Producción de Glucoamilasa por Aspergillus niger

Katherine L. Suárez Herencia

Introducción• El desarrollo de tecnologías emergentes implica el reto permanente de

utilizar nuevas herramientas de gestión tecnológica. La ingeniería de enzimas y su respectiva tecnología en el contexto de la biotecnología, es una de las áreas del conocimiento sobre las cuales reiterativamente se plantean grandes expectativas como posible generador de ventaja competitiva en economías emergentes. En este sentido, la importancia de producir glucoamilasa a partir de Aspergillus sp. mediante aplicaciones biotecnológicas está dirigida esencialmente al área de alimentos.

Enzimas• Las enzimas son proteínas que actúan como catalizadores de las

diferentes reacciones bioquímicas que constituyen el metabolismo de los seres vivos. Para que se produzca una determinada reacción, es necesaria la presencia de una determinada enzima, y la mayor o menor cantidad de ésta suele modificar la velocidad de la reacción controlada.

Amilasas• Las amilasas son enzimas que catalizan las reacciones hidrolíticas del

almidón, dando origen a diversos productos que posees una gran relevancia para algunas operaciones y procesos industriales. Las amilasas son comúnmente halladas en animales y plantas; sin embargo, para fines industriales las más utilizadas son aquellas de origen bacteriano o fúngico.

Tipos de alfa-amilasas• Amilasa de origen fúngico. Se producen por fermentación de una cepa del hongo

Aspergillus niger, y es la más utilizada en la fabricación del pan, como alternativa a la harina de malta. Ello es debido al hecho, entre otros, de que la alfa-amilasa fúngica tiene una mayor tolerancia a la sobredosificación que la de origen cereal, lo que se basa en su desactivación durante la primera fase de la cocción (60-65°C), por lo que no existe el riesgo de que se produzca exceso de dextrinas, lo cual produciría migas pegajosas.La actividad de las alfa-amilasas de origen fúngico comerciales se mide en dos unidades:– FAU (Unidad Fungal Amilasa o Fungal Amylase Unit), que es la cantidad que dextrinizará una solución estándar de almidón a una velocidad de 1 g/hora a 40°C.– SKB que mide la capacidad de la enzima para degradar una solución de almidón puro, a un pH de 4,5, durante 60 minutos a 30°C.La relación entre las FAU y las SKB, es que 1.000 FAU/g aproximadamente equivalen a 10.000 SKB/g.Las amilasas de origen fúngico utilizadas en la panadería tienen una actividad variada que va desde baja actividad 2.500 SKB/g hasta alta actividad 50.000 SKB/g.

Tipos de alfa-amilasas• La alfa-amilasa Bacteriana. Se produce a partir de la bacteria

Bacillus subtilis, y es muy resistente al calor por lo que a temperaturas de 70 a 90°C alcanza su máxima velocidad de reacción. El efecto secundario típico de la amilasa bacteriana es una disminución de la viscosidad del engrudo del almidón.

• La alfa-amilasa de origen cereal (harina de malta). Su elaboración consiste en la germinación del trigo para que se movilicen las alfa-amilasas naturales del grano. Estas amilasas se inactivan a 75°C.

• La Amiloglucosidasa. También denominada Glucoamilasa se obtiene del hongo Aspergillus niger, y actúa sobre las dextrinas produciendo glucosa, lo que se traduce en una aceleración de la fermentación.

Glucoamilasa• La glucoamilasa es un enzima extracelular producida por diversas especies de

Aspergillus.

• La Glucoamilasa también reconocida como amiloglucosidasa es una exohidrolasa que en la nomenclatura internacional está identificada como E.C.3.2.1.3., y su nombre sistemático es 1,4-alfa-D-glucano glucohidrolasa. Es una enzima que tiene como función actuar en la reacción de hidrólisis en cadenas de polisacáridos operando en los enlaces 1,4-alfa-D-glucosa separando unidades de glucosa a partir del extremo no reductor de la cadena.

• Los enlaces ramificados α-1-4 también se hidrolizan, pero mucho más lentamente, formándose un jarabe de glucosa, un contenido de glucosa del 95 al 97 % en peso y de un 30 a un 5 % de oligosacáridos grandes. Debido a esto se le define como una enzima desramificadora. La enzima es capaz de hidrolizar también, aunque lentamente, los enlaces a-1-3. La glucosa formada se utiliza como jarabe o se cristaliza para obtener glucosa pura sólida.

Glucoamilasa• El principal producto final de la acción de la glucoamilasa sobre el almidón

es glucosa, lo que la diferencia claramente de las alfa y beta amilasas. • Las glucoamilasas son inactivas sobre almidón nativo. Su actividad es

máxima entre pH 4 y 5.5, y temperatura alrededor de 55-65°C. La rata de reacción cae rápidamente a medida que disminuye el tamaño de la molécula de sustrato, siendo máxima sobre almidones previamente sometidos a licuefacción.

• La amiloglucosidasa se usa a gran escala en la industria de procesado del almidón en tanques discontinuos a 55-60 °C y pH de 4,5 y con períodos de incubación de 48-92 horas, para transformar las dextrinas formadas por la a-amilasa en glucosa.

• La Glucoamilasa se encuentra en el mercado tanto en forma sólida como líquida (líquido color marrón claro).

Usos de la Glucoamilasa• Fabricación de alcohol (biocombustibles). • Fabricación de azúcar de almidón.• Elaboración de la cerveza y fabricación de vinagre (la levadura de la

substitución con la enzima puede mejorar la producción).• Fabricación de jarabes de glucosa.• Fabricación de polvos gastrónomos, de antibióticos, de ácido cítrico, etc.• Fabricación de jugos de fruta (hidroliza el almidón, evitando que se

produzca turbidez después de la concentración).• Como reactivo para la determinación de almidones en alimentos.

Aspergillus niger• En 1729 el Aspergillus fue catalogado por primera vez por el biólogo

italiano Pier Antonio Micheli, que usó el nombre "Aspergillum" por parecerse el hongo al instrumento usado para dispersar agua bendita.

Aspergillus niger• Aspergillus niger es un hongo que produce un moho negro en

vegetales -muy común en la lechuga, el tomate o la acelga-. Es una de las especies más corrientes del género Aspergillus. Puede existir en dos formas básicas: levaduras e hifas.

• El Aspergillus niger se cultiva para producir varios productos químicos como: ácido cítrico (E330), ácido glucónico (E574), y enzimas como: glucoamilasa, galactosidasa, etc.

Clasificación Científica

Dominio: Eukaryota Reino: Fungi Filo: Ascomycota Subfilo: Pezizomycotina Clase: Eurotiomycetes Orden: Eurotiales Familia: Trichocomaceae Género: Aspergillus Especie: Aspergillus niger

Producción y Caracterización de Amiloglucosidasa extracelular de Aspergillus niger CA-19 mediante

Fermentación en Estado Sólido (SSF)

• Este estudio fue realizado con el propósito de producir la enzima amiloglucosidasa a partir de A. niger usando el método de Fermentación en Estado Sólido (SSF - Solid-State Fermentation) y encontrar una caracterización preliminar de la enzima producida.

• A. niger fue aislado en un medio de agar almidón con azul brillante de Remazol y fue usado como sustrato del proceso de fermentación para la producción enzimática el salvado de arroz suplementado con harina de soya.

• El crudo de la enzima extraída tuvo una temperatura y pH óptimos a 60°C y pH 4 respectivamente. Con excepción del almidón de cocoñame, la preparación enzimática fue capaz de hidrolizar el almidón del maíz y el almidón de otras raíces como el camote, yuca, etc. La hidrólisis fue directamente proporcional a la cantidad de almidón de la fuente.

Detección y Aislamiento de la cepa amilolítica de Aspergillus niger

• La cepa amilolítica de A. niger fue aislada de muestras de suelos tomadas en diferentes áreas de la UNAAB (University of Agriculture Abeokua, Nigeria) usando un medio de agar almidón con azul brillante de Remazol. La producción de una amilasa fue detectada por la desaparición del color azul del medio alrededor de los lugares de inoculación de las colonias, que fue calculada restando al radio de la zona aclarada el radio de la colonia.

• Las colonias de A. niger que produjeron grandes zonas de aclaramiento fueron tomadas y purificadas sembrándolas en estrías en un agar de extracto de malta. La identificación de este aislamiento se basó en las características morfológicas de las colonias y de las células con referentes en el método de Rasper y Fennel (1965).

Producción de Amiloglucosidasa por Fermentación en Estado Sólido

• La fermentación fue realizada en matraces Erlenmeyer de 250ml. El medio estaba constituido de salvado de arroz (10g) y harina de soya (3g) humedecido al 55%, esta humedad fue dada con una solución acuosa de sales minerales [MgSO4.7H20, 0.1%: KH2PO4, 0.1%; CaCl2, 0.1%; FeSO4, 0.05% y (NH4)2SO4, 0.1%]. La esterilización se hizo a 121°C durante 15 minutos. Después de enfriar los matraces, fueron inoculados con 1ml de suspensión conidial de A. niger CA-19 (2x106 esporas/100ml) y fue incubado a 30°C durante 72h.

• La extracción de la enzima del salvado enmohecido se hizo: Para 1g de salvado enmohecido, fueron agregados 10ml de buffer citrato 0.01M (pH4.5) y la mezcla fue removida en un agitador orbital (LAB-LINE, UK) a 150 rpm, durante 1 h a 28°C. El filtrado fue realizado a partir del caldo obtenido de la fermentación.

Prueba de Amiloglucosidasa

• La actividad de la Amiloglucosidasa fue probada a 60°C durante 1h usando almidón de maíz al 1% (p/v) en buffer citrato 0.1M (pH4.5). Los azúcares reductores fueron calculados por el método del DNS (ácido 3,5-dinitrosalicílico).

• Una unidad de actividad de amilasa (FAU) fue definida como la cantidad de enzima que liberó 0.1 umol de D-glucosa de almidón en 1.0uL de la mezcla reactiva.

Caracterización de Glucoamilasa

• Efecto de la Temperatura: Para establecer la temperatura óptima de actividad de la amiloglucosidasa, la enzima fue incubada con almidón soluble en un buffer de acetato 0.1M, en donde las temperaturas de reacción fluctuaron entre 20 y 90°C.

• Efecto del pH: La actividad de la amiloglucosidasa fue medida en varios rangos de pH que fueron de 4 a 10. El pH de reacción de la mezcla fue variando conforme se usaban diferentes buffers (buffer citrato para pH=3-6, buffer fosfato para pH=7-8 y buffer borato para pH=9-10)

• Estabilidad de la Enzima: La solución enzimática se mantuvo a una temperatura ambiente por 34 días. A diferentes intervalos de tiempo, se tomaron alícuotas de solución estándar de amilasa para analizar su actividad.

Caracterización de Glucoamilasa

• Digestión de Almidones Primarios: La capacidad del crudo de la enzima para hidrolizar almidones primarios fue estudiado usando almidones de maíz, yuca, camote, ñame y cocoñame. La solución comercial de almidón fue utilizada como estándar. La solución enzimática (1mL; buffer acetato fosfato (pH 4.5, 1 mL)) y 3mL de cada solución de crudo de almidón fue incubada a 60°C durante 1h. La capacidad de los crudos de almidón para hidrolizarse fue calculada de acuerdo a la cantidad de azúcares reductores (mg g-1) producidos.

• Cromatografía en Capa Fina: Los azúcares producidos por la hidrólisis del crudo de almidón con amiloglucosidasa de A. niger CA-19 fueron identificados mediante Cromatografía en Capa Fina (TLC) usando como fase móvil n-butanol : ácido acético : dietil éter : agua (9:6:3:1). Los azúcares reductores fueron revelados con un spray de hidrocloruro de p-anisidina.

Discusión y Resultados

• Es necesario el aislamiento y la selección de los organismos adecuados para la producción de amilasa.

• El resultado de este estudio mostró que la capacidad de aislar microorganismos productores de amiloglucosidasa, como el Aspergillus niger, constituyen la mayor fuente de producción de tipo comercial para enzimas usando la técnica de Fermentación en Estado Sólido.

• En la Fermentación en Estado Sólido, la selección de un adecuado sustrato sólido es un punto crítico que involucra la detección de un gran número de materiales agro-industriales para el crecimiento microbiano y la formación de sus productos. Dado que el salvado de arroz es un producto barato y de fácil disponibilidad, su uso como sustrato para la producción de enzimas lo hace ideal para la producción a gran escala de amilasa por fermentación en estado sólido.

Caracterización de Glucoamilasa

• Los estudios preliminares para caracterizar la enzima por sus actividades enzimáticas mostraron que la amiloglucosidasa producida por Aspergillus niger CA-19 fue óptimamente activa a 60°C. La actividad de la enzima decayó drásticamente a temperaturas mayores a 60°C y se paralizó totalmente a los 90°C.

Caracterización de Glucoamilasa

• El resultado mostró que la actividad de la enzima fue óptima cuando el ensayo se llevó a un pH 4.0. Al superar el pH 4, se observó un continuo decaimiento en la actividad de la enzima.

Hidrólisis del Almidón Crudo

• La capacidad de los gránulos de almidón de ser digeridos por la enzima, depende de la fuente de almidón y de la cantidad de enzima con la que se traten.

Cromatografía en Capa Fina

• Los productos finales determinados mediante la cromatografía en capa fina en óptimas condiciones (pH 4.0 a 60°C) mostraron que la glucosa fue el único producto obtenido después de 10, 20, 40 y 60 minutos de hidrólisis, indicando que el patrón de comportamiento de la enzima fue completamente el de la amiloglucosidasa. Este comportamiento resulta en una gran ventaja para la producción industrial de jarabe de glucosa. Así es como, este estudio de producción de amiloglucosidasa por A. niger CA-19 nos arroja resultados bastante promisorios.

Conclusiones

• Este estudio confirmó que Aspergillus niger es un excelente productor extracelular de amiloglucosidasa. Dado el hecho de que este microorganismo se encuentra en la lista de microorganismos generalmente reconocidos como seguros (GRAS - Generally Recognized As Safe) para elaboración de alimentos, cervezas y aplicaciones farmacéuticas, se hace necesaria ahondar las investigaciones para optimizar el proceso fermentativo para así obtener mayores cantidades de producción de amiloglucosidasa por esta cepa.

Referencias

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