C483. EL 99mTc-GLUTATION COMO RADIOFARMACO PARA EL DIAGNOSTICO DETUMORES.

Alejandro Perera (1), Mayla F Blanco (1), René Leyva (2), Jorge Duconge (3), Daniel Álvarez (3), AbelHernández (1), Anaís Prats (1), Yolicé Valdivia (1).1. Centro de Investigaciones Clínicas, 2. Centro de Isótopos, 3. Instituto de Farmacia y Alimentos.Dirección: 34 # 4501 e/ 45 y 47, Kohly, Playa, C. Habana. Teléfonos: 2030087. E-mail:cic@infomed.sld.cu

RESUMEN.Está reportado que la cantidad de glutatión en las células tumorales se correlaciona con el grado demalignidad de las mismas. El objetivo del presente trabajo fue desarrollar una formulación para elmarcaje del glutatión con 99mTc con suficiente estabilidad y evaluarlo como posible radiofármaco en eldiagnóstico de melanomas. Materiales y métodos: Se evaluó la influencia del pH, la cantidad deSnCl2*2H2O y la presencia de Na4P2O7*10H2O en el marcaje y estabilidad del complejo. Se inyectó 0.1mg (74 MBq) de 99mTc-glutatión a través del plexo ocular de ratas Sprague Dawly (190-210g) paradeterminar la farmacocinética y la biodistribución. Se realizaron imágenes gammagráficas hasta 24 hdespués de la administración del producto por el plexo ocular de ratones desnudos xenoinjertados conmelanoma B16. Resultados: Se obtuvo un marcaje de 97±2% estable por 24 h a pH=8.2-8.5 y 40µg deSnCl2*2H2O y 1.7 mg de Na4P2O7*10H2O por cada mg de glutatión. El radiofármaco mostró unT1/2=18.0±3.6 min en plasma, mientras que el mayor acúmulo fue en riñones (0.90-2.35 %DI/g) y orina(4.8-7.7 %DI) lo que sugiere que esa sea la vía fundamental de eliminación, el resto de los órganosmostraron captaciones inferiores al 0.05%DI/g. Las imágenes gammagráficas mostraron un intensoacúmulo del radiofármaco en el tumor. La relación tumor/región contralateral sana aumentó de 4.7 (5min)hasta 8.5 (24 h). Conclusiones: La formulación obtenida permitió el marcaje de glutatión con 99mTc conelevada eficiencia. Este radiofármaco pudiera ser útil para la detección gammagráfica de melanomas.

INTRODUCCIÓNEl cáncer constituye la segunda enfermedad de mayor morbi-mortalidad, tanto en Cuba, como endiferentes países del mundo (1, 2). El glutatión es un tripéptido que interviene en el metabolismo celular(3). En el caso de los tumores se ha determinado que está relacionado con los mecanismos de resistenciade éstos a determinados agentes citostáticos (4, 5). Se ha planteado por algunos autores la posibilidad demarcar el glutatión con 99mTc y emplearlo en el diagnóstico de determinadas neoplasias malignas comomelanomas (6) y tumores de cabeza y cuello (7). No obstante, la cantidad de pacientes ha sido pequeña yno se cuenta con suficiente información hasta el momento.El objetivo del presente trabajo fue desarrollar una formulación para el marcaje del glutatión con 99mTccon suficiente estabilidad y evaluarlo como posible radiofármaco en el diagnóstico de melanomas.MATERIALES Y METODOSDeterminación de las condiciones de marcaje: Para determinar las condiciones de marcaje del glutatión(1mg) con 99mTc, se variaron los siguientes factores: pH (7.5-8.5), cantidad de SnCl2*2H2O (20-60µg),cantidad de Na4P2O7*10 H2O (0-2.0 mg).Estudio de farmacocinética y biodistribución: Se inyectó 0.1 mg (0.1 mL) de 99mTc-glutatión (74 MBq)a través del plexo ocular de 30 ratas Sprague Dawly (190-210g) para determinar la farmacocinética y labiodistribución. Los animales fueron colocados en jaulas metabólicas para determinar el porcentaje deradiofármaco excretado por la orina y las heces fecales. Se tomaron muestras de, aproximadamente, 400µL de sangre a los 5, 10, 15, 20, 30, 45 minutos y 1, 2, 4, 6 y 8 horas a través del plexo ocular. Estas sedejaron coagular a temperatura ambiente, se centrifugaron a 1000 rpm (centrífuga SIGMA 201, Francia)y se tomaron alícuotas de 100 µL de suero, a las que posteriormente se les determinó la velocidad deconteos en un contador automático. La biodistribución se estudió a los 10 min, 1h, 4h, 12h y 24h. Gruposde 3 animales por cada tiempo fueron anestesiadas con éter etílico y posteriormente sacrificados parallevar a cabo la extracción y pesaje de los siguientes órganos: corazón, hígado, riñón derecho, bazo,pulmón, estómago, intestino grueso, intestino delgado.

Estudio gammagráfico en modelo animal: Se realizaron imágenes gammagráficas a: 0, 20 min., 1 h, 2h,4h, 6h, 8h, 10h y 24 h después de la administración del producto por el plexo ocular de 6 ratones atímicoshembras n/n (NMRI) xenoinjertados con melanoma B16. Se utilizó una cámara gamma Sophy DS7(Sopha Medical, Francia), empleando un pinhole de 2 mm de abertura. Se adquirieron imágenes planas enformato de 128x128 píxels, con zoom de 2 y 500 Kconteos como condición de parada. Se calculó larelación tumor/región contralateral sana (T/RC) para cada imagen.

RESULTADOS

Figura 1. Imagen gammagráfica de unratón 2h post-inyección.

Tumor

Las condiciones óptimas de marcaje fueron pH: 8.2-8.5, cantidad de Na4P2O5*10H2O: 1.7 mg, cantidadde SnCl2*2H2O: 40 µg. Con esas condiciones el porciento de marcaje del 99mTc-GHS fue de 97±2%. Laimpureza que más afectó el rendimiento fue el radiocoloide (3±1%). Sólo en algunos casos aislados sedetectó tecnecio libre (99mTcO4

-) en muy pequeñas cantidades.

En la tabla I se muestran los principales parámetros farmacocinéticos del 99mTc-GSH administrado através del plexo ocular en ratas Sprague Dawly a una dosis de 0.1 mg (74 MBq), calculados a partir de unmodelo monocompartimental.

El mayor acúmulo del radiofármaco fue detectado en riñones (0.90-2.35 %DI/g) y orina (4.8-7.7 %DI) loque sugiere que esa sea la vía fundamental de eliminación, el resto de los órganos mostraron captacionesinferiores al 0.05%DI/g. Las imágenes gammagráficas mostraron un intenso acúmulo del radiofármaco enel tumor (figura 1). La relación tumor/región contralateral sana aumentó de 4.7 (5min) hasta 8.5 (24 h).

Cmax: conc. máxima en sangre, AUC: área bajo la curva,T1/2: tiempo medio de aclaración, Vd: volumen de dilución,Cl: aclaración.

DISCUSIÓN

Desde el punto de vista de su biodistribución, el glutatiónpasa a la nefrona por filtración glomerular. Una vez en eltúbulo, una parte es reabsorbida, mientras la otra essometida a la acción de la -glutamil-transpeptidasa y lacisteinilglicina dipeptidasa presentes en las membranas delas células ciliadas del túbulo proximal (8-10). Lacisteína, producida por la degradación de este péptido ensus aminoácidos constituyentes, es mayor que lacapacidad de reabsorción de ésta por el lumen tubular (8).En ratones se ha observado, además, la eliminación delexceso de GSH en forma de -glutamilcisteína o deforma íntegra, sin degradar (9). Estos factores permitenexplicar la alta actividad encontrada en orina. Por otraparte, al ser una molécula peptídica con un pesomolecular de 307 Da, con rápida eliminación,fundamentalmente renal y acelerada incorporación a lostejidos, por las múltiples funciones que cumple dentro de

las células, explican las características de su perfil farmacocinético. El T1/2 obtenido fue de 18.0±3.6 min(0.30 ± 0.06 h), que se asemeja a los reportados en la literatura por otros autores (6, 8). Los elevadosvalores de Vd (265 ± 10 mL) son indicativos de la baja afinidad del radiofármaco por proteínasplasmáticas, pasando a distribuirse por todo el espacio vascular y el fluido extravascular (11). La rápidacinética del 99mTc-GSH, permite predecir la elevada relación tumor/región contralateral, que seevidenció desde los primeros momentos post-administración del radiofármaco. Se apreció además que losórganos blancos principales eran los riñones, lo cual corrobora los hallazgos de biodistribuciónpreviamente reportados. Estas características permiten suponer la factibilidad del uso de este péptidomarcado para la detección de melanomas.

CONCLUSIONESLa formulación obtenida permitió el marcaje de glutatión con 99mTc con elevada eficiencia. Esteradiofármaco pudiera ser útil para la detección gammagráfica de melanomas.

BIBLIOGRAFÍA1. Anuario Estadístico. Dirección Nacional de Estadísticas. Ministerio Salud Pública, Cuba, 2000.

Tabla I. Pricipales parámetros farmacocinéticos del 99mTc-GSH.

Parámetros Estimado (Media ± DE)Desviación

Relativa (%)Cmax (%DI/mL) 0,38±0,04 10,5AUC (%DIh/mL) 0,16±0,02 12,6

T1/2 (h) 0,30±0,06 20,0Vd (mL) 265±10 3,8Cl (mL/h) 608±70 11,5

2. The World Health Organization Report 2001. World Health Organization 2001.3. Lehninger AL Transporte activo a través de membranas. En: Lehninger AL (Editor), Bioquímica.

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C484. EL 99mTc-F11: NUEVO PÉPTIDO MARCADO PARA LA DETECCIÓNGAMMAGRÁFICA DE MELANOMAS. RESULTADOS PRECLÍNICOS.

Alejandro Perera (1), Anaís Prats (1), Osvaldo Reyes (2), Mónica Bequet (2), Nelson Santiago (2), AbelHernández (1), Yolicé Valdivia (1), René Leyva (3), Leydis Alberti (3), Jorge Duconge (4), EduardoFernández (4), Gilmara Pimentel (5), Yecenia Morejón (1).1. Centro de Investigaciones Clínicas, 2. Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología, 3. Centro deIsótopos, 4. Instituto de Farmacia y Alimentos, 5. Instituto Nacional de Oncología y Radiobiología.Dirección: 34 # 4501 e/ 45 y 47, Kohly, Playa, C. Habana. Teléfonos: 2030087. E-mail:cic@infomed.sld.cu

RESUMENEl melanoma es una de las neoplasias más agresivas. La integrina V3 es un receptor de adhesióncelular que se sobreexpresa en la membrana citoplasmática de estas células malignas, así como en laneovasculatura que se desarrolla en el tumor y sus metástasis. El objetivo del trabajo fue desarrollar unpéptido que contuviera la secuencia Arg-Gly-Asp-Ser y marcarlo con 99mTc, para obtener imágenesgammagráficas de un modelo animal de melanoma. El péptido F11 (AGGG-Abu-GRGDSPK) fueobtenido por síntesis en fase sólida. El péptido se marcó a pH neutro, variando la relación molar F11: Sn+2

entre 1:0.5 y 1:4.0. Se inyectaron 50µg (37MBq) de 99mTc-F11 por la vena lateral de la cola de ratasSprague Dawley para determinar su biodistribución y farmacocinética hasta 18 h. Se realizaron imágenesgammagráfícas hasta 16 h después de la administración de 50 µg (74MBq) de 99mTc-F11 por el plexoocular de ratones C57BL6 injertados con melanoma B16. Resultados: Se obtuvo un marcaje de95.2±2.1% estable por 24 h, para una relación molar F11:SnF2=1:1.3. La captación en riñones varió de2.5±0.5 %DI/g (1h) hasta 6.0±1.1 %DI/g (18h), lo que sugiere que esa sea la vía fundamental deeliminación. El resto de los órganos mostraron captaciones inferiores al 1.0% DI/g. El T1/2 en sangre fuede 3.54±0.40 h. Las imágenes gammagráficas mostraron un intenso acúmulo del radiofármaco en eltumor (relación tumor/región contralateral sana de 4 a las 16 h). Conclusiones: El péptido F11 marcadocon 99mTc pudiera ser un radiofármaco útil para la visualización gammagráfica de los melanomas.

INTRODUCCIÓNEl melanoma es una de las neoplasias más agresivas. Según datos del Archivo Nacional de Cáncer, Cubapresenta una incidencia de 0.9 por 100000 habitantes. En EEUU esta enfermedad ocupa el sexto lugar enmorbilidad entre las neoplasias en el sexo masculino y el séptimo en el femenino (1).La integrina V3 es una glicoproteína de transmembrana dimérica que media la adhesión y migraciónde las células tumorales. Este receptor juega un rol importante en el crecimiento tumoral, la invasividadlocal y el potencial metastásico (2, 3) y se sobreexpresa en la membrana citoplasmática de numerosascélulas malignas (osteosarcomas, glioblastomas, neuroblastomas, melanomas y carcinomas de pulmón,mamas, próstata, ovarios, sistema digestivo y otros) (4). Además, se expresa altamente en célulasendoteliales activadas y juega un importante papel en los procesos de angiogénesis (5).La secuencia Arg-Gly-Asp (RGD) está considerada el sitio de unión primario a esta integrina. Es por esoque diferentes autores han reportado péptidos marcados, que contienen esta secuencia para detectartumores y sus metastasis (3, 4, 6).El objetivo del trabajo fue desarrollar un péptido que contuviera la secuencia Arg-Gly-Asp-Ser ymarcarlo con 99mTc, para obtener imágenes gammagráficas de un modelo animal de melanoma.MATERIALES Y METODOSSíntesis del péptido: El F11 es un péptido lineal de 12 aminoácidos: AGGG-Abu-GRGDSPK, donde Abues el ácido 4-aminobutanoico, empleado como espaciador. La cadena que queda hacia el N-terminal seadicionó con el fin de que actuara como quelatante del 99mTc, permitiendo así el marcaje de la molécula,la otra parte es la encargada de unirse a la integrina αVβ3. Este péptido fue obtenido por síntesis en fasesólida.Marcaje del F11 con 99mTc: El péptido se marcó a pH neutro. La formulación se optimizó, tomandocomo factor la relación molar F11: Sn+2 (1:0.5, 1:1, 1:2 y 1:4). La variable de respuesta fue la purezaradioquímica del 99mTc-F11. Los resultados obtenidos se graficaron para determinar el valor óptimo.Estudio de biodistribución y farmacocinética: Se inyectaron 50µg (37MBq) de 99mTc-F11 por la venalateral de la cola de ratas Sprague Dawley (190-210 g). Los animales fueron divididos en grupos de tres.Para el estudio farmacocinético se tomaron muestras de sangre a los 10 min, 30 min, 45 min y 1, 2, 3, 4,6, 8 y 18 horas. La biodistribución se estudió a 1h, 3h, 6h y 18h. Los animales por cada tiempo fueronanestesiadas con éter etílico y posteriormente sacrificados para llevar a cabo la extracción y pesaje de lossiguientes órganos: corazón, hígado, riñones, bazo, pulmón, estómago, intestino grueso, intestino delgado,músculo y fémur.

Estudio gammagráfico en modelo animal: Se realizaron imágenes gammagráficas a: 1 h, 3h, 6h y 16 hdespués de la administración del producto por el plexo ocular de 3 ratones C57BL6 hembras injertadoscon melanoma B16. Se utilizó una cámara gamma Sophy DS7 (Sopha Medical, Francia), empleando unpinhole de 2 mm de abertura. Se adquirieron imágenes planas en formato de 128x128 píxels, con zoom de2 y 500 Kconteos como condición de parada. Se calculó la relación tumor/región contralateral sana(T/RC) para cada imagen.RESULTADOS.El péptido F11 fue sintetizado con una pureza química superior al 95%.Se determinó que la relación F11:Sn+2 óptima fue de 1:1.3, para la cual los por cientos de marcaje delpéptido con 99mTc fueron superiores a 95%.En la tabla I se muestran los principales parámetros farmacocinéticos del 99mTc-F11 administrado a travésde la vena lateral de la cola en ratas Sprague Dawly a una dosis de 50µg (37 MBq), calculados a partir deun modelo monocompartimental.

El mayor acúmulo del radiofármaco fue detectado en riñones (2.5-6.0 %DI/g) y orina (2.1-14.4 %DI) loque sugiere que esa sea la vía fundamental de eliminación, el resto de los órganos mostraron captacionesinferiores al 0.5%DI/g. Las imágenes gammagráficas mostraron un intenso acúmulo del radiofármaco enel tumor (figura 1). La relación tumor/región contralateral sana aumentó de 4.7 (5min) hasta 8.5 (24 h).

DISCUSIÓNLister-James J y cols. (7) plantean que de forma general, los péptidos pasan a las nefronas mediantefiltración glomerular y posteriormente son reabsorbidos en el túbulo proximal, donde pueden serdegradados por la acción de las peptidasas. Estos factores permiten explicar la alta actividad encontradaen riñones y orina. Los datos de biodistribución son similares a los reportados en la literatura parapéptidos lineales de este tipo (6). Los péptidos cíclicos muestran menor excreción renal, y una captaciónhepática superior, debido a su mayor carácter lipofílico (3, 4). El rápido aclaramiento sanguíneo obtenido(Tabla I), es característico de las moléculas peptídicas de bajo peso molecular (6-8).Las imágenes gammagráficas confirman los resultados de la biodistribución. La elevada relacióntumor/región contralateral desde los primeros momentos post-inyección, permite suponer la factibilidadde este péptido marcado para la detección de melanomas. Por otra parte, su baja eliminación a través deltracto gastrointestinal hacen de este radiofármaco un posible diagnosticador útil para la detección delesiones abdominales en comparación con otros radiofármacos (9, 10).

CONCLUSIONESEl péptido F11 marcado con 99mTc pudiera ser un radiofármaco útil para la visualización gammagráficade los melanomas.BIBLIOGRAFÍA

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Tabla I. Pricipales parámetros farmacocinéticos del 99mTc-F11.

Parámetros Estimado (Media ± DE)DesviaciónRelativa (%)

Cmax (%DI/mL) 2,09±0,34 16,2AUC (%DIh/mL) 10,7±1,6 15,0T1/2 (h) 3,54±0,40 11,3Vd (mL) 47,8±2,6 5,4Cl (mL/h) 9,4±1,5 16,0Cmax: conc. máxima en sangre, AUC: área bajo la curva,T1/2: tiempo medio de aclaración, Vd: volumen de dilución,Cl: aclaración.

Tumor

Figura 1. Imagen gammagráfica deun ratón 16h post-inyección

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Las drogas de abuso ¿Inductoras de aberraciones cromosómicas?

Autores: Dr. Aníbal Domínguez Odio*, Lic. Esperanza Lóriga Loaces ** y Lic. Jumirlet Ortega Pérez **

Institución: * Centro de Toxicología y Biomedicina. Autopista Nacinal Km 1 ½. Apdo. Postal 4033. Santiago de Cuba. Cuba.

** Centro Nacional de Toxicología. La Habana. Cuba.

RESUMEN: La existencia de un desconocimiento sobre la agresividad de las drogas de abuso sobre el material hereditario es real, y está

condicionada no solo por los limitados estudios realizados, sino además porque las únicas pruebas capaces de revelar los efectos mutagénicos

y/o carcinogénicos, que pudieran producir las drogas de abuso o sus mezclas sobre la integridad genómica humana, en ausencia de evidencias

epidemiológicas, son hasta hoy las que aportaría el consumidor en si. Por tal motivo se realizó en el Centro de Toxicología y Biomedicina, una

investigación con 125 pacientes drogodependientes, los cuales son adictos al alcohol, alcohol + psicofármacos, alcohol + marihuana, y

Datura estrongénica , L. Mientras que el control negativo consistió en donantes especiales del Banco de Sangre Provincial de Santiago de

Cuba. Como bioindicador de efecto se tomaron en cuenta la frecuencia de aparición de Micronúcleos, Binucleación, Picnositosis, Cromatina

condensada y Cariolisis en células exfoliadas de la mucosa bucal por ser eventos relevantes en los procesos carcinogenéticos. Como principales

resultados se obtuvieron que existen evidencias reales de daño genético severos en las células expuestas, elemento útil para predecir la

aparición y posible evolución de un proceso maligno.

INTRODUCCIÓN. A pesar de los adelantos logrados en este campo existen zonas oscuras sobre la agresividad de las drogas de abuso sobre

el material hereditario y la susceptibilidad genómica del consumidor. Esta situación está condicionada no solo por los limitados estudios

realizados, sino además porque las únicas pruebas capaces de revelar los verdaderos efectos mutagénicos y/o carcinogénicos, que pudieran

producir las drogas de abuso o mezclas de ellas sobre la integridad genómica humana, en ausencia de evidencias epidemiológicas, son hasta

hoy las que aportaría el hombre en si. Los micronúcleos y las atipías celulares valoran en su justa medida la importancia de los distintos

factores endógenos tanto en la modulación de la respuesta mutagénica, como en la vulnerabilidad genómica existente ante la acción de las

drogas. Sin embargo el mayor inconveniente de estos estudios es que tienen lugar a posteriori, una vez que el consumo se ha dado, pero

teniendo en cuenta que la determinación del daño genético diagnosticado se toma como indicador de riesgo carcinogénico y que el periodo de

latencia que media entre la exposición al agente xenobiotico y cáncer es bastante largo; los resultados pueden considerarse como de alto valor

predictivo, aún cuando se desconozcan los niveles reales de exposición.

Teniendo en cuenta la relación causal entre las mutaciones y la transformación maligna de las células (carcinogénesis) y ciertas alteraciones

del desarrollo. Nos proponemos como objetivo determinar el efecto de diferentes drogas de abuso sobre la frecuencia de aberraciones

cromosómicas y atípias nucleares en poblaciones expuestas.

MATERIAL Y METODOS. Población. Para dar cumplimiento a los objetivos trazados y teniendo en cuenta las características de la

población experimental se empleó un estudio de cohorte transversal. La población experimental quedo constituida por cuatro (4) grupos, cuyo

tamaño fue de 25 pacientes, los cuales fueron distribuidos según el motivo del ingreso, y un colectivo control, sin indicación de exposición

previa a drogas de abuso u otro agente sospechoso de genotoxicidad, ni antecedentes de padecimiento de enfermedades infecciosas. (Tabla 1).

Las muestras de células exfoliadas se obtuvieron y manipularon siguiendo las normas éticas establecidas.

Tabla 1. Grupos experimentales según motivo de ingreso.

Código Grupos

OH Alcohol

OH-PT Alcohol + Psicofármacos

OH-THC Alcohol + Marihuana

DE Datura estrongenica

NC Control

Obtención y preparación de las células bucales. Las muestras se obtuvieron mediante un raspado en la parte interna de los mejillas, con

aplicadores de madera y luego las células exfoliadas se depositaron en un tubo de ensayo, que contenía 2- 3 mL de solución salina fisiológica

(0.9 %). A continuación se centrifugo y se le retiró el sobrenadante, para posteriormente agregar la solución fijadora. Al cabo de 20 minutos se

volvió a centrifugar, para finalmente realizar el goteo de la suspensión celular sobre portaobjetos, que se dejaron secar para su posterior tinsión, y

análisis de microscópico.

Evaluación microscópica. Para estimar la frecuencia de micronúcleos, se tomaron en cuenta diversos criterios dentro entre ellos está la

morfología, forma, tamaño, Citoquímica y localización en la célula. Se incluyó otras atípias nucleares como por ejemplo la binucleación,

picnositosis, cariolisis y cromatina condensada. El análisis se le realizó a un mínimo de 1000 células consecutivas cuando la frecuencia de

micronúcleos fue menor de 3/ 1000 se evaluó un máximo de 3000 células para disminuir la probabilidad de que el no encontrar micronúcleos, se

debiera a un evento azaroso.

Análisis de datos. Se calcula la frecuencia de células micronucleadas y con atípias nucleares por 1000 células, obteniéndose los promedios,

luego se compararon las observaciones de la población expuesta y la no expuesta entre si por medio de la prueba de Wilcoxon- Mann Whitney

(P<0.005), conociéndose de esta forma la magnitud de la alteración genética y dependiendo de ello reconocer la existencia de un daño

potencial o efectivo para la salud.

RESULTADOS Y DICUSIÓN. La capacidad de las diferentes drogas de abuso abordadas en este estudio y sus respectivas combinaciones,

para inducir daños genéticos quedo demostrada, al analizar la frecuencia de aparición de micronúcleos y atípias celulares en pacientes adictos.

Los resultados indican (tabla 2), incrementos no solo de micronúcleos en más de 17 veces con respecto al control, sino además de alteraciones

nucleares tales como picnosis, cariolisis, y cromatina condensada alcanzando sus mayores incrementos en pacientes adictos al alcohol, seguido

por las combinaciones alcohol-marihuana y alcohol- psicofármacos.

Los efectos genotóxicos del alcohol encontrados en nuestra investigación están en concordancia con los hallados por otros autores, los cuales lo

describen como inductor prematuro de la separación de los centrómeros durante el proceso mitótico; inhibidor de la diferenciación trofoblástica

en la morula y como teratogénico (Adickes et al, 1993). En el caso concreto de los dos últimos tipos de drogadicción cabía de esperar

frecuencias aún mayores, teniendo en cuenta los reportes anteriores en los cuales describen a la Marihuana como inductora de rupturas

cromosómicas, delecciones, translocaciones y clastogenisidad tanto in vivo como in vitro (Zimmerman et al, 1990), por su parte los

psicofármacos al interactuar con el alcohol es posible obtener sinergismos o potencialización entre ellos, pero no fue así debido quizás al efecto de

diversos factores de confusión como: características interpersonales específicas, frecuencia de consumo, concentraciones de las diferentes drogas

involucradas en la combinación y la cinética de reeplazamiento de las células bucales (Marcos et al, 1984).

Puede observarse igualmente en la tabla 2, que en el caso de la Datura estrongenica, no indujo daños marcadamente genético, no obstante no se

puede descartar aún el peligro pues es posible, que el efecto genotóxico requiera de un periodo de exposición superior para manifestarse en el

órgano estudiado (Bauluz et al, 1984).

Tabla 2. Incrementos en veces de la frecuencia de micronúcleos y atípias celulares en pacientes toxicómanos con respecto al control.

Daño genético / 1000 célulasTipo de drogas

Micronúcleos Binucleación Picnosis Cariolisis Cromatina C.

OH-PT 3.68 * 1.60 * 4.19 NS 4.66 NS 2.67 *

OH-THC 4.80 * 1.59 * 3.00 NS 5.90 NS 3.35 *

OH 17.37 * 1.97 * 3.33 * 3.00 * 2.67 *

DE 2.98 * -- 5.33 * -- --

* Significativo para P<0.005, NS No significativo.

Si bien hubo incrementos de la frecuencia de aparición de casi todos los indicadores, tenidos en cuenta para medir las potencialidades

genotóxicas de los diferentes tipos de drogas, estos no siempre fueron estadísticamente significativos siendo el caso de las células picnoticas y

cariolíticas cuando se analizó la s combinaciones OH-PT y OH-THC, sin que medie una explicación actual.

Estos apuntan en principio que el OH ,OH-THC y OH-PT presentan acción clastogénica y anaugénica, por lo que su consumo incrementa el

riesgo de desarrollar procesos carcinogenéticos a sus consumidores.

De lo expuesto y discutido hasta aquí, se deduce que el consumo tanto de alcohol, como de alcohol-marihuana y alcohol-psicofármacos, supone

un riesgo genético para los toxicómanos. Dado el claro incremento particularmente de micronúcleos.

BIBLIOGRAFÍA

1. Adickes, E.D.; Mollner, T. J. & Makoid, M.C. Teratogenic effects of ethanol during hyperplastic growth in cardiac myocyte cultures.

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3. Marcos, R.; Carbonel, Elisabeth.; Creus, A.; Galofré, P. & Gutierres, Sara. Evaluación del riesgo asociado a la exposición terapéutica

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4. Beauluz, C.;Casado, J.A.; Martín, L.; Ortega, M. & Sierra, I. Mutagénesis y carcinogénesis inducida por radiaciones ionizantes en

modelos de ratones transgénicos. Evaluación mutagénica y genotóxica. Editorial Sociedad Española de Mutagénesis ambiental.

Madrid. España. 1998.

Determinación de sustancias fenólicas

y actividad antioxidante de la

macroalga B.triquetrum..

Autores: Alexis Vidal Novoa1, Mario Motidome2,

Jorge Mancini-Filho 3, Adyary Fallarero Linares1,

Mirtes Midori Tanae2, Luce Maria Brandao

Torres2, Antonio Jose Lapa2

Instituciones: 1Grupo de Farmacologia y

Toxicología, Facultad de Biología, Universidad de

La Habana, 2INFAR, UNIFESP, São Paulo, 3

Facultade de Ciencias Farmacéuticas, USP, São

Paulo.

RESUMEN

El objetivo del presente trabajo fue demostrar la

actividad antioxidante del alga marina

Brythamnion triquetrum y los posibles

compuestos que pudieran explicar esta actividad.

El extracto acuoso de esta alga contiene 8.08 mg

de polifenoles totales/g de extracto liofilizado y

una concentración inhibitoria media (CI50) de la

lipoperoxidación espontanea de 23.3 µg. Se

realizo un fraccionamiento con extracciones

liquido-liquido, TLC y columna de Amberlite

XAD-2, monitoreado por TLC y actividad

antioxidante según la técnica de Ohkawa et al.

(1979), resultando activas varias fracciones. Se

cuantificaron por CGL a los ácidos trans-

cinnámico, p-coumárico y ferúlico en cantidades

de 221.9, 4187.3 y 442..3 µg/g de liofilizado. Se

puede concluir que la actividad antioxidante del

alga roja Bryothamnion triquetrum se debe, al

menos en parte, por la presencia de estos ácidos

fenólicos.

INTRODUCCION

En los últimos años, las algas marinas han atraido

la atención como fuentes naturales de

antioxidantes con amplias perspectivas de

aplicación en el tratamiento de diferentes

patologías, conservación de alimentos y en los

cosmésticos1. Se ha demostrado que extractos

crudos de algunas especies de algas tienen un

notable efecto antioxidante2,3. Los polifenoles,

metabolitos secundarios de las plantas resultan

compuestos con una potente actividad

antioxidante, que están presentes en las algas,

entre los que se pueden citar: bromofenoles,

florotaninos, compuestos polifenólicos sulfatados

y ácidos polifenólicos. El objetivo de este trabajo

fue determinar ácidos fenólicos en un extracto

acuoso del alga marina Bryothamnion

triquetreum, que pudieran justificar, al menos

parcialmente, su actividad antioxidante.

MATERIALES Y METODOS.

Colecta y preparación del extracto acuoso: Las

algas se colectaron en el bajo de Santa Ana,

Ciudad Habana en Septiembre del 2000. Las

especimenes se homogeneizaron con agua

destilada en una relación 1:4 (p/v) y

posteriormente se centrifugaron a 800 g a –4oC,

20 minutos. Los sobrenadantes se liofilizaron y

guardaron en congelación hasta su uso. El

rendimiento estimado del producto en

comparación con el alga fresca fue de 0.5%.

Determinación de TBARS: Los TBARS

formados después de la lipoperoxidación

espontanea de homogenados de cerebro ratas se

midieron de acuerdo al método de Ohkawa et al4.

Esquema general del fraccionamiento: El

extracto acuoso de Bryothamnion triquetrum fue

fraccionado utilizando extracciones liquido-

liquido, TLC y columnas de Amberlite XAD-2.

Polifenoles totales: Los polifenoles totales se

determinaron según Quettier-Deleu et al5.

Determinación de ácidos fenólicos: Los acidos

fenólicos se determinaron por CGL de acuerdo al

procedimiento de Miranda et al.6.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En el presente trabajo se obtuvo una

concentración inhibitoria media de la

lipoperoxidación espóntanea (CI50) de 23.9 µg del

extracto acuoso liofilizado (Figura 1), resultado

similar a lo obtenido por Miranda et al6.

investigando la actividad antioxidante del

microalga Spirulina maxima, lo que evidencia la

posible utilidad de esta alga para estos fines. El

contenido total de compuestos polifenólicos del

extracto liofilizado fue de 8.05 mg de sustancias

fenólicas/g de liofilizado. Wong y Cheung7

reportan valores similares (8.44 mg/g ) para las

algas rojas H. charoides e H. japonica mientras

Jimenez-Escrig et al.8 trabajando también con

extractos del alga roja P. umbicalis y de otras

especies de algas marinas encontraron valores

entre 5 a 7 mg/g.

Al estudiar las diferentes fracciones obtenidas, los

valores mayores de actividad se observan en las

fracciones mas polares, lo que pudiera resultar

lógico si consideramos que generalmente los

compuestos polifenólicos, en buena medida

responsables de esta actividad biológica

presentan cierta polaridad. Varias fracciones

resultaron activas lo que se pudiera explicar por

dos factores: poca especificidad de los

procedimientos empleados y por otro lado un

número alto de compuestos fenólicos que se deben

resolver, con estructuras químicas muy parecidas,

lo que provoa que en varias fracciones aparezcan

los mismos metabolitos.Las fracciones de mayor

interes resultaron las fracciones intermedias de la

columna de con un rendimiento mas bajo pero

con un grado mayor de pureza.

El cromatograma de los patrones de ácidos

fenólicos se presenta en la Figura 2A mientras

que en la Figura 2B se muestra, de manera

ilustrativa, el cromatograma de una de las

fracciones de la columna de Amberlite XAD-2.

En esta fracción se identificaron al ácido trans-

cinnámico (tr 7.18), ácido p-coumárico (tr 14.93)

y ácido ferúlico (tr 17.89). En el resto de las otras

fracciones de los diferentes pasos del

fracionamiento sólo se identificaron estos tres

ácidos fenólicos.

En el analisis de 1 g del extracto del alga

liofilizado se determinaron: 221.6 µg de ácido

trans-cinnámico, 4187.3 µg de ácido p-coumárico

y 442.3 µg de acido ferúlico. Como se puede

apreciar el compuesto que aparece en mas

fracciones y en proporción mayor es el ácido p-

coumárico, aparentemente los tipos y cantidades

de los ácidos polifenólicos en las algas dependen

de la especie en cuestión. En los cromatogramas

de las diferentes fracciones aparecen algunos

picos presumiblemente de compuestos fenólicos

no identificados, esto resulta lógico si

1 10 100 1000

0

20

40

60

80

100

Dosis [extracto de alga] (µg)

% d

e in

hib

icio

n d

e la

lipo

per

oxi

dac

ión

FIGURA 2 - Curva dosis-inhibición de la lipoperoxidación delextracto acuoso del alga Bryothamnion triquetrum. Cada puntorepresenta la media de tres determinaciones. Se determino unaconcentración inhibitoria media de la lipoperoxidación de 23.3 Ug.

Figura 2. A: Cromatograma de los patrones de ácidos fenólicos y el BSA: a:salicilico,b: trans-cinnámico, c:p-hidroxibenzoico, d:BSA , e:vanilico, f:gentísico, g:coumárico h:protocatequinico, i:quínico, j:p-coumárico,k:gálico, l:ferúlico y m:cafeíco. B: Cromatograma de la fracción F5-8 de la columna de Amberlite XAD-2. Los picos identificadosb′, j′ y l′ se corresponden con los tiempos de retención de los ácidos trans-cinnámico, p-coumarico y ferulicorespectivamente y el pico d con el BSA.

consideramos que las algas rojas presentan una

gran cantidad de compuestos fenólicos simples

bromados, sulfatados y florotaninos, de los que

no se poseen patrones, entonces no es posible su

identificación por esta metodología. Diferentes

investigadores han reportado la actividad

antioxidante de los ácidos fenólicos identificados

en este trabajo10,11, por lo que se puede plantear

que la actividad antioxidante del extracto acuoso

del alga marina Bryothamnion triquetrum es

explicada, al menos parcialmente, por la presencia

de los ácidos fenólicos.

REFERENCIAS

1.-Potterat O. Curr. Org. Chem., 1:415-440, 1997.

2.-Le Tutour B. Phytochemistry, 29:3759-3765,

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5.-Quettier-Deleu C, Gressier B, Vasseur J, Dine

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Bailleul F, Trotin F. J. Ethnopharmacol.,72(1-

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6.-Miranda MS, Cintra RG, Barros SBM,

Mancini-Filho J. .Braz J. Med. Biol. Res.,

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10.-Schroeter H, Williams RJ, Matin R, Iversen L,

Rice-Evans CA. Free Rad. Biol. Med., 29(12):

1222-1233, 2000.

Perpectivas de las algas marinas como fuentes de antioxidantes naturales.

Fallarero1, C. Zaldivar1, R. Barro1, O. Castañeda1, F. Rivera1, A.Vidal1.

Institución: 1 - Grupo de Farmacología-Toxicología, Facultad de Biología, Universidad de La Habana

Dirección: Calle 25 # 455 e/ J e I. Vedado. Plaza de la Revolución. Ciudad de La Habana, Cuba.

RESUMEN

Se realizó un tamizaje para identificar actividad antioxidante en 16 especies de algas tropicales del mar Caribe

y se cuantificó la capacidad de inhibir la lipoperoxidación espóntanea. El 68% de las especies analizadas mostró

actividad antioxidante satisfactoria. Este resultado conjuntamente con algunos parámetros biológicos permitió

seleccionar a las especies Halimeda incrassata (Hi) y Bryothamniom triquetrum (Bt). Las curvas de inhibición

de la lipoperoxidación espontánea en cerebro de rata y de la dismutación de los iones superóxido (O2· -)

generados in vitro (actividad tipo SOD) evidenciaron IC50 menores que 0.5 mg/mL, valores que son comparables

a los obtenidos para extractos crudos de otras especies vegetales.

INTRODUCCION

Los compuestos antioxidantes se presentan como sustancias prometedoras para el tratamiento de algunas

patologías debido en buena medida a que las especies de radicales del oxígeno actualmente son reconocidas como

elementos importantes en un número crecientes de enfermedades1. Las algas, las cuales constituyen un importante

recurso dietético en muchos países con menor incidencia de enfermedades neurodegenerativas atraen la atención

como fuente de antioxidantes con amplia aplicación en la Biomedicina y Alimentación2-4. El objetivo del presente

trabajo es presentar evidencias de la actividad antioxidante de extractos acuosos de Bryothamniom triquetrum y

Halimeda incrassata mediante procedimientos “in vitro” .

MATERIALES Y METODOS

Colecta y preparación del extracto acuoso: Las algas se colectaron en el bajo de Santa Ana, Ciudad Habana

en Diciembre de 2001. Las especimenes se homogeneizaron con agua destilada en una relación 1:4 (p/v) y

posteriormente se centrifugaron a 800 g a –4oC, 20 minutos. Los sobrenadantes se liofilizaron y guardaron a –4oC

hasta su uso.

Determinación de TBARS: Los TBARS formados después de la lipoperoxidación espontanea de homogenados

de cerebro ratas se midieron de acuerdo al método de Ohkawa et al5.

Determinación de la actividad de la superoxido dismutasa (SOD). Las condiciones experimentales fueron

similares a las descritas por Fridovich y McCord6.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN.

Los resultados del tamizaje para identificar actividad antioxidante (Tabla 1) muestra que el 68% de las especies

estudiadas tienen más de 70% de actividad inhibitoria de lipoperoxidación, lo que evidencia las perspectivas de

estos extractos con estos fines. A partir de este tamizaje se decidió estudiar a las especies B.triquetrum (Bt) y

H.incrassata (Hi).

Tabla 1. Tamizaje de la actividad antioxidante de losextractos acuosos de algas marinas

ESPECIES% de inhibición de la

lipoperoxidación(X ±DE)

Halimeda incrassata 100.00 ± 0.0Halimeda copiosa 98.63 ± 1.9

Halimeda opuntia 98.47 ± 2.7

Halimeda discoidea 97.57 ± 2.4

Dictyopteris justii 94.33 ± 1.9

Galaxaura oblongata 88.15 ± 6.0

Galaxaura marginata 85.60 ± 6.3

Bryothamnium triquetrum 85.57 ± 4.1

Caulerpa racemosa 73.83 ± 6.8

Gracilaria domingensis 70.97 ± 6.5

Bryopsis plumosa 58.93 ± 12.8

Kappaphycus alvarezii 25.4 ± 12.4

Ulva fasciata 16.5 ± 15.4

Kappaphycus alvarezii (red) 13.8 ± 8.3

K. alvarezii (green) 11.7 ± 1.0

K. alvarezii (green-brown) 9.7 ± 13.7

La actividad antioxidante de los extractos de

Hi y Bt fue evaluada en lo referido a su

habilidad para dismutar iones O2•- (actividad

tipo SOD) y para capturar radicales OH•

(Figura 1). Como se puede observar, los

extractos de Hi y Bt tienen la capacidad de

inhibir la reducción del NBT de un modo

dosis-dependiente. La IC50 de ambos

extractos fue de 0.50 mg/mL. Un valor

similar de IC50 ha sido referido para la

actividad tipo SOD del extracto acuoso-

metanólico obtenido de la corteza de Betula

platyphylla7.

La eliminación de radicales O2•- tiene

efectos positivos para el mantenimiento de la

homeostasis oxidante. En condiciones in

vivo, estas entidades químicas pueden oxidar

fácilmente la familia de enzimas

deshidratasas que contienen complejos [4Fe-4S] en sus sitios activos como la dihidroxiácido deshidratasa, la 6-

fosfogluconato deshidratasa, la aconitasa y las fumarasas A y B lo que conlleva a la inactivación de tales proteínas

y a la pérdida del Fe2+ de dichos clubsters, con lo que se facilita la participación de este metal en la reacción de

Fenton. Del mismo modo, en condiciones in vitro, el anión O2•- puede reducir el Fe3+ que se encuentre disponible

y de esa manera también facilitar su

intervención en la reacción de Fenton.

También el O2•- puede reaccionar no

enzimáticamente con el NO• y formar ONOO-

que es un compuesto químico altamente

oxidante con muchos efectos tóxicos probados,

principalmente neurotóxicos8. En este sentido,

la eliminación de O2•- tiene efectos positivos

sobre el equilibrio oxidante del organismo y la

actividad tipo SOD de estos extractos

resulta beneficiosa.

Producto de la reacción de dismutación

del O2•- se obtiene H2O2 que puede

atravesar fácilmente las membranas biológicas y en presencia de metales de transición como el Fe2+ generar

radicales OH• por medio de la reacción de Fenton entonces la actividad tipo SOD puede contribuir al desequilibrio

-1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 0

20

40

60

80

100 H. incrassata B. triquetrum

Po

rcen

taje

de

inh

ibic

ión

de

la r

edu

cció

n d

el

NB

T(%

)

log (concentración de extracto) (mg/mL)

Figura 1. Curva dosis-respuesta para la actividad tipo SOD delos extractos de Hi y Bt. Los valores se expresan como media ± DS(n=10).

de la homeostasis en términos oxidativos.Entonces la actividad tipo SOD de los extractos sólo puede considerarse

importante si se acompaña de la

capacidad para descomponer los

peróxidos generados o para evitar un

daño oxidativo mediado directamente

por H2O2, y/o de la habilidad para

capturar los iones OH• que se forman

como resultado de la reacción de

Fenton. En la Figura 2 se puede

observar que sólo el extracto de Hi

muestra actividad atrapadora de

radicales OH•, y que tal actividad es

dosis–dependiente con una de IC50 es

1.64mg/mL. El extracto de Hi puede

resultar útil como antioxidante que

previene la excesiva generación de

oxidantes mediadas por la reacción de Fenton, ya que exhibe simultáneamente la capacidad de dismutar iones O2•-

y capturar los radicales OH• formados durante esa reacción.

Al analizar estos resultados podemos concluir que existen especies de algas en nuestro sistema ecológico marino

con perspectivas de uso como antioxidantes.

REFERENCIAS.

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2.-Yan X, Nagata T, Fan X. Antioxidative activities in some common seaweeds. Plant Foods Hum. Nutr., 52(3):

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tetrachloride in rats. Chemosphere, 41(1-2): 173-76, 2000.

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8.- Lipton S.A, Choi YB, Pan, SH, Lei SZ, Chen HS, Sucher NJ, Loscalzo J, Singel DJ, Stamler JS. Nature, 364:

626-632, 1993.

-0.6 -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4

0

10

20

30

40

50

Por

cent

aje

de i

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ició

n de

l

blan

quea

mie

nto

de l

a p

ND

A (%

)

log (concentración del extracto) (mg/mL)

H. incrassata

B. triquetrum

Figura 11. Curva dosis-respuesta para la capacidad de inhibir elblanqueamiento de la p-NDA de los extractos de Hi y Bt.

CONTAMINACIÓN DEL MEDIO AMBIENTE POR AGENTES FÍSICOS

Y QUÍMICOS EN LA ZAFRA TABACALERA EN LA PROVINCIA DE

PINAR DEL RÍO.

AUTORES: LIC. ARMANDO CORREA FERNÁNDE; DR. REYNALDO HEVIA PUMARIEGA.

DR. RAFAEL MOYA DÍAZ; LIC. ENMA RODRIGUEZ DURAN.

INSTITUCIÓN: CENTRO NACIONAL DE TOXICOLOGIA. Cuba.

E –mail: cenatox @ infomed. sld.cu

RESUMEN:

Durante los meses de Enero y Febrero del 2002 se produjeron dos intoxicaciones masivas agudas en

la Provincia de Pinar del Río en personas que laboran en la cosecha del tabaco. Los pacientes

expuestos presentaron síntomas tales como: Cefaleas, náuseas, vómitos, debilidad y dolores

abdominales. Se realizó un estudio de impacto ambiental con el objetivo de determinar la posible

etiología, para lo que realizamos visitas a las áreas afectadas. Se comprobó que dichos sucesos se

debieron a la interacción de los trabajadores con factores físicos y químicos. Los agentes químicos

(residuos de plaguicidas y nicotina) se determinaron por la técnica analítica de cromatografía gaseosa

y los agentes físicos (humedad y temperatura) por mediciones termohidrométricas.

INTRODUCCION:

Existen innumerables procesos naturales originados por el hombre que pueden lanzar al ambiente agentes químicos de

una manera inadecuada ó con riesgo para las diferentes formas de vida, ya sea desde el punto de vista cualitativo y

cuantitativo. También se conoces otros (agentes físicos que no dependen de la voluntad del hombre, dentro de los que se

destacan las radiaciones, el ruido, las vibraciones y alteraciones de la temperatura y la presión. En relación con los

agentes químicos, la situación se vuelve bastante compleja debido al elevadísimo número de sustancias que utiliza el

hombre hoy en día bajo las más diversas formas y en los más variados procesos.

Hay indicaciones de que en el mundo se están empleando alrededor de 600 000 productos químicos industriales. Este dato

es alarmante ya que desde el punto de vista toxicológico toda sustancia química está provista de un alto grado de

toxicidad, y puede inducir acciones y efectos nocivos sobre los seres vivos y en los ecosistemas.

Cuando por razones de protección de un cultivo contra plagas, enfermedades y malezas, se aplican los plaguicidas

correspondientes, se produce inicialmente un depósito sobre el objetivo en cuestión, cuya magnitud dependerá de la dosis

utilizada, de la composición del formulado del método y la uniformidad de la aplicación, de las características del medio

donde se aplican, así como las condiciones ambientales. De este modo, las plantas se convierten en depósito de

residuales por la acción de numerosos factores físicos y químicos.

En ocasiones ocurren contaminaciones en el ambiente imposibles de eliminar. Lo que sí es posible es conocer

exactamente es la dimensión del problema, sus riesgos a corto y largo plazo y las medidas a tomar para reducir al mínimo

sus consecuencias. Contaminación es la presencia en el medio de cualquier compuesto orgánico ó inorgánico en exceso

de su ocurrencia natural y originado por la actividad humana.

OBJETIVOS: El objetivo del presente trabajo es realizar un estudio de impacto ambiental para determinar la posible

etiología de las intoxicaciones ocurridas.

METODOS:

Para la realización de estas investigaciones se visitaron 19 campamentos ó áreas de trabajo en la provincia Pinar del Río,

donde se recolectaban 4 variedades de tabaco (I, II, III, y IV). De ellos 12 donde hubo afectados (66,6%) y siete sin

afectaciones seleccionadas al azar como controles. Se tomaron muestras de fluidos biológicos (sangre y orina) para

análisis toxicológicos, las de rocíos depositados sobre las hojas de tabaco se tomaron temprano en la mañana con apósitos

de algodón esterilizados, luego se exprimieron en frascos de vidrio esterilizado, se taparon y se guardaron en congelación

para su posterior uso. Para la determinación de estos análisis (nicotina y plaguicidas se aplicó la técnica de cromatográfia

gaseosa según PNO 02.01 Norma ISO 10315, con pequeñas modificaciones utilizadas en el Instituto de Investigaciones

del Tabaco (C. Habana). Las temperaturas y humedad relativa en los días de los sucesos fueron emitidas por el Centro

Meteorológico Provincial, dicho centro empleó el método Termohidrométrico.

Se clasificaron las actividades de las 304 personas involucradas.

Se constató que en todas estas áreas se laboraba con el tabaco mojado y que ingerían agua y alimentos en el campo, sin

previo aseo. En dos de los campamentos a los que pertenecían ocho enfermos del mes de Febrero se comprobó que el

tabaco estaba mojado ó húmedo.

Otros aspectos analizados fueron la procedencia del agua potable, en este caso se almacenaban en tanques abastecidos de

pozos ó por pipas, dichos recipientes estaban correctamente tapados y clorados, si los alumnos acostumbraban a bañarse

en ríos, lagos, ó presas cercanas a los campos, lo cual fue negativo.

RESULTADOS Y DISCUSION:

En este estudio preliminar se hicieron algunos hallazgos que aportaron datos relevantes, a la posible etiología del

mencionado evento toxicológico, la determinación cuantitativa de la nicotina (Tabla II), puso de relieve distintas

concentraciones, según la variedad, pero este dato, no refleja exactamente dicha concentración, ya que las muestras no se

tomaron de forma homogénea, en ocasiones no se realizaron embebiendo el algodón en las gotas de rocío y se observaron

partículas de resinas en las muestras. Tampoco se registro correctamente el número de hojas muestreadas, punto de

muestreo, porción de la hoja, todo lo cual, atenta contra la uniformidad de los resultados.

Otro factor que influyó en el posible desencadenamiento de dicho evento, fue la elevadísima temperatura promedio (290C) registrada en el mes de Enero, lo cual es atípico para una estación en la provincia. Otros elementos a destacar fueron

la presencia de niebla y la alta humedad relativa (98%), y las altas presiones migratorias (agentes físicos), la cual

favoreció la absorción de los productos químicos a través de la piel, que fue la vía de entrada del tóxico.

Aunque las concentraciones de residuos de plaguicidas encontrados unos días después del incidente en suelo, agua y

hojas de tabaco, estuvieron dentro de los límites permisibles (1 – 5 ppm), no se descarta la posibilidad de que el momento

de la intoxicación estuvieran cercanos al límite superior, lo que por sensibilidad humana, pudo afectar a algún que otro

individuo susceptible, hecho constatado en los diferentes campamentos visitados. Otro aspecto puede ser la posibilidad de

que haya ocurrido un sinergismo por la biodegradación de los plaguicidas utilizados con la nicotina de las hojas del

tabaco (agente químico).

En cuanto a las concentraciones de nicotina determinada en rocío sobre las hojas de tabaco se encontraron valores altos

teles como 65,28 ; 62,82 y 44,63 ug/mL aunque en cuba no existen valores permisibles de exposición a este alcaloide por

no haberse realizado estos estudio previos. En la literatura consultada (5, 6 y 7) se pudo comprobar que en otros países, se

han hecho estudios donde se identificaron trabajadores con sintomatológia similar a las presentadas en Pinar del Río.

Genbach y Perry (5) reportaron cifras de nicotina en el rocío de las hojas de tabaco entre 33 – 85 ug/mL. Ellos le llamaron

a esta afección “ Enfermedad del tabaco verde”, la causa más probable es la absorción de la nicotina a través de la piel,

cuando se cosecha tabaco verde.La nicotina es altamente soluble en agua, por lo tanto cuando el campo está mojado y los

trabajadores se empapan la ropa, esto favorece la absorción de la misma. Además, si el recolector de hojas de tabaco tiene

las manos o piel con algunas heridas, rasguños o erupción, también propicia la entrada de la sustancia al organismo. Se

comprobó en el presente estudio que los trabajadores que fumaban no se enfermaron, al parecer hacen tolerancia a la

nicotina, mientras los que no fumaban o eran novatos en el trabajo presentaron síntomas de intoxicación. Se constató que

el contacto directo con la hoja del tabaco, según la actividad desempeñada por el trabajador aumentó la incidencia de la

intoxicación, lo cual coincide con otros estudios (5, 6, 7). La intoxicación por nicotina como agente etiológico

(Enfermedad del tabaco verde), adquiere relevancia. Se produce en personas en contacto directo con el tabaco mojado,

cuadro clínico breve que desaparece al cesar la exposición, aparece fundamentalmente en horas de la tarde, como se

describe en esta enfermedad (5).

En el ámbito internacional la enfermedad del tabaco verde, se ha reportado en E.U5, India6 y Japon7, pero no se han hecho

muchos esfuerzos regulatorios para eliminar los peligros potenciales de esta enfermedad. En Cuba, no se tiene

experiencia al respecto, al parecer esta enfermedad había ocurrido con anterioridad al evento descrito en este trabajo pero

como el cuadro clínico es tan breve, se atribuían a otros eventos, sin que se reportaran que era una intoxicación por

nicotina.

CONCLUSIONES:

El sinergismo entre los factores ambientales y los agentes físico-químicos propició el desencadenamiento de dichos

eventos. La vía dérmica fue la puerta de entrada del tóxico. No se pudo establecer un criterio de intoxicación por nicotina

por la no existencia de un protocolo de investigación bien diseñado

REFRENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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CALIDAD DE LOS PARÁMETROS FÍSICO – QUÍMICOS DEL AGUA

EN ENSAYOS DE TOXICIDAD AGUDA EN PECES.

AUTORES: LIC. ARMANDO CORREA FERNÁNDEZ; LIC. ONELIO CARBALLO HONDAL;

LIC. EMILIO ALVAREZ PÉREZ; TÉC. ANIA REYES; TEC. JOSE

TRUJILLO

INSTITUCION: CENTRO NACIONAL DE TOXICOLOGÍA. E –mail: cenatox @ infomed. sld. cu

RESUMEN: El objetivo del presente trabajo fue determinar la calidad de los parámetros

físico-químicos del agua de los peces, destinados a un ensayo de toxicidad aguda estática

de un bioplaguicida obtenido por vía biotecnológica. La especie de pez empleada fue la

Cebra (Brachidanio rerio). El ensayo duro 96 horas, se empleó técnicas analíticas para

determinar la calidad del agua del Laboratorio de Investigaciones Toxicológicas y del

Ambiente.

Se midieron los parámetros: Oxigeno disuelto, Temperatura del ambiente y de la pecera, pH, Dureza total y

Conductividad como indicador auxiliar. Estas determinaciones son las exigidas por las Agencias Regulatorias

internacionalmente acreditadas para estos ensayos.

INTRODUCCIÓN:

La utilización de sustancias químicas y biológicas todos los aspectos de la vida se ha ido intensificado en los

últimos decenios. El comercio internacional se ha acrecentado proporcionalmente, dando un carácter

imperativo a la necesidad de un análisis y una evaluación constante de los procedimientos para determinar su

toxicidad. La inquietud respecto a los posibles riesgos para la salud que podrían derivarse de la exposición a

estas sustancias es una preocupación creciente en el mundo actual, especialmente en los países

industrializados. Es un requerimiento indispensable que los países dispongan de laboratorios destinados a

estudios de toxicología ambiental.

El comercio internacional se ha acrecentado proporcionalmente, el evidente potencial tóxico de dichos

agentes, pone de relieve la necesidad de evaluar constantemente los procedimientos de la calidad del agua en

aras de determinar su toxicidad.

La producción y aplicación de bioplaguicidas le ha permitido a Cuba contar con recursos propios para la

protección fitosanitaria de los cultivos y reducir el uso de los productos químicos en la agricultura, con el

consecuente beneficio para la protección del medio y la inocuidad de los alimentos.

En sentido general, la calidad del agua se determina por una serie de parámetros biológicos, físicos y

químicos. En cultivo de peces, se define la calidad del agua como la conveniencia de esta para la

supervivencia y crecimiento de los peces, y se controla normalmente por pocas variables. La mayoría de los

piscicultores conocen estas variables y están conscientes de la relación entre ellas y la producción.

MÉTODO:

Se utilizó un sistema de ensayo estático sin renovación de agua durante 96 horas con flujo de aire continuo

para la determinación de la toxicidad letal aguda o signos de toxicidad provocados por el producto de ensayo

sobre el pez cebra (Brachydanio Rerio), especie de agua dulce recomendada por las guías de estudio (EPA(1),

OECD(2) e ISO.7346-1(3)).

Para esto se empleo agua corriente del acueducto de Marianao, a la cual se le

determinaron los siguientes parámetros ; durante los 4 días cada 24 horas, en horas

tempranas de la mañana.

Dureza total entre 10-250 mg Ca CO3 / L

pH = 6 - 8.5

Sin presencia de cloro ( para asegurar que el agua no tuviera cloro, se dejó en reposo 72 horas el agua del

grifo) y se determinó la cantidad de cloro.

Oxígeno disuelto y/o de saturación y conductividad.

La concentración de oxígeno disuelto se determinó por el método electrométrico con un oxímetro, la

temperatura se determinó con termómetro calibrado, pH con pHmetro. En caso de observar cambios en el pH

del agua de las peceras, luego de añadir la sustancia de prueba, entonces se repetirá el procedimiento

ajustando el pH de la solución madre. El ensayo se realizó sin ajustar el pH. La dureza del agua y la

presencia del cloro se determinaron por el método tritrimétrico.

Parámetros físico-químicos a controlar durante el ensayo.

Parámetros físico-químicos a medir durante el ensayo en las peceras (diariamente). Estos comienzan a

medirse momentos antes de añadir los peces a las peceras, después de añadir los peces, luego cada 24 horas y

al concluir el ensayo.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN:

El oxígeno es el principal componente del aire, constituye un 20.95% pero es escasamente soluble en agua.

Las concentraciones de oxígeno disuelto son mayores a 0 0C y disminuye la temperatura como por ejemplo a

00c la concentración es 14,16 ppm y a 24 es 8.25 mg/l.

PARÁMETROS MÉTODOS VALOR ESPERADO

Oxígeno disuelto (ppm) Oxímetro 6-9 (ppm)

Temperatura del líquido en la

pecera y del localTermómetro 23± 20c

pH pH metros 6.6 – 7.2

Dureza del agua

(solamente el primer día)Método tritímetro

10-250

mg CaCo3/L

Conductividad

(medida adicional)Conductímetro < 700 µs/cm

En este ensayo no hubo diferencias significativas del oxígeno disuelto entre el grupo control (8.97 ppm) y los

grupos de ensayo (8.48; 8.53; 8.87; 8.54; 8.50 ppm) durante las 96 horas de estudio. El valor más bajo

registrado durante la prueba fue de 8.16 ppm y el más alto 8.96 ppm, estos resultados son permisibles para

estos tipos de ensayos.

Las temperaturas (peceras y ambiente) se mantuvieron constantes durante el ensayo y dentro del rango

requerido.

El pH se define como el logaritmo negativo de la actividad del ion hidrógeno

pH= - log (H+).

Las aguas más naturales tienen valores de pH de 6.5-9 aunque existen muchas exposiciones, los puntos

ácidos y alcalinos letales para los peces oscilan entre 4 y 11 respectivamente.

Los pH obtenidos en el presente estudio oscilaron entre 6.5 y 7.0 como promedio durante el ensayo, lo cual

explica que no hubo variación significativa y que tanto las condiciones ambientales como el producto

evaluado no interfirieron en el comportamiento de dicho pH, el rango obtenido de pH estuvo dentro de los

valores esperados.

La dureza total se refiere a la concentración de metal divalente en agua, expresado en miligramos por litro del

carbonato de calcio equivalente.

Es necesario que el agua que se utilice para los peces contenga cierta cantidad de calcio y magnesio porque

de esta manera reacciona también la alcalinidad total. En este ensayo se observó claramente que los valores

obtenidos (75.06 mg de CaCO3/L-200 mg de Ca CO3L) estuvieron dentro del rango esperado.

La conductividad es la capacidad que tiene el agua de conducir la corriente eléctrica y sus valores indican los

grados de salinidad relativos; dependiendo esta en cierta medida de las proporciones de los iones principales

disueltos en el agua.

El rango de conductividad obtenido en el ensayo fue de 403.2 a 629.28 µ/cm y estuvieron dentro de los

valores esperados.

CONCLUSIONES:

La calidad de los parámetros físico-químicos del agua de los peces, tales como: dureza total, pH, cloro,

conductividad eléctrica y oxígeno disuelto se mantuvo dentro del rango establecido durante el estudio.

BIBLIOGRAFÍA:

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FARMACOCINETICA DEL4-HIDROXI-3-METOXIBENZALDEHIDO POR VIA ENDOVENOSA EN PERROSBEAGLE

Dr. Carlos A. González Delgado (MsC) 1, Lic. Lourdes Olivera Ruano (MsC) 1, Lic. Yoagne Trapero Quintana 2,Lic. Armando Correa Fernández 1, Dr. Juan F. Sánchez de la Morena 1

1- Centro Nacional de Toxicología 2- Centro de Biofísica MédicaResumen:

Introducción: El 4 – Hidroxi – 3 – Metoxi-benzaldehido, producto flavorante que se encuentra en alimentos y bebidas, es

un aldehído aromático de escasa toxicidad que está siendo evaluado como un nuevo fármaco para el tratamiento de la

Sicklemia por su capacidad de inhibir la polimerización de la hemoglobina S. Objetivo: Caracterizar farmacocinéticamente

al mismo administrado en dosis única por vía endovenosa en perros Beagle. Materiales y Métodos: Se administró a 5

animales una dosis de 75 mg/Kg en solución hidroalcohólica al 15 %. Se extrajeron muestras de sangre a diferentes tiempos

antes y después de la administración para cuantificar sus niveles plasmáticos por cromatografía líquida de alta presión

(HPLC). El análisis farmacocinético se realizó mediante el programa de computación PKCALL. Los valores de

concentración plasmática se ajustaron a través de un modelo abierto de dos compartimiento y se calcularon los parámetros

“modelos dependientes” y “no dependientes” que definen este modelo utilizando las expresiones matemáticas

correspondientes. Resultados: El tiempo de vida media biológico ( t ½ ) fue de 19.71 ± 16.04 min., mientras que para la

fase alfa ( ) o de distribución el t ½ fue de 5.06 ± 1.45 min. La Cmax. alcanzada fue de 60.06 ± 25.04 µg/mL, con un

área bajo la curva total (AUC 0 - ∞ ) igual a 440.63 ± 149.92 µg-min/mL. Se obtuvo un valor para el aclaramiento plasmático

de 18.27 ± 5.71 mL/min/Kg y un volumen de distribución (Vd Área) igual a 491.10 ± 333.51 mL/Kg. Conclusiones: La

cinética de este producto una vez administrado por vía endovenosa puede ser descrita a través de un modelo abierto de dos

compartimientos con una eliminación muy rápida del organismo y un alto volumen de distribución.

Introducción:

La Sicklemia, enfermedad molecular bajo estudio desde hace mucho tiempo, permanece en la actualidad sin una terapéutica

efectiva con pocos o ningún fármaco disponible para este propósito. Es causada por la presencia de la hemoglobina mutante

S (Hb-S). El trastorno genético fundamental es la sustitución del ácido glutámico por la valina en la posición 6 de la cadena

que provoca la polimerización de la Hb-S formando agregados moleculares en forma de estructuras microtubulares

alongadas que rigidifican y distorsionan el glóbulo rojo y disminuye su flexibilidad. Estas células obstruyen los pequeños

vasos capilares y ocasionan una oxigenación deficiente en los tejidos. La hipoxia tisular causada por la vaso oclusión en la

microcirculación y el consiguiente daño de los órganos, constituye la primera causa de morbilidad y mortalidad en esta

enfermedad. Desde el punto de vista terapéutico, han sido evaluado in vitro diferentes productos que inhiben el proceso

de polimerización de la Hb-S. Uno de ellos, el 4 – Hidroxi – 3 – Metoxi-benzaldehido es el de mejores resultados por su

moderada acción antisickling y escasa toxicidad (1, 2). El objetivo del presente estudio fue el de evaluar la farmacocinética

del mismo por vía endovenosa (EV) en dosis única con vistas a una mejor interpretación de los resultados

farmacodinámicos y toxicológicos preclínicos.

Materiales y Métodos:

Se utilizaron cinco perros Beagle, machos, jóvenes, con pesos comprendidos entre 9.3 y 13.5 kg (10.54 ± 1.71 kg),

procedentes del CENPALAB. La administración de la sustancia de prueba se realizó de forma aleatoria. Se administró una

dosis única por vía oral de 75 mg por Kg de peso empleando para ello una solución de 45 mg/ml de vainillina en solución

alcohólica al 15%. Los animales se encontraron en ayunas desde la noche anterior al día de administración permitiéndosele

Tabla 1: Valores promedios de las constantes de velocidad y tiempos de vidamedia.

Figura 1: Perfil de los datos prom edio

0

10

20

30

40

50

60

70

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Tiempo (min)

Con

cen

trac

ión

(m

cg/m

L)

Observada Estimada

Tabla 2: Valores promedios de los parámetros farmacocinéticos de disposición.

tomar agua. La misma se realizó en forma de infusión EV rápida a través de la vena safena. Después de la administración

del producto tuvieron libre acceso a la toma de agua y alimentos. Se realizaron extracciones de muestras de sangre de 5mL

mediante un trocar colocado en la vena yugular para la determinación de los niveles plasmáticos de la sustancia de prueba

antes de administrar la misma (t=0) y después a los siguientes intervalos de tiempo posterior a su administración: 1, 5, 10,

15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 75, 90, 105, 120, 150 y 180 minutos. La sangre extraída fue centrifugada inmediatamente a 2000

rpm durante 5 minutos. Del plasma obtenido se tomó una alícuota de 1ml la cual fue almacenada a -20oC hasta su posterior

análisis por HPLC. Los datos de concentración plasmática fueron analizados utilizando el programa de computación

PKCALC. Los valores de concentración plasmática se ajustaron a través de un modelo abierto de dos compartimiento y se

calcularon los parámetros “modelos dependientes” y “no dependientes” que definen este modelo utilizando las expresiones

matemáticas correspondientes según Gibaldi y Perrier (3). Los valores de concentración plasmática inferiores al límite de

cuantificación de 0.2 µg/ml, no fueron tomados en consideración en el análisis farmacocinético.

Resultados y Discusión:

El volumen promedio de la solución administrada en este estudio fue de 17.56 mL, lo cual se corresponde con una dosis

única promedio de 790.38 mg (0.79 g).

La figura 1 muestra la curva promedio de los niveles plasmáticos en función del tiempo observada experimentalmente y la

ajustada según la ecuación del modelo. Los parámetros farmacocinéticos obtenidos se muestran en las tablas 1 y 2.

Al analizar la figura 1, se observa una disminución rápida en los primeros 30 minutos seguido de una disminución más lenta

así como el buen ajuste de los datos experimentales mediante el modelo bicompartimental ya que la curva estimada a partir

de la ecuación que describe el modelo propuesto prácticamente se superpone a la curva de los datos experimentales. De esta

forma, se obtuvo la siguiente ecuación que describe el modelo propuesto:

Ct = 56.3993 e – 0.1508 t + 11.0061 e – 0.05225 t

La caracterización farmacocinética (Tablas 1 y 2), muestra una permanencia muy corta de este producto por los bajos

valores del tiempo de vida media beta (t ½ = 19.71 min.) y del tiempo medio de residencia (MRT= 14.18 min.). En

correspondencia con estos resultados los valores de aclaramiento fueron muy elevados (195.35 mL/min.). Si embargo, al

plotear a escala logarítmica los valores de concentración plasmática se observa a partir de los 50 minutos una tendencia a

un estado de meseta o plateau con una disminución mucho más lenta de los niveles plasmáticos. El límite de cuantificación

de la técnica analítica empleada (0.21 µg/mL) no nos permitió obtener valores de concentración en todos los tiempos de

extracción. Por tal motivo, el comportamiento observado con los últimos valores de concentración nos hace suponer que la

eliminación del 4 – Hidroxi – 3 – Metoxi-benzaldehido del organismo sea un proceso mucho más lento lo cual se

correspondería con un t ½ y un MRT más prolongados.

β (min-1)T½ β(min)

∝(min-1)T½ ∝(min.)

K12(min-1)

K21(min-1)

Ke

(min-1)0.0522 19.71 0.1508 5.06 0.0165 0.0673 0.1192

±0.0237 ±16.04 ±0.0493 ±1.46 ±0.010 ±0.036 ±0.027

Cmax

(µg/mL)

ABC0-∞

(µg-in/mL

CL

(mL/min)

Vd Ctral/kg

( mL/kg )

VdZ/kg

(mL/kg

VdSS/kg

(mL/kgMRT

(min.)60.06 440.63 195.35 118.32 491.10 254.88 14.18

±25.04 ±149.92 ±76.19 ±31.41 ±333.5 ±106.5 ±6.07

Por su parte, durante la distribución o fase en la cual se dan simultáneamente los procesos de distribución y eliminación

se produce un descenso de los niveles plasmático muy rápido correspondiéndole un tiempo de vida media (t ½ ) igual a

5.06. Si tomamos en consideración que este producto para ejercer su acción penetra al interior de los eritrocitos y se une de

forma estable mediante enlaces covalente a la hemoglobina, esta disminución rápida de los niveles plasmáticos esta dada

por la ocurrencia simultanea de los procesos de distribución al interior de de los eritrocitos y a su eliminación propiamente

dicha del organismo. De esta forma, la cinética de distribución al interior de los eritrocitos y su posterior eliminación del

organismo una vez que se haya alcanzado el equilibrio final de distribución pudiera ser un proceso complejo en el cual

intervengan diferentes factores tales como: afinidad del mismo por los sitios activos presentes en la hemoglobina, número

de sitios activos, concentración de hemoglobina y valor del hematocrito, etc.

Las constantes de velocidad intercompartimentales K12, K21 presentaron valores de 0.01652 ± 0.01063 y 0.06735 ± 0.03637

min-1 respectivamente. La constante de velocidad de eliminación desde el compartimento central (Ke) presenta un valor de

0.1192 ± 0.0277 min-1.

Respecto al volumen de distribución se obtuvieron valores muy elevados para el volumen de distribución área (VdZ/kg) y el

volumen de distribución en estado estacionario (VdSS/kg) corregidos para los pesos de los animales de 491.10 mL/kg y

254.88 mL/kg respectivamente tomando en consideración el volumen plasmático del modelo animal empleado (4), lo cual

demuestra que este producto presenta un alto grado de internalización. En cuanto a esto, aunque no contamos con

antecedentes en la literatura que nos permitan explicar este comportamiento consideramos que pueda estar dado por su

entrada y almacenamiento en el interior de los eritrocitos y su posible distribución a otros órganos, tejidos o fluidos lo cual

debe ser objeto de futuros estudios. A partir de los datos experimentales obtenidos concluimos que la cinética de este

producto una vez administrado por vía endovenosa puede ser descrita a través de un modelo abierto de dos compartimientos

con una eliminación muy rápida del organismo y un alto volumen de distribución.

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Influencia de las especies reactivas de oxígeno en la diabetes mellitus tipo 2

Autores: Caridad Margarita García Peña1, María Teresa Díaz Soto2.1Centro de investigación y desarrollo de medicamentos. CIDEM. Ave. 26 # 1605 e/ Puentes Grandes y

Boyeros. Plaza. Ciudad de la Habana..Cuba.C,P.10600. Telef: (537)881-0818 881-0830. Fax: (537) 33-5556.

Cidem·@infomed,sld.cu.2Centro de estudios para las investigaciones y evaluaciones biológicas. Instituto de Farmacia y alimentos.

Universidad de la Habana.

Resumen.

Se ha comprobado en los últimos años la implicación que han tenido las especies reactivas de oxígeno

(EROS) en la patogénesis de la diabetes mellitus (DM). Conociendo que estas células presentan el más bajo

potencial secuestrador de estas especies se realizó un estudio clínico en pacientes diabéticos controlados, no

controlados comparándolos con un grupo control, midiendo variables bioquímicas relacionadas con el estrés

oxidativo: superóxido dismutasa (SOD), catalasa (CAT), malonildialdehído (MDA), y con el control

metabólico: fructosamina. Como resultado se obtuvo un incremento significativo de la fructosamina de los

pacientes diabéticos no controlados con respecto a los pacientes diabéticos no controlados y a su vez con

respecto al grupo control. Los niveles de CAT se vieron incrementados en los pacientes diabéticos no

controlados, con respecto a los controlados y al grupo control; ocurriendo lo mismo con los niveles de MDA.

Introducción.

La diabetes mellitus es considerada una afectación metabólica crónica, que puede ser causada por un déficit

relativo o absoluto de insulina 1,2 . En los últimos años se ha comprobado que las EROS participan en la

destrucción de las células beta pancreáticas y por tanto en el desarrollo de la diabetes.

Atendiendo a los antecedentes antes expuestos constituyó objeto del presente trabajo la evaluación del estrés

oxidativo en pacientes diabéticos tipo 2 con y sin control glicémico mediante la determinación de parámetros

bioquímicos que permiten caracterizar el estrés oxidativo en pacientes diabéticos tipo 2 y la relación entre el

grado de control glicémico y el estrés oxidativo.

Materiales y métodos.

El estudio se realizó de forma aleatorizada con un grupo de pacientes diabéticos controlados, no controlados

y un grupo control.Para la selección de los pacientes se tuvo en cuenta los siguientes criterios: pacientes

diabéticos tipo 2 conocidos, mayores de 15 años de edad..

Desarrollo experimental.

1. Determinación enzimática de la catalasa: se realiza el seguimiento de la descomposición del

peróxido de hidrógeno por la enzima a λ=240 nm 3.

2. Determinación de la actividad de la superóxido dismutasa: Las lecturas se realizan a 420 nm 4

3. Determinación de malonildialdehído: se determina a 535 nm.5

4. Determinación de contenido relativo de fructosamina: se determina por la reducción que estas

originan sobre el indicador nitrobluetetrazolium (NBT) 6

El procesamiento de los datos se realizó a través del método Anova precedida de un Test de Homogeneidad

de Varianza, también se realizó un Test de Comparación Múltiple y se determinó el coeficiente de correlación

de Pearson (r2).

Resultados.

En la Tabla I se reporta la caracterización clínica de la muestra estudiada.

En la figura 1 se muestra la actividad de la enzima SOD en los grupos analizados: el valor promedio de

(23089.57 ± 4209.38) U/L, en los pacientes diabéticos no controlados (34298.94 ± 2648.07) U/L y en el

grupo control de (45086.00 ± 2894.11) U/L.

En la figura 2 se muestra la actividad de la enzima catalasa (CAT) en los tres grupos analizados

comportándose de la siguiente manera: en el grupo de individuos diabéticos controlados fue de (1111.67 ±

231.66) U/L, en el grupo de pacientes diabéticos no controlados de (3036.00 ± 513.16) U/L y el grupo

control de (800.00 ± 92.87) U/L.

Tabla I: Caracterización clínica de la muestra.

Controln=24

Diabéticos con controlglicémico n=24

Diabético sin controlglicémico n=24

15-30 11/46% 3/11% 3/13%31-45 12/50% 8/28% 7/29%

Edad (años)

46-60 1/4% 17/61% 14/58%F 2/8% 18/64% 13/54%SexoM 22/92% 10/36% 11/46%

Edad debut de laenfermedad (años)

37 ± 12 38 ± 9

SOD (U/L)

0

20000

40000

60000 a

b

c

Control Diabéticos

Controlados

Diabéticos no

Controlados

Grupos con igual letra no son significativamente diferentes (p>0.05).Figura 1: Actividad enzimática de la SOD.

CAT (U/L)

0

1000

2000

3000

4000

aa

b

Control Diabéticos

Controlados

Diabéticos no

Controlados

Grupos con igual letra no son significativamente diferentes (p>0.05).Fig 2 Actividad enzimática de la CAT.

Se determinan las concentraciones de MDA, tanto en pacientes diabéticos controlados (3015.7 ± 892.47)

nmol/L, en diabéticos no controlados (9174.10 ± 1290.77) nmol/L como en el grupo control

(2212.00 ± 1007.12) nmol/L

Se evalúa el contenido relativo de fructosamina en cada uno de los grupos analizados mostrando los

siguientes valores: en el grupo de pacientes diabéticos sin control glicémico (0.07 ± 0.02), en los pacientes

con control glicémico (0.02 ± 0.01) y el grupo control (0.018 ± 0.015).

Discusión.

En la Tabla I se observa que en los grupos etarios 31-45 años y 46-60 años existe una mayor incidencia de la

enfermedad ello reafirma que la edad debut de la enfermedad es a partir de los 30 años, aunque es

excepcional encontrarla en sujetos jóvenes. En los dos grupos de individuos diabéticos estudiados se observó

el predominio del sexo femenino. La edad debut de la enfermedad fue de (38 ± 9) años en los pacientes

diabéticos sin control glicémico y de (37 ± 12) años en los pacientes diabéticos controlados metabólicamente.

Al analizar la actividad de la enzima SOD (Fig.1), se observa que en el grupo de diabéticos controlados y no

controlados disminuyó significativamente con respecto al grupo control (p<0.05), entre los dos primeros

grupos se encontraron diferencias significativas (p<0.05), apreciándose una disminución en la actividad de la

enzima de los pacientes diabéticos controlados en comparación con los pacientes diabéticos no controlados.

En la Fig. 2 se puede observar que existen diferencias significativas entre los dos primeros (p<0.05) y

observándose un incremento en la actividad de la enzima en los pacientes diabéticos controlados y no

controlados con respecto al grupo control. Se manifiestan diferencias significativas (p = 9.87 x 10-5) entre el

grupo control y el grupo de diabéticos no controlados. Estos resultados demuestran que esta inhibición de la

SOD en pacientes diabéticos no controlados se debe a las altas concentraciones de H2O2, el cual provoca una

estimulación marcada de la CAT (Fig 2), y la disminución de la actividad de la SOD de los pacientes con

control glicémico es debido a bajas concentraciones del radical anión superóxido que conlleva a la formación

de bajas concentraciones de H2O2 (sustrato de la CAT), manifestando una disminución en la actividad de esta

enzima.

Los niveles de MDA se relacionan con los obtenidos de la actividad de la SOD y la CAT , demostrándose

que en pacientes con control glicémico hay una disminución de la peroxidación lipídica con respecto a los

pacientes sin control glicémico.

Los valores obtenidos al determinar el contenido relativo de fructosamina demuestran que en los pacientes sin

control glicémico existe una correspondencia entre la ocurrencia de peroxidación lipídica y los niveles de

glucosa en sangre, coincidente este resultado con los obtenidos por Paolisso y col, en1998 quien planteó que

las altas concentraciones de glucosa sanguínea pueden generar EROs 7

Conclusiones.

En los pacientes diabéticos sin control glicémico, la glicosilación de proteínas contribuye a la generación de

EROs; el adecuado control glicémico influye positivamente en el estado oxidativo del paciente diabético;

en los pacientes diabéticos tipo 2 sin control glicémico hay presencia de peroxidación lipídica.

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Molecular and celular Biochemistry. 151, (113-119).

1

Caracterización histopatológica del daño inducido por Doxorrubicina en Corazón e Hígado.

Autores: Msc. Martínez Sánchez B.(1), Lic. Bequer Gessa P.(2), Dr. Merino N.(1), Dra. Torres Alemán MA.(1)

1 Centro de Estudios para las Evaluaciones e Investigaciones Biológicas. Instituto de Farmacia y Alimentos.Universidad de la Habana

2 Centro de Investigaciones BiomédicasResumén:El presente estudio se diseño con el afán de conocer las principales alteraciones en la arquitectura de lascélulas cardíacas y hépaticas después de ser expuestas a la Doxorrubicina en dos modelos experimentales,para los cuales se empleo una dosis de 3 mg/Kg de peso corporal durante 4 días consecutivos; la diferenciaentre ambos rádico en el tiempo en que duró el estudio para el primer caso se sacrificaron los animales al 5to

día (estudio 1)y para el segundo al 11no día, de comnezado el tratamiento(estudio 2).Finalmente se pudo concluir que con la metodología empleada para ambos casos no se logró desarrollar dañocelular irreversible.

Palabras Claves: cardiotoxicidad, antraciclinas, miocardiopatias, Doxorrubicina, InsuficienciaCardíaca Congestiva

Introducción:Es conocido que los medicamentos empleados en le tratamiento del cancér son extremadamente citotóxicos.Las antraciclians son muy utilizadaspor su eficacia clíncia en el tratamiento de diferentes tipos de tumores;pero muchos reportes indican que son altamente tóxicas principalmente para las célulascardíacas,constituyendo este una limitante para su uso clínico. (Casarett M. 1996, Goodman A. 1994)Las razones antes comentadas son el motor que impulsa el desarrollo de investigaciones al respecto y paratales fines se hace necesario contar con herramientas experimentales donde los resultados histológicos son deincalculable valor para el conocimiento humano, en su lucha por mejorar la calidad de vida; reduciendo elsufrimiento humano.

Metodología:Se utilizaron ratas hembras de la especie Sprague-Dowley procedentes del Centro Nacional para laProducción de Animales de Laboratorio (CENPALAB), las cuales se encontraban en un intervalo de pesocorporal entre 200-270 gramos. En el tiempo que duró el ensayo los animales recibieron comida y agua adlibitum, las condiciones ambientales fueron controladas con ciclo de luz y oscuridad de 12 horas, temperaturade 20-22 ° C y humedad de 50-52 %.El esquema de tratamiento a continuación se detalla:Se administró Doxorrubicina a una dosis de 3mg/Kg de peso corporal (i.p) durante cuatro días. Los animalesse dividieron para la realización de dos estudios: (1)- a dosis repetidas con sacrificio 24 horas después de laultima administración, (2)- a dosis repetidas con sacrificio a los 6 días después de la ultima administración.En ambos casos los animales empleados se distribuyeron en dos grupos, control(agua p/ inyección) y tratado(Doxorrubicina) en los días señalados se procedio al sacrificio, para lo cual se empleó cámara saturada coneter etílico. Seguidamente se procedio a la necropsia de los animales tomandose muestras deaproximadamente 5mm de diámetro de los tejidos seleccionados y se fijaron en una solución de formol al10%. El método empleado fue la inclusión en parafina con la técnica de tinción convencional en eosina-hematoxilina. Este estudio se realizó en el Centro de Estudios para las Evaluaciones e InvestigacionesBiológicas del Instituto de Farmacia y Alimentos de la Universidad de la Habana por el Dr. Nelson Merino.

Resultados:Al realizar la necropsia a los animales incluidos en el estudio 1 se pudo visualizar claramente, en todostratados con la antraciclina, la presencia de hidrotórax e hidroperitoneo, alteraciones que no estuvieronpresentes en los pertenecientes al grupo control. Estos resultados coinciden con los reportados en la literatura(Niitsu N.1997).Los resultados obtenidos en relación al daño histológico en miocardio detectados en los animales sometidos alestudio aparecen reflejados en la tabla 1, algunas de estas lesiones pueden observarse en las microfotografías(Fig 1 y 2)

2

Tabla 1: Principales alteraciones histopatológicas en corazón de ratas tratadas con Doxorrubicina y agua parainyección, n =5. Animales del estudio 1.

Alteraciones

Grupos

Edemainterfibrilar

Pericarditissubaguda

Necrosis focalde cardiomiocitos

Discretadegeneracióngranular de fibras

n 0/5 n 0/5 n 0/5 n 0/5Control

% 0% % 0% % 0% % 0%

n 1/5 n 1/5 n 1/5 n 1/5Tratado con Dox

% 20% % 20% % 20% % 20%

Fig 1: Microfotografía de corazón donde se observan infiltración mononuclear, y discreta degenaracióngranular de fibras

Fig 2: Microfotografía de corazón donde se observa edema interfibrilar

Las alteraciones encontradas en hígado se presentan en la tabla 2 que a continuación se muestra:

Tabla 2: Principales alteraciones histopatológicas en hígado de ratas tratadas con Doxorrubicina y agua parainyección, n =5. Animles del estudio 2.

AlteracionesGrupos

Lipidosis Zona focal denecrosis

n 0/5 n 0/5Control

% 0% % 0%

n 2/5 n 1/5Tratado con Doxorrubicina

% 40% % 20%

3

En el estudio 2 solo se obtuvieron par ale grupo tratado con el antitumoral, en 2 casos una discretadegeneración granular de las fibras del miocardio y un discreto infiltrado mononuclear en otro animal.

En lo que al hígado se refiere, sólo se pudo encontrar en 2 de los animales sometidos al tratamiento lipidosis yen el grupo control no se visualizaron cambios aparentes.

Discusión:De la Doxorrubicina se conoce su rápida captación por el corazón e hígado fundamentalmente siendometabolizada en mayor parte por este último, rindiendo un metabolito altamente tóxico por sus caraterísticasde radical libre. Tales razones se tuvieron en cuenta para seleccionar los tejidos a estudiar en el presentetrabajo. Los resultados obtenidos en el estudio histopatológico de corazón donde aparecen leves lesiones, noobservándose todas éstas en el estudio 2; debe señalarse que las alteraciones que se producen en este caso songeneralmente más discretas, dando a entender cierta recuperación de las alteraciones reversibles provocadasen el miocardio durante la terapia con el antitumoral.A partir del análisis conjunto de todos estos resultados podemos arribar a las siguientes conclusiones:

Conclusiones:Con el diseño experimental propuesto no se logran inducir daños en las céluas cardíacas y hepáticas

Referencias Bibliográficas:Casarett M, Doull S. Toxicology: the basic science of poisons. 6ª ed. Millan: Mac Millan PublishingCompany; 1996.Goodman A. Las bases farmacológicas de la terapeútica. 9ªed . Habana: Editorial Revolucionaria; 1994.Niitsu N, Kato M, Shicishi K, Umeda M. Doxorrubicin-induced myocardial damage in erderley patients withhematologic malignacies. Nippw-Ronen-Igakkai-Zasshi 1997; 34(1):38-42.

1

Modelos experimental de daño cardíaco tardío inducido pòr Doxorrubicina

Autores: Msc. Martínez Sánchez B.(1), Lic. Bequer Gessa P.(2), Dr. Suardíaz J. (3), Lic. Pérez Trueba G. (2),Dra. Torres Alemán MA. (1)

1 Centro de Estudios para las Evaluaciones e Investigaciones Biológicas. Instituto de Farmacia y Alimentos.Universidad de la Habana

2 Centro de Investigaciones Biomedicas3 Hospital Hermanos Ameijeiras

Resumén:El presente trabajo estuvo encaminado a instrumentar un modelo de daño cardíaco tardío, utilizando una dosisde Doxorrubician de 3 mg/Kg de peso corporal durante 4 días consecutivos, descansando 6 días. Al 11no díade iniciado el estudio se procedió a la caracterización del modelo crónico de citotoxicidad cardiaca a través dediferentes indicadores bioquímicos-enzimáticos séricos: creatinin fosfokinasa (CPK), transaminasas (TGO yTGP), albúmina (Alb), triglicéridos (Trig), glucosa.Se concluyó que bajo las condiciones experimentales descritas se logran alteraciones cardíacas reversibles,por lo que consideramos que para lograr un modelo de daño irreversible sobre cardiomiocitos debemodificarse el régimen de administración del antitumoral en los animales de experimentación.

Palabras Claves: cardiotoxicidad, antraciclinas, miocardiopatias, Doxorrubicina, InsuficienciaCardíaca Congestiva.

Introducción:En la quimioterapia de las enfermedades neoplásicas juega un papel fundamental el grupo de las antraciclinas,dentro de las cuales se encuentra la Doxorrubicina, ampliamente utilizada por su acción antitumoral. Sinembargo, limita su uso clínico la cardiotoxicidad, estudiada por muchos investigadores (Kesavan S. 1996,Godoy L. 1997) y de la que se conoce la alta incidencia en desenlaces fatales, relacionada con InsuficienciaCardiaca Congestiva. (ICC) Diferentes investigadores han demostrado que la miocardiopatía que inducen lasantraciclinas tiene diferentes formas de presentación y una de las más temibles es el desafío tóxico tardío quese produce. Se han mostrado datos que incluyen la existencia de Insuficiencia Cardiaca Congestiva (ICC),transcurridos hasta 20 años después de culminada la quimioterapia con Doxorrubicina. Todas estas razonesjustifican los esfuerzos encaminados a lograr la instrumentación de un biomodelo experimental de dañocardíaco inducido por Doxorrubicina.

Metodología:Se utilizaron ratas hembras de la especie Sprague-Dowley procedentes del Centro Nacional para laProducción de Animales de Laboratorio (CENPALAB), las cuales se encontraban en un intervalo de pesocorporal entre 200-270 gramos. En el tiempo que duró el ensayo los animales recibieron comida y agua adlibitum, las condiciones ambientales fueron controladas con ciclo de luz y oscuridad de 12 horas, temperaturade 20-22 ° C y humedad de 50-52 %.El esquema de tratamiento que se siguió fue el siguiente:Inicialmente para cumplimentar nuestro objetivo de trabajo en relación a la caracterización de un modelo dedaño cardíaco tardío, se administro una dosis de Doxorrubicina(Dox) de 3 mg/kg de peso corporal por víaintraperitoneal durante 4 días consecutivos. Para ello los animales se distribuyeron en 2 grupos detratamiento: control y tratado con el antitumoral. A continuación se dejaron un tiempo de lavado (6 días) yposteriormente a todos los animales incluidos en el estudio se les extrajo sangre del plexo ocular, con previaanestesia en cámara saturada con éter etílico. Las muestras de sangre se colectaron en microtubos de ensayo.Se prepararón los sueros que fueron almacenados en microtubos individuales a –4 º C hasta su posteriorutilización. (Thielman K. 1973) en la determinación de los diferentes biomarcadores:Actividad de las enzimas: transaminasa glutámico pirúvica (TGP) y transaminasa glutámico oxalacética,(TGO), creatinin- fosfoquinasa (CPK).Concentraciones de: glucosa (GLU), albúmina (ALB) y triglicéridos (TRIG).

Resultados:Las enzimas están consideradas catalizadores biológicos, los cuales favorecen múltiples reacciones y sonaltamente específicos en muchos casos. Ciertos tejidos contienen enzimas características que sólo penetran en

2

la sangre cuando existe una lesión celular en las cuales éstas se encuentran, por lo que la presencia de lasmismas son indicadores del probable sitio de daño tisular.

♦ Actividad de la Creatinin fosfokinasa total sérica:Por varios autores se ha considerado a la enzimacreatinin kinasa como un marcador ideal de daño encardiomiocitos. (González-Sastre F. 1995, Wallach J.1998) El comportamiento de la enzima Creatininfosfokinasa total sérica puede observarse claramentea través de la figura 1, a partir de la cual podemosdecir que en el grupo tratado con Doxorrubicina laactividad de la misma es menor significativamentecuando la comparamos con el grupo control.

Fig. 1. Comportamiento de la actividad enzimática de la creatinin kinasa en suero, en los grupos de tratamiento. (*)indica diferencias significativas respecto al grupo control (p<0.05).

♦ Comportamiento de la Albúmina sérica:

La albúmina es sintetizada en elhígado, por lo que siempre laaparición de alguna alteración de susconcentraciones séricas es sinónimode afectación a nivel de la funciónhépatica. La figura 2 muestra losniveles séricos de albúmina a travésde la cual podemos apreciar que parael grupo tratado con el antitumoral seobtuvo un valor significativamentemenor al compararlo con el grupocontrol.

Fig. 2. Comportamiento de los niveles de albúmina para los grupos de tratamiento. (*) indica diferenciassignificativas respecto al grupo Control (p< 0.05).

♦ Comportamiento de la Transaminasas (TGP y TGO):Según los resultados obtenidos a las actividades de TGP y TGO, podemos plantear que no se encontrarondiferencias significativas entre los grupos estudiados.

♦ Comportamiento de los niveles de Glucosa y Triglicéridos.La glucosa y triglicéridos séricos no mostrarón variaciones significativas en sus niveles, entre los grupos enestudio

Discusión:El desarrollo de la cardiotoxicidad cardiovascular es la consecuencia más común del efecto farmacológicoexagerado después de la administración a sobredosis de medicamentos utilizados en el tratamiento deenfermedades cardiovasculares , aunque también se conoce la afectación de este sistema por otros tipos defármacos. Sin embargo, no son suficientes los estudios realizados para tratar de conocer el papel que jueganen la etiología de enfermedades cardiovasculares crónicas diferentes compuestos químicos –durante ydespués- de la exposición a los mismos.A pesar de que algunos reportes indican que la enzima CPK no se encuentra en el suero de pacientes con ICC,en 1996 Kesavan y cols, reportaron un incremento de la misma debido al tratamiento con adriamicina. Porotra parte, este grupo de investigadores demostrao una asociación entre la patogénesis de la cardiomiopatíacrónica por antraciclinas y la inhibición selectiva de los genes de expresión para la CPK in vivo. Se conoceademás que la misma puede alterarse en muchas otras situaciones y que los cambios aparecen rápidamente enel tiempo, pero también tienden a normalizarse en el transcurso de los días después de provocado el daño(González-Sastre F. 1995); lo cual ocurre en el presente trabajo al dejar de administrar el antitumoral y

*

0

10

20

30

40

g/L

1 2

grupos de tratamiento

tratadocon dox

control

*

0

200

400

600

800

1000

1200

U/L

1 2

grupos de tratamiento

tratado condox

control

3

realizar posteriormente las determinaciones. Aunque es de señalar que para este caso en particular ha ocurridoalgo interesante, y es que la CPK en el modelo tardío disminuye su actividad significativamente, incluso pordebajo, de los niveles del grupo control. En primer lugar, podemos pensar en una inhibición de la enzimadirectamente por la doxorrubicina o sus metabolitos, producto de su biotransformación, hipótesis que habríaque corroborar en estudios futuros. Las Transaminasas son enzimas intracelulares que aparecen en cantidadesconsiderables por afectación de la membrana citoplasmática celular o de aquellos organelos subcelulares. Esconocido en la actualidad que la TGO es una enzima ubicua marcadora de daño tanto a nivel hepático como anivel cardíaco. El comportamiento de estas en el presente estudio, nos está sugiriendo la posible recuperacióncelular del daño inducido durante los primeros días de tratamiento.La toxicidad que limita el uso clínico de los antibióticos antraciclínicos es la evidencia de cardiomiopatía,cuya más grave consecuencia, como se conoce, es el desarrollo de Insuficiencia Cardiaca Congestiva(Kesavan S. 1996, Godoy L 1997,Yamashita JI. 1994,Lipshultz SE. 1995). Conceptualmente, se define estaalteración como el estado patológico en el cual una anormalidad de la función miocárdica es causa de laincapacidad del corazón para impulsar sangre con un ritmo que corresponda a la necesidad de los tejidos y sumetabolismo. En la literatura se plantea que se ha prestado mucha atención al problema de conocer si lainsuficiencia del miocardio resulta de un defecto en la producción de energía, en su conservación o en suutilización (Robbins SL. 2000). Todo este conocimiento, unido a la imposibilidad práctica de medir gastocardíaco en los animales empleados (ratas SD), justifica la necesidad de determinar una serie de indicadoresdel metabolismo energético.Aunque se conoce que la disminución de los niveles de albúmina ocurre debido a malnutrición, trastornoshepáticos, pérdidas a través de la orina debida a glomérulonefritis , entre otras condiciones morfológicas(Tilton RC. 1992), los reportes publicados por Robbins SL en 2000 indican que los efectos a distancia de laICC se manifiestan en diferentes órganos, perturbando sus funciones. Los riñones se encuentran entre losórganos afectados, debido al trastorno hemodinámico que se produce en estos casos. Según reportes deinvestigadores del Departamento de Nefrología del Instituto Gromigen para Estudios de Drogas, de Irlanda, laDoxorrubicina produce nefrosis en ratas Wistar (De Boer E. 1999). Todos estos trabajos coinciden con losresultados hallados en relación con la hipoalbúminemia, para el caso de animales tratados con Doxorrubicina,en el presente trabajo experimental.

Conclusiones:Con la metodología propuesta en nuestro trabajo, no se logra desarrollar un daño cardiaco tardío irreversible,sustentado este planteamiento por los resultados obtenidos en las diferentes variables estudiadas yprincipalmente en el exámen histopatológico de corazón e hígado

Referencias bibliográficas:Godoy L YS, Fukushige J, Igarashi H, Matsuzaki A, Ueda K. Antracycline-induced cardiotoxicity in childrenwith malignancies. Acta Pediátrica Japónica 1997; 39:188-193.Kesavan Shan. Anthracycline-induced cardiotoxicity. Ann Intern Medicine 1996; 125: 47-58González-Sastre F, Ordoñez J. Biochemical Markers of myocardial necrosis and coronary reperfusion.Springer-Verlag Ibérica. Barcelona 1995; 2-3Wallach J. MD. Intertpretación Clínica de las pruebas de Laboratorio. Masson S.A. 3ra Edición 1998; : 75-77,271.Yamashita JI, Ogawa M, Nomura K. Plasma endothelin-1 and doxorubicin cardiotoxicity. The New EnglandJournal of Medicine 1994; 331(22): 1528-1531.Lipshultz SE, Lipsitz SR, Mone SM, Goorin AM, Sallan SE et al. Female sex and higher drug dose as riskfactors for late cardiotoxicity effects of doxorubicin therapy for childhood cancer. The New England Journalof Medicine 1995; 332(26): 1738-1743.De Boer E, Novis G, Tiebosch AT, De Jong PE, De Zeenw D. Systemic factors are involved in thepathogenesis of proteinuria – induced glomerulosclerosis in adryamycin nephrotic rats. J Am Inv Nephrol1999; 10(10): 2359-66.Robbins SL, Cotran RS, Kumar V, Collins T. Patología estructural y funcional. 6ª ed. Madrid: McGraw-Hill-Interamericana;2000.Tilton RC, BalowsA, Hohnadelz DC, Reiss RF. Clinical Laboratory Medicine. St. Louis (Missouri): Mosby-Year Book, Inc; 1992.

FARMACOCINETICA DEL 4-HIDROXI-3-METOXIBENZALDEHIDO POR VIA ORAL EN PERROS BEAGLE

Dr. Carlos A. González Delgado (MsC) 1, Lic. Lourdes Olivera Ruano (MsC) 1, Lic. Yoagne Trapero Quintana 2,Lic. Armando Correa Fernández 1, Dr. Juan F. Sánchez de la Morena 1

1- Centro Nacional de Toxicología 2- Centro de Biofísica MédicaResumen:

Introducción: El 4 – Hidroxi – 3 – Metoxi-benzaldehido, producto flavorante que se encuentra en alimentos y bebidas, es

un aldehído aromático de escasa toxicidad que está siendo evaluado como un nuevo fármaco para el tratamiento de la

Sicklemia por su capacidad de inhibir la polimerización de la hemoglobina S. Los resultados obtenidos en estudios previos

administrado por vía endovenosa indican que su cinética puede describirse a través de un modelo bicompartimental con una

eliminación rápida y un gran volumen de distribución. Objetivo: Caracterizar farmacocinéticamente al mismo administrado

en dosis única por vía oral en perros Beagle. Materiales y Métodos: Se administró a 5 animales una dosis de 250 mg/Kg

en solución hidroalcohólica al 15 %. Se extrajeron muestras de sangre a diferentes tiempos antes y después de la

administración para cuantificar sus niveles plasmáticos por cromatografía líquida de alta presión (HPLC). El análisis

farmacocinético se realizó mediante el programa de computación PKCALL. Los valores de concentración plasmática se

ajustaron a través de un modelo abierto de un compartimiento y se calcularon los parámetros “modelos dependientes” y “no

dependientes” que definen este modelo utilizando las expresiones matemáticas correspondientes. Resultados: La absorción

fue rápida. El valor máximo de concentración plasmática (Cmax.) fue de 26.76 g/mL y se obtuvo a los 15 minutos

(Tmax.) El tiempo de vida media de absorción fue de 5.51 minutos. El área bajo la curva (ABC0-∞ ) alcanzada fue de 807.7

g-min/mL. La biodisponibilidad absoluta resulto ser del 60 %. El tiempo de vida media de eliminación (t½) fue de 13.42

minutos. Los valores obtenidos para el volumen de distribución (Vd) y aclaramiento plasmático (CL) fueron similares a los

obtenidos por vía endovenosa con valores de 298.64 mL/kg y 18.8 mL/min/kg respectivamente. Conclusiones: Este

producto al ser administrado por vía oral se absorbe inmediatamente y alcanza una biodisponibilidad del 60 %. Su cinética

se describe a través de un modelo abierto de un compartimiento con una eliminación muy rápida del organismo y un alto

volumen de distribución.

Introducción:

La Sicklemia, enfermedad molecular bajo estudio desde hace mucho tiempo, permanece en la actualidad sin una terapéutica

efectiva con pocos o ningún fármaco disponible para este propósito. Es causada por la presencia de la hemoglobina mutante

S (Hb-S). El trastorno genético fundamental es la sustitución del ácido glutámico por la valina en la posición 6 de la cadena

que provoca la polimerización de la Hb-S formando agregados moleculares en forma de estructuras microtubulares

alongadas que rigidifican y distorsionan el glóbulo rojo y disminuye su flexibilidad. Estas células obstruyen los pequeños

vasos capilares y ocasionan una oxigenación deficiente en los tejidos. La hipoxia tisular causada por vaso oclusión en la

microcirculación y el consiguiente daño de los órganos, constituye la primera causa de morbilidad y mortalidad en esta

enfermedad. Desde el punto de vista terapéutico, han sido evaluado in vitro diferentes productos que inhiben el proceso

de polimerización de la Hb-S. Uno de ellos, el 4 – Hidroxi – 3 – Metoxi-benzaldehido es el de mejores resultados por su

moderada acción antisickling y escasa toxicidad (1, 2). El objetivo del presente estudio fue el de evaluar la farmacocinética

del mismo por vía oral en dosis única con vistas a una mejor interpretación de los resultados farmacodinámicos y

toxicológicos preclínicos.

Tabla 1: Valores promedios de los parámetros farmacocinéticos de disposición

Tabla 2: Valores promedios de los parámetros farmacocinéticos de biodisponibilidad

Figura 1: Perfil de los datos prom edio

0

5

10

15

20

25

30

0 20 40 60 80 100 120 140

Tiempo (min)

Con

cen

trac

ión

Observada Estimada

Materiales y Métodos:

Se utilizaron cinco perros Beagle, machos, jóvenes, con pesos comprendidos entre 9.2 y 12.7 kg (10.78 ± 1.66 kg),

procedentes del CENPALAB. La administración de la sustancia de prueba se realizó de forma aleatoria. Se administró una

dosis única por vía oral de 250 mg por Kg de peso empleando para ello una solución de 50 mg/ml de vainillina en solución

alcohólica al 15%. Los animales se encontraron en ayunas desde la noche anterior al día de administración permitiéndosele

tomar agua. Después de la administración del producto tuvieron libre acceso a la toma de agua y alimentos. Se realizaron

extracciones de muestras de sangre de 5mL mediante un trocar colocado en la vena yugular para la determinación de los

niveles plasmáticos de la sustancia de prueba antes de administrar la misma (t=0) y después a los siguientes intervalos de

tiempo posterior a su administración: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 75, 90, 105, 120, 150 y 180 minutos. La sangre extraída fue

centrifugada inmediatamente a 2000 rpm durante 5 minutos. Del plasma obtenido se tomó una alícuota de 1ml la cual fue

almacenada a -20oC hasta su posterior análisis por HPLC. Los datos de concentración plasmática fueron analizados

utilizando el programa de computación PKCALC. Los valores de concentración plasmática se ajustaron a través de un

modelo abierto de un compartimiento y se calcularon los parámetros “modelos dependientes” y “no dependientes” que

definen este modelo utilizando las expresiones matemáticas correspondientes según Gibaldi y Perrier (3). Los valores de

concentración plasmática inferiores al límite de cuantificación de 0.2 µg/ml, no fueron tomados en consideración en el

análisis farmacocinético.

Resultados y Discusión:

El volumen promedio de la solución administrada en este estudio fue de 53.9 mL, lo cual se corresponde con una dosis

única promedio de 2.7 g.

La figura 1 muestra la curva promedio de los niveles plasmáticos en función del tiempo observada experimentalmente y la

ajustada según la ecuación del modelo. Los parámetros farmacocinéticos obtenidos se muestran en las tablas 1 y 2.

Los resultados experimentales se ajustaron a un modelo monocompartimental. Se observa, sin embargo, una ligera

tendencia a la bicompartimentalidad como en el caso de la administración EV, aunque la influencia del proceso de

absorción junto con el hecho de que los niveles plasmáticos obtenidos son lógicamente menores la bicompartimentalidad no

es tan aparente. Este hecho provoca que la semivida biológica de eliminación obtenida este fundamentalmente determinada

por la fase alfa y ligeramente prolongada por una posible fase beta. De esta forma, se obtuvo la siguiente ecuación que

describe el modelo propuesto:

C = -63.8120 e – 0.1575 t + 65.2897 e – 0.05156 t

Ka

(min -1)

t½ (Abs.)

(min)

Cmax

(µg/mL)

ABC0-∞

(µg-in/mL)Tmax.

(min)

FAbs

(%)

MAT

(min)0.1616 5.51 26.76 807.7 14 0.60 9.42±0.01 ±3.00 ±7.57 ±326.73 ±5.57 ±0.27 ±4.31

Ke

(Min-1)T½

(min)

CL

(mL/min)

VdZ/kg

(mL/kg)

CL/Kg

(mL/min/kg)

Vdss/Kg

(mL/kg)

MRT

(min)0.0522 13.42 197.94 349.55 18.80 298.64 20.98±0.006 ±1.7 ±84.95 ±120.85 ±9.53 ±87.84 ±2.72

Al analizar la figura 1, se observa que la absorción es rápida alcanzándose la Cmax (26.76µg/mL) en plasma

aproximadamente a los 14 minutos después de su administración. así como el buen ajuste de los datos experimentales

mediante el modelo monocompartimental ya que la curva estimada a partir de la ecuación que describe el modelo propuesto

prácticamente se superpone a la curva de los datos experimentales. Una vez alcanzada la Cmax, se produce una

disminución rápida de los niveles plasmáticos y al final una disminución algo más lenta. La caracterización farmacocinética

(Tablas 1 y 2), muestra una permanencia muy corta de este producto por los bajos valores del tiempo de vida media (t ½ =

13.42 min.) y del tiempo medio de residencia (MRT= 20.98 min.). En correspondencia con estos resultados los valores de

aclaramiento fueron muy elevados (197.94 mL/min.). El valor obtenido para la constante de absorción (Ka) fue de 0,1616

min −1 lo cual se corresponde con un T½ de absorción igual a 5,5 min. No se observó tiempo de latencia. El Tiempo Medio

de Absorción (MAT) fue de 9.42 min.

El ABC 0 - calculada por el método de los trapezoides lineales presentó un valor de 807.7 µg-min/mL. La biodisponibilidad

absoluta resulto ser del 60 %. Este valor de biodisponibilidad relativamente bajo pudiera estar condicionado entre otros por

los siguientes factores: características físico-químicas, coeficiente de reparto lípido-agua y grado de ionización a los

diferentes valores de pH del tracto gastrointestinal, precipitación y formación de complejos insolubles, metabolismo

presistémico, efecto de primer paso hepático y una ventana de absorción localizada en alguna porción específica del tracto

gastrointestinal

Respecto al volumen de distribución al igual que para la vía endovenosa, se obtuvieron valores muy elevados para el

volumen de distribución área (VdZ/kg) y el volumen de distribución en estado estacionario (VdSS/kg) corregidos para los

pesos de los animales de 349.55 mL/kg y 298.64 mL/kg respectivamente tomando en consideración el volumen plasmático

del modelo animal empleado (4), lo cual demuestra que este producto presenta un alto grado de internalización. En cuanto a

esto, aunque no contamos con antecedentes en la literatura que nos permitan explicar este comportamiento consideramos

que pueda estar dado por su entrada y almacenamiento en el interior de los eritrocitos y su posible distribución a otros

órganos, tejidos o fluidos lo cual debe ser objeto de futuros estudios. A partir de los datos experimentales obtenidos

concluimos que este producto al ser administrado por vía oral se absorbe inmediatamente y alcanza una biodisponibilidad

del 60 %. Su cinética se describe a través de un modelo abierto de un compartimiento con una eliminación muy rápida del

organismo y un alto volumen de distribución.

Bibliografía.

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4. Mitruka B.M. and Rawnsley H.M. Clinical biochemical and hematological reference values in normal experimental

animals. New York, Paris, Barcelona, Milan: Masson Publishing. USA Inc. 1977.

ESTUDIO DE TOXICIDAD A DOSIS ÚNICA VÍA DÉRMICA DE LA MELAGENINA PLUS

Autores: MSc. Emilio Monteagudo Jiménez, Lic. Virna Cepero Rivero, Dra. María Boffill Cárdenas

Tec. Luis Días Costa

UNIDAD DE TOXICOLOGÍA EXPERIMENTALINSTITUTO SUPERIOR DE CIENCIAS MEDICAS DE VILLA CLARA

INTRODUCCIÓN

La Melagenina es empleada en la repigmentación de la piel dañada por quemaduras de cualquier origen y

sobre todo en el tratamiento del vitiligo. Es un extracto alcohólico al 50% de placenta humana que contiene

una lipoproteína que estimula la reproducción de los melanocitos y la síntesis del pigmento melánico. Más

tarde se demostró que enriqueciendo este producto con calcio aumentaba su eficacia terapéutica y de esta

forma surgió la Melagenina Plus(1,2).

Independientemente de la inocuidad comprobada de los preparados precedentes de Melagenina, el estudio

preclínico de una sustancia nueva no puede prescindir de los ensayos toxicológicos experimentales(3), estos

estudios se convierten en un paso infranqueable en la conformación del expediente de la sustancia para su

registro, distribución y comercialización. Dentro de estos estudios el de Toxicidad Aguda Dérmica(4-6) cobra

especial importancia presuponiendo que el uso de la sustancia es vía tópica por tanto es necesario comprobar

experimentalmente los efectos tóxicos sistémicos de posible presentación por esta vía. Por lo antes expuesto

el presente trabajo se propone el siguiente objetivo: evaluar la toxicidad vía dérmica, a dosis única, de la

Melagenina Plus.

MATERIALES Y MÉTODOS

Niveles de dosis:

A solicitud del productor se trabajó con producto terminado (1 solo nivel de dosis) utilizándolo tal y como se

presenta (extracto alcohólico de placenta humana al 50%) y el diseño experimental se muestra a continuación:

Grupo Tratamiento Número de Total

animales

H M

I Control negativo (agua destilada) 5 5 10

II Control vehículo (etanol 70%) 5 5 10

III Tratados (Melagenina Plus) 5 5 10

Descripción de la técnica (4-7)

El día anterior al comienzo del experimento se depiló el área de aplicación de la sustancia, alrededor de 4 X 5

cm en el área interescapular. Los animales se pesaron antes de su dosificación la que se efectuó mediante

aplicación de 1 ml del producto sobre el área de la piel rasurada, mediante frotación con los dedos índice y

mediano.

Los animales se observaron sistemáticamente para determinar signos y síntomas generales de toxicidad y en

particular la presencia de edema y eritema los que se evaluaron a las 24 horas por la metodología de Draize.

El peso corporal se controló nuevamente el día 7 y 14 (antes del sacrificio de los animales).

La eutanasia se ejecutó acorde con las exigencias bioéticas actuales. Una vez sacrificados se sometieron a

análisis anatomopatológicos macroscópicos en busca de lesiones groseras en todos los órganos.

El análisis estadístico de los datos se realizó empleando el paquete SPSS versión 8.0 para Windows.

RESULTADOS

El experimento culminó con un 100% de supervivencia.

En las observaciones sistemáticas realizadas durante las primeras 24 horas no se detectaron signos ni síntomas

clínicos indicativos de toxicidad sistémica, comportándose de la misma forma los 13 días restantes del

experimento.

De manera similar, la determinación de edema y eritema arrojó valores de 0 para todos los animales.

Todos los animales ganaron peso durante el estudio. El análisis estadístico se realizó de forma independiente

para ambos sexos, debido a las diferencias propias de la especie; se obtuvo como resultado que no existieron

diferencias significativas en cada medición entre los tres grupos de tratamiento, ni en el incremento de peso

total en el experimento.

El análisis macroscópico arrojó la no existencia de lesiones en los órganos estudiados.

DISCUSIÓN

Los resultados del presente estudio coinciden con otros de investigaciones, tanto farmacológicas como

toxicológicas, precedentes(8-10) efectuadas a productos de la familia Melagenina, debe recordarse que en el

caso de la Melagenina Plus solo ha sido enriquecida con Ca para optimizar su esquema de aplicación por lo

que se presupone que su toxicidad continuase siendo baja, tal como se ha obtenido en este ensayo y

coincidiendo con lo anteriormente reportado.

CONCLUSIONES

La Melagenina Plus no provoca signos ni síntomas tóxicos tras su aplicación dérmica en el modelo

experimental empleado por lo que bajo nuestras condiciones experimentales particulares se considera No

Tóxico Sistémico por esta vía.

BIBLIOGRAFIA:

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10. Cárdenas MB et al. Estudio farmacotoxicológico de la melagenina en ratas. Informe Final.

Departamento Unidad de Garantía de la Calidad.Unidad de Toxicología Experimental. Instituto

superior de Ciencias Médicas de Villa Clara. 1994.

THE ALTERANTIVE TOXICOLOGY. THE CELL LIKE ONE OF THE MOST IMPORTANTPROTAGONIST.

MSc. Gastón García Simón.

LABORATORIOS LIORAD.

The Toxicology is the Science that studies among other aspects the potentiality of producing toxic effects in

man, experimental animals and environment by chemical substances. The same as most of the branches of the

knowledge it has had a tremendous development starting from the second half of last century, and begins with

the principle of 3ERRES that constitutes the rationale of what today is know as Alternative Toxicology. The

Alternative Toxicology is based in the procedures that Reduce, Refine and Replace animals in the Biomedical

experimentations, the teaching and the regulatory and toxicological studies. The cell, as structural and functional

basic unit of the human body is also playing a very important role in the evolution of this Science. Its

employment is in numerous procedures developed by Institutions so noted as the ECVAM (European Center for

the Validation of Alternative Methods), the CAAT (Center for Alternative Animal Testing), the ERGATT

(European Research Group for Alternatives in Toxicity Testing), Some of these institutions have protocols

worked out with those but refined validation procedures, based on the GLP (Good Laboratory Practice), to

mention some of the most important ones. The assays that have been described and use the cell or the cellular

cultures have been proposed to substitute test very well known like the Draize test, that determines the potential

irritating effect of chemical substances on the ocular structures. Among these are also for example the one that

uses the Red Blood Cells (RBC), an in vitro assay which allow the estimation of the irritation potential of

tensides and tenside containing materials such as shampoo, shower gels, cleaning products etc. The estimation is

based on the fact that surfactans interact strongly with cellular membranes and proteins. Both effects are

measured photometrically by use of the inherent native dye, oxyhemoglobin. Unlike other cell based systems,

the RBC assay is able to differentiate between membrane damage and protein damage, or the studies of

Photoirritation carried out on the shaved skin of animals exposed to the UV radiation, but now is doing using

erytrocytes too, with a similar mechanism.. This assay have been used by a number of investigator as a model

for phototoxicity studies. The Assay of reception of the neutral red coloring for the 3T3 cells of mouse

fibroblasts to demonstrate the cytotoxicity of some products, based on a comparison of the cytotoxicity of a

chemical when tested in the presence and in the absence of light after the exposure of the UVA radiation, the in

vitro 3T3 phototoxicity assay was recently evaluated in animals and human and has been shown to be predictive

for these effects, this procedure has been approved by the European Union for their use inside the countries

members and it is under study by the OECD (Organization Economical for the Cooperation and Development)

for their acceptance. Another alternative method is the use of the cytotoxic effects that produce some substances

over the cells L929, in order to study the Acute Toxicity (Undue) described in International Pharmacopeia for

the evaluation of the security of the ¨Medical Devices¨ and approved by the Directive 93/42/EEC, and the

ECVAM workshop ¨Alternatives to the animal testing on Medical Devices ¨ indicated that is recommended that

the requirement for the abnormal toxicity test to be conducted on batches should be deleted in all standards

harmonized. Medical Devices produced in compliance with GMP should not result in unexpected systemic

toxicity. Any failure in cleaning procedures, etc. could easily be detected by using simple cytotoxicity tests. Also

is known the use of the cells HEp-2 to study the cytotoxic effect of implantable materials used in Medicine and

Dentistry, the assay system determine the changes in cell morphology and proliferation of HEp-2 cell that occur

as a result of exposure to the test substances, The changes in cell number in a defined area of the culture are

recorded, to only mention some examples. In our conference we will address the procedures currently used in

view of substituting the traditional assays used in toxicology, the actual state of research in this field, and we will

also show some results obtained in our laboratory using the procedures of RBC. In this case we studied 19

substance and we can classified them as non, lightly, moderate and extremely irritant according to the

INVITTOX , protocol. In the case of the Photohemolisis test we study 5 substances and also we can classified it

as photoxic or non , and that of the L 929 cells to detect possible harmful effects of , 5 lots of two different

Manufactures of rubber plugs, as well as a total of 6 lots of plastic flasks, we classified the material like the USP

XXIV, and don ´t obtain any adverse effect over the cell. We can demonstrate convincingly that the cell is one

of the main protagonist in the development of the Alternative Toxicology.

Reference:

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Nottingham, U.K.

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the European communities L 169, 1-43.

EVALUACIÓN FÁRMACO TOXICOLOGICA DE DOS MEDICAMENTOS PROCEDENTES DEECUADOR OBTENIDOS A PARTIR DE PRODUCTOS NATURALES.

MSc. Gastón García Simón, MSc. Marcos Dehesa González, Téc. Luis A. Dios Oliva, Téc. Arturo ValdiviesoGarcía.Ave 35 # 23406, apto 20, San Agustín, La Lisa, Ciudad de la Habana, CubaFax.271 7899Teléfono: 2719531 hasta el 38.gaston@cieb.sld.cugastongs@medscape.comLABORATORIOS LIORAD. CONSEJO DE ESTADO.POSTER.

En la actualidad el retorno a la Medicina Natural y Tradicional es algo muy extendido en el mundo entero. ElEcuador no es una excepción. En este trabajo se estudiaron dos medicamentos elaborados con plantasmedicinales, procedentes del mencionado país, en igual número de forma farmacéutica, la Uña de Gato (Uncariatomentosa) y el Chuchuguazo (Maytenus laveis), a las que se les han atribuido poseer efecto antiinflamatorio. Elestudio estuvo encaminado a evaluar el efecto biológico de: dos Jarabes (Uña de Gato y Chuchuguazo) y de unacápsula (Uña de Gato) empleando el ensayo del edema plantar en ratas Wistar inducido por carragenina (al 1%).La concentración utilizada para esta prueba, de cada forma, fue de 100 mg/Kg, según se reporta por el CYTED(Programa Iberoamericano de la Ciencia y Tecnología para el Desarrollo). Se empleó para comprar a laIndometacina en la dosis recomendada por el mencionado programa (7 mg/kg). Para el estudio de ToxicidadAguda se utilizó la vía oral empleando para ello una cánula intragástrica, (la dosis de 2000 mg/kg), en la mismaespecie animal, siguiendo la guía de la OECD (Organización para la Cooperación y Desarrollo Económico). Losresultados obtenidos indicaron que las dos formulaciones estudiadas presentaron efecto antiinflamatorio similaral de la Indometacina, medicamento ampliamente utilizado para estos fines. En cuanto al posible efecto tóxicoagudo oral, a la 2000 mg/kg, (Dosis Límite), según la OECD los producto evaluados se consideran como sinclasificar y no son necesarios estudios a dosis superiores.INTRODUCCIÓN.Los productos naturales son en la actualidad uno de los principales arsenales de la terapéutica sus bondadososefectos y su escasa toxicidad hacen de ellos los medicamentos de elección para diferentes patologías, sinembargo muchos se emplean solo por la tradición popular y sin haber efectuado los correspondientes estudiosfarmatoxicológicos. El jarabe de Chuchuguazo y el de Uña de Gato, así como las cápsulas de esta última sonelaborados sobre la base de plantas oriundas del Ecuador, se les atribuyen efectos antiinflamatorios entre otros,por lo que se hizo necesario demostrar el mencionado efecto empleando las técnicas descritas en la literaturacomo la que aparecen en el programa Iberoamericano para el desarrollo y otras consultadas (1,2). Por otra parteson necesarios los estudios de Toxicidad Aguda como requisito indispensable que aparece detallado ennumerosas guías internacionales, el cual nos garantiza dentro del margen del error que tiene aparejada la técnicaque los compuestos que sean ingeridos o que incidentalmente puedan entrar al organismo se les conozca elposible potencial tóxico agudo para el humano. El estudio de Toxicidad Aguda Oral detallado en las guíasinternacionales es de obligatorio cumplimiento para todo producto que vaya a introducirse por vez primera en elmercado (3,4,5).Nuestro trabajo por tanto estuvo encaminado a la demostración del efecto farmacológico fundamental así laausencia de efectos tóxicos agudos de los mencionados productos naturales.MATERIALES Y METODOSEXPERIMENTO I: EFECTO ANTIINFLAMATORIOEXPERIMENTO II. ESTUDIO DE TOXICIDAD AGUDA DOSIS LIMITE.DESARROLLO:EXPERIMENTO I: VARIABLES A MEDIR.

Volumen desplazado por la pata del animal.• % de inflamación.

Se determinó el efecto antiinflamatorio agudo mediante el ensayo que induce inflamación en la pata de la ratapor la carragenina utilizando el procedimiento del CYTED (1).Se hicieron 5 grupos, todos recibieron la carragenina 0.1 % (0.1 mL), dos fueron tomados a manera de controluno positivo y el otro negativo (indometacina 7 mg/kg) carragenina al 0.1 % (0.1 mL) y los tres restantes losmedicamentos objetos de estudio en las dosis de 100 mg/kg para los jarabes y 300 mg/kg para las cápsulasSe procesaron los resultados obtenidos siguiendo las fórmulas descritas en el CYTED.Experimento II. Toxicidad Aguda.Se siguieron los procedimietos descritos en la OECD # 401.

Dosis Empleadas.Jarabe de chuchuguazo: 2000 mg/kg.Jarabe de Uña de Gato: 600 mg/kg (3 tomas)Cápsulas de Uña de Gato: 2000 mg/kg.

Pesadas de los animales: días 1, 7 y 14. Necropsias: A todos al final de la experiencia. Signos clínicos: Durante los 14 días del ensayo

RESULTADOS Y DISCUSIÓN.EXPERIMENTO I:Los resultados del efecto farmacológico se encuentra en la figura # 1 que se muestra a continuación

Como se puede apreciar el que mejor efecto antiinflamatorio comparado con la Indometacina presentó fue elJarabe de Chuchuguazo, seguido del Jarabe de Uña de Gato y de las cápsulas que aunque el % de inflamaciónfue mayor que para los dos anteriores aun así estaban por debajo de la Carragenina tomada a manera de control.TOXICIDAD AGUDA ORAL. OECD 401.Los Pesos corporales no disminuyeron en el tiempo es decir que los tres tratamientos presentaron ganancia enpeso.La necropsia efecuada a los órganos seleccionados (corazón, riñones, pulmones, corazón, hígado y bazo ), nomostraron alteraciones macroscópicas por lo que se decidió no tomar muestras para su procesamiento.Los animales no mostraron signos clínicos producto de la administración de los diferentes medicamentos.CONCLUSIONES

Los JARABES de Chuchuguazo y de Uña de Gato, y las cápsulas de Uña de Gato, presentaron efectoantiinflamatorio por la vía oral en las dosis seleccionadas en le modelo empleado.

Los medicamentos ensayados a las dosis que se estudiaron, dosis límite (jarabesy en uno la mayor quese puede suministrar en un día de tratamiento., no presentaron efectos tóxicos agudos por la vía oral.

BIBLIOGRAFÍA:1. CYTED. Programa iberoamericano de ciencia y Tecnología para el Desarrollo Lineal. Noviembre del

1996.2. Vogel H. G. And Vogel W. Drug Discovery and evaluation . Pharmacological Assay. Ed. Springer

Verlag 401, 1997.3. W. Hayes, Principles and methods of toxicology. Ed. Raven Press n. Y. 1994.4. Organizacion para la Cooperación y el Desarrollo Económico, TG 401. 19925. ISO Biological Evaluation 1, 10, 12, 1992, 1999.

0

20

40

60

80

100

horas

% d

e in

flam

aci

ón

indometacina 32.68 40.1 26.48 31.31

Carragenina 36.32 57.2 79.15 61.31

J. chuchuguazo 17.73 25.2 13.85 5.8

J. De uña de gato 26.5 42.4 30.07 22.74

Cápsulas U. de Gato 36.7 46.08 50.76 32.58

1 2 3 4

ESTUDIO PARA LA DETERMINACIÓN DEL POTENCIAL FOTOTOXICO DE 10 PERFUMES DEPRODUCCIÓN NACIONAL, EMPLEANDO EL PROTOCOLO 81 DEL INVITTOX.

García Simón G., Martínez Pacheco, Michel; Oliva Dios L. A. y Valdivieso García, A.

LABORATORIOS LIORAD. CONSEJO DE ESTADO.

Hasta hace muy poco tiempo los estudios que se realizaban para la determinación del potencial fototóxico,empleaba a los animales, pero no había una guía para estos fines. Con el desarrollo de las técnicas de laToxicología Alternativa se establecieron varios procedimientos, entre los que se destaca el de la determinacióndel potencial fotohemolítco y de la oxidación de la metahemoglobina para el tamizaje del posible efectofototóxico de los químicos o productos. En el presente estudio se empleó el protocolo 81 del INVITTOX, paradeterminar el posible efecto fototóxico de 10 perfumes de Producción Nacional. La Cloropromacina y el SodioDodecilo Sulfato se tomaron a manera de controles positivo y negativo respectivamente. Los resultadosobtenidos indicaron que ninguno de los perfumes empleados ni el Sodio Dodecilo Sultafo mostraban efectosfotohemolítos puesto que el F F (Factor Fotohemolíto, relación entre la concentración hemolítica media noirradiada con respecto a la irradiada) fue menor que 3, e igualmente los valores de la diferencia de DensidadOptica (tratado y control) no superaban a 0.05, mientras que para la Cloropromacina se apreció que estos eranmayores que los mencionados valores. Los resultados obtenidos nos permite plantear que los 10 perfumes deProducción Nacional no son potencialmente Fototóxicos para los humanos, así como la utilidad del mencionadoprotocolo para estos fines.

INTRODUCCIÓN:Los cambios en los hábitos sociales en el desarrollo de los países guió al incremento de la exposición de loshumanos al potencial fototóxico o fotoalérgico o sea fotosensibilizante de los compuestos (1). Estas respuestas alas drogas que son administradas sistémicamente son reportadas frecuentemente como reacciones adversas.Varias clases de agentes farmacéuticos han sido implicados, los que incluyen antibacterianos, NSAID,antidepresivos tricíclicos, diuréticos agentes anticancerosos y retinoides. (2) Los sistemas de ensayos para lafototoxicidad basados en animales aún no cuentan con una guía internacional para su estudio (1), por lo que unnúmero de ensayos in vitro se han desarrollado, los que incluyen cultivos celulares, Cándida albicans, sistemasbacterianos y células rojas de humanos (3,4).En 1994, el INVITOX ( In Vitro Toxicology) publicó el protocolo 81 titulado: ¨RBC PHOTOASSAY¨ (5), cuyopropósito es estudiar el potencial fototóxico de los químicos o productos terminados por su habilidad para alterarla membrana del eritrocito y/o oxidar a la hemoglobina, bajo la exposición a la luz Ultra Violeta y visible (luzsolar). El propósito de esta investigación fue identificar el potencial Fototóxico mediante el cálculo del FactorFotohemolítico (FF), así como la formación de la metahemoglobina empleando un procedimiento similar yobteniendo la DO, de 10 perfumes de producción Nacional, y utilizando como controles positivo a lacloropromacina, y negativo al Sodio Dodecilo Sulfato, puesto que al no existir una guía que norme el uso de unprocedimiento in vivo y dado a la importancia de que nuestro país se incorpore a la cada vez más importanteToxicología Alternativa y en consonancia con el principio de las 3ERRES, el mencionado ensayo del RBCPHOTOASSAY puede darnos una idea veraz de la peligrosidad o no de los mismos para la salud humana., sin elempleo de animales de experimentación.

MATERIALES Y METODOS.EXTRACCIÓN DE LAS CELULAS ROJAS SANGUÍNEAS (RBC).Este procedimiento se hizo siguiendo lo descrito en el protocolo 81, que nos sirvió de base.CONTROLES.Control positivo: se utilizó a la cloropromacina, en una concentración del 0.03 % (0.3 mg/mL).Control negativo: se utilizó al SDS, en una concentración del 0.1 % (1 mg/mL).Sustancia a ensayar:Se emplearon 10 perfumes provenientes de la firma Suchel Tropical, con su correspondiente certificado decalidad los que se denominaban:Bonabel amarillo; azul; rosado; violeta; Tropical 1 y 2; Agua de violetas; Café de París; Angel y Blue SkyControl de lisis espontánea y 100 % de lisis.Se determinó la lisis espontánea y el 100 %DETERMINACIÓN DE LA METAHEMOGLOBINA:Se efectuó con las mismas condiciones que para el ensayo de fotohemólisis.Pero se adicionó a cada pocillo de las placas (con y sin irradiación), 100 (µL) de una solución al 1 % de tritón X– 100

CALCULO DEL FACTOR FOTOHEMOLITICO Y CLASIFICACION DEL POTENCIALFOTOTÓXICO.Se empleó el método de los mínimos cuadrados para determinar la concentración que lisa al 50 % de loshematíes con y sin luz y posteriormente se utilizó la siguiente descrita en el mencionado protocolo.Se consideró a la sustancia como fototóxica si el Factor Fotohemolítico era mayor que 3.Formación de la metahemoglobina.DO = D.O. (con luz) – D.O. (sin luz)Cuando la DO es mayor de 0.05, igualmente se consideró al producto como Fototóxico.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN.FACTOR FOTOHEMOLITICO Y FORMACIÓN DE LA METAHEMOGLOBINATABLA # 1. RESULTADOS DE LA DETERMINACIÓN DEL POTENCIAL FOTOTÓXICO DE 10PERFUMES DE PRODUCCIÓN NACIONAL.

PRODUCTOS FF DO CLASIFICACION

CLOROPROMACINA 3.14 0.321 FOTOTOXICO

SDS 1.18 0.009 NO FOTOTOXICO

Agua de violetas 1.75 0.021 NO FOTOTOXICO

Angel 1.30 0.29 NO FOTOTOXICO

Bonabel amarillo 2.00 0.046 NO FOTOTÓXICO

Bonabel Rosado 1.59 0.001 NO FOTOTÓXICO

Bonabel Violeta 1.98 0.033 NO FOTOTOXICO

Blue sky1.66

0.31 NO FOTOTOXICO

Café de París 1.97 0.31 NO FOTOTOXICO

Tropical 1 1.41 0.10 NO FOTOTOXICO

Tropical 2 2.01 0.40 NO FOTOTOXICOBonabel azul

2.45 0.47 NO FOTOTÓXICO

La cloropromacina tomada como control positivo y reportada como tal por el protocolo que nos sirvió de basepara este estudió (2) mostró un valor del FF de 3, y su DO fue mayor igualmente que 0.05 por lo que se puedeconsiderar como Concentración Fototóxica, sin embargo el Sodio Dodecilo Sulfato, control negativo, a pesar deproducir hemólisis pues está referido que a la Concentración empleada (0.1 %) debe ocasionar la lisis de loshematíes (1), los resultados indicaron que tanto sin luz como con ésta los efectos fueron similares sobre lasmencionadas células por lo que el valor del FF fue de 1.09, lo cual lo clasifica como no potencialmenteFototóxico. Cuando se analizó los resultados obtenidos para los 10 perfumes de Producción Nacional, ningunode ello mostró un valor del FF igual o mayor que 3, ni tampoco la DO fue en caso alguno superior a 0.05, porlo que siguiendo lo descrito en el mencionado protocolo 81 (2), las sustancias se considera como Potencialmenteno Fototóxico. En un estudio realizado por Pape y col se encontró que cuando se utiliza solo el factorfotohemolítico se pueden producir aunque en un porciento bajo, falsos negativos, pero cuando se incluye ladeterminación de la formación de metahemoglobina entonces los resultados se acercan más a la realidad, o seadetecta correctamente a los que son o no potencialmente fototóxicos. Mariko y col también reportaron la utilidadde este ensayo para la determinación del potencial fototóxico de las sustancias (6), pero indicaron que nodetermina la fototoxicidad de compuestos como el 8 o el 5 metoxy-psoraleno, de las que se conoce su potencialpara producir este tipo de efectos en los humanos, pues ellos no causan hemólisis, por lo que concluyen que esimportante para estudiar la fototoxicidad in vitro, al igual que la mayoría de las otras determinacionestoxicológicas, lo correcto es tener una batería de ensayos, al menos dos de ellos, y que de una gran ayuda puedeser el QSAR (relación estructura química, actividad biológica).No obstante como los perfumes analizados no presentan en su composición estos compuestos, y dado a que no sedispone de una técnica in vivo validada y normada por las guías mencionadas, entendemos que con elconocimiento de las dificultades que este test presenta el mismo puede servirnos para la determinación de lospotenciales fototóxicos de los perfumes que producen nuestras industrias.

CONCLUSIONES. Los 10 perfumes de Producción Nacional no fueron potencialmente fototóxicos en el ensayo realizado. Se demostró por vez primera que la técnica in vitro de determinación de fototoxicidad, es factible,

rápida, reproducible y económica.

RECOMENDACIONES. Estudiar la factibilidad de otro ensayo como el de las células 3T3 de fibroblasto de ratón para

determinar la Fototoxicidad de los compuestos en general.

BIBLIOGRAFÍA.1. García G. Ensayos Toxicológicos de primera Barrera y la Toxicología Alternativa. Tesis para optar por

el grado académico de maestro en Ciencias, Habana, junio del 2000.2. Pape W. and Pfannenbecker U. RBC Photoassay- Photohaemolysis and Haemoglobin Oxidation,

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phototoxic potencial of chemical (ibid) 213-221.

Irritabilidad dérmica y oftálmica de la Crema Anticelulitis MB.

Autores: MSc. Emilio Montegudo Jiménez, MSc. Geidy Lorenzo Monteagudo, Dra. María Boffill Cárdenas,

Téc. Luis Díaz Costa, Téc. Belkys Verdecía Machado

UNIDAD DE TOXICOLOGÍA EXPERIMENTALINSTITUTO SUPERIOR DE CIENCIAS MEDICAS DE VILLA CLARA

INTRODUCCIÓN

Los productos naturales, aunque generalmente no son asociados con la producción de efectos tóxicos

considerables, no constituyen una excepción, por lo que también deben ser sometidos a evaluaciones que

garanticen la seguridad de su uso. Los estudios de Irritabilidad Dérmica y Oftálmica se sitúan dentro de las

pruebas de Primera Barrera imprescindibles a realizar a productos cuyo uso presupone el contacto con la piel.

Son ampliamente utilizados por los toxicólogos para evaluar el daño potencial de las sustancias sobre las

estructuras de la piel y el ojo. Los mismos aparecen estipulados como obligatorios por las Agencias

Regulatorias internacionales(1-6) así como por la Agencia Regulatoria Cubana (CECMED) para sustancias

que presuponen el contacto con piel u ojos. Es por ello que nuestro trabajo se propone como objetivos:

evaluar el potencial irritante dérmico de la Crema Anticelulitis MB y determinar el potencial irritante

oftálmico de este producto

MATERIALES Y MÉTODOS

IRRITABILIDAD DÉRMICA(2-4): se utilizaron 3 conejos de la raza Nueva Zelanda, hembras, de 2 – 3 kg

PV, hembras, procedentes del CENPALAB, con su correspondiente certificado de calidad.

Aproximadamente 24 horas antes de la aplicación, se rasuró la piel de la región dorsal a ambos lados de la

espina dorsal y se escogieron los animales que presentaron la piel intacta los que fueron alojados de manera

individual en módulos para esta especie e identificado cada box(7,8). Se aplicaron 0.5 g de la sustancia (2

aplicaciones por animal) directamente sobre la piel y se mantuvieron en contacto con ella durante 4 horas

mediante apósitos de gasa de 6cm2 y esparadrapo. Pasado este tiempo se retiraron los apósitos y la superficie

de la piel fue lavada con agua atemperada para eliminar la sustancia residual. Se observaron las áreas de

aplicación a las 1, 24, 48 y 72 horas posteriores a la retirada de los apósitos con el objetivo de determinar el

grado de eritema y edema, asignándosele la puntuación correspondiente según la escala propuesta por Draize.

Con los datos obtenidos se calculó el Índice de Irritación Primaria (IIP) para la clasificación final del

producto.

IRRITABILIDAD OFTÁLMICA(5,6): en esta técnica también se utilizaron 3 conejos de la raza Nueva

Zelanda, de 2 – 3 kg PV, hembras, procedentes del CENPALAB, con su correspondiente certificado de

calidad. La semana antes del comienzo del estudio, los conejos fueron trasladados al cubículo de

experimentación para lograr su aclimatación. Durante este tiempo se realizaron inspecciones diarias para

garantizar un adecuado estado de salud de los mismos. 24 horas antes del comienzo del experimento se

examinaron ambos ojos de los animales y se seleccionaron aquellos sin daño alguno ubicándose de manera

individual en módulo de la especie e identificado cada box. Se instilaron 0.1g de la sustancia de prueba en el

fondo del saco conjuntival del ojo derecho de cada animal, manteniendo los párpados unidos durante 5

segundos. El ojo izquierdo se tomó como control.

Transcurrida 1 hora de la aplicación de la sustancia se procedió a lavar el ojo con solución salina fisiológica

para realizar las observaciones correspondientes. Las lecturas posteriores se realizaron a las 24, 48 y 72 horas

para graduar los daños en estructuras tales como: córnea, iris y conjuntiva. Para determinar los posibles daños

corneales se tiñó el ojo con Fluoresceína sódica al 2% y se observó con el auxilio de una lámpara de luz

ultravioleta (Kamag). Con los resultados obtenidos se determinó el Índice de Irritación Ocular (IIO) a fin de

clasificar el producto.

RESULTADOS

El estudio de irritabilidad Dérmica evidencia los siguientes resultados:

OBSERVACIONES (HORAS)

1 24 48 72AnimalSitio de

aplicaciónEd Er Ed Er Ed Er Ed Er

I0 2 0 0 0 0 0 0

1

II 0 2 0 0 0 0 0 0

I0 0 0 0 0 0 0 0

2

II 0 0 0 0 0 0 0 0

I0 1 1 0 0 0 0 0

3

II 0 1 1 0 0 0 0 0

Leyenda: Ed: Edema Er: Eritema

Estos resultados conducen a la obtención de un Índice de Irritación Primaria (IIP) de 0,16, acorde a lo

esperado teniendo en cuenta el origen natural de los componentes esenciales de la crema y la estimada baja

toxicidad de los mismos el producto pasa la prueba como No irritante dérmico según la escala de clasificación

del método de ensayo.

Respecto a los resultados de la Irritabilidad Oftálmica estos se muestran en la siguiente tabla:

CórneaTiempo

(horas)Animal

Opacidad ÁreaIris Conjuntiva Quemosis Secreciones

1 1 0 0 1 0 0

2 0 0 0 1 0 01

3 0 0 0 1 0 0

1 0 0 0 0 0 0

2 0 0 0 0 0 024

3 0 0 0 0 0 0

1 0 0 0 0 0 0

2 0 0 0 0 0 048

3 0 0 0 0 0 0

1 0 0 0 0 0 0

2 0 0 0 0 0 072

3 0 0 0 0 0 0

Estos resultados conducen al cálculo del Índice de Irritación Ocular (IIO) el cual arroja un valor de

0,5 que comparándolo con la escala de clasificación establecida en el método de ensayo lo ubican

en la categoría de No Irritante Ocular también.

DISCUSIÓN

Tomando en consideración el origen natural de los componentes de la crema en estudio los

resultados se ajustan a las predicciones efectuadas a tal efecto, o sea, nula toxicidad tanto cutánea

como oftálmica, además no se reportan resultados relacionados con esta crema pues es de nueva

creación y el perfil de estudios efectuados es extremadamente reducido introducción además de por

razones de protección del producto.

CONCLUSIONES

De acuerdo al sistema de clasificación empleado, la Crema Anticelulitis MB se comporta como: NO

IRRITANTE CUTÁNEO y como NO IRRITANTE OCULAR

BIBLIOGRAFIA

1. Comisión de las Comunidades Europeas. Propuesta de Directiva del Parlamento y del Consejo por la

que se modifica por séptima vez la Directiva 76/768/CEE relativa a la aproximación de las

legislaciones de los Estados Miembros en materia de productos cosméticos. Bruselas; 2000.

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3. International Organization for Standardization (ISO 10993) . Part 10 ; 1999 p. 2-6.

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8. Consejo Canadiense de Protección de los Animales(CCAC). Manual sobre cuidado y uso de los

animales de experimentación. In: Stol L, editor. Ontario: CCAC; 1998. Disponible en:

URL:http://www.ccac.ca.

ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD HEMOLÍTICA DEL 4-HIDROXI-3-METOXIBENZALDEHÍDO

EN HEMATÍES SS.

Grisel del Toro García, José E. Falcón Dieguez, Yamirka Alonso Geli, Yolanda Valdés Rodríguez.

Centro de Biofísica Médica, Universidad de Oriente, Patricio Lumumba s/n, 90500, Santiago de Cuba, Cuba. Fax: (53) (22) 686214, 632545.E. mail: grisel@cbm.uo.edu.cu, griseldeltoro@yahoo.ca

Instituto de Farmacia y Alimentos. Universidad de la Habana. Calle 222 y 23 No.250, La Coronela, la Lisa, La Habana.

Palabras claves: 4-Hidroxi-3-metoxibenzaldehído, anemia drepanocítica, hematíe, hemólisis, polimerización, vainillina.

Resumen

La Anemia Drepanocítica es una hemoglobinopatía frecuente en el mundo y un modelo de enfermedad molecular. Se expresa por

una combinación homocigótica autosómica del gen β-globin mutado, que determina la sustitución del ácido glutámico (Glu) por la

valina (Val), en la posición 6 de cada cadena polipeptídica β (β6 glu→val), dando lugar a la hemoglobina S. Las moléculas de

desoxihemoglobina S se polimerizan formando estructuras microtubulares elongadas que rigidifican, distorsionan y disminuyen la

flexibilidad del hematíe. La polimerización es el evento primario de la drepanocitemia; los hematíes distorsionados obstruyen los

vasos de menor calibre de la microcirculación, provocando una oxigenación deficiente de los tejidos. Actualmente no existe un

tratamiento efectivo por lo que se impone el estudio de compuestos con actividad antisickling como posibles candidatos a

fármacos. El presente trabajo comprende el estudio de la actividad hemolítica del 4-Hidroxi-3-metoxibenzaldehído en hematíes SS

según el método Stanley 1987. El porcentaje de hemólisis promedio calculado para diferentes relaciones molares de hemoglobina

S: compuesto (1:1, 1:2, 1:4, 1:5, 1:8 y 1:10) fue inferior al 3%. No se detectaron diferencias significativas entre las medias

(P0.05%) al comparar 1:1, 1:2, 1:4, 1:5 y 1:8, ni entre 1:8 y 1:10. Sin embargo, hubo diferencias significativas entre las medias

de 1:1, 1:2, 1:4 y 1:5 vs 1:10. Esto indica ausencia de actividad hemolítica significativa del 4-Hidroxi-3-metoxibenzaldehído sobre

los hematíes SS, lo cual pudiera potenciar la moderada actividad biológica observada para este agente antisickling.

Introducción

La Anemia Drepanocítica (AD) es un problema de salud pública en Cuba, afectando al 3.1% de la población general distribuida en

Ciudad de la Habana, Santiago de Cuba y Guantánamo.1 Aún no existe un tratamiento efectivo contra esta anemia hemolítica

congénita, constituyendo una de las principales vías la búsqueda de un compuesto capaz de inhibir la polimerización de la

Hemoglobina S (HbS) que es el evento fisiopatológico primario de esta enfermedad.2,3 La presencia en sangre periférica de

numerosos eritrocitos de forma semilunar o drepanocitos es la causa de todas las manifestaciones clínicas y hematológicas de la

misma como consecuencia de la excesiva destrucción eritrocitaria e hiperplasia del sistema eritropoyético.4,5,6,7

La destrucción o hemólisis de los hematíes ocasiona hipoxia en los tejidos con un consecuente desgaste físico de la médula ósea y

la liberación al flujo sanguíneo de los llamados reticulocitos o hematíes jóvenes.8,9 A este daño celular intrínseco se adiciona la

lisis celular que puede ocurrir por la acción de diferentes agentes físicos o químicos externos. Por esta causa una de las pruebas de

utilidad en el estudio y desarrollo de un fármaco es la determinación de su actividad hemolítica, especialmente si está dirigido a los

hematíes. Atendiendo a estos criterios y, a la anemia hemolítica crónica que caracteriza la enfermedad, se impone determinar,

mediante estudios in vitro, la actividad hemolítica de aquellos compuestos que poseen actividad antisickling y que por sus

características toxicológicas inocuas puedan considerarse como posibles candidatos a fármacos. En estudios previos por

Cromatografía Líquida de Alta Eficacia (HPLC),10,11 Electroforesis,12 y Relajación Magnética Nuclear (RMN)13,14,15, se demostró

que el aldehído aromático 4-Hidroxi-3-metoxibenzaldehído (C8H8O3, vainillina) posee una moderada actividad antisickling.

Materiales y Métodos

Se utilizó etanol (ALFA AESAR); heparina sódica (SIGMA); NaCl, Na2HPO4, KH2PO4, NaCO3, 4-hidroxi-3-metoxibenzaldehído

(vainillina) (Panreac) y soluciones Drabkin 1 y 2 (Imefa). La vainillina, aldehído aromático de olor agradable, es un flavorante

presente en los alimentos16,17,18 para el que se reportan diferentes estudios de toxicidad oral con ratas, donde altas dosis fueron

consumidas por extensos períodos sin efectos adversos.19 Se utilizó una Centrifuga Tehtnica LC-320c, el Espectrofotómetro

ULTROSPEC III y el monitor de pH de Pharmacia LKB, y una Balanza electrónica ER-182A.

Se realizaron nueve pruebas in vitro en concentrados de hematíes obtenidos a partir de sangre total heparinizada de pacientes con

hemoglobinopatía SS,20 suministrada por el Laboratorio Clínico del Hospital General Santiago. Para el lavado de los hematíes y la

preparación de las soluciones hidroalcohólicas del compuesto se utilizó un tampón fosfato salino (PBS) a pH 7.4. El 4-hidroxi-3-

metoxibenzaldehído se preparó en 1 mL de solución hidroalcohólica (relaciones molares 1:1, 1:2, 1:4, 1:5, 1:8 y 1:10). Se

determinó la concentración de Hb por el método de la cianometahemoglobina21,8 con soluciones Drabkin 1 y 2.

Se determinó la actividad hemolítica mediante el cálculo del porciento de hemólisis (%H) (1), a partir de la medición de la

absorbancia para la Hb libre (λ= 545 nm) en el sobrenadante.22,23

100 DO -DO

DO - DO%Hem.

CNCP

CNM ⋅= (1) donde: DO = Densidad óptica, M = Muestra, CN = Control

Negativo, CP = Control Positivo.

Se utilizó un control positivo (0.1 % de Na2CO3), un control negativo de PBS a pH=7.4 y un control negativo* al que se añadió la

solución vehículo. Se tomó 1 mL del concentrado lavado y se resuspendió en PBS (pH=7.4, 10 mL), tomando 0.2 mL que se

añadieron a cada uno de los controles. Para cada relación molar se adicionó 10 µL de la solución del compuesto, así como 10 µL

del vehículo al control negativo*. Las soluciones se prepararon en un volumen final de 10 mL y para cada lectura se realizaron dos

réplicas. Una vez añadido el compuesto se agitaron las muestras, se dejaron reposar 30 min., posteriormente se centrifugaron y se

tomó el sobrenadante al cual se le midió la absorbancia y se le calculó el %H (1). Los resultados se representaron gráficamente,

usando el Microsoft Excel 97, y se obtuvieron las curvas de actividad hemolítica por relación molar y la curva promedio para cada

prueba. Se utilizó el Statgraphics Plus 2.1 para comparar las medias con el test de rangos múltiples, el análisis de varianza simple

(ANOVA) y el Kruskal-Wallis Test (P0.05%).

Discusión de los Resultados

En el estudio realizado no se detectó actividad hemolítica significativa, obteniendo el menor %H (0.02%) en una prueba para la

relación molar 1:8 y los mayores (5.46 y 5.94 %) en una sola prueba para 1:8 y 1:10, respectivamente. Para todas las relaciones

molares el %H se movió en un rango de 0.2-1.42%. El cuadro clínico y hematológico en esta enfermedad molecular varía de un

paciente a otro, por lo cual los cambios morfológicos celulares y la resistencia a factores externos también serán variables y

dependientes de las características individuales. Al comparar las medias no existieron diferencias significativas entre 1:1, 1:2, 1:4,

1:5 y 1:8; ni entre 1:8 y 1:10, sólo entre 1:10 y el resto de las relaciones molares al realizar el test de rangos múltiples (P0.05%).

Al no detectar dependencia de la actividad hemolítica vs la concentración, se promediaron los valores del %H de todas las

relaciones molares por prueba (Gráfico 2) con su respectiva desviación estándar. Teniendo en cuenta las características de la

muestra en estudio y que el %H promedio estuvo por debajo del 3%, las variaciones obtenidas fueron pequeñas. Las dos

manifestaciones hematológicas más comunes de la AD son las crisis dolorosas recurrentes y la hemólisis crónica, la severidad de

expresión de ambas varía entre individuos y parece ser que el número de células irreversiblemente falciformes circulantes

determina la componente hemolítica.24 Los hematíes SS, debido a la polimerización de la Hb, son más frágiles y rígidos que los

normales, por estar sometidos a cambios intracorpusculares que causan pérdida en su elasticidad, y su tiempo de vida medio es de

aproximadamente 60 días.8

Gráfico 1: Relación entre el %H calculado y cada relación molar en nueve

pruebas en hematíes SS.

0

1

2

3

4

5

6

7

1:1 1:2 1:4 1:5 1:8 1:10

Relación Molar

Po

rcie

nto

de

He

mó

lisis

(%

H)

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Gráfico 2: Actividad hemolítica promedio para las nueve pruebas en

hematíes SS. Las barras muestran la desviación estándar.

0

2

4

6

8

10

1 2 3 4 5 6 7 8 9

No. Ensayos

%H

Algunos autores han informado, que la sangre oxigenada de estos pacientes muestra una viscosidad aumentada asociada a la

presencia de drepanocitos irreversibles y, que probablemente debido a la reducida flexibilidad de su membrana aumentan la

viscosidad interna, la cual está asociada con la elevada concentración de Hb corpuscular media (CMHC).25 Se ha informado que la

numeración de drepanocitos, en sangre tanto arterial como venosa, procedente de distintas áreas del organismo, es notablemente

constante para el mismo paciente.25 Presumiblemente esta constancia numérica resulta del balance entre la velocidad de formación

y la destrucción, y esta última consiste en lisis intravascular debida a la fragilidad mecánica aumentada y la extracción por

retención y fagocitosis en el sistema reticuloendotelial.25 Todos estos factores deben ser considerados al estudiar el efecto

hemolítico de un agente antisickling. Aún cuando se observó un ligero incremento de la actividad hemolítica al utilizar una

relación molar aumentada en 10 veces, el %H (<3) obtenido nos lleva a pensar en una baja actividad hemolítica del compuesto en

estudio.

Bibliografía

1 Espinosa E., Svarch E., Martínez G.. Revista Cubana de Hematología, Inmunología y Hemoterapia 12:37 (1985).2 Serjeant G.R.: Sickle Cell Disesase. Segunda edición. Ed Oxford University Pr es (1992).3 Colombo B., Guerchicoff E., Martínez G.: Genética Clínica de las Hemoglobinas Humanas. ed Pueblo y Educación (1993).4 Jurrien D., M.D. and Schechter A.N., M.D. New Ingland Journal of Medicine. 299:752-763 & 804-811 & 863-870, October 5 & October 12 &October 19 (1978).5 Eaton W.A. and Hofrichter J.: Sickle Cell Hemoglobin Polymerization. Advances in Protein Chemistry, Vol.40, pp. 67-68, 157-175 (1990).6 Lehninger A.L. Ed. Worth Plublishers, Inc., 169-207 (1982).7 Kaperonis A.A. et al. Amer. J. Hematol. 21:269-275 (1986).8 Ciscar R.F.: Diagnóstico Hematológico. Tomo II. Editorial Jims, Barcelona. 1323-1375 (1972).9 Composición de la sangre. Enciclopedia Microsoft® Encarta® 99. © 1993-1998 Microsoft Corporation. Reservados todos los derechos.10 Abraham D.J. et al. Blood, Vol. 77, No6:1334-1341 (1991).11 Alvarez E., Cabal C., Fernández A., Soler C., Lores M., Del Toro G. Avances en Biotecnología Moderna. Vol. 4, E6, Diciembre (1997).12 Abdala J.C., Soler C., Fernández A., Alvarez E., Del Toro G. Revista Cubana de Química. Vol. VIII, No.2, (1996).13 Abdala J., Cabal C., Fernández A., Soler C., Alvarez E., Lores M., Del Toro G. Proceedings 36th IUPAC International Congress, Chimia Acta,Suiza, July (1997).14 Cabal C. et al. Physica Medica, Vol. XIII, November (1997).15 Cabal C. et al. Proceedings of the International Society for Magnetic Resonance in Medicine. (1998).16 USP XVIII. The United Stateds Pharmacopoeia (Eighteenth edition). The US Pharmacopoeial Convention, Mack Printing Company. EastonPA. 18042. (Inc. 1970).17 Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos. Monografía de Fármacos. 5ta. Edición 943-945 (1988).18 AVI Sourcebook and Hanbook Series (Sorce Book of Flavors). A División of Albright and Wilson, Ltd. London, England The AVI PublishingCompany, INC. West port, Connecticut. (1981)19 Hagan E.C. et al. Food Cosmet Toxicol 5/141 (1967).20 Sistema de aseguramiento de la calidad (No.42, PT13BQ).21 Sistema de aseguramiento de la calidad (No.43, PT14BQ).22 Stanley H.R. (ed): Toxicity testing of dental materials. CRC Press Inc. Boca ratón, Florida 13 (1985).23 Sistema de aseguramiento de la calidad (No.57, PT18BQ).24 Mohandas N. and Evans E. Blood, 64, 1:282-287 (1984).25 Milner P.F. Clínica Hematológica. SALVAT 2/2 pp. 72-107.

1

INFLUENCIA DEL 4-HIDROXI-3-METOXIBENZALDEHÍDO (VAINILLINA) EN LA POLIMERIZACIÓN DE

LA HEMOGLOBINA S.

INFLUENCE OF 4-HYDROXY-3-METHOXYBENZALDEHYDE (VANILLIN) ON HEMOGLOBIN S

POLYMERIZATION.

G. del Toro García , A.R. Pozo Díaz , J.C. Rodríguez Tito , A.A Fernández García , C. Soler Martínez .

Centro de Biofísica Médica, Universidad de Oriente, Patricio Lumumba s/n, 90500, Santiago de Cuba, Cuba. Fax: (53)

(22) 686214, 632545. E. mail*: grisel@cbm.uo.edu.cu, griseldeltoro@yahoo.ca Facultad de Ciencias Naturales, Universidad de Oriente, Patricio Lumumba s/n, 90500, Santiago de Cuba, Cuba.

Palabras claves: célula roja, polimerización, hemoglobina S, relajación, antisickling.

2

Resumen

Se presenta un estudio de la influencia del 4-hidroxi-3-metoxibenzaldehído (vainillina) en el tiempo de demora de la

polimerización de la Hemoglobina S utilizando la Relajación Magnética Nuclear Protónica (RMN-1H). Se utilizaron las

relaciones molares (HbS/vainillina) 1:1, 1:2 y 1:10. Estudios anteriores demostraron que la vainillina tenía una moderada

actividad antisickling cuando se comparaba con otros aldehídos. Las muestras incubadas con 4-hidroxi-3-

metoxibenzaldehído mostraron un incremento en el td y el porciento de variación del td por relaciones molares fue: (3.5 ±

1.5)% (1:1), (8 ± 2.4)% (1:2) y (21 ± 6.5)% (1:10). De este modo, incrementando la concentración de vainillina aumentó su

efecto en el retardo de la polimerización de la HbS. Los resultados por RMN confirmaron la moderada actividad

antisickling de la vainillina y se discute su utilidad terapéutica en el tratamiento de la Anemia Drepanocítica.

Abstract

The influence of 4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyde (vanillin) on the delay time of Hemoglobin S polymerization was

examined using Nuclear Proton Magnetic Relaxation (NMR-1H). HbS/vanillin molar ratio 1:1, 1:2 and 1:10 were used.

Earlier studies indicated that vanillin had moderate antisickling activity when compared with other aldehydes. The samples

incubated with vanillin showed an increase in delay time, and the percent increase vs molar ratio was: (3.5 ± 1.5)% (1: 1),

(8 ± 2.4)% (1: 2) and (21 ± 6.5)% (1: 10). Thus, increasing the concentration of vanillin increased its effect in delaying the

polymerization of Hemoglobin S. These NMR results confirmed the moderate antisickling activity of vanillin and its

therapeutic utility in the treatment of sickle cell disease is discussed.

3

Introducción

La Anemia Drepanocítica (AD) es una hemoglobinopatía frecuente en el mundo y constituye un modelo genuino de

enfermedad molecular. Sus principales manifestaciones clínicas son una anemia hemolítica crónica y las crisis

vasooclusivas (CVO) que causan dolor severo y el daño generalizado de los órganos.1,2,3,4,5,6 Resulta de la expresión

homocigótica de un gen β-globin mutante autosómico que determina la sustitución de un residuo polar (ácido glutámico)

por un residuo hidrofóbico (valina) en la posición 6 cada cadena polipeptídica β (β6 glu→val) de la molécula de hemoglobina

S (HbS).1,2,7 Las moléculas de desoxihemoglobina S (dHbS) polimerizan formando agregados moleculares en forma de

estructuras microtubulares elongadas que rigidifican, distorsionan el glóbulo rojo y disminuyen su flexibilidad. La

polimerización es el evento primario en la fisiopatología de la AD; las células rojas distorsionadas provocan la obstrucción

de los pequeños capilares en la microcirculación y una oxigenación deficiente de los tejidos.2,3,8,9,10 Se ha reportado que sólo

una de las dos Val β6 en cada tetrámero forma un contacto en el polímero.

En la polimerización existe un tiempo de demora (td) o proceso de nucleación durante el cual las unidades de HbS se

asocian unas con otras para formar un núcleo crítico, haciendo la posterior adición de unidades de Hb energéticamente

favorable. Los estudios realizados por difracción de rayos X y microscopía electrónica sugieren que en el polímero los

tetrámeros de dHbS se van uniendo alrededor de un eje vertical formando anillos helicoidales espirales de moléculas de Hb

que se encajan unas encima de las otras dando lugar a la formación de largas fibras.8,11,12,13,14

Se ha demostrado que los agentes antisickling pueden inhibir la polimerización. Muchos compuestos químicos han sido

estudiados, incluyendo los aldehídos aromáticos15,16,17,18, los ácidos aromáticos19,20,21, el ácido etacrínico22,23, los ácidos

alcanoicos24 y drogas como el ácido clofíbrico y el gemfibrozil.25 Sin embargo, muchos compuestos antisickling son

extremadamente tóxicos a las concentraciones terapéuticas, y por esta razón no es posible utilizarlos en el tratamiento

clínico de la AD.

El 4-hidroxi-3-metoxibenzaldehído (vainillina), aldehído aromático, tiene una actividad antisickling moderada.15,16 Este

compuesto reacciona con los grupos amino libres de la Hb intracelular para formar una Base Schiff. Los estudios por

Cromatografía Líquida de Alta Eficacia (HPLC)18 y Enfoque Isoeléctrico (IE)15 sugieren que la vainillina modifica

covalentemente la Hb, de modo que el aducto vainillina-Hb inhibe la polimerización por vía de un mecanismo dual de

acción: (1) incrementando la afinidad de la Hb por el oxígeno, modificando la curva de disociación de oxígeno; y (2)

causando inhibiciones estereoquímicas de la polimerización de dHbS.18

La polimerización de la HbS ha sido estudiada utilizando la Resonancia Magnética Nuclear (RMN) de Relajación (RMN-1H)26 por nuestro grupo de investigación. Las moléculas de agua que se encuentran asociadas a la molécula de HbS

disminuyen su movilidad debido a la formación de polímeros en el medio, provocando una reducción del tiempo de

relajación spin-spin (T2).Utilizando esta metodología se evaluó la actividad antisickling de aldehídos aromáticos entre los

que se encontraba la vainillina27,28,29,30, encontrando que los mismos incrementaron el td de la polimerización de la HbS. En

este de este trabajo se presenta un estudio sobre la influencia de la concentración de vainillina en la polimerización por

RMN.

4

Materiales y Métodos

Reactivos y Equipamiento

Todos los reactivos fueron obtenidos de suministradores comerciales, el etanol de ALFA AESAR, la heparina sódica y el

NaCl de SIGMA, Na2HPO4 y KH2PO4 de Merck. El 4-hidroxi-3-metoxibenzaldehído (vainillina) fue suministrado por

Dallant S.A. Este es un flavorante presente en los alimentos31,32,33 para el que se han reportado diferentes estudios de

toxicidad oral con ratas en los cuales altos niveles de vainillina fueron consumidos por extensos períodos sin efectos

adversos.34

Se utilizó una Centrífuga Jouan MR 18.12, con rotor angular, 50 mL; un Espectrofotómetro ULTROSPEC III y un monitor

de pH de Pharmacia LKB y la Balanza electrónica ER-182A. Se realizaron las mediciones del tiempo de relajación T2 en el

Relaxómetro Giromag 01®, equipo construido y registrado por el Centro de Biofísica Médica.

Preparación de las muestras

Se realizaron cuatro ensayos in vitro en muestras de solución de HbS obtenidas a partir de sangre venosa total de los

individuos homocigóticos SS de la consulta de Hematología Especial del Hospital Provincial "Saturnino Lora" y como

referencia se realizaron dos ensayos en muestras de individuos voluntarios (HbA). La muestra de sangre venosa

heparinizada se centrifugó a 3000 r.p.m. durante diez minutos. Posteriormente, se removió el plasma y las células rojas

fueron lavadas tres veces con PBS (pH=7.4). Se realizaron 4 pool de glóbulos (de 6 a 7 muestras cada uno), se hemolizó la

masa globular por congelación y se centrifugó (3000 r.p.m, 10 min.). La concentración de Hb fue determinada usando el

método de Drabkin en un espectrofotómetro ULTROSPEC III (Pharmacia). La solución de Hb fue dividida en porciones

(1.5 mL) y almacenada a 4°C hasta su posterior uso. Con las muestras de referencia (HbA) se realizó el mismo

procedimiento.

Las soluciones de vainillina fueron preparadas en 20% etanol/PBS. Se utilizó una muestra control en cada ensayo a la que

se le añadió la solución vehículo. Las muestras (500 µL) fueron depositadas en las ámpulas de RMN y termostatadas a

36°C durante el curso de las mediciones.

Medición por RMN

Para el Relaxómetro Giromag 01® se reporta un 5% de error sistemático y un rango de 3-9% de error aleatorio en la

medición y determinación del td. Se utilizó la serie de impulsos 90º- τ-180º, a la frecuencia de 4 MHz, con un intervalo no

mayor de 20 minutos entre cada medición. Las curvas de la variación temporal de T2 que describen la cinética del proceso

de polimerización fueron ajustadas evaluándose la diferenciación de los valores obtenidos de los tiempos de relajación, y se

normalizaron en un rango de 0 a 1 para facilitar la diferenciación del td entre las diferentes muestras. El cálculo del td fue

realizado partiendo de la curva sigmoidal normalizada, se tomaron los puntos límites (máximo y mínimo) en el tramo de la

curva donde disminuyen los valores de T2, se realizó un ajuste por regresión lineal y en el punto donde la recta coincidió

con el valor inicial de T2 se obtuvo el valor denominado td, a partir del cual se ha reportado que se inicia el crecimiento

rápido e irreversible de los polímeros.

La influencia de la concentración del compuesto en el proceso de polimerización se evaluó a partir del cálculo del porciento

de variación del td (%Vtd) para cada relación molar (rm) con relación al patrón (pat), el mismo fue calculado como sigue:

100)(

)()(% ×

−=

pattd

pattdrmtdVtd (1)

Se controló el pH, la concentración de HbS, la temperatura y el número de réplicas.

5

Discusión de los resultados

Medición por RMN y cálculo del td.

Con la metodología por RMN se estudió la cinética de polimerización de la HbS reproduciéndose para todas las muestras la

curva sigmoidal que la describe (Gráfico1). En la curva se observaron tres etapas características: la primera se corresponde

con las moléculas de hemoglobina en estado de disolución predominantemente; la segunda caracteriza el equilibrio

existente entre las moléculas en solución y las que están formando el polímero, el proceso de nucleación, durante la cual los

valores de T2 comienzan a disminuir debido al rápido crecimiento y la posterior alineación de los polímeros de HbS, que

provoca una disminución en la movilidad de las moléculas de agua con un consecuente aumento del tiempo de correlación

y en la tercera etapa se encuentran predominantemente las moléculas de hemoglobina en el polímero.29

Gráfico 1: Curva Sigmoidal que describe la polimerización de la HbS siguiendo la variación temporal de T2 por RMN en el Relaxómetro

Giromag 01®. T2 (ms): tiempo de relajación en milisegundos.

0 200 400 600 80040

60

80

100

120

140

Tiempo de demora (td)

Polímeros de HbS

HbS en solución

T2

(m

s)

Tiempo (min.)

El td fue determinado a partir de la curvas para cada una de las réplicas y se calcularon los valores promedios por ensayo y

cada relación molar, incluyendo la muestra control (Tabla 1).

Tabla 1: Tiempo de demora (td) de la polimerización de la HbS determinado a las muestras control e incubadas con vainillina (1:1, 1:2

y 1:10) para cada pool de HbS estudiado.

Pool Control 1:1 1:2 1:10

No.1 352 (1.6%) 370 (2.7%) 388 (2.7%) 403 (0.9%)

No.2 267 (2.2%) 279 (4.9%) 291 (5%) 347 (6%)

No.3 329 (2%) 335 (2.2%) 355 (2%) 407 (1.2%)

No.4 360 (0.6%) 369 (0.8%) 376 (1.4%) 422 (1.4%)

Los valores de td son en minutos, expresados como la media de mediciones realizadas por triplicado y con el valor del error dentro del

paréntesis.

6

Abraham18 en sus estudios empleando HPLC planteó la existencia de un 50% de modificación de la Hb para la relación

molar 1:1 y un 100% para 1:2. El hecho de que la vainillina incrementa el td en la polimerización de la HbS confirma los

resultados obtenidos en otros estudios, observándose en este caso una dependencia del alargamiento del td con la

concentración del compuesto para cada una de las relaciones molares. Si la vainillina se enlaza a la Hb formando aductos

base de schiff puede inhibir o retardar la polimerización, ya que bloquea los sitios de unión o de contacto entre las

moléculas de Hb dentro del polímero.

En el Gráfico 2 se muestran las curvas normalizadas comparativas entre el patrón y las diferentes relaciones molares para

uno de los pool evaluados.

Gráfico 2: Curvas de la polimerización de la HbS para el pool No.2 obtenidas en el Relaxómetro Giromag 02®. (T2med/T2ini, T2med:

tiempo de relajación medido, T2ini: tiempo de relajación inicial). Los datos representan el promedio de los experimentos realizados por

triplicado para las muestras control y tratadas con diferentes relaciones molares (RM).

0 100 200 300 400 5000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

RM 1:10 td = 347 min.

RM 1:2 td = 291 min.

RM 1:1 td = 279 min.

Control td = 267 min.

T2 m

ed/T

2 in

i

Tiempo (min.)

A partir de los valores medios del td se calculó, utilizando la expresión (1), el porciento de variación del td (%Vtd),

obteniéndose para la relación molar 1:1 una variación de 3.5 ± 1.5%, mientras que las relaciones molares 1:2 y 1:10

mostraron los resultados más significativos con 8 ± 2.4% y 21 ± 6.5% de variación respectivamente. Los valores de error

relativo se corresponden con las variaciones reportadas entre pacientes. Estos resultados sugieren que para la mayor

concentración ensayada aún podrían existir sitios de enlace en las moléculas de Hb, los cuales continúan ocupándose por las

moléculas del compuesto y bloqueando los sitios de contacto del polímero. La polimerización de la HbS es un proceso

complejo y sobre el mismo ejerce una contribución especial la concentración de oxígeno, factor que no pudo ser controlado

durante el estudio. Se ha reportado que la vainillina desplaza el equilibrio oxi-desoxi a favor de la forma oxi de la Hb,15,18

por esta razón se puede esperar la contribución de este efecto en el alargamiento del td y en el aumento de la solubilidad de

la HbS .

A partir de los datos experimentales de los 4 ensayos se realizó el gráfico del % de variación del td vs la relación molar (no

se muestra en el trabajo), observándose una zona que muestra un aumento lineal del td con respecto al aumento de la

concentración del compuesto. Sugerimos continuar los ensayos con relaciones molares intermedias (entre 1:2 y 1:10) con el

objetivo de determinar a partir de que concentración se inicia la saturación, teniendo en consideración lo planteado por

7

Abraham.

Un factor que no fue controlado durante el ensayo para cada uno de los pool utilizados fue la concentración de hemoglobina

fetal (HbF). Al analizar los valores del % de HbF reportados en la historia clínica se observó una diferencia marcada entre

los mismos. Conociendo los efectos inhibidores de la polimerización que ejerce este tipo de hemoglobina35 puede

identificar a esta como otro de los factores que provocan diferencias entre los valores del T2 y del td, encontrando valores

de desviación estándar elevados entre cada uno de los pool.

El ensayo realizado en HbA mostró que en las condiciones experimentales establecidas la misma no polimeriza, no

observándose por RMN la curva sigmoidal. En estudios anteriores, utilizando la técnica del Isoelectroenfoque, se comprobó

la ocurrencia de la reacción entre esta y la vainillina para la formación de la base de Schiff15,16.

Los resultados obtenidos en este trabajo corroboran que la vainillina tiene una moderada actividad antisickling demostrada

con el incremento del td de la polimerización de la HbS, lo cual la convierte en un potencial agente para el tratamiento de la

Anemia Drepanocítica.

8

Agradecimientos

Los autores agradecemos al colectivo de investigadores de la sección de BiofísicoQuímica del Centro de Biofísica Médica,

al Dr. Jorge Losada Gómez, especialista de 2do. Grado en Hematología Clínica del Hospital Clínico Quirúrgico “Saturnino

Lora” por su colaboración en el suministro de las muestras y su asesoría en todas nuestras investigaciones. Además, a la

Dra. Ana Teresa Govín Cid, especialista de 2do. Grado en Hematología Clínica del Hospital Infantil Norte “Juan de la Cruz

Martínez Maceira”, al Dr. Carlos Cabal Mirabal y al Dr. Eloy D. Alvarez Guerra por sus sugerencias en la revisión del

manuscrito y su colaboración en las investigaciones.

9

Bibliografía

1 Císcar F., Farreras P., Diagnóstico Hematológico, Tomo II, Editorial JIMS, Barcelona. 1387-1388, 1390, 1422-1426(1972).2 Dean J., Schechter A.N., Sickle Cell Anemia: Molecular and Cellular Bases of Therapeutic Aproaches, New Engl. J. Med.299: 752-763, 804-811, 863-870 (1978).3 A New Understanding of Sickle Cell Emerges, Science 211/16 (1981).4 Serjeant G.R., Sickle Cell Disease, Oxford Medical Publications, Second Edition, 56, 61, 71-77, 120-366 (1992).5 Colombo B., Guerchicoff E., Martínez G., Genética y clínica de las hemoglobinas humanas, Editorial Pueblo y Educación,Habana, 146-195 (1993).6 Espinosa E., La Anemia Drepanocítica en Cuba. Experiencia de 30 años, Revista Cubana de Hematología, Inmunología yHemoterapia. 12/2:97-105 (1996).7 Eaton W. A., Hofrichter J., Sickle Cell Hemoglobin Polymerization. Advances in Protein Chemistry 40:67-68, 80-110,157-175.8 Lehninger A.L, Bioquímica, Tomo I, Editorial Pueblo y Educación, Ciudad de la Habana, 150 (1981).9 Kaperonis A.A, Handley D.A., Chien S., Fibers, Crystals and other forms of HbS polymers in Deoxygenated SickleErythrocytes. Am. J. Hematol. 21:269-275 (1986).10 Rodgers D.W., Crepeau R.H., Edelstein S.J., Pairings and polarities of the 14 strands in sickle cell hemoglobin fibers,Proc. Natl. Acad. Sci. 84:6157-6161 (1987).11 Eaton W.A., Hofrichter J., P.D Ross, Delay Time of Gelation. A possible Determinant of Clinical Severity in Sickle CellDisease, Blood 47/4 (1976).12 Abraham D.J., Gazze D.M, Kennedy P.E., Mokotoff M., Desing, Synthesis, and Testing of Potential Antisickling Agents.5. Disubstituted Benzoic Acids Designed for the Donor Site and Proline Salicylates for the Acceptor Site. J. Med. Chem.27:1549-1559 (1984).13 Instituto de Hematología e Inmunología: Actualidad en Hematología 5/(3 (1981).14 Eaton W.A, Hofrichter J., Hemoglobin S gelation and Sickle Cell Disease, Blood 70:1245-1266 (1987).15 Zaugg R.M., Walder J.A., Klotz I.M., Schiff Base Adducts of Hemoglobin, J. Biol. Chem. 252:8542-8548 (1977).16 Beddell C.R., Kneen G., White R.D., The antisickling activity of a series of aromatic aldehydes, Br. J. Pharmacol., 70(1979).17 Nigen A.M., Manning J.M., Inhibition of erythrocytes sickling in vitro by DL-glycerladehyde, Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 74:367-371 (1977).18 Abraham D.J., Mehanna A.S., Wireko F.C., Whitney J., Thomas R.P., Orringer E.P., Vanillin, a Potential Agent for theTreatment of Sickle Cell Anemia, Blood 77:1334-1341 (1991).19 Abraham D.J., Design, Synthesis, and Testing of Potential Antisickling Agents. 1. Halogenated Benzyloxy and PhenoxyAcids, J. Med. Chem. 25:1015-1017 (1982).20 Abraham D.J., Design, Synthesis, and Testing of Potential Antisickling Agents. 4. Structure-Activity Relationships ofBenzyloxy and Phenoxy Acids, J. Med. Chem. 27:967-978 (1984).21 Merret M., Stammers D.K., White R.D., Wootton R., Kneen G., Characterization of the binding of the anti-sicklingcompound, BW12C, to haemoglobin, Biochem. J. 239:387-392 (1986).22 Abraham D.J., Design, Synthesis, and Testing of Potential Antisickling Agents. 3. Ethacrynic Acid, J. Med. Chem. 27(1984).23 Orringer E.P, Blythe D.S., Whitney J.A., Brockenbrough S., Abraham D.J., Physiologic and Rheologic Effects of theAntisickling Agent Ethacrynic Acid and its N-Butilated Derivative on Normal and Sickle Erythrocytes, Am. J. Hematol.30:39-44 (1992).24 Fatope M.O., Abraham D.J.: Desing, Synthesis, and Testing of Potencial Antisickling Agents. 10. (2,2-Dimethylchroman-6-yl)alkanoic Acids, J. Med. Chem. 30:1973-1977 (1987).25 Abraham D.J., Perutz M.F., Phillips E.V., Physiological and x-ray studies of potential antisickling agents, Proc. Natl.Acad. Sci. 80:324-328 (1993).26 Losada J., Guilart F., Cabal C.A., NMR Relaxation Study of Sickle Cell Disease, Proc. of the XXIV AMPERE CongressMagnetic Resonance and Related Phenomena, Poznañ 1027-1030 (1988).27 Abdala J.C., Alvarez E.D., Fernández A.A., Soler C., Del Toro G., Estudio de la interacción de compuestos carboniloscon Hemoglobinas in vitro. Valoración de su efecto antisickling, Revista Cubana de Química VIII 2:3-10 (1996).28 Abdala J.C., Alvarez E.D., Cabal C.A., Fernández A.A., Soler C., Lores M.A., Del Toro G., Influence of the Vanillin inthe Kinetics of Polmerization of HbS. Proceedings 36th IUPAC Internatinal Congress, Chimia Acta (1997).29 Cabal C.A., Kinetics of Polymerization of HbS by NMR Relaxation: Influence of Vanillin, Med. Phys. XIII (1997).30 Alvarez E.D., Cabal C.A., Fernández A.A., Soler C., Lores M.A., Del Toro G., IE-HPLC and NMR Relaxometrydemonstrate a potential roll for vanillin in Sickle Cell Disease, Avances en Biotecnología Moderna, 4/E6 (1997).

10

31 USP XVIII. The United Stateds Pharmacopoeia (Eighteenth edition). The US Pharmacopeial Convention, Mack PrintingCompany. Easton PA. 18042. (Inc. 1970).32 Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos. Monografía de Fármacos. 5ta. Edición 943-945 (1988).33 AVI Sourcebook and Hanbook Series (Sorce Book of Flavors). A División of Albright and Wilson, Ltd. London,England The AVI Publishing Company, INC. West port, Connecticut. (1981)34 Hagan E.C., Hansen W.H., Fitzhugh O.G., Jenner P.M., Jones W.I., Taylor J.M., Long E.L., Nelson A.A, Brouwer J.B.:Food flavorings and compounds of related structure. II. Subacute and chronic toxicity. Food Cosmet Toxicol 5/141 (1967).35 Nagel R.L., Bookchin R.M., Johnson J., Labie D., Wajcman H., Isaac-Sodeye W.A., Honig G.R., Schiliro G., CrookstonJ.H., Structural bases of the inhibitory effects of hemoglobin F and hemoglobin A2 on the polymerization of hemoglobin S,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:670-672 (1979).

1

PARTICIPACIÓN DE LA NAD(P)H OXIDASA Y LA CICLOOXIGENASA EN LA RESPUESTA

VASODILATADORA DEL ÓXIDO NÍTRICO EN LAS ARTERIAS PULMONARES DE LECHÓN

José Gustavo López-López*, Francisco Pérez-Vizcaíno§, Angel L Cogolludo§, Francisco Zaragozá-Arnáez§,

Manuel Ibarra§. Juan Tamargo§. *Benemérita Universidad Autónoma de Puebla-México. §Instituto de

Farmacología y Toxicología, CSIC-UCM-Madrid.

RESUMEN. El tratamiento de la Hipertensión Pulmonar Persistente Neonatal (HPPN) con oxido nítrico por

vía inhalatoria (NOi) ha mostrado una clara selectividad por el territorio pulmonar (en modelos animales),

sin embargo los estudios clínicos controlados demostraron que la eficacia del tratamiento con NOi era

parcial. Una de las posibles causas de la menor reactividad vascular al NO es el aumento de la inactivación

del NO por los radicales superóxido. En el presente estudio analizamos la influencia del estrés oxidativo

sobre la vasodilatación pulmonar in vitro inducida por el NO exógeno y además determinamos la fuente

enzimática de radicales superóxido (O2-) en este territorio vascular. En las arterias pulmonares de lechones

de 1 y 15 días de edad, el estrés oxidativo basal modula la acción vasodilatadora del NO, siendo la NAD(P)H

oxidasa de la adventicia la principal fuente endógena del anión superóxido. Mientras que en arterias

pulmonares de lechones de 1 día de edad, la ciclooxigenasa (COX) también participa en dicha modulación.

INTRODUCCIÓN. En 1969, Gersony y cols. describieron a la HPPN como un cuadro en recién nacidos a

término, que presentaban una presión arterial pulmonar superior a la sistémica y signos de cortocircuito de

derecha a izquierda, que conducían a un cuadro de hipoxemia grave. La terapia con NOi demostró una clara

selectividad por el territorio pulmonar, sin embargo los estudios clínicos controlados demostraron que la

eficacia de este tratamiento era parcial. Una de las posibles causas de la menor reactividad vascular al NOi es

el aumento de la inactivación del NO por el radical superóxido (O2-).

OBJETIVO. Determinar la fuente endógena que participa en el estrés oxidativo y su influencia sobre la

vasodilatación inducida por el NO en arterias pulmonares de lechón.

MATERIAL Y MÉTODOS. Se utilizaron anillos de arterias pulmonares procedentes de lechones de raza

híbrida Landrace-Largewhite de 1 día y de 2 semanas de edad. Al final del periodo de estabilización se añadió

al baño de órganos un análogo del Tromboxanoa A2 (TXA2) el U46619 (10-7 M). El aumento de tensión

alcanzaba valores estables al cabo de 20 minutos y, posteriormente, se añadía su correspondiente vehículo (o

el pretratamiento). Al cabo de unos 15 minutos se adicionaban volúmenes crecientes de solución saturada de

NO, que equivalían a concentraciones crecientes del mismo (2 x 10-10 - 2 x 10-7 M). Para la expresión de la

COX se utilizó la técnica de Western blot. Los resultados experimentales y controles se contrastaron

comparando las medias mediante el análisis de varianza (ANOVA) de 1 vía seguido del test de Newman-

Keuls, considerando estadísticamente significativas aquellas diferencias en las que la P fue menor de 0.05.

RESULTADOS. La adición de concentraciones crecientes de NO producía una respuesta vasodilatadora

concentración-dependiente (pIC30 = 7.23 ± 0.03, 1 día de edad y 7.56 ± 0.06, 2 semanas). El pretratamiento

2

con la superóxido dismutasa (SOD) desplazaba la curva de relajación del NO hacia la izquierda tanto en

arterias de animales de 1 día (pIC30=7.67±0.1) como de 2 semanas de edad (pIC30=8.62±0.16). El bloqueo de

la SOD tras la administración del DETCA producía una inhibición significativa del efecto relajante del NO en

las arterias pulmonares de lechones de 1 día (pIC30 = 6.05 ± 0.1) y de 2 semanas de edad (pIC30=6.66±0.3).

El Inhibidor de la NAD(P)H oxidasa (DPI) redujo de forma significativa el valor del pIC30 tanto en las

arterias pulmonares de los lechones de 1 día (pIC30 = 7.5 ± 0.05), como en las obtenidas de los animales de 2

semanas de edad (pIC30 = 8.13 ± 0.03). En las arterias pulmonares procedentes de los lechones de 1 día de

edad, la indometacina potenciaba el efecto relajante del NO de manera significativa (pIC30 = 7.51 ± 0.02). Sin

embargo, el pretratamiento con indometacina no modificaba la respuesta vasodilatadora del NO en arterias

pulmonares procedentes de lechones de 2 semanas de edad.

DISCUSIÓN. Papel del estrés oxidativo. Se ha descrito que algunos modelos de hipertensión pulmonar

(Steinhorn y cols., 2001) están asociados a un aumento en los O2-. Por esta razón decidimos estudiar en

nuestras condiciones experimentales el efecto del estrés oxidativo sobre la respuesta vasodilatadora del NO en

arterias pulmonares. Para ello, utilizamos diversas herramientas farmacológicas que sabemos que modifican

el status del estrés oxidativo: la SOD (transforma el O2- en H2O2), y DETCA (inhibidor de la SOD) (Wang y

cols., 1998). En las arterias pulmonares de animales de ambas edades, observamos un aumento en la potencia

del NO con el pretratamiento con la SOD, mientras que con el DETCA encontramos un efecto contrario.

Por todo lo anterior, proponermos que el efecto vasodilatador del NO está modulado por el nivel de los O2-

generado endógenamente por las arterias pulmonares.

Figura 1. Efecto relajante del NO en las arteriaspulmonares sin endotelio de los lechones de 1 día yde 2 semanas de edad, pretratadas con indometacina(10 -5 M). Los resultados se expresan como lamedia ±e.e.m. de 6-14 experimentos. *p<0.05 y**p<0.01 arterias control vs arterias tratadas conindometacina (animales de 1 día).

Figura 2. Efecto relajante del NO en arterias pulmonares de lechón sin endotelio de 2 semanas de edad en presencia de DPI (10-5 M), L-NAME (10-4 M), Indometacina (10-5) M), Oxipurinol (10-7 M) o Rotenona (5x10-5 M), SKF525A (10-5M) AA861 (10-5M). Los resultados se expresan como la media ± e.e.m. de 5-12 experimentos. **p<0.01 vs control.

-10 -9 -8 -7

Log [NO]

0

25

50

75

100

**

****

**

DPIL-NAMEOxipurinolRotenonaSKF525A

Control

AA861

Rel

aja

ció

n (

%)

-10 -9 -8 -7

Log [NO] (M)

0

20

40

60

Rel

aja

ció

n (

%)

*

**

**

Control (2 semanas)

Control (1día)

Indometacina (2 semanas)

Indometacina (1día)

3

Fuente del O2- en el tejido. Los principales sistemas enzimáticos generadores de los O2

- son: la NAD(P)H

oxidasa, la NOS, la ciclooxigenasa, la lipoxigenasa, la citocromo P450 oxidasa, la xantina oxidasa y la cadena

mitocondrial de transporte electrónico y para estudiar la influencia de estos sistemas enzimáticos, se han

utilizado los respectivos inhibidores (el DPI, el L-NAME, la indometacina, el AA861, el SKF 525A, el

oxipurinol y la rotenona respectivamente). En arterias de animales de 1 día y 2 semanas de edad, el DPI

potenció la relajación inducida por el NO, sugiriendo que esta respuesta producida por el DPI es debido a su

efecto inhibidor sobre la NAD(P)H oxidasa. Por tanto, proponemos que la NAD(P)H oxidasa de la membrana

es una fuente importante de producción del O2- en arterias pulmonares de lechón, tal y como se ha descrito en

otros vasos (Wang y cols., 1998). Sin embargo, en presencia de indometacina, las curvas concentración-

respuesta a NO de preparaciones de animales de 1 día de edad se desplazaron hacia la izquierda,

desapareciendo las diferencias en la respuesta a NO entre las preparaciones de animales 1 día o de 2 semanas

de edad; este resultado sugiere que estas diferencias podrían ser secundarias a cambios en la actividad de la

COX. Estos datos concuerdan con la mayor expresión de la COX en animales de 1 día con respecto con las

preparaciones de 2 semanas de edad. El mecanismo por el que un aumento de la actividad de la COX inhibe la

respuesta al NO es desconocido. Sin embargo, podríamos especular que en las arterias pulmonares de

animales de 1 día de edad, otra fuente de producción del O2- (diferente a la NAD(P)H oxidasa) sería la COX.

También estos resultados indicarían que la menor potencia del NO en arterias pulmonares procedentes de

animales de 1 día con respecto a la de las 2 semanas de edad, estaría relacionada con el estrés oxidativo

inducido por la COX.

CONCLUSIONES: En las arterias pulmonares de lechones de 1 y 15 días de edad, el estrés oxidativo basal o

el estimulado exógenamente, modula la acción vasodilatadora del NO. Nuestros resultados demuestran que la

NAD(P)H oxidasa es la principal fuente endógena del anión superóxido y que la vasodilatación inducida por

el NO aumenta con la edad postnatal. Sin embargo, el aumento de la respuesta al NO desapareció en

presencia de indometacina, sugiriendo un aumento en la actividad de la COX en los primeros momentos de

vida postnatal.

BIBLIOGRAFÍA.

Gersony W., Duc G. y Sinclair J. (1969) Circulation 1969; 30: 87-94.

Steinhorn R., Russel J., Lakshminrusimha S., Gugino S., Black S. y Fineman J. (2001) Am J Physiol. 280:

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Wang H., Pagano J., Du Y., Cayatte J., Quinn T., Brecher P. y Cohen A. (1998) Circ Res. 82: 810-818.

EVALUACIÓN FARMACOLÓGICA DE LOS EFECTOS DEL 1-O-DODECILGLICEROL

SINTÉTICO EN UN MODELO DE ANGIOGÉNESIS INFLAMATORIA.

Hélade Sotomayor Pérez, Beatriz González, Marisel Negret, Theudis Mosquera, José Luis León,Francisco Merchán, Miguel Bilbao, Yolanda Valdés.Instituto de Farmacia y Alimentos (IFAL). Universidad de La Habana. Ave. 23 No. 21425 e/ 214 y 222.

La Coronela, Lisa..

RESUMEN.

Los éteres lipídicos son modificadores de las respuestas biológicas. Entre los efectos que se les han

descritos a estos compuestos se encuentra la inhibición de la angiogénesis, observada en diferentes

modelos experimentales. Los 1-O-Alquilgliceroles, análogos de esta familia, conservan varias de sus

actividades farmacológicas. En este trabajo se evaluaron los efectos del 1-O-Dodecilglicerol (C12) en el

modelo de angiogénesis inflamatoria del granuloma inducido por adyuvantes. El C12 disminuyó el peso

del granuloma e inhibió la neovascularización asociada a éste, de forma similar a la hidrocortisona,

reconocido antinflamatorio y antiangiogénico.

INTRODUCCIÓN.

La angiogénesis o neovascularización es el proceso de formación, crecimiento y desarrollo de nuevos

vasos sanguíneos a partir de otros pre-existentes. Ocurre en determinadas condiciones fisiológicas y en

muchos estados fisiopatológicos, designados como enfermedades angiogénicas, entre los que se

encuentran el desarrollo de los tumores sólidos y sus metástasis, la retinopatía diabética y diversas

afectaciones de base inflamatoria como la artritis reumatoidea y la psoriasis1. En el tratamiento de las

enfermedades angiogénicas, reviste gran importancia la inhibición farmacológica de la angiogénesis. Los

éteres lipídicos (E.L.) constituyen modificadores de las respuestas biológicas y poseen diferentes efectos

farmacológicos. Entre los mecanismos de acción que han sido propuestos para éstos se encuentra la

inhibición de la angiogénesis. De ellos, la Edelfosina y el S-fosfonato han mostrado efectos

antiangiogénicos en diferentes modelos experimentales in vitro e in vivo. Los 1-O-Alquilgliceroles

(AQG) son análogos de esta familia de compuestos ya que conservan el grupo 1-O-Alquilo de cadena

larga. En el presente trabajo nos propusimos estudiar los efectos del AQG 1-O-Dodecilglicerol (C12) en

un modelo de angiogénesis inflamatoria.

MATERIALES Y MÉTODOS.

Material Químico. El C12 fue obtenido en el IFAL mediante una síntesis de Williamson. Su pureza

resultó mayor de un 90%.

Preparación de las muestras. El C12 fue disuelto en solución hidroalcohólica al 10 %.

Animales de Experimentación. Se emplearon ratas Wistar macho, entre 200 y 270 g, del Centro

Nacional de Producción de Animales de Laboratorio, mantenidas en cajas adecuadas con agua y comida

ad libitum y temperatura e iluminación óptimas.

Angiogénesis mediante el modelo del granuloma inducido por adyuvantes. Se empleó la técnica de

Kobayashi et al; 19982, modificada. A los animales anestesiados con éter dietílico se les creó una bolsa de

aire subcutánea por inyección de 3 ml de aire en la región dorsal. En la bolsa de aire, se inyectaron los

adyuvantes Montanide (0.8 ml) y aceite de croton (0.1 %). Pasados 6 días, se sacrificaron los animales

por inyección en la vena de la cola de 1 ml de solución del colorante rojo carmín, conteniendo 5 % de

gelatina blanca, que se mantuvo a 40ºC en un baño termostatado (Ultraterm 6000383). Los animales

muertos fueron sometidos por 20 minutos a temperaturas por debajo de 4ºC. Se extrajo el granuloma y se

lavó con agua destilada, antes de pesarlo en la balanza analítica. El contenido de carmín en el tejido

granulomatoso se tomó como indicativo de la angiogénesis lograda. Con el propósito de medir la cantidad

de colorante en los vasos formados en el tejido del granuloma, se cortó éste y se solubilizó con 4 ml de

NaOH a 3 N. Después se añadieron 2 ml de HCl al 37 %, dejándolo reposar 15 minutos. A continuación

se centrífugo (Sigma 2K15, Alemania) durante 10 minutos a 3000 rpm, seguidamente se filtró el

sobrenadante y se midió la densidad óptica a 490 nm en un espectrofotómetro (Ultrospec Plus

Spectrophotometer, Pharmacia LKB).

Evaluación de los efectos del C12 en el modelo de granuloma inducido por adyuvantes. Los animales

se distribuyeron al azar en 6 grupos experimentales. A 5 grupos se les aplicó tratamiento 2 horas más

tarde de habérseles inducido el granuloma y durante 5 días, mientras que el sexto grupo se mantuvo como

control al que se le administró el vehículo. Los tratamientos consistieron en inocular por vía i.p el C12 a 5,

10, 20 y 30 mg/kg de peso y al grupo restante como control positivo, hidrocortisona a 10 mg/kg por igual

vía. La evaluación de los efectos del C12 se realizó mediante el peso del granuloma y el contenido de

carmín en el mismo.

Visualización de la vasculatura asociada a la formación del granuloma. Se extrajo la piel que recubría

la bolsa de aire, la que fue cortada, estirada cuidadosamente y fotografiada con Cámara Epson PC. Para el

procesamiento de las imágenes se empleó el Programa Adobe PhotoShop 5.0, para WINDOWS. Se

empleó además un control sin granuloma.

Procesamiento estadístico. Se empleó el paquete de programas STATISTICA Versión 5.0 (StatSoft Inc.,

1995) para WINDOWS. Posterior a la estadística descriptiva, se realizó un test de Levene de

Homogeneidad de Varianza y la prueba de comparación múltiple de medias de Duncan.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN.

Angiogénesis mediante el modelo del granuloma inducido por adyuvantes. Transcurridos 6 días de lainyección de los adyuvantes, se divisó un granuloma bien establecido, en todos los gruposexperimentales. En el control, el peso promedio del granuloma fue de 4.97 ± 0.65 g. Resultadossimilares fueron informados al emplear el adyuvante completo de Freund2 e, inclusive, el propioMontanide y aceite de croton3. La neovascularización asociada fue medida por espectrofotometría entérminos del contenido de carmín en los tejidos del granuloma, lo cual es un índice de la formación denuevos vasos sanguíneos2. En el grupo control, es decir con granuloma y sin tratar, el contenido decarmín fue de 0.103 ± 0.029 mg. La efectividad del modelo experimental para permitir la evaluación delos efectos antiangiogénicos de un compuesto, fue comprobada al evaluar la acción de lahidrocortisona, reconocido antinflamatorio esteroidal que exhibe marcados efectos antiangiogénicos2.Ésta, a 10 mg/kg, redujo significativamente el peso del granuloma y el contenido de carmín en elmismo; lo que permite corroborar que el modelo del granuloma inducido por Montanide y aceite decroton, es adecuado para esta finalidad.Evaluación de los efectos sobre el peso del granuloma y el contenido de carmín en el modelo delgranuloma inducido por adyuvantes. En la tabla 1 se resumen los resultados obtenidos al evaluar losefectos del C12 sobre la angiogénesis inflamatoria.

Grupo

Peso del Granuloma. (g)

(x±SD)

Contenido de carmín.

(mg) (x±SD)

Control 4.97 ± 0.65 (a) 0.103 ± 0.029 (a)

Hidrocort. (10 mg/kg) 2.95 ± 0.16 (b) 0.049 ± 0.010 (b)

C12 (5 mg/kg) 2.85 ± 0.23 (b) 0.047 ± 0.007 (b)

C12 (10 mg/kg) 2.29 ± 0.27 (c) 0.037 ± 0.005 (b)

C12 (20 mg/kg) 1.34 ± 0.32 (d) 0.019 ± 0.005 (c)

C12 (30 mg/kg) 0.97 ± 0.10 (d) 0.011 ± 0.002 (c)

Tabla 1. Peso del Granuloma y Contenido de Carmín en los grupos experimentales: Control con

granuloma sin tratar, Hidrocortisona a 10 mg/kg como control positivo y C12 a 5, 10, 20 y 30 mg/kg,

respectivamente (n=6). En los parámetros Peso del Granuloma y Contenido de Carmín, grupos con una

letra en común no tienen diferencias significativas ( p>0.05).

Todos los grupos experimentales tienen diferencias estadísticamente significativas con respecto al control

con granuloma sin tratar, para ambos parámetros; lo que demuestra que el C12 inhibió la formación de

tejido granulomatoso en el modelo empleado y la neovascularización asociada a éste, expresadas mediante

el peso del granuloma y el contenido de carmín, respectivamente.

Esto constituye una evidencia experimental de los efectos antinflamatorios y antiangiogénicos de este

compuesto, resultados que coinciden con lo informado en la literatura sobre la acción antinflamatoria y

antiangiogénica de otros E.L. en diferentes modelos experimentales in vitro e in vivo. A partir de 1997 se

realizaron varios experimentos con AQG de origen natural que evidenciaron sus efectos antinflamatorios4

ya que inhibieron la liberación de AA en cultivos de macrófagos hiperactivados4. Además, se obtuvo un

efecto similar al de la indometacina en cuanto a la inhibición de la respuesta inflamatoria inducida por

carragenina5. Por otra parte, también se observó un efecto antinflamatorio de éstos en el modelo de

inflamación crónica del granuloma inducido por pellet de algodón4. Con respecto a sus efectos

antiangiogénicos, ha sido demostrado que la edelfosina inhibe la formación de túbulos en las células de la

microvasculatura endotelial humana (HMEC-1), exhibiendo así actividad antiangiogénica in vitro, aunque

los mecanismos exactos por los cuales este compuesto ejerce estos efectos son desconocidos. Otro éter

lipídico, el s-fosfonato, constituye un potente inhibidor de la angiogénesis, lo que ha sido demostrado in

vivo empleando el modelo de la CAM del embrión de pollo6.

Visualización de la vasculatura. En la figura 1 se muestra la vasculatura de la piel de la bolsa de aire

asociada al granuloma. La inducción de la neovascularización se demostró al comparar la piel de los

animales del grupo control con granuloma sin tratar (B) con la de los animales del control sin granuloma

(A). Como se observa, el C12 (30 mg/kg) provocó una reducción en la vasculatura, lo cual se evidenció al

comparar la piel de los animales tratados con este AQG (C) con la de los animales del control con

granuloma sin tratar (B).

Figura 1. Vasculatura de la piel de la bolsa de aire asociada al granuloma. La piel fue cortada, estirada

y fotografiada con Cámara Digital Epson PC. A) Control sin granuloma, B) control con granuloma sin

tratar y C) grupo tratado con C12 a 30 mg/kg.

A B C

Entre los mecanismos implicados en los efectos de los AQG, se encuentra la inhibición de la actividad

Fosfolipasa A25 pues, al bloquear la liberación del ácido araquidónico disminuye la generación de

eicosanoides, muchos de los cuáles son potentes mediadores de la inflamación. Ésta también podrían

justificar, al menos parcialmente, sus efectos antiangiogénicos; ya que de ellos, fundamentalmente las

prostaglandinas, inducen la expresión del factor de crecimiento del endotelio vascular, estimulando así la

angiogénesis.

BIBLIOGRAFÍA.1- Folkman, J (1995): The New England Journal Medicine; 333(26):1157-1763.2- Kobayashi, S; Inaba, K; Kimura, I; Kimura, M (1998): Biol.Pharm. Bull. 21(4): 346-349.3- Sotomayor, H (2001): Revista Cubana de Química. Vol. XIII, No. 2, 2001.4- Valdés, Y (1997): Tesis de Doctorado en Ciencias Biológicas. Facultad de Biología.

Universidad de La Habana.5- Jackson, JK; Burt, HM; Oktaba, AM; Hunter, W; et. al., (1998): Cancer Chemother

Pharmacol 41: 326-332.6- Bilbao, M (2001): Tesis en opción al título de Master en Ciencias. IFAL, Universidad de La

Habana.

EFECTOS DEL 1-O-HEXADECILGLICEROL Y EL 1-O-OCTADECILGLICEROL EN UN MODELO DE

ANGIOGÉNESIS INFLAMATORIA.

Hélade Sotomayor Pérez, Fara Amelia Primelles, José Luis León, Francisco Merchán, Miguel Bilbao.

Instituto de Farmacia y Alimentos (IFAL). Universidad de La Habana. Ave. 23 No. 21425 e/ 214 y 222. La Coronela, Lisa..

RESUMEN.

Los éteres lipídicos introducen un concepto terapéutico relativamente nuevo en el tratamiento de múltiples afectaciones humanas.

Tienen efectos antitumorales directos, antinvasivos, adyuvantes de poliquimioterapia y antinflamatorios, entre otros. Una

multiplicidad de mecanismos de acción ha sido propuesta para éstos. Uno de ellos es la inhibición de la angiogénesis, observada en

diferentes modelos experimentales. Los 1-O-Alquilgliceroles (AQG) son análogos de esta familia de compuestos. En este trabajo

se evaluaron los efectos de los AQG, 1-O-Hexadecilglicerol (C16) y 1-O-Octadecilglicerol (C18), en el modelo de angiogénesis

inflamatoria del granuloma inducido por adyuvantes. Estos AQG disminuyeron el peso del granuloma e inhibieron la

neovascularización asociada a éste, de forma similar a la hidrocortisona, compuesto de reconocida acción antinflamatoria y

antiangiogénica. Estos resultados, constituyen una importante pauta para profundizar en los efectos de los AQG y para avanzar en

la comprensión de los mecanismos de acción que median éstos.

INTRODUCCIÓN.

La mayoría de los tejidos necesitan vasos sanguíneos para desarrollarse y sobrevivir. La angiogénesis o neovascularización es el

proceso de formación, crecimiento y desarrollo de nuevos vasos sanguíneos a partir de otros pre-existentes. Ocurre en

determinadas condiciones fisiológicas y en muchos estados fisiopatológicos, designados como enfermedades angiogénicas, entre

los que se encuentran el desarrollo de los tumores sólidos y sus metástasis, la retinopatía diabética y diversas afectaciones de base

inflamatoria como la artritis reumatoidea y la psoriasis1. Una propuesta actual para la terapéutica de las enfermedades

angiogénicas, incluyendo las de componente inflamatorio, es la inhibición farmacológica de la angiogénesis. En el caso de las

enfermedades de base inflamatoria, casi siempre están acompañadas de una intensa neovascularización2; la que se desarrolla para

posibilitar varios de los eventos del proceso inflamatorio crónico. Los éteres lipídicos (E.L.) introducen un nuevo concepto

terapéutico en el tratamiento de múltiples afectaciones humanas. Entre los mecanismos de acción que han sido propuestos para

éstos, se encuentra la inhibición de la angiogénesis. Los E.L. Edelfosina y S-fosfonato han mostrado efectos antiangiogénicos en

diferentes modelos experimentales in vitro e in vivo. Los 1-O-Alquilgliceroles (AQG) son análogos de esta familia de compuestos

ya que conservan el grupo 1-O-Alquilo de cadena larga al que se le atribuyen los efectos farmacológicos que poseen. Tomando en

consideración el importante papel de la angiogénesis en distintas patologías, entre éstas, las que tienen un componente

inflamatorio, y, por otra parte, el hallazgo reciente de efectos del 1-O-Dodecilglicerol (C12) en la inhibición de la angiogénesis

inflamatoria3; nos propusimos como objetivo estudiar los efectos de los AQG, 1-O-Hexadecilglicerol (C16) y 1-O-Octadecilglicerol

(C18) en un modelo de angiogénesis inflamatoria.

MATERIALES Y MÉTODOS.

Material Químico. El C16 y el C18, fueron obtenidos en el IFAL mediante una síntesis de Williamson. La pureza de los

compuestos resultó mayor de un 90%.

Preparación de las muestras. Los AQG fueron disueltos en solución hidroalcohólica al 10 %, en las cantidades apropiadas para

conformar las dosis empleadas, a saber, 1, 10 y 20 y 30 mg/kg. Estas se encuentran dentro del rango dosis no tóxicas para ambos

compuestos.

Animales de Experimentación. Ratas Wistar macho, entre 240 y 270 g, del Centro Nacional de Producción de Animales de

Laboratorio, fueron mantenidos en cajas adecuadas con agua y comida ad libitum y temperatura e iluminación óptimas.

Angiogénesis mediante el modelo del granuloma inducido por adyuvantes. Se empleó la técnica de Kobayashi et al; 19982,

modificada. A los animales anestesiados con éter dietílico se les creó una bolsa de aire subcutánea, por inyección de 3 ml de aire en

la región dorsal. Seguidamente, en la bolsa de aire, se inyectaron los adyuvantes Montanide (0,8 ml) y aceite de croton (0.1 %).

Pasados 5 días, se sacrificaron los animales (anestesiados con éter) por inyección en la vena de la cola de 1 ml de solución del

colorante rojo carmín, conteniendo 5 % de gelatina blanca, que se mantuvo a 40ºC en un baño termostatado (Ultraterm 6000383).

Los animales muertos fueron sometidos por 20 minutos a temperaturas por debajo de 4ºC. Se extrajo el granuloma y se lavó con

agua destilada, antes de pesarlo en la balanza analítica. El contenido de carmín en el tejido granulomatoso se tomó como indicativo

de la angiogénesis lograda. Con el propósito de medir la cantidad de colorante en los vasos formados en el tejido del granuloma, se

cortó éste y se solubilizó con 4 ml de NaOH a 3 N. Después se añadieron 2 ml de HCl al 37 %, dejándolo reposar 15 minutos. A

continuación se centrífugo (Sigma 2K15, Alemania) durante 10 minutos a 3000 rpm, seguidamente se filtró el sobrenadante y se

midió la densidad óptica a 490 nm en un espectrofotómetro (Ultrospec Plus Spectrophotometer, Pharmacia LKB).

Evaluación de los efectos de los AQG C16 y C18 en el modelo de granuloma inducido por adyuvantes. Los animales se

distribuyeron al azar en 5 grupos experimentales. A 4 grupos se les aplicó tratamiento 2 horas más tarde de habérseles inducido el

granuloma y durante 4 días, mientras que el quinto grupo se mantuvo como control al que se le administró el vehículo (solución

hidroalcohólica al 10%). Los tratamientos consistieron en inocular por vía i.p el C16 o el C18 a 1,10, 20 y 30 mg/kg de peso y al

grupo restante como control positivo, hidrocortisona a 10 mg/kg por igual vía. La evaluación de los efectos de los AQG en este

modelo se realizó mediante los parámetros peso del granuloma y contenido de carmín en el mismo según fue descrito.

Procesamiento estadístico de los resultados. Se empleó el paquete de programas STATISTICA Versión 5.0 (StatSoft Inc., 1995)

para WINDOWS. Posterior a la estadística descriptiva, se realizó un test de Levene de Homogeneidad de Varianza y después la

prueba de comparación múltiple de medias de Duncan (p<0.05).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN.

Angiogénesis mediante el modelo del granuloma inducido por adyuvantes. Transcurridos 5 días de la inyección de los

adyuvantes, se divisó un granuloma bien establecido, en todos los grupos experimentales. En el control, el peso promedio del

granuloma fue de 4.89 ± 0.74 g. Resultados similares fueron informados al emplear el adyuvante completo de Freund2 e, inclusive,

el propio Montanide y aceite de croton3. La neovascularización asociada fue medida por espectrofotometría en términos del

contenido de carmín en los tejidos del granuloma, lo cual es un índice de la formación de nuevos vasos sanguíneos2. En el grupo

control, es decir con granuloma y sin tratar, el contenido de carmín fue de 0.104 ± 0.034 mg. La efectividad del modelo

experimental para permitir la evaluación de los efectos antiangiogénicos de un compuesto, fue comprobada al evaluar la acción de

la hidrocortisona, reconocido antinflamatorio esteroidal que exhibe marcados efectos antiangiogénicos2. Ésta, a 10 mg/kg, redujo

significativamente el peso del granuloma y el contenido de carmín en el mismo; lo que permite corroborar que el modelo del

granuloma inducido por Montanide y aceite de croton, es adecuado para esta finalidad.

Evaluación de los efectos de los AQG C16 y C18 en el modelo del granuloma inducido por adyuvantes. En la tabla 1 se

resumen los resultados obtenidos al evaluar los efectos del C16 y C18 sobre la angiogénesis inflamatoria en el modelo antes referido.

Todos los grupos difieren del control, lo que da cuenta de que ambos productos exhiben efectos inhibitorios del peso del granuloma

y del contenido de carmín en los tejidos del mismo, en este modelo. Existe una tendencia a que la reducción del peso de granuloma

Grupo

Peso del Granuloma. (g)(x±SD)

Contenido de carmín. (x±SD)

Control 4.89 ± 0.74 a 0.104 ± 0.03 a Hidrocort. (10 mg/kg) 2.40 ± 0.82 bc 0.054 ± 0.01 bc

C16 (1 mg/kg) 2.96 ± 0.39 b 0.059 ± 0.01 b C16 (10 mg/kg) 2.42 ± 0.26 bc 0.054 ± 0.01 bc C16 (20 mg/kg) 1.88 ± 0.57 ce 0.047 ± 0.01 bc C16 (30 mg/kg) 1.10 ± 0.34 d 0.036 ± 0.01 c C18 (1 mg/kg) 2.98 ± 0.70 b 0.061 ± 0.02 b C18 (10 mg/kg) 2.57 ± 0.34 bc 0.055 ± 0.02 bc C18 (20 mg/kg) 2.33 ± 0.32 bc 0.055 ± 0.01 bc C18 (30 mg/kg) 1.32 ± 0.52 de 0.038 ± 0.02 c

Tabla 1. Peso del Granuloma y Contenido de Carmín en los grupos experimentales, a saber, Control con granuloma sin tratar,

C16 y C18 a 1, 10, 20 y 30 mg/kg, respectivamente e Hidrocortisona a 10 mg/kg como control positivo. (n=6). Grupos con al menos

una letra en común no tienen diferencias significativas. Nivel de significación: p<0.05.

se acentúe con el incremento de la dosis de ambos productos, no obstante, este efecto tienen un comportamiento sólo parcialmente

dependiente de la dosis, aunque es más acentuado en el caso del C16. Esta tendencia también se observa, aunque ligera, en la

reducción del contenido de carmín en los tejidos del granuloma con el incremento de la dosis de ambos AQG, no obstante, estos

efectos en la reducción del contenido de carmín como medida indirecta de la neovascularización asociada al granuloma en el

modelo empleado, tienen un comportamiento esencialmente independiente de la dosis para ambos, en el rango utilizado. Es

oportuno destacar, que los resultados obtenidos en cuanto al peso del granuloma, para ambos AQG a las diferentes dosis, inclusive a

la menor, no tuvieron diferencias estadísticamente significativas con los resultados correspondientes al grupo tratado con

hidrocortisona; a excepción de la dosis de 30 mg/kg, a la cual, tanto el C16 como el C18 exhibieron un mayor efecto. Esto es de gran

importancia ya que la hidrocortisona es un fármaco de elección en la clínica de múltiples patologías de naturaleza inflamatoria.

Los resultados obtenidos coinciden con la escasa información en la literatura sobre la acción antinflamatoria y antiangiogénica de

otros E.L. en diferentes modelos. La edelfosina inhibe la formación de túbulos en las células de la microvasculatura endotelial

humana, lo cual es muestra de actividad antiangiogénica in vitro. El s-fosfonato, constituye un potente inhibidor de la angiogénesis,

lo que ha sido demostrado en el modelo de la membrana corioalantoica del embrión de pollo observándose que una acumulación de

s-fosfonato en ésta conduce a una lisis celular no específica, aunque existen evidencias de la inducción de apoptosis en las células

endoteliales por éste4. Varios pueden ser los mecanismos implicados en los efectos observados de los AQG. Entre ellos se

encuentra la inhibición de la actividad Fosfolipasa A25 pues, al bloquear la liberación del ácido araquidónico disminuye la

generación de eicosanoides, muchos de los cuáles son potentes mediadores de la inflamación. Ésta también podrían justificar, al

menos parcialmente, sus efectos antiangiogénicos; ya que de ellos, fundamentalmente las prostaglandinas, inducen la expresión

del factor de crecimiento del endotelio vascular, estimulando así la angiogénesis. Los resultados obtenidos son de gran importancia

ya que permiten, por una parte, corroborar los efectos antinflamatorios de C16 y el C18, en tanto que por otra, constituyen la

primera evidencia experimental de los efectos antiangiogénicos de estos AQG.

BIBLIOGRAFÍA.1- Folkman, J (1995): The New England Journal Medicine; 333(26):1157-1763.2- Kobayashi, S; Inaba, K; Kimura, I; Kimura, M (1998): Biol.Pharm. Bull. 21(4): 346-349.3- Sotomayor, H (2001): Revista Cubana de Química. Vol. XIII, No. 2, 2001.4- Jackson, JK; Burt, HM; Oktaba, AM; Hunter, W; et. al., (1998): Cancer Chemother Pharmacol 41: 326-332.5- Bilbao, M (2001): Tesis en opción al título de Master en Ciencias. Universidad de La Habana.

Niveles plasmáticos de Ibuprofeno y la administración combinada con cafeína

José Raúl Medina López 1, 2 Helgi Jung Cook 2 Marcela Hurtado y de la Peña 1 y Francisco Javier López

Muñoz 3

1 Dpto. de Sistemas Biológicos, Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco 2 Fac. de Química,

UNAM y 3 Dpto. de Farmacobiología, CINVESTAV-IPN.

Resumen: En trabajo anexo de nuestro grupo, se establece que la administración simultánea de Ibuprofeno

(IBU) con cafeína (CAF) produce sinergismo antinociceptivo, pero no se sabe si este efecto puede ser

explicado por cambios farmacocinéticos. En este trabajo se determinaron los niveles plasmáticos de IBU en

ratas Wistar, después de administrar a dos grupos (n=6) una dosis de 17.8 mg/kg de IBU (vía oral), uno de

ellos combinado CAF a 17.8 mg/kg. El IBU se cuantificó por cromatografía de líquidos de alta resolución.

Los experimentos se llevaron a cabo en ratas macho de 180 a 200 g de peso. A tiempos previamente

establecidos se tomaron muestras de 0.2 mL de sangre de la arteria caudal mediante un catéter colocado

previa ligera anestesia con éter después de administrar el o la combinación de compuestos. El plasma se

congeló a -20°C hasta el momento del análisis. Se calculó la Cmáx, el Tmáx y el área bajo la curva (ABC). Los

datos se ajustaron a un modelo abierto de dos compartimentos mediante el programa WinNonlin V02.0A. El

ABC (µgh/mL) del grupo que recibió IBU fue 68.81±10.52 unidades de área (ua) y el que recibió la

combinación IBU+CAF: 66.68±8.65 ua. Un análisis multivariable de medidas repetidas indicó que los

perfiles plasmáticos fueron paralelos (p>0.05). Estos resultados concuerdan con lo reportado por diversos

autores para otros analgésicos y apoyan la teoría de que la potenciación antinociceptiva producida por CAF

no se debe a una interacción farmacocinética, sino probablemente a un conjunto de mecanismos

farmacodinámicos.

Introducción: El Ibuprofeno es un agente no esteroide ampliamente prescrito con propiedades

antiinflamatorias y analgésicas usado principalmente en el tratamiento de la artritis reumatoide y osteoartritis.

Diversos métodos analíticos han sido publicados para la determinación de IBU o sus metabolitos en fluidos

biológicos1. Investigaciones recientes en modelos experimentales de dolor han utilizado combinaciones de

analgésicos-antiinflamatorios con CAF para determinar el efecto farmacológico2. Algunos reportes sugieren

que la potenciación ejercida por la cafeína puede ser atribuida a una interacción farmacocinética3 pero no hay

nada claro por la escasa información farmacocinética de la combinación IBU+CAF. El presente trabajo tiene

como objetivo determinar los niveles plasmáticos de IBU en ratas Wistar al administrarlo solo y combinado

con una dosis de CAF.

Material y métodos: El IBU o la combinación IBU+CAF se administró vía oral suspendido en

carboximetilcelulosa al 0.5% a dos grupos de ratas Wistar macho de 180 a 200 g de peso. Un grupo de seis

ratas recibió la dosis de IBU de 17.8 mg/kg y otro grupo similar una dosis combinada de IBU+CAF 17.8-17.8

mg/kg respectivamente. Se eligió administrar IBU solo y combinado con CAF a esta dosis porque en un

estudio farmacodinámico previo ésta combinación fue una de las que más potenciación mostró3. La

determinación del fármaco se realizó de 0.25 hasta 4 h. después de administrar el compuesto solo o

combinado. Se tomaron muestras de 0.2 mL de sangre de la arteria caudal. Las muestras de plasma se

congelaron a -20°C hasta el momento del análisis por cromatografía de líquidos de alta resolución (CLAR).

Se determinó la Cmáx, el Tmáx y el área bajo la curva (ABC). Además mediante un análisis multivariable de

medidas repetidas se compararon los perfiles plasmáticos. Las concentraciones plasmáticas de IBU fueron

determinadas por un método en CLAR previamente reportado por Shah4 con algunas modificaciones. Antes

de ser utilizado, el método fue validado en los principales parámetros: linearidad, precisión, exactitud,

estabilidad y selectividad. Como estándar interno se utilizó ácido mefenámico en acetonitrilo (40 µg/mL). El

equipo consistió en un cromatógrafo de líquidos Perkin Elmer Series 200 LC equipado con bomba binaria,

inyector manual y detector de UV de longitud de onda variable. La extracción de IBU del plasma se realizó

adicionando a muestras de 0.05 mL un volumen de 0.1 ml de solución de estándar interno. Las muestras

fueron centrifugadas a 5000 rpm durante 15 min. y se inyectaron 20 µL del sobrenadante al sistema

cromatográfico. Los compuestos fueron separados en una columna Symmetry C18 (Waters) eluída con la fase

móvil acetonitrilo:agua:metanol:ácido fosfórico (58:37:5:0.05 v/v) a una velocidad de flujo de 1.8 mL/min y

detección a 196 nm. La integración de los picos se llevó cabo en computadora con el programa PE Nelson-

Turbochrom. Los tiempos de retención fueron 1.8 y 2.4 min. para IBU y ácido mefenámico respectivamente.

Resultados: En todos los parámetros el método cumplió con los criterios de validación. La CAF no interfirió

en la determinación de IBU. En la Fig. 1 se muestran los niveles plasmáticos de IBU (Media±EE) en función

del tiempo de los dos grupos de ratas. Los datos fueron ajustados a un modelo abierto de dos compartimentos.

El análisis multivariable de medidas repetidas indicó que los perfiles plasmáticos son paralelos (p>0.05). En

la Tabla I se registran los principales parámetros farmacocinéticos determinados en cada tratamiento. El ABC

(µgh/mL) calculada para el grupo que recibió IBU fue 68.81±10.52 y del grupo que recibió la combinación

IBU+CAF: 66.68±7.89 En la Fig. 2 se muestra la comparación gráfica del ABC. Estos valores de ABC

representan los niveles plasmáticos globales alcanzados hasta las 4 h que duraron los experimentos.

Discusión: Los resultados en este trabajo permiten afirmar que no hay diferencia estadísticamente

significativa en los niveles plasmáticos de IBU al administrarse solo o combinado con CAF. Esto concuerda

con lo reportado por diversos autores2,5 apoyan la teoría y dan evidencias que la potenciación producida por

CAF no se debe a una interacción farmacocinética que eleva los niveles plasmáticos en este caso de IBU, sino

más bien a un conjunto de mecanismos farmacodinámicos responsables del sinergismo producido por CAF en

la administración combinada con analgésicos no esteroides.

Fig. 1 Niveles plasmáticos de IBU Media±EE n = 6 Fig. 2 ABC de IBU en los diferentes tratamientos

Tabla I Parámetros farmacocinéticos de IBU Media±EE

Parámetro Ibuprofeno Ibuprofeno+cafeínaCmáx (µg/mL) 40.86±8.33 40.62±5.92Tmáx (h) 0.54±0.14 0.58±0.13ABC (µgh/mL) 68.81±10.52 66.68±7.89TMR (h) 1.65±0.08 1.54±0.05

Bibliografía:

1. Martindale, The Extra Pharmacopoeia, Thirtieth edition, The Pharmaceutical Press. USA 1993

2. Díaz-Reval Ma. Irene, Ventura-Martínez Rosa, Hernández-Delgadillo Gloria Patricia, Domínguez-Ramírez

Adriana Miriam y López-Muñoz Francisco Javier. Effect of caffeine on antinociceptive action of ketoprofen

in rats. Arch Med Res 32 (2001) 13-20

3. López-Muñoz Francisco Javier, Medina López Raúl y Jung Cook Helgi. Potentiation of the analgesic effect

of ibuprofen by caffeine in the PIFIR model. Int Cong & Symp Ser 218 Mar (1996) 43-56

4. Shah Anita y Jung Donald. An improved high performance liquid chromatographic assay of ibuprofen in

plasma. J Chromatogr Biomed Appl 344, 408-411 (1985)

5. Flores-Acevedo DM, Flores-Murrieta FJ, Castañeda-Hernández G y López-Muñoz FJ. Potentiation of the

analgesic effect of tolmetin, a potent non-steroidal anti-inflamatory drug by caffeine in the rat. Pharm Sci

(1995) 1: 441

Efecto antinociceptivo de la combinación Ibuprofeno y cafeína en ratas

José Raúl Medina López1, 2 Helgi Jung Cook 2 Marcela Hurtado y de la Peña 1 y Francisco Javier López

Muñoz 3

1 Dpto. de Sistemas Biológicos, Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco 2 Fac. de Química,

UNAM y 3 Dpto. de Farmacobiología, CINVESTAV-IPN.

Resumen: En este trabajo se determinó si la cafeína (CAF) produce efecto de sinergismo antinociceptivo

cuando es administrada simultáneamente con Ibuprofeno (IBU) empleando el modelo Disfunción Inducida

por Dolor (PIFIR por sus siglas en inglés) utilizando ratas Wistar. Los animales recibieron intraarticularmente

0.05 mL de ácido úrico al 30% en la articulación de la pata trasera derecha (rodilla). Inmediatamente después,

se les adhirió a ambas patas traseras un electrodo y luego fueron colocadas en un cilindro de acero inoxidable

de 30 cm de diámetro, que fue rotado a 4 rpm. Cuando los electrodos colocados en las patas de los animales

hicieron contacto con la superficie del cilindro se cerró un circuito, y se registró en una computadora. El

cilindro fue rotado por periodos de dos minutos y se permitió descansar a las ratas por periodos de 15 ó 30

min. Después de la administración del ácido úrico las ratas desarrollaron una progresiva disfunción de la

articulación. Los datos fueron expresados como índice de funcionalidad (IF %), el cual se calculó dividiendo

el tiempo de contacto de la pata derecha lesionada entre el tiempo de contacto de la pata izquierda control.

Cuando el IF % fue 0, los animales recibieron una dosis oral de los compuestos. Un grupo recibió IBU a 17.8

mg/kg y otro IBU+CAF 17.8-17.8 mg/kg respectivamente. El efecto acumulado durante un periodo de 4 h

fue 70.9±39.9 unidades de área (ua) con IBU solo, mientras que combinado con CAF: 214.7±23.8 ua. La

diferencia fue estadísticamente significativa (p<0.01) por lo que se aportaron evidencias de generación de

sinergismo antinociceptivo cuando fue empleada una asociación IBU+CAF.

Introducción: El uso de la cafeína en modelos experimentales de dolor ha sido evaluado por diversos autores.

Este compuesto se añade para mejorar la eficacia analgésica de compuestos antiinflamatorios.1,2 El

Ibuprofeno es un fármaco analgésico-antiinflamatorio utilizado principalmente en clínica para el tratamiento

del dolor moderado o de algunas formas de artritis. La poca información farmacológica sobre la combinación

IBU+CAF es hasta cierta forma controversial por la variabilidad y subjetividad de los modelos utilizados para

evaluar dolor.3,4 Recientemente se ha descrito un modelo de disfunción inducida por dolor en ratas en el cual

se produce inflamación en una articulación por la administración de ácido úrico.5 Los padecimientos por la

acumulación de ácido úrico en el organismo es una situación común en la práctica clínica. El objetivo de este

trabajo es determinar el grado de potenciación de la CAF al administrarse con una dosis de IBU .

Material y métodos: Todos los experimentos se llevaron a cabo en ratas Wistar macho de 180 a 200 g de peso.

Doce horas antes de los experimentos se les privó de alimento y tuvieron libre acceso al agua todo el tiempo.

La intensidad y el efecto del o los compuestos fueron medidos usando el modelo PIFIR reportado por López-

Muñoz4. En este modelo los animales reciben -bajo los efectos de una ligera anestesia con éter- una inyección

intraarticular de 0.05 mL de ácido úrico al 30% en la articulación derecha (rodilla) para inducir nocicepción.

Inmediatamente después se les adhiere a las patas traseras un electrodo. Una vez que se recuperan de la

anestesia los animales son colocados en un cilindro de acero inoxidable de 30 cm de diámetro. El cilindro es

rotado a 4 rpm forzando a las ratas a caminar. La variable a medir es el tiempo de contacto entre cada pata y

el piso del cilindro. Cuando el electrodo colocado en la pata del animal hace contacto con el piso del cilindro

se cierra un circuito y el tiempo en que el circuito permanece cerrado se registra en una computadora. El

cilindro se rota por periodos de dos minutos y se permite descansar a las ratas por periodos de 15 ó 30 min.

Después de la administración del ácido úrico las ratas desarrollan una progresiva disfunción de la articulación,

esto es registrado como una disminución del tiempo de contacto entre la pata derecha y el cilindro. Los datos

son expresados como índice de funcionalidad (IF %) y se calcula dividiendo el tiempo de contacto de la pata

derecha lesionada entre el tiempo de contacto de la pata izquierda control y el resultado multiplicado por 100.

Después de cierto tiempo de administrado el ácido úrico el IF es cero (aproximadamente 2 a 2.5 h). En este

momento los animales reciben una dosis oral del o los analgésicos suspendidos en el vehículo adecuado y los

registros se llevan a cabo durante las 4 h siguientes. El recobro del IF es considerado como expresión del

efecto analgésico del fármaco o de la combinación de fármacos administrados. Con un análisis de varianza se

determina si las diferencias son estadísticamente significativas.

Resultados: En la Fig. 1 se presenta el curso temporal del efecto analgésico producido por la administración

de IBU a 17.8 mg/kg y de la combinación IBU+CAF 17.8-17.8 mg/kg respectivamente. La diferencia fue

estadísticamente significativa. (p<0.01) El Emáx observado se incrementa de 26.5% cuando se administra IBU

a 74.0% cuando se administra IBU+CAF. El Tmáx observado no varía (1 h). El efecto analgésico global hasta

las 4 h que dura el experimento es expresado como área bajo la curva (ABC) calculada por regla trapezoidal.

El ABC (%h) determinada para el grupo de ratas que recibió IBU fue 70.9±39.9 y para el grupo que recibió la

combinación IBU+CAF: 212.7±23.8 En la Fig. 2 se representa gráficamente este cambio.

Discusión: El ABC fue 299 % con la combinación IBU+CAF que con IBU solo. La generación de sinergismo

antinociceptivo es evidente con la administración IBU+CAF pero solo en ciertas combinaciones.6 El uso de

este modelo tiene por objeto reducir la variabilidad en la respuesta producida por los pacientes y evaluar el

dolor sin la subjetividad con que otros protocolos han tratado de medir el dolor. Es posible utilizar

compuestos antiinflamatorios no esteroides o del tipo aspirina o combinaciones incluso con opioides para

evaluar la actividad analgésica.7 Los resultados obtenidos concuerdan con lo reportado por diversos autores,

algunos sugieren que el sinergismo presentado por la administración de CAF en compuestos analgésicos-

antiinflamatorios se debe a un conjunto de mecanismos farmacodinámicos que es necesario dilucidar.1,2,8

Fig. 1 Curso temporal de IBU Media±EE n = 6 Fig. 2 Antinocicepción de IBU e IBU+CAF

Bibliografía:

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Villarreal Julián E. y Flores-Murrieta Francisco J. Characterization of the analgesic effects of paracetamol and

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mechanism of action. Pharmacol Rev 1993;45(1)43-85

Predicción de la actividad antibiótica y posible mecanismo de acción usando la metodología March

iside.

Luis Torresa,b, Humberto Gonzalezb Yaima Guevaraa. §

a Departamento de Farmacia. Universidad Central de las Villas, Santa Clara, 54830, Villa Clara, Cuba.

b Centro de Bioactivos Químicos, Universidad Central de las Villas, Santa Clara, 54830, Villa Clara, Cuba.

E-mail: ltorres@qf.uclv.edu.cu

Resumen

En el trabajo se aplica la aproximación March Inside a la predicción de la actividad antibiótica y posible

mecanismo de acción, con vistas a ello se realizó el cálculo de los descriptores moleculares a 820

compuestos activos e inactivos. Los descriptores calculados fueron usados en el diseño de una serie de

entrenamiento y otra de predicción Con la serie de entrenamiento se desarrolló una función discriminante

para la actividad antibiótica mediante el análisis Discriminante por Regresión Lineal Multivariada

obteniéndose una buena clasificación total de 92.85 %. El modelo fue validado mediante el uso de la serie

de predicción alcanzándose una buena clasificación de un 94 %. Se realizó el análisis discriminante lineal

para obtener un modelo matemático que permita la clasificación en cuatro posibles mecanismos de acción

con un porcentaje de buena clasificación para la serie de entrenamiento de 82.19%, este modelo fue

validado con una serie de predicción externa en la que se obtuvo un 81.44 % de buena clasificación. Se

realizó el cálculo de las contribuciones de enlaces para una serie de moléculas empleadas en la serie de

entrenamiento.

Introduction.

En la actualidad, el enfoque grafo-teorico es una importante alternativa para los metodos de diseño

molecular asistido por computadoras [1]. Los mas usados y conocidos son los llamados indices topologicos

[2]. Estos indices son obtenidos a partir de una representacion grafo-teorica de la molecula, en forma de

invariantes (no depende de la numeracion de los vertices o aristas del grafo molecular) [3]. Estas

invariantes grafo-teoricas constituyen un numero o un conjunto de numeros que describen de forma

cuantitativa la estructura molecular, por lo que pueden ser usados en estudios QSPR y QSAR [2-3].

En la actualidad el diseño de nuevos antibióticos constituye una linea priorizada por el Centro de

Bioactivos Quimicos y una promisoria alternativa en el desarrollo de nuevos fármacos en el tratamientos de

las enfermedades baterianas que afectan al hombre.

2. Materiales y Métodos.

Los datos de los compuestos usados en la serie de entrenamiento y predicción fueron tomados de la

referencia [4, 5]. Los descriptores moleculares calculados con la metodología March Inside. La regresión

lineal múltiple fue realizada con el paquete de programas estadísticos STATISTICA

En este trabajo se ha contado con una amplia data de 629 compuestos que comprenden compuestos activos

e inactivos. Dentro del grupo de los activos encontramos compuestos con actividad antibiótica que pueden

actuar por cuatro mecanismos diferentes. Esta data fue dividida en dos subseries, una conteniendo 333

compuestos activos y otra de 296 inactivos. Se tomaron como variables para caracterizar al fármaco las

probabilidades calculadas por la metodología March inside, teniendo estos cálculos se procedió a realizar

el tratamiento estadístico de la data obteniendo el siguiente modelo.

221.4*647.79

*981.246*905.192*043.43*344.35*866.15*017.0

9

764320

+−+−+−+=

P

PPPPPPY3

N = 629 D2 = 5.33 F = 139.27 = 0.38

Donde Y es la actividad antibiótica y Pi las probabilidades del fármaco calculadas según la metodología

March inside.

Donde λ es la lambda de Wilks’, D2 es la distancia de Mahalanobis y la F es la razón de Fisher.

Para la discriminación de compuestos activos / inactivos estudiados en este trabajo el modelo clasifica

correctamente el 91.89 % de los activos y el 93.92 % de los inactivos en la serie de entrenamiento para una

buena clasificación global del 92.85 %. El porcentaje de falsos activos y falsos inactivos en la serie de

entrenamiento es 6.08 y 8.11 % respectivamente. Los falsos activos son aquellos compuestos inactivos que

el modelo clasifica como activos y los falsos inactivos son los positivos que el modelo clasifica como

inactivos

La estadística indica que nuestro modelo es apropiado porque presenta un porcentaje de 92.85 % de buena

clasificación en la serie de entrenamiento y 94.00 % en la serie de predicción.

El porcentaje de falsos activos e inactivos como se describió anteriormente es el % de compuestos mal

clasificados en cada una de las respectivas series, esto puede estar motivado por diversos factores; uno de

los cuales puede estar asociado con la metodología de cálculo March inside, y como es bien conocido de

los estudios de REA en la molécula de un fármaco se puede encontrar una parte farmacófora y otra

correspondiente a los grupos transportes, los cuales no son esenciales para la actividad pero al estar

presentes en la molécula se tiene en cuenta su influencia sobre el cálculo del descriptor molecular, entonces

puede darse el caso que exista una mayor contribución de los grupos transportes al descriptor que no del

grupo farmacóforo; esto evidentemente puede llevar a clasificar un fármaco inactivo como activo y

viceversa.

Contribución de enlaces a la propiedad.

Una medida de lo que se ha planteado con anterioridad en relación con la contribución de los grupos

transportes y farmacóforos a la actividad lo es el cálculo de la contribución de fragmentos o de enlaces a

la actividad, para lo cual se calculan los descriptores locales y se evalúan posteriormente en el modelo de

clasificación general, de esta forma cada enlace se clasifica como activo o inactivo donde la suma total de

estas contribuciones será la contribución total de la molécula.

- Clasificación según los mecanismos de acción de los antibióticos.

Para llevar a cabo este estudio solo se trabajó con compuestos de actividad antibiótica, los que pueden

actuar según diferentes mecanismos de acción, fueron agrupados en cuatro mecanismos de acción, el

primer grupo corresponde a los compuestos que actúan por inhibición de la síntesis del ácido fólico, el

segundo grupo a los que actúan inhibiendo el DNA, el tercer grupo agrupa a los compuestos que inhiben la

formación de la pared celular y un cuarto grupo que incluye a los compuestos que actúan sobre las

subunidades 50s y 30s del ribosoma; de igual forma que para la obtención del modelo general de

clasificación anteriormente expuesto se emplearon los descriptores moleculares ya calculados inicialmente,

y se realizó posteriormente el análisis discriminante obteniéndose las ecuaciones con las que podemos

evaluar a cada uno de los compuestos y según las probabilidades posterior de clasificación, pero para una

mayor precisión esta evaluación se realiza directamente en el stadistica, o sustituyendo en las ecuaciones

canónicas encontradas y que se reportan a continuación.

310.1*528.31

*825.127*810.55*054.163*360.177*175.51*876.0

9

7643201

−−+−−+−−=

P

PPPPPPy4

255.1*677.239

*283.1038*324.95.9*33.247*109.32*187.17*223.0

9

7643202

−−+−+−−=

P

PPPPPPy 5

153.1*710.93

*234.402*344.361*119.27*532.39*833.7*569.1

9

7643203

−−+−++−−=

P

PPPPPPy

Porcentaje de buena clasificación y compuestos bien clasificados por cada mecanismo de acción y

total.

% Ac Fólico DNA Pcel RibosomaCorrect p=.30000 p=.05000 p=.10000 p=.55000

Ac. Fólico 84.91 90 0 5 11DNA 90.91 0 10 0 1Pcel 81.37 8 1 83 10Ribosoma 79.21 17 0 4 80Total 82.19 115 11 92 102

λ = 0.186 F = 33.71 N = 320

ConclusionesEn el trabajo se propone un modelo matemático que permite la clasificación de los compuestos en activos o

no como antibióticos, así como la clasificación dentro de cuatro posible mecanismos de acción, y la posible

zona farmacófora de la molécula.

6. References

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EFECTOS DEL “STRESS” OXIDATIVO SOBRE LAS PROPIEDADES DE LOS CANALES DE SODIOCARDIACOS Nav 1.5.

Loipa Galán1, Karel Talavera1, Mayppe González1, Merly de Armas1, Eduardo Salinas2, Gerardo Orta2, GuyVassort3 y Julio Alvarez1.1Laboratorio de Electrofisiología, Instituto de Cardiología y Cirugía

Cardiovascular, Apartado de Correos 6152, CP 10600, La Habana, CUBA.

Teléfono: 552646. Email: efisiol@infomed.sld.cu. 2

Laboratorio de Fisiología, Instituto de Fisiología, Universidad Autónoma de

Puebla, MÉXICO.3

U-390 INSERM, Montpellier, FRANCIA.

RESUMEN:

Estudios previos han demostrado la existencia de cambios importantes en la

cinética y/o la selectividad del canal de sodio (Na+

) en cardiomiocitos de

ratas que sobreviven a un infarto agudo del miocardio (PIM). A diferencia de

los cardiomiocitos normales, el canal de Na+

de cardiomiocitos de ratas PIM,

puede conducir Ca2+

en ausencia de Na+

extracelular. Estos cambios, pudieran

estar potencialmente relacionados al “ stress” oxidativo sufrido por las

células cardíacas en el curso del infarto. Con el objetivo de comprobar esta

hipótesis, realizamos estudios en canal de Na+ humano (hH1) clonado y

expresado en oocitos de Xenopus laevis y en el canal de Na+ de cardiomiocitos

de rata normal. En ausencia de Na+

extracelular el canal hH1, en condición

control, no conduce Ca2+

. Para inducir “ stress” oxidativo, los oocitos y los

cardiomiocitos se incubaron durante 3 - 5 min en peróxido de hidrógeno

(H2O2,). Este tipo de “ stress” oxidativo no indujo cambios significativos en

la cinética de la corriente de Na+

con respecto al control. La perfusión con

solución extracelular libre de Na+

, no evidenció conducción de Ca2+

a través

de los canales de Na+

. Estos resultados sugieren que el “ stress” oxidativo,

no provoca cambios en la cinética o la selectividad de los canales de Na+

cardíacos que permitan la conducción de Ca2+

a través del canal en medio

extracelular libre de Na+

. Otros mecanismos adicionales al “ stress”

oxidativo pudieran ser responsables del fenómeno de conducción de Ca2+

a

través del canal de Na+

.

INTRODUCCION:

Existen evidencias de que el “stress” oxidativo es causa mayor del daño celular y tisular durante los episodios de

isquemia-reperfusión del miocardio, lo cual provoca arritmias ventriculares severas incluyendo la fibrilación

ventricular 1-2. La estructura y función de muchas proteínas que contienen residuos de cisteína, como los canales

iónicos, son críticamente dependientes del estado de oxidación de los grupos sulfidrilos de esos residuos de

cisteínas. La importancia de los residuos de cisteína en el funcionamiento del canal de sodio ha quedado bien

establecida 3.

Estudios previos han demostrado la existencia de cambios importantes en la cinética y/o la selectividad del canal

de sodio en cardiomiocitos de ratas que sobreviven a un infarto agudo del miocardio (PMI). A diferencia de los

cardiomiocitos normales, el canal de sodio de los cardiomiocitos de ratas PMI puede conducir calcio en ausencia de

sodio extracelular y esta corriente es sensible a la tetrodotoxina (TTX) (ICa(TTX)) 4-6. Algunos laboratorios han

obtenido evidencias que favorecen al canal de sodio clásico (hH1 o Nav 1.5) como el candidato para ICa(TTX) 7,

mientras que otros proponen la existencia de un nuevo tipo de canal de sodio 8.

Estos cambios pudieran estar potencialmente relacionados al “stress” oxidativo sufrido por las células cardíacas

en el curso del infarto.

Con el objetivo de comprobar esta hipótesis, realizamos estudios en el canal de sodio humano (hH1) clonado y

expresado en oocitos de Xenopus laevis y en el canal de sodio de cardiomiocitos de ratas normales, bajo

condiciones de “stress” oxidativo.

MATERIALES Y METODOS

Estudios con la técnica de “patch-clamp” en cardiomiocitos aislados de ratas:

Los cardiomiocitos fueron aislados enzimáticamente por un método desarrollado en nuestro laboratorio 9. Estas

células se fijan a micropipetas de vidrio llenas con una solución intracelular. Estas micropipetas a su vez se

conectan a la entrada de un amplificador de "patch-clamp", a través del cual se aplican a la célula, los pulsos de

voltaje deseados y se registran las corrientes iónicas que esta genera. Estos registros se hicieron en la modalidad de

"whole cell recording".

Para estudiar la corriente de sodio se utilizó CsCl intra y extracelular (para bloquear las corrientes de potasio) y

CoCl2 (1-3 mM) para bloquear la corriente de calcio. Se midieron las siguientes variables: amplitud máxima,

tiempo hasta el máximo de la corriente y constantes de tiempo de inactivación, así como la relación de la corriente

con respecto al potencial de membrana. Para caracterizar sus cinéticas, se determinaron las curvas de disponibilidad

(o inactivación). Todas estas variables se midieron en condiciones control y después del “stress” oxidativo causado

en presencia del peróxido de hidrógeno (H2O2), así como en presencia de diferentes concentraciones extracelulares

de sodio y calcio como iones permeantes.

Estudios con la técnica de “voltage-clamp” en oocitos de Xenopus laevis que expresan el canal de sodio humano

NaV 1.5.

Expresión del canal Nav 1.5 en oocitos de Xenopus laevis: Esta técnica se realizó en el laboratorio de Biofísica

Cardíaca del Instituto de Fisiología de la Universidad de Puebla. En breve: se seleccionaron oocitos de Xenopus

laevis en estadíos IV-VI, los cuales se inyectaron con ADNc que codifica para la sub-unidad 1 del canal Nav 1.5

(o hH1, humano), así como ADNc que codifica para la sub-unidad 1 asociada a este canal en proporción

11:51 (1 ng/nL). Los oocitos se incubaron durante dos días en una solución de la siguiente composición (mM):

NaCl 96, KCl 2, CaCl2 1.8, MgCl2 2 y HEPES 5 a pH = 7.4, suplementada con gentamicina (sulfato) 50 mg/L.

Registros con la técnica de “voltage-clamp” de dos microelectrodos en oocitos de Xenopus: Se registraron las

corrientes de sodio con la técnica de “voltage-clamp” de dos microelectrodos 10. Los electrodos (0.1-0.2 MΩ) de

corriente y potencial se llenaron con KCl 3M. La composición de la solución fue la adecuada para garantizar

corrientes de una amplitud tal que permitiera un control adecuado del potencial de membrana durante el “voltage-

clamp”. En los experimentos se utilizó un amplificador para oocitos controlado por un sistema pClamp (versión 8,

Axon Instruments, USA) para adquisición y procesamiento de estas señales. Los protocolos de imposición de

voltaje fueron similares a los referidos anteriormente para la técncia de “patch-clamp” en cardiomiocitos de rata.

Para inducir estrés oxidativo, los oocitos se incubaron durante 3 - 5 min en H2O2.

RESULTADOS Y DISCUSION

A diferencia de lo que ocurre en cardiomiocitos de ratas PIM, en ausencia de sodio extracelular, tanto en

cardiomiocitos de rata (figura 1) como en el canal hH1 expresado en oocitos (figura 2), en condición control y bajo

condiciones de “stress oxidativo”, no conduce calcio, aún a concentraciones elevadas (20 mM) de este catión.

En los cardiomiocitos de rata el H2O2 produjo una disminución de la corriente de sodio, de manera no

dependiente de la concentración y sin cambios en la cinética de inactivación de la corriente, sin embargo en los

oocitos pretratados con H2O2 no hubo cambios significativos en la corriente de sodio, sin embargo después de 5

minutos de pretatratamiento con H2O2 las células mueren, lo mismo ocurrió en los cardiomiocitos de rata.

Los presentes resultados sugieren que el “stress” oxidativo, en estas condiciones y preparaciones, no provoca

cambios en la cinética o la selectividad del canal de sodio hH1 que permitan la conducción de calcio a través del

canal en un medio extracelular libre de sodio. Otros mecanismos adicionales al “stress” oxidativo pudieran ser

responsables del fenómeno de conducción de calcio a través del canal de sodio en las ratas PMI. Sin embargo, la

reducción de la corriente de sodio en los cardiomiocitos de rata bajo condiciones de “stress” oxidativo, pudiera ser

la responsable de los fenómenos de arritmias dados después de un infarto agudo del miocardio.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

1. Ferrari R: Oxygen-free radicals at myocardial level: effects of ischemia and reperfusion. Adv. Exp. Med. Biol.366: 99-111, 1994.

N a+

= 0

I Na (

nA

)

2 n

A

1 0 m s

0 2 4 6 8 1 0

- 1 0

- 8

- 6

- 4

- 2

0

C o n t r o l

T i e m p o ( m i n )

0

N a + = 0 + H2

O2

C o n t r o l

Figura 1

0 . 0 0 . 5 2 3 4- 3 0

- 2 5

- 2 0

- 1 5

- 1 0

- 5

0

C a2 +

5 m M C a2 +

2 0 m MC a2 +

1 0 m M

b

b

aa

N a + = 0

IN

a (

nA

)

T i e m p o ( m i n )F i g u r a 2

0

2 0 n A

5 m s

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Estudio Genotóxico del extracto acuoso de Boldoa purpurascen utilizando dos sistemas de ensayo acorto plazo.

AutoresLic.Jumirlet Ortega Pérez1, Lic.Esperanza Lóriga Loaces1, Mcs.Lourdes Cancino Badías2, Mcs.Dulce MaríaMosquera3, Lic.Lázara Milián3, Lic.Yamila López Linares1.

Instituciones

1Centro Nacional de Toxicología, 2Centro de Investigaciones Biomédicas, 3Facultad de Química, UniversidadCentral de Las Villas.

Resumen

La evaluación genotóxica de aquellos productos que se pretende introducir en el ambiente humano comomedicamento es una tarea de especial importancia. Con frecuencia se ha reportado actividad mutagénica ycarcinogénica en muchos productos de origen vegetal por lo que la realización de ensayos a corto plazo paradeterminar mutagenicidad es particularmente ventajoso con respecto a los ensayos de carcinogénesis enanimales en cuanto a tiempo y costo. En el presente estudio nos propusimos evaluar la genotoxicidad delextracto acuoso de Boldoa purpurascen, producto que se encuentra en fase de estudios pre-clínicos y de graninterés por su efecto diurético para el tratamiento de la litiasis. En la evaluación se utilizó el ensayo demutaciones reversas en Salmonella typhimurium cepas TA100 y TA98 en ausencia y presencia de activaciónmetabólica y el ensayo de micronúcleos en médula ósea de ratón. Los resultados obtenidos indicaron que elextracto acuoso de dicha planta no produce mutaciones puntuales en las cepas empleadas a las dosis usadas,ni produce efectos clastogénicos, ni aneuploidías en los eritrocitos jóvenes de la médula ósea de ratón.

Introducción.

La identificación de aquellos agentes a los que se expone el hombre es una tarea importante que enfrenta lagenética toxicológica. Dentro de los ensayos diseñados para la evaluación de productos, las pruebas a cortoplazo ofrecen numerosas ventajas; siendo los ensayos bacterianos de mutagénesis fácilmente reproducibles.Estos ensayos se limitan a la detección de mutaciones puntuales (sustituciones, desfases y pequeñasinserciones o deleciones). No obstante, en la actualidad está bien establecido que la inducción de mutacionespuntuales en oncogenes y genes supresores provoca la aparición de tumores tanto en el hombre como enanimales, y son la causa de numerosas enfermedades hereditarias. Los ensayos de mutaciones reversasemplean bacterias mutantes en un locus cuyos efectos fenotípicos son detectables, por ejemplo, porincapacidad para sintetizar un metabolito esencial. Mediante una segunda mutación, el agente con actividadmutagénica elimina el efecto de la mutación original, seleccionándose las bacterias revertantes por sucapacidad para crecer en medio mínimo carente del metabolito requerido por la cepa parental. El ensayo dereversiones más usado es el de la histidina propuesto por Ames y colboradores en 1973 (1). El test de micronúcleos en médula ósea es otro ensayo corto de genotoxicidad ampliamente utilizado paradetectar daños celulares inducidos por sustancias químicas a cromosomas o al aparato mitótico. Este ensayopermite el registro de alteraciones cromosómicas por vía indirecta, monitoreando el rango de micronúcleos eneritrocitos. Los micronúcleos (MN) se forman a partir de fragmentos acéntricos de cromátidas y decromosomas, así como de cromosomas completos que quedan rezagados en anafase y que se incorporan alnúcleo principal de la célula hija, apareciendo en el citoplasma de las células divididas en interfase como unoo varios núcleos (2).El extracto acuoso obtenido de las hojas de Boldoa purpurascen es usado por su acción diurética para eltratamiento de afecciones renales. Este efecto es atribuible a la presencia entre sus componentes de salesinorgánicas, flavonoides y saponinas. En el presente estudio nos propusimos la evaluación del potencialgenotóxico de Boldoa purpurascen mediante el ensayo de Ames en Salmonella typhimurium y el ensayo demicronúcleos en médula ósea de ratón.

Materiales y Métodos

Como sustancia de prueba: se empleó el extracto acuoso liofilizado de Boldoa purpurascen.

Ensayo de micronúcleos en médula ósea de ratón.

Se utilizó como modelo animal 25 ratones machos consanguíneos línea Balb/c, con una edad entre las 8-12semanas y cuyos pesos corporales estaban entre 22+/-3g. Como control positivo se utilizó la ciclofosfamida ala dosis de 60mg/Kg , por vía intraperitoneal, ya que es la vía más biodisponible por alcanzar con facilidad elórgano diana. Como control negativo fue empleado el disolvente agua destilada. A la dosis de 10mg/Kg. .Para la sustancia de prueba se utilizó la vía oral, que es la vía terapeútica propuesta para el producto, a lasdosis de 500, 1000 y 2000 mg/Kg de peso. Los animales se trataron durante dos días consecutivos, espaciadoslos tratamientos 24 horas y el sacrificio de los mismos luego de 24 horas de la última administración. Para elprocesamiento estadístico se utilizó el paquete estdístico TONYSTAT para determinar si los datos seguíanuna distribución normal y homogeneidad de varianza. Para el por ciento de micronúcleos se realizó latransformación 1/ x+ 1 y así cumplir con las condiciones para utilizar una prueba paramétrica. Se compararonlas medias entre los tratamientos por los tratamientos por el test t de Student utilizando el paquete estadísticoMICROSTAT.

Ensayo de Ames.

Se empleó como sistema biológico la enterobacteria Salmonella typhimurium, cepa TA 98 para detectarcorrimientos del marco de lectura y la cepa TA 100 para detectar sustituciones de pares de bases. Comocontroles positivos el 2- acetilaminofluoreno y la Azida de sodio y como control negativo agua destiladaestéril. Para la determinación de la posible capacidad del extracto de inducir mutaciones puntuales se empleóla variante de incorporación en placas.Cada cepa fue cultivada en caldo nutriente durante 16 horas, sinagitación. Al finalizar la incubación fueron adicionados 0.1 mL de cada una de las dosis del extracto acuoso(50, 100, 150, 300 y 500 µg /pl), -previamente seleccionadas en un estudio exploratorio- a tubos de agar quecontenían 0.1 ml del cultivo de 16 horas de Salmonella typhinmurium y 0.5 mL de la mezcla S9 (esta últimaen el caso del experimento con activación metabólica).Los tubos fueron mezclados vigorosamente en vórtex yañadidos en placas con medio mínimo, las cuales fueron incubadas durante 66 horas a 37oC (3). Para elregistro se sacaron las placas y se cuantificaron las colonias revertantes con ayuda de un contador digital.Secalcularon las medias y la relación existente entre el número de colonias revertantes tratadas y el control (Razón de Mutagenicidad, RM). Se evaluó la posibilidad de que el extracto produjera una respuesta positiva enalguna de las cepas empleadas con y sin activación metabólica, al incrementar al menos dos veces el númerode revertantes por placa en relación con los controles. La relación dosis-respuesta fue analizadaestadísticamente mediante el empleo del programa estadístico SALMONEL, elaborado por Myers ycolaboradores de la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos en 1987 (4). Se consideró unamuestra como positiva cuando la razón de mutagenicidad (RM) fue mayor o igual a dos en al menos tres dosisconsecutivas, y hubo efecto dosis respuesta. A su vez hemos seguido como criterio de negatividad a aquellosproductos que a ninguna de las dosis probadas para ninguna de las cepas muestran un incremento significativoen el número de revertantes al compararlas con el control.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN.

En las siguientes tablas se recogen los resultados de ambos ensayos.

Tabla .1. Resultados del ensayo de micronúcleos en ratones Balb/c.

Tratamiento Total EPC Total EPCmn IG (%EPCmn) IC (EPC/ENC)Control(X±DS)

8301 38 0.416±0.24 0.967 ±0.25

500mg/Kg(X±DS)

4706 17 0.442±0.345 1.015±0.463

1000mg/Kg(X±DS)

8349 28 0.0415±0.374 0.814±0.151

2000mg/Kg(X±DS)

8009 29 0.362±0.281 0.852±0.460

Ciclofosfamida(X±DS)

9568 538 5.530±2.272 0.650±0.555

Como se observa en la tabla anterior el índice de citotoxicidad encontrado para los animales tratados con elproducto demuestra que el mismo no induce efectos citotóxicos en los eritrocitos de la médula ósea.

Tabla No.2. Media de colonias revertantes. Razón de mutagenicidad.

No. de ColoniasTA100

RM No. De ColoniasTA98

RMDosis(µg/ml)

-S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9

H2O ctrol 114.5 108 20.5 1750 101.1 101.3 12 16.6 12 16.6 0.58 0.97100 118 106.3 18.6 17.3 18.6 17.3 0.90 1.01150 128.6 109.6 24.4 18.6 24.4 18.6 1.19 1.09300 149 115.2 34 18.6 34 18.6 1.65 1.09500 140 117.3 1.22 1.08 31 19.6 1.51 1.15

En la Tabla No.2 podemos observar que la media del número de revertantes para cada una de las dosisempleadas no sobrepasa el doble de la media del control, lo mismo con activación metabólica que en ausenciade ésta, tanto para la cepa TA 100 como para la TA 98. Por consiguiente la razón de mutagenicidad es menorque dos, condición que hace al extracto acuoso no mutagénico por no cumplirse el criterio de mutagenicidad. Los resultados del tratamiento estadístico fueron no significativos, es decir no hubo efecto dosis-respuesta,por lo tanto, nuestros resultados cumplen con el criterio de negatividad.

Considerando los resultados obtenidos en ambos ensayos podemos concluir que el extracto acuoso de Boldoapurpurascen no presenta efecto mutagénico probado por el ensayo de Ames en presencia y ausencia deactivación metabólica, ni produce efecto clastogénico, ni aneuploidías en los eritrocitos jóvenes de la médulaósea.

BIBLIOGRAFIA

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1

INSTITUTO NACIONAL DE ONCOLOGIA Y RADIOBIOLOGIA

Inducción de apoptosis por el arsemín en una línea de leucemia murina.

Autores: Juan Carlos Rodríguez Aurrecochea1, Mayrelis Azcue1, Yovana Pereira2, Dámarys Suárez3, Ramón Ropero1, Lissbet Pimienta1,

Melba Betancourt1,.Zulema Carreras2

1Instituto Nacional de Oncología y Radiobiología2Instituto Nacional de Endocrinología3Estación Experimental Apícola

RESUMEN.

Se utilizaron ratones BDF1 machos de 20-21 g de peso, inoculados con la leucemia P-388 y tratados intraperitonealmente

con una dosis única del producto (2.5 mg/kg) a los 7 días de inoculado el tumor, y sacrificados a las 0, 1, 6, 24, 30, 48 y 54

horas .En cada sacrificio se tomó muestra del líquido ascítico tumoral para la determinación de apoptosis hallándose el

porciento de estas. Se procedió a la coloración de Von Kossa para determinar los niveles de calcio intracelular ,así como del

líquido ascítico se tomaron muestras para la determinación de fósforo y calcio, al analizar los resultados comprobamos que

el arsemín indujo apoptosis en esta línea celular, así como se incrementaron los niveles de calcio intracelular, comprobando

la relación de este compuesto con la muerte celular.

INTRODUCCIÓN.

El cáncer o neoplasia es una enfermedad que se caracteriza fundamentalmente por una proliferación celular descontrolada,

las células cancerosas forman tumores malignos que invaden tejidos vecinos y posteriormente pueden colonizar tejidos

distantes a través de la sangre, la linfa o las superficies serosas1.

Los eventos involucrados son entre otros, la pérdida del control del ciclo celular, lo que justifica la rápida proliferación2, la

capacidad de invadir la respuesta inmune del organismo, y el incremento de la formación de vasos sanguíneos o

angiogénesis4,5,6.

La muerte celular programada o apoptosis es un proceso fisiológico que hace desaparecer una población de células en un

tiempo específico o en respuesta a una señal dada7,8.

MATERIALES Y MÉTODOS.

En los experimentos se empleó una solución de trióxido de arsénico, líquido incoloro, suministrado por el Centro de

Investigación y Desarrollo de Medicamentos (CIDEM), en bulbos que contenían 10 ml a una concentración de 1mg/ml. Se

emplearon 35 ratones entre 20-21g de peso corporal., inoculados con la línea tumoral leucémica P-388 por vía

intraperitoneal. El tratamiento consistió en la administración intraperitoneal de una dosis única del producto a los 7 días de

inoculado el tumor, la dosis empleada fue de 2.5 mg/kg, siendo sacrificados a las 0, 1, 6, 24, 30, 48 y 54 horas.

En cada sacrificio se tomó muestra del líquido ascítico tumoral para una extensión en una lámina o portaobjeto, para luego

ser coloreada por la técnica convencional de hematoxilina y eosina, Las células en apoptosis fueron identificadas

morfológicamente. Se contaron 300 células en cada lámina hallándose el porciento de células apoptóticas en cada animal.

Se empleó la técnica de Von Kossa para determinar las concentraciones de calcio intracelular. Se tomaron muestras del

liquido ascítico para la determinación de fósforo y calcio.

2

RESULTADOS.

Al analizar los resultados obtuvimos un índice máximo de apoptosis a las 30h para luego decrecer rápidamente alrededor de

las 48h (Gráfica 1).

Gráfica 1 Porciento de apoptosis en la leucemia P388 tratadas con trióxido de arsénico.

0.0

2.0

4.0

6.0

8.0

10.0

12.0

14.0

0 1 6 24 30 48 54tiempo (horas)

célu

las

apop

tóti

cas

(%)

%Apoptosis

Los niveles de fósforo y calcio disminuyeron sus concentraciones extracelulares en el transcurso del tiempo. Así el fósforo

alcanzó sus valores más bajos a las 48h con una concentración de 3.8 (mmol/ml) y el calcio también disminuyó para

alcanzar sus valores más bajos a las 24h con una concentración de 2.15 (mmol/ml) (Gráfica 2). Los dos elementos

estudiados fueron aumentando posteriormente hasta alcanzar valores parecidos a los iniciales.

Gráfica 2 Concentración de calcio del líquido extracelular en la leucemia P388 (mmol/ml).

2.0

2.1

2.1

2.2

2.2

2.3

2.3

2.4

2.4

0 1 6 24 30 48 54tiempo (horas)

Con

cent

raci

ón d

e C

alci

o

Conc.

Analizando los resultados anteriores decidimos comprobar las concentraciones de calcio intracelular por lo que recurrimos

a la técnica de Von Kossa en todas las muestras de aquellos animales sacrificados antes y a las 30h, demostrándose la

afinidad del nitrato de plata por el calcio en los animales sacrificados a las 24 y 30 hs respectivamente (Fig. 1).

3

Fig. 1 Muestra de células leucémicas coloreadas con la técnica de Von Kossa.

Obsérvese el calcio intracelular (x 40).

DISCUSIÓN.

Al analizar los resultados del fósforo y calcio podemos suponer que la disminución extracelular de estos compuestos es

debido a la penetración de ellos al medio intracelular suponiendo que el arsénico al dañar la célula tumoral hace que la

membrana se haga más permeable a la entrada de agua, iones y solutos presentes en el líquido extracelular. La pérdida

precoz de la permeabilidad selectiva de la membrana que conduce finalmente a una lesión franca de la membrana es un

rasgo constante de todas las formas de muerte celular9.

Boobis et al. plantearon la “hipótesis del calcio” donde su incremento es considerado como un activador en la citopatología

de la muerte celular. La isquemia y ciertas toxinas causan un aumento inicial de la concentración de calco citosólico debido

a la afluencia neta de Calcio a través de la membrana plasmática y a liberación de calcio desde la mitocondria y el retículo

endoplásmico. Los aumentos sostenidos del calcio de la célula se producen por aumentos inespecíficos de la permeabilidad

de la membrana 10.

La importancia clínica de leucemias y linfomas ha motivado un mayor número de estudios y conocimientos sobre la

apoptosis en estas enfermedades, Las alteraciones en el gen o en la expresión de bcl-2 son las que cuentan con más aportes

en la bibliografía11. La sobreexpresión de bcl-2 se ha correlacionado con la resistencia a la remisión completa en la leucemia

mieloide aguda.Un aumento relativo del cociente bcl-2,bax se correlaciona in vitro con la quimiorresistencia y la

disminución de la supervivencia en la leucemia linfática crónica 12.

Como puede observarse, la demostración de una alteración de la apoptosis en las enfermedades hematológicas malignas

puede mejorar la precisión diagnostica e identificar grupos que debieran tratarse de forma más agresiva y probablemente,

con nuevas estrategias.

El reconocimiento de que la mayoría de los agentes antineoplásicos actúan induciendo apoptosis en las células tumorales

abre nuevos horizontes para el desarrollo de productos más resolutivos en el control del cáncer 13.

BIBLIOGRAFIA

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treatment of acute promyelocitci leukemia: AS2O3 induces NB4cell apoptosis with down regulation of Bcl-2 expression

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1

EFECTOS DEL AGONISTA COLINÉRGICO OXOTREMORINA-M SOBRE LA SECRECIÓN DEINSULINA INDUCIDA POR GLUCOSA EN CÉLULA β PANCREÁTICAS INDIVIDUALES

María del Carmen Ramírez-Medeles y Alma Rosa Cortés Arroyo.Departamento Sistemas Biológicos, Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Xochimilco, México.

Resumen

Utilizamos el ensayo hemolítico inverso (RHPA) para estudiar la respuesta de células β pancreáticas

individuales al agonista muscarínico oxotremorina-m (Oxo-m). El fármaco produjo un aumento en el índice de

secreción (IS) de insulina inducida por glucosa 5.6 mM en forma dependiente de la concentración (0.2-50 µM). Este

efecto es resultado de un reclutamiento de las poblaciones funcionales de células β, así como de un aumento en la

cantidad de hormona liberada por cada célula. La magnitud de la pendiente de Hill (n = 0.9) para el IS de insulina

sugiere que el agonista actúa sobre un solo subtipo de receptor muscarínico en las células β del páncreas.

Introducción

La secreción de insulina por células β de islotes de páncreas está regulada por glucosa, nutrientes no glucósidos,

así como por varias hormonas y neurotransmisores (1,2). La ACh estimula la secreción de insulina de una manera

dependiente de la concentración plasmática de este nutriente (2). Este efecto es fundamental para asegurar la

tolerancia óptima de glucosa durante la digestión. La hiperinsulinemia es una característica de la obesidad, y la

cinética de secreción de insulina a menudo está alterada en la diabetes tipo 2 (3), sin embargo, aún no está claro si

estas patologías son consecuencia de una alteración en la actividad del sistema nervioso autónomo (2).

La investigación de los mecanismos de acción de agonistas muscarínicos en las células β pancreáticas es

fundamental para entender la fisiología y patología de la actividad colinérgica en la secreción de insulina.

Se estudió la respuesta de células β pancreáticas individuales al agonista muscarínico Oxo-m, medida como

secreción de insulina inducida por 5.6 mM de glucosa, utilizando el ensayo hemolítico inverso, RHPA (4). Este

método, se basa en la medición de imágenes de placas de hemólisis de eritrocitos de borrego formadas tras la

activación del complemento por complejos de antígeno ( hormona) - anticuerpo alrededor de las células que han

secretado la hormona ante un estímulo fisiológico o farmacológico.

Métodos

Se aislaron células β de páncreas de ratas Wistar normales por digestión con colagenasa, como se describe

previamente (5). Los procedimientos para el uso de animales se aprobaron por el comité interno para uso de animales

de experimentación. Las células se cultivaron en medio RPM1-1640 con 10% de SFB, penicilina (100 U/mL) y

estreptomicina (100 µ/mL) a 37°C (5% C02-95% aire) durante un día. En el RHPA seguimos el procedimiento ya

descrito (5), y utilizamos un antisuero contra insulina obtenido en el laboratorio (6).

Análisis estadístico. La asociación y la diferencia entre las proporciones de células que secretaron o no insulina en

cada condición estudiada se analizó con la prueba Chi-cuadrada con el programa SPSS v. 10.0. Los valores del IS se

ajustaron a la ecuación de Hill con regresión no lineal con el programa SigmaPlot v.5.0.

2

Resultados y discusión

La respuesta de las células β se midió como el área de hemólisis que rodea a cada célula, la cual es una medida

cuantitativa de la cantidad de insulina secretada por cada célula (4). Con una concentración basal (5.6 mM) de

glucosa, las células secretan cantidades moderadas de insulina y algunas no responden a este nivel de glucosa, como

se indica con la flecha en la figura 1A.

Figura 1. Detección de secreción de insulina por células β de páncreas con elensayo hemolítico inverso. (A) Secreción con 5.6 mM de glucosa, (B) con 5.6mM de glucosa en presencia de 50 µM de Oxo-m.

Las células β muestran una respuesta heterogénea a la glucosa (5), a los agonistas colinérgicos como carbacol,

(CCh) (7 ), y a otros nutrientes (8). Con una concentración basal de glucosa, secreta un 50% de las células (5,7-8), y

la cantidad de hormona liberada es moderada, aunque varía entre las poblaciones funcionales (5). La aplicación de

Oxo-m (50 µM) en el medio de incubación estimuló la secreción de insulina inducida por glucosa, que se manifiesta

como un aumento en el área de las placas de hemólisis alrededor de las células β (figura 1B), así como un aumento

en el porcentaje de células (reclutamiento) que responden a este nivel de glucosa (figura 2). La dosis más alta de

Figura 2. Reclutamiento de células β que responden aglucosa 5.6 mM, en función de la concentración de Oxo-m.

Oxo-m (50 µM) aumentó el porcentaje de células secretoras hasta un 80%, similar al que produce una concentración

estimulante de glucosa (15.6 mM). La acción insulinotrópica de los agonistas muscarínicos resulta, entre otros

mecanismos complejos, de un aumento en la concentración de Ca2+ intracelular, [Ca2+ ]c, y un aumento sustancial en

3

la eficiencia de este segundo mensajero para promover la exocitosis de la hormona (2). El aumento en el [Ca2+ ]c es

debido, en parte, a la activación de mecanismos de transducción de señales que inician con la activación de una

proteína Gq mediada por receptores muscarínicos M3, seguido por estimulación de una fosfolipasa C y liberación de

inositol trifosfato (IP3), el cual promueve la movilización de Ca2+ del retículo endoplásmico (9).

Figura 3. Índice de secreción de insulina inducida conglucosa 5.6 mM, en función de la concentración de Oxo-m.

El IS de insulina es una medida de la cantidad de hormona secretada por una población de células β ante un

estímulo (5), y resulta de multiplicar el área promedio de las placas de hemólisis por el porcentaje de células que

secretan insulina. La Oxo-m aumentó el IS de insulina inducido por glucosa 5.6 mM en forma dependiente de la

dosis (figura 3). La máxima concentración de Oxo-m (50 µM) produjo un aumento en el IS cuantitativamente similar

al que produce una concentración estimulante de glucosa (15.6 mM). Esto es, el IS aumentó casi dos veces respecto

del observado sólo con glucosa 5.6 mM. Este efecto es semejante al que produce el CCh (7 ), pero con una

concentración 500 veces menor, lo cual refleja una menor potencia de la Oxo-m. La magnitud de la pendiente de Hill

para el IS en función de la concentración de Oxo-m (0.2-50 µM) fue de 0.9, y sugiere que la oxo-m potencia la

secreción de insulina inducida por glucosa por activación de un subtipo de receptor muscarínico. Estos resultados son

congruentes con los efectos del agonista en islotes completos de páncreas de rata (10), donde, al parecer, la Oxo-m

estimula la secreción de insulina inducida por glucosa por activación del receptor muscarínico M3.

Referencias

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(Endocrinol. Metab.31), E336-E342, 1995.

VALORACIÓN DE LA CAPACIDAD DE IRRITACIÓN CUTANEA DEL ACEITE DE CASTAÑA

DEL PARÁ Y DEL GEL RESONANTE.

Lima, A. L.1; Costa, A. M. L.1; Fonseca, K. L.T.1; Silva-Jr., J.O.C.1; Dolabela, M.F.1 y Carvalho, R.A.2

1- CESUPA- Centro Universitário del Estado del Pará. 2- Instituto Evandro Chagas. Av. Almirante Barroso,

492, Belém, PA, Brasil. E-mail: reinaldocarvalho@iec.pa.gov.br

RESUMEN

Se le realiza el test de irritación cutanea, en conejo, del gel resonante contiendo 50 % água, 30 % tensoactivo

(trilaureth-4- phosphate) y 20 % aceite de castaña del Pará (Bertholletia excelsa H.B.K.) y tambien del aceite

de castaña del pará. El gel resonante resultó ser ligeiramente irritante ya el aceite muestró no ser irritante. Es

possible solamente la utilización del aceite de castaña del pará en la terapéutica.

Palabras claves: Irritación, aceite de castaña del pará y gel resonante.

SUMMARY

Skin test in rabbits was realized from ressonant cream with 20% of brazilian nut oil, 30% of thilaureth-4 –

phosphate and 50% of the water from brazilian nut oil. This cream was less irritating athough brazilian nut oil

use is possiblein therapeutic analisis.

Key words: irritating, brazilian nut oil and ressonant cream

INTRODUCCIÓN

Para cuidados com la piel y tratamientos de enfermedades hay una grande variedad de vahículos,

como preparaciones sólidas, “semi-sólidas” y líquidas, que eston disponiblespara uso clínico. Entre las

preparaciones “semi-sólidas”, el uso de geles expandido tanto en el campo cosmético quanto en el campo

medicamentoso (PROVOST, 1986).

Usando água, trilareth-4-phosphate y aceite de castaña del pará fue obtenido un gel resonante estable.

Apesar de tener presentado estabilidad física, el gel resonante no puede ser usado como base, debido no ser

conocido su potencial irritante y alergênico (BRITO, 1994).

El objetivo de este trabajo fue valorar el potencial irritante del gel resonante y del aceite de castaña

del pará.

MATERIAL Y METODOS

El aceite fue obtenido de la almendra de la castaña del Pará (Bertholletia excelsa H. B. K) y fue un

donación de la Brazmazon Industria de Oleaginosas do Pará. Ya el trilaureth-4- phosphate fue un donativo de

la Clariant del Brasil. Para el estudio se emplearon 6 conejos albinos machos de la espécie Oryctolagus

cuniculus, procedentes del bioterio del Instituto Evandro Chagas, cuyos pesos medios fueron 2,5Kg éstos se

ubicaron en jaules individuales adecuadas.

El gel resonante usado en el trabajo tiene la siguiente composición: 50 % água, 30 % tensoativo

(trilaureth-4- phosphate) y 20 % aceite (castaña- del- Pará). En cada animal fueron inicialmente pelados con

tijera en el dorso 6 regiones con aproximadamente 10X10cm. En tres regiones fueron hecho abrasion con

lamina de afeitar. Veinticuatro horas después, en cada conejo una region com abrasión y otra sin abrasión, se

procedió la administración de 0,5g de aceite, 0,5g de gel resonante y soló procedimiento de aplicación

(control). La irritación cutanea fue valorada 5, 24, 48 y 72h después de la aplicación. Para calcular el indice

de irritabilidad cutanea primaria se adoptó los seguientes critérios:

Tabla 1: Escala descritapor Draize para la evaluación de las lesiones en la piel

1-Eritema y formación de escaras

- Si no aparece nada

- Muy ligero el eritema

- Eritema bien definido

- Eritema moderado a severo

- Eritema severo con formación de úlceras y

costras

0

1

2

3

4

2-Formación de edemas

- Si no hay edema

- Edema poco perceptible

- Edema ligero

- Edema moderado

- Edema severo

0

1

2

3

4

Fuente: Pargas et al., 1996

La media aritmética obtenida del edema y eritema del aceite fueron sumados, donde se obteve el

potencial de irritacin cutanea. Se procedeu de modo semejante com gel resonante y control, se aplicó la escala

seguiente: 0,0-1,0 no irritante; 1,1-2,0 levemente irritante; 2,1- 3,0 moderadamente irritante y >3,1

severamente irritante (Brito, 1994).

RESULTADOS Y DISCUSION

En el grupo control no fue observado la presencia de edema o eritema. En las aréas tratadas con

aceite, el edema y eritema fueron pocoperceptibles (Tabla 2). Ya las áreas tratadas con gel presentaron

eritema ligero después de 72h del tratamiento.

El potencial de irritación cutanea de las areas con abrasion tratadas con aceite y gel fueron mayor que

el potencial de irritación sin abrasión (Tabla 3). Tambien áreas tratadas con gel resonante presentaron mayor

irritación de el que áreas tratadas con aceite, y cuanto mayor el tiempo de exposición (aceite y gel), mayores

fueron los potenciales de irritaciones (Tabla 3). Apesar del bajo potencial irritante del tensioactivo y leve

potencial irritante del aceite, cuando una formulación los contien ocuerre uno aumento del potencial irritante.

Tabla 2: Valoracion de la presencia de edema y eritema.Tiempo

(h)

Grupo control(eri-

tema y edema)

Grupo aceite- ede-

ma

Grupo aceite- eri-

tema

Grupo Gel- ede-

ma

Grupo Gel- eri-

tema

Sin

abrasion

Con

abrasion

Sin

abrasion

Con

abrasion

Sin

abrasion

Con

abrasion

Sin

abrasion

Con

abrasion

Sin

abrasion

Con

abrasion

5 0 0 0 0 0,5 0,5 0 0 1,17 1,17

24 0 0 0 0 0,5 0,67 0 0,5 1,17 1,34

48 0 0 0,17 0 0,5 0,83 0,5 1,0 1,34 1,50

72 0 0 0,17 0,17 1,0 1,17 0,84 1,5 2,0 2,17

Leyenda: 0- Si no hay edema o eritema; 1- Edema o eritema poco perceptible; 2- Edema o eritama ligero; 3-

Edema o eritema moderado; 4- Edemao eritema severo. Fuente: Formulario de Investigación.

Tabla 3: Avaliação do potencial de irritação do óleo de castanha do pará e do gel ressonante

Tempo (h) Grupo controle Grupo óleo Grupo Gel

Sem abrasão Com abrasão Sem abrasão Com abrasão Sem abrasão Com abrasão

5 0 0 0,5 0,67 1,17 1,17

24 0 0 0,5 0,67 1,17 1,83

48 0 0 0,67 0,83 1,83 2,5

72 0 0 1 1,51 2,83 3,55

Leyenda: 0,0-1,0: no irritante; 1,1-2,0: levemente irritante; 2,1-3,0: moderadamente irritante y > 3,1:

severamente. Fuente: Formulário de Investigación.

CONCLUSIONES

Estos resultados indican que: el aceite de castaña del pará presenta bajo potencial irritante para piel

integra y potencial moderado para piel lesada. La asociación de este aceite al trilareth-4-phosphate produz una

respuesta “sinérgica” para el poder irritante cutaneo, tanto para piel integra como para piel sometida la

abrasion. Y que toda la irritación observada no está relacionada la metodologia adoptada para la abrasion y

aplicación de las substancias.

AGRADECIMIENTO

El Raimundo Bahia Pantoja por el apoyo técnico

Apoyo Financeiro: CESUPA y IEC-FUNASA

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICASBORSATO, C.B. y CALDERARO, V.C. Desenvolvimento e avaliação da estabilidad fisica de forma

farmacêutica e/ou cosmética contendo óleo de castanha-do-pará. Belém: CESUPA, 200. 46p.

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PROVOST, C. Transparent oil- water gels. Int. J. Cosm. Sci. V.8,p. 233-47, 1986.

Nuevas aproximaciones teóricas para la determinación de propiedades Farmacocinéticas y Farmacodinámicas de

6-Fluoroquinolonas.

A Novel Approach to Determining Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Properties of 6-Fluoroquinolone

Derivatives.

Authors: Miguel Angel Cabrera Péreza*, Carlos Fernández Teruel b, Isabel González Álvarezb, and María del Val

Bermejo Sanz b. *macabrera@cbq.uclv.edu.cuaChemical Bioactive Center. Central University of Las Villas. Santa Clara 54830, Villa Clara, Cuba.bDepartment of Pharmacy and Pharmaceutical Technology. University of Valencia. Burjassot 46100, Valencia, Spain.

Abstract

The ToSS MoDe approach is used to estimate the human bioavailability (F) and the Minimum Inhibitory

Concentration (MIC90) against Streptococcus pneumoniae from a data set of 17 fluoroquinolone. Both pharmacokinetics

and pharmacodynamic properties were well described by the present approach. In order to obtain a qualitative model

that permit the classification of drugs with high and moderate bioavailability a discriminant analysis was carried out.

The percentage of good classification was 100 % for compounds of the training set. The leave-one-out cross validation

procedure showed an 88.23% of good classification. Later, a quantitative model, by the piecewise linear regression, was

developed. On the other hand a linear regression model that explained the 84% of variance was developed to predict the

MIC90 values.

1. Introduction

The primary goal of the drug discovery and development process is to obtain a new molecule possessing good

pharmacokinetic and pharmacodynamic properties. Recently, we developed a theoretical method, based on the use of a

Topological – Sub-Structural Molecular Design approach [1] in order to obtain predictive models for the n-octanol

/buffer partition coefficient, apparent intestinal absorption rate constant and intestinal permeability of 6-

fluoroquinolones derivatives [2].

Taking into consideration the broad antibacterial spectrum of 6-fluoroquinolones the aims of the work were: to use

the ToSS MoDe approach in generation of a discriminant function that permits the classification of molecules as a

high/moderate bioavailability (F); to obtain quantitative models, through the Piecewise Linear Regression, for this

biopharmaceutical property and finally to obtain a quantitative model of minimum inhibitory concentration (MIC90)

against Streptococcus pneumoniae by a multivariable linear regression model (MLR).

2. Materials and methods

The present approach is based on the calculation of the spectral moments of the topological bond matrix. In this

work the difference of electronegative between atoms that form a bond were used to weight the diagonal entries of the

edge matrix and were determined the local and total spectral moment of the quinolone molecular base. The variables

were selected considering the different rings, the influence of the polar and non-polar surface area as well as the

hydrogen-bonding capacity [3] on the physicochemical and absorption properties.

2.1 Development of the discrimination function and the Piecewise linear regression for human bioavailability

In the present work 17 compounds composed the data set of 6-fluoroquinolones derivatives. The classification

criterion for the discriminant function was selected in the following way: If the compound has an oral bioavailability ≥

90% is a well-absorbed drug (high F) and if a bioavailability value is between 90% and 10% the drug is moderately

absorbed. Also the validation of the model was carried out by a cross-validation (leave-one-out) procedure. The

discrimination function was obtained by using the stepwise linear discriminant analysis as implemented in

STATISTICA version 5.5.

The development of the Piecewise Linear Regression (PLR) was carried out. The estimation procedure was by

Simplex and Quasi-Newton method. The breakpoint chose was 90 due to this point is the frontier between 6-

fluoroquinolones with high and moderate bioavailability as selected in the previous discriminant analysis.

2.3 Development of a linear regression function for a pharmacodynamic property.

The best linear equation for the description of MIC90 against Streptococcus pneumoniae was obtained by a multiple

linear regression (MLR) method, using the forward stepwise regression, as a strategy variable selection. The quality of

the model was determined by examining the correlation coefficient, standard deviation of regression, standard deviation

of the cross validation “leave-one-out” procedure, Fisher ratio (Fexp > Ftab, α= 0.05) and the number of variables in the

equation.

3. Results and Discussion

The best discriminant function obtained for the bioavailability in the training set is given below:

Bioavailability = -0.956 – 0.119 µ1-DE + 1.559 · 10-10µ15-DE + 7.916 · 10-10µ15-PA-DE (1)

The value of the Wilk´s λ parameter for the model is 0.268 and the Fisher ratio F (3, 13) = 11.85. In Table 1 is illustrated

the percentage of probabilities obtained in the classification of compounds of the training and the external prediction set

(first and second columns of data). This model shows that the F values employed in the study is mainly dependent on the

total spectral moment (µi) and the polar area (µi-PA) of the molecules. The percentage of overall accuracy of the model

was 100 % for the training set. If we take into account the cross-validation by leave-one-out procedure, the model

showed an 88.23 % of good classification (15/17). Only Enoxacin regardless of good classified had the lower

probability. This compound has a naphthyridone structure, thus increasing the electronic density around the N atom and

the possibility of hydrogen bond formation using the unbound nitrogen electrons, with the consequent change in the

biological properties [2].

Table 1. Experimental and predicted values of bioavailability (F) and minimum inhibitory concentration (MIC90) of 6-fluoroquinolones by qualitative and quantitative theoretical methods.

No Name High F a (%) Moderate F a (%) FH exp b FH pred h MIC90 expi MIC90 predj

1 Ciprofloxacin 99.8 70 60 2 2.22 Clinafloxacin 99.7 80 66 0.06 0.353 Difloxacin 99.9 90 91 2 5.74 Enoxacin 52.7 90 93 16 11.15 Fleroxacin 98.0 96 93 8 36 Gatifloxacin 97.6 96c 95 0.39 0.287 Grepafloxacin 98.5 70d 69 0.39 0.538 Lomefloxacin 81.3 95 93 16 49 Moxifloxacin 81.7 86 87 0.25 0.2210 Norfloxacin 82.4 40e 48 16 2711 Ofloxacin 99.9 90 93 2 1.312 Pefloxacin 99.3 95e 93 8 2313 Rufloxacin 97.7 50 53 16 614 Sitafloxacin 99.9 84f 97 0.05 0.0515 Sparfloxacin 99.9 92d 94 0.5 0.6

16 Temafloxacin 99.5 92g 91 1 0.817 Trovafloxacin 96.2 80 77 0.25 0.42

a F predicted by Eq. (1); b F, Ref. [5]; c F, Ref. [6]; d F, Ref. [7]; e F, Ref. [8]; f F, Ref. [9]g F, Ref. [10], h F predicted by Eq. (2 and 3); i MIC90, taken from Ref. [5]; j MIC90, predicted by Eq. (4)

The three main descriptors in the Eq.1 are in relation with the size and the area of the polar groups of the molecules.

The descriptors of high magnitude, from both kind of spectral moment, have a positive contribution to the

bioavailability, which is in correspondence with the influence that the molecular weight and the hydrogen bond capacity

have on this biopharmaceutical property.

Once the human bioavailability has been classified by a discriminant function, a predictive piecewise linear

regression model for drugs with high and moderate F values was carried out. The best predictive models obtained for F

is given below:

Log FM = 1.275 + 4.346 · 10-7 µ8-DE + 3.840 · 10-3µ2-NPA (2)

Log FH = 1.963 + 5.858 · 10-8 µ8-DE – 2.320 · 10-4µ2-NPA (3)

N = 17 R = 0.926 R2 = 0.858

The bioavailability values obtained for the moderate and high groups are showed in Table 1 (forth column of data).

The model for Log F depends on the total spectral moments and the local spectral moments on non-polar area of the

molecules. If we analysed, for example, the Eq. 3, when the non-polar area is fairly high their negative contribution

make lower the F value for drugs with high bioavailability. This is a logic result, which is in concordant with the

findings reported by other authors [4] where a balance between polar and non-polar area is important to obtain a good

absorption profile.

The best predictive model obtained for the minimum inhibitory concentration (MIC90) against Streptococcus

pneumoniae (SP) is given below:

Log (1/MIC90)SP = -10.35 – 3.98 · 10-9µ15-R1 + 5.43 · 10-8µ14-R3 + 2.69 · 10-6µ8-DE (4)

N = 19; R = 0.915; R2 = 0.837; S = 0.363; SCV = 0.379; F (3,15) = 25.85

This model shows that the MIC90 of 6-fluoroquinolone derivatives employed in the study is dependent on the local

spectral moments in the rings 1 and 3, and also of the total spectral moments weighted with electronegative difference.

The experimental and predicted MIC90 values are summarized in Table 1 (fifth and sixth column of data).

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“PAPEL DE LOS RADICALES LIBRES SOBRE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS. EFECTO EN LA CARCINOGENESIS”

Autores: Lic. Mayté Eirez Izquierdo, Lic. Adonis E. Zorrilla García.

Centro: Centro Nacional Coordinador de Ensayos Clínicos (CENCEC)

RESUMEN

Según los resultados de incidencia obtenidos por los registros de cáncer de base poblacional existentes en el mundo y de

los datos de mortalidad mundial disponibles, se puede estimar que se producen más de 8 millones de casos nuevos de

cáncer al año (exceptuando los cánceres de piel diferentes del melanoma). 1 Han sido estas las razones que han convertido

al cáncer en un problema sanitario de primer orden, con la paradoja de que tanto su incidencia como su mortalidad

aumentan a pesar de los grandes progresos en el diagnóstico y tratamiento alcanzados en los últimos años. De manera

general el tratamiento clínico de esta enfermedad consiste en el tratamiento de los síntomas, buscando mejorar la calidad

de vida de estos pacientes, y no en el tratamiento de la causa, como constituye la generación de radicales libres en el

organismo.

No obstante se han realizado una serie de investigaciones enfocadas fundamentalmente al estudio del papel de sustancias

químicas exógenas en la carcinogénesis y la mutagénesis a través de la generación de especies reactivas de oxígeno como

mediadores del daño al ADN donde se abordan, como en nuestro caso, aspectos relacionados con el efecto de los radicales

libres sobre los ácidos nucleicos , mecanismos moleculares involucrados en la producción de Especies Reactivas del Oxígeno

(EROs) que afectan al ADN, acción de los radicales libres sobre el DNA que pueden inducir la carcinogénesis e incluso el

papel de las EROs en cada una de las etapas de la carcinogénesis, pretendiendo de esta forma encontrar una estrategia de

tratamiento adecuada para pacientes oncológicos, que proporcione no solamente una mejoría en la calidad de vida de los

mismos, sino también un arma potente contra una de las causas que conllevan a al desarrollo de esta patología.

INTRODUCCIÓN

El incremento del estrés oxidativo puede resultar de un aumento en la producción de precursores de radicales de oxígeno

reactivos, de un aumento de las Especies Reactivas del Oxígeno (EROs), de un incremento de las catálisis pro-oxidantes,

de una reducción de los sistemas antioxidantes o de una combinación de todos ellos. 2

Las especies reactivas de oxígeno presentan una alta reactividad tanto que son capaces de reaccionar con una amplia

gama de estructuras celulares, conociéndose que sus blancos fundamentales son los ácidos grasos insaturados de las

membranas fosfolipídicas, proteínas y ácidos nucleicos.2

EFECTO SOBRE ÁCIDOS NUCLEICOS

La molécula de ADN es uno de los principales blancos del ataque por radicales libres en la célula y las modificaciones que

sufre como consecuencia de esos ataques son relevantes para la pérdida de la homeostasis celular, pérdida que puede

prolongarse como consecuencia de las funciones del ADN como reservorio activo de información. Es por ello que se estudian

intensamente los agentes y mecanismos del daño por EROs puesto que su esclarecimiento va parejo a la elucidación de la

etiopatogenia de enfermedades de gran morbimortalidad como el cáncer .

En la molécula de ADN, los grupos nucleofílicos de la desoxirribosa y de las bases nitrogenadas quedan expuestos al ataque

electrofílico de las especies reactivas del oxígeno (EROs). 3

Existen diferentes tipos de daño oxidativo al DNA, entre los que se han reportado:

1) Rotura del esqueleto azúcar fosfato de una o de las dos hebras.

2) La modificación de las bases nitrogenadas. (saturación y fragmentación del anillo de timina)

3) La formación de uniones cruzadas (cross-links) ADN-ADN ó ADN- proteína.

ACCION DE LOS RADICALES LIBRES SOBRE EL DNA. CARCINOGENESIS

Las EROs pueden actuar sobre el DNA a través de diferentes mecanismos:

1. Modificación de las bases de DNA.

2. Generación de sitios AP.

3. Ruptura de una cadena del DNA.

4. Mutaciones.

5. Activación de oncogenes y inactivación de genes supresores.

6. Daño endotelial que favorece la metástasis.

PAPEL DE LAS EROs EN CADA UNA DE LAS ETAPAS DE LA CARCINOGÉNESIS

El cáncer se desarrolla como un proceso microevolutivo que requiere de la acumulación de múltiples eventos que tienen

lugar en un clón de células 4 y comprenden tres estadíos: 1-Inducción de mutación en el ADN de una célula somática

(Iniciación); 2-Estimulación de la expansión tumoral del clón mutado (Promoción) y Malignización del tumor

(Progresión). Se ha comprobado que las EROs pueden estimular el desarrollo tumoral en las tres etapas señaladas 5-7.

EROs en la iniciación tumoral

La iniciación requiere de una modificación permanente del material genético de una célula. Los posibles mecanismos por

los que transcurre el daño al ADN inducidos por estrés oxidativo son:

• Formación del. OH•, generado por la interacción del H2O2 con el hierro (Fe 2+) o cobre (Cu2+) constitutivos,

unidos o cercanos al ADN, o liberados en el interior celular a causa del estrés oxidativo. 2,,8

• Incremento del calcio (Ca2+) libre intracelular, ya sea producto de la movilización del mismo a partir de sus

depósitos intracelulares o a través del influjo extracelular. Esta respuesta es provocada por una sobrecarga de

estrés oxidativo que agota las reservas de antioxidantes endógenos, lo que constituye una señal para la liberación

de este elemento; que una vez liberado, además de provocar otras respuestas, conduce a la activación de

endonucleasas que fragmentan al ADN (proceso que normalmente tiene lugar durante la apoptosis) 9. Estos

mecanismos no son excluyentes, por lo que pueden tener lugar simultáneamente.

EROs en la promoción tumoral

En la promoción las EROs inducen un incremento notable del Ca2+ citosólico, movilizándolo de las reservas intracelulares

e incrementando su flujo desde el medio extracelular 10. El efecto del Ca 2+ puede tener lugar por vía directa induciendo

proto-oncogenes como c-fos o de forma indirecta, modificando la fosforilación de factores transcripcionales por proteína

quinasa C dependiente de Ca2+ (PKC) la cual, conjuntamente con otras quinasas, regula la actividad de factores

transcripcionales por múltiples cascadas de fosforilación.

Las EROs pueden estimular la actividad PKC por vía directa mediante la oxidación de sus residuos de cisteína en el

dominio regulatorio de la enzima. Puede ejercer efectos directos sobre la regulación de la actividad de factores

transcripcionales como el factor NF-Kappa B que tiene bajo su control una gran variedad de genes 11.

EROs en la progresión tumoral

El estadio final del cáncer es la malignización tumoral que se caracteriza por un crecimiento acelerado de las células, la

evasión de la vigilancia inmunológica y la invasión de otros tejidos.

Muchos de estos cambios involucran lesiones adicionales al ADN, pensándose que la generación elevada de EROs en las

células originan un estrés oxidativo persistente que incrementa su inestabilidad genómica, acompañándose de una

disminución de las enzimas antioxidantes lo cual incrementa a su vez la sensibilidad de estas células a las EROs 12.

Muchos tipos de tumores pueden originar una respuesta de intensidad variable del sistema inmune. En dependencia de la

intensidad de esta respuesta y la susceptibilidad del tumor, las EROs generadas por leucocitos activados pueden: originar

un proceso inflamatorio crónico que incrementa la progresión tumoral y conducir a la muerte celular por citotoxicidad o

inducir la muerte apoptótica.

CONCLUSIONES

Intensas y profundas son las investigaciones que como esta, al final solo aportan una pieza al inmenso rompecabezas que

identifica el tratamiento “ideal” de los pacientes oncológicos, que garantice una mejora en la calidad de vida y al mismo

tiempo una resección total de la lesión tumoral.

Consideramos que ciertas modificaciones dietéticas, con un contenido adecuado de antioxidantes, pudieran resultar

eficaces en la prevención o el tratamiento de diversos procesos patológicos que involucran la formación de EROs.

No todos los tratamientos dietéticos tienen el mismo grado de eficacia para lograr el objetivo deseado ni la misma

importancia en el tratamiento del proceso patológico. En algunas enfermedades la dieta constituye el tratamiento

fundamental; mientras que en otras, como el cáncer, puede representar un tratamiento coadyuvante.

BIBLIOGRAFÍA.

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human breast cancer. J Cancer Res Clin Oncol 120: 374-377; 1994.

PREVALENCIA DEL USO DE TABACO Y ALCOHOL ENTRE ESTUDIANTES DE FARMACIA

GOMES, V.D.; PATRINY- ALMEIDA, F.; PRISCILA- ALMEIDA, F.; GARCEZ, F. y DOLABELA, M.F.

CESUPA- Centro Universitário d Estado do Pará. Dirección para correspondencia: Av. Nazaré, 630, CEP

66035-170. Belém, PA, Brasil. E-mail: fani@canal13.com.br

RESUMENEn este trabajo valoró la prevalencia del uso de alcohol y tabaco entre los estudiantes del curso de farmácia

del CESUPA. Los estudiantes que participaron de este estudio responderon cuestionario conteniendo

preguntas que investigaban la edad del primer contacto con la droga, motivos del consumo, frecuencia del

uso, consumo entre los familiares y principales enfermedades familiares. Los no usuarios relataron los

motivos del no consumo de la droga. Los resultados obtenidos mostraron mayor prevalencia del uso del

alcohol entre los estudiantes que del tabaco.

Palabras claves: tabaco; alcohol y prevalencia del uso

SUMMARYIn this paper, alchol and tobbaco usings among pharmacy students from CESUPA were analized. The students

answer a questionary to investigate: how old they were at the frist drug contact, why they consumed, how

often they use it, as well as the consume among their family and main family deseases. The non- users have

reported why they haven’t consumed drugs. The results showed that alcohol is more consumed than tobbaco

among the students.

Keys words: tobbaco, alcohol and consumed

INTRODUCCIÓNLa verificación de que, algunas veces, los dependientes utilizon drogas asociadamente fue

demostrada por la primeira vez en 1972. Experimentalmente se sugirió que cuanto mayor la dependencia de

nicotina tanto mayor el consumo de alcohol, o que el alcohol ejerciese un estímulo inespecífico en varias

etapas comportamentales, aumentando el consumo de cigarrillos. Se sugiere entonces que ese tipo de

dependencia deba tener el mismo origen, esto és, que sea determinada por los mismos factores (CHAIEB et

al, 1998). No hay gene único para abuso o dependencia de drogas, asi como no hay evidencias de genes

exclusivos para este fenótipo. La acción del medio ambiente sobre estas condiciones biológicas produce la

expresion del fenótipo (MESSAS, 1999).

La preocupación de detectar el uso y abuso de alcohol y cigarrillo, bien como actitudes en individuos

con profesiones unidas a la salud se basea en: probabilidad de que esos estudiantes se tornen profesionales de

salud dependientes o se presume de que sirvieron de modelo para sus pacientes (CORRÊA, 1999). El objetivo

de este estudio fue determinar la prevalencia de tabaquismo y alcoholismo en estudiantes de farmacia del

Cesupa.

METODOLOGIAFue un estudio del uso de prevalencia populacional (N 125) por médio de cuestionario

autoadministrado contenindo cuestiones que investigaban el uso de tabaco y alcohol. El cuestionario contenía

preguntas que investigaban la edad del primer contacto con la droga, motivos del consumo, frecuencia del

uso, consumo entre los familiares y principales enfermadades familiares. Los no usuarios relataron los

motivos del en el consumo de la droga.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Respondieron al cuestionario 114 escolares y 11 no responderon. Solamente 6% de los entrevistados

relataron consumir tabaco, pero no se consideraban dependientes siendo esta droga consumida por la primera

vez entre 15- 18 años motivados por curiosidad e influencias de amigos, principalmente. La baja prevalencia

del consumo de tabaco puede estar relacionada la extensa campaña gubernamental brasileño contra el tabaco.

En relación al alcohol, 49,5% relataron consumirlo “socialmente” y en los fines de semana. El primer

contacto con alcohol ocurrió, principalmente, antes de los 18 años (65,9%) motivados por la recreación/

diversión, curiosidad e influencias de amigos (Tabla 1). Semejante al descripto en otros estudios (ELDERS et

al., 1994), el primer conctato de los escolares con las drogas se inició principalmente en la adolecencia,

reforzando la importancia de estrategias de control de propagandas y marketing sobre estas drogas, dirigida a

esta faja etária. Pues de acuerdo con Lima (2001), la adolescencia es una etapa en la cual frecuentemente

ocurre la experimentación de drogas sean lícitas o ilícitas.

Usuarios del alcohol relataron historias familiares de enfermedades, como diabetes (41,4%),

hipercolesterolemia (6,9%), diabetes/ hipertensión (27,5%) y otras (13,8%) (Tabla 2), el que demuestra la

predisposición genética en relación la estas patologías, que asociadas con las condiciones externas y hábitos

del individuo, como tabaquismo y/o alcoholismo, puedon desencadenar procesos patológicos o hasta mismo

agravar el estado del enfermo.

Tambien, los usuarios de alcohol (72% de los usuarios) relataron el consumo de entre familiares

(Tabla 2). De acuerdo con los estudiantes de la Unesp (CORRÊA, 1999), el consumo familiar de drogas,

influencia (estadísticamente) en el consumo de los hijos, una vez que se torna un hábito común en la vida de

estos estudiantes, yá que crecen asistiendo la estas costumbres y hábitos. El uso simultáneo de alcohol/ tabaco

fue de 5,3% de los escolares.

Entre los no- usuarios (57 entrevistados), 49,2% relataron no consumir drogas por ser cientes cuanto

a los daños, 24,6% no tiene curiosidad en el consumo, 2,3% desagradan el aroma de la humareda y sabor,

3,5% por aconsejamiento familiar, 3,4% dejaron el vicio y 7% no respondieron la pregunta. Estos resultados

confirmon la importancia de realizarse campañas educativas anti- tabaquista y anti-etilista volvida la

adolescentes y jóvenes.

Tabla 1: Características cuanto a la prevalencia de la droga, consumo e edad.

Características Nº %Prevalencia/Alcohol 57 50,0Primeir conctato 13 años 06 10,5

14 años 07 12,315 años 11 19,316 años 06 10,517 años 07 12,318 años 14 24,619 años 01 1,820 años 05 8,7

Motivos Curiosidad 08 14,0

Influencia 04 7,0Diversión/ocio 36 63,0Otros 09 16,0

Frecuencia 1 vez/semana 03 5,3Finales de semana 23 40,3Socialmiente 31 54,4Todos los días 00 00,0

Leyenda: Nº = número de escolares e % = percentaje. Fuente: Formulario de investigación.

Tabla 2: Percentual de usuarios cuanto al los tipos de casos de enfermedad y de consumo de drogas en la

família.

% de relatos de casos de enfermedad familiarUsuarios de alcohol Diabetes Hipercolesterolemia Diabetes/

hipertensiónOtras

(n= 57 personas) 41,4 6,9 27,5 13,8% de uso de drogas entre familiares de los usuarios de alcohol

Alcohol Tabaco Alcohol/Tabaco -(n= 57 personas) 44 8 22 -

Leyenda: Nº = número de escolares y % = percentaje. Fuente: Formulario de investigación.

CONCLUSIONES

En comparación el uso del tabaco y del alcohol en esta población se considera bajo el consumo del 1o y

elevado del 2o y aún apuntándose con un recurso adecuado al no uso la conciencia de los daños que causan.

Como las estrategias de prevención vienen siendo recomendadas, principalmente hasta los 18 años, son

necesarios estudios que apunten tales acciónes y su significancia.

AGRADECIMIENTOSAl Raimundo Bahia Pantoja por el apoyo técnico.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

CHAIEB, JOSÉ & CASTELLARIN, CÁSSIO. Associação tabagismo-alcoolismo: introdução as grandes

dependências humanas. REVISTA DE SAÚDE PÚBLICA. v 32 Nº3 246-54 São Paulo. junho, 1998.

[WWW.LIBRARY.BR]

CORRÊA, F.K.; et al. Uso de álcool e drogas por estudantes de medicina da Unesp. REVISTA BRASILEIRA

DE PSIQUIATRIA. vol 21 n°2 São Paulo, abr./jun. 1999. [WWW.SCIELO.BR]

ELDERS, M.J. et al. The reports of the surgeo general: preventing tabacco use among young people. Am.

J.PUBLIC.HEALTH. vol.84, p.543-7, 1984.

LIMA, M. S.DE; TAVARES, B. F. & BÉRIA, J.U. Prevalência do uso de drogas e desempenho escolar entre

adolescentes. REVISTA DE SAÚDE PÚBLICA. vol 35 n°2 São Paulo. abril, 2001. [WWW.SCIELO.BR]

MESSAS, G. P. A participação genética nas dependências químicas. REVISTA BRASILEIRA DE

PSIQUIATRIA. vol 21 nº2 São Paulo. outubro, 1999.[WWW.SCIELO.BR]

VALORACIÓN DE LA TOXICIDAD AGUDA DE OURATEA SEMISERRATA CLANS.

ESPIRITO – SANTO, A.P.1; FARIAS, T.P.O.1; VALADARES, Y.M.2; OLIVEIRA, A.B.2; BRAGA, F.C.2;

CARVALHO, R.A.3 y DOLABELA, M.F.1

1Cesupa- Centro de Ensino Superior do Pará; 2 Faculdade de Farmácia, Universidade Federal de Minas

Gerais; 3Instituto Evandro Chagas. Direción para correspondência: Av. Nazaré, 630, cep. 66035-170. Belém,

PA, Brasil. E-mail: fani@canal13.com.br

RESUMEN

En este trabajo se valoró la toxicidad aguda dosis única del extrato hidroalcóolico del caule de Ouratea semisarrata

Clans. Para realización de este ensayo se utilizó ratones pequeños Mus musculus adultos y machos, que fueron

pesados y tratados con el extrato y observados inmediatamente, 24 y 48 horas despues del tratamiento. Despues 48

horas los animales supervivientes fueron sometidos la punción intracardíaca, y la sangre fue utilizado en examenes

bioquímicos (glucosa y colesterol). Los resultados obtenidos sugieren que el extrato tiene toxicidad elevada, y

tambien promove redución de los niveles sanguíneos de glucosa y no altera significativamente los niveles de

colesterol.

Palabras claves: Ouratea semiserrata Clans, toxicidad

SUMMARY

The severe drugs problems (single dose) were appraised from O. semiserrata Clans hidroalcoholic extrate. Males

and adult mice were used in this study. They were weighed, treated with extrate and observed, immediately, 24 and

48 hours after treatment. After 48h, survival aminals suffered intracardiac punches. The collected blood was used in

biochemistry exams (glycosis and colesterl). The extrate has so high toxic level and it promotes glycosis blood level

reduction, but it doesn’t transform the colesterol levels so much.

Key words: Ouratea semiserrata Clans and irritation

INTRODUCIÓN

La Ouratea semiserrata pertenece a la família Ochnaceae que es una grande família de árboles que ocurron

en las regiones pantotropicais siendo constituída por cerca de 600 espécies, distribuídas en 39 géneros (VELANDIA

et al., 1998a y b). Ouratea semiserrata (Mart.) Engl. corresponde la un arbusto de tamaño medio, con hojas de bordas

serrilhadas y flores pequeñas, con pétalos amarillos (VELANDIA, 1997).

La actividad inibidora in vitro de la enzima conversora de angiotensina (ECA) fue previamente relatada

para el extrato de caules de Ouratea semiserrata Clans (BRAGA et al., 2001), bien como su actividad relaxadora en

preparaciones de aorta (Cortes et al., 2002). El presiente trabajo tebe como objetivos valorar la toxicidad aguda del

extrato de O. semiserrata y determinar su actividad sobre los niveles de la sangue de glucosa y colesterol.

METODOLOGIA

La planta fue coletada en la Serra do Cipó, MG, en octubro de 1999 y su excicata se encuentra en el

herbário do ICB/UFMG, sob el número 49269. El material vegetal pulverizado fue sometido a la extracción por

percolación exhaustiva con etanol a 96o y concentrados en evaporador rotatório, a 70ºC ,sob presión reducida

(VALADARES, 2000). Durante los ensayos, el extracto fue solubilizado en água destilada, permanecendo en

banho-maria por algunos minutos, para mejor solubilización, y todo el processo protegido de la luz.

Los animales seleccionados fueron ratones pequeños Mus musculus, procedentes del Biotério del Instituto

Evandro Chagas, pesando entre 34-36g (± 35g), edad entre 55- 58 días. Estos animales fueron acondicionados en

cajas de polipropileno autoclaves (Beiramar – modelo GC 111/30x20x13cm), con tapa tipo reja en acero inoxidável

y divisiones para ración balanceada y água. Las cajas fueron forradas con cáscara de arroz autoclavadas (cama de

los animales) y mantenidas en temperatura ambiente de 21 a 23ºC, con alternancia de luz la cada 12 horas y libre

acceso a la água y la comida (ração nuvital/Curitiba-Paraná/tipo: nuvilab)

Durante la execución del ensayo, el peso de los animales fueron determinados en balanza digital (Marte

A500) siendo que este procedimento fue realizado tambien 24, 48 y 72 horas despues del tratamiento. Por via IP

fueron adminstrados las siguintes dosis 2,42g/Kg; 0,47g/Kg; 0,123g/Kg; 0,013g/Kg e 0,0015g/Kg.

Los efeictos fueron observados, inmediatamente, 24, 48 y 72 horas despues el aplicación. Simultaneamente,

se anotó la tasa de mortalidad y la Dl50 (dosis letal 50%) fue calculada por el método próbito. Una observación

clínica de los síntomas producidos pela administracion de la substancia fueron observadas. Despues de las

observaciones de 72 horas, fueron realizadas las punciones intracardíaca en los ratones pequeños que superviveron

al tratamiento, con la sangre obtenido fueron realizados los examenes bioquímicos (glucosa y colesterol). Se resalta

aún que todos los animales sometidos a la sangria morreron.

La dosagem de glucosa sangüínea fue realizada pelo método enzimático, Glicose oxidase, Colorimétrico y

de Ponto final (LABORLAB). Yá la dosagem de colesterol sangüínea fue realizado pelo método enzimático

Colesterol Oxidase, Colorimétrico y de Punto final (LABORLAB). Los resultados fueron analisados

estatisticamente at ravés del teste t de Student, y fueron considerados significativos diferentes cuando p <0.05.

RESULTADOS E DISCUSIÓN

La DL50 fue de 0,092 + 0,038 g/Kg siendo el extrato considerado extremamiente tóxico (DL50 < 0,2g/kg de

animal). Los animales tratados, con las dosis de 2,42 y 0,47g/kg de animal, presentaron prostración en todas las

observaciones (100%) y vello eriçado (100% en 72h). La prostracion puede estar relacionada a un cuadro

hipotensivo inducido por el extracto de Ouratea semisserata. A pesar de prostrado, estos animales presentaron

aumento del peso semejante al grupo control (p>0,05, Teste T Student). El aumento de peso de estos animales

puedon o no estar relacionado la presencia de edema, secundário la hipotensión.

Examenes bioquímicos demonstraron que ocurreron redución en la tasa glicemica dosis – dependiente y

aumento de la tasa de colesterol sangüíneo, tambien dosis-dependiente (Tabla 1). La reducion de la tasa de glucosa

puede estar relacionada la inhibición del sistema nervioso simpático, esta inibición debe estar relacionada al

principio activo que inhibio la ECA causando vasodilatación. Yá el aumento de; colesterol, puede tambien esta

relacionado con o principio ativo de la planta.

Tabla 1 :Resultados de los examenes bioquímicos de glucosa e colesterol

Dosis (g/Kg ) Tasa Glucose + SD Tasa de Colesterol + SD

Control 114,28 + 36,55 142,5 + 64,5

2,42 ∗ ∗0,47 57,69 + 0 212,5 + 00,123 72,11 21,4 182,5 + 24,490,013 ⊕ ⊕0,0015 112,63 + 18,73 162,5 + 41,45Leyenda: ∗ animales mortos; ⊕ perda de los animales durante el ensayo. ( ) diferente del control (p<0,05, Ensayo

T- Student), ( ) igual al control (p>0,05, Ensayo T- Student). Fuente: Formularios de investigaciones.

CONCLUSIÓN

Los resultados obtenidos sugerem que el extrato de caules de O. semiserrata tiene toxicidad elevada (CL50

< 0,2 g/Kg), y promove reduciones de los niveles sanguíneos de glucosa y no altera significativamente los niveles de

colesterol.

AGRADECIMIENTOS

Al Raimundo Bahia Pantoja por el apoyo técnico.

APOYO FINANCIERO: Centro de Ensino Superior do Pará y Instituto Evandro Chagas (FUNASA)

REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICA

BRAGA F.C., WAGNER H., LOMBARDI J.A., OLIVEIRA A.B. Phytomedicine 2001 7: 245-50.

CORTES S.F., VALADARES Y.M., LEMOS V.S., BARBOSA M.P.T., OLIVEIRA A.B., BRAGA F.C. Planta

Med. 2002 (in press).

VALADARES, Ydia Mariele; et al. Estudo Fitoquímico e Avaliação da Atividade Hipotensora de Ouratea

semiserrata Clans., Ouratea Castanaefolia Engl. E Ouratea spectabilis (Mart. ) Engl. Dissertação de Mestrado.

Faculdade de Farmácia: Belo Horizonte, 2000.

VELANDIA, J, R. Constituintes Químicos de Ouratea semiserrata e Tranformações Químicas da Neoglia

Aureína. Janeiro Tese de Doutorado Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, 1997.

VELANDIA, J, R.; CARVALHO, M. G., BRAZ-FILHO, R.Novel trichloro- and terAChloroisoflavone isolated fron

Ouratea semiserrata. Nat. Prod. Lett., v.12, p.191-198, 1998. (a)

VELANDIA, J, R.; CARVALHO, M. G., BRAZ-FILHO, R. Ácido ent-16, 17 diidroxicauran-19-óico isolado de

Ouratea semiserrata e os desafios estereoquímicos dos carbonos quirais C-4 e C-16. Química Nova, v.21 (4), p.397-

404, 1998.(b)

EVALUACIÓN FARMACOLÓGICA DE LA SERIE HOMÓLOGA DE LOS 1-O-ALQUILGLICEROLES EN EL MODELO DE EDEMA INDUCIDO POR CARRAGENINA.

Miguel Bilbao Díaz, Yolanda Valdés Rodríguez, José Luis león Álvarez, Francisco Merchán González,Iván Santana Segura y Yadira Peña Proenza.Instituto de Farmacia y Alimentos. Universidad de la Habana. Ave. 23 No. 21425 entre 214 y 222, LaCoronela, La Lisa, Ciudad Habana. Teléf: (537) 2715512 Fax. (537) 336811. E-Mail: bilbao@ifal2.uh.cu

IntroducciónLa reducción de la respuesta inflamatoria en modelos animales constituye un factor de extraordinariaimportancia a la hora del establecimiento de compuestos con efectos antinflamatorios. A partir deldescubrimiento de los 1-O-alquil gliceroles en 1921, algunos investigadores han evaluado los efectosfarmacológicos de este grupo de compuestos. Dentro de los efectos más importantes que se hanencontrado sobresalen: los antitumorales directos, antinvasivos, adyuvantes de poliquimioterapia (1,2),inmunoadyuvantes (3,4), inductores de la diferenciación celular y la apoptosis (5) y antinflamatorios (1).Uno de los mecanismos por los cuales se han propuesto a estos compuestos como antinflamatorios loconstituye la inhibición de la FLA2 en diversos modelos experimentales (1,6).Teniendo en cuenta este hipótesis y además los resultados que se han obtenido con las mezclas de los 1-O-Alquil gliceroles naturales sobre la reducción de la respuesta inflamatoria (1), nos propusimos en estetrabajo evaluar los efectos de la serie homóloga de los 1-O-alquil gliceroles sintéticos en un modelo deedema inducido por carragenina.

Materiales y Métodos Modelo de inflamación local Aguda inducida por carragenina.

La acción antinflamatoria, fue seguida a través de la inducción del edema por carragenina, según la técnicadescrita por Winter y el PNT 0123 del CEIEB, donde se usó el Pletismómetro Ugo Basile 7150 para ladeterminación de la variación de volumen en cada uno de los casos.Se emplearon ratas Wistar hembras de 175 a 250 g de peso. Se dividieron en grupos experimentales congrupos de tratamiento (n=5), donde fue testada la modificación de la actividad proinflamatoria de lacarragenina a la 3 hora de trabajo (3h), por parte de los 1-O-alquilgliceroles sintéticos (1-O-octadecil glicerol(C18), 1-O-hexadecil glicerol (C16) y el 1-O-dodecil glicerol (C12) disueltos en una solución hidroalcohólica,donde se comparó dichas actividades respecto a un grupo tratado con Indometacina (Sigma) 5 mg/kg comocontrol positivo.

Análisis Estadístico.En el caso del experimento antinflamatorio se calcularon los estadísticos de posición y dispersión en cada unade las muestras experimentales (tiempo/sustancias). Con el objetivo de corroborar las premisas requeridaspara la aplicación de un análisis de varianza, se aplicó el test de Kolmogorov- Smirnov, así como diversaspruebas para establecer la condición de homogeneidad de varianzas muestrales. Posteriormente se aplicó unanálisis de varianza Modelo Factorial (efectos fijos) tomándose como factores, a los tiempos y a las distintassustancias usadas en el experimento.Al encontrarse diferencias significativas para cada factor (tiempo y sustancias) se aplicó un test de rangosmúltiples de Duncan para cada factor por separado, además se aplicó un análisis de varianza de clasificaciónsimple (efectos fijos).

Resultados y Discusión.• Resultados obtenidos para los 1-O-alquilgliceroles evaluados.

Tabla 1: Efectos del C18 sobre la inflamación local aguda inducida por carragenina, con una n =5 ratas y 5grupos experimentales.

Grupos % de Inflamación (3h)(X±DS)

% de Reducción de laInflamación (3h)

Carragenina (1%) 52,8 ± 4,2 -

Indometacina (5 mg·kg-1) 23,9 ± 5,4 54,73 (a)

C18 (3 mg·kg-1) 35,6 ± 4,1 32,57 (b)

C18 (5 mg·kg-1) 41,1 ± 1,8 22,15 (b)

C18 (7 mg·kg-1) 40,2 ± 2,4 23,86 (b)

Grupos con al menos una letra en común no tienen diferencias significativas (p<0,05).

Tabla 2: Efectos del C16 y la mezcla C16:C18 (1:1) sobre la inflamación local aguda inducida por carrageninacon una n =5 y 5 grupos experimentales.

Grupos % de Inflamación (3h)(X±DS)

% de Reducción de laInflamación (3h)

Carragenina (1%) 68,0 ± 7,5 -

Indometacina (5 mg·kg-1) 30,0 ± 6,3 55,88 (a)

C16 (1 mg·kg-1) 47,0 ± 8,2 30,88 (b)

C16 (3 mg·kg-1) 43,0 ± 8,8 36,76 (b)

C16 +C18 (1 mg·kg-1) 28,0 ± 5,1 58,82 (a)

Grupos con al menos una letra en común no tienen diferencias significativas (p<0,05).

Tabla 3: Efectos del C12 sobre la inflamación local aguda inducida por carragenina con una n =5 y 5grupos experimentales.

Grupos % de Inflamación (3h)(X±DS)

% de Reducción de laInflamación (3h)

Carragenina (1%) 73,0 ± 2,5 -

Indometacina (5 mg·kg-1) 21,0± 3,5 71,23 (a)

C12 (3 mg·kg-1) 56,0 ± 2,9 23,28 (b)

C12 (5 mg·kg-1) 60,0 ± 4,1 17,08 (b)

C12 (7 mg·kg-1) 62,0 ± 4,.8 15,06 (b)

Grupos con al menos una letra en común no tienen diferencias significativas (p<0,05).

En la tabla 2 se presentan los valores más significativos obtenidos para los 1-O-alquil gliceroles evaluados ala 3h, intervalo al cual se obtuvo el pico máximo de inflamación inducido por la carragenina. En la tablapuede observarse como el C16 (1 y 3 mg·kg-1) provocó una disminución entre un 30.88% y un 36.76%respectivamente de la inflamación inducida por carragenina. Este efecto resultó significativamente diferente(P<0.05) versus la indometacina (5 mg/kg). Sin embargo, la mezcla del C16 y el C18 (1 mg/kg de peso) mostróuna reducción significativa (P<0.05) del % de la inflamación provocado por la carragenina, y éste valor(58.82%) no difirió del mostrado por la indometacina (5 mg·kg-1 de peso), lo cual coincide con trabajosanteriores donde se utilizaron mezclas de 1-O-alquil gliceroles, las cuales redujeron la respuesta inflamatoriainducida por la carragenina de igual forma que la indometacina a la misma dosis utilizada de 5 mg·kg-1 (1).Con respecto al C18 y C12, aunque también fueron capaces de reducir la respuesta inflamatoria inducida por lacarragenina a la 3h, no resultaron estadísticamente diferentes al compararse con la indometacina. Al parecer,aunque estos compuestos tienen efectos sobre la reducción de la respuesta inflamatoria, necesitan utilizarseen mezclas para lograr un efecto farmacológico sinérgico y poder reducir la respuesta inflamatoria inducidapor la carragenina.

Bibliografía.1- Valdés Y: Propiedades Biológicas de los 1-O-Alquilgliceroles de origen marino. Tesis de Doctorado enCiencias Biológicas. Universidad de la Habana, 1997.2- Sotomayor H: Efectos antitumorales in vivo de los 1-O-Alquil gliceroles del aceite de hígado detiburón Galeocerdo cuvieris y del 1-O-Hexadecil glicerol sintético. Tesis en opción al título de Master enCiencias. Universidad de la Habana, 1999.3- Valdés Y, Pignol B, Coulomb H, Sedeño C y Braquet P: Efecto de los 1-O-Alquil gliceroles sobre laproducción de citoquinas por macrófagos humanos. J. Biomedical Supl. 11(10) 1991.

4- Pignol B, Chaumeron S, Coulomb H, Maisonnet T, Vandamme B, Broquet C, Mencia-huerta Y(1992): citado por Houlihan WJ, Lohmeyer M, Workman P y Cheon S: Phospholipid antitumor agents.Medicinal research reviews 15(3): 157-223, 1995.5- Hernández M: Efecto de los éteres lipídicos sobre líneas tumorales del sistema nervioso. Libro deResúmenes I Congreso Internacional Farmacología’98. La Habana, Cuba. pp. 72, 1998.6- Burford, RG, and Gowdey, C.W. Anti-Inflammatory activity of alkoxyglycerols inrats.Inter:Pharmacodyn.,173:56-70,1968.

EVALUACIÓN DE LA IRRITABILIDAD DERMICA DE UN PRODUCTO DE BASE SILÍCICA CON

ACTIVIDAD FARMACOLÓGICA DEMOSTRADA.

Autores:

MSc. Mirta Morales Díaz. ∗, Dr. Remigio Cortés Rodríguez∗∗, Dr. Omar Prieto García∗∗∗, Dr Orel Pérez García∗∗∗∗

∗Departamento de Farmacia.Universidad Central de Las Villas, ∗∗Centro de Bioactivos Quimicos.Universidad Central

de Las Villas, ∗∗∗ Departamento de Química. Universidad Central de Las Villas, ∗∗∗∗ Investigador de la planta de

zeolitas de Tasajeras. Villa Clara.

Resumen:

En nuestro grupo de investigaciones fue sintetizado un producto de base silícica, hasta el momento no reportado en la

literatura denominado Dermasel que ha demostrado poser muy buena actividad cicatrizante y antibacteriana en los

ensayos con animales de laboratorio

Se realizó su estudio de Irritabilidad Dérmica, para ello se utilizó la técnica propuesta por Draize en 1944. Se

utilizaron conejos albinos jóvenes adultos de la raza Nueva Zelanda, conformándose dos grupos de tres animales cada

uno a los que se les depiló la región dorsal, seleccionando cuatro áreas de 2.5x 2.5 cm, las que fueron numeradas en

zona 1,2,3,4 aplicándoseles el producto en forma pura, al 15%, 5% y una zona como control respectivamente. A las

zonas tratadas se les aplicó 0.5g del producto y se cubrieron con parches de 6cm2 durante cuatro horas, se lava y se

evaluan los resultados. Se tomaron muestras de piel para evaluarlas microscópicamente, no detectándose alteraciones

en ninguno de los casos . El producto resultó clasificado de no irritante a ligeramente irritante sobre piel, mostrando

una relación dosis-respuesta. Esto resulta favorable con vistas a una posible aplicación.

Introducción:

En la actualidad se encuentran variadas aplicaciones de productos de base silícica en la rama veterinaria,

microbiología, agricultura, e industria farmacéutica, donde se reportan diversos trabajos de su aplicación en

preparaciones usadas sobre la piel . A partir de los años 80 se intensificaron las investigaciones con vistas a

diversificar su uso. En este sentido en nuestro grupo de investigación fue sintetizado un producto de base silícica, hasta

el momento no reportado en la literatura denominado DERMASEL1, que ha demostrado poseer muy buena actividad

como cicatrizante y antibacteriano, por lo que se decidió comenzar su estudio toxicológico.

Materiales y Métodos:

La técnica expuesta desarrolla una metodología donde se empleó la escala de puntuación propuesta por Draize; 1944

para observar macroscópicamente si existe edema y eritema en la piel.

Se determinó la irritabilidad primaria en este órgano según las observaciones macroscópicas en esta estructura ,

clasificando la sustancia en irritante o no de acuerdo con la tabla de irritación propuesta por la OECD, 19972. En esta

técnica la estadística no procede por ser un método estandarizado.

Se utilizaron conejos albinos jóvenes adultos de raza Nueva Zelanda, de edad entre 5 y 7 meses, con una masa

corporal entre 2,5 y 3 kg , los cuales portaban el certificado de salud. La alimentación fue la recomendada para la

especie. Se conformaron 2 grupos de 3 animales cada uno para probar concentraciones diferentes (5% y 15%) del

principio activo, la asignación de los animales a cada grupo se realizó de forma aleatoria, así como las zonas donde se

efectuó la aplicación del mismo. Los animales se distribuyeron de forma individual en jaulas para conejos, marcados

mediante presillado en la oreja. Tanto la alimentación como el agua se administró ad libitum .Los utensilios se

fregaron con agua de la pila y detergente, secados al horno y esterilizados en la autoclave al igual que el pienso y el

agua.

Los animales se colocaron en cepos, depilando la región dorsal, seleccionando cuatro áreas de 2,5 x 2,5cm, 24 horas

antes de la aplicación, dos de ellas se afectaron con un objeto cortante fino que sólo dañó la epidermis, corroborado

por la ausencia de sangramiento. Las mismas se numeraron según el diseño acorde con la metodología modificada por

Knapec y Beitz 1976, para valorar la piel. Donde las áreas son numeradas aleatoriamente en zonas 1, 2, 3 y 4, la

numeración corresponde respectivamente a la aplicación del producto puro, forma terminada al 15%, forma terminada

5 % y control.

A las zonas tratadas se les aplicó 0,5 g del producto y se cubrieron con los parches de 6 cm2 recomendados

internacionalmente, sostenidos por una cinta adhesiva no irritante. El tiempo de exposición fue de 4 horas, al concluir

el mismo se eliminaron los parches y se lavó con agua atemperada, comenzándose a evaluar las manifestaciones de

edema y eritema según la escala de Draize. Las lecturas se efectuaron a 1, 24, 48 y 72 horas , los estudios de

reversibilidad de las lesiones transcurren hasta 21 días.

Se calcula el Indice de Irritabilidad Primaria en Piel (IIPp) mediante la suma individual de edemas y eritemas

dividiéndose entre el número de animales por la cantidad de observaciones desechándose las efectuadas a la hora, el

resultado del IIPp se lleva a la escala propuesta por la OECD, 1997 para piel, se clasifica el producto y se aprueba o se

rechaza.

Al concluir el experimento se efectúa la eutanasia y se extraen muestras de piel de los animales dañados para estudios

histopatológicos y estudios de reversibilidad del efecto.

En la preparación de la crema (5%,15%) se utiliza una mezcla de PEG 400 y PEG4000, según lo recomendado en la

farmacopea. El principio activo puro se aplica directamente sobre la piel después de ser remojado con agua.

Resultado y discusión:

Al realizar este tipo de estudio para el producto DERMASEL, se obtuvieron los resultados siguientes:

Al valorar la formación de eritemas y edemas y determinar el IIPP se obtienen valores comprendidos en el rango desde

0.5 a 1.3, lo que nos permite evaluar este producto de origen zeolítico como no irritante, siguiendo como criterio de

clasificación el elaborado por Draize que asume como no irritante a aquellas sustancias con IIPP menores de 2.0. Al

usar como criterio de clasificación el propuesto por la OECD en 1997 es clasificado como ligeramente irritante ya que

los valores de IIPP están comprendidos entre 0.4 y 1.9. No fue observado en los animales durante el tiempo del ensayo

ningún otro síntoma que indicara manifestaciones tóxicas, los mismos se mantuvieron siempre con buen estado

general y apetito normal.

Los resultados obtenidos están acordes con lo reportado por otros autores al utilizar este tipo de producto en

preparaciones cosméticas de baja irritabilidad 3,4,5,6 .

A las 72h los signos de irritabilidad son muy bajos para la mayoría de los animales. Al continuar las observaciones se

pudo comprobar que ya al quinto día post-aplicación ningún animal presentaba manifestaciones de eritemas o edemas,

situación que se mantuvo hasta los 21 días inicialmente establecidos para observar reversibilidad.

En la tabla 1, se aprecia que a pesar de obtenerse valores de irritabilidad muy bajos, estos son mayores en la piel

dañada que para la piel intacta, lo cual es justificable, teniendo en cuenta que en esta zona la integridad física de la piel

como barrera eficaz a la acción de diferentes agentes está afectada7 . Además se observa como el grado de irritación

aumenta en la medida que aumenta la concentración del producto, lo que evidencia una relación dosis respuesta.

Tabla 1. Piel dañada e intacta evaluada a las 24, 48 y 72 horas

Piel Dañada Piel Intacta.

Sustancia IIP IIP

Zeolita Pura 1.3 0.9

Zeolita 15% 1.16 0.6

Zeolita 5% 1.05 0.5

IIP: Indice de Irritabilidad Primaria.

A pesar de que no fueron detectados síntomas tóxicos, se confeccionaron 2 réplicas de láminas (por cada

concentración empleada) con muestras de piel, para su estudio microscópico, no detectándose alteraciones en ninguno

de los casos.

Teniendo en cuenta los resultados satisfactorios obtenidos por este producto en las pruebas farmacológicas en la cura

de quemaduras y teniendo además presente que la extrapolación al humano de los resultados obtenidos en los estudios

de irritabilidad en animales es limitado7,8 y a pesar de que en nuestro ensayo se utilizan como animales de

experimentación conejos albinos, cuya piel resulta muy sensible a las sustancias irritantes, es recomendable corroborar

estos resultados con otra especie animal, lo cual dará validez a su extrapolación al humano.

Conclusiones

1. El DERMASEL resultó ser clasificado de no irritante a ligeramente irritante sobre piel con valores de IIP mayores

para piel dañada, mostrando una relación dosis - respuesta tanto para la piel dañada como para la intacta.

2. Los efectos tóxicos causados manifestaron reversibilidad al ser aplicado el producto sobre la piel.

Bibliografía

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dermatitis.Japan Kokai Tokkyo Koho.J P. 6:285,1994.

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Tokkyo Koho. J P.2:273,1990.

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Toxicol.Appl.Pharmacol. 19:276-280,1971

“ Ciguatera:Clínica y epidemiología de l61 pacientes.”

Autores: Dr. Reynaldo B. Hevia Pumariega, Dr. Angel Suárez Escandón, Dra. Alida O.Hernández Mullings y Dr. Javier Herrera Acosta.

CENTRO NACIONAL DE TOXICOLOGIA.( CENATOX).

INTRODUCCION:

La ciguatera es una enfermedad conocida desde hace siglos, causada por la ingestión deuna gran variedad de peces de hábitat coralino que acumulan las toxinas por vía de lacadena alimentaria, siendo propia de áreas tropicales y subtropicales (1).Varios son los aspectos que pueden influir en el desarrollo de la toxicidad, ninguno de ellosexento de polémicas: edad, sexo, área geográfica, condiciones ambientales, estación delaño, tipo de pez, porción y cantidad ingerida, antecedentes previos de la enfermedad,variabilidad individual, toxinas presentes, ruta de intoxicación y otros (1,2).Las manifestaciones clínicas son pleomórficas y pertenecen a tres grupos fundamentales(gastrointestinales, neurológicas y cardiovasculares), ellas son debilitantes y tienden aprolongarse por semanas, meses o años; es de suma importancia el conocimiento de lasmismas por ser el diagnóstico clínico (3,4).Esta investigación tiene como objetivo analizar algunas características clínicas yepidemiológicas de la ciguatera.

METODO:

Se realizó un estudio descriptivo de carácter retrospectivo, para lo cual se revisaron todaslas historias clínicas de los pacientes ingresados por ciguatera en el CENATOX entreNoviembre de 1998 y Octubre del 2001. De cada una de ellas se recogieron las siguientesvariables: tipo de pez, manifestaciones clínicas iniciales, período de incubación, cuadroclínico general y evolución.Se confeccionó una base de datos que fue procesada en una computadora personal PentiumMMX con Windows 98 y Software Microsoft Excel (Microsoft Office 2000). Losresultados se dan en porcientos y se muestran en tablas y gráficos.

RESULTADOS:

Se ingresaron 161 casos los cuales se distribuyeron en todos los meses, predominando enel período Mayo-Agosto con 92 pacientes (Tabla No. 1).

Tabla No. 1: Distribución de ingresos por meses.

Enero Feb. Mar. Abril Mayo Jun. Jul. Agos. Sept. Oct. Nov. Dic. TotalNo. 14 8 12 12 27 24 21 20 9 7 5 2 161% 8,7 5 7,5 7,5 16,8 14.9 13 12,4 5,6 4,3 3,1 1,2 100

Fuente:Registro de ingresos del CENATOX.

Se identificaron 18 tipos de peces: Picúa 53 (32,9%), Aguají y Cherna 9 para ambos(5,6%), Serrucho 8(5%), Gallego 7(4,3%), Sierra 7 (4,3%); otros como Pargo, Dorado,Medregal, Salmón, Peto, Emperador también aparecieron. De los afectados 46desconocieron la especie ingerida.El período de incubación varió de 30 minutos hasta 72 horas, siendo en 132 (82%) de losenfermos menor de 12 horas. Las manifestaciones clínicas iniciales predominantes fueronlas gastrointestinales en 122 casos para un 75,8% , seguido de astenia 9,3%, neurológicas

8,1%, prurito 3,7% y las relacionadas con el sistema osteomioarticular 3,1%.(Gráfico 1).

Gráfico No. 1: Manifestaciones clínicas de debut.

Fuente: Historias Clínicas.

Los síntomas y signos ascendieron a 42, siendo los más significativos: diarreas(70,8%),astenia(67,1%), acroparestesias (58,4%), vómitos (55,3%),parestesias en labios y lengua(54,7%), disestesias paradójicas (42,2%). Se observaron con menor frecuencia: artralgias,molestias abdominales, mialgias, prurito, hipotensión, náuseas, cefalea, odontalgias,mareos, visión borrosa, ardentía genital, fiebre y otros.Todos los pacientes mejoraronegresándose en las primeras 72 horas.

DISCUSION:Se ha sugerido una toxicidad estacional de los peces, planteándose que las especiescapturadas entre los meses de Febrero-Agosto tienen más probabilidad de estar ciguatos(3,5); tuvimos casos todos los meses del año aunque con mayor incidencia en el períodoAbril-Agosto. Creemos que la teoría de la cadena alimentaria justifica que las toxinaspermanezcan en los mismos durante años, pero el auge de la pesca en verano y elfenómeno de las mareas rojas pueden contribuir al incremento del número de afectadosdurante esta estación.Hasta el presente se ha vinculado la intoxicación con alrededor de 425 especies (6); a pesarde estar descrita la misma en peces no ciguatos (5), es significativo algunas referencias(serrucho, cherna, pargo, emperador y salmón) lo cual pudo deberse a confusiones porparte de pescadores y consumidores o a la venta ilícita de forma irracional por comerciantesindividuales con fines lucrativos.

Gastrointestinales Astenia Neurológicas Prurito SOMA

El período de incubación concuerda con la mayoría de los reportes (1,3); aunque no sepuede describir una secuencia exacta de las manifestaciones lo más común es que lasgastrointestinales sean las iniciales, esto puede atribuirse a un efecto local irritativo sobre lamucosa digestiva mientras que los cambios a otros niveles parecen requerir más tiempo.Se han señalado alrededor de 175 síntomas en la enfermedad. Encontramos 42 concaracterísticas muy variables y con una frecuencia similar a la habitualmente descrita(1,3,4). Por lo anterior podemos plantear que el antecedente de ingestión de pescadoasociado a un cuadro gastrointestinal y neurológico sugieren este diagnóstico. El prurito ylos trastornos cardiovasculares no resultaron comunes quizás por las variaciones reportadasen las diferentes zonas geográficas (1,3). La presencia de fiebre (manifestaciónexcepcional) pudiera responder a la acción de alguna de las toxinas involucradas sobre elcentro termorregulador del hipotálamo.Todos los pacientes mejoraron en breve tiempo posiblemente por la evolución natural de lapatología (cuadro gastrointestinal fugaz) combinado con la terapéutica establecida.

CONCLUSIONES:1.- La ciguatera apareció durante todo el año con predominio en el verano.2.- Las especies tóxicas fueron diversas, siendo más común la barracuda.3.- El inicio resultó precoz con síntomas gastrointestinales.4.- Las manifestaciones clínicas fueron múltiples primando las digestivas y neurológicas, las cuales mejoraron en breve tiempo.

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Ann Interm Med 1995; 122(2):113-4.

Estudio bioquímico y cardiovascular de pacientes drogodependientes.

Autores: Lic. Onel Fong Lores, Lic. Maibia Tamayo Irzula, Lic. Clara Azalea Berenguer Rivas, Lic. Daniel

Reina, Dra. Liset García Cabrera, Lic. José Carlos Rodríguez Tito, Dr. Alberto Cutié Bressler.

Institución: Centro de Toxicologia y Biomedicina. Autopista Nacional Km 1 ½. Apdo Postal 4033, CP:

90400. Santiago de Cuba. Cuba. fong@toxi.scu.sld.cu

Resumen: El consumo de drogas ha sido, es, y lamentablemente seguirá siendo uno de los problemas más

acuciantes que la sociedad actual tiene planteados. Nuestro país se ha sumado a la lucha mundial contra este

flagelo, llevando a cabo labores de prevención y atención a la drogodependencia, donde nuestra provincia se

ha insertado con la apertura de un Servicio de Deshabituación en el Hospital Clínico Quirúrgico Gineco-

Obstétrico General Santiago. Un total de 160 pacientes bajo tratamiento en este Servicio fueron evaluados en

el Centro de Toxicología y Biomedicina, en el período de enero del 2001 a mayo del 2002, donde se

identificaron las sustancias o grupos de ellas, que con mayor frecuencia fueron consumidas por estos

pacientes y se monitoreó el comportamiento de parámetros bioquímicos y cardiovasculares. El Alcohol (99

%) y la Marihuana (65 %) fueron las sustancias que más se utilizaron. Las enzimas hepáticas Aspartato

aminotransferasa (62.5 %) y Fosfatasa alcalina (55 %), fueron las más afectadas, así como los metabolitos

Proteína (45 %) y Glucosa (35 %). Desde el punto de vista cardiovascular, la Hipotensión Arterial (32.5 %),

la Alteración de la Frecuencia Cardíaca (17.5 %) y el Trastorno de la Conducción (15 %) fueron las

afectaciones más prominentes. Estos resultados ameritan profundizar en el conocimiento de las drogas de

abuso, y dirigir principalmente los esfuerzos, del personal médico y paramédico, hacia la prevención,

diagnóstico precoz, tratamiento y rehabilitación de la drogodependencia.

Introducción: En los albores del siglo XXI, el fenómeno drogas se califica como uno de los más graves

problemas de la humanidad, uno de sus principales retos, una preocupación común. Aunque en Cuba este

flagelo no es expresión, ni reflejo del modo de vida de la población, en los últimos años ha comenzado a

manifestarse progresivamente, debido fundamentalmente al auge de las relaciones internacionales y el

turismo, así como la situación económica del país. Es por estas razones que el Ministerio de Salud Pública ha

llevado a cabo en toda la Isla un Programa Nacional Integral de Prevención del uso Indebido de Drogas 1, en

el cual nuestra provincia se ha insertado elaborando el Programa para la Prevención del Uso Indebido de

Droga y Atención al Drogodependiente 2. Atendiendo a los objetivos de ambos programas se pone en marcha

un Servicio de Deshabituación en el Hospital Clínico Quirúrgico Gineco-Obstétrico General Santiago, el cual

en colaboración con el Centro de Toxicología y Biomedicina (TOXIMED) se encarga del tratamiento de

pacientes drogodependientes y debido a las particularidades del mismo en la provincia, se estudian los

posibles efectos que tienen estas sustancias en el organismo. Por estas razones realizamos el presente estudio

trazándonos los siguientes objetivos:

1. Identificar sustancias o grupos de sustancias que con mayor frecuencia son utilizadas por pacientes

drogodependientes que acudan al Servicio de Deshabituación del Hospital Clínico Quirúrgico Gineco-

obstétrico General Santiago.

2. Determinar las posibles variaciones en el comportamiento de parámetros bioquímicos, en pacientes

drogodependientes.

3. Caracterizar las posibles variaciones en el Electrocardiograma de pacientes drogodependientes.

Materiales y Métodos: Se realizó un estudio descriptivo-transversal, donde el universo de trabajo

correspondió con la muestra de 160 pacientes drogodependientes que acudieron al Servicio de

Deshabituación del Hospital Clínico Quirúrgico Gineco-Obstétrico General Santiago en el período

comprendido entre enero del 2001 y mayo del 2002. Los pacientes fueron remitidos inmediatamente al

Centro de Toxicología y Biomedicina, donde fueron realizados los estudios analíticos toxicológicos en orina,

para la identificación de las sustancias de consumo, los cuales se realizaron por Cromatografía de Capa Fina

(Silica Gel G60) en el caso de los medicamentos Barbitúricos, Benzodiazepinas, Anfetaminas, Trihexifenidilo

y por tira reactiva ACCUSTRIP para las drogas ilegales: cocaína, marihuana y opiáceos 3. A continuación se

realizaron los estudios bioquímicos en sangre: Hemoglobina (Método de Drabkin), Conteo Global y

Diferencial de Leucocitos, Glucosa (Método de Glucosa Oxidasa), Proteínas (Método de Biuret), Colesterol

total (Método de Pearson), Urea (Método de Berthelot), Alanin aminotransferasa ALAT y Aspartato

aminotransferasa ASAT (Método de Frankel y Reitman), Fosfatasa Alcalina (Método de Bessey), Amilasa

(Método de Smith-Roe-Ugolev) y Colinesterasa (Método de La Huerga) 4. Finalmente, se procedió al

Examen Clínico Cardiovascular y a la realización del Electrocardiograma.

Los resultados se procesaron con ayuda del paquete estadístico Statistica for Windows, versión 4.3, de tal

manera que permitieron obtener Estadígrafos como la Media, Desviación Estándar y Coeficiente de

Variación; determinándose además el porcentaje (%) de pacientes por cada variable, cuyos valores se

encontraron fuera de los límites normales registrados para cada una de las pruebas.

Resultados y Discusión: En los pacientes estudiados en este periodo se identificaron un total de 11

sustancias (Tabla I), donde predominó el consumo de alcohol (99 %), droga lícita de fácil adquisición y

amplia aceptación social, la cual ha resultado en la gran mayoría de los casos la droga portera hacia otras

sustancias tal es el caso de la marihuana (65 %), cuyo cultivo en zonas montañosas del territorio y recalo en

las costas cubanas ha contribuido a incrementar su uso. La poca disponibilidad de drogas ilícitas y el alto

costo que presentan algunas, así como el control de las drogas psicotrópicas en el país, hacen que se

favorezca la exploración de otras modalidades de consumo con la utilización medicamentos lícitos lo que

genera, y se demuestra de forma general en el estudio, la presencia de poliadicciones a los psicofármacos

(trihexifenidilo, fenobarbital, diazepam, amitriptilina, nitrazepam, meprobamato) los cuales se consumen

preferentemente mezclados con el alcohol. En este sentido el farmacéutico debe jugar un papel fundamental

para evitar el desvío y uso indebido de estos medicamentos, lo cual puede afectar el bienestar y la armonía de

su comunidad, haciéndose cada vez más necesaria la labor educativa de la población, en cuanto a las

consecuencias del consumo indiscriminado de estos medicamentos. Por último, a pesar de su alto costo, se

destaca el consumo de cocaína en sus dos modalidades inhalable y fumable (crack).

Tabla I. Sustancias identificadas en pacientes drogodependientes.

AlcoholMarih.TrihexifDiazepFenobCrackCoca InhAmitripNirazepBenadrilNo.

Pacientes1581047770615134202014%9965484438322114149Marih: marihuana, Trihexif: trihexifenidilo,

Diazep: diazepam, Fenob: fenobarbital, Crack: cocaína fumable, Coca Inh: cocaína inhalable, Amitrip:

amitriptilina, Nitrazep: nitrazepam, Benadril: benadrilina.

Los resultados del estudio bioquímico (Tabla II) reflejan alteraciones fundamentalmente en las enzimas

hepáticas Aspartato (ASAT 62.5 %) y Alanin (ALAT) aminotransferasas, así como la Fosfatasa alcalina (55

%), dado por la hepatotoxicidad de estas sustancias, en especial el alcohol y la cocaína, reportándose en

pacientes alcohólicos incrementos de los niveles de ASAT por encima de la ALAT 5. En el caso de Fosfatasa

alcalina, mayoritariamente sus valores fueron disminuidos, lo cual junto a la disminución en la síntesis de

proteína (45 %), muestran una tendencia a la desnutrición proteica del drogodependiente 6. A esto se suma la

hipoglicemia (35 %) y la anemia (13 %). También es de destacar la disminución de los leucocitos (32 %) en

estos pacientes, de ellos los Neutrófilos y los Linfocitos 7, lo cual trae aparejado una alteración del Sistema

Inmune, que propicia en estos pacientes la aparición frecuentes de enfermedades infecciosas.

Tabla II. Alteraciones bioquímicas y cardiovasculares en pacientes drogodependientes.

ASATALATFAAmilChEProt.Gluc.Col.Hb.Leuc.T.A.T.F.C.T.C.No.

pacientes10124783207256422151642824%63155520045352613324017.515ASAT: Alanin transaminasa,

ALAT: Alanin transaminasa, FA: Fosfatasa Alcalina, Amil: Amilasa, ChE: Colinesterasa, Prot: Proteínas

totales, Gluc: Glucosa, Col: Colesterol, Hb: Hemoglobina, Leuc: Leucocitos totales. TA: Tensión arterial,

TFC: Trastornos de la frecuencia cardíaca, TC: Trastornos de la conducción.

Las principales alteraciones cardiovasculares encontradas aparecen en la Tabla II, donde se destaca en primer

lugar el comportamiento de la Tensión Arterial (40 %), medida a través del Examen Clínico Cardiovascular.

En este caso se destacan 52 casos de Hipotensión Arterial (32.5 %), que deben estar asociados al alto

consumo de drogas depresoras del Sistema Nervioso Central 8, además se observaron 24 casos de

hipertensión (7.5 %) que se reportan fundamentalmente en pacientes consumidores de cocaína 9. Las

restantes alteraciones observadas están en relación con modificaciones de la Frecuencia Cardíaca,

específicamente Bradicardia (17.5 %), así como Trastornos de Conducción Intraventricular (15 %), dentro de

ellos los trastornos de Repolarización Ventricular y Bloqueos Ventriculares de Rama Derecha, debe

destacarse que estos bloqueos encontrados no se acompañan de alteraciones acústicas (Soplos), percibidos a

través de la auscultación de los pacientes estudiados.

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INFLUENCIA DEL TIEMPO DE ISQUEMIA SOBRE EL BALANCE REDOX EN UN MODELO DE

ISQUEMIA PARCIAL HEPATICA EN RATAS

M.C. Niurka Pons Rodríguez, Michel Batista Carvajal, Dr. Nelson Merino García, Dra. Olga Sonia León

Fernández.

Centro de Investigaciones y Evaluaciones Bilógicas, Instituto de Farmacia y Alimentos, Universidad de la

Habana.

Resumen

En el presente trabajo se realizó un estudio sobre la influencia que ejercen diferentes tiempos de isquemia sobre

algunos parámetros indicadores del balance redox utilizando para ello un modelo de isquemia parcial hepática en

ratas. Se seleccionaron tiempos de isquemia de 30, 60 y 90 min y se utilizó un grupo control no sometido a

isquemia. Se obtuvieron homogenados del lóbulo hepático isquémico para la determinación de los niveles de

peróxidos orgánicos totales, niveles de malonildialdehído (MDA) y actividad enzimática de catalasa. Se

obtuvieron además muestras de suero sanguíneo para determinar la actividad de aspartato amino transferasa

(ASAT) y se realizó un estudio histológico del lóbulo isquémico.Los resultados obtenidos muestran que en los

grupos sometidos a isquemia por 60 y 90 min se produjo un incremento de las concentraciones de peróxidos

orgánicos totales y de MDA respecto al grupo control. Por el contrario, los niveles de actividad de la catalasa se

mantuvieron invariables en todos los grupos experimentales. Desde el punto de vista histológico solo se

produjeron algunas modificaciones estructurales moderadas en los grupos sometidos a isquemia de 60 y 90 min,

no encontrándose signos de necrosis en ningún caso. Los niveles de ASAT para todos los grupos fueron similares

al del control.

Introducción

Los procesos de isquemia y reperfusión constituyen un proceder quirúrgico inevitable en el trasplante de órganos

y la cirugía cardiopulmonar en general. El daño por isquemia / reperfusión es multifactorial y dentro de los

factores de mayor relevancia se encuentran las Especies Reactivas de Oxígeno (ERO) (1). Sin embargo, todavía

no se han esclarecido completamente los mecanismos moleculares de producción del estrés oxidativo ni el curso

temporal de estos fenómenos. En la isquemia / reperfusión se produce una primera etapa de daño por isquemia y

una segunda por reperfusión.. En el daño por isquemia, la disminución del flujo sanguíneo provoca un proceso de

hipoxia que afecta la fosforilación oxidativa en la mitocondria con la consiguiente reducción de los niveles de

ATP. Se ha reportado que la severidad del estrés oxidativo y el daño celular durante la reperfusión dependen del

tiempo de isquemia (2), sugiriéndose que la interrupción del flujo sanguíneo por un período de 60 min. ocasiona

daños celulares reversibles y que el punto de no retorno celular para los hepatocitos se produce con tiempos de

isquemia de 90 min (3).El presente trabajo se propone determinar de manera preliminar la influencia que ejerce el

tiempo de isquemia sobre el comportamiento de algunos parámetros asociados al estrés oxidativo en un modelo de

isquemia parcial hepática en ratas.

Materiales y Métodos

Se utilizaron ratas Sprague-Dawley (300g – 350g), procedentes de CENPALAB, las que se mantuvieron en

cuarentena por 7 días. Se dividieron aleatoriamente en 4 grupos, uno de ellos correspondiente al control (no

sometido a isquemia) y el resto sometidos a tiempos de interrupción del flujo sanguíneo de 30, 60 y 90 min. Se

utilizó un modelo de isquemia parcial del lóbulo hepático derecho, según la técnica descrita por Peralta y col. (4).

Como indicador del daño hepático se determinaron los niveles séricos de ASAT utilizando un kit de laboratorio

comercial. Se realizó además un estudio histológico utilizando la tinción con hematoxilina- eosina. Para los

estudios bioquímicos se obtuvieron homogenados del lóbulo hepático derecho utilizando solución amortiguadora

KCL-Histidina pH 7.4. Se determinaron las concentraciones de peróxidos orgánicos totales mediante una técnica

espectrofotométrica utilizando xilenol naranja. Como indicador de la peroxidación lipídica se determinaron los

niveles de MDA según la técnica reportada por Esterbauer y Cheeseman en 1990 (5). La actividad de catalasa fue

determinada por seguimiento de la variación de la densidad óptica por descomposición del H2O2. En todas las

muestras se determinó la concentración total de proteínas utilizando azul de Coomasie. Los cálculos se realizaron

utilizando una curva patrón con BSA.

Procesamiento estadístico: Se calculó la media y la desviación estandar de cada grupo. Se realizó un análisis de

varianza (ANOVA) y posteriormente se aplicó el test de Levene. Se compararon los grupos utilizando el test de

Duncan y el de U-Man-Whitney.

Resultados

La medición de los niveles de ASAT sérica no mostró diferencias significativas entre los grupos. La actividad

para el grupo control fue de 89 ± 28 U/L. A los 30 min de isquemia la actividad de ASAT era de 65±30 U/L,

mientras que a los 60 y 90 min. de isquemia los valores encontrados fueron de 63±33 U/L y 66±37 U/L

respectivamente. Los resultados se obtuvieron utilizando una n=6. Desde el punto de vista histológico, solamente

se apreciaron daños moderados para los tiempos de 60 y 90 min. de isquemia, no encontrándose signos de

necrosis en ningún caso. Las principales manifestaciones de daño encontradas fueron lipidosis microvesicular,

edema y hemorragia sinusoidal. La determinación de peróxidos orgánicos totales mostró un incremento de los

mismos a partir de los 30 min. de isquemia, manteniéndose esta situación para el resto de los tiempos estudiados

(fig. 1). Por otra parte, se encontró que los niveles de MDA se encontraban significativamente elevados para los

grupos correspondientes a los 60 y 90 min. de isquemia (fig.2)

M.D.A

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 30 60 90Tiempos de Isquemia (minutos)

Co

nce

nt.

de

per

óxi

do

s

(µmol/mg.proteínas)

*

*

Peróxidos Orgánicos Totales

0

50

100

150

200

250

0 30 60 90Tiempos de Isquemia (minutos)

Co

nce

nt.

de

per

óxi

do

s

(µmol/mg.proteínas)

* *

*

fig. 1. Niveles de peróxidos orgánicos totales en dife- fig. 2. Niveles de M.D.A en diferentes tiempos de rentes tiempos de isquemia. isquemia.

• Las barras representan la media ± la desviación estándar de 6 determinaciones. * p<0.05

La actividad enzimática de la catalasa se mantuvo al nivel del control en todos los grupos sometidos al proceso

isquémico. En el grupo sin isquemia la actividad de la enzima fue de 38 ± 13. En los restantes grupos los valores

fueron de 40 ± 10, 50 ±28 y 44 ± 20 para los tiempos de 30, 60 y 90 min. respectivamente. La actividad

enzimática fue expresada en u/g proteínas.

Discusión

Los resultados presentados brindan algunos elementos que apoyan el criterio de otros autores de que el tiempo de

isquemia influye en la magnitud de los daños que se manifiestan durante la reperfusión. En este trabajo las

alteraciones histológicas encontradas fueron moderadas. Los cambios estructurales comienzan a hacerse evidentes

a partir de los 60 min. de isquemia y no se encontraron signos de necrosis. Por otra parte, los resultados

encontrados con los niveles de ASAT corroboran que al menos hasta los 90 min. no se producen cambios

importantes de la integridad celular. Sin embargo, desde el punto de vista bioquímico sí se aprecian algunos

cambios tempranos. Se pudo apreciar que ya a los 30 min. se produjo un incremento significativo de los niveles de

peróxidos orgánicos y a partir de los 60 min. en el nivel de MDA. Estos resultados indican que ya a los 60 min. de

interrumpirse el flujo sanguíneo se comienzan a manifestar alteraciones en el estado redox del órgano.

La catalasa fue medida como un indicador de las defensas antioxidantes del órgano. No se apreciaron cambios

significativos en la actividad de la misma lo cual sugiere que los niveles de H2O2 no se han elevado, o al menos,

no lo suficiente para activar a dicha enzima. Hubiera sido necesario determinar la actividad de la glutatión

peroxidasa que es capaz de activarse a menores concentraciones de H2O2 que la catalasa.

Con este trabajo se concluye que durante la isquemia los cambios bioquímicos se manifiestan más rápidamente

que los estructurales. Por otra parte, el tiempo de isquemia influye en el comportamiento bioquímico e

histológico, siendo las alteraciones más numerosas en la medida que se incrementa el mismo. Deben ser

estudiados tiempos superiores a los 90 min. y otros parámetros asociados con el balance redox.

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DETERMINACION DE LA TOXICIDAD AGUDA (VIA ORAL) A UN NUEVO PRODUCTO SINTETICO

CON ACTIVIDAD FARMACOLOGICA DEMOSTRADA.

Autores:

MSc. Mirta Morales Díaz∗, Dr. Remigio Cortés Rodríguez∗∗, Dr. Omar Prieto García∗∗∗, Dr Orel Pérez García∗∗∗∗

∗Dpto de Farmacia.Universidad Central de Las Villas, ∗∗Centro de Bioactivos Químicos Universidad Central de Las

Villas, ∗∗∗ Dpto de Química. Universidad Central de Las Villas, ∗∗∗∗ Investigador de Tasajeras.

Resumen:

Se determinó la toxicidad aguda vía oral a un nuevo producto con actividad farmacológica demostrada llamado

DERMASEL. Se emplearon ratones OF1 , conformándose 8 grupos de 10 animales , administrándoseles las dosis de :

700,1050,2362,3543 y 5314 mg/kg de peso. La formulación utilizada se preparó en forma de suspensión conteniendo

el principio activo, goma tragacanto y agua . La determinación de la DL50 se efectuó por el método de Litchfield-

Wilcoxon . Como resultado se obtuvo una disminución marcada de peso corporal en los grupos de mayores dosis

hasta el quinto día, con una recuperación posterior. La mortalidad muestra un efecto retardado y dosis dependiente. El

producto resultó no clasificado según la OECD con una DL50 de 2028.433mg/kg de peso.

Introduccion:

Teniendo en cuenta las múltiples aplicaciones reportadas para los silicatos en nuestro país en los servicios de

ginecobstetricia y clínico–quirúrgicos1,en la prevención y tratamiento del pie de atleta2,como antibacteriano en la cura

de enfermedades bucales y heridas infectadas3, en nuestro grupo de investigación fue sintetizado un producto de base

silícica, hasta el momento no reportado en la literatura denominado DERMASEL4, que ha demostrado poseer muy

buena actividad como cicatrizante y antibacteriano, por lo que se decidió comenzar su estudio toxicológico

Materales y Métodos:

Se emplearon 120 ratones de la línea OF1, hembras y machos, con masa corporal entre 20 y 30 gramos de 2 meses de

edad, marcados mediante ponche en la oreja y mantenidos en cajas T2 de policarbonato. Como encamado se empleó

viruta de caña deshidratada y esterilizada. Los animales se distribuyeron de forma aleatoria en gupos de 5 por sexo en

cada caja. La alimentación consistió en pienso para ratones. Tanto el pienso como el agua se administraron ad libitum.

Inicialmente se realizó un tanteo de las dosis a aplicar, para el que se utilizaron 40 animales, 20 hembras y 20machos,

determinándose la DL0 y la DL100 para cada sexo, al no existir diferencias para las mismas entre los dos sexos, se

determinó la DL50 utilizando solamente animales machos. Las dosis a aplicar se selaccionaron aplicando un factor de

progresión gueométrica (1.5)entre la DL0 y DL100. De los animales en cuarentena se seleccionaron 80 machos de forma

aleatoria y se distribuyeron en 8 grupos de 10 animales cada uno, ubicando 5 por caja, administrandoles las dosis de:

700,1050, 1575,2362,3543 y 5314mg/kg de peso corporal, respectivamente a los grupos 1al 6, los grupos 7 y 8 se

mantuvieron como control de vehículo y control no tratado. Tres horas antes de la administración se retiraron los

alimentos. Las inspecciones clínicas se efectuaron durante las próximas 24 horas y luego se continuó con una

observación diaria hasta el día 14, cada animal se pesó el día en que se ralizó la administración y luego en días

alternos. Los animales que sobrevivieron se sacrificaron por dislocación cervical, realizándoseles la necropsia

conjuntamente con los que murieron durante el experimento para observar alteraciones macroscópicas en los pricipales

órganos (Estómago,Intestino,Hígado,Riñón,Ecéfalo).

La formulación a utilizar en el estudio de toxicidad aguda se preparó en forma de suspención conteniendo el principio

activo, goma tragacanto, y agua. Las dosis aplicadas se obtuvieron a partir de suspenciones de concentraciones

constantes y después de una agitación vigorosa durante 2 minutos. Para la administración se utilizó una jeriguilla de

insulina de 0.3mm de diámetro. La estabilidad se garantizó preparando la misma "in situ"y administrando

inmediatamente después. La determinación del valor de la DL50 se efectuó por el método de Litchfiel-Wilcoxon

computarizado usando Microsoft Excel para Windows 95. Posteriormente se clasifica el producto según la OECD.

Resultados y discusión:

Los signos tóxicos observados con posterioridad a la administración oral de los 6 niveles de dosis muestran que en los

siete días siguientes a la administración, los animalaes presentaron síntomas de depresión evidenciado por la

disminución de la actividad motora y la cabeza caída. Se presentaron además algunos casos de piloerección.

El resultado del peso corporal se muestra en la figura1. Del análisis de la misma se evidencia una disminución menor

del 10% de este parámetro para los gupos 1,2,3 y 4, hasta los días 5 y 8 posteriores a la aplicación.

Figura 1. Determinación de la masa corporal durante el estudio a dosis única por vía oral.

0 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4 1 61 0

1 2

1 4

1 6

1 8

2 0

2 2

2 4

2 6

G r u p o 1

G r u p o 2

G r u p o 3

G r u p o 4

G r u p o 5

G r u p o 6

C o n t r o l v e h í c u l o

C o n t r o l n o t r a t a d o

pe

so

(

g)

t i e m p o ( d í a s )

Los grupos que mostraron mayores afectaciones de peso fueron

el 5 y 6, con una disminución hasta el quinto día de 11.4% y

26% respectivamente. A partir del quinto y octavo día

comienza el proceso de recuperación de los animales que

sobreviven al experimento, caracterizado por el incremento de

peso y desaparición de los síntomas tóxicos.

La mortalidad se comportó como sigue: Durante los tres días

siguientes a la administración no ocurrió ninguna muerte, todas

ocurrieron entre los días 4 y 7 con un máximo de muertes en el día 5, para un 41.9% del total de muertes ocurridas.

Los grupos de dosis más elevadas manifestaron las muertes los días 4 y 5, mientras que el resto de los grupos de dosis

más bajas estas ocurrieron fundamentalmente en los días 6 y 7. El análisis de la mortalidad presentada muestra la

existencia de un efecto retardado para dicho producto, puesto de manifiesto entre los días 4 y 7, su análisis por grupos

mostró un incremento de la misma con la dosis, lo que sugiere un efecto dosis dependiente.

Teniendo en cuenta algunas de las características físico químicas del producto en estudio podemos argumentar mejor

los resultados expuestos. Es importante señalar que el DERMASEL es un polvo muy cohesivo que posee una elevada

tendencia a formar bóvedas lo cual justifica su mala fluidez y su significativa compresibilidad, esto nos induce a

pensar que el silicato objeto de estudio al adherirse a la mucosa gastroitestinal forme acúmulos. Esto nos permite dar

explicación a la disminución de la masa corporal hasta aproximadamente el quinto día posterior a la administración ya

que al adherirse el producto a las paredes gastrointestinales provoca una disminución de la absorción de los nutrientes

y electrolitos, llegando incluso en los casos de las dosis más elevadas, a ser tal la depauperación de los animales que

muchos de ellos mueren a partir del cuarto día de haber sido administrados.

En apoyo a lo planteada estan los resultados obtenidos por varios autores que han demostrado que algunos

aluminosilicatos se adsorven en las paredes del tracto gastrointestinal, interfiriendo en la absorción a través del mismo

e incluso en la absorción de otras sustancias administradas al mismo tiempo5,6. El efecto tóxico que ejerce el producto

sobre el tracto gastrointestinal se comprobó mediante necropsia de los animales que murieron durante la experiencia,

resultados similares fueron obtenidos por otros autores en sus trabajos con silicatos de aluminio y magnesio. La

recuperación paulatina expresada por la ganancia de la masa corporal y la desaparición de los signos tóxicos de

aquellos animalaes que sobreviven al experimento es explicada por la eliminación progresiva del producto del tracto

gastrointestinal, lo que va posibilitando la absorción de nutrientes y agua.

Figura 2 . Determinación de la DL50 para el producto DERMASEL administrado por vía oral.

0 1 0 0 0 2 0 0 0 3 0 0 0 4 0 0 0 5 0 0 0 6 0 0 00

2

4

6

8

1 0

1 2

Pr

ob

it

D o s i s ( m g / k g )

Probit = 2.35 + 0.0013· Dosis r = 0.9465 ÷2 = 0.3522 p = 0.161 DL50= 2038.433 1328.13<DL50<3459.914

Al hacer un análisis anatomopatológico de los animales

que sobrevivieron se comprobó la presencia de restos del

compuesto en forma de pequeños grumos en el tracto

gastrointestinal (estómago, intestino).

En los animales que murieron, se observó un mayor cubrimiento de las paredes de estos órganos por los grumos del

compuesto. El resto de los órganos analizados (hígado, riñón, encéfalo), no presentaron alteraciones macroscópicas.

Los resultados obtenidos nos permiten de forma preliminar plantear que es el tracto gastrintestinal el órgano que

mayor número de efectos negativos manifiesta.

El procesamiento de los resultados dio un valor para la DL50 de 2038.433mg/kg de peso corporal (1328.13<DL50 <

3459.91).Teniendo en cuenta este resultado el producto es catalogado como no clasificado , siguiendo las normativas

de la OECD, según Loomis se clasifica como ligeramente tóxico.

Conclusiones

La DL50 para el principio activo de base silícica (DERMASEL ) administrado por vía oral a ratas Sprague Dawley es

2038.433mg/kg de peso corporal con intervalos de (1328.13<DL50 < 3459.91), resultando no clasificado según las

normativas de la OECD.

Bibliografía.

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EFECTO PROTECTOR DE LA SPIRULINA PLATENSIS EN EL DAÑO PULMONAR INDUCIDO

POR PARAQUAT.

Autores:

MsC Rosario Megret Despaigne.

Dra: María Antonia Torres Alemán.

Dr: Nelson Merino García.

Lic. Liliana Marquez Sierra

Lic.Felipe Rosete Rosete.

Instituciones:

• Centro de Investigaciones y Evaluaciones Biológicas(CIEB)

Instituto de Farmacia y Alimentos(IFAL)

Universidad de la Habana.

• Dpto de Farmacia.

Facultad de Ciencias Naturales

Universidad de Oriente

Resumen

Se realizó el estudio del efecto protector de la Spirulina platensis en el daño pulmonar inducido por paraquat,

a través de un experimento donde se utilizaron 5 grupos experimentales: Control, Paraquat, Spirulina,

Spirulina + Paraquat y Vitamina E + Paraquat, los compuestos antioxidantes se administraron 7 días previo a

la aplicación del paraquat, al finalizar la investigación, se evaluaron los signos clínicos, la observación

macroscópicas y el estudio histopatológico de los pulmones, de todos los animales utilizados en el

experimento. Los resultados demostraron que la Spirulina platensis administrada por vía oral, disminuyó los

signos clínicos, las alteraciones macroscópicas y el daño celular pulmonar producido en este modelo de

toxicidad, sugiriendo que está microalga confiere una acción preventiva contra el daño oxidativo inducido por

paraquat.

Introducción:

El paraquat ha sido muy estudiado, desde el punto de vista de su toxicidad. El mecanismo de toxicidad de este

herbicida esta basado en la formación del radical bipiridilo y consecuentemente la Peroxidación Lipídica

(POL) y el daño celular; el mismo es tóxico a nivel pulmonar, hepático, renal y cardíaco, debiendo la muerte

a la asfixia causada por la progresiva y generalizada proliferación de fibrosis del tejido conectivo en los

alvéolos pulmonares, donde el tóxico se concentra selectivamente, desarrollándose esta reacción de 48 horas a

2 semanas posteriores a la ingestión1. Este herbicida es el causante del mayor número de fallecidos, en

intoxicaciones por plaguicidas en nuestro país, datos que nos permiten conocer en que medida el paraquat

resulta altamente perjudicial para el hombre. 2

En aras de encontrar una sustancia que sea capaz de atenuar el efecto tóxico de este compuesto, se han

realizado estudios con sustancias antioxidantes como es el caso de la Vitamina E, la Vitamina C y N-Acetil

cisteína; de los cuales se han obtenido resultados clínicos y experimentales satisfactorios3..Por lo que nos

propusimos utilizar la Spirulina platensis, que contiene VIT.E, VIT. C, VIT. A, Ficocianina, enzima

superóxido dismutasa, entre otros compuestos, los cuales le confieren poderosa actividad antioxidante; para

evaluar el efecto protector de esta microalga en el daño pulmonar inducido por las Especies Reactivas de

Oxigeno(EROs), producidas por el paraquat.

Materiales y métodos.

Para este estudio experimental, se utilizaron ratas hembras Sprague Dawley, las cuales son tratadas con

Spirulina platensis al 10% en carboximetil celulosa 0.5%, a una dosis de 2g/kg durante 7 días vía oral y el

Paraquat es administrado en solución salina 40mg / kg vía intraperitoneal. Todos lo animales se mantuvieron

de acuerdo a las normas internacionales, para el cuidado de los animales de experimentación.

Grupos Experimentales.

• Grupo 1. Control. Los animales de este grupo no recibieron tratamiento, los mismos se utilizaron como

patrón de comparación.

• Grupo 2. Los animales de este grupo recibieron Paraquat en solución salina, con el objetivo de inducir el

pulmonar, se utilizó como grupo de toxicidad para compararlo con los restantes grupos.

• Grupo 3. Recibieron Spirulina platensis 2g/Kg vía oral, durante 7 días.

• Grupo 4. Recibieron Spirulina platensis 2g/Kg vía oral, durante 7 días y luego se administró Paraquat en

solución salina, 48 h después se realizó el sacrificio.

• Grupo5. Recibieron vitamina E 50mg/Kg vía oral, como control de la actividad antioxidante, durante 7

días y luego se administró Paraquat en solución salina, 48h después se realizó el sacrificio.

Todos los animales se pesaron diariamente y se observaron los signos clínicos, luego de aplicar los

tratamientos correspondientes y por último se sacrificaron en ambiente de Eter etílico, se realizó el examen

macroscópico de los órganos, y la toma de muestra del pulmón para el estudio histopatológico por el método

de tinción con solución de hematosilina – eosina. Con observación al microscopio óptico.

Resultados y Discusión:Durante el experimento, no se encontraron manifestaciones de toxicidad en los primeros 7 días de

pretratamiento con Sp y Vit E, en ninguno de los animales de estos grupos, una vez administrado el PQ

comenzaron a aparecer alteraciones en la función respiratoria, los grupos pretratados con Vit E, se

encontraban clínicamente más afectados con respecto a los pretratados con Spirulina platensis, destacándose

la mayor toxicidad en el grupo de PQ, lo que se corresponde con el estudio macroscópico, observándose una

disminución de los daños en los grupos pretratados con los compuestos antioxidantes utilizados, como se

observa en la tabla No. 1. Las lesiones histopatológicas que aparecieron en las muestras de pulmón de los

grupos tratados con paraquat, fueron: hemorragia alveolar y edema inflamatorio perivascular, aunque las

mismas disminuyeron en los grupos pretratados con los compuestos antioxidantes utilizados, este resultado

fue más significativo, para los animales previamente tratados con Spirulina platensis..

Tabla No. 1. Observaciones macroscópicas por grupos experimentales.

Grupos Experimentales. Afectaciones macroscópicas.

Control No se observaron daños macroscópico.

Paraquat Pulmones completamente hemorrágicos..

Spirulina No se observan daños clínicos a nivel

macroscópico.

Spirulina +PQ Ligera congestión pulmonar.

Vit E+ PQ Pulmones hemorrágicos, principalmente en 2

animales

Los resultados de las observaciones clínicas y las observaciones macroscópicas de los pulmones analizados

en los diferentes grupos experimentales, indican la toxicidad del PQ, apuntando al daño pulmonar4 .

El pretratamiento con Spirulina y en menor medida el pretratamiento con Vit. E, confieren una disminución

de la toxicidad inducida por PQ. Estos resultados están en correspondencia con otras investigaciones5 6,

donde se han utilizado compuestos naturales y sintéticos con actividad antioxidante para contrarrestar el estrés

oxidativo producido por el exceso de O2.- que produce este compuesto. Los resultados histopatológicos

describen las lesiones pulmonares producidas por el PQ, que son característica en la toxicidad de este

herbicida, donde se explica la muerte celular y la alveolitis como consecuencia de la POL en los neumocitos

tipo I y II4. A diferencia de los grupos pretratados con Spirulina platensis donde el aumento de la actividad

antioxidante, contribuye en parte a elevar el sistema de defensa celular, lo que disminuye las lesiones

histopatológicas en este grupo, estos resultados indican un efecto atenuador en la toxicidad del paraquat, por

esta microalga,

Referencias Bibliográficas:

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Estudio de Clasificación Tóxica Aguda oral del alga Gracilaria cylindrica.

Autores: Lic. Virna Cepero Rivero*, MSc. Emilio Monteagudo Jiménez*, MSc. Daniel Cordovés Torres**,

Ing. Ramón Corona Martínez**, Dra. María Boffill Cárdenas*, Tec. Luis Díaz Costa*, Tec. Belkis Verdecía

Machado*, Tec. Ángel Mollineda Trujillo***

*Unidad de Toxicología Experimental (UTEX). Instituto Superior de Ciencias Médicas de Villa Clara.** Facultad de Química y Farmacia. Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas.*** Centro de Investigaciones Agropecuarias (CIAP). Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas.

Introducción:

Los productos de origen marino, especialmente las algas, se utilizan ampliamente, tanto a nivel internacional

como en nuestro país, en la industria de los cosméticos, donde tienen una amplia demanda. Actualmente han

comenzado a introducirse en la industria médico – farmacéutica, debido al gran potencial farmacológico que

poseen1. Cuba, por ser una isla rodeada de mar, presenta una posición privilegiada en cuanto a la explotación

de este recurso2.

Como primer paso en la estimación del potencial tóxico de una sustancia está la toxicología aguda, referida

como el estudio cualicuantitativo de los fenómenos tóxicos y de su aparición en función del tiempo tras la

administración de una dosis única de la sustancia o de varias dosis fraccionadas en el transcurso de 24 horas3.

El test de Clasificación Tóxica Aguda o Método de las Clases fue adoptado en la Guía No. 423 de la OECD4

como alternativa a la prueba clásica aguda. El método se basa en evaluaciones biométricas5 con dosis fijas

separadas adecuadamente para permitir la clasificación tóxica de una sustancia según el Sistema Global

Armonizado y utiliza 90% menos de animales que los de LD506.

Objetivos:

• Evaluar el potencial tóxico del extracto seco del alga Gracilaria cylindrica tras una exposición simple

por vía oral.

• Clasificar este extracto de acuerdo a la metodología internacional establecida para este modelo.

Materiales y Métodos:

Se emplearon ratas Wistar, procedentes del Centro Nacional para la Producción de Animales de Laboratorio

(CENPALAB), de rango de peso comprendido entre 190 y 230 gramos, adultas, jóvenes y de ambos sexos, las

que fueron mantenidas en las siguientes condiciones ambientales: temperatura: 22±2 oC, humedad relativa:

40-70%, ciclo luz-oscuridad: 12 / 12 horas, intensidad luminosa: 200-250 Lux. Recibieron como alimento la

dieta peletizada estipulada para la especie, con el correspondiente certificado de calidad. Consumieron agua

de la pila apta para consumo humano. Se permitió libre acceso tanto al agua como a los alimentos.

Se utilizaron 6 animales distribuidos por sexo en 2 grupos de 3 animales, los que fueron alojados en cajas de

policarbonato, modelo T-3 de fondo de rejilla.

La sustancia de ensayo se preparó suspendiendo el alga seca, molinada y tamizada (tamaño de partícula

menor de 0.1 mm) en un vehículo acuoso con carboximetilcelulosa al 2%.

A las 4 horas de retirado el alimento se administró la sustancia de ensayo por vía oral mediante cánula

intragástrica 18G a dosis única de 2 000 mg/Kg utilizando un volumen de administración de 15 ml/Kg,

comenzando por las hembras. Al día siguiente se administraron los machos siguiendo este mismo

procedimiento.

Los animales fueron observados de manera sistemática durante las primeras 24 horas postadministración y

con frecuencia diaria hasta el día 14 del experimento, las observaciones estuvieron dirigidas a la

determinación de: muerte, tiempo de ocurrencia de la muerte, signos y síntomas de toxicidad además de su

comienzo y duración. Posterior a lo cual fueron sacrificados bajo anestesia, realizándose un examen

anatomopatológico. El peso corporal se controló al inicio, séptimo día y final de experimento.

La clasificación final del producto se efectuó de acuerdo a los criterios establecidos por la OECD4.

Posteriormente se ensayó un nivel de dosis de 5 000 mg/Kg utilizándose un diseño experimental similar al

anterior. Para esto se preparó una suspensión de mayor concentración, administrándose un volumen de 15

ml/Kg, fraccionado en dos administraciones, con un intervalo de 4 horas entre ellas.

Resultados:

En el nivel de dosis de 2 000 mg/Kg, el ensayo culminó con un 100% de supervivencia. No se observaron

signos ni síntomas clínicos de toxicidad luego de la administración y los animales mostraron un

comportamiento normal durante todo el desarrollo del experimento.

El peso corporal, como índice de toxicidad, no mostró alteraciones, pues los animales ganaron peso dentro del

rango establecido como normal dentro de la curva de crecimiento de la especie y línea7.

El análisis anatomopatológico macroscópico no reveló alteraciones en los órganos y tejidos estudiados.

Las evidencias experimentales generadas permiten ubicar la LD50 de este producto por encima de 5 000

mg/Kg, lo que se corresponde con la clase : no clasificado.

Cuando se ensayó el nivel de dosis de 5 000 mg/Kg solamente un animal murió. El resto de los animales

mostró un comportamiento y ganancia de peso normales, no observándose signos ni síntomas clínicos de

toxicidad.

Discusión:

Hasta nuestros días, para dar un criterio de toxicidad aguda era necesario emplear un gran numero de

animales, sin embargo, en los últimos años han surgido métodos alternativos que tienen como objetivo

reemplazar, reducir y refinar el número de animales8.

Es por esta razón que se ha empleado este método, que por demás está acorde con el tipo de compuesto a

evaluar, del cual se espera una baja toxicidad9,10, razón que permitió considerar el comienzo del estudio partir

de la dosis de 2 000 mg/Kg PV.

Con estos resultados, de acuerdo con la Guía 423 de la OECD, puede procederse a la clasificación del

extracto evaluado. No obstante, se decidió probar, con fines informativos (screenig), los efectos producidos

por una dosis de 5 000 mg/Kg ya que se prevé la aplicación de este producto como suplemento nutricional, lo

que pudiera implicar un uso de altas dosis del mismo.

Esto nos permitió también corroborar los resultados obtenidos con el primer nivel de dosis estudiado, que

están en correspondencia con los esperados para un producto de esta naturaleza.

Conclusiones:

• La LD50 del alga Gracilaria cylindrica se encuentra por encima de los 5 000 mg/Kg y se ubica dentro de

la clase de toxicidad aguda, considerándose como no clasificada.

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inmunomoduladora de la fracción polisacárida de origen marino PC-1. Rev Cubana Oncol

2000;16(3):171-6.

Análisis de la eficiencia de la Ecuación de Cockcroft y Gault como patrón para el reajuste de dosis de

Aminoglucósidos en pacientes sin antecedentes patológicos de enfermedad renal diagnosticada.

Autor: MSc Zoe González Hernández.

DraSc. Yolanda Valdés Rodríguez.

DrSc. Luis Martín García.

Institución: Hospital Universitario “Arnaldo Milián Castro”.

Resumen: Se realizó un estudio experimental en el Hospital Universitario “Arnaldo Milián Castro”, de la

provincia Villa Clara, con el objetivo de analizar la eficiencia de la Ecuación de Cockcroft y Gault como

patrón para el reajuste de dosis de Aminoglucósidos en pacientes sin antecedentes patológicos de enfermedad

renal. Se demostró que cuando individualizamos dosis en pacientes según el Indice de Filtración Glomerular,

se puede obtener igual o mayor beneficio con menor costo, ya que la cantidad de medicamentos usadas es

menor, con un tiempo de mejoría menor también y una evolución clínica más satisfactoria. Asimismo se

comprobó que no existía vínculo entre el diagnóstico microbiológico y el diagnóstico presuntivo del médico,

provocando, por tanto, un uso irracional de medicamentos; se aprovechó en gran medida el sinergismo de

acción con otros antimicrobianos en los tratamientos impuestos a los pacientes.

Introducción: Bajo la hipótesis de que el empleo de la ecuación de Cockcroft y Gault como patrón para el

reajuste de dosis de Aminoglucósidos en pacientes sin daño renal previo o conocido tiene valor práctico en la

práctica diaria, decidimos realizar el presente trabajo con los objetivos:

General: Analizar la eficiencia de la Ecuación de Cockcroft y Gault como patrón para el reajuste de dosis de

Aminoglucósidos en pacientes sin antecedentes patológicos de enfermedad renal diagnosticada.

Específicos: -Valorar el sistema de dosificación utilizado por el personal médico, tomando como patrones el

Peso Corporal y la Tasa de Filtración Glomerular.

- Comparar el método de reajuste de dosis de Aminoglucósidos según la IFG con el regido por el

peso corporal mediante la aplicación un estudio Beneficio/Riesgo y Beneficio/Costo a cada uno de los grupos.

Material y Métodos: Se realizó un estudio experimental y prospectivo en el Hospital Universitario “Arnaldo

Milián Castro”, de la ciudad de Santa Clara, en el período comprendido entre enero y septiembre de 1997. Se

trabajó con 132 pacientes hospitalizados La muestra fue dividida en dos grupos pareados según los rangos de

Intensidad de Filtrado Glomerular que encierran los diferentes estadíos de deterioro renal, al primer grupo se

le administraron las dosis de Aminoglucósidos teniendo en cuenta el criterio médico y acorde al peso

corporal, al segundo se le reajustó la dosis de estos antimicrobianos usando como patrón el Indice de

Filtración Glomerular (IFG). Se extrajeron de las historias clínicas de los pacientes los datos necesarios para

el análisis de los objetivos trazados. A todos se les determinó la IFG según la ecuación de Cockcroft y Gault,

teniendo en cuenta también la edad, peso, sexo, creatinina sérica y factor de corrección:

QCSC

PEIFG *

*72

*)140( −= . A todos aquellos pacientes cuya IFG se comportó fuera del rango de 80-120 mL/min,

se les individualizó la dosis.

Luego se estableció un análisis comparativo entre ambos criterios de dosificación y entre los resultados

clínicos observados de los dos grupos de pacientes, para concluir en estudios Beneficio/Riesgo y

Beneficio/Costo de los tratamientos con Aminoglucósidos.

Análisis y Discusión de Resultados: En los dos grupos, el sexo masculino fue el más atendido con

Aminoglucósidos, con edades de más 60 años. Las patologías más comúnmente tratadas con

Aminoglucósidos correspondieron a Sepsis de Herida Quirúrgica (33.33 %) y Bronconeumonías Bacterianas

(80.30 %). Tales resultados concuerdan con lo demostrado por la literatura (1),(2),(3),(4). En ambas muestras

no se les realizaron cultivos microbiológicos antes de comenzar los tratamientos antimicrobianos en su mayor

porciento. Muchas veces se trabajó en base a la experiencia acumulada sobre los casos ingresados en el

hospital que padecieron iguales afecciones, por la demora que existía en obtener los resultados de los estudios

microbiológicos, que implicaba, de esperarse estos, un atraso en la rehabilitación de los pacientes. Los

gérmenes causales de las enfermedades tratadas con Aminoglucósidos en ambos grupos (los que se

estudiaron), se correspondieron con lo reportado por los autores consultados. Cuando analizamos las

combinaciones medicamentosas más frecuentes con Aminoglucósidos, detectamos que en ambos grupos se

hicieron combinaciones con Penicilinas en mayor cuantía, aprovechando el sinergismo de acción y para

aumentar el radio de acción antibacteriano. (5). Al primer grupo se le realizó un análisis de la dosificación de

Aminoglucósidos (Gráfica 1), según el criterio aplicado por el médico (peso corporal) y el que proponemos

(según IFG). De este análisis resultó que un porciento considerable estuvo sobredosificado y otro tanto

subdosificado según el peso corporal del paciente, lo que indica que no se aplicó para esta muestra un criterio

certero y único de dosificación, pudiendo provocar subsecuentes resistencias antimicrobianas o efectos

tóxicos, de ser las dosis menores o mayores, respectivamente que las estipuladas en la literatura (3), (6).

Cuando lo analizamos teniendo en cuenta la función renal detectamos que más de la mitad de este grupo se

encontraba sobredosificado si se consideraba tal sistema excretor, de lo que puede esperarse un incremento en

la probabilidad de aparición de los acostumbrados efectos indeseables que provocan estos Aminoglucósidos,

Cuando se realizó el estudio Beneficio/Riesgo se observó que en cada grupo el beneficio fue mayor que el

riesgo resultante, observándose mayor diferencia para el grupo reajustado (mayor cociente B/R), lo que

demuestra la eficacia de este método de individualización de dosis en nuestra muestra de estudio.

Tabla 1: Relación Beneficio/Riesgo de los grupos de tratamiento con Aminoglucósidos.

Tratamiento Grupo Reajustado Media B/R Desviación estándarKanamicina 7.45 1.97Gentamicina 7.82 2.28Amikacina 7.40 2.67

Tratamiento Grupo no ReajustadoKanamicina 3.37 3.16

Según Peso Corporal

1710

39

SobredosificadoBien dosificadoSubdosificado

Según IFG

57

27

SobredosificadoBien dosificadoSubdosificado

Gentamicina 5.50 3.39Amikacina 5.14 3.62

Fuente: Historias Clínicas.

Al realizar un estudio Beneficio/Costo de cada tratamiento se observó que en el primer grupo, en el que se

dosificaron los pacientes por el peso corporal, se gastaron 132.05 pesos por concepto de antibióticos, en

relación al supuesto reajuste por la IFG, mientras que en el segundo se experimentó un ahorro global de

215.82 pesos respecto al método inicial, por lo tanto, pudimos demostrar, para ambos grupos, que al emplear

la Ecuación de Cockcroft y Gault como patrón para el reajuste de dosis de Aminoglucósidos, el costo de estos

tratamientos disminuye considerablemente, sin decremento de los beneficios clínicos que reporta.

Conclusiones:

• El personal médico, generalmente, no sigue el criterio de dosificación según el peso corporal del

paciente, por lo que existe una elevada tendencia a la sub y sobredosificación de estos.

• No se tiene en cuenta la Intensidad de Filtrado Glomerular como función del estado renal, sino los

valores de creatinina sérica solamente, descartando la influencia que ejercen la edad, el sexo y el peso de

los pacientes en el funcionamiento de este sistema excretor.

• No se consideró en múltiples ocasiones el diagnóstico microbiológico emitido por el Laboratorio,

teniendo que recurrir a tratamientos empíricos que pueden o no resultar efectivos.

• La Relación Beneficio/Riesgo se comportó a favor del primero en ambos grupos de tratamiento, siendo

mayor en el grupo en que se tuvo en cuenta el estado renal de los pacientes, lo que valida la eficacia del

método de reajuste de dosis según la ecuación de Cockcroft y Gault. Asimismo, cuando se dosificó según

el estado renal de los pacientes, se obtuvo un mayor beneficio con un menor costo.

Recomendaciones:

• Tomar en cuenta los resultados del presente estudio en la práctica clínica diaria, en aras de incrementar la

calidad de la atención hospitalaria con un uso racional de medicamentos.

• Profundizar en la determinación de concentraciones plasmáticas de los Aminoglucósidos cuando se

individualiza su dosis empleando la ecuación de Cockcroft y Gault.

Bibliografía:

1. Isaksson, B. (1993). Postantibiotics effects of aminoglycosides on staphylococci. J. Antimicrob.

Chemother, 32, 2.

2. Li, R.C y Ma, H.H. (1999). Parameterization of inoculum effect vía mathematical modeling:

aminoglycosides against staphylococcus aureus and Escherichia coli. J. Chemother, 10, 203-207.

3. Freitag, J.I. (1984). Manual de Terapéutica Médica. Edición Revolucionaria. La Habana.

4. Bartlet, I.G. (1994). Pockectbook of Infection Desease Therapy. 4ta Edición, 33-34.

5. Godmman, A. (1984). Las Bases Farmacológicas de la Terapéutica. Tomo II. Edición Revolucionaria. La

Habana.

6. Programa de Computación “Vademecum” (1998).

Ensayo de Toxicidad Aguda Oral del 4-hidroxi-3-metoxibenzaldehído (4H3MB) en conejos albinos

Nueva Zelanda.

Autores: Trapero. Y1, Mancebo A2, González Y2, Arteaga M2, Fuentes D2 ,González B2, Hernández Y2

Instituciones: Centro de Biofísica Médica1, Centro Nacional para la Producción de Animales de Laboratorio

CENPALAB2

Resumen

Se presentan los resultados de un estudio de toxicidad aguda oral en conejos albinos Nueva Zelanda del

producto 4-hidroxi-3-metoxibenzaldehído (4H3MB). Este es un saborizante de amplio uso en bebidas y

alimentos, reportado como sustancia sintética flavorante admitida por la Food Chemical News Guides (1990).

Estudios preliminares reportan este producto como agente antisickling, por lo que puede ser, eficaz en el

tratamiento de la Drepanocitosis o Sicklemia. El objetivo del ensayo fue la evaluación a corto plazo, 14 días,

de la administración del (4H3MB). La sustancia se aplicó por vía oral, a 32 conejos de ambos sexos, previo

ayuno de 12 a 18 h y 3 niveles de dosis. Durante este período, los animales fueron observados diariamente

con el fin de determinar muerte o algún síntoma de toxicidad, y se determinó el peso corporal los días 0, 7 y

14 del ensayo. Se realizó la necropsia a todos los animales al finalizar el estudio con el objetivo de observar

lesiones macroscópicas. Los resultados mostraron la ausencia de signos clínicos en los niveles de dosis

tratados, al igual que en el grupo con vehículo , así como no se detectaron alteraciones macroscópicas,

inclinando a considerar la no toxicidad del (4H3MB) hacia los animales tratados. Sin embargo, se constataron

diferencias en el comportamiento del peso corporal en los diferentes grupos, demostrándose que, a pesar de la

variabilidad existente, el (4H3MB) fue capaz de alterar el comportamiento normal del peso corporal de los

animales tratados con las dosis Media y Alta.

1. Introducción

El 4-hidroxi-3-metoxibenzaldehído (4H3MB), de fórmula molecular C8H8O3, posee cristales en forma de

agujas finas de color blanco a amarillo pálido con olor agradable y sabor a vainilla es un saborizante de

amplio uso en bebidas y alimentos, el cual se reporta como sustancia sintética flavorante admitida por la Food

Chemical News Guides (1990). Conociendo el amplio uso de la Vainillina como flavorante y en busca de

nuevas perspectivas en la Industria Farmacéutica, se estudiaron los efectos de la misma en eritrocitos por

Abraham y colb. los cuales no encontraron cambios significativos en el contenido iónico y de agua de los

mismos incubados a concentraciones de Vainillina desde 1 hasta 10mM. Al valorar el potencial terapéutico de

la misma en el tratamiento de la Siklemia, argumentaron la posibilidad de hallar dosis efectivas en el rango de

1-4 g/día o valores inferiores a éstos.

2. Materiales y Métodos.

2.1 Sustancia de Ensayo.

El (4H3MB), producida por Panreac, NCI, España. Por sus características de baja solubilidad en sistemas

acuosos, se utilizó como solvente una solución de Carboximetilcelulosa (CMC) al 2 %. Se preparó una

solución madre de 20 mg/ml de (4H3MB), para su administración al grupo de Dosis Alta. Para los demás grupos

tratados, y a fin de minimizar las diferencias de volumen a administrar, se realizarán las diluciones

correspondientes de esta solución madre.

2.2 Animales

Se ejecutó con conejos Nueva Zelanda procedentes de la Colonia de Conejos del CENPALAB. Se utilizaron 32

conejos jóvenes adultos, 16 H y 16 M, de 1.5 a 2 Kg de peso corporal, de 12 semanas. Las hembras eran nulíparas

y no grávidas. Los animales se pesaron para su selección. Los animales se mantuvieron en condiciones

convencionales con temperatura de 24°C, humedad relativa de 78%, ciclo luz/oscuridad 12:12, agua y comida ad

libitum.

2.3 Dosificación y Administración.

Se utilizaron 4 grupos, cada uno compuesto por 8 animales, 4 H y 4 M. Los niveles de dosis fueron (1600,

1000, 400 mg/Kg de PC). Dado que la sustancia requiere el uso de un solvente específico, se estableció el

grupo control al cual se le administró el vehículo en similares condiciones a las utilizadas para el (4H3MB).

La sustancia se administró de forma fraccionada, en 24 horas, mediante intubación intragástrica, utilizando

una cánula curva metálica. A los animales se les retiró el alimento la noche anterior a la administración.

Luego de administrada la sustancia, se esperó 3 horas para reanudar el suministro de alimento.

2.4 Procedimiento Experimental

Los animales se mantuvieron en cuarentena durante 7 días. El período de observación fue de 14 días luego de la

administración. Los animales son observados diariamente para determinar muerte o síntoma de toxicidad, y se

determinó el peso corporal los días 0, 7 y 14. A los animales que murieron durante la prueba y a los que

sobrevivieron los 14 días, se les realizó la necropsia a fin de observar si existian lesiones macroscópicas.

2.5 Análisis estadístico.

El análisis estadístico se realizó con la ayuda del paquete estadístico SPSS 8.0 para Windows , tomando un nivel p

< 0.05 para la aceptación e interpretación de los resultados. La normalidad se determinó por el test de

Kolmogorov-Smirnov.

3. Resultados

Fueron encontrados muertos en los días 1 y 4, dos H , una del grupo dosis baja y una del de dosis alta. Ambos

fueron enviados al Dpto. de anatomía patológica. Todos los animales mostraron un comportamiento normal

para la especie, sin manifestar signos clínicos de toxicidad.

El peso corporal sufrió variaciones diferentes entre grupos. El análisis visual de los gráficos permite aseverar

que hubo afectación del PC de los animales. En las hembras los grupos Dosis Baja y Control mantuvieron un

crecimiento constante durante el ensayo. La media del grupo Dosis Media aumentó hacia el día 7, aunque un

animal disminuyó marcadamente. Entre los días 7 y 14 la media del grupo disminuyó, así como todos los

valores individuales. La media del grupo Dosis Alta disminuyó hacia el día 7, aunque es de señalar que de los

3 animales tomados para este análisis, únicamente un animal disminuyó de peso ostensiblemente. Entre los

días 7 y 14, dos aumentaron de peso en cambio, uno disminuyó. En general, entre los días 7 y 14 el valor de la

media aumentó. El análisis estadístico, arrojó diferencias significativas en las hembras entre los grupos Dosis

Alta y Dosis Media contra el resto de los grupos.

En los machos los grupos Dosis Baja y Control mantuvieron un crecimiento constante durante el ensayo. La

media del grupo Dosis Media aumentó hacia el día 7, aunque un animal disminuyó marcadamente. Entre los

días 7 y 14 la media del grupo disminuyó, así como todos los valores individuales, excepto uno que aumentó

ligeramente. La media del grupo Dosis Alta aumentó hacia el día 7, aunque es de señalar que un animal

disminuyó ostensiblemente. Entre los días 7 y 14, uno aumentó de peso ;el resto de los animales disminuyeron

de peso. En general, entre los días 7 y 14 el valor de la media disminuyó. El análisis estadístico arrojó que los

tres grupos tratados tuvieron diferencias significativas con el control vehículo.

Variaciones del peso corporalhembras

1.551.6

1.651.7

1.751.8

1.851.9

1.952

2.052.1

0 7 14

Día

Med

ia (

g)

control dosis baja dosis media dosis alta

Variaciones del peso corporalmachos

1.61.651.7

1.751.8

1.851.9

1.952

2.052.1

2.15

0 7 14

DíaM

edia

(g

)

control dosis baja dosis media dosis alta

Fig1 y Fig2 . Comportamiento del peso corporal de los animales durante el ensayo.Los animales que murieron fueron analizados macroscópicamente, detectándose en ambos la presencia de una

sustancia amarillenta en la cavidad toráxica, con pleuritis, pericarditis fibrinosa y hepatización pulmonar, por

lo que se concluyó que las muertes se debieron a deficiencias técnicas en la administración. En el resto de los

animales, sacrificados al final del ensayo, no se encontraron alteraciones anátomopatológicas atribuibles a la

sustancia de ensayo.

4. Discusión

En nuestro ensayo, la no presentación de signos clínicos en ninguna de las dosis ni en el grupo tratado con

vehículo, así como la no detección de alteraciones macroscópicas, inclina a considerar la no toxicidad del

(4H3MB). Esta consideración, sin embargo, queda contrarrestada por las diferencias surgidas en el

comportamiento del peso corporal en los diferentes grupos.

Los datos referentes al peso corporal poseen una gran sensibilidad para detectar alteraciones debidas a

químicos de baja toxicidad. La medición de este parámetro resultó de particular interés, ya que a pesar de la

variabilidad existente, queda firmemente demostrado que el (4H3MB), si fue capaz de alterar el

comportamiento normal del PC de los animales tratados con las dosis Media y Alta. Además, el uso de un

grupo tratado con el vehículo, que no presentó alteración alguna en ninguno de los parámetros, excluye la

posibilidad de que este ocasione las variaciones del peso corporal registrada en los grupos tratados.

La sustancia de ensayo no ocasiona, a ninguna dosis evaluada, alteraciones clínicas ni anatomopatológicas,

aunque si altera ostensiblemente, a las dosis de 1000 y 1600 mg/Kg, el crecimiento normal de los animales.

5. Bibliografía.

1. Abraham DJ et al. (1991) Vainillin, a potential agent for the treatment of Sickle Cell Anemia. Blood. Vol. 77.No. 6 (March 15). pp 1334-1341.

2. Hayes , P. et al. Principios y métodos de toxicología, tercera edición Raven Press . New York. 1994.

3. Reppeto, M. Toxicología fundamental. Segunda edición aumentada. Editor Científico médica. 1998.

4. Acute Oral Toxicity. OECD Guideline for testing of chemicals, 1987.

Toxicidad Aguda Oral del 4-hidroxi-3-metoxibenzaldehído en ratas Sprague Dawley.

Autores: Trapero. Y1, Arbesún. O2, García. M3

Instituciones: Centro de Biofísica Médica1, Centro de Toxicología y Biomedicina2 ,Lab. .Farmacéutico

Oriente 3.

Resumen

Se presentan los resultados del estudio de toxicidad aguda oral del producto 4-hidroxi-3-metoxibenzaldehído

(4H3MB), requisito necesario para su evaluación preclínica. Estudios preliminares de carácter biológico y

químico – físico han indicado que este producto puede ser eficaz en el tratamiento de la Drepanocitosis o

Sicklemia, enfermedad genética para la cual hasta el momento no hay tratamiento efectivo en el mundo. Los

resultados muestran un bajo efecto lesivo asociado con los signos y síntomas, comportamiento normal en

cuánto a los parámetros bioquímicos y hematológicos analizados para los grupos experimentales, así como

incremento de peso entre los grupos tratados y el control, no encontrándose diferencias significativas entre

estos. La sustancia en estudio se incluye en la categoría de Sustancia sin clasificar en conformidad con lo

establecido por la organización para la Economía, Cooperación y Desarrollo (OECD) entidad regulatoria de la

Unión Europea. Esto es un índice de la baja toxicidad que presenta el producto por lo que hace a este, como

el idóneo para su evaluación como candidato a fármaco para esta enfermedad.

1. Introducción

El 4-hidroxi-3-metoxibenzaldehído (4H3MB), es un aldehído aromático, posee cristales en forma de agujas

finas de color blanco a amarillo pálido con olor agradable y sabor a vainilla. Es un flavorante presente en los

alimentos, bebidas y tabacos.

Zaugg et al, reportaron la evaluación de 29 aldehídos con acción antisickling. En este estudio el (4H3MB),

muestra una moderada actividad antisickling in vitro . Debido a la alta prevalencia de la Sicklemia en

nuestro país. Desarrollamos algunos estudios para corroborar su actividad biológica y continuar con los

correspondientes a la parte pre clínica. Entre estos está el estudio de toxicidad oral aguda. Estos ensayos

comienzan evaluando las sustancias químicas que tienen un interés biológico y miden los efectos generales

sobre animales de experimentación en un periodo corto de tiempo a dosis única o a dosis repetida a pequeños

intervalos dentro 24 horas. Con el objetivo de determinar los síntomas correspondientes a la administración

del producto, su grado de letalidad y los efectos adversos para la salud humana atribuibles al mismo.

2. Materiales y Métodos.

2.1 Sustancia de Ensayo.

El (4H3MB), producida por Dallant, SA, España. La poca solubilidad en agua de la sustancia motivó que el

vehículo empleado fuera aceite de almendras refinado, Fravop, Alemania. Se preparó la solución a una

concentración de 36.36 mg/mL y 18.18 mg/mL, mezclando y agitando a una velocidad de 254 rpm,

llevándose a baño termostatado por espacio de 430 min a temperatura de 40°C. La solución resultó ser estable

a la temperatura de 22°C. Se utilizó la norma No. 401 Toxicidad Oral Aguda de la OECD, del año 1992.

2.2 Animales

60 ratas (30H y 30M) adultos jóvenes entre 42 y 50 días de la línea Sprague Dawley con procedencia:

División de roedores gnotobióticos, CENPALAB. El peso de las hembras 167.6-205.0gr y los machos 196.4-

232.8gr. las hembras nulíparas y no grávidas. Se utilizaron 6 grupos de 10 animales (5H,5M) cada uno.

Fueron distribuidos según muestreo aleatorio simple. Los animales se mantuvieron en condiciones

convencionales con temperatura de 22°C, humedad relativa de 55%, ciclo luz/oscuridad 12:12, agua y comida

ad libitum.

2.3 Dosificación y Administración.

Se utilizaron 5 niveles de dosis, diferenciados para producir un amplio rango de efectos tóxicos. El factor

geométrico empleado fue de 1.355, exigido por los métodos para el cálculo de la DL50. .

Los niveles de dosis fueron (2000, 1476,1089, 803 y 593 mg/Kg ). El (4H3MB) disuelto previamente en el

vehículo, fue administrado por vía oral utilizando para ello una sonda gástrica ¨Vygón¨ # 8 adaptada a una

jeringuilla plástica desechable de 5mL a razón de 1mL por cada 100gr de PC, por tratarse de una solución

oleosa. El grupo control recibió el vehículo a la misma temperatura.

2.4 Procedimiento Experimental

Los animales se mantuvieron en cuarentena durante 7 días. Las ratas fueron pesadas, marcadas y distribuidas

al azar 24 hora antes de iniciar el estudio. El pesaje se realizó al inicio de la cuarentena, a los 0,7 y 14 días.

Finalizado el proceso de administración comenzó la observación clínica de los signos y síntomas mas

representativos en intervalos de 2 horas: 1er día 6 observaciones, 2do día 3 observaciones, 3er día en adelante

una observación. Al concluir los 14 días se realizó toma de muestra de sangre por punción del seno

retroorbitario, previa anestesia de los animales con éter dietílico para determinaciones bioquímicas, se

sacrificaron los animales y se enviaron al Dpto. de Anatomía Patológica después de realizada la observación

clínica con el objetivo de realizar la observación microscópica de los órganos y sistemas. Se procedió a

prepararlos para su posterior análisis histopatológico.

2.5 Análisis estadístico.

Se utilizó el programa Statistical for Windows para estimar las variaciones de peso, a través de un análisis de

Varianza Multivariado (Bifactorial), utilizando como variables los pesos de los días 0,7 y 14 y como factores

el sexo y los niveles de dosis empleados, con un nivel de significación de un 5% (p<0.05)

3. Resultados

Dos horas después de la administración, se observa en todos los grupos experimentales somnolencia,

decremento de la actividad motora espontánea , disminución de los reflejos y diarrea. Los grupos de 2000,

1476 y 1089 mg/Kg presentaron además disnea, piloerección y catalepsia. Los grupos de 803 y 593 mg/kg

presentaron además balanceos, caída en posición lateral. Cuatro horas después los animales de todos los

grupos permanecían con todos los signos y síntomas de la 1ra observación, aunque se observó un aumento

apreciable en la consistencia de las heces. Seis horas después de la administración los animales continuaban

con los mismos signos y síntomas. Ocho horas después de la administración en el grupo control se observa

incremento de la actividad motora, respuesta a estímulos exteriores y mayor avidez por el agua y la comida.

En los grupos 2 000,1476, 1089mg/kg los animales continuaron en el mismo estado, se aprecia un ligero

aumento de la actividad motora, supresión de la disnea y baja respuesta a estímulos exteriores. Los grupos

803y 503 mg/kg se observa mayor avidez por el agua y la comida, mayor respuesta a estímulos exteriores y

en algunos animales se apreciaba somnolencia. En las otras observaciones persistía somnolencia y

piloerección, ya presentaban mayor respuesta a estímulos exteriores, avidez incrementada por el agua y la

comida, se observa de forma aislada acicalamiento y hábitos de aseo corporal normal. En el segundo día los

animales de los grupos control 1089, 803 y 593 poseían comportamiento y hábitos normales, los de los grupos

2000 y 1476 se comportaron de forma normal aunque se observó piloerección y agrupación en los extremos

de la caja. Del 3er día al 14 no se apreciaron signos ni síntomas de toxicidad, el comportamiento fue normal.

No hubo diferencia en el peso corporal de los animales. Los valores de las determinaciones bioquímicas

realizadas se observan en la siguiente tabla.

Tabla 1: Parámetros bioquímicos obtenidos en ratas.

Sexo Grupos mg/kg Proteínas

totales

TGP Creatinina Conteo

global

Conteo diferencial

Monocitos Linfocitos Neutrofilos

Hembras 200014761089803593

Control

62,5 ± 4,466,2 ±6,564.7 ±2,961,1 ±1,068,3 ± 0,860,7 ± 0,6

21,0 ± 3,925,2 ± 4,529,9 ± 2,723,3 ± 7,223,3 ± 0,222,3 ± 5,1

67,6 ± 4,070,3 ± 1,565,1 ±3,062,8 ± 1,263,5 ± 3,766,4 ± 3,0

7,4 ± 3,99,4 ± 2,29,3 ±1,39,3 ± 2,85,7 ± 0.810,3 ± 2,7

2,0 ± 1,04,7 ± 1,12,0 ± 0,94,3 ± 1,63,0 ± 1,12,3 ± 1,7

75,0 ± 2,064,7 ± 1,581,0 ± 2,078,3 ± 3,279,7 ± 2,175,0 ± 2,0

6,7 ± 5,05,0 ± 2,016,0 ± 5,27,7 ± 4,216,7 ± 2,510,0 ± 5,0

Machos 200014761089803593

Control

60,0 ± 2,358,6±2,660,9±3,759,1±1,563,4±2,560,2±3,0

28,6±2,829,1±2,022,3±5,326,2±3,726,1±0,527,7±3,7

55,6 ±8,957,8±0,846,8±1,955,5±2,854,8±2,954,7±2,0

10,7±0,510,6±3,911,4±2,18,5±1,39,3±1,78,9±2,3

3,3±2,53,7±2,12,0±1,03,3±1,12,7±0,62,0±1,7

76,0±2,668,7±7,278,3±0,677,0±3,678,7±4,076,3±5,0

10,7±8,610,7±8,915,0±5,017,7±8,112,3±0,612,3±6,0

4. Discusión

Los resultados obtenidos en el presente estudio muestran que la toxicidad (4H3MB) es muy baja. Al no

ocurrir muerte en ninguno de los niveles. Según lo establecido por la OECD el producto se incluye en la

categoría de sustancia sin clasificar. Los síntomas y signos apreciados pudieran estar relacionados con la

toxicidad inherente al producto, debido a que los animales del grupo control mostraron una recuperación mas

rápida que los restantes niveles de dosis. Sin embargo la pronta recuperación observada en todos los grupos y

la no aparición de muerte demuestran que el efecto lesivo asociada a la sustancia parecer ser muy bajo. No se

descarta que el distres que provoca la excesiva manipulación y administración reiterada, se relacionen con los

resultados obtenidos. Los animales sometidos al (4H3MB) no manifestaron alteraciones anatomopatológicas.

Los hallazgos morfohistopatológicos a nivel hepático se caracterizaron por esteatosis centrolobulillar de ligera

a moderada en algunos animales, en los diferentes niveles de dosis y el grupo control. Inferimos que esta

alteración se debe al aceite utilizado como solvente y no a daño tóxico o lesional de la sustancia.De los

parámetros bioquímicos determinados en los que los valores medios relativos a los niveles de dosis con los

del grupo control y el rango de valores normales establecidos mostraron un comportamiento normal. Hubo en

algunos grupos tendencia al límite superior de la TGP, la causa de este comportamiento es la presencia en

algunos animales de discretos incrementos de TGP sérica que puede ser motivado por la esteatosis hepática

referida en el estudio anatomopatológico. Esta enfermedad se caracteriza por la acumulación de grasa en el

hígado y puede ocasionar depleción de las reservas de glucógeno hepático y lesión de las membranas del

hepatocito lo que permite la salida de la TGP dejándola escapar al líquido intersticial y por tanto a la corriente

sanguínea.

5. Bibliografía.

1. Hayes , P. et al. Principios y métodos de toxicología, tercera edición Raven Press . New York. 1994.

2. Reppeto, M. Toxicología fundamental. Segunda edición aumentada. Editor Científico médica. 1998.

3. Acute Oral Toxicity. OECD Guideline for testing of chemicals, 401. 1987.

4. Abrahm, D.J.; Mehanna, A, S. Et al. Vanilina , a Potential agent for the treatment of Sickle cell anemia .

Blood , 1991; vol 77, no.6: pp 1334 –1341.

5. Toxicología preclinica. Anteproyecto, BPL, La Habana, 1991.

Quadratic Index and quantitative structure-mutagenicity relationship in 2-furylethylene derivatives.

Yovani Marrero*,§, † Giselle P. Machado† & Vicente Romero Zaldivar.

§Departmento de farmacia, Facultad de Química-Farmacia. Universidad Central de las Villas, Cuba.†Centro de Bioactivos Químicos, Universidad Central de las Villas, Santa Clara, 54830, Villa Clara, Cuba.Faculty of informatic. Universidad de Cienfuegos, cienfuegos, Cuba.*Author to whom correspondence should be addressed. E-mail: yovanimp@qf.uclv.edu.cu

Summary

A novel approach to topologic-molecular has been introduced for the classification of the 2-furyletilenos in

mutagenic and non-mutagenic. They were developed, using the quadratic indexes as molecular descriptors,

a discriminant function that allows the correct classification of 100% of the compounds in the training set

and external prediction set. Also, two quantitative models were found for the description of the mutagenic

power of the active compounds in structural terms.

Keywords: Quadratic indexes, QSPR, nitrofurans, 2-furylethilenes, mutagenic activity.

1. Introduction

The nitrofurans are an important family of chemical compounds that have been used as therapeutic agents

in human and veterinary medicine.1 Besides these biological properties, the nitrofurans are potential

mutagenic 2 molecular entities. The toxicity of the nitrofurans has restricted their development and their use

as medicinal agents (table I). Subsequent studies have opened new opportunities for the furylethylenes.

Table I. Common name, principal uses and toxicity nitrofurans derivates.

No Common name Use Mutaga Carcina

1 AF-2: Furylfuramide Food additive + +

2 Furylacrylic acid:2-furan preservative + *

3 Nitrofurazone Topical disinfectant + +

4 Nitrofurantoin Urinary tract disinfectant + -

5 Furazolidone Additive and prevent intestinal disease + *

6 Nifurtimox Treatment of chagas disease + ?

7 Fanft Experimental bladder carcinogen + +

2. Materials and methods

2.1 The TOMO-COMD Approach. The Quadratic Indexes were calculated with the program TOMO-

COMD3. The k-th total [ec.1] and local [ec. 2] quadratic indexes qk(x) are defined :

where n is the number of atoms of the molecule. The coefficients kaij are the elements aij of the k-th power

of the matrix M of the molecular pseudograph (G). Then, M = [aij], and the elements aij are defined:

qk(x)= ∑∑==

n

j

kn

i

aijXiXj11

[1] qkL(x)= ∑∑==

m

j

km

i

aijLXiXj11

[2]

where Pij is the number of edges that comply with ek ∼ vi,vj among the vertexes vi y vj. Lij is the number of

loops in vi. In ec. 2, m is the number of atoms of the fragment of interest and kaijL is the element of the file

“i” and column “j” of the matrix MkL=Mk(G, Fi). The matrix Mk

L=[kaijL] and the elements kaijL is defined:kaijL= kaij if both vi and vj are vertexes contained in the fragment of interest.

=1/2 kaij either vi or vj is contained in the fragment of interest but not both of them

=0 otherwise

2.2 Mutagenicity Data. Table II The compounds used in the present study were taken from the literature.4

oR 1

H

R 3R 2

No R1 R2 R3 Ames SOS A. Calc Residual S. Calc Residual

1 NO2 NO2 H + (6.602) + (1.30) 6.460 0.142 1.36 -0.06

2 H NO2 H - -

3 Br COOCH3 NO2 - -

4 NO2 COOCH3 NO2 + (6.602) + (0.24) 6.744 -0.142 0.69 -0.45

5 H COOCH3 NO2 - -

6 NO2 COOC2H5 COOC2H5 NS + (0.70) 0.81 -0.11

7 NO2 NO2 CH3 NS + (3.20) 3.03 0.17

8 NO2 COOCH3 CN + (5.301) + (0.45) 5.349 -0.048 -0.05 0.50

9 H COOCH3 CN - -

10 Br COOCH3 CN - -

11 NO2 CN CN + (6.046) + (0.33) 5.991 0.055 0.38 -0.05

12 H CN CN NS -

13 NO2 COOCH3 CH3 + (4.699) NS 4.706 -0.007

Logarithm (in parenthesis) of the inverse of concentration producing the maximum number of revertantper plates. Value (in parenthesis) of the potency of induction of SOS (SOSIP). Calculated Value for the(predicted) models 4 y 5 for the toxic power according to Ames y SOS (SOSPI) respectively.2.3 Statistical analysis. All the statistical analyses were carried out with STATISTICA.5

3. Results and Discussion.

With the purpose of developing a discriminant function, the lineal discriminant analysis was employed.

P= -151.214 + 40.76x10-2 Aeq4L(x) [3]N= 10 =0.093 D2=38.96 F(1.8)=77.934 p<0.0000

In table III the results obtained are illustrated in the classification of the compounds in training and

prediction sets. Discriminant functions for this same training and prediction set can be found in the

literature.4 Nevertheless, equation 1 y 2 of the reference4 classifies incorrectly the 13 compounds.

Table III. Results of the classification of 2-furylethylenes.

aij = Pij if i≠j y ∃ ek ∈ E / ek ∼ vi,vj

= Lij if i = j

= 0 otherwise

Noa Class. Obs. Prob. Ec. 3 Noa Class. Obs. Prob. Ec. 3 Nob Class. Obs. Prob. Ec. 3

1 - 100 8 + 100 1 + 100

2 - 100 9 - 100 2 + 100

3c - 86 10 - 89 3 + 100

4 + 100 11c + 100 4 + 100

5 - 100 12 - 100 5 + 100

6 + 100 13 + 100 6 + 100

7c + 100 7 + 100

a Compounds of Table II. b Compounds of Table I. c Compounds in the external prediction.

One of the important aspect of the structure-property activity relation of the models is the ability to predict

the activity studied. In table III the results of the virtual screening is of the 7 compounds presents a proven

mutagenicity activity. Finally, we develop 2 quantitative models using linear regression.

Log (1/C)= 0.850296 + 35.732x10-3 .NO2eq1L(x) +1.56x10-9. Aeq15L(x) [4]N= 5 R=0.99 S=0.15 F(2.2)=60.123 p<0.016SOSIP= -110.373-1.82x10-3. eq4(x)+9.89x10-3. Aeq5L(x) [5]N= 6 R=0.96 S=0.40 F(2.3)=17.702 p<0.021In table II, the two regression models show the obtained results. Both models present the values of the

correlation coefficient and of the ratio of Fisher higher than that of equations 3 and 4 of the reference4.

Therefore, the positive contribution of NO2eq1L(x) indicates that the presence of a nitro group in the molecule,

independent of the position it occupies, it increases the value of the log (1/C), and is logic if we keep in

mind that the capacity to accept one electron from the medium to produce an ion-radical will be increased.

Conclusions

Using the quadratic indexes as molecular descriptors function discriminant was developed, that allows the

correct classification of 100% of the compounds in training and external prediction sets. The predictive

quality of the model was also determined by evaluating 7 additional molecular entities with a proven

mutagenic activity. Two quantitative models were found for the description of the mutagenic power. The

comparison with another methodology shows a good behavior of the proposed descriptors.

References

1. Bryan, G.T. In Carcinigenesis -A comprehesive survey- nitrofurans: Chemestry, metabolism, mutagensis

and carcinigenesis; Bryan, G. T., Ed.; Raven Press: New York, 1978; Vol. 4, pp 1-12.

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3. Marrero, Y.; Romero, V. TOMOCOMD program. Universidad central de las villas. 2002.

4. Estrada, E. Mutat. Res. 1998, 420, 67-75.

5. STATISTICA ver. 5.5, Statsoft, Inc. 1999.

Elaboración de un “Extracto con Actividad Antinflamatoria” a partir de un residuo placentario.

G.Coto, G.Garcia, L.Oruña, G.Lago, D. Da’Lama , M.Alvarez

El uso de subproductos para evaluar su posible empleo ha sido una actividad constante en nuestro Centro para

disminuir cada vez más sustancias que pueden contaminar el ambiente, siendo aún una fuente potencial de principios

activos . Es por eso que se consideró que la masa placentaria generada en la extracción del principio activo de la

Pilotrofina Loción pudiera ser una fuente rica para la obtención de un extracto placentario acuoso (EPA) con

actividad antinflamatoria similar al informado por la literatura conocido como Extracto Filatov . Se diseñó un

proceso de obtención para lograr un producto estéril con calidad inyectable, libre de pirógenos y de AcVIH -1

(incluye subtipo 0) y VIH-2; Ag de Hepatitits B y AcHCV. Se comparó con un producto Suizo de características

similares, el perfil protéico de pesos moleculares entre ambos fué similar sobre todo en el volumen muerto no se

detectó presencia de proteinas de alto peso molecular en ambos productos. El nivel de metales pesados, minerales,

conductividad y otros indicadores químico-físicos fueron similares al patrón de referencia . La evaluación del efecto

antinflamatorio se realizó por dos vias intramuscular e intraperitonial empleando ratas albinas hembras dividida en

tres grupos I Control (+) Betametason, II Control( -) Carragenina 1% y III EPA . En la vía intramuscular la

Betametasona presentó los mejores resultados estadísticos pero EPA superior a la Carragenina en el mayor efecto

inflamatorio representando una reducción mayor del 50%. Por la via intraperitoneal los resultados de Betametasona y

EPA fueron similares

Introducción

Desde 1945, el profesor Filatov (1945, 1953) empleó la placenta humana para realizar extractos acuosos en sus

tratamientos para diferentes patologías oftalmológicas como son: procesos inflamatorios, queratitis e iritis y procesos

crónicos como retinosis pigmentaria. Existen diferentes laboratorios que han fabricado este producto, en Rusia (Medic

Export), Suiza (Serolab Sa), Italia (Lucchini) y Cuba (Centro De Histoterapia Placentaria)

En Cuba Miyares (1984) siguiendo la metodología propuesta por Filatov obtuvo este antinflamatorio el cual se

caracterizó por Melgares (1996) comparándolo con otro similar de procedencia Suiza. Rodríguez (1998) recopiló la

información obtenida y evaluó el efecto de diferentes enzimas termoestables presentes en estos extractos y que ha sido

una de las características distintivas de este compuesto que a pesar de ser expuesto a temperatura de 105 C enfriando,

centrifugando o filtrando y posteriormente liofilizado, al ser reconstituidos se ha detectado actividad enzimática.

También Jiménez (1993) presentó una modificación al procedimiento original el cual se comprobó su actividad

antiinflamatoria una vez que el producto se esterelizó en autoclave.

Miyares (1984, 1996) mostró la actividad antinflamatoria utilizando la técnica descrita por Germny y Martin (1971)

que se basa en provocar la peritonitis química en el ratón o la formación del edema inflamatorio de la pata de la rata

mediante la inyección de una solución de dextrana al 6 %. El presente trabajo propone una nueva metología a partir

de la masa placentaria después de haber sido sometida a la extracción del principio activo de la Pilotrofina Loción

para obtener un extracto antiinflamatorio.

Materiales y Métodos

Se utilizó la masa residual de placentas humanas empleadas en la elaboración Pilotrofina Loción de tres lotes

diferentes. Se realizaron tres lotes experimentales a partir de la masa residual de placenta. Esta masa ya pasó por un

proceso de extracción acuosa, el resto (la masa sólida) se almacenó a - 20 C hasta su posterior procesamiento para el

procedimiento propuesto en este trabajo. A un peso de masa placentaria residual se le añadió 2 volúmenes de suero

fisiológico (Solución de cloruro de sodio 8.5 g / L)(P/ 2 V) se agitó con agitador de paleta en forma de "U" a 750 rpm

durante 30 min a temperatura ambiente. Seguidamente se continuó la agitación a 350 rpm a 80 C durante 30 min.

Una vez terminado el tiempo se dejó reposar todo el material a temperatura ambiente. Posteriormente se ajustó el pH

con ácido láctico hasta pH 5.4 - 5.5 y se conservó a 8 C durante 20 horas con agitador de paleta a 350 rpm. Cumplido

este tiempo todo el material se dejó reposar, decantándose y se filtró por tres capas de gasa, se desechó la fase sólida y

la líquida se centrifugó a 10 000 rpm a 10 C durante 20 min, terminada esta operación se separó la fase líquida del

sedimento y se rectificó pH con ácido láctico hasta pH de 5.4 - 5.5. La solución se calentó a 100C durante 2 min, se

filtró el líquido cuando alcanzó la temperatura de 50 - 60 C mediante placas filtrantes esterelizantes (dos veces).

Previamente las placas se lavan con suero fisiológico a 60 C , seguidamente envasar en frascos, autoclavear a 121 C,

1 at durante 30 min, enfriar y centrifugar, separar fases desechar el sedimento y ajustar el pH con NaOH 0.5 N, pasar

por placas filtrantes esterelizantes similar a la filtración anterior, autoclavear en el envase final donde se considera ya

terminado para ser evaluado como un inyectable.

Ensayo Microbiológico y Pruebas de Efectividad Farmacológica y Tolerancia Local.

Las muestras (Tres lotes consecutivos) se enviaron al Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos

(CIDEM) donde se realizaron las pruebas de esterelidad y de pirógenos según las normas y procedimientos

establecidos por esta Institución. Las pruebas se efectuaron en los laboratorios LIORAD, CIEB e IFAL empleando las

técnicas según los Procedimientos Normalizados de Operación establecidos.

R e s u l t a d o s y D i s c u s i ó n :

Tabla 1. Características físico químicas del extracto placentario acuoso. Promedio de tres lotes experimentales.

Características organolépticas: Líquido transparente, ligera tonalidad amarilla, excento de partículas en suspensión.

pH : 6.5 - 7.1 = 6.8 Metales Pesados: >10 ppm cumple

NaCl (g/L) 7.5 - 7.76 Lípidos: 0 mg/100ml

Conductividad 14 ms/ cm Proteínas (N x 625) 194 mg /100 ml

Densidad 0.990 Lowey: 59mg/ 100 ml

Sólidos totales 1 g / 100 ml M.O: 1 - 0.08 = 0.919 g/100ml

Cenizas: 0.081

Tabla 2. Caracterización de los minerales presentes en el extracto acuoso de placenta (PPM)

Lotes experimentales. SEROLAB SA.

I II III REF

Cu 0.01 0.78 0.27 0.01

Mg 18.04 18.80 17.66 1.04

Ca 141.00 111.20 92.28 3.70

Mn 0.02 0.01 0.01 0.01

En la tabla 2. se aprecia la variabilidad que existe entre lotes para los minerales evaluados en los diferentes lotes

experimentales analizados. Se sugiere seguir analizando este indicador que refleja un mayor contenido de Magnesio,

calcio y cobre estos tres cationes influyen beneficiosamente en los procesos reparadores y bioestimulantes de los

tejidos, Filatov (1945).

Tabla 3. Determinación del peso molecular por cromatografía de filtración .

No. Tubo Ads Com/tub T.R Ve Kav P. Molec.

12 0.023 0.016 48 9.6 0.111 382 340

17 0.010 0.007 68 13.6 0.358 30 575

21 0.010 0.007 84 16.8 0.555 4 053

Leyenda: Abs. Absorbancia a 612 nm, Ve. Volumen de elusión, Kav. Constante promdio P.Molec: Peso molecular.

Como se puede apreciar el producto obtenido a partir de residuo de placenta que queda de la obtención de la

Pilotrofina si se compara con el obtenido por los Laboratorios SEROLAB SA es muy similar en cuanto al rango de

pesos moleculares lograndose tres picos (Tabla 2 ) y ninguno eluyen en el volumen muerto similar comportamiento

presenta el antiiflamatorio de referencia. Al parecer en la extracción acuosa que se realiza a la masa placentaria para

la obtención de Pilotrofina Loción así como en el procedimiento de fraccionamiento (cambio de pH, centrifugación y

calor) se eliminan las fracciones de altopeso molecular lo cual permite aprovechar la masa residual que queda

simplificandose un gran números de pasos en la tecnología propuesta en los procedimientos normalizados

operacionales de los laboratorios SEROLAB SA.

Conclusiones:

1. Se pudo emplear la masa placentaria que se desechaba una vez terminada el proceso de obtención de la

Pilotrofina Loción en la fabricación de un nuevo producto con actividad antiinflamatoria, ahorrando materia

prima (placenta fresca).

2. El extracto acuoso obtenido de la masa placentaria mostró efecto antiinflamatorio por vía intramuscular a la dosis

ensayada con un porcentaje de inhibición de la inflamación de 35.6.

3. El extracto acuoso mostró un efecto similar al de la Betametazona por vía intraperitonoal a la dosis ensayada con

un porcentaje de inhibición de la inflamación de 396.

4. En las pruebas de Tolerancia Local el producto se considera no tóxico.

Referencias:

Germany y Martin. 1971. Experimental study of antinflamatory drugs of diferent chemical structure. Ciencia cultura

Jiménez M.A. 1993. Peocedimiento para la obtención del antiinflamatorio autoclaveado. Informe Técnico. CHP.

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Comparación con uno comercial de fabricación rusa. Informe Técnico.

Miyares C. M. 1996. Plegable informativo del extracto acuoso de placenta humana. Antiiflamatorio oftálmico. CHP.