PREPARACIÓN DE PELÍCULAS POLIMÉRICAS CON LA …

“PREPARACIÓN DE PELÍCULAS POLIMÉRICAS CON LA

INCORPORACIÓN DE NANOPARTÍCULAS METÁLICAS PARA SU

USO EN PACIENTES CON HERIDAS QUIRÚRGICAS,

QUEMADURAS Y PIE DIABÉTICO”.

Nombre del Residente

Ismenia Esmeralda de Dios Cisneros

Nombre del Asesor

Oscar Barajas Pastor

Nombre de la Carrera

Ingeniería Bioquímica

Villa de Álvarez, Col., a 5 de Diciembre del 2017

INFORME TÉCNICO DE RESIDENCIA PROFESIONAL QUE PRESENTA:

PREPARACIÓN DE PELÍCULAS POLIMÉRICAS CON LA INCORPORACIÓN DE NANOPARTÍCULAS METÁLICAS PARA SU USO EN PACIENTES CON HERIDAS QUIRÚRGICAS, QUEMADURAS Y PIE DIABÉTICO.

Ingeniería Bioquímica Página 2

LISTA DE ABREVIATURAS

Abreviatura Significado

AG Ácido gálico

ATC Agar de soya tripticaseína

CST Caldo de soya tripticaseína

DMSO Dimetilsulfóxido

DRX difracción de rayos X

EDS 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida

FT-IR espectroscopía de infrarrojo

GPB Gelatina piel de bovino

H2O Agua

IR Espectroscopia infrarroja

MCs Microcápsulas

MCG Microcápsula de gelatina

NaCl Cloruro de Sodio

NaOH Hidróxido de sodio

NCG Nanocápsula de gelatina

NCs Nanocápsulas

NHS N-hidroxisuccinimida

Nm Nanómetro

Nps Nanopartículas

SEM Microscopio electrónico de barrido

TEM Microscopio electrónico de transmisión

TTC 2,3,5-cloruro de trifeniltetrazolio

UFC Unidades formadoras de colonias

ZnO Óxido de zinc



ÍNDICE

INTRODUCCIÓN ........................................................................................................................ 5

JUSTIFICACIÓN ......................................................................................................................... 9

OBJETIVOS ............................................................................................................................. 10

OBJETIVO GENERAL ............................................................................................................................ 10

OBJETIVO ESPECIFICO ......................................................................................................................... 10

PROBLEMA A RESOLVER ......................................................................................................... 11

CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES............................................................................................. 11

PARTE EXPERIMENTAL ............................................................................................................ 12

METODOLOGÍA .......................................................................................................................... 13-

SÍNTESIS DE NANOPARTÍCULAS METÁLICAS DE ÓXIDO DE ZINC ............................................................ 14

CARACTERIZACIÓN DE NANOPARTÍCULAS ZNO ................................................................................. 15-17

ESPECTROSCOPIA DE INFRARROJO (FT-IR) .................................................................................... 15

DIFRACTOGRAMA DE RAYOS X (XRD) ........................................................................................... 16

MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE BARRIDO (SEM) ........................................................................... 17

HISTOGRAMA ......................................................................................................................... 18

PREPARACIÓN DE PELÍCULAS BIODEGRADABLES SIN LA INCORPORACIÓN DE

NANOPARTÍCULAS METÁLICAS: ....................................................................................... 19-21

PELÍCULAS LDOPA .............................................................................................................. 19

SÍNTESIS DE PELÍCULA .................................................................................................................... 19

PREPARACIÓN DE PELÍCULA ............................................................................................................ 21

PREPARACIÓN DE PELÍCULAS BIODEGRADABLES CON LA INCORPORACIÓN DE NANOPARTÍCULAS METÁLICAS .. 21

PREPARACIÓN DE PELÍCULAS BIODEGRADABLES SIN LA INCORPORACIÓN DE

NANOPARTÍCULAS METÁLICAS: ......................................................................................... 22-25

SÍNTESIS DE PELÍCULA .................................................................................................................... 23

PREPARACIÓN DE PELÍCULA ............................................................................................................ 24

PREPARACIÓN DE PELÍCULAS BIODEGRADABLES CON LA INCORPORACIÓN DE NANOPARTÍCULAS METÁLICAS

..................................................................................................... ¡ERROR! MARCADOR NO DEFINIDO.25

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DE PELÍCULAS POLIMERICAS CON

NANOPARTÍCULAS METÁLICAS DE ZNO. ............................................................................. 26-33

PREPARACIÓN DE SOLUCIÓN FISIOLÓGICA AL 85% .............................................................................. 26

2,3,5-CLORURO DE TRIFENILTETRAZOLIO AL 0.1% (TTC) .................................................................... 26

PREPARACIÓN DE CALDO DE SOYA TRIPTICASEÍNA ............................................................................... 26

INÓCULO ..................................................................................................................................... 27

PREPARACIÓN DE MUESTRA EN VIALES ......................................................................................... 27-28

PREPARACIÓN DE AGAR TRIPTICASEÍNA ............................................................................................ 29



SIEMBRA ................................................................................................................................ 29-30

CONTEO BACTERIANO ............................................................................................................... 30-32

NANOCÁPSULAS DE GELATINA CON ÁCIDO GÁLICO ....................................................... 33-41

PARTE EXPERIMENTAL .............................................................................................................. 33-34

PREPARACIÓN DE NANOCÁPSULAS POLIMÉRICAS............................................................................. 34

PREPARACIÓN DE NANOCÁPSULAS POLIMÉRICAS UTILIZANDO COMO SOLVENTE METANOL. ................... 35

PREPARACIÓN DE NANOCÁPSULAS POLIMÉRICAS UTILIZANDO COMO SOLVENTE ETANOL........................ 36

PREPARACIÓN DE NANOCÁPSULAS POLIMÉRICAS UTILIZANDO CÓMO SOLVENTE ACETONA ..................... 37

PREPARACIÓN DE NANOCÁPSULAS POLIMÉRICAS UTILIZANDO CÓMO SOLVENTE ACETONA UTILIZANDO

ULTRASONIDO ................................................................................................................................... 38

CARACTERIZACIÓN ........................................................................................................... 3939-43

DISCUSIÓN DE RESULTADOS .......................................................................................... 44-45

PELÍCULAS POLIMERICAS ............................................................................................................... 44

NANOCÁPSULAS DE GELATINA .................................................................................................... 45-46

CONCLUSIONES ............................................................................................................. 47-48

PELÍCULAS POLIMERICAS................................................................................................................ 47

NANOCÁPSULAS DE GELATINA ......................................................................................................... 48

RECOMENDACIONES: ......................................................................................................... 49-50

PELÍCULAS POLIMERICAS................................................................................................................ 49

NANOCÁPSULAS DE GELATINA ......................................................................................................... 50

COMPETENCIAS DESARROLLADAS Y/O APLICADAS ...................................................................... 51-52

TRABAJO A FUTURO DE NANOCÁPSULAS ....................................................................................... 53

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................................... 54-56



INTRODUCCIÓN

En los últimos años se ha tomado gran interés en elementos nanométricos, siendo una área de

investigación muy importante debido a la gran cantidad de propiedades y aplicaciones

proporcionadas por este singular tamaño. La nanotecnología es un área interdisciplinaria de

investigación y desarrollo de sustancias o dispositivos en rango nanométrico (1 a 100 nm), siendo

un campo relativamente nuevo de investigación, sin embargo, avanza rápidamente en áreas de

ciencia y tecnología creando nanomateriales para tratamientos médicos, investigación agrícola,

restauración ambiental, aplicaciones energéticas y alimentaría. (Ramirez O., 2015) La

nanotecnología simboliza un escenario nuevo y habilitante que promete proporcionar una amplia

gama de usos novedosos y tecnologías mejoradas para aplicaciones biomédicas. Los motivos

detrás del intenso interés es que la nanotecnología permite la síntesis controlada de materiales.

Dentro de la nanotecnología destacan ciertas partículas de tamaño nanométrico, conocidas como

nanopartículas, las cuales se pueden construir por la unión de átomos individuales o por la

subdivisión de materiales volumétricos.

La reducción de materiales a nanoescala puede alterar con frecuencia sus propiedades eléctricas,

magnéticas, estructurales, morfológicas y químicas, lo que les permite interactuar de forma única

con las biomoléculas de las células y posibilitar su transporte físico hacia las estructuras interiores

de las células. Las partículas a nanoescala normalmente poseen un mayor porcentaje de átomos

en la superficie del material, lo que puede conducir a una mayor reactividad superficial, y puede

maximizar su capacidad de cargarse con agentes terapéuticos para administrarlos a las células

diana. (Rasmussen et al. 2010)

Las NP’s se definen como cualquier material con al menos una dimensión en el rango de 1-100

nm. La forma puede variar (no tiene que ser esférica) y los materiales incluyen metales,

semiconductores, polímeros y materiales basados en carbono. (Zamborini et al. 2012)

Edmundso et al. 2014, define de igual manera a las nanopartículas como un material en la escala

nanométrica (entre 1 y 100 nm en una de sus dimensiones). Sin embargo hay quienes definen a

las nanoparticulas como dispersiones de partículas sólidas con al menos una dimensión en un

rango de tamaño de 10-100 nm. (Horsfall et al. 2014)

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1871678414000296#!



Aplicaciones de las nanopartículas

Las nanopartículas metálicas tienen posibles aplicaciones en diversas áreas, como la electrónica,

los cosméticos, los revestimientos, los envases y la biotecnología. Por ejemplo, se puede inducir a

las nanopartículas a fusionarse en un sólido a temperaturas relativamente más bajas, a menudo

sin fundirse, dando lugar a recubrimientos mejorados y fáciles de crear para aplicaciones

electrónicas (por ejemplo, condensadores). (Thakkar et al. 2010) Las nanopartículas metálicas y/

óxidos metálicos o compuestos basados en metales muestran interesantes propiedades biológicas,

ópticas, magnéticas, electrónicas, catalíticas, etc. que, en general, se relacionan con el tamaño y la

forma de los nuevos materiales y pueden ser interesantes desde el punto de vista de su aplicación

práctica. Así, las propiedades únicas que muestran las nanopartículas metálicas provienen de la

alta relación superficie-volumen, del confinamiento cuántico del movimiento electrónico en

nanopartículas semiconductoras, de la resonancia de plasmones superficiales en algunas

partículas metálicas o del súper paramagnetismo en nanomateriales magnéticos.

Las propiedades de la molécula de núcleo utilizada, modificaciones, funcionalizaciones, su tamaño

y forma, y cualquier estructura secundaria o terciaria que puedan formar las nanopartículas dan

lugar a la multitud de propiedades útiles que presentan las nanopartículas. (Edmundson et al.,

2014).

En la medicina es común encontrarse con una gran variedad de tratamientos para combatir

diferentes padecimientos, tratamientos en los cuales se han ido utilizando diferentes elementos

que complementan los efectos de otras sustancias o aditamentos médicos. Como lo son las

nanopartículas metálicas que tras haber descubierto sus grandes propiedades han revolucionado

la medicina, una de las principales aplicaciones que encontramos se debe a su efecto

antimicrobiano. Siendo principalmente utilizados aquellos metales como la plata, el oro, el zinc,

entre otros.

Nanopartículas de óxido de Zinc

Los óxidos metálicos nanoparticulados, así como las nanopartículas de óxido de zinc (ZnO NP), son

únicos porque pueden ser producidos con superficies altas y con estructuras cristalinas inusuales

(Klabunde, 1996). Las propiedades antibacterianas de las nanopartículas de óxido de zinc se

investigaron utilizando microorganismos Gram-positivos y Gram-negativos. Estos estudios

demuestran que las nanopartículas de ZnO tienen una amplia gama de actividades antibacterianas



hacia varios microorganismos que se encuentran comúnmente en entornos ambientales.

(Padmavathy, 2008)

Materiales bioadhesivos

Se denomina "adhesiva" la sustancia que al estar en contacto entre dos superficies permite una

unión resistente a la separación. Los sustratos o adherentes corresponden a los materiales que se

unen por medio del adhesivo, y al conjunto de interacciones físicas y químicas que se presentan en

la interfase adhesivo-adherente se le conoce como "adhesión"; la "cohesión" corresponde a la

fuerza de atracción que mantiene unidas las moléculas de un material. Mientras que el término

bioadhesión se ha utilizado para describir el fenómeno relacionado con la capacidad que tienen

algunas macromoléculas de origen natural y de síntesis para adherirse a tejidos biológicos, se

fundamenta en los mecanismos conocidos de la adhesión convencional, con la particularidad que

representan las propiedades y características de los tejidos naturales. (Mathiowitz et al. 1999)

Mientras que Suarez, 2013, define al término “Adhesivo biocompatible” a cualquier adhesivo

natural o sintético que vaya a entrar en contacto con tejidos vivos o fluidos biológicos y, en

consecuencia, tenga que ser idóneo para aplicaciones biomédicas de corta o larga duración.

Figura. 1 Superficies presentes en una unión bioadeshiva. (Vallejo et al. 2008)

La adhesión en materiales poliméricos está determinada por uniones físicas, uniones químicas

secundarias y uniones químicas primarias como enlaces iónicos o covalentes. Las uniones químicas

primarias se obtienen a partir de la reacción química de grupos funcionales del material adhesivo



con el sustrato. En el caso de las uniones químicas secundarias que corresponden a enlaces

químicos de menor energía, se presentan características más apropiadas para la bioadhesión por

su transitoriedad. (Vallejo et al. 2008)

Chittchang et al. 2005 menciona la importancia de las concentraciones del polímero adhesivo, en

altas concentraciones, el polímero puede presentar poca bioadhesión al sustrato, pues adquiere

una conformación replegada y no dispone de grupos suficientes para establecer interacciones

adhesivas. Cuando la concentración del polímero es menor, las uniones se intensifican; sin

embargo, una concentración muy baja favorece la interpenetración, pero la unión formada es

inestable a causa del número escaso de moléculas que penetran por unidad de volumen.

En el presente documento se pretende describir la preparación de películas reforzadas con

nanopartículas de ZnO, utilizando gelatina y ácido gálico, así como 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)

carbodiimida y N-hidroxisuccinimida como agentes entrecruzantes. Evaluar las propiedades

antimicrobianas de estas biopelículas con nanopartículas metálicas de ZnO, elaborando películas

sin ZnO NP, las cuales fueron utilizadas como control. Este estudio permitirá fijar las bases para

dar origen al desarrollo de un producto con alto valor agregado, más particularmente un apósito

funcional el cual será capaz de liberar de manera controlada ZnO NP para su posterior aplicación

médica, contribuyendo con una mejor cicatrización y evitando infecciones posteriores de la herida.



JUSTIFICACIÓN

El proceso de cicatrización en pacientes con algún padecimiento como quemaduras, heridas

quirúrgicas o pie diabético es un problema de salud que aqueja a la población en México y en el

mundo. Inclusive durante las cirugías, las cuales se realizan día a día en muchos hospitales, se

generan heridas que tardan en cicatrizar, y en ocasiones a pesar de la costura se pueden llegar a

terminar dejando ciertas zonas por donde las bacterias pueden ingresar y generar una serie de

problemas en el tratamiento médico, que sin duda, alargarían la recuperación del paciente,

trayendo consigo complicaciones en sus obligaciones laborales o familiares.

Dando lugar a complicaciones serias, complejas y debilitantes que acompaña al paciente durante

su vida. Resultando imprescindible el desarrollo de materiales o auxiliares con propiedades

antibacterianas que impidan en gran medida la colonización de microorganismos altamente

ofensivos para el ser humano y evitar con esto complicaciones en estos padecimientos. Motivo por

el cual se han realizado diferentes investigaciones sobre formulaciones de materiales poliméricos

bioadhesivos que pueden ser de gran beneficio para la ciencia médica.

Los sistemas bioadhesivos han sido empleados en el campo de la salud, especialmente para

aplicaciones odontológicas y ortopédicas, como también para uso oftálmico y quirúrgico y

actualmente en el estudio sobre reemplazo de tejidos y la liberación controlada y localizada de

principios activos sobre mucosas. (Vallejos et al. 2008)

Las aplicaciones potenciales de este fenómeno exigen un estudio minucioso sobre los

fundamentos que rigen el comportamiento de los materiales poliméricos que se utilizan para estos

desarrollos cuando se encuentran en contacto con superficies de tipo biológico y cómo, a partir

del entendimiento de estos principios, es posible desarrollar materiales con mejores propiedades

de desempeño y proponer formulaciones optimizadas para utilizar como sistemas bioadhesivos.

Por todo lo planteado anteriormente, sumando las ventajas que representa el uso de las

nanopartículas metálicas como una nueva alternativa como agentes antibacterianos que tienen

grandes ventajas comparadas con antimicrobianos orgánicos y su alta estabilidad ya que no

causan resistencia de microorganismos, se cree posible la incorporación de ZnO NP a biopelículas

o bioadhesivos para el desarrollo de apósitos para pie diabético resulta muy prometedor.



OBJETIVOS

Objetivo general:

Sintetizar nanopartículas metálicas de óxido de zinc para el desarrollo de nuevos materiales con

aplicaciones médicas, y posteriormente incorporarlas en una matriz polimérica, con la finalidad de

obtener un material que tenga propiedades antibacterianas.

Objetivo específico:

Obtención de nanopartículas de óxido de zinc mediante el método de precipitación

química.

Síntesis de biopelículas poliméricas (ácido gálico-gelatina), el cual será obtenido mediante

una ruta de entrecruzamiento químico.

Incorporación de las nanopartículas de óxido de zinc a películas poliméricas.

Evaluación de la actividad antimicrobiana de NPs de ZnO frente a Escherichia coli ATCC-

8739 y Staphylococcus aureus ATCC-6538.



PROBLEMA A RESOLVER

La diabetes mellitus constituye un problema de salud universal, que afecta en forma creciente a

todas las sociedades. El pie diabético es una de las complicaciones más frecuentes de los pacientes

diabéticos, debido al déficit inmunológico asociado a esta enfermedad y al inadecuado

tratamiento que llevan por la insuficiente educación que poseen sobre su enfermedad. Es una

afección localizada en los pies de los pacientes diabéticos, cuyos factores determinantes

principales son: la isquemia, la infección y la polineuropatía.

Es por esto que el uso de la medicina alternativa que logre un recubrimiento sobre la zona

afectada, adicionando los beneficios que traen consigo la incorporación de nanopartículas

metálicas, como lo son principalmente propiedades con acción antimicrobiana, aumente su

sustantividad en la parte afectada.

Agilizando la cicatrización que trae consigo cirugías o accidentes, brindando una nueva y mejor

alternativa a personas que sufrieron quemaduras, no solo mejorando los efectos estéticos, sino

además controlar las infecciones que pudieran provocar estos padecimientos por el tiempo del

tratamiento.

CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES

Tabla 1. Cronograma de actividades a realizar durante residencia.

Actividades Periodos Agosto Sep. Oct. Nov. Dic.

Síntesis y caracterización de nanopartículas metálicas

mediante diferentes métodos.

Preparación de películas biodegradables con y sin la

incorporación de nanopartículas metálicas.

Evaluación de las nanopartículas sintetizadas

antimicrobiana con diferentes microorganismos.

Preparación de películas biodegradables para su

aplicación en heridas quirúrgicas, quemaduras o en pie

diabético.



PARTE EXPERIMENTAL

Tabla 2. Materiales y reactivos utilizados en la preparación de biopelículas poliméricas.

Equipos Reactivos Medios de Cultivo

Analizador Termogravimétrico

(TGA), TGA Q500 de TA

instruments

Etanol (C2H5OH) Solución fisiológica

Microscopio electrónico de

barrido (SEM), JEOL, modelo

JSM-7041F.

Agua destilada (H2O)

Caldo de Soya Tripticaseina

(CST)

Espectrofotómetro de

difracción de rayos X (WAXD),

Siemens modelo D5000.

Acetato de zinc dihidratado al

99% ((C2H3O2)2Zn·2H2O)

Agar de Soya Tripticaseina

(AST)

Espectrofotómetro Infrarrojo

(FTIR), Magna 500 Nicolet.

Hidróxido de sodio (NaOH) Solución 1/500 (Caldo de soya

Tripticseina/Agua)

Centrifuga Gelatina de piel de bovino

2,3,5-cloruro de

trifeniltetrazolio al 0.1% (TTC)

Mechero bunsen Ácido gálico Cepas de bacterias

Campana de extracción LDOPA Escherichia coli (ATCC-8739).

Incubadora Lab. Line

Instruments

1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)

carbodiimida (EDC)

Staphylococcus aureus (ATCC-

6538).

Campana de flujo laminar,

NUAIRE (modelNU-26-40).

N-hidroxisuccinimida (NHS)

Incubadora con agitación, New

Brunswick Scientific.

GLDS

Ultrasonido, Branson. GGAS

Vortex

Autoclave

Estufa



Metodología

La metodología de la investigación está divida en dos secciones, preparación de las muestras, y la

evaluación antibacteriana de los nanocpmpuestos. La primera sección es la preparación de las

muestras involucra la preparación de las nanopartículas de ZnO, la preparación de la biopelícula

polimérica (gelatina-co-ácido gálico) y la incorporación de las nanopartículas a la biopelícula

polimérica por medio de una solución acuosa. La segunda sección corresponde a la evaluación de

la actividad antibacteriana de las biopelículas poliméricas con ZnO NP.

Figura. 2 Diagrama de metodología de estudio.



Síntesis de nanopartículas metálicas de óxido de zinc

La síntesis se realizó a partir de la reacción de hidrólisis química bajo la siguiente metodología de

precipitación química. En la síntesis de las nanopartículas se utilizaron 600 mL de etanol, 100 mL

de agua, 0.06 M, acetato de zinc dihidratado al 99% y 0.22 M de hidróxido de sodio. Se vertieron

en un matraz de dos bocas 0.06 M de Acetato de zinc en 600 mL de etanol con un sistema de

reflujo con agitación durante 2 horas a 70 °C. Después se adicionó una solución de 0.22 M de

NaOH y 100 mL de agua los cuales se mantuvieron en agitación por 5 minutos y posteriormente se

enfrió manteniendo la agitación durante 12 horas. Una vez realizado lo anterior, la solución se

centrifugó en viales de 80 mL por 6 minutos a 15000 rpm, se llevó a secar en una estufa a 80 °C

durante 3 h, obteniendo un precipitado de color blanco correspondiente a las ZnO NP, el cual, las

cuales se llevaron a caracterización.

Figura. 3 Diagrama esquemático de la síntesis de nanopartículas metálicas de óxido de zinc



Figura. 4 Muestra de Nanopartículas de Óxido de Zinc.

Caracterización de nanopartículas ZnO

Realizando análisis de caracterización se estableció su espectro de infrarrojo, estructura cristalina

y tamaño de partícula empleando técnicas como lo son microscopio electrónico de barrido (SEM),

espectroscopia de infrarrojo (FT-IR) y difracción de rayos X (XRD).

Espectroscopia de Infrarrojo (FT-IR)

En la Figura 5, se observa el espectro de FTIR de las nanopartículas de ZnO obtenidas a partir de la

reacción de hidrólisis química. La aparición de una banda ancha a 3400 cm-1 correspondiente al

estiramiento O-H perteneciente a los grupos hidroxilos que se encuentran presentes en la

muestra.

A 1570 cm-1 muestra las bandas de tensión asimétrica, mientras que en 1417 cm-1 aparecen las

bandas de vibración de tensión simétricas del grupo acetato (COO-) provenientes del acetato de

Zinc, lavanda más pronunciada ubicada a 440 cm-1 se puede apreciar la banda del estiramiento del

enlace Zn-O correspondiente al ZnO.



Figura. 5 FT-IR de NP’s ZnO. El espectro infrarrojo muestra bandas prominentes en (3400 cm-1)

correspondiente al estiramiento O-H perteneciente a los grupos hidroxilos, así como grupos

importantes dentro de nuestra muestra, como es el caso de la banda más significativa (440 cm-1)

se puede apreciar la banda del estiramiento del enlace Zn-O correspondiente al ZnO.

Difractograma de rayos X (XRD)

DRX

Basado en la difracción producida cuando un haz de rayos X es dispersado por un material la DRX

permite caracterizar diferentes materiales cristalinos mediante el uso de la DRX, dispersando las

ondas que interaccionan de forma constructiva para direcciones específicas. (Martin, 2016)

Se muestra en la figura 6, el espectro de difracción de rayos X de las nanopartículas de ZnO y el

espectro de difracción para las nanopartículas de ZnO puro obtenido de la base de datos del

equipo (JCPDS). La detección de los planos característicos del zinc se permitió verificar la presencia

de óxido de zinc en el precipitado obtenido mediante difractometría de rayos x, observando que

las nanopartículas de ZnO adquiridas corresponden a la estructura cristalina tipo wurtzita

hexagonal, compuesta por coordinaciones tetraedrales de átomos de Zinc rodeados por Oxígenos

y viceversa con parámetros de red a= 3.251 y c= 5.205 Å.



Figura. 6 Patrón de difracción de rayos X de nanopartículas.

Microscopio electrónico de barrido (SEM)

Podemos observar en la Figura 7, la micrografía de SEM de las ZnO NP sintetizadas a partir de la

reacción de hidrólisis química, presentaron una morfología semiesférica, además de la formación

de algunos aglomerados característicos de la síntesis de las nanopartículas metálicas y/o óxidos

metálicos.

Figura. 7 Micrografía de SEM de las ZnO NP a x 150,000.



Con la imagen de microscopía fue posible elaborar un histograma formado mediante un análisis de

distribución de tamaños de partícula utilizando un analizador de imágenes WCIF ImageJ en el que

se midieron alrededor de 400 partículas, las cuales presentaron tamaños entre 5 a 47 nm y un

diámetro promedio de partícula de 26 nm. (Figura 8)

Figura. 8 Histograma de frecuencia de las nanopartículas de óxido de zinc.



Preparación de películas biodegradables sin la incorporación de nanopartículas

metálicas:

PELÍCULAS LDOPA

Síntesis de película La síntesis de biopelícula se llevó a cabo mediante entrecruzamiento químico. En un matraz bola

de dos bocas se adicionaron 70 mL de agua y 5 g de gelatina de piel de bovino, los cuales se

situaron bajo agitación a 350 rpm a 80 °C. Se añadieron 330 mg de LDOPA, 116 mg de EDC y 133

mg NHS, manteniéndose en agitación durante 24 horas a la misma temperatura.

Una vez transcurridas las 24 horas, se retiró el matraz bola y se vertió la mezcla sobre un vaso de

precipitado, con 150 mL de acetona en cada lavado. Durante los lavados se centrifugó a 15,000

rpm por 5 minutos para finalmente retirar el exceso de acetona y recuperando el precipitado con

una espátula, el cual se colocó en un molde y se llevó a la estufa por 24 horas a 80 °C.

Figura. 9 Síntesis de biopelícula.



Una vez transcurridas las 24 horas se retiró el molde de la estufa y se adicionó 1 g de producto

obtenido de la síntesis, 10 mL de agua desionizada y GLDS, el cual se llevó a agitación en una

plancha de calentamiento a 60 °C a 350 rpm por 2 h hasta que se disolvió completamente. (Figura

10)

Una vez disuelto se vertió sobre una placa con papel teflón y se trasladó a estufa por 24 h a 60 °C

(Figura 11)

Figura. 10 Disolución de muestra de síntesis de biopelícula.

Figura. 11 Preparación de biopelícula.



Preparación de películas biodegradables con la incorporación de nanopartículas

metálicas

Se adicionó 1 g de la síntesis de la película de gelatina con LDOPA a 10 mL de agua desionizada y

llevó a 60 °C en parrilla de agitación por 2 horas a 350 rpm. Las nanopartículas se adicionaron de

acuerdo al porcentaje de concentración, los cuales fueron de 1, 3 y 5% (10, 30 y 50 mg) siguiendo

este mismo procedimiento en la preparación de la película, solo cambiando la cantidad de

nanopartículas metálicas.

Una vez disuelto por completo, colocó sobre el baño de sonicación por 5 minutos, posteriormente

por 1 hora. Una vez sonicada la mezcla se vertió sobre las placas con papel teflón y se trasladaron

a estufa a 60 °C por 24 horas. Finalmente al solidificar, se retiraron las películas con ayuda de una

espátula y se guardaron para rotular.

Figura. 12 Dispersión de nanopartículas metálicas por sonicación.

Figura. 13 Preparación de biopelícula con nanopartículas metálicas.



Preparación de películas biodegradables sin la incorporación de nanopartículas

metálicas:

PELÍCULAS ÁCIDO GÁLICO

Síntesis de película Para la preparación de las películas se utilizó un matraz bola de dos bocas, conectado a un sistema

de enfriamiento. En el matraz se adicionaron 150 mL de agua desinizadas junto con 10 g de

gelatina de piel de bovino; esta solución se dejó en agitación constante a 80 °C hasta su completa

disolución. Posteriormente se adicionaron 1.5 g ácido gálico, 100 mg de EDC y 120 mg NHS, los

cuales se mantuvieron bajo agitación a 80 °C por 24 h. Transcurridas las 24 horas, se vertió la

mezcla sobre un vaso de precipitado, en el cual se realizaron dos lavados con 300 mL de acetona

en cada lavado. Una vez realizados los lavados, se retiró el exceso de acetona y con ayuda de una

espátula se recuperó el precipitado, el cual se colocó en un molde. La acetona recuperada en cada

lavado fue centrifugada a 15,000 rpm por 5 min para recuperar la mayor cantidad de precipitado,

posteriormente se agregó al molde y fue llevado a la estufa por 24 horas a 80 °C.

Figura. 14 Montaje de equipo de síntesis de biopelícula.

Cómo se muestra en la figura 15, después de 24 horas se retiró el molde de la estufa y se colocó 1

g de producto obtenido de la síntesis junto con 10 mL de agua desionizada y el GGAS el cual se



puso en agitación a 60 °C hasta su completa disolución. Una vez disuelto se vertió sobre una placa

con papel teflón y se puso a secar en una estufa por 24 horas a 60 °C. (figura 16).

Figura. 15 Disolución de muestra de síntesis de biopelícula.

Figura. 16 Preparación de biopelícula.



Preparación de películas biodegradables con la incorporación de nanopartículas

metálicas

En 10 mL de agua desionizada se le adicionó 1 g de la síntesis de la película de gelatina con ácido

gálico, se llevó a 60 °C en parrilla de agitación por 2 horas a 350 rpm. Las nanopartículas se

adicionarán de acuerdo al porcentaje de concentración, los cuales fueron de 1, 3 y 5% (10, 30 y 50

mg). Se siguió el mismo procedimiento en la preparación de la película, solo se modificó en la

cantidad de nanopartículas metálicas.

Después de lograr una completa incorporación de las NPZnO y la disolución de la película de

gelatina, dicha mezcla se sonicó por 5 min, durante 1 horas. Una vez sonicada la mezcla vertió

sobre las placas con papel teflón y se pusieron a secar a 60 °C durante 24 horas. Una vez obtenidas

las películas se procedió a realizar su caracterización mediante diferentes técnicas.

Figura. 17 Dispersión de nanopartículas metálicas por sonicación.



Figura. 18 Preparación de biopelícula con nanopartículas metálicas.

Figura. 19 Biopelícula.



Figura. 20 Muestras para evaluación de actividad antibacteriana.



EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DE PELÍCULAS POLIMERICAS

CON NANOPARTÍCULAS METÁLICAS DE ZNO.

La evaluación de la actividad antibacteriana de las nanopartículas de ZnO se desarrolló de acuerdo

al procedimiento estándar de macrodilución en agar descrito en la norma japonesa JIS-Z-2801:200

“Japanese industrial standard”.

Preparación de solución fisiológica al 85%

La solución fisiológica se preparó con 8.5 g de NaCl en 1000 mL de H2O destilada, de dicha solución

se vertieron 9 mL en cada tubos de ensayo y 40 mL en frasco con rosca los cuales se esterilizaron

a condiciones 121 °C de por 15 min.

Figura. 21 Preparación de solución fisiológica.

2,3,5-cloruro de trifeniltetrazolio al 0.1% (TTC)

En la preparación del TTC se adicionaron 200 mg de reactivo TTC en 200 mL H2O destilada, se llevó

a agitación por 15 min a 560 rpm, se colocó en un frasco con rosca y posteriormente se esterilizó a

condiciones de 121 °C durante por 15 min.

Figura. 22 Preparación de TTC 0.1%

Preparación de caldo de soya tripticaseína

Se prepararon 200 mL de caldo de soya tripticaseína (CST), vertiendo 8 g de CST en 200 mL de

agua destilada, se calentó hasta pérdida de la turbidez del agar, posteriormente se vertieron 50

mL del caldo en 4 matraces diferentes, los cuales se esterilizaron a condiciones de 121 °C por 15

min.



Inóculo

Dentro de campana en condiciones estériles se vertieron, 2 mL de Cepa E. Coli y S. aureus en

matraces con agar estéril y se llevaron a agitación por 24 horas a 180 rpm a 37 °C en un shaker.

Posteriormente a las 24 horas, se retiraron los matraces con los inóculos y bajo condiciones

estériles en una campana se vertieron en tubos de centrifugación previamente esterilizados, los

cuales se llevaron a centrifugar bajo condiciones de 12000 rpm a 23 °C por 15 min. Una vez

centrifugado, se retiró el caldo y se realizaron 3 lavados con 10 mL de solución fisiológica al 85% a

cada uno de los tubos, cuidando de no retirar la biomasa formada en el fondo del tubo. La

biomasa recuperada de cada microorganismo se resuspendió en 50 mL de una solución fisiológica,

para posteriormente determinar la cantidad UFC/mL mediante un recuento viable de cada

suspensión que contenía ambos microorganismos.

Figura. 23 Preparación del inóculo

Preparación de muestra en viales

En una campana de extracción estéril y con mechero encendido, en un frasco de 500 mL con H2O

destilada y estéril se retiraron 100 mL de H2O destilada que contenía el frasco y se le adicionaron

100 mL de CST, posteriormente se llevó a agitación con suaves movimientos de la mano de lado



izquierdo y derecho, cuidando no sacar el frasco de la campana, finalmente se retiró 1 mL de

solución, se vertió 1 mL de inoculo y se agito suavemente.

Una vez obtenidas las diluciones para cada muestra, se procedió a inocular cada vial con la

suspensión celular de E. coli y S. aureus ajustada a una densidad óptica de 0.15 (3 a 5 x 105)

considerando que el volumen del inoculo para cada vial fue de 100 μL (50,000 UFC/100μL).

Cabe mencionar que se realizaron 3 repeticiones de cada una de las muestras en los viales, por lo

cual se prepararon 21 viales para cada una de las cepas, con 2 blancos respectivamente. A cada

uno de los viales estériles se les colocó una muestra de película con o sin nanopartículas

respectivamente, posteriormente encima se le colocó una perla de cristal estéril y se le

adicionaron 4 mL de inoculo, a la muestra que no contenía película se le adicionaron únicamente

los 4 mL del inoculo. Enseguida los viales se incubaron bajo condiciones de 37 °C por 24 horas.

Figura. 24 Preparación de muestra en viales.



Preparación de Agar tripticaseína

Para la preparación de 1 L de Agar tripticaseína (ATC), se vertieron 40 g de agar en 1000 mL de

agua destilada y se llevó a calentamiento hasta que perdió la turbidez del agar. Posteriormente se

adicionaron 500 mL en 2 matraces diferentes y se esterilizó a 121 °C por 15 min.

Una vez estéril, se agregó 1 mL de TTC por cada 100 mL de solución de Agar, el cual da la

pigmentación en caso de que haya crecimiento bacteriano en la siembra.

Figura. 25 Preparación de Agar tripticaseína.

Siembra

La determinación de las UFC se llevó en una campana previamente estéril y con el mechero

encendido. Como se muestra en la figura 26, se realizan 5 diluciones por cada muestra que

corresponde a cada una de las cepas. Dentro de un ambiente estéril, se tomó 1 mL de la muestra

de los viales, colocándola en un tubo el cual fue tapado y agitado vigorosamente, realizando las

diluciones 10-6.

Una vez teniendo las diluciones se realizó la siembra en cada una de las cajas Petri marcadas

previamente, en las cuales se vertió 1 mL de la solución original, así como de las diluciones

realizadas, cuidando de seguir la continuación de cada disolución, posteriormente se le agregaron

a cada caja 20 mL del agar preparado anteriormente, el cual debe estar a no más de 38 °C de lo

contrario podría afectar al crecimiento bacteriano. A continuación se realizaron movimientos en

forma de “8” tanto de lado izquierdo, como derecho y de arriba hacia abajo por 20 segundos en

cada movimiento, de tal manera que incorporemos la muestra y el agar. Después se dejó



solidificar y una vez sólidos, con la tapa hacia abajo, se colocaron en la incubadora a 37 °C por 24

horas. (Figura 26)

Figura. 26 Procedimiento en la realización de diluciones, las diluciones 10-6, se realizan tomando 1

mL de la muestra de los viales y colocándolo en un tubo el cual se tapa y se agita vigorosamente.

Figura. 27 Siembra de bacterias.

Conteo bacteriano

Transcurridas las 24 horas, se retiraron las cajas de la incubadora y se observaron para evaluar el

crecimiento bacteriano de las películas, realizando el conteo de las UFC/mL y determinar con ello

el número de bacterias presente en la suspensión celular. Este procedimiento se realizó para cada

una de los microorganismos a evaluar, se llevó a cabo con la ayuda de un microscopio

estereoscópico.

Como se observa en la figura 28, para contar las UFC de cada bacteria estudiada se utilizó cloruro

de trifeniltetrazolio (TTC), es un colorante que tiñe las colonias de color rojo, este se coloca antes

de vaciar el agar a las cajas petri mientras todavía se encuentra caliente, mientras más colonias se



encuentren en el agar, este tomará un color rojo con mayor intensidad. Es importante mantener

marcada cada una de las colonias que se vayan contando para evitar errores y contar nuevamente.

En la figura 29, se muestran un par de cajas Petri con las cuales se trabajaron y en las cuales se

puede observar la técnica con la cual se fueron marcando cada una de las colonias, es importante

mencionar que en el caso de estas dos placas no se observó un exceso del crecimiento bacteriano

por lo que se facilitó el conteo.

Figura. 28 Diagrama de la metodología seguida para llevar a cabo un correcto conteo de bacterias

en medio sólido, en el cual se ejemplifica cuales se deben de contar y cuales se descartan por el

exceso de bacterias dentro de la caja Petri.

En la figura 29, se muestran un par de cajas Petri con las cuales se trabajaron y en las cuales se

puede observar la técnica con la cual se fueron marcando cada una de las colonias, es importante

mencionar que en el caso de estas dos placas no se tuvieron un exceso del crecimiento bacteriano

por lo que se facilitó el conteo.

Figura. 29 Conteo de colonias bacterianas.



Figura. 29 Imagen del microscopio estereoscópico.



NANOCÁPSULAS DE GELATINA CON ÁCIDO GÁLICO Durante la estancia realizada en la preparación de películas poliméricas surgió la posibilidad de

preparar nanocápsulas utilizando algunos de los reactivos empleados en la síntesis de las películas

poliméricas.

La preparación de las nanocápsulas (gelatina-co-ácido gálico) se llevó a cabo por el método de

nanoprecipitación sin y con la incorporación de NPZnO. (Gómez, 2014). Una vez obtenidas las

nanocápsulas se procedió a realizar su caracterización mediante diferentes técnicas como

espectroscopia de infrarrojo (FTIR) y microscopía electrónica de transmisión (TEM). En la figura

31, se observa esquemáticamente la metodología que se siguió para la elaboración de

nanocápsulas de óxido de zinc. La metodología de la investigación está divida en dos secciones,

síntesis de gelatina-co-ácido gálico y la preparación de las nanocápsulas de gelatina.

Figura 31. Diagrama de metodología de estudio.



Parte experimental

Tabla 3. Materiales y reactivos utilizados en la preparación de nanocápsulas de gelatina.

Equipos Reactivos

Analizador Termogravimétrico (TGA), TGA Q500 de TA

instruments

Etanol (C2H5OH)

Microscopio electrónico de barrido (SEM), JEOL, modelo

JCM 6000

Agua destilada (H2O)

Espectrofotómetro de difracción de rayos X (WAXD),

Siemens modelo D5000.

Acetato de zinc dihidratado al 99%

((C2H3O2)2Zn·2H2O)

Espectrofotómetro Infrarrojo (FTIR), Magna 500 Nicolet. Hidróxido de sodio (NaOH)

Centrifuga Gelatina de piel de bovino

Mechero bunsen Ácido gálico

Campana de extracción 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)

carbodiimida (EDC)

Incubadora Lab. Line Instruments N-hidroxisuccinimida (NHS)

Campana de flujo laminar, NUAIRE (modelNU-26-40). DMSO

Incubadora con agitación, New Brunswick Scientific.

Ultrasonido, Branson.

Vortex

Autoclave

Estufa



Preparación de nanocápsulas poliméricas

Las nanocápsulas de Gelatina y ácido gálico que contienen NP de ZnO se prepararon de la

siguiente manera. Se disolvieron 2 g de gelatina (GPB) junto con 0.30 g de ácido gálico (AG), 20 mg

de EDC y 24 mg de NHS en 30 mL de DMSO, a 70 °C durante 5 horas, cuidando que la temperatura

se mantuviera estable en todo momento (Figura 32). Una vez disuelto se midió el pH el cual fue de

7, posteriormente cada hora se midió el pH para contralar cada uno de los factores que pudieran

alterar el producto final de la síntesis.

Figura 32. Metodología utilizada en la síntesis para la preparación de nanocápsulas, en la cual se

muestran las condiciones utilizadas, así como los reactivos y las cantidades de se adicionaron para

la síntesis.

Preparación de nanocápsulas poliméricas.

Las nanocápsulas se formaron bajo la adaptación del método de nanoprecipitación utilizando

diferentes solventes para su precipitación (metanol, etnol y acetona). (Gómez, 2014) Una vez

transcurridas las 5 horas se procedió a la realización de nanocápsulas para lo cual se colocaron 50

mL de metanol a 5°C en un vaso de precipitado de 100 mL y con ayuda de un agitador magnético y

una parrilla de agitación se agitó a 600 rpm por 5 minutos, con una jeringa de insulina se dejó caer

gota a gota la mezcla obtenida de la síntesis, una vez transcurridos los 5 minutos, se retiró de

agitación. (Figura 33.)



Figura 33. Metodología utilizada en la preparación de las nanocápsulas sin y con la incorporación

de las NPZnO.

Preparación de nanocápsulas poliméricas utilizando como solvente Etanol.

Las nanocápsulas se formaron bajo la adaptación del método de nanoprecipitación utilizando

diferentes solventes para su precipitación (metanol, etnol y acetona) (Gómez, 2014). Se procedió

a la realización de NCs para lo cual se colocaron 50 mL de etanol a 5 °C en un vaso de precipitado

de 100 mL y con ayuda de un agitador magnético y una parrilla de agitación se agitó a 600 rpm por

5 min, con una jeringa de insulina se dejó caer gota a gota la mezcla obtenida de la síntesis, una

vez transcurridos los 5 min, se retiró de agitación.

A continuación se recogieron por centrifugación a condiciones de 10,000 rpm, a 20 °C por 5 min,

de tal manera que pudieran separarse completamente las nanocápsulas del solvente. Las

nanocápsulas obtenidas, se llevaron a liofilizar por 24 horas. El producto final se almacenó dentro

de viales a temperatura ambiente. (Figura, 34)



Figura 34. Diagrama esquemático de la metodología utilizada en la preparación de nanocápsulas

poliméricas utilizando como solvente Etanol.

Preparación de nanocápsulas poliméricas utilizando cómo solvente Acetona utilizando

ultrasonido

En la figura 36, podemos observar el procedimiento que se llevó a cabo para la preparación de

nanocápsulas de gelatina. Siguiendo el mismo método de nanoprecipitación (Gómez, 2014)

utilizado anteriormente y con la finalidad de reducir el tamaño de la cápsula, se hicieron pruebas

con ayuda del ultrasonido.

En esta preparación de NCs se utilizó como único solvente el etanol tras las pruebas realizadas

anteriormente. La solución que contenía la síntesis de GPB y AG se dejó caer por goteo con una

jeringa de insulina sobre etanol a 5°C, el ultrasonido encendido en todo momento se dejó

encendido por 1 minuto bajo.



Figura 36. Método de nanoprecipitación

Caracterización Para caracterizar las nanocápsulas fue necesario establecer su tamaño de partícula y la presencia

de grupos funcionales empleando diversas técnicas experimentales como microscopía electrónica

de transmisión (TEM) y espectroscopia de infrarrojo (FT-IR).

Espectroscopia de Infrarrojo (FTIR)

La espectroscopia es el estudio de la interacción entre la radiación electromagnética y la materia

en función de la longitud de onda (λ) o número de ondas (k). En concreto, la espectroscopia IR

analiza la absorción de radiación en el rango IR (4000 a 400 cm-1) por 19 un material, a

determinado número de onda, que se debe a transiciones entre distintos niveles energéticos

asociadas a vibraciones del mismo. Experimentalmente, se hace incidir luz IR y ésta atraviesa la

muestra. Cuando la longitud de onda de vibración de un enlace (o grupo de enlaces) coincide con

alguna de las longitudes de onda incidentes, se produce absorción. (Martin, 2016)

Preparación de la muestra

Pastilla de NCG

Para realizar el estudio de las muestras en polvo se preparó una pastilla de NCG (%). Las pastillas

se prepararon utilizando KBR y pesando 0.06 g de la muestra, siguiendo este mismo procedimiento



se realizaron las pastillas de gelatina y de ácido gálico, con las cuales se hicieron los FTIR de cada

una de las muestras.

Resultados de IR de nanocápsulas de gelatina (NCG)

Los resultados de FTIR se muestran en la figura 37. En esta figura se logran apreciar los grupos

funcionales que se encuentran presentes en la síntesis como es el caso de grupos aminos (3279

cm-1), las bandas localizadas en (2950 cm-1) encontramos grupos metilenos, en (2850 cm-1)

pertenecen a los grupos metilos, los cuales se deben a la composición de los reactivos utilizados.

Mientras que en otras, (1630 cm-1) grupos amidas, siendo estos tres picos los más significativos en

la gráfica. En bandas como (1528 cm-1) tenemos grupos ácidos, los cuales pueden deberse a la

flexión de las vibraciones del grupo N-H. Las bandas prominentes como es el caso de la banda

(1012 cm-1) la cual se puede tomar como una evidencia del entrecruzamiento del ácido gálico.

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

0

20

40

60

80

100

Inte

nsid

ad

(U

.A.)

Numero de onda (cm-1)

NCG

3279

3077

2936

1630

15281012

Figura 37. Espectro de infrarrojo de las nanocápsulas sintetizadas.



Microscopía electrónica de trasmisión (TEM)

Preparación de muestra

La muestra para la caracterización al TEM se preparó dispersando una pequeña cantidad de las

nanocápsulas en un vial que contenía 10 mL de etanol, una vez dispersadas mediante el uso de

ultrasonido se procedió a preparar las rejillas Lacey carbón, tomando 1 gota de la solución y

depositándola posteriormente en la rejila hasta sequedad total.

Resultados de TEM

Las imágenes observadas en el TEM muestran figuras amorfas, las cuales no corresponden a las

descritas en la bibliografía, sin embargo dichas figuras alcanzan el tamaño indicado en bibliografía,

el cual corresponde a tamaños entre 200 nm.

La inestabilidad que presenta el producto de la síntesis de GPB con AG pudo haber causado que

durante la preparación de la muestra en la rejilla presentara una descomposición perdiendo su

forma. Sin embargo analizando determinadamente la figura 38, se pueden observar pequeñas

nanocápsulas las cuales fueron marcadas con círculos rojos de tal manera que se pudieran

diferenciar en la imagen, dichas nanocápsulas se encuentran unidas a lo que parece ser un

fragmento de biopolímero.

Las nanocápsulas obtenidas muestran el mismo comportamiento obtenido en microcápsulas

realizadas en las pruebas iniciales, por lo que después de este análisis se tienen evidencias de la

presencia de nanocápsulas.

Se consideran diferentes factores que pudieron haber provocado la aglomeración de

nanocápsulas, tales como; la temperatura, la inestabilidad del material, así como una posibilidad

de que las nanocápsulas se aglomeraran con el método utilizado con ultrasonido, ya que como se

mencionó anteriormente, el material al ser muy inestable y tener poca resistencia antes de que

solidifiquen las nanocápsulas pudieron haber provocado tales anomalías.



Figura 38. Nanocápsulas de gelatina observadas por microscopía electrónica de trasmisión (TEM).

La realización de liofilización en la muestra es importante para mantener sólidas las NCG, así como

la posibilidad de realización de caracterización bajo crio-TEM si la muestra no es liofilizada

previamente, esto bajo consideración en caso de no liofilizar conociendo la inestabilidad del

material y su comportamiento a temperatura ambiente y fuera del solvente.



Microscopio electrónico de barrido (SEM)

El análisis se realizó con microscopio electrónico de barrido (SEM) con la finalidad de obtener

información precisa con respecto a su morfología, ya que a simple vista no se puede tener la

información necesaria con la cual se pueda comprobar que el material utilizado en la preparación

de las NCG sea apropiado, por lo cual se realizó dicha caracterización.

La microscopía indicó claramente que las microcápsulas de gelatina (MCG) presentan una forma

esférica, una superficie rugosa y porosa, tal como se aprecia en la figura 39.

Figura 39. Micrografías de microcápsulas de gelatina obtenidas por Microscopio electrónico de barrido. A) forma de MCG y b) superficie de MCG.

La porosidad observada en una de las (MCG), pudiera deberse al tipo de material con el cual se

está trabajando y su vez por la metodología seguida en su elaboración. Otras de las características

que presentan es que su grosor, no se pudiera saber si esta característica es mayor a otras hasta la

realización de pruebas comparativas.

Se pueden apreciar claramente dos MCG, de las cuales ambos casos la distribución de tamaño es

bastante homogénea. Esto queda comprobado al observar los resultados obtenidos del tamaño de

partícula de ambas MCG, la diferencia es insignificante y esto pudiera deberse por la técnica con la

cual se elaboraron, ya que resulta complicado tener exactitud cuándo se trabaja por goteo.



DISCUSIÓN DE RESULTADOS

Películas poliméricas

Para el método de precipitación química utilizado, se corroboró que se pueden obtener

nanopartículas de óxido de zinc con una morfología semiesférica y un tamaño de partícula

polidisperso.

Con respecto a las biopelículas que se realizaron se tuvieron defectos en la textura de estas, ya

que no se hinchaban tras la adición de agua e impedía el ablandamiento por lo que dificultaba al

momento de cortarlas. Durante la síntesis de las biopelículas fue importante que la temperatura

estuviera estable ya que cualquier cambio podría provocar alguna alteración sobre la reacción.

También se considera importante la adición exacta de los reactivos para lograr que la síntesis se

llevara a cabo correctamente y se lograra la obtención de un buen producto, teniendo igual

cuidado con respecto al tiempo de reacción durante la elaboración de las biopelículas, al no

realizarse en el tiempo establecido el producto obtenido podría no ser el deseado y teniendo

defectos o alteraciones por su composición.

Siguiendo las indicaciones de la norma Japonesa (JIS-Z-2801:200) las pruebas antibacterianas se

realizaron 5 veces por cada cepa y película polimérica, de tal manera que pudiera corroborar los

resultados con los obtenidos con respecto al efecto antibacterial de las nanopartículas de óxido de

zinc sobre las biopelículas poliméricas.

Con la preparación de películas con incorporación de nanopartículas, se evaluó su actividad

antibacteriana en cada una de las películas, teniendo resultados favorables en todos los

porcentajes de nanopartículas que se adicionaron a las películas, se inhibió el crecimiento en todas

las cajas con diluciones de dichas películas, teniendo crecimiento únicamente en los blanco, de tal

manera que se puede comprobar que las nanopartículas de ZnO tienen un efecto bacteriostático e

inhibitorio en el crecimiento bacteriano a concentraciones relativamente bajas tanto para E. coli

como S. aureus.



Nanocápsulas de gelatina con ácido gálico

Las nanocápsulas de GPB y AG se prepararon de acuerdo con el método de nanoprecipitación

(Gómez, 2014) y debido a las características que presentó la fase orgánica se modificó el uso de

solventes utilizando etanol, acetona y metanol a 5 °C.

Las microcápsulas poliméricas obtenidas en los primeros ensayos se hicieron a partir de la síntesis

de gelatina con diferentes concentraciones de DMSO, las pruebas arrojaron que aquellas síntesis

que formaban mejor las MCs, fueron las que tenían 100% de DMSO, además con el uso de

diferentes solventes, tales como el metanol, etanol y acetona. Sin embargo tras los resultados se

descartó el metanol, ya que las MCs no alcanzaban a tomar una forma sólida en menor tiempo y

se deshicieron en el solvente, ya que este dejó en constante agitación.

En la figura 39, se pueden observar microcápsulas poliméricas (MCs) que se formaron a partir del

uso de acetona como solvente y además se puede decir que estas mostraron mejor apariencia

física y resistencia. Sin embargo, cuando se utilizó como solvente el etanol y una vez liofilizadas las

nanocápsulas fueron estas las que mantuvieron su forma semiesférica y aquellas que se formaron

cuando se utilizó acetona como solvente se pegaron y perdieron la forma esférica, la única ventaja

que se mostró al utilizar acetona, fue que el tamaño era menor a aquellas MCs donde se utilizó

etanol. Después de obtener estos resultados, se omitió el uso de acetona para la formación de

nanocápsulas, de tal manera que al utilizar el ultrasonido, el único solvente utilizado fue el etanol.

Figura 39. A) Microcápsulas de gelatina con ácido gálico usando como solvente acetona. B), C) Microcápsulas de gelatina usando como solvente etanol.



Al utilizar el método de nanoprecipitación (Gómez, 2014), no se obtuvieron los resultados

esperados con respecto al tamaño de las capsulas, ya que estas aún no tenían un tamaño que

entrará a la escala nanométricas que manejaban algunas bibliografías, por lo que sé considera que

el método puede ser modificado para lograr conseguir el tamaño deseado.

Relación en la identificación de absorción por espectroscopia infrarroja

En la figura 40, se muestra la comparación de infrarrojos de ácido gálico (A) y gelatina (B) con

relación a las nanocápsulas de gelatina (C). La banda (1015 cm-1) la cual se puede tomar como una

evidencia del entrecruzamiento del ácido gálico, al igual que en la banda (945 cm-1), mientras que

en otras se atribuyen a los grupos funcionales que se encuentran presentes en la síntesis como es

el caso de grupos aminos (3288 cm-1), (1627 cm-1) grupos amidas, estos cuatro picos son de los

más significativos en la gráfica y son de gran relevancia para saber el comportamiento que tuvo la

reacción al final en las nanocápsulas. Los picos localizados en (2866 cm-1) se encuentran los grupos

metilos, en (2925 cm-1) encontramos grupos metilenos, los cuales se deben a la composición de los

reactivos utilizados. En bandas como (1521 cm-1) tenemos grupos ácidos, los cuales pueden

deberse a la flexión de las vibraciones del grupo N-H.

Figura. 40 Comparación de los espectros infrarrojos de ácido gálico (A) y gelatina (B) en relación

con las nanocápsulas de gelatina (C).



CONCLUSIONES

Conclusión de películas poliméricas

Se lograron la obtención de un producto, biopelículas por medio de entrecruzamiento químico

utilizando un sistema de ultrasonido y empleando concentraciones del 1 y 3% de nanopartículas

de ZnO metálica. Dichas biopelículas de gelatina-co-ácido gálico con nanopartículas de óxido de

zinc presentaron una excelente actividad antibacteriana contra E. coli y S. aureus.

Para el método de precipitación química utilizado, se corroboro que se pueden obtener

nanopartículas de óxido de zinc con una morfología semiesférica. Así como la obtención de

biopelículas por medio de entrecruzamiento químico las cuales se caracterizaron para determinar

sus propiedades y composición química.

La incorporación de las nanopartículas en las biopelículas mostraron que estas no afectan las

propiedades físicas de las biopelícula, sin embargo la metodología seguida para la dispersión de

estas Np’s si afecta su efecto, así como su concentración.

Las películas poliméricas presentaron efectos antibacterianos y un gran potencial para ser

utilizados como agente para combatir infecciones provocadas por algunos tipos de bacterias Gram

positivo y Gram negativo, esto debido a su peculiaridad manera de actuar de las nanopartículas

metálicas, ya que una vez que el ZnO mata o envuelve la membrana celular, las nanopartículas de

ZnO permanecen fuertemente adsorbidos en la superficie de la membrana incluso así las

nanopartículas de ZnO continúan liberando peróxidos en el medio. Aunque de las películas

poliméricas faltaría hacer más estudios para conocer la compatibilidad que tiene el material con la

piel y la cicatrización en humanos.

Aunque se ha probado la eficiencia que las películas poliméricas tienen y su gran potencial para

ser utilizados como agente para combatir infecciones provocadas por algunos tipos de bacterias

Gram positivo y Gram negativo, faltaría hacerse más estudios para conocer la compatibilidad que

tiene el material con la piel y la cicatrización en humanos.



Conclusión de nanocápsulas de gelatina

Para el método de nanoprecipitación utilizado, se corroboró que se pueden obtener nanocápsulas

de gelatina con una morfología semiesférica. La parte orgánica se obtuvo por medio de

entrecruzamiento químico el cual se caracterizó para determinar sus propiedades y composición

química.

Se modificó parte de la metodología seguida, utilizando solventes a temperaturas de 5°C. Aunque

se utilizaron diferentes solventes y se tuvieron buenos resultados con acetona, al momento de

liofilizar, las nanocápsulas tuvieron perdida de forma, aglomerándose y adquiriendo una textura

viscosa, por lo cual se decidió solamente trabajar con etanol el cual dio buenos resultados una vez

que se liofilizaron las muestras.

Debido a la inestabilidad del material con el cual se trabajó es importante y fundamental la

liofilización de las nanocápsulas para lograr obtener un producto duradero, además de mantener

dentro de viales de cristal cerrados, en un lugar seco y fresco, ya que el cambio de temperatura

puede afectar las nanocápsulas provocando perdida de forma o rompimiento de la misma,

liberando su contenido y exponiéndolo.

Modificando parte de la metodología seguida, se utilizó el ultrasonido resultando parte

fundamental en la metodología, a su vez de la utilización del solvente a temperaturas de 5°C, con

la cual aumentaba el tiempo de solidificación de las NCG. Aunque se utilizaron diferentes

solventes y se tuvieron buenos resultados con acetona, al momento de liofilizar, las nanocápsulas

tuvieron perdida de forma, aglomerándose y adquiriendo una textura viscosa, por lo cual se

decidió solamente trabajar con etanol el cual dio buenos resultados una vez que se liofilizaron las

muestras.

Debido a la inestabilidad del material con el cual se trabajó es importante y fundamental la

liofilización de las nanocápsulas para lograr obtener un producto duradero, además de mantener

dentro de viales de cristal cerrados, en un lugar seco y fresco, ya que el cambio de temperatura

puede afectar las nanocápsulas provocando perdida de forma o rompimiento de la misma,

liberando su contenido y exponiéndolo.



Recomendaciones: Películas poliméricas

Es importante que al momento de verter la solución sobre las placas no excedan los 10 mL

por placa, ya que podría llegar a tener un espesor inadecuado para su manejo y podría ser

difícil de cortar, así como su aplicación.

Es importante mantener estéril el área de trabajo y seguir el protocolo al realizar los

análisis microbiológicos para evitar contaminación en las cajas y de esta manera obtener

los resultados más confiables en nuestro análisis. Además de esta manera se evitara tener

algún problema de salud por el mal manejo de microorganismos.

Nanocápsulas de gelatina

Tener buen manejo de la temperatura ya que esta juega un papel importante en el

entrecruzamiento. A una alta temperatura puede provocar una degradación de la gelatina,

ya que está en especial siendo una proteína a una temperatura mayor de 80 °C puede

perder sus propiedades.

El tiempo en el cual se llevó a cabo la reacción es otro punto importante, ya que a un

menor tiempo es posible no tener entrecruzamiento, de igual manera un tiempo más

prolongado de reacción puede provocar degradación.

El uso de solventes a temperaturas menores de 5 °C ayudan a obtener una capsula con

mejor forma y consistencia más firme.

Es importante tener una aguja fina con la cual se vaya liberando la parte orgánica sobre el

solvente, siempre recordando de que debe mantenerse a goteo y debe ser muy cerca del

solvente de tal manera que se pueda conseguir la más fina capsula posible.

La agitación es un factor primordial en la elaboración de las nanocápsulas, ya que esta

parte del proceso, ayuda a solidificar las NCG sin que están se peguen antes de tener

firmeza, además ayuda a dispersarlas.

Es importante mantener un periodo muy corto durante el uso del ultrasonido, ya que un

periodo largo puede provocar la ruptura de las nanocápsulas, de igual manera se

recomienda no tener la potencia tan elevada y siempre mantenerse a las revoluciones

mencionadas en la metodología.



La centrifugación se recomienda para separar las nanocápsulas del solvente y es

importante no exceder las revoluciones por minuto mencionadas en la metodología, ya

que pudieran provocar la ruptura de las nanocápsulas.

La liofilización es una parte esencial, ya que por la inestabilidad del material este vuelve a

su estado líquido a temperatura ambiente una vez que esta fuera del solvente, por lo que

es importante liofilizar inmediatamente después de centrifugar.

Es importante mantener las nanocápsulas de gelatina en un frasco cerrado y en un lugar

fresco, ya que el cambio de temperatura pudiera provocar que se pegaran



Competencias desarrolladas y/o aplicadas

Competencias genéricas:

Instrumentales

• Capacidad de análisis y síntesis

• Capacidad de organizar y planificar

• Conocimientos básicos de la carrera

• Comunicación oral y escrita

• Habilidades básicas de manejo de la computadora incluyendo dibujo asitido por computadora.

• Habilidad para buscar, discriminar y analizar información proveniente de fuentes diversas.

• Tomar decisiones.

Interpersonales

• Capacidad crítica y autocrítica.

• Trabajo en equipo.

• Habilidades interpersonales.

• Capacidad de comunicación.

Sistémicas

• Capacidad de aplicar los conocimientos en la práctica.

• Habilidades de investigación.

• Capacidad de aprender.

• Capacidad de generar nuevas ideas (creatividad).

• Habilidad para trabajar en forma autónoma.

• Búsqueda del logro.



Química analítica: fue de las principales competencias que aplique durante el desarrollo del

proyecto de investigación que realice en mi estancia, esto debido a que es fundamental el

conocimiento en la preparación de soluciones.

Además de la aplicación de competencias adquiridas en dicha materia, tuve la oportunidad de

desarrollar habilidades en la preparación de diferentes soluciones, mejorar técnicas como lo son la

medición, pipeteo, cálculos, así como el reconocer diferentes reactivos.

Microbiología: fue otras de las competencias fundamentales durante el desarrollo del proyecto

debido a que se realizó una parte antibacteriana en la cual se utilizaron diversas metodologías,

tales como siembra en placa, preparación de medios de cultivos, diluciones, conteo bacteriano,

entre otros.

Análisis instrumental: un parte importante en la caracterización fue la interpretación de los datos

arrojados por diferentes instrumentos, como fue el caso del IR, en el cual con el apoyo de

bibliografía se interpretaron las bandas que arrojó durante la medición.

Química orgánica: en este proyecto fue importante el dominio de la química orgánica ya que fue

parte fundamental durante la preparación de las películas biopoliméricas. De igual manera para la

síntesis de nanopartículas fue necesaria la aplicación de diferentes metodologías vistas en química

orgánica.



Trabajo a futuro de nanocápsulas

Este material obtenido tiene un amplio campo de estudio para conocer como este interacciona

con las nanopartículas y como todo en conjunto trabajan.

Se plantea para trabajo a futuro lo siguiente:

Realizar estudio para establecer sus propiedades mecánicas.

Realizar estudios de liberación de las nanopartículas de óxido de zinc.

Determinar con mayor exactitud la cantidad de nanopartículas que puede absorber

las nanocápsulas dependiendo de la concentración.

Realizar estudios de citotoxicidad para el material.

Realización de caracterización bajo cryo-TEM.



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