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Utilidad de las técnicas deUtilidad de las técnicas de biología molecular en el g
diagnóstico microbiológico
Dr. Miguel Fajardo OlivaresServicio de Microbiología
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Métodos fenotípicos
Métodos moleculares
Métodos basados en proteómica
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Métodos molecularesMétodos moleculares
VentajasRapidez
InconvenientesExperienciap
EspecificidadImposibilidad del
pCoste económico “Dirigidas”Imposibilidad del
método fenotípicoT t i t ATB
DirigidasInfección??
Tratamiento ATB previo
Pruebas de sensibilidad
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Tipos de métodos molecularesTipos de métodos moleculares
ÁTécnicas que NO amplifican Ác. NucleicosHibridación de ADN o ARN
Técnicas que amplifican Ác. Nucleicos (PCR)PCR i lPCR convencionalPCR a tiempo real (q-PCR) } Multiplex
Nested PCRRT-PCR
5’3’ TaqID ID ID
λ λ λ
3’Taq
ID ID ID
ID ID
λ
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Técnicas de hibridaciónTécnicas de hibridación
ÚÚnicaMúltipleMúltiple
Diferentes microorganismosDif t lid d i i iDiferentes cualidades mismo microorganismo
Ventajas: mide cantidad de ADN muestraRequisito: cantidad mínima suficiente
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Técnicas de hibridaciónTécnicas de hibridación
Lectura mediante amplificación de la señalVisualInformática
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Reacción cadena de la polimerasaReacción cadena de la polimerasa
Procedimiento que permite realizar copias de un fragmento de ADN de forma rápidag pHa desaparecido la limitación de disponer de cantidad suficiente de ADN comode cantidad suficiente de ADN como material de partida X copiasp
x n veces
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Componentes de la PCRComponentes de la PCR
Molde de ADNDos sondas iniciadores o primersDos sondas, iniciadores o primersdNTPsTaq polimerasaTampón de reacciónTampón de reacciónMg2+, salesMaterial adecuado
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Etapas de la PCR Un cicloEtapas de la PCR Un ciclo
Desnaturalización del ADN
Hibridación de los iniciadores específicos al ADN de cadena sencillasencilla
Extensión enzimática del ADN
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Nº de copias tras la PCRN de copias tras la PCR
Amplificación exponencial
Nº ciclos
Nºamplicones
n ciclos = 2n moléculas
1 2
2 4
3 8
4 164 16
5 32
6 646 64
20 1.048.576
30 1.073.741.824
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¿Dónde se realizan las PCR?¿Dónde se realizan las PCR?
Termociclador
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Tiempo de duración de la PCRTiempo de duración de la PCR
Ti d tTipo de muestraTipo de microorganismo
Cantidad de C+GARN o ADN
Té i l dTécnica empleadaCapacidad del termocicladorC lid d d l tiCalidad de los reactivosCasa comercialNº de ciclo en el que amplifiqueN de ciclo en el que amplifique
Clase de PCR
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Clases de PCRClases de PCRPCR convencional / tiempo realPCR convencional / tiempo real
PCR múltiple “multiplex PCR”PCR anidada “nested PCR”PCR anidada nested PCRPCR retrotranscripción “RT-PCR”
cenc
iaFl
uore
sc
nº ciclo PCR
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Tiempo TOTAL de la PCRTiempo TOTAL de la PCR
2 horas
1-3 horas
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Nuestras hibridacionesNuestras hibridaciones
Toxina de Clostridium difficile
Detección de Staphylococcus aureus o St h l l tiStaphylococcus coagulasa negativos y gen mecA directo de hemocultivos
Detección de Gardnerella aginalisDetección de Gardnerella vaginalis, Trichomonas viginalis, Candida spp
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Toxina B de Clostridium difficileToxina B de Clostridium difficile
D t t > 50 i / ió t dBDetecta > 50 copias / reacción gen tcdBVPP = 98% VPN = 100%S stancias q e interfieren con la pr ebaSustancias que interfieren con la prueba
Pastas de Zn, óxido de ZnDetergentesDetergentes
Sustancias que No interfierenParafinaParafinaGeles y lubricantes rectalesDuphalacEspermicidas
Tox A+/Tox B- (Voth DE, et al. Clin Microbiol Rev 2005; 18:247-263)
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GDH Toxin A/B
Neg / Neg Pos / PosPos / Neg
HIBRIDACIÓNNEGATIVO POSITIVO
HIBRIDACIÓN DNA
NegNEGATIVO
PosPOSITIVONEGATIVO POSITIVO
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MRSA/SA BLOOD CULTUREMRSA/SA BLOOD CULTURE
Test cualitativo: SA, SCoN, gen mecADetectar > 20 copias / reacciónDetectar > 20 copias / reacciónVPP = 96% VPN 99%Muestra:
HemocultivoHemocultivoLíquidos orgánicos en hemocultivoOt lí id á i i i lOtros líquidos orgánicos: sinovial
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•Antecedentesbacteriemia S aureus48 h 3 hbacteriemia S. aureus•Servicios de riesgo
48 horas 3 horas
Siembra en l d
MRSA/SABLOOD CULTUREplacas de agar BLOOD CULTURE
IdentificaciónAntibiograma
Género+especieR o S a meticilinAntibiograma R o S a meticilin
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Nuestras PCRNuestras PCR
VIH, VHB, VHCVIH, VHB, VHC
CMV, VEB, BK, JC, VHs, Bordetella spp
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Nuestras PCRNuestras PCR
Pseudomonas, Acinetobacter, Staphylococcus y gen mecA
Influenza A y B, Mycobacterium complex, SARM nasal, EnterovirusSARM nasal, Enterovirus
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PCR para Acinetobacter, Pseudomonas y Staphylococcus con mecA
PCR ti lPCR a tiempo realSondas marcadas con fluoróforosSensibilidadSensibilidad:
P. aeruginosas > 100 copias/µL, gen hcpCA baumannii > 10 copias/µL gen dnaAA. baumannii > 10 copias/µL, gen dnaAS. aureus > 10 copias/µL, gen NUCGen mecA > 1000 copias/µL
Muestra: aspirado traqueobronquialTransporte inmediato o congelar a -20ºCReactivos almacenados a -20ºCPurificar el DNA de la muestra
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PCR para Acinetobacter, Pseudomonas y Staphylococcus con mecA: resultados
Antes del ciclo 30 no amplificaTiempo mínimo estimado = 3 5 horasTiempo mínimo estimado 3.5 horas
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PCR para Acinetobacter, Pseudomonas y Staphylococcus con mecA
Indicada:Paciente nuevo sin pruebas previasp pPaciente no colonizado
No está indicada:No está indicada:Resultados previos positivosColonización/infección conocidaDemasiado tarde para empezar la técnicap pCultivos convencionales son positivos
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PCR tiempo real para CMV (BK y EB)PCR tiempo real para CMV (BK y EB)
70% población es seropositivaRegión altamente conservada gen UL83Región altamente conservada gen UL83Muestra
Sangre total SIN heparina o plasma
Cuantitativa: 713-4x108 copias / mLCuantitativa: 713 4x10 copias / mL=método de extracción, transporte y manipulac=técnica=técnica=muestra
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PCR tiempo real Bordetella sppPCR tiempo real Bordetella spp
Di ó ti lit tiDiagnóstivo cualitativoBordetella pertussisBordetella parapertussis
Muestra: frotis nasofaringeoMuestra: frotis nasofaringeoTransporte
Torundas con medio de AmiesTorundas con medio de AmiesMedio líquido para virus
C ió tConservación muestraHasta 48 h a 4ºC
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PCR Bordetella (Focus)
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PCR tiempo real MTB/RIFPCR tiempo real MTB/RIF
Detecta ADN complejo M. tuberculosisMutaciones del gen rpoB: rifampicina RMutaciones del gen rpoB: rifampicina RMuestra
Tracto respiratorio inferior
Muestras No validadas casa comercialMuestras No validadas casa comercialRespiratorias en pacientes diagto/tratOtras muestrasOtras muestras
Tiempo del ensayo = 2.5 horas
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RT PCR EnterovirusRT-PCR Enterovirus
D t ió lit ti d ARN LCRDetección cualitativa de ARN en LCRDetecta
PoliovirusPoliovirusCoxackievirusEchovirusEnterovirus
NO detecta: Herpes, Arbovirus, Paperas…Muestra
Refrigerar hasta 72 horasC l 20ºCCongelar a -20ºCNo se puede centrifugar
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PCR virus de la gripePCR virus de la gripe
RT-PCR a tiempo realDetección cualitativaDetección cualitativa
Gripe AG i BGripe BGripe 2009 H1N1
MuestraLavados/aspirados nasofaringeosLavados/aspirados nasofaringeosExudados nasofaringeos
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Nuevas PCR
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PCR RT: GeneXpertPCR-RT: GeneXpert
Extracción de DNA o RNA + amplificaciónTiempo de preparación < 2 minutosTiempo de preparación < 2 minutosTiempo de la prueba: 30-45 minutos Neumonías atípicas
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PCR RT: GeneXpertPCR-RT: GeneXpert
E t ió d DNA RNA lifi ióExtracción de DNA o RNA + amplificaciónTiempo de preparación < 2 minutosp p pTiempo de la prueba: 30 minutos Virus respiratorioVirus respiratorio
Adenovirus BocavirusE t i VRSEnterovirus VRSParainfluenza RinovirusInfluenza A y B CoronavirusMetaneumovirus
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ETSDiferentes casas comerciales
Neisseria gonorrhoeaeNeisseria gonorrhoeaeChlamydia trachomatisMycoplasma genitaliumMycoplasma hominisUreaplasma urealyticum
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Espectrometría de masas: Maldi-tofEspectrometría de masas: Maldi tofMatrix Assisted Laser Desorption Ionization-time of fligth
Fundamento de la técnicaIdentificar moléculas termolábiles (proteínas) a partir de un compuesto desconocido mediante ionización
E t ó tEspectrómetroFuente de ionizaciónAnalizador de masasDetector de iones
ResultadoGráfico de proteínas
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Visión esquemática del procesoVisión esquemática del proceso
Fuente Láser
ColumnaAceleración
Muestra + Matriz sobre la tarjeta + + +
+ + +
DetectorElectrodos
Tiempo de vueloIntensidad
m/z Modified from: Lottspeich, Zorbas, eds“Bioanalytik”, Spektrum Akademischer Verlag, 1998
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MALDI-TOF DE BIOMERIEUXMALDI TOF DE BIOMERIEUX
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Aplicación del MALDI Biotyper en Microbiología ClínicaBacterias gram+ y gram-, levaduras y mohos
1000
2000
3000
A. fumigatus
0
4000
6000
8000
B. subtilis
0
2000
csgsghudjsahfadj0.8
1.0
C albicans
0.0
0.2
0.4
0.6
Escherichia coli2500
C. albicans
500
1000
1500
2000
E. coli
03000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000
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Identificación directa desde el hemocultivo
Tasa de identificación del 78%
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ConclusionesConclusiones
1. Las técnicas de biología molecular tienen ventajas e inconvenientes, y por lo tanto: indicaciones
2. No sustituyen, en muchos casos, a las técnicas convencionales
3. Son mas rápidas que las técnicas convencionales, pero no instantáneaspero no instantáneas
4. Son más laboriosas y costosas5 Permiten diagnosticar mayor número de gérmenes5. Permiten diagnosticar mayor número de gérmenes6. Existen otras técnicas igual de eficaces
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“No hay mayor mentira que la verdad mal entendida”
Willi J f d d d lWilliam James, fundador de la psicología funcional, 1880