PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA ENFERMEDAD DE CHAGAS
PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO
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MANUAL DE PROCEDIMIENTOS
LABORATORIO ANÁLISIS DE AGUAS Y ALIMENTOS
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MEDIOS DE CULTIVO
INTRODUCCION
La microbiología como herramienta diagnostica se ha desarrollado gracias al estudio de
los microorganismos a nivel in Vitro y esto solo se puede realizar gracias a la
utilización de los medios de cultivo, que permiten fomentar el crecimiento microbiano
de forma que puedan comprobarse sus características en cultivo. De igual manera
facilita el desarrollo de las características bioquímicas que luego pueden ser
demostrables por observación directa o indirecta por la reacción en presencia de
algunos reactivos.
“ Los microorganismos pueden ser aislados y cultivados fuera de su
nicho ecológico natural” Koch.
DEFINICION
Son alimentos artificiales que semejan un ambiente natural de desarrollo, contienen en
forma asimilable, nitrógeno, hidrocarbonados, lípidos, sustancias orgánicas y sales
minerales; son de presentación usualmente deshidratados y su reconstitución necesita
solamente la adición de agua destilada no necesariamente estéril a la cantidad necesaria
para guardar la proporción según las instrucciones de preparación encontradas en la
etiqueta de frasco.
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CLASES DE MEDIOS DE CULTIVO
Los medios de cultivo se clasifican según su constitución, presencia o no de sustancias
inhibitorias y a su naturaleza así :
1. CONSTITUCION 2. COMPONENTES 3. NATURALEZA
Líquidos Básicos Natural
Sólidos Enriquecidos Artificial
Semisólidos Selectivos
1. Constitución: La constitución de los medios de cultivo esta determinada por la
concentración de Agar (Polisacárido obtenido de algas marinas, químicamente es un
galactano formado por moléculas de galactosa y con la propiedad de ser resistente a
la acción degradativa de la mayoría de las bacterias y de no desintegrarse por los
medios físicos empleados en su preparación) Se usa en reemplazo de la gelatina
porque esta ultima se funde a 37ºC y a la temperatura de las incubadoras adquiere
consistencia de caldo, mientras que el agar mantiene su forma de gel a temperaturas
de incubación.
Las concentraciones de agar determinan 3 tipos de medios de cultivo :
Medios de cultivo sólidos: Aquellos con concentraciones de 1,5% de agar.
Medios Semisólidos: Aquellos con concentraciones de 0,7% de agar
Medios Líquidos: Aquellos con ausencia total de agar.
2. Componentes: Los componentes determinan diversos tipos de medios de cultivo
de acuerdo a la ausencia o presencia de estos.
Medios de Cultivo Básicos Son aquellos medios de cultivo simples, solo
contienen algunos extractos carne (fuente proteica y vitamínica, pequeñas
cantidades de Carbono, Nitrógeno e Hidrogeno) , peptona, sal, agua y agar.
Ej. Caldo Nutritivo, Caldo BHI, Caldo Tioglicolato, Agar nutritivo, Agar
Tripticase soya
Medio de Cultivo Enriquecido: Medios de cultivo básicos que han sido
suplementados con líquidos corporales, Vitaminas especificas, aminoácidos,
proteínas y otras cargas nutricionales
Ej. Agar Sangre de Cordero, Agar Chocolate
Medio de cultivo Selectivos: Son usualmente medios de cultivo básicos o
enriquecidos a los cuales se les han agregado sustancias que impiden el
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desarrollo de algunas bacterias en particular, permitiendo por lo tanto el
aislamiento solo de bacterias seleccionadas. Este tipo de medios se utilizan en
muestras que contienen grandes cargas Microbiológicas.
Los medios Selectivos pueden clasificarse a su vez en :
Medios de cultivo bajamente selectivos : Aquellos que contienen bajas
concentraciones de sustancias inhibitorias y permiten la recuperación de
familias bacterianas.
Ej. Agar MacConkey, Agar EMB (Eosina – Azul de Metileno)
Medios de cultivo medianamente selectivos : Aquellos que contienen
concentraciones medias de sustancias inhibitorias y permiten la recuperación de
géneros bacterianos.
Ej. Agar XLD (Xilosa – Lisina - Desoxicolato), Agar HE (Hektoen enterico),
Agar S/S (Salmonella – Shiguella)
Medios de cultivo altamente selectivos : Aquellos que contienen altas
concentraciones de sustancias inhibitorias y permiten la recuperación
únicamente de especies bacterianas.
Ej. Agar Bismuto Sulfito.
Actualmente existen los medios de cultivo fluorogenos o con sustrato especifico para
determinados microorganismos, que no requieren de periodos de incubación
prolongados, además permiten reacciones muy especificas en cada microorganismo,
disminuyendo de esta forma el tiempo de análisis y son una garantía en la calidad del
diagnostico.
Entre estos tenemos:
Caldo LMX Fluorocult (MUG): Para determinar NMP Coliformes
Caldo Fluorocult Lauryl Sulfato (MUG): Para determinar NMP Coliformes
Caldo Brilla Fluorocult (MUG) Para determinar NMP Coliformes
Agar Chomocult – Recuento de Coliformes
Agar Colistant – recuento de Coliformes
Agar Rambach – Salmonella
3. Naturaleza: Se refiere al tipo de componentes con los que han sido preparados los
medios de cultivo, permitiendo ser clasificados en :
Medios de cultivo naturales : Aquellos que dentro de su composición tienen alto
contenido de productos naturales
Ej. : La Leche
Medios de cultivo artificiales : Son los que tienen mayor concentración de
componentes químicos sintéticos.
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PREPARACION
Una vez realizados los cálculos para el agar deshidratado y el agua, la preparación
homogeneizada se lleva a ebullición y posteriormente se lleva a esterilización a 121ºC
a 15 lb. de presión por un tiempo no mayor a 15 minutos. Una vez terminado este
proceso, se dejan enfriar a temperatura ambiente hasta mas o menos 45ºC, se deja
solidificar en el tubo o se sirven en cajas de petri, posteriormente se conservan en
temperaturas de refrigeración.
CONDICIONES CONTROLADAS
Para garantizar la recuperación microbiana se deben controlar las condiciones químicas
del medio como el pH que debe encontrarse cercano a la neutralidad y depende del tipo
y las especificaciones del medio de cultivo, las concentraciones de Oxigeno y las
condiciones físicas como el tiempo y la temperatura .
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AISLAMIENTO Y CONSERVACION DE MICROORGANISMOS
Para lograr aislar microorganismos se hace necesario elegir el medio de cultivo
adecuado que proporcione las características necesarias de enriquecimiento que
permita el desarrollo bacteriano para posteriormente realizar las técnicas de
inoculación.
El propósito de las técnicas de inoculación es introducir artificialmente una porción de
muestra (inoculo) en un medio de cultivo adecuado con el fin de iniciar su crecimiento.
MATERIALES
Se cuenta con el medio de cultivo previamente seleccionado y para realizar las técnicas
de inoculación primaria se recomienda la utilización de una asa (alambre de nicromo o
platino, recto o circular), un hisopo o mediante el uso de la punta de una pipeta
volumétrica de vidrio en el caso que la muestra provenga de una dilución.
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PROCEDIMIENTO
Existes diversas técnicas de aislamiento microbiano dependiendo del propósito de la
inoculación :
Aislamiento por agotamiento - Siembra por agotamiento
Fundamento : Es diluir (Agotar) el inoculo sobre la superficie de un agar para
lograr obtener UFC (Unidades Formadoras de Colonia) aisladas, las cuales se
pueden luego subcultivar (repicar) individualmente transfiriéndolas a otros
medios de cultivos.
Material : Asa en argolla, medio de cultivo sólido en caja de Petri, material
Microbiológico diluido (En solución liquida o en solución salina)
Procedimiento :
a. Antes de realizar las estrías, el asa debe esterilizarse con ayuda del mechero, lo
que se evidencia por un color rojo encendido a lo largo del alambre
b. Enfriar el asa en un borde del medio de cultivo a utilizar
c. Tomar la muestra y depositarla en un extremo de la caja
d. Realizar siembra masiva en una pequeña porción del agar
e. Posteriormente realizar estrías en cuatro lados con el fin de obtener
crecimiento aislado
2. Aislamiento por estría - Siembra por estría
Fundamento: Es agotar el inoculo sobre la superficie de un agar para lograr
realizar recuento de UFC.
Material: Asa en argolla, medio de cultivo sólido en caja de Petri, material
Microbiológico diluido (En solución liquida o solución salina)
Procedimiento:
Antes de realizar las estrías, el asa debe esterilizarse con ayuda del mechero,
lo que se evidencia por un color rojo encendido a lo largo del alambre
Enfriar el asa en un borde del medio de cultivo a utilizar
Tomar la muestra y depositarla en el extremo superior de la caja y
suavemente deslizarlo hacia el extremo inferior
Posteriormente realizar estrías sobre toda la superficie del agar
4 . Aislamiento por Profundidad - Siembra por profundidad
Fundamento : Es mezclar el inoculo con el agar para lograr realizar recuento de
UFC (Unidades Formadoras de Colonia)
Material : Pipeta volumétrica, medio de cultivo sólido en caja de Petri, material
Microbiológico diluido (Solución liquida, solución salina)
Procedimiento:
Agregar 1 ml de la muestra previamente diluida en la aja de petri .
Verter el medio de cultivo a una temperatura de 40ºC , en la caja de Petri con
el ml de muestra diluida.
Mezclar con el fin de homogeneizar bien la muestra con el medio de cultivo
Dejar solidificar
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5. Aislamiento en superficie - Siembra en superficie
Fundamento : Es diluir el inoculo sobre la superficie del agar para lograr realizar
recuento de UFC
Material : Pipeta volumétrica , medio de cultivo sólido en caja de Petri, material
Microbiológico diluido (En solución liquida o solución salina)
Procedimiento :
Agregar 0.1 ml de la muestra previamente diluida sobre la superficie del
medio de cultivo sólido.
Distribuir la muestra por toda la superficie del agar con la ayuda de un
rastrillo Microbiológico o con la punta de una pipeta volumétrica estéril, con
el fin de obtener UFC aisladas.
6. Aislamiento por Picadura - Siembra por Picadura
Fundamento : Facilitar el desarrollo de las características bioquímicas
microbianas
Material : Asa recta, medio de Cultivo sólido o semisólido en tubo, colonia pura
del microorganismo a evaluar
Procedimiento :
Antes de realizar la picadura, el asa debe esterilizarse con ayuda del mechero,
lo que se evidencia por un color rojo encendido a lo largo del alambre
Enfriar el asa en un borde del medio de cultivo a utilizar
Tomar la muestra y depositarla en el medio de cultivo mediante picadura,
procurando que el asa entre y salga en la misma dirección
7. Aislamiento Mixto - Siembra Mixta
Fundamento : Facilitar el desarrollo de las características bioquímicas
microbianas
Material: Asa recta, medio de Cultivo sólido en disposición inclinada en tubo
(Pico de flauta), Colonia pura del microorganismo a evaluar
Procedimiento :
Antes de realizar la siembra, el asa debe esterilizarse con ayuda del mechero,
lo que se evidencia por un color rojo encendido a lo largo del alambre
Enfriar el asa en un borde del medio de cultivo a utilizar
Tomar la muestra y depositarla en el medio de cultivo mediante picadura,
procurando que el asa entre y salga en la misma dirección
Posteriormente realizar estría por la superficie del agar inclinado.
INTERPRETACION
Partiendo de las observaciones iniciales el microbiólogo se encuentra en capacidad de :
Analizar y evaluar el desarrollo de UFC :
Realizar el protocolo de análisis de crecimiento teniendo en cuenta : tamaño, forma,
elevación, margen, color superficie, densidad , consistencia y hemólisis (solo en
medio de agar sangre)
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Determinar la pureza del cultivo :
Dependiendo del numero de microorganismos diferentes que pueden desarrollarse
en el medio se catalogan como :
Cultivo Puro : Aquel donde solo se obtiene un tipo de crecimiento bacteriano.
Solo un tipo de bacteria, Solo un tipo de UFC.
UFC: Son los descendientes de una sola bacteria; tras muchos ciclos
reproductivos cada bacteria individual genera por fisión binaria una colonia
compuesta de millones de millones de células similares a la original unidas para
hacerse visibles microscópica.
Cultivo Mixto : Aquel que contiene dos o mas tipos diferentes de organismos.
Dos o mas tipos de UFC.
Analizar y decidir si se requieren procedimientos adicionales de identificación
METODOS DE SIEMBRA EN ALIMENTOS
Los métodos de Siembra en alimentos siempre parten de la dilución del alimento con el
fin de poder facilitar el recuento de UFC para entregar un reporte.
Diluciones:
Para la dilución del alimento utilizamos Agua Peptonada al 0,1%, conservando
la relación 1 en 10 ósea 1g o ml del alimento con 9 ml de diluyente. Entre
mayor sea la cantidad del alimento utilizado mucho mas representativo para
determinar la calidad del producto.
Para estas diluciones normalmente utilizamos:
10 g o ml del alimento con 90 ml de agua Peptonada al 0,1%
5 g o ml del alimento con 45 ml de agua Peptonada al 0,1%
1 g o ml del alimento con 9 ml de agua Peptonada al 0,1%
Dependiendo del tipo de alimento se realizan tres o mas diluciones manteniendo
siempre la misma relación.
SIEMBRA.
Desinfectar el área donde se va a trabajar, evitar las corrientes de aire, utilizar la
indumentaria adecuada: Gorro, guantes, tapabocas, delantal blanco de laboratorio con
cremallera, manga larga.
En una balanza colocar el frasco con el diluyente o una bolsa estéril, pesar 10 g del
alimento, llevar a homogenizar en una bolsa estéril al homogenizador de alimentos
(Stomacher, Ultraturrax). Una vez Homogenizado el alimento, realizar las diluciones
tomando del primer frasco o bolsa (Dilución 10-1
) 10 ml y pasarlos a otro frasco con 90
ml de Agua Peptonada al 0,1%, esta queda dilución 10-2
, y así sucesivamente según la
cantidad de diluciones que se vayan a realizar.
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Posteriormente pasar 1 ml de cada dilución a cajas de petri, agregar el medio de cultivo
e incubar según el microorganismo en estudio.
3. AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y RECUENTO DE
MICROORGANISMOS.
Toma de muestra:
La muestra debe ser recogida en la empresa de manera aséptica, la persona encargada
de realizar el muestreo debe tener la dotación adecuada: Delantal blanco manga larga,
Gorro, Guantes, Tapabocas y debe contar con el material necesario para la toma de las
muestras; Cubiertos estériles, Frascos estériles, Bolsas estériles. Debe lavarse y
desinfectarse las manos inmediatamente antes y después de realizar el muestreo, de ser
necesario realizar lavado y desinfección entre cada toma de muestra. Las nuestras se
deben transportar al laboratorio en el menor tiempo posible en neveras plásticas o de
icopor con gel refrigerante.
Recepción de la muestra:
La muestra debe ser recogida en la empresa de manera aséptica y generalmente como se
va a entregar al consumidor (Empaque original), llevada al laboratorio en el menor
tiempo posible y en las condiciones requeridas por la muestra como es el caso de los
productos refrigerados o congelados. Una vez la muestra se encuentre en el laboratorio,
proceder a marcarla con el código respectivo:
01: Alimentos
02: Aguas
03: Físico Químico
los últimos dos dígitos del año, y su respectivo numero consecutivo de llegada de la
muestra al laboratorio.
Procesamiento de la muestra :
Muestras Liquidas: Realizar diluciones 1/10 del producto. Utilizar frascos de
compota con 45 ml de agua peptonada al 0,1% estéril, con pipeta estéril agregar
5 ml de la muestra previamente homogenizada y realizar las diluciones
(manteniendo la relación 1/10) que sean necesarias según el producto.
Muestras Sólidas: Realizar diluciones 1/10 del producto. Utilizar frascos de
compota con 45 ml de agua peptonada al 0,15 estéril, pesar en la balanza el
frasco con tapa, retirar la tapa, colocarla boca arriba en el plato de la balanza,
llevar la balanza a cero. Con cubiertos estériles cortar porciones del alimento
(parte externa e interna) agregar al frasco con el agua peptonada hasta alcanzar
los 5g, proceder a homogenizar la muestra con la ayuda del homogenizador de
alimentos y realizar las diluciones que sean necesarias según el producto.
Una vez preparadas las diluciones proceder a realizar la siembra del producto:
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RECUENTO DE MICROORGANISMOS MESOFILOS AEROBIOS.
Son diferentes microorganismos, patógenos y no patógenos que nos dan un indicativo
de la calidad higiénico sanitaria en la cual fue elaborado un producto. Todos los
microorganismos patógenos son Mesófilos, entre ellos tenemos Estafilococo,
Salmonella, Escherichia coli, etc. Pero no todos los microorganismos Mesófilos son
patógenos.
Aislamiento: De las diluciones realizadas, seleccionar una o dos para realizar
siembra en profundidad y por duplicado, tomar 1 ml de la dilución y pasar a cajas de
petri previamente marcadas en la tapa (Con la fecha, el consecutivo de recepción, la
dilución y el microorganismo en estudio), agregar el medio de cultivo (Agar Plate
Count), a una temperatura +/- 40ºC, homogenizar bien la muestra con el medio de
cultivo suavemente por rotación, dejar solidificar e incubar a 37ºC de 24 a 48 horas.
Recuento: Una vez cumplido el tiempo realizar el recuento de UFC en la dilución
que mejor lo permita, donde encontremos colonia aisladas, sacar el promedio de las dos
cajas, multiplicar por el factor de dilución e informar como Recuento de
Microorganismos Mesófilos aerobios.
RECUENTO DE MOHOS Y LEVADURAS.
Son microorganismos que nos dan un indicativo de la calidad del ambiente donde fue
elaborado un producto o del almacenamiento y manejo de las materias primas. El riesgo
de la presencia de los hongos es que además de darle mal aspecto al producto, producen
toxinas causantes de intoxicación alimentaria, en cuanto a las levaduras son las que dan
inicio a los procesos de fermentación, no son patógenas pero producen sustancias que
no son adecuadas para el consumo humano.
Aislamiento: De las diluciones realizadas, seleccionar una o dos para realizar la
siembra en profundidad y por duplicado, tomar 1 ml de la dilución y pasar a cajas de
petri previamente marcadas en la tapa (Con la fecha, el consecutivo de recepción, la
dilución y el microorganismo en estudio), agregar una gota de suspensión de
Cloranfenicol, para inhibir el crecimiento de bacterias contaminantes, luego agregar el
medio de cultivo Agar Papa Dextrosa (PDA) o Saboraud Dextrosa Agar (SDA) a una
temperatura +/- 40ºC, homogenizar bien la muestra con el medio de cultivo suavemente
por rotación, dejar solidificar e incubar a temperatura ambiente de 5 a 7 días. Una vez
cumplido el tiempo realizar el recuento de UFC en la dilución que mejor lo permita,
donde encontremos colonia aisladas e informar como recuento de Mohos y Levaduras.
NOTA: Todos los medios de cultivo para aislamiento de Mohos y levaduras
requieren de un suplemento antibiótico para evitar el crecimiento de
Bacterias.
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NMP DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES.
Son enterobacterias, microorganismos patógenos y no patógenos que nos dan un
indicativo de la calidad higiénica de la manipulación del producto. Entre los Coliformes
totales tenemos microorganismos patógenos como la Salmonella, y el coliforme fecal es
la Escherichia coli, indeseable en cualquier producto puesto que su presencia indica
contaminación con materia fecal.
Aislamiento: De las diluciones realizadas, sembrar una serie de nueve tubos, por
triplicado cada dilución, tomar 1 ml de la dilución y pasar a cada uno de los tubos, tres
para la primera dilución, tres para la segunda y tres para la tercera. Homogenizar bien la
muestra con el caldo de cultivo suavemente por inversión, incubar a 37ºC de 24 a 48
horas. Una vez cumplido el tiempo observar las siguientes reacciones, según el caldo de
cultivo donde se haya realizado el aislamiento:
Caldo LMX Fluorocult, no requiere campana de Durham. El medio inicialmente
es amarillo muy claro y transparente, la presencia de Coliformes Totales se evidencia
por un viraje del medio de amarillo a azul turquesa, la fluorescencia frente a una
lámpara de luz ultravioleta evidencia la presencia de Coliformes Fecales lo cual se
confirma con la prueba de Indol, agregando unas gotas de reactivo de Kovac´s a los
tubos que dieron positivos para Coliformes Totales (Viraje a azul), la reacción que
presenta es la formación de un anillo color rojo cereza lo cual nos confirma la presencia
de fecales. Las reacciones se comparan con la tabla de NMP.
Caldo Lauryl Sulfato Fluorocult: requiere campana de Durham. El caldo
inicialmente es amarillo muy claro y transparente, la presencia de Coliformes Totales se
evidencia la turbidez del medio y la producción de gas que hace que la campana se
ubique en la superficie del tubo, la fluorescencia frente a la lámpara de luz ultravioleta
evidencia la presencia de Coliformes Fecales lo cual se confirma con la prueba de
Indol, agregando unas gotas de reactivo de Kovac´s a los tubos que dieron positivos
para Coliformes Totales (Turbidez y formación de gas), la reacción que presenta es la
formación de un anillo color rojo cereza lo cual nos confirma la presencia de
Escherichia coli. Las reacciones se comparan con la tabla de NMP y se informa como
NMP de Coliformes totales o fecales.
RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES
Aislamiento: De las diluciones realizadas, seleccionar una o dos para realizar
siembra en profundidad y por duplicado, tomar 1 ml de la dilución y pasar a cajas de
petri previamente marcadas en la tapa (Con la fecha, el consecutivo de recepción, la
dilución y el microorganismo en estudio), agregar el medio de cultivo (Agar
Chomocult, Colinstan Chomogenic Agar), a una temperatura +/- 40ºC (El medio no
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requiere esterilización), homogenizar bien la muestra con el medio de cultivo
suavemente por rotación, dejar solidificar e incubar a 37ºC de 24 a 48 horas.
Recuento: Una vez cumplido el tiempo realizar el recuento de UFC en la dilución
que mejor lo permita, donde encontremos colonia aisladas, realizar el conteo de todas
las UFC para Coliformes Totales (Colonias Rojas y Azules), proceder a realizar el
recuento solo de las color azul para determinar Coliformes Fecales, sacar el promedio
de las dos cajas, multiplicar por el factor de dilución e informar como Recuento de
Coliformes Totales y Recuento de Coliformes Fecales.
RECUENTO DE ESPORAS DE Clostridium SULFITO REDUCTOR.
Los Clostridios son Bacilos esporulados que se encuentran normalmente en el ambiente,
se aíslan de productos cárnicos, derivados de frutas, frutas procesadas, concentrados
para animales, enlatados.
Preparación de la muestra: De las diluciones realizadas, seleccionar una, colocar
10 ml en un tubo estéril y llevar al Baño María a 80ºC durante 10 minutos, luego llevar
el tubo con la muestra a una cubeta con hielo durante 5 minutos, con el fin de activar
las esporas de Clostridium que se encuentren presentes en la muestra mediante choque
térmico.
Aislamiento: Tomar 1 ml de la dilución previamente calentada 10 minutos a 80ºC y
posteriormente enfriada en hielo durante 5 minutos para activar la espora, pasar a tubos
tapa rosca estériles agregar el medio de cultivo (Agar SPS - Sulfito Polimixina
Sulfadiazina, de color verde), a una temperatura +/- 40ºC, homogenizar bien la muestra
con el medio de cultivo suavemente por rotación, dejar solidificar, una vez solidificado
el agar, agregar otra capa de agar, o de glicerina y llevar a incubar normalmente. Una
vez cumplido el tiempo realizar el recuento de UFC en la dilución que mejor lo permita,
donde encontremos colonia negras aisladas y se informa como recuento de Esporas de
C.S.R.
RECUENTO DE Estafilococo COAGULASA POSITIVO.
Es un coco Gram. positivo, microorganismo patógeno, produce intoxicación
alimentaria, se encuentra en productos Cárnicos, Lácteos y de Repostería,
principalmente.
Aislamiento: De las diluciones realizadas, seleccionar una o dos para realizar
siembra en la superficie del Agar Baird Parker de color amarillo (El medio tiene
suspensión de yema de huevo por lo tanto no es posible realizar siembra en profundidad
puesto que al calentar el medio esta se desnaturaliza) y por duplicado, tomar 0,1 ml de
la dilución homogenizar en la superficie del agar con la ayuda de un rastrillo
bacteriológico o de la punta de una pipeta, dejar secar un poco la muestra e incubar a
37ºC de 24 a 48 horas. Una vez cumplido el tiempo se observan colonias negras por la
conversión del telúrito a teluro metálico, las colonias de Estafilococo epidermidis
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presentan la misma característica, las colonias que presentan halos de acalaramiento
alrededor, halos de lipólisis y proteolisis son presumibles de Estafilococo aureus.
Confirmación: De las colonias que sean características, negras y con halos,
seleccionar algunas y realizarles la prueba de Coagulasa, tomar una colonia y
emulsionarla en un tubo con 0,5 ml de plasma de conejo, incubar a 37ºC durante 4
horas y observar la formación del coagulo. Si hay formación de un coagulo estable es
positivo para Estafilococo aureus y se informa como Recuento de Estafilococo
Coagulasa positivo.
Suspensión de Yema de huevo:
Desinfectar los huevos, dejarlos en alcohol durante cinco minutos, en área estéril
separar la clara de la yema. Para 500 ml de yema de huevo, agregar: 4,25g de NaCl y
2,1g de Telurito de Potasio, ajustar a 1000 ml con agua destilada estéril. Agitar con
fuerza. Agregar al medio de cultivo base ya esterilizado y a una temperatura de 45ºC
50ml de Suspensión de Yema de Huevo por 950 ml de medio de cultivo preparado
estéril, mezclar y servir en cajas de petri. Almacenar en refrigeración
RECUENTO DE Bacillus cereus.
Los Bacillus son bacilos Gram. positivos esporulados, microorganismos patógenos,
produce intoxicación alimentaría, se encuentra normalmente en el suelo, polvo,
cereales, productos deshidratados o liofilizados como harinas, féculas, leche en polvo,
café.
Aislamiento: De las diluciones realizadas, seleccionar una o dos para realizar
siembra en la superficie del Agar Mossel (De color rosa, el medio tiene emulsión de
yema de huevo por lo tanto no es posible realizar siembra en profundidad puesto que al
calentar el medio esta se desnaturaliza) y por duplicado, tomar 0,1 ml de la dilución
homogenizar en la superficie del agar con la ayuda de un rastrillo bacteriológico o de la
punta de una pipeta, dejar secar un poco la muestra e incubar a 37ºC de 24 a 48 horas.
Una vez cumplido el tiempo se observan colonias secas similares a la parafina y el
medio vira a color amarillo por fermentación del azúcar .
Confirmación: De las colonias que sean características, seleccionar algunas y
realizarles catalasa (+), Hidrólisis del almidón (+), licuefacción de la gelatina (+) y
coloración de Gram.
PRESENCIA /AUSENCIA DE Salmonella. (Método Sustrato Definido)
Es una enterobacteria, Coliforme total, microorganismo patógeno, produce intoxicación
alimentaría, se encuentra en carnes y sus derivados, leches y derivados, huevos y
derivados.
Preenriquecimiento: Pasar 25 g del Alimento a un erlemmeyer con 225 ml de caldo
de Preenriquecimiento Salmosyst, incubar a 37ºC durante 8 horas. Una vez cumplido el
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tiempo tomar con pipeta estéril 10 ml del caldo y pasar a un tubo tapa rosca estéril,
agregar una pasta del suplemento selectivo Salmosyst, (no agitar) dejar reposar durante
media hora, agitar fuertemente e incubar 24 h. Si no se tiene el caldo Salmosyst,
realizar el procedimiento de Preenriquecimiento en un caldo BHI, Tioglicolato o
Lauryl.
Aislamiento: Del tubo incubado con el suplemento selectivo realizar siembra por
agotamiento en agar Rambach de color rosado (Sustrato especifico), incubar 24 h a
37ºC, al cabo de los cuales se observan:
Colonias Rojas: Salmonella
Colonias Azules: Echerichia coli
Informar como presencia o ausencia de Salmonella en 25 g.
Si no se tiene Agar Rambach se puede utilizar Agar XLD de color rojo, HE de color
azul, Bismuto Sulfito de color verde , S/S de color salmón, pero es necesario realizar
pruebas confirmatorias, por medio de una batería.
PRESENCIA /AUSENCIA DE Salmonella. (Método rápido de Screening: Lateral
Flow System)
Preenriquecimiento: Pasar 25 g del Alimento a un erlemmeyer con 225 ml de caldo
de Preenriquecimiento Dupont, incubar a 37ºC durante 8 horas. Una vez cumplido el
tiempo tomar con pipeta estéril 10 ml del caldo y pasar a un tubo tapa rosca estéril,
introducir la tira Lateral Flow System. Esperar 10 minutos.
Interpretación: Luego de los 10 minutos retirar la tira del tubo y esperar la
aparición de la línea de color rojo que indica la reacción. Una sola línea es Negativo,
Dos líneas es Positivo para Salmonella.
Informar como presencia o ausencia de Salmonella en 25 g.
PRESENCIA /AUSENCIA DE Listeria monocytogenes.
Es un bacilo o coco bacilo Gram. positivo, con extremos redondeados, se encuentra en
el suelo, polvo, agua, aguas residuales, forraje, fango, abonos naturales, agua de río,
carnes, leches, hortalizas.
Preenriquecimiento: Pasar 25g del Alimento a un erlemmeyer con 225 ml de caldo
L- Palcam de color vino tinto, incubar a 37ºC durante 24 horas. Una vez cumplido el
tiempo realizar siembra por agotamiento en agar Palcam, incubar 24 h a 37ºC, en
ambiente microaerofilico (Bombonera con vela) al cabo de los cuales se observan
colonias color verde grisáceo con un halo color marrón negro sobre el fondo rojo cereza
del medio inicial.
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Confirmación: De las colonias que sean características, seleccionar algunas y
realizarles catalasa (+), Movilidad (+) típico en forma de sombrilla, coloración de
Gram. y Prueba de CAMP.
Informar como presencia o Ausencia de Listeria monocytogenes en 25 g
PRESENCIA/AUSENCIA DE Pseudomona aeruginosa.
Es un bacilo Gram. negativo, su determinación es importante a nivel de productos
cosméticos.
Aislamiento: De las diluciones realizadas, seleccionar una o dos para realizar
siembra en la superficie del Cetrimide por agotamiento o siembra masiva con 0,1 ml de
la dilución con la muestra, dejar secar un poco la muestra e incubar a 37ºC de 24 a 48
horas. Una vez cumplido el tiempo se observan colonias verdes con olor característico.
Confirmación: A las colonias que sean características, realizarles confirmación con
una prueba de oxidasa que es positiva, informar como positivo o negativo.
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DETERMINACION DE CAPACIDAD DESINFECTANTE
Conservar cepas puras (ATCC) de los microorganismos que se vayan a avaluar, repicar
a caldo BHI incubar durante 24 h, realizar lectura de la suspensión de microorganismos
en espectrofotómetro a 540 nm, hasta obtener absorbancia de 0,1 que equivale a 106
microorganismos.
Aparte en tubos estériles adicionar 5 mililitros del desinfectante en cada tubo y agregar
en cada uno 0,5 ml del cultivo de cada microorganismo a evaluar con una absorbancia
de 0,1, inmediatamente realizar la siembra en profundidad con Agar Tripticase Soya,
repetir la siembra a los 10, 15, 30, 45 y máximo 60 minutos de contacto del
desinfectante con el microorganismo.
NOTA: es importante controlar el tiempo de contacto con un reloj o cronometro y
mantener los medios de cultivo a la temperatura adecuada para la siembra en el
momento exacto de cumplirse el tiempo de contacto.
Dejar solidificar, montar un control (+) con 0,1 ml de la suspensión del microorganismo
y control negativo solo con el desinfectante. Incubar 24 h a 37ºC, una vez cumplido el
tiempo realizar la lectura, lo ideal es que a partir del tiempo 0, o contacto inmediato no
haya crecimiento de ninguno de los microorganismos es estudio, verificar la turbidez
frente al control positivo (Turbio o con colonias visibles) y al control negativo
(Completamente transparente).
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PROCEDIMIENTO PARA CONTROLES DE PROGRAMA DE L&D
De una correcta Toma, Manipulación y Transporte de las muestras depende la adecuada
custodia de estas para garantizar resultados reales. El transporte debe en ser
refrigeración y no tardar mas de una (1) hora para iniciar el proceso de análisis, de lo
contrario mantener refrigeradas a 4ºC hasta el momento de procesarlas. Dependiendo
del proceso se utilizan diferentes medios de cultivo, si se va a realizar la validación de
un desinfectante post proceso de L&D utilizar Caldo Leethen en lugar de Agua
Peptonada para inactivar el desinfectante y la siembra de Mesófilos Aerobios realizarla
en Agar Tripiticase Soya en lugar de Agar Plate Count, si solo se va a verificar la
calidad higiénico sanitaria durante el proceso, utilizar Peptona y Plate Count.
FROTIS DE MANOS
Toma de muestra: El muestreo se debe realizar en cualquier momento durante el
proceso de elaboración de productos en la empresa, sin previo aviso puesto que la
finalidad es determinar la calidad higiénico sanitaria del personal manipulador en la
planta de proceso. Solicitar educadamente al manipulador el favor de facilitarnos sus
manos para realizar la toma de la muestra.
Procedimiento: Humedecer un aplicador estéril en el tubo con agua peptonada (AP) al
0,1%, eliminar el remanente contra las paredes del tubo y proceder a tomar la muestra
de la palma de la mano del manipulador y de los espacios interdigitales, con la punta
del aplicador tomar muestra de las uñas del manipulador, introducir nuevamente el
aplicador el tubo con AP, quebrar el palo a la altura de la boca del tubo para facilitar la
extracción del aplicador en el momento de la siembra y así evitar manipular la muestra.
Siembra: realizar la siembra única con el método requerido para Mesófilos aerobios,
Mohos y levaduras y para Estafilococo Coagulasa positiva. Para la siembra de
Coliformes totales y fecales se hace en un solo tubo, se incuba de la manera
acostumbrada.
Recuento: Contar y reportar la totalidad de microorganismos que crecen en las cajas
para Mesófilos aerobios, Mohos y Levaduras, informar como UFC/mano. El
Estafilococo informarlo como positivo o negativo, para los Coliformes observar la
turbidez del caldo y si la prueba de Indol es positiva, informar la prueba cono positiva o
negativa según el resultado.
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NOTA: Informar las observaciones realizadas durante el muestreo, por ejemplo:
Unas largas, Cortaduras, Resequedad en las Manos, etc.
FROTIS DE SUPERFICIES
Toma de muestra: El muestreo se debe realizar en cualquier momento durante el
proceso de elaboración del producto en la empresa, sin previo aviso si la finalidad es
determinar la calidad Microbiológica de la superficie en contacto con el producto
durante el proceso. Si se quiere verificar el proceso de limpieza y desinfección, realizar
el muestreo a la Superficie Lavada y desinfectada.
Procedimiento: Colocar en la superficie una plantilla con área establecida o demarcar
el área a muestrear. Humedecer un aplicador estéril en el tubo con agua peptonada
(AP) al 0,1%, o con caldo Letheen para inactivar los desinfectantes luego del proceso
de L&D; eliminar el remanente contra las paredes del tubo y proceder a tomar la
muestra del interior de la plantilla o del área demarcada , en forma horizontal y vertical,
introducir nuevamente el aplicador el tubo con AP, quebrar el palo a la altura de la
boca del tubo para facilitar la extracción del aplicador en el momento de la siembra y
así evitar manipular la muestra.
Siembra: realizar la siembra única con el método requerido para Mesófilos aerobios,
Mohos y levaduras. Para la siembra de Coliformes totales y fecales se hace en un solo
tubo, se incuba de la manera acostumbrada.
Recuento: Contar y reportar la totalidad de microorganismos que crecen en las cajas
para Mesófilos aerobios y mohos y Levaduras, informar como UFC/área. Para los
Coliformes observar la turbidez del caldo y si la prueba de Indol es positiva, informar la
prueba cono positiva o negativa según el resultado.
FROTIS DE UTENSILIOS
Toma de muestra: El muestreo se debe realizar en cualquier momento durante el
proceso en la empresa, sin previo aviso puesto que la finalidad es determinar la calidad
Microbiológica de los Utensilios que están en contacto con el producto en la planta de
proceso.
Procedimiento: Humedecer un aplicador estéril en el tubo con agua peptonada (AP) al
0,1%, eliminar el remanente contra las paredes del tubo y proceder a tomar la muestra
del Utensilio que se va a evaluar, introducir nuevamente el aplicador el tubo con AP,
quebrar el palo a la altura de la boca del tubo para facilitar la extracción del aplicador
en el momento de la siembra y así evitar manipular la muestra.
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Siembra: realizar la siembra única con el método requerido para Mesófilos aerobios,
Mohos y levaduras. Para la siembra de Coliformes totales y fecales se hace en un solo
tubo, se incuba de la manera acostumbrada.
Recuento: Contar y reportar la totalidad de microorganismos que crecen en las cajas
para Mesófilos aerobios y mohos y Levaduras, informar como UFC/utensilio. Para los
Coliformes observar la turbidez del caldo y si la prueba de Indol es positiva, informar la
prueba cono positiva o negativa según el resultado.
FROTIS DE EQUIPOS
Toma de muestra: El muestreo se debe realizar en cualquier momento durante el
proceso en la empresa, sin previo aviso si la finalidad es determinar la calidad
Microbiológica del equipos en el momento del proceso. Si se quiere verificar el proceso
de limpieza y desinfección, realizar el muestreo al equipo lavado y desinfectado.
Procedimiento: Humedecer un aplicador estéril en el tubo con agua peptonada (AP) al
0,1%, eliminar el remanente contra las paredes del tubo y proceder a tomar la muestra
del interior del Equipo, introducir nuevamente el aplicador el tubo con AP, quebrar el
palo a la altura de la boca del tubo para facilitar la extracción del aplicador en el
momento de la siembra y así evitar manipular la muestra.
Siembra: realizar la siembra única con el método requerido para Mesófilos aerobios,
Mohos y levaduras. Para la siembra de Coliformes totales y fecales se hace en un solo
tubo, se incuba de la manera acostumbrada.
Recuento: Contar y reportar la totalidad de microorganismos que crecen en las cajas
para Mesófilos aerobios y mohos y Levaduras, informar como UFC/equipo. Para los
Coliformes observar la turbidez del caldo y si la prueba de Indol es positiva, informar la
prueba cono positiva o negativa según el resultado.
CONTROL DE AMBIENTES
Para Empresas de alimentos:
Toma de muestra: En el sitio donde se va a realizar el muestreo destapar dos cajas de
petri plásticas, previamente marcadas, dejando los agares expuestos al medio ambiente,
una caja con Agar Papa Dextrosa con Cloranfenicol para la determinación de mohos y
levaduras, la otra con Agar Plate Count para Mesófilos aerobios. Dejar destapadas
durante 15 minutos, al cabo de los cuales de tapan las cajas y se llevan al laboratorio
para proceder a roturarlas e incubarlas según la necesidad:
Mohos y levaduras: temperatura ambiente de 5 a 7 días.
Mesófilos aerobios: 37ºC, de 24 a 48 horas
Psicrofilos: 5 a 7ºC , durante siete días.
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Recuento: Contar y reportar la totalidad de microorganismos que crecen en las cajas
para Mesófilos aerobios y mohos y Levaduras, informar como UFC/15 minutos.
Para empresas de cosméticos o Farmacéuticas:
Toma de muestra: En el sitio donde se va a realizar el muestreo destapar dos cajas de
petri plásticas pequeñas, previamente marcadas, dejando los agares expuestos al medio
ambiente, una caja con Saboureaud para la determinación de mohos y levaduras, la otra
con Agar Tripticase Soya para Mesófilos aerobios. Dejar destapadas durante 30
minutos, al cabo de los cuales de tapan las cajas y se llevan al laboratorio para proceder
a roturarlas e incubarlas según la necesidad:
Mohos y levaduras: temperatura ambiente de 5 a 7 días.
Mesófilos aerobios: 37ºC, de 24 a 48 horas
Recuento: Contar y reportar la totalidad de microorganismos que crecen en las cajas
para Mesófilos aerobios y mohos y Levaduras, informar como UFC/15 minutos.
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LAVADO, SECADO, ESTERILIZACIÓN DE MATERIAL
Todo el material de vidrio debe lavarse, secarse en el horno secador a una temperatura
de 60ºC, una ves este seco, se debe empacar o envolver en papel Kraf y llevar a
esterilizar en el autoclave. Una vez estéril secar nuevamente en el horno secador y
almacenar para ser utilizado posteriormente. El paquete que se destape no se debe
utilizar puesto que corremos el riego de contaminación.
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MANEJO DE DESECHOS (MATERIAL CONTAMINADO)
Todo material de desecho Biológico o contaminado se considera de alto riesgo, por lo
tanto se debe manejar de la siguiente forma:
Todo material que se utilice para el crecimiento, aislamiento e identificación de
microorganismos debe ser llevado al autoclave antes de ser desechado. Las cajas
de petri con microorganismos y los tubos de NMP con crecimiento se deben
esterilizar en autoclave a una temperatura de 120ºC. 15 Lbs psi durante 15
minutos, posteriormente dejar solificar el agar y descartarlo en bolsa roja. Tener
en cuenta como descartar los productos:
Material reciclable: Papel, Cartón, Vidrio (Llevarlo al parqueadero)
Material para incinerar: Descartar en bolsa de color rojo. EMAS recoge la
basura semanalmente, en este basurero deben ir
depositados los siguientes desechos:
o Restos de alimentos que se encuentren contaminados
o Medios de cultivo estériles y solidificados
o Cajas de petri desechables
o Aplicadores
o Tubos Swab Rinse Kit
Basura común: va para el relleno sanitario, y es la basura que comúnmente se
descompone, desechos orgánicos, se arroja por el shut.
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ANALISIS DE AGUAS
Las muestras de Agua para análisis Microbiologicos deben ser tomadas asépticamente
en frascos estériles y transportadas al laboratorio refrigeradas y en el menor tiempo
posible. De no ser así mantenerlas refrigeradas. Las condiciones de la toma de la
muestra son iguales a las de alimentos; dotación completa.
Toma de muestra:
La muestra debe ser recogida aséptica, la persona encargada de realizar el muestreo
debe tener la dotación adecuada: Delantal blanco manga larga, Gorro, Guantes,
Tapabocas y debe contar con el material necesario para la toma de las muestras; Frascos
estériles, Debe lavarse y desinfectarse las manos inmediatamente antes y después de
realizar el muestreo, de ser necesario realizar lavado y desinfección entre cada toma de
muestra. Las nuestras se deben transportar al laboratorio en el menor tiempo posible en
neveras plásticas o de icopor con gel refrigerante.
Recepción de la muestra:
Una vez la muestra se encuentre en el laboratorio, proceder a marcarla con el código
respectivo:
02: Aguas
los últimos dos dígitos del año, y su respectivo numero consecutivo de llegada de la
muestra al laboratorio.
Procesamiento de la muestra :
Agua Tratada: Agregar a la muestra 0,1 de Tiosulfato para inactivar el cloro.
Realizar siembre directa
Agua No Tratada: Realizar diluciones 1/10 del agua a analizar. Utilizar frascos
de compota con 45 ml de agua peptonada al 0,1% estéril, y realizar las
diluciones que sean necesarias según el producto.
RECUENTO DE HETEROTROFOS.
Son diferentes microorganismos, patógenos y no patógenos que nos dan un indicativo
de la calidad higiénico sanitaria del agua.
Aislamiento: Realizar siembra en profundidad y por duplicado, tomar 1 ml de la
dilución y pasar a cajas de petri previamente marcadas en la tapa (Con la fecha, el
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consecutivo de recepción, la dilución y el microorganismo en estudio), agregar el medio
de cultivo (Agar Plate Count), a una temperatura +/- 40ºC, homogenizar bien la muestra
con el medio de cultivo suavemente por rotación, dejar solidificar e incubar a 37ºC de
24 a 48 horas.
Recuento: Una vez cumplido el tiempo realizar el recuento de UFC en la dilución
que mejor lo permita, donde encontremos colonia aisladas, sacar el promedio de las dos
cajas, multiplicar por el factor de dilución e informar como Recuento de Heterotrofos.
RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES.
Son enterobacterias, microorganismos patógenos y no patógenos que nos dan un
indicativo de la calidad del agua a analizar. Entre los Coliformes totales tenemos
microorganismos patógenos como la Salmonella, y el coliforme fecal es la Escherichia
coli, indeseable en cualquier producto puesto que su presencia indica contaminación
con materia fecal.
Aislamiento: Realizar siembra en profundidad y por duplicado, tomar 1 ml de la
muestra y pasar a cajas de petri previamente marcadas en la tapa (Con la fecha, el
consecutivo de recepción, la dilución y el microorganismo en estudio), agregar el medio
de cultivo (Agar Colistant), a una temperatura +/- 40ºC, homogenizar bien la muestra
con el medio de cultivo suavemente por rotación, dejar solidificar e incubar a 37ºC de
24 a 48 horas.
Recuento: Una vez cumplido el tiempo realizar el recuento de UFC en la dilución
que mejor lo permita, donde encontremos colonia aisladas, sacar el promedio de las dos
cajas, multiplicar por el factor de dilución e informar como Recuento de Coliformes
Totales y fecales así:
Coliformes Totales: Colonias transparentes y azul violeta
Coliformes fecales. Colonias Azul Violeta.
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BIBLIOGRAFÍA.
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Cámara de la industria de Alimentos ANDI. Santa fe de Bogotá.
ECOLOGÍA MICROBIANA DE LOS ALIMENTOS – ICMSF – Editorial
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NTC ISO 22.000 Sistema de gestión de la inocuidad alimentaria. ICONTEC
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www.invima.gov.co