Opioide-hartzaileak (d, k, m) eta kannabinoide-hartzaileak ... · 1. irudiak gizonezkoen...
Transcript of Opioide-hartzaileak (d, k, m) eta kannabinoide-hartzaileak ... · 1. irudiak gizonezkoen...
Opioide-hartzaileak (d, k, m) eta kannabinoide-hartzaileak (CB1, CB2) giza espermatozoideetan espresatzen dira eta haien mugikortasunean eragiten dute
Jakintza-arloa: Medikuntza
Egilea: EKAITZ AGIRREGOITIA MARCOS
Urtea: 2008
Zuzendaria: JON IRAZUSTA ASTIAZARAN
Unibertsitatea: UPV-EHU
ISBN: 978-84-8438-395-6
Hitzaurrea
Opioide-hartzaileak (δ, κ, μ) eta kannabinoide-hartzaileak (CB1, CB2) giza espermatozoideetan espresatzen dira eta haien mugikortasunean eragiten dute izenburua duen tesia 2003ko udaberrian hasi zen eta 2008ko apirilaren 25ean defendatu zen. Euskal Herriko Unibertsitateko, Medikuntza fakultateko, Fisiologia saileko Jon Irazustaren zuzendaritzapean egin zen. Tesia aurrera eramateko, Carmen Ochoa doktorearekin eta Madrilgo Unibertsitate Konplutenseko Manolo Guzmán doktorearen taldearen laguntzarekin egina izan zen. Ordura arte ezezaguna zen helburu bat ebatzeari ekin zioten: sistema opioidea eta sistema kannabinoidea espermatozoideen gaineko eragina, alegia. Emaitza oso interesgarriak lortu ziren, izan ere, giza espermatozoideetan osagai opioideentzako eta kannabinoideentzako hartzaileak deskribatu zituzten lehenetarikoak izan ziren. Eta horren ondorioz, tesiak eman dituen artikulu zientifikoak zientzia-aldizkari prestigiotsuetan publikatu dira eta oso aipatuak izan dira beste ikertzaileengatik. Emaitza haiek, gaur egun, egilearen ikerketa-lerroaren oinarria dira, hala ere, tesiaren egilearen gaur egungo helburua emakumeen ugalkortasuna ikertzean datza.
Ekaitz Agirregoitia Marcos, 2012
Ekaitz Agirregoitia Marcos Doktore-tesia Leioa, 2008
Opioide-hartzaileak (δ, κ, µ) eta kannabinoide-hartzaileak
(CB1, CB2) giza espermatozoideetan espresatzen dira eta
haien mugikortasunean eragiten dute
Opioide-hartzaileak (δ, κ, µ) eta kannabinoide-hartzaileak
(CB1, CB2) giza espermatozoideetan espresatzen dira eta
haien mugikortasunean eragiten dute
Ekaitz Agirregoitia Marcos
Leioa, 2008ko apirila
Doktore-tesi honen zuzendaria
Jon Irazusta Astiazaran
Fisiologia Saila
Medikuntza eta Odontologia Fakultatea
Euskal Herriko Unibertsitatea
Doktore-tesi hau 2003ko udaberrian hasi zen eta 2008ko urtaro berdinean bukatu da.
Eskerrik asko bost urte hauetan doktore-tesi hau, zuzenean edo zeharka, aurrera
eramatea ahalbidetu duzuen norbanako, talde eta erakunde guztiei. Eta barkatu doktore-
tesi hau aurrera eramatean kale egin dizuedanoi. Nire hitzek ezin dute zuen bost urteko
lana eta pazientzia saritu, izan ere zuek gabe ez nintzateke ezer izango...
Gora zuek!
Nire familia guztientzat... aurrera bolie!
Aita, Ama, Naia, maite zaituztet!!!
Bertze jendek uste zuten ezin eskriba zaiteien
orai dute phorogatu enganatu zirela.
Heuskara ialgi adi mundura.
(Bernard Etxepare, 1545)
Edozein ekintzak indar berdineko eta kontrako noranzko erreakzioa eragiten du
(Isaac Newton, 1687)
LABURDUREN ZERRENDA
2-AG: 2-arakidonoilglizerola
AC: adenilato ziklasa
ACEA: arakidonoil-2´-kloroetilamida
ACTH: hormona adrenikortikotropikoa
ADH: hormona antidiuretikoa
ADP: adenosina 5´-difosfatoa
AEA: N-arakidonoiletanolamina
(anandamida)
ALH: buruaren albo-
desplazamenduaren anplitudea
AM251: 1-(2,4-diklorofenil)-5-(4-
iodofenil]])-4-metil-N-(1-
piperidil)pirazol-3-karboxamida
AM630: [(6-iodo-2-metil-1-[2-(4-
morfolinil)etil]-1H-indol-3-yl)(4-
metoxifenil)metanona],
AMP: adenosina 5´-monofosfatoa
ANOVA: bariantzaren analisia;
APN: N aminopeptidasa
ATP: adenosina 5´-trifosfatoa
BCF: zeharkatze-maiztasuna
BOP: barne-peptido opioideak
BSA: behi-serum albumina
CB1: 1 motako kannabinoide-hartzailea
CB2: 2 motako kannabinoide-hartzailea
CaM: kalmodulina
CaMK: kalmodulina kinasa
cAMP: AMP ziklikoa
CASA: ordenagailu bidezko haziaren
analisia
CBD: kannabidiola
CBN: kannabinola
cDNA: DNA osagarria
DAMME: D-ala2-Mephe4-Met-(O)-OI-
entzefalina
DEPC: dietilpirokarbonatoa
DMSO: dimetil sulfoxidoa
DNA: azido desoxirribonukleikoa
dNTP: deoxirribonukleotido trifosfato
DPDPE: [D-Pen2,5]-Entzefalina
ECL: kimioluminiszentzia-areagotzailea
EDTA: azido diaminoetanotetraazetikoa
FAAH: gantz-azidoen amida hidrolasa
FSH: hormona folikulu-estimulatzailea
GAPDH: glizeraldehido 3-fosfato
deshidrogenasa
GDP: guanosina 5'-difosfatoa
GH: hazkuntza-hormona
GnRH: hormona gonadotropina-
askatzailea
GTP: guanosina 5'-trifosfatoa
IZK: immunozitokimika
JNK: Jun N-bukaera kinasa
JWH-015: (2-Metil-1-propil-1H-indol-3-
il)-1-naftalenil-metanona
LH: hormona luteinizatzailea
LIN: linealtasuna
LPH: lipotropina
LSD: desberdintasun minimo adierazgarria
MAP: mitogenoz aktibaturiko proteina
MAPK: MAP kinasa
MGL: monoazilglizerollipasa
mRNA: RNA mezularia
MSH: melanotropina
NAPE: N-
arakidonoilfosfatidiletanolamina
NAT: N-aziltransferasa
NEP: endopeptidasa neutroa
OME: Osasunerako Munduko
Erakundea
PAGE: poliakrilamidazko gel
elektroforesia
PBS: fosfato/gatz-indargetzailea
PE: proentzefalina
PD: prodinorfina
PI3K: fosfatidilinositol-3 kinasa
PCR: polimerasaren kate-erreakzioa
PKA: cAMParen menpeko proteina
kinasa
PLD: D fosfolipasa
POMC: proopiomelanokortina
PRL: prolaktina
PVDF: polibinilideno difluoroa
RNA: azido erribonukleikoa
RT: alderantzizko transkripzioa
SDS: Sodio dodezil sulfatoa
SR141716a:N-piperidino-5-(4-
klorofenil)-1-(2,4-diklorofenil)-4-metil-
3-pirazol-karboxamida
SR144528: N-[(1S)-endo-1,3,3-trimetil
biziklo[2.2.1] heptan-2-il]-5-(4-kloro-3-
metilfenil)-1-(4-metilbenzil)-pirazol-3-
karboxamida]
STR: zuzentasuna
TAE: Tris/azetato indargetazailea
TBEK: Tyrode-BSA eraldatu ez-
kapazitantea
TBS: tris/gatz-indargetzailea
TEK: Tyrode eraldatu ez-kapazitantea
TEMED: N,N,N,N'-
tetrametiletilenodiamina
THC: Δ9-tetrahidrokannabinola
TRPV1: 1 motako baniloide-hartzailea
U-50488: 3,4-Dikloro-N-metil-N-[2-(1-
pirrolidinil)ziklohexil]benzeneazetamida
VAP: batez besteko ibilbidearen abiadura
VCL: abiadura lerromakurra
VSL: abiadura lerrozuzena
WB: western blot
WOB: oszilazioa
ZP: mintz peluzidoa
AURKIBIDEA Orrialdea
SARRERA 1
1. GIZONEZKOEN UGALTZE-APARATUA 3
1.1. Ugaltze-aparatu arraren anatomia fisiologikoa 3
1.2. Gameto arra (espermatozoidea) 6
2. ERNALKETA 15
2.1. Espermatozoide eta obozitoen garraioa 15
2.2. Espermatozoideen kapazitazioa 16
2.3. Espermatozoideen akrosomaren erreakzioa 17
2.4. Espermatozoidearen eta obozitoaren arteko lotura 17
3. ESPERMATOZOIDEEN MUGIKORTASUNA 19
3.1. Espermatozoideen mugikortasunaren azterketa molekularra 19
3.2. Mugikortasunaren azterketa fisiologikoa 21
4. SEINALEEN TRANSDUKZIO-BIDEAK GIZA
ESPERMATOZOIDEETAN 25
5. SISTEMA OPIOIDEA ETA KANNABINOIDEA 27
5.1. Sistema opioidea 27
5.2. Sistema kannabinoidea 36
HELBURUAK 45
MATERIALAK ETA METODOAK 49
1. MATERIALAK 51
1.1. Gailuak 51
1.2. Erreaktiboak 51
1.3. Soluzioak 52
2. METODOAK 57
2.1. Laginak lortzea 57
2.2. Espermatozoideak prestatzea 57
2.3. Hartzaileen espresio genikoa 58
2.4. Hartzaileen proteinen presentzia 63
2.5. Hartzaileen proteinak kokatzea 69
2.6. Espermatozoideen behaketa fisiologikoa 71
2.7. Analisi estatistikoa 76
EMAITZAK ETA EZTABAIDA 77
1. helburua: δ, κ eta µ opioide-hartzaileen espresioa eta kokapena giza
espermatozoideetan 79
1.1. Opioide-hartzaileen proteinaren espresioa giza espermatozoideetan 79
1.2. Opioide-hartzaileen kokapena giza-espermatozoideetan 80
1.3. Opioide-hartzaileen mRNAren espresioa giza espermatozoideetan 82
2. helburua: CB1 eta CB2 kannabinoide-hartzaileen espresioa eta kokapena giza
espermatozoideetan. 85
2.1. Kannabinoide-hartzaileen mRNAren espresioa giza espermatozoideetan 85
2.2. Kannabinoide-hartzaileen proteinaren espresioa giza espermatozoideetan 86
2.3. Kannabinoide-hartzaileen kokapena giza espermatozoidetan 87
3. helburua: Opioide- eta kannabinoide-hartzaileen aktibazioaren eragina
espermatozoideen mugikortasunean. 89
3.1. Agonista eta antagonista opioideen eragina espermatozoideen
Mugikortasunean 89
• δ opioide-hartzailearen agonista (DPDPE) eta antagonista (naltrindol)
opioideen eragina mugikortasunean 89
• κ opioide-hartzailearen agonista (U-50488) eta antagonista (nor-
binaltorfimina) opioideen eragina mugikortasunean 94
• µ opioide-hartzailearen agonista (morfina) eta antagonista (naloxona)
opioideen eragina mugikortasunean 94
3.2. Agonista eta antagonista kannabinoideen eragina espermatozoideen
Mugikortasunean 98
• CB1 kannabinoide-hartzailearen agonista (ACEA) eta antagonista
(SR 141716A) kannabinoideen eragina mugikortasunean 98
• CB2 kannabinoide-hartzailearen agonista (JWH-015) eta antagonista
(SR144528) kannabinoideen eragina mugikortasunean 101
EZTABAIDA OROKORRA ETA HIPOTESIAK 105
1. Garrantzitsua al da opioide- eta kannabinoide-hartzaileen mRNA mantentzea
espermatozoide helduetan? 107
2. Opioide eta kannabinoide-hartzaileen kokalekua: beren funtzioaren adierazle? 109
3. Opioide eta kannabinoideek espermatozoideen ugaltze-traktuetan zeharreko
bidaia erregulatzen dute? 110
ONDORIOAK 115
BIBLIOGRAFIA 119
ERANSKINAK 141
1. Eranskina: Denbora errealean egindako PCR kuantitatiboa (qRT-PCR) 143
2. Eranskina: PCRan anplifikatutako anplikoien sekuentziazioa 145
3. Eranskina: Mugikortasun parametroak 147
DOKTORE-TESI HONETATIK ERATORRITAKO ARTIKULUA 151
Sarrera
Sarrera 3
1. GIZONEZKOEN UGALTZE-APARATUA
1.1 Ugaltze-aparatu arraren anatomia fisiologikoa
1. irudiak gizonezkoen ugaltze-aparatua osatzen duten atalak erakusten ditu. Jarraian,
atal bakoitzaren kokalekua eta funtzioa aztertuko dugu banan-banan:
1.1.1 Testikuluak
Testikuluak (A) espermatozoideak sortu eta metatzeko eta androgenoak jariatzeko
organo espezializatuak dira. Eskrotoan biltzen dira, bertako tenperatura gorputzaren
ohikoa baino 2-3 ºC baxuago mantentzeko. Izan ere, testikuluen tenperatura altuagoa
denean, espermatogenesia kaltetua gertatzen da (Munkelwitz and Gilbert, 1998;
Zorgniotti, 1980). Barrabilak zenbait atalez osatuta daude:
a) Tubulu seminiferoak
Tubulu seminiferoak (B), testikuluen barneko ehunka hodixka bihurri eta era oso
trinkoan paketatuak dauden egiturak dira. Tubuluak zenbait lobulutan banatzen dira,
baina guztiek sare testikularrean bukatzen dute. Tubuluetan, espermatogenesia gertatzen
da; aurrerago azalduko dugu (Rhoades eta Tanner, 1995).
b) Sare testikularra
Tubulu seminiferoek sare testikularra (D) izeneko gune biltzailera igortzen dute beren
edukia, eta barrabiletako hoditxo eferenteetatik (E1) epididimora eramaten dute
(Guyton eta Hall, 1997).
1.1.2 Epididimoa
Epididimoa (E), testikuluen atzealdean kokatzen den hodia da; haren funtzioa hodi
deferentea eta testikuluak lotzea da. Epididimo bi dauzkate gizonek; bat testikuluko.
Doktore-tesia
Sarrera 4
Epididimoa, klasikoki, hiru zatitan banatu izan da: epididimoaren burua (E1), gorputza
(E2) eta isatsa (E3) (Rhoades eta Tanner, 1995). Gizakian, epididimoa 4-5 metro luze
da, eta espermatozoideek, bide hori egiteko, 3 egunetik gora ematen dute (Wen eta
Yang, 2000). Geroxeago ikusiko dugun bezala, organo hau oso garrantzitsua da
espermatozoideen heltze-prozesuan eta mugikortasunean (Cosentino eta Cockett, 1986).
Testikuluen eta epididimoaren jariakina hazi-likidoaren % 5 da, baina gametoen
ugaltze-prozesurako ezinbestekoak diren zenbait propietate bereganatzen laguntzen dute
(Jequier eta Crich, 1986).
1.1.3 Hodi Deferenteak
Hodi deferentea (F) epididimoaren edukia jaso eta hodi isurlera (H) eramaten duen
hodia da. Bide horretan dauden anpuluak (G) haziaren biltegi gisa jokatzen du. Hori da,
hain zuzen, basektomietan mozten den hodia.
(B) tubuluseminiferoak
(I) guruin besikularra
GERNU-MASKURIA (K)
(E) epididimoa
(E3) epid. isatsa (cauda)
(D) sare testikularra
(F) hodi deferentea
(L) uretra
(J) prostata
(A) TESTIKULUA
(E1) hoditxo eferenteak + epid. burua (caput)
(E2) epid. gorputza (corpus)
(M) guruin bulbo-uretrala
(H) Hodi isurlea
(G) hodi deferentearen anpulua(O) gorputz leizetsu
(N) gorputz arola
(P) glandea
1. irudia. gizonezkoen ugaltze-aparatuaren atalak. Azalpena testuan. (Debuse, 1998-tik moldatua).
1.1.4 Guruin Osagarriak
Espermatozoideak epididimotik uretraraino garraiatzeko ekintzari emisio deritzo, eta
bide horretan nahasten dira espermatozoideak eta guruin osagarrien jariakin guztiak.
Ekintza hori epididimo, hodi deferente eta hodi isurleen muskuluen uzkurketek eragiten
Doktore-tesia
Sarrera 5
dute (Rhoades eta Tanner, 1995). Beraz, guruin osagarriak uretrarekin konektatuta
daude, eta haien jariakinek espermatozoideen iraupena eta ugalkortasuna mantentzen
dute (Jequier eta Crich, 1986).
a) Guruin besikularra
Guruin besikularraren (I) jariakin gelatinakara horixka hazi-likidoaren % 46-80 izaten
da. Jariatzen dituzten gaien artean fruktosa (espermatozoideen elikagai energetiko
nagusia), azido askorbikoa, fibrinogenoa, bikarbonatoa eta prostagladinak daude,
besteak beste, eta ahalmen indargetzaile handia du (Jequier eta Crich, 1986).
b) Prostata
Prostata (J) gernu-maskuriaren (K) azpialdean dagoen guruina da, eta uretrarekin (L)
konektatuta dago (Rhoades eta Tanner, 1995). Prostataren jariakin urtsu eta
koloregabekoa hazi-likidoaren % 13-33 izaten da, eta zinkez eta hainbat entzimaz
(proteasa, fosfatasa azidoak...) osatua dago. Prostataren jariakin horrek pH azidoa du,
eta ugalkortasunaren zenbait prozesu garrantzitsu erregulatzen duten prostasoma
izeneko mintzezko besikulak ditu (Jequier eta Chrich, 1986). Prostasometan, osagai
lipidiko (kolesterola, esfingomielina...), ioi eta molekula txiki (Ca++, Zn++, GDP, ADP,
ATP...) eta proteina ugari (% 33,8 entzimak, % 19 proteina garraiatzaileak, % 17,3
seinaleen transdukziorako proteinak, % 14,4 GTP proteinak eta % 5,8 proteina
txaperonak) identifikatu dira (Utleg eta lank., 2003).
d) Guruin bulbo-uretrala
Guruin bulbo-uretralak (M) hazi-likidoari azken bi jariakinak gehitzen dizkio. Bi
jariakinek —gelatinakara, alde batetik, eta urtsua, bestetik— hazi-likidoaren % 2-5
osatzen dute, eta glukoproteinatan aberatsak dira (Jequier eta Crich, 1986).
1.1.5 Uretra
Testikuluaren eta kanpo-ingurunearen arteko azken egitura da. Zati prostatikoa, zati
menbranosoa eta zati arola ditu (L). Uretraren zati arola zakilaren barnean dago, eta
Doktore-tesia
Sarrera 6
gorputz arolak (N) inguratzen du. Haren gainean zakilaren trenkadak bitan banatzen
dituen gorputz leizetsua (O) dago, eta zakilaren gorputz arol distal zabaldua zakilaren
glandea (P) da. Egitura muskular horiek guztiek parte hartzen dute zakilaren tentetzean.
Hazi-isurtzea hazia uretratik kanporatzea da (Guyton eta Hall, 1997).
1.2 Gameto arra (espermatozoidea)
1.2.1 Espermatogenesia
Zelula ama germinaletatik espermatozoideetara doan desberdintze-prozesua da
espermatogenesia (2. irudia). Prozesu hori testikuluetan gertatzen da, tubulu
seminiferoetan hain zuzen ere. Haurtzaroan, gametoen sorrera atsedenean mantentzen
da, baina pubertaroan, hormona gonadotropikoen (FSH eta LH) kontzentrazioaren
igoerarekin batera, testikuluetako Leydig zelulek testosterona hormona jariatuko dute
eta, horrekin batera, espermatogenesia hasiko da. Prozesua bizitza osoan mantenduko
da, baina zahartzaroan urritze txiki bat nabaritzen da (Sadler, 2004).
Espermatogenesia, edo zelula germinal arren sorrera-prozesua, 3 zatitan banatu ohi da
(Dudek eta Fix, 2004):
a) Espermatozitogenesia
Zelula germinatibo primordialak (46, 2N), bitelo-zakuaren paretetan agertzen dira
garapen enbrionarioaren hirugarren astean eta, zatiketa mitotikoak jasaten dituzten
bitartean, mugimendu ameboideen bidez, 4. eta 5. asteen artean gonadetara heltzen dira.
Pubertaroan, zelula germinatibo primordialak A motako espermatogoniara (46, 2N)
desberdintzen dira.
A motako espermatogoniek etengabe mitosiak pairatzen dituzte, arra zelula amez
hornitzeko. Baina horietako hainbat zelula B motako espermatogonietara diferentziatzen
dira (46, 2N).
Doktore-tesia
Sarrera 7
b) Meiosia
B motako espermatogoniak lehenengo meiosian sartzen dira eta, DNA erreplikatzen
dutenean, espermatozito primario bihurtzen dira (46, 4N). Espermatozito primario
horiek lehenengo meiosia bukatzen dute, eta bakoitzak 2 espermatozito sekundario
sortzen ditu (23, 2N). Espermatozito sekundario horiek, bigarren meiosia eginda,
bakoitzak 2 espermatida sortzen ditu (23, 1N).
espermatozito I
espermatozito II
espermatogonia B
espermatogonia A
Mitosia(16 egun)
I. meiosia(24 egun)
II. meiosia(orduak)
espermatidak
espermatozoideak
hondakin-gorputzak
Espe
rmio
gene
sia
Espe
rmat
ozito
gene
sia
Desberdin-tzapena
Mei
osia
2. irudia. Espermatogenesiaren eskema. Zelula ama germinaletatik eratorritako A motako espermatogoniak, espermatogenesia prozesuaren lehenengo zelulak dira. Zelulen zatiketaren bidez zelula-klonak eratzen dira eta zelula berri horiek guztiak, zubi zitoplasmatikoen bidez, lotuak geratzen dira espermatozoideak hondakin-gorputzetatik banatzen diren arte. Zelula elkarlotuen kopurua, eskeman irudikatzen direnak baino askoz gehiago dira (Miller eta Ostermeier, 2006-tik moldatua).
d) Espermiogenesia
A motako espermatogoniek espermatogenesia egiten hasten direnetik espermatidak
sortu arte, zitozinesia osatugabea da. Hori dela eta, zelula batetik eratorritako zelula-
Doktore-tesia
Sarrera 8
klon luzeak zubi zitoplasmatikoen bidez lotuak agertzen dira. Zelula germinatibo heldu
(espermatozoideak) independiente bilakatzeko, espermatidek zenbait aldaketa
morfologiko pairatzen dituzte. Aldaketa horiek, besteak beste, hauek dira: akrosoma
garatzea, nukleoa kondentsatzea, zitoplasmaren zati nagusia desagertzea eta burua,
erdiko zatia eta isatsa eratzea. Dena den, espermatozoide horiek ez dute ernaltzeko
gaitasunik emearen ugaltze-traktuan kapazitazioa eta erreakzio akrosomikoa pairatu
arte.
Gizakietan, ziklo espermatogeniko bakoitzak 64 egun irauten ditu. Hala ere, ziklo
bakoitza bukatu baino lehen, 2-3 asteko erregulartasunez, beste ziklo batzuk hasten dira.
Ondorioz, tubulu seminifero bakoitzean garapen-egoera desberdinetan dauden zelulak
izango ditugu, eta garatuenak tubulu horien argiune edo lumen aldera kokatuko dira (3.
irudia). Tubulu horien alde basalean espermatogenesia erregulatzen duten Sertoli
zelulak ere kokatzen dira, eta odolaren eta tubuluaren arteko hesia edo muga dira
(Browder eta lank., 2000).
Tubuluseminiferoen
pareta
Espermatogonia
I. Espermatozitoa
II. Espermatozitoa
Espermatida
Espermatozoidea
GAR
APEN
AREN
SEK
UEN
TZIA
Tubuluseminiferoen
lumena
3. irudia. Espermatozitoen garapena tubulu seminifero baten zehar-ebakian. Xafla basalean, zelula ama germinalen populazioa dago (espermatogoniak). Zelula horiek zatitzean sortzen diren zelula alabak lumen aldera migratuko dute eta 64 egun eta gero, espermatozoideetara desberdintzen dira (irudia The McGraw-Hill Companies egindakotik moldatua dago).
Doktore-tesia
Sarrera 9
1.2.2 Espermatozoideen egitura
Espermatozoideen funtzioa ugaltze-zelula emeraino (obozitoa) iritsi eta hura ernaltzea
da. Helburu hori lortzeko, oso morfologia zehatza dute. Ugaztunen espermatozoidea bi
zati nagusitan banatu ohi da: burua eta isatsa (4. irudia).
4. irudia. Espermatozoidearen eta isatsaren ultraegituraren irudi eskematikoa. A) Ugaztunen espermatozoidea buruaz (akrosoma, nukleoa eta zitoplasma) eta isatsaz (lepoa, tarteko zatikia, zatiki nagusia eta bukaerako zatikia) osaturik dago. B) Tarteko zatiaren zehar-ebakiaren eskema. Bertan, kanpotik barrura, mintz plasmatikoa (MP), mitokondrien geruza (MG), 9 kanpo-zuntz dentso (KZD) eta axonema eratzen duten egiturak [mikortubulu-bikoteen eraztuna (MBE), dineinazko besoak (DB) eta erdiko mikrotubulu-bikotea (EMB)] daude. D) Zatiki nagusiaren zehar-ebakiaren eskema. Bertan, mintz plamatikoa (MP), 7 kanpo-zuntz dentso (KZD) eta 2 zuntzezko mintz zutabe (ZMZ) daude. Axonemako osagaiak ez dira aldatzen. E) Bukaerako zatiaren zehar-ebakiaren eskema. Bertan, mintz plamatikoa (MP) eta axonema agertzen dira. Azalpena testuan. (Turner, 2006-tik moldatua).
MBE EMB
DB
MP
MP
Tarteko zatia
Zatiki nagusia
Bukaerako zatikia
LepoaMG
KZD
MP
KZD
ZMZ
Zitoplasma
Akrosoma
Nukleoa
A
B
D
E
Burua
Buru barruko egitura aipagarrienak akrosoma, nukleoa eta zitoplasma — oso murritza—
dira (Browder eta lank., 2000):
Doktore-tesia
Sarrera 10
a) Akrosoma: Buruaren alde apikalean kokatzen den besikula handi bat da. Egitura
horren barruan, obozitoaren matrize estrazelularra (mintz peluzidoa)
zeharkatzeko beharrezkoak diren entzima hidrolitikoak daude. Entzima horiek,
akrosomaren exozitosiagatik (erreakzio akrosomikoa) askatzen dira.
b) Nukleoa: Akrosomaren atzetik geratzen den buruaren zatian kokatzen da,
eskualde post-akrosomalean hain zuzen. Espermatozoidearen nukleoan, DNA
oso kondentsatua dago espermatogenesian zehar protaminek histonak
ordezkatzen dituztelako. Nukleoan ere, oraindik guztiz ezagunak ez diren
zenbait funtzio bete ditzakeen RNA dago. Nukleoa obozitora sartu behar den
zatia da.
d) Zitoplasma: Espermatozoide helduek oso zitoplasma murritza dute.
Zitoplasmaren galera nagusia, espermatozoideak tubulu seminiferoen epiteliotik
askatzera doazenean gertatzen da. Askatzen duten zitoplasma zatiari hondakin-
gorputz deritzo; gorputz horietan, RNA paketatua, Golgi aparatua, erretikulu
endoplasmikoa, lisosomak eta peroxisomak daude. Sertoli zelulek fagozitatzen
dituzte hondakin gorputzak.
Nukleoko kromatinaren kondentsazio handiagatik, ez da mRNArik de novo sortuko, eta
zitoplasmaren presentzia murritza eta organuluen galera direla eta, mRNA hori ez da
itzultzen proteinetara, eta besikulen garraiorik ez da gertatzen. Espermatozoide helduek,
beraz, proteinen espresioa eta besikulen garraioa galdua dute (Miller eta Ostermeier,
2006). Horrek esan nahi du espermatozoideek ez dituztela konposatu berriak
sintetizatuko eta, beraz, espermatogenesian sortutakoarekin heldu beharko dutela
obozitora. Dena den, epididimoan zeharreko garraioan, likido seminalarekin kontaktuan
dauden bitartean edota emearen ugaltze-bidean zehar, espermatozoideen mintz
plasmatikoko proteina eta lipidoen trukea gertatzen da (Schuel eta Burkman, 2005).
Modu horretan, gerta daiteke espermatozoideek, ingurunearen arabera, jarduera
aldatzea. Bestalde, duela gutxi, proposatu da proteina jakin batzuen mRNAren itzulpen
mitokondriala gerta daitekeela (Miller eta Ostermeier, 2006). Beraz, gai horrek
eztabaida sortzen du oraindik.
Doktore-tesia
Sarrera 11
Isatsa
Espermatozoidearen isatsak egitura konplexua eta espezializatua osatzen du gametoaren
mugimendua ahalbidetzeko. Morfologikoki, lau zatitan banatzen da: lepoa, tarteko
zatikia, zatiki nagusia eta bukaerako zatikia (Mortimer, 1997):
Zelula eukariotikoen flageloetan, mugimendua sortzeko motorra axonema da.
Axonemaren egitura espermatozoideen isatsaren zatiki guztietan mantentzen den egitura
komuna da, eta mikrotubuluz eta haiei lotutako proteinez osatua dago. Zehazki,
tubulinaz eraturiko 9 mikrotubulu bikotek eraztun bat osatzen dute eta, erdian, beste bi
mkrotubulu paratzen dira. Mikrotubulu bikoteei lotutako egitura proteiko
garrantzitsuenak dineinazko besoak dira. Izan ere, proteina horrek ATPasa jarduera
duenez, energia kimikoa energia mekaniko bihurtzen du eta, ondorioz, konformazio-
aldaketa jasaten du. Beraz, mugimendua “mikrotubuluen arteko irristadura” bidez
gertatzen da, tubulina/dineina motorren funtzionamenduari esker (Marigomez eta
Cajaraville, 1999).
a) Lepoa: Buruaren eta isatsaren arteko giltzadura da.
b) Tarteko zatikia: Axonemaren inguruan, 9 kanpo-zuntz dentso daude; haien
inguruan, mitokondriaz osaturiko geruza; eta, azkenik, dena inguratzen mintz
plasmatikoa. Zatiki honetan sortzen da gametoaren mugimendurako beharrezkoa
den ATPa.
d) Zatiki nagusia: Hemen ere, axonema inguratzen duten kanpo-zuntz dentsoak
daude, baina 3.a eta 8.a luzetara kokatutako bi zuntzezko mintz-zutabek
ordezkatzen dituzte. Bi zutabeak elkarri lotuak agertzen dira. Azkenik, dena
inguratzen duen mintz plasmatikoa dago. Zatiki honetan ere ATPa sortzen da.
e) Bukaerako zatikia: Axonema eta haren inguruan, mintz plasmatikoa dago.
Doktore-tesia
Sarrera 12
1.2.3) Espermatozoideen heltzea
Espermatogenesia bukatu ostean, espermatozoideak tubulu seminiferoko argiunera
askatzen dira (espermiazioa). Espermatozoide askeak, obozitoa ernaltzeko gai izateko,
lehen aipatutako aldaketa morfologikoaz gain, aldaketa fisiologiko eta biokimiko
sakonak ere jasan behar izango ditu. Aldaketa horiei guztiei espermatozoidearen heltze-
prozesu deritze (Yanagimachi, 1994).
Beraz, mugimendu peristaltikoen bidez, espermatozoideak sare testikularra igaro ostean,
hoditxo eferenteetatik epididimora igarotzen dira; han, heltze-prozesuak jarraitzen du.
Alde batetik, epididimoaren burutik isatserainoko bidean, espermatozoideek
mugikortasuna bereganatzen dute (zitosoleko cAMP eta ATParen igoerarekin loturiko
prozesua) eta epididimoaren isats horretan metatzen dira. Bestalde, bide osoan zehar,
espermatozoideek zenbait molekula trukatzen dituzte ingurunearekin (gluzido, proteina
eta lipido ugari mintzetik erauzi, eraldatu edota bereganatu egiten dira) (Yanagimachi,
1994). Heltze-prozesuaren helburu nagusiak, beraz, mugikortasuna lortzea eta obozitoa
ezagutu eta berarekin fusionatzeko beharrezkoak diren konposatuak lortzea dira (Gatti
eta lank., 2004). Hala ere, lehen aipatu dugunez, ernalketarako gaitasun osoa
emakumezkoen ugaltze-aparatuan bukatzen da, kapazitazioarekin eta erreakzio
akrosomikoarekin (Sadler, 2004).
1.2.4) Espermatozoideen isurtzea
Espermatozoideak, kanporatuak izan arte, hodi deferentean eta haren anpuluan denbora
luzean metatu daitezke. Gizonezkoaren kitzikatze eta erekzioarekin batera, emisio
deituriko prozesua hasten da. Prozesu horretan, espermatozoideak likido seminala
osatzen duten zenbait jariakinekin elkartzen dira. Uretra, haziarekin betetzean,
zentzumen-seinaleak sortzen dira eta hazia isurtzen da. Isurtzen den hazia osagai
zelularrek (espermatozoideek) eta osagai jariatuek (likido seminalak) osatzen dute.
Likido seminala espermatozoideak emearen ugaltze-aparatuan barrena garraiatzeaz
arduratzen da, baina, gainera haren osagaiek badituzte beste zeregin asko ere: ATPa
ekoizteko substratu energetikoak (fruktosa...) gehitzen ditu. Isuritako haziaren
koagulazioa gertatzen da (fibrinogeno eta semenogelinaren bidez), hasiera batean haziak
Doktore-tesia
Sarrera
Doktore-tesia
13
baginatik alde egin ez dezan eta baginaren alde sakonetan (umetoki-lepoaren aldean)
manten dadin. Koagulua 15-20 minutuan disolbatzen da (fibrinolisinari esker), eta,
horregatik, espermatozoideen mugikortasuna areagotzen da. Likido seminalean dauden
faktore inhibitzaileei esker, geldotu egiten da espermatozoideen jarduera (kapazitazioa
eta erreakzio akrosomikoa saihestuz), eta, modu horretan, beren bideragarritasuna
mantentzen da. Haziaren pH-a 7,2 eta 7,8 artean egon ohi da, eta horrek
espermatozoideen mugikortasunean laguntzen du. Gizon emankor batek 2-6 ml hazi
isurtzen ditu, eta hazi horrek 50-250 milioi espermatozoide ditu mililitroko (Guyton eta
Hall, 1997).
Sarrera 15
2. ERNALKETA
Espermatozoidearen eta obozitoaren arteko loturari ernalketa deritzo. Prozesu hori
umetoki-tronparen anpuluan gertatzen da. Beraz, ernalketa gertatzeko,
espermatozoideek emearen umetoki-tronpara heldu behar dute eta obuluak obariotik
askatu eta umetoki-tronpara iritsi behar du (Mortimer, 1997).
2.1 Espermatozoide eta obozitoen garraioa
Espermatozoideei dagokienez, lehenik eta behin, isuritako hazia baginara heltzen da.
Likido seminalaren babesagatik, espermatozoideek baginako pH azidoa jasan dezakete.
Espermatozoideak likido seminaletik askatzen dira, eta umetoki-lepoaren hodira
garraiatuak dira. Lepoko mukosak lagunduta, espermatozoideak umetokira igarotzen
dira, eta, handik, umetokiko tronpara (Fallopioren tronpa) heltzen dira. Baginan,
umetokian eta umetokiaren eta tronparen arteko loturako bidean, espermatozoideen
galera handia gertatzen da, eta baginara askatutako espermatozoideen % 1 soilik heltzen
da tronpara. Umetoki-tronparen istmora ailegatzean, espermatozoideek mugikortasuna
murrizten dute; leku horretan amaitzen da espermatozoideen migrazioa obulazioa
gertatu arte (Sadler, 2004) (5. irudia).
Obozitoari dagokionez, oso ondo erregulatuta dagoen obulazioa gertatu eta gero,
obozitoa, kumulu ooforoko zelulez inguratua, obulutegitik askatzen da eta, zerrenda
obarikoen mugimenduak lagunduta, umetoki-tronparen anpulura heltzen da.
Aipatutako obulazio-prozesua gertatzen denean, agian kumulu ooforoko zelulek
askatutako substantzia kimioerakarleek eraginda, istmoan zeuden espermatozoideen
mugikortasuna berriro aktibatzen da eta umetoki-tronparen istmotik anpulura igeri
egiten dute (Sadler, 2004). Mugimenduaren hiperaktibazio hori, espermatozoideek
ernaltzeko gaitasuna bereganatzeko jasaten duten kapazitazioa eta ondoriozko erreakzio
akrosomikoaren hasiera da (Bedford, 1983) (5. irudia).
Doktore-tesia
Sarrera 16
Ernalketa
Obozitoa
Obarioa
Anpulua Istmoa
Umetoki-tronpa
5. irudia. Espermatozoide eta obozitoen garraioaren eskema umetoki-tronpan. Espermatozoideak umetoki-tronparen istmora ailegatzean, mugikortasuna txikitzen dute. Obulazioa gertatzean, obozitoa umetoki-tronpara kanporatzen da eta espermatozoideak hiperaktibatzen dira. Ernalketa, anpuluan gertatzen da. Azalpen zabaldua testuan (Schuel, 2006-tik moldatua).
2.2 Espermatozoideen kapazitazioa
Espermatozoideek ernalketaren azkeneko pausoak aurrera eramateko emearen ugaltze-
aparatuan jasaten duten aldaketa multzoari kapazitazio deritzo (Sadler, 2004). Aldaketa
horiek espermatozoideak likido seminaletik askatzen direnean eta emearen ugaltze-
aparatuko likidoekin harremanetan jartzen direnean hasten dira. Zehazki, umetoki-
tronpako likidoek espermatozoideen jardueraren inhibizioa eragiten zuten faktoreak
(proteina, glukoproteina, lipido...) kentzen dituztenean (Mortimer, 1997). Esate
baterako, espermatozoidearen mintzetik kolesterola erauzten da, eta, horren ondorioz,
espermatozoidearen buruaren mintz plasmatikoa desegonkortu egiten da (Cross, 1996).
Mintzaren jariakortasun-aldaketa horrek bikarbonatoa eta kaltzioaren sarrera eta beste
ioien irteera eragiten du, besteak beste, eta espermatozoideen metabolismoaren aldaketa
dakar (Flesch eta Gadella, 2000). Kapazitazioa prozesu itzulezina da.
Doktore-tesia
Sarrera 17
2.3 Espermatozoideen akrosomaren erreakzioa
Espermatozoideen kapazitazioa gertatzen denean, akrosomaren kanpo-mintza eta
espermatozoidearen buruko mintz plasmatikoa fusionatzen dira (Flesch eta Gadella,
2000). Horrek (1) akrosomako entzimen askapen txikia ekarriko du eta koroa
erradiatuko zelularteko bidea irekiko dio espermatozoideei. Espermatozoideak mintz
peluzidora lotzean (ZP3 proteinari esker), (2) akrosomaren kanpo-mintza erabat
disolbatzen da; akrosoma barruko entzima guztien exozitosia gertatzen da, eta mintz
peluzidoa digeritzen da (Guyton eta Hall, 1997) (6. irudia).
Umetoki-tronparen inguruneko substantziek bideratutako kapazitazioa eta erreakzio
akrosomikoa leku eta une zehatzean gertatzen ez badira, espermatozoideek ez dute
ernaltzeko gaitasunik izango (Harrison, 1996).
6. irudia. Erreakzio akrosomikoa eta ernalketa (espermatozoide eta obuluaren loturaren xehetasuna). Espermatozoideen kapazitazioa gertatzen denean akrosoma barruko entzimek (1) granulosako zelulak eta (2) mintz peluzidoa digerituko dute eta (3) espermatozoidea eta obozitoaren arteko mintzen fusioa gertatzen da. (irudia The McGraw-Hill Companies egindakotik moldatua dago).
2.4 Espermatozoidearen eta obozitoaren arteko lotura
Koroa erradiatuko zelulak eta mintz peluzidoa zeharkatzea lortzen duen
espermatozoidea obozitoaren mintz plasmatikoarekin (oolema) kontaktuan jartzen da,
eta (3) bi zelulen arteko mintzen fusioa gertatzen da (6. irudia). Espermatozoide horren
material genetikoa obozitoaren barnean sartuta, ernalketa gauzatzen da. Sortutako
Doktore-tesia
Sarrera 18
zigotoa aktibatu egiten da (agian, espermatozoideak eramandako faktoreek eraginda) eta
haren segmentazioa hasten da. 3 egunetan blastomeraz osatutako morula umetoki-
tronpatik umetokira garraiatuko da, eta, blastozisto-egoeran dagoenean, umetokian
ezarriko da. Hortik aurrera, enbrioia garatuko da (Sadler, 2004). (7. irudia).
1
Obarioa
Anpulua Istmoa
Umetoki-tronpa
2 3
45
6
7
8
9
10
7. irudia. Giza garapenaren lehenengo asteko gertaerak. 1) Obulazio osteko obozitoa. 2) Ernalketa, obulaziotik 12-24 ordu beranduago. 3) Zigotoa, DNAren bikoizketa unea. 4) 2 zelula-aldia (30 orduko adina). 5) 4 zelula-aldia (40 orduko adina). 6) 8 zelula-aldia. 7) Morula, 12-16 zelula-aldia (3 eguneko adina). 8) Morula berantiarra, umetokira heltzean (4 eguneko adina). 9) Blastozisto goiztiarra (4 egun eta erdiko adina), mintz peluzidoa desagertu da. 10) Ezarpen fase goiztiarra (6 eguneko adina). (Salder, 2004; Schuel, 2006-tik moldatua).
Doktore-tesia
Sarrera 19
3. ESPERMATOZOIDEEN MUGIKORTASUNA
Orain arte, gizonezkoen gametoetatik abiatuz, ugaltze-fisiologia aztertu dugu. Zehazki,
gameto arren sorrera (gametogenesia), egitura, heltzea, isurtzea, emearen ugaltze-
traktuan zeharreko garraioa eta ernalketa-prozesuak azaldu ditugu.
Jakin behar da ezen, gizonezkoak, ugalkorra izateko, aurrean aipatutako prozesu horiek
guztiak era egokian egiteko gai izan behar duela; zeren eta gizonezkoari ernalketa
gertatu arteko prozesuren batek huts egiten badio, ugalkortasun-gaitasuna murriztua
edukiko du.
Beraz, ugalkortasunik ezaren ikerketa egitean, ernalketa gauzatzeko beharrezkoa den
edozein prozesu fisiologiko edota biokimikoren erregulazioa aztertzen da, eta, behin
erregulazioa ulertuta, gai izango gara ugalkortasunik ezaren zergatiak errazago
ulertzeko.
Gizonezkoen ugalkortasuna aztertzeko, arruntki onartzen da prozesu fisiologiko
garrantzitsuenetariko bat espermatozoideen mugikortasuna dela. Hori horrela da, batez
ere, espermatozoideen mugikortasun urriak edo mugikortasunik ezak, ia beti,
ugalkortasunik eza dakarrelako (Turner 2006). Baina espermatozoideen mugikortasun
urriari loturiko ugalkortasunik ezaren erantzulea emea zein arra izan daiteke, hau da,
arazoa espermatozoidean (osagai maskulinoa), espermatozoideak zeharkatu behar duen
emearen ugaltze-traktuan (osagai femeninoa) edo bietan egon daiteke.
3.1 Espermatozoideen mugikortasunaren azterketa
molekularra
Espermatozoideak, mugitzeko, flageloaren mugimenduez baliatzen dira. Flageloaren
mugimenduaren oinarrian dauden erreakzio kimikoak ugariak izan arren, laburki baino
ez ditugu azalduko.
Espermatozoidearen isatsaren egitura aztertu dugunean, aipatu dugu flageloen
mugimendua axonemak sorturiko astinduran datzala; axonemaren “mikrotubuluen
Doktore-tesia
Sarrera 20
arteko irristaduran”, hain zuzen ere (Marigomez eta Cajaraville, 1999). Axoneman, 250
bat proteina daude, hala nola proteina zitoeskeletikoak (tubulina...), proteina motorrak
(dineina...), proteina txaperonak, kaltzioa lotzen duten proteinak eta proteina kinasak
zein fosfatasak... (Inaba, 2003). Axonemaren dineina-besoei ATPa lotzean, dineinaren
ATPasa aktibatzen da, eta, ATParen hidrolisiagatik, dineiak konformazio-aldaketa
jasaten du eta ondoz ondoko mikrotubuluen gainean mugitzen da. Baina axonemaren
dineina molekula guztiak ez dira batera aktibatzen; oinaldeko molekulak aktibatzen dira
lehenik, eta aktibazio hori hedatu egiten da pixkanaka axonemaren puntarantz, proteinaz
proteina motako elkarrekintzen bitartez. (Marigomez eta Cajaraville, 1999; Turner,
2006). Espermatozoideek, tarteko zatikiaren mitokondrietan gertatzen den fosforilazio
oxidatiboak eraginda, ATPa eskuratzen dute. Baina, isatsean zehar, mitokondriarik ez
dagoen tarteetan, ATPa lortzeko, oso garrantzitsua da batez ere zatiki nagusiaren
zuntzezko mintzetan gertatzen den glikolisia (Turner, 2006).
Espermatozoideen mugikortasuna erregulatzeko seinaleztatze-biderik garrantzitsuenak
cAMP/PKA eta kaltzioari loturikoak dira (Yanagimachi 1994, Ho 2002, Turner 2006).
Kaltzio ioia kanpotik zelulara barneratzean edota espermatozoideak barneko kaltzio-
biltegia hustutzean: (1) kaltzioak, kalmodulinara (CaM) lotzean, kalmodulina kinasa
(CaMK) aktibatzen du eta, ondorioz, mugikortasuna aktibatzen da (Ignotz Suarez 2005;
Turner, 2006); (2) bestalde, kaltzioak ezohiko adenilato ziklasa “disolbagarria” (sAC)
aktibatzen du (bikarbonatoak ere eragin berdina du) eta sAC-k AMP ziklikoa (cAMP)
sortzen du. (3) ATPtik sortzen den cAMPk, cAMParen menpeko proteina kinasa (PKA)
aktibatuko du eta, ondorioz, PKAk eta berak aktibatutako tirosina kinasak flageloaren
proteinak (dineinak,...) fosforilatuko dituzte, eta mugimendua sorraraziko dute (Tash
1989; Turner, 2006) (8. irudia).
Kaltzioa edota bikarbonatoak sorturiko seinaleztatze-bide horretaz gain,
espermatozoideen pH-an gertatutako aldaketek, GTPa lotzen duen proteina eraentzaile
(G proteina; ingelesezko GTP binding regulatory protein) txikiek edota
heterotrimerikoez gidaturiko seinaleztatzeak ere zerikusia dute mugikortasunaren
erregulazioan (Yanagimachi 1994, Wang 2003, Turner, 2006). Hala ere, mekanismo
horiek ez dira oraindik oso ondo ezagutzen.
Doktore-tesia
Sarrera 21
(1) (2)
(3)
Mugikortasuna Mugikortasuna
Tyrosina kinasa
Ser/Thr fosfatasak
Tyrosina fosfatasak
Barneerreserbak
Mintzeanzeharreko
kanala
(2)
8. irudia. Ugaztunen espermatozoideen mugikortasunaren erregulazioan parte hartzen duten hainbat seinaleztatze-bideen eskema. 1) CaM menpeko bidea. 2) sAC menpeko bidea. 3) cAMP/PKA bidezko seinaleztatzea. Azalpena testuan. (Turner, 2006-tik moldatua).
3.2 Mugikortasunaren azterketa fisiologikoa
Espermatozoideek, zeharkatzen duten ingurunearen arabera eta behar funtzionalen
arabera, mugikortasun-patroi desberdinak dituzte. Hala, plasma seminalean dauden
espermatozoide isuri berrien ibilbide lerrozuzenak, emearen lepoko mukosara heltzean,
fisiologikoki aurkeztuko lituzketen ibilbide lerrozuzen berdinak dira.
Espermatozoideek, plasma seminaletik askatzean eta emearen ugaltze-traktutik gora
abiatzean, mugikortasun-ezaugarriak aldatzen dituzte. Lehen aipatu dugun bezala,
umetoki-tronparen istmoan, espermatozoideen mugikortasuna motelduz doa eta,
kapazitazioa gertatzearekin batera, flageloaren uhin-luzera berriz handitzen da;
ondorioz, buruaren albo-desplazamendu handiko ibilbideak sortzen hasten dira (Álvarez
C, 2003; Mack eta lank., 1988; Roberson eta lank., 1988). Azkenean, uhinaren
anplitudea asimetriko bihurtzen da, eta mugimendu ez-progresibo eta indartsua
sumatzen da; horri espermatozoidearen hiperaktibazio deritzo (Álvarez C, 2003;
Burkman, 1984). Espermatozoideen ernaltzeko gaitasuna lortzea eta mugikortasuna
garatzea modu paraleloan gertatzen direnez, mugikortasuna erabili izan da
espermatozoide-populazio batek ernaltzeko duen gaitasuna zeharka neurtzeko (Álvarez
C, 2003; Holland-Moritz eta Krause 1992).
Doktore-tesia
Sarrera 22
Mugikortasuna kontuan harturik, Osasunerako Munduko Erakundeak lau taldetan
sailkatu zituen espermatozoideak (WHO, 1999):
- a motako mugikortasuna: higidura progresiboa (lerrozuzena) eta azkarra duten
espermatozoideak.
- b motako mugikortasuna: higidura ez-progresiboa (sigi-sagakoa) edota motelegia
duten espermatozoideak.
- c motako mugikortasuna: tokitik mugitzen ez diren edota ibilbide zirkular hertsia
duten espermatozoide mugikorrak.
- d motako mugikortasuna: mugimendurik ez duten espermatozoideak (geldiak).
Mugikortasunaren azterketa fisiologikoa egitean, mugikortasun hitzak bi kontzeptu
adierazten ditu: alde batetik, “espermatozoidearen mugikortasun lerrozuzen aktiboa”
[adibidez, gizonezkoen espermatozoideen batez besteko abiadura-lerro zuzena
segundoko 25 µm-koa da 37 ºC-an, eta tenperaturaren arabera aldatzen da (Kraemer eta
lank., 1998)]; bestetik, “espermatozoide mugikorren portzentaje totala” [adibidez,
Osasunerako Munduko Erakundearen arabera, hazi-lagina normaltzat hartzeko,
espermatozoideen % 25ek baino gehiagok a motako mugikortasuna izan behar dute edo,
gutxienez, espermatozoideen % 50ek a+b mugikortasuna izan behar dute (WHO,
1999)].
Diagnostikoa egiteko, mugikortasun-parametroaren erabilera handituz joan den heinean,
espermatozoideen abiadura eta espermatozoide mugikorren portzentajeaz gainera,
espermatozoideen ibilbideak edo mugimendu motak aztertzeko tresnak sortu dira
(Álvarez C, 2003). Hala, gaur egun, mikroskopioei loturiko neurketa-sistema
automatikoen bidez (CASA; ingelesezko computer assisted sperm analysis),
espermatozoidearen buruak bi planoetan egiten duen denboran zeharreko higidura azter
dezakegu. Aztertzen diren parametro nagusiak abiadura eta ibilbidea adierazten dutenak
dira (Mortimer, 2000):
a) Abiadura-parametroak:
VCL = abiadura lerromakurra (µm/s)
VSL = abiadura lerrozuzena (µm/s)
VAP = batez besteko ibilbidearen abiadura (µm/s)
Doktore-tesia
Sarrera
Doktore-tesia
23
b) Ibilbide-parametroak (abiaduren konparaketaz lortuak):
LIN = linealtasuna (VSL/VCL) X 100 (%)
STR = zuzentasuna (VSL/VAP) X 100 (%)
WOB = oszilazioa (VAP/VCL) X 100 (%)
d) Bestelako parametroak:
ALH = buruaren albo-desplazamenduaren anplitudea (µm)
BCF = zeharkatze-maiztasuna (Hz)
Bukatzeko, aipatu behar da Osasunerako Munduko Erakundeak espermatozoideen
mugikortasuna, kontzentrazioa eta morfologia irizpidetzat hartuta eratu zuela haziaren
patologien terminologia (WHO, 1999):
- Normozoospermia: eiakulatu normala, lehen aipatutako erreferentzia-balioa
betetzean.
- Oligozoospermia: Espermatozoideen kontzentrazioa erreferentzia-balioa baino
txikiagoa denean.
- Astenozoospermia: Espermatozoideen mugikortasuna erreferentzia-balioak baino
txikiagoak direnean.
- Teratozoospermia: Espermatozoide (morfologikoki) normalen kopurua erreferentzia-
balioa baino urriagoa denean.
- Nekrozoospermia: Espermatozoide bizien kopurua % 50 baino baxuagoa denean.
- Azoospermia: Espermatozoiderik ez eiakulatuan.
- Aspermia: Eiakulaturik ez.
Sarrera 25
4. SEINALEEN TRANSDUKZIO-BIDEAK GIZA
ESPERMATOZOIDEETAN
Gure gorputzeko organo eta ehunen integrazio funtzionalean, ezinbestekoa da zelula-
zelularen eta zelula-ingurunearen arteko komunikazio-sistema egokia izatea. Zenbait
zelula (zelula miokardikoak) komunikazio elektriko zuzenaz komunikatzen dira euren
artean. Hala ere, komunikabiderik hedatuenek oinarri kimikoa dute; adibidez, nerbio-
sistemaren sinapsietako neurotransmisoreak, sistema endokrinoaren hormonak edota
sistema immunearean bitartekari kimikoak. Komunikazio kimikoan parte hartzen duten
substantzia motak asko dira eta izaera kimiko desberdina dute (lipidoak, aminoazido
eraldatuak,...). Substantzia kimikoek seinale zehatzak eragiten dituzte zelulan eta,
modulaturiko transdukzio-bidearen arabera, zelula-barneko eraldaketa zehatza gertatzen
da. Gorputzean gertatzen den seinaleztatze modu hori ugaltze-sisteman ere gertatzen da
(Guyton eta Hall, 1997).
Lehenago aztertu dugun bezala, espermatozoideen sorrera-prozesutik obozitoa ernaldu
arte, espermatozoideek zenbait ingurune zeharkatu behar dituzte. Zehazki,
espermatozoideentzat duten garrantzi fisiologikoagatik, ingurune horietako
aipagarrienak dira tubulu seminiferoak (espermatogenesia han gertatzen delako),
epididimoa (heltze-prozesua han gertatzen delako), likido seminala (jardueraren
inhibitzailea eta bideragarritasunaren erantzulea delako) eta umetoki-tronpa
(kapazitazioa, hiperaktibazioa, erreakzio akrosomikoa eta gametoen mintzen fusioa han
gertatzen direlako). Espermatogenesia burutu ahal izateko, gameto arraren eta
ingurunearen arteko elkarrekintzak gertatzen dira; era berean, espermatozoideen heltze-
prozesua aurrera joateko, espermatozoideen eta gizonezkoaren ugaltze-traktuko
ingurunearen arteko elkarrekintzak gertatzen dira. Hazi-isurtzearekin, espermatozoideak
emearen ugaltze-traktura heltzen dira, eta likido seminaletik askatzen dira. Hortik
aurrera, espermatozoide horien funtzioak, emearen ugaltze-traktuko ingurunearekin
dituzten elkarrekintzek erregulatzen dituzte. Emearen ugaltze-traktuan, konposizio
biokimiko desberdineko inguruneak zeharkatzean, lehen aipatu ditugun elkarrekintzei
esker, espermatozoideen mintz eta zelula barruko transformazioa gertatzen da.
Eraldaketa horiek ahalbidetuko dute, hain zuzen, ingurune bakoitzean dauden eragile
fisiologikoei erantzuteko gaitasuna bereganatzea. Modu horretan, ernalketarako
Doktore-tesia
Sarrera 26
beharrezkoak diren prozesuak (kapazitazioa, hiperaktibazioa, erreakzio
akrosomikoa,...), bata bestearen ondorio gisa (modu sekuentzialean) gertatzen dira. Hala
ere, elkarrekintza eta aldaketa horiek oso ondo erregulatuak egon behar dute, zeren eta,
aipatutako gertaerak leku desegokian eta une desegokian gertatzen badira, murriztu
egingo baita ugaltzeko gaitasuna.
Laburtuz, ernalketa gauzatzeko, espermatozoideetan gertatu behar duten aldaketa eta
prozesu horiek guztiak (mugikortasuna barne), zelulen arteko eta zelularen eta
ingurunearen arteko seinaleen transdukzio-sistemek erregulatuko dituzte (Baldi eta
lank., 2002).
Badakigu zelula somatikoetan dauden seinaleztatze-bide asko, nukleoaren jarduera
eragiten duten bideak izan ezik, espermatozoideetan ere agertzen direla. Izan ere, azken
urteetan asko ikertu dira espermatozoideen mintz plasmatikoari loturiko hartzaileek
gidaturiko transdukzio-bideak. Eta, zehatzago adierazita, deskribatu da nerbio-sisteman
oso sakon ikertutako komunikazio zelularreko sistema askok espermatozoidearen
kapazitazioan, erreakzio akrosomikoan, mugikortasunean, arnasketan edota kimiotaxian
eragiten dutela (Meizel, 2004; Schuel eta Burkman; 2005).
Alde horretatik, hainbat ornogabe eta ugaztunen espermatozoideek hormona,
neurotransmisore eta neuromoduladoreak lotzen dituzten hartzaileak espresatzen
dituzte; substantzia horien artean, serotonina eta katekolaminak (Meizel eta Turner,
1983; Nelson eta Cariello, 1989; Bandivdekar eta lank., 1991), adenosina eta ATPa
(Minelli eta lank., 1995; Fraser eta Adeoya-Osiguwa, 1999; Meizel, 2004), azetilkolina
(Baccetti eta lank., 1995), prostaglandina eta leukotrienoak (Basuray eta lank., 1990;
Schaefer eta lak., 1998), gonadotropinak, progesterona, estrogenoak eta androgenoak
(Luconi eta lank., 1998; Lee eta lank., 2000; Solakidi eta lank., 2005), glizina (Meizel
eta Son, 2005), tazikininak (Ravina eta lank., 2007) eta beste substantzia batzuk daude
(berrikuspenerako, Meizel, 2004; Naz eta Sellamuthu, 2006).
Doktore-tesia
Sarrera 27
5. SISTEMA OPIOIDEA ETA KANNABINOIDEA
Opioideak eta kannabinoideak bi droga-talde psikoaktiboak dira. Opioideak peptidoak
dira, eta kannabinoideak lipidoak dira, baina profil farmakologiko antzekoa dute.
Fisiologikoki, biek eragiten dute analgesia, katalepsia, hipotermia, depresio motorra,
hipotentsioa, immunosupresioa, sedazioa eta beste hainbat efektu. Zelulan, substantzia
bakoitzak hartzaile desberdinak aktibatzen ditu, baina opioide-hartzaileak zein
kannabinoide-hartzaileak G proteinei lotuta daude, zehazki Gi/Go motako G proteinei
lotuak daude. Hartzaile horien aktibazioak, oro har, adenilato ziklasaren (AC) jarduera
eta tentsioaren mendeko kaltzio-kanalak inhibitu, potasio-kanalak aktibatu eta MAP
kinasen transdukzio-bidea estimulatzen du (Viganó eta lank., 2004). Azkenaldian,
opioide eta kannabinoideen arteko modulazio gurutzatua gertatzen dela proposatu da.
Orain arte lortu diren emaitzetan oinarrituta, modulazio gurutzatu hori azaltzeko,
hipotesi bat baino gehiago proposatu da; kannabinoideek peptido opioideak askatzea
edo alderantziz (Corchero eta lank., 1999), kannabinoideek opioide-hartzaileak
espresatzea edo alderantziz (Börner eta lank., 2006), hartzaile-mailako edota
transdukzio-bideen elkarrekintzak (Shapira eta lank., 2000) eta abar (berrikuspenerako,
Viganó eta lank., 2004; Fattore eta lank., 2005), baina oraindik ikerketa gehiago behar
dira hipotesietatik teorietara pasatzeko.
5.1 Sistema opioidea
Opioa lo-belarraren (Papaver Somniferum L.) fruituetatik ateratako erretxina da, eta
haren ondorioen arduradun nagusia morfina da (Lorenzo eta lank., 1999). Opioaren
eragin psikoaktiboak direla eta, beste edozein narkotiko baino gehiago erabili izan da,
alkohola alde batera utzita. Izan ere, opioak beti izan du toki gailena medikuntzan, eta,
gutxienez azken 4000 urteotan, terapeutikan ugari erabili da (Snyder, 1993). Opioaren
osagai aktiboak isolatzerakoan hasi ziren opiazeoen eragin kimikoak zientifikoki
ulertzen. 1805ean, Friedrich Sertürner izeneko kimikari alemaniar batek lo-belarretik
morfina hutsa lortu zuen, eta substantzia hori morphium izenaz bataiatu zuen, Morfeo
edo loaren jainko grekoaren oroimenez. Oro har, lo-belar landare batek eman dezakeen
opio gordin kantitatea 5-10 gramokoa da. Opioaren % 75-80 substantzia inaktiboak dira,
eta beste % 20-25 substantzia aktiboek osatzen dute. Garrantzitsuenak morfina (% 10),
Doktore-tesia
Sarrera 28
narkotina (% 6), papaverina (% 1) eta kodeina (% 0,5) dira. Heroina morfinari talde
azetilo bi gehituz lorturiko eratorri erdisintetikoa da, eta talde azetilo horiei esker,
lipodisolbagarritasun handia du. Horren ondorioz, ehunetara errazago heltzen da, eta
sortutako efektuak morfinak sortutakoak baino biziagoak dira.
Opioideak peptidoak dira, eta peptido horien hartzaileak, estekatzaileekiko duten
itxurazko afinitatearen arabera, hiru mota farmakologikoki desberdinetan sailkatu dira:
δ opioide-hartzailea (δ = delta, “deferens” hitzagatik, saguaren hodi deferentean
identifikatu zelako; DOP-R), κ opioide-hartzailea (κ = kappa, ketoziklazozinagatik;
KOP-R) eta μ opioide-hartzailea (μ = mu, morfinagatik; MOP-R) (Lord eta lank., 1977).
Hartzaile metabotropiko horiek, izatez, monomerikoak dira, mintz plasmatikoa
zeharkatzen duten 7 α-helizez eratuta daude, eta gai dira Gi/o proteinetara lotzeko
(Picatoste eta lank., 1996). Hartzaile horien artean, aminoazido-sekuentzien
antzekotasuna oso handia da [% 60 orotara eta % 73-76 mintzean zeharreko aldeetan
(Minami eta Satoh, 1995)]. Azken hamarkadan, opioide-hartzaileekin antzekotasun
handia duen nozizeptina lotzen duen opioide-hartzailea (nozizptina dinorfinaren antzeko
peptidoa da; NOP-R) deskribatu izan da (Wick eta lank., 1994; Mollereau eta lank.,
1994). Opioide-hartzaileak izaki bizidun ornogabeetan zein ornodunetan espresatzen
dira (Waldhoer eta lank., 2004).
5.1.1 δ opioide-hartzailea
Gizakiaren nerbio-sistema zentralari dagokionez, δ-hartzaileen dentsitate handia ikus
daiteke kortexean eta kaudatu-putamenean (Pilapil eta lank., 1987). δ-hartzailearen
mRNA, kortexean, kaudatu-putamenean, hipokanpoan eta amigdalan banatzen da
(Simonin eta lank., 1994). δ-hartzaileak, batez ere, axoietan kokatzen dira; beraz, ziur
aski gune presinaptikoan funtzionatzen dute gehienetan (Elde eta lank., 1995). Ehun
periferikoetan, δ-hartzailea, besteak beste, linfozitoetan (Sharp eta lank., 1998), hestean
eta guruin adrenalean (Wittert eta lank., 1996) espresatzen da.
5.1.2 κ opioide-hartzailea
Nerbio-sistema zentralean, κ opioide-hartzaileak kortexean, amigdalan eta klaustroan
ikus daitezke (Pilapil eta lank., 1987). κ-mRNA, besteak beste, kortexean, talamoan,
Doktore-tesia
Sarrera 29
hipotalamoan, gorputz ildaskatuan eta accumbens nukleoan agertzen da (Peckys eta
Landwehrmeyer, 1999). κ-hartzaileak dendritetan eta gorputz zelularrean kokatzen dira
gehienbat, eta, ziur aski, postsinaptikoki funtzionatzen dute (Elde eta lank., 1995). Ehun
periferikoei dagokienez, κ-hartzailea hestean (Wittert eta lank., 1995) eta, batez ere,
zelula immuneetan agertzen da (Rivière, 2004).
5.1.3 μ opioide-hartzailea
Nerbio-sistema zentralari dagokionez, δ-hartzaile eta μ-hartzaileen mRNAren banaketa
nahiko antzekoa den arren, badira ezberdintasunak. Kortexean, δ-mRNAren maila
handia da; μ-mRNAren maila, ostera, nahiko eskasa da (klase bietako hartzaileak
ugariak izan arren). Talamoan eta hipotalamoan, berriz, δ-mRNA gutxi (baita δ-
hartzaileak ere) eta μ-mRNA ugari agertzen da. Gorputz ildaskatuan (kaudatu-
putamenean) eta accumbens nukleoan, mRNA eta hartzaile mota biak azaltzen diren
arren, δ-mRNA lausotuago banatzen da (Mansour eta lank., 1994). μ-hartzaileak
dendritetan eta gorputz zelularrean kokatzen dira gehienbat, eta, ziur aski,
postsinaptikoki funtzionatzen dute (Elde eta lank., 1995). μ-hartzailea ehun
periferikoetan ere deskribatu da, besteak beste, arratoiaren hodi deferentean (Lemaire
eta lank., 1978), barean, guruin adrenalean eta giltzurrunean (Wittert eta lank., 1995) eta
saguaren hestean (Pol eta lank., 2001).
5.1.4 Barne-sistema opioidea
Opioide-hartzaileek, haien barne-estekatzaileek (barne-peptido opioideak; BPO) eta
sintesi- eta andeakuntza-prozesuetan parte hartzen duten molekulek barne-sistema
opioidea eratzen dute.
Nerbio-sistema zentralean ezagutzen diren peptido guztiak (karnosina dipeptidoa eta
glutation tripeptidoa izan ezik) gorputz neuronaleko erribosometan (erretikulu
endoplasmiko bikortsuan), molekula aitzindari peptidiko handi edo pre-pro-proteina
moduan sintetizatzen dira (Siegel eta lank., 1993). Metalo-endopeptidasa batek
hidrolizatu ondoren, pro-proteina moduan garraiatzen dira Golgi aparatura; handik,
pikor batzuetan, axoian zehar amaiera presinaptikoraino heltzen dira. Bide horretan
Doktore-tesia
Sarrera 30
zehar, hidrolisi eta aldaketa berri batzuk jasaten dituzte, peptido aktibo bihurtu arte.
Neurona peptidergikoa kitzikatzean, mintz presinaptikoaren despolarizazioa gertatzen
da, eta, ondorioz, tentsioaren menpeko kaltzio-kanalak zabalduko dira eta ioi horren
kontzentrazio zelularra igoko da (Thorn eta lank., 1978). Modu horretan, neuropeptidoz
beterik dauden besikulak, exozitosi bidez, gune sinaptikora askatzen dira.
Barne-sistema opioidearen kasuan, opioide-hartzaileak aurkitu ondoren, haien barneko
estekatzaileak eta horien aitzindariak sortzen dituzten hiru geneak identifikatu ziren:
a) Proentzefalina (PE) (Comb eta lank., 1982); nerbio-sistema zentralean eta muin
adrenalean sintetizatzen da. Tripsina, endopeptidasa eta N-karboxipeptidasa motako
entzimen eraginez, 243 aminoazidoko proteina horretatik, zazpi peptido opioide sor
daitezke. Garrantzitsuenak bost aminoazidoz eratutako entzefalinak (met- edo leu-
entzefalina) dira. Pentapeptido horien sintesiaren arduraduna garunean isolatutako
entzefalina konbertasa izeneko karboxipeptidasa bat da (Hughes, 1983).
b) Prodinorfinak (PD) (Kakidani eta lank., 1982); besteak beste, dinorfina A (1-17),
dinorfina B (1-13) eta β-neo-endorfina sortzen ditu.
d) Proopiomelanokortina (POMC) (Nakanishi eta lank., 1979); aitzindari honek
barne-opioideak ez diren peptidoak ere gordetzen ditu. Izan ere, β-endorfina peptido
opioideaz gainera, hormona adrenikortikotropikoa (ACTH), α eta β-lipotropina (LPH),
α eta β-melanotropina (MSH), eta beste zenbait peptidoren aitzindaria da. Molekula
horiek sintetizatzen dituen entzima POMC entzima bihurtzailea da (Turner eta lank.,
1987).
Gaur egun, 20 barne-peptido opioide ezagutzen dira eta 5-32 aminoazido arteko luzera
izan dezakete. Guztien ezaugarri komuna amino muturretik karboxi muturrera
errepikatutako aminoazido-sekuentzia da (“Tyr-Gly-Gly-Phe-Met” edo “Tyr-Gly-Gly-
Phe-Leu”), Met eta Leu-entzefalina alegia. Salbuespenak nozizeptina eta endomorfina
dira; azkenak 4 aminoazido baino ez ditu. Ugaztunen peptido opioide naturalak Met-
entzefalina, Leu-entzefalina, β-endorfina, Dinorfina A, Dinorfina B, α-Neoendorfina,
Nozizeptina eta Endomorfina dira (Florez, 1998).
Doktore-tesia
Sarrera 31
Oro har, entzefalinak δ-hartzailearen lotugai natural gisa ezagutzen dira, baina μ-
hartzaileei ere lotzen zaizkie. Dinorfinak κ-hartzaileari lotzen zaizkio, eta β-endorfinak
μ-hartzailea eta baita δ-hartzailea ere ia afinitate berez ezagut ditzake (Roques, 1999). 1.
taulan, peptido opioideek hartzaile bakoitzekiko dituzten afinitateak azaltzen dira.
1. taula. Estekatzaile opioideen afinitate-profilak, binding esperimentu bidez lortuak.
Ki (nM) Estekatzailea
δ κ µ Erreferentzia
Barne-opioideak
[Met5]-entzefalina 0,9 4440 9,5 Leslie, 1987
[Leu5]-entzefalina 3 835 20 Chang eta lank., 1981
Dinorfina A (1-17) 3,2 0,12 0,7 Leslie, 1987
Dinorfina B (1-8) 4,4 9 3,4 Leslie, 1987
β-endorfina 2,7 57 2 Leslie, 1987
α-Neoendorfina 0,57 0,20 1,3 Leslie, 1987
Endomorfina >500 >500 0,67 Goldberg eta lank., 1998
Opioide sintetikoak
DPDPE 1,4
19 (Kd)
790
-
>10000
>3000 (Kd)
Hunter eta lank., 1990
Fukuda eta lank., 1995
Naltrindol 0,13 >5000 >10000 Fang eta lank., 1994
U50,488 8690 0,72 941 Leslie, 1987
Nor-binaltorfimina 10,2 0,038 16,7 Metcalf eta Coop, 2005
Morfina* >1000
390 (Kd)
163
-
1,4
23 (Kd)
Satoh eta Minami, 1995
Fukuda eta lank., 1995
Naloxona 27 17,2 1,78 Leslie, 1987
*Morfina ez da gizakion barne-opioidea ezta opioide sintetikoa ere, izan ere, lo-belarraren erretxinatik eratorritako alkaloide opioidea da.
Peptido opioideen inaktibazioa, batez ere, peptidasa izeneko entzimek buruturiko
andeakuntza metabolikoaren bitartez gertatzen da. Biologikoki aktiboak diren peptidoak
apurtzean, zatiki inaktiboak sortzen dira (Iversen, 1987). Entzefalinaren (BPO ia guztien
sekuentzia errepikakorra) andeakuntza, bi entzimak katalizatzen dute batez ere: alanina
aminopeptidasa N (APN), entzefalinaren Tyr-Gly lotura apurtzen duena (Waksman eta
lank., 1985), eta endopeptidasa neutroa (NEP), entzefalinaren Gly-Phe lotura apurtzen
duena (Relton eta lank., 1983). Andeakuntza horien bidez, entzefalinaren jarduera
erregula daiteke.
Doktore-tesia
Sarrera 32
5.1.5 Opioide-hartzaileen aktibazioa
Opioide-hartzaileen moten artean, mintzean zeharreko domeinu eta zelula barnean
geratzen diren bukleen homologia handia izan arren (% 73-76 eta % 86-100, hurrenez
hurren), N- zein C- muturren eta zelulaz kanpoko 2. eta 3. bukleen homologia txikia da
(% 9-10, % 14-72 eta % 14-20, hurrenez hurren) (Chen eta lank., 1993). Beraz, erraz
uler daiteke hartzaile moten arteko homologia txikiko leku horiek peptido desberdinen
ezagupenean inplikaturik egongo direla (Jordan eta Devi, 1998) (10.A irudia).
Bideratutako aminoazidoen mutagenesiaren bidez jakin izan da ezen, δ-hartzaileetan
hondar baten (Lys108) ordezkapena egiten bada, µ-agonista espezifikoak, δ-hartzaile
mutatu horietara lot daitezkeela (Minami eta lank., 1996). Era berean, hiru opioide-
hartzaileetan serina-hondar bat ordezkatzean (Ser177 δ-n, Ser187 κ-n eta Ser196 µ-n),
naloxona antagonista ez-espezifikoak agonista gisa jokatzen du (Claude eta lank.,
1996).
Mintzean zeharreko hirugarren domeinu zitoplasmatikoa, 2. eta 3. barne-bukleak eta C-
muturreko zatiren bat G proteina heterotrimerikora lotzen dira
5.1.6 Seinaleztatzea opioide-hartzaileen bidez
Opioide-hartzaileak nagusiki G proteina inhibitzaileetara elkartzen dira. Agonistek G
proteina horiek aktibatzean, oro har, AC entzimaren inhibizioa gertatzen da eta, horren
ondorioz, cAMParen kontzentrazio-mailak txikitzen dira eta PKAren aktibazioa
murrizten da. Horrek, neuronetan, zelula barneko eta nukleoko proteina askoren
fosforilazio-egoeran eragingo du; ondorioz, badirudi transkripzio-prozesu askoren
aldaketak gerta daitezkeela, eta, epe batean, opiazeoekiko tolerantziaren edota
abstinentzia-sindromearen prozesuen errudun bihurtzen dira (Lorenzo eta lank., 1999).
Nerbio-ehunari dagokionez, opioideek sorturiko erantzuna, maiz, (1) aktibitate
bioelektrikoaren inhibizioa eta (2) neurotransmisoreen askapenaren inhibizioa da.
Erantzun molekularrari dagokionez, μ- eta δ-hartzaileen aktibazioak mintzaren
hiperpolarizazioa eta jarduera bioelektriko neuronalaren inhibizioa dakar, era zuzenean
Doktore-tesia
Sarrera 33
potasio-kanalen irekiera gertatzen delako (ioi horren konduktantzia igoz) edota
agonistak, zelula barneko kaltzioa askatzen duelako eta ioi horrek, zeharka, potasio
kanalen irekiera eragiten duelako (Williams eta lank., 1982). Bestalde, κ-hartzailearen
aktibazioak tentsioaren menpeko kaltzio-kanalen inaktibazioa ekar dezake; horren
ondorioz, kaltzioa neurona barnera sartzea ekiditen da eta neurotransmisoreen
askapenaren inhibizioa gertatzen da (Surprenant eta lank., 1990; Lorenzo eta lank.,
1999). Dena den, deskribatu da opioide-hartzaileak AC aktibatzen duten G proteinetara
(Gs) ere elkartu daitezkeela (Crain eta Shen, 1990, Ammer eta Schulz, 1997).
Azpimarratzekoa da δ- eta µ-agonisten kontzentrazio txikiek (nM) bide estimulatzailea
indartzen dutela eta kontzentrazio handiagoetan (µM) bide inhibitzailea aktibatzen dela
(Fields eta Sarne, 1997).
5.1.7 Opioide-hartzaileen ekintza fisiologikoak
Opioide-hartzaileak aktibitate fisiologiko askoren modulazioarekin erlazionatu dira. Oro
har, peptido opioideak edo alkaloide opiazeoak —morfina, adibidez— nerbio-sistema
zentralean edo nerbio-sistema periferikoan sartzean sortzen den ekintza-espektroa
antzekoa da. Hala ere, eragin horien intentsitatea ezberdina da eratorri opioide motaren
eta aktibatutako hartzailearen arabera (2. taula).
2. Taula. Opiazeoen ekintzak eta hartzaileak. (Flórez, 1998).
Ekintza Hartzaileak Ekintza Hartzaileak
Minaren inhibizioa μ, δ, κ Diuresia
Arnas depresioa μ, δ Inhibizioa μ
Menpekotasun psikikoa μ > κ Aktibazioa κ
Menpekotasun fisikoa μ > κ; δ? Bradikardia μ > δ = κ
Tolerantzia μ, δ, κ Hipotentsioa δ = κ > μ
Euforia eta sedazioa μ Akzio endokrinologikoak
Disforia κ PRL askatzea μ
Miosia μ, κ GHa askatzea δ > μ
Gihar-zurruntasuna μ ACTHa askatzea μ, κ
Mugikortasun gastrointestinala μ, δ? ADHa inhibitzea κ
Puxikaren mugikortasuna μ LHa inhibitzea μ, δ
Doktore-tesia
Sarrera 34
5.1.8 Sistema opioidearen inplikazioa ugalkortasunean
Peptido opioideek, zenbait lekutan arituz, ugaltze-sisteman eragiten dute (Fabri eta
lank., 1989). Peptido opioideek, nerbio-sistema zentralaren bidez, jokabide sexuala
inhibitzeaz gainera, ugaltze-funtzioa ere inhibitzen dute, alde batetik, hipotalamoko
GnRHaren jariapena ekidinez, hipofisiko hormona gonadotropikoen jariapena
inhibitzen dutelako (Kalra eta lank., 1988), eta, bestetik, guruin pituitarioa bera
zuzenean inhibitzen dutelako. Ehun periferikoetan, lyeding zelulek sortutako β-
endorfinek tubulu seminiferoen funtzioa inhibitzen dute (Fabri eta lank., 1989).
Horretaz gainera, substantzia opioide exogenoen kontsumoak (heroina, metadona)
emakumezkoetan amenorrea eragiteaz gainera (Santen eta lank., 1975), kalteak sortzen
ditu hazi-parametroetan eta, bereziki, espermatozoideen mugikortasunean (Cicero eta
lank., 1975; Ragni eta lank., 1985). Beraz, ikertzen hasi ziren ea opioideek
espermatzoideetan nerbio-sistema zentralaren bidez edota ehun periferikoen bidez
zeharka eragiteaz gainera zuzeneko efektua ere ba ote zuten.
Alde horretatik, badakigu peptido opioideak ugaltze-egituretan daudela hala nola
lyeding zeluletan, epididimoan eta prostatan (Gerendai, 1991). Bestalde, likido
seminalean ere, hainbat peptido opioideren kontzentrazio handiak deskribatu dira: esate
baterako, β-endorfina (Fraioli eta lank., 1984; Davidson eta lank., 1989), met-
entzefalina (Sastry eta lank., 1982; Fujisawa eta lank., 1996) eta leu-entzefalina (Sastry
eta lank., 1982). Izan ere, peptido horien kontzentrazioa handiagoa da plasma
seminalean, plasma periferikoan baino. Azkenik, espermatozoideetan ere, askotariko
peptido opioideak topatu dira, hala nola β-endorfina, met-entzefalina, leu-entzefalina
(Sastry eta lank., 1982; Foresta eta lank., 1986) eta proentzefalinatik eratorritako
produktuak (Kew eta lank., 1990).
Ugaltze-sisteman, δ-, κ- eta µ-hartzaileen mRNAk arratoien testikuluetako Sertoli eta
Leydig zeluletan eta espermatogenesiko zenbait zelula motatan deskribatu dira (Fabbri
eta lank., 1985; Wittert eta lank., 1996; Jenab eta Morris, 2000). Horretaz gainera, bi
arrain motaren espermatozoidetan ere, hiru opioide-hartzaileen lokalizazioa deskribatu
da (Aiudi eta lank., 2004), eta zaldien espermatozoideetan µ-hartzailearen presentzia
ikusi da (Albrizio eta lank., 2005). Datu horiekin guztiekin, pentsatzekoa da
espermatozoideen gaineko opioideen efektu zuzena gerta zitekeela.
Doktore-tesia
Sarrera 35
Hala, opioideen kontzentrazio desberdineko inguruneak erabilita, frogatu da opioide
horiek espermatozoideen mugikortasunean eragiten dutela; opiazeo-drogazaleetan
gertatzen zen bezala, alegia. Dena den, peptido motaren, kontzentrazioaren eta
inkubazio-denboraren arabera, efektu bat baino gehiago deskribatu dira:
Alde batetik, leu-entzefalina, edo met-entzefalinaren D-ala2-Mephe4-Met-(O)-OI-
enkephalin (DAMME) analogoa erabiltzean, mugikortasunaren inhibizioa ikusi da
(Sastry eta lank., 1991; Foresta eta lank., 1985); met-entzefalina erabiltzean, berriz, ez
da efekturik ikusi edo mugimendua mantentzen duela deskribatu da (Fraioli eta lank.,
1984; Fujisawa eta lank., 1996).
Bestetik, lan batzuetan β-endorfina erabiltzean dosiaren menpeko mugikortasunaren
inhibizioa ikusi arren, peptido hori naloxonarekin batera inkubatzean, bi efektu
kontrajarri deskribatu dira; mugikortasunaren inhibizioa ez ekiditea eta ekiditea (Fraioli
eta lank. 1984; Mari eta lank., 2005). Dena den, badirudi β-endorfinaren kontzentrazioa
ez dela adierazle ona gizonezko ez-ugalkor eta ugalkorren artean desberdintzeko (El-
Haggar eta lank., 2006).
Azkenik, deskribatu da naloxona antagonistaren kontzentrazio baxuak mugikortasuna
mantentzen laguntzen duela (Albrizio eta lank., 2005; Mari eta lank., 2005) baina
kontzentrazio handiagoak mugikortasuna murriztu (Albrizio eta lank., 2005) edo
areagotu egin dezakeela denboran zehar (Sastry eta lank., 1991).
Gauza azpimarragarria da hazi astenozoospermikoan topatutako met-entzefalina eta β-
endorfinaren kantitatea normozoospermikoan topatutakoa baino txikiagoa dela
(Fujisawa eta lank., 1996; El-Haggar eta lank., 2006).
Barne-sistema opioidea osatzeko, entzima degradatzaileen eginkizunari buruz hitz
egitea falta zaigu. Entzimen-jarduerari dagokionez, APNa espermatozoideetan, likido
seminalean eta prostasometan agertzen da; NEPa, berriz, soilik prostasometan. Gainera,
bestelako ehunetan baino jarduera handiagoa ikusi da (Fernandez eta lank., 2002). Datu
horiek entzimen kokalekuaren deskribapenarekin bat datoz, nahiz eta NEPa, modu
ahulean, espermatozoideetan ere ikusi den (Subiran eta lank., 2008). APNa eta NEPa
inhibitzean, espermatozoideen mugikortasuna mantentzen da denboran zehar, eta efektu
Doktore-tesia
Sarrera 36
hori naloxonak ekiditen du (Subiran eta lank., 2008). Bestalde, astenozoospermikoek,
normozoospermikoekin alderatuta, APN-jarduera txikiagoa dute (Irazusta eta lank.,
2004).
Mugikortasunaz aparteko faktoreak aztertuz, proentzefalinatik eratorritako peptidoak
akrosoman mantentzen dira eta, erreakzio akrosmikoa gertatzean, ingurunera askatzen
dira; horren ondorioz, ernaltze-prozesuan nolabaiteko garrantzia izan dezakeela
proposatu da (Kew eta lank., 1990). Bukatzeko, naloxona antagonistaren kontzentrazio
baxuak kapazitazioa areagotzen du (Albrizio eta lank., 2005).
Argi geratzen da, beraz, peptido opioideen efektu oso kontrajarriak deskribatu direla eta
asko geratzen dela argitzeko. Gainera, oso ikerketa gutxi egin dira giza hazia erabilita,
eta orain arte ez da deskribatu opioide-hartzaileen presentzia giza espermatozoideetan.
5.2 Sistema kannabinoidea
Kannabinoideak kalamu landareak (Cannabis sativa L.) sintetizatutako metabolito
sekundarioen multzo gisa definitzen dira. Efektu bioaktiboen arduradun nagusia Δ9-
tetrahydrokannabinola (THC) da. Kalamua, azken milurtekoetan medikuntzan, helburu
espiritualekin edota dibertimendurako erabili izan da. Marihuanaren osagai aktiboak
isolatutakoan hasi zen zientifikoki ulertzen kannabinoideen eragin kimikoa. Dena den,
bestelako sendabelarrekin alderatuta, kannabinoideen purifikazioa berandu gertatu zen,
konposatu horien izaera lipofilikoa dela eta. 1940ko hamarkadan lortu zen lehenengo
kannabinoide purua (Todd, 1946); geroago, 1960ko hamarkadan, THCa purifikatu eta
egitura deskribatu zen (Gaoni eta Mechoulan, 1964). THCa kannabinoide indartsuena
eta ugariena da, baina marihuanak dibenzopiranetik eratorritako 70 konposatu inguru
ditu. Garrantzitsuenak Δ9-tetrahydrokannabibarina (THCaren efektua antagonizatzen
duena), kannabidiola (CBD) eta kannabinola (CBN) dira (Elsohly eta Slade, 2005).
Esan bezala, marihuanatik eratorritako kannabinoideek izaera oso lipofilikoa dute.
Ezaugarri horregatik, hasiera batean, bestelako konposatu ez-hidrodisolbagarrien
(anestesikoak, disolbatzaileak...) moduan jokatzen zutela pentsatu zen, hau da, efektua
mintz zelularren jariakortasunean eragindako aldaketengatik sortzen zela (Lawrence eta
Gill, 1975).
Doktore-tesia
Sarrera 37
Hipotesi hori bertan behera geratu zen 1990eko hamarkadan, estekatzaile
kannabinoideekiko afinitatea zuten mintz-hartzaileak deskribatu zirenean (Matsuda eta
lank. 1990, Munro eta lank, 1993). Gaur egun arte, egitura heptahelikoidala eta Gi/o
proteinei lotutako bi kannabinoide-hartzaile mota klonatu dira. Hartzaile mota biek
sekuentzien antzekotasun handia erakusten dute [% 44 orotara eta % 68 mintzean
zeharreko aldeetan (Munro eta lank, 1993)]. Dena den, aurrerago ikusiko dugun bezala,
adierazpen-eredu oso desberdina dute. Bestalde, aipatzekoa da kannabinoide-hartzaileak
izaki bizidun ornogabeetan zein ornodunetan espresatzen direla (McPartland, 2004,
Begg eta lank., 2005).
5.2.1 CB1 kannabinoide-hartzailea
CB1-a oso kontserbatua agertzen da espezie batzuetan. Esate baterako, arratoiaren eta
gizakiaren CB1 hartzailearen aminoazidoen % 98an antzekotasuna dago. Banaketari
dagokionez, animalia helduan, batez ere, nerbio-sistema zentralean aurkitzen da eta
dentsitate handia du hipokanpoan, zerebeloan, amigdalan edo garun-enborrean.
Garuneko zelula mota guztiek [neuronak (Herkenham eta lank., 1990), astrozitoak
(Sanchez eta lank., 1998), oligodendrozitoak (Molina-Holgado eta lank., 2002) eta
mikrogliak (Cabral eta lank., 2001)], CB1 hartzailea espresatzen dute. Bestalde, CB1-a
ehun periferikoetan ere espresatzen da, hala nola bare, birika, hezur-muin, amigdala,
bihotz, prostata, umetoki, obario (Galiegue eta lank., 1995), heste (Di Carlo eta Izzo,
2003), ehun adiposo (Cota eta lank., 2003), erretina (Buckley eta lank., 1998), gibel
(Osei-Hyiaman eta lank., 2005) eta endotelio baskularrean (Liu eta lank., 2000).
Arratoi-enbrioiaren garapenean, CB1 hartzaile funtzionala ernaldiaren 11. eta 14.
egunaren artean agertzen da, gainerako neurotransmisoreen espresioarekin batera
(Pertwee, 2005a). Badirudi fase goiztiarretan aktibatzearen arrazoiak gene
garrantzitsuen indukzioa, metabolismo energetikoaren aktibazioa, azido
arakidonikoaren mobilizazioa eta nerbio-garapena direla (Ramos eta lank, 2002).
Kannabinoide-hartzaileen espresioari buruzko informazioa giza enbrioiaren garapenean
oso mugatua da, eta soilik dakigu hartzaile funtzionalak haurdunaldiaren 19. astean
agertzen direla (Mato eta lank 2003).
Doktore-tesia
Sarrera 38
5.2.2 CB2 kannabinoide-hartzailea
Gaur egun, informazio gutxiago dugu CB2-ari buruz CB1-ari buruz baino. Espezie
batetik bestera, CB2-a ez da CB1-a bezain ondo kontserbatu [arratoiaren eta gizakiaren
arteko antzekotasuna % 81 da (Munro eta lank., 1993, Shire eta lank., 1996)] eta
banaketa oso desberdina dauka. Nerbio-sistema zentralari dagokionez, CB2-a, zelula
mikroglialetan (Nunez eta lank., 2004), garunaren hainbat neurona-azpipopulaziotan
(Skaper eta lank., 1996, Ashton eta lank., 2006) eta garun-enborrean espresatzen da
(Van Sickle eta lank., 2005, Ashton eta lank., 2006). Ehun periferikoetan, CB2-a batez
ere barean, amigdaletan, B eta T zeluletan, monozitoetan, zelula dendritikoetan
(Galiegue eta lank., 1995, Schatz eta lank., 1997), erretinan (Croxford eta Yamamura,
2005) eta endotelio baskularrean (Blazquez eta lank., 2003, Golech eta lank., 2004)
kokatzen da. Zelula immuneen aktibazioak, mikroglialak barne, CB2-aren espresio-
maila areagotzen du (Kaminski eta lank., 1992, Croxford eta Yamamura, 2005).
5.2.3 Barne-sistema kannabinoidea
Kannabinoide-hartzaileek, haien barne-estekatzaileek (endokannabinoideak) eta sintesi-,
andeakuntza- eta rekaptazio-prozesuetan parte hartzen duten molekulek barne-sistema
kannabinoidea eratzen dute. Endokannabinoideak kate luzeko gantz-azido
poliasegabeen eratorriak dira (nagusiki, azido arakidonikoa) eta talde polar batekin
amida edo ester lotura sortzen dute. Endokannabinoideen artean, N-
arakidonoiletanolamina [anandamida, AEA (Devane eta lank., 1992)] eta 2-
arakidonoilglizerola [2-AG (Mechoulam eta lank., 1995)] azpimarratzekoak dira. Bi
konposatu horiek, CB1 zein CB2 hartzaileetara lotzeko gaitasuna dute. 3. taulan,
konposatu kannabinoideek hartzaile bakoitzarekiko dituzten afinitateak azaltzen dira.
Kaltzioaren menpeko bi entzimaren ekintzagatik sintetizatzen da AEA. Hasiera batean,
N-aziltransferasa (NAT) batek hondar arakidonilo bat transferitzen dio
fosfatidiletanolaminaren –NH2 taldeari (Sugiura eta lank., 1996), eta N-
arakidonoilfosfatidiletanolamina (NAPE) sortzen da. Gero, fosfolipasa D (PLD) batek,
AEA eta azido fosfatidikoa askatuko ditu (Di Marzo eta lank., 1994), nahiz eta azken
erreakzio hori eztabaidagarria den (Leung eta lank., 2006). Estimulu baten erantzun
gisa, zitoplasman kaltzioa metatzen denean, endokannabinoideak sintetizatzeko
makineria aktibatzen da eta konposatu horien sorkuntza areagotzen da. Behin lipido
Doktore-tesia
Sarrera 39
horiek sortuta, zelulatik kanpora garraiatuak izaten dira, agian proteina garraiatzaile
baten bidez (Wang eta lank., 2006), eta bi bide har ditzakete: (1) hartzaile
espezifikoetara lotu edo (2) birkaptatuak eta andeatuak izan. Endokannabinoideen
andeakuntza, bi entzimak katalizatzen dute, batez ere: gantz-azidoen amida hidrolasa
(FAAH), AEArentzat (Giang eta Cravatt, 1997, Cravatt eta lank., 2001) eta
monoazilglizerollipasa (MGL), 2-AGarentzat (Dinh eta lank., 2002). Kannabinoideen
kanporatzea eta birkaptazioari buruzko gaia eztabaidagarria da, zeren eta, oraindik,
molekula horientzako proteina garraiatzailerik ez baita klonatu, eta balizko proteina
horren existentzia nola gabezia babesten duten datuak argitaratu dira (Beltramo eta
lank., 1997, Hillard eta lank., 1997, Glaser eta lank., 2003, Hillard y Jarrahian, 2003).
3. taula. Estekatzaile kannabinoideen afinitate-profilak binding esperimentu bidez lortuak.
Ki (nM) Estekatzailea
CB1 CB2 Erreferentzia
Barne-kannabinoideak
AEA 78 >500 Pertwee, 2005a
2-AG 58 145 Pertwee, 2005a
Kannabinoide sintetikoak
ACEA 1,4 >2.000 Howlett eta lank., 2002
SR141716a 11,8 13.200 Howlett eta lank., 2002 JWH-015 383 13,8 Howlett eta lank., 2002 SR144528 >10.000 5,6 Howlett eta lank., 2002 Kannabinoide klasikoak Δ9-THC 80,3 32,2 Howlett eta lank., 2002
5.2.4 Kannabinoide-hartzaileen aktibazioa
Estekatzaile kannabinoideak hartzaileetara lotzeko modua oso gai interesgarria da,
agonista eta antagonista berrien diseinuan lagundu dezakeelako. Gaur arte ditugun
datuen arabera, kannabinoideak mintz lipidikoan sartu eta, albo-difusioari esker,
hartzaileetara lotuko lirateke (Makriyannis eta lank., 2005) (10.B irudia). Badirudi
prozesu horrentzako faktore garrantzitsuenetariko bat estekatzaile kannabinergikoen
talde polarren kokalekua dela. Izan ere, talde horietan gertatutako leku-aldaketek aldatu
egin ditzakete estekatzaileek mintz lipidikoan duten konformazioa, kokapena eta
orientazioa, eta, modu horretan, aktibitate biologikoa modula daiteke (berrikuspenerako,
Doktore-tesia
Sarrera
Doktore-tesia
40
COOH
NH2
CB
CBCB
Difusio laterala
Talde polarra
Talde polarrak
Zelula barnealdea
Zelula kanpoaldea
Glikozilazioak
OP
A B
10. irudia: Opioideak eta kannabinoideak hartzaileetara lotzeko proposatutako ereduak. A) Peptido opioideen lotunea opioide-hartzailearen mintzaren zeharreko domeinuek, N-muturrak eta bestelako kanpo-bukleek eratzen dute. B) Estekatzaile kannabinoidea mintz plasmatikoan barneratzen da eta albo-difusioaz proteina heptahelikoidalera lotzen da. Irudian agertu ez arren, kannabinoide-hartzaileak ere glikosila daitezke N- muturrean. OP: Opioide; CB: Kannabinoide. (Carracedo, 2006b-tik moldatua).
Makriyannis eta lank., 2005). Kannabinoide-hartzaileen jarduerari dagokionez, badirudi
hartzaileak ez daudela egoera basal ez-aktiboan. Izan ere, CB1 antagonistak,
SR141716ak (Pertwee, 2005b) eta AM251-ak, eta CB2 antagonistak, SR144528-ak eta
AM630-ak gai dira agonista kannabinoideek sortutakoen alderantzizko efektu
kannabinomimetikoak sortzeko (berrikuspenerako, Pertwee, 2005a). Eta antagonista
horien efektu batzuk, tonu endokannabinoidearen blokeoagatik sor daitezkeen arren,
badirudi beste efektu batzuek ez dutela zerikusirik blokeo horrekin. Hipotesirik
onartuenak dio kannabinoide-hartzaileak konformazio (aktibazio-egoera) desberdinetan
egon daitezkeela: (1) hartzaileak aktibatuak egongo liratekeen “ON” egoera bat
(efektoreei akoplatuak), eta (2) hartzaileak ez-akoplatuak egongo liratekeen “OFF”
egoera bat edo gehiago. Hala, agonistek “ON” egoerako hartzaileen kopurua handituko
lukete, alderantzizko agonistek “OFF” egoerakoak areagotuko lituzkete eta antagonista
neutroek konformazio bakoitzaren proportzioa mantenduko lukete (berrikuspenerako,
Pertwee, 2005b). Azkenik, kannabinoideen hainbat efektu ez dira CB1 edo CB2-aren
aktibazioari lotu eta, horregatik, kannabinoideetarako afinitatea duten bestelako
hartzaile batzuen existentzia proposatu da: (1) Vanilloide-hartzaileak; kapsaizina
(agonista) eta kapsazepina (antagonista) estekatzaile vanilloideak lotzen dituzte, baina
AEA bezalako kannabinoideen bidez ere aktiba daitezke (Di Marzo, 1998, Zygmunt eta
Sarrera 41
lank., 1999, Begg eta lank., 2005). (2) CB3-a; balizko kannabinoide-hartzaile berri bat
klonatu da, GPR55 hartzaile “umezurtza” (Baker eta lank., 2006).
5.2.5 Seinaleztatzea kannabinoide-hartzaileen bidez
Kannabinoide-hartzaileak, nagusiki, G proteina inhibitzaileetara elkartzen dira. G
proteina horien aktibazioak αi eta βγ azpiunitateen banaketa dakar. αi azpiunitateak AC
inhibitzen du, eta cAMPren ekoizpena txikitzen. Horren ondorioz, PKAren aktibazioa
ere murrizten da. Bestalde, βγ dimeroak seinaleztatze-bide desberdinak aktiba ditzake,
hala nola fosfatidilinositol-3 kinasa (PI3K)-Akt eta mitogenoek aktibaturiko kinasak
(MAPK) p38 MAPK eta Jun N-bukaera kinasa (JNK) (Liu eta lank., 2000, Rueda eta
lank., 2000, Herrera eta lank., 2005). Dena den, deskribatu da kannabinoide-hartzaileak
AC aktibatzen duten G proteinetara (Gs) ere elkartu daitezkeela (adibidez, Gq eta G13)
(Bonhaus eta lank., 1998, Lauckner eta lank., 2005). Bukatzeko, kannabinoide-
hartzaileek G proteinetatik independente diren efektuak sor ditzakete, hala nola
esfingomielinaren FAN bidezko hidrolisia (Sanchez eta lank., 2001) edo zenbait kanal
ionikoren erregulazioa (berrikuspenerako, Pertwee 2005a).
5.2.6 Kannabinoide-hartzaileen ekintza fisiologikoak
Sistema kannabinoidearen funtzioak, animalia-ereduetan, in vitro sistemetan eta
kannabisaren erabilera ludikoak sortutako efektuetan ikertu dira. Sistema horren paper
garrantzitsuenetariko bat neuromodulatzailearena da; izan ere, CB1 hartzailea G
proteinei loturiko hartzailerik ugariena da nerbio-sistema zentralean (Herkenham eta
lank., 1990). Sistema kannabinoidearen ekintza, nerbio sistema zentralean eta ehun
periferkoan deskribatu da (4. taula).
5.2.7 Sistema kannabinoidearen inplikazioa ugalkortasunean
Kannabinoideek, leku desberdinetan arituz, ugaltze-sisteman eragiten dute.
Kannabinoideek ugaltze-funtzioa inhibitzen dute hipotalamoko GnRHa (Gammon eta
lank., 2005) eta hipofisiko prolaktina (PRL) eta hormona luteinizatzaileen (LH) mailak
jaitsiz (Vescovi eta lank., 1992; de Miguel eta lank., 1998) eta, ondorioz, Leyding
zeluletan sortutako testosterona-maila ere jaisten da (Harclerode, 1984). Baina, badirudi
Doktore-tesia
Sarrera 42
Leyding zeluletan dauden CB1 hartzaileen bidez testosteronaren jaitsiera zuzenean
gertatzen dela (Wenger eta lank., 2001). Horretaz gainera, substantzia kannabinoide
exogenoen kontsumoak (THC), emakumezkoen hilekoan eta haurdunaldian
ezegonkortasunak sortzeaz gainera (Smith and Asch, 1987), kalteak sortzen ditu hazi-
parametroetan eta, bereziki, espermatogenesian eta espermatozoideen mugikortasunean
(Hembree eta lank., 1976; Hong eta lank., 1982). Beraz, ikertzen hasi ziren ea
kannabinoideek espermatozoideetan nerbio-sistema zentralaren bidez edota ehun
periferikoen bidez zeharka eragiteaz gainera zuzeneko efektua ere ba ote zuten.
4. taula. Barne-sistema kannabinoidearen ekintza garrantzitsuenak (Carracedo, 2006b).
Ehuna Ekintza
Nerbio-sistema zentralean Babes neuronala
Kontrol motorra
Termorregulazioa
Oroimenaren modulazioa
Nozizepzioa
Gosearen kontrola
Oka egitearen kontrola
Erregulazio neuroendokrinoa
Begian Begi-barneko presioaren murrizpena
Digestio-sisteman Gosearen kontrola
Obesitatearen tratamendua
Heste-mugimenduen kontrola
Ugaltze-sisteman Ugalkortasunaren kontrola
Hezurrean Hezurren berrosatzearen kontrola
Sistema immunean Immunomodulazioa
Sistema baskularrean Hipotentsioa
Alde horretatik, badakigu AEA saguen umetokian eta emakumezkoen umetoki-tronpan
(Schmid eta lank., 1997) eta arratoien testikuluetan (Sugiura eta lank., 1996) agertzen
dela. Bestalde, giza espermatozoideek zeharkatu behar dituzten likido batzuetan ere
AEA deskribatu da, hala nola likido seminalean, umetoki-tronpako likidoan eta likido
folikularrean (Schuel eta lank., 2002).
Doktore-tesia
Sarrera
Doktore-tesia
43
Ugaltze-sisteman, CB1 hartzailea prostata (Ruiz-Llorente eta lank., 2003), testikulu
(Galiegue eta lank., 1995) eta Lyeding zeluletan (Gye eta lank., 2005) deskribatu da eta
CB2 hartzailea prostata (Sarfaraz eta lank., 2005), testikulu (Brown eta lank., 2002) eta
Sertoli zeluletan (Macarrone eta lank., 2003). Espermatozoideetan, CB1 kannabinoide-
hartzailearen lehenengo ebidentziak itsas trikuan deskribatu ziren (Chang eta lank.,
1993) eta, geroago, giza (Schuel eta lank., 2002; Rossato eta lank., 2005) txerri-
(Maccarrone eta lank., 2005), sagu-, arratoi- eta igel-espermatozoideetan (Gye eta lank.,
2005; Cobellis eta lank., 2006) deskribatu dira. Datu horiekin guztiekin, pentsatzekoa da
gerta daitekeela kannabinoideek zuzeneko efektua eragitea espermatozoideetan.
Ildo horretan, kannabinoideek (THC, AM 356), erreakzio akrosomikoaren blokeoaren
bidez (Schuel eta lank., 1994), itsas trikuen espermatozoideen ugaltzeko gaitasuna
inhibi dezakete (Schuel eta lank., 1991; Berdyshev, 1999). Era berean, AEA barne-
kannabinoideak espermatozoideen mugikortasuna eta erreakzio akrosomikoa inhibitzen
du CB1 hartzailearen aktibazioaren bidez (Schuel eta lank., 1994; Rossato eta lank.,
2005; Macarrone eta lank., 2005; Cobellis eta lank., 2006). Eta deskribatua dago txerri-
espermatozoideek AEA sintetizatu (NAPE-PLD), lotu (CB1, TRPV1) eta andeatzeko
(FAAH) beharrezkoa den makinaria biokimiko guztia dutela (Maccarrone eta lank.,
2005).
Bukatzeko, interesgarria da aipatzea ezen saguen enbrioian eta umetoki-tronpan,
AEAren sintesi eta andeakuntzagatik, ugaltze-traktuaren zati horretan “AEA-tonu”
desberdinak ezarriko direla. Eta badirudi “AEA-tonu” hori oso garrantzitsua izan
daitekeela espermatozoideek ernaltzeko gaitasuna eskuratzeko eta geroko enbrioia
garatzeko (berrikuspenerako, Schuel, 2006; Wang eta lank., 2006).
Gaur egun arte, kannabinoideek espermatozoideetan duten eraginaren azterketa, batez
ere, CB1 hartzailean egin da. Aitzitik, nahiz eta autore batzuek ez duten baztertzen CB2
hartzailea espermatozoideetan egotea (Schuel eta Burkman, 2005; Maccarrone, 2007),
hartzaile mota horrek espermatozoideetan duen eraginari buruzko lanik ez da egin
oraindik.
Helburuak
Helburuak 47
Azkeneko hamarkadetan, zelula-zelula edota zelula-ingurune seinaleen transdukzio-
sistemak ikertzen dituzten laborategi askotan ohartu dira ustez neuronetako espezifikoak
ziren mintz-hartzaileak bestelako zelula somatikoetan ere badaudela. Horren ondorioz,
hartzaile horientzako estekatzaileak eta ehun bakoitzean dituzten funtzioak deskribatuz
joan dira.
Ildo horretatik, azkeneko urteetan, ar zein emeen ugaltze-sistemako osagaietan
konposatu “neuroaktiboak” (neurotransmisoreak eta neuromoduladoreak) lotzen
dituzten hartzaileen presentzia zabala aurkitzeaz gainera, ikusi da ugalkortasunerako
garrantzitsuak diren gertaeretan parte hartzen dutela. Izan ere, ugaltze-aparatuetan,
sistema “neuronal” klasiko batzuk osorik deskribatu dira.
Opiazeoak eta kannabinoideak (alkohola alde batera utzita), droga psikoaktibo
erabilienetakoak izan dira aspalditik. Barne-sistema opioide eta kannabinoidea
deskribatu zirenean eta, beraz, barnetik zein kanpotik eratorritako substantzia horien
ekintza modua ulertuz joan zen heinean, aukera asko zabaldu ziren medikuntzaren
garapenerako. Hasiera batean, sistema opioide eta kannabinoidearen eragina nerbio-
sistema zentralean ikertu zen eta, nahiz eta substantzia oso desberdinak izan, duten
ekintza-moduagatik eta sortzen duten efektuengatik, bi sistemak erlazionatzeko joera
izan da beti. Lehenengo ikerketen arabera sistema neuronaltzat hartuak izan baziren ere,
bi sistema horien osagaiak ehun periferikoetan deskribatuz joan dira eta, gaur egun,
emakumezko eta gizonezkoen ugaltze-aparatuetan partzialki deskribatuak izan dira.
Hala ere, substantzia opioide eta kannabinoideen efektu batzuk deskribatu diren arren,
oso informazio gutxi dago opioide-hartzaileek eta kannabinoide-hartzaileek giza
espermatozoideetan duten eraginari buruz.
Aurrekariak kontuan hartuta eta giza ugalkortasuna hobeto ulertzeko asmoarekin, tesi
honetarako, 3 helburu nagusi proposatu ditugu:
1. δ, κ eta µ opioide-hartzaileen espresioa eta kokapena giza espermatozoideetan.
2. CB1 eta CB2 kannabinoide-hartzaileen espresioa eta kokapena giza
espermatozoideetan.
3. Opioide- eta kannabinoide-hartzaileen aktibazioaren eragina espermatozoideen
mugikortasunean.
Doktore-tesia
Materialak eta Metodoak
Materialak eta metodoak 51
1. MATERIALAK
Ikerketa honetan, honelako gailuak, erreaktiboak eta soluzioak erabili genituen:
1.1 Gailuak - Abiadura handiko zentrifuga hozgarria. Sorvall RC 28S. - Angelu finkoko Sorvall SM-24 errotorea. - Ultrazentrifuga. Kontron Centrikon T2070. - Angelu finkoko Kontron TFT 45.6 errotorea. - Bolumen aldakorreko pipeta automatikoak. Nychiryo. - Espektrofotometroa. Shimadzu UV-2401 PC. - Homogeneizagailua, teflonezko enboloduna. Heidolph. - Inkubagailu lehorra. Hotcold S, 0º-60ºC bero-tartea. Selecta. - Inkubagailu hezea. Unitronic 320 OR. Selecta. - pH-metroak, Micro-pH 2001 eta Micro-pH 2002. Crison. - Zehaztasunezko balantza. R180D. Sartorius. - Termoegonkortutako irabiagailu magnetikoa. Agimatic. - Mikroskopio fase-kontrasteduna. Nikon H550S. - Laser-mikroskopio fokukidea. Olympus Fluoview FV500. - Bideokamera. Basler. - Elektroforesi- eta transferentzia-euskarriak. Mini Trans-Blot III. Bio-Rad. - Termozikladorea. Mastercycler. Eppendorf. - RT-PCR sistema. 7900. Applied Biosystems. - Densitometroa. Molecular Imager GS-800. Bio-Rad. 1.2 Erreaktiboak 1.2.1 Opioideak
Morfina hidroklorida (Alcaliber S.A.) DPDPE: [D-Pen2,5]-Entzefalina (Sigma-Aldrich) U-50488: 3,4-Dikloro-N-metil-N-[2-(1-pirrolidinil)ziklohexil]benzeneazetamida (Sigma-Aldrich) Naloxona (Sigma-Aldrich) Naltrindola (Sigma-Aldrich) Nor-binaltorfimina (Sigma-Aldrich) 1.2.2 Kannabinoideak
ACEA: arakidonil-2-kloroetilamida (Tocris Bioscience) JWH-015: (2-Metil-1-propil-1H-indol-3-il)-1-naftalenil-metanona (Sigma-Aldrich) SR141716a: N-piperidino-5-(4-klorofenil)-1-(2,4-diklorofenil)-4-metil-3-pirazol-karboxamida (Manolo Guzman doktoreak utzia, Madrilgo Unibertsitate Konplutentsea, UCM) SR144528: N-[(1S)-endo-1,3,3-trimetil biziklo[2.2.1] heptan-2-il]-5-(4-kloro-3-metilfenil)-1-(4-metilbenzil)-pirazol-3-karboxamida] (Manolo Guzman doktoreak utzia, UCM)
Doktore-tesia
Materialak eta metodoak 52
1.2.3 Beste erreaktibo batzuk
Pisu molekular ezaguneko proteinak (Invitrogen) TRIZOL® (Invitrogen) RNasa inhibitzailea (Promega) Transcriptor RT + erreakzio-indargetzailea (Roche) Azarezko hexameroak (Amersham) GoTaq® polimerasa + erreakzio-indargetzailea (Promega) Pisu molekular ezaguneko nukleotidoak (Bioline) Nukleotidoentzako karga-indargetzailea (Biolina) Fluoromount G (EMS) Gainerako erreaktiboak (Sigma-Aldrich) 1.3 Soluzioak 1.3.1 Tyrode-BSA
100 mM NaCl 21,7 mM sodio-laktato 20 mM Hepes 15 mM NaHCO3 5 mM glukosa 3 mM KCl 2 mM CaCl2 1 mM sodio-pirubato 0,4 mM MgSO4 0,3 mM KH2PO4 100 µg/ml kanamizina 7 mg/ml BSA (Behi-serum albumina) H2O-a bolumena bete arte Prestakin hori 0,22 µm-ko iragazkitik iragazi behar da, eta 7,4 pH-an eta 285-300 mOsm-ean mantendu behar da. 1.3.2 Tyrode-BSA eraldatu ez-kapazitantea (TBEK)
Tyrode-BSA inguruneari, bikarbonatoaren (15 mM NaHCO3) ordez, NaCl hein berean gehitzen zaio osmolaritatea mantentzeko. 1.3.3 Tyrode eraldatu ez-kapazitantea (TEK)
Tyrode inguruneari, bikarbonatoaren (15 mM NaHCO3) eta BSA-ren (7 mg/ml) ordez, NaCl hein berean gehitzen zaio osmolaritatea mantentzeko. 1.3.4 Fosfato/gatz-indargetzailea (Phosphate buffered saline; PBS)
137 mM NaCl 2,7 mM KCl 1,5 mM KH2PO4 8,1 mM Na2HPO4 H2O-a bolumena bete arte
Doktore-tesia
Materialak eta metodoak 53
1.3.5 Lisi-indargetzailea
PBS % 1 (b/b) Triton X-100 % 1 (b/b) Proteasen inhibitzaileen koktela 1.3.6 Tris-HCl 10 mM pH-a:7,4
1000 ml H2O 12,11 g Tris-Base HCl-aren pH-a 7,4-ra heldu arte 1.3.7 Tris-HCl / 1M / pH 8,8 Tris
1000 ml H2O 121,14 g Tris-Base HCl-aren pH-a 8,8-ra heldu arte 1.3.8 Tris-HCl 0,5M pH:6,8
1000 ml H2O 62,07 g Tris-Base HCl-aren pH-a 6,8-ra heldu arte 1.3.9 Homogeneizazio-soluzio indargetzailea
10 mM Tris-HCl, pH 7,4 % 1 (b/b) Proteasen inhibitzaileen koktela H2O-a bolumena bete arte 1.3.10 Bradford erreaktiboa
0,117 mM Coomasie urdin distiratsua % 5 (b/b) Etanola % 15 (p/b) Azido ortofosforikoa H2O bolumena bete arte Prestakina nahastu egiten da bi orduz, irabiatuz. Disolbatu ez den koloratzailea erauzteko, disoluzioa birritan iragazten da iragazpaperez. 1.3.11 Sodio dodezil sulfatoa (SDS) - % 10
100 ml H2O 10 g SDS 1.3.12 Persulfato amonikoa - % 10
10 ml H2O 1 g persulfato amoniko
Doktore-tesia
Materialak eta metodoak 54
1.3.13 Proteinentzako karga-indargetzailea (Laemmli sample buffer) - 5X
% 10 (p/b) SDS % 25 (b/b) Tris-HCl 250 mM pH 6,8 % 0,025 (p/b) bromofenol urdin % 50 (b/b) glizerol % 5 β-merkaptoetanol H2O-a bolumena bete arte Karga-indargetzaileak 5 aldiz diluitua geratu behar du laginean. 1.3.14 Gel banatzailea
% 30 akrilamida / % 1 bisakrilamida: akrilamida, % 30etik nahi den %-ra eramateko, diluitu egin behar da (adibidez, % 12rako, 2,5 aldiz diluitu). Tris-HCl 1 M pH 8,8: % 25 (bol) % 10 SDS: % 1 (bol) H2O-a bolumena bete arte % 10 (p/b) Persulfato amonikoa: 50 µl TEMED: 10 µl 1.3.15 Gel kontzentratzailea
% 30 akrilamida / % 1 bisakrilamida: akrilamida % 4ra (7,5 aldiz diluitu) Tris-HCl 0.5 M pH 6.8: % 25 (bol) % 10 SDS: % 1 (bol) H2O: bolumena bete arte % 10 (p/b) persulfato amonikoa: 25 µl TEMED: 5 µl 1.3.16 Elektroforesi-indargetzailea - 10X
250 mM Trizma-Base % 1 (p/b) SDS 2 M Glizina H2O-a bolumena bete arte pH 8,3 doitua atera behar da, ez ukitu Erabiltzeko, H2O-arekin10 aldiz diluitu behar da. 1.3.17 Transferentzia-indargetzailea - 10X
250 mM Trizma-Base % 0,25 (p/b) SDS 1,92 M Glizina H2O-a bolumena bete arte pH 8,3 doitua atera behar da, ez ukitu Erabiltzeko, H2O-arekin 10 aldiz diluitu behar da. Diluitzean, % 20 (b/b) metanol gehitu behar zaio. 1.3.18 Ponceau gorria
% 1 (p/b) Ponceau gorria % 5 (b/b) Azido azetiko glazial H2O-a bolumena bete arte
Doktore-tesia
Materialak eta metodoak
Doktore-tesia
55
1.3.19 Tris/gatz-indargetzailea (Tris buffered saline; TBS)
50 mM Tris-HCl pH 7,5 150 mM NaCl H2O-a bolumena bete arte 1.3.20 Blotto soluzioa
TBS % 0,1 Triton X-100 1.3.21 Blokeo soluzioa
Blotto % 5 esne gaingabetua 1.3.22 Luminola (250 mM)
10 ml DMSO 0,44 g luminol 1.3.23 Azido p-kumarikoa (90 mM)
10 ml DMSO 0,15 g azido p-kumariko 1.3.24 Kimioluminiszentzia-areagotzailea (Enhanced chemiluminesence; ECL)
1,25 mM luminol 0,2 mM azido p-kumariko 0,1 M Tris-HCl pH: 8.5 H2O-a bolumena bete arte Nahastura hori 4 ºC-an eta iluntasunean gordetzen da erabilia izan arte. Erabiltze-egunean, iluntasunean gordeta dugun nahasturara % 0,3 (b/b) H2O2 (%30) gehitu behar zaio. 1.3.25 Tris/azetato indargetazailea + EDTA (TAE)
0,4 M Tris-Base % 5,7 (b/b) Azido azetiko glazial 10 mM EDTA pH 8 1.3.26 Agarosa-gela
% 2 agarosa 100 ml TAE (DEPC) Irakiten jarri (1-2 min) % 1 etidio bromuro Gel-euskarrira bota, eta orraziak jarri polimerizatu arte (20 min)
Materialak eta metodoak 57
2. METODOAK
2.1 Laginak lortzea
Giza haziaren laginak Euskalduna-Bilbao Klinikan jasotzen ziren, Euskalduna-Bilbao
Klinikaren Hazi-bankuko Laborategiak eta Lagunduriko Ugalketa Unitateak eta Euskal
Herriko Unibertsitateak (UPV/EHU) xedatu zuten hitzarmenari esker. Emaile guztiak
(25-40 urte bitartekoak) osasuntsuak eta, Osasunerako Munduko Erakundearen (OME)
irizpideen arabera (OMS, 1999), normozoospermikoak ziren. Emaileak ez ziren opio
edota kannabinoideen ohiko erabiltzaileak. Ikerketa, lagin biologikoen eta giza laginen
erabilera dela eta, UPV/EHUren eta Osakidetzaren Ikerkuntza Klinikoaren Batzorde
Etikoaren oniritziaz egin zen. Hazi-laginak masturbazio bidez lortzen ziren 2 edo 3
eguneko abstinentzia eta gero. Ontzi esteriletan isurtzen ziren eta gutxienez 30
minutuan 37 ºC-an mantentzen ziren hazia likidotu arte. Lagin bakoitza prozesatzen hasi
baino lehen, hazi-bolumena zein espermatozoideen kontzentrazioa eta mugikortasuna
neurtzen ziren.
2.2 Espermatozoideak prestatzea
Swim-up
Espermatozoide ez-mugikorrak eta hazian egon zitezkeen bestelako zelulak kentzeko,
swim-up deritzon teknika aplikatu zitzaien hazi-lagin guztiei (1.A irudia). Klinikatik
jasotako hazi berria Eppendorf saio-hodi batzuetan banatzen zen (250 µl eppendorf-
eko). Haren gainean, Tyrode-BSA eraldatu ez-kapazitantearen (TBEK) (Flesch, 1999)
500-600 µl emeki gehitu eta 2 fase eratzen ziren. Espermatozoide mugikorrenak hazitik
TBEKra mugi zitezen, eppendorf saio-hodiak 60 minutuz 37 ºC-an mantentzen ziren,
eta, denbora horren ostean, eppendorf saio-hodi bakoitzaren goiko geruzako (TBEK +
espermatozoide mugikorrenak) zati gehiena berreskuratzen zen, eta espermatozoide-
kontzentrazioa neurtzen zen fase-kontraste bidezko mikroskopioan. Eppendorf saio-
hodi guztietatik berreskuratutako goiko geruzak 15 ml-ko zentrifuga-saio-hodietan
batzen ziren eta 800 g-an zentrifugatzen ziren 10 minutuz. Hauspeakinean agertutako
espermatozoide mugikorrak ondoren azalduko diren prozeduretan erabiltzen ziren.
Doktore-tesia
Materialak eta metodoak 58
Azkenik, espermatozoide ez zen bestelako zelularik ez zegoela baieztatzeko, lagin
guztiak fase-kontraste bidezko mikroskopioan aztertzen ziren (1.B irudia).
A B
Hazi berria (250 µl)
TBEK gehitu(500-600 µl)
Goiko geruza kendu(espermatozoide
mugikorrak)
TBEK kendu
Swim-up60 min 37 ºC
Goiko geruza(k)zentrifugatu
(800 g / 10 min)
WBIZKRT-PCR
Mugikortasuna
1. irudia: Espermatozoideen prestaketa. A) Espermatozoide mugikorrenak berrezkuratzeko Swim-up teknikaren pausuak. TBEK: Tyrode eraldatu ez-kapazitantea WB: western-blot, IZK: immunozitokimika, RT-PCR: Real-Time Polymerase Chain Reaction. B) Espermatozoide-laginaren purutasunaren azterketa fase-kontraste bidezko mikroskopiopean. Argazkian, espermatozoide ez den bestelako zelularik ez da ikusten.
2.3 Hartzaileen espresio genikoa
2.3.1 RNA: erauztea, kalitatea behatzea eta kontzentrazioa neurtzea
a) RNA erauztea
Swim-up teknikaren bidez isolatutako giza espermatozoide, garun-kortex eta Jurkat
zelulak TRIZOL® erreaktiboarekin lisatzen ziren. Ehunak mililitro bat TRIZOL®-ean
eta enbolo txiki batekin homogeneizatzen ziren, eta espermatozoide-zelulak zuzenean
pipetarekin homogeneizatzen ziren. Homogeneizatu horren gainean, kloroformoa
gehitzen zitzaion (0,2 ml kloroformo : 1 ml TRIZOL®) eta 2-3 minutuan giro-
tenperaturan nahasten zen. Zentrifugazioaz (10.000 g / 10 min / 4 ºC) faseak eratzen
ziren; goiko fase gardena RNA zen; interfasea zuria DNA zen; beheko fase arrosa
TRIZOL®-a zen.
Fase gardena berreskuratzen zen (guztia ez, ziurtatzeko hurrengo faseko DNA hartzen
ez zela) eta isopropanola (1:1) gehitu eta nahasten zen. 10 minutuan giro tenperaturan
mantendu eta gero, zentrifugatu egiten zen (10.000 g / 10 min / 4 ºC). Gainjalkineko
Doktore-tesia
Materialak eta metodoak 59
isopropanola kentzen zitzaion hauspeakina hartu gabe eta hauspeakin horren gainean
500 µl etanol (% 70) gehitu eta nahasten ziren. Hurrengo zentrifugazio baten ondoren
(10.000 g / 5 min / 4 ºC), etanol guztia kentzen zen hauspeakin gardena kendu gabe
(etanol guztia ondo kentzeko, 2-3 minutuan berogailu batean lehortzen zen). Azkenik,
lortutako hauspeakina urarekin (10-50 µl-rekin, lagin kantitatearen arabera)
homogeneizatzen zen.
DNA genomikoaren kutsadura ekidin nahi zenean, DNasa digestio-pausoa zeukan
RNeasy Protect Kit (Quiagen) erabili zen fabrikatzailearen argibideak jarraituz.
Hartzaile bakoitzaren azterketa egiteko, batez beste 5 espermatozoide-laginen mRNA
erabili zen.
b) RNAren kalitatea behatzea
Erauzitako RNAren kalitatea neurtzeko, RNA % 1,5-2 agarosa-gel batean korriarazten
zen. Lagineko RNA kalitatekoa izateko, gelean korriaraztean, 28S eta 18S RNA
erribosomikoen banda diskretuak eta 2:1 proportzioan agertzea gomendatzen zen. Hala
ere, garun-kortex eta Jurkat zelulek baldintza hori bete arren, espermatozoideek 28S eta
18S RNA erribosomikoak galtzen dituzte (2.A irudia) eta, beraz, DNA genomikoaren
interferentziarik egongo ez zela ziurtatzeko, RNA-ren erauzketan DNAsa digestio-
pauso bat egin edota PCRan, exoi desberdinetan kokaturiko primer-ak erabili ziren.
c) RNA-ren kontzentrazioa espektrofotometro bidez neurtzea
Ur puruarekin, lortutako RNAren 1/20 diluzioa egin eta, 200-350 nm artean, espektro-
ekorketa egiten zen. Espektrofotometroak ohiko kurba sortu behar zuen (2.B irudia).
Kurba horretan, 280 nm-an (proteina) eta 260 nm-an (RNA) absorbantzia-puntu
maximoak agertzen ziren. Teorikoki, laginaren purifikazioa ontzat emateko, RNA-
puntuaren absorbantziak proteina-puntaren bikoitza izan behar zuen. RNArentzat,
absorbantzia unitate bat 40 µg/ml direla jakinda, RNA kantitatea (µg/ml) kalkulatzeko,
[absorbantzia x diluzio-faktorea x konbertsioa] aplikatzen zen.
Doktore-tesia
Materialak eta metodoak 60
SpKx / Jr PMPM
A B
2. irudia: A) Erauzitako RNAren kalitatearen behaketa. PM: nukleotidoen pisu molekularreko standarra; Kx: garun-kortexa; Jr: Jurkat; Sp: espermatozoideak. B) Erauzitako RNA-ren absorbantzia-kurba espektrofotometroaren bidez neurtua. 260 nm-an absorbantzia-puntu maximoa agertzen da; RNAri dagokiona alegia.
2.3.2. RT-PCR
a) Oinarria
DNA zati zehatz baten kopia kopuru handia lortzeko, polimerasaren kate-erreakzioa
(Polymerase Chain Reaction; PCR) erabiltzen da, oligonukleotido espezifikoak (primer-
ak) erabiliz. Baina RNA mezularien (mRNA) azterketa egin nahi bada, lehenik eta
behin, DNA osagarria (cDNA) eratu behar da alderantzizko transkriptasa baten bidez.
Prozesu horri alderantzizko transkripzioa (Retro-Transcription; RT) deritzo. Beraz,
lagin bateko mRNA guztien cDNA eratu eta gero, anplifikatu nahi den genearen
sekuentzia-tartea mugatuko duten 2 primer-ak erabiliz, PCRa egingo da. Hori dela eta,
teknika osoari RT-PCR deritzo.
b) Protokoloa
b.1 Alderantzizko transkripzioa (RT)
0,2 ml-ko Eppendorf saio-hodi batean nahasten ziren 1 µg RNA total, 2 µl azarezko
hexamero eta ur purua (RNasa-rik gabe) 13 µl arte. Azarezko hexameroak RNAra
lotzeko, nahasketa 10 minutuan 65 ºC-an berotzen zen, eta, horren ostean, izotzean
Doktore-tesia
Materialak eta metodoak 61
uzten zen minutu batean (RNAren egitura sekundarioak desegiteko). Zentrifuga-pultsu
batekin lagina berreskuratzen zen, eta 4 µl Transcriptor RT erreakzio-indargetzaile (8
mM MgCl2), 0,5 µl RNasa inhibitzaile (20 U), 1 µl dNTP (deoxirribonukleotido
trifosfato) (0,5 mM bakoitzeko) eta 0,35-0,5 µl (7-10 U) alderantzizko transkriptasa
(Transcriptor RT) gehitzen zitzaizkion. Bortex-az ondo nahastu eta gero, zentrifuga-
pultsu batekin lagina berreskuratzen zen. Alderantzizko transkripzioa egiteko, lagina 10
minutuan 25 ºC-an, 60 minutuan 55 ºC-an (cDNA eratzeko), 5 minutuan 85 ºC-an (RT
inhibitzeko) eta, azkenean, izotzean mantentzen zen. Lortutako cDNA -20 ºC-an gorde
zen erabilia izan arte. (3.A irudia).
B A
+ primers+ dNTP+ GoTaq
5´ 3´
(f)(r)
5´ 3´
5´ 3´
3´ 5´
5´ 3´
3´ 5´
5´ 3´
3´ 5´
5´
11
22
33
22
33
11
cDNA
2211
33
5´ 3´
3´ 5´
2ziklo = kopiak
Ziklo 1 = 2 kopia
Ziklo 2 = 4 kopia
5´ 3´mRNA
hexameroak
+ dNTP+ RT
mRNA
cDNA
5´ 3´3´ 5´
cDNA
3. irudia: RT-PCR. A) Alderantzizko transkripzioaren eskema. Azarezko hexameroak mRNAra lotzen dira eta RT-ak dNTP-ak gehitzen joango da cDNA eratuz. B) Polimerasaren kate erreakzioaren eskema. Desnaturalizazioa, hibridazioa (anneling), primer espezifikoak, cDNA-ren tarte konkretuetan lotuko dira, katearen hedapena GoTaq DNA polimerasaren bidez. Inkubazio denborak eta tenperaturak testuan azaltzen dira. RT: Retrotranskriptasa, dNTP: deoxirribonukleotido trifosfato, cDNA: DNA osagarria.
b.2 Polimerasaren kate-erreakzioa (PCR )
PCRa egiteko 0,2 ml-ko Eppendorf saio-hodiak erabiltzen ziren. Lagin bakoitzeko,
erreakzio-nahastura berdina sortzen zen aurrera (forward; f) eta atzerako (reverse; r)
primer-ak (1.taula) izan ezik:
Doktore-tesia
Materialak eta metodoak 62
1 µl cDNA (< 0,5 µg)
10 µl GoTaq® polimerasa erreakzio-indargetzailea (1,5 mM MgCl2)
1 µl dNTP (0,2 mM bakoitzeko)
2,5 µl aurrerako primer-a (1 µM) (X. Taula)
2,5 µl atzerako primer-a (1 µM) (X. Taula)
0,25 µl GoTaq® polimerasa (1,25 U)
50 µl arte, ura
1. taula. RT-PCR bidez egindako mRNAren analisian erabilitako primer-ak. hDOR: giza δ opioide-hartzailea; hKOR: giza κ opioide-hartzailea; hMOR: giza µ opioide-hartzailea; hCB1: giza CB1 kannabinoide-hartzailea; hCB2: giza CB2 kannabinoide-hartzailea; GAPDH: Glizeraldeido 3-fosfato deshidrogenasa.
Genea Sekuentzia (5´- 3´) Anplikoia (bp) Erreferentzia
hDOR (f) ACGTGCTTGTCATGTTCGGCATCGT (r) ATGGTGAGCGTGAAGATGCTGGTGA 222 Börner eta lank., 2004
hKOR (f) AGATACACAAAGATGAAGACAGCAACCAAC (r) TCCCTGACTTTGGTGCCTCCAAGGACTATT 352 Neudeck eta lank., 2003
hMOR (f) GCAGATGCCTTAGCCACCAGTA (r) GAGGCGCAAGATCATCAGTCCATA 440 Kraus eta lank., 2003
hCB1 (f) CGTGGGCAGCCTGTTCCTCA (r) CATGCGGGCTTGGTCTGG 408 Carracedo eta lank., 2006a
hCB2 (f) CGCCGGAAGCCCTCATACC (r) CCTCATTCGGGCCATTCCTG 522 Carracedo eta lank., 2006a
GAPDH (f) GGGAAGCTCACTGGCATGGCCTTCC (r) CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC 322 Carracedo eta lank., 2006a
Nahastura prest zegoenean, lagin bakoitza termozikladorean sartzen zen, eta, PCRa
gauzatzeko, denbora-tarte, tenperatura eta ziklo egokiak ezartzen ziren (2.taula). Hasiera
batean, lagina (cDNA) desnaturalizatu behar zen . Gero, primer-ak eta DNA
polimerasa cDNAra lotzeko, tenperatura jaisten zen (tenperatura hori enpirikoki
topatu behar zen) eta, behin hibridazioa emanda, tenperatuta igotzen zen DNA
polimerasak lan egin ahal izateko . Prozesu hori behin eta berriz errepikatuz,
cDNAren tarte espezifikoaren anplifikazio esponentziala gertatzen zen (3.B irudia).
Anplifikatutako laginak nukleotidoentzako karga-indargetzailearekin nahasten ziren, eta
etidio bromurodun agarosa-geleko kaleetan kargatzen ziren. Geleko kale batean,
nukleotidoen pisu molekularreko estandarra kargatzen zen. Gela, 15 V-eko
korrontearekin korriarazten zen, eta argi ultramorearen pean argazkia ateratzen zen.
Bukatzeko, argazkiaz baliatuz, lagin bakoitzean lortutako anplikoiak (anplifikatutako
zatia) sortzen zuen banda pisu molekularreko estandarrarekin alderatzen zen. Espero
Doktore-tesia
Materialak eta metodoak 63
ziren base pareak lortzen baziren, lagin horretan hartzailearen mRNAren presentzia
ondorioztatzen zen.
2. taula. PCRaren ezaugarriak.
Prozesua Denbora Tenperatuta Ziklo zk. Hasierako desnaturalizazioa 2´ 95 ºC 1
Desnaturalizazioa 30´´ 95 ºC Hibridazioa (anneling) 30´´ 58 ºC Katearen hedapena 1´ 72 ºC
40
Azken hedapena 5´ 72 ºC 1 Mantenua - 4 ºC 1
2.4 Hartzaileen proteinen presentzia
2.4.1 Espermatozoideen mintzak prestatzea
Swim-up teknikatik eratorritako espermatozoideei lisi-indargetzailea gehitzen zitzaien,
eta, ordu batean kulunkatu ondoren, izotzean lisatzen ziren. Denbora hori igarota, %
40ko anplitudera sonikatzen ziren (0,5 segundoko 10 ziklo) eta lortutako
homogeneizatuak 600 g-ra zentrifugatzen ziren, 10 minutuan eta 4 ºC-an. Lortutako
hauspeakina (apurtu ez ziren zelulak eta nukleoak) kendu eta gainjalkina 100.000 g-an
ultrazentrifugatzen zen, 45 minutuan eta 4 ºC-an. Azkeneko zentrifugaziotik
eratorritako hauspeakina (mintz zelularrak), immunoblota egiteko, -80 ºC-ra gordetzen
zen (4. irudia).
Lisi-bufferragehitu
Kulunka60 min / 4 ºC
Zentrifugatu600 g / 10 min / 4 ºC
Ultrazentrifugatu100000 g / 45 min / 4 ºC
Mintzzelularr
Gainjalkinaak
Sonikatu
4. irudia: Espermatozoideen mintzen prestaketaren eskema pausoz pauso.
Hartzaile bakoitzaren azterketa egiteko, batez beste 5 espermatozoide-laginen proteinak
erabili ziren.
2.4.2 Garun-kortexeko zelulen eta Jurkat zelulen mintzak prestatzea
Giza garunaren kortex prefrontalaren materia grisa homogeneizazio-soluzio
indargetzailean homogeneizatu zen tefloizko enboloa zuen homogeneizagailu mekaniko
Doktore-tesia
Materialak eta metodoak 64
baten bidez, minutuko 800 birako abiaduran, gutxienez minutu batean eta 4 ºC-an.
Jurkat zelulek prozesamendu berdina jasan zuten. Homogeneizatuak 1.500 g-an
zentrifugatu ziren, 5 minutuan eta 4 ºC-an. Lortutako hauspeakina (apurtu ez ziren
zelulak eta nukleoak) kendu eta gainjalkina 100.000 g-ra ultrazentrifugatu zen, 35
minutuan eta 4ºC-an (5. irudia). Azkeneko zentrifugaziotik eratorritako hauspeakinaren
(mintz zelularrak) proteina-kontzentrazioa neurtzeko, homogeneizazio-soluzio
indargetzailean berreseki zen.
Zentrifugatu1500 g / 10 min / 4 ºC
5. irudia: Garunaren kortexaren eta Jurkat zelulen mintzen prestaketaren eskema pausoz pauso.
Jurkat hilezkor bilakatu diren T linfozitoen lerro zelularra da. 1976an odol
periferikoaren T leuzemia pairatzen zuen 14 urteko mutiko baten odoletik eratortzen
dira (Schneider, 1977). Giza garunaren kortex prefrontalaren materia grisa zein Jurkat
zelulak, Guillermo Velasco doktorearen (UCM) eta Leyre Urigüen doktorearen
(UPV/EHU) adeitasunez lortu ziren.
2.4.3 Proteinen kontzentrazioa neurtzea (Bradford metodoa)
a) Oinarria
Laginetan dagoen proteina-kontzentrazioa kalkulatzeko metodoa Coomasie urdin
distiratsuak polipeptidoekiko duen afinitatean oinarritzen da (Bradford, 1976). Teknika
kolorimetrikoa da, hau da, zenbait konposatu kimikok argia xurgatzeko duten
gaitasunean oinarritzen da. Koloratzailea proteinetara lotzean, gai kimiko horren
xurgapenaren uhin-luzeran aldaketa sortzen da: 465 nm-tik 595 nm-ra pasatzen da.
Koloratzailea asetzailea denez, xurgapenaren gehikuntza proteina-kontzentrazioarekiko
zuzenki proportzionala da. Hala, xurgapenaren gehikuntza espektrofotometroan neurtuz,
proteina kantitate ezagunekin egindako xurgapen patroi-zuzen batean interpola daiteke.
Ultrazentrifugatu100000 g / 35 min / 4 ºC
Homogeneizatu800 rpm / 1 min / 4 ºC
Mintzzelularrak
GainjalkinaHomogeneizazio-bufferra gehitu
Doktore-tesia
Materialak eta metodoak 65
b) Protokoloa
Patroi-zuzena egiteko, 10 mM Tris-HCl + BSA (1 mg/ml) soluzioaren bolumen batzuk
(0 µl-tik, 25 µl-ra) eta 2,5 ml Bradford erreaktiboa nahastu eta 10 minutuan inkubatzen
genituen. Xurgapenaren uhin-luzera kontrolatzen duen monokromadorea 595 nm-an
finkatuz, hodi bakoitzaren edukiaren absorbantzia neurtzen zen. Ikusi behar genuen
lortutako absorbantzia-emaitzak kontzentrazioarekiko proportzionaltasun zuzena
azaltzen duen Y = aX + b funtzio zuzenera doitzen zirela. Beraz, behin eskala eginda,
esperimentuetarako erabiliko ziren lagin bakoitzaren 10 µl, 2,5 ml Bradford
erreaktiborekin inkubatzen ziren 10 minutuan (3 erreplika) eta espektrofotometroan
neurtzen ziren 595 nm-an. Lagin bakoitzaren proteina-kontzentrazioa jakiteko,
absorbantziaren balioak patroi-zuzenean interpolatzen genituen.
2.4.4 Western Blot (WB): Elektroforesia (SDS-PAGE), transferentzia eta
immunodetekzioa
a) Oinarria
Elektroforesia proteinen nahasketa konplexuak banatzeko erabili ohi da, gero proteinak
identifikatzeko edo purifikatzeko helburuarekin. SDSren presentzian egindako
dimentsio bateko poliakrilamidazko gel elektroforesian (SDS-PAGE), proteinak, eremu
elektriko bati esker, geleko poroetan zehar barreiatzen dira. Akrilamida-kontzentrazioa
handitzean, poroen tamaina txikituko da. Beraz, gelaren poroen tamainak eta
proteinaren karga, neurri eta itxurek proteinen migrazio-abiadura mugatuko dute.
Gelean korriarazitako proteinak nitrozelulosa, nylon edo PVDF (Polyvinylidene
difluoride) mintz baten azalari itsasteari deritzo transferentzia. Prozesu hori
elektroforesiz egiten da, eta, behin prozesua bukatua, proteinen tindaketa itzulgarria
egiteko aukera dago.
Immunodetekzioa antigorputz monoklonal edo poliklonal bidez antigeno espezifikoa
ezagutzeko erabiltzen da. Kasu honetan, bilatzen dugun proteina espezifikoa bilatzeko
erabiliko da.
Doktore-tesia
Materialak eta metodoak 66
b) Protokoloa
b.1 Elektroforesia
Gela prestatzea
Bi kristal-laukirekin 0,75 mm-ko tarteko sandwicha sortu eta beheko aldea ixten zen.
Kristalek sortutako tartean, gelaren zati banatzailea (beheko partean) eta
kontzentratzailea (goiko partean) sortzen ziren:
Gel banatzailea: proteinak negatiboki kargatu (SDSagatik) eta desnaturalizatzen
zirenez (SDS, β-merkaptoetanol eta beroagatik), pisu molekularraren arabera soilik
banatuko ziren. Akrilamidaren portzentajea aztertu nahi genuen proteinaren pisu
molekularraren arabera erabaki zen. Gure proteinak, teorikoki, 40 kDa-etik 100 kDa-era
agertzeko aukera zegoenez, taula teoriko batez baliatuz (6.A irudia), % 12-ko
bereizmena zuten gelak egitea erabaki zen. Beste portzentajeko gelak egin nahi izanez
gero, erabakitako portzentajearen arabera aldatzen ziren akrilamida eta ur kantitatea
(materialak eta metodoak 1.3.14 atala).
Erlenmeyer batean, gel banatzailea eratzeko konposatu guztiak gehitzen ziren (amonio
persulfatoa eta TEMED azkenean) eta lasai nahasten ziren. Pipeta batez, nahasketa
kristalen artean sartzen zen (~7 cm) eta, gela zuzen geratzeko, nahasketaren gainean
isopropanola gehitzen zen (~0,5 cm). Gela polimerizatzen zenean (10-20 min), goiko
partetik isopropanola ondo kentzen zitzaion.
Gel kontzentratzailea: proteinak gel banatzailera igaro baino lehen
lerrokatu/kontzentratu behar ziren gel kontzentratzailean. Gel hori eratzeko, akrilamida-
portzentajea beti % 4 izan zen (materialak eta metodoak 1.3.15 atala).
Gel banatzailea bezala eratzen zen (osagai desberdin bakarra Tris-HCl pH 6,8 zen).
Pipeta batekin, eratutako nahasketa gel banatzaile polimerizatuaren gainean botatzen
zen kristalen tartea goraino bete arte eta orrazia jartzen zitzaion kaleak era zitezen. Gela
polimerizatzen zenean (10-20 min), orrazia kendu eta elektroforesi-indargetzaileaz
beteriko elektroforesi-euskarrian jartzen zen.
Doktore-tesia
Materialak eta metodoak 67
Laginak prestatzea, kargatzea eta gel-korriaraztea
Zentrifugazio bidez lortutako mintz zelularren hauspeakina (espermatozoideetan) edo
homogeneizatua (garun-kortexeko zeluletan eta Jurkat zeluletan), proteinentzako karga-
indargetzailearekin berreseki edo diluitzen zen eta 3-5 minutuan irakiten jartzen zen
(100 ºC). Gelaren kale bakoitzeko ~500x106 zelula/ml espermatozoide eta, garun-
kortexeko zelulen edo Jurkat zelulen 30 µg proteina kargatzen ziren % 12ko
bereizmenarekin eratutako gelean. Kale batean pisu molekular ezaguneko proteinak
kargatzen ziren. Proteinak 100 V-ean korriarazten ziren kontzentrazio-gela zeharkatu
arte eta, hortik aurrera, korrontea 200 V-ean eramaten zen bromofenol urdina gelaren
bukaeraraino heldu arte.
Kuxinak
Whatmanpaperak
GelPVDF
+
-
A B
6. irudia: A) Poliakrilamidazko Tris-HCl/Glizina/SDS buffer gelen bereizmen portzentajeen hautaketarako taula teorikoa. Proteinen bandak, pisu molekularraren (KDa) arabera kokatzen dira. B) Transferentzia sandwich-eko muntaiaren ordena, polo negatibotik polo positibora.
b.2 Transferentzia-metodo hezea
Sandwicharen muntaia
Transferentzia-sandwich-aren muntaiaren ordena, polo negatibotik polo positibora, hau
izan zen: kuxina, Whatman paperak (x3), gela (zati kontzentratzailerik gabe),
transferentzia-mintza (PVDF), Whatman paperak (x3) eta kuxina (6.B irudia).
Burbuilak kentzeko, azkeneko Whatman paperen gainetik zilindro bat pasatzen zen.
Doktore-tesia
Materialak eta metodoak 68
Gela, Whatman paperak, PVDFa eta kuxinak, transferentzia-indargetzailean
egonkortzen ziren (5-10 min).
Geletik mintzerainoko transferentzia
Transferentzia-sandwich-a itxi eta transferentzia-cassette-an orientazio egokian jarri
ostean (gela anodoari eta PVDFa katodoari begira), cassette-a transferentzia-
indargetzailez beteriko transferentzia-euskarrian sartzen zen eta proteinak 100 V-ean
transferitzen ziren 1,5 orduan.
Mintza tindatzea (itzulgarria)
Transferentzia ondo gertatu zela baieztatzeko, PVDFa Ponceau gorrian murgiltzen zen
5 minutuan eta, gero, urarekin hainbat garbiketa egiten zen. Horren ostean, PVDFa
Blotto soluzioan egonkortzen zen.
b.3 Immunodetekzioa
Lotura ez-espezifikoak ekiditeko, PVDFa blokeo-soluzioan ordu batean murgiltzen zen
giro-tenperaturan. Garbiketa arin baten ostean, gizakientzako untxi-antigorputz
poliklonal primario espezifikoekin inkubatzen zen gau osoan 4 ºC-an (3. taula).
3. taula. Western blot eta immunozitokimikan erabilitako antigorputzak. hDOR: giza δ opioide-hartzailea; hKOR: giza κ opioide-hartzailea; hMOR: giza µ opioide-hartzailea; hCB1: giza CB1 kannabinoide-hartzailea; hCB2: giza CB2 kannabinoide-hartzailea.
ANTIGENOA OSTALARIA DILUZIOA (WB)
DILUZIOA(IZK)
ETXE KOMERTZIALA
hDOR Untxia 1/2500 1/800 Chemicon hKOR Untxia 1/300 1/50 Santa Cruz hMOR Untxia 1/2500 1/800 Chemicon hCB1 Untxia 1/250 1/400 Affinity BioReagents hCB2 Untxia 1/200 1/400 Cayman
Anti-Rabbit IgG : HRP Astoa 1/2500 - Affinity BioReagents
Anti-Rabbit IgG : Alexa Fluor 488 Ahuntza - 1/500 Molecular Probes
Doktore-tesia
Materialak eta metodoak 69
Horren ostean, garbiketak egiten ziren Blotto soluzioarekin (3x5 min) eta
peroxidasarekin konjugatutako untxiaren IgG-aren kontrako asto-antigorputz
sekundarioarekin inkubatzen zen ordu batean giro-tenperaturan. Blotto soluzioarekin
PVDFaren azkeneko garbiketak egin ondoren (3x5 min), PVDFa ECLan murgiltzen zen
minutu batean. PVDFa azetato-paperen tartean sartu eta argazki-filma gainean jartzen
zen (1-5 min). Azkenik, bandak ikusarazteko, filma errebelatzen zen. Bukatzeko,
argazkiaz baliatuz, kale bakoitzean lortutako banda pisu molekularreko estandarrarekin
alderatzen zen. Hartzaile bakoitzerako espero ziren kDa-ak lortzen baziren, lagin
horretarako hartzailearen presentzia ondorioztatzen zen.
b.4 Stripping-a
PVDFtik antigorputzak erauzteko eta mintza berrerabiltzeko, stripping deituriko teknika
erabili zen. PVDFa, guanidina-tiozianatoan (6 M) 5-10 segundoan murgiltzen zen
(PVDFa gardendu arte) eta, Blotto soluzioarekin garbiketak egin eta gero (3x5 min),
PVDFa berrerabili egiten zen beste immunodetekzio baterako.
2.5 Hartzaileen proteinak kokatzea
2.5.1 Immunozitokimika (IZK)
a) Oinarria
Immunozitokimika zeluletan dauden antigeno jakinak lokalizatzeko erabiltzen da.
Immunodetekzio ez-zuzena antigorputz primario espezifikoa gehi antigorputz
sekundario markatua erabiliz egiten da. Antigorputzen marka fluorogenikoa bada,
antigeno espezifikoak fluoreszentzia-mikroskopio bidez detektatu eta lokalizatuko dira.
b) Protokoloa
Immunofluoreszentzia bidez hartzaile bakoitzaren kokalekua zehazteko, swim-up
teknikarekin isolatutako espermatozoideak PBSan esekitzen ziren. Mikroskopio-estalki
baten gainean, Poly-L-lisina jartzen zen, espermatozoideak euskarri horretan itsas
Doktore-tesia
Materialak eta metodoak 70
zitezen. Zelulak finkatzeko, paraformaldehido % 3-rekin (10 min) eta metanol
hotzarekin (10 min) erabili zen. Estalkiak PBSarekin garbitzen ziren (3x5 min) pauso
bakoitzaren bukaeran. Finkatze-prozesua amaituta, espermatozoideak PBS + % 10
(bol/bol) behi-umekiaren serumarekin blokeatzen ziren 20 minutuan.
Tindaketa immunofluoreszente ez-zuzena egiteko, espermatozoideak untxi-antigorputz
poliklonal primario espezifiko bakoitzarekin inkubatzen ziren gau osoan 4 ºC-an
(3.taula). Horren ostean, PBSarekin garbitzen zen (3x5 min) eta konposatu
fluorogenikoz konjugatutako untxiaren IgG-en kontrako ahuntz-antigorputz
sekundarioarekin inkubatzen zen (3. taula) iluntasunean, bi orduan eta giro-
tenperaturan. Estalkien azkeneko garbiketa egin ondoren (3x5 min), Fluoromont G-
rekin muntatu ziren porta baten gainean. Espermatozoideak mikroskopio fokukidearen
bidez aztertu ziren argon ioi bidezko laserrarekin 488 nm-an (urdina) kitzikatuz eta 505-
520 nm-an (berde) jasoz (7. irudia).
7. irudia: Immunozitokimikako esperimentuaren eskema pausoz pauso. Estalkiek 12 mm-ko diametroa dute eta inkubaketak egiteko, hazkuntza zelularrerako erabiltzen diren 24 putzuko plakak erabiltzen dira; irudian 24 putzutik bat irudikatzen da. Azalpen zabaldua testuan.
Doktore-tesia
Materialak eta metodoak 71
Espermatozoideen nukleoak markatu nahi zirenean, azkenaurreko garbiketan Hoestch
33342 koloratzailea (3 µM) erabiltzen zen. Argon ioi bidezko laserrarekin 405 nm-an
(UV) kitzikatuz, 440 nm-an (urdina) jasotzen zen, baina, kasu honetan, modu
sekuentzialean, Alexa-488 eta Hoestch 33342-ren seinaleak nahas ez zitezen.
Antigorputz primarioarekin egindako inkubaketa kenduta, kontrol negatiboak modu
berdinean egin ziren.
Hartzaile bakoitzaren azterketa egiteko, batez beste 3 espermatozoide-lagin erabili
ziren.
2.6 Espermatozoideen behaketa fisiologikoa
2.6.1 Espermatozoideen inkubaketa-ingurunea
a) Opioideekin egindako inkubaketak
Swim-up bidez berreskuratutako espermatozoideak TEK ingurunearekin berreseki ziren
~30x106 zelula/ml kontzentraziora. Inkubaketa-ingurunea TEKa izan zen, eta bertara
konposatu opioideak gehitzen ziren: µ-agonista morfina eta antagonista naloxona; δ-
agonista DPDPE eta antagonista naltrindola; κ-agonista U-50488 eta antagonista nor-
binaltorfimina. Konposatu horien stock-a TEKean egin zen.
Eppendorf saio-hodi batzuetan 180 µl TEK + espermatozoide jartzen ziren eta,
amaierako bolumena 200 µl izateko, TEKa + opioide konposatua 10 aldiz
kontzentratuagoa zeukan stock-etik 20 µl gehitzen ziren. Kontrol orokorra egiteko,
eppendorf saio-hodi batean opioiderik gabeko 20 µl TEK gehitzen ziren. Opioide-
hartzaile bakoitzaren aktibazioa agonista espezifikoaren kontzentrazio desberdinak
erabilita aztertzen zen; 10-5, 10-6 eta 10-7 M. Antagonismoa aztertzeko, laginak
antagonista espezifikoarekin preinkubatzen ziren 30 minutuan eta, gero, agonista
gehitzen zitzaien. Antagonistaren kontzentrazioa agonistarena baino hamar aldiz
handiagoa izan zen kasu bakoitzean (kasu honetan, eppendorf saio-hodi batera 160 µl
TEK + 20 µl antagonista + 20 µl agonista botatzen ziren). Azkenik, antagonista
Doktore-tesia
Materialak eta metodoak 72
espezifikoaren dosi altuenak (10-4M) espermatozoideetan efekturen bat sorrarazten ote
zuen ikusteko, kontrol bat egin zen antagonista bakoitzerako (8. irudia).
TEKan berreseki30x106 sp / ml
180 µlAgonista (10X)
TEK
20 µl
20 µl
Antagonista (10X)
160 µl
180 µl
180 µl
20 µl
20 µl20 µl
Agonista (1X) Antagonista (1X) + 30 min
+ agonista (1X)
Antagonista (1X) Kontrola
8. irudia: Espermatozoideak agonista eta antagonista opioideekin inkubatzeko diseinu esperimentala.
b) Kannabinoideekin egindako inkubaketak
Swim-up bidez berreskuratutako espermatozoideak TEK ingurunearekin berreseki ziren
~60x106 zelula/ml kontzentraziora. Inkubaketa-ingurunea TEKa izan zen, eta bertara
konposatu kannabinoideak gehitu ziren: CB1-agonista ACEA eta antagonista SR
141716a; CB2-agonista JWH-015 eta antagonista SR144528. Konposatu horien stock-a
etanol eta DMSOan egin zen.
Eppendorf saio-hodi batzuetan TEK 80 µl + kannabinoide konposatua 10 aldiz
kontzentratuagoa zeukan stock-etik 20 µl gehitzen ziren eta vortex-arekin ondo
irabiatzen ziren. Kasu honetan, 2 kontrol orokor egiten ziren; alde batetik, eppendorf
saio-hodi batean kannabinoiderik gabeko 20 µl TEK gehitzen ziren; bestetik, 20 µl
kannabinoide disolbatzaile huts (etanol edo DMSO) gehitzen ziren. Bolumen finala 200
µl izateko, aurretik lortutako 100 µl-etara, TEKean berresekitutako 100 µl
espermatozoide gehitzen ziren. Kannabinoide-hartzaile bakoitzaren aktibazioa agonista
espezifikoaren kontzentrazio desberdinak erabilita aztertzen zen; 10-5, 10-6 eta 10-7 M.
Doktore-tesia
Materialak eta metodoak 73
Kasu honetan, laginak ez ziren antagonista espezifikoarekin pre-inkubatu, zeren eta,
kannabinoideak lipidoak izanik, irabiaketa bortitza behar baitute ingurunean
homogeneoki zabaltzeko. Beraz, behin espermatozoideak ingurunean zeudela, ezin zen
irabiaketa bortitz hori egin. Beraz, antagonismoa aztertzeko, antagonistaren eta
agonistaren kontzentrazio ekimolekularrak batera nahastu ziren kasu bakoitzerako (kasu
honetan, eppendorf saio-hodi batera 60 µl TEK + 20 µl agonista + 20 µl antagonista
botatzen ziren eta, kontrol espezifikorako, 60 µl TEK + 40 µl kannabinoide
disolbatzaile huts jartzen ziren). Azkenik, antagonista espezifikoaren dosiek, bakarrik,
espermatozoideetan efekturen bat sorrarazten zuten ikusteko, kontrol bat egin zen
antagonista bakoitzerako eta dosi bakoitzerako (10-5, 10-6 eta 10-7 M) (9. irudia).
BORTEX
TEKan berreseki60x106 sp / ml
100 µlAgonista (10X)
Etanol / DMSO
20 µl
20 µl
Antagonista (10X)
100 µl
100 µl
20 µl
20 µl20 µl
Agonista (1X) Antagonista (1X) + agonista (1X)
Antagonista (1X) Kontrola
BORTEX
TEK 80 µl
TEK 80 µl
100 µl
9. irudia: Espermatozoideak, agonista eta antagonista kannabinoideekin inkubatzeko diseinu esperimentala. 2.6.2 Espermatozoideen mugikortasunaren analisia
Mugikortasunaren analisia fase-kontrastedun mikroskopioarekin eta ordenagailu
bidezko Sperm Class Analyzer 2005® softwarearekin (10.a irudia) neurtu zen, 4. taulako
konfigurazioa erabiliz. Aztertu beharreko konposatua espermatozoideekin kontaktuan
jarri ondoren, espermatozoideen mugikortasuna zenbait denboratan neurtzen zen;
opioideentzat, 0, 0,5, 1 eta 3,5 orduak eta kannabinoideentzat, 0, 0,5, 1 eta 2 orduak
erabili ziren.
Doktore-tesia
Materialak eta metodoak 74
4. taula: erabilitako CASA sistemaren konfigurazioa.
Parametroak
Frame/segundoko: eskuratutako irudiak segundoko 25
Frame zenbatekoa: grabatutako irudiak 25
LVV muga (µm/s): espermatozoide geldo baten abiadura maximoa 10
MVV muga (µm/s): espermatozoide ertain baten abiadura maximoa; hortik 35
gora, azkartzat hartuko da
STR minimoa (%): azkarrak ez ezik, progresibotzat hartzen diren 80
espermatozoideen kopurua adierazteko balioa
Fase-kontrastea: mikroskopioak erabilitakoa irudiak grabatzean PH+
Handiagotzea x20
Espermatozoideen kontzentrazioa eta mugikortasuna neurtzeko, lagin bakoitzetik, 37
ºC-an zegoen Makler zenbaketa-kameran (10.B irudia) 7,5 µl jartzen ziren. Lagin
bakoitzetik, 2 tanta desberdinetatik eratorritako 100 espermatozoide neurtzen ziren
gutxienez. Espermatozoideen mugikortasuna adierazteko, Osasunerako Munduko
Erakundearen irizpideen araberako nomenklatura erabili zen (10.D irudia): A motako
A B
D
10. irudia: Sperm Class Analyzer 2005®. A) Fase kontrastedun mikroskopioa eta ordenagailua. B) Makler zenbaketa-kamera. D) Espermatozoideen mugikortasunaren argazkia Sperm Class Analyzer 2005® softwarearekin neurtua (a mota: gorri, b mota: berde, c mota: urdin eta d mota: hori).
Doktore-tesia
Materialak eta metodoak 75
mugikortasuna (abiadura ≥ 25 µm/s): higidura progresiboa (lerro zuzena) eta azkarra
erakusten duten espermatozoideen proportzioa; B motako mugikortasuna (abiadura ≥ 10
µm/s, baina ≤ 25 µm/s): higidura motel/makala (sigi-sagakoa) erakusten duten
espermatozoideen proportzioa; C motako mugikortasuna (abiadura < 10 µm/s):
mugikortasun ez-progresiboa duten espermatozoide mugikorren proportzioa. D motako
mugikortasuna (geldirik): mugimendurik ez duten espermatozoideen proportzioa.
Bestalde, espermatozoideek egindako ibilbideen arabera, mugikortasun-parametro
hauek neurtu ziren:
VCL: abiadura lerromakurra (kurbolineala) (µm/s): frame bakoitzean, buruaren zentroa
agertzen den lekuak elkarri lotuz lortzen da. Irudia eskuratzen den denbora osoa hartu
behar da kontuan.
VSL: abiadura lerrozuzena (µm/s): irudia eskuratzen den denboran, lehenengo eta
bukaerako puntuak elkarri lotuz lortzen da.
VAP: batez besteko ibilbidearen abiadura (µm/s): VCLa sortzen duten puntuen
estrapolazioz lortzen da.
Ibilbideerreala
Ibilbideerreala
11. irudia. Espermatozoideen hainbat mugikortasun-parametroen irudikapena (Ibilbide erreala, VCL, VSL, VAP eta ALH). Espermatozoideek egindako ibilbide errealetik kalkulatzen dira. (Tablado eta lank., 1996-tik moldatua).
LIN: linealtasuna (VSL/VCL) X 100: ibilbide lerromakurraren zuzentasuna adierazten
du.
STR: zuzentasuna (VSL/VAP) X 100: batez besteko ibilbidearen zuzentasuna
adierazten du.
WOB: oszilazioa (VAP/VCL) X 100: ibilbide lerromakurraren oszilazioa batez besteko
ibilbidearen gainean adierazten du.
ALH: buruaren albo-desplazamenduaren anplitudea (µm): buruaren desplazamenduaren
anplitudea batez besteko ibilbidearen gainean adierazten du.
Doktore-tesia
Materialak eta metodoak
Doktore-tesia
76
BCF: zeharkatze-maiztasuna (Hz): buruak batezbesteko ibilbidea zenbat alditan
zeharkatzen duen adierazten du.
2.7 Analisi estatistikoa Emaitzen analisi estatistikoa bariantzaren analisia (Analysis of variance; ANOVA)
eginez aztertu zen. Adierazgarritasunaren muga minimoa p<0,05-ean ezarri zen. Hala
konparatu zen espermatozoideen mugikortasunaren batez bestekoaren aldaketa
tratamenduen artean eta denboran zehar. Post-hoc analisirako, Student t testean
oinarritutako desberdintasun minimo adierazgarriaren testa erabili zen (Least Significant
Difference t test; LSD). Analisi estatistikorako, SPSS 14.0 (Statistical Package for the
Social Sciences) softwarea erabili zen.
Emaitzak eta eztabaida
Emaitzak eta eztabaida 79
1. helburua: δ, κ eta µ opioide-hartzaileen espresioa eta
kokapena giza espermatozoideetan
1.1 Opioide-hartzaileen proteinaren espresioa giza espermatozoideetan
1.irudia (A, B eta D) espermatozoide eta giza garun-kortexeko mintz plasmatikoak
erabilita egindako western bloten erakusgarria da.
KDa
A DB
100
70
35
Sp Kx
7050
35
KDa Sp Kx
70
50
KDa Sp Kx
50
1. irudia: δ opioide-hartzailea (A), κ opioide-hartzailea (B) eta µ opioide-hartzailea (D) western bloten analisia giza espermatozoideetan (Sp) eta garun-kortexean (Kx). Pisu molekularreko markatzaileak (kDa) bloten ezkerrean agertzen dira. n = 5.
Anti-δ antigorputz poliklonalak ~50 kDa-eko banda agerrarazi zuen espermatozoideen
proteina-erauzkinean. Garun-kortexean, ~50 kDa-eko banda ez ezik, 70 eta 36 kDa-eko
bandak ere aurkitu ziren (1.A irudia). Datu horiek bibliografian topatutako hainbat
lanekin bat datoz. Adibidez, argitaratutako lan batean, δ opioide-hartzailearentzat, 46
kDa-eko masa molekular teorikoa ondorioztatu izan da, nahiz eta SDS-PAGE eta gero,
δ opioide-hartzailearekiko immunorreaktibotasuna masa molekular batzuetan (50-tik 70
kDa-era) agertu (Christoffers, 2005). Bestalde, Persson-ek eta lankideek arratoiaren
garunean hiru banda desberdin immunokokatu zituzten 72, 48 eta 36 kDa-ean (Persson,
2005). Azken lan horretan, 48 kDa-eko banda proteina osoa izango zela ondorioztatu
zuten. Era berean, proposatu zuten 36 kDa-eko banda itzulpen ondoko prozesamenduan
C-muturra moztuta edukiko lukeen zatia izango zela eta dimeroak (72 kDa) sortzeko
ahalmena edukiko zuela. Beraz, ondoriozta genezake espermatozoideetan, kontrol
positiboarekin (kortexa) alderatuz, proteinaren forma bakarra agertzen dela.
Doktore-tesia
Emaitzak eta eztabaida 80
Anti-κ antigorputz poliklonala erabiliz, espermatozoideetan ~100, 65, 56 eta 36,5 kDa-
eko 4 banda detektatu ziren. Garun-kortexean, ~65 eta 56 kDa arteko
immunorreaktibotasuna detektatu zen (1.B irudia). Hau da, kontrol positibo moduan
erabilitako kortexean antzemandako bandak espermatozoideetan ere agertu ziren. Banda
horiek, lehenago egindako lanetan, arratoiaren eta igelaren garunetan eta giza plazentan
ere deskribatuak izan dira (Simon 1987, Ahmed 1989, Mejean 1992). κ opioide-
hartzailearentzat ondorioztatutako masa molekular teorikoa 43 kDa izan arren, lan
guztietan 55-65 kDa arteko immunorreaktibotasuna topatu izan da, agian, itzulpen
ondoko aldaketak direla eta (Arvdisson 1995). 100 kDa-eko banda dimero bat izan
daitekeela deskribatu da (Arvidsson 1995, Jordan 2001) eta 36,5 kDa-eko banda ez da
deskribatua izan.
Azkenik, anti-µ antigorputz poliklonalak ~70 eta 50 kDa-eko bandak agerrarazi zituen
espermatozoideen proteina-erauzkinean, baina, garun-kortexean, gehienbat ~50 kDa-
eko banda detektatu zen (1.D irudia). Albriziok eta lankideek antzeko banda ez-
glikosilatuak (65 eta 50 kDa) aurkitu zituzten zaldi- eta giza espermatozoideetan
(Albrizio 2005, Albrizio 2006). µ opioide-hartzailearen 49,8 kDa-eko masa molekular
teorikoa (Christoffers 2003) bat dator espermatozoideetan eta garun-kortexean lortu
genituen bandekin. Dena den, hainbat lanetan, gure laginean bezala, pisu molekular
altuagoko bandak ere aurkitu izan dira, ziurrenik, itzulpen ondoko aldaketak direla eta
(Christoffers 2003).
Western blot-eko PVDF mintzak δ-, κ- zein µ-antigorputz poliklonal primarioekin
inkubatzen ez zirenean, antigorputz sekundarioak ez zuen inolako seinalerik eman
(aurkeztu gabeko datuak).
1.2 Opioide-hartzaileen kokapena giza-espermatozoideetan
Azterketa immunozitokimikoen bidez, hiru opioide-hartzaileen presentzia baieztatu zen.
Gainera, hartzaile bakoitzaren kokapena zehaztu eta elkarren artean konparatu ahal izan
ziren.
δ opioide-hartzailea espermatozoideen mintz plasmatikoan detektatu zen buruaren
aurrealdean (akrosoma aldearen gainean), lepoan, tarteko zatian eta isatsean (2.A
Doktore-tesia
Emaitzak eta eztabaida 81
irudia). Kew-ek eta lankideek, nagusiki, µ zein δ opioide-hartzailera lotzen den
[Met5]entzefalina-Arg6-Phe7 peptidoaren kontrako antigorputza erabiliz, akrosoma
aldearen gainean aurkitu genuen immunokokapen berdina aurkitu zuten (Kew 1990).
Gure kasuan, behatutako zelulen % 20an, buruko seinalea akrosoma osteko hasierako
zatira arte hedatzen zen (2.B irudia).
κ opioide hartzailearen immunotindaketa espermatozoideen mintz plasmatikoan aurkitu
zen buruaren aurrealdean, lepoan, tarteko zatian —nabarmena— eta isatsean (2.D
irudia). Aztertutako zelula guztien % 17ren seinalea, buruaren aurrealdean aurkitu
beharrean, ekuatorean edo akrosoma osteko zatian aurkitu zen (2.E irudia).
Azkenik, µ opioide-hartzailearen seinalea espermatozoideen mintz plasmatikoaren
buruan (ekuatore/akrosoma osteko zatian), tarteko zatian eta isatsean zehar agertu zen
(2.F irudia). Tindaketa patroi hori zaldien espermatozoideetan topatutakoarekin bat
dator, gutxi gorabehera (Albrizio 2005).
Espermatozoideak oso zelula zatikatuak dira; horregatik uste da proteina bakoitza
beharrezkoa den egituran bakarrik aurkitzen dela. Hala baldin bada, erreakzio
akrosomikoan parte hartzen duten proteinek akrosoman kokatu behar dute; obozitoen
mintz plasmatikora lotzen diren proteinek ekuatorean egon behar dute; eta
mugikortasunerako beharrezkoak diren proteinek, espezifikoki, espermatozoide helduen
isatsean kokatu behar dute (Turner 2006). Beraz, teoria hori aintzat hartuz eta goian
azaldu dugun opioide-hartzaile bakoitzaren banaketa kontuan hartuz, hiru opioide-
hartzaileek kokalekua partekatzen dutenean, funtzio berean parte har dezaketela
ondoriozta genezake. Aitzitik, hiruak kokaleku desberdinetan topatuz gero, funtzio
espezifiko desberdinetan ere parte har dezaketela ondoriozta genezake.
Bestalde, immunotindaketa-prozedura berdina jasan duten zeluletan aurkitutako seinale
patroi desberdinaren arrazoia mintz plasmatikoa egoera funtzional desberdinean
aurkitzearen ondorioa izan daiteke. Izan ere, espermatozoideek, obozitoa ernaltzeko
gaitasuna eskuratzeko jasaten duten aktibazio-prozesuan zehar, zeina batzuetan berez
gerta baitaiteke (Maccarrone 2005), mintz plasmatikoaren berrantolaketa pairatzen dute
(Flesch eta Gadella 2000).
Doktore-tesia
Emaitzak eta eztabaida 82
δ-, κ- zein µ-antigorputz poliklonal primarioekin egin beharreko inkubaketa egiten ez
zenean, antigorputz sekundarioak ez zuen inolako seinalerik ematen (2.G irudia).
2. irudia: Opioide-hartzaileen azterketa immunozitokimikoa giza espermatozoideetan. A eta B) δ opioide-hartzailearen kokapena. D eta E) κ opioide-hartzailearen kokapena. F) µ opioide-hartzailearen kokapena. G) kontrol negatiboa (Hoechst 33342-ak nukleoa markatzen du urdinez). n = 3. Gezitxoek hartzaile bakoitzaren tindaketa patroiaren aldakortasuna (B eta E) edo kontrol negatiboaren nukleoa (G) seinalatzen dute. Eskala-barra, 10 µm.
1.3 Opioide-hartzaileen mRNAren espresioa giza espermatozoideetan
Giza espermatozoideetatik erauzitako RNArekin egindako RT-PCR bidez µ eta κ
opioide-hartzaileen mRNAk detektatu ziren arren, ez zen δ opioide-hartzailearena
aurkitu. µ eta κ opioide-hartzaileentzat, espermatozoideetan zein kontrol positibo
moduan erabilitako giza garunaren kortexean, espero genuen bezala, 352 bp eta 440 bp-
ko zatiak topatu genituen, hurrenez hurren. δ opioide-hartzailearentzat, espero genuen
222 bp-ko zati anplifikatua giza garunaren kortexean aurkitu genuen baina ez
espermatozoideetan. Barne-kontrol moduan erabilitako GAPDH genea ondo anplifikatu
zen (3. irudia). [RT-PCRaren bidez lortutako espermatozoideen µ eta κ opioide-
hartzaileen anplikoien sekuentziak bat datoz NCBI-BLAST (National Center for
Biotechnology Information - Basic Local Alignment Search Tool) datu-baseko mRNA
sekuentziekin (1. eranskina)]
Doktore-tesia
Emaitzak eta eztabaida 83
DELTA
Sp
KAPPA
MU
Kx
GAPDH
3. irudia: RT-PCRaren produktuen etidio bromurodun % 2 agarosa-gelaren elektroforesia giza espermatozoideentzat (Sp) eta garun-kortexarentzat (Kx). DELTA, δ opioide-hartzailearentzako primer espezifikoekin lortutako anplikoia (222 bp) soilik garunaren kortexean topatu zen. KAPPA, κ opioide-hartzailearentzako primer espezifikoekin lortutako anplikoia (352 bp). MU, µ opioide-hartzailearentzako primer espezifikoekin lortutako anplikoia (440 bp). GAPDH, barne-kontrol moduan erabili zen (322 bp). n = 5.
Emaitza horiek bat datoz µ- eta κ-hartzaileen proteina-datuekin. Baina espermatozoide
helduetan, δ opioide-hartzailearen immunorreaktibotasuna detektatu genuen arren,
opioide-hartzaile horren mRNAren presentziarik ez zen ikusi, ez RT-PCR erabilita (3.
irudia) ezta RT-PCR kuantitatiboa erabilita ere (2. eranskina).
Alde batetik, badakigu espermatozoide helduek ez dutela transkripzioa eta itzulpen-
prozesua egiteko gaitasunik (Flesh eta Gadella, 2000). Espermatogenesiaren azkeneko
urratsetan espermatozoideek beren zitoplasmaren zati handi bat (organulu gehienak eta
mRNAren gehiengoa barne) galtzen dutelako gertatzen da (Miller, 2005). Hori dela eta,
RNAren presentzia nukleo/perinukleora edota mitokondrietara mugatzen da, in situ
hibridazio bidez frogatu den bezala (Pessot1989, Kumar 1993, Wykes 1997).
Beste alde batetik, RNAren andeakuntza selektiboa gertatzen denez, giza
espermatozoideen RNA-populazio jakinak babestuak egongo liratekeela deskribatu da.
Azken horrek adieraziko luke espermatozoide helduetan RNA-populazio egonkorrak
egon daitezkeela (Ostermeier, 2005).
Ondorioz hipotetiza dezakegu espermatozoideek, espermatogenesia bukatu eta hurrengo
faseetan δ opioide-hartzailearen mRNA behar izango ez luketenez, ez luketela gordeko
mRNA hori. Horrek azalduko luke zergatik agertzen den espermatogenesian zehar
espresatu den hartzailearen proteina espermatozoide helduetan δ-hartzailearen mRNA
Doktore-tesia
Emaitzak eta eztabaida 84
azaltzen ez den arren. Ildo beretik, Ravinak eta lankideek, tazikininen hartzaileak
aztertzean, ondorio berdina proposatu zuten (Ravina, 2007).
Proposatutako ondorio hori egia bada, µ- eta κ-hartzaileen mRNAk, “mezulari hautatu”
moduan, funtzio bat eduki lezake zigoto goiztiarraren garapenean, bestelako
espermatozoide-transkriptoreentzat proposatu den bezala (Ostermeier, 2002;
Ostermeier, 2004).
Dena den, espermatozoidearen mRNAren funtzioen inguruan sortutako eztabaidak
oraindik pizturik dirau (Miller, 2005).
Doktore-tesia
Emaitzak eta eztabaida 85
2. helburua: CB1 eta CB2 kannabinoide-hartzaileen espresioa
eta kokapena giza espermatozoideetan.
2.1 Kannabinoide-hartzaileen mRNAren espresioa giza espermatozoideetan
Giza espermatozoideetatik erauzitako RNArekin egindako RT-PCR bidez, CB1 zein
CB2 kannabinoide-hartzaileen mRNAk detektatu ziren. CB1 kannabinoide-hartzailearen
408 bp-ko anplikoia espermatozoideetan eta kontrol positibo moduan erabilitako giza
garuneko kortexean aurkitu zen, baina ez, ordea, kontrol negatibo moduan erabilitako
Jurkat zeluletan. Bestalde, CB2 kannabinoide-hartzailearen kasuan espero genuen 522
bp-ko zatia, espermatozoideetan eta kontrol positibo moduan erabilitako Jurkat
zeluletan topatu genuen, baina ez kontrol negatibo moduan erabilitako giza garuneko
kortexean (4. irudia).
CB1
Sp Kx
GAPDH
Jr
CB2
4. irudia: RT-PCRaren produktuen etidio bromurodun % 2 agarosa-gelaren elektroforesia giza espermatozoideentzat (Sp), garun-kortexarentzat (Kx) eta Jurkat zelulentzat (Jr). CB1, CB1 kannabinoide-hartzailearentzako primer espezifikoekin lortutako anplikoia (408 bp) ez zen Jurkat zeluletan topatu. CB2, CB2 kannabinoide-hartzailearentzako primer espezifikoekin lortutako anplikoia (522 bp) ez zen giza garuneko kortexean topatu. GAPDH, barne-kontrol moduan erabili zen (322 bp). n = 5.
Hartzaileen mRNA espermatozoide helduetan agertzeak adieraziko luke CB1 eta CB2
hartzaileak, opioide-hartzaileak bezala, testikuluetako zelula espermatikoetan sortuko
liratekeela. Hau da, ez lirateke epididimoan zeharreko bidaian eskuratuko,
ernalkuntzarako beharrezkoak diren beste mintz-proteinekin gertatzen den bezala
(Focarelli, 1998; Scuell eta Burkman, 2005), eta ez lirateke prostasometatik
bereganatuko (Arienti 1997a, Arienti 1997b) ere, zeren eta, ez opioide-hartzaileak, ez
kannabinoideak, ez baitira prostasometan deskribatuak izan (Utleg 2003).
Doktore-tesia
Emaitzak eta eztabaida 86
µ eta κ opioide-hartzaileen kasuan adierazi dugun bezala, kasu honetan ere, CB1 eta CB2
hartzaileen mRNA espermatozoide helduetan selektiboki mantendu badira, uste
izatekoa da ernalkuntzaren ondoren zenbait funtzio beteko dituztela.
2.2 Kannabinoide-hartzaileen proteinaren espresioa giza espermatozoideetan
5. irudia espermatozoideen, giza garuneko kortex prefrontalaren materia grisaren eta
Jurkat zelulen mintz plasmatikoak erabilita egindako western blot-en erakusgarria da.
Anti-CB1 antigorputz poliklonalak ~58 kDa-eko banda agerrarazi zuen
espermatozoideetan eta garun-kortexean (5.A irudia). Pisu molekular hori bat dator
espermatozoideetan (Rossato, 2005) eta beste zeluletan (de Jesus, 2006; Xu, 2005)
lehenago egindako hainbat lanekin. Bestalde, mRNArekin gertatu zen bezala, kontrol
negatibo moduan erabilitako Jurkat zelulen proteina-erauzkinean ez zen seinalerik
aurkitu (5.A irudia); izan ere, zelula mota horien CB1 genearen transkripzioa oso txikia
da, eta, beraz, proteina ez da ia detektatzen (Herrera 2006, Börner 2007).
B
kDa Sp Kx Jr
50
60
40
A
kDa Sp Kx Jr
50
60
40
5. irudia: CB1 kannabinoide-hartzailea (A) eta CB2 kannabinoide-hartzaileentzako (B) western blot-en analisia giza espermatozoideetan (Sp), garun-kortexean (Kx) eta Jurkat zeluletan (Jr). Pisu molekularreko markatzaileak (kDa) blot-en ezkerrean agertzen dira. n = 5.
Anti-CB2 antigorputz poliklonala erabiliz, espermatozoideetan eta kontrol positibo
moduan erabilitako Jurkat zeluletan, 44 kDa-eko banda detektatu zen (5.B irudia) eta,
gutxi gorabehera, lehenago deskribatutako pisu molekular teorikoarekin bat dator
(Filppula, 2004). Espermatozoideekin egindako lanetan, CB2 proteinaren existentzia
kolokan jarri da (Rossato, 2005; Maccarrone, 2005). Dena den, Schuel eta Burkman-ek
idatzitako berikuspenean (Schuel eta Burkman, 2005) ondo adierazi zuten bezala,
Maccarrone-k eta lankideek basurde-espermatozoideekin egindako lanean (Maccarrone,
2005), alde batetik, western blot bidez CB2 hartzailearen seinale ahula ikus daiteke, eta,
Doktore-tesia
Emaitzak eta eztabaida 87
bestetik, SR144528 CB2 antagonista espezifikoak [3H]CP55.940aren lotura espezifikoa
~% 15 blokeatzen duela ere ikus daiteke. Aipagarria da Maccarrone bera, CB2
hartzaileari buruzko 2007ko berrikuspen batean (Maccarrone, 2007), CB2-aren
presentziaz mintzatzen dela 2005ean egin zuen lanean oinarrituta. Laburbilduz, gure
emaitzek aurreko datuak indartu eta CB2-aren presentzia baieztatzen dute.
Bestalde, mRNArekin gertatzen zen bezala, giza garunaren kortexean ez zen CB2
proteinaren seinalerik detektatu (5.B irudia), bestelako lanetan dagoeneko ikusita
dagoen bezala (Herrera, 2006; Blazquez, 2006).
Western blot-eko PVDF mintzak CB1 zein CB2 antigorputz poliklonal primarioekin
inkubatzen ez zirenean, antigorputz sekundarioak ez zuen inolako seinalerik ematen
(aurkeztu gabeko datuak).
2.3 Kannabinoide-hartzaileen kokapena giza espermatozoidetan
Azterketa immunozitokimikoen bidez, CB1 eta CB2 kannabinoide-hartzaileen presentzia
baieztatu zen. Horretaz gain, kokalekua zehaztu eta elkarren artean aldaratu ahal izan
zen.
CB1 kannabinoide-hartzailea espermatozoideen buruaren aurrealdean (akrosoma
aldearen gainean) eta tarteko zatian aurkitu zen (6.A irudia). Emaitza horiek lehenago
egindako beste lanen aurkikuntzak baieztatu zituzten (Rossato, 2005). Hala ere, gure
kasuan, isatsean ere seinalea topatu zen (6.A irudia). Behatutako zelula guztien %
15ean, buruko seinalea akrosoma osteko zatiraino hedatzen zen (6.B irudia). Basurde-
espermatozoideetan egindako ikerketetan, CB1 hartzailearen presentzia akrosoma
osteko zatira eta isatsera mugatzen zen (Maccarrone, 2005).
CB2 kannabinoide-hartzailearen immunotindaketa, ostera, buruaren akrosoma osteko
zatian, tarteko zatian eta, intentsitate txikiagoarekin, isatsean aurkitu zen (6.D irudia).
Aztertutako zelula guztien % 20ren seinalea buruaren aurreko zatiraino hedatzen zela
ikusi zen (6.E irudia).
Doktore-tesia
Emaitzak eta eztabaida 88
Opioide-hartzaileen kokalekua eztabaidatu dugunean ondorioztatukoaren harira,
proteina bakoitza espermatozoidean erabilgarria den egituran bakarrik aurkitzen bada
(Turner, 2006), CB1 eta CB2 hartzaileen arteko kokalekuen desberdintasunak iradoki
lezake prozesu fisiologiko desberdinetan parte hartzen dutela.
6. irudia: Kannabinoide-hartzaileen azterketa immunozitokimikoa giza espermatozoideetan. A eta B) CB1 kannabinoide-hartzailearen kokapena. D eta E) CB2 kannabinoide-hartzailearen kokapena. F) kontrol negatiboa. G) F irudia, fase-kontraste bidezko mikroskopiarekin. n = 3. Gezitxoek (B eta E) hartzaile bakoitzaren tindaketa patroiaren aldakortasuna seinalatzen dute. Eskala-barra, 10 µm.
Azkenik, immunotindaketa-prozedura berdina jasan duten zeluletan aurkitu dugun
seinale patroi desberdina opioide-hartzaileetan eta beste hainbat hartzaile eta proteina
immunokokatzean behatu izan da (Meizel, 2004; Subiran, 2007). Berretsi egiten dugu
gertaera hori zelulen mintza egoera-funtzional desberdinean egoteagatik gerta daitekeela
(Maccarrone, 2005; Flesch eta Gadella, 2000).
CB1 zein CB2 antigorputz poliklonal primarioekin egin beharreko inkubaketa egiten ez
zenean, antigorputz sekundarioak ez zuen inolako seinalerik ematen (6.F irudia).
Doktore-tesia
Emaitzak eta eztabaida 89
3. helburua: Opioide- eta kannabinoide-hartzaileen
aktibazioaren eragina espermatozoideen mugikortasunean.
3.1 Agonista eta antagonista opioideen eragina espermatozoideen
mugikortasunean
Sarreran ikusi dugun bezala, farmakologikoki, gutxienez hiru opioide-hartzaile mota
desberdintzen dira estekatzaileekiko duten itxurazko afinitatearen arabera. Baina
badakigu, halaber, konposatu opioide bakoitzak hartzaile mota bakoitzarekiko
selektibotasun-maila desberdina daukan arren, edozein opioide-hartzailetara lot
daitekeela kontzentrazioa handitzen bada. Hala, aztertu dugun hartzaile bakoitzaren
aktibazioaren emaitzak banatuak emango ditugun arren, hartzaileen arteko
elkarrekintzak azaldu ahal izateko, emaitzen eztabaida orokorra egingo dugu.
• δ opioide-hartzailearen agonista (DPDPE) eta antagonista (naltrindol)
opioideen eragina mugikortasunean
OMEk zehaztutako espermatozoideen mugikortasun motak aztertuz, ikus daiteke
DPDPEaren kontzentrazio altuenak (10-5 M) ez zuela aldaketa adierazgarririk sortu
denboran zehar (7.A irudia). Era berean, inkubaketa-denborarik luzeenean (3,5 ordu),
DPDPE agonistaren kontzentrazio desberdinek ez zuten elkarren arteko ezberdintasun
adierazgarririk erakutsi OMEk zehaztutako mugimendu motetan (7.A' irudia).
Aipagarria da naltrindol 10-4 M-a gehitu eta berehala (0 ordu) a eta b motako
espermatozoideen ehunekoak modu adierazgarrian jaitsi eta, horren ondorioz, d
motakoa igo zela naltrindol gabeko inkubaketekin alderatuz (8.A, B eta D irudiak).
Gainera, naltrindola bakarrik egonda edo naltrindola zeukan laginari DPDPEa (10-5 M)
gehituz, mugikortasun patroi antzekoak ikusi ziren denboran zehar mugimendu mota
guztietan (8.A, B, C eta D irudiak). Beraz, ematen du antagonista 10-4 M denean
mugikortasun patroia antagonistaren presentziak gidatzen duela denboran zehar. Dena
den, 3,5 ordu igaro ostean, naltrindol 10-4 M-aren presentziak soilik A motako
mugikortasunaren ehunekoa mantendu zuen era adierazgarrian aldatua, naltrindol
gabeko inkubaketekin alderatuz (8.A eta A' irudia). Naltrindolak ere VCL, VSL, VAP,
Doktore-tesia
Emaitzak eta eztabaida
Doktore-tesia
90
0
20
40
60
0 0.5 1 3.50
20
40
60
a b c d a+b
0
20
40
60
a b c d
0
20
40
60
a b c d0
20
40
60
0 0.5 1 3.5
A´
Mug
ikor
tasu
na(%
)
Mugikortasun mota (OME)
B´
0
20
40
60
0 0.5 1 3.5
Mug
ikor
tasu
na(%
)
Mugikortasun mota (OME)
AM
ugik
orta
suna
(%)
Denbora (orduak)
B
Mug
ikor
tasu
na(%
)
Denbora (orduak)
D´
Mug
ikor
tasu
na(%
)
Mugikortasun mota (OME)
D
Mug
ikor
tasu
na(%
)
Denbora (orduak)
#$
*
*
*
KontrolaDPDPE 10-7 MDPDPE 10-6 MDPDPE 10-5 M
KontrolaDPDPE 10-7 MDPDPE 10-6 MDPDPE 10-5 M
ab
cd
U-50488 10-5 Mab
cd
U-50488 10-5 M
ab
cd
DPDPE 10-5 Mab
cd
DPDPE 10-5 M
a+bab
cd
Morfina 10-7 Ma+ba
bcd
Morfina 10-7 M
KontrolaU-50488 10-7 MU-50488 10-6 MU-50488 10-5 M
KontrolaU-50488 10-7 MU-50488 10-6 MU-50488 10-5 M
KontrolaMorfina 10-7 MMorfina 10-6 MMorfina 10-5 M
KontrolaMorfina 10-7 MMorfina 10-6 MMorfina 10-5 M
#
$
7. irudia: Opioide-hartzaileen agonista eta antagonista opioideen eragina giza espermatozoideen mugikortasunean. A) DPDPE 10-5M gehitzean a, b, c eta d motako mugikortasunen portzentajean sortutako erantzuna denboran zehar. B) U-5048810-5M gehitzean a, b, c eta d motako mugikortasunen portzentajean sortutako erantzuna denboran zehar. D) Morfina 10-5M gehitzean a, b, c, d eta a+b motako mugikortasunen portzentajean sortutako erantzuna denboran zehar (*P<0,05 versus gainontzeko orduak; $P<0,05 versus 0 eta 0,5 orduak). A´) DPDPEren hainbat dosik a, b, c eta d motako mugikortasunen portzentajean sortutako erantzuna 3,5 orduko inkubazioa eta gero. B´) U-50488ren hainbat dosik a, b, c eta d motako mugikortasunen portzentajean sortutako erantzuna 3,5 orduko inkubazioa eta gero. D´) Morfinaren hainbat dosik a, b, c, d eta a+b motako mugikortasunen portzentajean sortutako erantzuna 3,5 orduko inkubazioa eta gero (#P<0,05 versus kontrola).
Emaitzak eta eztabaida
Doktore-tesia
91
0
10
20
30
40
50
60
0
10
20
30
0 0.5 1 3.50
10
20
30
0
10
20
30
40
50
0
5
10
15
20
25
30
10-7 10-510-6
Kontzentrazioa (M)
Kontzentrazioa (M)10-7 10-510-6
Kontzentrazioa (M)10-7 10-510-6
Kontzentrazioa (M)10-7 10-510-6
10
30
50
0 0.5 1 3.5
A
a m
ota
(%)
B
b m
ota
(%)
C
c m
ota
(%)
D
d m
ota
(%)
10
30
50
0 0.5 1 3.5
B´
b m
ota
(%)
Denbora (orduak)
D´
d m
ota
(%)
Denbora (orduak)
C´c
mot
a (%
)
Denbora (orduak)
0
10
20
30
0 0.5 1 3.5
A´
a m
ota
(%)
Denbora (orduak)
*
*
*
##
*
8. irudia: δ opioide-hartzailearen agonistaren (DPDPE) eta antagonistaren (naltrindol) efektua giza espermatozoideen mugikortasunean. A, B, C eta D) hurrenez hurren a, b, c eta d motako mugikortasunen portzentajean topatutako erantzuna denboran zehar. Kontrola; naltrindol 10-4 M
DPDPE 10-5M + naltrindol 10-4 M; DPDPE 10-5M (*P<0,05 versus ordu bereko naltrindolgabeko tratamenduak). A´, B´, C´ eta D´) hurrenez hurren a, b, c eta d motako mugikortasunen portzentajean topatutako erantzuna DPDPEren kontzentrazio aldakorrekin eta 3,5 orduko inkubazioaeta gero (naltrindolaren kontzentrazioa DPDPErena baino 10 aldiz handiagoa izan zen beti).
Kontrola; naltrindol 10-4 M; DPDPE + naltrindol; DPDPE (#P<0,05 versus kontzentraziobereko naltrindol gabeko tratamenduak).
Emaitzak eta eztabaida
Doktore-tesia
92
0
10
20
30
0
10
20
30
0
10
20
30
40
50
60
10
30
50
0 0.5 1 3.5
0
10
20
30
0 0.5 1 3.5
10-7 10-510-6
Kontzentrazioa (M)
Kontzentrazioa (M)10-7 10-510-6
Kontzentrazioa (M)10-7 10-510-6
Kontzentrazioa (M)10-7 10-510-6
A
a m
ota
(%)
B
b m
ota
(%)
C
c m
ota
(%)
D
d m
ota
(%)
B´
b m
ota
(%)
Denbora (orduak)
D´
d m
ota
(%)
Denbora (orduak)
C´
c m
ota
(%)
Denbora (orduak)
A´
a m
ota
(%)
Denbora (orduak)
0
10
20
30
0 0.5 1 3.5
0
10
20
30
40
10
30
50
0 0.5 1 3.5
9. irudia: κ opioide-hartzailearen agonistaren (U-50488) eta antagonistaren (nor-binaltorfimina) efektua giza espermatozoideen mugikortasunean. A, B, C eta D) hurrenez hurren a, b, c eta d motako mugikortasunen portzentajean topatutako erantzuna denboran zehar. Kontrola; nor-binaltorfimina 10-4 M; U-50488 10-5M + nor-binaltorfimina 10-4 M; U-50488 10-5M. A´, B´, C´eta D´) hurrenez hurren a, b, c eta d motako mugikortasunen portzentajean topatutako erantzuna U-50488ren kontzentrazio aldakorrekin eta 3,5 orduko inkubazioa eta gero (nor-binaltorfiminarenkontzentrazioa U-50488rena baino 10 aldiz handiagoa izan zen beti). Kontrola; nor-binaltorfimina 10-4 M; U-50488 + nor-binaltorfimina; U-50488.
Emaitzak eta eztabaida
Doktore-tesia
93
15
35
55
75
0 0.5 1 3.5
0
5
10
15
20
0
10
20
30
40
50
0
10
20
30
0
10
20
30
40
50
0
10
20
30
40
50
60
10-7 10-510-6
Kontzentrazioa (M)
Kontzentrazioa (M)10-7 10-510-6
Kontzentrazioa (M)10-7 10-510-6
Kontzentrazioa (M)10-7 10-510-6
A
a m
ota
(%)
B
b m
ota
(%)
C
c m
ota
(%)
D
d m
ota
(%)
B´
b m
ota
(%)
Denbora (orduak)
D´
d m
ota
(%)
Denbora (orduak)
C´
c m
ota
(%)
Denbora (orduak)
A´
a m
ota
(%)
Denbora (orduak)
Kontzentrazioa (M)10-7 10-510-6
E
a+b
mot
a (%
)
E´
a+b
mot
a (%
)
Denbora (orduak)
0
10
20
30
0 0.5 1 3.5
0
10
20
30
0 0.5 1 3.5
10
30
50
0 0.5 1 3.5
10
30
50
0 0.5 1 3.5
*
#
$
$
$
*
*
*
*
***
10. irudia: µ opioide-hartzailearen agonistaren (morfina) eta antagonistaren (naloxona) efektua giza espermatozoideen mugikortasunean. A, B, C, D eta E) hurrenez hurren a, b, c, d eta a+b motako mugikortasunen portzentajean topatutako erantzuna denboran zehar. Kontrola; naloxona 10-4 M
morfina 10-7M + naloxona 10-6 M; morfina 10-7M (*P<0,05 versus 0 ordu). A´, B´, C´, D´ eta E´) hurrenez hurren a, b, c, d eta a+b motako mugikortasunen portzentajean topatutako erantzuna morfinaren kontzentrazio aldakorrekin eta 3,5 orduko inkubazioa eta gero (naloxonarenkontzentrazioa morfinarena baino 10 aldiz handiagoa izan zen beti). Kontrola; naloxona 10-4
M; morfina + naloxona; morfina (#P<0,05 versus morfina 10-7M + naloxona 10-6 M; $P<0,05 versus kontzentrazio horretan konparatutako gainontzeko tratamenduak ).
Emaitzak eta eztabaida 94
LIN, STR, ALH eta BCF parametroak jaitsi zituen modu adierazgarrian (3. eranskinna).
• κ opioide-hartzailearen agonista (U-50488) eta antagonista (nor-
binaltorfimina) opioideen eragina mugikortasunean
Mugikortasun motak aztertuz, ikus daiteke U-50488ren kontzentrazio altuenak (10-5 M)
ez zuela aldaketa adierazgarririk sortu denboran zehar (7.B irudia). Era berean,
inkubaketa-denborarik luzeenean (3,5 ordu), U-50488 agonistaren kontzentrazio
desberdinek ez zuten elkarren arteko ezberdintasun adierazgarririk erakutsi OMEk
zehaztutako mugimendu motetan (7.B' irudia).
κ opioide-hartzailearen antagonista nor-binaltorfimina 10-4 M-ak ere ez zuen inolako
aldaketa adierazgarririk sortu aztertutako kontzentrazio, denbora eta mugimendu
motetan (9. irudia). Bestelako parametroetan ere ez zen aldaketarik ikusi (3. eranskina).
• µ opioide-hartzailearen agonista (morfina) eta antagonista (naloxona)
opioideen eragina mugikortasunean
Morfina 10-7 M-aren presentziak OMEk zehaztutako mugimendu mota guztietan
aldaketa adierazgarriak sortu zituen inkubazioaren hirugarren orduan (inkubazio
totalaren 3,5 orduan). Zehazki, a eta b motako espermatozoideen ehunekoa jaitsi eta c
eta d motako espermatozoideena handitu zen (7.D irudia). Erabilitako morfina-
kontzentrazioen ekintza 3,5 orduko inkubazio-denboran aztertuz, dosiaren menpeko
alderantzizko joera ikusi zen. Hau da, kontrolarekin alderatuz, a eta b motako
espermatozoideen ehunekoen jaitsiera agerikoena morfina-kontzentrazio txikienean (10-
7 M) gertatu zen; era berean, c eta d motako espermatozoideen ehunekoen handipen
nabariena morfina-kontzentrazio berdinean (10-7 M) gertatu zen (7.D' irudia). Hala ere,
dosiaren menpeko alderantzizko joerak nabariak izan arren, soilik d motako
espermatozoideen ehunekoaren handipena izan zen kontrolarekiko ezberdina modu
adierazgarrian (44,9 ± 10,7 vs 25,9 ± 4,6; P < 0,05; 7.D' irudia). Dena den, aipagarria da
a eta b mugikortasunak batuz gero (mugikor progresiboak) morfina 10-7 M-ak sortutako
a+b motako espermatozoideen ehunekoen jaitsiera era adierazgarrian desberdina izan
zela, kontrolarekin alderatuta, (27,1 ± 9,3 vs 45,8 ± 6,7; P < 0,05; 7.D' irudia).
Doktore-tesia
Emaitzak eta eztabaida 95
Morfina 10-7 M-ak mugimenduan sortutako aldaketa horiek, µ opioide-hartzailearen
antagonista den naloxonak (10-4 M) saihestu zituen, inkubaketa-denborarik luzeenean
(3,5 ordu) (10. A´, B´, D´ eta E´ irudiak). Alde batetik, d motako espermatozoideen
ehunekoaren handipena ekidin zuen (44,9 ± 10,7 vs 25,7 ± 3,4; P < 0,05; 10. D eta D´
irudiak); bestetik, a zein b motako espermatozoideen ehunekoaren jaitsiera ere saihestu
zuen (a motarako: 4,6 ± 1,9 vs 13,8 ± 2,9; P < 0,05; 10.A eta A´ irudiak. b motarako:
22,5 ± 7,9 vs 36,4 ± 7,1; P = 0,07; 10.B eta B´ irudiak). Kasu horretan ere, naloxonak
(10-4 M) era nabariagoan saihestu zuen espermatozoide progresiboen baturaren (a+b)
ehunekoaren jaitsiera (27,1 ± 9,6 vs 50,3 ± 6,5; P < 0,05; 10.E eta E´ irudiak).
Morfinak (10-7 M) VCL, VSL eta VAP parametroak jaitsi zituen, eta naloxonak (10-4
M) efektu hori lehengoratu zuen. Bestalde, ibilbidearekin zerikusia duten parametroak
ez ziren aldatu morfinarekin (3. eranskina).
Emaitzen eztabaida hasteko, gogoratuko dugu argitaratu diren hainbat ikerketatan
efektu kontraesankorrak deskribatu izan direla entzefalina edo haren analogoek [oro har,
µ-hartzailearekin alderaturik δ-hartzailearekiko afinitate handiagoa duten peptido
opioideak (Leslie, 1987)] espermatozoideen funtzioan duten eragina aztertzean. Lan
horien arabera, entzefalina-dosi altuak espermatozoideen mugikortasuna jaisten bazuen
ere (Sastry eta lank., 1991; Foresta eta lank., 1985), mugikortasuna mantentzeko,
peptido horren dosi txikia behar zen (Fujisawa eta lank., 1996).
Gure emaitzek, hein batean, paradoxa hori azaldu dezakete. Alde batetik, egia izan
daiteke entzefalina-kontzentrazio minimo bat beharrezkoa izatea mugimendua
mantentzeko (Fujisawa eta lank., 1996), zeren eta, gure esperimentuetan, naltrindolak
(10-4M) espermatozoideen mugikortasunaren jaitsiera eragin zuen eta, agian,
naltrindolak δ-hartzaileari lotuta zeuden barne-entzefalinak desplazatu zituelako gertatu
zen jaitsiera hori. Bestalde, litekeena da, halaber, entzefalina-kontzentrazio altua
erabiltzean mugikortasunaren inhibizioa gertatzea (Sastry eta lank., 1991; Foresta eta
lank., 1985) baina, beharbada, inhibizio hori ez dago δ-hartzaileei lotua, zeren eta, nahiz
eta entzefalinen selektibotasuna δ > µ izan, barne-peptido horiek δ- zein µ-hartzaileei
lot baitaitezke (Jordan eta lank., 2000). Beraz, entzefalina-kontzentrazio batetik aurrera,
µ opioide-hartzailera lotzen hasiko ziren eta, gure emaitzen arabera, badakigu µ
opioide-hartzailearen aktibazioak mugikortasunaren jaitsiera dakarrela. Bukatzeko, gure
Doktore-tesia
Emaitzak eta eztabaida 96
emaitzetan ikusi dugu guk erabilitako δ-antagonistak (DPDPE) ez zituela sortu beste
lanetan deskribatutako entzefalinaren efektuak. Horren zergatia izan daiteke, DPDPEa,
δ-hartzailearekiko oso espezifikoa denez (Ki = 1,4 nM / Kd = 19 nM), kontzentrazio
altuagoak behar izatea (Ki > 10000 nM / Kd > 3000 nM) µ-hartzailearen bidez efektua
sortzeko (Hunter eta lank., 1990; Fukuda eta lank., 1995).
µ opioide-hartzailearekin jarraituz, ikusi dugu µ opioide-hartzailearen agonistak
(morfina, 10-7 M) espermatozoide geldien kopurua igo zuela eta antagonistak
(naloxona), berriz, ekintza hori saihestu zuela. Emaitza hori bat dator giza eta zaldi-
espermatozoideekin egindako inkubazioekin. Bi lan horietan, espermatozoideak µ-
opioide-hartzailearen beste agonista batekin (β-endorfina) eta guk erabilitako
antagonista berdinarekin (naloxona) inkubatu ziren. Horietako lan batean, agonistarekin
5 minutuko inkubazioa egin eta gero, mugikortasunaren dosiaren menpeko jaitsiera
ikusi zuten, baina naloxonak ez zuen efektua ekidin (Fraioli eta lank., 1984). Beste
lanean, β-endorfinarekin 24 orduko inkubazioa egin eta gero, mugikortasunaren
dosiaren menpeko inhibizioa ikusi zuten eta naloxonak (10-8 M) ekintza hori ekidin
zuen. Gainera, azken lan horretan, naloxonarekin bakarrik inkubatzean, ikusi zuten
espermatozoideek mugikortasunari eusten ziotela (Mari eta lank., 2005).
Zaldi-espermatozoideekin egindako beste lan batean, bost orduz inkubatu eta gero,
naloxona 10-8 M-ak mugikortasun progresiboan eragin positiboa zuen; naloxona 10-3 M-
ak, berriz, ekintza negatiboa sortu zuen (Albrizio, 2005). Naloxonak µ opioide-
hartzaileekiko afinitate handiagoa dauka δ-hartzaileekiko baino (Leslie, 1987;
Chacrabarti, 1997). Beraz, naloxona-kontzentrazio txikiak, µ opioide-hartzailearen
antagonizazioaren bidez, mugikortasunean lagunduko du; naloxona-kontzentrazio altua,
aldiz, δ-hartzaileen estekatzaileak ere desplazatzen has daiteke eta mugikortasuna inhibi
dezake (naltrindolaren efektu berdina). Hala eta guztiz ere, gure taldean egindako
lanetan eta tesi honetan, naloxona 10-4 M-arekin ez dugu efektu kaltegarririk ikusi
mugikortasunean (Subiran, 2007). Bestalde, naloxona-kontzentrazio altuaren (10-4 M)
efektu positiboak ere deskribatu dira (Sastry eta lank., 1991). Beraz, argi dago gai
eztabaidagarria dela oraindik.
Jakingarria da nola daitekeen µ opioide-hartzailearen agonistek, β-endorfinak [10-9 M
eta 10-8 M (Mari eta lank., 2005)] eta morfinak (10-7 M) espermatozoideen
Doktore-tesia
Emaitzak eta eztabaida 97
mugikortasunean efektu negatiboa sortzea eta kontzentrazio handiagoetan (morfina 10-6
M eta 10-5 M) efektu adierazgarririk ez sortzea. Alde horretatik, litekeena da 10-7 M
baino kontzentrazio altuagoetan morfina µ opioide-hartzaileari (Ki = 1,4 nM / Kd ~ 23
nM) zein δ opioide-hartzaileari (Ki > 1000 / Kd ~ 390 nM) lotzea (Satoh eta lank.,
1995; Fukuda eta lank., 1995) eta, horren ondorioz, δ-efektua sorraraztea, zeinak, ikusi
dugunaren arabera, espermatozoideen mugikortasuna manten baitzezakeen.
Dena den, heroinazaleen (µ-agonista) patologia espermatiko nagusia mugikortasunaren
jaitsiera izatea bat dator guk aurkitutako morfinaren efektu negatiboarekin. Beraz,
opiazeozale gizonezkoen artean atzemandako hazi-kalitate eskasa eta ugalkortasunik
eza ez zen izango soilik hipotalamoan (Stansfield eta Cunningam, 1987; Fabbri eta
lank., 1989; Giri eta Kaufman, 1994) eta guruin pituitarioan (Kalra eta lank., 1988)
sortutako efektuengatik; aitzitik, espermatozoideen opioide-hartzaileen bidez zuzenean
eragindako ekintza ere izango zen.
κ opioide-hartzailearen agonistak zein antagonistak espermatozoideen mugikortasunean
efektu adierazgarririk sortu ez zuten arren, hartzaile hori espermatozoideen hainbat
aldetan agertu izanak iradokitzen du mugikortasuna ez den beste eginkizunen bat eduki
lezakeela.
Beraz, laburbilduz: hiru hartzaileek erakutsi duten elkarren arteko banaketa desberdina
izateak, batetik, eta agonista- zein antagonista-dosi bakoitzak espermatozoideen
mugikortasunean ekintza bat baino gehiago sortu izanak, bestetik, aditzera ematen
digute ezen, benetan, hartzaile bakoitzak funtzio espezifiko desberdinak bete
ditzaketela. Izan ere, espermatozoideek hain egitura eta funtzio polarizatua dutenez,
seinaleztapen-sistema bakoitza beharrezkoa den zelularen alde espezifikoan kokatuko
da (Aquila eta lank., 2004; Turner, 2006).
CASAk neurtutako bestelako parametroei begiratuta, esan dezakegu µ-hartzailearen
aktibazioak espermatozoideen abiaduran eragiten duela baina ibilbideak edo higidura
motak ez dituela aldatzen eta δ-hartzailearen inaktibazioak (antagonistarekin), aldiz,
espermatozoideen abiaduraren eta ibilbideen aldaketa sortzen duela.
Doktore-tesia
Emaitzak eta eztabaida 98
3.2 Agonista eta antagonista kannabinoideen eragina espermatozoideen
mugikortasunean
• CB1 kannabinoide-hartzailearen agonista (ACEA) eta antagonista (SR
141716A) kannabinoideen eragina mugikortasunean
ACEAk, CB1 kannabinoide-hartzailearen agonista espezifikoak, denboraren eta
dosiaren menpeko eran jaitsi zuen a motako espermatozoideen ehunekoa (11.A eta B
irudiak), eta, ondorioz, d motakoen ehunekoa igo zuen. (11.A eta B irudiak). A eta D
motako mugikortasunetan aurkitutako diferentziak inkubazioaren 2. orduan (11.A
irudia) eta 10-5 M-eko kontzentrazioan (11.B irudia) adierazgarriak izan ziren. b eta c
motako mugikortasunen ehunekoek ez zuten aldaketa adierazgarririk jasan inkubazio
denboran zehar, ezta erabilitako ACEA-dosiekin ere (11.A eta B irudiak).
Gure esperimentuetan ACEAk sortutako espermatozoide ez-mugikorren ehunekoaren
igoerak hainbat lanetan CB1 hartzaileari egotzitako zeregin inhibitzailea baieztatuko
luke (Schuell and Burkman, 2005) zeren eta, ACEA oso selektiboa baita CB1
hartzailearekiko (Howlett, 2002).
Bestalde, nahiz eta denboran zehar SR 141716a CB1 antagonistaren kontzentrazio
altuenak (10-5M) b, c eta d mugikortasunetan aldaketa adierazgarririk ez zuen eragin
(12.B', C' eta D' irudiak), a motako mugimenduan eragin negatiboa sortu zuen (12.A'
irudia). Eta SR 141716a, ACEArekin batera inkubatzean, ACEAren efektu negatiboa
saihestu beharrean, a, b eta d motako mugikortasunetan dosiaren menpeko eran indartu
zuen efektu hori (12.A, B eta E irudiak).
Aurretik publikatutako beste lan batzuetan, anandamida (AEA) eta SR141716arekin
egindako inkubaketetan, AEAk efektu inhibitzailea sortu zuen eta SR 141716ak ez zuen
eraginik sortu espermatozoideen mugikortasunean. Gainera, biak batera inkubatzean,
SR 141716ak AEAren efektua saihestu zuen (Rossato, 2005; Cobellis, 2005).
Lehen komentatu dugun bezala, gure lanean SR 141716ak ez du ACEAren eragina
ekidin, eta horrek azalpen bat izan behar du. Zenbait ehunetan egindako CB1
hartzailearekiko afinitate-azterketetan, hauxe ondorioztatu da: (1) ACEA CB1-
selektiboa da eta, CB1 hartzailearekiko, SR 141716a antagonista baino afinitate
Doktore-tesia
Emaitzak eta eztabaida
Doktore-tesia
99
-5
5
15
25
35
45
55
65
0 0.5 1 2
0
10
20
30
40
50
60
0 0.5 1 20
20
40
60
a b c d
0
20
40
60
a b c d
B
Mug
ikor
tasu
na(%
)
Mugikortasun mota (OME)
E
Mug
ikor
tasu
na(%
)
Mugikortasun mota (OME)
AM
ugik
orta
suna
(%)
Denbora (orduak)
D
Mug
ikor
tasu
na(%
)
Denbora (orduak)
KontrolaACEA 10-7 MACEA 10-6 MACEA 10-5 M
KontrolaACEA 10-7 MACEA 10-6 MACEA 10-5 M
ab
cd
JWH-015 10-5 Mab
cd
JWH-015 10-5 M
ab
cd
ACEA 10-5 Mab
cd
ACEA 10-5 M
KontrolaJWH-015 10-7 MJWH-015 10-6 MJWH-015 10-5 M
KontrolaJWH-015 10-7 MJWH-015 10-6 MJWH-015 10-5 M
#
#
$
#
*
*
**
*
**
$
#
$
11. irudia: Kannabinoide-hartzaileen agonista eta antagonista kannabinoideen eragina giza espermatozoideen mugikortasunean. A) ACEA 10-5M gehitzean a, b, c eta d motako mugikortasunen portzentajean sortutako erantzuna denboran zehar (*P<0,05 versus 0 ordu; $P<0,05 versus 0 eta 0,5 orduak). B) ACEAren hainbat dosik a, b, c eta d motako mugikortasunen portzentajean sortutako erantzuna 2 orduko inkubazioa eta gero (#P<0,05 versus kontrola eta ACEA 10-7M; $P<0,05 versus mugikortasun mota horretan konparatutako gainontzeko tratamenduak). D) JWH-015 10-5M gehitzean a, b, c eta d motako mugikortasunen portzentajean sortutako erantzuna denboran zehar (*P<0,05 versus 0 ordu). E) JWH-015aren hainbat dosik a, b, c eta d motako mugikortasunen portzentajean sortutako erantzuna 2 orduko inkubazioa eta gero (#P<0,05 versus kontrola; $P<0,05 versus mugikortasun mota horretan konparatutako gainontzeko tratamenduak).
handiagoa du (Howlett, 2002). (2) AEA CB1/CB2-selektiboa da, eta, CB1
hartzailearekiko, SR 141716a baino afinitate txikiagoa du (Howlett, 2002).
Emaitzak eta eztabaida
Doktore-tesia
100
10-7 10-510-6
Kontzentrazioa (M)
Kontzentrazioa (M)10-7 10-510-6
Kontzentrazioa (M)10-7 10-510-6
Kontzentrazioa (M)10-7 10-510-6
A
a m
ota
(%)
B
b m
ota
(%)
C
c m
ota
(%)
D
d m
ota
(%)
B´
b m
ota
(%)
Denbora (orduak)
D´
d m
ota
(%)
Denbora (orduak)
C´
c m
ota
(%)
Denbora (orduak)
A´
a m
ota
(%)
Denbora (orduak)
0
10
20
30
40
0
10
20
30
0
10
20
30
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0
5
10
15
20
25
0 0.5 1 2
0
10
20
30
40
50
0 0.5 1 2
0
5
10
15
20
25
30
35
0 0.5 1 2
10
20
30
40
50
60
70
80
0 0.5 1 2
**
*
*
*
*
#
#
$
&
#
$
#
12. irudia: CB1 kannabinoide-hartzailearen agonistaren (ACEA) eta antagonistaren (SR141716a) efektua giza espermatozoideen mugikortasunean. A, B, C eta D) hurrenez hurren a, b, c eta d motako mugikortasunen portzentajean topatutako erantzuna denboran zehar. Kontrola SR14171610-5 M; ACEA 10-5M + SR141716a 10-5 M; ACEA 10-5M (*P<0,05 versus 0 ordu). A´, B´, C´eta D´) hurrenez hurren a, b, c eta d motako mugikortasunen portzentajean topatutako erantzuna kontzentrazio aldakorrekin eta 2 orduko inkubazioa eta gero (SR141716aren eta ACEArenkontzentrazio ekimolekularrak erabili ziren). Kontrola; SR141716a; ACEA + SR141716a;
ACEA (#P<0,05 versus kontzentrazio horretan konparatutako gainontzeko tratamenduak; $P<0,05 versus kontrola eta ACEA 10-5M + SR141716a 10-5 M; &P<0,05 versus kontrola eta SR141716a 10-5
M).
Emaitzak eta eztabaida 101
Beraz, afinitate horiek kontuan hartuz, erraz uler dezakegu AEA eta SR 141716a erabili
duten lanetan (Rossato, 2005; Cobellis, 2005) antagonismoa gertatzea, are gehiago
espermatozoideak antagonistarekin preinkubatu ahal izan zituztela kontuan hartzen
badugu. Aitzitik, gure lanean, ACEA eta SR 141716a (ekimolekularki) batera inkubatu
genituen. Modu horretan, ACEAk CB1 hartzaileei lotu eta aktibatu ahal izan zituen,
baina SR 141716ak CB1 hartzaileari lotzeko zailtasunak izango zituen eta, hortaz,
antagonismoa ez zen gertatu.
Dena den, alde batetik, SR 141716aren kontzentrazio altuenak (10-5 M) A
mugikortasunean eragindako efektu negatiboak adieraziko lituzke; bestetik, ACEArekin
batera inkubatzean sortutako efektu negatibo horren indarpenak SR 141716aren efektua
adieraziko luke. Horren alde, deskribatua izan da SR 141716ak, berak bakarrik, itsas
trikuaren ugalkortasunean efektu negatiboa sortzeko ahalmena duela, eta, are gehiago,
THCaren efektu negatiboa indartzeko gaitasuna duela (Berdyshev, 1998).
CASAk neurtutako bestelako parametroak aztertuz, ikus dezakegu ACEAk (10-5 M)
aldaketa sortzen zuela parametro guztietan, ibilbidearekin zerikusia zutenekin izan ezik
(LIN, STR eta WOB). Dena den, SR 141716a ACEArekin batera inkubatzean, aurrean
ikusi dugun eragin indartzaile berdina eduki zuen parametro horietan guztietan,
(3.eranskina). Beraz, badirudi CB1 hartzailearen aktibazioak, batez ere,
espermatozoideen abiaduran eragiten duela.
• CB2 kannabinoide-hartzailearen agonista (JWH-015) eta antagonista
(SR144528) kannabinoideen eragina mugikortasunean
JWH-015, CB2 kannabinoide-hartzailearen agonista espezifikoak, denboraren eta
dosiaren menpeko eran jaitsi zuen a motako espermatozoideen ehunekoa (11.D eta E
irudiak), eta b motakoen ehunekoa igo zuen. (11.D eta E irudiak). a eta b motako
mugikortasunetan aurkitutako alde horiek adierazgarriak izan ziren inkubazioaren 2.
orduan (11.D irudia) eta 10-5 M-eko kontzentrazioan (11.E irudia). c eta d motako
mugikortasunen ehunekoek ez zuten aldaketarik jasan inkubazio-denboran zehar, ezta
JWH-015 dosiekin ere (11.D eta E irudiak).
Doktore-tesia
Emaitzak eta eztabaida
Doktore-tesia
102
20
30
40
50
10
20
30
40
0 0.5 1 2
0
5
10
15
20
0 0.5 1 2
10
20
30
40
0 0.5 1 2
10-7 10-510-6
Kontzentrazioa (M)
Kontzentrazioa (M)10-7 10-510-6
Kontzentrazioa (M)10-7 10-510-6
Kontzentrazioa (M)10-7 10-510-6
A
a m
ota
(%)
B
b m
ota
(%)
C
c m
ota
(%)
D
d m
ota
(%)
B´
b m
ota
(%)
Denbora (orduak)
D´
d m
ota
(%)
Denbora (orduak)
C´
c m
ota
(%)
Denbora (orduak)
A´
a m
ota
(%)
Denbora (orduak)
** #
10
20
30
40
50
0
5
10
15
20
0
10
20
30
40
**
*#
20
30
40
50
60
0 0.5 1 2
13. irudia: CB2 kannabinoide-hartzailearen agonistaren (JWH-015) eta antagonistaren (SR144528) efektua giza espermatozoideen mugikortasunean. A, B, C eta D) hurrenez hurren a, b, c eta d motako mugikortasunen portzentajean topatutako erantzuna denboran zehar. Kontrola SR14452810-4 M; JWH-015 10-5M + SR144528 10-5 M; JWH-015 10-5M (*P<0,05 versus 0 ordu). A´, B´, C´ eta D´) hurrenez hurren a, b, c eta d motako mugikortasunen portzentajean topatutako erantzuna kontzentrazio aldakorrekin eta 2 orduko inkubazioa eta gero (SR144528ren eta JWH-015aren kontzentrazio ekimolekularrak erabili ziren). Kontrola; SR144528; JWH-015 + SR144528; JWH-015 (#P<0,05 versus kontzentrazio horretan konparatutako gainontzeko tratamenduak; $P<0,05 versus kontrola eta JWH-015 10-5M + SR144528 10-5 M; &P<0,05 versus kontrola eta SR144528 10-5 M).
Emaitzak eta eztabaida
Doktore-tesia
103
Baina, JWH-015 CB2 agonista espezifikoa SR 144528 antagonista espezifikoarekin
batera inkubatzean, agonistak sorturiko a eta b mugikortasunen ehunekoen aldaketarik
ez genuen topatu (13.A' eta B' irudiak), hau da, SR 144528 10-5 M-ak, agonistak
sorturiko eragina ekidin zuen. Gainera, SR 144528 antagonistak, bakarrik inkubatuta, ez
zuen eraginik sortu denboran zehar (13.A, B, C eta D irudiak), ezta edozein dosi
erabilita ere (13. A', B', C' eta D' irudiak). Kasu horretan ere, azpimarratu behar da
JWH-015a CB2-selektiboa dela eta, CB2 hartzailearekiko, SR 144528 antagonista baino
afinitate txikiagoa duela (Howlett, 2002).
Beraz, CB1 zein CB2 kannabinoide-hartzailearen aktibazioak A motako
espermatozoideen galera ekarri zuen. Hala ere, CB1 agonistak igo egin zuen
espermatozoide geldien kopurua, eta CB2 agonistak, berriz, B motako mugikortasuna
handitu zuen.
Beraz, laburbilduz: bi hartzaileek erakutsi duten elkarren arteko banaketa desberdinak,
batetik, eta agonista bakoitzak espermatozoideen mugikortasunean ekintza desberdina
sortu izanak, bestetik, aditzera ematen digute ezen, benetan, hartzaile bakoitzak funtzio
espezifiko desberdinak bete ditzaketela. Izan ere, opioide-hartzaileentzat esaten genuen
bezala, espermatozoideek hain egitura eta funtzio polarizatua dutenez, seinaleztapen-
sistema bakoitza beharrezkoa den zelularen alde espezifikoan kokatuko da (Aquila eta
lank., 2004; Turner, 2006).
CASAk neurtutako bestelako parametroei begiratuta, ikus dezakegu JWH-015ak (10-5
M) eragin negatiboa sortu zuela VCL eta BCFn eta ibilbidearekin lotutako LIN, STR
eta WOB parametroetan, baina SR 144528ak (10-5 M), modu adierazgarrian, soilik
VCL-ko eragina lehengoratu zuen, nahiz eta LIN, STR eta WOB parametroetan,
lehengoratzeko joera oso markatua egon (3. eranskina). Hau da, CB2 hartzaileen
aktibazioak, espermatozoideen abiadura lerromakurra jaisteaz gainera, zelula horien
ibilbideak erregula ditzake.
Eztabaida orokorra eta hipotesiak
Eztabaida orokorra eta hipotesiak 107
Tesi honen helburu orokorra izan da sistema opioide eta kannaboinoideak ugaltze-
prozesuko faseetan eduki lezaketen eraginaren inguruko ezagupena handitzea: (1)
espermatozoideetan, konposatu horientzako hartzaileen presentzia ba ote dagoen
aztertzea eta (2) espermatozoideen mugikortasunean, hartzaile horien eginkizuna zein
den jakitea. Jarraian, gaiari buruz dauden eztabaidak berrikusiz, tesian lortutako ondorio
nagusiak eztabaidatuko ditugu, eta etorkizunean zabaldu litezkeen lan-lerroak aztertuko
ditugu.
1. Garrantzitsua al da opioide- eta kannabinoide-hartzaileen mRNA mantentzea
espermatozoide helduetan?
Espermatogenesian zehar, espermatozoideek RNA espresatzen dute eta proteinatara
itzultzen dute (Boerke eta lank., 2007). Baina, behin espematogenesia bukatua,
transkripzioa isildua dute, alde batetik, nukleoko DNA oso paketatua dutelako eta,
bestetik, proteinatara itzultzeko makineria galdu dutelako (Miller eta Ostermeier, 2006).
Hala ere, ikusi dugu espermatozoide helduetan opioide- eta kannabinoide-hartzaileen
mRNA agertzen dela. Eta badirudi espermatozoide helduetan agertzen den RNA
espermatogenesian eratutako RNA izan daitekeela baina espermatozoideetan gordeta
mantendu dela (Miller eta lank., 2005).
Espermatozoide helduetan, δ opioide-hartzailearen mRNA ez da agertzen, baina κ-, µ-,
CB1 eta CB2 hartzaileen mRNAk, berriz, agertzen dira. Aldiz, proteinaren azterketa
egitean, argi frogatzen da espermatozoide helduetan aztertutako hartzaile guztiak
daudela. Horrek adieraziko luke opioide- eta kannabinoide-hartzaileen mRNAk eta
proteinak espermatogenesian zehar sortzen direla eta espermatogenesiaren azken
faseetan κ-, µ-, CB1 eta CB2 hartzaileen mRNAk gordeak izan direla baina δ-
hartzailearen mRNA, ostera, andeatu edo zitoplasmarekin batera desagertu dela.
Gainera, ez dirudi zoriz gertatzen den prozesu bat denik, zeren eta erabilitako
gizabanako guztietan agertu baita patroi berdina. Wykes-ek eta lankideek (1997) eta
Ostermeier-ek eta lankideek (2005), besteak beste, hainbat generekin egindako lanetan,
guk aipatutako RNAren andeakuntza edo galera selektiboa deskribatu zuten giza
espermatozoideetan. Lan horietan, andeakuntzatik babestuak dauden RNA-populazio
egonkorrak existitzen direla ondorioztatu zuten. Beraz, δ opioide-hartzailearen mRNA
ondorengo faseetan behar ez delako desagertuko litzateke; aldiz, κ-, µ-, CB1 eta CB2
Doktore-tesia
Eztabaida orokorra eta hipotesiak 108
hartzaileen mRNAk, betebeharren baterako beharrezkoak izan daitekeenez,
espermatozoideetan mantenduko lirateke (Miller eta lank., 2005).
Iradoki da espermatozoide helduetan gordeta geratzen den RNA horrek funtzio bat
baino gehiago izan ditzakeela: (1) kromatinaren paketatzean lagundu; (2) impronta
genomikoan parte hartu (antisense-RNA bezala); (3) proteinatara itzuli mitokondrietako
polisomen bidez; (4) obozitoaren RNA-erreserbekin batera, zigotoaren aktibazioan
lagundu ernalkuntzaren ondoren; eta (5) enbrioiaren patroi espaziala markatu (Miller eta
Ostermeier, 2006).
Ikuspegi aplikatua:
Aurrean aztertutakoaren arabera eta ikuspegi aplikatuari helduz, opioide- eta
kannabinoide-hartzaileen mRNAri dagokionez, interesgarria izan daiteke zenbait gauza
ikertzea:
- Obozitoetan, opioide- eta kannabinoide-hartzaileen mRNA eta proteinen
presentzia azter liteke. Izan ere, deskribatu da obozitoek espresatzen ez dituzten
mRNA batzuk espermatozoideek pasatzen dizkietela eta, agian, horrek aktibatu
dezakeela enbrioiaren garapena (Ostermeier eta lank., 2004). Beraz,
garrantzitsuak al dira guk aztertutako hartzaileen mRNAk enbrioien garapena
aktibatzeko?
- Halaber, aztertzekoa litzateke gizonezko batzuen espermatozoide helduetan
opioide- eta kannabinoide-hartzaileen mRNA eta proteinen presentzia. Zeren
eta, espermatozoideetan gertatzen den mRNAren galera benetan zoriz gertatzen
ez bada, hainbat “mRNA-giltza” aztertuz, gizon ugalkor eta ez-ugalkorren
“mRNA profilak” sortu ahal izango lirateke (Ostermeier eta lank., 2005).
Hortaz, garrantzitsuak al dira guk aztertutako hartzaileen mRNAk enbrioia
bideragarria izateko? Eta, beraz, garrantzitsuak al dira mRNA horiek
ugalkortasun-profilak sortzeko?
- Aurrean aipatutako mRNAren ideia hori egia bada, agian, horrek jatorri
ezezaguneko abortuei buruz zerbait argitu liezaguke.
Doktore-tesia
Eztabaida orokorra eta hipotesiak 109
2. Opioide- eta kannabinoide-hartzaileen kokalekua: beren funtzioaren adierazle?
δ-, κ-, µ-, CB1 eta CB2 hartzaileak espermatozoideen isatsean agertzeak
mugikortasunean parte hartu behar zutela pentsatzera eraman gintuen. Eta, ikusi dugun
bezala, κ opioide-hartzailearentzat susmo hori bete ez den arren, δ-, µ-, CB1 eta CB2
hartzaileek parte hartzen dute mugikortasunaren erregulazioan. Horrek baieztatu egingo
luke Turner-en berrikuspenean (2006) azaldutakoa; hau da, espermatozoideak oso
zelula zatikatuak izanda, proteina bakoitza, funtzio zehatza betetzeko, beharrezkoa den
egituran aurkitzen dela.
Bestalde, hartzaile bakoitzak kokapen-patroi nagusi bat eduki arren, beti agertzen da
espermatozoideen portzentaje bat kokapen-patroi desberdinarekin, agian,
espermatozoideen mintz plasmatikoa egoera-funtzional desberdinean aurkitzen delako,
baina, oraingoz, baieztapen hori ez dugu frogatu.
Ikuspegi aplikatua:
Aurrean aztertutakoaren arabera eta ikuspegi aplikatuari helduz, opioide- eta
kannabinoide-hartzaileen kokapenari dagokionez, interesgarria izan daiteke zenbait
gauza ikertzea:
- Erreakzio akrosomikoan parte hartzen duten proteinek akrosomaren aldean
kokatu behar badute (Turner, 2006), δ-, κ-, eta CB1 hartzaileek, erreakzio
akrosomikoan duten parte-hartzea azter liteke. Horrela bada, garrantzitsuak al
dira aipatutako hartzaileak erreakzio akrosomikoan?
- Obozitoen mintz plasmatikora lotzen diren proteinek espermatozoideen
ekuatorean egon behar badute (Solakidi eta lank., 2005; Turner, 2006), µ- eta
CB2 hartzaileek obozitoaren ezagupenean duten parte-hartzea azter liteke. Beraz,
garrantzitsuak al dira aipatutako hartzaileak obozitoaren ezagupenean?
- Azkenik, interesgarria suerta daiteke hartzaile baten kokapen-patroi
desberdinaren arrazoia zehaztea; izan ere, arrazoi fisiologikoa (espermatozoidea
aktibazio-egoera desberdinean egoteagatik) edo arrazoi patologikoa (hartzailea
Doktore-tesia
Eztabaida orokorra eta hipotesiak 110
leku desegokian kokatu delako) izan daiteke. Beraz, garrantzitsua al da
hartzaileen kokapena aztertzea, ugalkortasunik eza detektatzeko?
3. Opioide eta kannabinoideek espermatozoideen ugaltze-traktuetan zeharreko
bidaia erregulatzen dute?
Espermatozoideak testikuluetan sortzen dira, epididimoan heldu egiten dira eta, plasma
seminalarekin elkartzean, isuri egiten dira. Isuritako hazi hori baginara heltzen da, eta
espermatozoideek igeri egiten dute umetokiaren lepoko mukian gora. Umetokia
zeharkatu ostean, umetoki-tronpara sartzen dira, eta anpulura ailegatzen dira. Ibilbide
horretan espermatozoideak kapazitatu badira, anpuluan ernalketa gertatuko da
(Yanagimachi, 1994). Zeharkatzen duten ingurune bakoitzean, espermatozoideen
aktibazio- eta mugikortasun-patroia aldatuz doa espermatozoideek topatzen duten
mikroingurune bakoitzaren ezaugarri fisiko-kimikoen arabera (Mortimer, 1997). Oro
har, hau onartzen da: plasma seminalean eta umetokian (mikroinguruneak),
espermatozoideak egonkortu eta kapazitazio goiztiarra saihestuko duten molekulak
egongo dira. Gero, espermatozoideak, modu sekuentzialean, umetoki-tronpako
likidoekin, likido folikularrarekin eta granulosako zelulen jariakinekin
(mikroinguruneak) kontaktuan jarriko dira (Schuel eta lank., 2002). Leku horietan,
“kapazitazioaren aurkako” molekulen kontzentrazioa jaitsiz joango da (Cross, 1996) eta
espermatozoideak “erdikapazitazio” egoeran geratuko dira. Obulazioa gertatzean,
espermatzoideak, pixkanaka-pixkanaka, kapazitatuz joango dira ernalketa gertatu ahal
izateko (Mortimer, 1997).
Prozesu horretan guztian molekula askok parte hartzen duten arren, opioide eta
kannabinoideek ere zerikusia dutela espekula daiteke (Jin eta lank., 1988; Wang eta
lank., 2006). Hala, ugaltze-traktuko likidoetan dauden opioide eta kannabinoideen
kontzentrazio-gradienteak ikusita, iradoki dezakegu zer eginkizun bete lezaketen.
1. taulan ikus dezakegunez, espermatozoideak, likido seminalean daudenetik emearen
ugaltze-traktura heldu arte, gero eta AEA-kontzentrazio baxuagoak aurkitzen ditu, eta
horrek ahalbidetuko luke CB1 hartzailearen bidez inhibituak zeuden kapazitazioa eta
mugikortasuna aktibatzea (Maccarrone eta lank., 2005). Gainera, gure datuen arabera,
Doktore-tesia
Eztabaida orokorra eta hipotesiak 111
CB2 hartzailearen bidez inhibitua zegoen mugikortasuna ere aktiba daiteke AEAren
kontzentrazio-jaitsiera progresibo horregatik.
1. taula: Kannabinoide eta opioideen kontzentrazioak animalien gorputz-likidoetan; a) Habayeb eta lank., 2004: gizakian; b) Schuel eta lank., 2002: gizakian; d) Fraioli eta lank., 1984: gizakian; e) Sharp eta Pekary, 1980: gizakian; f) Zalata eta lank., 1995: gizakian; g) Petraglia eta lank., 1986: behian.
β-endorfina (pM)
Met-entzefalina (pM)
AEA (nM)
-
-
1,68 ± 0,16a
0,87 ± 0,09a
Plasma periferikoa♀ ♂
308,5 ± 44,5g39,7 ± 15,5g151 ± 37,7g82,5 ± 37e
12,9 ± 1,2d
44,4f2,8 ± 0,4d
471,5 ± 58,1g29,5 ± 10,1g197,5 ± 43,5g139,2 ± 8d41,3 ± 0,6d
2,9 ± 0,9b10,7 ± 2,5b-12,1 ± 2,1b-
Likido folikularra
Umetoki-tronpa
Umetokia(endometrio)
Likido seminala
β-endorfina (pM)
Met-entzefalina (pM)
AEA (nM)
-
-
1,68 ± 0,16a
0,87 ± 0,09a
Plasma periferikoa♀ ♂
308,5 ± 44,5g39,7 ± 15,5g151 ± 37,7g82,5 ± 37e
12,9 ± 1,2d
44,4f2,8 ± 0,4d
471,5 ± 58,1g29,5 ± 10,1g197,5 ± 43,5g139,2 ± 8d41,3 ± 0,6d
2,9 ± 0,9b10,7 ± 2,5b-12,1 ± 2,1b-
Likido folikularra
Umetoki-tronpa
Umetokia(endometrio)
Likido seminala
Opioideei dagokienez, alde batetik, gizakien likido seminalean eta umetokiko
endometrioan dauden Met-entzefalina eta β-endorfinaren kontzentrazioak odol plasman
daudenak baino handiagoak dira eta, bestetik, Met-entzefalinaren kontzentrazioa, β-
endorfinarena baino handiagoa da (1. taula). Behietan egindako neurketekin ikus
dezakegu, ez dagoela opioideen beheranzko kontzentrazio-gradienterik
(kannabinoideetan bezala); izan ere, umetokiko endometrioan eta likido folikularrean
baino opioide-kontzentrazio txikiagoa dago umetoki-tronpan (1. taula). Beraz,
espermatozoideek, umetoki-tronpara heltzean, opioide-kontzentrazio baxuagoa topatuko
dute, eta horrek hainbat eragin sor dezake espermatozoideetan; adibidez, deskribatu da
opioideek muskulu leunaren uzkurketa inhibitzen dutela (Kilpatrick eta Rosenthal,
1986); beraz, opioide-kontzentrazioa txikiagoa denez, umetoki-tronpako muskuluaren
uzkurketa ez da inhibituko, eta espermatozoideak errazago garraia daitezke. Gainera, µ-
hartzailearen aktibazioa jaitsiko da, eta, dauzkagun datuen arabera, mugikortasunaren
inhibizioa geldituko da. Baina harrigarria da ikustea likido folikularrean opioide-
kontzentrazioa berriro igotzen dela (1. taula) eta, gainera, handitu egiten da β-
endorfinaren kontzentrazioa, batez ere, obulazioa gertatzen denean (Petraglia eta lank.,
1985; Petraglia eta lank., 1987; Facchinetti eta lank., 1988). Beraz, badirudi β-endorfina
garrantzitsua dela obozitoaren garapenerako eta obulaziorako (Petraglia eta lank., 1985),
baina, obulazioa hastean, likido folikularra askatzen da eta umetoki-tronpara doa
(Schuel eta lank., 2002). Beraz, jakin beharko genuke nola eragiten duten opioideek
kapazitazioan eta erreakzio akrosomikoan, zeren eta, hala, ugaltze-traktuko opioideen
kontzentrazio-aldaketen zergatia ulertuko genuke.
Doktore-tesia
Eztabaida orokorra eta hipotesiak 112
Ernalketa gertatu eta gero, enbrioia umetokira garraiatu behar da, eta endometrioan
ezarriko da (Sadler, 2004). Hilekoaren faseetan eta ernaldian zehar umetokiko
endometrioan opioide eta kannabinoideek duten presentzia aztertu dutenean,
kontzentrazio-gradientearen patroi aldakorrak topatu dituzte.
Alde batetik, fase folikularretik fase luteora bitartean, AEAk odolean duen
kontzentrazioa jaisten doa eta FAAHrena handitzen doa (Habayeb eta lank., 2004;
Lazzarin eta lank., 2004). Dena den, ez dago argi kontzentrazio periferiko horiek
eragina duten ugaltze-traktuko kontzentrazioetan (Schuel eta Burkman., 2005). Baina
badirudi umetokiko “AEA-tonuak” zerikusia eduki lezakeela enbrioiaren ezarpenarekin.
Izan ere, ernalduta ez dauden saguen umetokian eta ezargunearen inguruan, AEA-maila
altuenak ikusi dira, eta AEA-maila baxuenak, berriz, enbrioiaren ezargunean eta sagu
ernalduen umetokian (Schmid eta lank., 1997). Gainera, badirudi enbrioiaren FAAH
entzima bidezko mekanismo bat dela (Habayeb eta lank., 2002). Beraz, oro har, AEA-
kontzentrazio baxuak ezarpenean laguntzen du, baina kontzentrazio altua, ordea,
kaltegarria da (Wang eta lank., 2006).
Endometrioan opioideen kontzentrazioa fase folikularretik fase luteoa arte igotzen doa
(1. taula). Gainera, proentzefalinaren mRNAren espresioa asko igotzen da umetokiko
ezargunearen inguruko zeluletan ernalketa aurrera joan ahala, baina, era berean,
txikiagoa da proentzefalinaren mRNA ezargunearen inguruko aldean ezargunearen
aldean baino (Jin eta lank., 1988; Rosen eta lank., 1990). Dena den, β-endorfinaren
mRNA ez da igotzen, eta ez dakigu mRNAren balioak peptido opioidekin bat datozen.
Beraz, oraindik ez dago guztiz argi ezarpenean opioideek duten eginkizuna.
Azaldutako guztiarekin, argi geratzen da sistema opioideak eta kannabinoideak parte
hartzen dutela ugalkortasunaren hainbat faseren erregulazioan.
Ikuspegi aplikatua:
Aztertutakoaren arabera eta ikuspegi aplikatuari helduz, ugaltze-traktuetako hartzaile
eta substantzia opioide eta kannabinoideei dagokienez, interesgarria izan daiteke zenbait
gauza ikertzea:
Doktore-tesia
Eztabaida orokorra eta hipotesiak
Doktore-tesia
113
- Emakumezkoen eta gizonezkoen (batez ere, likido seminala) ugaltze-traktuko
“tonu-opioidea” eta “tonu-kannabinoidea” ugalkortasunik ezarekin erlazionatzen
saiatzea. Opioideen kasuan, gutxien ikertutako peptidoak dinorfinatik eratorriak
dira, eta, kannabinoideen kasuan, 2AG barne-kannabinoideari buruz ia ez da
lanik egin.
- Jarraitzeko, opiazeo eta kannabinoideak aisialdi-droga moduan kontsumitzen
dutenen “ugalkortasun-egoera” azter liteke, zeren eta, odolean ez ezik agian
ugaltze-traktuan ere, opioide eta kannabinoideen tonu-aldaketak gerta
baitaitezke.
- Ildo beretik jarraituz, aztertzekoa litzateke opiazeo edo kannabinoideen erabilera
klinikoak ugalkortasunean ekar ditzakeen aldaketak.
- Azkenik, substantzia opioide eta kannabinoideek hartzaileen bidez eragiten
dutenez, ugaltze-traktuetako ehun eta zeluletako opioide- eta kannabinoide-
hartzaile mota bakoitzaren presentzia eta kopurua azter liteke eta ugalkortasunik
ezarekin erlazionatu liteke.
Azkenaldian, asko ikertzen ari da kannabinoideek ugaltze-prozesuan duten eginkizuna
eta hainbat ikerlari berrikuspen asko egiten ari dira. Aldiz, opioideek ugaltze-prozesuan
duten eginkizunaren ikerketa alboratua geratu da, eta ona litzateke 1980ko hamarkadako
lanak berreskuratu eta berrikuspen zabala egitea. Hala ere, eta bukatzeko, oso zaila da
sistema bakar batek edo bik ugalkortasunik ezaren edo ugalkortasunaren arrakastaren
zergatia azaltzea. Nolanahi ere, pauso bat izan liteke sistema horien eginkizunak
aztertzea eta konparatzea, ugaltze-prozesuaren orokortasuna ulertzeko.
Ondorioak
Ondorioak 117
1. Espermatozoide helduetan, κ eta µ opioide-hartzaileen mRNA agertzen da. Aldiz, δ
opioide-hartzailearen mRNA ez da agertzen zelula horietan.
2. Espermatozoide helduetan, δ, κ eta µ opioide-hartzaileen proteina dago, eta, isatsean
eta tarteko zatian kokatzeaz gainera, espermatozoideen buruan era bereizgarrian
kokatzen dira: buruaren aurrealdean, aurrean eta atzealdean eta atzealdean, hurrenez
hurren.
3. µ opioide-hartzailearen agonista morfina 10-7 M-ak, 3,5 orduan, modu adierazgarrian
jaisten du a+b motako mugikortasuna duten espermatozoideen ehunekoa. Horren
ondorioz, handitu egiten da espermatozoide geldien kopurua. Aldiz, µ opioide-
hartzailearen antagonista naloxona 10-4 M-ak saihestu egiten du efektu hori.
4. δ opioide-hartzailearen agonista DPDPEk ez du eraginik sortzen espermatozoideen
denboran zeharreko mugikortasunean. Aitzitik, naltrindol antagonista 10-4 M-ak,
ingurunera gehitu eta berehala, a eta b motako espermatozoideen ehunekoak modu
adierazgarrian jaisten ditu eta, horren ondorioz, igo egiten da espermatozoide geldien
ehunekoa.
5. κ opioide-hartzailearen agonista U-50488ak eta antagonista nor-binaltorfiminak ez
dute eraginik sortzen espermatozoideen denboran zeharreko mugikortasunean.
6. Espermatozoide helduetan, CB1 eta CB2 kannabinoide-hartzaileen mRNA agertzen
da.
7. Espermatozoide helduetan, CB1 eta CB2 kannabinoide-hartzaileen proteina dago eta,
isatsean eta tarteko zatian kokatzeaz gainera, espermatozoideen buruan era bereizgarrian
kokatzen dira: CB1, batez ere, buruaren aurrealdean eta CB2, batik bat, buruaren
atzealdean.
8. ACEAk, CB1 kannabinoide-hartzailearen agonista espezifikoak, a motako
espermatozoideen ehunekoa denboraren eta dosiaren menpe jaisten du, eta, horren
ondorioz, espermatozoide geldien ehunekoa igotzen du. Bestalde, CB1 antagonista SR
Doktore-tesia
Ondorioak
Doktore-tesia
118
141716 10-5M-ak, ACEArekin batera inkubatzean, agonista horren efektu negatiboa
indartzen du.
9. JWH-015ak, CB2 kannabinoide-hartzailearen agonista espezifikoak, a motako
espermatozoideen ehunekoa denboraren eta dosiaren menpe jaisten du, eta, horren
ondorioz, b motako espermatozoideen ehunekoa igotzen du. Aldiz, CB2 antagonista SR
144528ak, JWH-015-arekin batera inkubatzean, saihestu egiten du agonista horren
efektua.
Bibliografia
Bibliografia 121
Ahmed M. S., Zhou D. H., Cavinato A. G., Maulik D.: Opioid Binding-Properties of the Purified Kappa-Receptor from Human-Placenta. Life Sciences 1989, 44(13):861-871.
Aiudi G., Albrizio M., Guaricci A. C., Centoducati G., Minoia P.: Localization of
mu, delta, and kappa opioid receptors on Sparus aurata and Dicentrarchus labrax sperm cells. Book of abstracts of the Aquaculture Europe 2004, Barcelona, Spain, 2004, p 102
Albrizio M., Guaricci A. C., Maritato F., Sciorsci R. L., Mari G., Calamita G.,
Lacalandra G. M., Aiudi G. G., Minoia R., Dell'Aquila M. E., Minoia P.: Expression and subcellular localization of the mu-opioid receptor in equine spermatozoa: evidence for its functional role. Reproduction 2005, 129(1):39-49.
Albrizio M., Guaricci A. C., Calamita G., Zarrilli A., Minoia P.: Expression and
immunolocalization of the mu-opioid receptor in human sperm cells. Fertil Steril 2006, 86(6):1776-1779.
Álvarez C.: Análisis integrado de morfología y movilidad espermática humana
con el uso del Sperm Class Analyzer. Tesis Doctoral. Servei de publicacions. Universitat de València, València; 2003.
Ammer H., Schulz R.: Chronic morphine treatment increases stimulatory beta-2
adrenoceptor signaling in A431 cells stably expressing the mu opioid receptor. J Pharmacol Exp Ther 1997, 280(1):512-520.
Aquila S., Sisci D., Gentile M., Middea E., Catalano S., Carpino A., Rago V., Ando
S.: Estrogen receptor (ER)alpha and ER beta are both expressed in human ejaculated spermatozoa: evidence of their direct interaction with phosphatidylinositol-3-OH kinase/Akt pathway. J Clin Endocrinol Metab 2004, 89(3):1443-1451.
Arienti G., Carlini E., Verdacchi R., Cosmi E. V., Palmerini C. A.: Prostasome to
sperm transfer of CD13/aminopeptidase N (EC 3.4.11.2). Biochim Biophys Acta 1997a, 1336(3):533-538.
Arienti G., Polci A., Carlini E., Palmerini C. A.: Transfer of CD26/dipeptidyl
peptidase IV (E.C. 3.5.4.4) from prostasomes to sperm. FEBS Lett 1997b, 410(2-3):343-346.
Arvidsson U., Riedl M., Chakrabarti S., Vulchanova L., Lee J. H., Nakano A. H.,
Lin X. Q., Loh H. H., Law P. Y., Wessendorf M. W., Elde R.: The Kappa-Opioid Receptor Is Primarily Postsynaptic - Combined Immunohistochemical Localization of the Receptor and Endogenous Opioids. Proc Natl Acad Sci USA 1995, 92(11):5062-5066.
Ashton J. C., Friberg D., Darlington C. L., Smith P. F.: Expression of the
cannabinoid CB2 receptor in the rat cerebellum: An immunohistochemical study. Neurosci Lett 2006, 396(2):113-116.
Doktore-tesia
Bibliografia 122
Baccetti B., Burrini A. G., Collodel G., Falugi C., Moretti E., Piomboni P.: Localization of 2 Classes of Acetylcholine Receptor-Like Molecules in Sperms of Different Animal Species. Zygote 1995, 3(3):207-217.
Baker D., Pryce G., Davies W. L., Hiley C. R.: In silico patent searching reveals a
new cannabinoid receptor. Trends Pharmacol Sci 2006, 27(1):1-4. Baldi E., Luconi M., Bonaccorsi L., Forti G.: Signal transduction pathways in
human spermatozoa. J Reprod Immunol 2002, 53(1-2):121-131. Bandivdekar A. H., Segal S. J., Koide S. S.: Demonstration of Serotonin Receptors
in Isolated Spisula Oocyte Membrane. Invertebr Reprod Dev 1991, 19(2):147-150. Basuray R., Dejonge C., Zaneveld L. J. D.: Evidence for a Role of Cysteinyl
Leukotrienes in Mouse and Human Sperm Function. J Androl 1990, 11(1):47-51. Bedford J. M.: Significance of the Need for Sperm Capacitation before
Fertilization in Eutherian Mammals. Biol Reprod 1983, 28(1):108-120. Begg M., Pacher P., Batkai S., Osei-Hyiaman D., Offertaler L., Mo F. M., Liu H.,
Kunos G.: Evidence for novel cannabinoid receptors. Pharmacol Therapeut 2005, 106(2):133-145.
Beltramo M., Stella N., Calignano A., Lin S. Y., Makriyannis A., Piomelli D.:
Functional role of high-affinity anandamide transport, as revealed by selective inhibition. Science 1997, 277(5329):1094-1097.
Berdyshev E. V.: Inhibition of sea urchin fertilization by fatty acid ethanolamides
and cannabinoids. Comp Biochem Phys C 1999, 122(3):327-330. Blazquez C., Casanova M. L., Planas A., del Pulgar T. G., Villanueva C.,
Fernandez-Acenero M. J., Aragones J., Huffman J. W., Jorcano J. L., Guzman M.: Inhibition of tumor angiogenesis by cannabinoids. FASEB J 2003, 17(1):529-531.
Blazquez C., Carracedo A., Barrado L., Real P. J., Fernandez-Luna J. L., Velasco
G., Malumbres M., Guzman M.: Cannabinoid receptors as novel targets for the treatment of melanoma. FASEB J 2006, 20(14):2633-2635.
Boerke A., Dieleman S. J., Gadella B. M.: A possible role for sperm RNA in early
embryo development. Theriogenology 2007, 68:S147-S155. Bonhaus D. W., Chang L. K., Kwan J., Martin G. R.: Dual activation and
inhibition of adenylyl cyclase by cannabinoid receptor agonists: Evidence for agonist-specific trafficking of intracellular responses. J Pharmacol Exp Ther 1998, 287(3):884-888.
Borner C., Kraus J., Schroder H., Ammer H., Hollt V.: Transcriptional regulation
of the human mu-opioid receptor gene by interleukin-6. Mol Pharmacol 2004, 66(6):1719-1726.
Doktore-tesia
Bibliografia 123
Borner C., Hollt V., Kraus J.: Cannabinoid receptor type 2 Agonists induce transcription of the mu-opioid receptor gene in Jurkat T cells. Mol Pharmacol 2006, 69(4):1486-1491.
Borner C., Hollt V., Sebald W., Kraus J.: Transcriptional regulation of the
cannabinoid receptor type 1 gene in T cells by cannabinoids. J Leukocyte Biol 2007, 81(1):336-343.
Bradford M. M.: Rapid and Sensitive Method for Quantitation of Microgram
Quantities of Protein Utilizing Principle of Protein-Dye Binding. Analytical Biochemistry 1976, 72(1-2):248-254.
Browder L. W., Erickson, C. A., Jeffery, W. R.: Developmental Biology, 3.
argitalpena. Saunders College Publishing argitaletxea, New York; 1991. Brown S. M., Wager-Miller J., Mackie K.: Cloning and molecular characterization
of the rat CB2 cannabinoid receptor. Biochim Biophys Acta 2002, 1576(3):255-264. Buckley N. E., Hansson S., Harta G., Mezey E.: Expression of the CB1 and CB2
receptor messenger RNAs during embryonic development in the rat. Neuroscience 1998, 82(4):1131-1149.
Burkman L. J.: Characterization of Hyperactivated Motility by Human-
Spermatozoa During Capacitation - Comparison of Fertile and Oligozoospermic Sperm Populations. Arch Andrology 1984, 13(2-3):153-165.
Cabral G. A., Harmon K. N., Carlisle S. J.: Cannabinoid-mediated inhibition of
inducible nitric oxide production by rat microglial cells: Evidence for CB1 receptor participation. Adv Exp Med Biol 2001, 493:207-214.
Carracedo A., Gironella M., Lorente M., Garcia S., Guzman M., Velasco G.,
Iovanna J. L.: Cannabinoids induce apoptosis of pancreatic tumor cells via endoplasmic reticulum stress-related genes. Cancer Research 2006a, 66(13):6748-6755.
Carracedo A.: Acción antitumoral de los cannabinoides: implicación de p8 y la
vía de estrés de retículo endoplásmico. Tesis Doctoral. Universidad Complutense de Madrid, Madrid; 2006b.
Chakrabarti S., Yang W. L., Law P. Y., Loh H. H.: The mu-opioid receptor down-
regulates differently from the delta-opioid receptor: Requirement of a high affinity receptor G protein complex formation. Mol Pharmacol 1997, 52(1):105-113.
Chang M. C., Berkery D., Schuel R., Laychock S. G., Zimmerman A. M.,
Zimmerman S., Schuel H.: Evidence for a cannabinoid receptor in sea urchin sperm and its role in blockade of the acrosome reaction. Mol Reprod Dev 1993, 36(4):507-516.
Chang K. J., Hazum E., Cuatrecasas P.: Novel Opiate Binding-Sites Selective for
Benzomorphan Drugs. P Natl Acad Sci-Biol 1981, 78(7):4141-4145.
Doktore-tesia
Bibliografia 124
Chen Y., Mestek A., Liu J., Yu L.: Molecular-Cloning of a Rat Kappa-Opioid Receptor Reveals Sequence Similarities to the Mu-Opioid and Delta-Opioid Receptors. Biochem J 1993, 295:625-628.
Christoffers K. H., Li H., Keenan S. A., Howells R. D.: Purification and mass
spectrometric analysis of the mu opioid receptor. Mol Brain Res 2003, 118(1-2):119-131.
Christoffers K. H., Li H., Howells R. D.: Purification and mass spectrometric
analysis of the delta opioid receptor. Mol Brain Res 2005, 136(1-2):54-64. Cicero T. J., Meyer E. R., Wiest W. G., Olney J. W., Bell R. D.: Effects of Chronic
Morphine Administration on Reproductive-System of Male Rat. J Pharmacol Exp Ther 1975, 192(3):542-548.
Claude P. A., Wotta D. R., Zhang X. H., Prather P. L., McGinn T. M., Erickson L.
J., Loh H. H., Law P. Y.: Mutation of a conserved serine in TM4 of opioid receptors confers full agonistic properties to classical antagonists. Proc Natl Acad Sci USA 1996, 93(12):5715-5719.
Cobellis G., Cacciola G., Scarpa D., Meccariello R., Chianese R., Franzoni M. F.,
Mackie K., Pierantoni R., Fasano S.: Endocannabinoid system in frog and rodent testis: type-1 cannabinoid receptor and fatty acid amide hydrolase activity in male germ cells. Biol Reprod 2006, 75(1):82-89.
Comb M., Seeburg P. H., Adelman J., Eiden L., Herbert E.: Primary Structure of
the Human Met-Enkephalin and Leu-Enkephalin Precursor and Its Messenger-Rna. Nature 1982, 295(5851):663-666.
Corchero J., Romero J., Berrendero F., Fernandez-Ruiz J., Ramos J. A., Fuentes J.
A., Manzanares J.: Time-dependent differences of repeated administration with Delta(9)-tetrahydrocannabinol in proenkephalin and cannabinoid receptor gene expression and G-protein activation by mu-opioid and CB1-cannabinoid receptors in the caudate-putamen. Mol Brain Res 1999, 67(1):148-157.
Cosentino M. J., Cockett A. T.: Structure and function of the epididymis. Urol Res
1986, 14(5):229-240. Cota D., Marsicano G., Lutz B., Vicennati V., Stalla G. K., Pasquali R., Pagotto U.:
Endogenous cannabinoid system as a modulator of food intake. Int J Obesity 2003, 27(3):289-301.
Crain S. M., Shen K. F.: Opioids Can Evoke Direct Receptor-Mediated Excitatory
Effects on Sensory Neurons. Trends Pharmacol Sci 1990, 11(2):77-81. Cravatt B. F., Demarest K., Patricelli M. P., Bracey M. H., Giang D. K., Martin B.
R., Lichtman A. H.: Supersensitivity to anandamide and enhanced endogenous cannabinoid signaling in mice lacking fatty acid amide hydrolase. Proc Natl Acad Sci USA 2001, 98(16):9371-9376.
Doktore-tesia
Bibliografia 125
Cross N. L.: Human seminal plasma prevents sperm from becoming acrosomally responsive to the agonist, progesterone: cholesterol is the major inhibitor. Biol Reprod 1996, 54(1):138-145.
Croxford J. L., Yamamura T.: Cannabinoids and the immune system: Potential for
the treatment of inflammatory diseases? J Neuroimmunol 2005, 166(1-2):3-18. Davidson A., Vermesh M., Paulson R. J., Graczykowski J. W., Lobo R. A.:
Presence of immunoreactive beta-endorphin and calcitonin in human seminal plasma, and their relation to sperm physiology. Fertil Steril 1989, 51(5):878-880.
De Jesus M. L., Salles J., Meana J. J., Callado L. F.: Characterization of CB1
cannabinoid receptor immunoreactivity in postmortem human brain homogenates. Neuroscience 2006, 140(2):635-643.
de Miguel R., Romero J., Munoz R. M., Garcia-Gil L., Gonzalez S., Villanua M. A.,
Makriyannis A., Ramos J. A., Fernandez-Ruiz J. J.: Effects of cannabinoids on prolactin and gonadotrophin secretion: involvement of changes in hypothalamic gamma-aminobutyric acid (GABA) inputs. Biochem Pharmacol 1998, 56(10):1331-1338.
Devane W. A., Hanus L., Breuer A., Pertwee R. G., Stevenson L. A., Griffin G.,
Gibson D., Mandelbaum A., Etinger A., Mechoulam R.: Isolation and Structure of a Brain Constituent That Binds to the Cannabinoid Receptor. Science 1992, 258(5090):1946-1949.
Di Carlo G., Izzo A. A.: Cannabinoids for gastrointestinal diseases: potential
therapeutic applications. Expert Opin Inv Drug 2003, 12(1):39-49. Di Marzo V.: 'Endocannabinoids' and other fatty acid derivatives with
cannabimimetic properties: biochemistry and possible physiopathological relevance. Bba-Lipid Lipid Met 1998, 1392(2-3):153-175.
Dimarzo V., Fontana A., Cadas H., Schinelli S., Cimino G., Schwartz J. C., Piomelli
D.: Formation and Inactivation of Endogenous Cannabinoid Anandamide in Central Neurons. Nature 1994, 372(6507):686-691.
Dinh T. P., Carpenter D., Leslie F. M., Freund T. F., Katona I., Sensi S. L., Kathuria
S., Piomelli D.: Brain monoglyceride lipase participating in endocannabinoid inactivation. Proc Natl Acad Sci USA 2002, 99(16):10819-10824.
Dudeck W. R., Fix J. D.: High-Yield (Embryology) 3. argitalpena. Lippincott
Williams & Wilkins argitaletxea, Philadelphia; 2004. El-Haggar S., El-Ashmawy S., Attia A., Mostafa T., Roaiah M. M. F., Fayez A.,
Ghazi S., Zohdy W., Roshdy N.: Beta-endorphin in serum and seminal plasma in infertile men. Asian J Androl 2006, 8(6):709-712.
Elde R., Arvidsson U., Riedl M., Vulchanova L., Lee J. H., Dado R., Nakano A.,
Chakrabarti S., Zhang X., Loh H. H., Law P. Y., Hokfelt T., Wessendorf M.:
Doktore-tesia
Bibliografia 126
Distribution of Neuropeptide Receptors - New Views of Peptidergic Neurotransmission Made Possible by Antibodies to Opioid Receptors. Ann Ny Acad Sci 1995, 757:390-404.
ElSohly M. A., Slade D.: Chemical constituents of marijuana: The complex
mixture of natural cannabinoids. Life Sciences 2005, 78(5):539-548. Fabbri A., Tsaimorris C. H., Luna S., Fraioli F., Dufau M. L.: Opiate Receptors Are
Present in the Rat Testis - Identification and Localization in Sertoli Cells. Endocrinology 1985, 117(6):2544-2546.
Fabbri A., Jannini E. A., Gnessi L., Ulisse S., Moretti C., Isidori A.:
Neuroendocrine control of male reproductive function. The opioid system as a model of control at multiple sites. J Steroid Biochem 1989, 32(1B):145-150.
Facchinetti F., Storchi A. R., Petraglia F., Volpe A., Genazzani A. R.: Expression of
Proopiomelanocortin-Related Peptides in Human Follicular-Fluid. Peptides 1988, 9(5):1089-1092.
Fang L., Knapp R. J., Horvath R., Matsunaga T. O., Haaseth R. C., Hruby V. J.,
Porreca F., Yamamura H. I.: Characterization of [H-3] Naltrindole Binding to Delta-Opioid Receptors in Mouse-Brain and Mouse Vas-Deferens - Evidence for Delta-Opioid Receptor Heterogeneity. J Pharmacol Exp Ther 1994, 268(2):836-846.
Fattore L., Deiana S., Spano S. M., Cossu G., Fadda P., Scherma M., Fratta W.:
Endocannabinoid system and opioid addiction: Behavioural aspects. Pharmacol Biochem Be 2005, 81(2):343-359.
Fernandez D., Valdivia A., Irazusta J., Ochoa C., Casis L.: Peptidase activities in
human semen. Peptides 2002, 23(3):461-468. Fields A., Same Y.: The stimulatory effect of opioids on cyclic amp production in
SK-N-SH cells is mediated by calcium ions. Life Sciences 1997, 61(6):595-602. Filppula S., Yaddanapudi S., Mercier R., Xu W., Pavlopoulos S., Makriyannis A.:
Purification and mass spectroscopic analysis of human CB2 cannabinoid receptor expressed in the baculovirus system. J Pept Res 2004, 64(6):225-236.
Flesch F. M., Colenbrander B., van Golde L. M., Gadella B. M.: Capacitation
induces tyrosine phosphorylation of proteins in the boar sperm plasma membrane. Biochem Biophys Res Commun 1999, 262(3):787-792.
Flesch F. M., Gadella B. M.: Dynamics of the mammalian sperm plasma
membrane in the process of fertilization. Biochim Biophys Acta 2000, 1469(3):197-235.
Florez J.: Farmacología humana, 3. argitalpena, Masson argitaletxea. Barcelona;
1998.
Doktore-tesia
Bibliografia 127
Focarelli R., Giuffrida A., Capparelli S., Scibona M., Fabris F. M., Francavilla F., Francavilla S., Giovampaola C. D., Rosati F.: Specific localization in the equatorial region of gp20, a 20 kDa sialylglycoprotein of the capacitated human spermatozoon acquired during epididymal transit which is necessary to penetrate zona-free hamster eggs. Mol Hum Reprod 1998, 4(2):119-125.
Foresta C., Tramarin A., Scandellari C., Arslan P.: Effects of a met-enkephalin
analogue on motility, O2 consumption, and ATP content of human spermatozoa. Arch Androl 1985, 14(2-3):247-252.
Foresta C., Caretto A., Indino M., Betterle C., Scandellari C.: Localization of met-
enkephalin on human spermatozoa and evidence for its physiological role. Arch Androl 1986, 17(1):19-24.
Fraioli F., Fabbri A., Gnessi L., Silvestroni L., Moretti C., Redi F., Isidori A.: Beta-
endorphin, Met-enkephalin, and calcitonin in human semen: evidence for a possible role in human sperm motility. Ann N Y Acad Sci 1984, 438:365-370.
Fraser L. R., Adeoya-Osiguwa S.: Modulation of adenylyl cyclase by FPP and
adenosine involves stimulatory and inhibitory adenosine receptors and G proteins. Mol Reprod Dev 1999, 53(4):459-471.
Fujisawa M., Kanzaki M., Okada H., Arakawa S., Kamidono S.: Metenkephalin in
seminal plasma of infertile men. Int J Urol 1996, 3(4):297-300. Fukuda K., Kato S., Mori K.: Location of Regions of the Opioid Receptor Involved
in Selective Agonist Binding. J Biol Chem 1995, 270(12):6702-6709. Galiegue S., Mary S., Marchand J., Dussossoy D., Carriere D., Carayon P.,
Bouaboula M., Shire D., Le Fur G., Casellas P.: Expression of central and peripheral cannabinoid receptors in human immune tissues and leukocyte subpopulations. Eur J Biochem 1995, 232(1):54-61.
Gammon C. M., Freeman G. M., Xie W. H., Petersen S. L., Wetsel W. C.:
Regulation of gonadotropin-releasing hormone secretion by cannabinoids. Endocrinology 2005, 146(10):4491-4499.
Gaoni Y., Mechoulam R.: Isolation Structure + Partial Synthesis of Active
Constituent of Hashish. J Am Chem Soc 1964, 86(8):1646-1647 Gatti J. L., Castella S., Dacheux F., Ecroyd H., Metayer S., Thimon V., Dacheux J.
L.: Post-testicular sperm environment and fertility. Anim Reprod Sci 2004, 82-83:321-339.
Gerendai I.: Modulation of testicular functions by testicular opioid peptides. J
Physiol Pharmacol 1991, 42(4):427-437. Giang D. K., Cravatt B. F.: Molecular characterization of human and mouse fatty
acid amide hydrolases. Proc Natl Acad Sci USA 1997, 94(6):2238-2242.
Doktore-tesia
Bibliografia 128
Giri M., Kaufman J. M.: Opioidergic Modulation of in-Vitro Pulsatile Gonadotropin-Releasing-Hormone Release from the Isolated Medial Basal Hypothalamus of the Male Guinea-Pig. Endocrinology 1994, 135(5):2137-2143.
Glaser S. T., Abumrad N. A., Fatade F., Kaczocha M., Studholme K. M., Deutsch
D. G.: Evidence against the presence of an anandamide transporter. Proc Natl Acad Sci USA 2003, 100(7):4269-4274.
Goldberg I. E., Rossi G. C., Letchworth S. R., Mathis J. P., Ryan-Moro J.,
Leventhal L., Su W., Emmel D., Bolan E. A., Pasternak G. W.: Pharmacological characterization of endomorphin-1 and endomorphin-2 in mouse brain. J Pharmacol Exp Ther 1998, 286(2):1007-1013.
Golech S. A., McCarron R. M., Chen Y., Bembry J., Lenz F., Mechoulam R.,
Shohami E., Spatz M.: Human brain endothelium: coexpression and function of vanilloid and endocannabinoid receptors. Mol Brain Res 2004, 132(1):87-92.
Guyton A.C., Hall J. E.: Tratado de fisiología médica, 9. argitalpena. McGraw-Hill
interamericana argitaletxea, Madrid; 1997. Gye M. C., Kang H. H., Kang H. J.: Expression of cannabinoid receptor 1 in
mouse testes. Arch Androl 2005, 51(3):247-255. Habayeb O. M. H., Bell S. C., Konje J. C.: Endogenous cannabinoids: Metabolism
and their role in reproduction. Life Sciences 2002, 70(17):1963-1977. Habayeb O. M. H., Taylor A. H., Evans M. D., Cooke M. S., Taylor D. J., Bell S.
C., Konje J. C.: Plasma levels of the endocannabinoid anandamide in women - A potential role in pregnancy maintenance and labor? J Clin Endocr Metab 2004, 89(11):5482-5487.
Harclerode J.: Endocrine effects of marijuana in the male: preclinical studies.
NIDA Res Monogr 1984, 44:46-64. Harrison R. A. P.: Capacitation mechanisms, and the role of capacitation as seen
in eutherian mammals. Reprod Fert Develop 1996, 8(4):581-594. Hembree W., Nahas G., Zeidenberg P.: Oligospermia in Cannabis Smokers. Sem
Hop Therapeut 1976, 52(7-8):425-425. Herkenham M., Lynn A. B., Little M. D., Johnson M. R., Melvin L. S., Decosta B.
R., Rice K. C.: Cannabinoid Receptor Localization in Brain. Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87(5):1932-1936.
Herrera B., Carracedo A., Diez-Zaera M., Guzman M., Velasco G.: P38 MAPK is
involved in CB2 receptor-induced apoptosis of human leukaemia cells. FEBS Lett 2005, 579(22):5084-5088.
Doktore-tesia
Bibliografia 129
Herrera B., Carracedo A., Diez-Zaera M., del Pulgar T. G., Guzman M., Velasco G.: The CB2 cannabinoid receptor signals apoptosis via ceramide-dependent activation of the mitochondrial intrinsic pathway. Exp Cell Res 2006, 312(11):2121-2131.
Hillard C. J., Edgemond W. S., Jarrahian A., Campbell W. B.: Accumulation of N-
arachidonoylethanolamine (anandamide) into cerebellar granule cells occurs via facilitated diffusion. J Neurochem 1997, 69(2):631-638.
Hillard C. J., Jarrahian A.: Cellular accumulation of anandamide: consensus and
controversy. Brit J Pharmacol 2003, 140(5):802-808. Hollandmoritz H., Krause W.: Semen Analysis and Fertility Prognosis in
Andrological Patients. International J Androl 1992, 15(6):473-484. Hong C. Y., Desaintonge D. M. C., Turner P., Fairbairn J. W.: Comparison of the
Inhibitory-Action of Delta-9-Tetrahydrocannabinol and Petroleum Spirit Extract of Herbal Cannabis on Human-Sperm Motility. Hum Toxicol 1982, 1(2):151-154.
Howlett A. C., Barth F., Bonner T. I., Cabral G., Casellas P., Devane W. A., Felder
C. C., Herkenham M., Mackie K., Martin B. R., Mechoulam R., Pertwee R. G.: International Union of Pharmacology. XXVII. Classification of cannabinoid receptors. Pharmacol Rev 2002, 54(2):161-202.
Hughes J., Kosterlitz H. W.: Opioid-Peptides - Introduction. Brit Med Bull 1983,
39(1):1-3. Hunter J. C., Leighton G. E., Meecham K. G., Boyle S. J., Horwell D. C., Rees D.
C., Hughes J.: Ci-977, a Novel and Selective Agonist for the Kappa-Opioid Receptor. Brit J Pharmacol 1990, 101(1):183-189.
Ignotz G. G., Suarez S. S.: Calcium/calmodulin and calmodulin kinase II
stimulate hyperactivation in demembranated bovine sperm. Biol Reprod 2005, 73(3):519-526.
Inaba K.: Molecular architecture of the sperm flagella: Molecules for motility and
signaling. Zool Sci 2003, 20(9):1043-1056. Irazusta J., Valdivia A., Fernandez D., Agirregoitia E., Ochoa C., Casis L.:
Enkephalin-degrading enzymes in normal and subfertile human semen. J Androl 2004, 25(5):733-739.
Iversen L. L.: Overview: peptides in the nervous system. Neuropeptides and their
peptidases-ean. Turner A. J. Ellis Horwood Ltd. argitaletxea, Chichester; 1987. Jenab S., Morris P. L.: Interleukin-6 regulation of kappa opioid receptor gene
expression in primary Sertoli cells. Endocrine 2000, 13(1):11-15. Jequier A. M., Crich J.: Semen analysis: a practical guide. Blackwell Scientific
publications, Oxford; 1986.
Doktore-tesia
Bibliografia 130
Jin D. F., Muffly K. E., Okulicz W. C., Kilpatrick D. L.: Estrous Cycle-Related and Pregnancy-Related Differences in Expression of the Proenkephalin and Proopiomelanocortin Genes in the Ovary and Uterus. Endocrinology 1988, 122(4):1466-1471.
Jordan B., Devi L. A.: Molecular mechanisms of opioid receptor signal
transduction. Brit J Anaesth 1998, 81(1):12-19. Jordan B. A., Cvejic S., Devi L. A.: Opioids and their complicated receptor
complexes. Neuropsychopharmacology 2000, 23(4):S5-S18. Jordan B. A., Trapaidze N., Gomes I., Nivarthi R., Devi L. A.: Oligomerization of
opioid receptors with beta(2)-adrenergic receptors: A role in trafficking and mitogen-activated protein kinase activation. Proc Natl Acad Sci USA 2001, 98(1):343-348.
Kakidani H., Furutani Y., Takahashi H., Noda M., Morimoto Y., Hirose T., Asai M.,
Inayama S., Nakanishi S., Numa S.: Cloning and Sequence-Analysis of Cdna for Porcine Beta-Neo-Endorphin Dynorphin Precursor. Nature 1982, 298(5871):245-249.
Kalra S. P., Allen L. G., Sahu A., Kalra P. S., Crowley W. R.: Gonadal-Steroids
and Neuropeptide-Y Opioid Lhrh Axis - Interactions and Diversities. J Steroid Biochem Mol Biol 1988, 30(1-6):185-193.
Kaminski N. E., Abood M. E., Kessler F. K., Martin B. R., Schatz A. R.:
Identification of a Functionally Relevant Cannabinoid Receptor on Mouse Spleen-Cells That Is Involved in Cannabinoid-Mediated Immune Modulation. Mol Pharmacol 1992, 42(5):736-742.
Kew D., Muffly K. E., Kilpatrick D. L.: Proenkephalin products are stored in the
sperm acrosome and may function in fertilization. Proc Natl Acad Sci U S A 1990, 87(23):9143-9147.
Kilpatrick D. L., Rosenthal J. L.: The Proenkephalin Gene Is Widely Expressed
within the Male and Female Reproductive Systems of the Rat and Hamster. Endocrinology 1986, 119(1):370-374.
Kraemer M., Fillion C., Martin-Pont B., Auger J.: Factors influencing human
sperm kinematic measurements by the Celltrak computer-assisted sperm analysis system. Hum Reprod 1998, 13(3):611-619.
Kraus J., Borner C., Giannini E., Hollt V.: The role of nuclear factor kappa B in
tumor necrosis factor-regulated transcription of the human mu-opioid receptor gene. Mol Pharmacol 2003, 64(4):876-884.
Kumar G., Patel D., Naz R. K.: C-Myc Messenger-Rna Is Present in Human
Sperm Cells. Cell Mol Biol Res 1993, 39(2):111-117. Lauckner J. E., Hille B., Mackie K.: The cannabinoid agonist WIN55,212-2
increases intracellular calcium via CB1 receptor coupling to G(q/11) G proteins. Proc Natl Acad Sci USA 2005, 102(52):19144-19149.
Doktore-tesia
Bibliografia 131
Lawrence D. K., Gill E. W.: Effects of Delta1-Tetrahydrocannabinol and Other
Cannabinoids on Spin-Labeled Liposomes and Their Relationship to Mechanisms of General Anesthesia. Mol Pharmacol 1975, 11(5):595-602.
Lee C. Y. G., Ho J., Chow S. N., Yasojima K., Schwab C., McGeer P. L.:
Immunoidentification of gonadotropin releasing hormone receptor in human sperm, pituitary and cancer cells. Am J Reprod Immunol 2000, 44(3):170-177.
Lemaire S., Magnan J., Regoli D.: Rat Vas-Deferens - Specific Bioassay for
Endogenous Opioid Peptides. Brit J Pharmacol 1978, 64(3):327-329. Leslie F. M.: Methods Used for the Study of Opioid Receptors. Pharmacol Rev
1987, 39(3):197-249. Leung D., Saghatelian A., Simon G. M., Cravatt B. F.: Inactivation of N-acyl
phosphatidylethanolamine phospholipase D reveals multiple mechanisms for the biosynthesis of endocannabinoids. Biochemistry 2006, 45(15):4720-4726.
Liu J., Gao B., Mirshahi F., Sanyal A. J., Khanolkar A. D., Makriyannis A., Kunos
G.: Functional CB1 cannabinoid receptors in human vascular endothelial cells. Biochem J 2000, 346:835-840.
Lord J. A. H., Waterfield A. A., Hughes J., Kosterlitz H. W.: Endogenous Opioid
Peptides - Multiple Agonists and Receptors. Nature 1977, 267(5611):495-499.
Lorenzo P, Ladero J. M., Leza J. C., Lizasoain I.: Drogodependencias. Panamericana argitaletxea, Madrid; 1999.
Luconi M., Bonaccorsi L., Maggi N., Pecchioli P., Krausz C., Forti G., Baldi E.:
Identification and characterization of functional nongenomic progesterone receptors on human sperm membrane. J Clin Endocr Metab 1998, 83(3):877-885.
Maccarrone M., Cecconi S., Rossi G., Battista N., Pauselli R., Finazzi-Agro A.:
Anandamide activity and degradation are regulated by early postnatal aging and follicle-stimulating hormone in mouse Sertoli cells. Endocrinology 2003, 144(1):20-28.
Maccarrone M., Barboni B., Paradisi A., Bernabo N., Gasperi V., Pistilli M. G.,
Fezza F., Lucidi P., Mattioli M.: Characterization of the endocannabinoid system in boar spermatozoa and implications for sperm capacitation and acrosome reaction. J Cell Sci 2005, 118(Pt 19):4393-4404.
Maccarrone M.: CB(2) receptors in reproduction. Br J Pharmacol 2007. Makriyannis A., Tian X. Y., Guo H. X.: How lipophilic cannabinergic ligands
reach their receptor sites. Prostag Oth Lipid M 2005, 77(1-4):210-218.
Doktore-tesia
Bibliografia 132
Mansour A., Fox C. A., Thompson R. C., Akil H., Watson S. J.: Mu-Opioid Receptor Messenger-Rna Expression in the Rat Cns - Comparison to Mu-Receptor Binding. Brain Research 1994, 643(1-2):245-265.
Mari G., Rizzato G., Iacono E., Merlo B., Minoia R., Belluzzi S.: Effects of beta-
endorphin and naloxone on motility of cooled equine spermatozoa. Anim Reprod Sci 2005, 89(1-4):223-225.
Marigomez I., Cajaraville M. P.: Zelula. Udako Euskal Unibertsitatea argitaletxea,
Bilbo. 1999. Mato S., Del Olmo E., Pazos A.: Ontogenetic development of cannabinoid receptor
expression and signal transduction functionality in the human brain. Eur J Neurosci 2003, 17(9):1747-1754.
Matsuda L. A., Lolait S. J., Brownstein M. J., Young A. C., Bonner T. I.: Structure
of a cannabinoid receptor and functional expression of the cloned cDNA. Nature 1990, 346(6284):561-564.
McPartland J. M.: Phylogenomic and chemotaxonomic analysis of the
endocannabinoid system. Brain Res Rev 2004, 45(1):18-29. Mechoulam R., Benshabat S., Hanus L., Ligumsky M., Kaminski N. E., Schatz A.
R., Gopher A., Almog S., Martin B. R., Compton D. R., Pertwee R. G., Griffin G., Bayewitch M., Barg J., Vogel Z.: Identification of an Endogenous 2-Monoglyceride, Present in Canine Gut, That Binds to Cannabinoid Receptors. Biochem Pharmacol 1995, 50(1):83-90.
Meizel S., Turner K. O.: Serotonin or Its Agonist 5-Methoxytryptamine Can
Stimulate Hamster Sperm Acrosome Reactions in a More Direct Manner Than Catecholamines. J Exp Zool 1983, 226(1):171-174.
Meizel S.: The sperm, a neuron with a tail: 'neuronal' receptors in mammalian
sperm. Biol Rev Camb Philos Soc 2004, 79(4):713-732. Meizel S., Son J. H.: Studies of sperm from mutant mice suggesting that two
neurotransmitter receptors are important to the zona pellucida-initiated acrosome reaction. Mol Reprod Dev 2005, 72(2):250-258.
Mejean A., Hawkinson J., Guthapfel R., Goeldner M., Hirth C.: A Photoactivatable
Naltrexone Derivative Labels Glycoproteins of Different Molecular-Weight Corresponding to the Mu-Opioid and Kappa-Opioid Receptors. Biochemistry 1992, 31(40):9685-9693.
Metcalf M. D., Coop A.: Kappa opioid antagonists: Past successes and future
prospects. Aaps J 2005, 7(3):E704-E722. Miller D., Ostermeier G. C., Krawetz S. A.: The controversy, potential and roles of
spermatozoal RNA. Trends Mol Med 2005, 11(4):156-163.
Doktore-tesia
Bibliografia 133
Miller D., Ostermeier G. C.: Towards a better understanding of RNA carriage by ejaculate spermatozoa. Hum Reprod Update 2006, 12(6):757-767.
Minami M., Satoh M.: Molecular-Biology of the Opioid Receptors - Structures,
Functions and Distributions. Neurosci Res 1995, 23(2):121-145. Minami M., Nakagawa T., Seki T., Onogi T., Aoki Y., Katao Y., Katsumata S.,
Satoh M.: A single residue, Lys108, of the delta-opioid receptor prevents the mu-opioid-selective ligand [D-Ala(2),N-MePhe(4),Gly-ol(5)]enkephalin from binding to the delta-opioid receptor. Mol Pharmacol 1996, 50(5):1413-1422.
Minelli A., Miscetti P., Proietti A., Luzi L., Mezzasoma I.: Adenosine-Triphosphate
Catabolism in Bovine Spermatozoa. Comp Biochem Phys B 1995, 110(3):605-611. Molina-Holgado E., Vela J. M., Arevalo-Martin A., Almazan G., Molina-Holgado
F., Borrell J., Guaza C.: Cannabinoids promote oligodendrocyte progenitor survival: Involvement of cannabinoid receptors and phosphatidylinositol-3 kinase/Akt signaling. J Neurosci 2002, 22(22):9742-9753.
Mollereau C., Parmentier M., Mailleux P., Butour J. L., Moisand C., Chalon P.,
Caput D., Vassart G., Meunier J. C.: Orl1, a Novel Member of the Opioid Receptor Family - Cloning, Functional Expression and Localization. FEBS Lett 1994, 341(1):33-38.
Mortimer S. T.: A critical review of the physiological importance and analysis of
sperm movement in mammals. Hum Reprod Update 1997, 3(5):403-439. Mortimer S. T.: CASA--practical aspects. J Androl 2000, 21(4):515-524. Munkelwitz R., Gilbert B. R.: Are boxer shorts really better? A critical analysis of
the role of underwear type in male subfertility. J Urol 1998, 160(4):1329-1333. Munro S., Thomas K. L., Abu-Shaar M.: Molecular characterization of a
peripheral receptor for cannabinoids. Nature 1993, 365(6441):61-65. Nakanishi S., Inoue A., Kita T., Nakamura M., Chang A. C. Y., Cohen S. N., Numa
S.: Nucleotide-Sequence of Cloned Cdna for Bovine Corticotropin-Beta-Lipotropin Precursor. Nature 1979, 278(5703):423-427.
Naz R. K., Sellamuthu R.: Receptors in spermatozoa: Are they real? J Androl
2006, 27(5):627-636. Nelson L., Cariello L.: Adrenergic-Stimulation of Sea-Urchin Sperm Cells.
Gamete Res 1989, 24(3):291-302. Neudeck B. L., Loeb J., Buck J.: Activation of the kappa-opioid receptor in Caco-2
cells decreases interleukin-8 secretion. Eur J Pharmacol 2003, 467(1-3):81-84. Nunez E., Benito C., Pazos M. R., Barbachano A., Fajardo O., Gonzalez S., Tolon
R. M., Romero J.: Cannabinoid CB2 receptors are expressed by perivascular
Doktore-tesia
Bibliografia 134
microglial cells in the human brain: An immunohistochemical study. Synapse 2004, 53(4):208-213.
Osei-Hyiaman D., DePetrillo M., Pacher P., Liu J., Radaeva S., Batkai S., Harvey-
White J., Mackie K., Offertaler L., Wang L., Kunos G.: Endocannabinoid activation at hepatic CB1 receptors stimulates fatty acid synthesis and contributes to diet-induced obesity. J Clin Invest 2005, 115(5):1298-1305.
Ostermeier G. C., Dix D. J., Miller D., Khatri P., Krawetz S. A.: Spermatozoal RNA
profiles of normal fertile men. Lancet 2002, 360(9335):772-777. Ostermeier G. C., Miller D., Huntriss J. D., Diamond M. P., Krawetz S. A.:
Reproductive biology - Delivering spermatozoan RNA to the oocyte. Nature 2004, 429(6988):154-154.
Ostermeier C. G., Goodrich R. J., Diamond M. P., Dix D. J., Krawetz S. A.: Toward
using stable spermatozoal RNAs for prognostic assessment of male factor fertility. Fertil Steril 2005, 83(6):1687-1694.
Peckys D., Landwehrmeyer G. B.: Expression of mu, kappa, and delta opioid
receptor messenger RNA in the human CNS: A P-33 in situ hybridization study. Neuroscience 1999, 88(4):1093-1135.
Persson A. I., Thorlin T., Eriksson P. S.: Comparison of immunoblotted delta
opioid receptor proteins expressed in the adult rat brain and their regulation by growth hormone. Neurosci Res 2005, 52(1):1-9.
Pertwee, R.: Cannabinoids, Handbook of Experimental Pharmacology-ean.
Springer argitaletxea, Germany; 2005a. Pertwee R. G.: Inverse agonism and neutral antagonism at cannabinoid CBI
receptors. Life Sciences 2005b, 76(12):1307-1324. Pessot C. A., Brito M., Figueroa J., Concha I. I., Yanez A., Burzio L. O.: Presence
of Rna in the Sperm Nucleus. Biochem Bioph Res Co 1989, 158(1):272-278. Petraglia F., Segre A., Facchinetti F., Campanini D., Ruspa M., Genazzani A. R.:
Beta-Endorphin and Met-Enkephalin in Peritoneal and Ovarian Follicular Fluids of Fertile and Postmenopausal Women. Fertil Steril 1985, 44(5):615-621.
Petraglia F., Facchinetti F., Mfuta K., Ruspa M., Bonavera J. J., Gandolfi F.,
Genazzani A. R.: Endogenous Opioid-Peptides in Uterine Fluid. Fertil Steril 1986, 46(2):247-251.
Petraglia F., Dimeo G., Storchi R., Segre A., Facchinetti F., Szalay S., Volpe A.,
Genazzani A. R.: Proopiomelanocortin-Related Peptides and Methionine Enkephalin in Human Follicular-Fluid - Changes During the Menstrual-Cycle. Am J Obstet Gynecol 1987, 157(1):142-146.
Doktore-tesia
Bibliografia 135
Picatoste F., Sarri E., Claro E.: Proteinas G y sistema adenilil ciclasa. Monografías de Neurociencias (7): Receptores para Neurotransmisores-ean. Ediciones en Neurociencias, J. A. Garcia – Sevilla argitaletxea. Barcelona. 1996.
Pilapil C., Welner S., Magnan J., Gauthier S., Quirion R.: Autoradiographic
Distribution of Multiple Classes of Opioid Receptor-Binding Sites in Human Forebrain. Brain Res Bull 1987, 19(5):611-615.
Pol O., Alameda F., Puig M. M.: Inflammation enhances mu-opioid receptor
transcription and expression in mice intestine. Mol Pharmacol 2001, 60(5):894-899. Ragni G., De Lauretis L., Gambaro V., Di Pietro R., Bestetti O., Recalcati F.,
Papetti C.: Semen evaluation in heroin and methadone addicts. Acta Eur Fertil 1985, 16(4):245-249.
Ramos J. A., De Miguel R., Cebeira M., Hernandez M. and Fernandez-Ruiz J.:
Exposure to cannabinoids in the development of endogenous cannabinoid system, Neurotox Res 2002, 4(4):363-372.
Ravina C. G., Seda M., Pinto F. M., Orea A., Fernandez-Sanchez M., Pintado C. O.,
Candenas M. L.: A role for tachykinins in the regulation of human sperm motility. Hum Reprod 2007, 22(6):1617-1625.
Relton J. M., Gee N. S., Matsas R., Turner A. J., Kenny A. J.: Purification of
Endopeptidase-24.11 (Enkephalinase) from Pig Brain by Immunoadsorbent Chromatography. Biochem J 1983, 215(3):519-523.
Rhoades R. A., Tanner G. A.: Fisiología médica. Masson argitaletxea, Barcelona;
1997. Riviere P. J. M.: Peripheral kappa-opioid agonists for visceral pain. Brit J
Pharmacol 2004, 141(8):1331-1334. Roques B. P., Noble F., Fournie-Zaluski M. C.: Endogenous opioid peptides and
analgesia. Opioids in pain control. Basic and clinical aspects-ean. Stein C. Cambridge University Press argitaletxea, Cambridge; 1999.
Rosen H., Itin A., Schiff R., Keshet E.: Local-Regulation within the Female
Reproductive-System and Upon Embryonic Implantation - Identification of Cells Expressing Proenkephalin-A. Mol Endocrinol 1990, 4(1):146-154.
Rossato M., Ion Popa F., Ferigo M., Clari G., Foresta C.: Human sperm express
cannabinoid receptor Cb1, the activation of which inhibits motility, acrosome reaction, and mitochondrial function. J Clin Endocrinol Metab 2005, 90(2):984-991.
Rueda D., Galve-Roperh I., Haro A., Guzman M.: The CB1 cannabinoid receptor
is coupled to the activation of c-Jun N-terminal kinase. Mol Pharmacol 2000, 58(4):814-820.
Doktore-tesia
Bibliografia 136
Ruiz-Llorente L., Sanchez M. G., Carmena M. J., Prieto J. C., Sanchez-Chapado M., Izquierdo A., Diaz-Laviada I.: Expression of functionally active cannabinoid receptor CB1 in the human prostate gland. Prostate 2003, 54(2):95-102.
Sadler T. W.: Langman. Embriología médica, 9. argitalpena. Panamericana
argitaletxea, Madrid; 2004. Sanchez C., Galve-Roperh I., Rueda D., Guzman M.: Involvement of
sphingomyelin hydrolysis and the mitogen-activated protein kinase cascade in the Delta(9)-tetrahydrocannabinol-induced stimulation of glucose metabolism in primary astrocytes. Mol Pharmacol 1998, 54(5):834-843.
Sanchez C., de Ceballos M. L., del Pulgar T. G., Rueda D., Corbacho C., Velasco
G., Galve-Roperh I., Huffman J. W., Cajal S. R. Y., Guzman M.: Inhibition of glioma growth in vivo by selective activation of the CB2 cannabinoid receptor. Cancer Research 2001, 61(15):5784-5789.
Santen R. J., Sofsky J., Bilic N., Lippert R.: Mechanism of Action of Narcotics in
Production of Menstrual Dysfunction in Women. Fertil Steril 1975, 26(6):538-548. Sarfaraz S., Afaq F., Adhami V. M., Mukhtar H.: Cannabinoid receptor as a novel
target for the treatment of prostate cancer. Cancer Res 2005, 65(5):1635-1641. Sastry B. V., Janson V. E., Owens L. K., Tayeb O. S.: Enkephalin- and substance
P-like immunoreactivities of mammalian sperm and accessory sex glands. Biochem Pharmacol 1982, 31(21):3519-3522.
Sastry B. V., Janson V. E., Owens L. K.: Significance of substance P- and
enkephalin-peptide systems in the male genital tract. Ann N Y Acad Sci 1991, 632:339-353.
Schaefer M., Hofmann T., Schultz G., Gudermann T.: A new prostaglandin E
receptor mediates calcium influx and acrosome reaction in human spermatozoa. Proc Natl Acad Sci USA 1998, 95(6):3008-3013.
Schatz A. R., Lee M., Condie R. B., Pulaski J. T., Kaminski N. E.: Cannabinoid
receptors CB1 and CB2: A characterization of expression and adenylate cyclase modulation within the immune system. Toxicol Appl Pharm 1997, 142(2):278-287.
Schmid P. C., Paria B. C., Krebsbach R. J., Schmid H. H. O., Dey S. K.: Changes in
anandamide levels in mouse uterus are associated with uterine receptivity for embryo implantation. Proc Natl Acad Sci USA 1997, 94(8):4188-4192.
Schneider U., Schwenk H. U., Bornkamm G.: Characterization of Ebv-Genome
Negative Null and T-Cell Lines Derived from Children with Acute Lymphoblastic Leukemia and Leukemic Transformed Non-Hodgkin Lymphoma. Int J Cancer 1977, 19(5):621-626.
Doktore-tesia
Bibliografia 137
Schuel H., Chang M. C., Berkery D., Schuel R., Zimmerman A. M., Zimmerman S.: Cannabinoids inhibit fertilization in sea urchins by reducing the fertilizing capacity of sperm. Pharmacol Biochem Behav 1991, 40(3):609-615.
Schuel H., Goldstein E., Mechoulam R., Zimmerman A. M., Zimmerman S.:
Anandamide (arachidonylethanolamide), a brain cannabinoid receptor agonist, reduces sperm fertilizing capacity in sea urchins by inhibiting the acrosome reaction. Proc Natl Acad Sci U S A 1994, 91(16):7678-7682.
Schuel H., Burkman L. J., Lippes J., Crickard K., Forester E., Piomelli D., Giuffrida
A.: N-Acylethanolamines in human reproductive fluids. Chem Phys Lipids 2002, 121(1-2):211-227.
Schuel H., Burkman L. J.: A tale of two cells: endocannabinoid-signaling regulates
functions of neurons and sperm. Biol Reprod 2005, 73(6):1078-1086. Schuel H.: Tuning the oviduct to the anandamide tone. J Clin Invest 2006,
116(8):2087-2090. Shapira M., Vogel Z., Sarne Y.: Opioid and cannabinoid receptors share a
common pool of GTP-binding proteins in cotransfected cells, but not in cells which endogenously coexpress the receptors. Cell Mol Neurobiol 2000, 20(3):291-304.
Sharp B., Pekary A. E., Meyer N. V., Hershman J. M.: Beta-Endorphin in Male-
Rat Reproductive-Organs. Biochem Bioph Res Co 1980, 95(2):618-623. Sharp B. M., Roy S., Bidlack J. M.: Evidence for opioid receptors on cells involved
in host defense and the immune system. J Neuroimmunol 1998, 83(1-2):45-56. Shire D., Calandra B., RinaldiCarmona M., Oustric D., Pessegue B.,
BonninCabanne O., LeFur G., Caput D., Ferrara P.: Molecular cloning, expression and function of the murine CB2 peripheral cannabinoid receptor. Bba-Gene Struct Expr 1996, 1307(2):132-136.
Siegel G. J., Agranoff B. W., Albers R. W., Molinoff P. B.: Basic neurochemestry.
Raven press argitaletxea, New York. 1993. Simon J., Benyhe S., Hepp J., Khan A., Borsodi A., Szucs M., Medzihradszky K.,
Wollemann M.: Purification of a Kappa-Opioid Receptor Subtype from Frog Brain. Neuropeptides 1987, 10(1):19-28.
Simonin F., Befort K., Gaveriauxruff C., Matthes H., Nappey V., Lannes B.,
Micheletti G., Kieffer B.: Molecular Characterization of the Human Delta-Opioid Receptor. Regul Peptides 1994, 54(1):279-280.
Skaper S. D., Buriani A., DalToso R., Petrelli L., Romanello S., Facci L., Leon A.:
The ALIAmide palmitoylethanolamide and cannabinoids, but not anandamide, are protective in a delayed postglutamate paradigm of excitotoxic death in cerebellar granule neurons. Proc Natl Acad Sci USA 1996, 93(9):3984-3989.
Doktore-tesia
Bibliografia 138
Smith C. G., Asch R. H.: Drug-Abuse and Reproduction. Fertil Steril 1987, 48(3):355-373.
Snyder S. H.: Drogas y cerebro. Biblioteca Scientific American. Prensa Científica
argitaletxea, Barcelona; 1993. Solakidi S., Psarra A. M. G., Nikolaropoulos S., Sekeris C. E.: Estrogen receptors
alpha and beta (ER alpha and ER beta) and androgen receptor (AR) in human sperm: localization of ER beta and AR in mitochondria of the midpiece. Hum Reprod 2005, 20(12):3481-3487.
Stansfield S. C., Cunningham F. J.: Involvement of Opiate Receptor Subtypes in
the Modulation of Lhrh Secretion by the Cockerel (Gallus-Domesticus) Mediobasal Hypothalamus Invitro. J Endocrinol 1987, 114(1):111-117.
Subiran N., Agirregoitia E., Valdivia A., Ochoa C., Casis L., Irazusta J.: Expression
of enkephalin-degrading enzymes in human semen and implications for sperm motility. Fertil Steril 2007.
Sugiura T., Kondo S., Sukagawa A., Tonegawa T., Nakane S., Yamashita A., Waku
K.: Enzymatic synthesis of anandamide, an endogenous cannabinoid receptor ligand, through N-acylphosphatidylethanolamine pathway in testis: Involvement of Ca2+-dependent transacylase and phosphodiesterase activities (vol 218, pg 113, 1996). Biochem Bioph Res Co 1996, 221(1):206-206.
Surprenant A., Shen K. Z., North R. A., Tatsumi H.: Inhibition of Calcium
Currents by Noradrenaline, Somatostatin and Opioids in Guinea-Pig Submucosal Neurons. J Physiol-London 1990, 431:585-608.
Tablado L., Perez-Sanchez F., Soler C.: Is sperm motility maturation affected by
static magnetic fields? Environ Health Persp 1996, 104(11):1212-1216. Tash J. S.: Protein-Phosphorylation - the 2nd Messenger Signal Transducer of
Flagellar Motility. Cell Motil Cytoskel 1989, 14(3):332-339.
Thorn N. A., Russell J. T.: Torp-Pedersen C., Treiman M.: Calcium and neurosecretion. Ann N Y Acad Sci 1978, 307: 618-639.
Todd A. R.: Hashish. Experientia 1946, 2(2):55-60.
Turner A. J. Endopeptidase-24.11 and neuropeptide metabolism. Neuropeptides
and their peptidases-ean. Turner A. J., Ellis Horwood Ltd., Chichester; 1987. Turner R. M.: Moving to the beat: a review of mammalian sperm motility
regulation. Reprod Fertil Dev 2006, 18(1-2):25-38. Utleg A. G., Yi E. C., Xie T., Shannon P., White J. T., Goodlett D. R., Hood L., Lin
B.: Proteomic analysis of human prostasomes. Prostate 2003, 56(2):150-161.
Doktore-tesia
Bibliografia 139
Van Sickle M. D., Duncan M., Kingsley P. J., Mouihate A., Urbani P., Mackie K., Stella N., Makriyannis A., Piomelli D., Davison J. S., Marnett L. J., Di Marzo V., Pittman Q. J., Patel K. D., Sharkey K. A.: Identification and functional characterization of brainstem cannabinoid CB2 receptors. Science 2005, 310(5746):329-332.
Vescovi P. P., Pedrazzoni M., Michelini M., Maninetti L., Bernardelli F., Passeri
M.: Chronic Effects of Marijuana Smoking on Luteinizing-Hormone, Follicle-Stimulating-Hormone and Prolactin Levels in Human Males. Drug Alcohol Depen 1992, 30(1):59-63.
Vigano D., Rubino T., Parolaro D.: Molecular and cellular basis of cannabinoid
and opioid interactions. Pharmacol Biochem Be 2005, 81(2):360-368. Waksman G., Bouboutou R., Devin J., Bourgoin S., Cesselin F., Hamon M.,
Fourniezaluski M. C., Roques B. P.: Invitro and Invivo Effects of Kelatorphan on Enkephalin Metabolism in Rodent Brain. Eur J Pharmacol 1985, 117(2):233-243.
Waldhoer M., Bartlett S. E., Whistler J. L.: Opioid receptors. Annu Rev Biochem
2004, 73:953-990. Wang D., King S. M., Quill T. A., Doolittle L. K., Garbers D. L.: A new sperm-
specific Na+/H+ Exchanger required for sperm motility and fertility. Nat Cell Biol 2003, 5(12):1117-1122.
Wang H., Dey S. K., Maccarrone M.: Jekyll and hyde: two faces of cannabinoid
signaling in male and female fertility. Endocr Rev 2006, 27(5):427-448. Wen X. H., Yang Z. W.: Quantitative (stereological) study on the spermatozoal
storage capacity of epididymis in rats and monkeys. Asian J Androl 2000, 2(1):73-77. Wenger T., Ledent C., Csernus V., Gerendai I.: The central cannabinoid receptor
inactivation suppresses endocrine reproductive functions. Biochem Biophys Res Commun 2001, 284(2):363-368.
World Health Organization: Collection and examination of human semen. WHO
laboratory manual for the examination of human semen and sperm-cervical mucus interaction 4. argitalpenean. Cambridge University Press argitaletxea, Cambridge; 1999.
Wick M. J., Minnerath S. R., Lin X. Q., Elde R., Law P. Y., Loh H. H.: Isolation of
a Novel Cdna-Encoding a Putative Membrane-Receptor with High Homology to the Cloned Mu-Opioid, Delta-Opioid, and Kappa-Opioid Receptors. Mol Brain Res 1994, 27(1):37-44.
Williams N., Clouet D. H.: The Effect of Acute Opioid Administration on the
Phosphorylation of Rat Striatal Synaptic Membrane-Proteins. J Pharmacol Exp Ther 1982, 220(2):278-286.
Doktore-tesia
Bibliografia
Doktore-tesia
140
Wittert G., Hope P., Pyle D.: Tissue distribution of opioid receptor gene expression in the rat. Biochem Bioph Res Co 1996, 218(3):877-881.
Wykes S. M., Visscher D. W., Krawetz S. A.: Haploid transcripts persist in mature
human spermatozoa. Mol Hum Reprod 1997, 3(1):15-19. Xu W., Filppula S. A., Mercier R., Yaddanapudi S., Pavlopoulos S., Cai J., Pierce
W. M., Makriyannis A.: Purification and mass spectroscopic analysis of human CB1 cannabinoid receptor functionally expressed using the baculovirus system. J Pept Res 2005, 66(3):138-150.
Yanagimachi R.: Mammalian fertilization. The Physiology of reproduction 2.
argitalpenean. Raven Press Ltd, New York argitaletxea; 1994. Zalata A., Hafez T., VanHoecke M. J., Comhaire F.: Evaluation of beta-endorphin
and interleukin-6 in seminal plasma of patients with certain andrological diseases. Hum Reprod 1995, 10(12):3161-3165.
Zorgniotti A. W., Sealfon A. I., Toth A.: Chronic scrotal hypothermia as a
treatment for poor semen quality. Lancet 1980, 1(8174):904-906. Zygmunt P. M., Petersson J., Andersson D. A., Chuang H. H., Sorgard M., Di
Marzo V., Julius D., Hogestatt E. D.: Vanilloid receptors on sensory nerves mediate the vasodilator action of anandamide. Nature 1999, 400(6743):452-457.
Eranskinak
Eranskinak 143
1. ERANSKINA
PCRan anplifikatutako anplikoien sekuentziazioa
1. Helburua: Opioide-hartzaileentzako RT-PCRan lortutako datuak egiaztatzea.
2. Oinarria
RT-PCRa egin eta gero lortutako anplikoien sekuentzia jakinda, baiezta dezakegu
agarosako geletan ikusitako bandak benetan guk pentsatzen ditugun sekuentziak
dauzkatela.
Sekuentziazioa egiteko, lehenik eta behin, PCRtik lortutako produktuak araztu behar
dira kit bat erabilita (High pure PCR product purification kit, Roche) eta, gero,
araztutakoa sekuentziazten da. Lortutako sekuentziazio-emaitzak NCBI-BLAST datu-
baseko (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi) mRNA guztiekin konparatzen dira.
Hala baieztatu dugu PCRtik lortutako produktuaren sekuentzia ea bat ote datorren
bilatzen ari garen mRNArekin.
3. Protokoloa
100 µl PCR Binding buffer 500 µl gehitu
Ondo nahastu eta “High Pure”tutu filtrodunetara pasa,
zentrifugatu 13.000 g / 1 min
Zentrifugatu 13.000 g / 1 min
Iragazitako likidoa baztertu
Zentrifugatu 13.000 g / 1 min
Zentrifugatu 13.000 g / 1 min
Wash buffer 500 µl gehitu
Wash buffer 200 µl gehitu
Elution buffer 500 µl gehitu
Iragazitako likidoa baztertu
Iragazitako likidoa baztertu
PCR produktua araztua
2. irudia: PCRaren produktua arazteko prozeduraren eskema.
Doktore-tesia
Eranskinak 144
Araztutako parte bat % 1,5-2ko agarosako gel batean korriarazten da (putzuko,
araztutako 5 µl + 1µl karga-buffer), arazketa ondo egin dela baieztatzeko. Beste partea
sekuentziazio-zerbitzura eramaten da.
4. Emaitzak eta eztabaida
Emaitzen arabera, PCRtik lortutako produktuaren sekuentzia bat dator datu-basetako κ
eta µ opioide-hartzaileen mRNArekin.
hKOR
5´TAATATTTACCTGGCTTTGGCAGATGCTTTAGTTACTACAACCATGCCCTTTCAGAGTACGGTCTACTTGATGAATTCCTGGCCTTTTGGGGATGTGCTGTGCAAGATAGTAATTTCCATTGATTACTACAACATGTTCACCAGCATCTTCACCTTGACCATGATGAGNGTGGACCGCTACATTGCCGTGTGCCACCCCGTGAAGGCTTTGGACTTCCGCACACCCTTGAAGGCAAAGATCATCAATATCTGCATCTGGCTGCTGTCGTCATCTGTTGGCATCTCTGCAATAGTCCTTGGAGGCACCAAAGGTCAGGGAA 3´
hMOR
5´CGTCTCGAGGTGAATTACCTAATGGGAACATGGCCATTTGGAACCATCCTTTGCAAGATAGTGATCTCCATAGATTACTATAACATGTTCACCAGCATATTCACCCTCTGCACCATGAGTGTTGATCGATACATTGCAGTCTGCCACCCTGTCAAGGCCTTAGATTTCCGTACTCCCCGAAATGCCAAAATTATCAATGTCTGCAACTGGATCCTCTCTTCAGCCATTGGTCTTCCTGTAATGTTCATGGCTACAACAAAATACAGGCAAGGTTCCATAGATTGTACACTAACATTCTCTCATCCAACCTGGTACTGGGAAAACCTGCTGAAGATCTGTGTTTTCATCTTCGCCTTCATTATGCCAGTGCTCATCATTACCGTGTGCTATGGACTGATGATCTTGCGCCTCA 3´
3. irudia: κ (hKOR) eta µ opioide-hartzaileentzako (hMOR) RT-PCRaren produktuen sekuentziak giza espermatozoideetan. hKOR anplikoiaren sekuentzia NCBI-BLAST datu-baseko BC099912.1, Homo sapiens-aren Kappa 1 opioide-hartzailearen mRNArekin bat dator. hMOR anplikoiaren sekuentzia NCBI-BLAST datu-baseko NM_001008505.1, Homo sapiens-aren mu 1 opioide-hartzailearen MOR-1X transkriptoaren mRNA-rekin bat dator.
Doktore-tesia
Eranskinak 145
2. ERANSKINA
Denbora errealean egindako PCR kuantitatiboa (qRT-PCR)
1. Helburua: Opioide-hartzaileentzako RT-PCRan lortutako datuak balioztatzea.
2. Oinarria
Roche-ren “Universal Probe Library” sistema denbora errealean egindako Taqman-PCR
sistema klasikoan oinarritzen da, baina hiru primer erabiltzen dira. Horietako bi primer
ohiko PCRa egiteko kontzeptua erabiliz diseinatzen dira (forward eta reverse primer-
ak). Hirugarren primer-ak talde fluoreszentea du, eta anplifikaziora gehitzen denean
(sortzen ari den anplikoira gehitzean), emisio fluoreszentea handitzen du (primer horrek
aldaketa kimikoak ditu, eta, polimerasak primer-aren muturretan nukleotidoak gehitzen
dituenean, fluoreszentzia igortzen da). Sistema honek anplifikazioaren espezifizitatea
areagotzen du (hiru primer erabiltzeagatik) eta DNA-harizpi bikoitz ez-espezifikoen
detekzioa baztertzen ditu, fluoreszentzia primer bati lotua dagoelako. Termozikladore
espezifiko batekin, anplifikazio-ziklo bakoitzean, fluoreszentzia jaso eta kuantifikatu
egiten da. Hala, zikloz ziklo lorturiko fluoreszentziaren datuak irudikatuz bilatzen
dugun mRNA anplifikatzen bada, fluoreszentziaren portaera sigmoideoa lortuko dugu.
Anplifikazio-kurbaren alde lineala analizatzeko, mozte-marra bat egiten da erreakzio
guztietarako; hala, laginen arteko anplifikazio-zikloen desberdintasunak analiza
daitezke. Datu horiekin, erreferentzia-lagin bat hartuta, lagin bakoitzaren espresio-datu
erlatiboak lor daitezke.
3. Protokoloa
a) cDNA Transcriptor kit (Roche) erabiliz sortu zen. b) Introien artean sortutako primer-ak “Roche Universal Probe Library” metodoaz sortu ziren (www.roche-applied-science.com). Primer bikote hauek erabili ziren: - Giza δ opioide-hartzailerako (f) primer: 5´-ttgtcatgttcggcatcg-3´ (r) primer: 5´-aaggccaggttgaagatgtaga-3´ Probe: Human #49
Doktore-tesia
Eranskinak 146
- Giza κ opioide-hartzailerako (f) primer: 5´-ccttgaaggcaaagatcatca-3´ (r) primer: 5´-tgcaaggagcactcaatgac-3´ Probe: Human #71 - Giza µ opioide-hartzailerako (f) primer: 5´-cggccaatacagtggatagaa-3´ (r) primer: 5´-gttagggcaacggagcagt-3´ Probe: Human #38 d) 96 edo 384 putzuko plaketan gehitu behar dena putzu bakoitzeko - Lagina: 1-5 µl - Master mix: 5 µl (Roche Faststart Taqman Probe Master 1,25 ml + ROX 8,5 µl) - Primer-ak (f-r): 0,1 µl (200 nM) - Roche Primera (Probe): 0,1 µl (100 nM) - H2O 10 µl arte e) Anplifikazioa eta datuen analisia 7900 Real-Time PCR System (Applied Biosystems) gailuan egin ziren.
4. Emaitzak eta eztabaida
qRT-PCRa erabiliz, δ opioide-hartzailearen mRNAren anplifikaziorik ez da topatzen
espermatozoide helduetan. Aitzitik, κ eta µ opioide-hartzaileen mRNAren anplifikazioa
topatzen da zelula horietan (Ct = 36,4 ± 0,3 eta 30,7 ± 0,3 hurrenez hurren).
hDOR
hKOR hMOR
1. irudia: Opioide-hartzaileentzako qRT-PCR analisiaren anplifikazio-kurbak giza espermatozoideetan. hKOR: giza κ opioide-hartzailea; hMOR: giza µ opioide-hartzailea; hDOR: giza δ opioide-hartzailea. hKOR-en eta hMOR-en mRNA anplifikatzen da eta hDOR-en mRNA ez da anplifikatzen.
Doktore-tesia
Eranskinak
Doktore-tesia
147
3. ERANSKINA
Mugikortasun-parametroak
Helburua: Tesi honetako “Emaitzak eta eztabaida” atala ez luzatzeko, soilik
espermatozoideen mugikortasun parametro esanguratsuen grafikoak erakutsi dira.
Jarraian, Sperm Class Analyzer 2005® softwarearekin neurtutako mugikortasun-
paramtro guztiak erakusten dira.
DEL
TA o
pioi
de-h
artz
aile
aren
ago
nist
aren
(DPD
PE) e
ta a
ntag
onis
tare
n (N
altr
indo
l) er
agin
a es
perm
atoz
oide
en m
ugik
orta
sun-
para
met
roet
an
18.4
84.
6241
.98
1.31
16.2
91.
5723
.27
5.71
60.4
54.
7452
.27
1.40
20.1
91.
6331
.72
.97
38.7
03.
3863
.42
3.63
60.7
41.
751.
98.0
39.
12.2
9.5
3.3
525
.75
6.95
20.7
64.
2652
.97
10.9
526
.28
7.19
41.3
34.
6212
.63
.62
28.8
12.
5231
.12
1.74
44.2
21.
5470
.22
1.60
.37
.12
1.95
.74
16.3
36.
3342
.46
2.67
16.9
32.
4824
.28
6.14
58.7
95.
8649
.06
1.84
18.0
02.
1530
.34
1.28
36.6
34.
0659
.17
6.39
61.8
51.
251.
81.1
58.
82.5
64.
501.
4246
.95
6.28
19.6
61.
6628
.90
6.14
51.4
46.
7646
.52
2.31
14.5
01.
1129
.07
2.55
31.0
5.7
950
.02
1.33
62.2
12.
421.
17.1
04.
141.
02.5
3.3
525
.75
6.95
20.7
64.
2652
.97
10.9
526
.28
7.19
41.3
34.
6212
.63
.62
28.8
12.
5231
.12
1.74
44.2
21.
5470
.22
1.60
.37
.12
1.95
.74
18.4
84.
6241
.98
1.31
16.2
91.
5723
.27
5.71
60.4
54.
7452
.27
1.40
20.1
91.
6331
.72
.97
38.7
03.
3863
.42
3.63
60.7
41.
751.
98.0
39.
12.2
918
.48
4.62
41.9
81.
3116
.29
1.57
23.2
75.
7160
.45
4.74
52.2
71.
4020
.19
1.63
31.7
2.9
738
.70
3.38
63.4
23.
6360
.74
1.75
1.98
.03
9.12
.29
18.4
84.
6241
.98
1.31
16.2
91.
5723
.27
5.71
60.4
54.
7452
.27
1.40
20.1
91.
6331
.72
.97
38.7
03.
3863
.42
3.63
60.7
41.
751.
98.0
39.
12.2
922
.37
7.49
37.4
21.
6617
.31
2.20
22.9
05.
4059
.79
7.24
48.9
9.8
420
.25
1.09
30.3
3.2
541
.49
2.95
66.7
83.
5561
.97
1.13
2.06
.10
8.55
.33
2.19
.90
34.5
34.
4619
.02
4.02
44.2
79.
1036
.72
5.22
45.1
94.
1012
.81
.75
30.4
73.
3628
.72
2.02
42.9
83.
7267
.11
1.34
.70
.18
2.78
.60
11.9
71.
5244
.41
1.13
21.2
52.
7422
.38
3.27
56.3
71.
9347
.74
4.57
17.1
21.
0428
.79
2.16
36.1
81.
0959
.65
1.12
60.6
61.
591.
81.0
78.
05.7
315
.17
2.71
47.7
73.
3015
.07
2.80
22.0
03.
5062
.94
3.27
53.4
73.
6818
.33
.91
31.2
01.
9234
.78
3.00
59.3
54.
5458
.53
1.59
2.02
.09
7.89
.72
3.70
2.30
34.4
65.
0721
.23
2.18
40.6
17.
6138
.17
6.38
45.8
82.
5413
.67
1.16
30.4
21.
4629
.72
1.56
44.8
82.
9466
.44
1.75
1.00
.36
3.13
1.04
19.3
56.
3435
.52
1.45
18.8
82.
5526
.26
6.18
54.8
77.
1548
.31
2.36
19.1
12.
0830
.07
1.40
39.3
73.
0263
.18
4.64
62.2
7.4
82.
25.0
78.
70.2
010
.83
4.44
35.8
15.
8219
.33
1.18
34.0
410
.35
46.6
39.
3445
.57
4.43
17.1
91.
0528
.42
2.19
38.1
92.
2460
.94
3.58
62.7
11.
541.
50.2
76.
90.7
417
.91
2.43
40.2
22.
4419
.75
2.12
22.1
35.
0258
.13
3.94
45.9
51.
9818
.07
.98
29.1
01.
4039
.46
2.32
62.3
93.
8763
.29
.42
1.90
.06
8.08
.29
13.4
02.
5238
.88
3.61
20.2
02.
7327
.51
4.85
52.2
95.
1847
.95
4.13
18.0
51.
7630
.00
1.92
37.6
41.
6859
.91
2.76
62.8
81.
282.
10.1
38.
05.4
8.6
4.4
326
.99
3.66
21.2
22.
6751
.15
5.58
27.6
34.
0642
.43
5.20
12.7
4.9
228
.87
2.44
30.6
12.
0444
.39
2.18
68.8
62.
27.5
0.0
61.
67.5
89.
493.
9235
.28
.99
19.7
52.
8935
.49
4.08
44.7
73.
3845
.10
3.34
16.0
41.
5128
.92
2.11
35.6
42.
6555
.53
3.84
64.1
3.4
31.
57.1
67.
08.7
55.
021.
7840
.64
4.58
22.4
02.
7431
.94
2.98
45.6
65.
5845
.35
5.87
15.0
31.
2428
.94
2.72
33.7
42.
1052
.14
1.96
64.5
72.
161.
28.2
66.
27.9
12.
28.9
933
.48
5.30
21.2
81.
7942
.97
7.37
35.7
66.
2041
.01
1.95
13.6
1.8
128
.93
1.04
33.2
51.
5847
.08
2.36
70.6
71.
07.7
6.1
74.
22.1
719
.19
4.50
41.3
42.
0716
.85
.94
22.6
26.
4860
.53
5.63
49.0
12.
9519
.59
.82
30.7
31.
1140
.61
3.83
64.1
24.
1863
.00
1.91
1.88
.11
8.85
.20
9.61
2.75
37.4
84.
7319
.67
2.28
33.2
47.
5647
.09
6.30
45.8
53.
9316
.93
.80
28.0
81.
5837
.57
2.96
60.6
43.
1961
.74
1.99
1.98
.32
7.35
.79
10.1
63.
4534
.72
1.16
20.8
95.
2634
.23
8.31
44.8
83.
7943
.43
1.79
15.5
11.
2827
.03
1.20
35.9
53.
4457
.68
5.12
62.2
1.6
61.
54.2
96.
181.
2018
.44
6.40
38.0
8.4
518
.38
1.76
25.1
05.
2556
.52
6.24
51.4
12.
3720
.09
1.64
31.6
1.6
339
.07
2.80
63.4
04.
4761
.71
1.67
2.16
.25
7.88
.63
1.61
1.51
37.6
610
.80
17.4
32.
1443
.31
12.2
939
.27
12.1
647
.76
2.51
13.5
51.
8931
.85
2.13
28.1
52.
8941
.98
3.28
66.6
82.
58.6
1.4
92.
101.
448.
773.
1034
.96
3.59
22.9
04.
5233
.37
8.29
43.7
36.
6346
.78
4.12
16.1
0.5
628
.33
1.21
34.9
42.
0856
.99
1.90
61.2
92.
822.
23.2
27.
60.4
212
.00
4.81
37.5
37.
4714
.30
1.33
36.1
712
.18
49.5
312
.01
53.6
94.
1118
.26
1.66
32.0
91.
1234
.02
2.06
56.6
84.
0860
.35
2.63
1.87
.48
6.86
1.42
1.98
1.08
38.3
84.
9318
.39
2.33
41.2
65.
6040
.35
5.84
52.2
14.
9415
.31
.79
34.6
52.
2729
.77
1.76
44.4
52.
0467
.00
2.56
.62
.21
2.64
.91
15.2
46.
2235
.31
1.23
15.5
01.
3133
.96
7.15
50.5
57.
2550
.12
1.58
19.6
71.
6931
.35
.84
39.1
32.
6362
.57
4.41
62.6
21.
352.
25.2
18.
16.3
914
.24
6.74
39.4
42.
1714
.48
1.63
31.8
56.
5853
.68
6.84
53.8
23.
9419
.45
1.79
32.2
61.
0636
.35
3.27
60.1
84.
8960
.46
2.49
1.95
.39
8.14
.79
19.0
45.
3042
.65
2.02
15.8
12.
4022
.50
4.69
61.6
96.
7752
.69
3.16
20.3
91.
9231
.68
1.30
38.4
01.
3363
.86
3.50
60.4
41.
582.
24.1
48.
93.3
9
Kont
rola
Nal
trind
ol 1
0-4
MD
PDPE
10-
7 M
+ n
altri
ndol
10-
6 M
DPD
PE 1
0-6
M +
nal
trind
ol 1
0-5
MD
PDPE
10-
5 M
+ n
altri
ndol
10-
4 M
DPD
PE 1
0-7
MD
PDPE
10-
6 M
DPD
PE 1
0-5
M
0 or
du
Kont
rola
Nal
trind
ol 1
0-4
MD
PDPE
10-
7 M
+ n
altri
ndol
10-
6 M
DPD
PE 1
0-6
M +
nal
trind
ol 1
0-5
MD
PDPE
10-
5 M
+ n
altri
ndol
10-
4 M
DPD
PE 1
0-7
MD
PDPE
10-
6 M
DPD
PE 1
0-5
M
0,5
ordu
Kont
rola
Nal
trind
ol 1
0-4
MD
PDPE
10-
7 M
+ n
altri
ndol
10-
6 M
DPD
PE 1
0-6
M +
nal
trind
ol 1
0-5
MD
PDPE
10-
5 M
+ n
altri
ndol
10-
4 M
DPD
PE 1
0-7
MD
PDPE
10-
6 M
DPD
PE 1
0-5
M
1 or
du
Kont
rola
Nal
trind
ol 1
0-4
MD
PDPE
10-
7 M
+ n
altri
ndol
10-
6 M
DPD
PE 1
0-6
M +
nal
trind
ol 1
0-5
MD
PDPE
10-
5 M
+ n
altri
ndol
10-
4 M
DPD
PE 1
0-7
MD
PDPE
10-
6 M
DPD
PE 1
0-5
M
3,5
ordu
Bate
zbe
stek
oEr
rore
a
A (%
)Ba
tez
best
eko
Erro
rea
B (%
)Ba
tez
best
eko
Erro
rea
C (%
)Ba
tez
best
eko
Erro
rea
D (%
)Ba
tez
best
eko
Erro
rea
AB (%
)Ba
tez
best
eko
Erro
rea
VCL
(µm
/s)
Bate
zbe
stek
oEr
rore
a
VSL
(µm
/s)
Bate
zbe
stek
oEr
rore
a
VAP
(µm
/s)
Bate
zbe
stek
oEr
rore
a
LIN
(%)
Bate
zbe
stek
oEr
rore
a
STR
(%)
Bate
zbe
stek
oEr
rore
a
WO
B (%
)Ba
tez
best
eko
Erro
rea
ALH
(µm
)Ba
tez
best
eko
Erro
rea
BCF
(Hz)
KA
PPA
opi
oide
-har
tzai
lear
en a
goni
star
en (U
-504
88) e
ta a
ntag
onis
tare
n (N
or-b
inal
torf
imin
a) e
ragi
na e
sper
mat
ozoi
deen
mug
ikor
tasu
n-pa
ram
etro
etan
29.2
78.
3135
.27
4.98
17.0
94.
0618
.37
2.87
64.5
55.
8357
.28
6.42
27.6
35.
3236
.91
4.63
46.1
34.
3071
.58
5.40
64.2
12.
082.
07.2
79.
34.9
618
.20
6.33
42.2
46.
0214
.50
3.95
25.0
64.
4460
.44
6.85
57.4
26.
0521
.38
2.68
32.8
42.
4937
.03
1.60
64.0
54.
1458
.35
2.24
2.03
.35
8.53
.79
21.7
46.
8237
.68
5.60
15.8
22.
9424
.77
4.23
59.4
16.
7952
.37
4.88
21.8
03.
0331
.95
2.72
41.0
72.
7467
.29
5.16
61.4
41.
921.
93.1
78.
99.5
730
.17
5.98
36.4
74.
0413
.49
3.23
19.8
83.
0066
.64
4.70
58.0
75.
0125
.24
2.62
34.9
22.
5943
.46
2.37
71.8
43.
7360
.57
1.66
2.07
.22
9.07
.77
18.2
06.
3342
.24
6.02
14.5
03.
9525
.06
4.44
60.4
46.
8557
.42
6.05
21.3
82.
6832
.84
2.49
37.0
31.
6064
.05
4.14
58.3
52.
242.
03.3
58.
53.7
929
.27
8.31
35.2
74.
9817
.09
4.06
18.3
72.
8764
.55
5.83
57.2
86.
4227
.63
5.32
36.9
14.
6346
.13
4.30
71.5
85.
4064
.21
2.08
2.07
.27
9.34
.96
29.2
78.
3135
.27
4.98
17.0
94.
0618
.37
2.87
64.5
55.
8357
.28
6.42
27.6
35.
3236
.91
4.63
46.1
34.
3071
.58
5.40
64.2
12.
082.
07.2
79.
34.9
629
.27
8.31
35.2
74.
9817
.09
4.06
18.3
72.
8764
.55
5.83
57.2
86.
4227
.63
5.32
36.9
14.
6346
.13
4.30
71.5
85.
4064
.21
2.08
2.07
.27
9.34
.96
23.0
96.
1733
.54
3.68
15.9
63.
0827
.42
4.42
56.6
35.
5856
.11
6.62
24.5
54.
0034
.62
3.65
42.7
72.
7168
.78
4.74
62.3
91.
622.
01.2
98.
86.7
016
.42
5.81
34.8
16.
4720
.61
4.06
28.1
64.
3151
.23
7.20
50.8
45.
2920
.44
2.86
31.5
32.
7939
.58
2.06
63.5
84.
4162
.67
1.44
2.09
.29
8.15
.84
28.1
58.
9533
.06
6.44
15.4
03.
4323
.40
4.69
61.2
17.
8155
.22
6.37
24.7
63.
7434
.10
3.38
44.5
53.
8871
.14
5.76
62.5
42.
002.
09.2
38.
99.7
124
.10
6.32
30.3
82.
9216
.32
3.98
29.2
13.
3954
.48
6.89
52.4
65.
7022
.17
3.13
31.9
22.
8741
.60
1.80
67.8
73.
9961
.72
2.01
2.02
.32
8.99
.60
19.9
75.
5332
.98
4.00
17.5
24.
5529
.54
2.39
52.9
46.
7452
.38
6.15
20.0
62.
7031
.08
2.89
38.0
91.
6463
.45
3.65
60.4
02.
002.
11.2
78.
22.6
422
.87
7.67
32.4
55.
4617
.41
3.34
27.2
83.
7155
.32
5.94
50.1
84.
4022
.17
3.32
31.8
12.
5743
.55
3.75
68.2
45.
4263
.84
1.95
1.86
.19
8.90
.64
27.5
09.
5127
.43
5.20
17.7
63.
3827
.30
4.76
54.9
47.
8351
.97
5.19
23.8
74.
2132
.67
3.35
44.9
24.
9670
.67
5.97
63.1
92.
671.
98.1
88.
81.8
923
.59
5.82
31.2
85.
5317
.04
2.66
28.0
94.
4654
.87
6.76
54.3
65.
2223
.13
3.42
33.6
22.
7541
.98
3.55
67.2
65.
4362
.43
1.65
2.00
.20
8.84
.54
24.5
97.
2829
.42
3.96
16.7
43.
7829
.26
3.82
54.0
06.
9749
.17
5.67
23.4
04.
0831
.60
3.43
46.2
23.
2271
.59
5.01
64.8
52.
191.
88.2
59.
08.8
123
.14
9.17
28.1
83.
6221
.93
5.51
26.7
43.
5751
.33
7.20
45.0
04.
4119
.73
3.26
28.1
02.
3742
.57
3.14
68.0
65.
9463
.05
1.96
1.81
.27
7.60
.93
25.2
36.
9829
.85
4.56
15.7
03.
7129
.23
4.94
55.0
87.
9752
.63
5.32
23.6
83.
1132
.78
2.81
44.1
81.
7570
.71
4.37
63.0
41.
981.
84.3
48.
29.7
726
.68
8.64
29.7
36.
0917
.32
4.48
26.2
84.
4756
.40
7.39
51.5
94.
9823
.52
4.12
32.6
43.
1544
.35
4.55
69.5
25.
9263
.53
2.02
1.83
.26
8.10
1.09
16.1
86.
1136
.30
4.71
17.4
43.
5230
.08
2.95
52.4
85.
9249
.78
4.75
19.1
02.
5029
.97
2.01
38.1
62.
6962
.74
5.16
61.3
02.
451.
83.2
87.
72.8
232
.88
9.06
27.4
56.
2113
.25
4.62
26.4
24.
4860
.34
8.59
53.9
86.
4225
.75
4.41
33.5
53.
9146
.88
3.74
74.7
35.
0362
.76
2.60
2.12
.25
9.27
.78
24.6
27.
4729
.60
2.75
19.5
74.
2726
.21
3.45
54.2
27.
2348
.97
5.58
21.8
43.
5430
.01
3.09
43.5
52.
1970
.74
4.34
61.9
01.
802.
05.2
18.
91.7
122
.83
7.21
31.0
33.
6415
.83
3.90
30.3
13.
5453
.86
7.24
50.0
85.
7223
.19
3.93
31.7
83.
5145
.12
3.40
70.7
34.
8563
.82
1.99
1.85
.24
8.37
.79
20.2
25.
9229
.07
3.64
17.8
53.
2732
.87
6.63
49.2
98.
2651
.43
5.84
22.0
73.
3730
.65
3.40
42.2
72.
5070
.43
3.49
60.1
52.
632.
36.3
28.
33.9
315
.39
6.31
27.8
24.
5516
.09
2.73
40.7
07.
9343
.21
9.39
45.7
74.
8218
.43
2.71
28.6
32.
9039
.52
1.94
63.2
23.
5362
.89
2.71
1.83
.31
6.91
.65
16.7
65.
8227
.00
6.50
16.4
94.
1339
.75
12.2
643
.76
11.0
745
.06
9.93
18.0
74.
2925
.82
5.33
37.3
53.
2665
.57
4.71
56.8
23.
161.
82.4
06.
431.
3815
.93
6.78
23.1
46.
7817
.60
3.51
43.3
410
.90
39.0
712
.23
41.8
66.
7417
.60
3.73
24.9
94.
2140
.04
3.21
67.3
24.
1459
.37
3.02
1.59
.36
6.88
1.29
10.7
63.
8925
.90
7.56
15.5
23.
8647
.82
11.2
836
.65
10.5
741
.23
8.82
15.0
93.
1424
.30
4.53
36.0
22.
7360
.04
3.72
60.1
73.
521.
79.4
95.
771.
3117
.14
6.10
25.8
52.
3019
.53
3.60
37.4
85.
8442
.99
7.00
47.0
85.
9119
.91
3.32
27.6
63.
2541
.60
2.22
70.3
03.
3759
.47
3.04
2.16
.28
8.47
.74
13.9
47.
5324
.62
8.13
15.9
65.
1745
.48
12.5
838
.57
12.7
241
.73
10.7
517
.06
4.91
25.4
66.
1433
.31
6.93
53.9
111
.52
51.8
610
.53
1.52
.43
6.27
1.59
18.8
66.
0827
.82
5.20
20.1
44.
4333
.18
7.30
46.6
89.
4648
.58
6.75
20.3
53.
4828
.31
3.62
41.0
52.
1970
.08
3.69
58.7
82.
182.
04.2
67.
40.7
5
Kon
trola
Nor
-bin
alto
rfim
ina
10-4
MU
-504
88 1
0-7
M +
Nor
10-
6 M
U-5
0488
10-
6 M
+ N
or 1
0-5
MU
-504
88 1
0-5
M +
Nor
10-
4 M
U-5
0488
10-
7 M
U-5
0488
10-
6 M
U-5
0488
10-
5 M
0 o
rdu
Kon
trola
Nor
-bin
alto
rfim
ina
10-4
MU
-504
88 1
0-7
M +
Nor
10-
6 M
U-5
0488
10-
6 M
+ N
or 1
0-5
MU
-504
88 1
0-5
M +
Nor
10-
4 M
U-5
0488
10-
7 M
U-5
0488
10-
6 M
U-5
0488
10-
5 M
0,5
ordu
Kon
trola
Nor
-bin
alto
rfim
ina
10-4
MU
-504
88 1
0-7
M +
Nor
10-
6 M
U-5
0488
10-
6 M
+ N
or 1
0-5
MU
-504
88 1
0-5
M +
Nor
10-
4 M
U-5
0488
10-
7 M
U-5
0488
10-
6 M
U-5
0488
10-
5 M
1 or
du
Kon
trola
Nor
-bin
alto
rfim
ina
10-4
MU
-504
88 1
0-7
M +
Nor
10-
6 M
U-5
0488
10-
6 M
+ N
or 1
0-5
MU
-504
88 1
0-5
M +
Nor
10-
4 M
U-5
0488
10-
7 M
U-5
0488
10-
6 M
U-5
0488
10-
5 M
3,5
ordu
Bat
ezbe
stek
oE
rror
ea
A (%
)B
atez
best
eko
Err
orea
B (%
)B
atez
best
eko
Err
orea
C (%
)B
atez
best
eko
Err
orea
D (%
)B
atez
best
eko
Err
orea
AB
(%)
Bat
ezbe
stek
oE
rror
ea
VC
L (µ
m/s
)B
atez
best
eko
Err
orea
VS
L (µ
m/s
)B
atez
best
eko
Err
orea
VA
P (µ
m/s
)B
atez
best
eko
Err
orea
LIN
(%)
Bat
ezbe
stek
oE
rror
ea
STR
(%)
Bat
ezbe
stek
oE
rror
ea
WO
B (%
)B
atez
best
eko
Err
orea
ALH
(µm
)
Med
iaE
rror
ea
BC
F (H
z)
Doktore-tesia
148 Eranskinak
Eranski
MU
opi
oide
-har
tzai
lear
en a
goni
star
en (M
orfin
a) e
ta a
ntag
onis
tare
n (N
alox
ona)
era
gina
esp
erm
atoz
oide
en m
ugik
orta
sun-
para
met
roet
an
22.2
25.
0941
.63
4.76
17.9
61.
9718
.19
3.12
63.8
54.
4148
.08
1.10
19.7
01.
4129
.90
1.04
41.1
43.
3066
.50
5.78
62.2
31.
831.
70.2
58.
36.8
819
.18
4.75
49.3
65.
5017
.38
3.30
14.0
91.
9468
.54
4.28
50.8
42.
1819
.48
1.42
31.2
81.
4338
.31
2.38
62.1
63.
2461
.51
.70
1.93
.05
8.58
.27
19.1
84.
7549
.36
5.50
17.3
83.
3014
.09
1.94
68.5
44.
2850
.84
2.18
19.4
81.
4231
.28
1.43
38.3
12.
3862
.16
3.24
61.5
1.7
01.
93.0
58.
58.2
719
.18
4.75
49.3
65.
5017
.38
3.30
14.0
91.
9468
.54
4.28
50.8
42.
1819
.48
1.42
31.2
81.
4338
.31
2.38
62.1
63.
2461
.51
.70
1.93
.05
8.58
.27
19.1
84.
7549
.36
5.50
17.3
83.
3014
.09
1.94
68.5
44.
2850
.84
2.18
19.4
81.
4231
.28
1.43
38.3
12.
3862
.16
3.24
61.5
1.7
01.
93.0
58.
58.2
722
.22
5.09
41.6
34.
7617
.96
1.97
18.1
93.
1263
.85
4.41
48.0
81.
1019
.70
1.41
29.9
01.
0441
.14
3.30
66.5
05.
7862
.23
1.83
1.70
.25
8.36
.88
22.2
25.
0941
.63
4.76
17.9
61.
9718
.19
3.12
63.8
54.
4148
.08
1.10
19.7
01.
4129
.90
1.04
41.1
43.
3066
.50
5.78
62.2
31.
831.
70.2
58.
36.8
822
.22
5.09
41.6
34.
7617
.96
1.97
18.1
93.
1263
.85
4.41
48.0
81.
1019
.70
1.41
29.9
01.
0441
.14
3.30
66.5
05.
7862
.23
1.83
1.70
.25
8.36
.88
16.5
95.
0640
.72
2.88
19.8
11.
4322
.89
4.11
57.3
04.
6546
.07
2.06
18.2
91.
6429
.54
1.46
40.0
43.
8162
.54
5.93
64.0
6.5
91.
40.3
17.
061.
5323
.64
5.50
44.6
23.
8913
.54
3.68
18.2
12.
0268
.26
4.84
50.3
93.
4819
.77
1.78
31.0
12.
3039
.42
3.02
63.9
43.
9361
.51
1.46
1.70
.21
7.34
.93
17.1
54.
2740
.14
4.36
23.3
13.
7619
.40
3.96
57.2
94.
6948
.25
2.40
18.9
51.
3829
.11
1.30
39.2
52.
0064
.90
2.66
60.4
51.
541.
85.1
78.
12.8
628
.74
7.18
37.2
43.
6814
.88
.47
19.1
44.
0465
.98
4.45
48.4
62.
0221
.38
1.59
30.4
4.9
444
.65
4.31
70.4
85.
5962
.97
1.21
1.86
.05
7.85
.95
22.4
86.
8142
.76
5.09
16.5
41.
7918
.23
2.52
65.2
33.
0849
.52
2.44
20.2
52.
2231
.06
1.77
40.7
93.
4364
.92
4.68
62.6
51.
081.
82.2
07.
931.
1820
.61
7.46
42.1
42.
8519
.63
2.57
17.6
13.
0262
.76
5.09
47.4
72.
3620
.01
2.22
30.0
51.
8141
.96
3.46
66.5
15.
5663
.17
.95
1.64
.33
7.08
1.53
21.7
11.
1040
.41
5.20
19.9
51.
8217
.93
4.58
62.1
25.
8847
.05
2.89
19.3
2.6
429
.17
1.74
41.3
91.
5466
.69
2.15
62.0
5.9
21.
86.0
78.
18.7
022
.48
6.79
39.1
64.
5617
.91
2.23
20.4
53.
5761
.64
5.43
47.2
22.
2619
.88
1.95
29.7
41.
8241
.90
2.81
66.7
54.
4262
.92
1.86
1.85
.15
8.51
.57
19.2
35.
7534
.72
1.89
22.0
52.
8924
.00
2.51
53.9
54.
8543
.21
2.03
18.7
51.
8727
.66
1.22
43.1
73.
2067
.48
5.06
64.0
41.
021.
65.1
48.
34.4
916
.67
5.40
38.8
73.
8117
.94
2.01
26.5
14.
2455
.54
5.10
45.5
32.
5019
.43
1.70
28.9
61.
6342
.66
2.86
67.1
14.
4463
.59
.66
1.89
.20
7.69
.84
19.9
44.
5834
.17
1.60
19.2
81.
1526
.61
3.70
54.1
13.
6645
.09
2.60
19.7
01.
8628
.09
1.42
43.5
82.
9469
.76
4.06
62.3
8.9
11.
99.1
38.
64.2
023
.01
5.58
37.2
76.
4119
.39
3.20
20.3
24.
2160
.29
7.01
48.6
83.
7120
.85
2.06
30.7
41.
5443
.25
3.90
67.8
35.
4063
.84
2.94
1.82
.38
7.47
1.13
14.8
94.
3735
.92
2.28
19.0
42.
2230
.15
2.67
50.8
13.
4447
.00
1.15
18.1
81.
1529
.09
.92
38.5
91.
9262
.60
3.93
61.8
81.
061.
78.2
77.
961.
2823
.50
4.11
35.1
41.
8218
.81
1.13
22.5
64.
1958
.63
5.24
44.0
02.
0220
.53
1.61
28.3
11.
2046
.57
2.46
72.3
33.
6864
.38
.45
1.82
.12
8.39
.73
20.9
46.
8434
.55
2.77
22.3
72.
1922
.14
3.93
55.5
05.
1543
.05
1.94
19.2
31.
4527
.66
.78
44.8
53.
3969
.35
4.19
64.5
31.
991.
72.1
07.
64.9
617
.40
7.72
31.1
64.
2620
.74
4.25
30.7
05.
9948
.56
9.55
44.7
04.
1117
.18
2.78
27.6
32.
2138
.15
3.84
61.2
05.
3362
.18
2.00
1.65
.22
7.12
1.28
9.67
2.98
36.1
63.
1128
.27
2.40
25.9
13.
5945
.83
5.25
44.2
54.
2216
.88
1.34
27.9
11.
9738
.55
1.34
60.4
21.
4863
.89
2.28
1.63
.29
7.07
.91
7.72
1.37
40.2
62.
9125
.85
1.52
26.1
83.
1247
.97
4.18
45.2
82.
7316
.07
.87
27.8
41.
1135
.60
.96
57.7
32.
1061
.81
1.51
1.61
.30
6.69
1.12
13.8
42.
2436
.48
5.50
23.9
53.
2225
.74
2.62
50.3
14.
7645
.39
4.00
17.8
1.9
227
.94
1.80
40.2
13.
2164
.39
3.53
62.2
02.
121.
98.2
28.
31.7
58.
111.
8734
.82
5.98
23.4
03.
7933
.66
3.85
42.9
47.
1841
.67
5.98
16.1
41.
4926
.66
2.89
39.7
72.
1260
.89
1.14
65.2
12.
711.
60.1
17.
09.7
510
.85
3.30
46.8
63.
7522
.80
2.47
19.4
93.
0257
.71
3.43
51.6
65.
0718
.41
1.72
30.8
01.
7335
.74
1.14
59.5
23.
3060
.54
2.66
1.98
.53
6.40
1.37
4.59
1.44
22.5
36.
0828
.00
2.49
44.8
88.
3227
.12
7.45
30.1
54.
5812
.17
1.46
20.2
42.
6841
.53
2.15
60.9
53.
1268
.47
3.43
1.37
.27
6.57
1.32
8.39
2.24
32.9
95.
5423
.13
4.53
35.4
85.
4541
.38
7.69
42.6
65.
3616
.33
1.46
27.5
42.
6239
.30
2.51
59.5
11.
8965
.94
2.98
1.40
.29
5.84
.95
11.6
73.
6235
.01
4.92
22.0
22.
7431
.32
6.56
46.6
78.
2543
.15
4.05
17.8
41.
9128
.35
2.42
41.4
01.
9462
.60
1.87
66.1
22.
361.
84.2
77.
51.5
5
kont
rola
Nal
oxon
a 10
-4 M
Mor
fina
10-7
M +
Nal
oxon
a 10
-6 M
Mor
fina
10-6
M +
Nal
oxon
a 10
-5 M
Mor
fina
10-5
M +
Nal
oxon
a 10
-4 M
Mor
fina
10-7
MM
orfin
a 10
-6 M
Mor
fina
10-5
M
0 or
du
kont
rola
Nal
oxon
a 10
-4 M
Mor
fina
10-7
M +
Nal
oxon
a 10
-6 M
Mor
fina
10-6
M +
Nal
oxon
a 10
-5 M
Mor
fina
10-5
M +
Nal
oxon
a 10
-4 M
Mor
fina
10-7
MM
orfin
a 10
-6 M
Mor
fina
10-5
M
0,5
ordu
kont
rola
Nal
oxon
a 10
-4 M
Mor
fina
10-7
M +
Nal
oxon
a 10
-6 M
Mor
fina
10-6
M +
Nal
oxon
a 10
-5 M
Mor
fina
10-5
M +
Nal
oxon
a 10
-4 M
Mor
fina
10-7
MM
orfin
a 10
-6 M
Mor
fina
10-5
M
1 or
du
kont
rola
Nal
oxon
a 10
-4 M
Mor
fina
10-7
M +
Nal
oxon
a 10
-6 M
Mor
fina
10-6
M +
Nal
oxon
a 10
-5 M
Mor
fina
10-5
M +
Nal
oxon
a 10
-4 M
Mor
fina
10-7
MM
orfin
a 10
-6 M
Mor
fina
10-5
M
3,5
ordu
Bate
zbe
stek
oEr
rore
a
A (%
)Ba
tez
best
eko
Erro
rea
B (%
)Ba
tez
best
eko
Erro
rea
C (%
)Ba
tez
best
eko
Erro
rea
D (%
)Ba
tez
best
eko
Erro
rea
AB (%
)Ba
tez
best
eko
Erro
rea
VCL
(µm
/s)
Bate
zbe
stek
oEr
rore
a
VSL
(µm
/s)
Bate
zbe
stek
oEr
rore
a
VAP
(µm
/s)
Bate
zbe
stek
oEr
rore
a
LIN
(%)
Bate
zbe
stek
oEr
rore
a
STR
(%)
Bate
zbe
stek
oEr
rore
a
WO
B (%
)Ba
tez
best
eko
Erro
rea
ALH
(µm
)
Med
iaEr
rore
a
BCF
(Hz)
nak 149
Doktore-tesia
CB
1 ka
nnab
inoi
de-h
artz
aile
aren
ago
nist
aren
(AC
EA) e
ta a
ntag
onis
tare
n (S
R14
1716
a) e
ragi
na e
sper
mat
ozoi
deen
mug
ikor
tasu
n-pa
ram
etro
etan
46.2
16.
4617
.54
4.89
9.54
2.10
26.7
14.
3963
.75
2.86
72.1
73.
8153
.02
5.00
58.9
45.
2373
.02
3.40
89.8
51.
5381
.21
3.01
2.03
.02
10.1
7.2
547
.37
5.52
14.1
74.
7510
.70
1.12
27.7
51.
8561
.55
1.41
69.8
11.
5846
.12
4.07
51.2
83.
3666
.05
5.77
89.4
62.
3773
.49
4.78
2.34
.17
10.0
8.5
038
.41
4.78
14.3
04.
1710
.80
1.78
36.5
07.
9152
.71
6.30
66.4
64.
9343
.06
5.83
49.6
35.
6463
.92
4.31
86.0
82.
3274
.10
3.69
2.30
.20
10.3
8.3
937
.07
7.26
14.7
22.
4310
.59
2.02
37.6
25.
7651
.80
5.09
58.4
14.
1038
.17
6.07
42.8
95.
6864
.36
5.55
88.2
62.
5672
.61
4.31
2.13
.12
10.6
4.2
336
.04
1.17
23.7
84.
1017
.22
2.54
22.9
62.
0159
.82
4.19
65.6
74.
8837
.24
4.35
45.3
85.
1056
.26
2.73
82.0
31.
3168
.54
2.78
2.60
.06
9.40
.42
39.5
42.
2820
.39
1.76
10.4
61.
1729
.61
1.82
59.9
31.
9266
.28
2.57
40.3
42.
8246
.64
3.08
60.7
12.
5386
.45
1.08
70.1
82.
382.
40.1
29.
71.1
426
.77
3.48
19.6
04.
3416
.27
2.05
37.3
74.
7146
.38
6.19
55.9
28.
2931
.27
4.85
38.0
95.
9255
.64
1.66
82.1
41.
5367
.78
2.04
2.27
.20
9.45
.19
38.4
42.
4314
.70
3.07
14.0
61.
6632
.80
6.70
53.1
35.
3955
.53
3.46
37.2
93.
6242
.72
4.36
66.7
83.
6287
.42
1.06
76.3
94.
021.
97.0
99.
83.2
342
.34
5.34
15.4
42.
5613
.24
4.04
28.9
82.
2657
.78
3.58
55.5
17.
1237
.68
7.30
42.4
27.
3066
.09
4.78
87.8
72.
3075
.00
3.81
1.95
.07
10.2
1.4
425
.10
3.58
18.7
83.
3614
.39
3.06
41.7
33.
4943
.89
3.67
52.7
92.
1428
.97
2.92
34.7
62.
6954
.58
3.98
82.8
42.
2365
.65
3.25
2.26
.22
9.11
.71
36.9
35.
9127
.45
4.42
10.7
51.
4524
.88
2.86
64.3
83.
5073
.65
6.22
45.3
46.
5154
.18
7.02
60.8
55.
1583
.14
2.78
72.9
14.
402.
45.1
68.
95.6
130
.76
2.63
22.5
52.
5513
.97
2.88
32.7
34.
7453
.31
3.13
58.3
74.
2430
.37
3.93
37.5
63.
4851
.62
4.73
79.9
43.
5564
.22
3.30
2.30
.22
9.11
.27
21.1
44.
5625
.83
6.08
9.39
1.96
43.6
46.
6746
.97
6.69
58.2
77.
7527
.54
5.21
35.8
35.
4946
.89
5.48
75.8
43.
6161
.26
4.01
2.28
.19
8.85
.55
24.8
13.
1619
.47
3.00
18.8
33.
8736
.89
4.42
44.2
83.
0250
.22
6.67
24.8
52.
7930
.95
3.10
50.0
33.
0080
.08
1.75
62.4
23.
042.
37.3
48.
67.3
831
.34
5.44
23.5
04.
8711
.84
1.67
33.3
33.
4054
.84
4.27
59.6
36.
1229
.77
4.70
37.2
44.
7549
.40
3.83
79.2
03.
0762
.10
2.41
2.54
.19
8.04
.41
28.8
04.
0222
.49
1.89
14.2
22.
5034
.50
2.57
51.2
92.
3454
.56
3.78
27.5
42.
6535
.34
2.49
50.6
24.
3277
.60
3.37
64.9
12.
952.
18.1
09.
06.2
221
.84
3.14
21.8
94.
0915
.30
3.58
40.9
86.
3043
.72
3.43
53.1
24.
7225
.65
4.01
33.2
93.
6447
.48
3.67
75.9
14.
2262
.33
1.51
2.32
.14
9.01
.77
23.3
22.
9324
.28
2.17
17.3
12.
0135
.10
3.86
47.6
02.
7450
.91
6.12
23.2
82.
6230
.56
3.27
45.9
82.
3276
.14
2.57
60.3
21.
402.
21.1
98.
75.6
629
.85
2.15
18.2
02.
5613
.21
1.71
38.7
55.
2148
.05
3.96
53.2
24.
6026
.64
3.19
32.7
23.
2949
.55
1.91
80.8
51.
8661
.22
1.00
2.42
.16
8.92
.62
12.9
96.
6920
.28
3.01
17.5
93.
6849
.15
4.05
33.2
73.
7746
.81
6.87
19.1
64.
1427
.35
4.43
40.2
13.
9668
.90
5.19
58.0
81.
312.
04.2
56.
95.9
531
.95
4.48
26.9
14.
3314
.42
1.56
26.7
22.
0458
.87
1.19
67.5
86.
4739
.28
7.20
48.8
57.
0356
.79
5.71
79.1
84.
1871
.27
3.78
2.33
.10
9.62
.16
34.1
94.
2319
.67
1.21
10.8
71.
1235
.28
4.87
53.8
64.
4356
.94
7.47
31.8
85.
4437
.66
5.70
55.1
03.
2283
.82
1.94
65.5
82.
472.
24.0
89.
79.5
325
.35
6.46
22.7
52.
4413
.36
2.22
38.5
54.
5148
.10
5.61
59.0
57.
3227
.66
4.36
36.0
14.
9246
.68
4.45
76.3
13.
4260
.80
2.95
2.46
.12
8.88
.49
18.3
95.
0823
.72
4.06
13.9
93.
5043
.91
7.73
42.1
06.
7449
.85
6.14
22.5
14.
0630
.51
4.33
45.0
95.
4373
.06
5.58
61.1
73.
121.
90.3
67.
59.7
729
.39
4.17
29.6
07.
1015
.93
1.25
25.0
93.
7158
.98
3.05
61.2
03.
9130
.47
5.72
39.5
34.
5649
.39
7.83
75.4
15.
1464
.45
5.49
2.26
.31
8.74
.92
24.0
02.
7823
.49
3.74
17.1
82.
3435
.33
5.89
47.4
94.
5050
.01
5.19
24.6
13.
0731
.90
3.54
49.1
32.
6576
.91
1.91
63.7
51.
862.
33.2
08.
59.3
921
.13
7.39
18.1
7.8
015
.05
2.92
45.6
56.
5739
.31
6.60
50.0
06.
3921
.55
3.08
29.7
63.
0443
.83
5.97
72.2
26.
8660
.10
2.71
2.27
.32
7.53
.47
24.0
96.
8727
.03
4.99
14.3
51.
6734
.55
8.17
51.1
17.
0655
.38
4.89
25.5
74.
7234
.13
3.52
45.9
27.
4773
.09
6.68
61.7
54.
412.
31.2
68.
96.8
720
.00
4.55
23.4
82.
0424
.50
1.58
32.0
34.
9643
.47
3.51
46.6
63.
7020
.68
2.43
27.7
22.
6944
.07
2.68
74.3
12.
6659
.17
1.60
2.27
.12
9.07
.59
6.22
2.71
11.0
61.
9915
.91
3.38
66.8
13.
8017
.28
4.58
39.8
47.
2616
.14
3.73
23.3
54.
2939
.78
1.99
68.0
43.
6958
.52
.52
2.16
.51
6.28
.79
32.0
92.
6024
.44
3.56
15.4
13.
2828
.07
3.48
56.5
33.
8564
.12
4.75
33.2
32.
9241
.92
3.99
51.8
62.
5379
.46
1.53
65.2
32.
672.
88.1
78.
93.2
631
.54
5.25
22.1
74.
1310
.10
1.13
36.2
05.
7653
.70
5.33
62.2
65.
8932
.39
5.38
40.0
84.
4451
.81
7.00
79.3
84.
9364
.49
4.75
2.61
.23
9.15
.39
26.3
55.
5118
.04
6.15
17.2
91.
5038
.32
5.25
44.3
96.
1557
.99
6.38
28.3
94.
0536
.08
4.56
49.1
55.
5578
.43
4.17
62.1
33.
672.
41.2
09.
22.5
112
.34
5.12
17.7
23.
7414
.28
2.53
55.6
63.
7030
.06
2.14
51.3
54.
6522
.45
3.63
31.2
03.
1343
.83
5.67
71.3
66.
1360
.76
2.60
1.88
.32
7.10
1.17
25.6
75.
1921
.93
3.03
12.3
01.
7940
.10
4.43
47.6
04.
6964
.45
7.26
29.7
26.
1338
.67
6.11
44.9
54.
2175
.45
3.98
59.2
52.
622.
80.0
88.
90.8
225
.17
1.02
26.3
9.8
816
.52
3.38
31.9
23.
8551
.56
.53
52.2
83.
5524
.49
2.27
31.8
92.
2546
.65
1.72
76.4
52.
2060
.98
.50
2.49
.21
8.61
.40
17.0
55.
2426
.16
5.47
14.5
5.6
942
.25
7.56
43.2
08.
2047
.16
3.96
19.8
52.
0028
.22
2.19
42.6
94.
2971
.09
6.76
59.9
4.6
01.
96.4
06.
951.
3120
.03
6.49
19.0
7.8
121
.08
4.57
39.8
23.
8539
.11
5.71
45.3
34.
8619
.86
2.74
26.8
92.
6543
.82
3.78
73.1
64.
3259
.68
2.40
2.34
.36
8.44
.60
14.1
82.
9930
.40
3.18
17.8
41.
5337
.58
4.25
44.5
84.
5047
.77
2.46
18.8
91.
7727
.88
1.75
39.6
43.
5767
.56
3.76
58.3
51.
992.
43.1
87.
28.5
81.
391.
119.
461.
5012
.64
3.39
76.5
25.
0510
.84
1.97
35.6
92.
4413
.11
1.56
21.1
81.
4236
.38
2.04
61.3
03.
6259
.40
1.19
.52
.32
1.19
.79
Kon
trola
AC
EA
10-
7 M
AC
EA
10-
6 M
AC
EA
10-
5 M
SR
1417
16a
10-7
MS
R14
1716
a 10
-6M
SR
1417
16a
10-5
MA
CE
A 1
0-7
M +
SR
1417
16a
10-7
MA
CE
A 1
0-6
M +
SR
1417
16a
10-6
MA
CE
A 1
0-5
M +
SR
1417
16a
10-5
M
0 or
du
Kon
trola
AC
EA
10-
7 M
AC
EA
10-
6 M
AC
EA
10-
5 M
SR
1417
16a
10-7
MS
R14
1716
a 10
-6M
SR
1417
16a
10-5
MA
CE
A 1
0-7
M +
SR
1417
16a
10-7
MA
CE
A 1
0-6
M +
SR
1417
16a
10-6
MA
CE
A 1
0-5
M +
SR
1417
16a
10-5
M
0,5
ordu
Kon
trola
AC
EA
10-
7 M
AC
EA
10-
6 M
AC
EA
10-
5 M
SR
1417
16a
10-7
MS
R14
1716
a 10
-6M
SR
1417
16a
10-5
MA
CE
A 1
0-7
M +
SR
1417
16a
10-7
MA
CE
A 1
0-6
M +
SR
1417
16a
10-6
MA
CE
A 1
0-5
M +
SR
1417
16a
10-5
M
1 or
du
Kon
trola
AC
EA
10-
7 M
AC
EA
10-
6 M
AC
EA
10-
5 M
SR
1417
16a
10-7
MS
R14
1716
a 10
-6M
SR
1417
16a
10-5
MA
CE
A 1
0-7
M +
SR
1417
16a
10-7
MA
CE
A 1
0-6
M +
SR
1417
16a
10-6
MA
CE
A 1
0-5
M +
SR
1417
16a
10-5
M
2.00
Bat
ezbe
stek
oE
rrore
a
A (%
)B
atez
best
eko
Erro
rea
B (%
)B
atez
best
eko
Erro
rea
C (%
)B
atez
best
eko
Erro
rea
D (%
)B
atez
best
eko
Erro
rea
AB
(%)
Bat
ezbe
stek
oE
rrore
a
VC
L (µ
m/s
)B
atez
best
eko
Erro
rea
VS
L (µ
m/s
)B
atez
best
eko
Erro
rea
VA
P (µ
m/s
)B
atez
best
eko
Erro
rea
LIN
(%)
Bat
ezbe
stek
oE
rrore
a
STR
(%)
Bat
ezbe
stek
oE
rrore
a
WO
B (%
)B
atez
best
eko
Erro
rea
ALH
(µm
)
Med
iaE
rrore
a
BC
F (H
z)
Doktore-tesia
150 Eranskinak
CB
2 ka
nnab
inoi
de-h
artz
aile
aren
ago
nist
aren
(JW
H-0
15) e
ta a
ntag
onis
tare
n (S
R14
4528
) era
gina
esp
erm
atoz
oide
en m
ugik
orta
sun-
para
met
roet
an
50.7
22.
8021
.35
2.98
8.56
2.39
19.3
72.
1980
.63
2.19
89.6
63.
0261
.82
2.27
70.2
82.
4269
.08
2.73
87.9
4.4
378
.53
2.78
2.45
.07
10.1
0.3
347
.79
2.91
24.5
12.
947.
981.
3619
.74
2.83
80.2
72.
8384
.71
2.84
50.7
23.
0559
.64
2.58
59.8
22.
5984
.88
1.69
70.4
21.
992.
70.1
310
.56
.73
41.6
45.
9027
.60
8.28
8.47
1.95
22.2
92.
1477
.71
2.14
76.6
55.
0044
.29
3.22
53.7
81.
5359
.11
7.01
82.0
94.
1271
.20
5.48
2.60
.37
10.3
4.5
655
.77
3.38
17.4
31.
705.
791.
0921
.02
3.76
78.9
93.
7679
.80
4.13
52.9
04.
3959
.07
4.69
66.0
32.
2789
.49
.30
73.7
72.
332.
41.0
610
.79
.08
46.2
82.
8224
.24
2.35
6.61
.86
22.8
64.
7077
.14
4.70
81.6
22.
4051
.10
2.95
60.1
23.
1462
.72
3.74
84.9
41.
5073
.71
3.42
2.55
.21
10.5
6.3
545
.92
7.95
26.4
96.
509.
722.
2817
.87
4.06
82.1
34.
0675
.97
2.47
44.8
54.
0653
.64
3.38
59.2
75.
7583
.18
3.52
70.7
64.
482.
53.2
610
.38
.69
49.9
92.
7119
.91
3.76
10.8
62.
1219
.25
4.78
80.7
54.
7872
.57
2.35
49.8
21.
3456
.37
2.04
68.6
91.
1088
.50
1.71
77.6
4.6
12.
13.0
610
.30
.17
46.7
02.
8320
.76
3.57
10.6
82.
2221
.86
2.53
78.1
42.
5366
.47
2.53
44.1
61.
6849
.93
2.36
66.4
91.
5388
.55
1.00
75.1
01.
752.
16.0
910
.69
.28
45.9
75.
4019
.65
3.97
9.15
2.11
25.2
35.
6974
.78
5.69
75.5
84.
5750
.96
3.51
57.8
03.
6667
.36
1.67
88.0
91.
6776
.45
.63
2.21
.04
10.3
4.4
750
.79
4.90
21.9
92.
2811
.20
2.39
16.0
32.
7283
.97
2.72
72.9
83.
5946
.78
5.32
54.9
65.
5363
.56
4.64
84.8
01.
7074
.78
4.27
2.28
.14
10.6
8.2
043
.25
4.26
22.7
12.
4310
.96
1.11
23.0
92.
4076
.91
2.40
79.6
72.
2051
.28
4.50
60.6
54.
1764
.06
4.22
84.1
92.
0775
.88
3.44
2.49
.03
9.89
.69
39.5
97.
4221
.62
2.65
10.5
81.
2828
.22
5.32
71.7
85.
3273
.19
5.64
39.8
21.
7547
.77
2.14
55.6
15.
5983
.48
2.69
66.2
34.
812.
78.4
210
.30
.43
37.8
47.
4920
.70
4.79
11.0
41.
4730
.42
2.76
69.5
82.
7675
.00
3.42
42.9
56.
3150
.90
5.48
57.1
37.
1683
.49
3.02
67.8
66.
162.
52.3
19.
46.2
830
.38
5.85
29.5
15.
0614
.07
1.82
26.0
53.
3973
.96
3.39
74.9
15.
4034
.06
2.98
43.3
52.
2246
.36
5.72
78.2
73.
7058
.61
4.45
3.14
.43
10.2
0.2
842
.40
4.79
20.0
04.
8710
.71
1.60
26.9
03.
0073
.10
3.00
71.7
91.
5340
.19
2.00
48.1
1.9
256
.14
3.54
83.4
12.
8667
.12
2.05
2.50
.15
10.2
8.3
341
.83
2.65
20.5
84.
1410
.03
2.20
27.5
74.
2772
.44
4.27
72.8
85.
8443
.54
3.17
51.3
63.
2460
.18
3.68
84.6
82.
0470
.91
2.78
2.42
.23
10.2
5.4
640
.11
1.41
18.1
63.
8811
.51
2.42
30.2
25.
1069
.78
5.10
66.9
74.
7142
.28
3.47
48.6
93.
7463
.48
4.22
86.8
42.
1773
.01
3.97
2.28
.30
9.92
.31
45.2
21.
4418
.93
4.22
10.2
52.
0825
.61
2.04
74.4
02.
0470
.33
5.09
41.1
52.
0148
.45
2.30
58.8
31.
7184
.94
1.55
69.2
81.
782.
55.1
810
.00
.67
42.8
24.
4317
.34
2.83
10.1
21.
8829
.72
3.99
70.2
83.
9972
.49
6.74
42.3
33.
1150
.35
4.12
58.9
63.
5084
.28
1.91
69.8
12.
872.
54.2
110
.24
.49
32.6
25.
9425
.25
4.55
13.4
21.
1228
.72
2.67
71.2
82.
6769
.18
4.53
35.2
33.
9143
.77
3.04
51.7
46.
9079
.89
3.79
63.9
85.
602.
58.2
810
.14
.78
39.0
82.
2626
.12
3.62
14.3
23.
4020
.49
3.28
79.5
13.
2877
.48
4.73
46.5
13.
5655
.44
4.27
60.2
23.
5783
.96
1.52
71.7
13.
922.
69.1
710
.08
.48
36.2
82.
1922
.85
2.62
14.1
22.
6026
.75
1.35
73.2
51.
3571
.49
7.37
40.1
03.
9248
.26
4.15
56.5
03.
6782
.87
1.91
68.0
43.
282.
57.2
49.
60.5
047
.58
5.55
22.1
33.
708.
391.
0821
.91
2.09
78.1
02.
0978
.53
6.79
46.2
65.
2553
.74
4.92
59.3
35.
7985
.61
2.91
68.8
54.
672.
71.3
89.
99.2
330
.56
6.12
31.9
17.
7411
.08
2.37
26.4
54.
6473
.55
4.64
79.2
54.
1435
.53
5.31
45.9
13.
4745
.33
7.28
76.3
25.
7758
.29
4.90
3.35
.38
9.18
.53
39.0
35.
9130
.96
5.54
8.33
2.78
21.6
83.
0978
.33
3.09
77.2
35.
6741
.45
1.85
50.5
3.9
054
.75
5.46
82.0
43.
4766
.30
4.14
2.76
.28
9.33
.45
38.7
54.
7824
.30
6.20
9.86
2.96
27.1
03.
1572
.90
3.15
75.1
67.
2244
.02
1.59
52.0
4.8
960
.47
6.88
84.7
33.
8570
.74
5.38
2.60
.33
10.1
3.5
443
.24
5.84
18.5
21.
7012
.07
1.49
26.1
85.
5473
.82
5.54
71.8
32.
2940
.19
2.02
47.3
81.
8956
.05
2.94
84.7
51.
5966
.05
2.52
2.74
.28
10.5
9.3
042
.52
3.05
22.2
23.
6712
.36
1.97
22.9
03.
9377
.11
3.93
72.9
14.
4641
.22
2.49
49.4
12.
8256
.54
.33
83.4
51.
7767
.85
1.44
2.72
.22
9.72
.32
41.2
53.
7921
.52
2.91
10.5
13.
6026
.71
6.29
73.2
96.
2975
.60
5.02
43.3
22.
4151
.18
2.88
57.7
03.
3184
.70
1.77
68.0
12.
892.
74.2
79.
89.2
735
.24
3.52
28.3
14.
9814
.65
1.30
21.8
01.
7978
.20
1.79
79.3
25.
3238
.73
2.87
48.7
42.
5549
.51
5.09
79.2
22.
3662
.08
4.57
3.31
.35
10.3
2.5
237
.82
3.42
25.3
54.
3913
.52
2.85
23.3
02.
8676
.70
2.86
68.7
44.
5939
.38
4.95
47.2
74.
7257
.01
4.62
82.7
82.
2368
.57
3.73
2.63
.14
9.74
.30
46.6
32.
1622
.96
.72
9.80
.79
20.6
22.
2379
.39
2.23
74.9
54.
2139
.16
1.48
47.2
01.
1452
.80
3.76
82.8
91.
3563
.58
3.84
3.05
.36
9.67
.20
28.9
01.
7932
.76
1.89
13.9
01.
2524
.45
3.28
75.5
53.
2870
.33
4.09
35.0
61.
2044
.72
2.17
50.2
22.
7178
.67
2.61
63.7
51.
692.
84.2
19.
61.4
624
.31
1.35
41.3
82.
3710
.64
.87
23.6
92.
0076
.31
2.00
89.1
96.
4832
.82
.72
45.1
01.
2837
.24
2.04
72.8
2.5
451
.10
2.51
3.80
.41
8.71
.20
41.5
72.
9919
.67
1.55
12.8
51.
6225
.91
2.35
74.0
92.
3573
.81
6.45
42.4
13.
5949
.93
3.38
57.7
03.
4984
.61
2.08
68.1
03.
082.
73.2
49.
91.3
131
.68
3.91
23.3
93.
9215
.26
.91
29.6
82.
9270
.32
2.92
69.6
82.
6835
.42
2.27
43.5
11.
1651
.41
5.29
81.1
83.
0862
.88
3.98
2.86
.19
9.65
.16
33.4
45.
9324
.17
5.29
15.2
41.
8427
.15
4.96
72.8
64.
9668
.74
3.31
35.4
23.
4343
.53
2.69
51.2
12.
8180
.85
2.90
63.2
51.
593.
02.2
99.
94.2
635
.70
2.29
23.7
3.4
815
.71
1.08
24.8
82.
9375
.13
2.93
64.6
73.
8333
.96
.81
41.2
31.
2652
.88
2.19
82.4
2.5
964
.13
2.32
2.83
.36
9.79
.45
38.2
53.
3330
.56
3.79
12.3
73.
3918
.83
2.70
81.1
72.
7069
.35
4.58
35.3
32.
8344
.01
2.24
51.0
02.
9779
.92
2.54
63.7
42.
402.
72.1
99.
69.2
329
.98
2.80
33.1
42.
9511
.62
1.44
25.2
72.
3274
.74
2.32
74.9
51.
7534
.37
1.45
44.4
41.
3446
.07
2.97
77.2
91.
5659
.51
3.14
3.25
.28
9.13
.37
Kon
trola
JWH
-015
10-
7 M
JWH
-015
10-
6 M
JWH
-015
10-
5 M
SR
1445
28 1
0-7
MS
R14
4528
10-
6 M
SR
1445
28 1
0-5
MJW
H-0
15 1
0-7
M +
SR
1445
28 1
0-7
MJW
H-0
15 1
0-6
M +
SR
1445
28 1
0-6
MJW
H-0
15 1
0-5
M +
SR
1445
28 1
0-5
M
0 or
du
Kon
trola
JWH
-015
10-
7 M
JWH
-015
10-
6 M
JWH
-015
10-
5 M
SR
1445
28 1
0-7
MS
R14
4528
10-
6 M
SR
1445
28 1
0-5
MJW
H-0
15 1
0-7
M +
SR
1445
28 1
0-7
MJW
H-0
15 1
0-6
M +
SR
1445
28 1
0-6
MJW
H-0
15 1
0-5
M +
SR
1445
28 1
0-5
M
0,5
ordu
Kon
trola
JWH
-015
10-
7 M
JWH
-015
10-
6 M
JWH
-015
10-
5 M
SR
1445
28 1
0-7
MS
R14
4528
10-
6 M
SR
1445
28 1
0-5
MJW
H-0
15 1
0-7
M +
SR
1445
28 1
0-7
MJW
H-0
15 1
0-6
M +
SR
1445
28 1
0-6
MJW
H-0
15 1
0-5
M +
SR
1445
28 1
0-5
M
1 or
du
Kon
trola
JWH
-015
10-
7 M
JWH
-015
10-
6 M
JWH
-015
10-
5 M
SR
1445
28 1
0-7
MS
R14
4528
10-
6 M
SR
1445
28 1
0-5
MJW
H-0
15 1
0-7
M +
SR
1445
28 1
0-7
MJW
H-0
15 1
0-6
M +
SR
1445
28 1
0-6
MJW
H-0
15 1
0-5
M +
SR
1445
28 1
0-5
M
2 or
du
Bat
ezbe
stek
oE
rrore
a
A (%
)B
atez
best
eko
Erro
rea
B (%
)B
atez
best
eko
Erro
rea
C (%
)B
atez
best
eko
Erro
rea
D (%
)B
atez
best
eko
Erro
rea
AB
(%)
Bat
ezbe
stek
oE
rrore
a
VC
L (µ
m/s
)B
atez
best
eko
Erro
rea
VS
L (µ
m/s
)B
atez
best
eko
Erro
rea
VA
P (µ
m/s
)B
atez
best
eko
Erro
rea
LIN
(%)
Bat
ezbe
stek
oE
rrore
a
STR
(%)
Bat
ezbe
stek
oE
rrore
a
WO
B (%
)B
atez
best
eko
Erro
rea
ALH
(µm
)B
atez
best
eko
Erro
rea
BC
F (H
z)