 4789 4041 4577 3768

R2 24.7 11.6 20.50 14.10

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Fuente: H W Vivanco, et al. 1994

Tasa de Fertilización de acuerdo al numero de colecciones previasTécnica Promedio±SD Y= a± bx valor de P

1953 Laparoscopica 55.75± 32.54 58.55 - 1.63 0.011

1789 Quirúrgica 54.05± 34.00 55.07 - 0.57 0.474

Figura 9. Tasa de fertilización de acuerdo al numero de colecciones previas

Tasa de recolección de acuerdo al numero de operaciones previas

Técnica Promedio±SD Y= a ± bx valor de P2141 Laparoscopica 55.75± 32.54 58.55 - 1.63 0.011

2172 Quirurgica 54.05± 34.00 55.07 - 0.57 0.474

Figura 8. Tasa de recolección de acuerdo al método y el numero de operaciones previas

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En adición a todos los factores analizados, el estado nutricional del animal y su condición general son muy importantes (SEIT CF. y Steward, R.D.1990). Las donantes y recipientes deben estar en buena condición y recibiendo una nutrición balanceada. Como medida practica de manejo tanto en LambXL como en la ATC las ovejas tanto donantes como recipientes eran sometidas a esquila, desparasitacion y vacunaciones por lo menos 8 semanas antes de la recolección de embriones. El plano nutricional era elevado del nivel de mantenimiento (100%) hasta un nivel de 130% es decir 30% sobre el nivel de mantenimiento. Esta elevación se hacia en forma gradual y en un lapso de 6 semanas generalmente ofreciendo suplementos de granos (maíz, lupinos).

Un problema frecuente, es la regresión temprana del cuerpo luteo en donantes, esto ha sido ligado a deficiencia energética y se corrigió con suplementacion con granos de lupinos (Jabbour et al., 1991). Nuestras observaciones en ovinos ( subjetivas ya que no hemos tabulado información) sugieren que el nivel de stress es el factor más responsable de la regresión luteal temprana. El stress puede ser exacerbado por el hecho de tener que poner en ayuno pre operatorio a la donante por un periodo prolongado ocasionando una brusca caída del nivel de glucosa en la sangre. Cualquiera que sea el factor desencadenante , la regresión luteal al final depende de la secreción de prostaglandina F2 alfa. Algunos autores han usado bloqueadores de la protaglandina (Flunixina 2,2 mg/Kg) para corregir exitosamente esta situación ( Battye et al. 1988). En Australia observamos cierta incidencia de regresión temprana del cuerpo luteo tanto en donantes como en recipientes durante larga exposición a forrajes secos (no verdes) la que fue asociada a bajos niveles de Vitamina A en la sangre y corregida con una inyección de 3000 u.i de Vitamina A.

De todos los factores de mayor impacto en los resultados, el factor de mayor importancia es un factor difícil de medir y es el “nivel de stress” al que son sometidos los animales. La producción de glucorticoides y ACTH es el más poderoso bloqueador de LH, afectando la maduración folicular ( que depende de la secreción pulsátil de LH en el pro estro), la presentación del celo (que depende de la maduración folicular y por ende del nivel de estrógeno), el pico ovulatorio de LH (que depende del nivel de estrógeno), la ovulación y la formación del cuerpo luteo, que dependen del pico ovulatorio de LH ( ver revisión Moberg G.P., 1984). Animales que no están acostumbrados a manejo rutinario, no están familiarizados con las instalaciones, manipuleo, contacto con humanos, etc. darán muy pobres resultados. Es muy importante reducir al máximo el nivel de stress si se quieren obtener resultados satisfactorios. Esto es importante tanto para donantes como para recipientes.

e) La tasa de sobrevivencia de los embriones

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Una serie de factores influyen la proporción de embriones que se verán representados como corderos nacidos vivos y normales. Las fuentes de variación mas frecuentemente identificadas como de mayor importancia para la tasa de sobrevivencia de los embriones son: las donantes ( sobre todo su edad y raza), los tratamientos recibidos por donantes que afectan la calidad de los embriones, la manipulación de los embriones (medios de lavaje y transporte o mantenimiento, temperaturas, ingredientes, etc.), la edad del embrión y estado de desarrollo al momento de la transferencia, las técnicas y eficiencias en la colección y transferencia de embriones, la condición, nutrición, raza y manejo de las recipientes (ver revisión en Rangel-Santos, R. 1991; Baril, G. et al. 1993).

Datos de LambXL muestran los efectos de la raza del embrión y el numero de embriones transferidos por recipiente (cuadro 22), la edad de la donante (cuadro 23), la edad del embrión y el estado de desarrollo de acuerdo a la edad del embrión (cuadro 24), la "calidad" del embrión calificada subjetivamente ( cuadro 25), la condición de la recipiente (cuadro 26), el método de sincronización de la recipiente (cuadro 27), el lado uterino de la transferencia (cuadro 28) el intervalo al estro en la recipiente (cuadro 29) y el grado de sincronización entre donante y recipiente (cuadro 30).

Cuadro 22. Tasa de sobrevivencia embrionaria de acuerdo a la raza del embrión y el numero de embriones transferidos por recipiente.

Un embrión por recipiente

Dos embriones por recipiente

Total por raza

Raza de Donante N Promedio±SE N Promedio±SE N Promedio±SE

Danish Texel 45 48.9± 7.5 237 45.6± 2.8 289 45.2± 2.6

Finnish Texel 25 56.0± 10.1 130 55.0± 3.8 155 55.2± 3.6

Finnish Landrace 22 54.6± 10.9 305 50.8± 2.6 344 51.0± 2.4

Gotland P. 14 50.0± 13.9 111 46.0± 4.3 125 46.4± 4.1

Oxford Down 54 44.4± 6.8 260 41.5± 2.7 317 41.6± 2.5

White Headed Marsh 12 50.0± 15.1

53 34.9± 5.6 65 37.7± 5.4

Total 172 49.4± 3.8 1096 46.7± 1.3 1295 46.8± 1.25

Fuente: LambXL, 1987.

Cuadro 23. Sobrevivencia embrionaria de acuerdo a la edad de la oveja donante.Edad de la donante N Promedio ajustado ± SEBorreguillas de 1 ano 312 49.4 (b)

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Ovejas de 2 anos 583 59.0 (a)



Ovejas de 5 anos 28 38.6 (b)

Promedios con diferente letra en paréntesis son significativamente diferentes (P£0.05)Fuente: LambXL, 1987.

Cuadro 24. Sobre vivencia embrionaria en ovinos de acuerdo al estado de desarrollo del embrión a una edad embrionaria determinada al momento de la transferencia.

EdadEmbrión de 5.0 días

Embrión de 5.5 días



Estado de desarrollo N Prom. ±

SEN Prom. ± SE N Prom. ±

SEN Prom. ± SE

16 células 13 34.6±8.7 17 20.6±6.2 15 26.7 ± 9.6

Morula temprana 8 12.5±12.5 36 41.7±6.8 53 36.8±5.2 12 45.8 ±9.6

Morula 15 16.7± 9.3 79 38.0±5.0 102 39.2±4.2 41 43.9 ±6.6

Morula compacta 23 58.7±9.8 151 52.3±3.8 188 54.5±3.2 55 44.6 ±5.6

Blástula 29 69.0±8.4 67 53.0±5.5 45 58.9 ±6.8

Blástula expandida 4 62.5±23.9 9

61.1±16.250 66.0 ±6.0

Blástula eclosionada 9 72.2

±12.1Edad del embrión contada a partir del momento de inseminación. Fuente: LambXL. 1987.

Cuadro 25. Influencia de la calidad del embrión en la tasa de preñez y en la supervivencia embrionaria de ovinos Texel de acuerdo al numero de embriones transferidos por recipiente.

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Tasa de preñez Sobre vivencia embrionariaTransferencia: N Promedio N Promedio

1 embrión Grado 1 181 78.00 (b) 142 78.00 (a)

2 embriones Grado 1 239 92.00 (a) 478 70.00 (b)

1 embrión Grado 2 73 68.00 (b) 73 68.00 (b)

2 embriones Grado 2 90 80.00 (b) 180 51.00 (c)

Promedios con diferente letra en paréntesis son diferentes (P£0.05)Fuente: LambXL. Kiwitea. 1990

Cuadro 26. Influencia de la condición de la recipiente en la sobre vivencia embrionariaPeso vivo de la recipiente N Promedio ± SE39 - 50 Kg 112 40.1 ± 3.7 (d)

51 - 60 Kg 271 54.7 ± 2.4 (b) (c)

61 - 70 Kg 401 55.4 ± 2.0 (b) (c)

71 - 80 Kg 186 70.0 ± 2.9 (a)

81- 90 Kg 18 47.7 ± 9.3 (c)

Recipientes fueron ovejas adultas de la raza Romney Marsh. Fuente: LambXL.1987. Promedios con letras diferentes entre paréntesis son estadísticamente diferentes (P£0.05)

Cuadro 27. Efecto del método de sincronización de la recipiente en la sobre vivencia embrionaria.

N Sobre vivencia promedia ± SESincronizadas con MAP 108 70.6 ± 5.7 (a)

Sincronizadas con CIDR 104 74.5 ± 5.0 (a)

Transferencia hecha en ovejas de ciclo natural 52 66.2 ± 6.9 (a)

Promedios con igual letra son iguales (P>0.05)Fuente: LambXL.1987.

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Cuadro 28. Efecto del lado del útero de la recipiente en que se efectuó la transferencia sobre la sobre vivencia de los embriones ovinos transplantados.

N Promedio de sobrevivencia ± SEDos embriones implantados ipsilateralmente al sitio de ovulación ocurrida en el lado derecho 74 66.2 ± 5.3 (a)

Un embrión implantado ipsilateral al sitio de ovulación y un embrión contralateral al sitio de ovulación (total 2 embriones uno a cada lado) 108 63.2 ± 4.8 (a)

Dos embriones implantados ipsilateralmente al sitio de ovulación ocurrida al lado izquierdo 48 67.7 ± 6.5 (a)

Promedios de igual letra no son diferentes (P>0.05)Fuente: LambXL.1987.

Cuadro 29. Efecto del intervalo entre la remoción de la esponja o el CIDR y el inicio del celo en la recipiente.Intervalo en días N Sobrevivencia promedio ± SE1 - 1.5 103 69.5 ± 4.6 (a)

2 - 2.5 162 72.9 ± 3.8 (a)

3 - 3.5 32 76.4 ± 8.1 (a)

Promedios con igual letra no son diferentes (P>0.05)Fuente: lambXL 1987.

Cuadro 30. Efecto de la sincronización entre donante y recipiente sobre la supervivencia embrionaria.Intervalo en días entre el celo de la recipiente y el celo de la donante N Sobrevivencia promedio ± SE0 578 56.4 ± 1.4 (a)

0.5 - 1 725 55.9 ± 6.6 (a)

1.5 - 2 9 38.8 ± 27.9 (a)

Promedios con igual letra no son diferentes (P>0.05)Fuente: LambXL. 1987.

Tal como se menciono para el caso de las donantes, la reducción del "stress" y una balanceada nutrición son aspectos de gran importancia para obtener la máxima sobrevivencia embrionaria hasta el parto.

Esfuerzos hechos en LambXL y la ATC para incrementar la tasa de sobrevivencia embrionaria, además de tratar de optimizar todos los factores que influencian esta

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variable, incluyeron tratamientos hormonales a las recipientes tal como se muestra en el cuadro 31. La conclusión de esos ensayos es que la suplementacion de progesterona ( CIRD insertada en la recipiente inmediatamente después de la transferencia, reemplazada el dia 13 después de la transferencia y mantenida hasta el dia 56 de gestación) no tuvo ningún efecto mejorador de la tasa de sobrevivencia. Los otros tratamientos son promisorios pero el numero de observaciones tan pequeño no permitió determinar si la superioridad observada en los grupos tratados fueron debidas al tratamiento.

Al final, el parámetro de mayor importancia en la transferencia embrionaria es el numero de crías logradas por donante tratada y el numero total de crías por donante que se pueden generar en un ano. Con miras a incrementar estos parámetros desarrollamos e introdujimos como practica rutinaria en LambXL la bisección de embriones con resultados altamente satisfactorios incrementando la producción de corderos en un 30% (cuadro 32; ver también Vivanco H.W.et al., 1991; Rangel-Santos R., 1991; Vivanco H.W. y Greaney K. 1992). La eficiencia en producción de corderos vía transferencia embrionaria evidentemente incrementa con la experiencia. Sin incluir bisección de embriones, el numero de corderos producidos por oveja tratada por sesión o ronda en el otoño de 1987 en LambXL fue en promedio de 1.26 corderos, en la Australian Texel Corporation en el otoño de 1994 el promedio fue de 3.98 corderos por oveja tratada. El numero total de recolecciones por oveja al ano para el ano 1994 fue de 7 colecciones produciendo un total promedio de 27.86 corderos por oveja tratada por ano. Este numero pudo ser incrementado en un 30% (total de 36 corderos) si se hubiera usado bisección de embriones en la ATC.

.

Cuadro 31. Evaluación de tratamientos hormonales aplicados a ovejas recipientes para el incremento de la tasa de sobrevivencia embrionaria.Experimento No

Tratamientos dentro de experimentos

No de recipientes

No de embriones transferidos

No de fetos obtenidos

Porcentaje de sobrevivencia

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I 300 u.i. HCG al momento de la transferencia 91 181 65 35.91Control 89 177 51 28.80

II CIDR a la transferencia 645 1180 747 63.33Control 727 1279 801 62.65

III CIDR a la transferencia 640 1024 736 71.87Control 643 1157 804 69.05

IV CIDR a la transferencia 993 1787 1004 56.16Control 49 80 40 50.00

200 u.i PMSG al momento de la transferencia 22 44 29 66.00

Fuente: LambXL , ATC. ver también Vivanco H W. 1996

Cuadro 32. Sobrevivencia embrionaria de mitades embrionarias resultado de bisección su comparación con embriones enteros y su impacto en el incremento de la sobrevivencia embrionaria total Tipo de embrión Numero de

embriones transferidos

Numero de fetos generados

Sobrevivencia de los semi embrión (%)

Sobrevivencia de los embriones enteros (%)

Sobrevivencia total de los embriones originales (%)

Mitades de embrión 1410 710 50.3 - 100.6

Embriones enteros 1252 771 - 61.6 61.6

Fuente: LambXL.1991. Vivanco H.W.et al.1991

La transferencia de embriones es pues un método efectivo y practico de reproducción en los ovinos, su eficiencia depende de las técnicas usadas y sobre todo de la experiencia alcanzada, su uso es justificado (a un alto nivel de eficiencia) como instrumento de mejora genética.

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3. La recolección de ovocitos y producción de embriones “in vitro” en el ovino:

A. El estado actual de la tecnología de recolección de ovocitos y producción de embriones in vitro en el ovino. Areas que requieren solución y mayor desarrollo tecnológico.

A pesar de que los primeros trabajos sobre recolección de ovocitos (OPU) y producción de embriones “in vitro” (IVP) hechos por Robinson en ovinos datan del ano 1950 y son muy anteriores a los primeros trabajos hechos en el bovino por Bergulla y colaboradores en 1974 (ver revisión de Raymond et al. 1981), esta tecnología reproductiva ha alcanzado eficiencia comercial mucho mas rápido en el vacuno y esta ya en pleno uso industrial mientras que en el ovino aun cuando existen ciertas aplicaciones comerciales, la tecnología esta todavía en desarrollo y requiere de as trabajo para llevarla a niveles de eficiencia adecuados. Esto es simplemente reflejo de la mayor cantidad de recursos dedicados internacionalmente al desarrollo de OPU-IVP en bovinos debido a su mayor valor comercial.

La tecnología de recolección de ovocitos y producción de embriones “in vitro” (OPU-IVP), se viene desarrollando para las diversas especies domesticas no solamente como una alternativa para evitar los problemas (tales como limitado numero de embriones producidos por donante y gran variabilidad en las respuestas superovulatorias, alto costo) que se tienen en la ovulación múltiple y producción de embriones “in vivo” (MOET), sino que tiene sus virtudes especificas y permite aplicaciones imposibles de lograr con la técnica de MOET.

El hecho de poder cosechar los gametos femeninos ( ovocitos) directamente de los ovarios de los animales donantes, madurar los ovocitos fuera del animal donante en laboratorio ( “in vitro”), capacitar el espermatozoide en laboratorio, fertilizar los ovocitos madurados usando los espermatozoides capacitados en laboratorio y cultivar los embriones resultantes “in vitro” hasta el estadio de transferirlos a hembras recipientes es tal vez la revolución tecnológica mas importante en la industria animal desde la invención de la inseminación artificial. Esta tecnología permite potencialmente obtener material genético de hembras de diferente edad (juveniles pre o post púberes, adultos y hasta seniles) y diferentes estados fisiológicos ( lactantes, secas, vacías, preñadas, ciclando normalmente, inducidas a ciclar durante el anestro) y de animales muertos (ya sea beneficiados, muertos por accidente o sacrificados por razones humanitarias).

El potencial de la tecnología de OPU-IVP de revolucionar la industria animal es enorme ya que su aplicación permitirá incrementar aun mas las tasas de progreso genético ( se puede reducir el intervalo generacional en forma dramática) y la creación de nuevos y mas eficientes sistemas de producción (mellizaje por transferencia embrionaria,

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producción de compuestos genéticos o híbridos, producción de corderos de carne en rebaños de ovejas lecheras, etc.).

B. Aspectos técnicos de la recolección de ovocitos y producción de embriones “in vitro” en ovinos:

a) La recolección de ovocitos:

La cosecha de ovocitos de ovarios de animales beneficiados, cualquiera que sea la especie, se hace por aspiración folicular usando ya sea simplemente jeringas hipodérmicas con agujas de 18 g de diámetro o mediante aspiradores que no son mas que agujas montadas en tubos de colección conectados a bombas de vacío ( Xu et al. 1992; Gordon, 1994) o por disección y ruptura de los folículos (Lu et al., 1987 ; 1988). En promedio se obtienen entre 3 y 4 ovocitos por ovario aspirado (6 a 8 por par de ovarios o sea equivalente a una oveja) de ovejas adultas sacrificadas sin previo tratamiento hormonal (Vivanco, datos no publicados del laboratorio de arTech).

La cosecha o recolección de ovocitos (“Ovum Pick UP” o OPU) ya sea en borregas adultas o borreguillas prepuberes vivas es uno de los procesos tecnológicos que se tienen que simplificar. La recolección de ovocitos en el ovino es aun hecha por métodos quirúrgicos y bajo anestesia total, ya sea por laparotomía con la consiguiente exposición del ovario fuera de la cavidad abdominal o por laparoscopia introduciendo la aguja de aspiración a través de la cánula intra abdominal (Snyder y Nellor, 1975; Tervit et al., 1993; 1995; 1996).

Otro aspecto importante que requiere de mayor investigación es determinar si es realmente necesario estimular hormonalmente las donantes vivas durante la estación reproductiva antes de ser sometidas a recolección de ovocitos, cual seria el tratamiento hormonal optimo y cual la frecuencia con que se pude cosechar ovocitos del ovario ovino sin y con estimulación hormonal. En vacunos debido a la ocurrencia de varias ondas foliculares en el ovario dentro del ciclo estral se colectan ovocitos cada 3 a 4 días obteniéndose un promedio de 7 a 10 ovocitos por vaca sin necesidad de aplicar tratamientos hormonales ( Vivanco, 2000). En el ovino, ya sea por el hecho de que la recolección de ovocitos emplea métodos quirúrgicos de relativamente alto costo o por falta de información sobre ondas foliculares ( hasta muy recientemente, gracias al trabajo del grupo uruguayo liderado por Edgardo Rubianes que ha contribuido grandemente a comprender mas la dinámica de la fisiología ovárica de la oveja), las recolecciones de ovocitos en animales vivos siempre se han hecho bajo estimulación hormonal y no se han hecho colecciones repetidas en las mismas donantes. En promedio aun bajo estimulación hormonal el numero de ovocitos colectados por oveja adulta ha sido relativamente bajo lográndose entre 12 a 14 ovocitos por oveja tratada (Tervit, 1996; Baldasarre et al., 1996; Ptak et al., 1998).

La reciente aplicación de ultrasonografia transrectal para el estudio de los eventos reproductivos en las ovejas demuestra que los folículos desarrollan en “ondas” o pequeños ciclos que se repiten a lo largo del ciclo estral, en ovinos

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estas ondas foliculares y los factores que las influencian han sido descritas por Ginther et al. (1995), Leyva et al. (1998), Bartlewski et al. (1999), Evans et al. ( 2000), Rubianes et al. (1996), Viñoles et al.(2000), Rubianes (2001). Para la mayoría de las razas y condiciones fisiológicas se observa la ocurrencia de 3 ondas dentro de un ciclo estral pero es solo durante el pro-estro y el estro en que el o los folículos destinados a ovular escaparan de volverse atréticos (tal como ocurre en las ondas foliculares durante el diestro en que todos los folículos terminan en atresia) y continuaran su desarrollo y maduración alcanzando el estado pre ovulatorio (Guilbault, 1998). La ocurrencia de ondas foliculares en el ovino adulto en estación reproductiva ofrece la posibilidad de recolecciones de ovocitos repetidas y a intervalos de 3 a 4 días tal como se efectúa en el bovino, materia que es necesario investigar.

La recolección de ovocitos de corderos pre púberes ( tan jóvenes como 6 a 7 semanas de edad) esta siendo usada ya comercialmente en Australia a pesar que las eficiencias son relativamente bajas (especialmente en la tasa de sobrevivencia de los embriones transferidos), debido a su gran impacto en la reducción del intervalo generacional y su consecuente efecto en la ganancia genética anual. Estos programas están siendo usados mayormente en la mejora del ganado Merino “Super Fino”. Los corderos son estimulados hormonalmente antes de la recolección de ovocitos la cual se efectúa ya sea post mortem (beneficiando los corderos después del tratamiento) o por laparotomía ventral (Earl, C.R. et al., 1994; Kelly, J.M. et al. 2001), El cuadro 33 muestra la producción promedio de ovocitos maduros e inmaduros recolectados de corderos de 6 semanas de edad tratados hormonalmente, los resultados varían grandemente de acuerdo a la efectividad de los tratamientos hormonales y entre autores.

Cuadro 33. Numero promedio de ovocitos recolectados por aspiración folicular vía laparotomía ventral en ovinos pre-púberes de 6 –7 semanas de edad.

Fuente Numero de corderosdonantes

Numero ± SD de folículos por cordero

Numero ± SD de ovocitos por codero

Tasa de recolección (%)

% de ovocitos maduros

Earl,C.R et al. (1994).

6 14.8 ± 16.6

11.2 ± 11.5

88.8 83.2

Kelly, J.M. et al (2001)

3 68.3 ± 14.8

51.3 ± 13.3

75.1 s/i

53

Como resultado de la estimulación hormonal para la recolección de ovocitos tanto en adultos como pre-púberes una relativamente grande proporción de los ovocitos están ya maduros o en estado avanzado de maduración al momento de la recolección, esto debe ser tomado en cuenta para reducir el numero de horas en maduración “in vitro” para los ovocitos de acuerdo a su grado de maduración, sin embargo esto se hace muy raramente en la mayoría de los laboratorios empleándose mas bien tiempos fijos de maduración “in vitro” diseñados para ovocitos inmaduros , afectando la viabilidad de los ovocitos de maduración más avanzada al momento de colección.La recolección de ovocitos de ovejas fuera de estación reproductiva requiere de tratamiento hormonal de las donantes antes de la recolección (Cheng, 1985; Pugh et al., 1991; Ptak, citado por Loi P. et al., 1998).

En general los tratamientos hormonales previa recolección de ovocitos, tanto para ovejas pre-púberes como adultas dentro y fuera de la estación reproductiva están basados en administración de dosis bajas de FSH por 2 o 3 días cada 12 horas en animales en fase progestacional inducida por tratamiento exógeno de prosgesterona o progestagenos, suspendiéndose el tratamiento progestacional y gonadotropico 12 horas antes del beneficio o de la recolección “in vivo” (Eral, C.R. et al., 1994;Tervit, 1996; Baldasarre et al., 1996; Ptak et al., 1998; Kelly, J.M. et al. 2001).

b) Producción de embriones “in vitro” (IVP):

Los ovocitos recolectados son sometidos a maduración y fertilización en laboratorio y los embriones resultantes son ya sea cultivados también en laboratorio hasta el momento de transferirlos a recipientes definitivas o pueden ser cultivados en oviductos de recipientes temporales para ser luego lavados y transferidos a recipientes definitivas. Los laboratorios difieren en los sistemas usados para IVP desde los sistemas de maduración hasta los sistemas de cultivo de embriones.

b.1. Maduración de ovocitos in vitro:

Los ovocitos luego de aspirados de los folículos son evaluados y seleccionados en base a sus características microscópicas. Los ovocitos no atreticos y rodeados de células del cúmulo ooforo (ovocitos con mas capas y de capas más compactas de células del cúmulo se consideran de mayor calidad o mayor habilidad de producir embriones “in vitro”), son colocados en medios de maduración y en incubación por alrededor de 24 horas a 39°C.

54

La maduración meiotica del ovocito sin embargo ocurre de todas maneras (así no se cultive el ovocito) en forma espontánea tan luego como el ovocito es removido del foliculo ( Edwards, 1965). La adicción de gonadotropinas en los medios de maduración “in vitro” aumenta la proporción de ovocitos que maduran ( que alcanzan el estadio de Metafase II), pero no aumenta su potencial de desarrollo, es decir se lograra el mismo numero de embriones de un determinado numero de ovocitos así estos hayan sido madurados con o sin gonadotropinas ( Galli y Moor, 1991).

El medio universal utilizado para maduración de ovocitos en prácticamente todas las especies es el medio TCM-199 (“Tissue Culture Media”-199) el cual es suplementazo ya sea con gonadotropinas y con células de granulosa ovárica de ovejas previamente tratadas con gonadotropinas (Tervit et al.,1993) o con “factores de desarrollo” celular tales como EGF (“Epidermal Growth Factor”), IGF-I (“Insulin-like Growth Factor-I”), TGF-a (“Transforming Growth Factor - a”) que estimulan la maduración del ovocito sin necesidad de gonadotropinas (Harper y Brakett, 1993; Kobayashi et al., 1994); Gandolfi et al., 1996). Un aditivo común al medio de maduración es el suero fetal de bovino (FCS “Fetal Calf Serum”) tal como fue usado en los trabajos pioneros de Cheng. (1985), Cheng et al (1986) en Cambridge, UK. En bovinos, Lu et al.(1987) uso suero de vaca en celo reemplazando la necesidad de ambos FCS y suplemento hormonal, la misma estrategia no ha sido informada para el caso del ovino. Uno de las contribuciones más significativas al desarrollo de medios de maduración fue hecha por el grupo Argentino de la Fundación Pérez Companc que encontró una evidente relación entre la concentración de glutationa en el ovocito y la capacidad de los ovocitos para la fertilización y subsecuente desarrollo embrionario (De Matos et al., 1995) . Hoy en día en nuestros laboratorios en Nueva Zelanda usamos la estrategia de suplementar los medios de maduración de ovocitos ovinos con cisteamina la cual determina el incremento de la concentración de glutationa en los ovocitos (Wells et al., 1996), la misma estrategia ha sido informada para ovocitos de corderos por el grupo de Sardinia ( Ptak et al., 1997).

La maduración de los ovocitos es una de las etapas mas criticas de la producción de embriones “in vitro” ya que no solo afecta las subsiguientes fases del proceso de producción de embriones sino también la sobrevivencia del embrión transferido y hasta el nacimiento tal como lo demuestra en su revisión Hasler (1994).

b.2. La fertilización “in vitro”:

55

Para asegurar que ocurra una fertilización normal es necesario que los ovocitos estén en el estadio de maduración adecuado y que la concentración adecuada de espermatozoides recién capacitados se encuentre disponible para fertilizar los ovocitos dentro del micro ambiente adecuado para la fertilización.

La vida de los gametos es relativamente corta una vez que han alcanzado su maduración o capacitación. El envejecimiento de los gametos es una de las causas principales de anormalidades del embrión y de la mortalidad embrionaria temprana (ver Bearden y Fuquay, 1980). Por lo depuesto el proceso de maduración de ovocitos y capacitación espermática in vitro deben ser planificados para que la fertilización “in vitro” ocurra con gametos en estado optimo para la fertilización.

Hay diversos métodos empleados para la capacitación espermática “in vitro”. Los espermatozoides deben ser preparados antes de ser sometidos al proceso de capacitación. Primeramente deben ser separados del plasma seminal y/o del dilutor lo que se logra ya sea por centrifugación de la dosis de semen o por “nadado hacia arriba” o “swim up” en medios de diferente densidad o por filtrado a través de gradientes de concentración ( Percoll, Pharmacia Inc.) o por separación con filtros de lana de vidrio. Una vez separado el espermatozoide es lavado en buffer adecuados y es sometido a la acción de los factores de capacitación. En el caso de semen fresco el semen es mantenido por 6 horas después de colectado a temperatura de 20°C antes de proceder a la separación espermática, esto determina el inicio del proceso de capacitación por “stress” celular (Tervit et al., 1993). En el caso de semen congelado, este ya ha sufrido también procesos iniciales de capacitación debido al efecto “stress” del congelamiento (Guillan y Maxwell , 1998). El proceso de capacitación espermática es un proceso complejo que resulta en la maduración final del espermatozoide y la secreción de enzimas que son necesarias para la penetración de la zona pellucida ( Bedford, J.N., 1970). El medio mas usado hasta hoy para la capacitación espermática del ovino esta basado en el suero de oveja en meta estro en una solución de Hepes buffer (Cheng, 1985;Crozet et al., 1987; Tervit et al.,1993 ). La capacitación espermática ovina ha sido optimizada con la adición de lactato de calcio (Pugh et al., 1991). Los espermatozoides son expuestos al medio de capacitación por lo menos 30 minutos antes de la inseminación de los ovocitos.

Los ovocitos luego del proceso de maduración son preparados para la fertilización mediante la parcial remoción de las células del cúmulo

56

ooforo ya sea en forma mecánica o con auxilio de incubación con hialuronidasa.

La fertilización “in vitro” es un proceso críticamente dependiente en el apropiado micro ambiente, este al igual que para la maduración in vitro se logra manteniendo los gametos a una temperatura de 39 °C en incubadores con una concentración de 5% de CO2 en aire a la máxima humedad (ver Gordon, 1990). La concentración espermática es otro factor critico, la mayoría de autores recomienda usar 1 millón de espermatozoides por mililitro, sin embargo hay una gran variación entre carneros y razas los cuales difieren en la optima concentración por lo que es necesario estudiar cada caso individual. Los cuadros 34 y 35 muestran la variación obtenida en nuestro laboratorio en Nueva Zelanda en la eficiencia de la fertilización y producción de embriones “in vitro” de acuerdo a la raza o especie del carnero. Normalmente los gametos (espermatozoides y ovocitos) son mantenidos en incubación en el medio de fertilización por hasta 24 horas transcurridas las cuales los ovocitos fertilizados (embriones) pasan a los medios y sistemas de cultivo donde permanecen hasta su transferencia a recipientes o congelación para conservación.

Cuadro 34. Eficiencia de producción de embriones “in vitro”. Método SOFaaBSA. ArTech, AgResearch NZ usando semen de diversas razas de carneros.Variable Texel Ronmey Poll

DorsetSuffolk Coopwort

hNumero de

57

ovocitos inseminados

75 66 66 57 51

Numero de ovocitos fertilizados

59 50 32 53 42

Porcentaje de fertilidad

78.0 75.0 48.0 92.0 82.0

Numero de embriones (blástulas) producidos a los 7 días post fertilización

22 35 22 28 13

Porcentaje de blástulas producidas

29.0 53.0 33.0 49.0 25.0

Cuadro 35. Fertilización de ovocitos de ovejas Romney Marsh con semen de carneros Romney Marsh y con semen de un híbrido ovino x caprino (“Geep”) y subsecuente cultivo de los embriones en SOFaaBSA. arTech , AgResearch, NZ.

Variable Semen híbrido Semen RomneyNúmero de ovocitos inseminados 70 60Numero de ovocitos fertilizados 39 53% de fertilización 55.0 88.0Numero de embriones logrados (blástulas de 7 días)

17 31

Porcentaje de embriones producidos sobre ovocitos inseminados

24.28 51.0

b.3. El cultivo de los embriones:

Hay prácticamente 3 métodos para cultivar embriones desde 24 horas después de haber sido puestos en contacto con los espermatozoides capacitados. Dos de estos métodos son métodos “in vitro”, el tercero

58

es simplemente utilizar receptoras intermedias cultivándose los embriones en sus oviductos ligados (para evitar que los embriones lleguen al útero), estas receptoras temporales pueden ser ovejas (Galli y Lazzari, 1996) o conejas (Fukui y Ono, 1988), cultivándose los embriones hasta el estadio máximo de blástula expandida cuando son recuperados de los oviductos de las recipientes temporales y ya sea transferidos a recipientes definitivas o congelados para su conservación.

Uno de los métodos “in vitro” es el método denominado de “Co-Cultivo” , llamado así porque los embriones se cultivan en el medio de cultivo (el medio de cultivo mas usado en co-cultura es el TCM-199 suplementado con 10% de FCS) en el cual se ha establecido previamente una colonia de células somáticas que crecen adheridas a la base del plato de cultivo formando una sola capa y cubriendo aproximadamente el 80% del área de la base (80% de confluencia), estas células son por lo general células de la granulosa ovárica o del epitelio del oviducto obtenidas de las mismas ovejas donadoras de los ovocitos u otras células disponibles comercialmente tales como las células de hígado de rata búfalo “BRL” (“Búfalo Rat Liver Cells”) ( ver Gordon, 1990). Las células somáticas producen factores de promoción del desarrollo celular (factores de desarrollo pépticos y/o citoquinas) que soportan el desarrollo de los embriones. Las condiciones de incubación para co-cultura requieren 39°C, 5% CO2 en aire a máxima humedad. (Rexroad y Powell, 1986; Gandolfi y Moor, 1987; Gandolfi, 1994).

El otro sistema de cultivo “in vitro” es el “Sistema Definido”, llamado así debido a que la concentración de cada componente del medio es conocida, definida, son ingredientes que se añaden y mezclan, no hay productos producidos por células o aportados por el suero ( como en el caso de co-cultivo). El sistema definido de mayor uso es el llamado “SOF” (“Synthetic Oviduct Fluid”), que fue diseñado originalmente por Robin Tervit de nuestro instituto en Nueva Zelanda ( Tervit, et al., 1972) y luego modificado por añadido de amino ácidos y albúmina de suero bovino obteniéndose el llamado “SOFaaBSA” (Gardner et al., 1974) que es el de mayor uso en ovinos en la actualidad. Las condiciones de incubación para el sistema definido SOF requieren 39°C, 5%CO2 , 7% O2 y 88% N2.

c. Eficiencia en la producción de corderos con embriones “in vitro”:

Loi P. et al. (1998) comenta acertadamente que el cultivo de embriones “in vitro” a pesar de la relativa buena eficiencia de producción de embriones transferibles aun enfrenta problemas por

59

ejemplo las divisiones celulares en los primeros 4 ciclos de división celular son mas retardadas en el cultivo “in vitro” que “in vivo”, esta etapa esta grandemente asociada con la activación de los genes del embrión, lo que puede estar asociado a la menor fortaleza y sobrevivencia embrionaria de los embriones “in vitro” en comparación a los embriones “in vivo”, sin embargo el trabajo comparativo de Walmslet S.E. et al (2000) no muestra ninguna diferencia entre la supervivencia embrionaria de embriones producidos por fertilización “in vitro” y transferidos a recipientes inmediatamente después de fertilizados (día 2) y por lo tanto desarrollados “in vivo” versus embriones que continuaron “in vitro” hasta ser transferidos el día 6 (después del proceso de activación de genes) .Los datos del estudio se muestran en el cuadro 36.

Cuadro 36. Tasas de preñez obtenidas con embriones cultivados “in vivo” luego de fertilización “in vitro” (transferidos el día 2) versus embriones “cultivados “in vitro” hasta el estadio de morula compacta o blástula (transferidos el día 6).

Día de transferencia embrionaria

No total de embriones transferidos

No total de recipientes

Promedio de embriones por recipiente

Numero (%) de recipientes preñadas

Día post fertilización 113 35 3.2 18 (51.0%)Día 6 post fertilización 64 21 3.0 21 (57.0%)Fuente: Walmsley S.E. et al. (2000)

La habilidad de los ovocitos de corderos pre púberes de ser fertilizados y desarrollar “in vitro” hasta el estadio de embriones transferibles, así como de sobrevivir luego de la transferencia hasta el nacimiento del cordero es menor que la de los ovocitos de animales adultos. Aun cuando la maduración del núcleo del ovocito ocurre a una tasa comparable a la de los ovinos adultos, la fertilización y subsiguiente desarrollo embrionario es menos eficiente, esto es atribuido grandemente a la ocurrencia de maduración citoplasmática anormal (Ledda et al., 1997; O’Brien et al., 1997; 1997a) . O’Brien et at.(1996) también encontraron que los ovocitos de corderos pre púberes ya sea que se maduren “in vitro” o “in vivo” muestran un mas bajo metabolismo de la glutamina y una mayor incidencia de fertilización poliespermica. Sin embargo, a pesar de estas diferencias, algunos autores han informado similares tasas de producción de embriones (al estadio de blástula) a partir de ovocitos de ovejas adultas y pre-púberes, esto tal vez al efecto de específicos protocolos

60

de estimulación hormonal ( Armstrong et al., 1994; 1997; Earl et al., 1995).

Los cuadros 37 y 38 ofrecen la eficiencia de producción de embriones y de corderos a partir de ovocitos de donantes pre-púberes (corderos de 6 a 7 semanas de dad).

Cuadro 37. Producción embrionaria “in vitro” y tasa de supervivencia embrionaria temprana de embriones producidos de ovocitos de corderos donantes de 6 a7 semanas de edad de acuerdo al estadio de maduración de los ovocitos al momento de la recolección.

Tipo de ovocitos al momento de la recolección

Numero de ovocitos inseminados

Numero de ovocitos fertilizados (% sobre inseminados)

Numero de embriones transferidos (% sobre inseminados)

Numero de fetos a los 48 días de gestación (% sobre ovocitos inseminados)

% de supervivencia embrionaria sobre numero de embriones transferidos

Maduros (madurados in vivo)

30 21 (70.0) 18 (60.0) 8 (27.0) 44.44

Inmaduros (madurados in vitro)

16 9 (56.0) 5 (31.0) 0 (0.0) 0.00

Fuente: Earl, C.R. et al. (1994)

61

Cuadro 38. Producción de corderos por varias generaciones consecutivas usando como donantes de ovocitos corderos de 6 a 7 semanas de edad.Donantes Numero

de donantes


Numero de ovocitos fertilizados (% sobre inseminados)

Numero de embriones transferidos (porcentaje sobre ovocitos inseminados)

Numero de recipientes

Numero de corderos nacidos (% sobre embriones transferidos)

Corderos de segunda generación (hijas de corderos)

3 154 90 (58.0) 75 (48.7) 25 10 (13.3)

Corderos de Tercera generación (hijas y nietas de corderos)

5 278 248 (89.0)

181 (65.1)

50 41 (22.6)

Fuente: Kelly J.M. et al.(2001)

Los resultados del cuadro 37 son muy promisorios para el caso de ovocitos madurados “in vivo”. Los resultados del cuadro 38 parecen haber sido afectados por el alto numero de embriones transferidos por recipiente.

Producción de corderos a partir de embriones “in vitro” ( Brown B.W y Radziewic T. 1996) es más eficiente cuando se usan donantes adultas que donantes pre puberes. El cuadro 39 muestra la eficiencia total obtenida usando el sistema SOFaaBSA , lográndose en promedio 33.7% de embriones transferibles sobre ovocitos inseminados y 43.5 % de sobrevivencia embrionaria hasta el nacimiento.

Cuadro 39. Eficiencia en la producción de embriones in vitro y subsiguiente supervivencia embrionaria hasta la paricion

62

Experimento


Numero (%) de ovocitos fertilizados

Numero(%) de embriones transferidos

Numero de recipientesimplantadas

Numero (%) de recipientes que parieron

Numero de corderos nacidos (% sobre embriones transferidos)

No 1 84 76 (90.0) 29 (38.2) 29 12 (41.0) 12 (41.0)No2 143 129 (90.0) 40 (31.0) 20 12 (60.0) 18 (45.0)Total 227 205 (90.0) 69 (33.7) 49 24 (49.0) 30 (43.5%)Fuente: Brown B.W y Radziewic T. 1996

Hay todavía gran debate en cuanto al hecho de que corderos nacidos de embriones producidos “in vitro” son más grandes al nacimiento que corderos nacidos de reproducción natural o de inseminación artificial, algunos autores creen que esto es debido a efectos del suero usado en los medios de cultivo, esto no pudo ser demostrado por Thompson et al. (1995) cuando trato de probar esta hipótesis produciendo corderos con embriones cultivados en “SOFaaBSA donde no hubo diferencia en el tamaño al nacimiento entre corderos producidos con o sin suero en el medio de cultivo. Sin embargo, es un hecho que corderos nacidos de embriones in vitro son mas grandes que corderos nacidos por reproducción natural tal como se muestra en el cuadro 40.

Cuadro 40. Tamaño al nacimiento y ritmo de crecimiento de corderos nacidos por reproducción natural y corderos nacidos de transferencia de embriones “in vitro”

Corderos nacidos de reproducción natural (16 corderos)

Corderos nacidos de transferencia de embriones “in vitro” (12 corderos)

nacimiento 1 mes 2 mes 3 mes nacimiento 1 mes 2 mes 3 mes

63

Peso vivo Kg 4.0 11.0 18.7 24.1 5.7 16.9 23.7 28.0Ritmo de crecimiento gr/dia

232 215 193 330 273 231

Peso testicular gr

27 45.7

Fuente: Brown B.W y Radziewic T. 1996

Todas variables comparadas en el cuadro 40 fueron significativamente superiores (P, <0.02) para los corderos nacidos de embriones “in vitro”, lo que sugiere la posibilidad de que existan factores en el proceso de producción de embriones “in vitro” que tendrían un efecto mitogenico que resulta en una mayor ritmo de crecimiento sobre todo en ciertos de ciertos tejidos tal como el tejido testicular. Esto desde el punto de vista productivo puede ser ventajoso siempre y cuando el peso y tamaño al nacer no sea excesivamente levado que ponga en riesgo a la madre y/o al cordero.

La tecnología de producción de embriones “in vitro” tiene pues un gran potencial y conjuntamente con las tecnologías de inseminación artificial y transferencia embrionaria constituyen un paquete tecnológico eficaz para lograr el mejoramiento sostenido de la productividad animal.

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