PCR en Tiempo Real. ADN molde Primers Taq polimerasa dNTPs MgCl 2 Buffer Fluorocromo.
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PCR en Tiempo Real
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ADN molde Primers Taq polimerasa dNTPs MgCl2 Buffer Fluorocromo
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PCR en Tiempo RealPCR convencional
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Ventajas Sensibilidad Cuantificación Monitoreo de todo el procedimiento Disminución del riesgo de contaminación Automatización Amplicones pequeños Amplio rango dinámico Transcripción reversa
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• No específico• Curva de disociación• Económico SYBR Green
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SYBR Green
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• No específico• Curva de disociación• Económico SYBR Green
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FAM: fluoresceínaJOE: dimetoxi-dicloro-fluoresceínaTAMRA: tetrametil-rodaminaROX: rodamina X
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LUX™ primers
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Sondas TaqMan®
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Molecular Beacons ®
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Sondas Scorpions™
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A mayor producto de amplificación mayor
fluorescencia!!!!
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Threshold
BasalControl Negativo
Ct
ΔRn
Muestra
Rn
Número de ciclos
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• Rn: intensidad de la señal emitida por el reporter normalizada por la emisión del colorante utilizado como referencia pasiva (ROX).
• Threshold: umbral en el que se produce un cambio significativo en la fluorescencia.
• Basal: ciclos iniciales de la PCR (3-15) en los cuales hay cambios mínimos en la emisión de fluorescencia.
• Ct: número de ciclo en el cual la fluorescencia emitida supera el threshold. Está inversamente correlacionado con el log. del núm. inicial de copias.
• ΔRn: magnitud de fluorescencia generada durante la PCR.
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Controles endógenos:
β-Actina
rARN 18S
GAPDH
β2-microglobulina
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Métodos de cuantificación
• Cuantificación Absoluta
• Cuantificación Relativa a) Método del ΔΔCt: compara los Ct del gen
testeado y del gen de referencia (ΔCt) en cada muestra, y luego se comparan los ΔCt de las muestras experimentales con respecto a los calibradores.
(EFICIENCIA 100%). r= 2 -(ΔCtm-ΔCtc)
r= 2 -(ΔΔCt)
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b) (Etarget)ΔCt
target (control-muestra)
r= (Eendógeno) ΔCt
endógeno (control-muestra)
E= 10 [-1/ pendiente]-1
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Curva de disociación
• Contenido de GC.• Secuencia y tamaño del amplicón.
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Ej. Cuantificación Relativa (SYBR Green) mediante el método del 2 -(ΔΔCt)
Objetivo: medir la expresión de TRalfa en leucocitos PMN de ratas controles e hipotiroideas. Endógeno: beta-actina.
Tejido calibrador: hígado de rata.
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Curva de Rango Dinámico TRalfa
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Curva de Rango Dinámico Beta Actina
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Puesta a punto:
cDNAPrimers
(Calibrador!!!!!)
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Target: TRalfa (m y calibrador)
• Master Mix
Endógeno: BetaActina(m y c)
NTC!!!
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Ej. Discriminación Alélica (Taqman)
Objetivo: determinar genotipo homocigota o heterocigota para polimorfismo en gen de PPARγ2.
Alelos: Ala12 Pro12
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Sonda 1 (FAM)
Sonda 2 (VIC)
Alelo 1
Match
Mismatch
Alelo 2
Match
Mismatch
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• Homocigota alelo 1:
• Heterocigota:
• Homocigota alelo 2:
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