4. Procesamiento de Las Muestras Para Ihq
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PROCESAMIENTO DE MUESTRAS PARA
ESTUDIO INMUNOHISTOQUIMICO
Prof. T.M. Laura Ochoa M.
Objetivos.
• Conservar la inmunoreactividad de células y tejidos.
• Conservar la estructura secundaria y terciaria de las proteínas.
• Conservar la localización de los antígenos.
• Preservar la morfología.
• No provocar interferencia con los inmunoreactivos.
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La unión del antígeno (Ag) con el anticuerpo (Ac) se deben a la formación de múltiples enlaces no covalentes (enlaces H, interacciones electrostáticas, de Van der Waals e
hidrófobas)Se establecen múltiples interacciones
Determinantes antigénicos.
• Corresponde al área específica dentro del antígenos que se une al paratopo.
• Pueden ser LINEALES en cuyo caso su formación esta dada por una secuencia aminoacídica o CONFORMACIONALESdada por la estructura secundaria o terciaria de la proteína.
DETERMINANTES ANTIGÉNICOS
Tipos de Muestras para estudioIHQ.
• Células de cultivo.
• Células en suspensión.
• Frotis citológicos
• Frotis sanguíneos.
• Cortes de criostato.
• Cortes en parafina
• Cortes de ultramicrótomo.
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Procesamiento de los líquidos.
• Procesar inmediatamente
• Centrifugar durante 5 minutos a 2.500 rpm
• Con el pellet confeccionar varios frotis ( 3-5), secar parcialmente
• Fijadores: etanol 95°, acetona al 80% en PBS mas formalina 1%, Cytospray.
• Lavar en PBS
• ICQ
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CITOLOGÍAS
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Frotis previamente teñidos.
• Marcar con lápiz diamante al dorso del portaobjeto las zonas sospechosas de mejor celularidad.
• Despegar el cubreobjeto.
• Retirar todo el medio de montaje en xilol
• Decolorar con alcohol ácido
• Hidratar hasta el agua destilada
• ICQ
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Cortes por congelación.
• Transporte al laboratorio
– Suero fisiológico (transporte inmediato)
– Hielo / Medio de transporte (horas)
– Congelado en tanque de nitrógeno líquido (días)
• Mejor preservación antigénicas que cortes en parafina.
• Morfología deficiente.
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Cortes por congelación.
• Congelación: debe ser realizada rápidamente para evitar la formación de cristales de hielo.
• Fijación: Cualquier fijador. Acetona: buena conservación de antígenos de membrana.
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Cortes en Criostato.
• CORTE
– De 6 – 10 micrones o lo más delgado que sea posible
– Montaje sobre portaobjetos pretratados.
– Evitar melladuras e irregularidades.
– Fijar en acetona fría por 15 minutos y secar.
• IHQ ó guardar cortes congelados a -70°C
Cortes por congelación.
VENTAJAS
• Excelente conservación de reactividad antigénica.
DESVENTAJAS
• Morfología deficiente
• Difícil almacenamiento de tejidos y de inmunotinciones
• Dificultades con enzimas endógenas
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Procesamiento de cortes en parafina para IHQ.
• FIJACIÓN
• IMPREGNACIÓN / INCLUSIÓN
• CORTE Y MONTAJE
ETAPAS A CONSIDERAR
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Objetivos de la fijación.
• Detener los procesos de autólisis. Especialmente la acción de proteasas y nucleasas
• Conservar la cito-histoarquitectura de la muestra similar a su estado “in vivo”.
• Preparar al tejido para los procedimientos posteriores
• Anti-microbiano
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Obtención de la muestra.
• Muestras frescas deben ser cortadas en
un tamaño aproximado de 2cm2 x 4 mm
de grosor.
• Fijadas a la brevedad
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Fijador ideal para IHQ.
• No induzca cambios conformacionales en el antígeno (epitopo)
• No enmascare determinantes antigénicos
• No provoque difusión, extracción o desplazamiento de antígenos.
• Permita la penetración de los inmunoreactivos
• Buena morfología
• Baja toxicidad, estabilidad en su almacenamiento, barato.
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Fijación con Formaldehido.
• Más popular de los fijadores
• Es un gas y su presentación comercial es en solución acuosa 37 - 40%
• La fijación involucra una interacción con proteínas, específicamente con aminoácidos básicos, con formación de puentes metilénicos.
• En algunos casos se produce un fenómeno de “enmascaramiento” progresivo de epitopos.
• Frecuentemente requiere el uso técnicas de recuperación de inmunoreactividad.
FORMALDEHÍDO HIDRATO DE METILENO
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FORMALDEHÍDO
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Especies presentes en el
Formaldehido.
• Rompimiento de polímeros a unidades de
hidrato de metileno.
• Proceso dura un par de días si se prepara
en agua. Y es instantáneo cuando se
prepara en buffer a pH fisiológico.
Componentes de la solución de
formaldehido.
• METANOL 10% :
Disminuye la velocidad de la
polimerización del hidrato de metileno.
Promueve la precipitación del para
formaldehído.
En la reacción entre dos moléculas de
formaldehído, una se reduce a metanol y
la otra se oxida a ácido fórmico.
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FORMALINA al 4%
COMPONENTES DEL FORMALDEHIDO EN SOLUCIÓN (FORMALINA)
• Hidrato de metileno Compuesto activo
• Metanol 1%
• Ácido fórmico Compuestos
• Paraformaldehído no deseados
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FORMALINA
Equilibrio de la solución
Tiempo/ pH
Compuesto Compuestos
activo no deseados
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FIJACIÓN CON FORMALDEHIDOPenetración
Hidrato de Reacción
Metileno con grupos
NH2
Formación de
Puentes Reacción
metilénicos entre NH2
metilados
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PROTEÍNA NATIVA
EPITOPOS
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PROTEINA FIJADA CON
FORMALDEHIDO
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Fijación con Formaldehido.• Solución de fijación: Se debe utilizar en
sus condiciones mas estables
– Neutralizada con carbonato de calcio
– Tamponada en PBS pH 7,2 – 7,4
• Tiempo de fijación
– Desde que la muestra es extraída hasta que es fijada.
– Muestra en el fijador.
• Ojo con los congelamientos previos.
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Condiciones de fijación con Formaldehido
• Temperatura / Tiempo de fijación:
– T. A. 6 – 24 hrs
– 4° C 24 – 72 hrs
• Tamaño de la muestra:
– 10 x 10 x 4 mm
• Volumen de fijador:
– 20 – 30 veces el volumen de la muestra
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Fijación con Formaldehido.
EN MUESTRAS FIJADAS EN FORMALDEHIDO EN
CONDICIONES ÓPTIMAS SE PUEDEN OBTENER EXCELENTES
RESULTADOS DE INMUNOTINCIÓN PARA LA
MAYORÍA DE LOS ANTÍGENOS
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Fijación con Ac. Pícrico.
• Fijador de tipo coagulante, poco
penetrante.
• Se emplea en mezclas fijadoras. La más
usada es la mezcla de Bouin.
• Provee buena morfología.
• Su uso se recomienda para estudio de
inmunoglobulinas, filamentos intermedio y
hormonas.
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Fijación con Bicloruro de Mercurio.
• Poco penetrante. Se emplea en mezclas fijadoras: ZENKER; FORMOL SUBLIMADO; B5, etc.
• Aditivo y coagulante
• Excelente morfología
• B5 recomendado especialmente para la fijación de ganglios linfáticos.
• Buena conservación de antígenos intracitoplasmático, pero no de membrana.
• Provee al tejido buena permeabilidad para los inmunoreactivos.
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Fijación con etanol.
• Poco penetrante
• Fijador coagulante
• Buena penetración de inmunoreactivos
• Puede inducir a cambios conformacionales
• Endurece los tejidos
• Morfología regular
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FIJACIÓN CON ACETONA
• Poco penetrante
• Fijador coagulante
• Principalmente indicado para
frotis sanguíneos y cortes en
congelación.
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Deshidratación, aclaramiento e
impregnación. • Agente aclarante en
buen estado
(sin agua)
• Temperatura de las
parafinas de
impregnación entre
56 - 62° C.
• Tiempo de
impregnación entre
30 – 45 minutos en
cada parafina.Prof. T.M. Laura Ochoa M.
PROCESADOR
DE TEJIDOS
AL VACIO
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Corte y Montaje.
• Grosor recomendado:4 –5
• Montaje en portaobjetos o cubreobjetos
• Evitar cortes con melladuras, irregularidades, gruesos o desgarrados
• Evitar tocar el agua del baño con las manos con crema
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Corte y Montaje
• Medios adhesivos:
– ALBUMINA DE MAYER
– COLA FRÍA 1%
– POLI-L-LISINA ACUOSA
– 3,AMINOPROPYLTRIETHOXI-SYLANE.
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Corte y Montaje.
• Realizar los cortes la misma semana que
se realizará técnica IHQ.
• Mantener guardados en oscuridad y en
refrigerador. Libres del polvo.
• Mantener bloques de parafina
almacenados en lugares frescos.
• La limpieza de los portaobjetos previa a la
silanización, deber ser sin detergentes.
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Montaje.
• Medios hidrófobos.
• Medios hidrófilos.
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Desparafinación e Hidratación.
• Asegurar remover
total de la parafina,
con agentes de
desparafinación de
buena calidad.
• Cambiar con
regularidad los
reactivos
• Hidratación gradual.
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LA ELECCIÓN DEL MÉTODO DE
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA DEPENDE DEL
PROPÓSITO DEL ESTUDIO
INMUNOHISTOQUÍMICO.
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