Tema 19: Genmica

Genmica y Protemica y sus aplicaciones biofarmacuticasDr. Marcos Mendoza MejaEscuela de Ciencias de la SaludUniversidad del Valle de MxicoCampus Lomas VerdesIV Congreso de Ciencias Qumicas, Ambiental y BiotecnologaRiviera Maya, Q. Roo. 10 Nov. 2012Objetivos:Estimular el inters hacia las ciencias micas y sus aplicaciones en las ciencias biolgicas y de la salud. Promover en los estudiantes el espritu crtico hacia el potencial de la investigacin biotecnolgica para el desarrollo de la humanidad.Presentar elementos de juicio que permitan comprender la importancia de que en Mxico se haga investigacin en Genmica y Protemica.

ADELA-EMILIA GMEZ AYALA , O F F A R M , VOL 26 NM 4 ABRIL 2007Descripcin de las ciencias micas que han generado un cambio cuantitativo apreciable en el anlisis de la genmicaEl Proyecto Genoma Humano se inici en 1990 previsto para el 2007, sin embargo, se termin el 26 de Junio de 2000, con la secuenciacin de todo el genoma humano de unos 30,000 genes y 3 mil millones de pares de bases (pb).

Con la secuenciacin completa del genoma humano, los investigadores pueden mover su enfoque del hallazgo de genes, el cual puede ser manejado a travs de la base de datos, hacia el entendimiento de la funcin de dichos genes y luego a la PROTEMICA5Humanos30,000 genesGENOMICAChimpanc30,000 genesA. thaliana25,000 genesRatn30,000 genesC. elegans19,000 genesD. melanogaster13,000 genes

98% idntico70% idntico20% idntico60% idnticoDe 289 geneshumanos implicados enenfermedades,hay 177cercanamentesimilares a los genes deDrosophila. El genoma humano es 10 veces mas pequeo que el genoma de la salamandra Bolitoglossa subpalmata y 200 veces mayor que el de la AmebaEntre una persona y otra el ADN solo difiere en 0.2%GenmicaESTRUCTURAL:Caracterizacin de la naturaleza fsica de genomas completosFUNCIONAL:Caracterizacin del proteoma y de los patrones globales de expresin gnicaCaracterizacin molecular de genomas completos

7Proteomaconjunto completo de genes de un genoma que determinan protenas.

Estructural saber qu genes hay, qu marcadores.

La tecnologa del DNA, unido a avances informticos, ha permitido el desarrollo de una serie de tecnologas que nos permiten analizar en un mismo experimento la expresin de miles de genes o la variacin de cientos de variantes genticas en un elevado nmero de individuos en relativamente poco tiempo y dinero.

Estos avances se han utilizado para la construccin del genoma, para determinar procesos moleculares complejos que dan lugar a las enfermedades o para la asociacin entre polimorfismos y enfermedades. Actualmente la industria farmacutica incluso pretende identificar variantes individuales que hacen que unos individuos respondan bien a un tratamiento y otros no.Qu es un polimorfismo?cules conoces?para qu puede servir el anlisis de estos polimorfismos?cmo se han construido los mapas del genoma?para qu nos sirven?ContenidosIntroduccinPolimorfismos del DNA: tipos, metodologa de estudio y aplicacionesCartografa de los genomas, nuevas herramientas Identificacin de un genEstrategias para el conocimiento del genoma: ejemplo del genoma humanoMapas genmicos de especies domsticasGenmica funcionalDNA eucariticoGenes funcionales de copia nicaDNA de secuencia repetidaDNA separadorSecuencias funcionalesSecuencias sin funcinconocidaSecuencias funcionalesNo codificantesFamilias de genes codificantes(y pseudogenes asociados)Familias de genes dispersosFamilias de genes en tndemRepeticiones heterocromatinaDel centrmeroVNTRSecuencias derivadasDe transposicionesTransposonesRetrotransposonesClasificacin del DNA eucariotaGenmica estructuralCaracterizacin de la naturaleza fsica de genomas:- Polimorfismos del DNA- Cartografa

10Genmica estructural: Caracterizacin de la naturaleza fsica de genomas fsicosSi os acordais de la clasificacin del DNA eucariota que dbamos a principios de curso, haba toda una serie de DNA repetido sin funcin conocida, bien, vamos a volver a recordar este tipo de DNA pero desde otra perspectiva, desde el punto de vista de polimorfismo o variante gentica.ContenidosIntroduccinPolimorfismos del DNA: tipos, metodologa de estudio y aplicacionesCartografa de los genomas, nuevas herramientas Identificacin de un genEstrategias para el conocimiento del genoma: ejemplo del genoma humanoMapas genmicos de especies domsticasGenmica funcionalPolimorfismo genticoExistencia de distintos alelos:Polimorfismo bioqumico:Deteccin de variacin al nivel del producto del gen: protenas, enzimasPolimorfismos del DNA:Variaciones presentes en la secuencia de basesPolimorfismos producidos por mutaciones puntualesPolimorfismos del nmero de repeticiones en tndem12Polimorfismo existencia de distintas formas. Los polimorfismos genticos han ido variando a lo largo del tiempo, en un primer lugar se hablaba de diferencias fenotpicas (semilla lisa, semilla rugosa). Estas variantes se asociaron a variantes allicas de los genes.Conforme fueron avanzando las tcnicas analticas, pasamos a poder analizar otro tipo de polimorfismos, otro tipo de variaciones que tuvieran su origen en el genoma y surgieron los polimorfismos bioqumicos. Podamos analizar protenas, ver sus diferencias en la migracin por electroforesis (debidas a cambios de carga que a su vez se deben a cambios aminoacdicos y, por tanto, a cambios en el gen).Finalmente, la tecnologa del DNA recombinante nos ha llevado a poder analizar directamente el DNA, no sus productos. As, se ha ampliado de gran manera un nmero de polimorfismos genticos que podemos analizar y, con ello, ampliar las aplicaciones de la utilizacin de los mismos.Estos polimorfismos a veces no tienen ningn significado biolgico pero veremos que nos pueden ser de gran utilidad. Variacin de un nucletido en una posicin determinada. Frecuencia:1/1000pb Tambin conocidos como SNP (Single Nucleotide Polymorphisms)Polimorfismos debidos a mutaciones puntualesCambios de bases:Transiciones:Purina Purina:Pirimidina Pirimidina: TransversionesPurinaPirimidina: Pirimidina Purina

Alelo 1Alelo 2TACGAGCTATACGGGCTAAGPurinas

TCPirimidinas13Mutacin puntual es la que afecta nicamente a un nucletido, supone la sustitucin de un nucletido por otro. Ya vimos en un tema anterior que consecuencias pueden tener estas mutaciones, cambios de protenas o no si son silentes. En este tema las veremos nicamente como polimorfismos. Estas mutaciones puntuales son muy frecuentes ya que no tenemos en cuenta nicamente aquellas que se encuentran en regiones codificantes sino tambin aquellas que se encuentran en el DNA espaciador o en intrones, an as, van a ser tiles.SNP: Single Nucleotide Polymorphisms:Polimorfismo muy frecuente (1/300 pb)10 a 30 millones de SNP en el genoma humanoDos posibles alternativas en cada individuoHerencia es muy estable (baja tasa de mutacin 10-6 vs 10-3 de los microsatlites)Fcil estandarizacinAplicaciones en la determinacin de enfermedades y en farmacogenticaDeteccin de los SNP:RFLP:Southern BlotPCR + RFLPSecuenciacinMinisecuenciacinSondas especficasSSCPsPCR en tiempo realRFLPsDeteccin mediante enzimas de restriccin:Southern BlotPCR+RFLPNormalmente determinados en exonesRFLPs-SNP Origen: mutaciones puntuales Variabilidad: 2 alelos Localizacin: exones, intrones, regiones reguladoras, DNA espaciador15RFLPs se identifican principalmente en exones porque de ellos conocemos las secuencias para crear sondas. Sin embargo, cualquier fragmento de DNA genmico nos servira para detectar RFLPs, independientemente de si se trata de regin codificante o no.Deteccin de mutaciones puntualesRFLP:Alelo 1Alelo 2TGGACGTCTTGGATGTCT

MCL1Aat IIAlelo 1 Alelo 2

Sonda16Primera: PCR+RFLP, tenemos un fragmento amplificado en el cual sabemos que hay un polimorfismo que puede ser detectado por una enzima de restriccin. Si est la secuencia la corta y nos da dos bandas y si no dar slo una. Esto lo vern los alumnos en prticas, con la deteccin del SSP mediante esta tcnica.

Cuando no conocemos la secuencia del gen pero tenemos una sonda de otra especie y buscamos polimorfismo mediante esta tcnica podemos realizar un southern blot. (tecnica descrita en el tema referente al DNA recombinante, al final). Simplemente decir que se puede detectar por esta tcnica.

Deteccin de mutaciones puntualesMinisequencingExplicar la minisecuenciacin. Como se visualiza: electroforesis capilar o en microarray17

18Introducir que pueden servir como marcadores para diagnosticar una enfermedad. Explicar el ejemplo y recordar la recombinacin.VNTRTamao (Kb)Unidad repeticinMtodo deteccinSatlites100-500 20 kbCentrifugacin ClCsElec. campos pulsadosMinisatlites0,1-2020-40 pbElec. Agarosa SouthernMicrosatlitespb1-4pbElec. AcrilamidaSecuenciacinPolimorfismos debidos a variaciones en el nmero de repeticiones de DNA en tndemDNA satlite: repeticiones de formaciones muy grandes (100 kb y algunas Mb)DNA no transcritoRegiones de heterocromatina, principalmente en centrmeros (DNA alfoide)DNA minisatliteRepeticiones de tamao moderado (60pb)Distribuidas por todo el genoma, principalmente en telmerosNormalmente no se transcribenTipos:DNA minisatlite hipervariableDNA telomricoPolimorfismos debidos a variaciones en el nmero de repeticiones de DNA en tndemDNA minisatlite hipervariableLocalizacin dispersa en todos los cromosomas, entre 0,1-20 kb de longitud, de repeticiones en tndem cortasSecuencia repetida comn (core):GGGCAGGAXGSon muy polimrficasSe encuentran en intronesEstas secuencias se han empleado como huellas dactilares

Los minisatlites se determinan mediante RFLPs + Southern corte con enzimas de restriccin y determinacin de los fragmentos hibridando con una sonda que reconoce la secuencia core

En la diapositiva se muestra un punto concreto de un cromosoma, pero tened en cuenta que en un cromosoma puede haber muchos ms minisatlites

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VNTRs22Una de las primeras sondas VNTR que se detect se obtuvo a partir de una repeticin en tndem que haba en un intrn del gen de la mioglobina humana. Posteriormente se vio que la regin central se encontraba en muchos otros minisatlites si bien la secuencia que se repeta poda tener un tamao distinto y no tena por qu ser igual en distintos VNTR.

Debido a la gran variabilidad observada se convirtieron en unas herramientas de gran valor en el anlisis de la individualidad gentica.110468INDIVIDUO 2117134523335921324132433INDIVIDUO 12468135791113572461135724681135724681352462461357221357913524221024684 5 7 9 10 11 8 6 INDIVIDUO 1

INDIVIDUO 2

FingerprintsDNA microsatlite (STR): Short Tandem RepeatPequeas formaciones (generalmente < 150pb) de repeticiones en tndem de secuencias muy simples (de 1 a 4 nucletidos)Repartidas por todo el genoma, normalmente en intrones. Frecuentes y altamente polimficos (nmero medio de alelos 10)Herencia mendeliana codominante

CACACACACACACACACACACACACACACACAAlelo 1Alelo 2Polimorfismos debidos a variaciones en el nmero de repeticiones de DNA en tndemVisualizacin de los microsatlites

ACGT

Secuenciacin:

Genotipado:

27Los microsatlites tambin los podemos usar como marcadores asociados a fenotipos concretos, por ejemplo una enfermedad. No sabemos qu mutacin produce la enfermedad pero si tiene un marcador asociado podemos seguir ese marcador en una filogenia y ver con qu alelo est ligado.Implicaciones de las secuencias microsatlites en patologas: Expansin de microsatlites de trinucletidos:Sndrome de X frgil (FMR-1) (CCG)nDistrofia miotnica (DM) (CTG)nEnfermedad de Huntington (HD) (CAG)nAtaxia de Friedreich (FA)Nueve formas de ataxia espinocerebelar (SCA)Expansin de tetranucletidos: DM2Expansin de pentanucletidos: SCA10

Enfermedades humanas se han creado animales modelo28Aunque la funcin de los microsatlites no es conocida, se han aportado distintas hiptesis desde no tener funcin a tener algn tipo de participacin en:Regulacin de puntos activos de recombinacinControl de segregacin de los cromosomas (por su localizacin centromrica)Estabilizacin de los cromosomas durante la replicacin (por su localizacin en telmeros)Podran dar estabilidad a los cromosomas

Adems se han implicado algunos microsatlites a enfermedades concretas, como causantes de las mismas. No se conocen enfermedades animales producidas por microsatlites.

Mecanismos de patogenicidad de los microsatlites:Enfermedades de herencia recesiva ligada al X expansin de tripletes que interfiere la transcripcin del gen mutado (no protena)Enfermedades con herencia dominante expansin de tripletes produce una protena alteradaEnfermedades con herencia dominante producidas por expansiones en regiones no codificantes expansiones en el ARN funcin celular alterada?

Secuencias de DNA dispersas

DNA basura?- Regulacin de la expresin? Mecanismo de reparacin? Puntos de recombinacin?

Aplicaciones de los polimorfismos del DNA:Diagnstico genticoLigamiento con fenotiposIdentificacin individual Construccin de los mapas gnicos

Tcnicas bsicas: Extraccin del DNA genmico Electroforesis Hibridacin (Southern, Northern) Restriction Fragment Lenght Polymorphism Reaccin en Cadena de la Polimerasa Secuenciacin (mtodo de Sanger) ClonacinDiagnstico gentico directo: Mutaciones puntuales Inserciones, deleciones Repeticiones en tndem Transcripcin diferencial Procesamiento alternativo del RNA Metilacin

RFLPs, Secuenciacin, chipsPCR, SouthernPCR, secuenciacinRT-PCR, Northern, chips RT-PCR, North.MPCR32MPCR Esta tcnica consiste en una reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) posterior al tratamiento del DNA genmico con bisulfito sdico. El bisulfito sdico convierte las bases del DNA llamadas citosinas en otras distintas llamadas uracilos, si dichas citosinas no se encuentran metiladas. Esta estrategia permite diferenciar el alelo materno (metilado) y el paterno (no metilado).

Diagnstico gentico indirecto:Anlisis de marcadores genticosXGen alteradoMarcador polimrficoMutacin puntualMicrosatliteRFLPDelecinInsercinGenotipo del marcador Genotipo del gen daado

Identificacin individual:Marcadores fenotpicos (HLA, Gr. Sanguneos) Anlisis de marcadores microsatlites PCR, secuenciacin Fingerprinting (minisat.)

Deteccin mediante RFLP + Southern

MicrosatlitesMinisatlitesControl de filiacinControl de libros genalgicosContenidosIntroduccinPolimorfismos del DNA: tipos, metodologa de estudio y aplicacionesCartografa de los genomas, nuevas herramientas Identificacin de un genEstrategias para el conocimiento del genoma: ejemplo del genoma humanoMapas genmicos de especies domsticasGenmica funcionalMapas del genoma:Mapa genticoPosiciones relativas de los genes entre si, sin anclaje fsicoDistancia entre marcadores determinada por la frecuencia de recombinacin en la meiosisMapa fsicoPosicin exacta de un genDistancia entre marcadores determinada por n de pb

Mapas genticosRequerimientosExistencia de polimorfismo en los genes a mapearAnlisis de familias informativas (AaBb x AABB)Estudios de ligamiento :Herencia ligada al cromosoma XMarcadores polimficos asignados a paneles de familias Alozimas Polimorfismos del ADN (microsatlites, RFLPs) Caza de genes relacionados con enfermedades o caracteres productivos: Fibrosis Qustica (9 aos) humanoMapas fsicosResolucinCromosoma (paneles de clulas hbridas somticas)Banda cromosmica (FISH)Clulas hbridas irradiadasSecuencia nucleotdica

ContenidosIntroduccinPolimorfismos del DNA: tipos, metodologa de estudio y aplicacionesCartografa de los genomas, nuevas herramientas Identificacin de un genEstrategias para el conocimiento del genoma: ejemplo del genoma humanoMapas genmicos de especies domsticasGenmica funcionalEstrategias para la identificacin de un genClonado posicionalClonado funcionalGen candidatoIdentificacin del fenotipoMapaGenMutacionesFuncinFuncinGenMutacionesMapaGenMutacionesMapaFuncinIdentificacin de un genIdentificacin clsicaEstudios en familias(modo de herencia)Anlisis de ligamiento o mapa fsico(identificacin de la regin cromosmica)Acotar la zona cromosmica(clonaje en YAC)Anlisis de los clones (contigs, bsqueda de marcadores, ORF, mutaciones)genEstudios de expresinGenmicaEstudios de expresingenmutacionesGen de doble musculaturaCrecimiento anormal del tejido muscular debido a una hipertrofia (=hiperplasia)20% ms de rendimiento de carneAumento de cortes con gran valor econmicoCarne magraMuy buena conversin alimentariaDificultades en el parto

Azul BelgaPiamontesaLimusinaCharolsAsturiana de los Valles1995: Carcter controlado por un gen mayor mh42Hiperplasia se consigue con ejercicioGen de doble musculaturamh?Identidad?Localizacin cromosmica

Azul Belga x Frisona

Rastreo del genoma con microsatlites

Regin BTA2 prxima centrmero

MYOS-/-MiostatinaGen candidatoMYOS 2q11Mutaciones con efecto fenotipo: Doble musculaturaDescripcinTipo de mutacinRazainsercin/delecin en la posicin 418Corrimiento en el marco de lecturaBelgian blue, Asturianas, Rubia Gallega, Aubractransicin C T en la posicin 610Sin sentido - terminacin prematura de la protenaCharolistransversin G T en la posicin 676Sin sentido - terminacin prematura de la protenaMaine-Anjou, ParthenaisDelecin de 11 pb desde la posicin 821 hasta la 831Corrimiento en el marco de lectura - terminacin prematura de la protenaBelgian blue, Limousine, South Devon, Asturiana de los Vallestransicin G A en la posicin 938Transversin consentido. Cys Tyr en la proteinaPiemontese, GasconMutaciones sin efecto fenotipo: Normalestransversin C A en la posicin 282Mutacin consentido. Phe Leu en la proteinaLimousine, Aubrac, Devon, Pirenaicatransicin C T en la posicin 414Transicin silente sin cambio en la protenaAmpliamente distribuidaTipificacin de animales:

Diagnstico indirecto:- microsatlitesDiagnstico directo:- mutaciones MYOSHerencia autosmica recesivaLigamiento vs asociacinLigamiento:Identificacin de regiones del genoma con un n de alelos compartidos en individuos afectados > al esperado (en familias)Anlisis de 500 polsRegiones candidatas y acotamiento de la reginAlelos raros de alto riesgoAsociacin:Anlisis de individuos afectados no emparentados e identificacin de alelos compartidosFacilidad para la obtencin de muestrasNecesidad de analizar miles de marcadoresAlelos de accin modesta en enfermedades comunes

ContenidosIntroduccinPolimorfismos del DNA: tipos, metodologa de estudio y aplicacionesCartografa de los genomas, nuevas herramientas Identificacin de un genEstrategias para el conocimiento del genoma: ejemplo del genoma humanoMapas genmicos de especies domsticasGenmica funcionalMapa genmico:Representacin lineal de los sitios genmicos importantes (genes y marcadores)1990: Proyecto Genoma Humano (National Institute of Health and the Department of Energy, USA)

Construccin del mapa fsico y genticoDeterminar la secuencia de 3000 millones de caracteres del DNA humano con un 99.9% de fiabilidadDeterminar y localizar las variaciones del DNA entre individuos (polimorfismos)Localizar todos los genes humanosEstablecer las funciones de estos genes y otras partes del genomaMapear y secuenciar el genoma humanoMapear y secuenciar los genomas de animales modelo:E. coli (4,6 millones pb)S. cerevisiae (12 millones pb)C. elegans (97 millones pb)D. melanogaster (165 millones pb)M. musculus (3000 millones)OtrosRecolectar y distribuir datos:Publicar en 24 h toda secuencia >2000pbCrear bases de datosDesarrollar programas de anlisis de DNADesarrollar herramientas para comparar e interpretar la informacin genmicaCompartir la informacin pblicamenteEstudiar los aspectos ticos, legales y sociales de la investigacin en genticaEntrenamiento de investigadoresDesarrollo de tecnologas

Desarrollar el catlogo definitivo de genes codificantes de protenasUtilizar la genmica comparativa para alinear el genoma humano con el de otras especies para la identificacin de genesEncontrar los elementos funcionales que controlan el tiempo y nivel de expresin de genes y micro-RNAs

Secuenciar el restante 20% de heterocromatina (problemas de repeticiones)

The end of the begining

2003: Genoma completado

ContenidosIntroduccinPolimorfismos del DNA: tipos, metodologa de estudio y aplicacionesCartografa de los genomas, nuevas herramientas Identificacin de un genEstrategias para el conocimiento del genoma: ejemplo del genoma humanoMapas genmicos de especies domsticasGenmica funcionalMapas genmicos en especies domsticasMapas de ligamiento, ricos en marcadores de DNAMapas fsicos, ricos en genes conservados (permiten el mapeo comparativo)Unin de ambos mapasMapas de EST (Expressed Sequence Tag)Mapas de alta resolucin en cromosomas especficosIdentificacin de genes candidatos y regiones con QTLsMapas genmicos en especies domsticasAustralian Sheep Gene mapping Web sitehttp://rubens.its.unimelb.edu.au/~jillm/jill.htmBovMap databasehttp://locus.jouy.inra.fr/cgi-bin/bovmap/intro2.plPig basehttp://www.thearkdb.org/browser?species=pigDogmaphttp://www.dogmap.ch/

ContenidosIntroduccinPolimorfismos del DNA: tipos, metodologa de estudio y aplicacionesCartografa de los genomas, nuevas herramientas Identificacin de un genEstrategias para el conocimiento del genoma: ejemplo del genoma humanoMapas genmicos de especies domsticasGenmica funcionalGenmica funcionalLos datos de la secuenciacin a gran escala son el punto de partida de la genmica funcionalBsqueda de ORF en secuencias de DNA desconocidasIdentificacin de su funcinEmpleo de chips (microarrays) de DNA para estudio de regulacin gnica56ORF: tramos de lectura abierta. A travs de programas informticos podemos determinar si una determinada secuencia contiene algn fragmento que pudiera dar lugar a un mensajero, fragmentos que empiecen por el codn AUG y terminen con un codn fin de mensaje. Cualquier ORF de al menos 100 codones se considera como un posible gen.

Para identificar la funcin de estos genes se puede utilizar la mutagnesis in vitro, para anular la expresin del gen o para la obtencin de cualquier fenotipo mutante que nos pueda dar pistas sobre su funcin. Muchas ORF cuando se eliminan no dan fenotipos detectables, otros son de gran importancia.

Al igual que los chips de silicio han revolucionado la industria de los ordenadores, estos chips de DNA estn revolucionando la investigacin en gentica.Chips de DNAMuestras de DNA ordenadas, unidas a un chip de cristal del tamao de un cubreobjetosEn un chip puede haber miles de muestras (cDNA de genes conocidos)Los chips se exponen a muestras de mRNA marcados procedentes de distintos tejidos (distinta fase de desarrollo, tumoral vs normal, etc.)Se miden variaciones en la expresin de los tejidos

Aplicaciones de la GenmicaConocimiento y comprensin de procesos patolgicosPrecisin de diagnstico:Clasificacin ms fina (cncer de colon, piel)Farmacogenmica respuesta individual a tratamientos, eleccin de quimioterapiaEvaluacin correcta del riesgo gentico:Prediccin de la agresividad tumoralPrevencin conocido el riesgo genticoComenzar planes de vigilancia en riesgo de cncer, hipercolesterolemia, hemocromatosis,..Anlisis de recin nacidosDeteccin de portadoresDesarrollo de terapias:Terapia gnica: reemplazar un gen alterado por el gen funcionalTerapia basada en la gentica: Diseo de nuevas drogasTratamientos basados en las bases molecularesEleccin del tratamientoIdentificacin de genes con inters en produccin.Implicaciones del conocimiento del genoma

ADELA-EMILIA GMEZ AYALA , O F F A R M , VOL 26 NM 4 ABRIL 2007Descripcin de las ciencias micas que han generado un cambio cuantitativo apreciable en el anlisis de la genmica

PROTEMICA:

El trmino Proteoma fue usado por vez primera en 1995 para describir el conjunto de PROTEnas de un genOMA, en una clula o un tejido.

De forma imperceptible, la palabra proteoma dio lugar a una nueva disciplina, la Protemica.

Pero, qu es la protemica? Esencialmente la protemica es el estudio a gran escala de los productos gnicos de un genoma mediante mtodos bioqumicos, con el fin de obtener una visin global integrada de los procesos celulares, as como describir y conocer la funcin de las protenas (clave para entender y tratar las enfermedades).

Se puede hablar de dos tipos de protemica:

Protemica de expresin:

Es el estudio cuantitativo de la expresin de protenas entre muestras que difieren en alguna variable. En esta estrategia se compara la expresin del proteoma total o de subprotemas entre diferentes muestras.

La informacin obtenida puede permitir la identificacin de nuevas protenas implicadas en transduccin de seales, la identificacin de protenas especficas de una enfermedad y protenas de inters en microbiologa mdica.

Protemica del mapa celular:

Es el estudio de la localizacin subcelular de las protenas y de las interacciones protena-protena, mediante la purificacin de orgnulos o complejos y la posterior identificacin de sus componentes mediante espectrometra de masas.

Tambin se utiliza el trmino de protemica funcional para referirse a diversas aproximaciones protemicas que permiten el estudio y caracterizacin de un grupo de protenas determinado proporcionando informacin importante sobre sealizacin, mecanismos de la enfermedad o interacciones protena-frmaco.

Regulacin transcripcionalProcesamiento de intronesEdicin de mRNAPoliadenilacinRegulacin traduccionalTRANSCRIPCINPROCESAMIENTOTRADUCCINDNARNAmRNAProtenaProtelisisModificacin Post-transduccionalCompartimentalizacinEl proteoma es dinmicoMecanismos por los que un gen puede dar lugar a mltiples productos gnicos.Las cuatro plataformas de la tecnologa protemica son:

Preparacin y manejo de la muestra

Determinacin de la informacin de la secuencia parcial de aminocidos

Identificacin y cuantificacin de protenas

Mapeo celular

Estrategias utilizadas en protemica para la identificacin y el anlisis de protenas. Siglas: (SEC)Size-exclusion chromatography; (IEX) ion-exchange chromatography; (HIC) hidrophobic interactionchromatography; (FFE) free flow electrophoresis; (CZE) capillary zone electrophoresis; (FRET)flourescence resonance energy transfer. Curso Mtodos Fisco-Qumicos en Biotecnologa Instituto de BiotecnologaUniversidad Nacional Autnoma de Mxico, 2006.68

La electroforesis es la migracin de solutos inicos bajo la influencia de un campo elctrico; estas partculas migran hacia el ctodo o nodo (electrodos - y +), en dependencia de una combinacin de su carga, peso molecular y estructura tridimensional.Electroforesis zonal

Es una de las tcnicas ms utilizadas en bioqumica y biologa molecular por su elevada resolucin. El campo elctrico se aplica a un medio o soporte estabilizante (en vez de a un fluido) y la muestra se deposita en una reducida zona del mismo

Inmunoelectrofresis

Es una combinacin de una electroforesis en geles de agarosa seguida de una inmunodifusin .

En la primera parte, se realiza una aplicacin puntual de la muestra, por lo que al final las distintas protenas estarn distribuidas a lo largo del gel segn el eje de migracin.

Fases de una inmunoelectroforesis (IEF).La electroforesis bidimensional 2D-PAGE

La electroforesis bidimensional 2D-PAGE permite separar hasta miles de protenas en un solo experimento, y constituye actualmente el mtodo ms eficiente para la separacin de mezclas muy complejas de protenas.

Esta basada en una separacin de protenas en funcin de la carga, seguida de una separacin de las protenas en funcin de su masa molecular.

Identificacin y caracterizacin de protenas

Las protenas pueden ser identificadas por diversos procedimientos, entre los que se incluyen:

La secuenciacin del extremo N-terminal,

deteccin con anticuerpos especficos,

composicin de aminocidos,

co-migracin con protenas conocidas,

sobre-expresin y delecin de genes.Debido a su rapidez y elevada sensibilidad, la espectrometra de masas se ha convertido en el mtodo de deteccin para la identificacin de protenas a gran escala, el primer paso para el estudio de proteoma de distintos organismos.

El anlisis de las protenas mediante espectrometra de masas ha sido posiblegracias al desarrollo de varios mtodos de ionizacin suave para convertirbiomolculas grandes, polares y no voltiles en iones en fase gaseosa.

Los espectrmetros de masa estn formados al menos por una fuente de iones,un analizador de masas y un detector que mide la relacin masa/carga (m/z) de losiones en fase gaseosa.Esta tcnica tan robusta implica:

1.- La conversin de los pptidos en iones en fase gaseosa mediante tcnicas de ionizacin suave, como ionizacin desorcin con lser asistida con matriz (MALDI) a partir de una muestra en estado slido, o la ionizacin mediante electrospray (ESI) de una muestra en solucin.

2.- Separacin de los iones segn su m/z en un analizador de masas (por ejemplo un analizador tipo ToF (Time of Flight), cuadrupolo, trampa inica, etc.)

3.- Fragmentacin opcional de los iones peptdicos.

4.- Medida de las masas en un detector obteniendo un espectro de masas que refleja la abundancia de los iones frente a su valor m/z.

Molecular Mechanisms on the Toxic Effects of Gluten Gianna Ferretti, et al. Nutrients 2012, 4, 243-257; doi:10.3390/nu4040243

Effect of gluten on oxidative stress and gene expression Gianna Ferretti, et al. Nutrients 2012, 4, 243-257; doi:10.3390/nu4040243

Fuente: Investigacin en Salud Vol. VII, No. 2