Procedimientos en Microbiología Clínica

Recomendaciones de la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica

Editores: Emilia Cercenado y Rafael Cantón

27.

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Coordinador: José Ramón Blanco

Autores: Pedro Anda José Ramón Blanco Isabel Jado

Mercedes Marín José Antonio Oteo Inmaculada Pons Aranzazu Portillo Isabel Sanfeliu

ISBN-978 84-612-2074-8

Diagnóstico microbiológico de las infecciones por patógenos bacterianos

emergentes: Anaplasma, Bartonella, Rickettsia, Tropheryma whipplei

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ÍNDICE DEL DOCUMENTO CIENTÍFICO

1. Anaplasmosis humana (ehrlichiosis humana granulocítica)1.1. Introducción1.2. Clasificación y consideraciones clínicas1.3. Recogida de la muestra1.4. Manejo de la muestra en su recepción en el laboratorio de microbiología1.5. Procesamiento de la muestra1.6. Técnicas microbiológicas1.7. Criterios diagnósticos1.8. Profilaxis1.9. Tratamiento2. Infección por Bartonella spp.2.1. Introducción2.2. Consideraciones clínicas

2.2.1. Fiebre de Oroya (fase aguda) y verruga peruana (fase crónica)2.2.2. Enfermedad por arañazo de gato2.2.3. Fiebre de las trincheras2.2.4. Angiomatosis bacilar y peliosis hepática2.2.5. Endocarditis

2.3. Diagnóstico2.3.1. Métodos directos2.3.2. Cultivo microbiológico2.3.3. Serología2.3.4. Métodos moleculares

2.4. Tratamiento y profilaxis3. Infecciones por Rickettsia spp.3.1. Introducción3.2. Clasificación y consideraciones clínicas

3.2.1. Grupo de las fiebres manchadas3.2.2. Grupo de las fiebres tíficas

3.3. Recogida de la muestra3.4. Transporte y conservación de la muestra3.5. Manejo de la muestra en su recepción en el laboratorio de microbiología3.6. Procesamiento de la muestra3.7. Cultivos. Selección de medios y condiciones de incubación3.8. Criterios para interpretación de resultados3.9. Procedimientos adicionales a realizar en situaciones especiales3.10. Información de resultados3.11. Técnicas rápidas de diagnóstico3.12. Procedimientos no aceptables4. Enfermedad de Whipple4.1. Introducción e historia

4.1.1. Descripción de Tropheryma whipplei4.2. Manifestaciones clínicas4.3. Tratamiento4.4. Epidemiología y patogénesis4.5. Diagnóstico microbiológico

4.5.1. Obtención y conservación de las muestras4.5.2. Procesamiento de muestras: extracción del ADN4.5.3. Detección de ADN de Tropheryma whipplei por PCR4.5.4. Precauciones e interpretación de resultados4.5.5. Otros métodos para el diagnóstico de laboratorio

5. Bibliografía5.1. Anaplasmosis humana (ehrlichiosis humana granulocítica)5.2. Infección por Bartonella spp.5.3. Infecciones por Rickettsia spp.5.4. Enfermedad de Whipple

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ÍNDICE DE LOS DOCUMENTOS TÉCNICOS

1. PNT-EMG-01. Aislamiento de Anaplasma phagocytophilum a partir de muestras clínicas mediante cultivo2. PNT-EMG-02. Diagnóstico de anaplasmosis humana mediante inmunofluorescencia indirecta3. PNT-EMG-03. Detección directa de Anaplasma phagocytophilum en muestras clínicas mediante amplificación

genómica (PCR) y secuenciación4. PNT-EMG-04. Diagnóstico de las infecciones por Bartonella spp. a partir de muestras clínicas mediante cultivo5. PNT-EMG-05. Diagnóstico de las infecciones por Bartonella spp. mediante serología6. PNT-EMG-06. Diagnóstico de las infecciones por Bartonella spp. mediante amplificación genómica y

secuenciación7. PNT-EMG-07. Aislamiento de Rickettsia spp. a partir de muestras clínicas mediante cultivo8. PNT-EMG-08. Diagnóstico de las rickettsiosis mediante inmunofluorescencia indirecta9. PNT-EMG-09. Detección directa de Rickettsia spp. en muestras clínicas mediante amplificación genómica y

secuenciación del gen gltA10.10. PNT-EMG-10. Detección de ADN de Tropheryma whipplei en muestras clínicas mediante PCR

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Procedimientos en Microbiología ClínicaRecomendaciones de la Sociedad Española de Enfermedades

Infecciosas y Microbiología Clínica

Editores: Emilia Cercenado y Rafael Cantón

27. DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO DE LAS INFECCIONES POR PATÓGENOSBACTERIANOS EMERGENTES: Anaplasma, Bartonella, Rickettsia, Tropherymawhipplei. 2007

Coordinador: José Ramón Blanco

Autores: Pedro AndaJosé Ramón BlancoIsabel JadoMercedes MarínJosé Antonio OteoInmaculada PonsAranzazu PortilloIsabel Sanfeliu

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1. ANAPLASMOSIS HUMANA (EHRLICHIOSISHUMANA GRANULOCITICA)1.1. INTRODUCCIÓNCon los términos ehrlichiosis y anaplasmosisdenominamos a un grupo de infecciones bacterianastransmitidas por garrapatas duras (Ixodidae) y queafectan a hombres y animales. Son de distribuciónuniversal y están provocadas por diferentes especies delos géneros Anaplasma y Ehrlichia (familiaAnaplasmataceae). Taxonómicamente pertenecen alorden Rickettsiales (alfa 1 Proteobacteria). Secaracterizan por ser Gram negativas, pleomórficas, y decrecimiento intracelular obligado. Recientemente, estasbacterias se han reorganizado en una nuevaclasificación, que ha sido aceptada e incorporada a estetexto. Una característica que las diferencia de lasrickettsias es que se replican en unas vacuolasderivadas de la membrana celular de las células queinfectan, principalmente leucocitos y plaquetas. Ehrlichiaspp. y Anaplasma spp. no crecen en los medios decultivo habituales, precisando para su crecimiento líneascelulares (células promielocíticas HL-60 y precursoresmielomonocíticos). No se tiñen con la tinción de Gram,aunque se pueden poner de manifiesto en las célulasque infectan, en forma de agregados citoplasmáticosdenominados “mórulas”, mediante las tinciones deWright y Giemsa.

Las ehrlichias y anaplasmas se mantienen en lanaturaleza en un ciclo biológico similar al de laborreliosis de Lyme (garrapata-mamífero-garrapata),siendo infectados los hombres ocasionalmente por lapicadura de diferentes especies de garrapatas duras.En Europa la única garrapata implicada en latransmisión de A. phagocytophilom es Ixodes ricinus,guardando la anaplasmosis humana y la borreliosis deLyme un inminente paralelismo, ya que compartenvector, alguno de los reservorios y como tal, ambienteepidemiológico.

1.2. CLASIFICACIÓN Y CONSIDERACIONESCLÍNICASLa primera descripción de una ehrlichiosis humanadata de 1953, describiéndose en Japón el primeraislamiento de E. sennetsu en un paciente con uncuadro clínico similar a la mononucleosis infecciosa.Desde entonces se han implicado en patologíahumana nuevas especies de Ehrlichia y Anaplasma yen la actualidad se considera que las ehrlichiosis (yanaplasmosis) son un problema emergente. En laTabla 1 se muestran las diferentes especies deEhrlichia y Anaplasma implicadas en patologíahumana con sus dianas y vectores.

En el área occidental son tres las especies deehrlichias que tienen importancia por su incidencia ypotencial gravedad: E. chaffeensis, agente productorde la ehrlichiosis humana monocítica (EHM) en NorteAmérica; A. phagocytophilum (denominación actualque engloba a los antiguamente denominados:agente de la ehrlichiosis humana granulocítica, E.phagocytophila, y E. equi) productora de laanaplasmosis humana (AH) (antigua ehrlichiosishumana granulocítica), y E. ewingii responsable deun cuadro similar a la AH en pacientesinmunodeprimidos en Norte América. Hasta la fechano existen datos convincentes de la presencia enEuropa de otras ehrlichiosis humanas diferentes a laAH, si bien la reciente descripción de una nuevaespecie de Ehrlichia, denominada provisionalmenteE. walkerii, en I. ricinus recogidos de pacientespodría justificar algunos casos dudosos de EHMdiagnosticados en Europa.

La EHM se describió en 1987 en EE.UU. Aunqueen un principio se implicó a E. canis (agenteproductor de la ehrlichiosis monocítica canina) comola bacteria responsable (reacción serológicacruzada), en la actualidad se sabe que el agentecausal es E. chaffeensis, denominada así por

Tabla 1. Especies de Ehrlichia y Anaplasma implicadas en patología humana

Especies de Ehrlichia y Anaplasma Vector Distribución geográfica

E. canis Riphicephalus sanguineus Mundial

E. chaffeensisAmblyomma americanum

Dermacentor variabilis

Norteamérica

Centroamérica

A. phagocytophilum Ixodes ricinus

Europa

Norteamérica

Norte de África

E. ewingii A. americanum Norteamérica

E. sennetsu DesconocidoJapón

Malasia

DOCUMENTO CIENTÍFICO

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aislarse en Fort Chaffee (Arkansas). Desde entoncesse han comunicado miles de casos de EHM en EE.UU.En ese mismo país, en 1994, se describió por primeravez la AH provocada por la actualmente denominada A.phagocytophilum y en 1999 se descubrió que E.ewingii, un patógeno reconocido como agente causalde ehrlichiosis granulocítica en perros, podía tambiéncausar infección en humanos con inmunodepresión.Tras estos hallazgos, se han descrito en EE.UU. másde mil casos de AH, lo que contrasta con los menos de100 casos descritos en Europa (incluida España),desde su primera descripción en Eslovenia en 1997.En el momento de escribir estos procedimientosmicrobiológicos sólo podemos afirmar que E. canis esel causante de la ehrlichiosis canina. No obstante estaehrlichia, ampliamente distribuida por todo el mundo, yvehiculada por la garrapata marrón del perro(Riphicephalus sanguineus) ha sido implicada comopatógeno humano en Venezuela.

A pesar de que las dianas de E. chaffeensis y A.phagocytophilum son diferentes (monocitos ygranulocitos respectivamente) ambas presentan uncuadro clínico superponible. No obstante al no existirdatos sobre la presencia en Europa de otrasehrlichiosis humanas diferentes a la AH el presentedocumento se centrará en la descripción de ésta. EnEuropa no se ha detectado la presencia de E.chaffeensis ni en artrópodos ni en mamíferos (humanosincluidos). Los casos de EHM que se publicaron enEuropa hace años, se basaron en reaccionesserológicas cruzadas y en la actualidad no se aceptan. El contacto con sangre de animales infectados, elempleo de hemoderivados (transfusiones) y latransmisión perinatal son vías excepcionales deadquisición de la enfermedad. La mayor incidencia deestas infecciones se produce en los meses en los quelas diferentes especies de garrapatas implicadas en latransmisión de estas bacterias están más activas(primavera-verano y principio de otoño). En Europa se han realizado diferentes estudios deprevalencia de la infección por A. phagocytophilum enhumanos y garrapatas. En los mismos llama la atenciónla prevalencia tan alta que encontramos en la garrapatavector (hasta el 45%), y los pocos casos humanos quese diagnostican. A este respecto se ha apuntado que esposible que algunas variedades de A. phagocytophilum,como la variante AP-1 descrita inicialmente en EE.UU., ytambién detectada en España, en I. ricinus procedentesde La Rioja, no sean patógenas. No se conoce con exactitud la fisiopatología de lasehrlichiosis/anaplasmosis. Al igual que en otrasenfermedades transmitidas por garrapatas, lasehrlichias llegan a la sangre tras la picadura de unagarrapata. Desde allí infectan a los leucocitoscirculantes y a las células del sistema retículo-endotelial. Estos microorganismos penetran en elinterior de las células por fagocitosis. Una vez en elinterior es posible que inhiban la fusión fagosoma-lisosoma y retrasen la apoptosis celular, facilitando lamultiplicación de las bacterias. Una característica de lasdiferentes especies de Ehrlichia y Anaplasma es que seaglomeran en el citoplasma formando unas inclusionesque se pueden observar al microscopio óptico,

denominadas mórulas. Estas mórulas se forman a lospocos días, y se pueden observar fundamentalmenteen sangre periférica, pero también en médula ósea,sinusoides hepáticos y/o esplénicos, e incluso en lascélulas del líquido céfalo-raquídeo (LCR). La afinidadde las diferentes especies de este tipo de bacterias porsus células diana, es la responsable de las citopeniasobservadas (leucopenia, trombopenia), llegando enocasiones a provocar grados severos deinmunodepresión. Este hecho facilita la apariciónocasional de infecciones oportunistas. Los principales determinantes antigénicos de lasehrlichias son las proteínas de la membrana desuperficie. Si bien se cree que la infección confiereuna protección duradera frente a nuevas infecciones,se han confirmado casos de reinfección por la mismaespecie de Ehrlichia. Asimismo existen datos de laposible persistencia de estas bacterias en elcitoplasma de las células infectadas durante largosperiodos de tiempo. Las ehrlichiosis y anaplasmosis son infeccionessistémicas, por lo que provocan daño en diferentesórganos y sistemas, pudiéndose encontrar granulomasy megacariocitosis en médula ósea, necrosis focalhepática y la existencia de un infiltrado linfohistiocíticoperivascular que afecta a hígado, meninges, cerebro,corazón, etc. La AH granulocítica (AHG) es una enfermedadfebril aguda en la que la mayoría de los pacientesrecuerdan la picadura de una garrapata en losdías/semanas previos. Se han comunicado máscasos en varones que en mujeres. El periodo deincubación varía entre 5-21 días (media 11 días). Lamayor parte de los casos europeos se han producidoentre abril y octubre (época de actividad del vector)con un pico en julio. Los pacientes se presentan confiebre de comienzo súbito (>38,5ºC), malestargeneral, cefalea, mialgias y artralgias. La exploraciónfísica no muestra datos a destacar, salvo la presenciaocasional de conjuntivitis y adenopatías. Lasórganomegalias no son frecuentes. Además delcuadro pseudo-gripal pueden existir otrasmanifestaciones clínicas: respiratorias (tos);digestivas (náuseas, vómitos, diarrea, dolorabdominal, anorexia) y neurológicas (meningitis). Lapresencia de exantema es más frecuente en lospacientes con EHM y muy rara en la AHG. Más de lamitad de los pacientes requieren hospitalizacióndurante la enfermedad en las series americanas. Enla AHG europea las manifestaciones clínicas parecenmenos severas, si bien algunos casos de AHG sepresentan como una neumonía atípica. Entre lascomplicaciones de estas infecciones se han descrito,entre otras, coagulación intravascular diseminada,distress respiratorio del adulto, neuropatíasperiféricas, parálisis facial, pancarditis y rabdomiolisis.La inmunodepresión (leucopenia) provocada enalgunas ocasiones se acompaña de infeccionesoportunistas (neumonía micótica), que pueden llevara la muerte al paciente. En Norteamérica, entre el 0-5% de los pacientes con AHG fallecen, y la mayoríade las muertes se deben a infecciones oportunistas o

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a enfermedades concomitantes, si bien estosaspectos no se describen en la literatura europea. Aunque los hallazgos de laboratorio(hematológicos y bioquímicos) son inespecíficos,estos pueden ayudar al diagnóstico. Así la mayoríade los pacientes presentan en la fase aguda de laenfermedad leucopenia y trombopenia, además deelevación moderada de las transaminasas (AST,ALT), lactodeshidrogenasa (LDH), y proteína Creactiva. Estas alteraciones se suelen resolver en laAHG europea en unos 14 días del inicio del cuadro.En los pacientes con AHG que presentan signosmeníngeos, el análisis del LCR suele ser normal, adiferencia de los pacientes con EHM en los que seobserva pleocitosis linfocitaria, con aumento deproteínas, y mayor prevalencia de clínicaneurológica. La glucorraquia suele encontrarse enlos límites de la normalidad. Por último, se debe tener en cuenta que dadoque los vectores de estas bacterias pueden transmitirotras enfermedades como la borreliosis de Lyme,encefalitis centroeuropea o las babesiosis, se puededar el caso de que coexistan más de unaenfermedad en el paciente que ha sido picado porgarrapatas, y observarse manifestaciones clínicas demás de una de ellas.

1.3. RECOGIDA DE LA MUESTRA Para el aislamiento de A. phagocytophilum sedebe obtener sangre durante la fase aguda de laenfermedad, que es cuando existe la mayorconcentración de leucocitos infectados en sangreperiférica. La sangre se debe extraer preferiblementeen tubos de EDTA, y preservarse a temperaturaambiente no más de 48 horas o congelada a –20ºCantes de la inoculación en los medios de cultivo. Lasangre infectada con A. phagocytophilum recogidaen tubos de heparina también se ha mostrado útilpara el cultivo durante 10 días a temperaturaambiente y hasta 13 días conservada a 4ºC. Noobstante se recomienda no utilizar estos tubos yaque comprometen su posterior utilización para laposible amplificación del genoma mediante técnicasde PCR. En el caso de afectación neurológica,también se debe recoger LCR.

1.4. MANEJO DE LA MUESTRA EN SURECEPCIÓN EN EL LABORATORIO DEMICROBIOLOGÍA Todas las muestras deben manejarse como situvieran microorganismos potencialmente peligrosos.Cuando una muestra se recibe en el laboratorio, yantes de procesarse, debe someterse a unainspección previa para asegurarse que ha sido bienseleccionada, recogida y transportada. Las muestrasse rechazarán en los siguientes casos: 1) muestra noidentificada, 2) transporte inadecuado o demasiadoprolongado, 3) muestra derramada, 4) cantidadinsuficiente o inadecuada. En todos estos casos secontactará con el médico solicitante para solicitaruna nueva muestra.

1.5. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA En la tabla 2 se recogen las muestras necesariaspara la mayoría de las técnicas de diagnóstico queactualmente se llevan a cabo en los laboratorios demicrobiología, indicando aspectos generales sobre larecogida, tiempo y temperatura de transporte yconservación. Se debe tener en cuenta que, habitualmente, lacarga microbiana en este tipo de infecciones esmenor que en el caso de otras bacterias. Esto obligaa recoger mayor cantidad de muestra para obtenerun rendimiento óptimo. Las muestras inaceptablesno deben procesarse y se debe informarinmediatamente al médico responsable del paciente.Los consejos generales para optimizar elprocesamiento de muestras son:

1. Comprobar que el etiquetado de la muestra escorrecto.

2. Registrar toda la información necesaria quepudiera afectar a la calidad de la muestra y querepresente interés diagnóstico (aspecto, color,coágulos, etc.), así como aspectos relacionadoscon su recogida, transporte y conservación.

3. Durante el procesamiento, deben seguirse todaslas medidas de seguridad necesarias, tanto parael personal como para la muestra.

4. El procesamiento debe llevarse a cabo tanpronto como sea posible, más aún en el caso deque se persiga el aislamiento del agente,garantizando de esta forma la viabilidad.

1.6. TÉCNICAS MICROBIOLÓGICASObservación de mórulas. Para la observación deleucocitos infectados lo mejor es preparar lasextensiones de sangre periférica inmediatamentedespués de la extracción de sangre. Deben secarseal aire y conservarse a temperatura ambiente parasu observación.Cultivo. Se realiza en muy pocos centros,recomendándose para la realización del mismo unlaboratorio con un nivel mínimo de seguridad de tipo3. La línea celular más empleada para el cultivo deA. phagocytophilum es la de células promilocíticasleucémicas HL-60. La sangre fresca (100 µL), o 5mL de la capa leucocitaria de sangre en EDTAcongelada previamente a -20ºC se debe inocular enfrascos de 25-cm2 con células HL-60 con unadensidad de 2 x 105 células. La infección se puedecomprobar mediante tinciones de Giemsa, siendogeneralmente visibles las mórulas a los 3-7 días dela inoculación, o mediante PCR.Serología. La serología es la técnica de laboratoriomás utilizada para el diagnóstico microbiológico deestas infecciones. Dentro de las diferentes técnicasserológicas, la técnica de inmunofluorescenciaindirecta (IFI) es la más empleada. En la actualidaddisponemos de diferentes antígenos para eldiagnóstico de la AH, que bien son preparados consustrato de células infectadas o con antígenos puros.

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Tabla 2. Muestras necesarias para el diagnóstico de anaplasmosis humana.

MUESTRA RECOGIDATRANSPORTETiempo ytemperatura

CONSERVACIÓN Tiempo ytemperatura PRUEBA

DIAGNÓSTICA NOTA

Suero Recoger en tubo de serología <24 h, 2-8°C +24h, -20°C IFI1

Sangre con EDTA Recoger en tubo con EDTA < 48 h, TA+48h, - 20°C

+48h, - 20°C(no variasdescongelaciones)

PCR2

Sangre citratada Recoger en tubo con citrato < 48 h, TA+48h, - 20°C

+48h, - 20°C(no variasdescongelaciones)

PCR2

Sangre heparinizada Recoger en tubo con heparina < 24h, TA+ 24h, -80ºC

+24h, -80°C(no variasdescongelaciones)

Cultivo3 La heparina 4puede inhibirla PCR

1Inmunofluorescencia indirecta. 2Reacción en cadena de la polimerasa. 3Muy laborioso, se requiere personal especializado e instalaciones con nivel debioseguridad 3. 4Evitar el uso de heparina para muestras en las que se vaya a realizar diagnóstico molecular, puesto que este anticoagulante puede inhibir la PCR.Abreviatura: TA: Temperatura ambiente

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Su mayor limitación es la existencia de reaccionescruzadas entre las diferentes especies de Ehrlichia yAnaplasma. No obstante, al no existir en Europaninguna evidencia que haya demostrado la presencia deotras ehrlichiosis humanas diferentes a la de la AH, anteun cuadro clínico sugestivo, ante una serología positivase debe sospechar en una AH. También se han descritoreacciones cruzadas entre estas bacterias y otrosRickettsiales, como R. rickettsii, y R. typhi. En nuestraexperiencia también se pueden producir reaccionescruzadas en la mononucleosis infecciosa, en la fiebre Q,y en la infección por R. slovaca. Su limitación es la faltade sensibilidad en fases agudas. Se debe extraer unsegundo suero entre 14 y 21 días para observarseroconversión.Detección molecular. Se realiza mediante métodosbasados en la PCR. No están estandarizados ypueden mostrar resultados discrepantes. Se halogrado la detección de ADN de A. phagocytophilumde sangre y de suero en la fase aguda. En laactualidad se dispone de múltiples dianas,habiéndose demostrado como más sensibles losfragmentos los que amplifican un fragmento del gen16S ARNr. También se utilizan amplificaciones delgen epank o los fragmentos homólogos del gen msp2.

1.7. CRITERIOS DIAGNÓSTICOSEl diagnóstico de la anaplasmosis/ehrlichiosisrequiere un alto índice de sospecha. Ante loshallazgos de laboratorio (trombopenia, leucopenia yaumento de las transaminasas) y los antecedentesepidemiológicos, se debe sospechar esta posibilidad.Estas infecciones se han de tener en cuenta enaquellos individuos previamente sanos que presentanfiebre tras realizar actividades al aire libre y en lospacientes que refieren antecedentes de picadura degarrapata y que no responden al tratamiento conbetalactámicos o macrólidos, especialmente en áreasendémicas para la borreliosis de Lyme. La normalidad

de los parámetros analíticos no descarta laenfermedad. En la Tabla 3, se exponen los criteriosdel ESCAR (European Society of Clinical Microbiologyand Infectious Diseases Study Group for Coxiella,Rickettsia, Anaplasma and Bartonella) para eldiagnóstico de la AH. Existen también criterios de losCDC para el diagnóstico de la EHM y la AH.

1.8. PROFILAXIS Las ehrlichiosis y anaplasmosis se previenenevitando la picadura de las garrapatas. A esterespecto, llevar una indumentaria adecuada en loslugares boscosos y con hierba alta, el uso derepelentes, y la revisión del cuerpo tras lasexcursiones en búsqueda de estos artrópodos y sucorrecta extracción mediante pinzas constituyen lasmedidas de profilaxis primaria. Por el momento noexisten vacunas, y no hay evidencia de que laprofilaxis antibiótica tras la picadura de garrapatassea coste-efectiva.

1.9. TRATAMIENTO Dado que la confirmación microbiológica puedetardar varias semanas o no producirse, ante lasospecha clínica, los autores de este procedimientoopinan que se debe administrar tratamiento de formaempírica. Son muchos los antibióticos que handemostrado ser eficaces, y al igual que en lasrickettsiosis, la doxiciclina es el tratamiento deelección incluidos los niños (100 mg cada 12 horasdurante 7 a 14 días y en niños ajustar según peso).Las quinolonas (ciprofloxacino, ofloxacino ylevofloxacino) y la rifampicina son posiblesalternativas terapéuticas. La respuesta al tratamientoes buena y los síntomas se resuelven 24-48 horasdespués de iniciado el tratamiento. En ausencia derespuesta al tratamiento se han de descartar otrasposibilidades diagnósticas o coinfección por otrosagentes.

Tabla 3. Propuestas para la definición de casos de AHG del ESCAR (European Society of Clinical Microbiologyand Infectious Diseases Study Group for Coxiella, Rickettsia, Anaplasma and Bartonella).

Anaplasmosis humana confirmada1. Fiebre con antecedente de exposición o picadura de garrapata, y2. Demostración de infección por Anaplasma phagocytophilum por seroconversión o aumentode cuatro veces el título de anticuerposa , o3. Resultado de PCR positivo con posterior secuenciación de los amplicones demostrandoADN específico de Anaplasma en sangre, o4. Aislamiento de A. phagocytophilum en cultivo de sangre

Probable anaplasmosis humana1. Fiebre con antecedente de exposición o picadura de garrapata, y2. Presencia de un título estable de anticuerpos frente a A. phagocytophilum en los suerosagudo y convaleciente si el título es 4 veces el punto de cortea, o3. Resultado de PCR positivo sin posterior secuenciaciónb, o4. Presencia de mórulas intracitoplasmáticas en frotis sanguíneoa Por ensayos de inmunofluorescencia, usando tanto antígeno intracelular como purificado, enlaboratorio de referencia o con el sistema comercializado de MRL Diagnostics(Cypress,CA,USA). b Usando los cebadores específicos de especie citados en la tabla 3.

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2. INFECCIÓN POR BARTONELLA SPP.2.1. INTRODUCCIÓNHasta 1993 Bartonella bacilliformis, causante de laenfermedad de Carrion, era la única especie deBartonella conocida. Desde entonces el número deespecies de Bartonella identificadas se haincrementado considerablemente. De las 21especies de Bartonella descritas hasta la actualidadsolamente 10 son reconocidas como patógenoshumanos. Las más frecuentes son B. bacilliformis, B.quintana y B. henselae. Otras especies de Bartonellaimplicadas en patología humana son B. elizabethae,B. vinsonii, B. washoensis, B. grahamii, B.clarridgeiae, B. koehlerae y B. alsatica. Estosmicroorganismos están directamente implicados enalgunas patologías como la enfermedad por arañazode gato (EAG), angiomatosis bacilar, peliosishepática, bacteriemia, endocarditis, osteomielitis,uveítis y desordenes neurológicos.

Desde el punto de vista microbiológico lasbartonellas son pequeños bacilos gramnegativos,polimorfos, delgados, cortos y ligeramente curvados(muy parecidos a Helicobacter o Haemophilus eindistinguibles al microscopio del género Afipia). Sulongitud oscila entre 1-1,2 µm y su diámetro 0,5-0,8µm.Las diferentes especies de Bartonella presentan unagran diversidad de reservorios y de vectores detransmisión. El factor que determina la distribucióngeográfica de las diferentes especies es el tipo devector que precisan. Así B. bacilliformis se encuentraexclusivamente en algunos países de América delSur (Perú, Colombia, Bolivia, Chile y Guatemala),otras como B. quintana o B. henselae son totalmentecosmopolitas. En el caso de B. henselae elreservorio fundamental es el gato doméstico y laspulgas el vector de transmisión; para B. quintana elvector de transmisión son los piojos y su únicoreservorio es el hombre, el resto de bartonellaspresentan diversos vectores y reservorios.

2.2. CONSIDERACIONES CLÍNICAS2.2.1. Fiebre de Oroya (fase aguda) y verrugaperuana (fase crónica). Esta enfermedad esconocida como enfermedad de Carrion y esendémica en Sudamérica, donde se encuentra suvector, la mosca de la arena (Lutzomyia verrucarum).No se conocen otros reservorios diferentes alhombre. La enfermedad se manifiesta con fiebre,malestar, palidez, anorexia, debilidad y anemiahemolítica aguda acompañada de septicemia, comoconsecuencia de la invasión masiva de los hematíes.Sin tratamiento su pronóstico es grave (mortalidaddel 40-85%). La fase crónica (verruga peruana) semanifiesta unos meses más tarde, y se manifiestacomo unas lesiones cutáneas sobreelevadas,pseudotumorales, angiomatosas y que sangran confacilidad al contacto.2.2.2. Enfermedad por arañazo de gato (EAG). Secaracteriza por la aparición de adenopatíasregionales después de haber sufrido un arañazo omordedura de gato. Es una infección de distribuciónmundial, presenta estacionalidad y tiene una

incidencia estable, sin brotes epidémicos. Puedeafectar a personas de cualquier edad, pero más del80% de los casos se da en pacientes menores de 21años. Al inicio de la infección el 60-90% de lospacientes presenta una pápula o pústula en la zonade inoculación y posteriormente (entre 1-3 semanas)aparece la afección ganglionar en el área de drenajedel punto de inoculación. La mayoría de adenopatíasson axilares, cervicales o inguinales. En pocos casosexisten manifestaciones atípicas (5-25%) siendo lasmás frecuentes la afección oculo-glandular(síndrome de Parinaud), junto con otrasmanifestaciones oftalmológicas y la encefalitis.Algunos pacientes en edad pediátrica puedenpresentar asociados a la EAG cuadros deencefalopatías; su recuperación es completa en lamayoría de los casos.2.2.3. Fiebre de las trincheras. También llamadatambién fiebre de Volinia o fiebre de los 5 días. B.quintana es el agente patógeno responsable de lainfección. El principal reservorio es el ser humano yel vector transmisor es el piojo de la ropa (Pediculuscorporis) que infecta al hombre a través de lapicadura. Tras una incubación de 12-25 días, lospacientes presentan fiebre, escalofríos, cefalea,dolor pretibial y una profunda postración.2.2.4. Angiomatosis bacilar (AB) y peliosishepática. En 1983 se describieron las primeraslesiones subcutáneas asociadas a pacientes coninmunodeficiencias. Se trata de una infeccióncutánea caracterizada por pequeñas pápulaseritematosas, de color rojo púrpura que puedencrecer a nódulos dérmicos, subcutáneos o placasinduradas e hiperpigmentadas debido a unaproliferación vascular. Se descubrió inicialmente enpacientes immunodeprimidos por el VIH yhabitualmente con CD4+ <100. Las especiesasociadas a AB son B. henselae y B. quintana. La peliosis hepática es una lesión predominantede órganos sólidos con elementosreticuloendoteliales. El hígado es el principal órganoafectado aunque puede afectar al bazo, ganglioslinfáticos e incluso la médula ósea. B. henselae es laúnica especie implicada en este cuadro clínico.2.2.5. Endocarditis. Las endocarditis con cultivonegativo (ECN) suponen entre el 2,5 y el 31% detodas las endocarditis. Descartado el tratamientoantibiótico, las causas que pueden favorecer laobtención de cultivos negativos serían el crecimientolento de algunas bacterias y la dificultad de algunosmicroorganismos para crecer en mediosconvencionales. Las mejoras en las técnicas dedetección por PCR y las modificaciones en lastécnicas de cultivo han favorecido el diagnóstico delas endocarditis. En estos momentos Bartonella spp.es responsable del 1-17% de todos los casos. Lascaracterísticas clínicas son similares al resto deendocarditis, suele producirse en pacientes sinvalvulopatía previa y en un 60% de los casos existecontacto con gatos.

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2.3. DIAGNOSTICO2.3.1. Métodos directos. La biopsia, su examenhistológico y la demostración de bartonellas es unode los métodos diagnósticos más rápido y rentableen la actualidad.2.3.1.1. Tipo de muestra. Las muestras que seutilizan para el diagnóstico directo son biopsias deganglios, piel, válvulas y en algunos casos puedeutilizarse la sangre.2.3.1.2. Transporte y conservación de la muestra.Las muestras deben recogerse de manera asépticapor personal cualificado y enviarse rápidamente allaboratorio para su posterior manipulación. Lasbiopsias se conservan en formaldehído, mientrasque las muestras de sangre se inocularándirectamente en botellas de hemocultivo. Lasmuestras pueden conservarse a temperaturaambiente hasta su recepción en el laboratorio.2.3.1.3. Tinciones. La tinción de impregnaciónargéntica de Warthin-Starry es la más utilizada. Enella se pueden observar masas de bacteriaspleomórficas teñidas de oscuro casi negras. Otrastinciones útiles son las de hematoxilina y eosina y lade naranja de acridina. Las muestras sonparafinadas en bloques y cortadas en láminas de0,4-0,5 mm de grosor para su posterior tinción. En el examen histológico puede observarse laproliferación vascular lobular de pequeños vasos congrandes células endoteliales (epiteloides) queprotruyen dentro de los capilares recientementeformados, pudiendo obstruir su luz y presentaratípias nucleares que a su vez están rodeadas porun infiltrado inflamatorio de polimorfonuclares,algunos linfocitos y algunas zonas focales denecrosis, así como grumos de material granular queson cúmulos de bacilos de B. henselae y que sedisponen habitualmente de forma próxima a la luz delos vasos. En la peliosis hepática existe unaproliferación importante de capilares sinusoidales,formación de grandes lagos vasculares en unestroma mixoide y con células inflamatorias.También pueden observarse bacterias en el estroma.De manera excepcional se pueden observargranulomas necrotizantes. Si en lugar de biopsia, el microorganismo se aislade un cultivo de sangre positivo, la tinción necesitade un proceso previo de concentración y lisis de lasangre. Para realizar la tinción con naranja deacridina (0,01%) se deben poner unas gotas de lamuestra de sangre lisada en un portaobjetos, fijardurante 2 minutos con metanol y teñir. Si la muestraes positiva se observará la presencia de bacilospequeños y pleomórficos de color naranja(visualización con microscopio de fluorescencia).2.3.1.4. Interpretación de resultados. Las técnicas deobservación directas proporcionan un resultadopresuntivo o compatible de infección por Bartonellaspp. Estas han de ir acompañadas de otros métodosdiagnósticos (serología, cultivo, PCR), para eldiagnóstico definitivo de la infección.2.3.2. Cultivo microbiológico. El aislamiento deBartonella spp. en muestras humanas es difícil yrequiere de procesos especiales que no se dan en

laboratorios de microbiología de manera rutinaria.Por sus requerimientos nutricionales sonconsiderados microorganismos exigentes ofastidiosos, y debido a esto siempre hay que tener encuenta que un hemocultivo o cultivo de biopsianegativo después de un largo periodo de incubaciónno excluye en absoluto la sospecha de infección porBartonella.2.3.2.1. Tipos de muestras. Las muestras másutilizadas para el cultivo microbiológico son lasbiopsias (ganglios linfáticos, válvulas cardíacas, piel)y sangre (pacientes inmunodeprimidos o consospecha de endocarditis).2.3.2.2. Transporte y conservación. Las biopsiasdeberán obtenerse de manera aséptica para poderevitar posibles contaminaciones y se transportaran allaboratorio con agua destilada lo más rápidamenteposible. El cultivo se realizará inmediatamente o seconservará a –80ºC para un proceso posterior. Loscultivos de sangre se inocularan directamente en unabotella de hemocultivo, para ser incubados en unsistema automático durante al menos 21 días.También se puede cultivar la sangre directamente enmedios sólidos, siempre que se realice el proceso delisis de los hematíes.2.3.2.3. Procesamiento y medios de cultivo. Lasbiopsias deberán ser maceradas en un mortero demanera estéril para poder minimizar el riesgo decontaminación bacteriana. El medio más utilizadopara el crecimiento de Bartonella spp. es el agarsangre con un 5% de sangre de cordero o agarchocolate (medios comercializados), aunque existentrabajos que presentan mejores rendimientos decrecimiento si se utiliza sangre fresca de conejo.También pueden utilizarse medios líquidossuplementados con hemina e incluso cultivo celularmediante la técnica de shell vial (las muestras desangre heparinizada o tejido se diluyen en mediolíquido, MEM, RMPI con suero bovino fetal, sesometen a un proceso de centrifugación sobre capasde líneas celulares y se incuban durante un periodode 15-30 días). Estos cultivos se revelan medianteuna tinción de Jiménez. El sobrenadante se guardapara poder inocular en posteriores cultivos celularesen el caso que se observe la presencia debartonellas o para poder realizar una PCR. La detección de Bartonella spp. en sangremediante métodos automatizados es difícil,posiblemente debido a la baja o inexistenteproducción de CO2; no obstante se han obtenidoalgunos aislados de B. henselae de pacientesinmunodeprimidos. En estos casos se recomienda,tras 21 días de incubación de los frascos dehemocultivos, una siembra en un medio sólido.Cuando el hemocultivo es dado como negativo por elincubador automático se debe proceder a laconcentración de la muestra y a su siembra en unaplaca de agar sangre durante un periodo no inferior a2 meses. Si la muestra de sangre no se haprocesado en una botella de hemocultivo, se puederealizar el cultivo en medio sólido, siempreprocediendo a una lisis previa de los hematíes.

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Existen 2 métodos actualmente aceptados, elprimero es someter la sangre a un proceso decongelación de –80ºC durante 24 horas y una vezlisada sembrar. El otro sistema es utilizar elIsolator™ blood-lysis tube que lisa directamente loshematíes.2.3.2.4. Condiciones de incubación. El crecimientodel género Bartonella (excepto B. bacilliformis) esmuy lento. Las muestras deberán incubarse a 35-37ºC con un 5% de CO2 (excepto B. bacilliformisque solamente crece a 28-30ºC). El tiempo mínimode incubación variará dependiendo del tipo de cultivode que se trate. Si es un cultivo primario o unamuestra directa de paciente se deberá incubardurante un periodo mínimo de 2 meses; si por elcontrario se trata de subcultivos de Bartonella(previamente aislados), son necesarios solamente de3-10 días. Aumentar el tiempo incubación de lasmuestras en medios húmedos incrementa el riesgode contaminación por hongos y por bacterias decrecimiento rápido. Este problema se minimizaadicionando antimicóticos como anfotericina B alcultivo o más fácilmente mediante el cierre de laplaca de cultivo con Parafilm después detranscurridas las primeras 24 horas de incubación.2.3.2.5. Criterios para interpretación de resultados.Se considera positivo el cultivo para Bartonella spp.cuando se observan en el medio pequeñas colonias,de color blanco-amarillento y aspecto rugoso,siempre muy adheridas al medio, incrustadas en lasuperficie y difíciles de arrastrar con un asa desiembra. Tienen un tamaño pequeño que oscila entrelos 0,3-2,0 µm. El primer subcultivo puede presentardificultades en su crecimiento, pero después demúltiples resiembras o subcultivos crecen confacilidad (3-10 días). Las colonias de B. henselae yB. quintana de un primer aislamiento presentan unamorfología muy heterogénea, formas irregulares,redondeadas y rugosas, después las colonias de lossubcultivos tienen un aspecto más brillante y muchomenos adheridas al medio.

2.3.2.5.1. Identificación del microorganismo.Identificar las diferentes especies del géneroBartonella en el laboratorio, resulta muy difícil, yaque fenotípicamente y genotípicamente son muysimilares. La tinción de Gram confirmará que setrata de bacilos Gram negativos. Todas lasespecies son oxidasa, ureasa, nitrato reductasanegativas y todas las bartonellas, excepto B.bacilliformis, son catalasa negativa. Bartonella spp.es un microorganismo bioquímicamente inerte, noutiliza azucares (fructosa, inositol, lactosa,maltosa, manitol, rafinosa, ni sucrosa) que seencuentran en la mayoría de las pruebasbioquímicas de identificación comercializadas.Además sus bases de datos son a menudoincompletas y no tienen la suficiente informaciónsobre este género. Los resultados de identificaciónde especies de Bartonella obtenidos con estossistemas no son ni concluyentes, ni fiables, niaceptables. Tras el análisis de diferentes estudioscomparativos entre los diferentes métodoscomercializados (RapID ANA II System, MicroScan

Rapid, Rapid ID 32 A) la única conclusiónaceptada es que solamente se pueden utilizar parauna identificación a nivel de género.2.3.2.5.2. Subcultivos y conservación de las cepas.Los subcultivos de estas bacterias no presentanningún problema, con un medio enriquecido consangre de cordero, incubadas a una temperatura,humedad y concentración de CO2 adecuadas seobtiene un buen crecimiento de la cepa. Estaspueden conservarse con un medio de congelaciónrico en nutrientes, tipo caldo brucella con un 10%de glicerol, y congeladas a –80ºC con el fin degarantizar un periodo más largo de supervivencia.

2.3.3. Serología2.3.3.1. Utilidad clínica. La detección de anticuerposespecíficos frente a Bartonella spp. para eldiagnóstico de esta infección evita losinconvenientes del largo periodo de incubación queprecisa el cultivo bacteriológico y la complejidad delas técnicas de biología molecular. Se han utilizadodiferentes técnicas serológicas: lainmunoperoxidasa, enzimoinmunoensayo (EIA) einmunofluorescencia (IFI). Esta última técnica, es lamás utilizada por su sensibilidad, especificidad y seconsidera la técnica de referencia. Estácomercializada, y en la actualidad se dispone de IFIpara la detección de B. henselae y B. quintana. Sepueden detectar inmunoglobulinas IgG (utilizadaspara el diagnóstico de la infección y para estudios deseroprevalencia) e IgM (anticuerpos específicos de lainfección aguda).2.3.3.2. Muestra, transporte y conservación. Lamuestra utilizada para realizar la detección deanticuerpos es el suero, que debe congelarse a –80ºC si no se va a realizar la técnica tras larecepción de la muestra.2.3.3.3. Procesamiento de la muestra. La técnica deIFI utiliza como antígeno bacterias de B. henselae yB. quintana. Para la detección de IgG se aconsejautilizar bacterias cultivadas en células Vero y fijadasen un portaobjetos, mientras que para ladeterminación de IgM se utiliza una suspensiónbacteriana procedente de cultivos en medio sólidos.Se realizará la técnica siempre teniendo en cuentalas recomendaciones del fabricante.2.3.3.4. Criterios de interpretación. El título del sueroes la dilución más alta que presenta reacciónpositiva. Las muestras obtenidas al inicio de lainfección pueden ser negativas, por este motivosiempre que se sospecha una infección porBartonella spp. es importante estudiar dos muestrasrecogidas en un intervalo de 15-21 días en paralelo(fase aguda y convaleciente) y observar unincremento o seroconversión de los títulos deanticuerpos (aumento de dos títulos). Se consideranpositivos los títulos >1/64. Si existe sospecha de endocarditis y el cultivo desangre es negativo, se deben tener en cuentamicroorganismos poco habituales como Coxiellaburnetii. En el caso de Bartonella spp. títulos de IgG≥800 por IFI son altamente predictivos deendocarditis.

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2.3.4. Métodos moleculares. Las técnicasmoleculares son útiles para la identificación de cepasaisladas, pero su papel es mucho más relevantecuando se trata de realizar un diagnóstico directo dela enfermedad en muestras biológicas.2.3.4.1. Identificación de cepas. Para identificar lacepa aislada primero se debe disponer de un cultivopuro de este microorganismo, posteriormente deberealizarse una extracción de ADN, existen en elmercado distintos métodos comercializados,QIAamp® ADN Mini Kit (QIAGEN GmbH, Germany),y kit de extracción de Ecogen entre otros Una vezrealizada la extracción el ADN podrá conservarse ennevera para una posterior PCR o podrá congelarse a–80ºC donde se mantiene estable durante un largoperiodo de tiempo. Existen en la actualidadnumerosas secuencias utilizadas para amplificar elgénero Bartonella y para poder diferenciar especies. Para la determinación del género Bartonella unade las secuencias más útiles es BhCS.781p yBhCS.1137n, que corresponden a un fragmento delgen de la citrato sintasa (gltA) de Bartonella spp.Para la diferenciación de las especies existe aúnmás variedad de secuencias, da buen resultadoutilizar los primers complementarios de la regiónintergénica del 16S-23S ARNr. Una vez realizada laPCR si es positiva para el género Bartonella, sepuede deducir la especie mediante su visualizaciónen el gel de agarosa y confirmar el resultado con lasecuenciación.2.3.4.2. Detección directa por PCR de muestrasbiológicas. Las técnicas moleculares son muy útilesen el diagnóstico directo de la infección porBartonella. Se pueden aplicar a biopsias o tejidossólidos y también se puede realizar amplificación deADN en sangre con EDTA. En los dos casos seprecisa un proceso previo de extracción de ADN, quese realiza con sistemas comercializados. El procesode amplificación es el mismo que el comentadoanteriormente para la identificación de cepas.

2.4. TRATAMIENTO Y PROFILAXISClásicamente la EAG no se trataba con antibióticos,sino que se utilizaban analgésicos para minimizar eldolor y se realizaba un seguimiento de los síntomasclínicos del paciente. Si precisa antibioterapia sesuele tratar con azitromicina (500 mg el primer día y250 mg los 4 restantes). Para las formas más graveses útil la asociación de doxiciclina (200 mg/día) yrifampicina (600 mg/día). La angiomatosis bacilarsuele tratarse con eritromicina (500 mg/6 horas)durante 3 meses o doxicilina (200 mg/día) durantetres meses. En el caso de la endocarditis se asociacon gentamicina (3 mg/kg/día) durante 14 días yazitromicina (250 mg/día) o doxiciclina (100 mg/día)durante 4-6 meses. En los casos de fiebre de lastrincheras y bacteriemia, los fármacosrecomendados son doxiciclina 200 mg/día oazitromicina 500 mg/día durante 4-semanas. Lafiebre de Oroya se trata con cloranfenicol ocefalexina durante 10 días y la verruga peruana conrifampicina 300 mg/12 h o ciprofloxacino 500 mg/díadurante 10 días.

Tan importante es realizar un buen tratamientoantibiótico de la infección como intentar evitar sucontagio. La profilaxis depende directamente de laerradicación de vectores transmisores de la infección(pulgas de gato y piojos), así como la administraciónde vacunas a animales domésticos (perros y gatos)para así poder disminuir la prevalencia de lainfección.

3. INFECCIONES POR RICKETTSIA SPP.3.1. INTRODUCCIÓN

El género Rickettsia está constituido por especiesde pequeños cocobacilos Gram negativospleomórficos, inmóviles y aerobios, que secomportan como patógenos intracelulares obligadosy están relacionados serológicamente. Se tiñenrazonablemente bien con los métodos de Giemsa,Castañeda y Giménez y débilmente con la tinción deGram.

Este grupo de bacterias representan una de lasmayores ironías biológicas conocidas hasta ahora.Por una parte, han sido causantes desde laantigüedad, y aún en nuestros días, del tifusepidémico, una de las plagas más devastadoras queha sufrido la humanidad; por otro lado, estudiosfilogenéticos indican que un antecesor evolutivo deuna rickettsia dio lugar a uno de los sucesos másimportantes en la evolución de los eucariotas: elorigen de las mitocondrias.

Las rickettsiosis constituyen un grupo deenfermedades zoonóticas de distribución geográficaheterogénea cuya severidad varía desde formasbenignas y autolimitadas a infecciones fulminantesde elevada mortalidad. La mayoría de los casos seadquieren por picadura de garrapatas, piojos opulgas que están infectadas por el microorganismo.El hombre es un huésped accidental en el ciclobiológico de las rickettsias en el que intervienendiversos mamíferos (reservorios) y artrópodos queno sufren, en general, daño por la presencia de labacteria y actúan como reservorios y/o vectores delmicroorganismo. Diversos mamíferos, esencialmentepequeños roedores, ganado y perros, contribuyen aperpetuar la infección y cerrar el ciclo biológico de labacteria. Un hecho de especial interés en relación ala epidemiología de las rickettsiosis reside en que ladistribución de una especie determinada, en general,coincide con la distribución de la garrapata vectora.Sin embargo, las bases de la asociación entredeterminadas especies de rickettsia y de garrapatasno se conocen en detalle. Así, mientras que ladistribución de la fiebre botonosa (FB) producidaprincipalmente por R. conorii, se asocia a ladistribución de Rhipicephalus sanguineus, R.rickettsi, causante de la fiebre de las MontañasRocosas, está asociada a ixódidos de distintosgéneros.

Hasta el año 1991 sólo se conocían cincoenfermedades rickettsiales. Desde entonces, graciasal desarrollo de los métodos de cultivo y de lastécnicas de biología molecular, se han descrito otrasmuchas ocasionadas por especies aisladas engarrapatas y consideradas hasta entonces no

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patógenas para el hombre. De hecho, entre 1984 y el2005 se han identificado 11 nuevas especies osubespecies de rickettsias consideradas por muchosautores como agentes emergentes. Así, entre losejemplos más ilustrativos destacan R. parkeri,considerada no patógena durante más de 60 años(en 2004 fue aislada a partir de la escara de unpaciente), y el caso de R. massiliae, cuyapatogenicidad, se ha demostrado 13 años despuésde su primer aislamiento de garrapatas. Por ello, enla actualidad la mayoría de los investigadoresconsideran potencialmente patógena a toda especieque se encuentra en un artrópodo capaz de picar apersonas. En cualquier caso, el impacto de estasenfermedades continúa siendo de gran interésdebido a su alta prevalencia en algunas áreas ytambién por su considerable mortalidad. Además, suimportancia ha aumentado recientemente debido asu potencial utilización como agresivos biológicos.

3.2. CLASIFICACIÓN Y CONSIDERACIONESCLÍNICASLos principales síntomas de una rickettsiosisaparecen entre los 6-10 días después de la picaduray se caracterizan por cefalea, erupciones máculo-papulares, dolores musculares, linfadenopatía local yuna o varias escaras en el punto de inoculación. Apartir del sitio de entrada del agente, la infección seextiende por la circulación venosa invadiendo elendotelio de capilares, venas y arterias donde semultiplica y produce una vasculitis más o menosgeneralizada. Si bien los principales signos clínicosvarían dependiendo de la especie implicada, losdaños tienen un mismo origen y derivan de lavasculitis por la multiplicación bacteriana en lascélulas endoteliales. Sin embargo, hay que tener encuenta que, además de la cepa causante de lainfección y del vector, puede influir el estadoinmunitario del paciente. La lesión vascular provocaun aumento de la permeabilidad capilar que favorecela extravasación de líquido intravascular (edema)pudiendo causar hipovolemia e hipotensión. En loscasos más severos las rickettsiosis suelen iracompañadas de edema pulmonar, neumoníaintersticial y erupción hemorrágica. También sepueden producir miopericarditis, meningitislinfocitaria y afectación hepática y gastrointestinal.Las alteraciones del sistema nervioso central suelenser relativamente frecuentes pudiendo provocardistintos cuadros clínicos como ataxia, afasia yhemiplejía. Algunas de estas alteraciones derivan enimportantes secuelas como sordera, pérdida devisión y paraplejía, entre otros defectos neurológicos.

Las rickettsias se clasifican en dos gruposatendiendo a las bases clínicas y a los agentesetiológicos responsables: el grupo de las fiebresmanchadas y el de las fiebres tíficas. Las especiesde ambos grupos presentan una distribucióndiferente en función del área geográfica y del tipo dehospedador y vector. Así, en América, la especiemás frecuente del grupo de las fiebres manchadases R. rickettsii, mientras que en la cuencamediterránea es R. conorii. A continuación se

detallan las especies más relevantes desde el puntode vista clínico-epidemiológico.

3.2.1. Grupo de las fiebres manchadas (GFM). Lasrickettsias pertenecientes al grupo de las fiebresmanchadas muestran una distribución mundial. Lamayoría se transmiten por garrapatas y están muyrelacionadas serológicamente. A continuación setratará sobre las especies más interesantes ennuestro medio bien por el cuadro clínico queproducen, aumento reciente de su área dedistribución y/o características epidemiológicas. R. conorii subespecie conorii La rickettsiosis más frecuente en nuestra área esla fiebre botonosa (FB), también llamada fiebreexantemática mediterránea cuyo agente causal es R.conorii. La enfermedad fue descrita por primera vezen Túnez en 1910, aunque hasta 1932 no se conocióel papel de R. sanguineus como vector. Ladistribución de la FB abarca el norte de África y elsureste de Europa, aunque se han descrito casos enel norte y centro de Europa y en Turquía. Un dato deinterés epidemiológico reside en que los casossuelen concentrarse en primavera y verano,correspondiendo al periodo de máxima actividad delvector. Tradicionalmente, R. conorii se consideramenos patógena que R. rickettsii, aunquerecientemente se ha constatado que las formasseveras de la fiebre botonosa alcanzan a un 6% delos pacientes, con una tasa de mortalidad del 2,5%.En general, la aparición de los síntomas tiene lugartras un periodo de 6 días de incubación. Lospacientes muestran fiebre alta, exantema y unaescara en el punto de inoculación. En los casosseveros se puede observar erupción petequial yproblemas neurológicos, renales y cardíacos. Actualmente se incluyen dentro del taxón de R.conorii subespecie conorii tres estirpes: la cepaSeven o Malish, Kenia y Marroquí. Recientemente, eldesarrollo de métodos de genotipado estápermitiendo caracterizar la bacteria en profundidad loque ha llevado a proponer la definición de lassubespecies que estaban agrupadas en el mismotaxón: R. conorii subespecie conorii, R. conoriisubespecie israelensis y R. conorii subespeciecaspia. R. conorii subespecie israelensis Los primeros casos se comunicaron a mediadosdel siglo pasado en Palestina y fueron aumentandoen paralelo al desarrollo de nuevos asentamientosrurales. El agente causal se aisló, por primera vez en1971 de un paciente y de ejemplares de R.sanguineus que parasitaban perros de pacientes.Primeramente se observó que el agente responsablepresentaba diferencias por inmunofluorescencia conotros miembros del grupo de las fiebres manchadas.En los últimos años se ha aislado en pacientes enPortugal y también se ha detectado de garrapatas enItalia, lo que parece indicar que su distribución esmás amplia de lo que en un principio se pensaba.Por otra parte, algunos estudios indican que laprevalencia de esta enfermedad está en aumento.Recientemente se han realizado estudios

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moleculares que evidencian que los aisladosisraelíes son muy homogéneos entre sí y diferentesde las cepas Malish y Marroquí de R. conorii. Todoello ha llevado a proponer la clasificación de esteagente como R. conorii subespecie israelensis. Adiferencia de la FB, en el llamado tifus exantemáticoisraelí no aparece escara en el punto de lainoculación sino una pápula rosácea, aunque sólo enel 7% de los casos. El periodo de incubación es deunos 7-8 días y los síntomas observados en todoslos pacientes son fiebre y exantema, aunque puedenaparecer también artralgias, mialgias, cefalea yvómitos. Se ha observado esplenomegalia yhepatomegalia en el 30-35% de los casos. En niñosy adultos con deficiencia en la glucosa-6-fosfatodeshidrogenasa se han descrito casos fatales yformas severas de la infección. R. rickettsii Es el agente causal de la fiebre manchada de lasMontañas Rocosas. En esta enfermedad Rickettsdescribió en 1909 los microorganismos que luegollevarían el nombre de Rickettsia en su honor.Genética e inmunológicamente, R. rickettsii muestrauna estrecha relación con otros miembros del GFM.La epidemiología de la enfermedad está relacionadacon la garrapata que infecta que actúa, al mismotiempo, como reservorio y vector. Diferentesespecies de ixódidos transmiten la enfermedad endistintas área geográficas: Dermacentor variabilis yD. andersonii en Estados Unidos, R. sanguineus enMéxico y Amblyomma cajennense en América delSur. Entre 1997 y 2002 se han comunicado 3.649casos a los Centros de Control y Prevención deEnfermedades de Estados Unidos (CDC). Conrespecto a la patogenia de esta bacteria, cabedestacar que, además de la ya citada invasión delendotelio con el consiguiente aumento de lapermeabilidad que origina edema, hipovolemia,hipoproteinemia e hipotensión, se produce unconsumo elevado de plaquetas que lleva a latrombocitopenia en el 50% de los casos. En el iniciode la enfermedad el cuadro clínico suele ser pocoespecífico, con un periodo de incubación de 7 días,aunque puede oscilar entre 2-14 días. Los síntomasmás frecuentes son malestar, fiebre, cefalea ymialgia. En el 25% de los casos aparececonjuntivitis, insuficiencia respiratoria grave, ictericiay afectación neurológica, que supone el principalfactor de morbilidad. Otras manifestaciones gravesincluyen fallo respiratorio y renal, miocarditis ynecrosis de dedos de manos y pies, lóbulo auditivo,etc. La tasa de casos fatales en pacientes notratados oscila entre 10-25%, existiendo casosfulminantes. En contraste con otras rickettsias delGFM, R. rickettsii generalmente no produce escaraen el lugar de la picadura. Además, en el 10% de lospacientes el exantema está ausente, lo que produceun retraso en el diagnóstico y tratamiento de laenfermedad. Otras rickettsiosis del grupo de las fiebresmanchadas de interés en nuestro medio R. sibirica subespecie mongolotimonae se aislópor primera vez en 1991 de ejemplares de

Hyalomma asiaticum recogidos en Mongolia y China.Se trata de una especie antigénica ygenotípicamente única dentro del GFM, por lo queinicialmente se propuso el nombre de R.mongolotimonae. Sin embargo, estudios moleculareshan evidenciado su cercanía al complejo R. sibirica.R. sibirica mongolotimonae fue aislada por primeravez en Francia en 1996 en un paciente hospitalizadoen marzo (mes atípico para una FB). El paciente notenía antecedentes de viaje y había sido picado porgarrapatas del género Hyalomma, presuntamenteintroducidas por aves migratorias. Posteriormente, sehan documentado nueve casos en Francia, dos enGrecia, dos en Portugal y uno en España con unaincidencia predominante entre los meses de marzo yprimeros de julio, lo que constituye una característicaespecífica de la infección. Entre los síntomasdetectados en varios pacientes destaca unalinfangitis que se extiende desde la escara deinoculación. Estos hechos, junto a la observación demúltiples escaras de inoculación, constituyenaspectos propios de la enfermedad lo que debe serconsiderado en el diagnóstico diferencial de lasrickettsiosis en Europa, África y Asia. R. akari produce la denominada viruelarickettsiósica y se transmite por el ácaro del ratónAllodermanyssus sanguineus. Fue descritainicialmente en Nueva York en 1946 yposteriormente en Sudáfrica, Corea y la antiguaUnión Soviética. El periodo de incubación es de 10días. El signo inicial es la aparición de una pápula enel lugar de la picadura que progresa a escara negra.A los 2-6 días del inicio de la fiebre, aparece elexantema, maculoso al principio y luego papular, encuyo centro se desarrolla una vesícula. El exantemamuestra infiltración epidérmica por célulasmononucleares. Los vasos sanguíneos se ven muyafectados, con trombos de fibrina y extravasación dehematíes. Es frecuente la adenopatía regional, fiebreremitente y cefaleas intensas. La erupción cutáneapuede confundirse con varicela, meningitismeningocócica, sarampión atípico u otrasrickettsiosis. No se han descrito casos fatales y lafiebre remite en una semana sin tratamiento. R. slovaca fue aislada por primera vez enChecoslovaquia en 1968 a partir de D. marginatum.Sin embargo no fue hasta 1980 cuando se produjo laprimera sospecha de que pudiese infectar apersonas. La tasa de infección en D. marginatus y D.reticulatus varía de un 1% a más de un 75% y sesabe que actúan como vectores y reservorios alpresentar transmisión transestádica y transovárica.La lesión en la zona de la picadura produce unaescara necrótica en el punto de inoculación rodeadade un halo eritematoso que se localiza,generalmente, en el cuero cabelludo, que es la zonadonde preferentemente estas garrapatas pican a laspersonas. El síntoma más significativo es elengrosamiento de los ganglios linfáticos, lo que hallevado a denominar esta rickettsiosis como TIBOLA(tick- borne lynphadenopathy) o también DEBONEL(Dermacentor-borne necrosis erithemalynphadenopathy). El espectro completo de la

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sintomatología de esta infección está aún pordeterminar, aunque existe la sospecha de quealgunos pacientes pueden sufrir trastornosneurológicos. El resto de los síntomas suelen sermoderados, aunque se pueden producir secuelas delarga duración como astenia y alopecia en la escara,que puede durar varios meses. Aunque el agentecausante de este cuadro clínico es R. slovaca, datosrecientes evidencian la presencia de otras especiesen D. marginatum, como R. raoultii, especie dereciente descripción que englobaría a las variantesRpA4 y DnS14, y Candidatus R. rioja entre otras, porlo que se hace necesario estudiar el papel quepuedan tener otras rickettsias en la etiología de lainfección. R. felis fue detectada por primera vez en pulgasde Ctenocephalides felis en 1918. Aunque supatogenicidad fue demostrada por primera vez en1991 en un paciente con una enfermedad febrilsemejante al tifus murino en Texas (EE.UU.) y nopudo ser cultivada y caracterizada hasta el año 2001,evidenciándose que sólo puede crecer a bajastemperaturas. Posteriormente en 2002, se infectarontres pacientes en México que sufrieron fiebre,exantema, dolor de cabeza y afectación del sistemanervioso central. Recientemente se han descritocasos en España, Brasil, Alemania y sudesteasiático. Además, en España, Francia, Reino Unido,Brasil, Argentina, Etiopía, Tailandia y Nueva Zelandase ha detectado en pulgas. Por el momento no seconocen en profundidad sus características clínicas ysu incidencia, pero los datos epidemiológicos(reservorio en animales peridomésticos), vector detransmisión y cuadro clínico similar al del tifus murinohacen pensar que un número importante de casosde fiebre de duración intermedia y también algunosde los diagnosticados como tifus murino podríandeberse a R. felis. R. aeschlimannii fue clasificada dentro del GFMen 1997, aunque había sido detectada previamenteen H. marginatum en Zimbabwe, Portugal, Mali yNíger. En 2002 se produjo el primer caso deinfección humana en un paciente que presentaba uncuadro clínico compatible con FB similar al causadopor R. conorii subespecie conorii. Por otra parte, enEspaña en 2003 se publicó un estudio de 144 casosde FB, y en 11 de ellos los pacientes presentaronmúltiples escaras. Teniendo en cuenta la bajaprevalencia de R. conorii en R. sanguineus ennuestro área y su baja afinidad para picar apersonas, se ha postulado que algunos de los casosde FB podrían haber sido causados por R.aeschlimannii. En 1993 se denominó R. massiliae a unarickettsia que había sido aislada, un año antes, apartir de R. sanguineus en Francia, y que mostrabadiferencias dentro del grupo de las fiebresmanchadas. Se ha detectado en Portugal, Grecia,España, Argentina y algunas áreas de África en otrasespecies de garrapatas del género Riphicephalus.En 1996 se detectó una variante llamada Bar29 enCataluña en R. sanguineus. Esta rickettsia pareceresistente a la rifampicina en cultivos celulares y de

hecho se ha constatado el fracaso terapéutico en ungrupo de niños diagnosticados de FB en Cataluña,en los que se había utilizado este antibiótico, lo quehace sospechar su implicación en enfermedadhumana en dicha zona. El primer caso humano fueconfirmado retrospectivamente en 2005 en Francia,en un paciente diagnosticado de FB en 1985 quepresentaba fiebre, escara en el punto de inoculación,erupciones máculo-papulares y hepatomegalia. Estudios medioambientales recientes llevados acabo en Castilla y León, zona endémica de FB,indican la presencia de R. massiliae en garrapatas.Este dato, junto a la baja presencia de R. conorii enR. sanguineus, de nuevo sugiere que algunoscuadros de FB podrían estar produciéndose porotras especies de rickettsias del GFM. R. monacensis fue aislada por primera vez en2002 a partir de Ixodes ricinus en un parque deBerlín. En España se han detectado rickettsiascercanas a R. monacensis y a las variantes IRS3 eIRS4 en la misma especie de garrapata, aunque nohan podido ser cultivadas. Recientemente se hadescrito en España por primera vez su papelpatógeno, en dos pacientes que presentabancuadros clínicos compatibles con FB. R. helvetica por el momento no puede serconsiderada patógena. Se aisló por primera vez en1979 a partir de I. ricinus recogidos en Suiza.Posteriormente se ha detectado en ixódidos enFrancia, Suecia, Bulgaria, España e Italia. Sudistribución no se limita a Europa, puesto quetambién se ha detectado en Japón. Todos los casosen los que se ha sospechado que R. helvetica era elagente etiológico de una infección se basan endiagnósticos serológicos. Por tanto, se precisaevaluar estos resultados en detalle, además decultivar la bacteria a partir de una muestra clínicapara confirmar su patogenicidad.

3.2.2. Grupo de las fiebres tíficas (GFT). Losrepresentantes de este grupo son dos: R. prowazekii,responsable del tifus exantemático epidémico y R.typhi, que produce el llamado tifus murino oendémico. Tifus exantemático epidémico La enfermedad producida por R. prowazekii seconoce desde el año 1083 y se transmite por el piojocorporal, Pediculus humanus variedad corporis. Elreservorio es el ser humano, en el que la infecciónpersiste durante los periodos entre las epidemias. Elvector se infecta al alimentarse de sangre de unpaciente con enfermedad aguda, excretandorickettsias por la heces durante 5-7 días. El hombrese infecta al contaminarse la picadura u otras heridassuperficiales de la piel con las heces o con el piojoaplastado sobre el sitio de la picadura. Tambiénse puede adquirir la enfermedad a través de lainhalación de heces secas de piojos infectados o porcontacto directo a través de las mucosas. En algunaszonas de Estados Unidos, las ardillas voladoras sonun reservorio y la pulga de la ardilla un vectorpotencialmente transmisor de la enfermedad alhombre. No se transmite directamente entre

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personas. En la actualidad, el tifus epidémico estácircunscrito a regiones montañosas del sur y centrode América, México, África Central y Oriental yalgunos países de Asia. La proliferación de piojos sepropicia en situaciones de catástrofe, hambruna,falta de higiene y hacinamiento, aumentando elriesgo de la enfermedad y favoreciendo la apariciónde brotes como los sucedidos después de la guerrade Burundi en 1997, en Rusia en el mismo año y enPerú en 1998. El cuadro clínico aparece tras un periodo deincubación de 10-14 días y se caracteriza por fiebrealta, escalofríos, cefalea, artromialgia y anorexia. El25-30% de los pacientes manifiesta tos seca,mareos, fotofobia, náusea, dolor abdominal yestreñimiento. El exantema suele aparecer en el 90-95% de los casos y comienza en el tronco a los 4-7días y se extiende a extremidades, habitualmenterespetando la cara, las palmas y plantas.Inicialmente es maculoso, rosado y desaparece conla presión, evolucionando a maculopapular de colormás rojizo y, posteriormente, a petequial y confluenteen los casos graves. En estos casos, durante laevolución pueden producirse meningoencefalitis,neumonitis, miocarditis e insuficiencia renal. Sueleexistir elevación ligera de las transaminasas y en lamitad de los casos anemia normocítica ynormocrómica, además de trombocitopeniamoderadas. La mortalidad es elevada y secorrelaciona con la edad, alcanzando un 60% enmayores de 50 años. Tifus murino o endémico En 1926 Maxcy estableció las diferencias entreesta zoonosis y el tifus epidémico. La enfermedad,causada por R. typhi, tiene una distribución mundialcon áreas endémicas extensas en los cincocontinentes. En España hay evidencias de laexistencia de casos en las provincias de Sevilla,Huelva, Murcia y las Islas Canarias. En 1931 se aislóel microorganismo de pulgas y cerebro de ratacapturadas cerca de pacientes afectados por laenfermedad. Muchos autores opinan que suimportancia clínica y sanitaria se ha subestimado yaque en la actualidad el tifus murino constituye unparadigma de enfermedad infecciosa emergente. Suimportancia a nivel mundial queda reflejada en laelevada frecuencia con que se detectan anticuerposespecíficos en diferentes estudios sero-epidemiológicos, oscilando entre 3-36%. En España,un estudio realizado en Sevilla, ha estimado unaincidencia del 7% como causa etiológica de la fiebrede duración intermedia, si bien parece que este datopodría estar subestimado, teniendo en cuenta laexistencia de casos de curso leve que son tratadosen atención primaria y que no se computan al nollegar a las consultas de los especialistas. Clásicamente, se ha considerado que losreservorios esenciales de R. typhi son las ratasperidomésticas Rattus rattus y R. norvegicus,actuando la pulga de rata Xenopsylla cheopis comovector. La pulga se infecta al ingerir sangre de ratasinfectadas. A continuación, la rickettsia se divide ensu intestino y es excretada por las heces, lo que

infecta a nuevas ratas a través de erosiones de lapiel que el animal se produce al rascarse. Además,las pulgas infectadas transmiten el microorganismopor vía transovárica a toda su descendencia. Latransmisión a humanos es accidental porcontaminación del lugar de la picadura o de lesionescutáneas con heces de la pulga. Recientemente seha constatado que la pulga de gato, Ctenocephalidesfelis, puede desempeñar un importante papel en elciclo biológico y en la transmisión de R. typhi. Lapresencia de casos en áreas donde no se handetectado ni ratas ni sus pulgas infectadas por estarickettsia, junto a la gran abundancia de gatos enmuchos hogares (sin olvidar que C. felis tiene granavidez por picar a personas) hacen queposiblemente nos encontremos ante un relevanteproblema de salud pública. La mayor parte de los casos se producen entremayo y octubre, que son los meses de mayoractividad de los vectores, aunque sólo un 3-30% delos pacientes refiere picadura de artrópodo en losdías previos a la enfermedad. El periodo deincubación oscila entre 7-14 días. Desde el punto devista clínico, los síntomas son bastante inespecíficose incluyen fiebre, exantema, artromialgia y cefalea.El exantema, que se produce en el 60-70% de loscasos dura una media de 4 días, es maculopapulosotenue y afecta al tronco y extremidades, respetandopalmas y plantas. Los casos graves han sidodescritos en el 2-4% de los casos. Otro aspectofrecuente del tifus murino es la alteración en labioquímica hepática con un alto porcentaje depacientes que muestran hepatolisis moderada. Sinembargo la hepatitis y la colestasis son menosfrecuentes. También se producen alteracioneshidroelectrolíticas en sangre como consecuencia deldaño microvascular (disminución de los niveles dealbúmina, potasio, sodio y calcio) y un alargamientoen los tiempos de coagulación, así comotrombopenia.

3.3. RECOGIDA DE LA MUESTRALa selección de las muestras dependerá en ciertamedida de la sintomatología del paciente, así como de lainfraestructura y capacidades disponibles en ellaboratorio de microbiología donde se vayan a procesar.Como regla general, se intentará obtener aquellas mássencillas y con métodos menos invasivos. En principio,las muestras más adecuadas para el diagnóstico de lasrickettsiosis son: suero, sangre con citrato, contenido depápulas o vesículas y biopsia cutánea de la escara deinoculación. En el caso de afectación neurológica,también se debe recoger LCR.

3.4. TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN DE LAMUESTRALas muestras remitidas al laboratorio deben cumpliruna serie de condiciones generales que van acondicionar, en cierta medida, la eficiencia y calidadde los resultados obtenidos. Estos requisitos son:selección de la muestra más adecuada y rentable,recogida en cantidad suficiente y de forma estéril y a

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ser posible antes del inicio del tratamientoantimicrobiano.Además, para realizar el mejor diagnósticomicrobiológico posible también resulta de vitalimportancia que la muestra se transporte encondiciones idóneas y, en el caso de que se vaya arealizar cultivo, que éste no se demore más allá de24 horas. Las muestras se deben recoger y enviar encontenedores estériles de un solo uso y con cierrehermético. En el caso de envío de muestras a centros dereferencia o investigación preparados para larealización de cultivos, la sangre debe enviarse a serposible el mismo día de la extracción y sin congelar.Si el envío no se va a realizar de manera inmediata,conviene congelar a −80ºC hasta su envío, que debellevarse a cabo en hielo seco para prevenir ladescongelación. Aunque hay pocos estudios sobre ladisminución de la viabilidad de las rickettsias atemperatura ambiente o por la acción de lacongelación-descongelación de la muestra, esconocida la dificultad de aislar estos agentes y, másaún, a partir de muestras en las que se demora elcultivo. También hay que tener en cuenta la pérdidade viabilidad por temperatura elevada (>37ºC),sobrecrecimiento de otras bacterias así como larefrigeración a largo plazo, factores que puedencomprometer el aislamiento. Menos requerimientosse precisan para el diagnóstico molecular, puestoque los ácidos nucleicos permanecen estables aúncuando la bacteria no es viable. Por tanto, en estoscasos las muestras se enviarán refrigeradas. Elsuero, al igual que las muestras que estánpotencialmente contaminadas con otro tipo debacterias (como muestras de piel) deben tambiénenviarse refrigeradas. El recipiente de recogida se identificará con losdatos del enfermo (nombre y localización), y debeprotegerse para que no se rompa en su transporte allaboratorio. Los envases para la recogida de las muestrasdependen del tipo de muestra que se va a recoger,siendo, en resumen:- Tubos estériles con tapón de rosca para sangre yLCR.- Frascos estériles de boca ancha con tapón derosca para fragmentos de tejidos, garrapatas, etc.- Torundas o hisopos de algodón estériles paratomar muestras de superficies corporales como lassecreciones de pápulas y máculas. Las muestras deben ir acompañadasobligatoriamente del volante de petición paraMicrobiología. En este volante debe hacerse constarla siguiente información: datos del paciente (nombrey apellidos, número de historia clínica, fecha denacimiento y sexo); datos clínicos y epidemiológicos(orientación diagnóstica, tratamiento antimicrobiano,enfermedad de base, antecedentes de interés comoviajes, picaduras, etc.) y datos del centro y médicosolicitante.

3.5. MANEJO DE LA MUESTRA EN SURECEPCIÓN EN EL LABORATORIO DEMICROBIOLOGÍA

Todas las muestras deben manejarse como situvieran microorganismos potencialmente peligrosos.Cuando una muestra se recibe en el laboratorio, yantes de procesarse, debe someterse a unainspección previa para asegurarse que ha sido bienseleccionada, recogida y transportada. Las muestrasse rechazarán en los siguientes casos: 1) muestra noidentificada, 2) transporte inadecuado o demasiadoprolongado, 3) muestra derramada, 4) cantidadinsuficiente o inadecuada. En todos estos casos secontactará con el médico solicitante para pedir unanueva muestra.

3.6. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRAEl tipo de procesamiento y los medios utilizadosdependen de las características de cada muestra. Enla tabla 4 se recogen las muestras necesarias para lamayoría de las técnicas de diagnóstico queactualmente se llevan a cabo en los laboratorios demicrobiología, indicando aspectos generales sobre larecogida, tiempo y temperatura de transporte yconservación.En términos generales, los procedimientos utilizadosson los habituales en el laboratorio de microbiología,si bien hay que tener en cuenta que, habitualmente,la carga microbiana en este tipo de infecciones esmenor que en el caso de otras bacterias. Esto obligaa recoger mayor cantidad de muestra para obtenerun rendimiento óptimo. Las muestras inaceptablesno deben procesarse y el médico responsable delpaciente debe ser informado inmediatamente.Los consejos generales para optimizar elprocesamiento de muestras son:

1. Comprobar que el etiquetado de la muestra escorrecto.2. Registrar toda la información necesaria quepudiera afectar a la calidad de la muestra y querepresente interés diagnóstico (aspecto, color,coágulos, etc.), así como aspectos relacionadoscon su recogida, transporte y conservación.3. Durante el procesamiento, deben seguirse todaslas medidas de seguridad necesarias, tanto para elpersonal como para la muestra.4. El procesamiento debe llevarse a cabo tanpronto como sea posible, más aún en el caso deque se persiga el aislamiento del agente,garantizando de esta forma la viabilidad.

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Tabla 4. Muestras necesarias para el diagnóstico de las rickettsiosis.

MUESTRA RECOGIDATRANSPORTE

Tiempo ytemperatura

CONSERVACIÓNTiempo y

temperatura

PRUEBADIAGNÓSTICA NOTA

Suero Tubo con tapón de rosca <24 h, 2-8°C +24h, -20°C IFI1

Sangre conEDTA

Recoger en tubo con EDTA < 24 h, 2-8 ºC. +24h, -20°C PCR2 El EDTA3

dificulta elcultivo

Sangrecitratada

Recoger en tubo con citrato < 24 h, 2-8 ºC. +24h, -60/-80°C(no variasdescongelaciones)

PCR, Cultivo4

Sangreheparinizada

Recoger en tubo conheparina

< 24 h, 2-8 ºC. +24h, -60/-80°C(no variasdescongelaciones)

Cultivo Laheparina5

puedeinhibir laPCR

LCR Recoger en tubo estéril < 24 h, 2-8 ºC. +24h, -20°C PCRBiopsiacutánea

Se recomienda asepsia enla toma de la muestra.Colocar el tejido en un tuboo frasco estéril con suerofisiológico estéril paraprevenir la desecación

<24 h, 2-8°C +24 h, -20°C Microscopía6

PCRMuestra dela escaradeinoculación

Contenido depápulas/máculas

Recoger en tubo/torundaestériles

<24 h, 2-8°C +24 h, -20°C PCR

1Inmunofluorescencia indirecta. 2Reacción en cadena de la polimerasa. 3El EDTA levanta la monocapa de célulasVero dificultando el cultivo. 4Muy laborioso, se requiere personal especializado e instalaciones con nivel deseguridad 3, por lo que sólo se realiza en laboratorios de referencia e investigación. 5Evitar el uso de heparinapara muestras en las que se vaya a realizar diagnóstico molecular, puesto que este anticoagulante puede inhibir laPCR. 6Previa tinción de tejido infectado, incluyendo la lesión de inoculación, por el método de Giménez.

3.7. CULTIVOS. SELECCIÓN DE MEDIOS YCONDICIONES DE INCUBACIÓN Para el cultivo de las rickettsias del GFM serequiere medio MEM (Minimum Esencial Medium)sin antibiótico suplementado con suero bovino fetal(SBF) al 10% (concentración final, CF), 2 mM deglutamina CF y 0,2% (CF) de aminoácidos noesenciales. La incubación de los cultivos se lleva acabo a 33-35ºC en ausencia de CO2. Para R. typhise requiere el mismo medio suplementado con SBFal 2% (CF). El diagnóstico definitivo de las rickettsiosisrequiere el aislamiento e identificación de la especiea partir del cultivo, lo que supone con frecuencia,varios días o semanas de espera. El cultivo de llevaa cabo en células Vero E6 o fibroblastos L92. Elefecto citopático producido no es muy característiconi específico de especie y, aunque puede aparecer alas 24-48 h post- inoculación, generalmente senecesitan 5-7 días para su desarrollo. El cultivo sepuede acelerar si se inocula la muestra sobre unamonocapa de las células susceptibles previamentecrecidas sobre un portaobjetos circular (shell vial,SV), seguida de una centrifugación. Después de 5-7días de incubación se procede a detectar lapresencia de la bacteria mediante tinción deGiménez, IFI con anticuerpos específicos o PCR.Este procedimiento resulta muy laborioso, serequiere personal especializado e instalaciones con

nivel de seguridad 3, por lo que sólo se realiza enlaboratorios de referencia o investigación. Además,el principal problema es su baja sensibilidad por loque se recomienda no realizar este procedimiento enel caso de muestras procedentes de pacientes quehayan comenzado un tratamiento antibiótico.. Porello resulta un procedimiento no rutinario que debehacerse sólo en casos seleccionados. Sin embargo,es la técnica diagnóstica más específica,fundamental para la obtención de antígenos, paraestudiar la sensibilidad a los antibióticos y en ladeterminación de las especies de Rickettsiapredominantes en un área determinada.

3.8. CRITERIOS PARA INTERPRETACIÓN DERESULTADOS Hay que tener en cuenta que la serología estálimitada por las reacciones cruzadas entre el grupode las fiebres manchadas y las del grupo tifus. La IFIes una de las técnicas más sensibles y la másampliamente utilizada en la actualidad para eldiagnóstico de las rickettsiosis exantemáticas, yaque permite la detección por separado, de lasdiversas inmunoglobulinas, lo que ayuda adiferenciar entre infecciones recientes y pasadas. Serealiza utilizando un sustrato antigénico inactivadocon calor. Estos antígenos están comercializados,estandarizados y prefijados en los portaobjetos sobrelos que se añaden diluciones seriadas del suero del

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paciente. La detección de anticuerpos en el suero delpaciente se realiza mediante una reacción antígeno–anticuerpo que se revela con una antiglobulinahumana marcada con fluoresceína, que permite lavisualización de los microorganismos mediantemicroscopio de fluorescencia. Todas lasinmunoglobulinas se positivizan tardíamente, a partirde la primera semana de comienzo de los síntomas.La confirmación del diagnóstico requiere detectaruna seroconversión, que se produce en la fase deconvalecencia, entre la tercera y cuarta semana.Para una correcta interpretación de los resultados deserología, se deben tener en cuenta los datos dereactividad basal de la población en zonasendémicas. Como técnicas experimentales, para evitar lareactividad cruzada, en algunos casos se utilizanensayos de inmunobloting con sueros sometidos aabsorciones con antígenos heterólogos. Este métododa como resultado un considerable aumento de laespecificidad si bien tiene una baja sensibilidad. Las técnicas moleculares, como la PCR,permiten un diagnóstico rápido y específico aldetectar DNA de rickettsia en tejidos infectados,cultivos y garrapatas.

3.9. PROCEDIMIENTOS ADICIONALES AREALIZAR EN SITUACIONES ESPECIALES En el curso de los cuadros clínicos causados porR. prowazekii, que produce el tifus epidémico, enocasiones se puede producir infección pulmonar.Hay que tener en cuenta que este microorganismopresenta una especial peligrosidad en su manejo yque es responsable de infecciones adquiridas en ellaboratorio, si bien R. prowazekii puede serinactivada por los desinfectantes habituales. Por ello,el procesamiento de las muestras sospechosas(pulmón, bazo, ganglios linfáticos), en las que hayuna concentración de organismos mayor a la de lasangre, requiere medidas de bioseguridad del nivel 3y personal preparado. En los laboratorios clínicos serecomienda realizar pruebas serológicas de suerospareados. En la separación del suero a partir de lasangre es necesario tener un especial cuidado paraevitar la producción de aerosoles durante lamanipulación. Dada la peligrosidad que implica eltrabajo con microorganismos vivos, el intento deaislamiento o la detección por inmunofluorescenciadirecta deben limitarse y las muestras post-mortemde los casos fatales deben enviarse a un laboratoriode referencia. En algunos casos puede resultar interesante elestudio de la sensibilidad a antimicrobianos, asícomo la aplicación de técnicas de tipificaciónmolecular aunque, debido a las características deestos agentes, quedan reservadas para estudios deinvestigación.

3.10. INFORMACIÓN DE RESULTADOSEl microbiólogo ha de conocer la situación clínica delpaciente en estudio para realizar una adecuadainterpretación con los datos disponibles. Ellaboratorio de microbiología debe emitir un informe

donde se expongan las técnicas realizadas y lainterpretación de los resultados obtenidos, sobretodo cuando aparezcan resultados dudosos o dedifícil explicación. La interpretación de los resultados serológicos sedebe hacer a la luz de los datos clínicos y de lautilización simultánea otras técnicas para aumentarla sensibilidad diagnóstica. Más aún teniendo encuenta la reactividad cruzada entre las distintasespecies de Rickettsia. Cuando se notifica un resultado de PCR negativose debe tener en cuenta que, en ocasiones, la cargabacteriana en algunas muestras suele ser muy baja ypor tanto los métodos moleculares pueden no sersuficientemente sensibles por lo que un resultadonegativo no descarta una infección. Los cultivos en los que se aíslan contaminantesde la microbiota comensal del área anatómica deestudio se informarán como “microbiota comensal osaprofita”. Los cultivos sin aislamiento se informarán como"no se aíslan microorganismos".

3.11. TÉCNICAS RÁPIDAS DE DIAGNÓSTICO. Las muestras de tejidos pueden examinarsemicroscópicamente mediante tinción de Giménez,que permite visualizar las rickettsias pero nodiferencia a nivel de especie ni tampoco de otrosmicroorganismos por lo que su detección suele serdudosa en muchos casos. Las técnicas moleculares son un instrumentovalioso para el diagnóstico etiológico de lasrickettsiosis, ya que pueden detectar en poco tiempogenoma de todos los patógenos potenciales, nodependiendo de la viabilidad del microorganismo.Estas técnicas se ven menos afectadas que loscultivos por los tratamientos antibióticos previos,aunque también disminuyen la sensibilidad, y laobtención de los resultados es mucho más rápida.Además, se pueden realizar en muestras obtenidaspor técnicas no invasivas (LCR, sangre, linfocitos desangre periférica, plasma, suero) y tienen altasensibilidad y especificidad. Por el momento, lamayor parte de las técnicas descritas son dedesarrollo propio (in house), y no estáncomercializadas. Los genes más comúnmenteanalizados son los que codifican dos proteínas de lamembrana externa: rOmpA (presente en todas lasespecies excepto R. helvetica, R. australis, R. bellii yR. canadensis) y rOmp B (presente en todas lasespecies excepto R. helvetica, R. bellii y R.massiliae). También se utilizan el gen gltA, quecodifica la citrato sintetasa (válido para todas larickettsias), el gen que codifica la proteína de 17-kDa(válido para todas las rickettsias del GFM) y el gen D(válido para la mayoría de las especies).Recientemente, se ha desarrollado una PCR-RLB[RLB (del inglés reverse line blotting)] que utilizacomo diana el espacio intergénico 23S-5S ARNr que,junto a una hibridación en fase reversa utilizandosondas especie-específicas, permite la identificaciónde la especie implicada sin necesidad desecuenciación. Este método es altamente sensible y

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específico, tanto para muestras clínicas comoambientales. Cuando se desee una mayorsensibilidad, hay que recurrir a PCR anidadas yposterior hibridación en fase reversa. Además,recientemente se ha desarrollado la tecnología dePCR a tiempo real que permite la obtención deresultados en muy poco tiempo (menos de unahora). Todas estas ventajas hacen que la PCR sepresente como la prueba ideal para el diagnóstico deestas infecciones, aunque existen algunasdesventajas, como son la limitación para realizarpruebas de sensibilidad a los antibióticos y laimposibilidad de coleccionar los aislados para futurasinvestigaciones. Quedan por establecer algunosparámetros antes de incorporar estas pruebas a losprotocolos de diagnóstico clínico, como por ejemploel tipo de muestra óptima, control interno deinhibición, sensibilidad, especificidad yreproducibilidad de la técnica. Estas razones hacenque, generalmente, el tratamiento de las rickettsiosisdeba iniciarse sobre la base proporcionada por datosclínicos-epidemiológicos.

3.12. PROCEDIMIENTOS NO ACEPTABLES En el diagnóstico no se deben utilizar ensayosfabricados en el propio laboratorio que no esténvalidados y por tanto no garanticen la adecuadacalidad de los resultados obtenidos. Se deben seguirlas instrucciones del fabricante en los ensayoscomerciales y, en caso contrario, se deben notificarlos cambios que se produzcan en el procedimientonormalizado de trabajo. No se deben aceptarinformes que no sean inteligibles para el clínico oaquellos en los que no quede reflejado claramente eltipo de ensayo que se ha realizado y su correctainterpretación.

4. ENFERMEDAD DE WHIPPLE4.1. INTRODUCCIÓN E HISTORIALa enfermedad de Whipple (EW) es una infecciónmultisistémica poco frecuente, causada por labacteria Tropheryma whipplei. La enfermedad tieneun curso crónico e insidioso y se manifiesta con unagran variedad de síntomas poco específicos entre losque destacan: fiebre, pérdida de peso, diarrea, dolorabdominal, artritis, hiperpigmentación de la piel yadenopatías. Se han descrito también la afectacióndel sistema nervioso central, endocarditis y uveitisasociadas o no a síntomas gastrointestinales.

Sin tratamiento antibiótico tiene una evoluciónfatal. Se han recomendado varias pautas,principalmente empleando tratamientos prolongadoscon fármacos que atraviesen la barrerahematoencefálica como el cotrimoxazol, para evitarlas recurrencias asociadas a la afectación delsistema nervioso central, aunque por el momento, nohay recomendaciones específicas de tratamiento.

El diagnóstico clínico de esta enfermedad puedeser complejo, dada la amplia variedad de síntomasque se pueden presentar. Al no existir ningún signoni síntoma específico, la confirmación del diagnósticomediante pruebas de laboratorio es fundamental.Normalmente, se ha realizado en los laboratorios de

anatomía patológica mediante la visualización deinclusiones PAS-positivas, diastasa-resistentes en elinterior de macrófagos, que presentan un aspectoespumoso en muestras de biopsias intestinales o deotros tejidos afectados. Actualmente, se empleanestas técnicas asociadas a las de biología molecularbasadas en PCR, que permiten detectar fragmentosdel ADN de T. whipplei en distintas muestras y asíestablecer el diagnóstico etiológico.

La EW fue descrita en 1907 por el patólogoGeorge Hoyt Whipple, como una “lipodistrofiaintestinal”. En 1950, se describió la presencia demacrófagos espumosos con inclusiones PAS-positivas y diastasa-resistentes en biopsias depacientes con la enfermedad. Estas inclusiones hansido consideradas largo tiempo, como diagnósticasde la enfermedad. Durante años, se sospechó unacausa infecciosa, que no se pudo demostrar hastaque en 1961 se observó por microscopía electrónica,la presencia de bacterias con forma bacilar en elinterior de macrófagos de la mucosa intestinal de unpaciente afectado por la enfermedad, lo querepresentó el primer dato objetivo de una posiblecausa bacteriana.

En 1991 el empleo de PCR universal del gen 16SARNr en una muestra de biopsia duodenal de unpaciente que padecía la enfermedad, permitiódetectar una bacteria desconocida perteneciente algrupo de los actinomicetos. En 1992 se diseñó unaPCR específica para su detección y se propuso elnombre de Tropheryma whippelii al reconocer que setrataba de un microorganismo no descrito. En 2000,se consiguió finalmente cultivar la bacteria encultivos celulares complejos, se describióformalmente como especie y se latinizó su nombre,quedando como Tropheryma whipplei.4.1.1. Descripción de Tropheryma whipplei. Sunombre deriva del griego trophe (alimentación),eryma (barrera) y del apellido de la primera personaque describió la enfermedad. La secuenciación del gen que codifica para elARN ribosómico 16S de T. whipplei ha demostrado,que pertenece al grupo de los actinomicetos y quetiene un alto contenido de G+C en su ADN. Se tratade un bacilo Gram positivo aerobio de unos 0.2 x 2µm, que tiene una delgada pared celular, rodeada deuna membrana externa que le da un aspectotrilaminar al microscopio electrónico. La bacteria nose tiñe bien con la tinción de Gram en tejidos yaparece como Gram negativa cuando se tiñe a partirde cultivos celulares. Durante años, se ha considerado como unmicroorganismo no cultivable ya que a pesar denumerosos esfuerzos, la bacteria no se pudo cultivarhasta el año 2000, en que se consiguió en medioscelulares con líneas de fibroblastos humanos,comprobándose que tiene un tiempo medio deduplicación de unos 18 días. El cultivo de la bacteria ha permitido lasecuenciación de su genoma completo y se hacomprobado que T. whipplei tiene un genomareducido (< 1Mb) y que carece de rutas debiosíntesis de varios aminoácidos y carbohidratos, lo

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que determina que necesite adquirir estos nutrientesy de ahí su dificultad para crecer en cultivosconvencionales. A partir de este descubrimiento, seha diseñado un medio sintético para su cultivo dondela bacteria crece extracelularmente. Sin embargo,actualmente sólo se ha conseguido en laboratoriosde investigación muy especializados y aún pareceestar lejos su incorporación a los laboratorios dediagnóstico microbiológico. El estudio por PCR de la región ITS 16S-23S(internal transcribed spacer) y del dominio III del genque codifica para el 23S ARNr de varias cepasdescritas, ha demostrado cierta heterogeneidadentre ellas que se ha empleado para su tipado,describiéndose 4 genotipos. Se ha especulado, quelas distintas variantes podrían distribuirsegeográficamente de forma diferente y estarrelacionadas con la zona de adquisición de laenfermedad, pero hasta ahora no se ha descrito unarelación entre genotipos y síntomas o gravedad de laenfermedad. Se ha considerado que T. whipplei es unmicroorganismo intracelular obligado, pero estudiosrealizados con sondas de hibridación fluorescentes ymicroscopia confocal han demostrado que se puedelocalizar en el interior o entre las células de la laminapropia intestinal. En los cultivos celulares semultiplica activamente en el interior de las células,pero sobrevive tanto intracelular comoextracelularmente, lo que indicaría que no es unpatógeno intracelular estricto. En sangre periférica,circula en el interior de las células mononucleares (loque explica su carácter multisistémico).

4.2. MANIFESTACIONES CLÍNICASLa EW se ha considerado tradicionalmente comouna enfermedad gastrointestinal aunque no en todoslos casos descritos es así, ya que hasta un 15% delos pacientes no presenta, en el momento deldiagnóstico, los síntomas gastrointestinalesconsiderados típicos (Tabla 1).La forma clásica de la enfermedad, se caracterizapor un periodo prodrómico asociado a artralgiasmigratorias, poliartritis y fatiga seguidas por unsíndrome progresivo de dolor, distensión abdominal,malaabsorción y diarrea que conducen a una pérdidade peso severa. En un 65-95% de los pacientes, lasmanifestaciones gastrointestinales suelen estarprecedidas en varios años por síntomas articulares,que no suelen hacer sospechar la enfermedad, loque da lugar a un retraso diagnóstico de hasta 5años desde el comienzo de los síntomas. Sintratamiento, la EW se asocia a numerosasremisiones y recaídas, con empeoramiento gradualque puede conducir a una caquexia severa, a laafectación de múltiples órganos incluido el SNC yque finalmente conduce a la muerte del paciente. Enla mayoría de los casos, los síntomasgastrointestinales son los que conducen aldiagnóstico y suelen manifestarse por episodios dediarrea acuosa con esteatorrea (asociada a lamalaabsorción intestinal), dolor abdominal tipo cólicoy distensión abdominal. En un 52% de los pacientes

Tabla 5. Principales manifestaciones clínicas de laenfermedad de Whipple.

Manifestaciones Clínicas

Frecuentes (90-50%) Pérdida de peso Diarrea Dolor Abdominal Artralgias Artritis Fiebre de bajo grado Adenopatías Hiperpigmentacion de la pielMenos frecuentes

SNC (20-30%) Cambios cognitivos, demencia Nivel de conciencia alterado Manifestaciones hipotalámicas Mioclonias Ataxia Miorritmia oculomasticatoria Miorritmia oculofacial

CARDIOVASCULARES (35-65%) Endocarditis Pericarditis Miocarditis

OFTALMOLÓGICAS (5-15%) Uveitis Retinitis Queratitis Neuritis óptica Edema de papila Vitritis

PULMONARES (30-40%) Tos Derrame pleural

las manifestaciones se acompañan de la presenciade adenopatías periféricas o retroperitoneales quepueden ser de gran tamaño y en ocasiones seconfunden con linfomas. La fiebre es otro de lossíntomas considerados clásicos pero, suele estarpresente sólo en un 40-60% de los casos publicados.Suele ser de bajo grado y presentarse asociada asudoración nocturna. La fiebre puede aparecer comosíntoma aislado o junto a las manifestacionesgastrointestinales o articulares. La hiperpigmentaciónde la piel es otro de los síntomas que se ha asociadotradicionalmente a la enfermedad. Aparece en un 40-60% de los casos descritos y suele ser responsablede que la enfermedad se confunda con el síndromede Addison. Las manifestaciones articulares se handescrito entre el 65-90% de los pacientes yconstituyen la afectación extraintestinal másfrecuente. En la mayoría de los casos, se asocian alas manifestaciones gastrointestinales clásicas,

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aunque pueden aparecer aisladas y confundirse conenfermedades reumatológicas. También puedenaparecer mialgias asociadas. Los cambiosdestructivos de la articulación son raros. Laafectación vertebral es infrecuente y suele apareceren forma de espondilitis y sacroileitis. La alteraciónneuronal del SNC se ha descrito entre el 20-30% delos pacientes, aunque en estudios post-mortem seha encontrado hasta en un 91% de los casos. Elestudio por PCR o tinción de PAS del LCR hapermitido detectar la bacteria en un elevadoporcentaje de casos, incluidos los que cursan sinmanifestaciones de SNC. La afectación del SNCpuede ocurrir principalmente en tres circunstancias:lo más frecuente son las recaídas después deltratamiento antibiótico de alguna de las otrasmanifestaciones de la enfermedad, con menorfrecuencia aparecen junto con las manifestacionesgastrointestinales o articulares y rara vez aparecenaisladas como la primera o única manifestación (20%de los pacientes presentan alteraciones neurológicassin afectación de otros órganos). Lasmanifestaciones neurológicas pueden ser muyvariadas y confundirse con muchas otrasenfermedades neurológicas. Entre el 50-70% de lospacientes con afectación del SNC presentandeterioro cognitivo, demencia, nivel de concienciaalterado y oftalmoplejia supranuclear. Con menorfrecuencia pueden aparecer manifestacioneshipotalámicas, ataxia o convulsiones. Alrededor del20% de los pacientes, presentan miorritmiaoculomasticatoria y miorritmia oculofacial (queconsisten en movimientos lentos y rítmicos de losmúsculos faciales) que se han consideradopatognomónicas de la enfermedad. El pronóstico dela enfermedad para los pacientes con afectación delSNC es malo, su supervivencia a los 4 años deldiagnóstico es menor del 25%, tienen más recaídasy en muchos casos presentan grandes secuelas. La afectación cardiaca es frecuente y se hadescrito entre el 20-70% de los pacientes quepresentan la forma clásica de la EW. Puedepresentarse en forma de pericarditis, miocarditis ocon mayor frecuencia endocarditis con hemocultivosnegativos, que suele requerir el recambio valvular.Hasta el momento, se han descrito unos 20 casos deendocarditis infecciosa causada por T. whipplei, ysólo unos pocos se presenta como únicamanifestación de la enfermedad. La afectaciónpulmonar ocurre entre un 30-40% de los pacientes yen un 14% suele haber derrame pleural. Lospacientes describen tos crónica no productiva, dolortorácico y tienen disnea y poliserositis. Entre el 5% y15% de los pacientes con enfermedad de Whipplepresentan afectación ocular, siendo la principalmanifestación la uveitis anterior o posterior y enocasiones vitritis, queratitis, neuritis óptica o edemade papila. Estas manifestaciones suelen aparecerasociadas a las manifestaciones neurológicas ogastrointestinales. En otros pacientes lasmanifestaciones son aún menos específicas yrecuerdan a la sarcoidosis, linfomas, enfermedadesgranulomatosas o simplemente aparecen como

fiebre de origen desconocido. El sistema endocrino ygenitourinario rara vez se ven afectadas por laenfermedad.

4.3. TRATAMIENTOSin tratamiento antibiótico la enfermedad tiene unaevolución fatal. Por el momento, no hay ensayosclínicos ni estudios comparativos y prospectivossobre su tratamiento. Las recomendaciones actualesse basan en series retrospectivas de casos tratadosde forma empírica. Actualmente, se encuentra enmarcha el primer el primer ensayo clínico que evalúala utilidad del tratamiento inicial con ceftriaxona omeropenem seguido de cotrimoxazol y que reclutapacientes de todo el mundo(http://www.whippledisease.info). El tratamiento antibiótico se debe encaminar nosólo a tratar la enfermedad en el momento deldiagnóstico, sino también a evitar las recidivas (2-33% de los casos en el plazo de unos 5 años) queafectan principalmente al SNC y que se asocian amal pronóstico. Por tanto, se deben emplearantibióticos que atraviesen la barrera hemato-encefálica, aún en ausencia de manifestacionesneurológicas. Hasta 1970, las tetraciclinas eran el fármaco másusado, pero se han asociado a un elevado númerode recidivas sobre todo en el SNC, ya que noatraviesan la barrera hematoencefálica. Se harecomendado comenzar con un tratamientoparenteral de 2 semanas de duración con ceftriaxona(2g/día) o penicilina G (1.2 millones de U/día)asociada a estreptomicina (1g/día), seguido de untratamiento oral de al menos un año contrimetroprim-sulfametoxazol (160 mg/800 mg 2 vecesal día). Como tratamiento alternativo en la fase inicialse pueden emplear imipenem o meropenem y en lafase de tratamiento oral penicilina V, cefixima,doxiciclina, rifampicina o cloramfenicol. No se harecomendado el empleo de corticoides. En algunospacientes hay recurrencias a pesar del tratamiento yse ha publicado la utilidad de asociar interferón-γ altratamiento antibiótico. Recientemente, se hasugerido la utilidad de tratar con doxiciclina asociadaa hidroxicloroquina, para erradicar el reservoriointracelular de la bacteria en pacientes sin afectacióndel SNC (indicado por PCR’s negativas en LCR). Sihay afectación del SNC, se deben añadir dosis altasde sulfametoxazol o sulfadiazina. En pacientesalérgicos a beta-lactámicos se puede emplear en lafase inicial cotrimoxazol (3 veces/día) asociado aestreptomicina (1 g/día) durante 2 a 4 semanas ycontinuar con trimetroprim-sulfametoxazol 2 veces aldía durante al menos un año. En pacientes alérgicosa las sulfamidas se puede sustituir el cotrimoxazolpor doxiciclina (100 mg, 2 veces/día) asociado ahidroxicloroquina (200 mg, 3 veces/día). Enendocarditis infecciosa se ha recomendadoprolongar el tratamiento parenteral durante 4-8semanas y se suele requerir el recambio valvular.Cuando hay afectación del SNC o recurrencia seemplea la misma pauta, pero si se usa penicilina Gse incrementa la cantidad a 4 MU y se continúa con

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trimetroprim-sulfametoxazol dos veces al día duranteal menos un año. Los primeros estudios de sensibilidad de labacteria se han realizado recientemente en cultivoscelulares, en medios sintéticos y por deducciónmediante estudios moleculares. En cultivo celular labacteria es sensible a doxiciclina, cotrimoxazol,rifampicina, penicilinas, macrólidos, y teicoplanina.La sensibilidad al imipenem es variable y esmoderadamente sensible o resistente a vancomicina,cefalosporinas y fluorquinolonas. Sin embargo, enmedios sintéticos aparece como sensible afluorquinolonas, cefalosporinas y vancomicina. Delanálisis del genoma de la bacteria se deduce que esresistente a trimetroprim al carecer de la ruta desíntesis de su diana (dihidrofolato-reductasa). En la mayoría de los pacientes el tratamientoantibiótico conduce a una rápida mejoría de lossíntomas. La PCR se hace negativa a las dossemanas del inicio del tratamiento, mientras que latinción de PAS que tarda más en responder. Se harecomendado la realización de PCR’s seriadas enbiopsias duodenales y LCR para el seguimiento de larespuesta al tratamiento.

4.4. EPIDEMIOLOGÍA Y PATOGÉNESISLa EW es poco frecuente y por el momento no seconoce su incidencia real. Afecta principalmente avarones de mediana edad, raza blanca y origeneuropeo y parece ser más frecuente en personas deorigen rural. Actualmente, se sabe poco del mecanismo deadquisición y del hábitat de T. whipplei. Se cree queestá ampliamente distribuida en el medio ambiente eincluso se ha detectado en aguas residuales. Se hapostulado una ruta de adquisición oral y una ciertapredisposición genética de los pacientes ya que, labacteria es ubicua pero se dan pocos casos de laenfermedad. La asociación con la presencia delHLA-B27 no ha podido comprobarse y se hapostulado la presencia de defectos en la inmunidadcelular de células T o en la fagocitosis y la capacidadde degradación intracelular de los macrófagos (queserían muy específicos de la inmunidad frente a T.whipplei y que no predisponen a la infección conotros microorganismos).

4.5. DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICOLos métodos basados en PCR son por el momento,los únicos abordables en laboratorios de diagnósticomicrobiológico que permiten confirmar que unaenfermedad está causada por T. whipplei ya que, elcultivo y la serología sólo están disponibles enlaboratorios de investigación y la microscopíaelectrónica no es fácilmente abordable. Las técnicasde PCR son actualmente necesarias para confirmarel diagnóstico presuntivo realizado por histología ysobre todo, son imprescindibles en los casos que sepresentan con histología negativa o conmanifestaciones clínicas poco usuales. La primera caracterización de la bacteria serealizó por PCR con iniciadores universales paradetectar el gen que codifica para el ARN ribosómico

16S asociada a secuenciación, directamenterealizada en una biopsia intestinal de un pacientecon sospecha de enfermedad de Whipple. Este tipode estrategia es útil cuando se sospecha unaetiología bacteriana, la infección puede estarcausada por varias especies diferentes y además sedispone de una muestra de un tejido o liquidonormalmente estéril. En este caso, la detección de T.whipplei puede ser un hallazgo casual nosospechado y ha demostrado ser muy útil en lainvestigación de casos de endocarditis infecciosacon hemocultivos negativos. Sin embargo, este tipode técnicas tienen como principal desventaja sufacilidad de contaminación y su escasa sensibilidadanalítica, por lo que cuando se sospecha laenfermedad, es mejor emplear técnicas de PCRespecíficas y sólo emplear técnicas de PCRuniversal cuando no exista seguridad sobre laetiología de la infección. El cultivo de la bacteria y la secuenciacióncompleta de su genoma ha permitido el diseño denumerosas técnicas de PCR para su detección(Tabla 2), pero por el momento no existe ningúnconsenso sobre cual es la más sensible y específicapara detectar la bacteria en distintos tipos demuestras.

4.5.1. Obtención y conservación de las muestras.Al ser una enfermedad multisistémica las muestras arecoger dependerán en gran medida de los órganosafectados o las manifestaciones clínicas quepresente el paciente. Se debe realizar conjuntamenteun estudio histológico con tinción de PAS ymicrobiológico con técnicas de PCR específicas paradetectar T. whipplei. Las muestras más rentables son las biopsias deórganos afectados (duodenal, adenopatías, válvulascardiacas, etc.) y líquidos estériles (LCR, sinovial ypleural). Algunos autores han detectado la bacteriaen muestras de heces y saliva, incluso en pacientessanos, pero estos resultados no han sidoreproducibles y se han asociado a falsos positivos,por lo que no se recomienda el empleo de este tipode muestras para el diagnóstico.

En general, las muestras enviadas con mayorfrecuencia al laboratorio de microbiología clínica sonlas biopsias duodenales y las adenopatíasmesentéricas, ya que la enfermedad se sospechacon mayor frecuencia en pacientes conmanifestaciones gastrointestinales. Se debenrecoger varias biopsias de las porciones proximal ydistal del duodeno y yeyuno, ya que las lesionespueden tener una distribución parcheada. Lasbiopsias se deben tomar en todos los pacientes,incluso sin manifestaciones gastrointestinalesaparentes. El análisis de muestras de biopsias depacientes tratados, sirve para la monitorización deltratamiento en pacientes con biopsias previamentepositivas. La mucosa duodenal se recupera en lasprimeras semanas o meses tras el tratamiento, laaparición de biopsias positivas después de unaresolución previa puede indicar una recaída.

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Tabla 6. Secuencias de algunos iniciadores de PCR para la detección de Tropheryma whipplei (Ver referencia 3).

Iniciador Secuencia (5’-3’)(forward/reverse) Diana

Tamañodel producto

(pb)Referencias

W3FEW2RB

f: GGAATTCCAGAGATACGCCCCCCGCAAr: CGGGATCCCATTCGCTCCACCTTGCGA

16S rARN 284 Relman y cols 1992.N. Engl. J. Med. 327:293-301

whipp-frw1whipp-rev

f : TGA CGG GAC CAC AAC ATC TGr : ACA TCT TCA GCA ATG ATA AGA AGT T

hsp651ª amplificación

500

whipp-frw2whipp-rev

f : CGC GAA AGA GGT TGA GAC TGr : ACA TCT TCA GCA ATG ATA AGA AGT T

hsp652ª amplificación

357

Morgenneg y cols.2000. J. Clin.Microbiol. 38: 2248-2253

Twrpoβ-FTwrpoβ-R

f::AAAAAGGCCGCACGCGAGTTr: AAAGAGGCTCCAACGCCACG

rpoβ 650 Drancourt y cols.2001. J. Clin.Microbiol. 39: 2425-2430

TW27FTW182R27F-182R

f: TGTTTTGTACTGCTTGTAACAGGATCTr:TCCTGCTCTATCCCTCCTATCATC6-FAM-AGAGATACATTTGTGTTAGTTGTTACA-TAMRA

SecuenciasrepetidasPCR tiempo realSonda Taqman

105 Raoult y cols. 2006.N. Eng. J. Med. 355:1503-1505

TW704TW899TW795-ANCORTW817-RED640

f: AAAGAGGTTGAGACTGr: ATCGGTTACAAAATAAGCAGAAGGTTGGCAAGGAAGGC-FLUORESCEINALC-RED-640TGTCACTGTCGAGGAGTCAAATACT-FOSFATO

hsp65PCR tiempo realsondas FRET

213 Sloan y cols. 2005.J. Clin. Microbiol. 43:3516-3518

El análisis del LCR es fundamental para laevaluación de la afectación del sistema nerviosocentral incluso en pacientes sin manifestacionesneurológicas. Está recomendado realizar el análisisde LCR de todo paciente diagnosticado deenfermedad de Whipple ya que, si existe afectaciónneurológica el pronóstico es peor y las recaídas másfrecuentes. Se ha destacado la utilidad de lastécnicas de tinción de PAS y PCR del LCR para lamonitorización de la efectividad del tratamiento yevaluar recaídas de la enfermedad. La detección de T. whipplei por PCR, se deberealizar siempre en muestras de válvulas cardiacasde pacientes con endocarditis infecciosa conhemocultivos negativos. Se pueden recoger tambiénmuestras de adenopatías de cualquier localización,humor vítreo, líquido articular, líquido pleural, tejidoesplénico, biopsias cerebrales e incluso sangreperiférica que quizás, sería la muestra más sencillade obtener, pero aunque algunos autores handescrito su utilidad, en general tiene bajo rendimientoy numerosos falsos negativos. La obtención, conservación y manipulación delas muestras es un paso crítico, pero no es diferentedel realizado para el diagnóstico por PCR de otrasinfecciones bacterianas (ejemplo M. tuberculosis).Las muestras deben recogerse asépticamente y aser posible antes del inicio del tratamiento antibiótico.Se deben introducir en contenedores estériles detamaño adecuado y deben ser enviadas rápidamenteal laboratorio de microbiología clínica sin añadirconservantes ni aditivos, aunque se puedenintroducir en suero salino estéril para evitar sudesecación, si el envío se va a demorar. Esconveniente, procesar las muestras de forma rápida.

Se deben conservar a 4ºC hasta su análisis ydurante un máximo de unos 3 días. Si no es posiblerealizar la extracción de ADN con rapidez o se van aenviar las muestras a un laboratorio externo, sedeben conservar congeladas a -20ºC o -70ºC hastasu análisis, sin ser sometidas a ciclos de congelacióny descongelación (una vez congeladas las muestrassólo se deben descongelar para realizar la extraccióndel ADN). En todos los pasos de obtención ymanipulación de las muestras se deben seguirnormas de bioseguridad adecuadas. El líquido articular y la sangre periférica se debenenviar en tubos anticoagulados con EDTA. Si seemplea sangre periférica se debe analizar en sutotalidad y no solamente el suero. Es preferible noemplear tubos con heparina, ya que inhibe la TaqADN polimerasa. Si la cantidad de muestra recibida es suficiente,es conveniente procesar una fracción y conservarcongelada el resto para realizar nuevos análisis si seobtuvieran resultados discordantes. En ocasiones la visualización de inclusionesPAS-positivas en el laboratorio de anatomíapatológica, determina que se necesite después laconfirmación por PCR de la presencia de T. whippleien la muestra. Se pueden admitir muestras incluidasen parafina o tratadas con formol, sin embargo hayque considerar que el rendimiento de la extraccióndel ADN de la muestra y la sensibilidad de detecciónson menores en estos casos (se producenfragmentaciones del ADN que pueden afectar a laPCR).4.5.2. Procesamiento de muestras: extracción delADN. Antes de comenzar la extracción del ADN sedebe realizar una homogeneización de la muestra. Si

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se habían mantenido congeladas se deben dejardescongelar completamente. En caso de muestraslíquidas conviene realizarlo en un agitador rotatorio.Las muestras de biopsias se deben triturar yhomogenizar, por ejemplo con un bisturí estéril sinañadir ningún reactivo y luego transferirse a un tubopara realizar la extracción de ADN. Se suelenanalizar unos 50-100 mg de muestra. En muestrasde líquidos estériles, se debe procesar alrededor de1 ml de muestra (LCR, pleural y articular) y esconveniente concentrar las células por centrifugacióna alta velocidad (≅13.000 rpm), para analizar porseparado sobrenadante y pellet. Si las muestras aanalizar están incluidas en bloques de parafina, sedeben desparafinar mediante lavados sucesivos porejemplo con xileno y finalmente con etanol y tampónsalino. Para la extracción del ADN, se pueden empleardiversos métodos tanto manuales comoautomatizados adaptados al tipo de muestra que seprocese. Como no se conoce la eficacia comparativade todos los métodos disponibles, es convenienteque cada laboratorio emplee aquel en el que tienemás experiencia. Todos los reactivos y el materialque se utilice deben ser de “calidad molecular” ylibres de nucleasas. En la literatura los másempleados se basan en la lisis de la muestra conproteinasa K y la posterior extracción y purificaciónde ácidos nucleicos con fenol/cloroformo/etanol,cloruro de guanidinio y columnas con gel de sílice,resinas quelantes tipo chelex, etc. Es importanteconsiderar que, según el tipo de muestra puede sernecesario prolongar la etapa de lisis con proteinasaK, hasta la destrucción completa del tejido. La etapade elución o recuperación final del ADN esconveniente realizarla en algún tampón salino (porejemplo AE), en vez de en agua destilada libre denucleasas, ya que consigue una mejor conservacióny se evita la hidrólisis del ADN. El ADN extraído debeser recuperado en tubos libres de nucleasas, a serposible con tapón de rosca (tipo sarstedt) para evitarla apertura de los tubos durante las centrifugaciones.Una vez extraído el ADN total de la muestra sepuede conservar a 4ºC durante aproximadamenteuna semana hasta su análisis o se puede congelar a-20º o -70ºC. Se deben evitar los ciclos decongelación y descongelación que alteran el ADN.4.5.3. Detección de ADN de Tropheryma whippleipor PCR. Por el momento no hay disponiblestécnicas comerciales de PCR para la detección de T.whipplei. Se han publicado múltiples métodos “dediseño casero” y por tanto no estandarizados,basados en la amplificación de distintas regiones desu genoma (Tabla 2). No se han publicado estudiosque comparen la sensibilidad y especificidad de lasregiones más empleadas y cada estudio empleadiferentes técnicas y modos de extraer el ADN, por loque es difícil recomendar unas u otras para suimplantación en laboratorios de diagnóstico. Engeneral, suelen ser métodos sencillos que se puedenincorporar fácilmente a laboratorios de microbiologíaclínica dotados de un laboratorio de biologíamolecular.

Se han publicado técnicas basadas en PCRrealizada en formato convencional, seminested-PCRo nested-PCR para incrementar la sensibilidad dedetección y PCR a tiempo-real con sondas tipoTaqman o FRET para aumentar además laespecificidad y facilitar la detección. De la mismamanera, se han empleado iniciadores para diversasregiones (Tabla 2). Las utilizadas con más frecuenciason: regiones específicas del 16S ARNr, rpoB,hsp65, el dominio III del ARNr 23S, la regiónintergénica 16S-23S ARNr o regiones repetidas delgenoma. La detección de la bacteria por PCRuniversal del gen 16S ARNr y secuenciación comoparte del diagnóstico de sospecha de una infecciónbacteriana (no específicamente de T. whipplei),aunque válida en muestras ordinariamente estériles,debe ser confirmada con el análisis de otras dosregiones diferentes y específicas del genoma de T.whipplei. La identidad de los productos de amplificaciónobtenidos debe confirmarse siempre porsecuenciación, hibridación con sondas en formatoPCR a tiempo real o southern-blot, PCR-RFLP, etc.El método empleado con mayor frecuencia es lasecuenciación automática, por el método de losdideoxinucléotidos marcados con fluorescencia ydetección por electroforesis capilar, seguida delalineamiento con secuencias de T. whippleipreviamente publicadas en el Genebank. Sinembargo, es un método caro. La PCR a tiempo realcon sondas permite la detección específica de losproductos formados de una forma sencilla y másrápida que la PCR en formato tradicional, al no tenerque realizar geles de agarosa, ni análisis posterior delos productos de amplificación. Quizás la PCR atiempo real sea el método que se imponga en elfuturo, pero hay que tener en cuenta que losreactivos y los equipos necesarios también son carosy por el momento no están disponibles en todos loslaboratorios de diagnóstico clínico. El análisis del dominio III del ARNr 23S y delespaciador intergénico 16S-23S por PCR ysecuenciación se ha empleado para el tipadomolecular de la bacteria con fines epidemiológicos.4.5.4. Precauciones e interpretación deresultados. Quizás el principal problema de lastécnicas de PCR es la obtención de falsos positivos(lo que es especialmente delicado cuando se trata dedetectar microrganismos que no se pueden confirmarcon cultivo) y falsos negativos. Para evitar estosproblemas, se deben emplear las normas generalesde trabajo en laboratorios de PCR: cambio frecuentede guantes, trabajo secuencial en áreas separadas,material independiente para cada área, irradiacióncon luz UV del material y las superficies, empleo deuracilo y UNG-D-glicosilasa en la mezcla de reacciónde la PCR para evitar contaminación con productosde amplificación de PCR’s previas, etc. Las contaminaciones cruzadas se debendescartar siempre empleando controles negativos (1cada cinco muestras) que sean procesados en lasmismas condiciones de las muestras. No se debenprocesar demasiadas muestras conjuntamente,

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sobre todo si la extracción de ADN se realiza deforma manual. Cada resultado positivo de unamuestra, se debe confirmar realizando con la mismamuestra una segunda PCR, que detecte una regióndiferente del genoma de T. whipplei, por lo que encada laboratorio es conveniente disponer al menosdos técnicas distintas de PCR. El empleo desistemas de PCR a tiempo real que empleancapilares y sondas de detección, evita abrir y cerrarfrecuentemente los tubos y por tanto lascontaminaciones cruzadas. Estos problemas sonespecialmente frecuentes en PCR’s tipo nested. Otra de las causas de falsos positivos de unaPCR que se debe descartar, es la obtención deproductos de amplificación inespecíficos, queaunque tengan el tamaño adecuado (en el caso devisualización en geles) no correspondan a la dianabuscada. La obtención de productos inespecíficosdepende de cómo que se haya diseñado yoptimizado cada PCR. Para evitarlo, la identidad decada producto se debe confirmar mediantehibridación con sondas (southern-blot o PCR atiempo real), secuenciación, cortes con enzimas derestricción, etc. Actualmente el método más usadoes la PCR asociada a secuenciación y alineamientode secuencias en bases de datos públicas comogenebank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Los falsos negativos se suelen producir por lapresencia en la muestra de inhibidores de la PCR,para descartarlos es conveniente introducir uncontrol interno, analizar varias diluciones de lamuestra o bien detectar en paralelo por PCR un genque debe estar presente siempre en la muestra,como la β-globina humana. Otra causa importante defalsos negativos de la PCR, es el bajo rendimientoen la etapa de extracción del ADN total de la muestraclínica, que puede verse afectado por una toma demuestra y conservación inadecuadas y que sedescarta con la introducción del control internopreviamente a la etapa de extracción. En la interpretación de resultados se debenconsiderar todas las precauciones descritasanteriormente, para dar un resultado como positivo onegativo. Se deben obtener resultados concordantesen el análisis de dos regiones diferentes y si seobtienen resultados discordantes analizar un nuevofragmento de la muestra (si está disponible). Recientemente, se han publicado algoritmos paraayudar al diagnóstico de la enfermedad de Whippleconsiderando los resultados de la tinción de PAS ydel análisis por PCR. Hay autores que consideran laPCR como una técnica complementaria del estudiohistológico y recomiendan su empleo cuando sesospecha la enfermedad y el estudio histológico esnegativo o en muestras del SNC. Otros autoresrecomiendan realizar conjuntamente las dostécnicas, ya que consideran que la tinción de PAStiene falsos negativos y no es completamenteespecífica de la enfermedad de Whipple. Si ambastécnicas son positivas se considera el diagnósticoprobado. Si sólo uno de los test es positivo, seconsidera el diagnóstico probable y se debedescartar la enfermedad por análisis de otro tejido (si

está disponible también por serología o análisisinmunohistoquímico). Si sólo la PCR es positiva, sedeben analizar 2 regiones de ADN diferentes en lamisma muestra o emplear muestras delocalizaciones distintas (LCR, líquido articular,adenopatías, etc.). Cuando se establece undiagnóstico de certeza, se debe analizar LCR conPCR incluso en ausencia de manifestacionesneurológicas.4.5.5. Otros métodos para el diagnóstico delaboratorio. El cultivo de T. whipplei y lasecuenciación de su genoma completo enlaboratorios de investigación, ha facilitado el diseñode técnicas serológicas experimentales y el diseñode medios sintéticos para su cultivo. Un mayordesarrollo de estos métodos quizás permitirá, en unfuturo próximo, su empleo en el diagnóstico de laenfermedad de Whipple en laboratorios demicrobiología clínica. Cultivo. Durante años se ha considerado a T.whipplei como un microorganismo no cultivable. Apesar de numerosos esfuerzos la bacteria no sepudo cultivar hasta el año 2000, en que se consiguióen medios celulares con líneas de fibroblastoshumanos, comprobándose que tiene un tiempomedio de duplicación largo. El cultivo se realiza enmedios celulares, la bacteria crece lentamente enlíneas de fibroblastos humanos como MRC-5 y HELen medio mínimo esencial sin antibióticos, con 10%de suero bovino fetal y 2mM de L-glutamina y trasvarias semanas de incubación se puede observar unefecto citopático. En las actuales condiciones decultivo el tiempo medio de duplicación varía entre32h. y 4 días. El crecimiento de T. whipplei se debeasegurar por PCR, tinción de PAS o microscopíaelectrónica. El cultivo empleando la técnica de shell-vial aumenta el rendimiento. Se ha conseguidocrecer la bacteria también en células HeLa ymonocitos humanos de sangre periféricadesactivados con IL-4. A partir del genoma de T.whipplei se ha diseñado un medio sintético para sucultivo en el que crece la bacteria extracelularmente.Sin embargo, por ahora sólo se ha conseguido enlaboratorios altamente especializados y aún pareceestar lejos su incorporación a los laboratorios dediagnóstico microbiológico. Serología. Con el cultivo de la bacteria se hanproducido varios antígenos que permiten ladetección serológica de la enfermedad. Se hadesarrollado un test de inmunofluorescencia indirectamediante la fijación de una monocapa de célulasinfectadas por la bacteria. La presencia de IgG frentea antígenos de T. whipplei es frecuente en pacientessin la enfermedad, lo que puede indicar reaccionescruzadas o como se ha especulado una distribuciónubicua del microorganismo. La presencia de IgMcorrelaciona mejor con la presencia de enfermedad.Sin embargo, por el momento los pocos métodospublicados no tienen suficiente especificidad para suuso diagnóstico. Microscopía electrónica. Su utilidad se basa envisualizar por microscopía electrónica detransmisión, bacilos con una membrana externa

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trilaminar en el interior de macrófagos. Es unatécnica laboriosa que necesita equipos y personalmuy experimentado y actualmente sólo se realiza encentros de referencia. Inmunohistología La posibilidad de obtener anticuerpos mono opoliclonales específicos de T. whipplei ha permitidoel desarrollo de técnicas de hibridación in situ (FISH),que permiten detectar la bacteria en secciones detejido del paciente convenientemente preparadas ymediante microscopía confocal o de fluorescencia.Como en los casos anteriores estas técnicas aún noestán disponibles para el diagnóstico.

5. BIBLIOGRAFIA

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DOCUMENTO TÉCNICO

PNT-EMG-01AISLAMIENTO DE Anaplasma phagocytophilum A PARTIR DE MUESTRAS CLÍNICAS MEDIANTE

CULTIVO

ELABORADO REVISADO Y APROBADOJefe de Servicio

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EDICIÓN FECHA ALCANCE DE LAS MODIFICACIONES

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Este documento es propiedad del Servicio de Microbiología Clínica del Hospital…………….. La información en élcontenida no podrá reproducirse total ni parcialmente sin autorización escrita del Responsable. Las copias noregistradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios.

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Aislamiento de Anaplasma phagocytophilum apartir de muestras clínicas mediante cultivo

Edición Nº 01 Página 2 de 3

1. PROPÓSITO Y ALCANCE El objeto de este procedimiento es describir lametodología de aislamiento de A. phagocytophilum apartir de muestras clínicas. Este procedimiento selleva a cabo mediante cultivos celulares inoculadoscon muestras de pacientes en los que se sospechauna Anaplasmosis Humana (AH). Es aplicable adeterminadas muestras clínicas que se reciben enlos laboratorios clínicos siendo obligatorio disponerde un laboratorio de bioseguridad de nivel 3.

2. FUNDAMENTOEl diagnóstico de AH requiere el cumplimiento de

criterios clínicos (síndrome febril, leucopenia,trombocitopenia, aumento de las enzimas hepáticas),antecedente de picadura de garrapata o posibilidadde la misma (ambiente epidemiológico apropiado) yla confirmación mediante pruebas diagnósticas.

A. phagocytophilum, agente causal de la AH, viveen el citoplasma de las células que infecta, agrupadaen unas inclusiones denominadas mórulas que sepueden visualizar mediante tinición con colorantesGiemsa o Wright en extensiones de sangre, médulay LCR mediante microscopía convencional. Noobstante, la visualización de las mórulas sólopermitiría establecer un diagnóstico de sospecha deAH, ya que también se observan en otras infeccionesprovocadas por Ehrlichia-Anaplasma. Además en laliteratura europea estas técnicas tienen escasorendimiento. El diagnóstico mediante técnicas debiología molecular tiene una baja rentabilidad y laspruebas serológicas disponibles para la detección deanticuerpos frente a A. phagocytophilum tienen lalimitación de las reacciones cruzadas, la necesidad,en muchos casos, de un segundo suero en fase deconvalecencia para demostrar una seroconversión yla no disposición de antígenos locales (ver PNTs dePCR e Inmunofluorescencia Indirecta de A.phagocytophilum). Todos estos factores hacen que elaislamiento de A. phagocytophilum en medios decultivo sea la principal prueba diagnóstica. El granproblema es que no crece en los medios de cultivohabituales, siendo necesarias líneas celulares y unlaboratorio de nivel de seguridad 3.

3. DOCUMENTOS DE CONSULTA- Guidelines for the diagnosis of tick-borne bacterial

diseases in Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. 2004.10:1108-32.

- Laboratory Biosafety Manual (WHO, 2003).- Manual de instrucciones de funcionamiento y

mantenimiento de equipos del laboratorio(centrífuga, termociclador, estufa, etc.).

- Preparación de medios, reactivos y viales concultivos celulares.

- Procedimiento del laboratorio sobre gestión deresiduos.

- Procedimiento en Microbiología Clínica de laSEIMC nº 1a de "Recogida, transporte yprocesamiento general de las muestras en ellaboratorio de microbiología", 2003.

- Procedimiento en Microbiología Clínica de laSEIMC nº 10 de "Seguridad en el laboratorio demicrobiología clínica", 2000.

- Protocolo del laboratorio de verificación ycalibración de equipos e instrumentos.

4. MUESTRAS4.1. TIPO DE MUESTRA, RECOGIDA,TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN La muestra más adecuada para el cultivo de A.phagocytoplilum es la sangre recogida con heparina.Se recogerá según se indica en el Procedimiento enMicrobiología Clínica de la SEIMC nº 1a de"Recogida, transporte y procesamiento general delas muestras en el laboratorio de microbiología"(PNT-RTP-01. 2003). Las muestras se debenrecoger en contenedores estériles de un solo usocon cierre hermético y enviarse, a ser posible, elmismo día de la extracción y sin congelar. Si el envíono se va a realizar de manera inmediata, convienecongelar a −80ºC hasta su envío, que debe llevarsea cabo en hielo seco para prevenir ladescongelación.

4.2. PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS En términos generales, el procedimiento utilizadopara el procesamiento de estas muestras es elhabitual del laboratorio de microbiología. Lasmuestras deben manejarse como potencialmentepeligrosas. Cuando una muestra se recibe en ellaboratorio, y antes de procesarse, debe someterse auna inspección previa para asegurarse que ha sidobien seleccionada, recogida y transportada. Lasmuestras se rechazarán en los siguientes casos: 1)muestra no identificada, 2) transporte inadecuado odemasiado prolongado, 3) muestra derramada, 4)cantidad insuficiente. Las muestras inaceptables nodeben procesarse y el médico debe ser informadoinmediatamente. En estos casos, se contactará conel médico solicitante para pedir una nueva muestra.

Los consejos generales para optimizar elprocesamiento de muestras son:1. Comprobar que el etiquetado de la muestra escorrecto.2. Registrar toda la información necesaria quepudiera afectar a la calidad de la muestra querepresente algún interés diagnóstico así comoaspectos relacionados con su recogida, transporte yconservación.3. Durante el procesamiento, deben seguirse todaslas medidas de seguridad necesarias, tanto para elpersonal como para la muestra.

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Aislamiento de Anaplasma phagocytophilum apartir de muestras clínicas mediante cultivo

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4. El procesamiento debe llevarse a cabo tan prontocomo sea posible garantizando de esta forma laviabilidad del patógeno.

5. MEDIOS DE CULTIVO, REACTIVOS YPRODUCTOS

- Línea celular HL60 (ATCC CCL-240)- Medio de cultivo: Minimum essential medium

(MEM) suplementado con un 10% de suerobovino fetal (SBF) y 2 mM. de L-glutamina

- Tripsina- Tampón fosfato salino (PBS) de pH 7,2 estéril.

6. APARATOS Y MATERIALES- Cabina de flujo laminar vertical de nivel de

bioseguridad clase II.- Centrífuga con adaptadores para viales que

alcance una velocidad de 3.000 rpm.- Estufa convencional.- Pipetas Pasteur estériles.- Micropipetas de varios volúmenes.- Puntas de micropipeta.- Pipetas de 5 y 10 ml estériles.- Frascos de cultivo Falcon de 25 cm2.

7. PROCEDIMIENTO1. Obtención de la capa leucocitaria a partir de lamuestra de sangre total con heparina: centrifugar lamuestra a 1.000 rpm durante 2-3 min. y recoger elplasma de la zona más próxima a la capa deglóbulos rojos que queda al fondo. Posteriormente,hacer una segunda centrifugación a 3.000 rpmdurante 5 min. y recoger lo que se ha sedimentado.2. Inoculación de la capa leucocitaria en 3 ml de lalínea celular HL60 (ajustada a una densidad de500.000 células/ml).3. Incubación de las células (densidad de 200.000 a600.000 células/ml) a 37ºC. Dos veces por semanase debe retirar el medio y añadir 5 ml de medio decultivo fresco.4. El cultivo puede ser positivo entre los 5 y 12 díasdespués de la inoculación. La identificación de losaislamientos se comprueba mediante la detección delas mórulas teñidas con tinciones de Giemsa oWright o con técnicas de biología molecular (PCR ysecuenciación).

8. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO1. Limitaciones propias de los cultivos celulares,como múltiples contaminaciones o rotura de lamonocapa.2. El cultivo de A. phagocytophilum, resulta muylaborioso y se requiere personal especializado einstalaciones con nivel de seguridad 3, por lo que surealización queda limitada a los laboratorios quecumplan estos requisitos.3. Existe un gran número de variantes de A.phagocytophilum, algunas de ellas descritas ennuestro medio, que no se han podido cultivar en estalínea celular.

9. BIBLIOGRAFÍA

1. Blanco JR, Oteo JA. Human granulocytic ehrlichiosis inEur J Clin Microbiol Infect 2002; 8:763-772.

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DOCUMENTO TÉCNICO

PNT-EMG-02DIAGNÓSTICO DE ANAPLASMOSIS HUMANA MEDIANTE INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI)

ELABORADO REVISADO Y APROBADOJefe de Servicio

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EDICIÓN FECHA ALCANCE DE LAS MODIFICACIONES

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Este documento es propiedad del Servicio de Microbiología Clínica del Hospital…………….. La información en élcontenida no podrá reproducirse total ni parcialmente sin autorización escrita del Responsable. Las copias noregistradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios.

PNT-EMG-02Servicio de MicrobiologíaHospital.................... Diagnóstico de anaplasmosis humana mediante

inmunofluorescencia indirecta (IFI) Edición 01 Página 2 de 3

1. PROPÓSITO Y ALCANCE El objeto de este procedimiento es detectaranticuerpos frente a A. phagocytophilum a partir demuestras de suero humano mediante la técnica deinmunofluorescencia indirecta.

2. FUNDAMENTO La técnica de IFI permite detectar anticuerpos enel suero del paciente, al visualizar, en un microscopiode fluorescencia, la luz emitida por una moléculafluorescente conjugada a un anticuerpo anti-inmunoglobulina G humana que se encuentra unidoal complejo antígeno-anticuerpo, formado por launión de los anticuerpos presentes en el suero delpaciente con el antígeno prefijado en unportaobjetos. La técnica tiene lugar en dos etapas:en un primer paso, se enfrenta el suero del paciente,diluido en tampón fosfato salino (PBS) con elantígeno fijado en un portaobjetos. Tras unaincubación en determinadas condiciones dehumedad y temperatura, que facilitan la uniónespecífica del antígeno-anticuerpo, se realizan unoslavados que eliminarán los anticuerpos noespecíficos que no se han unido al antígeno. En unsegundo paso, se añade un anticuerpo anti-inmunoglobulina humana marcado con isotiocianatode fluoresceína (FITC), este anticuerpo se unirá alanticuerpo que ya se encuentra unido al antígeno. Alobservar el portaobjetos con un microscopio defluorescencia, la luz incide sobre la FITC emitiendouna luz de color verde manzana que nos permitedetectar la presencia de anticuerpos.

3. DOCUMENTOS DE CONSULTA- Procedimiento en Microbiología Clínica de laSEIMC nº 1a de "Recogida, transporte yprocesamiento general de las muestras en ellaboratorio de microbiología", 2003.- Procedimiento en Microbiología Clínica de laSEIMC nº 10 de "Seguridad en el laboratorio demicrobiología clínica", 2000.

4. MUESTRAS4.1. TIPO DE MUESTRA, RECOGIDA,TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN La muestra de elección para el diagnóstico deanaplasmois humana (AH) es el suero. Éste serecoge según se indica en el Procedimiento enMicrobiología Clínica de la SEIMC nº 1ª (Recogida,transporte y procesamiento general de muestras enel laboratorio de microbiología, PNT-RTP-0, 2003), yse envía en contenedores estériles de un solo uso ycon cierre hermético. El suero debe enviarserefrigerado lo antes posible. Si el envío no se va arealizar de manera inmediata, conviene congelarlo a−20ºC hasta su envío, el cual deberá llevarse a caboen hielo seco para prevenir su descongelación.

4.2. PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS:En términos generales, el procedimiento utilizado

para el procesamiento de estas muestras es elhabitual del laboratorio de microbiología. Cuando unamuestra se recibe en el laboratorio, y antes deprocesarse, debe someterse a una inspección previapara asegurarse que ha sido bien seleccionada,recogida y transportada. Las muestras se rechazaránen los siguientes casos: 1) muestra no identificada,2) transporte inadecuado o demasiado prolongado,3) muestra derramada, 4) cantidad insuficiente.Además de estos casos, no se aceptará suerohemolítico ni hiperlipémico. Las muestrasinaceptables no deberán procesarse y el médicodeberá ser informado inmediatamente. En estoscasos, se contactará con el médico solicitante parapedir una nueva muestra. Los consejos generales para optimizar elprocesamiento de las muestras son:

1. Comprobar que el etiquetado de la muestra escorrecto.2. Registrar toda la información necesaria quepudiera afectar a la calidad de la muestra y querepresente interés diagnóstico así comoaspectos relacionados con su recogida,transporte y conservación.3. Durante el procesamiento, deben seguirsetodas las medidas de seguridad necesarias,tanto para el personal que lleva a cabo lamanipulación como para la muestra.

Puesto que resulta importante realizar estudioscuantitativos de sueros del mismo paciente a lolargo del tiempo, es fundamental conservar unaalícuota congelada a −20ºC de cada muestra que seanalice para poder realizar en paralelo el estudiocomparativo con las diferentes muestras.

5. REACTIVOS, PRODUCTOS, APARATOS YMATERIAL NECESARIO5.1. REACTIVOS Y PRODUCTOS

- Portaobjetos con celdas de antígeno prefijado:cada celda contiene células inactivadas einfectadas por A. phagocytophilum (FocusDiagnostics).

- Conjugado de anticuerpos anti-inmunoglobulinas humanas macadas confluoresceína: Se encuentra ya preparadocomercialmente (varios proveedores) o se puedepreparar en el momento de uso (adición deinmunoglobulinas anti-IgG humanas a unadilucción 1:100 de azul de evans en PBS).

- Medio de montaje: contiene glicerol tamponadocon PBS a pH de 7,2.

- PBS: un frasco de solución salina tamponada defosfato en polvo. Se reconstituye con 1 litro deagua destilada (o purificada). La soluciónreconstituida es tampón a 0,01 M de pH 7,2.

Estos reactivos han de conservarse refrigeradosentre 2 y 8°C.

PNT-EMG-02Servicio de MicrobiologíaHospital.................... Diagnóstico de anaplasmosis humana mediante

inmunofluorescencia indirecta (IFI) Edición 01 Página 3 de 3

5.2. APARATOS- Estufa.- Microscopio de fluorescencia.- Nevera de 2 a 8°C5.3. MATERIALES

- Tubos de plástico, fondo cónico tipo Eppendorf de1,5 ml.

- Gradillas.- Placas de microdilución .- Micropipetas de varios volúmenes (20 µL, 200 µL,

1000 µL).- Puntas para micropipetas.- Vortex.- Botella Pyrex con tapón de rosca de 1.000 ml

para la preparación de PBS, y almacenamientodel tampón sobrante.

- Jarra coplin o frasco lavador para el tampón.- Cubreobjetos de 20 x 50 mm.- Cámara húmeda para la incubación de los portas.- Agua destilada o purificada- Reloj- Papel absorbente para secar las láminas- Controles positivo y negativo. Existen ya

comercializados (Focus diagnostics) o bien seutilizan sueros diagnosticados de AH (controlpositivo) o diagnosticados de otras infecciones(control negativo) disponibles en el laboratorio.

6. PROCEDIMIENTO1. Antes de comenzar la técnica se deben sacar losreactivos de la nevera para que se atemperen.2. Preparar la dilución de ensayo del suero 1/64 (porejemplo: 5 µL del suero del paciente en 315 µL dePBS). Si se quiere titular la muestra preparardiluciones seriadas en PBS utilizando la placa demicrodiluciones (1/128, 1/256, 1/512, 1/1024…).3. Preparar un esquema de las celdas delportaobjetos donde aparezca en que posición va aestar situado cada suero del paciente y su dilucióncorrespondiente, así como la posición de loscontroles.4. Añadir 25 µL de los sueros, del control negativo ydel positivo en las celdas correspondientes.5. Incubar los portaobjetos en cámara húmeda a37°C durante 30 minutos.6. Retirar los portaobjetos de la cámara húmeda yenjuagar con PBS. A continuación, sumergirlos enuna jarra tipo Coplin con PBS 10 minutos.7. Lavar en agua destilada o purificada y dejar quese sequen al aire.8. Añadir aproximadamente 25 µL de conjugado acada celda.9. Incubar las láminas en cámara húmeda a 37°Cdurante 30 minutos.10. Repetir los pasos de lavado 6 y 7.11. Poner unas gotas de medio de montaje en lalámina y cubrir con un cubreobjetos de 20 x 50 mm.12. Examinar las celdas con un aumento final de400X con un microscopio de fluorescencia equipadocorrectamente. Leer los portaobjetos el mismo día

que se realiza la prueba para que la fluorescenciasea óptima. Si esto no fuese posible, guardar lasláminas en la oscuridad de 2 a 8°C hasta 24 horas.

7. CONTROL DE CALIDADEn cada serie se deben incluir controles positivos ynegativos.1. En el control positivo se deben observarinclusiones de fluorescencia intensa y brillante decolor verde manzana sobre las células que aparecenen un color rojo oscuro.2. En el control negativo no se debe verfluorescencia o esta debe tener una reactividadinsignificante. La fluorescencia que no empareja lamorfología y la distribución del control positivo seconsidera negativa.

Si los controles no exhiben estos resultados, losresultados de las muestras del paciente deben serconsiderados inválidos y la prueba deberá repetirse.

8. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS La óptica del microscopio y la condición y el tipode fuente de luz determinan la intensidadfluorescente total y los títulos finales. En cadadeterminación se deben leer primero las celdascontrol para asegurar la interpretación correcta.Lectura de los portaobjetos: La fluorescencia se valora de la forma siguiente:Positiva de 2 a 4+: fluorescencia verde manzanamoderada a intensa.Positiva de 1+: fluorescencia equivalente a laobservada en el título final de referencia del controlpositivo.Negativa: no hay fluorescencia o es igual a laobservada en la celda del control negativo (o menorque la del título final).Interpretación de resultados de las muestras delpaciente: La inversa de la dilución de suero más alta queexhibe fluorescencia verde manzana (1+) sedenomina el título final de suero.≥1:64: Títulos finales de anticuerpos IgG séricos de≥1:64: sugieren infección en época indeterminada ypueden ser indicativos de una infección anterior o deuna respuesta temprana a una infección reciente.<1:64: No se han detectado anticuerpos.Una seroconversión o aumento del título de, almenos, cuatro veces entre dos muestras de sueroobtenidas de 1 a 2 semanas después y evaluadas enparalelo junto a los antecedentes epidemiológicos yuna clínica compatible permite establecer eldiagnostico de AH.

9. BIBLIOGRAFÍA1. Brouqui P, Salvo E, Dumler JS, et al. Diagnosis of

granulocytic ehrlichiosis in humans byimmunofluorescence assay. Clin Diagn Lab Immunol2000; 8:199-202.

2. Guerrero A, Losada I, De Lucas S, et al. Ehrlichiosisinfection prevalence in Spain or cross-reactions. MedClin (Barc) 2001; 116:315.

PNT-EMG-03DETECCIÓN DIRECTA DE Anaplasma phagocytophilum EN MUESTRAS CLÍNICAS MEDIANTE

AMPLIFICACIÓN GENÓMICA (PCR) Y SECUENCIACIÓN

ELABORADO REVISADO Y APROBADOJefe de Servicio

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muestras clínicas mediante amplificación genómica(PCR) y secuenciación Edición 01 Página 2 de 6

1. PROPÓSITO Y ALCANCE El objeto de este procedimiento es describir lametodología de detección de Anaplasmaphagocytophilum (anteriormente denominadoEhrlichia phagocytophila) en muestras clínicasmediante PCR (reacción en cadena de lapolimerasa) convencional y posterior secuenciacióndel producto amplificado. Este procedimiento esaplicable a todas las muestras clínicas con sospechade anaplasmosis que se reciben en los laboratoriosde microbiología clínica que realicen diagnósticomolecular. También es aplicable al ADN extraído apartir de cultivos infectados con muestras clínicas(ver el PNT-EMG-01: Aislamiento de A.phagocytophilum a partir de muestras clínicasmediante cultivo).

2. FUNDAMENTO Las técnicas moleculares son un instrumentovalioso para el diagnóstico etiológico deanaplasmosis, ya que pueden detectar en pocotiempo el genoma de cualquier patógeno potencial,independientemente de la viabilidad delmicroorganismo. Estas técnicas se ven menosafectadas que los cultivos por los tratamientosantibióticos previos, aunque también puedendisminuir la sensibilidad. La obtención de losresultados es mucho más rápida en comparación conel cultivo y tienen alta sensibilidad y especificidad.Por el momento, la mayor parte de las técnicasdescritas son de desarrollo propio (in house), noestando comercializadas. Aunque existe una grancantidad de dianas descritas, el gen ARNr 16S esuna de las más comúnmente utilizadas puesto queestá presente en el genogrupo de A.phagocytophilum (que incluye las especiesanteriormente denominadas E. phagocytophila,Ehrlichia equi y agente de la ehrlichiosis humanagranulocítica (HGE)). Otra diana que ha demostradogran capacidad de detección es la del gen repetidoen múltiples copias msp2 (hge-44 o p44), quecodifica una proteína de superficie inmunodominantede 40-49kDa de A. phagocytophilum. Dado que enpacientes que hayan sido picados por garrapatasfuera de Europa se puede adquirir una infección porEhrlichia chaffeensis u otra especie, con estasmuestras se pueden utilizar otras dianas quepermitirían la amplificación de todas las Ehrlichiae(fD1 y rP2).

3. DOCUMENTOS DE CONSULTA- Guidelines for the diagnosis of tick-borne bacterial

diseases in Europe. Clin Microbiol Infect 10:1108-1132.

- Laboratory Biosafety Manual (WHO, 2003).- Manual de instrucciones de funcionamiento y

mantenimiento de equipos (centrífuga, baño,termociclador, centrífuga de vacío, fuente ycubetas de electroforesis) del laboratorio.

- Procedimiento del laboratorio sobre Gestión deresiduos.

- Procedimiento en Microbiología Clínica de laSEIMC nº 1a de "Recogida, transporte yprocesamiento general de las muestras en ellaboratorio de microbiología", 2003.

- Procedimiento en Microbiología Clínica de laSEIMC nº 10 de "Seguridad en el laboratorio demicrobiología clínica", 2000.

- Protocolo del laboratorio de verificación ycalibración de equipos e instrumentos.

4. MUESTRAS4.1. TIPO DE MUESTRA, RECOGIDA,TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN La muestra más adecuada para el diagnósticomolecular de A. phagocytophilum es la capaleucocitaria obtenida de sangre en fase agudaextraída con EDTA o citrato. Para ello se recomiendacentrifugar la muestra a 1.000 rpm durante 2-3 min. yrecoger el plasma de la zona más próxima a la capade glóbulos rojos que queda al fondo.Posteriormente, hacer una segunda centrifugación a3.000 rpm. durante 5 min. y recoger lo que se hasedimentado. El procesamiento de la muestra deberealizarse siempre lo más rápidamente posible; éstapuede mantenerse a temperatura ambiente durantelas primeras 48 h o congelarse a -20ºC si se superaese tiempo. Se recogerá según se indica en elProcedimiento en Microbiología Clínica de la SEIMCnº 1a de "Recogida, transporte y procesamientogeneral de las muestras en el laboratorio demicrobiología". PNT-RTP-01. 2003. Las muestras sedeben recoger y enviar en contenedores estériles deun solo uso y con cierre hermético.

4.2. PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS: En términos generales, el procedimiento utilizadopara el procesamiento de estas muestras es elhabitual del laboratorio de microbiología.Las muestras deben manejarse como si tuvieranmicroorganismos potencialmente peligrosos. Cuandouna muestra se recibe en el laboratorio, y antes deprocesarse, debe someterse a una inspección previapara asegurarse que ha sido bien seleccionada,recogida y transportada. Las muestras se rechazaránen los siguientes casos: 1) muestra no identificada,2) transporte inadecuado o demasiado prolongado,3) muestra derramada, 4) cantidad insuficiente. Lasmuestras inaceptables no deben procesarse y elmédico debe ser informado inmediatamente. Enestos casos, se contactará con el médico solicitantepara pedir una nueva muestra.Los consejos generales para optimizar elprocesamiento de muestras son:

1. Comprobar que el etiquetado de la muestra escorrecto.2. Registrar toda la información necesaria quepudiera afectar a la calidad de la muestra y querepresente interés diagnóstico así como aspectos

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muestras clínicas mediante amplificación genómica(PCR) y secuenciación Edición 01 Página 3 de 6

relacionados con su recogida, transporte yconservación.3. Durante el procesamiento, deben seguirse todaslas medidas de seguridad necesarias, tanto para elpersonal como para la muestra.4. El procesamiento debe llevarse a cabo tanpronto como sea posible garantizando de estaforma la estabilidad del ADN del patógeno.

5. REACTIVOS Y PRODUCTOS5.1. REACTIVOS PARA LA EXTRACCIÓN DE ADNSe utilizará el kit “QIAamp DNA Blood” (QIAGEN,Hilden, Germany), para la extracción de ADN a partirde muestras de sangre.

5.2. REACTIVOS PARA LA AMPLIFICACIÓN(volumen de reacción: 50 µL).Concentración final en la reacción:- 1× de tampón de reacción NH4- 3 mM de MgCl2 (en ocasiones, puede recurrirse aoptimizar la cantidad de MgCl2, modificando suconcentración en un rango entre 1-6 mM).- 0,2 mM de la mezcla de 4 dinucleótidos trifosfato(dNTPs) (varios proveedores).- Oligonucleótidos 50 pmol de cada uno de ellos:

Para el gen rrs de A. phagocytophilum:ge9f: 5’-AACGGATTATTCTTTATAGCTTGCT-3’ge10r: 5’-TTCCGTTAAGAAGGATCTAATCTCC-3’

Para el gen msp2 de A. phagocytophilum:msp2-3F: 5´-CCAGCGTTTAGCAAGATAAGAG-3´msp2-3R: 5´-GCCCAGTAACAACATCATAAGC-3´

Para el gen rrs de todas las Ehrlichiae:fD1: 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’rP2: 5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’

- 1,5 U Taq polimerasa (varios proveedores).

5.3. REACTIVOS PARA LA ELECTROFORESIS- Tampón TBE 1× (Tris-HCl 100 mM, ácido bórico 90mM, Na2EDTA.2H2O 1 mM; pH 8,3).- Tampón de carga para electroforesis (azul debromofenol 0,25%, cianol xileno FF 0,25%, glicerol30%).- Marcador de tamaño molecular de intervalo 100-1.000 pb (varios proveedores).- Agarosa “Low Melting” (varios proveedores).- Bromuro de etidio (10 mg/ml).- Agua destilada.

5.4. REACTIVOS PARA LA PURIFICACIÓN DELPRODUCTO AMPLIFICADOSe utilizará el kit “QUIAquick gel extraction”(QIAGEN).

5.5. REACTIVOS PARA LA SECUENCIACIÓNSe utilizará el kit “BigDyeTM Terminator CycleSequencing v2.0 Ready Reaction” AppliedBiosystems (USA).

6. APARATOS Y MATERIALES6.1. INSTRUMENTAL- Cabina de Seguridad Biológica de clase IIA.- Centrífuga de sobremesa con rotor oscilante paracentrifugar tubos de sangre- Microcentrífuga para tubos de fondo tipo Eppendorfy rotor angular, con velocidad de rotación de 16.000× g.- Agitador orbital tipo vortex.- Bloques de calor seco o termobloques.- Termociclador.- Balanza de precisión.- Espectrofotómetro.- Microondas para fundir la agarosa.- Cubetas de electroforesis.- Fuente de alimentación para electroforesisconvencional.- Transiluminador de luz U.V.- Equipo fotográfico o de captación de imágenes.- Nevera (2-8°C).- Congelador (-20°C).

6.2. MATERIALES- Tubos tipo Eppendorf de 1,5 y 0,2 ml.- Gradillas de diferentes formatos.- Gradillas congeladora (-20°C) y refrigeradora (2-8°C).- Cajas de congelación para tubos Eppendorf.- Micropipetas de diferentes volúmenes- Puntas de micropipeta estériles provistas de filtro aprueba de aerosoles.- Tubo Vacutainer con anticoagulante EDTA o citratopara extracción de la sangre.- Botellas esterilizadas mediante calor seco parapreparar tampones y geles de agarosa.

7. PROCEDIMIENTO7.1. EXTRACCIÓN DEL ADN. Para la extracción de ADN de las muestras seutilizará el “kit QIAamp DNA Blood” para sangresiguiendo las instrucciones del fabricante.

7.2. AMPLIFICACIÓN.7.2.1. Controles necesarios:- Control positivo: ADN de A. phagocytophilum a unadilución límite de detección para comprobar laeficacia de la amplificación de la PCR.- Control negativo de extracción: extraer una muestrade agua en las mismas condiciones y a la vez que seextraen las muestras para analizar. Este controlpermite comprobar la ausencia de contaminacionesdurante el proceso de extracción.- Control negativo de PCR sin cebadores.- Control negativo de PCR sin ADN: Se amplifica unamuestra del agua estéril.Estos dos controles últimos permiten comprobar laausencia de contaminaciones durante el proceso deamplificación.- Para confirmar que el ADN se ha extraídocorrectamente y que no existen inhibidores en lamuestra que impidan el proceso de amplificación,

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muestras clínicas mediante amplificación genómica(PCR) y secuenciación Edición 01 Página 4 de 6

debe amplificarse en cada una de las muestras uncontrol interno, por ejemplo el de la betaglobina queamplifica un fragmento de 150 pb (cebadores: sense-CATGCCTCTTTGCACCATTC y antisense-TGGTAGCTGGATTGTAGCTG).7.2.2. Condiciones de la PCR del gen rrs de A.phagocytophilum:- Un ciclo de desnaturalización a 95ºC durante 3 min.- 35 ciclos de los siguientes pasos:

1. Desnaturalización a 94ºC durante 30 s.2. Hibridación a 55ºC durante 30 s.3. Extensión a 72ºC durante 1 min.

- Un ciclo para completar la extensión de losproductos de PCR. Consiste en una incubación a72ºC durante 5 min.

Condiciones de la PCR del gen msp2 de A.phagocytophilum:- Un ciclo de desnaturalización a 94ºC durante 4 min.- 40 ciclos de los siguientes pasos:

1. Desnaturalización a 94ºC durante 30 s.2. Hibridación a 56ºC durante 30 s.3. Extensión a 72ºC durante 30 s.

- Un ciclo para completar la extensión de losproductos de PCR. Consiste en una incubación a72ºC durante 1 min.

Condiciones de la PCR del gen rrs de Ehrlichiae:- Un ciclo de desnaturalización a 95ºC durante 15min.- 40 ciclos de los siguientes pasos:

1. Desnaturalización a 94ºC durante 30 s.2. Hibridación a 53ºC durante 30 s.3. Extensión a 72ºC durante 90 s.

- Un ciclo para completar la extensión de losproductos de PCR. Consiste en una incubación a72ºC durante 3 min.

7.3. ELECTROFORESIS.- Preparar el gel de agarosa al 0,8% en tampón TBE1×.- Cargar el gel, añadiendo previamente el tampón decarga a las muestras. Utilizar uno de los pocillos paracargar el marcador de tamaño molecular.- Conectar la fuente de electroforesis de manera queno se sobrepasen 5 V/cm (considerando la distanciamás corta entre los electrodos). Lo habitual es quese conecte a 100-150 V.- Desconectar la fuente cuando el colorante azul debromofenol esté aproximadamente a la mitad del gel(aproximadamente 1 hora). Para visualizar losamplicones, depositar el gel sobre un transiluminadorcon luz ultravioleta en un lugar oscuro.

7.4. LECTURA E INTERPRETACIÓNPara validar los resultados del ensayo, en la carreradel control negativo no debe aparecer ninguna banday en la del control positivo debe aparecer una bandade 919 pares de bases (pb) para el gen rrs y unabanda de 334pb para msp2 de A. phagocytophilum yde 1500 pb para los cebadores universales. Para

poder interpretar si ha habido amplificación en lasmuestras, debe aparecer en cada una de ellas labanda correspondiente al amplificado de controlinterno.

7.5. PURIFICACIÓN DEL PRODUCTOAMPLIFICADO Y SECUENCIACIÓNEl producto amplificado se purifica cortando la bandaa partir del gel de agarosa y utilizando el kitQUIAquick gel extraction kit, siguiendo lasrecomendaciones del fabricante. Posteriormente, sesomete a una nueva amplificación conconcentraciones limitantes de dideoxinucleótidosmarcados (secuenciación unidireccional). Se utiliza elkit “BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing v2.0Ready Reaction” con los mismos oligonucleótidosque los usados en la fase de amplificación, a razónde 3 pmol por reacción de secuencia. Mediante elempleo de un secuenciador automático losamplificados se resuelven mediante electroforesiscapilar, obteniéndose un cromatograma con lasecuencia de bases. Finalmente, la secuencia deácidos nucleicos se edita y se compara, mediante elempleo de un software específico, programas dealineamiento utilizando secuencias de referencia obien mediante comparación on line con secuenciasde bases de datos (programa Blast)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).

8. OBTENCIÓN Y EXPRESIÓN DE RESULTADOSLos resultados de PCR se expresan en términos

cualitativos de positivo o negativo. Los datos desecuencia permiten identificar las posiblesmutaciones puntuales de las diferentes variantes deA. phagocytophilum que parecen tener diferentecarácter patógeno o no patógeno para humanos.

Cuando se notifica un resultado de PCR negativose debe tener en cuenta que, en ocasiones, la cargabacteriana en algunas muestras suele ser muy baja ypor tanto los métodos moleculares pueden no sersuficientemente sensibles, por lo que un resultadonegativo no descarta una infección.

9. RESPONSABILIDADESBásicamente son las siguientes:- Personal del área de recogida y procesamiento demuestras: recepción, identificación y procesamientode las muestras, rechazo de las muestras remitidasen condiciones defectuosas y adopción de medidascorrectoras.- Personal técnico: control de las muestras,solicitudes y hojas de trabajo, realización de latécnica, lectura y registro de resultados, archivo dehojas de trabajo.- Facultativo responsable: supervisión del trabajo yde los resultados, resolución de dudas técnicas,adopción de medidas correctoras en el caso de quese hayan cometido errores, firma del informe deresultados.

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10. ANOTACIONES AL PROCEDIMIENTO En el caso de la amplificación del gen rrs, lasecuenciación del producto amplificado permitediferenciar variantes de A. phagocytophilum. Existenotros muchos genes comúnmente analizados comolos genes ankA (epank1), groESL, rpoB o gltA (véasetabla 1).

11. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Si bien la PCR es una prueba ideal para eldiagnóstico de estas infecciones, existen algunasdesventajas en comparación con el cultivo, como sonla limitación para realizar pruebas de sensibilidad alos antibióticos y la imposibilidad de coleccionar losaislados para futuras investigaciones. Se debenestablecer algunos parámetros antes de incorporarestas pruebas a los protocolos de diagnóstico clínicode los hospitales, como por ejemplo definir el controlinterno de inhibición, sensibilidad, especificidad yreproducibilidad de la técnica.

12. BIBLIOGRAFÍA1. Brouqui P, Bacellar F, Baranton G, et al. Guidelines for

the diagnosis of tick-borne bacterial diseases in Europe.Clin Microbiol Infect 2004; 10:1108-1132.

2. Chen SM, Dumler JS, Bakken JS, et al. Identification ofgranulocytotropic Ehrlichia species as the etiologic agentof human disease. J Clin Microbiol 1994; 32:589-595.

3. Dumler JS, Brouqui P. Molecular diagnosis of humangranulocytic anaplasmosis. Expert Rev Mol Diagn 2004;4:559-569.

4. Inokuma H, Brouqui P, Drancourt M, et al. Citratesynthase gene sequence: a new tool for phylogeneticanalysis and identification of Ehrlichia. J Clin Microbiol2001; 39:3031-3039.

5. Massung RF, Mauel MJ, Owens JH, et al. Geneticvariants of Ehrlichia phagocytophila, Rhode Island andConnecticut. Emerg Infect Dis 2002; 8:467-472.

6. Massung RF, Priestley RA, Miller N, et al. Inability of avariant strain of Anaplasma phagocytophilum to infectmice. J Infect Dis 2003; 188:1757-1763.

7. Portillo A, Santos AS, Santibáñez S, et al. Detection of anon-pathogenic variant of Anaplasma phagocytophilumin Ixodes ricinus from La Rioja, Spain. Ann N Y Acad Sci2005; 1063:333-336.

8. Stuen S, Van de Pol I, Bergström K, et al. Identificationof Anaplasma phagocytophila (formerly Ehrlichiaphagocytophila) variants in blood from sheep in Norway.J Clin Microbiol 2002; 40:3192-3197.

9. Sumner JW, Nicholson WL, Massung RF. PCRamplification and comparison of nucleotide sequencesfrom the groESL heat shock operon of Ehrlichia species.J Clin Microbiol 1997; 35:2087-2092.

10. Taillardat-Bisch AV, Raoult D, Drancourt M. RNApolymerase beta-subunit-based phylogeny of Ehrlichiaspp., Anaplasma spp., Neorickettsia spp. and Wolbachiapipientis. Int J Syst Evol Microbiol 2003; 53:455-458.

11. Walls JJ, Caturegli P, Bakken JS, et al. Improvedsensitivity of PCR for diagnosis of human granulocyticehrlichiosis using epank1 genes of Ehrlichiaphagocytophila-group ehrlichiae. J Clin Microbiol 2000;38:354-356.

12. Zeidner NS, Burkot TR, Massung R. Transmission ofthe agent of Human Granulocytic Ehrlichiosis by Ixodesspinipalpis ticks: Evidence of an enzootic cycle of dualinfection with Borrelia burgdorferi in Northern Colorado. JInfect Dis 2000; 182:616-619.

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muestras clínicas mediante amplificación genómica(PCR) y secuenciación Edición 01 Página 6 de 6

Tabla 1. Genes utilizados como diana para la detección de A. phagocytophilum mediante PCR, secuencia de cebadores y tamaño del fragmento amplificado encada caso.Gen Nombre de los cebadores Secuencia de los cebadores (5’→ 3’) Fragmento (pb)

ReferenciaankA (epanK1)

LA 6

LA 1

f: GAGAGA TGCTTATGGTAA GAC

r: CGTTCAGCCATCATTGTGAC

(444)Walls et al., 2000

GroESL * HS1HS6

HS43HS45

f: TGGGCTGGTA (A/C) TGAAATr: CCICCIGGIACIA (C/T) ACCTTC

f: AT (A/T) GC (A/T) AA (G/A) GAAGCATAGTCr : ACTTCACG (C/T) (C/T) TCATAGAC

(1343)Sumner et al, 1997

(480)Sumner et al., 1997

rpoB D420GLR1820AGB

D1760AGBR4060AGB

f: CTIGAAGAIGCIGGIGCr: GACCTTCIGGIGTTTC (A/G) AIIGGAC

f: GGITTIGAIGTICGIGACGr: GAITTAACIGTIAICATTTCC

(1230)Taillardat-Bisch et al., 2003

(2650)Taillardat-Bisch et al., 2003

gltA HG-M28FHG1257R

f: GTAATAAATTGTATTATCAGAGr: AATACGTGAGTTTGAAACCA

(1236)Inokuma et al., 2001

f: forward; r: reverse.* PCR anidada

DOCUMENTO TÉCNICO

PNT-EMG-04DIAGNÓSTICO DE LAS INFECCIONES POR Bartonella spp. A PARTIR DE MUESTRAS CLÍNICAS

MEDIANTE CULTIVO

ELABORADO REVISADO Y APROBADO

Jefe de ServicioNombre/Firma Fecha Nombre/Firma Fecha

EDICIÓN FECHA ALCANCE DE LAS MODIFICACIONES

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Este documento es propiedad del Servicio de Microbiología Clínica del Hospital…………….. La información en élcontenida no podrá reproducirse total ni parcialmente sin autorización escrita del Responsable. Las copias noregistradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios.

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partir de muestras clínicas mediante cultivo Edición 01 Página 2 de 3

1. PROPOSITO Y ALCANCE El objetivo de este documento es describir elprocesamiento de muestras para el diagnósticomicrobiológico de la infección por Bartonella spp.mediante cultivo bacteriológico. Se documentan lostipos de muestra, su procesamiento en el laboratorio,las condiciones de cultivo y los métodos deidentificación.

2. FUNDAMENTO Las bartonellas son bacterias gramnegativas,pleomórficas y de difícil aislamiento. Estanrelacionadas principalmente con la enfermedad porarañazo de gato, angiomatosis bacilar, peliosishepática, bacteriemias, uveítis, endocarditis entreotras manifestaciones clínicas. Su aislamiento encultivo, además de su utilidad para el diagnósticomicrobiológico de la infección, posibilita el tipado decepas para fines epidemiológicos y para estudios desensibilidad.

3. DOCUMENTOS DE CONSULTA- Gestión de residuos.- Normas de bioseguridad: la situación del personal ylas medidas a tomar frente a los riesgos relacionadoscon la exposición a agentes biológicos regulados porel Real decreto (RD) 664/97 y la adaptacióncontenida en la orden de 25 de marzo de 1998. - Procedimiento en Microbiología Clínica de laSEIMC nº 10 de "Seguridad en el laboratorio demicrobiología clínica", 2000.

4. MUESTRAS4.1 PETICION La petición que acompaña a cada muestra debeestar estrictamente cumplimentada y en ella deberáconstar el número de historia, nombre, edad, serviciode procedencia, tipo de muestra (de forma muyespecifica), tratamiento previo, así como eldiagnóstico clínico.

4.2 RECOGIDA DE LA MUESTRA. Las muestras más utilizadas para el cultivomicrobiológico de Bartonella spp. son las biopsias(ganglios o adenopatías, válvulas cardíacas, piel,etc.) y el hemocultivo (pacientes inmunodeprimidos ocon sospecha de endocarditis).

4.3 TRANSPORTE Y CONSERVACION DE LASMUESTRAS Las biopsias deberán obtenerse de maneraaséptica para poder evitar posibles contaminacionesy se transportaran al laboratorio con agua destiladalo más rápidamente posible. El cultivo se realizaráinmediatamente o se conservaran a –80ºC para suprocesamiento posterior. Los cultivos de sangre seinocularán directamente en una botella dehemocultivo para ser procesados en un sistemaautomático durante al menos 21 días. También sepuede cultivar la sangre directamente en mediossólidos, siempre que se realice el proceso de lisis de

los hematíes, para ello se recogerá la sangre en untubo con EDTA y se congelará a -80ºC durante almenos 24 horas antes de sembrarse en el mediosólido.

4.4 CRITERIOS DE RECHAZO Cualquier error en la identificación de la muestra:etiquetado erróneo o inadecuado, falta deinformación; mala conservación (temperaturainapropiada, muestra en medios incorrectos);muestras con aspecto de mala conservación(biopsias secas). Todas estas incidencias deben sercomunicadas al clínico, indicando el noprocesamiento de las muestras y los posibles erroresen la interpretación de resultados si se realiza.

5. MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS5.1 MEDIOS DE CULTIVOAgar Columbia con 5% de sangre de cordero, Agarchocolate con 1% de isovitalex y botellas dehemocultivos (del sistema que cada laboratorioutilice). Todos los medios deben estar conservadosentre 2-8ºC hasta la fecha de caducidad indicada.

5.2 REACTIVOSColorantes para tinción Gram, reactivos para larealización de la oxidasa, catalasa.

6. APARATOS Y MATERIALESNeveras, cabina de seguridad biológica, congeladorde –80ºC, asas de siembra, morteros, guantes,mechero incinerador o Bunsen, centrífugas,portaobjetos.

7. PROCEDIMIENTO7.1 PREPARACION E INOCULACION DE LAMUESTRA Las biopsias se trituran en un mortero con 0,5 mlde agua destilada, y posteriormente se inoculan de 2a 4 gotas del triturado en las placas de cultivo (agarsangre y agar chocolate) y se realizan estrías con elasa por toda la superficie de la placa. Las muestrasde sangre con EDTA después de un proceso decongelación a –80ºC durante al menos 24 horas sesembraran en medios sólidos. Como alternativa parala lisis de la sangre se puede utilizar el métodoIsolator™ blood-lysis tube. La sangre inoculada en botellas para suprocesamiento automatizado se incubará al menos21 días, una vez transcurridos se centrifugará elcontenido del hemocultivo a 2000-2500 rpm durante15 min y se sembrará el sedimento en mediossólidos. También pueden utilizarse cultivos celularesmediante la técnica de shell vial. En este caso, lasmuestras de sangre heparinizada o tejido se diluyenen medio líquido, MEM o RMPI con suero bovinofetal, se someten a un proceso de centrifugaciónsobre capas de líneas celulares y se incuban duranteun periodo de 15-30 días. Estos cultivos se revelanmediante una tinción de Giménez, el sobrenadante

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partir de muestras clínicas mediante cultivo Edición 01 Página 3 de 3

se guarda para poder inocular en posteriores cultivoscelulares en el caso que se observe Bartonella spp.o para poder realizar una PCR.

7.2 CONDICIONES DE INCUBACIÖNEl crecimiento del género Bartonella (excepto B.

bacilliformis) es muy lento. Las muestras deberánincubarse a 35-37ºC con un 5% de CO2 (excepto B.bacilliformis que solamente crece a 28-30ºC).

El tiempo mínimo de incubación varíadependiendo del tipo de cultivo de que se trate. Si esun cultivo primario o una muestra directa depaciente, se deberá incubar durante un periodomínimo de 2 meses. Si por el contrario se trata desubcultivos de Bartonella spp. (previamenteaislados), son necesarios solamente de 3-10 días deincubación. La larga incubación de las muestras enmedios húmedos aumenta mucho el riesgo decontaminación por hongos y por bacterias decrecimiento rápido. Este problema se minimizaadicionando antimicóticos como anfotericina B alcultivo o más fácilmente mediante el cierre de laplaca de cultivo con parafilm después detranscurridas las primeras 24 horas de incubación.

7.3 OBSERVACION DE LOS CULTIVOS EIDENTIFICACION DEL MICROORGANISMO

Los cultivos se examinan una vez a la semana.En cultivos primarios a partir de las 3 semanas seempieza a observar crecimiento. Las colonias tienenun aspecto gris-amarillento, son rugosas yenclavadas en el medio. Para su identificación sedebe realizar tinción de Gram, oxidasa y catalasa. Laidentificación de género y especie se realizamediante técnicas de PCR.

7.4 SUBCULTIVO DEL MICROORGANISMOA partir de una colonia sospechosa de Bartonella

spp. se realizará un subcultivo en agar sangre. Estese incubará en las mismas condicionesanteriormente descritas. El crecimiento de lossubcultivos es más rápido, a la semana ya sepueden observar las colonias que con posterioressiembras van perdiendo rugosidad y adherencia almedio.

7.5 ALMACENAMIENTO DE LAS CEPAS AISLADASLas cepas aisladas se congelaran a –80ºC en un

medio nutritivo tipo caldo de Brucella con un 10% deglicerol.

8. OBTENCION Y EXPRESION DE RESULTADOSSe considera positivo el cultivo para Bartonella

spp. cuando se observan en el medio pequeñascolonias entre 0,3-2,0 µm, de color blanco-amarillento y aspecto rugoso, siempre muy adheridasal medio, incrustadas en la superficie y difíciles dearrastrar con un asa de siembra y que por lastécnicas de identificación se confirme que se trata deBartonella spp.

9. RESPONSABILIDADESLos técnicos de laboratorio serán los

responsables de la realización de la técnica. Elfacultativo tendrá la responsabilidad de lainterpretación de los resultados y la validación de losmismos.

10. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTODebido a que la sensibilidad del cultivo bacteriano

es baja, un resultado negativo no descarta lainfección por este microorganismo. El correctodiagnóstico de infección por Bartonella spp. Debebasarse en criterios clínicos, serológicos ymicrobiólogicos (cultivo y PCR).

11. BIBLIOGRAFIA1. Agan BK, Dolan MJ. Laboratory diagnosis of Bartonella

infections. Clin Lab Med 2002; 22:937-962.2. Brenner SA, Rooney JA, Manzewitsch P et al. Isolation

of Bartonella (Rochalimaea) henselae: Effects ofmethods of blood collecting and handling. J ClinMicrobiol 1997; 35:544-547.

3. Tierno PM, Inglima K, Parisi MT. Detection of Bartonella(Rochalimeae) henselae bacteremia using Bact/Alertblood culture system. Am J Clin Pathol 1995; 104:530-536.

DOCUMENTO TÉCNICO

PNT-EMG-05DIAGNÓSTICO DE LAS INFECCIONES POR Bartonella spp. MEDIANTE SEROLOGIA

ELABORADO REVISADO Y APROBADO

Jefe de ServicioNombre/Firma Fecha Nombre/Firma Fecha

EDICIÓN FECHA ALCANCE DE LAS MODIFICACIONES

01 Edición inicial

COPIA REGISTRADA Nº..........ASIGNADA A.....................................................................................

Este documento es propiedad del Servicio de Microbiología Clínica del Hospital…………….. La información en élcontenida no podrá reproducirse total ni parcialmente sin autorización escrita del Responsable. Las copias noregistradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios.

PNT-EMG-05Servicio de MicrobiologíaHospital.................... Diagnóstico de las infecciones por Bartonella spp.

mediante serología Edición 01 Página 2 de 3

1. PROPOSITO Y ALCANCE El objetivo de este documento es normalizar elprocesamiento de muestras para el diagnósticoserológico de la infección por Bartonella spp. Este documento es de consulta para el personaldel laboratorio encargado de su realización einterpretación.

2. FUNDAMENTO El método serológico se basa en la detección deanticuerpos IgG e IgM específicos frente a B.henselae y B. quintana. Este método puede utilizarsepara el diagnóstico de la infección, el posibleseguimiento de la enfermedad, así como paraestudios de seroprevalencia. La técnica más utilizadaactualmente es la inmunofluorescencia indirecta (IFI).

3. DOCUMENTOS DE CONSULTA- Normas de bioseguridad: la situación del personal ylas medidas a tomar frente a los riesgos relacionadoscon la exposición a agentes biológicos regulados porel Real decreto (RD) 664/97 y la adaptacióncontenida en la orden de 25 de marzo de 1998. - Procedimiento en Microbiología Clínica de laSEIMC nº 10 de "Seguridad en el laboratorio demicrobiología clínica", 2000.

4. MUESTRAS4.1 PETICION La petición que acompaña a cada muestra debeestar estrictamente cumplimentada y en ella deberáconstar el número de historia, nombre, edad, serviciode procedencia, tratamiento previo, así como eldiagnóstico clínico.

4.2 RECOGIDA DE LA MUESTRA La muestra adecuada para la determinaciónserológica de anticuerpos es el suero y si no esposible se puede utilizar plasma. Las muestras de sangre se centrifugan a 1000-1500 g durante 10 minutos. Se conservarán a 4 ºCun máximo de 72 h. Si se demora más la realizaciónde la técnica se congelarán a -30ºC. Las muestrashemolizadas o hiperlipémicas pueden dar problemasde interpretación.

5. REACTIVOS Y PRODUCTOSLos reactivos utilizados son comercializados, por

lo que el manejo y la conservación de los reactivosse ajustaran a las instrucciones del fabricante.

6. APARATOS Y MATERIAL Estufa, congeladores, neveras, material fungible(tubos, puntas pipetas, etc) pipetas calibradas,recipientes de lavado y microscopio de fluorescencia.

7. PROCEDIMIENTO Cada laboratorio debe describir detalladamentelos pasos a seguir para realizar la técnica, desde lacongelación de los sueros al atemperamiento de los

reactivos. Se debe seguir en todo momento lasinstrucciones del fabricante. Existen sistemas comercializados para ladeterminación de anticuerpos tipo IgG e IgM. Comoejemplo se recomienda realizar una determinaciónde cribaje a una dilución del suero de 1/64 para laIgG y 1/20 para la IgM. Si ésta es positiva sedeberán realizar más diluciones dobles del suero.

8. OBTENCION Y EXPRESION DE RESULTADOSPara la aceptación de los resultados, es

imprescindible que los controles incorporados a latécnica sean correctos. En el caso en que unpaciente tenga más de un suero, estos se ensayaránen paralelo para minimizar la variabilidadinterensayos.

Las muestras son negativas cuando hay ausenciade fluorescencia y son positivas cuando se observanbacterias o cúmulos de bacterias fluorescentes enlas células. Las muestras positivas deben diluirse yse considerará el título del suero la dilución más altaque presenta reacción positiva.

9. RESPONSABILIDADESLos técnicos de laboratorio serán los

responsables de la realización de la técnica. Elfacultativo tendrá la responsabilidad de lainterpretación de los resultados y la validación de losmismos.

10. ANOTACIONES AL PROCEDIMIENTOLas muestras obtenidas al inicio de la infección

pueden ser negativas, por este motivo siempre quese sospecha una infección por Bartonella spp. esimportante estudiar dos muestras recogidas en unintervalo de 15-21 días en paralelo (fase aguda yconvaleciente) y observar un incremento oseroconversión de los títulos de anticuerpos(aumento de dos títulos).

Debido a que la seroprevalencia de anticuerposfrente a la Bartonella spp. en la población sana no esdespreciable, se ha tenido en cuenta como valorpredictivo de infección unos títulos superiores a1/128 en casos de enfermedad por arañazo de gato,mientras que en los casos de endocarditis los títulosdeben ser ≥1/800.

11. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTOSe debe tener en cuenta que existen reacciones

cruzadas entre las especies de Bartonella spp. y quemediante la serología es difícil determinar la especiecausante de la infección. En algunos casos cuandose observa un título superior en dos diluciones dealguna de ellas se podría considerar a esta comoresponsable de la infección.

12. BIBLIOGRAFIA1. Agan BK, Dolan MJ. Laboratory diagnosis of Bartonella

infections. Clin Lab Med 2002; 22:937-962.2. Sander A, Posselt M, Oberle K et al. Seroprevalence of

antibodies to Bartonella henselae in patients with cat

PNT-EMG-05Servicio de MicrobiologíaHospital.................... Diagnóstico de las infecciones por Bartonella spp.

mediante serología Edición 01 Página 3 de 3

scatch disease and in healthy controls: Evaluation andcomparison of two commercial serological test. Clin DiagLab Immunol 1998; 5:486-490.

DOCUMENTO TÉCNICO

PNT-EMG-06DIAGNÓSTICO DE LAS INFECCIONES POR Bartonella spp. MEDIANTE AMPLIFICACIÓN GENÓMICA Y

SECUENCIACIÓN

ELABORADO REVISADO Y APROBADO

Jefe de ServicioNombre/Firma Fecha Nombre/Firma Fecha

EDICIÓN FECHA ALCANCE DE LAS MODIFICACIONES

01 Edición inicial

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Este documento es propiedad del Servicio de Microbiología Clínica del Hospital…………….. La información en élcontenida no podrá reproducirse total ni parcialmente sin autorización escrita del Responsable. Las copias noregistradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios.

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Mediante amplificación genómica y secuenciación Edición 01 Página 2 de 3

1. PROPOSITO Y ALCANCEEl objetivo de este documento es describir el

procesamiento de muestras para el diagnósticomediante técnicas de PCR de la infección porBartonella spp.

2. FUNDAMENTOLas técnicas moleculares se basan en la detecciónde ADN específico de Bartonella spp. Este métodopuede utilizarse para el diagnóstico de la infecciónen muestras biológicas (biopias o sangre) y para laidentificación de las cepas aisladas.

3. DOCUMENTOS DE CONSULTA- Gestión de residuos- Normas de bioseguridad: la situación del personal ylas medidas a tomar frente a los riesgos relacionadoscon la exposición a agentes biológicos regulados porel Real decreto (RD) 664/97 y la adaptacióncontenida en la orden de 25 de marzo de 1998. - Procedimiento en Microbiología Clínica de laSEIMC nº 10 de “Seguridad en el laboratorio demicrobiología clínica”, 2000.

4. MUESTRAS4.1 PETICION La petición que acompaña a cada muestra debeestar estrictamente cumplimentada y en ella deberáconsta el número de historia, nombre, edad, serviciode procedencia, tratamiento previo, así como eldiagnóstico clínico.

4.2 RECOGIDA DE LA MUESTRA Las determinaciones se pueden realizar enbiopsias (piel, válvulas, ganglios), o en sangre (conEDTA), las muestras se mantendrán congelas a –80ºC hasta la realización de la técnica.

5. REACTIVOS Y PRODUCTOS Los reactivos para la extracción de ADN, larealización de la PCR y purificación del productopara una posterior secuenciación se encuentranactualmente comercializados, por lo que el manejo yla conservación de los reactivos se ajustaran a lasinstrucciones del fabricante. Los iniciadores para ladetección de Bartonella spp. son variadosdependiendo de las publicaciones consultadas. Noexiste en el mercado español un reactivocomercializado de amplificación para estemicroorganismo. Los productos utilizados para larealización del gel de agarosa (agarosa en polvo,bromuro de etidio, TBE) se conservan a temperaturaambiente y los controles de peso molecular en elcongelador de –80ºC.

6. APARATOS Y MATERIALESCongeladores, neveras, microondas, balanzas,material fungible para realizar la PCR, pipetascalibradas, termociclador, secuenciador, fuente decorriente, bateas para correr los geles de azarosa.

7. PROCEDIMIENTO Cada laboratorio debe describir detalladamentelos pasos a seguir para realizar cada fase de esteprocedimiento, desde la congelación de lasmuestras, el atemperamiento de los reactivos, elproceso de extracción del ADN, el proceso deamplificación de ADN, la preparación de geles deagarosa y la secuenciación. En todos estos aspectosse deben seguir las recomendaciones de losfabricantes, ya que en la mayoría de los casos setrata de sistemas comercializados (ver apartado2.3.4. del documento científico de esteprocedimiento). La técnica de PCR es útil para el diagnóstico dela infección aplicada a muestras clínicas y para laidentificación de cepas. La metodología a seguir enambos es la misma excepto en el proceso deextracción de ADN que dependerá del tipo demuestra. Para la determinación del género Bartonella unade las secuencias más útiles es BhCS.781p yBhCS.1137n, que corresponden a un fragmento delgen de la citrato sintasa (gltA) de Bartonella spp.Para la diferenciación de las especies existe aúnmás variedad de secuencias, da buen resultadoutilizar los iniciadores complementarios de la regiónintergénica del 16S-23S ARNr. Una vez realizada laPCR si es positiva para el género Bartonella, sepuede deducir la especie mediante su visualizaciónen el gel de agarosa y confirmar el resultadomediante la secuenciación.

8. OBTENCION Y EXPRESION DE RESULTADOS Para la aceptación de los resultados, esimprescindible que los controles incorporados a latécnica sean correctos. Siempre se utilizará uncontrol negativo (para evidenciar contaminación decualquier reactivo) y un control positivo paracomprobar que la reacción de amplificación ha tenidolugar. Las muestras son negativas cuando no existeamplificación de ADN para el microorganismo que sepretende detectar y por tanto no se observa ningunabanda en el gel de azarosa, y son positivas cuandoeste ADN se amplifica y se puede observar unabanda a la altura del gel esperada. Siempre se debeutilizar un marcador de pesos moleculares paracomprobar el tamaño de la banda.

9. RESPONSABILIDADES Los técnicos de laboratorio serán losresponsables de la realización de la técnica. Elfacultativo tendrá la responsabilidad de lainterpretación de los resultados y la validación de losmismos.

10. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO La principal limitación de esta técnica es ladificultad de disponer de muestras adecuadas, comoválvulas cardiacas para el diagnostico deendocarditis o biopsias. También al tratarse de

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Mediante amplificación genómica y secuenciación Edición 01 Página 3 de 3

técnicas manuales que se han de optimizar resultadifícil su incorporación al laboratorio de rutina, con locual se suelen realizar en centros especializados. Los resultados de las técnicas moleculares sonbuenos cuando se aplican a la identificación decepas y muestras de biopsias, pero no así enmuestras de sangre que presentan mayoresproblemas en su interpretación.

11. BIBLIOGRAFIA1. Agan BK, Dolan MJ. Laboratory diagnosis of Bartonella

infections. Clin Lab Med 2002; 22:937-962.2. Avidor B, Kletter Y, Abulafia S, et al. Molecular diagnosis

of cat scratch disease: a two-step approach. J ClinMicrobiol 1997; 35:1924-1930.

3. Jensen WA, Fall MZ, Rooney J, et al. Rapid identificationand differentiation of Bartonella species using a single-step PCR assay. J Clin Microbiol 2000; 38:1717-1722.

4. Regnery RL, Anderson BE, Clarridge JE, et al.Characterization of a novel Rochalimaea species, B.henselae spp. nov., isolated from blood of a febrilehuman immunodeficient virus-positive patient. J ClinMicrobiol 1992; 30:265-274.

DOCUMENTO TÉCNICO

PNT-EMG-07AISLAMIENTO DE Rickettsia spp. A PARTIR DE MUESTRAS CLÍNICAS MEDIANTE CULTIVO

ELABORADO REVISADO Y APROBADO

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EDICIÓN FECHA ALCANCE DE LAS MODIFICACIONES

01 Edición inicial

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Este documento es propiedad del Servicio de Microbiología Clínica del Hospital…………….. La información en élcontenida no podrá reproducirse total ni parcialmente sin autorización escrita del Responsable. Las copias noregistradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios.

PNT-EMG-07Servicio de MicrobiologíaHospital.................... Aislamiento de Rickettsia spp. a partir de muestras

clínicas mediante cultivo Edición 01 Página 2 de 4

1. PROPÓSITO Y ALCANCE El objeto de este procedimiento es describir lametodología de aislamiento de rickettsias a partir demuestras clínicas. Este procedimiento se lleva acabo mediante cultivos celulares inoculados conmuestras de pacientes en los que se sospecha unarickettsiosis. Es aplicable a determinadas muestrasclínicas que se reciben en los laboratorios clínicossiendo obligatorio disponer de un laboratorio debioseguridad de nivel 3.

2. FUNDAMENTO El cultivo es la técnica diagnóstica másespecífica, además de ser fundamental para laobtención de antígenos y para estudiar lasensibilidad a los antibióticos. Sin embargo, elaislamiento de rickettsias mediante cultivo celularconvencional a partir de una muestra procedente deun paciente con rickettsiosis es un proceso muylaborioso, poco sensible y tiene el inconveniente deretrasar la emisión de los resultados. Cuando creceuna rickettsia el efecto citopático no siempre tienelugar y, cuando se produce, no es específico deespecie. Además, aunque puede aparecer a las 24-48 h post- inoculación, generalmente se necesitanvarios días para su desarrollo. El cultivo se puedeacelerar si se inocula la muestra sobre unamonocapa de células susceptibles previamentecrecidas sobre un portaobjetos circular (shell vial),seguida de una centrifugación. Después de 5-7 díasde incubación se puede detectar la presencia de labacteria mediante la tinción de Giménez,inmunofluorescencia indirecta (IFI) con anticuerposespecíficos o bien mediante técnicas molecularescomo la PCR (reacción en cadena de la polimerasa).Para la identificación de la especie de rickettsiaaislada, se precisa la secuenciación de una dianaespecífica de especie.

3. DOCUMENTOS DE CONSULTA- Laboratory Biosafety Manual (WHO, 2003).- Manual de instrucciones de funcionamiento y

mantenimiento de equipos del laboratorio(centrífuga, termociclador, estufa, etc.).

- Preparación de medios, reactivos y viales concultivos celulares.

- Procedimiento en Microbiología Clínica de laSEIMC nº 1a de "Recogida, transporte yprocesamiento general de las muestras en ellaboratorio de microbiología", 2003.

- Procedimiento en Microbiología Clínica de laSEIMC nº 10 de "Seguridad en el laboratorio demicrobiología clínica", 2000.

- Procedimiento del laboratorio sobre gestión deresiduos.

- Protocolo del laboratorio de verificación ycalibración de equipos e instrumentos.

4. MUESTRAS4.1. TIPO DE MUESTRA, RECOGIDA,TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN La muestra más adecuada para el cultivo derickettsias es la sangre recogida con citrato oheparina. Se recogerá según se indica en elProcedimiento en Microbiología Clínica de la SEIMCnº 1a de "Recogida, transporte y procesamientogeneral de las muestras en el laboratorio demicrobiología" (PNT-RTP-01. 2003). Las muestras sedeben recoger en contenedores estériles de un solouso con cierre hermético y enviarse, a ser posible, elmismo día de la extracción y sin congelar. Si el envíono se va a realizar de manera inmediata, convienecongelar a −80ºC hasta su envío, que debe llevarsea cabo en hielo seco para prevenir ladescongelación.

4.2. PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS En términos generales, el procedimiento utilizadopara el procesamiento de estas muestras es elhabitual del laboratorio de microbiología. Hay quetener en cuenta que la bacteriemia durante unarickettsiosis es de menor intensidad que en el casode otras infecciones, lo que obliga a recoger mayorcantidad de muestra para obtener un rendimientoóptimo. Las muestras deben manejarse comopotencialmente peligrosas. Cuando una muestra serecibe en el laboratorio, y antes de procesarse, debesometerse a una inspección previa para asegurarseque ha sido bien seleccionada, recogida ytransportada. Las muestras se rechazarán en lossiguientes casos: 1) muestra no identificada, 2)transporte inadecuado o demasiado prolongado, 3)muestra derramada, 4) cantidad insuficiente. Lasmuestras inaceptables no deben procesarse y elmédico debe ser informado inmediatamente. Enestos casos, se contactará con el médico solicitantepara pedir una nueva muestra.Los consejos generales para optimizar elprocesamiento de muestras son:

1. Comprobar que el etiquetado de la muestra escorrecto.2. Registrar toda la información necesaria quepudiera afectar a la calidad de la muestra querepresente algún interés diagnóstico así comoaspectos relacionados con su recogida, transportey conservación.3. Durante el procesamiento, deben seguirse todaslas medidas de seguridad necesarias, tanto para elpersonal como para la muestra.4. El procesamiento debe llevarse a cabo tanpronto como sea posible garantizando de estaforma la viabilidad del patógeno.

5. MEDIOS DE CULTIVO, REACTIVOS YPRODUCTOS5.1. CULTIVOS CELULARESViales de plástico de fondo plano de 15 mm dediámetro externo (5 ml de capacidad) con tapón,

PNT-EMG-07Servicio de MicrobiologíaHospital.................... Aislamiento de Rickettsia spp. a partir de muestras

clínicas mediante cultivo Edición 01 Página 3 de 4

conteniendo una monocapa confluente de célulasVero formada sobre un cubreobjetos redondo de 12mm de diámetro. Estos viales se preparannormalmente en el propio laboratorio (al menos 24horas antes), a razón de 50.000 células/ml,aproximadamente. También serán aceptables loscultivos shell vial de procedencia comercial y calidadcontrolada por el fabricante y el laboratorio.

5.2. REACTIVOS- Células Vero (ATCC CCL-81).- Medio MEM (Minimum Essential Medium), (variosproveedores).- Suero bovino fetal (varios proveedores).- L-glutamina (varios proveedores).- Aminoácidos no esenciales (varios proveedores).- Medio de cultivo: Medio MEM suplementado consuero bovino fetal (SBF) al 10% (concentración final,CF), 2 mM de L-glutamina (CF) y 0,2% CF deaminoácidos no esenciales.- Tripsina (varios proveedores).- Tripsina-verseno: Tripsina al 0,25 % CF en PBScon 1 mM CF de EDTA (ácido etilen-diamino-tetraacético).- Tampón fosfato salino (PBS) de pH 7,2, estéril.Puede ser de procedencia comercial, (variosproveedores).- Azul tripán (varios proveedores).

6. APARATOS Y MATERIAL NECESARIOS6.1. INSTRUMENTAL- Cabina de flujo laminar vertical de nivel debioseguridad clase II.- Centrífuga con adaptadores para viales quealcance una velocidad de 4.000 × g.- Estufa convencional.- Microscopio invertido, dotado de objetivos de 10, 20y 40×.- Cámara hematocimétrica.

6.2. MATERIALES- Pipetas Pasteur estériles.- Micropipetas de varios volúmenes.- Puntas de micropipeta.- Pipetas de 5 y 10 ml estériles.- Pipetus.- Viales estériles para shell vial.- Cubreobjetos circulares de vidrio de 12 mm,estériles.- Frascos de cultivo Falcon de 25 cm2 (variosproveedores).

7. PROCEDIMIENTO7.1. CULTIVOS CELULARES: PREPARACIÓN DEVIALES shell vial- Lavar las células eliminando el medio de cultivo yañadiendo 5 ml de solución de PBS estéril en elfrasco Falcon que contiene la monocapa de célulasVero.

- Tripsinizar las células añadiendo 2-3 ml de soluciónde tripsina-verseno, incubar a 37ºC unos segundos.- Cuando las células empiecen a despegarse, pararla tripsinización añadiendo 5-10 ml de medio decultivo.- Mediante una pipeta aspirar y expulsar el medio,haciendo que el líquido golpee la superficie delcultivo, con el fin de despegar las células y lograruna suspensión homogénea. Evitar, en la medida delo posible, la formación de espuma.- Contar las células viables en cámarahematocimétrica con azul tripán (son viables las queno permiten la entrada del colorante).- Ajustar la suspensión a 50.000 células/ml,añadiendo medio de cultivo.- Repartir en los viales shell vial, a razón de 1 ml portubo.- Colocar los tubos en la estufa a 37ºC e incubarhasta que se forme una monocapa confluente.- Al día siguiente, visualizar los tubos al microscopioinvertido para ver si la monocapa está bien formaday no hay contaminación.

7.2. INOCULACIÓN DE LOS VIALES- Rotular los viales con el número de laboratorio y lafecha de inoculación.- Antes de inocular, eliminar el medio MEM de losviales.- Se inoculan 0,2 ml de la muestra por cada vial.- Idealmente el número de viales a sembrar será de2 por muestra. En algunos casos, según lascaracterísticas clínicas y a juicio del facultativoresponsable del laboratorio, se podría incrementar elnúmero de viales.- Centrifugar a 2.500 × g durante 30 minutos a 22ºC.- Aspirar la muestra, con cuidado de no levantar lamonocapa.- Añadir 1,5 ml de medio de cultivo e incubar a 33-35ºC en estufa.- Al día siguiente, visualizar los tubos al microscopioinvertido para ver si la monocapa está en buenascondiciones y no existe contaminación; cambiarnuevamente el medio de crecimiento.- Incubar a 33-35 ºC en estufa, durante 4-6 días.

7.3. SUBCULTIVO O PASE DE LOS CULTIVOS- Raspar la monocapa utilizando una punta demicropipeta o bien bolitas de vidrio estériles.- Pasar 1ml del cultivo a un frasco Falcon de 25 cm2,en el que previamente se ha crecido una monocapaconfluente de células Vero y se ha retirado el mediode cultivo.- Rotular el nuevo frasco poniendo el número demuestra, el número de pase y la fecha de subcultivo.- Incubar 30 min. a temperatura ambiente, moviendoel frasco suavemente cada 5 min.- Retirar el sobrenadante.- Añadir 5 ml de medio de cultivo.- Incubar a 33-35ºC en estufa.

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clínicas mediante cultivo Edición 01 Página 4 de 4

- Al día siguiente, observar los frascos al microscopioinvertido, para ver si la monocapa está en buenascondiciones y no hay contaminación.- Incubar a 33-35 ºC en estufa.

7.4. PROCESAMIENTO DE LOS CULTIVOS. Una vez incubado el cultivo durante 5-7 días, seraspa la monocapa y se procede a determinar si estácreciendo una rickettsia mediante la tinción deGiménez, IFI con suero específico o técnicasmoleculares, como la PCR. Para la identificación dela especie de rickettsia, se precisa la secuenciaciónde una diana específica de ADN. Aún obteniendo unresultado negativo, no se puede descartar lapresencia de una rickettsia en el cultivo hastapasados 20 días de incubación.

7.5. PUNTOS CRÍTICOS EN LA REALIZACIÓN DELA TÉCNICA No existen puntos especialmente críticos fuerade la realización metódica de toda técnica delaboratorio. Sin embargo, hay que tener en cuentaque los cultivos celulares se realizan en ausencia deantibióticos, por lo que hay que ser muy cuidadosospara prevenir contaminaciones. También, se debenmanipular con precaución los cubreobjetos, para queno se rompan o se dañe la monocapa.

7.6. CONTROL DE CALIDAD- El habitual de control de los reactivos.- Cada nuevo lote de suero debe analizarse paraasegurar el crecimiento adecuado de las célulasVero. El resultado se señalará en el registro decontrol de calidad de reactivos correspondiente.

8. OBTENCIÓN Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS Un efecto citopático no indica necesariamente lapresencia de una rickettsia en el cultivo. En estecaso, si la realización de pruebas complementariasindica la ausencia de la bacteria, el resultado sedebe expresar como "Muestra tóxica: resultado novalorable". Si con la tinción de Giménez se observarauna imagen microscópica típica de crecimientobacteriano, hay que tener en cuenta que no haydiferenciación a nivel de especie y que tambiénpueden crecer otros microorganismos intracelulares,por lo que se deben realizar otros análisis para eldiagnóstico etiológico de la infección. Los resultadosde PCR e IFI en el cultivo se expresan en términoscualitativos de positivo o negativo.

9. RESPONSABILIDADES Básicamente son las siguientes:- Personal del área de recogida y procesamiento demuestras: recepción, identificación y procesamientode las muestras, rechazo de las muestras remitidasen condiciones defectuosas y adopción de medidascorrectoras.- Personal técnico: control de las muestras,solicitudes y hojas de trabajo, realización de la

técnica, lectura y registro de resultados, archivo dehojas de trabajo.- Facultativo responsable: supervisión del trabajo yde los resultados, resolución de dudas técnicas,adopción de medidas correctoras en el caso de quese hayan cometido errores, firma del informe deresultados.

10. ANOTACIONES AL PROCEDIMIENTO La positividad del cultivo en shell vial indica lapresencia de una determinada especie de rickettsiaen la muestra y, por tanto, demuestra que el pacientesufre una infección activa. Para asociar la infecciónal cuadro clínico del paciente deben valorarseconjuntamente todos los datos clínicos yepidemiológicos.

11. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO El cultivo de rickettsias resulta muy laborioso y serequiere personal especializado e instalaciones connivel de seguridad 3, por lo que su realización quedalimitada a los laboratorios que cumplan de este tipode requisitos. Además, debido a su baja sensibilidad,no se recomienda realizar este procedimiento en elcaso de muestras procedentes de pacientes quehayan comenzado un tratamiento antibiótico. Todoello hace que este procedimiento resulte poco viableen la rutina hospitalaria, por lo que debe realizarsesólo en casos seleccionados. Por otra parte, laimplicación de un número creciente de especies derickettsia en patología humana hace que no sedisponga, en ocasiones, de la experiencia adecuadapara la identificación de determinadas especiespotencialmente patógenas. En estos casos, lasmuestras deberán ser remitidas a un centro dereferencia. Una limitación de la técnica es el aumento de latoxicidad de la muestra sobre la monocapa celulardurante el proceso. Esto ocurre especialmente enmuestras como la sangre (fracción leucocitaria) ymuestras de tejidos, precisamente aquellas en lasque mayor significado clínico tiene el cultivo de labacteria.

12. BIBLIOGRAFÍA1. Gouriet F, Fenollar F, Patrice JY et al. Use of shell-vialcell culture assay for isolation of bacteria from clinicalspecimens: 13 years of experience. J Clin Microbiol 2005;10:4993-5002.2. Parola P, Paddock CD, Raoult D. Tick-bornerickettsioses around the world: emerging diseaseschallenging old concepts. Clin Microbiol Rev 2005; 18:719-56.3. Quesada M, Sanfeliu I, Cardenosa N et al. Ten years'experience of isolation of Rickettsia spp. from bloodsamples using the shell-vial cell culture assay. Ann N YAcad Sci 2006; 1078:578-581.4. Vestris G, Rolain JM, Fournier PE et al. Seven years'experience of isolation of Rickettsia spp. from clinicalspecimens using the shell vial cell culture assay. Ann N YAcad Sci 2003; 990:371-374.

DOCUMENTO TÉCNICO

PNT-EMG-08DIAGNÓSTICO DE LAS RICKETTSIOSIS MEDIANTE INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA

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PNT-EMG-08Servicio de MicrobiologíaHospital.................... Diagnóstico de las rickettsiosis mediante

inmunofluorescencia indirecta Edición 01 Página 2 de 4

1. PROPÓSITO Y ALCANCE El objetivo de este documento es describir eldiagnóstico serológico de las rickettsiosis mediante lautilización de la técnica de inmunofluorescenciaindirecta (IFI). Este procedimiento es aplicable a loslaboratorios clínicos que reciben muestras de suerosprocedentes de pacientes con sospecha de infecciónpor Rickettsia spp.

2. FUNDAMENTO Los métodos serológicos se basan en ladetección de anticuerpos específicos frente aRickettsia spp., generalmente de tipo IgG e IgM. Aligual que otras serologías, este método se puedeutilizar para el diagnóstico de la infección, para elseguimiento de la respuesta inmune específica ypara conocer la prevalencia de anticuerpos frente aeste microorganismo. Para la realización de estatécnica los antígenos utilizados, que consisten encélulas infectadas por diferentes especies deRickettsia, están comercializados, estandarizados yprefijados en los portaobjetos, sobre los que seañaden diferentes diluciones del suero del paciente.En el caso de que existan anticuerpos frente alcorrespondiente antígeno, se formará un complejoantígeno-anticuerpo que será revelado mediante unaanti-inmunoglobulina humana de origen animal,marcada con isotiocianato de fluoresceína (FITC) yvisualizado con un microscopio de fluorescencia.

3. DOCUMENTOS DE CONSULTA- Laboratory Biosafety Manual (WHO, 2003).- Manual de instrucciones de funcionamiento ymantenimiento de equipos del laboratorio (centrífuga,termociclador, estufa, etc.).- Preparación de medios, reactivos y viales concultivos celulares.- Procedimiento en Microbiología Clínica de laSEIMC nº 1a de "Recogida, transporte yprocesamiento general de las muestras en ellaboratorio de microbiología", 2003.- Procedimiento en Microbiología Clínica de laSEIMC nº 10 de "Seguridad en el laboratorio demicrobiología clínica", 2000.- Procedimiento del laboratorio sobre gestión deresiduos.- Protocolo del laboratorio de verificación ycalibración de equipos e instrumentos.

4. MUESTRAS4.1. TIPO DE MUESTRA, RECOGIDA,TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN La muestra a analizar mediante IFI de rickettsiases el suero. Éste se recoge según se indica en elProcedimiento en Microbiología Clínica de la SEIMCnº 1a de "Recogida, transporte y procesamientogeneral de las muestras en el laboratorio demicrobiología". PNT-RTP-01 (2003), y se envía encontenedores estériles de un solo uso y con cierrehermético. El suero debe enviarse refrigerado lo

antes posible. Si el envío no se va a realizar demanera inmediata, conviene congelarlo a −20ºChasta su envío, el cual deberá llevarse a cabo enhielo seco para prevenir su descongelación.

4.2. PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS En términos generales, el procedimiento utilizadopara el procesamiento de estas muestras es elhabitual del laboratorio de microbiología. Cuando unamuestra se recibe en el laboratorio, y antes deprocesarse, debe someterse a una inspección previapara asegurarse que ha sido bien seleccionada,recogida y transportada. Las muestras se rechazaránen los siguientes casos: 1) muestra no identificada,2) transporte inadecuado o demasiado prolongado,3) muestra derramada, 4) cantidad insuficiente.Además de estos casos, no se aceptará suerohemolítico ni hiperlipémico. Las muestrasinaceptables no deberán procesarse y el médicodeberá ser informado inmediatamente. En estoscasos, se contactará con el médico solicitante parapedir una nueva muestra.Los consejos generales para optimizar elprocesamiento de las muestras son:1. Comprobar que el etiquetado de la muestra escorrecto.2. Registrar toda la información necesaria quepudiera afectar a la calidad de la muestra y querepresente interés diagnóstico así como aspectosrelacionados con su recogida, transporte yconservación.3. Durante el procesamiento, deben seguirse todaslas medidas de seguridad necesarias, tanto para elpersonal que lleva a cabo la manipulación como parala muestra. Puesto que resulta importante realizar estudioscuantitativos de sueros del mismo paciente a lo largodel tiempo, es fundamental conservar una alícuotacongelada a −20ºC de cada muestra que se analicepara poder realizar en paralelo el estudiocomparativo con las diferentes muestras.

5. MEDIOS DE CULTIVO, REACTIVOS YPRODUCTOS- Tampón fosfato salino (PBS) pH 7,2 (variosproveedores).- Tween 80 (varios proveedores).- PBS-Tween 80: diluir 65±5 µL de Tween 80 en 1 Lde PBS.- Portaobjetos comerciales con el antígeno fijado(BioMérieux, Francia; Focus Diagnostics, USA; yVircell, España).- Anti-inmunoglobulina humana conjugada con FITCde procedencia comercial (varios proveedores).- Cubreobjetos (60 × 24 mm) (varios proveedores).- Líquido de montaje (varios proveedores).- Azul de Evans (varios proveedores).

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6. APARATOS, MATERIAL E INSTRUCCIONES DESEGURIDAD6.1. INSTRUMENTAL- Estufa.- Microscopio de fluorescencia.

6.2. MATERIALES- Tubos de plástico de fondo cónico tipo Eppendorfde 1,5 ml.- Gradillas.- Micropipetas de varios volúmenes.- Puntas para micropipetas.- Pipetas de 5 y 10 ml estériles.- Pipetus.- Vortex.- Matraz aforado de 500 ml ó 1.000 ml para lapreparación de soluciones.- Frasco lavador para el tampón.- Cubreobjetos de 60x24 mm.- Cámara húmeda.- Cubetas de lavado de los portaobjetos.- Sujeta-portaobjetos.

7. PROCEDIMIENTO7.1. PROTOCOLO DE INMUNOFLUORESCENCIAINDIRECTA (IFI)1) Antes de comenzar con la realización de latécnica, atemperar los portaobjetos, controles yconjugados durante 5 min.2) Utilizando placas de microtitulación, realizardiluciones seriadas de los sueros (1/10, 1/20, 1/40,1/80, 1/160, 1/320, 1/640, 1/1280, 1/2560 y 1/5120)con tampón PBS.3) Sacar los portas con el antígeno teniendocuidado de no tocar las áreas con antígeno. Para elmarcado de los portas usar sólo lápiz de punta dura,nunca rotulador.4) Aplicar 10 µl de cada dilución en cada pocillo porduplicado. Incluir un suero control positivo y uncontrol negativo. El positivo consistirá en un suero detítulo alto, procedente de un paciente que ha sufridouna rickettisosis. El negativo será un sueroprocedente de una persona que no ha sufrido estainfección.5) Incubar en cámara húmeda a 37ºC durante 30min.6) Extraer el portaobjetos de la cámara húmeda ylavar 2 veces durante 5 min. en una cubeta con PBS-Tween 80. No mover el portaobjetos dentro del PBS-Tween 80. Sacar los portas y enjuagarlos en otracubeta con agua destilada. Dejar secar los portascompletamente.7) Añadir 10 µL del conjugado a la diluciónrecomendada a cada pocillo, cubriéndoloscompletamente con el mismo. La dilución delconjugado se prepara con una solución de azul deEvans al 1/100 en PBS. Se utilizan los conjugadosanti-IgG, anti-IgM y anti-inmunoglobulinas totales.8) Incubar en cámara húmeda a 37ºC durante 30min.

9) Repetir el punto nº 6 y dejar secar.10) Aplicar líquido de montaje y cubrir con elcubreobjetos sin que se formen burbujas. Eliminar ellíquido de montaje sobrante.

7.2. LECTURA E INTERPRETACIÓN Realizar una observación inmediata en elmicroscopio de fluorescencia con el objetivo de 20×.Si esto no fuera posible, guardar los portas en unlugar oscuro y frío para protegerlos de la desecaciónrealizando la lectura dentro de las siguientes 24 h.- En caso de resultado positivo se observa unafluorescencia puntiforme característica que evidenciala presencia de las rickettsias y contrasta con el rojodel citoplasma celular producido por el azul deEvans.- Los sueros negativos dan lugar a una coloraciónroja uniforme. Durante la observación, se recomienda noconcentrarse mucho tiempo en la misma área,siendo preferible desplazarse por toda la preparacióncon el fin de evitar pérdidas de fluorescencia. Paraello debe hacerse un barrido con objetivo 20×.

7.3. PUNTOS CRÍTICOS EN LA REALIZACIÓN DELA TÉCNICA No existen puntos especialmente críticos fuerade la realización metódica de toda técnica delaboratorio.

7.4. CONTROL DE CALIDAD- El habitual de control de los reactivos.- Cada nuevo lote de suero control positivo debetitularse. El resultado se señalará en el registro decontrol de calidad de reactivos correspondiente.

8. OBTENCIÓN Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS8.1. OBTENCIÓN DE LOS RESULTADOS Para la aceptación de los resultados, esimprescindible la validación del ensayo en funcióndel resultado de los controles y los criteriosestablecidos por el fabricante. El control positivodebe presentar una fluorescencia intensa y brillantede color verde manzana y debe proporcionar el títuloesperado dentro del rango de una dilución mayor omenor. Si el título no es el esperado, se debe repetirtodo el procedimiento. El control negativo debepresentar ausencia de fluorescencia. Unafluorescencia amarillenta o verde oscuracorresponde a una reactividad inespecífica y no debetenerse en cuenta.Evaluación positiva: la fluorescencia específica es deun color verde manzana con una intensidadgeneralmente de 1+ (débil), 2+ (moderado), 3+(brillante), hasta 4+ (muy brillante).Evaluación negativa: ausencia de fluorescencia. Como en todas las serologías, se considera queha tenido lugar una seroconversión cuando alanalizar dos muestras de suero obtenidas de unpaciente con una diferencia de unos 20 días, se

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observa un aumento del nivel de anticuerpos decomo mínimo cuatro veces el título inicial.8.2 EXPRESIÓN DE RESULTADOSLos resultados obtenidos son cualitativos (positivo onegativo) y cuantitativos (título del suero).- A partir de un título único mayor o igual a 1/40 elsuero se considera positivo.- Seroconversión: se observa un aumento del títulode, al menos, cuatro veces entre los dos suerospareados.

9. RESPONSABILIDADES Básicamente serán las siguientes:- Área de recogida y procesamiento de muestras:recepción, identificación y procesamiento de lasmuestras. Rechazo de las muestras remitidas encondiciones defectuosas y adopción de medidascorrectoras.- Personal técnico: control de las muestras,solicitudes y hojas de trabajo, realización de latécnica, lectura de las preparaciones, registro deresultados y archivo de hojas de trabajo.- Facultativo responsable: supervisión del trabajo yde los resultados, resolución de dudas técnicas,interconsultas, adopción de medidas correctoras deerrores cometidos y firma de informes de resultados.

10. ANOTACIONES AL PROCEDIMIENTO Para minimizar la variabilidad entre diferentesensayos, a la hora de estudiar la variación en el títulode anticuerpos en un paciente a lo largo del tiempo,deben analizarse simultáneamente todos los suerosdel paciente. Así, se evitan posibles variaciones deuna o dos diluciones, disminuye el error debido alazar y se aumenta la exactitud de la técnica.Cada suero se debe analizar utilizando losconjugados anti-IgM, anti-IgG o anti-inmunoglobulinas totales. En el caso de ladeterminación de las IgMs, previamente la muestradeberá tratarse con un reactivo comercial para laabsorción de las IgGs, a efectos de eliminar falsospositivos debidos al factor reumatoide. Hay que tener en cuenta que sólo existenportaobjetos comerciales para R. conorii, R. rickettsiiy R. typhi. Para el estudio serológico con otrasespecies, se deben producir los antígenos y prepararlos portas en el propio laboratorio. Esto presenta elinconveniente de que el cultivo de rickettsias resultamuy laborioso, se requiere personal especializado einstalaciones con nivel de seguridad 3, por lo que surealización queda limitada a los laboratorios quecumplan estos requisitos. Para una correcta interpretación de losresultados de serología, deben tenerse en cuenta losdatos de reactividad basal de la población en zonasendémicas.

11. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO La IFI para la detección de anticuerpos frente aRickettsia está considerada la mejor pruebadiagnóstica serológica. Sin embargo, se encuentralimitada por las reacciones cruzadas entre diferentesespecies de rickettsia. Otra limitación común a otrosensayos serológicos, es la necesidad del estudio desueros pareados para poder demostrar unaseroconversión, ya que en ocasiones no se llega adisponer de una segunda muestra de suero. Uninconveniente adicional es que la seroconversiónpuede tardar varias semanas en producirse desde elinicio de los síntomas, retrasando en el diagnóstico.Además, en algunos casos no se produceseroconversión, lo que no excluye la enfermedad.

12. BIBLIOGRAFÍA1. Brouqui P, Bacellar F, Baranton G et al. Guidelines for

the diagnosis of tick-borne bacterial diseases in Europe.Clin Microbiol Infect 2004; 10:1108–1132.

2. Parola P, Raoult D. Ticks and tickborne bacterialdiseases in humans: an emerging infectious threat. ClinInfect Dis 2001; 32:897–928. (Erratum, Clin Infect Dis33:749.).

3. Parola P, Paddock CD, Raoult D. Tick-bornerickettsioses around the world: emerging diseaseschallenging old concepts. Clin Microbiol Rev 2005;18:719-756.

4. Rolain JM, Shpynov S, Raoult D. Spotted-fever-grouprickettsioses in north Asia. Lancet 2003; 362:1939.

DOCUMENTO TÉCNICO

PNT-EMG-09DETECCIÓN DIRECTA DE Rickettsia spp. EN MUESTRAS CLÍNICAS MEDIANTE AMPLIFICACIÓN

GENÓMICA Y SECUENCIACIÓN DEL GEN gltA

ELABORADO REVISADO Y APROBADO

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Este documento es propiedad del Servicio de Microbiología Clínica del Hospital…………….. La información en élcontenida no podrá reproducirse total ni parcialmente sin autorización escrita del Responsable. Las copias noregistradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios.

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clínicas mediante amplificación genómica ysecuenciación del gen gltA

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1. PROPÓSITO Y ALCANCE El objeto de este procedimiento es describir lametodología de detección de las especies deRickettsia en muestras clínicas mediante PCR(reacción en cadena de la polimerasa) convencionaly posterior secuenciación del producto amplificado.Este procedimiento es aplicable a todas las muestrasclínicas con sospecha de rickettsiosis que se recibenen los laboratorios de microbiología clínica querealicen diagnóstico molecular. También es aplicableal ADN extraído a partir de cultivos infectados conmuestras clínicas (ver el PNT-EMG-07: Aislamientode Rickettsia spp. a partir de muestras clínicasmediante cultivo).

2. FUNDAMENTO Las técnicas moleculares son un instrumentovalioso para el diagnóstico etiológico de lasrickettsiosis, ya que pueden detectar en poco tiempoel genoma de cualquier patógeno potencial,independientemente de la viabilidad delmicroorganismo. Estas técnicas se ven menosafectadas que los cultivos por los tratamientosantibióticos previos, aunque también puedendisminuir la sensibilidad, y la obtención de losresultados es mucho más rápida en comparación conel cultivo. Además tienen alta sensibilidad yespecificidad. Por el momento, la mayor parte de lastécnicas descritas son de desarrollo propio (inhouse), no estando comercializadas. Aunque existeuna gran cantidad de dianas descritas, el gen gltA esuna de las más comúnmente utilizadas puesto queestá presente en todas las especies de Rickettsia.

3. DOCUMENTOS DE CONSULTA- Laboratory Biosafety Manual (WHO, 2003).- Manual de instrucciones de funcionamiento ymantenimiento de equipos del laboratorio (centrífuga,termociclador, estufa, etc.).- Preparación de medios, reactivos y viales concultivos celulares.- Procedimiento en Microbiología Clínica de laSEIMC nº 1a de "Recogida, transporte yprocesamiento general de las muestras en ellaboratorio de microbiología", 2003.- Procedimiento en Microbiología Clínica de laSEIMC nº 10 de "Seguridad en el laboratorio demicrobiología clínica", 2000.- Procedimiento del laboratorio sobre gestión deresiduos.- Protocolo del laboratorio de verificación ycalibración de equipos e instrumentos.

4. MUESTRAS4.1. TIPO DE MUESTRA, RECOGIDA,TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN Las muestras más adecuadas para el diagnósticomolecular de rickettsias son sangre extraída concitrato o EDTA, muestra cutánea de la escara deinoculación, contenido de pápulas o máculas y en el

caso de afectación neurológica, LCR. Se recogerásegún se indica en el Procedimiento en MicrobiologíaClínica de la SEIMC nº 1a de "Recogida, transporte yprocesamiento general de las muestras en ellaboratorio de microbiología". PNT-RTP-01. 2003.Las muestras se deben recoger y enviar encontenedores estériles de un solo uso y con cierrehermético.

4.2. PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS: En términos generales, el procedimiento utilizadopara el procesamiento de estas muestras es elhabitual del laboratorio de microbiología, si bien hayque tener en cuenta que la bacteriemia durante unarickettsiosis es menor que en el caso de otrasinfecciones. Esto obliga a recoger mayor cantidad demuestra para obtener un rendimiento óptimo. Las muestras deben manejarse como si tuvieranmicroorganismos potencialmente peligrosos. Cuandouna muestra se recibe en el laboratorio, y antes deprocesarse, debe someterse a una inspección previapara asegurarse que ha sido bien seleccionada,recogida y transportada. Las muestras se rechazaránen los siguientes casos: 1) muestra no identificada,2) transporte inadecuado o demasiado prolongado,3) muestra derramada, 4) cantidad insuficiente. Lasmuestras inaceptables no deben procesarse y elmédico debe ser informado inmediatamente. Enestos casos, se contactará con el médico solicitantepara pedir una nueva muestra.Los consejos generales para optimizar elprocesamiento de muestras son:

1. Comprobar que el etiquetado de la muestra escorrecto.2. Registrar toda la información necesaria quepudiera afectar a la calidad de la muestra y querepresente interés diagnóstico así como aspectosrelacionados con su recogida, transporte yconservación.3. Durante el procesamiento, deben seguirse todaslas medidas de seguridad necesarias, tanto para elpersonal como para la muestra.4. El procesamiento debe llevarse a cabo tanpronto como sea posible garantizando de estaforma la estabilidad del ADN del patógeno.

5. REACTIVOS Y PRODUCTOS5.1. REACTIVOS PARA LA EXTRACCIÓN DE ADN Se utilizará el kit “QIAamp DNA Blood” (QIAGEN,Hilden, Germany), para la extracción de ADN a partirde muestras de sangre, suero y LCR. Para biopsiascutáneas se utilizará el kit “QIAamp DNA Tissue”(QIAGEN).

5.2. REACTIVOS PARA LA AMPLIFICACIÓN(volumen de reacción: 100 µL).- 1× de tampón de PCR.- 0, 2 µM de MgCl2.- Dinucleotidos trifosfato (dNTPs) a 200 µM cada unode ellos (varios proveedores).

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clínicas mediante amplificación genómica ysecuenciación del gen gltA

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- Oligonucleótidos 10 pmol µmol de cada uno deellos:Rp877p: 5’-GGGGACCTGCTCACGGCGG-3’Rp1258n: 5’-ATTGCAAAAAGTACAGTGAACA-3’- 1,25 U Taq polimerasa (varios proveedores).

5.3. REACTIVOS PARA LA ELECTROFORESIS- Tampón TBE 1× (Tris-HCl 100 mM, ácido bórico 90mM, Na2EDTA.2H2O 1 mM; pH 8,3).- Tampón de carga para electroforesis (azul debromofenol 0,25%, cianol xileno FF 0,25%, glicerol30%).- Marcador de tamaño molecular de intervalo 100-1.000 pb (varios proveedores).- Agarosa “Low Melting” (varios proveedores).- Bromuro de etidio (10 mg/ml).- Agua destilada.

5.4. REACTIVOS PARA LA PURIFICACIÓN DELPRODUCTO AMPLIFICADOSe utilizará el kit “QUIAquick gel extraction”(QIAGEN).

5.5. REACTIVOS PARA LA SECUENCIACIÓNSe utilizará el kit “BigDyeTM Terminator CycleSequencing v2.0 Ready Reaction” AppliedBiosystems (USA).

6. APARATOS Y MATERIAL NECESARIOS6.1. INSTRUMENTAL- Cabina de Seguridad Biológica de clase IIA.- Microcentrífuga para tubos de fondo tipo Eppendorfy rotor angular, con velocidad de rotación de 16.000× g.- Agitador orbital tipo vortex.- Bloques de calor seco o termobloques.- Termociclador.- Balanza de precisión.- Espectrofotómetro.- Microondas para fundir la agarosa.- Cubetas de electroforesis.- Fuente de alimentación para electroforesisconvencional.- Transiluminador de UV.- Equipo fotográfico o de captación de imágenes.- Nevera (2-8°C).- Congelador (-20°C).

6.2. MATERIALES- Tubos tipo Eppendorf de 1,5 y 0,2 ml.- Gradillas de diferentes formatos.- Gradillas congeladora (-20°C) y refrigeradora (2-8°C).- Cajas de congelación para tubos Eppendorf.- Micropipetas de diferentes volúmenes- Puntas de micropipeta estériles provistas de filtro aprueba de aerosoles.- Tubo Vacutainer estéril o tubo con tapón de roscapara recogida de LCR.

- Hisopo (torunda) y un tubo Eppendorf con 500 µLde suero salino estéril para resuspender la muestra(raspado o líquido vesicular).- Tubo Vacutainer con anticoagulante EDTA o citratopara extracción de la sangre.- Botellas esterilizadas mediante calor seco parapreparar tampones y geles de agarosa.

7. PROCEDIMIENTO7.1. EXTRACCIÓN DE ADN. Para la extracción de ADN de las muestras seutilizará el “kit QIAamp DNA Blood” para sangre,suero y LCR. Para biopsias cutáneas se utilizará elkit “QIAamp DNA Tissue”. En ambos casos sesegurán las instrucciones del fabricante.

7.2. AMPLIFICACIÓN.7.2.1. Controles necesarios.- Control positivo: ADN de Rickettsia a una diluciónlímite de detección para comprobar la eficacia de laamplificación de la PCR.- Control negativo de extracción: extraer una muestrade agua en las mismas condiciones y a la vez que seextraen las muestras para analizar. Este controlpermite comprobar la ausencia de contaminacionesdurante el proceso de extracción.- Control negativo de PCR: se amplifica una muestradel agua estéril. Este control permite comprobar laausencia de contaminaciones durante el proceso deamplificación.- Para confirmar que el ADN se ha extraídocorrectamente y que no existen inhibidores en lamuestra que impidan el proceso de amplificación,debe amplificarse en cada una de las muestras uncontrol interno, por ejemplo el de la betaglobina queamplifica un fragmento de 150 pb (iniciadores:sense-CATGCCTCTTTGCACCATTC y antisense-TGGTAGCTGGATTGTAGCTG).7.2.2. Condiciones de la PCR.- Un ciclo de desnaturalización a 95ºC durante 2 min.- 40 ciclos de los siguientes pasos:

1. Desnaturalización a 95ºC durante 30 s.2. Hibridación a 45ºC durante 30 s.3. Extensión a 65ºC durante 55 s.

- Un ciclo para completar la extensión de losproductos de PCR. Consiste en una incubación a72ºC durante 3 min.

7.3. ELECTROFORESIS.- Preparar del gel de agarosa al 1% en de tampónTBE 1×.- Cargar el gel, añadiendo previamente el tampón decarga a las muestras. Utilizar uno de los pocillos paracargar el marcador de tamaño molecular.- Conectar la fuente de electroforesis de manera queno se sobrepasen 5 V/cm (considerando la distanciamás corta entre los electrodos). Lo habitual es quese conecte a 100-150 V.- Desconectar la fuente cuando el colorante azul debromofenol esté aproximadamente a la mitad del gel

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clínicas mediante amplificación genómica ysecuenciación del gen gltA

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(aproximadamente 1 hora). Para visualizar losamplicones depositar el gel sobre un transiluminadorcon luz ultravioleta en un lugar oscuro.

7.4. LECTURA E INTERPRETACIÓN Para validar los resultados del ensayo, en lacarrera del control negativo no debe aparecerninguna banda y en la del control positivo debeaparecer una banda de 380 pb. Para poderinterpretar si ha habido amplificación en lasmuestras, debe aparecer en cada una de ellas labanda correspondiente al amplificado de controlinterno.

7.5. PURIFICACIÓN DEL PRODUCTOAMPLIFICADO Y SECUENCIACIÓN El producto amplificado se purifica cortando labanda a partir del gel de agarosa y utilizando el kit“QUIAquick gel extraction kit”, siguiendo lasrecomendaciones del fabricante. Posteriormente, sesomete a una nueva amplificación conconcentraciones limitantes de dideoxinucleótidosmarcados (secuenciación unidireccional). Se utiliza elkit “BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing v2.0Ready Reaction” con los mismos oligonucleótidosque los usados en la fase de amplificación, a razónde 3 pmol por reacción de secuencia. Mediante elempleo de un secuenciador automático losamplificados se resuelven mediante electroforesiscapilar, obteniéndose un cromatograma con lasecuencia de bases. Finalmente, la secuencia de ácidos nucleicos seedita y se compara, mediante el empleo de unsoftware específico, programas de alineamientoutilizando secuencias de referencia o bien mediantecomparación on line con secuencias de bases dedatos (Blastn).

8. OBTENCIÓN Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS Los resultados de PCR se expresan en términoscualitativos de positivo o negativo. Los datos desecuencia permiten identificar la especie implicada. Cuando se notifica un resultado de PCR negativose debe tener en cuenta que, en ocasiones, la cargabacteriana en algunas muestras suele ser muy baja ypor tanto los métodos moleculares pueden no sersuficientemente sensibles, por lo que un resultadonegativo no descarta una infección.

9. RESPONSABILIDADES Básicamente son las siguientes:- Personal del área de recogida y procesamiento demuestras: recepción, identificación y procesamientode las muestras, rechazo de las muestras remitidasen condiciones defectuosas y adopción de medidascorrectoras.- Personal técnico: control de las muestras,solicitudes y hojas de trabajo, realización de latécnica, lectura y registro de resultados, archivo dehojas de trabajo.

- Facultativo responsable: supervisión del trabajo yde los resultados, resolución de dudas técnicas,adopción de medidas correctoras en el caso de quese hayan cometido errores, firma del informe deresultados.10. ANOTACIONES AL PROCEDIMIENTO En el caso de la amplificación del gen gltA que sedescribe en este procedimiento, la elevadaconservación de las secuencias de ADN en lasregiones donde se han diseñado los oligonucleótidospermite que se trate de una PCR genérica. Además,la secuenciación del producto amplificado permitediferenciar a nivel de especie. Otros genescomúnmente analizados tienen el inconveniente deque no están presentes en todas las especies. Es elcaso de dos genes que codifican sendas proteínasde la membrana externa: rOmpA (presente en todaslas especies del grupo de las fiebres manchadas(GFM) excepto R. helvetica, R. australis, R. bellii y R.canadensis) y rOmp B (presente en todas lasespecies excepto R. helvetica, R. bellii y R.massiliae). También se utilizan el gen que codifica laproteína de 17-kDa (válido para todas las rickettsiasdel GFM) y el gen D (válido para la mayoría de lasespecies).

11. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO Si bien la PCR es una prueba ideal para eldiagnóstico de estas infecciones, existen algunasdesventajas en comparación con el cultivo, como sonla limitación para realizar pruebas de sensibilidad alos antibióticos y la imposibilidad de coleccionar losaislados para futuras investigaciones. Se debenestablecer algunos parámetros antes de incorporarestas pruebas a los protocolos de diagnóstico clínicode los hospitales, como por ejemplo definir el controlinterno de inhibición, sensibilidad, especificidad yreproducibilidad de la técnica.

12. BIBLIOGRAFÍA1. Ge H, Tong M, Jiang J et al. Genotypic comparison of

five isolates of Rickettsia prowazekii by multilocussequence typing. FEMS Microbiol Lett 2007; 271:112-117.

2. Regnery RL, Spruill CL, Plikaytis BD. Genotypicidentification of rickettsiae and estimation of intraspeciessequence divergence for portions of two rickettsialgenes. J Bacteriol 1991; 173:1576-1589.

3. Roux V, Rydkina E, Eremeeva M et al. Citrate synthasegene comparison, a new tool for phylogenetic analysis,and its application for the rickettsiae. Int J Syst Bacteriol1997; 2:252-261.

DOCUMENTO TÉCNICO

PNT-EMG-10DETECCIÓN DE ADN DE Tropheryma whipplei EN MUESTRAS CLÍNICAS MEDIANTE PCR

ELABORADO REVISADO Y APROBADO

Jefe de ServicioNombre/Firma Fecha Nombre/Firma Fecha

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muestras clínicas mediante PCR Edición 01 Página 2 de 7

1. PROPÓSITO Y ALCANCE El objetivo del presente documento es describirla metodología que se sigue para la deteccióncualitativa de ADN de Tropheryma whipplei endistintas muestras clínicas (biopsia duodenal,adenopatías, LCR, etc.) mediante PCR. Se describeel procedimiento a seguir para la realización de dostécnicas de PCR en formato convencional coniniciadores específicos del gen 16S ARNr y hsp65 deT. whipplei.

2. FUNDAMENTO La enfermedad de Whipple es una infecciónmultisistémica rara, causada por la bacteriarecientemente descrita Tropheryma whipplei. Laamplificación por PCR con iniciadores específicospermite detectar distintas regiones del ADN de T.whipplei directamente en muestras de biopsias,adenopatías y líquidos estériles. Estas técnicas sonpor el momento, la únicas disponibles para eldiagnóstico de la enfermedad en los laboratorios demicrobiología clínica, ya que el cultivo delmicroorganismo es muy complejo y no hay métodosserológicos fácilmente disponibles. El procedimiento consta de varias fases:preparación de la mezcla de reacción de PCR,extracción del ADN total de la muestra clínica,realización de la PCR en termociclador, detección delos productos amplificados en geles de agarosa,purificación y secuenciación de los mismos,alineamiento de secuencias en Genebank einterpretación de resultados. Para evitar falsos positivos se deben analizar dosregiones distintas del ADN de T. whipplei y secuenciartodos los productos obtenidos para asegurar suidentidad. En este caso, se analizan una parte del genque codifica para el ARN ribosómico 16S de T.whipplei (este gen se encuentra en varias copiasdentro del genoma) y un fragmento del gen quecodifica para la proteína de choque térmico 65 de T.whipplei. Esta última se detecta mediante una PCR“semianidada”. Además se detectará el gen de la β-globina humana, como control positivo de una correctaextracción de ADN de las muestras procesadas.

3. DOCUMENTOS DE CONSULTA- Manual de instrucciones del kit de extracción:QuiAmp DNA Minikit (Quiagen).- Manual de instrucciones del kit de purificación deproductos de PCR: High Pure PCR productpurification Kit (Roche®).- Manual de instrucciones de los termocicladores,microcentrifugas, fuentes y cubetas deelectroforesis).- Normas de gestión de residuos.- Procedimiento en Microbiología Clínica de laSEIMC nº 1a de "Recogida, transporte yprocesamiento general de las muestras en ellaboratorio de microbiología", 2003.

- Procedimiento en Microbiología Clínica de laSEIMC nº 10 de "Seguridad en el laboratorio demicrobiología clínica", 2000.- Registro de calibraciones de los termocicladores.

4. MUESTRAS4.1. VOLANTE DE PETICIÓN El volante de petición que acompaña a cadamuestra debe estar estrictamente cumplimentado yen el deberá constar la filiación, edad, número dehistoria, servicio de procedencia, tipo de muestra (deforma muy específica), tratamiento previo ydiagnóstico del enfermo, así como el código delclínico que realiza la petición. Si se envían muestras desde otros hospitales, esconveniente que estos establezcan previamentecontacto telefónico con el facultativo responsable dela realización de la técnica.

4.2. TIPOS DE MUESTRASSe admiten las siguientes muestras: Biopsiaduodenal (es recomendable obtener varias muestrasde las porciones proximal y distal de yeyuno e íleon),biopsias o aspirados de adenopatías, biopsiascerebrales, válvulas cardiacas, humor vítreo yacuoso, líquidos articular, cefalorraquídeo y pleural.En caso de que no se pueda recoger otra muestra,se podrá enviar sangre periférica (pero elrendimiento es mucho menor que con otrasmuestras).

Se podrán admitir muestras incluidas en parafina otratadas con formol, pero se resaltará en lainterpretación de resultados su menor rentabilidaddiagnóstica. No son admisibles muestras de saliva,orina o heces.

4.3. TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN El rendimiento de las técnicas a realizardepende, en gran medida, de una correctamanipulación y conservación de las muestras.Las muestras se deben recoger asépticamente y a serposible antes del inicio del tratamiento antibiótico. Sedeben introducir en contenedores estériles de tamañoadecuado y deben enviarse rápidamente al laboratoriode microbiología clínica, sin añadir conservantes niaditivos, aunque se pueden introducir en suero salinoestéril, para evitar su desecación si el envío se va ademorar. Es conveniente procesar las muestras de formarápida. Se deben conservar a 4ºC hasta su análisis ydurante un máximo de unos 3 días. Si no es posiblerealizar la extracción de ADN con rapidez o se van aenviar las muestras a un laboratorio externo, se debenconservar congeladas a -20ºC o -70ºC hasta suanálisis. Las muestras no se deben someter a ciclosde congelación y descongelación (una vez congeladassólo se deben descongelar para realizar la extraccióndel ADN). En todos los pasos de obtención y

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manipulación de las muestras, se deben seguirnormas de bioseguridad adecuadas. El líquido articular y la sangre periférica se debenenviar en tubos con anticoagulante EDTA. Si seemplea sangre periférica, se debe analizar en sutotalidad y no solamente el suero. Es preferible noemplear tubos con heparina, ya que inhibe la Taq ADNpolimerasa.

4.4. CRITERIOS DE ACEPTACIÓN Y RECHAZODeben ser cuidadosamente observadas lassiguientes incidencias relacionadas con la muestra:

1ª Muestras mal identificadas.2ª Mala conservación (temperatura inapropiada,muestras en medio no apropiado).3ª Muestras deterioradas (biopsias secas,muestras derramadas, etc.).4ª Muestra insuficiente para las determinacionessolicitadas.

Todas estas incidencias deben comunicarse alservicio peticionario, indicando si se realizará elprocesamiento o no de la muestra y notificando lasincidencias en el volante de resultados y lasprecauciones necesarias a la hora de interpretar losresultados obtenidos.

5. REACTIVOS Y PRODUCTOS5.1 EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ÁCIDOSNUCLEICOS Se puede emplear cualquier métodoconvencional de extracción y purificación de ADN,por ejemplo el método de fenol-cloroformo yadescrito en otros procedimientos (ejemplo PNT-VIR-07). Por su sencillez, recomendamos los métodoscomerciales, basados en la extracción con columnastipo QIAmp DNA Minikit (Quiagen).En caso de muestras incluidas en parafina, éstas selavarán con xileno y etanol absoluto, antes de laetapa de extracción con columnas.

5.2 REACCIÓN DE AMPLIFICACIÓN

• Gen 16 S ARNr

“Master mix“Volumen/reacción

W3FE (5µM)* ………….………..5 µlW2RB (5 µM)……………………5 µldNTP’s (25mM)……….............0,4 µlbuffer 10x**……………………..5 µlMgCl2 (25mM)……....................4 µlH2O libre de nucleasas……..........24,6 µlTaq ADN pol (1U/ µl)................1 µl

45 µl

• Región hsp65

“Master mix 1“Volumen/reacción

whipp-frw1 (5µM)* …………....5 µlwhipp-rev(5 µM) ………….....…5 µldNTP’s (25mM) ……….............0,4 µlbuffer 10x** ……………………..5 µlMgCl2 (25mM) ……....................4 µlH2O libre de nucleasas……..........24,6 µlTaq ADN pol (1U/ µl)................1 µl

45 µl

“Master mix 2“Volumen/reacción

whipp-frw2 (5µM)* …………....5 µlwhipp-rev(5 µM) ………….....…5 µldNTP’s (25mM) ……….............0,4 µlbuffer 10x** ……………………..5 µlMgCl2 (25mM) ……....................4 µlH2O libre de nucleasas……..........28,6 µlTaq ADN pol (1U/ µl) ................1 µl

49 µl

• β-globina humana

“Master mix“Volumen/reacción

β-globF (5µM)* ………….........5 µlβ-globR (5 µM) …...……...........5 µldNTP’s (25mM) ……….............0,4 µlbuffer 10x** ……………………..5 µlMgCl2 (25mM)……....................5 µlH2O libre de nucleasas……...23,6 µlTaq ADN pol (1U/ µl)................1 µl

45 µlNotas:Los iniciadores se preparan en solución stock de 100µM a partir del liofilizado y se conservan a -20ºC.*Entre paréntesis figuran las concentraciones de lasolución de trabajo de cada reactivo.** Se empleará el tampón adecuado para la TaqADN polimerasa que se utilice.Todos los reactivos se conservarán en alicuotas a -20ºC. A la hora de preparar las distintas “mastermixes” se debe considerar, que hay que empleartantos tubos como muestras se procesen, unadilución 1/10 de cada una de las muestras, un controlnegativo cada 5 muestras, un control negativo deextracción y un control positivo.

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Iniciadores de PCR :

Iniciador Secuencia (5’-3’) Regiónamplificada

Tamañoamplicón(pb)

W3FEW2RB

f : GGA ATT CCA GAG ATA CGC CCC CCG CAAr : CGG GAT CCC ATT CGC TCC ACC TTG CGA gen 16S rARN 284

whipp-frw1whipp-rev

f : TGA CGG GAC CAC AAC ATC TGr : ACA TCT TCA GCA ATG ATA AGA AGT T

hsp651ª amplificación 500

whipp-frw2whipp-rev

f : CGC GAA AGA GGT TGA GAC TGr : ACA TCT TCA GCA ATG ATA AGA AGT T

hsp652ª amplificación 357

βglobFβglobR

f: GAA GAG CCA AGG ACA GGT ACr :GGA AAA TAG ACC AAT AGG CAG

β-globinahumana 400

5.3. DETECCIÓN DE AMPLICONES• Agarosa: Preparar un gel de agarosa al 1,4% entampón TBE 1x, de tamaño adecuado a la cubeta deelectroforesis que se utilice.

• TBE 1X: 100ml de TBE 10X comercial+ 900 ml delagua destilada.

• Bromuro de etidio: solución stock de 10mg/ml.Conservar a 4ºC protegido de la luz. Se añaden 5 µla cada 100 ml de suspensión de agarosa. Manipularsiempre con guantes, es un reactivo tóxico.

• Buffer de carga:Azul de bromofenol al 1% .........2,5 mlFicoll ……………………………..2,5 gEDTA 0,5M pH 8 ……………….1 mlAgua destilada ………………….10 ml

• Marcadores de peso molecular (100pb)• Agua destilada• Tampón PBS comercial

5.4. PURIFICACIÓN DE AMPLICONES Para la purificación de amplicones previa a lasecuenciación, se recomienda el empleo de kitcomerciales tipo: High Pure PCR product purificationKit (Roche®).

5.5. SECUENCIACIÓN Kit de secuenciación de ácidos nucléicos, basadoen el método de los dideoxinucleótidos marcados,adaptado al secuenciador disponible.

6. APARATOS Y MATERIAL- Micropipetas (diferentes en cada área de trabajo).- Puntas de micropipeta de “calidad molecular” confiltro.- Gradillas para tubos sarstedt o similares.

- Agitador tipo vortex.- Tubos de reacción de 1,5 ml de “calidad molecular”(tipo sarstedt).- Rejillas, Bases, tubos y tapas de PCR adaptados altermociclador.- Bandeja con hielo.- Cabina de seguridad biológica.- Hojas de bisturí estériles.- Placas de Petri estériles.- Termobloques.- Microcentrífuga.- Termociclador.- Balanza.- Matraces y probetas para preparar la suspensiónde agarosa.- Fuente de electroforesis, bandejas y cubetas.- Horno microondas o baño de agua caliente.- Sistema de visualización de geles contransiluminador UV.- Secuenciador automático de ácidos nucleicos.

7. PROCEDIMIENTO7.1. PREPARACIÓN DE MUESTRAS7.1.1. Distribución de áreas de trabajoÁrea 1 (Se realizará en primer lugar para no tenerque volver a este área)- Preparación de alícuotas de los reactivos del Kit deextracción en tubos sarstedt.- Preparación de “master mixes“.- Distribución de “master mix“ 16S ARNr, β-globina y“master mixes“ 1 y 2 de la región hsp65 en los tubosy placas de PCR.

Área 2- Preparación de las muestras, extracción ypurificación de ácidos nucleicos.- Incorporación del ADN extraído a las los tubos quecontienen cada “master mix“.

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Área 3- Reacciones de amplificación- Detección de amplicones- Purificación de amplicones- Reacciones de secuenciación7.1.2. Preparación de reactivosÁrea 1- Preparación de alícuotas de los reactivos del kit deextracción en tubos sarstedt.- Preparación de “master mixes“ (gen 16S ARNr, β-globina, “master mix“ 1 y 2 de hsp65). Para realizarlos cálculos conviene tener en cuenta el número decontroles positivos y negativos que se van a utilizar.- Distribución de “master mixes“ en los tubos y placasde PCR (se añadirán 45 µl de cada una de las 3“master mixes” 16S ARNr, β-globina y “master mix“ 1de hsp65, a tubos de PCR de placas separadas y 49µl a los tubos de la placa de PCR que contiene la“master mix“ 2 de hsp65). Los tubos con la “mastermix“ 1 de hsp65 y la de β-globina se pueden colocaren la misma placa de PCR, ya que compartensecuencia térmica de amplificación. La preparación de las “master mixes” se deberealizar en hielo y las placas de PCR se debenconservar refrigeradas hasta su utilización (no másde 4 horas). La placa que contiene la “master mix“ 2de la región hsp65 se puede conservar congeladahasta su utilización (no más de una semana).7.1.3. Preparación de muestras Las muestras se deben procesar en el área 2 yen campana de flujo laminar de nivel de bioseguridadadecuado. Todas las muestras se deben atemperarantes de su procesamiento. Las muestras líquidas(sangre, LCR, líquido articular, etc.) se debenhomogenizar completamente. Las muestras de tejidose fragmentarán y homogenizarán con un bisturísobre una placa Petri estéril en condicionesasépticas. Una vez homogenizada, la muestra seintroducirá en tubos sarstedt rotuladosadecuadamente. Es conveniente conservar unfragmento de muestra por si son necesarios análisisposteriores.En caso de muestras incluidas en parafina, éstas selavarán con xileno y etanol absoluto, antes de laetapa de extracción con columnas:- Dividir la muestra en fragmentos pequeños eintroducir en tubo sarstedt.- Añadir 1,5 ml de xileno y agitar en vortex a máximavelocidad 3 min..- Centrifugar a 13.000 rpm 5 min.- Retirar el sobrenadante y repetir una vez más.- Añadir etanol absoluto al pellet y agitar en vortex 3min.- Centrifugar a 13.000 rpm 5 min.- Retirar el sobrenadante de etanol y repetir una vezmás.- Dejar evaporar el etanol retenido por el pellet ylavar con PBS.- Centrifugar a 13.000 rpm 5 min.

- Retirar el PBS y procesar como el resto debiopsias.Las muestras recibidas en formol se lavarán 2 vecescon tampón PBS antes de la extracción del ADN.

7.2. EXTRACCIÓN DE ADN Si se emplean métodos comerciales, se debenseguir las recomendaciones del fabricante para laextracción de ADN de tejidos, líquidos biológicos osangre. Es conveniente prolongar la incubación conproteinasa K, hasta la lisis completa de la muestra(alrededor de 2,5 h). Los líquidos se centrifugarán (1ml) en un tubo tipo sarsted de fondo cónico, a 13.000rpm durante 10 min. Se analizarán pellet ysobrenadante por separado (la totalidad del pellet y500 µl de sobrenadante). Se debe extraer al menos una muestra libre deADN de T. whipplei como control negativo deextracción.

7.3. AMPLIFICACIÓN Y REAMPLIFICACIÓN DEADN DE T. whipplei POR PCRControles: en cada placa de PCR se introducirá uncontrol negativo (agua bidestilada estéril y libre denucleasas) cada 5 muestras, un control positivo(muestra previamente positiva o plásmido construidoa tal efecto) y controles negativos de extracción.• Gen 16S ARNr- Distribuir 45µl de “master mix“ en cada tubo de laplaca de amplificación (en área 1 y en hielo).- Añadir 5µl del ADN extraído, una dilución 1/10,controles negativos y positivos a los distintos tubosde la placa de PCR que contienen la “master mix“(en área 2 y en hielo).- Tapar los tubos e introducir la placa en eltermociclador, con el siguiente programa de PCR:

- Desnaturalización inicial, 94ºC 5 min.- 40 ciclos de PCR: desnaturalización 94ºC 1min., anillamiento 60ºC 1 min., elongación 72ºC1 min.- Elongación final: 72ºC 10 min.- Refrigeración 4ºC

• “Master mix” 1 de hsp65 y β-globina- Distribuir 45 µl de la “master mix“ 1 de hsp65 encada tubo de la placa de amplificación y en paralelootros 45 µl de la “master mix“ de β-globina (en área 1y en hielo).- Añadir 5 µl del ADN extraído, una dilución 1/10,controles negativos y positivos, en cada tubo de laplaca de PCR que contiene 45 µl de cada “mastermix“ (en área 2 y en hielo). En la PCR de β-globinano es necesario incluir una dilución 1/10 de cadamuestra.- Tapar los tubos e introducir la placa en eltermociclador, con el siguiente programa de PCR.

- Desnaturalización inicial: 94Cº 5 min.- 40 ciclos de PCR: desnaturalización 94ºC 1min., anillamiento 57ºC 1 min., elongación 72ºC1 min.

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- Elongación final: 72ºC 10 min.- Refrigeración 4ºC.

• “Master mix“ 2 de hsp65- Distribuir 49 µl de la “master mix“ 2 de hsp65 encada tubo de la placa.- Congelar hasta que termine la primeraamplificación. - Añadir 1 µl del producto de amplificación de la“master mix“ 1 hsp65. Incluir un nuevo controlnegativo y positivo en cada tubo de la placa de PCR(en área 3 y en hielo).- Tapar los tubos e introducir la placa en eltermociclador, con el siguiente programa de PCR:

- Desnaturalización inicial: 94ºC 5 min.- 30 ciclos de PCR: desnaturalización 94Cº 1min., anillamiento 60ºC 1 min., elongación 72ºC1 min.- Elongación final: 72ºC 10 min.- Refrigeración 4ºC.

7.4. DETECCIÓN DE LOS PRODUCTOS DEAMPLIFICACIÓN- Preparar un gel de agarosa al 1,4 % en TBE 1x ycon bromuro de etidio e introducirlo en una cubeta deelectroforesis con TBE 1x.- En tubo sarstedt añadir 2µl de buffer de carga a 10µl de muestra (productos amplificados de lasdistintas PCR’s).- Cargar 10µl de cada una de las muestras en el gel,incluyendo el marcardor de 100 pb.- Correr el gel a 100V hasta que el frente alcance elborde del mismo.- Visualizar el gel con transiluminador UV.7.4.1. Lectura e interpretación de resultados- En la calle del gel correspondiente a los controlesnegativos, no debe observarse ninguna banda deamplificación. Si aparece indica contaminación de laPCR y el ensayo no se debe considerar válido.Todos los controles positivos, deben presentar unabanda de amplificación de tamaño adecuado (16SARNr: 284 pb, hsp65-1: 500 pb, hsp65-2: 357 pb). Enel control positivo de la 2º PCR de hsp65 se puedendetectar 2 bandas de amplificación de 500 pb y357pb o una banda de 357pb. Todas las muestrasdeben presentar la banda de amplificación del gende la β-globina (400 pb), en caso contrario lasmuestras estarán inhibidas y debe repetirse la PCRcon una nueva extracción de ADN. Para que unamuestra se considere positiva, debe presentaramplificación en las dos regiones del ADN de T.whipplei analizadas (16S ARNr y hsp65) y todos loscontroles deben ser positivos o negativos comocorresponda.

7.5. PURIFICACIÓN DE AMPLICONES Una vez obtenida amplificación para una muestradeterminada, se purificarán los ampliconescorrespondientes para, posteriormente, realizar las

reacciones de secuenciación. Se deben seguir lasinstrucciones del kit que se emplee.

7.6. SECUENCIACIÓN Como existen numerosos métodos y aparatos desecuenciación de ácidos nucleicos se deben seguirlas instrucciones del fabricante del sistema desecuenciación que se utilice. Escapa al objetivo deeste PNT describir la técnica de secuenciación deácidos nucléicos.

7.7. ALINEAMIENTO DE SECUENCIAS Para cada muestra, se debe confirmar laidentidad de cada uno de los amplicones obtenidosen el análisis de las dos regiones del ADN de T.whipplei.Se puede realizar en Genebank usando BLAST(Basic-local-alignment-search-tool) software(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Para ello secopia la secuencia obtenida en formato FASTA, en lasección dedicada a ello de la página de BLAST. Seselecciona la base de datos de nucleótidos y seenvía a Genebank, que devuelve por vía electrónicael alineamiento de la secuencia enviada, con lassecuencias similares que se encuentran en la basede datos. El sistema proporciona un porcentaje desimilitud. La obtención de un alineamiento con unporcentaje de similitud ≥99%, con una secuencia dela misma región de T. whipplei que la que se haanalizado, se considera que confirma la identidad delamplicón obtenido.

8. OBTENCIÓN Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS Las muestras se informarán como positivas: si sedetecta una banda de amplificación de 284 pb en laPCR del gen 16S ARNr y bandas de 500 pb y 357 pben las PCRs hsp65 1 y 2, en la muestra sin diluir y/odiluida 1/10. El alineamiento de las secuencias de losamplicones obtenidos, debe tener una identidad ≥99% con una secuencia de la misma región de T.whipplei y la PCR del gen de la β-globina debepresentar una banda de 400 pb para cada muestra. La muestras se informarán como negativas: si nose obtienen bandas de amplificación en las PCRs delgen 16S ARNr ni hsp65 y se obtiene una banda de400 pb. en la PCR de la β-globina. Las muestras se considerarán inhibitorias: si noaparece banda de amplificación de 400 pb. en laPCR de la β-globina, aún después de una nuevaextracción y repetición de la PCR. Si aparecenbandas de amplificación en los controles negativos elensayo se considerará inválido (por posiblecontaminación del proceso) y se repetirá de nuevo.Si los controles positivos no presentan amplificación,se considerará que ha habido algún error deprocesamiento y se repetirá el análisis.

9. RESPONSABILIDADES El proceso de recogida de la muestra esresponsabilidad del servicio solicitante. La

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información sobre las normas de recogida, transportey conservación de las muestras y su distribución alos servicios solicitantes es responsabilidad dellaboratorio de microbiología.Área de recogida y procesamiento de muestras dellaboratorio de microbiología: recepción, identificacióny procesamiento de las muestras. Rechazo de lasmuestras remitidas en condiciones defectuosas(medios de transporte inadecuados, derramadas) yadopción de medidas correctoras.Personal técnico: realización del procesamiento delas muestras y técnicas de PCR. Registro deresultados. Archivo de hojas de trabajo. Archivo dealícuotas de ADN o muestras.Facultativo responsable: supervisión del trabajo,alineamiento de secuencias e interpretación deresultados. Resolución de dudas técnicas.Resolución de errores cometidos. Emisión yvalidación de informes de resultados. Interconsultas.

10. ANOTACIONES AL PROCEDIMIENTO Todo el personal del laboratorio deberá conocer yseguir las normas generales de bioseguridad ehigiene, así como las normas de trabajo enlaboratorios de biología molecular. Todas lasmanipulaciones deben realizarse con guantes. Es importante considerar que para la obtenciónde resultados correctos en un laboratorio dediagnóstico molecular en el que se realizan técnicasde PCR, se debe distribuir el trabajo en 3 áreasperfectamente diferenciadas:

- Area 1 o zona limpia: dedicada a la preparaciónde reactivos. En la que no se introducirán muestrasni reactivos que contengan ADN, tanto amplificadocomo no amplificado. En este área se preparan lasmezclas reacción (“master mix“) de la PCR.- Área 2 o de manipulación de muestras yextracción de ADN. En este área se procesan lasmuestras, se realiza la extracción y purificación delADN y se añade el ADN a la “master mix“. En estazona no se debe introducir ADN amplificado.- Área 3 o de amplificación. En este área sedetectan y procesan los productos de PCR (cargade geles, purificación, etc.).

En cada zona de trabajo debe existir materialindependiente (puntas de micropipeta, micropipetas,guantes, etc.). No se debe trasladar el material deuna zona a otra, salvo el estrictamente necesario. Elflujo de trabajo debe ser: área 1→2→3 y nunca a lainversa. Es importante que para el manejo del materialque esté en contacto con bromuro de etidio, se usensiempre guantes y se extremen las precauciones deseguridad, ya que es un reactivo muy tóxico. Lavisualización de geles con transiluminador UV, deberealizarse con caretas protectoras o en sistemacerrado de visualización de geles.

11. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO El resultado obtenido depende en gran medidade la calidad de la muestra remitida. Las muestras desangre periférica y las enviadas en parafina otratadas con formol, en general tienen bajorendimiento de amplificación. Los resultados obtenidos en las PCRs dependenen gran medida de la realización de las técnicas enhielo. Se desconoce la utilidad de estas técnicas enpacientes en tratamiento. Se recomienda no rechazar muestras sinconsultar previamente con el clínico responsable delpaciente. Ocasionalmente, se pueden producir inhibicionesde la PCR que no permitirán obtener un resultado yque se detectarán por falta de amplificación del genβ-globina humana. En estos casos se repetirá denuevo el procedimiento desde el principio, volviendoa extraer el ADN de la muestra si es posible o en sucaso analizando el mismo ADN y una dilución 1/10.Si aún así no se consigue obtener amplificación elresultado será de: muestra inhibitoria. Excepcionalmente, se pueden obtener resultadosdiscordantes entre las PCRs de las distintas regionesanalizadas. Si una de las dos regiones analizadasaparece como positiva y la otra como negativa o silas secuencias no presentan identidad con T.whipplei, se repetirá el análisis con un nuevofragmento de muestra. Si aún así, se obtienenresultados discordantes, se informará cada PCRcomo positiva o negativa según corresponda y serecomendará interpretar los resultados conprecaución (para su interpretación se deberánconsiderar los datos clínicos del paciente, losresultados de la tinción de PAS de las muestras, losresultados de PCR de otras muestras del mismopaciente, etc.) y si está disponible se podrá analizaruna tercera región del genoma de T. whipplei.

12. BIBLIOGRAFÍA1. Fenollar F, Raoult D. Molecular techniques in Whipple's

disease. Expert Rev Mol Diagn 2001; 1:299-309.2. Marín M, Muñoz P, Sanchez M, et al. Tropheryma

whipplei infective endocarditis as the only manifestationof Whipple's disease. J Clin Microbiol 2007; 45:2078-2081.

3. Morgenegg S, Dutly F, Altwegg M. Cloning andsequencing of a part of the heat shock protein 65 gene(hsp65) of "Tropheryma whippelii" and its use fordetection of "T. whippelii" in clinical specimens by PCR.J Clin Microbiol 2000; 38:2248-2253.

4. Relman DA. 1993. PCR-based detection of theuncultured bacillus of Whipple's disease. p. 496-500. In:Persing, DH; Smith, T; Tenover, FC y White, TJ. (Ed.).Diagnostic molecular microbiology principles andapplications. American Society for Microbiogy.