Procedimientos muestras IHQ
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Procesamiento de muestras para
estudio inmunohistoquímic
o cromogénicoSantiago Sepúlveda
Jorge Gatica
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Objetivos Conservar la inmunorreactividad de
células y tejidos Conservar la localización antigénica. No provocar interferencia con los
procedimientos inmunohistoquímica (IHQ)
Preservar la morfología del tejido
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Tipos de muestras para estudio IHQ
CÉLULAS DE CULTIVO CÉLULAS EN SUSPENSIÓN FROTIS CITOLÓGICOS FROTIS SANGUÍNEOS CORTES EN CRIÓSTATO CORTES EN PARAFINA CORTES ULTRAMICRÓTOMO
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Procesamiento de muestras incluidas en parafina para IHQ cromogénica
ETAPAS A CONSIDERAR: FIJACIÓN IMPREGNACIÓN / INCLUSIÓN CORTE Y MONTAJE RECUPERACION DE INMUNOREACTIVIDAD BLOQUEO DE PEROXIDASA ENDOGENA Y
REACTIVIDAD INESPECIFICA INCUBACION CON ANTICUERPOS Y SISTEMA
DE DETECCIÓN
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Fijación Detener los procesos de autólisis.
Especialmente la acción de proteasas y nucleasas
Conservar la cito-histoarquitectura de la muestra similar a su estado “in vivo”.
Preparar al tejido para los procedimientos posteriores
Anti-microbiano
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Fijación con formaldehido Fijador más utilizado Formalina neutra
10% pH 7,0 La fijación involucra una interacción con
proteínas, específicamente con aminoácidos básicos, con formación de puentes metilénicos.
Provoca enmascaramiento de antígenos (Ag.), perjudicando la inmunotinción.
Requiere de recuperación antigénica.
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Aclaramiento e impregnación en parafina
Agente “aclarante” en buen estado Temperatura de las parafinas de
impregnación entre 56 -62°C. Tiempo de impregnación entre 30 –45
minutos en cada parafina.
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Corte y montaje. Grosor recomendado:4 –5 µm. Montaje en portaobjetos previamente
silanizados. Evitar cortes con melladuras,
irregularidades, gruesos o desgarrados.
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Recuperación de inmunoreactividad
El formaldehido y otros reactivos forman enlaces cruzados intra e inter-proteicos que enmascaran a los epítopos originando falsos negativos.
Los métodos de recuperación están designados para romper lo enlaces cruzados, desenmascarando los epítopos y aumentando la intensidad de las inmunotinciones.
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Recuperación antigénica mediante calor (HIER)
El más utilizado Incubación de placas en buffer (citrato
pH 6,0 o EDTA pH 8,0) Llevar a temperatura de 90°C aprox.
con fuente de calor (sea vaporera, olla a presión o microondas) por un tiempo aprox. de 25 min.
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Bloqueo de peroxidasa endógena y de reactividad inespecífica
Necesarios para resultados óptimos en IHQ cromogénica. Evitan falsos positivos.
Bloqueo de peroxidasa endógena 3% H₂O₂
NECESARIA SI SE USA HRP COMO ENZIMA EN LA REACCIÓN CROMOGÉNICA. Bloqueo de reactividad inespecífica
PBS/BSA al 2,5%.
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Incubación con Ac. primario Anticuerpo (Ac.) especifico para el
antígeno a estudiar. Debe ser compatible con el sistema de
detección a utilizar posteriormente. En ocasiones, puede tener conjugado el
sistema de detección.
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Demostración de reacción Ag-Ac mediante uso de enzimas
La enzima está activa Va conjugada al componente del
penúltimo paso de la inmunotinción La actividad de la enzima se revela
mediante un sustrato y un cromógeno.
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Incubación con anticuerpo secundario
Reconoce al anticuerpo primario Suele estar conjugado con biotina, con
el sistema de detección o utilizarse como puente.
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Sistema de amplificación Amplifica la señal de la reacción ag.-ac.
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Algunos ejemplos…
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Pleural based thymoma - Cytokeratin AE1/AE3 immunostain - Case 282, by Yale Rosen bajo la licencia CC BY-SA. Parámetros de contraste y brillo modificados del original.
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Lymphangioleiomyomatosis (LAM) - HMB45 immunostain - Case 261,by Yael Rosen, bajo la licencia CC BY-SA 4.0. Parámetros de brillo, contraste y saturación modificados del original.