Genómica microbianaAbraham BetancourtMauro RodríguezJesam Baños

Genoma El genoma de un organismo es la

totalidad de su información genética, incluidos los genes y sus secuencias reguladoras, como también el DNA no codificante.

La secuencia de un organismo no solo revela sus genes, también nos ofrece importantes pistas de como funciona el organismo.

Genómica Este término se refiere a la disciplina

encargada de mapear, secuenciar, analizar y compara los genomas

El primer genoma que fue secuenciado es el del virus MS2 que posee RNA con 3.569 nucleótidos.

El primer genoma celular es el de la Haemophilus influenzae con 1.830.137 bp.

Genomas procarióticos: Contenido de ORF Las secuencias de varios cientos de

procariotas se encuentran ahora disponibles en varias bases de datos que son del dominio público.

se pueden encontrar en www.genomesonline.org/

En algunos casos se secuencian los genomas de varias cepas diferentes de la misma bacteria para poder determinar el grado de variabilidad genética dentro de una especie.

Las bacterias de los dominios archea y Bacteria presentan una correlación entre el tamaño del genoma y su cantidad de ORF.

En los eucariotas en donde el DNA no codificante puede ser una mayor parte del genoma que el que codifica para proteínas.

Pelagibacter ubique: es un organismos demasiado eficiente en el uso del DNA ya que no posee intrones, inteínas ni transposones y es poseedor de los espacios intergénicos mas pequeños conocidos hasta el momento.

Los organismo autótrofos necesitan una cantidad mayor de genes que los organismo heterótrofos.

Los genomas mas pequeños pertenecen a los procariotas parásitos o endosimbiontes siendo el genoma de los endosimbiontes mas pequeño que el de los parasitos.

Los genomas de los parasitos obligados varian entre 490 kbp.

Genomas grandes Algunos procariotas suelen llegar a tener genomas

muy grandes que inclusive pueden llegar a ser comparables al de los microorganismos eucariotas, pero los genomas de los procariotas pueden tener una mayor cantidad de DNA codificante.

EjemploBradyrhizobium japonicum tiene 9.1 Mbp de DNA y 8300 ORF mientras que la Saccharomyces cereviseae tiene 12.1 Mbp de DNA y solo 5800 ORF.

Genomas prcarióticos: análisis bioinformáticos y distribuciones génicas

Después de un análisis genómico típico da paso a la comparación de genes, comparándolo con el de otro organismo.

Estas actividades forman parte del campo dela bioinformática que es la ciencia que se encarga de aplicar potentes herramientas informáticas a las secuencias de DNA y proteínas con el fin de acceder a secuencias comparativas

Los genomas están modelados por el estilo de vida del organismo que lo posee.

Los análisis comparativos son útiles para la búsqueda de genes que codifican enzimas que deben existir con casi total seguridad a causa de propiedades conocidas de un organismo.

Las ORF no caracterizadas se dicen que codifican para proteínas hipotéticas, que son probables su existencia pero se desconoce su función.

Una ORF no caracterizada comparte un gen conocido que codifica una proteína una pauta de lectura ininterrumpida de una longitud razonable con codones de inicio y parada, pero codifica para una proteína que carece de la de la suficiente homología de secuencia con cualquier proteína conocida por lo que no puede ser identificada como tal.

Tamaños de genomas procariotas Conocer el tamaño nos ayuda a analizar mas a fondo

un organismo y a compararlo con otro. Ejemplo. micoplasma genitalium y m pneumoniae el segundo contiene los 470 marcos de lectura abierta del primero.

El mínimo de genes codificantes para proteína que una célula procariota necesita son de 265 a 350

La proteobacteria Carsonella ruddii fue secuenciado en el 2006 y presenta el genoma mas pequeño 159,662 pb y 182 genes. Endosimbionte obligado.

Análisis genómico Uno de los primeros pasos es comparar la

secuencia con una anteriormente encontrada para otros genomas, para determinar la función genómica y los genes indispensables del organismo.

Thermotoga maritima es un hipertermofilo de sedimentos marinos capaz de metabolizar diferentes azucares. Una gran parte de su genoma esta dedicado al transporte y metabolismo de carbohidratos y aminoácidos. Así se puede deducir que la bacteria vive en ambientes ricos en materia orgánica.

Los marcos de lectura abierta secuenciados, rondan en un promedio de 60% de genes que codifican para proteínas las cuales se conocen sus funciones, el resto son URF. ORF (Open Reading Frame): es el marco de lectura

abierta, todas las proteinas que un genoma puede codificar.

URF (unidentified Reading Frame): son las proteinas de las cuales no se conoce su funcion.

Evolución y familias génicas La genómica comparativa nos ayuda también a

determinar las relaciones evolutivas entre los diferentes organismos.

Además nos ayuda a entender las formas primigenias de vida y las formas derivadas de esta

Duplicación génica y familias génicas. Muchos genes han surgido por duplicación de

los existentes. El 47% de los genes de B. subtilis esta relacionado con uno o mas genes de otras bacterias de la familia. Estos genes son conocidos como parálogos. Parálogos: genes encontrados en un

organismos que son similares a los de otro organismo en cuestión.(iguales)

Ortólogos: genes que difieren como consecuencia de la especiación. (parecidos mas no iguales)

A partir de estudios de secuencia del rRNA, los genes de Archea implicados en la replicación del DNA, transcripción y traducción están más relacionados con Eukarya que con Bacteria. Sin embargo muchos de los otros genes están más relacionados con Bacteria. Esto sugiere que muchos genes en todos los organismos tienen raíces evolutivas comunes.

Transferencia Génica Horizontal. Es un proceso que opera actualmente y que

dificulta los estudios génicos ancestrales. Esto sucede cuando un organismo toma

genes de otro muy distante evolutivamente. La bacteria Thermotoga maritima tiene

alrededor de 400 genes que son de origen arqueano y 81 forman agrupamientos, estos genes han sido adquiridos por archeas termofilicas que ocupan el mismo nicho.

Genomas de microrganismos eucariòticos

El genoma de la Levadura El genoma de S. cerevisiae contiene 16

cromosomas con un tamaño de 13 392 Kb (Excluyendo mitocondria, plásmidos y virus RNA). Dentro de este se encuentran varios repetidos, el operón rRNA se encuentra repetido alrededor de 100 veces. Además contiene 270 genes para tRNA y 80 para RNA no codificante. Contiene 5570 ORF de los cuales 3400 son proteínas conocidas.

Existen 877 genes esenciales en este organismo. Una de las maneras en que se puede saber si un gen es esencial es utilizando alelos knockout.

Otros microorganismos eucarioticos Encephalitozoon cuniculi es un parasito

intracelular que causa varias patologías, carece de mitocondrias y, aunque su genoma haploide tiene 11 cromosomas en total solo contiene 2.9Mb, mas pequeño que muchas bacterias.

Ustilago maydis es un hongo fitopatogeno con un tamaño aproximado de 20Mb, causa enfermedades al maíz con un impacto económico.

El conocimiento de ambos genomas ayuda al desarrollo de fármacos para su control.

Genoma de orgánulos Los genomas que se encuentran en las mitocondrias o en los cloroplastos fueron originados por endosimbiosis de organismos, por este motivo se parecen mas a genomas de bacteria que de eukarya

Cloroplastos Todos los genes conocidos de cloroplastos

son circulares. El tamaño normal del genoma cloroplastico es de 120-160 kb. Y tienen secuencias repetidas que aíslan genes pequeños

Muchos de los genes del genoma de un cloroplasto codifican para proteínas involucradas en la fotosíntesis. Pero también algunos codifican tRNA y proteínas usadas en la transcripción y traducción.

Mitocondrias Las mitocondrias codifican para proteínas involucradas

en la fosforilación oxidativa e igualmente que los cloroplastos para tRNA, rRNA y proteínas de traducción y transcripción.

Puede presentar forma circular como los cloroplastos o forma lineal.

El genoma mitocondrial humano consta de 16 569 pb. Un genoma mitocondrial animal contiene 13 genes aproximadamente que codifican para proteínas

Algunas mitocondrias pueden presentar plásmidos, que hacen el estudio de su genoma aun mas complejo.

Edición de RNA El proceso de maduracion del RNA

tambien se da en mitocondrias al igual que la formacion de intrones.

El RNA de la mitocondria sufre otro proceso llamado Edición del RNA.

Este proceso consta en la delecion e insercion de nucleotidos que no estaban en la secuencia inicial.

Este proceso esta controlado por un segmento de RNA llamado guía que muestra el camino a la maquinaria enzimática aplicada.

También existe otro proceso de edición que consta en el intercambio de nucleótidos.

Organulos y genoma nuclear Tanto cloroplastos como mitocondrias

requieren más proteinas que las codificadas en sus genomas, por ejemplo proteinas estructurales o inclusive algunas relacionadas con sus funciones.

La mitocondria de S. Cerevisiae incluye mas de 400 proteínas diferentes de las cuales solamente 8 están codificadas por ella misma.

Función y regulación del genoma.

Un transcriptoma es el complemento entero de RNA producido en determinadas condiciones.

Mictromatrices y transcriptoma.

Las técnicas de hibridación también se puede utilizar junto con los datos de la secuencia genómica para medir la expresión génica mediante la hibridación del mRNA . esta técnica nos lleva al desarrolla de la micromatrices o chips génicos.

Las micromatrices son pequeños soportes en estado sólido sobre los cuales se fijan y disponen un patrón conocido de genes o porciones de genes.

Los segmentos génicos son sintetizados por la reacción de la cadena polimerasa (PCR) o se diseñan oligonucleótidos para cada gen en función de las secuencia genómica

Una vez unidas al soporte solido estos segmentos de DNA se pueden hibridar con un mRNA de células cultivadas en condiciones específicas, se escanea y analiza por un ordenador. La hibridación entre un mRNA especifico y el DNA correspondiente en el chip indica que el gen se ha transcripto.

La retrotranscriptasa se utiliza para generar DNA complementario (cDNA) a paritr de mRNA. Como alternativa el cDNA se puede utilizar como molde de la RNA-polimerasa de T7, que genera múltiples copias de RNA , llamadas cRNA.

La fotolitograifia, proceso utilizado generar chips informáticos, se ha adaptado para producir chips de DNA de sílice de entre 1 y 2 cm de tamaño .

Los matrices con el genoma completo contienen segmentos de DNA que en conjunto representan el genoma entero de un organismo. Cada gen esta representado mas de una vez en la matriz con el fin de aumentar la fiabilidad.

ejemplo

Este chip alberga los 5600genes que codifican proteínas de S. cerevisiae, por lo que en un experimento se puede medir la expresión génica global de este organismo.

En este caso el chip se hibrida con cRNA o cDNA derivadas en condiciones específicas. Cualquier cRNA/cDNA se une solo al DNA del chip de cuya secuencia es complementario. Para ver la unión el cRNA/cDNA se marca con un pigmento fluorescente y el chip se escanea con un detector de fluorescente inducida por láser. Las señales son analizadas por un ordenador, el cual no dará una lista con lso genes expresados y los grados de expresión.

Aplicaciones de los chips de DNA: expresión génica.

Se pude comparar la expresión de grupos específicos de genes en diferentes condiciones de crecimiento. La capacidad para analizar la expresión simultánea de miles de genes, descubrir las complejidades del metabolismo y la regulación.

Los análisis transcriptomicos pueden demostrar que genes se desactivan y cuales se activan cuando las células de levadura cambian del metabolismo fermentativo (anaerobio) al respiratorio o viceversa. Se dice que sufren una reprogramación metabólica.

Aplicaciones en identificación.

Se puede utilizar para identificar específicamente microorganismos. La matriz contiene un grupo de secuencias características de DNA de cada uno de una serie de organismos o virus.

Establecer diferencias entre cepas muy relacionadas mediante la diferenciación en sus patrones de hibridación. Esto permite una identificación muy rápida de virus o bacterias patógenas.

Determinar organismos superiores. ( chip disponible comercialmente llamada FoodExpert-ID,se utiliza en la industria alimentaria para asegurar la pureza de alimentos.

Proteomica.

Estudia la estructura, la función y la regulación de las proteínas de un organismo utilizando todo el genoma.

Proteotema conjunto total de proteínas codificadas por un genoma, o conjunto proteico total de un organismo.( se refiere a las proteínas presentes en una célula en un momento determinado)

Métodos en proteomica.

Se desarrolló con la llegada de la electroforesis bidimensional. Esta técnica puede identificar y medir todas las proteínas presentes en una muestra celular.

En su primer dimensión las proteínas se separan por diferencias en sus puntos isoeléctricos, el pH al que la carga neta de cada proteína es cero. En la segunda dimensión, las proteínas son desnaturalizadas de modo que cada aminoácido adquiere una carga fija.

La cromatografía liquida se usa cada vez más para separar mezclas proteicas. La muestra se disuelve en un líquido adecuado y se fuerza a pasar, mediante presión, por una columna empaquetada con un material que constituye la fase estacionaria, que separa las proteínas por variaciones en sus propiedades químicas. (Tamaño, carga iónica, hidrofobicidad). A media que la mezcla viaja a través de la columna se separa por interacción delas proteínas con la fase estacionaria. Las fracciones se recogen a la salida de la columna. Las proteínas de cada fracción se difieren con proteasas y los péptidos se identifican por espectrometría.

Genómica y proteomica comparativas.

Obtenida la secuencia del genoma de un organismo se puede comprar con la de otros organismos para localizar e identificar genes similares a los que se conocen. Las secuencias más importantes en este caso es la de aminoácidos de las proteínas codificadas.

Más del 50% de identidad tienen funciones similares. Por encima del 70% es casi seguro que tienen funciones similares.

Metabolómica

Conjunto completo de intermediarios metabólicos y otras moléculas pequeñas producidas en un organismo.

Análisis del metaboloma por espectrometría de masas.

Este enfoque no se limita a tipos particulares de moléculas y puede ser extremadamente sensible. La espectrometría de masas usando una resolución másica extremadamente alta permite la determinación inequívoca de la formula molecular de cualquier molécula pequeña.

DNA móvil: transposones y secuencias de inserción La evolución esta basada en la

transmisión de rasgos característicos de una generación a otra, pero en los procariotas también se da la transferencia horizontal.

La transferencia génica horizontal se da cuando ciertos genes son transferidos de una célula a otra de modo diferente de al proceso habitual de herencia.

En procariotas se conocen al menos tres diferentes tipos de transferencia génica horizontal: transformación, transducción y conjugación.

El flujo horizontal de genes puede ser muy extenso en la naturaleza pero para que sea detectable en la genómica comparativa el cambio de un organismo a otro debe ser muy amplio.

Detección del flujo horizontal de genes La presencia de genes que son encontrados en

especies que son muy diferentes entre si nos puede indicar que ha existido una transferencia horizontal

Los genes transferidos horizontales codifican típicamente funciones metabólicas diferentes de los procesos moleculares centrales en la replicación del DNA.

En estudios recientes se han encontrado que alrededor de 200 genes en el ser humano que son de origen procariota.

Evolución de virulencia: islas de evolución La comparación de los genomas

bacterianos patógenas con los de sus parientes cercanos inocuos revela bloques de material genéticos que codifican para ciertos factores de virulencia.

Algunos de los genes de virulencia se encuentran en plásmidos o bacteriófagos lisògenos, pero también algunos se encuentran agrupados en regiones cromosómicas llamadas islas de patogenia.

Islas cromosómicas Estas regiones extra suelen estar flaqueadas por

repeticiones invertidas, lo que implica que la región completa se inserto por transposición.

El uso codónico de las islas cromosómicas a menudo difieren del resto del genoma.

Se encuentran a menudo en algunas especies de cepas concretas.

Genómica ambiental Se ocupa del análisis de DNA de

muestras microbianas obtenidas del ambiente sin haber sido asilado o identificado primero los organismos ambientales.

La mayoría de los microorganismo presentes en el ambiente no han sido estudiados pero se puede obtener información mediante la obtención de muestras ambientales para analizar su RNA o DNA.

Las micromatrices se han utilizado para explorar los patrones de la expresión génica.

La mayoría de la diversidad genética de la tierra se derivan de los virus.