RESUMEN FISIOLOGÍA CELULAR CERTAMEN 1 ▪ LA MEMBRANA PLASMATICA, ESTRUCTURA Y TRANSPORTE ▪ SEÑALIZACION CELULAR Y TRANSDUCCION DE SEÑALES ▪ COMPARTIMENTALIZACION CELULAR Y CITOESQUELETO ▪ CELULAS EXCITABLES Y SISTEMA NEUROMUSCULAR ▪ CELULAS CONTRACTILES MEMBRANA PLASMATICA, ESTRUCTURA Y TRANSPORTE COMPONENTES ESTRUCTURALES DE LAS MEMBRANAS No todas las células tienen la misma cantidad de membrana y tampoco las tienen en la misma proporción. Las células secretoras, por ejemplo, sin distintas a las células estructurales. La membrana plasmática es una bicapa lipídica, semilíquida, y proporciona la fluidez celular. ▪ LIPIDOS - Fosfolípidos - Esteroles: colesterol (cél. animales) - fitoesteroles (cél. vegetales) ▪ PROTEINAS: - Enzimas - Receptores - Canales Iónicos - Transportadores - Bombas moleculares 30% DE LAS PROTEINAS CODIFICADAS POR EL GENOMA, SON PROTEINAS DE MEMBRANA ▪ CARBOHIDRATOS: Importantes en el reconocimiento celular y respuesta inmune. FOSFOLÍPIDOS - Son moléculas anfipáticas. Tienen una parte polar y otra apolar. La polaridad de los fosfolípidos puede ser modificada por los sustituyentes del fosfato. Los principales fosfolípidos de membrana son: - Fosfatidiletanolamina → Eléctricamente neutra a pH fisiológico. - Fosfatidilserina → Eléctricamente NEGATIVA a pH fisiológico. - Fosfatidilcolina → Eléctricamente neutra a pH fisiológico. - Esfingomielina → Eléctricamente neutra a pH fisiológico. La serina actúa como glicerol. Empaquetamiento de moléculas lipofílicas en un medio acuoso - Los ácidos grasos y los fosfolípidos son moléculas anfipáticas. En un medio acuoso tienden a formar dos tipos distintos de estructuras: micelas lipídicas o bicapas lipídicas.

- La fluidez de la bicapa está determinada por el tipo de ácido graso o de isomería del ácido graso del fosfolípido: Cadenas insaturadas, enlaces cis → Membrana fluida, fosfolípidos más separados Cadenas saturadas, enlaces trans → Membrana más empaquetada, fosfolípidos muy compactados. Movimientos de los fosfolípidos en las membranas

- Difusión Lateral: Desplazamiento en la membrana ↔ - Rotación: Giro sobre su propio eje - Flexión: Ácidos grasos se mueven con respecto a la cabeza - Trasposición (Flip-flop): Fosfolípidos cambian de posición con respecto a la membrana, es decir, si antes estaban con su

cabeza hacia el citoplasma, quedan con su cabeza hacia el espacio extracelular. ↨ COLESTEROL - El colesterol es menos anfipático que los fosfolípidos. El -OH es el único componente que le otorga polaridad. La presencia de colesterol en las membranas celulares: 1. Aporta mayor resistencia mecánica a la tracción 2. Evita la formación de estructuras cristalinas de fosfolípidos 3. Facilita la inserción de proteínas en la matriz fosfolipídica

▪ EN LA MEMBRANA PLASMATICA EXISTE UNA MOLECULA DE COLESTEROL POR CADA DOS MOLECULAS DE FOSFOLIPIDOS ▪ EN LAS MEMBRANAS INTERNAS LA PROPORCION ES MUCHO MENOR

►Microdominios Lipídicos (RAFTS): Región de la membrana plasmática engrosada por su mayor concentración de colesterol. Distribución asimétrica de fosfolípidos y glicolípidos en la membrana plasmática En la cara extracelular hay mayor concentración de fosfatidil colina, fosfatidiletanolamina y esfingomielina, que son neutros a pH fisiológicos. En la cara citoplasmática hay mayor concentración de fosfatidilserina, que tiene una carga negativa a pH fisiológico. PROTEÍNAS Distribución de las proteínas en la membrana plasmática - Proteínas Integrales: Atraviesan la membrana de lado a lado, teniendo sus residuos de aminoácidos apolares en el interior de la membrana. Las proteínas integrales pueden pasar una vez por la membrana: proteína monopasaje; o atravesar varias veces la membrana plasmática: proteína multipasaje. - Proteínas Periféricas: “Flotan” en cualquiera de las dos cara de la membrana. Sistemas de Asociación de proteínas con la membrana - Se unen a ácidos grasos - Se unen a un polisacárido - Se asocian a una proteína integral - Se unen mediante un grupo prenil

Gráficos de Hidropatía Para determinar si una proteína es mono o multipasaje, se puede hacer un gráfico de hidropatía, que consiste en medir la repulsión que generan ciertos segmentos de proteína al agua. Si se obtienen varios segmentos que repelen al agua, se evidencia que estamos frente a una proteína multipasaje. → El ambiente extracitoplasmático es oxidante. El ambiente citoplasmático es reductor. El extremo extracitoplasmático de la proteína integral está oxidado, y el extremo intracitoplasmático está reducido. Estudio de las membranas celulares Para estudiar por separado los elementos de la membrana se usan moléculas con actividad detergente, que tienen la capacidad de disolver la membrana. - Detergentes no Iónicos: No forman cargas. Tritón X-100 - Detergentes Iónicos: Forman cargas. Desoxicolato de sodio (sales biliares). Dodecilsulfato de sodio (SDS) Uso de un detergente para solubilizar, purificar y reconstruir sistemas de proteínas en membranas - Se emulsionan componentes proteicos y lipídicos - Por cromatografía en columna se purifica la proteína a estudiar - Para estudiar la función de la proteína se reconstituye su ambiente. - El uso de proteasas permite identificar segmentos externos de proteínas integrales, transformando proteínas multipasaje en dos proteínas multipasaje más pequeñas. - La criofractura permite identificar en qué dominio de la membrana (citoplasmático o extracelular) está más inserta una proteína. Movimiento de las Proteínas en la Membrana Plasmática Las proteínas no están fijas en la membrana. Para demostrar su movimiento, se realizó un experimento en el que se creó un heterocarionte con proteínas de membrana de ratón y de humano. Se incorporaron anticuerpos marcados y se incubó. Luego de unos minutos, el heterocarionte tenía distribuidos de manera aleatoria en su membrana las proteínas provenientes del humano y las provenientes del ratón. Medición de la velocidad de difusión lateral de una proteína de membrana - Técnica FRAP (Fluorescence recovery after photobleaching - recuperación de la fluorescencia después de fotoblanqueo) - Técnica FLIP (Fluorescence loss in photobleaching - pérdida de fluorescencia en un fotoblanqueo)

Limitación de la Movilidad lateral de las proteínas de membrana Cada célula tiene bien compartimentalizada la posición de las proteínas dentro de la membrana plasmática, por lo que es necesario limitar la difusión lateral. Existen cuatro sistemas diferentes: - Por autoensamblaje - Por agregados moleculares desde el interior - Por agregados moleculares desde el exterior - Por interacción con proteínas de otras células

GLICOCÁLIX CELULAR Los polisacáridos sólo están presentes en la parte externa de la membrana plasmática, asociados a proteínas o lípidos. Sirven para el reconocimiento celular. - Selectinas: proteínas que reconocen glicoproteínas o glicolípidos extracelulares en forma muy específica. - Lectinas: Son capaces de reconocer polisacáridos de varias células. TRANSPORTE A TRAVÉS DE LA MEMBRANA CELULAR Permeabilidad de Diferentes moléculas a través de la membrana - Atraviesan la membrana con facilidad: ▪ Gases → O2 - CO2 ▪ Moléculas hidrofóbicas → Benceno ▪ Moléculas Polares pequeñas → H2O, Etanol

- No atraviesan la membrana: ▪ Moléculas polares grandes → Glucosa ▪ Moléculas cargadas (iones) → H+, Cl -, Na+, Ca++, aminoácidos.

El transporte a través de las membranas se puede realizar por: ◘ DIFUSIÓN SIMPLE

Ocurre a través de los fosfolípidos de la membrana. (EJ: Gases, agua, benceno) Opera según el coeficiente de permeabilidad de una molécula y no es saturable. Coeficiente de Permeabilidad → Solubilidad relativa de una molécula en dos solventes de diferente polaridad

◘ TRANSPORTADORES (TRANSPORTE FACILITADO) ▪ TRANSPORTE PASIVO A favor de un gradiente de concentración; de mayor concentración a menor concentración. Puede ser un gradiente químico, de carga eléctrica o electro-químico. Es saturable y depende sólo de la concentración de la molécula transportada. - Proteínas Transportadoras - Canales Iónicos

▪ TRANSPORTE ACTIVO Requiere de aporte energético y depende de la disponibilidad de esta energía. En contra de un gradiente de concentración; de menor concentración a mayor concentración. - Co-transportadores → Transporte Acoplado - Bombas Moleculares

Ionóforos Transportadores o formadores de canales de origen natural o sintético que incrementan la permeabilidad de las membranas a diferentes iones. Muchos medicamentos actúan como ionóforos. ▪ Valinomicina: Transportador móvil de K de origen natural ▪ FCCP: Transportador móvil de protones, es sintético. ▪ A23187: Trasnsportador móvil de Ca y Mg, es sintético. ▪ Gramicidina: Formador de canales inespecífico para Na, K y protones. Proteína sintetizada por bacterios y se utiliza como antibiótico.

Los triángulos a los lados de los transportadores se refieren a la dirección del gradiente de concentración. Los canales iónicos son los más veloces, luego los transportadores y finalmente las bombas moleculares.

TRANSPORTE PASIVO ♦ Transportadores Uniport (Uniportadores) Transportan sólo una molécula a la vez y es a favor del gradiente de concentración. Sufren cambios conformacionales que permiten que la proteína transportadora pueda mediar el transporte pasivo de un soluto ▫ PROTEÍNAS INTEGRALES MULTIPASAJE TRANSPORTADORES UNIPORT DE GLUCOSA O GLUT, DISTINTOS PARA DIFERENTES TIPOS CELULARES (GLUT 1, GLUT 2, GLUT 3, ETC..)

TRANSPORTE ACTIVO Hay tres maneras diferentes de realizar el transporte activo: 1. Transportadores Acoplados: No requieren de aporte de energía externa ♦ Transportadores Simport El ion que aporta la energía va a favor del gradiente de concentración, y la molécula va en el mismo sentido, pero en contra de su gradiente de concentración. ▫ SIMPORTADOR SODIO-GLUCOSA Usando el Na en alta concentración en el segmento distal del tubo digestivo, se transporta glucosa en contra del gradiente de su concentración. Por cada dos iones de Na se incorpora una glucosa en el epitelio intestinal. En el túbulo renal este simportador es más eficiente: la relación Na-Glucosa es 1:1. Los Gluts no operan en este segmento porque el gradiente de concentración de glucosa no es favorable por su paso previo por zonas con presencia de Gluts. Como el Na aumenta en el medio intracelular, la bomba Na-K ATPasa restablece la concentración original.

♦ Transportadores Antiport El ion que aporta la energía va a favor del gradiente de concentración y la molécula se mueve en sentido contrario al ion, en contra de su gradiente de concentración. ▫ ANTIPORTADOR SODIO/CALCIO Entran 3 iones de Na+ y sale 1 ion Ca++ ▫ ANTIPORTADOR CLORURO-BICARBONATO ▫ ANTIPORTADOR POTASIO O SODIO-PROTONES

2. Bombas Impulsadas por ATP ♦ Bombas tipo P Durante el proceso de bombeo son fosforiladas por el ATP y movilizan iones.

▫ BOMBA SODIO POTASIO ATPasa Bomba electrogénica, puesto que produce diferencia de cargas eléctricas. Salen 3 Na+ y entran 2 K+. Tiene una subunidad mayor y una menor. Ambas son proteínas integrales. Es inhibida por un grupo de sustancias de origen vegetal llamados GLICÓSIDOS. La ouabaina (glicósido) se une a la subunidad mayor. Por efecto de la ouabaina, el sodio intracelular aumenta, por lo que se dificulta la entrada de más sodio. El antiportador Na/Ca deja de funcionar, con lo cual, aumenta la concentración de calcio en la célula cardiaca, y como consecuencia, aumenta la fuerza de contracción. ▫ BOMBA DE CALCIO ATPasa

♦ Bombas tipo V Operan en vesículas y generalmente bombean protones dentro de vesículas. No se fosforilan. BOMBA DE PROTONES DE LOS LISOSOMAS

♦ Bombas tipo F Similares a bombas tipo V. Operan en las mitocondrias. Pueden revertir el proceso. ATP SINTETASA

♦ Bombas tipo ABC (ATP BINDING CASSETTE) Transportan moléculas más complejas como el colesterol, proteínas o drogas. Participan en el sistema MDR (multidrug resistance). Tienen sitios de unión para el ATP en algunos dominios intracelulares.

3. Bombas Impulsadas por la luz CANALES IÓNICOS Y EL POTENCIAL DE LA MEMBRANA - Son proteínas de membrana. - Tienen conformación abierta o cerrada → TODO O NADA - La mayoría son muy selectivos - Pueden ser regulados en su abertura o cierre por:

▪ CAMBIOS DE VOLTAJE ▪ PRESENCIA DE LIGANDOS INTRACELULARES O EXTRACELULARES A TRAVÉS DE RECEPTORES ▪ EN FORMA MECÁNICA (presión temperatura) → UN CAMBIO CONFORMACIONAL BLOQUEA EL ESPACIO ABIERTO DEL CANAL

Concentración de iones dentro y fuera de una célula - La célula debe contener cantidades iguales de cargas positivas y negativas: debe ser eléctricamente neutra. - La diferencia de carga sólo se produce en el área inmediata a ambas caras de la membrana.

ION [ ] INTRACELULAR (Mm) [ ] EXTRACELULAR (Mm) Na+ 5-15 145 K+ 140 5 Mg2+ 0.5 1-2 Ca2+ 10-4 1-2 H+ 7 x 10-5 4 x 10-5 Cl- 5-15 110

Bases Iónicas de un Potencial de Membrana La diferencia de carga sólo se produce en el área inmediata a ambas caras de la membrana, no modifica la distribución de las cargas al interior de la célula o al exterior de ésta. Generación del Potencial de Membrana ● Si no existe paso de iones, el potencial de membrana será 0.

● Si la membrana es sólo permeable al Na+, al equilibrio, el potencial será -59mV, tomando como referencia el medio extracelular (EC) Como inicialmente hay menor concentración de Na+ en el medio extracelular, el Na+ se va a mover, vía canales selectivos de Na+ hacia el medio intracelular, aumentando la cantidad de cargas positivas en éste. Comparativamente, el medio intracelular queda positivo y el extracelular negativo. Así, tomando como referencia el medio extracelular, se tiene un potencial de membrana de -59 mV.

● Si la membrana es sólo permeable al potasio, al equilibrio el potencial será +59mV, tomando como referencia el medio EC. Todo esto es una situación ideal. En la célula se movilizan ambos iones. Si se considera como referencia el medio intracelular (con carga negativa), el potencial de equilibrio de ambos iones se invierte. El potencial de equilibrio del sodio sería, en este caso, +59 mV y el del potasio -59 mV. Ecuación de Nernst Si se aplica la ecuación de Nernst a una célula considerando como referencia el citoplasma, el valor que se obtiene varía de -40 mV a -100 mV en distintas células, y es considerado como el potencial de reposo celular. Este potencial de reposo está determinado por los canales de K+ que permanecen permanentemente abiertos → canales de K+ de reposo. En células nerviosas el potencial de reposo es de -60mV En células musculares esqueléticas y cardiacas es de -90 mV. Ecuación de Goldman Incorpora, además de la permeabilidad del K, la del Na y Cl, ya que estos canales pueden abrirse temporalmente, permitiendo el paso al interior de la célula de una pequeña cantidad de sodio y cloruro. Estructura Molecular de los canales de Potasio, Sodio y Calcio Probablemente, los primeros canales que aparecieron en la evolución fueron los canales de potasio. Los canales de sodio y calcio estructuralmente parecen una repetición de 4 veces el canal de potasio. Los canales iónicos pueden encontrarse en tres estados:

▪ Abiertos ▪ Cerrados ▪ Inactivados

La especificidad de los canales iónicos se debe a una estructura interna identificada como filtro de selectividad y que opera principalmente en los canales de potasio. Selectividad de los canales de sodio al ion sodio Las formas monohidratadas de los iones sodio permiten su paso por los canales de sodio. El ion potasio hidratado no puede pasar por los canales de sodio, puesto que su radio es mayor a lo que permite el poro y simplemente no cabe. Selectividad de los canales de potasio Sólo pasan por los canales de potasio las formas no hidratadas de estos iones. El ion sodio no puede pasar porque le es más difícil perder su molécula de agua de hidratación que al potasio (por electronegatividad del Na) El potasio actúa en 4 puntos clave en el filtro de selectividad, no así el sodio.

Path Clamp Técnica de pinzamiento de membrana. Permite medir apertura y cierre de canales iónicos, permeabilidad de membranas y potenciales de reposo. Se trabaja con un sólo canal iónico. Inactivación de los canales de potasio y sodio En un canal estructuralmente abierto, un dominio de la estructura polipeptídica del canal, bloquea temporalmente el paso de los iones. Funcionalmente el canal está cerrado, pues no permite el paso de iones. Compensación del efecto electrogénico El efecto electrogénico de la bomba de sodio es compensado por la apertura permanente de los canales de potasio. Por efecto de la bomba sodio-potasio salen 3 Na+ y entran 2 K+. Los canales de K+ eliminan el exceso de potasio intracelular. Efecto conjunto co-transportadores Sodio-glucosa, Bomba de sodio y transportadores GluT en el epitelio intestinal Desde el lumen intestinal hacia el interior del enterocito, ingresa la glucosa vía simportador sodio-glucosa. Entre el medio intracelular y el tejido conectivo actúa la bomba sodio-potasio. Por transporte pasivo, los Glut 2 transportan la glucosa hacia la sangre. Intercambio Oxígeno-anhídrido carbónico en los eritrocitos - Función del Antiportador cloruro-bicarbonato - Importancia de la enzima anhidrasa carbónica: tiene constante uno, lo que quiere decir que dependiendo de la concentración relativa de sustratos es hacia qué lado se dirige la reacción.

PRODUCCION DE HCL EN EL LUMEN GASTRICO CON LA PARTICIPACION DEL ANTIPORTADOR CLORURO-BICARBONATO, DE CANALES DE CLORURO, DE CANALES DE POTASIO, Y DE LA BOMBA PROTONPOTASIO ATPasa

SEÑALES CELULARES Y TRANSDUCCIÓN DE SEÑALES Cascada Metabólica Un receptor (ligando) proveniente del medio extracelular desencadena una serie de respuestas intracelulares al unirse a un receptor de membrana, que es una proteína integral de membrana. La señalización intracelular puede involucrar la participación de diferentes tipos de proteínas, que pueden actuar en las cascadas metabólicas a distintos niveles:

- Proteínas Transmisoras - Proteínas Mensajeras - Proteínas Amplificadoras - Proteínas Transductoras

- Proteínas de Bifurcación - Proteínas Integradoras - Proteínas de Regulación de la Expresión Génica

Diferentes tipos de receptores extra e intracelulares ♦ Receptores de Señales Hidrofílicas → Respuesta rápida y poco duradera

- Las señales hidrofílicas viajan libres solubilizadas en el plasma y requieren de un receptor para traspasar la membrana, puesto que al ser hidrofílica no puede atravesarla por sí sola. - Los receptores para señales hidrofílicas son receptores de superficie celular.

● Diferentes formas de señalización celular ▪ Dependiente de contacto: Una célula señalizadora posee una molécula señal unida a su membrana y la célula blanco posee un receptor unido a su membrana. Se pueden producir cambios en una de las dos células o en ambas. ▪ Paracrina: Una célula emite señales para células específicas, generalmente vecinas, produciendo respuesta rápidas y de corta duración. LA FORMACIÓN DEL ÓXIDO NÍTRICO ES UN TÍPICO EJEMPLO DE SEÑALIZACIÓN PARACRINA. (SEGUNDO MENSAJERO) ▪ Sináptica: La liberación de un neurotransmisor activa sólo a las células en contacto con este terminal axonal. Es una señal a distancia, pero muy dirigida y específica. ▪ Endocrina: Célula secretora emite señal hormonal a la circulación sanguínea para células lejanas. Esta señal llega a todo el organismo, pero sólo responden células con receptores específicos. ▪ Autocrina: Derivación de la señalización paracrina. Una célula genera una señal autoestimuladora, y responde ante ésta. ▪ A través de uniones comunicantes (GAP junctions): Permite el paso de moléculas pequeñas: nucleótidos, nucleótidos cíclicos, aminoácidos, dipéptidos, esteroles. ● Efecto de señales múltiples en las células animales Dependiendo del número, tipo e intensidad de la señal recibida, puede variar la respuesta de una misma célula, pues posee receptores de membrana con características diversas y muy específicas. Una misma molécula puede determinar diferentes respuestas en diferentes células. ● Diferentes tipos de receptores de membrana ▪ Receptores asociados a canales iónicos: un ligando se une a un canal iónico, abriéndolo o cerrándolo casi inmediatamente. Se produce una respuesta rápida de corta duración. ▪ Receptores asociados a proteínas G: una molécula señal se une a un receptor que activa a una proteína G al entrar en contacto con ésta. Se genera una respuesta un poco más lenta, pero más permanente en el tiempo. ▪ Receptores asociados a enzimas: El receptor puede ser una enzima, que al recibir un ligando se activa o inactiva (receptores catalíticos) o el receptor no enzima se puede unir a un ligando para activar a una enzima.

♦ Receptores de Señales Hidrofóbicas → Respuesta lenta, pero duradera - Las señales hidrofóbicas viajan unidas a una proteína transportadora (EJ: albúmina en el plasma sanguíneo). Atraviesan libremente la membrana debido a su carácter hidrofóbico. - Los receptores para señales hidrofóbicas son intraceulares, tanto citoplasmáticos como nucleares.

● Receptor de Hormonas Esteroidales y receptores nucleares Unión de hormona esteroidal a un receptor nuclear. Esta proteína (receptor) se une al DNA a través de motivos estructurales del tipo dedos de zinc. Se producen cambios en la expresión de un gen determinado. El receptor inactivo tiene un dominio de activación de la transcripción en su extremo amino terminal, tiene un dominio de unión al DNA, posee también un sitio de unión a la hormona esteroidal y en su extremo carboxilo hay unidas proteínas inhibidoras. Al unirse a un ligando, se libera la proteína inhibidora, el receptor cambia su estructura, permitiendo la asociación al DNA en su dominio de unión, a través de motivos estructurales dedos de zinc. Además del ligando pueden existir proteínas coactivadoras que induzcan o mantengan el cambio conformacional en el receptor. ● Respuestas a hormonas esteroidales al activar receptores nucleares - Respuesta Temprana: Los complejos hormona esteroidal - receptor activan la transcripción de los genes de la respuesta primaria, induciendo la síntesis de unas pocas proteínas diferentes. - Respuesta Tardía: Una proteína de la respuesta primaria inactiva la transcripción de los genes de la respuesta primaria. Otra proteína de respuesta primaria activa la transcripción de los genes de la respuesta secundaria. Se sintetizan proteínas de respuesta secundaria, modificando la función de sistemas metabólicos.

● Interruptores Moleculares (Proteínas intracelulares) ▪ Quinasas activadas por Fosforilación

- Serina/ Treonina Quinasas se inactivan liberado fosfato (desfosforilación) - Tirosina Quinasas

▪ Quinasas activadas por GTP (proteínas G) - Proteínas G triméricas se inactivan por conversión GTP → GDP (desfosforilación) - Proteínas G monoméricas

Diferentes mecanismos de integración de señales - Proceso de Señalización Posterior: se necesita una segunda fosforilación para activar la proteína, mediada por 2 tipos de señales de dos receptores distintos; o cada subunidad de la proteína es activada por una señal distinta y luego se ensambla. - Respuestas Cooperativas: Mecanismos de señalización donde la interacción receptor-ligando produce una respuesta umbral súbita. En neuronas y células musculares, la acetilcolina produce la apertura de unos pocos canales de sodio, los que a su vez producen la apertura de muchos canales más, produciendo un potencial de acción. - Retroalimentación Positiva Acelerante: Un ligando estimula a una enzima, pero el producto de la catálisis produce una mayor activación de la enzima. Mecanismos que permiten desensibilización a un ligando específico ▪ Secuestro del receptor: El receptor queda atrapado en un endosoma. DOWN-REGULATION ▪ Regulación por disminución: se destruye receptor en lisosoma Disminución cantidad de receptores de membrana ▪ Inactivación del receptor: una proteína intracelular bloquea la actividad del receptor ▪ Inactivación de proteína señalizadora: El receptor se activa, pero la señal no produce respuesta celular. ▪ Producción de una proteína inhibidora: la proteína señalizadora es activada por el receptor, y ésto determina la activación de una proteína inhibidora de la activación de la proteína señalizadora. Señalización mediante receptores de superficie asociados a proteínas G Son muy diversos, pero todos estos receptores tienen la característica de ser proteínas integrales multipasaje, que pasan siete veces la membrana plasmática. Constituyen una superfamilia de receptores de membrana. La gran mayoría de los fármacos y también toxinas de carácter hidrofílico actúan a nivel de estos receptores. Poseen un dominio de interacción con el ligando en el medio extracelular, y en el espacio intracelular tienen un dominio de interacción con la proteína G. Estructura Molecular de un Proteína G Trimérica Una proteína G trimérica inactiva tiene 3 subunidades: α, β, γ, y está unida a GDP. Cuando las proteínas G se activan (GDP→ GTP), se disocian en dos proteínas señalizadoras: la subunidad α y la subunidad β-γ. Ambas subunidades pueden tener efectos de señalización. La subunidad α de la proteína G se inactiva a sí misma, hidrolizando el GTP que está unido a ella, con lo cual finaliza el efecto de señalización y la respuesta derivada de ésta. Este efecto se debe a que la subunidad α tiene actividad GTPasa Otras proteínas G - Proteínas Gs: activan a la adenilato ciclasa - Proteínas Gi: inhiben a la adenilato ciclasa. Toxinas que afectan actividad de Proteínas G - Toxina colérica: inhibe actividad GTPasa de la subunidad α de la proteína Gs, por lo que permanece activa y así la adenilato ciclasa también permanece activa. - Toxina Pertúsica: impide que una proteína Gi interaccione con la enzima adenilato ciclasa activa, con lo cual se sigue produciendo AMP cíclico. Ambas toxinas producen aumento de AMPc por diferentes mecanismos. Transducción de señales en el proceso visual La luz interacciona con un fotorreceptor que contiene rodopsina, éste activa a una proteína G, que a su vez, activa a la GMPc fosfodiesterasa. Esta enzima produce el cambio de GMPc → GMP (disminución de GMPc), con un consecuente cierre de los canales de sodio. Con ésto, hay una hiperpolarización de membrana, que produce un bloqueo de corriente oscura, generándose la señal visual. Proteína Quinasa activada por AMPc (PKA) Las subunidades reguladoras están unidas a las subunidades catalíticas inactivas. Al unirse el AMPc a las subunidades reguladoras, el complejo AMPc - subunidades reguladoras se separa de las subunidades catalíticas ahora activas.

Proteínas Gq Proteínas G que activan a la enzima fosfolipasa C. Las proteínas Gq activadas producen la liberación de inositol trifosfato (IP3), el que produce un aumento de la concentración intracelular del calcio. El aumento de la concentración intracelular de calcio desencadena múltiples respuestas de regulación (activación de enzimas, secreción de vesículas, contracción muscular, etc). El fosfatidilinositol, fijo a la membrana, es degradado por la fosfolipasa C hasta inositol trifosfato (IP3) y diacilglicerol. El diacilglicerol queda unido a la membrana y activa a la proteína quinasa C (PKC). El IP3 es liberado al citoplasma, se une a un canal liberador de Calcio en el retículo endoplasmático, produciendo la liberación del Calcio hacia el citoplasma. El calcio activa a la proteína quinasa C, que va a fosforilar a otras proteínas. Principales mecanismos de regulación de la concentración citoplasmática del Calcio - Antiportador Na/Ca - Bomba de Ca - Bomba de Ca en retículo endoplasmático Procesos fisiológicos normales en la célula - Proteínas citoplasmáticas que secuestran Ca (Calmodulinas) - Importación activa de Ca en la mitocondria: ocurre en condiciones especiales, cuando la apoptosis es inminente. Proteínas quinasas activadas por el complejo calcio calmodulina o CAM-Quinasas Cuando el Calcio activa proteínas quinasas, no lo hace en forma libre, lo hace ligado a las calmodulinas. Cada calmodulina une cuatro iones calcio y cambia su propia conformación., para luego unirse a la proteína CAM-quinasa inactiva y activarla. Regulación de la Homeostasis Vascular por la activación de la proteína Gq y la liberación del ácido araquidónico En las células del epitelio vascular, en las plaquetas y en los leucocitos, la proteína Gq puede activar a una fosfolipasa A2, que libera ácido araquidónico (AA) desde los fosfolípidos de la membrana celular. Receptores Enzimáticos o ligados a Enzimas Todos son proteínas monopasaje en su forma monomérica. Son muy numerosos y se clasifican en: ▪ Receptores Tirosina quinasa: fosforilan residuos de tirosina ▪ Receptores asociados a tirosina quinasa: proteínas que al ser activadas activan a tirosina quinasas. ▪ Receptores de tirosina fosfatasas ▪ Receptores serina/treonina quinasas ▪ Receptores de guanilato ciclasa ▪ Receptores asociados a histidina quinasas Proteínas Ras Proteínas G monoméricas que al ser activadas transmiten la señal a través de múltiples vías y se considera que posiblemente inducen tumores cancerosos. Tiene una compleja interacción con un receptor catalítico (que se autofosforila).

COMPARTIMENTALIZACIÓN INTRACELULAR La célula eucariótica es una estructura altamente compatimentalizada. Existen compartimentos claramente definidos y entre ellos hay gran interrelación. No funcionan en forma aislada. El núcleo se originó a partir de una antigua célula procariítca que tenía los ribosomas y el DNA unido a la membrana (mesosoma). Hubo una invaginación de la membrana plasmática, y ésta envolvió al material genético, arrastrando consigo a los ribosomas, para formar el núcleo y el retículo endoplasmático. La mitocondria se originó a partir de una célica procariótica aeróbica con su propia membrana, que al unirse mediante simbiosis a la célula pre-eucariótica, adquiere una doble membrana. Espacios topológicamente equivalentes en la célula eucariótica Topológicamente equivalentes significa que pertenecen al mismo compartimiento y/o que están conectados entre sí. Núcleo - Citoplasma Retículo y Golgi - lisosomas- extracelular Movilización de proteínas entre compartimientos ♦ Transporte regulado a través de poros:

▪ Citoplasma ↔ núcleo ♦ Transporte transmembrana que usa translocadores proteicos:

▪ Citoplasma → mitocondria ▪ Citoplasma → retículo endoplasmático ▪ Citoplasma → peroxisomas

♦ Transporte Vesicular (sólo entre compartimientos topológicamente equivalentes) ▪ Retículo endoplasmático ↔ Golgi ▪ Golgi → lisosomas ▪ Golgi → superficie celular ▪ Golgi → vesículas de secreción

Los tres sistemas de transporte requieren de señales de clasificación para las proteínas a ser transportadas. Estas pueden ser secuencias señales, generalmente en el grupo amino terminal, o regiones señales, que requieren de la estructura terciaria de la proteína. Si la proteína no tiene ninguna señal de destino es una proteína citoplasmática. Transporte Citosol ↔ Núcleo El transporte citosol-núcleo se realiza a través de poros nucleares estructuralmente definidos, formados por nucleoporinas. Este transporte es altamente selectivo. Las moléculas pequeñas difunden pasivamente a través del poro nuclear. Las moléculas grandes requieren de un transporte activo, realizado por una GTPasa monomérica identificada como RAN. Transporte Citosol → Mitocondria Una molécula, para llegar a la matriz, debe atravesar dos membranas. Los translocadores mitocondriales permiten este paso.

▪ Complejo TOM: Translocador de la membrana externa ▪ Complejo TIM: Translocador de la membrana interna ▪ Complejo OXA: Translocador ubicado en la membrana interna, que transporta desde la matriz mitocondrial hacia el espacio intermembrana.

El transporte de proteínas a la mitocondria requiere de la aproximación de ambas membranas a la vez y es un proceso activo, por lo tanto, requiere energía proveniente de la hidrólisis de ATP. Transporte intermembrana de una proteína de residencia en matriz Cuando hay transporte intermembrana, las membranas se acercan. El complejo TOM se asocia al complejo TIM. La proteína entra denaturada, no con su conformación final. Una vez ingresada la proteína, se produce un corte de la secuencia señal por medio de una peptidasa. Internalización de una proteína a la mitocondria Este proceso requiere de hsp 70 citosólica y mitocondrial, de ATP extra e intramitocondrial y de una gradiente electroquímica de protones. Las hsp (heat shock proteins) son “chaperonas moleculares” que denaturan a las proteínas para que puedan pasar por el complejo TOM-TIM y ayudan a corregir proteínas malformadas. Importación de proteínas del citosol al espacio intermembrana o para inserción en la membrana interna mitocondrial El complejo OXA reconoce una segunda señal, y deja proteínas intercaladas en la membrana interna o ern el espacio intermembrana.

RECAMBIO Y DEGRADACIÓN DE LAS PROTEÍNAS Para que una proteína sea funcional, se requieren cambios estructurales.

▪ Plegamiento ▪ Unión a cofactores ▪ Glicosilación ▪ Fosforilación Modificaciones post-traduccionales, una vez liberadas del ribosoma (ya plegadas) ▪ Acetilación ▪ Metilación ▪ Unión a otras proteínas

Chaperonas Moleculares hsp Las principales chaperonas son las hsp 60 y las hsp 70. Están vigilando constantemente a la proteína. Son específicas para grupos de proteínas. - hsp70: corrigen estructuralmente proteínas mal plegadas o que en las modificaciones post-traduccionales adquirieron estrcutura incorrecta. Si hacen mal esta corrección, hay una segunda instancia de reparación. - hsp60: tiene sitios hidrofóbicos de unión de proteínas, donde la proteína con estructura incorrecta se une, y luego se corrige. Si falla la hsp60, se desarma la proteína. Si falla la segunda instancia de reparación (hsp60) la proteína es degradada en el proteasoma (complejo multiproteico). Para reconocer qué proteínas deben ser degradadas, éstas son marcadas con la proteína ubicuitina (ubicuitinizadas). A mayor cantidad de ubicuitina, más eficiente es el proceso de degradación. Si las proteínas alteradas no son destruidas, conducen a condiciones patológicas, puesto que se unen para formar agregados proteicos. Estructura del Proteasoma El proteasoma no degrada totalmente las proteínas a aminoácidos. Forma péptidos de diferente tamaño que pueden incorporarse a la membrana plasmática, constituyendo señales de destrucción celular (apoptosis). En algunos casos, estos pequeños péptidos pueden autoensamblarse y dar origen a agregados proteicos con estructura β resistente a proteólisis, responsables de patologías neurodegenerativas tales como: Creuzfeldt-jacob, Huntington, Alzheimer. CITOESQUELETO Los principales componentes estructurales del citoesqueleto son: - Microfilamentos (filamentos de Actina) - Microtúbulos Poseen inestabilidad dinámica (se arman y se desarman constantemente) - Filamentos intermedios ♦ Filamentos de Actina o Microfilamentos Los filamentos de actina determinan la estructura de:

- Microvellosidades - Estructuras motoras - Contactos Focales - Anillo Contráctil Mitótico - Corteza Celular - Filopodios y lamelipodios

En estado polimerizado, está unido a una molécula de ADP, cuando no está polimerizado está a unido a ATP. El extremo + del filamento de actina es el que más crece y el extremo - es por donde decrece. Las subunidades de actina están en recambio rotatorio (treadmilling) - 70% de los filamentos de actina están en nucleación (iniciando formación de polímero de actina) - 10% está en elongación - 20% está en estado estacionario (con igual velocidad de armado y desarmado) Proteínas accesorias en la polimerización del filamento de actina - Nucleación y formación de la red de actina por el complejo ARP (actin related protein), que frena el crecimiento del polímero, haciendo que se una a otros y forme el reticulado. - Profilina activa la polimerización uniéndose a un monómero de actina. - Timosina inhibe la polimerización - Cofilina disminuye el ángulo de giro del polímero de actina haciendo al polímero más grueso y ancho (estructura más rígida).

Estructuración de los Haces de Actina en la célula ▪ Haz contráctil: filamentos en sentidos contrarios, antiparalelos, unidos por α-actinina. ▪ Red semejante a un gel: filamentos en todos los sentidos, filamina entrecruza los filamentos. ▪ Haces paralelos muy juntos, unidos por fimbrina. (microvellosidades) Proteínas que entrecruzan filamentos de actina

▪ Espectrina (tetrámero) ▪ Fimbrina (monómero

▪ α-actinina (dímero) ▪ Filamina (dímero)

Gelsolina Proteína des-gelificante con actividad despolimerizante. Activada y regulada por el Calcio, produce la fragmentación de filamentos de actina, generándose una modificación gel ↔ sol. Esta modificación es necesaria cuando se movilizan organelos y cuando una célula emite prolongaciones. Participación de proteínas accesorias en la activación de las plaquetas Un influjo mediado por una señal activa a la gelsolina. Una señal más lenta mediada por IP3 inactiva la gelsolina. Se forman haces entrecruzados de los filamentos de actina y contracción de miosina. Las plaquetas activadas se extienden y se adhieren a los coágulos de sangre y se contraen. Contactos focales y fibras de estrés en fibroblastos en cultivo La célula no contacta con toda unasuperficie, sino que posee puntos de unión, resultando en un movimiento secuencial. Un contacto focal está formado por un haz de filamentos de actina en plano paralelo con proteínas accesorias que se contactan con proteínas transmembrana (integrinas), que a su vez, toman contacto con el medio extracelular. Esta estructura no es permanente. Microtúbulos Determinan la estructura de: - Cilios - Flagelos - Axonema - Huso mitótico - Centríolo y Centrosoma - Axon neuronal Están formados por 13 dímeros de tubulinas α y β, en forma de barril, dejando un centro vacío. Tienen inestabilidad dinámica. Mientras el GTP no se hidroliza, la estructura es muy estable. Cuando se hidroliza (GTP → GDP) es muy inestable y se produce la depolimerización. ▪ La estatmina inhibe la polimerización de las tubulinas, por lo que el microtúbulo se acorta. ▪ La polimerización de las tubulinas α y β es nucleada (iniciada) por una tubulina γ que no forma parte de los microtúbulos. Centrosoma Celular Las tubulinas γ se ubican en lugares de nucleación (complejos en forma de anillo de tubulina γ), desde donde crecen los microtúbulos. Centríolo El centríolo está formado por 9 tripletes de microtúbulos en disposición 13/11/11, formando un ángulo de 45º con la triada contigua. Un haz de microtúbulos es capaz de localizar el centro de la célula y formar un nuevo centro organizador de microtúbulos, sin necesidad de un núcleo. Organización de los haces de microtúbulos por las MAPs (microtubule associated proteins) y proteínas TAU Las proteínas MAP y TAU permiten que los microtúbulos se muevan. Se ubican en la superficie de los microtúbulos. Organización molecular del axonema que forma cilios y flagelos Está constituido por nueve dupletes, un túbulo con 13 subunidades de tubulina α y otro con 11 subunidades de tubulina β, más un par de microtúbulos centrales (estructura 9+ 2). En el centro hay dos microtúbulos completos (13 subunidades de tubulina cada uno). La unión entre los nueve dupletes está dada por brazos de dineína (proteínas motoras) y nexina. Hay una unión radial de los dupletes a los microtúbulos centrales.

Dineínas Son proteínas motoras, que al hidrolizar ATP pueden cambiar de posición en los microtúbulos. Las cabezas de dineína se mueven desde el extremo + hacia el extremo - de los microtúbulos, permitiendo el movimiento de un duplete con respecto al otro. Cada movimiento de una dineína requiere de la hidrólisis de un ATP, por lo que el gasto energético de la célula para mover un cilio o flagelo es muy alto. Las dineínas también actúan como transportadoras, permitiendo el movimiento retrógrado desde el terminal axónico hasta el soma neuronal. Quinesinas Son proteínas motoras. Hay distintos tipos de éstas, como quinesinas del citoplasma, quinesinas del huso mitótico (KRPs). En el axón, las quinesinas permiten el movimiento anterógrado, y también requieren de ATP. Drogas que afectan a los filamentos de actina y microtúbulos

FILAMENTOS INTERMEDIOS Estructuras de carácter más estable y permanente que microfilamentos y microtúbulos. No tienen inestabilidad dinámica. Aportan resistencia al interior de la célula. Los filamentos intermedios son cadenas polipeptídicas que se asocian entre si. Por ser porteínas, son resistentes a la tracción y a la presión. Existen diferentes tipos de filamentos intermedios

▪ Queratinas ácidas (tipo I) → epitelio ▪ Queratinas básicas (tipo II) → epitelio ▪ Vimentina (tipo III) → mesénquima ▪ Desmina (tipo III ) → músculo ▪ Proteína ácida fibrilar glial (tipo III) → células gliales y astrocitos ▪ Periferina (tipo III) → neuronas periféricas y centrales

Los filamentos intermedios tienen alta resistencia a la deformación: “efecto elástico”. En células nerviosas, podemos encontrar dos tipos de filamentos intermedios: - Neurofilamentos, con gran entrecruzamiento - Filamentos Gliales, con escaso entrecruzamiento. Epidermiólisis Bullosa Enfermedad genética en la cual la piel se desprende en colgajos, produciendo ampollas, inflamaciones e infecciones. Es provocada por un gen mutante de la queratina.