Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

El principio de la PCR comprende la amplificación de fragmentos deseados de ácido desoxiribonucleico (ADN), con el propósito de incrementar el ADN en estudio a niveles que puedan ser detectables. A lo largo de los estudios moleculares, la PCR ha ejercido un profundo efecto en el área diagnostica, cambiando la manera de interpretar la definición del concepto conocido como sensibilidad, permitiendo así detectar pequeñas cantidades de ADN o ARN con gran precisión; siendo de esta manera, la base fundamental en la biología molecular que incluyan estudios relacionados con material genético.

Componentes de la PCR

Enzima termoestable (Polimerasa); acelera el proceso de formación de la copia de ADN, dependiente del patrón original.

Par de secuencias sintéticas (oligonucleótidos ó “Primers”), que permitan crear el fragmento de ADN en estudio.

Deoxynucleotidos Trifosfatos (dNTPs), necesarios para proporcionar las bases nitrogenadas en la construcción del ADN.

Cationes Divalentes, cofactor importante para generar la reacción enzimática en el proceso de formación del ADN.

Solucion amortiguadora, permite mantener el equilibrio acido-base en la PCR.

ADN Molde en cadena sencilla o doble, proporciona las secuencias necesarias para amplificar la región especifica de interés.

Etapas de la PCR

1. Desnaturalización: La cadena de ADN es sometida a altas temperaturas (94 C), permitiendo obtener cadenas sencillas de ADN.

2. Alineación: Los componentes de la PCR son enfriados para permitir la unión de los oligonucleótidos sintéticos a las moléculas de cadena sencilla, en sus regiones específicas.

3. Elongación: El complejo formado de ADN cadena sencilla-Oligonucleótido sintético, es sometido a altas temperaturas (72 C) para crear la reacción de replicación, en conjunto con los demás factores: la polimerasa, dNTPs, cationes divalentes y la solución amortiguadora.

Tipos de PCR en Genolab

PCR Convencional: Amplifica la región de interés en el ADN molde, mediante secuencias sintéticas específicas.

PCR Tiempo Real: Detecta y mide las secuencias de ácidos nucleicos producidos. Dicho método requiere el uso de secuencias sintéticas “Primers”, similares a los empleados en la PCR convencional, su diferencia reside en la presencia de marcadores fluorescentes unidos a las secuencias sintéticas o mediante el empleo de métodos alternos basados en química fluorescente. Para ello, es necesario la presencia de un equipo (termociclador) que permita medir la intensidad de fluorescencia.

PCR Múltiple: Modificación de la PCR convencional y tiempo real, su principio comprende la amplificación de dos o mas moldes de ADN, diferentes entre sí, en una misma reacción.

PCR Transcripción Reversa: Su aplicación es usada para amplificar secuencias específicas de ácidos ribonucleicos (ARN), tales como ARN mensajero (ARNm) o ARN viral. El método empleado abarca la utilización de enzimas que permitan crear el ADN complementario mediante el proceso de transcripción reversa.

PCR Anidada: Consiste en una PCR convencional, con la diferencia de presentar una segunda ronda de amplificación, empleando pares de secuencias sintéticas diferentes a las usadas en la primera ronda.

Referencias:

Sambrook, J., Fritsch, E.F. & Maniatis, T. Molecular cloning. A laboratory manual, 2Edition. 1998 Cold Spring Harbor

Viljoen, G. Nel, L. Crowther, J. Molecular Diagnostic PCR Handbook. 2005 Springer.