Presentacion Tesis FINAL WG 2010

El Sistema linamarasa/linamarina/glucosa oxidasa como tratamiento potencial contra

gliomas en cerebros de ratas desnudas

Willie Girald RosaUniversidad Autónoma de MadridCentro de Biología Molecular Severo Ochoa

Tumores CerebralesTumores primarios: derivados de componentes

cerebrales.Tumores secundarios: derivados de células

tumorales localizadas en otras areas del organismo (metástasis)

Clasificación tumores primarios:◦ Tumores de evolución lenta (bajo grado)

Grado I: benignos, crecimiento lento y circunscriptos Grado II: crecimiento lento, pero con límites imprecisos o de

extensión.◦ Tumores de evolución rápida (alto grado)

Grado III: tumores anaplásicos Grado IV: malignos, crecimiento muy rápido en todas las

regiones examinadas histologicamente. Desarrollo a partir de un astrocitoma difuso o anaplásico, pero comúnmente

se presenta de novo sin evidencias de lesiones anteriores.

El Glioblastoma Multiforme (GBM)

Representa el 25% de todos los tumores cerebrales, el 55% de los tumores del grupo glioma y el 90% de los gliomas de los hemisferios cerebrales del adulto. ◦ La punta de incidencia es la edad media de la vida. Hombres

doble que mujeres. Tratamientos:

◦ Convencionales: neurocirugía, quimioterapia y radioterapia.◦ No convencionales: terapias génicas, viroterapias y otros.

Sistema linamarasa/linamarina/Glucosa Oxidasa (lis/lin/GO)

Reacción lis/lin

Reacción GO/glucosa

Efecto del sistema lis/lin/GO en la célula

La terapia causa depleción de ATP, fisión mitocondrial y consecuentemente muerte celular

Estudios previos sobre el efecto in vitro e in vivo del sistema lis/lin/GO

o Estudios previos han demostrado el efecto de la terapia:o in vitro

• Células de glioma canino• Células humanas tumorales: HeLA, U-373 MG,

PC-3• Explantes de gliomas de pacientes

o in vivo• Reducción de masa tumoral significativa en

flancos de ratones inmunodeficientes

Objetivos Validación del sistema lis/lin/GO en el cerebro de

ratas rnu/rnu Determinar la cantidad del cocktail terapéutico

que posee el mayor efecto terapéutico y el menor efecto tóxico

Potenciar el sistema lis/lin/GO con agentes que aumenten el estres oxidativo en la célula

Estudiar los sistemas de suministro intracranial de fármacos para el sistema nervioso central

Establecer las condiciones para trasladar la terapia combinada lis/lin/GO de in vitro a in vivo

Linea de células U87MG-lis y efecto del sistema lis/lin/GO in vitro

Procedentes de gliomas Transformadas con el plásmido pILE

◦ Contiene el gen epo-lis La proteina terapéutica linamarasa se produce

constitutivamente Ensayo de viabilidad celular del sistema lis/lin/GO

500 ug/ml linamarina5.5 mUE/ml GO48h a 37ºC

Modelo AnimalRatas desnudas (inmunodeficientes)Genotipo rnu/rnu

◦ Mutación autosómica recesiva en el locus rnu del cromosoma 10

Ratas atímicas ◦ Principal característica inmunológica es

que son deficientes en células TPoseen actividad normal de células BElevada población de células

asesinas natas (NK) y de macrófagos

Diseño Experimental

Cirugía Estereotáxica

Confirmación del Tumor por Resonancia Magnética

Aplicación de Estrategias para el Tratamiento del Tumor

Implantación Células U87MG-lis

Local Sistémico

Diagrama Coronal indicando el lugar para la Implantación Intracraneal de las

células U87MG-lis

Estereotáxico

Confirmación del desarrollo del tumor por Resonancia

Magnética

Axial Coronal Sagital

•Resonancias Magnéticas (RM)• Potenciadas en T1: se utiliza agente contraste

para delinear el volumen del tumor y su localización.

• Potenciadas en T2: se emplea para visualizar el edema y acumulación del fluido.

Confirmación de la producción de la linamarasa por Western Blot e Inmunotinción

Verde: linamarasaAzul: núcelos teñidos con DAPI

Sistemas de suministro de fármacos empleados en la terapia combinada lis/lin/GO

Bomba Osmótica (BO)Modelo 2ML1Volumen total 2 ml10 µl/hora/7dias

Bomba Osmótica (BO)Modelo 2001Volumen total 200 ul1 µl/hora/7dias

Inyección intratumoralJeringa Hamilton de 10ul1µl/min

Bomba Osmótica

Moderador de flujo

Cateter

Cánula de infusión cerebral

Estrategias para la validación del sistema lis/lin/GO

Tratamiento localLis-Lin-GO

(Resuspensión de célulasen lin/GO; I-D)

Grupo ISub-grupos A-D

Inyecciones Intracraneales

Tratamiento Sistémico Lis-Lin-GO + BSO

Grupo IV

+2ML1

Subcutaneo

Intraperitoneal

Tratamiento local y SistémicoLis-Lin-GO

Grupo III+

2ML1

Subcutaneo

Intraperitoneal

Tratamiento local y SistémicoLis-Lin-GO

Grupo VSub-grupos A-G

+ +2ML1

Cánula

M2001(200ul)

Cánula


Grupo II

+

Tratamiento SistémicoLis-Lin-GO

Grupo VI

7 dias

Subcutáneo A-F

Intraperitoneal A-D

Subcutáneo

Tratamiento local de los animales del Grupo I

Grupo Experiment

al

Animales

Control

AnimalesTratados

Tipo de Administració

n

Linmg/ml

GOUE/ml

Curadas

Muertas por

toxicidad

Muertas por tumor

Grupo In=25 Subgroupos: I-A n=12 I-B n=4

I-C n=4

I-D* n=5

4

1

1

1

8

3

3

4

200 µl BOs (i.c.)

200 µl BOs (i.c.)

200 µl BOs (i.c.)

200 µl BOs (i.c.)

36

50

50

50

14

20

40

30

0

0

0

4

0

0

3

0

12

4

1

1

Total 7 18 4 3 18

M2001 Cánula


Grupo ISub-grupos A-D

+

*Células fueron resuspendidas en PBS con el cocktail 250mg lin-150 UE GO antes de la implantación

(i.c.-canula intracraneal)

Resumen de Resultados del Grupo I

M2001 CánulaTratamiento localLis-Lin-GO

+Grupo ISub-grupos A-D

61% 17% 22%

Sub-grupo A

Sub-grupo D(Resuspensión en 250 mg/ml lin +150 UE/ml GO)

Muerte por Toxicidad

Muerte por Tumor

Sobrevivieron

Tratamiento local de los animales del Grupo II


Group II

Inyecciones Intracranial

Grupo Experiment

al

Animales

Control

Animales

Tratados

Tipo de Administraci

ón

Linmg/ml

GOUE/ml

Curada

Muertas por

toxicidad

Muertas por tumor

Grupo IIn=7

2 5 1-i.t./6d of 10l 250 150 0 0 7

i.t. (inyeccion intratumoral ); d. (dia o dias); GO (glucosa oxidasa); lin (linamarina)

Modificaciones del tratamiento:•Eliminación de BO 2001•Solo inyecciones intracraneales por 6 dias

Resumen de Resultados del Grupo II

A: antes del tratamientoB: después del tratamiento Kaplan Meier (p=0,291);

estadisticamente significante

Local TreatmentLis-Lin-GOx

Group IIIntracranial injections


Muerte por Tumor

Sobrevivieron

Tratamiento sistémico de los animales del Grupo III

Grupo Experiment

al

Animales

Control

Animales

Tratados


ón

Linmg/ml

GOUE/ml

Curadas

Muertas por

toxicidad

Muertas por tumor

Grupo III n=12

2 10 BOs2-ip/d/3d 1-sc/d/3d

250--

-15.531

0 0 12

Tratmiento sistemicoLis-Lin-GO

Grupo III

+

2ML1

Subcutaneous

Intraperitoneal

i.t. (inyeccion intratumoral ); i.p. (inyeccion intraperitoneal ); s.c. (inyeccion subcutananea); d. (dia o dias; OB (bomba osmotica, suministra a 10/h/7days); GO (glucosa oxidasa); lin (linamarina)

Modificaciones del tratamiento:•Primer grupo tratado sistémicamente con BOs 2ML1 e inyecciones intraperitoneales y subcutaneas.

Butionina Sulfoximina (BSO) como posible potenciador del sistema lis/lin/GO

Inhibe la ruta de la biosíntesis del glutation. Actua sobre la enzima gamma-glutamilcisteina sintasa. Inhibición provoca depleción de glutation el cual es un metabolito clave en la

protección celular contra el estrés oxidativo.

•Permite generación de ROS•Efecto anti-angiogenesis

Estudios in vitro con la butionina sulfoximina y el sistema lis/lin/GO

Estudios de toxicidad del BSO y GO en ratas Wistar

BSOCiclo 1.20 mmol/kg/dia/3 días

(Skapek et al)

2 inyecciones-I.P. día/3d 40 mg

1 inyección- S.C. noche/3d 80 mg

Glucosa Oxidasa

2 inyecciones- I.P. día/3d 1mg/ml

1 inyeccion- S.C. noche/3d 2mg/mln = 6I.P. = intraperitonealS.C. = subcutaneod = dia o diasNingún efecto tóxico del BSO fue observado bajo estas condiciones

BSO + GO

n = 4

15 UE/mlGlucosa Oxidasa

30 UE/mlGlucosa Oxidasa

+2ML1

7 dias de tratamiento

+

No-Tóxico

TóxicoCánula

GO intracraneal

Tratamiento sistémico lis/lin/GO/BSO de los animales del Grupo IV

Tratamiento sistémicoLis-Lin-GO + BSO

Grupo IV

+

2ML1

Subcutaneo

Intraperitoneal

GrupoExperimental

AnimalesControl

AnimalesTratados

Tipo de Administración

Linmg/ml

GOUE/ml

BSOmM

Curdas Muertas por

toxicidad

Muertas por

tumor

Grupo IVn=6


225--

015.531

8004590

0 1 5

i.t. (inyeccion intratumoral); i.p. (inyeccion intraperitoneal ); s.c. (inyeccion subcutanea); d. (dia or dias); BSO (Butionina sulfoxamina); BO (Bomba osmotica, suministra 10/h/7days); GO (glucosa oxidasa); lin (linamarina)

Modificaciones del tratamiento:•Primer grupo tratado sistémicamente con BSO; dosis de BSO adaptadas de estudios por Skapek et al.

Resumen de Resultados del Grupo IV


Muerte por Tumor

Sobrevivieron

A: ControlB, C y D : después del tratamiento

Tratamiento sistémicoLis-Lin-GO + BSO

Grupo IV +2ML1

Subcutaneous

Intraperitoneal 20% 80%

Tratamiento local de los animales del Grupo V-A

Grupo Experiment

al

Animales

Control

Animales

Tratados


n

Linmg/ml

GOUE/ml

Curadas

Muertas por

toxicidad

Muertas por tumor

Sub-grupo V-A n=2


40050

100

2.515.531

1 1 0

Tratamiento local y sistémicoLis-Lin-GO

Sub-grupo V-A+

2ML1

Subcutaneo

Intraperitoneal

+

Observaciones:•Residuo de 700 µl fue medido en la BO de la rata curada•Sangramiento nasal y cianosis fue observado en unas de las ratas.•La rata que sobrevivió fue sacrificada a los 156 días para análisis histopatológico.

Modificaciones del tratamiento:• Eliminación del BSO•Aumento significativo de linamarina a 400 mg/ml•Primer grupo tratado con suministro del cocktail via cánula intracraneal conectada a BO 2ML1.•Primeras BOs conteniendo GO• Tratamiento sistemico con linamarina (I.P. & S.C.)

Estudio sinérgico de GO durante diferentes tiempos de incubación

Vida media de la enzima GO es de 30 min a 37°C Ensayo de viabilidad con células U87MG-lis

¿Podría afectarse el efecto sinérgico de la glucosa oxidasa en el sistema lis/lin/GO durante los 7 días de tratamiento?

-20

0

20

40

60

80

100

120

0h 6h 29h 52h 73h 169h 192h 216h control

Surv

ival

%

Horas de pre-incubación de GO a 37ºC

Tratamiento local y sistémico de los animales del Grupo V-C


Sub-grupo V-C+

2ML1

Subcutaneo

Intraperitoneal

+

Grupo Experiment

al

Animales

Control

Animales

Tratados


ón

Linmg/ml

GOUE/ml

Curada

Muertas por

toxicidad

Muertas por tumor

Sub-grupo V-C n=2


40050

100

207.531

1 1 0

Modificaciones del tratamiento:•Reducción de GO intracraneal de 40 UE a 20 UE en BO•Reducción de GO intraperitoneal de 15.5 UE a 7.5 UE•Eliminacion de Inyección intratumoral (i.t.) de GO

Observaciones:•Residuo de 720 µl fue medido en la BO de la rata curada•Residuo idéntico al de la rata curada del grupo V-A

Resumen de Resultados del Grupo V-CRegresión del Glioblastoma después del tratamiento

AntesPre-tratamiento

Después14 días

post-tratamiento

MRI T123 días

post-tratamiento

MRI T223 días

post-tratamiento

MRI T145 días

post-tratamiento

Tratamiento local y sistémico de los animales del Grupo V-E


Sub-grupo V-E+

2ML1Subcutaneo

+

Grupo Experiment

al

Animales

Control

Animales

Tratados


ón

Linmg/ml

GOUE/ml

Curada

Muertas por

toxicidad

Muertas por tumor

Sub-grupo V-E n=3

0 3 BOs2-sc/d/3d

40050

180.212

1 2 0

Modificaciones del tratamiento:-Reducción de GO en BO de 20 UE a 18 UE-Reducción significativa de GO subcutanea de 12.4 UE a 0.212 UE-Se eliminaron las inyecciones intraperitoneales

Observaciones:•Residuo de 620 µl fue medido en la BO de la rata curada•Residuo muy parecido al de la rata curada del grupo V-A y V-C•Las BOs de ratas muertas por toxicidad suministraron los fármacos a una razón mas rápida de lo normal (1ml en menos de 48h)

Resumen de Resultados del Grupo V-ERegresión del Glioblastoma después del tratamiento

Axial T1Control

2 días post-implantación

Sagital T1 Axial T114 días post-tratamiento

Tratamiento local y sistémico de los animales del Grupo V-F

Grupo Experiment

al

Animales

Control

Animales

Tratados


ón

Linmg/ml

GOUE/ml

Curada

Muertas por

toxicidad

Muertas por tumor

Sub-grupo V-F n=6

0 6 BOs2-sc/d

40050

100.212

0 6 0

BO de 2ML1


Sub-grupo V-F+

Subcutáneo+

Modificaciones del tratamiento:•Reducción de GO en BO de 18 UE a 10 UE

Observaciones:•Las BOs de ratas muertas por toxicidad suministraron los fármacos a una razón mas rápida de lo normal (1.2 ml en menos de 48h)

Tratamiento local de los animales del Grupo V-G

Tratamiento Local Lis-Lin-GO

Sub-grupo V-G+

2ML1

Grupo Experiment

al

Animales

Control

Animales

Tratados


n

Linmg/ml

GOUE/ml

Curadas

Muertas por

toxicidad

Muertas por tumor

Sub-Grupo V-G n=2

0 2 OPs 400 2.5 0 1 1

Modificaciones del tratamiento:•Reducción de GO en BO de 10 UE a 2.5 UE

Observaciones:• La BO de la rata muerta por toxicidad suministró los fármacos a una razón mas rápida de lo normal (1 ml en menos de 48h)• Las condiciones utilizadas no fueron terapéuticas para la rata tratada. El sistema de infusión intracraneal se le removió al tercer día.

Tratamiento solamente sistémico por 7 días de los animales del Grupo VI

Grupo Experiment

al

Animales

Control

Animales

Tratados


ón

Linmg/ml

GOUE/ml

Curadas

Muertas por

toxicidad

Muertas por tumor

Grupo V-G n=5

0 5 2-s.c/d/7d 50 0.212 1 0 4

Tratamiento sistémicoLis-Lin-GO

Grupo VI

7 diasSubcutáneo

Modificaciones del tratamiento:•Eliminación del tratamiento con BOs y cánula intracraneal•Prolongación del tratamiento sistémico a 7 días

¿Podría haber un caso de remisión por parte del sistema inmune del animal?

Observaciones:• Muy probablemente la barrera hematoencefálica y la barrera hematotumoral previenen que los componentes del cocktail lleguen al cerebro.

Remisión del tumor en rata del grupo VI MRI T1Antes

2 dias pos-implantación

MRI T1Después5 días

pos-tratamiento

MRI T2Después5 días

pos-tratamiento

MRI T118 dias pos-implantación CSC-5

Rata muere a los 78 días

La rata fue implantada con lineas de células aisladas de gliomas de pacientes (CSC-5) y no se observó remisión de estos tumores.

Resumen de resultados de los tratamientos

Tratamiento local & sistémico lis-lin-GO

Grupo VSub-grupos A-G + +

2ML1Cánula 86%14%

Subcutaneo A-F

Intraperitoneal A-D


Muerte por Tumor

Sobrevivió

Tratamiento sistémicolis-lin-GO-BSO

Grupo IV

2ML1

Subcutaneo

Intraperitoneal

+20% 80%

M2001 CánulaTratamiento locallis-lin-GO

+Grupo ISub-grupos A-D

61%17% 22%

Tratamiento locallis-lin-GO

Grupo IIInyecciones intratumorales

100%

Tratamiento sistémicolis-lin-GO

Grupo III +2ML1

Subcutaneo

Intraperitoneal 100%

Tratamiento sistémico lis-lin-GO

Grupo VI

7 díasSubcutaneo100%

Diseño Experimental II

Ratas rnu/rnu implantadas con U87MGlis

Tratamiento lis/lin/GO local y sistémico36-96 horas

Extirpación del área tumoral y extracción de proteínas

Western Blot

Linamarasa MHC I humano

Detección in vivo e in vitro de las proteinas linamarasa y MHC I humana

In vivo en Ratas rnu/rnu In vitro en células U87MGlis

Efecto tóxico a corto tiempo

Conclusiones El sistema lis/lin/GO podría eliminar tumores pequeños de

gliomas en el cerebro de ratas inmunodeficientes pero cuando lo hace, es tóxico para los animales. La hipotética ventana terapéutica es probablemente muy estrecha.

◦ No hemos conseguido el efecto terapéutico buscado usando el cocktail lis/lin/GO con los tratamientos locales empleados, teniendo en cuenta los actuales sistemas de administración del fármaco disponible.

◦ Los tratamientos sistémicos no son terapéuticos probalemente debido a la barrera hematoencefálica.

◦ El efecto letal del cocktail terapéutico podría erradicar completamente el tumor implantado en ratas inmunodeficientes en menos de 48 horas a concentraciones que son demasiado tóxicas al animal.

Presentacion Tesis FINAL WG 2010

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