METABOLITOS SEC LA PATAGONIA AR BIOLÓGICA ...

METABOLITOS SECUNDARIOS DE HEPÁTICAS DE

LA PATAGONIA ARGENTINA. SU ACTIVIDAD

BIOLÓGICA

Tesista:

Directora :

Codirector:


PATAGONIA ARGENTINA. SU ACTIVIDAD

BIOLÓGICA

Lic. José Miguel Gilabert Valero

Dra. Alicia Bardón

Dr. Mario E. Arena

Cascada del lago Steffen, Rio Negro, Argentina.


PATAGONIA ARGENTINA. SU ACTIVIDAD

Foto: Guillermo Palavecino.

Cascada del lago Steffen, Rio Negro, Argentina.

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TUCUMÁN

FACULTAD DE BIOQUÍMICA, QUÍMICA Y FARMACIA HONORABLE CONSEJO DIRECTIVO Dra. Silvia Fernández de Brunetti Dra. María Graciela Agüero Lic. María Cristina Torres Mag. Adriana Correa Zeballos Master María Regina Rintoul Dra. María Ángela Jure Bioq. Farm. David José Merep Sr. Mario Luis Rodríguez Sr. Joaquín Di Pasquale Srta. Cecilia Lludgar Sr. Maximiliano Gastal

DECANA Dra. Silvia Nelina González

VICE-DECANA Dra. Aida Ben Altabef

SECRETARIA DE ASUNTOS ACADEMICOS Dra. Marta Elena Cecilia

JEFA DEL DEPARTAMENTO POSGRADO Lic. Marta Quinteros

DEPARTAMENTO DE POSGRADO

AUTORIDADES

DIRECTORA

Dra. Florencia Fagalde

REPRESENTANTE TITULAR EN EL DEPARTAMENTO DE POSGRADO DE LA UNT

Dra. Rosana Chehín

CONSEJO TITULAR

Dra. Florencia Fagalde Dra. María Inés Ybarra Dra. Adriana María Sales Dra. Nancy Roxana Vera Dra. María Eugenia Bibas Bonet Dra. Rosana Chehín Farm. Mónica Eugenia Nacir

CONSEJO SUPLENTE

Dra. Sonia Beatriz Díaz Dra. María Cristina Rubio de Recúpero

TRABAJO DE POSGRADO PARA LA OBTENCIÓN DEL GRADO ACADÉMICO SUPERIOR DE DOCTOR EN CIENCIAS

QUÍMICAS

PROGRAMA DE POSGRADO EN CIENCIAS QUÍMICAS

Acreditado y Categorizado A-Doctorado según Resolución nº: 115/03 y B-Maestría según Resolución nº: 114/03 ante la

Comisión Nacional de Acreditación Universitaria (CONEAU)

Directora

Dra. Aída Ben Altabef

Comité Académico

Dra. Aída Ben Altabef

Dr. Eleuterio Luis Arancibia Dra. Carola Schuff

TRABAJO DE POSGRADO TITULADO

METABOLITOS SECUNDARIOS DE HEPÁTICAS DE LA PATAGONIA ARGENTINA. SU ACTIVIDAD BIOLÓGICA

TESISTA

Lic. José Miguel Gilabert Valero

DIRECTORA

Dra. Alicia Bardón

CODIRECTOR

Dr. Mario E. Arena

COMISIÓN DE SUPERVISIÓN

Dra. Adriana Neske Dr. Juan Carlos Valdéz

A mi madre y hermanos.

A mi padre quien me incitó a recorrer este camino y a quien extraño

profundamente.

A Marina.

AGRADECIMIENTOS

A la directora de este trabajo de tesis, la Dra. Alicia Bardón, por sus enseñanzas y

sus precisos consejos no sólo en lo relacionado al trabajo científico.

Al codirector de este trabajo de tesis, el Dr. Mario Arena, por su ayuda, confianza y

amistad.

Al Dr. Manuel González Sierra por sus enseñanzas sobre espectroscopia, su

amabilidad y predisposición para registrar los espectros de RMN y por su amistad.

A la Dra. María Schiavone por su invalorable labor en la determinación taxonómica

de las especies estudiadas.

Al Dr. Juan Carlos Valdés y Dra. Adriana Neske, quienes formaron parte de la

comisión de supervisión, por el interés demostrado y sus oportunas sugerencias.

A las personas que colaboraron en el trabajo experimental durante las pasantías

que realizaron en la cátedra, Lic. Karenina Marcinkevicius, Lic. Rodrigo Gibilisco y Lic.

Álvaro Guzmán.

Al Lic. Livio Corzo por la realización del estudio histológico en los ensayos con

insectos.

Al Dr. Alberto Ramos por su ayuda en los ensayos biológicos con bacterias.

A mis amigos y compañeros de trabajo Lic. Federico Arrighi, Lic. Lilian Di Toto

Blessing, Dr. Marcos Derita, Lic. Lucrecia Arias, Lic. Abel Arrollo Aguilar, Lic. Mariana

Díaz y Lic. Eduardo Parellada por su ayuda, compañía y afecto.

A los docentes del Instituto de Química Orgánica y el laboratorio de cromatografía,

Dra. Elena Cartagena, Dra. Nancy Vera, Lic. Marta Ramírez, Dra. María Inés Ibarra y

Dra. Susana Kousal por su buena predisposición para responder a mis preguntas.

A la Dra. Cecilia Socolsky por registrar los espectros de RMN de 500 MHz de algunos

de los compuestos.

Al Consejo de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET) por las becas

otorgadas para la realización de esta tesis.

“I believe the simplest explanation is, there is no God. No one created the universe

and no one directs our fate. This leads me to a profound realization that there

probably is no heaven and no afterlife either. We have this one life to appreciate the

grand design of the universe and for that, I am extremely grateful.”

“Creo que la explicación más simple es, no hay Dios. Nadie creó el universo y nadie

dirige nuestro destino. Esto me lleva a la profunda reflexión de que probablemente no

hay cielo ni tampoco vida después de la muerte. Tenemos sólo esta vida para apreciar

el magnífico diseño del universo y por eso, estoy extremadamente agradecido.”

― Stephen Hawking

INDICE

Resumen…………….……………………………………………..…………………………………….. 13

Capítulo I: Introducción

1.1 Generalidades.…………..……………………………………………………………......... 15

1.2 Antecedentes químicos………………………………………………………………... 19

1.2.1 Terpenoides………………………………………………………………………… 20

1.2.1.1 Monoterpenoides……………………....………………………………………… 20

1.2.1.2 Sesquiterpenoides…………………..………..………………………………….. 20

1.2.1.3 Diterpenoides……………………….……………………………………………... 24

1.2.1.4 Esteroides y triterpenoides…………………………………………………... 25

1.2.2 Compuestos Aromáticos………………………………………………………. 26

1.2.2.1 Derivados del ácido benzoico y del ácido cinámico…………………26

1.2.2.2 Bibencilos……………………………………………………...……………………. 26

1.2.2.3 Bis-bibencilos……………………………………………………………………… 27

1.2.2.4 Dímeros de bis-bibencilos…………………………………………………….. 27

1.2.2.5 Fenoles de cadena alquílica larga………………………………………….. 28

1.2.2.6 Naftalenos e isocumarinas………………………………………………........ 28

1.2.2.7 Neolignanos, fenantrenos, ftálidos y otros compuestos

aromáticos…………………………………………………………………………... 28

1.2.2.8 Flavonoides…………………………………………………………………………. 29

1.2.3 Lipidos………………………………………………………………………………… 30

1.2.3.1 n-Alcanos………………….…………………………………………………………. 30

1.2.3.2 Ácidos grasos………………………………………………………………………. 30

1.2.4 Carbohidratos……………………………………………………………………… 30

1.2.5 Compuestos con azufre………………………………………………………… 30

1.3 Antecedentes biológicos…..………………………………………………………….. 30

1.3.1 Sabores picantes, amargos y dulces.………..…………………………….. 33

1.3.2 Dermatitis alérgica por contacto.………………………………………….. 33

1.3.3 Actividad antitumoral…..………………………………………………………. 34

1.3.4 Actividad molusquicida…..……………………………………………………. 35

1.3.5 Actividad antialimentaria de insectos………….…..……………………. 35

1.3.6 Actividad inhibidora de la liberación de anión superóxido.......... 35

1.3.7 Actividades antimicrobianas y antifúngicas..….…….………………... 36

1.3.8 Actividad piscicida……………..……………….……………………………….. 36

1.4 Referencias………………………………………………………………….……..………… 38

Capítulo II: Materiales y métodos

2.1 Recolección, clasificación y preparación del material

Vegetal………………………………………………………………………………………….. 42

2.2 Extracción….…………………………………………………………………………………. 42

2.3 Purificación y aislamiento..………………………………………………………….. 43

2.4 Identificación de los compuestos..……………………………………………….. 45

2.4.1 Espectroscopía infrarroja (IR)………………………………………………. 45

2.4.2 Espectroscopía ultravioleta-visible (UV)……………………………….. 45

2.4.3 Espectrometría de masas (EM)……………………………………………... 46

2.4.4 Resonancia magnética nuclear (RMN)…………………………………... 47

2.4.5 Dicroísmo circular (DC)……………………………………………………….. 47

2.5 Actividad biológica……………………………………………………………………… 49

2.5.1 Actividad anti-patogénica sobre P. aeruginosa y S. aureus……….49

2.5.1.1 Determinación del crecimiento bacteriano…………………………… 50

2.5.1.2 Determinación de la formación de biofilm……………………….......... 50

2.5.1.3 Evaluación de los efectos sobre el proceso de QS……………………51

2.5.1.4 Ensayo sobre la actividad elastasa………………………………………… 52

2.5.2 Actividad insecticida sobre S. frugiperda……………………………….. 53

2.5.2.1 Insectos y dieta……………………………………………………………………. 53

2.5.2.2 Bioensayo de toxicidad………………………………………………………… 53

2.5.2.3 Análisis histológico………………………………………………………………. 54

2.6 Referencias…………………………………………………………………………………… 55

Capítulo III: Estudio químico de Porella chilensis

3.1 Antecedentes químicos de la familia Porellaceae….……………………. 58

3.2 Clasificación botánica de P. chilensis……………..………………..…………… 58

3.3 Experimental…….………....……………...……………………………………...………... 59

3.3.1 Material vegetal……...………….………………………………......................... 59

3.3.2 Extracción y aislamiento…………………….…………….………………….. 59

3.4 Resultados……………………………………………………………….…...……..……….. 60

3.4.1 Elucidación estructural de los nuevos compuestos 1 y 2………... 60

3.4.2 Determinación de la configuración absoluta de 2………..…............ 64

3.4.3 Determinación de la configuración absoluta mediante cálculos

computacionales y DC………………………………………………………….. 67

3.4.4 Estudio quimiotaxonómico de P. chilensis……………..……….……… 69

3.4.5 Datos espectrales de 1 y 2………………………….…………………..…….. 70

3.5 Referencias…………….…………………………………………..…………..…………….. 72

Capítulo IV: Actividad anti-patogénica de Porella

chilensis

4.1 Generalidades……………………………………………..………………….…………….. 76

4.2 Experimental………………...………………………………………………….…………... 76

4.2.1 Crecimiento bacteriano……………………………………….……………….. 77

4.2.2 Ensayos sobre la formación de biofilm……………..…………….……... 77

4.2.3 Ensayo de efectos sobre el QS…………………………………….…………. 77

4.2.4 Análisis estadístico…..………………………………………………….……….. 77

4.3 Resultados………………………………………………………………………..…….…….. 77

4.3.1 Fusicoccanos……………………………………………………………………….. 78

4.3.2 Pinguisanos…………………………………………………………………………. 78

4.3.3 Aromadendranos…………………………………………………………………. 78

4.4 Referencias….……………………………………………………………………………….. 82

Capítulo V: Actividad insecticida de Porella

chilensis

5.1 Generalidades………………………………………………………………………………. 85

5.2 Experimental…………….…………………………………………………………………. 86

5.2.1 Análisis estadístico......................................................................................... 86

5.3 Resultados y discusión…………………………………………………………………. 87

5.4 Referencias…………………………………………………………………………………… 92

Capítulo VI: Estudio químico de Lepidozia

chordulifera

6.1 Consideraciones botánicas…………………………………………………………... 95

6.2 Clasificación botánica de L. chordulifera……………………………………… 97

6.3 Antecedentes químicos de la familia Lepidoziaceae…………………… 97

6.4 Experimetal………………………………………………………………………………….. 98

6.4.1 Material vegetal..………………………………………………………………….. 98

6.4.2 Extracción y aislamiento………………………………………………………. 98

6.5 Resultados……………………………………………………………………………………. 99

6.6 Estudio quimiotaxonómico de L. chordulifera…….……………..………....104

6.7 Referencias…………………………………………………………………………………… 105

Capítulo VII: Actividad anti-patogénica de

Lepidozia chordulifera

7.1 Generalidades………………………………………………………………………………. 107

7.2 Antecedentes………………………………………………………………………………... 108

7.3 Experimetnal………………………………………………………………………………... 108

7.3.1 Crecimiento bacteriano…….…………………………………….……………. 108

7.3.2 Ensayos sobre la formación de biofilm………………………….………. 109

7.3.3 Ensayo de efectos sobre el QS……………………………………….………. 109

7.3.4 Ensayos sobre la actividad elastasa………………………………………. 109

7.3.5 Análisis estadístico…..…………………………………………………….…….. 109

7.4 Resultados………………………………………………………………………..…….…….. 110

7.4.1 L. chorduliera contra P. aeruginosa……………………………………….. 110

7.4.1.1 Inhibición del crecimiento bacteriano……………………………….….. 111

7.4.1.2 Inhibición de la formación de biofilm……………………………………. 111

7.4.1.3 Inhibición del proceso de QS (inhibición de la producción de

autoinductores)…………………………………………………………………… 111

7.4.1.4 Actividad elastasa…………………………………………………….………….. 111

7.4.1.5 Relación estructura – actividad…………………………………………….. 112

7.4.2 L. chorduliera contra S. aureus……….……………………………………… 114

7.4.2.1 Inhibición del crecimiento bacteriano…………………………………… 114

7.4.2.2 Inhibición de la formación de biofilm……………….…………………… 114

7.4.2.3 Relación estructura – actividad…………………………………………….. 115

7.5 Referencias…………………………………………………………………………………… 116

Capítulo VIII: Resumen de resultados y

conclusiones

8.1 Porella chilensis............................................................................................. ………... 119

8.2 Lepidozia chordulifera…………………………………………………………………. 121

8.3 Actividad biológica………………………………………………………………………. 123

8.4 Referencias…………………………………………………………………………………… 125

Apéndice

Espectros………………………………………………………………………………………………... 130

Resumen

Nuestro laboratorio es el pionero en el estudio químico de especies nativas de hepáticas del norte

argentino y en la descripción estructural de numerosos nuevos compuestos así como de sus actividades

biológicas. Esos resultados unidos a los aportes del presente trabajo de tesis constituyen los únicos

abordajes a la química y actividad biológica de hepáticas en la República Argentina.

Se purificaron e identificaron los metabolitos secundarios de dos especies foliosas de la clase

Hepaticae que crecen en la Patagonia Argentina, y se evaluaron algunos efectos biológicos de los

compuestos mayoritarios aislados de dichas especies, en lo que constituye el primer aporte a la química

de hepáticas de la Patagonia.

Las especies estudiadas fueron Porella chilensis y Lepidozia chordulifera. De la primera se aislaron

cuatro diterpenoides de tipo fusicoccano, dos de ellos nuevos productos naturales, como así también

cuatro sesquiterpenoides de tipo pinguisano y dos de tipo aromadendrano. De Lepidozia chordulifera se

aislaron dos aromadendranos y diez triterpenoides, todos ellos conocidos. Entre los triterpenoides se

encuentran dos taraxanos, tres ácidos triterpénicos frecuentemente encontrados en plantas superiores

y cinco dammaranos.

El aislamiento de los metabolitos se logró mediante el empleo exhaustivo de MPLC y HPLC. La

identificación de los productos aislados se realizó por espectrometría de masas, espectroscopía de

infrarrojo, ultravioleta, RMN protónico y de 13

C con técnicas mono y bidimensionales. Para la

determinación de la estereoquímica absoluta de los diterpenoides nuevos se empleó la técnica de

dicroísmo circular electrónico (medido en el rango del UV).

Se evaluaron las propiedades antipatogénicas de los constituyentes mayoritarios sobre bacterias

patógenas oportunistas de humanos, una cepa de Pseudomonas aeruginosa (Gram -) y otra de

Staphylococcus aureus (Gram +). Estos ensayos se llevaron a cabo sobre bacterias en estado fenotípico

plantónico (vida libre) y en estado fenotípico biofilm. Siendo estos los primeros estudios sobre

compuestos de hepáticas actuando sobre biofilms bacterianos, el sistema de comunicación bacteriana o

quorum sensing (QS), y factores de virulencia. Uno de los compuestos del tipo fusicoccano y los dos del

tipo aromadendrano de P. chilensis inhiben significativamente la formación de biofilm, el crecimiento

bacteriano y el QS. Entre los terpenoides de L. chorudilifera, los cinco compuestos dammaranos y un

aromadendrano inhiben la formación de biofilm de P. aeruginos., Sólo tres de los dammaranos y el

compuesto aromadendrano, previamente mencionado, inhiben también la formación de biofilm de S.

aureus. El crecimiento plantónico no es inhibido por ninguno de estos compuestos. La enzima elastasa,

factor de virulencia, es inhibida por todos los terpenoides de L. chorudilifera, siendo los más activos dos

de los ácidos triterpénicos.

También se determinaron los efectos tóxicos e insecticidas sobre el lepidóptero Spodoptera

frugiperda (insecto plaga del maíz en el norte Argentino), siendo los compuestos del tipo pinguisano los

más activos.

Capítulo I

Introducción

I

METABOLITOS SECUNDARIOS DE HEPÁTICAS DE LA PATAGONIA

ARGENTINA. SU ACTIVIDAD BIOLÓGICA

15 | P á g i n a

I

Capítulo I

Introducción

1.1 Generalidades

Las Briofitas, que comprenden más de 25.000 especies en todo el mundo,

taxonómicamente se encuentran ubicadas entre las algas y las pteridofitas. Las

briofitas representan varias líneas evolutivas muy distintas y se encuentran clasificadas

en tres clases: Musci (musgos, 14.000 especies), Hepaticae (hepáticas, 6.000 especies)

y Athocerotae (antoceros, 300 especies) (Asakawa y col., 2012) (Organigrama 1.1).

Organigrama 1.1. Ubicación de las hepáticas dentro de la división Briophyta.

Las hepáticas son plantas pequeñas y verdes que carecen de un verdadero tejido

vascular. En su cuerpo se distinguen 3 partes: rizoide, caulidios y filidios, análogos

Hierba con cuerno, Antocero

megaceros sp.

Hepática

Bazzania peruviana (Nees) Trev

Musgo

Zygodon pentastichus (Mont.) Müll. Hal.

Musci (musgos) Hepaticae (hepáticas) Athocerotae (antoceros)

División Briophyta



16 | P á g i n a

I

(pero no homólogos) a la raíz, tallo y hojas de los vegetales superiores,

respectivamente. Además, las hepáticas no poseen semillas.

Según presenten o no caulidio y filidios, las hepáticas pueden separarse en dos

grandes grupos, hepáticas foliosas y hepáticas talosas (Figura 1.1).

Figura 1.1. (A) Hepática talosa Conocephalum cunicum (B) Hepática foliosa Plagiochila asplenoides.

El término “hepática” (del latín hepaticus, relativo al hígado) surgió en el siglo IX. La

doctrina “Signatura Rerum” (“Las señales de las cosas”) era un concepto medieval

según el cual la apariencia externa de un cuerpo y su semejanza con otros revelaban su

propósito. El parecido con los lóbulos del hígado de algunas hepáticas talosas llevó a la

gente de la época a creer que sería útil contra dolencias hepáticas. En inglés, se usa el

término “liverwort” que resulta de “liver”, hígado, y la terminación “wort”,

proveniente de “wyrt”, que en inglés antiguo significa “hierba”. Actualmente, no hay

evidencias de que las hepáticas tengan uso alguno en el tratamiento de enfermedades

de hígado.

En cuanto a la clasificación taxonómica, la clase Hepaticae se divide en dos

subclases, Jungermanniidae y Marchantiidae. La primera está constituida por cuatro

órdenes y la segunda por tres (Organigrama 1.2). La clasificación morfológica de las

hepáticas es extremadamente difícil, por lo que un estudio de sus metabolitos

secundarios es invaluable para la asignación de especies.

Respecto a la fitoquímica de las briofitas, cabe destacar que hasta mediados de la

década de mil novecientos setenta era casi completamente ignorada. Esto se debía,



17 | P á g i n a

I

quizás en primer término, a que eran consideradas plantas pequeñas de uso

insignificante en la dieta humana. Por otro lado, la dificultad para colectar una

cantidad suficiente de material puro de una determinada especie desalentaba su

estudio. En la mayoría de los casos sucede que las matas de la especie que se desea

investigar están entremezcladas con varias otras especies, ramas, corteza y raíces de

plantas superiores, y con parte del suelo de donde fueron extraídas. Separar tales

mezclas bajo la lupa o bien a simple vista consume mucho tiempo y convierte esta

tarea en algo tedioso. En otros casos la determinación taxonómica a nivel de especie

es difícil, sino imposible, debido a la falta de estudios botánicos suficientes que

permitan confirmar dicha clasificación.

Sin embargo, la extraordinaria riqueza química por la diversidad estructural de sus

metabolitos secundarios, así como el uso de las hepáticas en la medicina popular en

China y Japón y el interés acerca de su actividad biológica, dieron origen en los últimos

veinte años, al estudio de numerosas especies de hepáticas de todo el mundo. Los

primeros estudios de metabolitos secundarios de hepáticas argentinas fueron

realizados en nuestro laboratorio, con el estudio de los constituyentes químicos de

Dumortiera hirsuta, Plagiochasma rupestre, Marchantia plicata, (Bardón y col., 1999a;

Bardón y col., 1999b; Kamiya, 2000) Porella swartziana, Frulania brasilensis (Bovi Mitre

y col., 2004; Bardón y col., 2002; Asakawa y Bardón, 2001) y Plagiochila bursata

(Ramírez y col., 2010). En el presente trabajo de tesis continuamos con el estudio de

hepáticas argentinas, y en particular, de la Patagonia argentina.

Por las razones antes mencionadas es que estudiamos los productos naturales

presentes en hepáticas, presentes particularmente en los cuerpos oleosos (figura 1.2).

Los cuerpos oleosos producen además de una variedad de terpenoides lipofílicos con

diferentes esqueletos carbonados, una variedad de compuestos aromáticos,

especialmente fenólicos. Muchos de estos constituyentes son particulares de

hepáticas y muestran interesantes actividades biológicas, como antimicrobiana,

antifúngica, citotóxica, antialimentaria de insectos, insecticida, inhibitoria de algunas

enzimas y apoptósis (Asakawa, 2004).


Organigrama 1.2. Clasificación

Figura 1.2. Células con cuerpos oleosos de

killarniensis Pearson). a) 10x, b) 20x, c) 40x, d) 100x

(http://www.chem.gla.ac.uk/staff/davidry/)

Jungermanniidae

Calobryales

Jungermanniales

Takakiales

Metzgariales



Clasificación botánica de las hepáticas.

Células con cuerpos oleosos de Plagiochila bifaria (Sw.)

Pearson). a) 10x, b) 20x, c) 40x, d) 100x. Fotos: Mathis Riehle y David S. Rycroft

(http://www.chem.gla.ac.uk/staff/davidry/)

Clase Hepaticae

Jungermanniidae

Orden

Marchantiidae

Sphaerocarpales

Monocleales

Marchantiales

Subclase



18 | P á g i n a

I

(Sw.) Lindenb. (syn. P.

Fotos: Mathis Riehle y David S. Rycroft

Marchantiidae

Orden



19 | P á g i n a

I

1.2 Antecedentes químicos

Los productos naturales aislados de plantas y microorganismos se han dividido, con

cierta arbitrariedad, en dos grandes grupos: metabolitos primarios y metabolitos

secundarios. Esta división se basa en las características detalladas en la Tabla 1.1.

En esta clasificación, los metabolitos primarios comprenden aquellas sustancias que

se encuentran en todos los organismos vivos, siendo por lo tanto, metabólicamente

esenciales. Un grupo reducido de estos metabolitos primarios, sirve como precursor de

los metabolitos secundarios.

Para el químico el término “producto natural” es sinónimo de metabolito

secundario y una definición más pragmática de metabolito secundario es: “Toda

sustancia que aparenta no tener un papel explicito en la economía interna del

organismo que lo produce”.

Metabolito primario Metabolito secundario

Producto del metabolismo general Producto del metabolismo especial.

Biosintetizado a partir de metabolitos

primarios.

Ampliamente distribuidos en plantas y

microorganismos.

Con distribución restringida a ciertas

plantas y microorganismos (a veces es

característico de un género dado o una

especie en particular).

Ejemplos: Aminoácidos de proteínas

comunes, monosacáridos comunes,

nucleótidos, ácidos carboxílicos del ciclo del

ácido cítrico, lípidos, glicéridos, entre otros.

Ejemplos: Alcaloides, terpenoides,

flavonoides, oligosacáridos, entre otros.

Tabla 1.1. Metabolitos primarios vs metabolitos secundarios.

Se detallan a continuación los metabolitos secundarios de hepáticas aislados hasta

el presente.



20 | P á g i n a

I

1.2.1 Terpenoides

Bajo este nombre se agrupan un gran número de compuestos cuyos esqueletos

carbonados presentan como factor común la unión de unidades de isopreno (2-metil-

1,3-butadieno)

1.2.1.1 Monoterpenoides

Se agrupan bajo este nombre los compuestos formados por la unión de dos

unidades de isopreno, es decir, poseen diez átomos de carbono.

La mayoría de los monoterpenoides fueron separados e identificados por

cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría de masas, razón por la cual las

configuraciones de los centros asimétricos no fueron establecidas.

Se detectaron monoterpenoides tanto en la subclase Jungermanniidae como en la

sub clase Marchantiidae. Los más frecuentemente hallados son α-pineno, β-pineno y

limoneno.

1.2.1.2 Sesquiterpenoides

Las hepáticas son ricas fuentes de sesquiterpenoides. No obstante, una

característica importante de la clase Hepaticae es que muchos de los

sesquiterpenoides aislados de ella, difieren de aquellos encontrados en plantas

superiores en la configuración de uno o más centros quirales. Un claro ejemplo de esta

situación es la que se presenta para los sesquiterpenoides del tipo aromadendranos.



21 | P á g i n a

I

Todos los aromadendranos aislados de hepáticas poseen configuración ent, es decir,

son enantiómeros de los que se encuentran en plantas superiores (Gijsen, 1993).

En general, los organismos vivos biosintetizan estéreo-específicamente uno de los

compuestos del par enantiomérico mediante reacciones enzimáticas estero-

específicas. Por ejemplo, los aminoácidos constituyentes de proteínas y los azucares

poseen normalmente la forma D y L, respectivamente, y sus contrapartes antipodales

no son sintetizadas en absoluto. Sin embargo, salvo raras excepciones, las hepáticas

fabrican sesquiterpenoides que son imágenes especulares de los sintetizados por otros

tipos de plantas. Esto indica que el complejo enzima-sustrato para la síntesis de

sesquiterpenoides en hepáticas puede poseer una conformación inversa a la que

posee en plantas superiores. Este es un hecho importante no solo desde la

quimiotaxonomía, sino también desde la filogenia o historia evolutiva de las hepáticas

(Matsuo, 1982).

Se han aislado gran cantidad y variedad de sesquiterpenoides, en su mayoría de la

subclase Jungermanniidae. A continuación se exponen ejemplos de sesquiterpenoides

aislados de hepáticas que presentan distintos tipos de esqueletos.



22 | P á g i n a

I

OHC

Isobiciclogermacrano

OHC

H H

Lepidozanos

H

Bisabolanos

H

H

Bourbonanos

Calamenanos Calacoranos Cadalenos

O

Cariofilenos



23 | P á g i n a

I



24 | P á g i n a

I

1.2.1.3 Diterpenoides

Estos compuestos se forman por la unión de cuatro unidades de isopreno, es decir,

poseen veinte átomos de carbono.

Las hepáticas también son ricas en diterpenoides. Al igual que en el caso de los

sesquiterpenoides, la mayoría de los diterpenoides de hepáticas poseen la

configuración absoluta opuesta a la encontrada en plantas superiores.

La mayoría de los diterpenoides de hepáticas se aislaron de la subclase

Jungermanniidae, solo se encontraron unos pocos en la subclase Marchantiidae.

A continuación se exponen algunos diterpenoides aislados de hepáticas que

representan los esqueletos más frecuentes.



25 | P á g i n a

I

1.2.1.4 Esteroides y triterpenoides

Los esteroides presentan como estructura general al cicloperhidropentano

fenantreno. Estos compuestos exhiben entre veintisiete y veintinueve átomos de

carbono. Casi todas las hepáticas producen campesterol (24α-metilcolesterol),

stigmasterol (24α-etilcolesta-5,55-dien-3β-ol), sitosterol (24α-etilcolesta-5-en-3β-ol) y

un menor número elaboran brasicasterol.

Los triterpenos se forman a partir de la unión se seis unidades de isopreno y

presentan 30 átomos de carbono. Estos compuestos fueron originalmente aislados de



26 | P á g i n a

I

musgos, helechos y muy a menudo de coníferas, y raramente se han hallado en

hepáticas. Se ha postulado que la biosíntesis de triterpenoides se encuentra bloqueada

tanto en hepáticas como en algas indicando una cercanía evolutiva entre ambas

(Asakawa, 1986).

Entre los pocos triterpenoides aislados, el más frecuentemente encontrado es el

escualeno (C30H50) y se encuentra principalmente en especies de la subclase

Jungermanniidae. En cambio, los compuestos de tipo hopanoide se han obtenido

principalmente de especies de la subclase Marchantiidae.

1.2.2 Compuestos aromáticos

1.2.2.1 Derivados del ácido benzoico y del ácido cinámico

Muy pocos de estos compuestos fueron aislados y parecería que están restringidos

a un pequeño número de especies.

1.2.2.2 Bibencilos

Se han aislado bibencilos tanto de la clase Jungermanniidae como de la clase

Marchantiidae.



27 | P á g i n a

I

Un ejemplo es el ácido lunulárico, hormona de crecimiento que se encuentra

ampliamente distribuida dentro de las hepáticas.

OH

CO2H

OH

Ácido lunulárico

1.2.2.3 Bis-bibencilos

Las hepáticas son ricas fuentes de bis-bibencilos, los cuales resultan de la unión de

dos unidades de bibencilo. Los bis-bibiencilos han sido aislados tanto de de la clase

Jungermanniidae como de la clase Marchantiidae.

1.2.2.4 Dímeros de bis-bibencilos

Resultan de la unión de dos unidades de bibencilos. Todos estos compuestos fueron

aislados de la subclase Jungermanniidae.



28 | P á g i n a

I

1.2.2.5 Fenoles de cadena alquílica larga

Fueron aislados de algunas especies de la subclase Jungermanniidae.

1.2.2.6 Naftalenos e isocumarinas

Solo fueron detectados unos pocos ejemplares de este tipo de compuestos en

hepáticas.

1.2.2.7 Neolignanos, fenantrenos, ftálidos y otros compuestos

aromáticos

También fueron aislados muy pocos neolignanos, fenantrenos y ftálidos de

hepáticas.



29 | P á g i n a

I

1.2.2.8 Flavonoides

Los flavonoides están ampliamente distribuidos en hepáticas, reportes previos

listan la presencia de flavonoides en más de 100 especies pertenecientes a 60 géneros

diferentes de hepáticas.

Entre el 70 y 100% de las Marchantiidae y el 50% de las Jungermanniidae presentan

flavonoides.

Los principales tipos de flavonoides aislados de Marchantiidae son flavonas O-

glucurónidos y C-glicósidos, mientras que los flavonoles son muy escasos.

Dentro de la subclase Jungermanniidae, las Metzgariales son caracterizadas por

flavonas C-glicósidos, las Jungermanniales pro flavonas C y O-glicósidos, y dentro de las

Marchantiidae, Marchantiales, Sphaerocarpales y Monocleales, por flavonas O-

glucurónidos. Los dos últimos órdenes se pueden diferenciar de Marchantiales por la

completa ausencia de flavonas C-glicósidos.



30 | P á g i n a

I

1.2.3 Lípidos

1.2.3.1 n-Alcanos

En hepáticas, la proporción entre n-alcanos con número par e impar de átomos de

carbono es la misma, a diferencia de lo que sucede en plantas superiores en las que

son predominantes los n-alcanos con número par de átomos de carbono.

1.2.3.2 Ácidos grasos

La mayoría de las hepáticas poseen varios ácidos grasos libres. Solo en especies de

los géneros Riccia y Monoclea se encontraron ácidos grasos acetilénicos. En especies

del género Monoclea, se encontraron además ácidos grasos en-ino que están

ampliamente distribuidos en musgos.

1.2.4 Carbohidratos

Se aislaron diferentes carbohidratos de hepáticas, como (-)-D-manitol, (+)-glucosa,

(+)-sacarosa y (+)-trealosa, cuya configuración absoluta coincide con la encontrada en

plantas superiores.

1.2.5 Compuestos con azufre

Las hepáticas presentan un fuerte olor a algas cuando son secadas. Uno de los

responsables de este aroma es el sulfuro de dimetilo.

También se han encontrado ésteres que contienen azufre en sus moléculas.

1.3 Antecedentes biológicos

Los estudios realizados en busca de productos naturales bioactivos, se han

incrementado en los últimos años debido a causas diversas. Una de ellas es la

necesidad de conseguir más alimentos y medicamentos para una población humana



31 | P á g i n a

I

que crece en forma progresiva y para la cual se calcula que, en unos años, será

insuficiente la producción proyectada. Otra causa es el problema de la extinción de

especies vegetales y animales que ocurre día a día debido al exterminio de

ecosistemas realizado a mano del hombre. Esto produce pérdidas irreparables ya que

con ellas se extingue toda la información de los productos naturales que las especies

son capaces de biosintetizar. Otra razón importante se origina en la creciente pérdida

del conocimiento etnobotánico empírico, adquirido por los pueblos a través de miles

de años, debido a la influencia de culturas extrañas a las autóctonas. Todas estas

causas generaron como consecuencia que los investigadores formaran equipos de

trabajo multidisciplinarios para poder afrontar la búsqueda de información sobre

especies bioactivas, la recolección del material y su posterior estudio (Molyneux y

Colegate, 2007).

Por otra parte, el interés en aislar productos naturales biológicamente activos para

su aplicación y no emplear la planta entera u otras preparaciones crudas con motivos

experimentales o terapéuticos, tiene las siguientes justificaciones: las variaciones en

las cantidades de constituyentes activos según el lugar geográfico, las estaciones del

año, condiciones climáticas y ecológicas, las diferentes partes de la planta que se

empleen, la existencia de compuestos indeseables que causen modulaciones

impredecibles de la bioactividad y también la pérdida de la misma debido a

variabilidad en la recolección, almacenado y preparación del material crudo. El empleo

de compuestos puros, además, trae aparejado una serie de ventajas. Entre ellas, la

posibilidad de producir sintéticamente los productos naturales luego de su

determinación estructural, modificarlos estructuralmente y comprender su mecanismo

de acción. Estas investigaciones pueden también complementarse con estudios acerca

de las relaciones estructura-actividad, facilitando el desarrollo de nuevos compuestos

con bioactividad similares o más deseables. También admite la posibilidad de ser

administrado en dosis exactas, reproducibles, con los consiguientes beneficios desde el

punto de vista experimental o terapéutico.

Generalmente, las briofitas no son dañadas por bacterias, hongos, insectos,

caracoles o babosas. Es un hecho conocido que las briofitas contienen aleloquímicos y

hay registros de su uso como plantas medicinales en Norte América, China y Europa.



32 | P á g i n a

I

Hace más de 400 años es conocido el hecho de que algunas especies de Fissidens y

Poytrichum poseen actividad diurética y sus cenizas promueven el crecimiento del

cabello humano. La mayoría de las briofitas con usos medicinales fueron usadas como

decocciones, o bien, trituradas y el polvo resultante mezclado con aceite para hacer un

ungüento con el cual curar cortes, quemaduras y/o heridas externas. Los aborígenes

nativos de América del Norte usaron especies de Bryum, Mnium y Philotonis, y

Politrychum juniperinum como musgos medicinales para curar quemaduras,

contusiones y heridas. Marchantia polymorpha ha sido usada en Europa como

diurético (Asakawa y col., 2012).

En tabla 1.2 se listan las hepáticas usadas en medicina popular, así como los efectos

y actividades fisiológicas atribuidas.

Especie Actividades fisiológicas y efectos

Conocephalum cunicum Antimicrobiana, antifúngica y antipirética. Se emplea

sobre heridas, quemaduras, escaldaduras, fracturas,

tejidos inflamados, picaduras de serpientes venenosas y

tratamiento de cálculos biliares.

Frulania tramarisci Antiséptica

Marchantia polymorpha Antipirética y diurética. Se emplea en heridas,

fracturas, picaduras de serpientes venenosas,

quemaduras, escaldaduras y heridas abiertas.

Reboulia hemisphaerica Se emplea sobre ronchas, heridas abiertas y

contusiones

Tabla 1.2. Hepáticas utilizadas en medicina popular y propiedades atribuidas.

Las actividades biológicas atribuidas a las hepáticas, se deben principalmente a los

terpenoides y compuestos aromáticos presentes en los cuerpos oleosos (figura 1.1).

Además de las actividades biológicas descriptas arriba, algunas briofitas emiten

fragancias características y, dependiendo de la fuente, sabores intensamente picantes,

amargos o dulces.



33 | P á g i n a

I

1.3.1 Sabores picantes, amargos y dulces

Algunos géneros de briofitas producen sustancias que provocan intensos sabores

picantes, amargos o dulces. En ciertos casos estos sabores se deben a la presencia de

sesquiterpenos (Toyota y col., 1991) y diterpenos (Asakawa, 1990). Los más intensos y

picantes se deben a dialdehidos como poygodial y sacculatal (Asakawa y col., 2012).

1.3.2 Dermatitis alérgica por contacto

Muchas hepáticas producen dermatitis alérgica por contacto, especialmente

algunas especies de Frullania. Esta reacción se ha atribuido a la presencia de α-

metilen-γ-lactonas sesquiterpénicas ((+)-frullanolide y (-)-frullanolide) (Molyneux y

Colegate, 2007). En Schistochila appendiculata, se ha atribuido a la presencia de alquil

fenoles, ácidos salicílicos de cadena alquílica larga y sus sales de potasio, como así

también a catecol de cadena larga (Asakawa y col., 1987). Poligodial, antes citado,

también produce este tipo de irritación.



34 | P á g i n a

I

1.3.3 Actividad antitumoral

A través del Instituto Nacional de Cáncer, USA, se investigaron 184 especies de 97

géneros de musgos, 23 especies de 16 géneros de hepáticas y 1 especie de

antocerotales, buscando encontrar posibles agentes antitumorales (Asakawa, 1990).

Se realizaron ensayos sobre la línea celular P388 correspondiente a leucemia linfocítica

de ratón.

El nivel de actividad antitumoral entre las especies de hepáticas fue relativamente

bajo. Entre las 23 especies de hepáticas investigadas solo cuatro presentaron actividad

P388. Ellas fueron las Jungermanniales Bazzania trilobata y Porella bolanderi y las

Marchantiales Conocephalum conicum y Dumortiera hirsuta. De las especies de

musgos estudiadas, 43 de ellas resultaron activas y la única especie de antoceros

estudiada resultó inactiva.

Los constituyentes químicos de hepáticas, musgos y antoceros difieren

considerablemente. En particular, el procedimiento de extracción en los ensayos

mencionados arriba (EtOH caliente durante 8 hs), pudo haber sido demasiado vigoroso

para los constituyentes de hepáticas entre los que se incluyen bibencilos, bis-

bibencilos cíclicos, mono-, sesqui- y diterpenoides que contienen funciones

hemiacetales, dialdehidos, etc, propensos a descomponerse bajo estas condiciones

(Asakawa y col., 2012).

Algunos guaianolidos de Conocephalum conicum también demostraron poseer

actividad anti cáncer contra la línea celular de leucemia linfocítica P388.

Las sustancias ricardin A y B, y el pinguisano dehidropinguisenol aisladas de

Riccardia multifida fueron activas contra las células KB de carcinoma humano. También

las sustancias plagiochilina A de diferentes especies de Plagiochila; eremofrulanolide y

oxifrulanolide de Frullania dilatata; y marchantin A, B y C de diferentes especies de

Marchantia mostraron actividad citotóxica contra células KB (Asakawa, 1982).



35 | P á g i n a

I

1.3.4 Actividad molusquicida

Algunos sesquiterpenoides de tipo cuprano y monociclofarnesano, aislados de

Ricciocarpos natans, el ácido lunulárico y dos bibencilos relacionados con este último,

mostraron tener actividad molusquicida contra Biomphalaria glabrata, vector de la

schistosomiasis (Wurzel y Becker, 1990).

1.3.5 Actividad antialimentaria de insectos

Algunas especies demostraron tener actividad antialimentaria de insectos debido a

ciertos terpenoides presentes en ellas. El más activo resultó ser plagiochilina A, un

sesquiterpeno del tipo secoaromadendrano, aislado de varias especies del genero

Plagiochila, sobre el lepidóptero Spodoptera exempta. Polygodial también mostró

poseer actividad antialimentaria de áfidos (Asakawa, 1990).

1.3.6 Actividad inhibidora de la liberación de anión superóxido

El exceso de anión radical superóxido (O2-) en los organismos es la causa de varias

angiopatías. Se ha demostrado que norpinguisona de Porella vernicosa, el éster

metílico de norpinguisona aislado de P. elegantula, y Perrottetianal A de P.

perrottetiana, inhiben la liberación de superóxido en experimentos realizados con

animales de laboratorio.



36 | P á g i n a

I

1.3.7 Actividades antimicrobianas y antifúngicas

Varias hepáticas mostraron actividad antimicrobiana y otras tantas exhibieron

actividad antifúngica (Molyneux y Colegate, 2007). Ciertos bibencilos prenilados fueron

activos contra Staphylococcus aureus (Asakawa y col., 1991).

Los diterpenoides α-santonina, 8-hidroxi-9-hidroperrotetianal, perrotetianal A y

perrotetianal B también mostraron actividad antimicrobiana contra S. aureus y Bacillus

subtilis. Marchantin A fue activo contra S. aureus (Asakawa, 1990) y Streptococcus

pyogenes (Kamory y col., 1995).

Los diterpenoides del tipo dolabelano, de Odontoshisma denudatum (Matsuo y col.,

1988) y algunos de sus derivados, como así también 3-metoxi-4’-hidroxibibencilo

aislado de Plagiochila stephensoniana (Lorimer y col., 1993), y algunos sesquiterpenos

fenólicos de Herbertus aduncus (Matsuo y col., 1981), demostraron poseer actividad

fungicida. Además se observó que las concentraciones de acido lunulárico en muchas

hepáticas llegan a ser suficientes para prevenir casi completamente el ataque de

hongos (Schwabe, 1990) y que ciertas hidroxi-acetofenonas aisladas de Plagiochila

fasciculata, también mostraron actividad antifúngica (Lorimer y Perry, 1994).

1.3.8 Actividad piscicida

Se observó que los extractos crudos que contenían sustancias picantes poseían

fuerte actividad hemolítica (Asakawa, 1990).



37 | P á g i n a

I

Tanto polygodial como sacculatal, exhiben la mayor actividad piscicida (Asakawa y

col., 2012). Otros sesquiterpenoides como diplophyllin, (+)-frullanolide y plagiochilina

A también mostraron actividad piscicida (Molyneux y Colegate, 2007).

Los estudios antimicrobianos reportados en bibliografía fueron llevados a cabo

sobre bacterias en estado fenotípico plantónico (vida libre)(Ríos y Recio, 2005). En la

actualidad, es un hecho conocido que el 99% de las bacterias viven en comunidades,

utilizando señales químicas para su comunicación y que son capaces de formar biofilm

como mecanismo de resistencia. No parece haber estudios realizados sobre

compuestos de hepáticas actuando sobre biofilms bacterianos o comunicación

bacteriana.

Dado el amplio espectro de actividades biológicas reportados para los productos

aislados de hepáticas, su diversidad estructural, y los estudios previos llevados a cabo

en nuestro laboratorio, consideramos más que interesante la realización de estudios

químicos sobre las especies argentinas de hepáticas, y consecuentemente estudios

biológicos sobre los metabolitos aislados de ellas.



38 | P á g i n a

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Capítulo II

Materiales y Métodos

II



42 | P á g i n a

II

Capítulo II

Materiales y métodos

La estrategia planificada para el estudio químico de las especies vegetales plantea el

seguimiento de una serie de pasos para llevar a cabo el aislamiento e identificación de

los metabolitos secundarios, como así también la posterior determinación de sus

actividades biológicas. Dichos pasos se describen a continuación.

2.1 Recolección, clasificación y preparación del material vegetal

La búsqueda y recolección del material vegetal se realizó en Febrero de 2005 en

lago Steffen, Provincia de Río Negro, Argentina. La búsqueda se realizó en zonas

principalmente húmedas y propicias para el crecimiento de las hepáticas.

Para facilitar la clasificación taxonómica del material vegetal, es conveniente que las

plantas presenten sus estructuras reproductoras. La reproducción de las briofitas se

realiza recién cuando empieza la época lluviosa. Esto se debe a que la fecundación se

lleva a cabo cuando las gotas de agua transportan los espermatozoides desde los

anteridios hasta los arquegonios, donde se encuentran los óvulos.

Una etapa imprescindible previa a la extracción, es la limpieza del material vegetal

que implica quitar las demás plantas (musgos, líquenes, helechos y otras plantas) que

por lo general se encuentran mezclados con la especie que se desea estudiar. Como así

también se debe retirar la tierra adherida a los rizoides.

2.2 Extracción

El material vegetal fue secado al aire y triturado con el fin de aumentar la superficie

de contacto con el solvente y asegurar un buen rendimiento en el proceso de

extracción. Las extracciones fueron llevadas a cabo por maceración a temperatura

ambiente. El material así preparado fue colocado en un erlenmeyer, se cubrió con



43 | P á g i n a

II

solvente y se dejó en reposo por 10 días con agitación ocasional. Luego, el extracto

obtenido se filtró y el solvente se eliminó en evaporador rotatorio. Se realizaron dos

extracciones con éter etílico, obteniéndose un extracto de baja polaridad (extracto

etéreo) y luego, una vez seco el material, se realizaron dos extracciones con metanol

obteniéndose un extracto polar (extracto metanólico).

2.3 Purificación y aislamiento

En primer lugar, el extracto obtenido se somete a un desclorofilado mediante

cromatografía por exclusión con Sephadex LH-20. La cromatografía por exclusión de

tamaño, también denominada cromatografía en gel, es eficiente para separar grupos

de solutos en base a su tamaño efectivo en solución. Las fases estacionarias utilizadas

para lograr estas separaciones son polímeros que han sido entrecruzados de modo que

formen una red abierta con numerosos poros de tamaño uniforme. El grado de

entrecruzamiento en una serie de geles define los diferentes tamaños de poro y rango

de fraccionamiento. Cuando se hace pasar una fase móvil que contiene disuelta una

serie de solutos de distintos tamaños a través de una columna que contiene este tipo

de materiales, las moléculas demasiado grandes para entrar en los poros son

“excluidas” y permanecen en la fase móvil sin interactuar con la fase estacionaria, por

lo tanto, estas son eluidas con rapidez. Las moléculas de menor tamaño pueden

difundir libremente dentro y fuera de los poros del gel, de modo que, en efecto su

trayectoria a través de la columna es más larga y eluirán mas tarde.

Este efecto selectivo de tamaño es utilizado para separar moléculas de gran tamaño

presentes en un extracto, como son las clorofilas, de los metabolitos secundarios de

menor tamaño. La fase estacionaria utilizada para este procedimiento es Sephadex LH-

20, y la fase móvil una mezcla 1:1 CH2Cl2:MeOH.

Una vez que se posee el extracto desclorofilado, se procede a someterlo a una

cratografía en columna de mesada (CC) con el fin de realizar una primera separación

de los componentes químicos agrupados en “paquetes” de compuestos de polaridad

similar. Esta se realiza con Sílica gel de 70-230 Mesh como fase estacionaria y mezcla

de n-hexano – acetato de etilo (100:0 � 0:100) como fase móvil para el extracto



44 | P á g i n a

II

etéreo y acetato de etilo - metanol (100:0 � 0:100) para el extracto metanólico. La

evolución de cada columna de mesada fue monitoreada por cromatografía en capa

fina. Para ello se utilizaron cromatofolios Merck F254 (con indicador fluorescente a 254

nm). El revelado de las placas se realizó por métodos físicos y químicos. El revelado

físico fue logrado por la observación de la placa bajo luz ultravioleta de 254 nm y 350

nm. Este método no destructivo de revelado permite la detección de sustancias que

absorben radiación ultravioleta a la longitud de onda mencionada. El revelador

químico elegido fue el reactivo de Godin (Godin, 1954), seguido de asperjado con una

solución de H2SO4 al 30% y calentamiento en estufa a 110 ºC. Este revelador es útil en

la detección de sustancias oxidables como alquenos, alcoholes y aldehídos y según el

color que presentan las manchas permite tener una idea de qué tipo de compuesto se

trata.

Las fracciones de columna obtenidas fueron procesadas en algunos casos por

cromatografía líquida de mediana presión (MPLC) y por cromatografía de líquida de

alta presión (HPLC) en otros casos. Estas técnicas presentan una mayor resolución que

la cromatografía en columna y difieren entre sí en el tamaño y empaquetamiento de

las columnas, siendo las de HPLC más pequeñas y empaquetadas. Estas técnicas

permiten la resolución de mezclas y la obtención de compuestos puros. Tanto la

técnica de MPLC como la de HPLC, pueden ser llevadas a cabo ya sea en fase normal o

en fase reversa. En fase normal se emplea como adsorbente sílica gel y como fase

móvil mezclas de solventes de baja polaridad (generalmente hexano – acetato de

etilo). En fase reversa, la fase estacionaria es no polar (octilsilano C8 u octadecilsilano

C18) y la fase móvil es polar, usándose con frecuencia mezclas MeOH – H2O o CH3CN –

H2O.

Las cromatografías de MPLC y HPLC se realizaron en un cromatógrafo Gilson con un

refractómetro diferencial como detector con las siguientes columnas: MPLC (A) Merck

LiChroprep Si 60 (40-60 μm, fase normal), HPLC (B) Chemo Pack Develosil 60 (5 μm, 10

mm i.d. x 250 mm, fase normal), (C) Phenomenex Luna C8 (5 μm, 10 mm i.d. x 250 mm,

fase reversa), and (D) Phenomenex Luna C18 (5 μm, 10 mm i.d. x 250 mm, fase

reversa)



45 | P á g i n a

II

2.4 Identificación de los compuestos

La identificación de los compuestos puros obtenidos fue lograda mediante métodos

espectroscópicos. Las técnicas empleadas fueron las siguientes: espectroscopía

infrarroja (IR) y ultravioleta-visible (UV), espectrometría de masas (EM), resonancia

magnética nuclear (RMN) y dicroísmo circular (DC).

2.4.1 Espectroscopía infrarroja (IR)

La espectroscopía infrarroja (IR) permite obtener información sobre los grupos

funcionales presentes en la molécula analizada, siendo una técnica complementaria en

la elucidación estructural. Los espectros de IR fueron obtenidos en un

espectrofotómetro Perkin Elmer GX1.

2.4.2 Espectroscopía ultravioleta-visible (UV)

La espectroscopía ultravioleta-visible es una técnica que brinda información sobre

los grupos cromóforos presentes en la molécula de interés. Para que una molécula

absorba radiación ultravioleta a longitudes de onda de entre 200 y 400 nm, debe

presentar por lo menos uno de los siguientes grupos:

- Dos o más dobles enlaces conjugados

- Un anillo aromático

- Un grupo carbonilo α,β-insaturado

- Un doble enlace adyacente a un átomo adyacente a un átomo con un

par de electrones no compartidos (O, N, S, etc.)

El espectro ultravioleta-visible de una sustancia es sencillo y consta de una o unas

pocas bandas anchas de absorción. Sin embargo la posición exacta de máximos de

absorción puede brindar información sobre el grupo cromóforo presente en la

molécula. Los espectros de UV fueron obtenidos en un espectrofotómetro Shimadzu

UV-160.



46 | P á g i n a

II

2.4.3 Espectrometría de masas (EM)

Esta técnica a baja resolución brinda información estructural por análisis de

fragmentaciones sufridas por la molécula, y en algunos casos permite obtener su peso

molecular redondeado al número entero más cercano. La comparación de los

espectros de masas de baja resolución con espectros de sustancias de referencia

depositados en una biblioteca informática, permite en algunos casos determinar o

confirmar una estructura.

Para analizar una muestra por espectrometría de masas, esta debe ser ionizada.

Con este fin pueden emplearse diferentes métodos, entre las cuales utilizamos las

ionizaciones por electrones (EI) y química (CI).

Los iones formados por ionización por electrones presentan un gran exceso de

energía, que tienden a perder por fragmentaciones del ion molecular formado. Este

hecho hace que el pico correspondiente al ion molecular sea de baja intensidad en

algunos casos e incluso esté ausente en otros.

En la técnica de ionización química se utiliza un gas auxiliar, generalmente metano o

isobutano. Este gas auxiliar es ionizado por impacto electrónico, los iones así formados

reaccionan con la muestra transfiriéndole un protón. Esta reacción da lugar a iones

cuasimoleculares [M+1]+ (m/z = peso molecular + 1), esta ionización es más suave que

la lograda mediante ionización por electrones y los iones cuasimoleculares formados,

de menor energía, sufren menos fragmentaciones dando picos de mayor intensidad.

Los espectros de masas de baja resolución fueron obtenidos en un espectrómetro

Thermo Polaris Q. Este espectrómetro de masas utiliza como detector una trampa de

iones y no un detector de cuadrupolo como la mayoría de los espectrómetros. El

detector de trampa de iones es capaz de producir en algunas situaciones iones

cuasimoleculares cuando se está utilizando ionización por electrones (EI). Este es un

fenómeno observado frecuentemente y está descripto en bibliografía como auto-

ionización química en detectores de trampa de iones (Eichelberger y col., 1987).

Cuando se realiza a alta resolución (HR), la espectrometría de masas permite

obtener el peso molecular exacto del compuesto, y a partir de este valor la fórmula

molecular del compuesto de interés. Esto se debe a que los pesos atómicos no son



47 | P á g i n a

II

números enteros como resultado de la presencia de isótopos. Sólo unas pocas

combinaciones de átomos son capaces de presentar un determinado peso molecular

expresado con cuatro decimales, y es así como se determina la formula molecular.

Los espectros de masas de alta resolución fueron obtenidos en un espectrómetro

JEOL JMS AX 500.

2.4.4 Resonancia magnética nuclear (RMN)

Esta técnica es la más importante en la elucidación estructural de compuestos

orgánicos ya que brinda información sobre la conectividad de los átomos en la

molécula y sobre la disposición espacial de los átomos.

Existen técnicas de RMN unidimensionales y bidimensionales. Dentro de las técnicas

unidimensionales encontramos la resonancia magnética nuclear protónica (1H-RMN) y

de 13

C (13

C-RMN). Dentro de las bidimensionales encontramos las técnicas COSY (en

inglés: “Correlated Spectroscopy” o ”Espectroscopía correlacionada”), HSQC (en inglés:

“Heteronuclear Simple Quantum Coherence” o “Coherencia Cuántica Simple

Heteronuclear”), HMBC (en inglés: “Hetronuclear Multiple Bond Coherence” o

“Coherencia Cuántica Heteronuclear múltiple”) y NOESY (en inglés: “Nuclear

Overhauser Enhanced Spectroscopy” o “Espectroscopía por efecto Nuclear

Overhauser”).

Los espectros de RMN de este trabajo fueron registrados con los siguientes equipos:

- Varian Unity 500 MHz para 1H y 125 MHz para

13C

- Bruker 300 MHz para 1H y 75 MHz para

13C

- Bruker 200 MHz para 1H y 50 MHz para

13C

2.4.5 Dicroísmo circular (DC)

Un rayo de luz polarizado en un plano puede considerarse formado por dos

componentes polarizados circularmente, uno a la derecha y el otro a la izquierda. Estos

componentes están en fase y son de la misma amplitud. Al pasar por un medio

ópticamente activo, cada componente interactúa de manera diferente con los centros

quirales de las moléculas presentes. La interacción de la radiación con la muestra



48 | P á g i n a

II

induce un desfasamiento y un cambio de magnitud diferenciales en ambos

componentes circularmente polarizados de la luz, y estos fenómenos provocan una

rotación del plano de polarización en un ángulo α y la distorsión de este plano genera

una elipse. La rotación del plano y la diferente absorción de las componentes

circularmente polarizadas varían de acuerdo con la longitud de onda, pudiéndose

obtener espectros de estos fenómenos, esto es, gráficas de la rotación o elipticidad

versus la longitud de onda.

Los espectros de dicroísmo circular (DC) permiten obtener configuraciones

absolutas de los compuestos quirales por comparación, ya que la misma configuración

absoluta de dos compuestos con configuraciones electrónicas semejantes, darán

espectros DC del mismo signo. Además, los enantiómeros tendrán espectros de DC que

serán imágenes especulares uno del otro. Existen además reglas empíricas, como la

regla del octante, las cuales permiten predecir el signo de ciertas bandas del espectro

de CD para algunos sistemas específicos (Djerassi, 1960).

Avances producidos en química computacional ofrecen nuevas alternativas en lo

referido a la determinación de configuraciones absolutas de moléculas orgánicas. Es

posible mediante cálculos computacionales obtener los espectros de DC teóricos para

ambos enantiómeros y por comparación con el espectro de CD experimental

determinar la configuración absoluta de una determinada sustancia (Wu y col., 2010).

Los cálculos de los espectros de CD teóricos realizados en este trabajo fueron

realizados con Gaussian 09. Para los cálculos se utilizó la teoría del funcional densidad

(DFT) al nivel B3LYP/6-31G(d) de modo de optimizar la geometría de la molécula.

Luego, se hicieron los cálculos para los correspondientes estados excitados para las

geometrías optimizadas del estado fundamental. Se utilizó DFT dependiente del

tiempo combinado con el modelo PCM (TD-DFT/PCM) con la misma base para calcular

la energía de excitación y la fuerza rotatoria para los 50 primeros estados excitados. El

espectro de ECD (Dicroísmo Circular Electrónico) final fue calculado a partir de las

siguientes ecuaciones:


2.5 Actividad biológica

Los bioensayos ejecutados

o Actividad

aeruginosa

el crecimiento

inductores

o Actividad

esta actividad se realizaron ensayos sobre el crecimiento

y la formación de

o Actividad insecticida contra el lepidóptero

2.5.1 Actividad

Las cepas utilizadas en los ensayos microbiológicos fueron

biofilm (figura 2.1) provenientes de la colección internacional

Collection” (ATCC): P. aeruginosa

aureus ATCC 6538 P, coco Gram positivo

Figura 2.1. Microorganismos formadores de biofilm. A)

aureus

A



Actividad biológica

ejecutados en este trabajo de tesis permitieron evaluar

Actividad anti-patogénica contra el patógeno oportunista

aeruginosa. Para determinar esta actividad se realizaron

el crecimiento bacteriano, formación de biofilm, producción de auto

inductores y actividad elastasa.

Actividad anti-patogénica contra Staphylococcus aureus

esta actividad se realizaron ensayos sobre el crecimiento

la formación de biofilm.

Actividad insecticida contra el lepidóptero Spodoptera frugiperda.

Actividad anti-patogénica sobre P. aeruginosa y

Las cepas utilizadas en los ensayos microbiológicos fueron dos cepas formadoras de

provenientes de la colección internacional “American Type Culture

P. aeruginosa ATCC 27853, bacilo Gram negativo

6538 P, coco Gram positivo.

Microorganismos formadores de biofilm. A) Pseudomonas aeruginosa

B



49 | P á g i n a

II

permitieron evaluar:

contra el patógeno oportunista Pseudomonas

ara determinar esta actividad se realizaron ensayos sobre

producción de auto-

Staphylococcus aureus. Para evaluar

esta actividad se realizaron ensayos sobre el crecimiento antibacteriano

Spodoptera frugiperda.

y S. aureus

dos cepas formadoras de

“American Type Culture

negativo y Staphylococcus

Pseudomonas aeruginosa B) Staphylococcus



50 | P á g i n a

II

Los medios de cultivos empleados fueron:

- Medio Luria-Bertani (LB) para la cepa de P. aeruginosa. (NaCl 1% p/v, extracto de

levadura 0,5% p/v, peptona 0,5% p/v, pH 6,5).

- Medio Müller-Hinton (MH) para la cepa de S. aureus. (Almidon 0,15% p/v, infusión

de carne 0,2% p/v, peptona de caseína hidrolizada 1,75% p/v, pH 7,4).

2.5.1.1 Determinación del crecimiento bacteriano

Un cultivo de 12 h del microorganismo (DO ≥ 1) fue diluido al 10% (v/v) en medio de

cultivo adecuado. El cultivo diluido (190 µl) fue vertido en cada uno de los 96 pocillos

de una microplaca. Además, se prepararon soluciones conteniendo 1 y 0.1 mg/ml de

los compuestos a testear en DMSO – H2O destilada (1:1) y 10 µl de cada una fueron

agregadas individualmente a cada pocillo de la microplaca (8 repeticiones) de modo de

obtener concentraciones finales de 5 y 50 µg/ml. A los pocillos para el control negativo

(8 repeticiones) conteniendo 190 µl de cultivo diluido se les adicionó 10 µl de DMSO –

H2O destilada (1:1). Las placas fueron incubadas a 37 ºC durante 24 h y se determinó el

crecimiento bacteriano espectrofotométricamente a 600 nm en lector de microplaca

(PowerWave XS2, Biotek, VT, USA).

2.5.1.2 Determinación de la formación de biofilm

Para la determinación de la concentración de biofilm se empleó una micro técnica

basada en un protocolo previamente reportado (O'Toole y Kolter, 1998). Luego de

medir el crecimiento bacteriano, el líquido de los pocillos fue descartado y el material

que se mantuvo adherido al plástico (biofilm) fue lavado 3 veces con PBS. El biofilm

que permaneció adherido después del lavado fue teñido con una solución acuosa de

cristal violeta (0.1% p/v) durante 20 min. El exceso de colorante fue eliminado

mediante lavados con H2O y el cristal violeta unido al biofilm fue posteriormente

disuelto en 200 µl de EtOH absoluto. Se determinó la absorbancia a 540 nm usando un

lector de microplaca (PowerWave XS2, Biotek, VT, USA). Ciprofloxacina, un conocido

inhibidor de biofilm (Sandasi y col., 2011), fue incorporado al bioensayo a 5 µg/ml



51 | P á g i n a

II

como control positivo en las mismas condiciones experimentales que las utilizadas

para evaluar los compuestos.

2.5.1.3 Evaluación de los efectos sobre el proceso de QS (sólo P.

aeruginosa)

Un cultivo de 12 h a 37 ºC de la cepa reportera P. aeruginosa qsc 119 (DO ≥ 1)

(Whiteley y col., 1999) en LB fue diluido 10 veces en el mismo medio. Una porción de

25 µl de esta suspensión fue mezclada en cada pocillo de una microplaca con 25 µl de

un sobrenadante libre de células obtenido de un cultivo de P. aeruginosa ATCC 27853

incubado en LB conteniendo 5 y 50 µg/ml de los compuestos a testear durante 24 h.

Azitromicina, capaz de intervenir en los procesos de QS (Tateda y col., 2001), fue usado

a 5 µl/ml como control positivo de inhibición de QS bajo las mismas condiciones que

los compuestos. Los pocillos de control negativos (8 repeticiones) conteniendo 50 µl de

sobrenadante libre de células obtenido de un cultivo de P. aeruginosa ATCC 27853

incubado en LB conteniendo 10 µl de DMSO – H2O (1:1).

P. aeruginosa qsc 119 es una cepa mutante que no produce AHL (moléculas señal

del QS), pero responde a las AHL exógenas con la producción de β-galactosidasa. En

consecuencia, la actividad de β-galactosidasa está bajo el control del QS y en relación

directa con la actividad de autoinductores. La actividad β-galactosidasa fue medida

espectrofotométricamente por el test de Miller (O'Toole y Kolter, 1998).

Luego de una incubación de entre 4 y 5 h de la cepa P. aeruginosa qsc 119 en

presencia del sobrenadante, a cada pocillo se le agregaron 50 µl de buffer Z, 10 µl de

CHCl3 y 5 µl del detergente dodecilsulfato de sodio (SDS) 0,1%. Se incubó a 28 ºC

durante 15 min con agitación suave. A continuación se agregaron 20 µl de solución de

orto-nitrofenilgalactopiranósido (ONPG) (4 mg/ml) a cada pocillo, este compuesto es

un sustrato de la β-galactosidasa y la solución debe ser preparada en el mismo día de

su uso debido a que se descompone en presencia de la luz. Esta se puede guardar en la

heladera por unos pocos días protegida de la luz con papel aluminio. Una vez que se

desarrolló color amarillo claro, entre 3 y 5 h, se registró el tiempo t y se detuvo la

reacción con el agregado de 65 µl de Na2CO3 1M. Finalmente se midió la DO a 420, 550



52 | P á g i n a

II

y 600 nm y se calcularon las unidades de β-galactosidasa mediante la siguiente

fórmula:

�� 1000 � ��420�� 1,75 � ��550��

�� 600��

Donde:

DO420nm = Absorbancia del producto de reacción entre la enzima β-galactosidasa y el

ONPG

DO550nm = Indica la dispersión de luz (partículas)

DO600nm= Indica la densidad celular antes del ensayo

t = Tiempo de desarrollo de color en horas

V = Volumen de cultivo qsc en mililitros

Composición del Buffer Z pH 7,0. Para 1000 ml de agua destilada

Nombre Cantidad (g)

Fosfato dibásico de sodio heptahidratado 16,1

Fosfato monobásico de sodio monohidrato 5,5

Cloruro de potasio 0,75

Sulfato de magnesio heptahidratado 0,246

β-mercaptoetanol 2,7 ml

El compuesto β-mercaptoetanol debe ser agregado en el momento de usar. Se debe

llevar a pH 7 con HCl.

2.5.1.4 Ensayo sobre la actividad elastasa (solo P. aeruginosa)

Las producción de las distintas elastasas de P. aeruginosa está regulada por el

proceso de QS. Para evaluar el efecto de los compuestos aislados sobre la actividad

elastasa de P. aeruginosa se hizo crecer la misma en caldo LB durante 24 horas a 37ºC

en presencia de los compuestos a testear a una concentración de 50 µg/ml.

Posteriormente se separaron las células mediante centrifugación (15 minutos a 11000

rpm). Se midió la actividad elastasa en los sobrenadantes obtenidos luego de la

incubación con los compuestos.



53 | P á g i n a

II

La enzima elastasa degrada la elastina, en presencia del sustrato insoluble rojo

congo-elastina (RC-E), libera el colorante unido a la elastina y este se solubiliza. La

concentración de rojo congo liberado al medio se determina

espectrofotométricamente a 495 nm (Gambello y Iglewski, 1991).

2.5.2 Actividad insecticida sobre S. frugiperda

2.5.2.1 Insectos y dieta

Las larvas de S. frugiperda fueron obtenidas de nuestras colonias de laboratorio,

originalmente colectadas de plantas de maíz (Zea mays) y mantenidas en dieta

artificial durante dos generaciones. Las colonias no fueron previamente expuestas a

insecticidas. Los individuos fueron mantenidos en cámara de cría a 25±1 ºC, 60-70% de

humedad relativa, y un fotoperiodo de 12 h Luz/Oscuridad. La dieta larval consiste de

una mezcla de levadura (3g), poroto hervido y molido (224g), germen de trigo (52g),

agar agar (60g), acido ascórbico (9g), metil-p-hidroxibenzoato (3g), formaldehido (3 ml

de una solución al 40% en agua), y agua (1.5 l).

2.5.2.2 Bioensayo de toxicidad

Una porción de dieta artificial fue impregnada con solvente (acetona) y, después de

remover el solvente, esta porción fue empleada como dieta control. Otras porciones

fueron impregnadas y cuidadosamente mezcladas con una solución en acetona de los

compuestos puros de forma de obtener 100 µg y 200 µg de cada uno por gramo de

dieta. Luego de evaporar el solvente, las dietas control y tratadas fueron puestas en

tubos de ensayos (15 x 1.5 cm, 20 para el control y 20 para tratado). Larvas

cuidadosamente pesadas y de tamaño homogéneo (2do

estadío) fueron puestas

individualmente en cada tubo y mantenidas a 25 ± 1 ºC y 60-70% HR en cámara de cría

(Electro Lab). Los tubos de ensayo fueron cubiertos con un pequeño trozo de algodón

húmedo para prevenir la desecación de la dieta. A las larvas se les permitió

alimentarse con cantidades pesadas ( 50 mg/d) de las dietas control y tratadas hasta el

estado de pupa. Luego de 14 días del inicio del experimento, se pesaron nuevamente



54 | P á g i n a

II

las larvas para obtener el índice de crecimiento (GR) durante ese periodo. El peso de

dieta larval fue también calculado para el mismo período (14 días) de modo de

determinar el índice de consumo (CR). Además, fueron evaluadas las malformaciones

en adultos.

GR = (A-B)/t, es el promedio del incremento del peso larval por día, donde A = peso

larval final, B = peso larval inicial, y t = 14 días (periodo de evaluación) (Ramírez y col.,

2010).

CR = D/t, es el promedio de dieta larval consumida por día, donde D es el peso total

de dieta consumida durante los 14 días del experimento (Ramírez y col., 2010).

2.5.2.3 Análisis histológico

Las larvas (tratadas y control) fueron fijadas con el fijador de Bouin (Carson, 1997)

durante 24 h. Después de la deshidratación en soluciones acuosas de etanol al 70 y

90%, y finalmente en etanol puro, las larvas fueron incorporadas en n-butanol puro

durante 24 h para ablandar la cutícula. Las larvas fueron llevadas a una mezcla de n-

butanol-histowax (1/1) a 60 ºC durante 24 h. Luego, se cortaron secciones de 5-7 µm

de espesor en un micrótomo minot (LEICA RM 2035) y teñidas con hematoxilina-eosina

(H-E). EL análisis histológico fue realizado en un microscópio LEICA DM 1000 y se

tomaron fotografías con una microcámara SONY DSC-W 100.



55 | P á g i n a

II

Referencias

Carson F. L. Histotechnology: A self-instructional text. ASCP Press, Chicago. 1997.

Djerassi C. Optical Rotary Dispersion: Applications to Organic Chemistry. McGraw-

Hill Book Co, New York. 1960.

Eichelberger J. W., Budde W. L. and Slivon L. E. Existence of self chemical ionization

in the ion trap detector. Anal. Chem. 1987, 59, 2730-2732.

Gambello M. J. and Iglewski B. H. Cloning and characterization of the Pseudomonas

aeruginosa lasR gene, a transcriptional activator of elastase expression. Journal of

Bacteriology 1991, 173, 3000-3009.

Godin P. A new spray reagent for paper chromatography of polyols and cetoses. Nature

1954, 174, 134.

O'Toole G. A. and Kolter R. Flagellar and twitching motility are necessary for

Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Molecular Microbiology 1998, 30, 295-

304.

Ramírez M., Kamiya N., Popich S., Asakawa Y. and Bardón A. Insecticidal constituents

from the Argentine Liverwort Plagiochila bursata. Chemistry and Biodiversity 2010, 7,

1855-1861.

Sandasi M., Leonard C. M., van Vuuren S. F. and Viljoen A. M. Peppermint (Mentha

piperita) inhibits microbial biofilms in vitro. South African Journal of Botany 2011, 77,

80-85.



56 | P á g i n a

II

Tateda K., Comte R., Pechere J. C., Köhler T., Yamaguchi K. and van Delden C.

Azithromycin inhibits quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrobial

Agents and Chemotherapy 2001, 45, 1930-1933.

Whiteley M., Lee K. M. and Greenberg E. P. Identification of genes controlled by

quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa. Proceedings Of The National Academy Of

Sciences Of The United States Of America 1999, 96, 13904-13909.

Wu X. F., Hu Y. C., Yu S. S., Jiang N., Ma J., Tan R. X., Li Y., Lv H. N., Liu J. and Ma

S. G. Lysidicins F-H, three new phloroglucinols from Lysidice rhodostegia. Organic

Letters 2010, 12, 2390-2393.

Capítulo III

Estudio químico de

Porella chilensis

III



58 | P á g i n a

III

Capitulo III:

Estudio químico de Porella chilensis

3.1 Antecedentes químicos de la familia Porellaceae

Particularmente, las especies de Porella producen sesquiterpenoides de los tipos

africano, pinguisano, germacrano, guaiano, drimano y aromadendrano, como así

también diterpenoides del tipo sacculatano. (Asakawa y col., 2012; Asakawa, 2004;

Van Klink y col., 2002; Fukuyama y col., 1988; Toyota y col., 1989b; Toyota y col.,

1991a; Quang y Asakawa, 2010; Asakawa y col., 1987; Tori y col., 1993; Tori y col.,

1994; Bovi Mitre y col., 2004; Toyota y col., 1989a). Todos los aromadendranos

encontrados en hepáticas poseen configuracion ent y a algunos de ellos se les conoce

su contraparte antipodal en plantas superiores. (Gijsen, 1993)

3.2 Clasificación botánica de P. chilensis.

Jungermanniidae Marchantiidae

Metzgeriales Takakiales Calobryales Jungermanniales

Suborden

Jungermanniineae Lepidoziineae Ptilidiineae Porellineae Radulineae Pleuroziineae

Familia

Porellaceae

Genero

Porella

Especie

Porella chilensis

Subclase

Clase Hepaticae

Orden

Jubulineae



59 | P á g i n a

III

3.3 Experimental

3.3.1 Material vegetal

El material vegetal de Porella chilensis (Lehm. & Lindenb.) Trevis. (Figura 3.1), fue

recolectado en Febrero de 2005 en lago Steffen, Provincia de Río Negro, Argentina.

Una muestra fue depositada en el herbario Miguel Lillo (LIL Nº 3411), Tucumán,

Argentina.

Figura 3.1. Porella chilensis (Lehm. & Lindenb.) Trevis

3.3.2 Extracción y aislamiento

El material vegetal (573 g) fue extraído a temperatura ambiente por 7 días con éter

etílico para dar 4,8 g de extracto después de la remoción del solvente con rotavapor

(rendimiento 0,84 %). El extracto fue sometido a cromatografía en columna (CC) con

Sephadex LH-20 (MeOH-CH2Cl2, 1:1) y luego a CC con silica gel (70 – 230 mesh) con

hexano y cantidades crecientes de acetato de etilo (AcOEt) y finalmente MeOH como

eluyentes para dar 5 fracciones.



60 | P á g i n a

III

El compuesto 6 (250 mg) fue obtenido como material cristalino a partir de la

fracción I. Después de la separación de 6 por filtración, el material sobrenadante fue

sometido a MPLC con columna A, con hexano y cantidades crecientes de AcOEt (0 –

100%) como eluyente, para dar el compuesto 5 (19 mg) y una nueva cantidad de 6 (12

mg).

La fracción II (98 mg), fue sometida a HPLC con columna B (hexano-AcOEt, 23:2),

para dar los compuestos 8 (6,5 mg) y 9 (6mg).

La fracción III (296 mg) fue procesada por HPLC con columna A con hexano y

cantidades crecientes de AcOEt (5 – 100%) como eluyente, para dar los compuestos 3

(5 mg) y 7 (39 mg).

Por recromatografía en columna de la fr IV con silica gel, usando hexano y

cantidades crecientes de AcOEt (10 – 100%) se obtuvieron 2 subfracciones. El

compuesto 3 (39 mg) fue obtenido de la fracción 1. La fracción 2 fue procesada por

HPLC con columna C (MeOH-H2O 17:3), para dar los compuestos 1 (1,6 mg), 2 (4,3 mg),

4 (7 mg) y una nueva cantidad del compuesto 3 (7 mg).

La fracción V fue sometida a CC con Sephadex LH20 y luego a HPLC con columna D

(MeOH-H2O 3:1) para dar el compuesto 10 (9 mg).

3.4 Resultados

Del estudio del extracto etéreo se obtuvieron dos nuevos diterpenoides del tipo

fusicoccano (1 y 2) junto con dos fusicoccanos conocidos (3 y 4), cuatro

sesquiterpenoides conocidos del tipo pinguisano (5 - 8), y dos aromadendranos

conocidos (9 y 10), siendo norpinguisona (6) el compuesto mayoritario.



61 | P á g i n a

III

Los compuestos conocidos anadensin (3) (Huneck y col., 1983), fusicoauritona (4) (Zapp

y col., 1994), pinguisenol (5) (Asakawa, 1982), norpinguisona (6) (Asakawa, 1982),

norpinguisona acetato (7) (Van Klink y col., 2002), norpinguisona metil ester (8) (Tori y

col., 1993), ent-spathulenol (9) (Asakawa y col., 2012; Nagashima y col., 1993), y ent-

4β,10α-dihidroxyaromadendrano (10) (Nagashima y col., 1993) fueron identificados

por sus caracteristicas espectroscópicas en comparación con los datos de literatura

previamente reportados (Espectros disponibles en Apéndice, página 130).

Algunos de los terpenoides aislados de P. chilensis han sido previamente aislados de

P. acutifolia (Toyota y col., 1991b) (compuesto 5), P. densifolia (Quang y Asakawa,

2010; Asakawa y col., 1987) (6, 8 y 9), P. elegantula (Fukuyama y col., 1988) (8), P.

navicularis (Toyota y col., 1989a) (6 y 8), y P. recurva (Van Klink y col., 2002) (6-8).

3.4.1 Elucidación estructural de los compuestos 1 y 2

El espectro de HREIMS de 1 (2α-hidroxifusicocc-3-en-5-ona) dio un pico para el ion

molecular de m/z 304.2395, consistente con la formula molecular C20H32O2,



62 | P á g i n a

III

correspondiente a cinco grados de instauración. En el espectro 1H RMN (tabla 3.1) se

encontraron señales para cinco metilos, tres de ellos secundarios (δ 0.80, d, J=6.7Hz,

H-19; δ 0.90, d, J=6.6Hz, H-20; δ 1.34, d, J=6.8Hz, H-17) y dos terciarios (δ 0.95, s, H-18;

δ 2.07, s, J=1.0Hz, H-16). El espectro 1H

1H COSY reveló un acoplamiento alílico entre

H-16 y el protón a δ 5.77 (q, J=1.0Hz), indicando su ubicación y su naturaleza olefínica.

En adición, el espectro HMBC (tabla 3.2) mostró picos cruzados entre el sistema AB

metilénico correspondiente a H-1 (δ 1.85, d, J=15.3Hz; δ 1.95, d, J=15.3) y C-2, C-3, C-6,

C-10, C-11, C-12 y C-18, indicando su ubicación en C-1. Las señales a δ 128.5 y 178.1 en

el espectro 13

C RMN (tabla 3.1) corresponden al único doble enlace presente en la

molécula y su ubicación fue deducida por la correlación en el espectro de HMBC entre

el protón olefínico (δ 5.77) y el C-16 (δ 13.3). La única señal carbonílica en el espectro

13C RMN (δ 209.0), fue asignada al C-5 a través de su relación en el espectro HMBC con

H-4 y el protón del metino H-6 (δ 2.50, d, J=10.2), mientras que la única señal de

carbinol en el espectro de 13

C RMN (δ 82.6) fue asignada al C-2 basado en su

correlación HMBC con H-1, H-4, H-6 y H-16. La estereoquímica relativa del compuesto

1, como se representa en la figura 3.2, fue establecida por las correlaciones observadas

en el espectro NOESY entre H-18 y (i) H-1β, (ii) H-6 (con orientación β), (iii) H-9β, (iv)

H-12β, (v) H-13β, (vi) H-17 y (vii) H-19, indicando que todos ellos están ubicados en el

lado β de la molécula. En adición, la estructura conformacional de menor energía

(Figura 3.3) calculada con el programa hyperchem (v8.0.6) (54.73 kcal/mol) es

coincidente con lo propuesto en la figura 3.2. La estereoquímica relativa para C-6 y C-7

(Figura 3.2) es consistente con la constante de acoplamiento observada en el espectro

1H RMN (J=10.2 Hz) entre H-6 (con orientación β) y H-7 (con orientación α) como

muestra la tabla 3.1. Cálculos adicionales con el programa Pcmodel (v6.0) para el

confórmero de minima energía indican un ángulo diedro de 147.3º para HβC(6)-

HαC(7), con un acoplamiento calculado de J=9.1 Hz.



63 | P á g i n a

III

2

111

1213

1410

15

H3C19

CH3

20

6

7

89

5

4

3

O

H3C16

H

H

H

H3C18

H

HH

H

H

H

H

H

H

H

H

CH3

17

H

H

OH

Figura 3.2. NOEs parciales observados para el compuesto 1

Figura 3.3. Conformación de minima energía del compuesto 1 (54.73 kcal/mol)

La formula molecular de 2 (3α-hidroxifusicocc-2(6)-en-5-ona), C20H32O2, fue

deducida de su espectro de HREIMS, el cual muestra un pico para el ion molecular de

m/z 304.2401 (calculado 304.2402) que corresponde a cinco grados de instauración.

Los datos de RMN de 2 (Tabla 3.1) mostraron una cercana similitud con los del

compuesto 1. En el espectro 1H NMR se detectaron cinco señales de metilos, tres de

ellos secundarios (δ 0.84, J=6.7Hz, H-19; δ 0.87, J=6.5 Hz, H-20; δ 1.05, J=6.9 Hz, H-17),

y dos terciarios (δ 1.01, s, H-18; δ 1.43, s, H-16). Las señales a δ 146.2 y 169.9 en el

espectro 13

C NMR (Tabla 3.1) y la ausencia de protones olefínicos indicaron que el

doble enlace es tetrasustituido. Su locación fue deducida por las correlaciones HMBC

(Tabla 3.2) entre H-4 (2.54 ppm) y ambos, C-2 y C-6. El único grupo OH fue ubicado en

C-3 basado en las correlaciones HMBC entre C-3 y H-1, H-4 y H-16. La posición del



64 | P á g i n a

III

único carbonilo (δ 205.04) en el espectro 13

C RMN pudo ser inferida por la correlación

HMBC entre C-5 y H-1. La estereoquímica relativa del compuesto 2 fue establecida por

correlaciones NOESY (Figura 3.4) observadas entre H-18 y (i) H-1β, (ii) H-8β, (iii) H-

12β, (iv) H-16 y (v) H-19, indicando que CH3-16, CH3-18 y el grupo isopropilo en C-14,

están todos en posición β. Correlaciones entre H-14 y (i) H-10 y (ii) H-15 indican que

todos ellos permanecen en el lado α de la molécula.

Figura 3.4. NOEs parciales observados para el compuesto 2

3.4.2 Determinación de la configuración absoluta de 2

La configuración absoluta de 2 fue determinada en base a su espectro de CD el cual

mostró una traza similar a la de las ciclopentenonas sesquiterpénicas A y B, (Bovi Mitre

y col., 2004) las cuales comparten caracteristicas estructurales con el compuesto 2. En

ciclopentenonas α,β-insaturadas, la transición n→π* del grupo carbonilo produce una

banda de absorción débil entre 310 y 350 nm. Para este tipo de compuestos se

observan efectos Cotton a las longitudes de onda mencionadas (Stöcklin y col., 1970;

Djerassi y col., 1957). El espectro de CD de 2 muestra un efecto Cotton negativo (Δε317

−5.11) como puede ser predicho por la regla del octante (Djerassi y col., 1960; Moffitt y

col., 1961). De acuerdo al espectro de NOESY, el CH3-16 cae en el cuadrante superior

derecho (−) dada su orientación pseudoecuatorial, mientras que el resto de los



65 | P á g i n a

III

sustituyentes alrededor del cromóforo carbonilo tienen contrapartes simétricas o caen

cerca del plano del carbonilo y por consiguiente, ejercen un bajo “peso” en el efecto

Cotton (figura 3.5). La estereoquímica del los compuestos A y B (Bovi Mitre y col.,

2004) fue establecida en base a el signo negativo de su efecto Cotton para la transición

n→π* del anillo de la ciclopentenona (Δε336 −2.61 y Δε350 −0.68), entonces el

compuesto 2 y los compuestos A y B pertenecen la misma serie estereoquímica.

OH

CH3

+

+

-

-

5

4

32

6

Figura 3.5. Aplicación de la regla del octante para el compuesto 2.



66 | P á g i n a

III

En base a razones biogenéticas, la configuración absoluta de los nuevos

fusicoccanos 1 y 2 puede ser asumida como la misma que la de los compuestos 3 y 4,

para los cuales su configuración absoluta fue determinada por síntesis total (Kato y

col., 1994; Williams y col., 2007). En los compuestos 1-4, la ubicación del grupo OH en

el lado α de la molécula está soportado por los resultados obtenidos para las

reacciones de oxidación con oxigeno singlete de fusicoccadienos (Kato y col., 1994) en

las cuales el ataque del 1O2 ocurre estereoselectivamente en la cara α de la molécula,

dando α-epoxidos en el anillo de ciclopentenona. Estas transformaciones constituyen

síntesis del tipo biogenética de fusicoccanos oxigenados (Figura 3.6).

Figura 3.6. Reacciones de oxidación con oxigeno singlete de fusicoccadienos.



67 | P á g i n a

III

3.4.3 Determinación de la configuración absoluta mediante cálculos

computacionales y DC

Tal como se describe en el capítulo II, es posible acceder a la configuración absoluta

de una molécula mediante la combinación del cálculo computacional y su espectro de

dicroísmo circular. Para tal fin se realizaron cálculos computacionales para la obtención

de los espectros de DC teóricos para los cuatro compuestos fusicoccanos (1 - 4). La

figura 3.8 muestra los espectros de DC experimental, y teórico calculado para el

epímero con la configuración absoluta tal cual se muestra en su estructura.

Figura 3.7. Espectros de DC experimental y teórico calculado para el compuesto 1

Dado que compuestos epímeros presentan espectros de dicroísmo circular que son

imágenes especulares uno del otro, y dado que el espectro teórico calculado para el

epímero propuesto coincide en el signo de las bandas presentes en el espectro

experimental, se deduce que la configuración absoluta propuesta para 1 también se

sustenta en cálculos basados en modelos teóricos.

-10

-8

-6

-4

-2

0

2

4

6

200 250 300 350 400

∆∆ ∆∆E

λλλλ (nm)

Compuesto 1 (2a-hidroxifusicocc-3-en-5-ona)

DC teórico

DC experimental



68 | P á g i n a

III

Las figuras 3.8, 3.9 y 3.10 muestras los espectros de DC experimental y calculados

para los fusicoccanos 2, 3 y 4. En todos los casos, la configuración absoluta a la que se

aborda es idéntica a la obtenida por otros métodos.



-15

-10

-5

0

5

10

15

20

25

30

200 250 300 350 400

∆∆ ∆∆E

λλλλ (nm)

Compuesto 2 (2αααα-hidroxifusicocc-3-en-5-ona)

DC teórico

DC experimental

-50

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

40

200 250 300 350 400

∆∆ ∆∆E

λλλλ (nm)

Compuesto 3 (Anadensin)

DC teórico

DC experimental



69 | P á g i n a

III


3.4.4 Estudio quimiotaxonómico de P. chilensis

Las especies de Porella fueron divididas en nueve quimiotipos: drimano-

aromadendrano-pinguisano (tipo I), sacculatano (tipo II), pinguisano (tipo III),

pinguisano-sacculatano (tipo IV), africano (tipo V), santalano-africano-ciclofarnesano

(tipo VI), guaiano (tipo VII), germacrano-pinguisano-sacculatano (VIII), germacrano-

africano-guaiano (tipo IX). (Asakawa, 2004)

Basado en los terpenoides presentes en P. chilensis, esta especie puede estar

ubicada en un nuevo quimiotipo (X), que contiene pinguisanos, aromadendranos y

también fusicoccanos.

-35

-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

5

10

15

200 250 300 350 400

∆∆ ∆∆E

λλλλ (nm)

Compuesto 4 (Fusicoauritona)

DC teórico

DC experimental



70 | P á g i n a

III

3.4.5 Datos espectrales de 1 y 2

Compuesto 1 Compuesto 2

H δδδδH C δδδδC H δδδδH C δδδδC

1a 1.85 d (15.3) 1 51.1 1a 2.49 d (14.1) 1 37.2

1b 1.95 d (15.3) 2 82.6 1b 2.73 d (14.0) 2 169.9

4 5.77 q (1.0) 3 178.1 4a,b 2.54 s 3 76.1

6 2.50 d (10.2) 4 128.5 7 2.60 m 4 50.8

7 2.01 m 5 209.0 8a 1.59 m 5 205.0

8a 1.64 m 6 54.2 8b 2.00 m 6 146.2

8b 2.28 m 7 30.5 9a,b 1.68 m 7 31.3

9a 1.44 m 8 36.3 10 2.01 m 8 31.9

9b 1.72 m 9 19.4 12a 1.24 dd (11.3, 6.5) 9 26.3

10 2.23 m 10 48.6 12b 1.69 m 10 43.2

12a 1.38 m 11 43.9 13a 1.46 m 11 44.4

12b 1.56 m 12 45.9 13b 1.57 m 12 40.3

13a,b 1.37 m 13 23.4 14 1.94 m 13 24.9

14 1.50 m 14 49.3 15 1.74 m 14 46.3

15 1.80 m 15 28.3 16 1.43 s 15 28.6

16 2.07 d (1.0) 16 13.3 17 1.05 d (6.9) 16 28.4

17 1.34 d (6.8) 17 20.7 18 1.01 s 17 21.5

18 0.95 s 18 24.4 19 0.84 d (6.7) 18 22.9

19 0.80 d (6.7) 19 19.4 20 0.87 d (6.5) 19 20.3

20 0.90 d (6.6) 20 23.9 - - 20 24.4

Tabla 3.1. Datos espectrales 1H NMR (500 MHz) y

13C NMR (125 MHz) de los compuestos 1 y 2

(CDCl3).

Constantes de acoplamiento (J en Hz) son dadas en paréntesis.

Señales indicadas con m fueron multipletes no resueltos o superpuestos.

Las asignaciones para 13

C fueron confirmadas por mediciones HSQC y DEPT.



71 | P á g i n a

III

Compuesto 1 Compuesto 2

H C H C

1a 2, 3, 10, 11, 18 1a 2, 3, 6, 10, 11, 12

1b 2, 6, 11, 12, 18 1b 2, 3, 6, 11, 12, 18

4 2, 3, 5, 6 ,16 4a,b 2, 3, 5, 6, 16

6 1, 2, 5, 7, 8, 17 9a,b 11

8a 10 10 8, 9, 11,14, 15, 18

8b 7, 9, 10, 17 12a 10, 11, 14, 18

9b 7, 8, 10, 11 12b 1, 11, 13, 18

10 8, 9, 11, 14, 15, 18 13a 14, 15

12a 13 13b 10, 11, 12, 14, 15

12b 10, 18 15 10,13,14, 19, 20

15 14, 19, 20 16 2, 3, 4

16 2, 3, 4 17 7

17 6, 7, 8 18 1, 10, 11, 12

18 1, 10, 11, 12 19 14, 15, 20

19 14, 15, 20 20 14, 15, 19

20 14, 15, 19 - -

Tabla 3.2. Correlaciones HMBC para los compuestos 1 y 2

Compuesto 1 (2α-hidroxifusicocc-3-en-5-ona): Solido blanco amorfo; [α]D -10º (c

0.42, CHCl3)27D; UV (MeOH) λmax (log ε) 221 (4.0) nm; CD (EtOH) ∆ε326 +4.14,

∆ε234 −8.96, ∆ε209 +3.96 (c 2.88x10-4

M); IR νmax CHCl3 cm-1

: 3416, 2920, 1690, 1633,

1452, 1378; 1H y

13C NMR (tabla 1); HRMS: encontrado 304.2395; C20H36O2 requiere

304.2402; EIMS: m/z (rel. int.): 304 [M]+ (11), 286 [M - H2O]

+ (69), 271 [M - H2O - Me]

+

(8), 261 [M - C3H7]+ (8), 243 [M - H2O - C3H7]

+ (62), 176 [M - 128]

+ (97), 135 [M - 169]

+

(100).

Compuesto 2 (3α-hidroxifusicocc-2(6)-en-5-ona): Aceite incoloro; [α]D -4º (c 0.56,

CHCl3)29D; UV (MeOH) λmax (log ε) 241 (4.0) nm; CD (EtOH) ∆ε317 −5.11, ∆ε245 +19.29,

∆ε210 −8.69 (c 4.11x10-4

M); IR νmax CHCl3 cm-1

: 3407, 2920, 1685, 1624, 1462, 1372; 1H y

13C NMR (table 1); HRMS: encontrado 304.2401; C20H36O2 requiere 304.2402; EIMS:

m/z (rel. int.): 304 [M]+ (47), 286 [M – H2O]

+ (27), 271 [M - H2O - Me]

+ (5), 261 [M –

C3H7]+ (80), 243 [M - H2O - C3H7]

+ (100), 225 [M - 79]

+ (95), 201 [M - 103]

+ (37).



72 | P á g i n a

III

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Capítulo IV

Actividad anti-patogénica

de Porella chilensis

IV



76 | P á g i n a

IV

Capítulo IV

Actividad anti-patogénica de Porella

chilensis

4.1 Generalidades

Los biofilms bacterianos son complejas comunidades de bacterias embebidas en

una matriz de exopolisacaridos. Esta matriz es producida por las bacterias incluidas en

ella y la misma se encuentra adherida a superficies inertes o vivas. Los

microorganismos en estado de biofilm son más resistentes a antibióticos y al sistema

inmunológico del huésped que las células planctónicas. En Pseudomonas aeruginosa la

formación de biofilm, la producción de factores de virulencia y la resistencia a

antimicrobianos son regulados por el proceso de quórum sensing (QS) (Costerton y

col., 1999). A través de este proceso, las bacterias son capaces de interactuar unas con

otras y coordinar la expresión de genes de acuerdo a la densidad de población

empleando comunicación química. En bacterias Gram negativas, el proceso de QS

toma lugar vía la emisión y recepción de señales moleculares difusibles,

particularmente N-acilhomoserin lactonas (AHL), conocidas como autoinductores de

QS (Greenberg, 1997). Controlar la producción de biofilm y/o el proceso de QS de P.

aeruginosa empleando compuestos naturales puede ser una buena estrategia en la

búsquedas de nuevos antimicrobianos.

Productos naturales, como lactonas sesquiterpénicas y acetogeninas anonáceas,

son capaces de alterar la formación de biofilm de P. aeruginosa (Cartagena y col.,

2007).

Los 10 terpenoides aislados de P. chilensis fueron evaluados en su habilidad para

inhibir el crecimiento bacteriano, la formación de biofilm y la producción de

autoinductores en una cepa de P. aeruginosa.



77 | P á g i n a

IV

4.2 Experimental

4.2.1 Crecimiento bacteriano

El crecimiento bacteriano fue determinado espectrofotométricamente a 600 nm en

lector de microplaca (ver capítulo II). A los pocillos para el control negativo se les

adicionó un volumen de una mezcla DMSO – H2O destilada (1:1) en vez de los

compuestos a evaluar. El valor de la absorbancia del control negativo fue 1.34.

4.2.2 Ensayo de formación de biofilm

La formación de biofilm fue determinada por la técnica de cristal violeta en

microplaca (ver capítulo II). La absorbancia del control negativo fue 2.75.

Ciprofloxacina, un conocido inhibidor de biofilm (Sandasi y col., 2011), fue

incorporado al bioensayo a 5 µg/ml como control positivo en las mismas condiciones

experimentales que las utilizadas para evaluar los compuestos.

4.2.3 Ensayo de efectos sobre el QS

La cuantificación de autoinductores para determinar los efectos sobre el QS fue

determinada mediante el uso de la cepa reportera P. aeruginosa qsc 119 (ver capítulo

II). La actividad del control negativo fue 15.2 expresado como unidades de miller.

Azitromicina, capaz de intervenir en los procesos de QS (Tateda y col., 2001), fue

usado a 5 µl/ml como control positivo de inhibición de QS bajo las mismas condiciones

que los compuestos testeados.

4.2.4 Análisis estadístico

Los datos son presentados como media ± desviación estándar (DS). Las diferencias

significativas entre valores se establecieron con el test de Student. Valores de p ≤ 0.05

fueron considerados significativos.



78 | P á g i n a

IV

4.3 Resultados

4.3.1 Fusicoccanos

Como se muestra en la figura 4.1a (página 80), los compuestos del tipo fuscicoccano

alteraron el crecimiento bacteriano en formas diferentes. El compuesto 1 incrementó

el crecimiento en un 15 % a 50 µg/ml, mientras que los compuestos 3 y 4 inhibieron

significativamente el crecimiento bacteriano a la misma dosis (16 y 25 %) en relación al

control negativo. A 50 µg/ml, los fusicoccanos 1, 2 y 4 produjeron un fuerte aumento

en la producción de biofilm (95, 93 y 105 %, respectivamente) comparado con el

control negativo. Estos resultados indican que la formación de biofilm depende del

incremento en la producción de autoinductores más que del crecimiento bacteriano

(figura 4.1a). El compuesto 3 es el único fusicoccano que fue capaz de inhibir el

crecimiento bacteriano y la formación de autoinductores. Estos efectos conllevan a

una inhibición en la producción de biofilm.

4.3.2 Pinguisanos

El crecimiento bacteriano fue levemente acrecentado por todos los pinguisanos,

tanto a 50 como a 5 µg/ml (figura 4.1b, página 80). Para los compuestos 5 y 6 se

observó una buena correlación entre crecimiento bacteriano, formación de biofilm y

producción de autoinductores. El compuesto 7 fue capaz de inhibir en 27 y 20 % la

producción de biofilm a 50 y 5 µg/ml, respectivamente. Es importante resaltar que el

compuesto 8 produjo incrementos en el crecimiento bacteriano y la formación de

autoinductores que no resultaron en un aumento en el porcentaje de biofilm.

4.3.3 Aromadendranos

Los compuestos 9 y 10 inhibieron significativamente no sólo el crecimiento

bacteriano, sino también la producción de biofilm y autoinductores incluso a 5 µg/ml

(figura 4.1c). La inhibición de autoiductores producida por 10 (80 %) no está sólo



79 | P á g i n a

IV

relacionada con la inhibición sobre el crecimiento bacteriano (24 %), sugiriendo que el

proceso de QS también fue alterado.

Sólo el fusicoccano 3 es tan potente como ciprofloxacina en la inhibición de

formación de biofilm (figura 4.1a), mientras que los aromadendranos 9 y 10 son menos

potentes que el antibiótico a la misma concentración (figura 4.1c).

El antibiótico ciprofloxacina, utilizado como control positivo de inhibición de

formación de biofilm, produjo una inhibición del crecimiento de 73 % e impidió en un

51 % la formación de biofilm a 5 µg/ml, mientras que el antibiótico azitromicina,

utilizado como control positivo de inhibición de QS, no alteró significativamente el

crecimiento bacteriano pero inhibió en un 76 % el proceso de QS a la misma dosis.

Los compuestos fusicoccanos y pinguisanos comparten algunas características

estructurales con algunos productos naturales capaces de inhibir la producción de

autoinductores de P. aeruginosa. Algunas furanonas halogenadas (Givskov y col., 1996;

Manefield y col., 2002), como así también el ácido penicilico y patulina (Rasmussen y

col., 2005) portan anillos de furanona, los cuales aparentemente juegan un papel

importante en la inhibición de la formación de biofilm. Desde nuestros resultados, es

difícil evaluar los requerimientos estructurales para la actividad. En la serie de

fusicoccanos (todos contienen un anillo de ciclopentanona), pequeñas diferencias en la

estructura molecular alteran el proceso de QS, inhibiéndolo o estimulándolo. Estos

efectos diferenciales (inhibición o estimulación) fueron también previamente

reportados para una serie de análogos de N-acilhomoserinlactonas estructuralmente

relacionados (Smith y col., 2003). Es importante destacar que los aromadendranos 9 y

10, que inhibieron ambos parámetros (formación de biofilm y autoinductores), no

están estructuralmente relacionados a ningún compuesto activo previamente

reportado. Mientras que los inhibidores de QS más potentes (dos análogos de AHLs

sintéticos) (Devienne y Raddi, 2002) producen una inhibición del 50 % a 2 y 6 µM. El

efecto producido por los terpenoides de P. chilensis puede ser considerado moderado

(9 produce 33% de inhibición a 16.4 µM).



80 | P á g i n a

IV

4.1a)

4.1b)

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220%

Compuestos (µµµµg/mL)

Fusicoccanos

Crecimiento Biofilm QS

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220

%


Pinguisanos




81 | P á g i n a

IV

4.1c)

Figura 4.1. Efectos de los compuestos 1-10 y controles positivos en crecimiento bacteriano,

formación de biofilm y producción de autoinductores (expresado en porcentaje). a) Fusicoccanos, b)

pinguisanos, c) aromadendranos.

Entre los productos naturales que afectan la producción de biofilm en P.

aeruginosa, los más potentes son cuatro germacranólidos (lactonas sesquiterpénicas)

que inhiben más del 70% a 0,6 µM (Cartagena y col., 2000). Ninguno de los

compuestos aislados de P. chilensis es tan potente. De hecho, el fusicoccano 3 y los

aromadendranos 9 y 10 inhiben 47, 41 y 37% de la formación de biofilm a 16.4 µM

respectivamente.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220%


Aromadendranos




82 | P á g i n a

IV

Referencias

Cartagena E., Bardon A., Catalan C. A. N., De Hernadez Z. N. J., Hernandez L. R. and

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Capítulo V

Actividad insecticida de

Porella chilensis

V



85 | P á g i n a

V

Capítulo V

Actividad insecticida de Porella chilensis

5.1 Generalidades

Los estudios relacionados a las interacciones insectos-plantas son relevantes para el

desarrollo de nuevos pesticidas basados en plantas. Estas interacciones involucran

metabolitos secundarios de plantas que actúan como reguladores de crecimiento y

antialimentarios. Estos metabolitos secundarios actúan afectando los sistemas

hormonal y nervioso, como así también el estomago y tejidos musculares (Senthil-

Nathan y col., 2008).

El canal alimentario de insectos está constituido por 3 zonas, el intestino anterior,

medio y posterior. En Lepidóptera, el intestino medio está constituido por células

columnares, caliciformes, endócrinas y regenerativas. Estas células se encuentran

involucradas en procesos de absorción y secreción de enzimas, homeostasis iónica y

renovación del epitelio (de Sousa y col., 2009). Las células epiteliales del intestino

medio están protegidas del contenido del intestino por una delicada película de quitina

llamada membrana peritrófica (MP). La MP es secretada por las células columnares del

epitelio digestivo envolviendo los alimentos consumidos por el insecto y puede actuar

como una barrera física y química para la entrada de patógenos. Esta membrana

compartimenta la digestión y protege las microvellosidades de las células epiteliales

del contacto directo con las partículas de alimento, permitiendo así el pasaje de

enzimas digestivas hacia el lumen, y consecuentemente, la absorción de los productos

de digestión (Lehane, 1997; Terra, 2001). La MP actúa como una potencial línea de

defensa reduciendo o eliminando la absorción de ciertos aleloquímicos (Barbehenn,

2001) y controlando los procesos de detoxificación.

Previamente fue reportado (de Sousa y col., 2009) que las alteraciones en el

intestino medio afectan el crecimiento y desarrollo de insectos como resultado de

cambios fisiológicos en los cuales están involucrados la transformación y absorción de



86 | P á g i n a

V

alimento. Muchos reportes indican que los productos naturales de plantas pueden

producir alteraciones histológicas en el canal alimentario de insectos cuando son

incorporados a la dieta larval. Las larvas del lepidóptero Plodia interpunctella,

alimentadas con el producto natural harmalina a 250 µg/g y 20-hidroxiecdisona a 50

µg/g, exhibieron severos daños en las células epiteliales del intestino medio (Rharrabe

y col., 2007; Rharrabe y col., 2009), mientras que larvas del S. frugiperda alimentadas

con 60 µg/g de aceite de neem (Azadirachta indica) mostraron necrosis de células

columnares, regenerativas y caliciformes (Roel y col., 2010). Las larvas de S. exigua

mostraron daño en la MP después del tratamiento con el producto natural

goniothalamin a 10 µg/g (Senthil-Nathan y col., 2008). En base a los resultados

mencionados anteriormente y dado que las larvas de S. frugiperda causan daño por

consumo de follaje a mas de 80 especies de plantas, muchas de las cuales tienen

importancia agrícola como algodón, sorgo y diferentes pastos y forrajes (Murúa y Virla,

2004), decidimos evaluar la toxicidad y efectos en el canal alimentario producido por

los terpenoides 2-8 y 10, en larvas de S. frugiperda. El objetivo de este estudio fue

evaluar los efectos de los terpenoides aislados de P. chilensis en el desarrollo y

supervivencia de larvas de S. frugiperda evaluando las alteraciones producidas en el

intestino medio.

5.2 Experimental

Los procedimientos experimentales para las determinaciones se describen en

capítulo II.


Los resultados son reportados como Media ± DS. Las diferencias en los valores

medios fueron evaluadas por análisis de varianza (ANOVA). El test de Dunnett fue

utilizado para la comparación de los diferentes grupos con el grupo control. En todos

los análisis estadísticos, un valor de P > 0,05 fue considerado no significante. Los

valores fueron calculados con el software Sigmaplot 12.0.



87 | P á g i n a

V

5.3 Resultados y discusión

Los compuestos 2-8, y 10 fueron incorporados a la dieta larval de S. frugiperda a

100 µg por g de dieta mientras que 3 y 5-8 fueron agregados a 200 µg/g.

No se detectaron diferencias significativas (P > 0,05) en los valores del índice de

consumición (CR) en las dosis testeadas. Sin embargo, la determinación del índice de

crecimiento (GR) durante 14 días, mostró que en el mencionado periodo, los

compuestos 3 y 5-8, a 200 µg/g, produjeron una disminución del 42, 70, 55, 51 y 63 %

en el crecimiento larval respectivamente (figura 5.1), en relación al control. Además, a

200 µg/g, el tratamiento con los compuestos 3 y 5-8 produjo mortalidades del 10, 40,

50, 30 y 45% respectivamente (tabla 5.1). A 100 µg/g, solo los compuestos 2, 6 y 8

redujeron significativamente el crecimiento larval en 26, 19 y 35% respectivamente,

comparado con el control, indicando un efecto dosis dependiente. A la misma dosis,

los compuestos 2-8 y 10 mataron 20, 5, 15, 25, 30, 20, 20 y 30% de la población larval,

respectivamente (tabla 5.1). Los valores de mortalidad mostrados no fueron ajustados

a la mortalidad natural observada en el grupo de control (5%). Los tratamientos no

produjeron mortalidad pupal ni mortalidad o malformaciones de adultos.

Mortalidad larval (%)

Compuesto 100 µg/g 200 µg/g

Control 5 5

2 20 ND1 3 5 10

4 15 ND1 5 25 40

6 30 50

7 20 30

8 20 45

10 30 ND1

1No Determinado

Tabla 5.1. Índices de mortalidad producidos por los compuestos 2-8 y 10 en larvas de Spodoptera

frugiperda a 100 y 200 µg/g, calculados a los 14 días de exposición (n=20).



88 | P á g i n a

V

Figura 5.1. Índice de crecimiento porcentual en relación al control (considerado 100%) calculado a

los 14 días de exposición (n = 20). *Para los tratamientos a 100 µg/g, los compuestos 2, 6, 7 y 8

mostraron diferencias significativas en comparación al grupo control (test de Dunnet, F = 7,27, df = 126,

P < 0,001). Para los tratamientos a 200 µg/g, todos los compuestos mostraron diferencias significativas

en comparación con el grupo control (test de Dunnet, F = 18,4, df = 81, P < 0,001).

Los resultados de la evaluación histológica de la pared del intestino medio de larvas

de S. frugiperda tratadas con los compuestos 2-8 y 10 a 100 µg/g y el grupo de larvas

control se muestran en la figura 5.2. El compuesto 2 (figura 5.2c) produjo una lisis

parcial de las células epiteliales y alteró sus núcleos, en los cuales pudo observarse

cromatina densa.

Los compuestos 5 y 6, mostraron las alteraciones más importantes en el epitelio del

intestino medio, siendo 6 el terpenoide que produjo los mayores índices de

mortalidad. Como se muestra en las figuras 10d y 10e. La MP y la capa epitelial se

encuentran ausentes, quedando solo el tejido muscular y restos de epitelio esparcidos

en el lumen. Para los compuestos 7 (figura 5.2f) y 10 (figura 5.2h) se observó deterioro

en la región apical de las células. Mientras que el tratamiento con el compuesto 8

produjo lisis parcial del tejido epitelial como puede observarse en la figura 5.2g.

Además, todos los compuestos mencionados destruyeron la MP, la cual no fue

* **

**

*

*

*

*

0

20

40

60

80

100

120

control 2 3 4 5 6 7 8 10

% c

reci

mie

nto

Compuestos

Indice de crecimiento GR (100 ug/g)

GR (200 ug/g)



89 | P á g i n a

V

detectada en el analisis histológico de las larvas tratadas. Los tratamientos con los

compuestos 3 y 4 a 100 µg/g no produjeron alteraiones histológicas en el intestino

medio. Como se mencionó en el parrafo anterior, los compuestos 3 y 4 no inhibieron el

crecimiento larval a la dosis mencionada.

Las alteraciones histológicas son en parte responsables de la disminución en el

crecimiento bacteriano de las larvas. Los compuestos testeados produjeron

alteraciones histológicas similares a las reportadas para el aceite de neem (A. indica)

(Roel y col., 2010) incoporado a la dieta de larvas de S. frugiperda a 400 ppm. Es

importante resaltar que el compuesto activo del aceite de neemes el

nortetraterpenoide azadirachtin. Comparado con los productos naturales gonithalamin

(Senthil-Nathan y col., 2008) y 20-hidroxiecdisona (Rharrabe y col., 2009), previamenta

evaluados en su toxicidad contra larvas de lepidopteros, los terpenoides reportados

aquí prodecen el mismo efecto a concentraciones mayores. Sin embargo, los

terpenoides testeados son mas toxicos (producen el mismo efecto a dosis menores)

que harmalina (Rharrabe y col., 2007), un compuesto natural reportado capaz de

generar daños histológicos en larvas del lepidoptero P. intepunctella.

Este es el primer reporte sobre los efectos y daños histológicos producidos por los

terpenoides de P. chilensis en el epiteliodel intestino medio de S. frugiperda. Los

terpenoides de hepáticas, que en muchos casos son enantiomeros de los encontrados

en plantas superiores, han sido raramente investigados en su potencial para controlar

insectos, a pesar de que algunos pocos mostraron actividades promisorias.

La exploración del potencial insecticida de los terpenoides de P. chilensis indica que

se requieren mas estudios para caracterizar el espectro completo de los efectos letales

y subletales que estos pueden producir. Aunque los terpenoides de P. chilensis no son

tan toxicos como otros productos naturales como azadirachtin (Martinez y Van Emden

2001) o los esteroles de Myrtillocactus geometrizans (Cespedes y col. 2005), sus

estructuras son bastantes mas simples, y en consecuencia, más faciles de obtener por

procedimientos de sintesis.






90 | P á g i n a

V



91 | P á g i n a

V

Figura 5.2. Microscopia óptica del intestino medio de Spodoptera frugiperda (teñidas con

hematoxilina-eosina). a: Sección de larva donde el intestino medio es claramente observado (10X, barra

de escala: 400 µm). b: Fragmento de intestino medio de larva control donde la capa epitelial es

observada en detalle (100X, barra de escala: 40 µm). c: Fragmento de intestino medio de larva tratada

con 100 µg/g de compuesto 2 donde se observa lisis parcial de las células epiteliales (100X, barra de

escala: 40 µm). d: Fragmento de intestino medio de larva tratada con 100 µg/g de compuesto 5 donde la

capa epitelial está ausente (100X, barra de escala: 40 µm). e: Fragmento de intestino medio de larva

tratada con 100 µg/g de compuesto 6 donde la capa epitelial está ausente (100X, barra de escala: 40

µm). f: Fragmento de intestino medio de larva tratada con 100 µg/g de compuesto 7 donde se observan

células epiteliales con destrucción apical (100X, barra de escala: 40 µm). g: Fragmento de intestino

medio de larva tratada con 100 µg/g de compuesto 8 donde se observa lisis parcial del tejido epitelial

(100X, barra de escala: 40 µm). h: Fragmento de intestino medio de larva tratada con 100 µg/g de

compuesto 10 donde las células epiteliales muestran destrucción apical (100X, barra de escala: 40 µm).

(PM) membrana peritrófica; (M) tejido muscular; (�) capa epitelial; (L) lumen; (C) células columnares,

(G) células caliciformes; (R) células regenerativas; (CM) musculo circular; (LM) musculo longitudinal; (AD)

destrucción apical de las células; (RE) epitelio remanente; (DM) destrucción de la membrana celular.



92 | P á g i n a

V

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Capítulo VI

Estudio químico de


VI


Capítulo VI

Estudio químico de

6.1 Consideraciones botánicas

La especie Lepidozia chordulifera

constituida por plantas de color verde claro a verde

longitud y hojas pinnadas o bipinnadas,

raramente flageliformes, curvadas hacia abajo en la punta

inserción de la hoja es oblicua. Hojas del tallo distantes a imbricadas, asimétricas,

aovado–truncadas, 0,4 mm de longitud, 0,3 a 0,4 mm de ancho en la base

dorsal fuertemente convexo,

ventrales enteros o dentados, divididas en 4 segmentos desiguales desde la mitad de

su longitud, triangulares

sobre troncos, base de árboles o suelo

Figura 6.1. Lepidozia chordulifera



Estudio químico de Lepidozia chordulifera

Consideraciones botánicas

Lepidozia chordulifera pertenceciente a la familia Lepidoziaceae

constituida por plantas de color verde claro a verde–marrón con

longitud y hojas pinnadas o bipinnadas, las ramas laterales de 5 a 10 mm de longitud,

raramente flageliformes, curvadas hacia abajo en la punta (figura 6.1)


truncadas, 0,4 mm de longitud, 0,3 a 0,4 mm de ancho en la base

dorsal fuertemente convexo, ya sea entero o con 1 a 2 dientes conspicuos

ntrales enteros o dentados, divididas en 4 segmentos desiguales desde la mitad de

su longitud, triangulares. Esta especie crece formando tapices sueltos o almohadillas

sobre troncos, base de árboles o suelo (Ardiles y col., 2008).

Lepidozia chordulifera (Ardiles y col., 2008).



95 | P á g i n a

VI


pertenceciente a la familia Lepidoziaceae está

tallos de 5 cm de

las ramas laterales de 5 a 10 mm de longitud,

(figura 6.1). La línea de


truncadas, 0,4 mm de longitud, 0,3 a 0,4 mm de ancho en la base con margen

entero o con 1 a 2 dientes conspicuos y márgenes

ntrales enteros o dentados, divididas en 4 segmentos desiguales desde la mitad de

formando tapices sueltos o almohadillas



96 | P á g i n a

VI

6.2 Clasificación botánica de L. chordulifera

6.3 Antecedentes químicos de la familia Lepidoziaceae

Las especies de Lepidozia producen como constituyente mayoritario un

sesquiterpeno del tipo bazzanano llamado β-bazzaneno. Este sesquiterpeno es

también un marcador químico de las especies de Bazzania pertenecientes a la misma

familia (Asakawa y col., 2012). Sin embargo, una investigación previa de Lepidozia

chordulifera (Zapp y col., 2008) no arrojó como resultado el aislamiento de bazzaneno,

en cambio, esta especie de Lepidozia demostró ser capaz de sintetizar una variada

gama de triterpenos, entre ellos taraxerol y los ácidos carboxílicos triterpénicos

shoreico, betulínico, betulónico y ursólico.

De otras especies del género Lepidozia se aislaron compuestos de los tipos

isobiciclogermacrano, lepidozano, cadinano, eudesmano, maaliano, vitrano y bibencilo

(Asakawa y col., 2012).

Jungermanniidae Marchantiidae

Metzgeriales Takakiales Calobryales Jungermanniales

Suborden

Jungermanniineae Lepidoziineae Ptilidiineae Porellineae Radulineae Pleuroziineae

Familia

Lepidoziaceae

Genero

Lepidozia

Especie


Subclase

Clase Hepaticae

Orden

Jubulineae



97 | P á g i n a

VI

β-bazzaneno

6.4 Experimental

6.4.1 Material vegetal

El material vegetal de Lepidozia chordulifera T. Taylor (Figura 5.1), fue recolectado

en Febrero de 2005 en lago Steffen, Provincia de Río Negro, Argentina. Una muestra

fue depositada en el herbario de la Fundación Miguel Lillo (LIL Nº 3414), Tucumán,

Argentina.

6.4.2 Extracción y aislamiento

El material vegetal (240 g) fue extraído a temperatura ambiente por 7 días con éter

etílico obteniéndose 5,9 g de extracto después de la remoción del solvente con

rotavapor (rendimiento 2,46 %). El extracto fue sometido a cromatografía en columna

(CC) con Sephadex LH-20 (MeOH-CH2Cl2, 1:1) y luego a CC con silica gel (70 – 230

mesh) con hexano y cantidades crecientes de AcOEt y finalmente MeOH como

eluyentes para dar 5 fracciones.

La fracción I (370 mg), fue sometida a HPLC de fase normal con columna B (hexano-

AcOEt, 49:1) para dar el compuesto 11 (17 mg).

A partir de la fracción II (103 mg), la cual fue sometida a HPLC con columna B

(hexano-AcOEt, 26:1) se obtuvieron los compuestos 12 (34 mg), 21 (10 mg) y 9 (15

mg).

Por tratamiento de la fracción III (80 mg) mediante HPLC de fase reversa y columna

C (MeOH:H2O, 9:1) se obtuvo 18 (7 mg).

La fracción IV (150 mg), fue sometida a HPLC de fase reversa con columna C

(MeOH:H2O, 17:1) para dar 19 (3 mg), 20 (4 mg) y una sub-fracción, la cual fue

recromatografiada con columna D (MeOH:H2O, 17:1 + ácido acético 1%) obteniéndose

13 (11 mg), 14 (3 mg) y 15 (6 mg).



98 | P á g i n a

VI

La fracción V (120 mg) fue sometida a CC con Sephadex LH20 y luego a

cromatografía de fase reversa con columna C (MeOH:H2O, 22:3 + HAc 1%) para dar 16

(14 mg) y una sub-fracción. De esta última, luego de ser reprocesada por

cromatografía con columna D (MeOH:H2O, 21:4 + HAc 1%), se obtuvo 17 (3 mg) y una

nueva cantidad de 16 (3 mg).

6.5 Resultados

Los compuestos 11 y 12 fueron identificados como taraxerona y taraxerol en base a

sus características espectroscópicas y datos previamente reportados en bibliografía

(Hernandez-Chavez y col., 2012). El espectro de RMN protónico de taraxerona (11)

mostró ocho señales de metilos singletes a 0,83, 0,91, 0,92, 0,96, 1,07, 1,08, 1,09 y

1,14 para H-26, H-30, H-28, H-29, H-24, H-25, H-23 y H-27, respectivamente y una

señal doble doblete para a un protón olefínico a δ 5.56 asignado a H-15, con

constantes de acoplamiento J1=8.1 y J2=3.2 Hz, que corresponden a los acoplamientos

con cada uno de los protones H-16.

El espectro de RMN protónico de taraxerol (12) mostró características similares a las

de 11, ocho señales para metilos terciarios a 0.80, 0.82, 0.90 (6H), 0.92, 0.95, 0.98 y

1.09 para H-23, H-29, H-27, H-30, H-25, H-28, H-24 y H-26, respectivamente y también

una señal doble doblete para a un protón olefínico a δ 5.53 correspondiente a H-15

(J=8.2, 3.2 Hz) debido a los acoplamientos con cada uno de los H-16. A diferencia del

compuesto 11, taraxerol (12) muestra una señal doble doblete para un protón unido a

carbinol (H-3) a δ 3.19 (J=10.5, 5.0 Hz) acoplado con los protones 2β y 2α.

Los compuestos 13, 14 y 15 fueron identificados como los ácidos oleanólico,

ursólico y betulínico, respectivamente, en base a sus características espectroscópicas y

por comparación con datos de bibliografía (Gohari y col., 2009; Ayatollahi y col., 2011;

Muhit y col., 2010).

El espectro de RMN protónico de 13 presentó características similares a 12, salvo

por la presencia de siete y no ocho metilos singletes a δ 0.75, 0.77, 0.90, 0.91, 0.93,

0.98 y 1.13 para los hidrógenos H-26, H-23, H-29, H-25, H-30, H-24 y H-27

respectivamente y una señal triplete para un protón olefínico a δ 5.28 (J=3.5 Hz). El



99 | P á g i n a

VI

espectro también presentó una señal doble doblete para un protón unido a carbinol

(H-3) a δ 3.22 (J=5.0 Hz) debido a los acoplamientos con los protones en C-2. Además,

el espectro muestra una señal doble doblete para un hidrógeno a δ 2.82

correspondiente a H-18 (J1=13.7, 4.3 Hz) acoplado con cada uno de los protones H19.

El espectro de RMN protónico de 14 (ácido ursólico), mostró 5 señales singletes a δ

0.78, 0.79, 0.93, 0.98 y 1.08 correspondientes a los metilos H-23, H-26, H-25, H-24 y H-

27, respectivamente, y dos señales dobletes a δ 0.86 (J=6.8 Hz) y 0.94 (J=6.4 Hz)

correspondientes a los metilos CH3-29 y CH3-30, respectivamente. Al igual que 13, el

compuesto 14 también presentó una señal triplete para un protón olefínico a δ 5.25



100 | P á g i n a

VI

con una constante de acoplamiento de 3,4 Hz. También, una señal doble doblete para

un protón unido a carbinol (H-3) a δ 3.22 con constantes de acoplamiento J1=10.9 y

J2=4.8 Hz que corresponden a los acoplamientos con los protones en C-2.

El espectro de RMN protónico de 15 (ácido betulínico) mostró seis señales singletes

para metilos a δ 0.75, 0.82, 0.93, 0.96, 0.97 y 1.68 para los protones H-23, H-25, H-26,

H-24, H-27 y H-30. Dos señales singletes ensanchadas para protones olefínicos a δ 4.61

y 4.73 correspondientes a los protones H-29a y H-29b. Además, una señal doble

doblete para un protón unido a carbinol (H-3) a δ 3.19 (J=10.8, 5.2 Hz) acoplado con los

protones en C-2, como así también una señal triple doblete a δ 2.98 para el protón H-

19 con constantes de acoplamiento J1=10.9 y J2=4.9 Hz debido al acoplamiento con los

protones H-21 y el protón H-18, respectivamente.

La información obtenida de una revisión bibliográfica sobre los datos

espectroscópicos de RMN de 1H y

13C de los ácidos 13, 14 y 15 en CDCl3, muestra datos

muy disimiles y en otros casos se informan desplazamientos químicos para mezclas de

solventes, quizás debido a la baja solubilidad de estos compuestos en CHCl3. En la tabla

6.1 se muestran valores comparativos para las señales diagnóstico de los compuestos

13, 14 y 15 disueltos en CDCl3.

Los compuestos 16, 17, 18 y 19 fueron identificados en base a sus características

espectroscópicas y por comparación con datos de bibliografía como ácido shoreico

(Govindachari y col., 1994), eichlerialactona (Rao y col., 1975), cabraleona y

cabraleadiol (Hisham y col., 1996) respectivamente. El espectro de RMN protónico del

ácido shoreico (16) mostró 7 señales para metilos terciarios a δ 0.85, 0.88, 1.01, 1.11,

1.14, 1.19 y 1.73 que corresponden a H-18, H-19, H-30, H-21, H-26, H-27 y H-29

respectivamente, como así también dos señales singletes para hidrógenos vinílicos a δ

4.65 y 4.84 correspondientes a los hidrógenos en C-28, y una señal para un hidrógeno

unido a un carbono base de oxigeno a δ 3.64 correspondiente a H-24. Mientras que el

espectro de 1H RMN de eichlerialactona (17) sólo mostró 5 señales para metilos

terciarios a 0.86, 0.90, 1.01, 1.34 y 1.73 correspondientes a los hidrógenos H-18, H-19,

H-30, H-21 y H-29, respectivamente, y dos señales singletes para hidrógenos olefínicos

a δ 4.66 y 4.86 que corresponden a los hidrógenos en C-28.



101 | P á g i n a

VI

El espectro 1H RMN de cabraleona (18) mostró ocho señales para metilos terciarios

a δ 0.88, 0.94, 1.01, 1.04, 1.08, 1.11, 1.15 y 1.19 correspondientes a los hidrógenos

metílicos H-18, H-19, H-30, H-28, H-27, H-29, H-21 y H-26, una señal doble doblete

para un hidrógeno unido a un carbono base de oxigeno a δ 3.64 correspondiente a H-

24 con constantes de acoplamientos J1=9.6 y J2=5.5 Hz debido a los acoplamientos con

cada uno de los hidrógenos en C-23.

13 14 15

1H 13

C 1H 13

C 1H 13

C

3 3,22 dd (10,5; 5,0) 79,1 3,22 dd (10,9; 4,8) 79,1 3,19 dd (10,8; 5,2) 79,1

12 5,28 t (3,5) 122,7 5,25 t (3,4) 126 1,69 m 25,5

18 2,81 dd (13,7; 4,3) 40,9 2,19 d (11,7) 52,7 1,61 m 49,2

23 0,77 s 28,1 0,78 s 15,8 0,75 s 15,3

24 0,98 s 15,5 0,98 s 28,2 0,96 s 28,1

25 0,91 s 13,3 0,93 s 15,6 0,82 s 16,2

26 0,75 s 17,1 0,79 s 17,3 0,93 s 16

27 1,13 s 26,0 1,08 s 23,9 0,97 s 14,7

28 - 183,1 - 180,9 - 181,2

29 0,90 s 33,1 0,86 d (6,8) 17,0 4,61 s (a), 4,73 s (b) 110,1

30 0,93 s 23,6 0,94 d (6,4) 21,2 1,68 s 19,5

Tabla 6.1. Datos espectrales 1H NMR (300 MHz) y

13C NMR (75 MHz) de los compuestos 13, 14 y 15

(CDCl3).

Las constantes de acoplamiento (J in Hz) vienen dadas en paréntesis.

Señales indicadas con m fueron multipletes no resueltos o superpuestos.

Las asignaciones para 13

C fueron confirmadas por mediciones HSQC, DEPT y HMBC.

El espectro protónico de RMN de cabraleadiol (19) mostró características

espectroscópicas similares a las de cabraleona. Ocho señales para metilos terciarios a δ

0.84, 0.86, 0.89, 0.94, 0.97, 1.11, 1.15 y 1.19 correspondientes a los hidrógenos

metílicos H-29, H-19, H-30, H-28, H-18, H-27, H-21 y H-26, una señal doble doblete

para un hidrógeno unido a un carbono base de oxigeno a δ 3.65 correspondiente a H-

24 (J=9.6, 5.4 Hz) acoplado con cada uno de los hidrógenos en C-23. El espectro de

cabraleadiol muestra también una señal triplete para carbinol a δ 3.40 con constante

de acoplamiento J=2 Hz debido al acoplamiento con los protones en C-2.



102 | P á g i n a

VI

La estereoquímica relativa para la cadena lateral que contiene el grupo

tetrahidrofurano de los compuestos 16, 18 y 19, fue establecida como CH3-21β y el

grupo isopropilol en C-24 también en posición β en base al desplazamiento químico de

H-24 en el espectro de RMN protónico, como así también en base al desplazamiento

químico de C-24 en el espectro de RMN de 13

C en CDCl3. Para los compuestos 16, 18 y

19, la señal correspondiente a C-24 aparece a 86.2, mientras que en los epímeros con

el grupo isopropilol en C-24 en posición α (ácido eichleriánico, ocotillona y ocotillol)

esta señal es encontrada a 83.2. Además, 16, 18 y 19 presentan la señal de H-24 como

un doble doblete a δ 3.65, mientras que sus epímeros muestran esta señal como un

triplete a δ 3.71 (Hisham y col., 1996).

El compuesto 20 fue identificado como 3β-hidroxihexanordammaran-20-ona

(Tanaka y col., 1987) en base a sus características espectroscópicas y por comparación

con datos de bibliografía. El espectro de 1H RMN mostró cinco señales de metilos

terciarios a δ 0.77, 0.84, 0.87, 0.97 y 0.98 correspondientes a H-28, H-19, H-30, H-29 y

H-18, una señal singlete a δ 2.13 para una metilcetona (H-21), una señal triple doblete

a δ 2.58 (H-17) con constantes de acoplamiento J=10.9, 6.1 Hz, y una señal doble

doblete para un carbinol a δ 3.20 (H-3) (J=10.9, 5.4 Hz).

El compuesto 21 fue identificado en base a sus características espectroscópicas y

por comparación con datos de bibliografía como viridiflorol (Bombarda y col., 2001). El

espectro de 1H RMN mostró señales para tres metilos terciarios a δ 0.99, 1.02 y 1.15

que corresponden a H-13, H-12 y H-14 respectivamente, un metilo secundario a δ 0.92

(H-15), un triplete para el metino H-6 con constante de acoplamiento J=9.1 Hz y un

multiplete para el metino H-7 a δ = 0.62.

6.6 Estudio quimiotaxonómico de Lepidozia chordulifera

Como se mencionó anteriormente, los compuestos taraxerol (12) y los ácidos

carboxílicos triterpénicos ursólico (14), betulinico (15) y shoreico (16), y 3β-

hidroxihexanordammaran-20-ona (20) fueron aislados en una investigación previa de

L. chordulifera (Zapp y col., 2008). Taraxerona (11), Taraxerol (12), ácido ursólico (14) y



103 | P á g i n a

VI

ácido betulínico (15) fueron previamente aislados de L. raptans (Zhang, 2011).

Cabraleadiol (19) fue previamente reportado en Blepharidophyllum densifolium (Flegel

y Becker, 1999) y viridiflorol (21) fue previamente aislado de Bazzania trilobata,

Locopholea bidentata y L. heterophylla (Asakawa y col., 2012). Sin embargo, parece ser

la primera vez que los compuestos ácido oleanólico (13), eichleralactona (17), y

cabraleona (18) son reportados en una especie de hepáticas.

También, es importante remarcar que ni la actual investigación de L. chordulifera, ni

la realizada previamente por Zapp y col. (2008) arrojó como resultado el aislamiento

de bazzaneno, considerado un marcador químico del género. Teniendo en cuenta que

la presencia de bazzaneno en las especies de Lepidozia fue registrada para especies

asiáticas, sugerimos reconsiderar la presencia de este como marcador químico del

género, o por lo menos considerarlo sólo para las especies asiáticas y no así para las

americanas, dado que ambos estudios, el actual y el realizado por Zapp y col. (2008),

fueron realizados sobre material vegetal recolectado en sud-América.



104 | P á g i n a

VI

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Capítulo VII

Actividad anti-patogénica

de Lepidozia chordulifera

VII



107 | P á g i n a

VII

Capítulo VII

Actividad antibiofilm de Lepidozia

chordulifera

7.1 Generalidades

La patogenicidad bacteriana está asociada a factores de virulencia. Estos, o bien

pueden estar unidos a las células bacterianas o ser sintetizados por ella y excretados al

tejido circundante. En bibliografía pueden encontrarse numerosos reportes

relacionados a las proteasas o elastasas elaboradas por las bacterias como

componentes de sus toxinas. Inyecciones de elastasas producidas por Pseudomonas

aeruginosa en la piel de animales induce en pocos minutos a lesiones hemorrágicas, y

en 24 horas estas lesiones se vuelven necróticas (Liu, 1974). En infecciones sistémicas

provocadas por P. aeruginosa se producen comunmente hemorragias de órganos

internos, particularmente en los pulmones, y se cree que las elastasas y otras enzimas

proteolíticas son responsables de la patogénesis de estas lesiones (Morihara y col.,

1979; Morihara y Tsuzuki, 1977; Liu, 1974). Por los descripto arriba, es que la

producción de elastasas es considerado uno de los factores de virulencia clave en P.

aeruginosa (Shaver y Hauser, 2004).

Como se mencionó en el capítulo IV, la formación de biofilm, la producción de

factores de virulencia y la resistencia a antimicrobianos son regulados por el proceso

de quórum sensing (QS). La posibilidad de inhibir el proceso de QS o algunos de los

factores de virulencia relacionados a la patogenicidad de bacterias, aparece como una

estrategia para hacerlas más susceptibles al sistema inmune del hospedador. Es

importante encontrar productos naturales capaces de producir dichos efectos sin

afectar directamente el crecimiento bacteriano puesto que al no producir una presión

selectiva sobre el microorganismo el producto no produciría generación de resistencia

por parte del microorganismo. Por lo expuesto, controlar la producción de biofilm y/o



108 | P á g i n a

VII

el proceso de QS de patógenos mediante compuestos naturales puede ser una buena

estrategia en la búsqueda de nuevos antimicrobianos.

Diez de los doce terpenoides de L. chordulifera fueron evaluados en su habilidad

para inhibir el crecimiento bacteriano, la formación de biofilm, la producción de

autoinductores y la actividad elastasa en una cepa de Pseudomonas aeruginosa.

Otros estudios se realizaron para determinar la capacidad de estos compuestos de

inhibir el crecimiento bacteriano y la formación de biofilm en una cepa de

Staphylococcus aureus.

El compuesto 11 (taraxerona) mostró un cierto grado de descomposición por lo que

no pudo ser incluido en el bioensayo, mientras que el compuesto 9 (ent-spatulenol) no

fue incluido debido a que ya había sido testeado con los demás constituyentes de P.

chilensis (ver capítulo III).

7.2 Antecedentes

Algunos de los compuestos aislados de L. chordulifera poseen interesantes

actividades biológicas previamente reportadas. Taraxerol y taraxerona (11 -12)

producen efectos alelopáticas, antifúngicas y antiparasitarios (Macias-Rubalcava y col.,

2007; Magadula y Erasto, 2009; Hernandez-Chavez y col., 2012). Taraxerol produce

efectos analgésicos y antiinflamatorios (Ghosh y col., 2009). Los ácidos oleanólico y

ursólico (13 - 14) son bactericidas (Horiuchi y col., 2007) y anticancerígenos (Yan y col.,

2010; Li y col., 2002). El compuesto 15 (ácido betulínico) presenta una gama de

actividades, entre ellas anti HIV, antibacteriana, antinflamatoria, antihelmíntica y

antioxidante (Yogeeswari y Sriram, 2005). El compuesto 17 produce efectos anti

micobacterianos (Phongmaykin y col., 2008).

7.3 Experimental

7.3.1 Crecimiento bacteriano

El crecimiento bacteriano fue determinado espectrofotométricamente a 600 nm en

lector de microplaca (ver capítulo II). A los pocillos para el control negativo se les



109 | P á g i n a

VII

adicionó un volumen de una mezcla DMSO – H2O destilada (1:1) en vez de los

compuestos a evaluar. El valor de la absorbancia control fue 1.59 para P. aeruginosa y

1.35 para S. aureus.

7.3.2 Ensayo de formación de biofilm

La formación de biofilm fue determinada por la técnica de cristal violeta en

microplaca (ver capítulo II). La absorbancia del control negativo fue 2.09 para P.

aeruginosa y 0.35 para S. aureus.

Ciprofloxacina, un conocido inhibidor de biofilm (Sandasi y col., 2011), fue

incorporado al bioensayo a 5 µg/ml como control positivo en las mismas condiciones

experimentales que las utilizadas para evaluar los compuestos.

7.3.3 Ensayo de efectos sobre el QS

La cuantificación de autoinductores para determinar los efectos sobre el QS fue

determinada mediante el uso de la cepa reportera P. aeruginosa qsc 119 (ver capítulo

II). La actividad del control negativo fue 13.8 expresado como unidades de miller.

Azitromicina, capaz de intervenir en los procesos de QS (Tateda y col., 2001), fue

usado a 5 µl/ml como control positivo de inhibición de QS bajo las mismas condiciones

que los compuestos evaluados.

7.3.4 Ensayo sobre la actividad elastasa

Los ensayos para determinar la actividad elastasa fueron descriptos en capítulo II.

Dicha actividad se determinó espectrofotométricamente a 495 nm. A esta longitud de

onda absorbe el colorante rojo congo, el cual es liberado al medio luego de que la

enzima elastasa degrada el sustrato insoluble rojo congo-elastina (RC-E). La

absorbancia para el control negativo fue 6.11.




110 | P á g i n a

VII

Los datos son presentados como media ± desviación estándar (DS). Las diferencias

significativas entre valores se establecieron con el test de Dunnett. Valores de p ≤ 0.05

fueron considerados significativos.

7.4 Resultados

Ninguno de los compuestos evaluados a la concentracion de 5 µg/ml inhibió el

crecimiento bacteriano ni la producción de biofilm de las cepas estudiadas de P.

aeruginosa y S. aureus. En base a estos resultados, los estudios de inhibición de QS y

actividad elastasa se realizaron sólo a 50 µg/ml.

A continuación se presentan los resultados obtenidos para los ensayos realizados a

50 µg/ml para P. aeruginosa (figura 6.1) y S. aureus (figura 6.2).

7.4.1 L. chorduliera contra P. aeruginosa

*Existe diferencia significativa (P<0.05) con el grupo control. Test de Dunnett.

Figura 6.1. Efectos de los compuestos 12-21 a 50 µg/ml, control negativo y controles positivos

(ciproflozacina y azitromicina a 5 µg/ml) en crecimiento bacteriano, formación de biofilm, producción de

autoinductores y actividad de elastasa (expresado en porcentaje).

*

* * * * *

*

**

*

*

* *

*

**

**

* * *

*

*

*

0

20

40

60

80

100

120

140

160

%

Compuestos

Crecimento Biofilm

QS Elastasa



111 | P á g i n a

VII

7.4.1.1 Inhibición del crecimiento bactetriano

Ningún compuesto mostró actividad antimicrobiana a la concentración de 50 µg/ml,

de hecho los compuestos 14, 15, 17, 18, 19 y 20 produjeron estimulaciones de 41, 14,

14, 20, 16 y 12 % en el crecimiento bacteriano, respectivamente. En presencia de los

compuestos 12, 13, 16 y 21 no se registraron diferencias significativas con respecto al

control.

7.4.1.2 Inhibición de la formación de biofilm

Si bien, a la concentración testeada, los compuestos 16-21 no inhibieron el

crecimiento bacteriano. Estos inhibieron significativamente la producción de biofilm en

27, 38, 51, 33, 47 y 60 %, respectivamente. Los demás compuestos no presentaron

diferencias significativas con el control. El antimicrobiano ciprofloxacina a 5 µg/ml,

utilizado como control positivo, produjo una inhibición del 89% en la producción de

biofilm.

7.4.1.3 Inhibición del proceso de QS (inhibición de la producción de

autoinductores)

Ninguno de los compuestos testeados produjo modificaciones significativas en la

producción de autoinductores. Azitromicina, utilizado a 5 µg/ml como control positivo

de inhibición de QS, redujo la producción de autoinductores en 81 %.

7.4.1.4 Inhibición de la actividad elastasa

Todos los compuestos fueron capaces de producir disminuciones significativas en la

elastasa, siendo los ácidos triterpénicos 14 y 15 los más activos. Los compuestos 12 y

13 y 16 - 21 produjeron disminuciones de 60, 65, 75, 73, 75, 60, 70 y 55 %,

respectivamente, mientras que los compuestos 14 y 15 produjeron una disminución en

la actividad elastasa en 96 y 92 %, respectivamente.



112 | P á g i n a

VII

Los tritepenoides taraxerol y acido oleanólico 12 y 13 produjeron una disminución

en la actividad elastasa alrededor de un 60 %.

El compuesto 21, el único compuesto aromadendrano de la serie, fue capaz de

inhibir un 60 % la producción de biofilm y un 45 % la producción de elastasa sin

producir una modificación significativa en el crecimiento bacteriano. Una situación

similar se observa para el acido shoerico (16), el cual produjo una disminución de 27 %

en la formación de biofilm y 75 % en la actividad elastasa.

La situación mencionada en el párrafo anterior, puede ser deseable en la

postulación de compuestos antipatogénicos, ya que al no afectar el crecimiento

bacteriano estos compuestos no producen una presión selectiva sobre el

microorganismo que conduzca a la generación de resistencia, sin embargo, al tener

disminuido su principal mecanismo de defensa (biofilm) y estar atenuado uno de sus

principales factores de virulencia (actividad elastasa) el microorganismo puede ser

susceptible al ataque por parte del sistema inmune del hospedador

Los ácidos treiterpénicos ursólico y betulínico (14 y 15) a pesar de no mostrar

diferencias significativas en la formación total de biofilm, inhiben casi totalmente la

actividad elastasa (> 90 %).

Los compuestos 17 - 20 estimularon levemente el crecimiento bacteriano (entre 10

y 20 %) pero fueron capaces de inhibir tanto la formación de biofilm (entre 30 y 60%)

como la actividad elastasa (entre 60 y 70 %). Es decir, se produce un incremento en la

población bacteriana (mayor crecimiento) pero con individuos menos patógenos

(menor actividad elastasa) y menos resistentes (menor formación de biofilm).

7.4.1.5 Relación estructura – actividad

Viridiflorol (21), el único sesquiterpeno evaluado, fue menos activo en su actividad

elastasa que los triterpenoides 12-20, sin embargo, 21 fue más potente que los

triterpenoides mencionados en su capacidad para inhibir el biofilm. Esta capacidad fue

previamente observada en otros aromadendranos aislados de Porella chilensis.

Entre los triterpenoides analizados, aquellos que poseen esqueleto dammarano (16

– 20) fueron más potentes en la inhibición de la formación de biofilm. La presencia o



113 | P á g i n a

VII

ausencia del anillo tetrahidrofurano (THF) sobre el carbono 17 o la presencia de un OH

o carbonilo en carbono 3 no es importante para la actividad citada.

Con respecto a la actividad elastasa, los compuestos 14 y 15 resultaron los más

activos. Ambos portan grupos carboxilos en carbono 17, y aunque el triterpeno 13

también posee un grupo carboxilo en carbono 17 este no resultó tan activo, por lo

tanto, es difícil establecer una certera relación estructura-actividad para los ácidos 13,

14 y 15.

2

3

4

5

10

1

6

7

8

9 14

13

12

11

15

16

17

18

22

21

20

19

O

23

25 26

24

27

3029

28

HO HO

OH

O

HO

OH

O

HO

OH

O2

29

4

5

10

1

6

7

8

9 14

13

12

11

19 18

30

3

HO

O

28

15

16

17

20

O

24

23

22

21

25

26

27

OH

HO

O

O

O

O

O

OH

HO

O

OH

O

HO

3

4

5

1

2

6

7

8

9

10

15

H

11

12

13

14

OH

H

11 12 13

14 15 16

17 18 19

20 21

H H

H H H H H H

H

H

H H H H

H

H

H H

H

H

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H

H

H H

H

H

H

H

H

H

HOH

H

9

H

H

H

H



114 | P á g i n a

VII

7.4.2 L. chordulifera contra S. aureus

*Existe diferencia significativa (P<0.05) con el grupo control. Test de Dunnett.

Figura 6.2. Efectos de los compuestos 12-21 a 50 µg/ml, control y control positivo (ciprofloxacina a 5

µg/ml) en crecimiento bacteriano y formación de biofilm (expresado en porcentaje).

7.4.2.1 Inhibición del crecimiento bacteriano

Solo los compuestos 13 y 21 fueron capaces de disminuir el crecimiento bacteriano

en 38 y 22 % respectivamente. Mientras que los compuestos 14, 16, 17, 19 y 20

estimularon el crecimiento en 12, 19, 16, 9 y 12 % respectivamente. Los compuestos

12, 15 y 18 no mostraron diferencias significativas con el control.

7.4.2.2 Inhibición de la formación de biofilm

El antibiótico ciprofloxacina agregado al ensayo a 5 µg/ml como control positivo,

produjo una inhibición del 45 % en la formación de biofilm, mientras que los

compuestos 12, 16, 18, 19 y 21 a 50 µg/ml fueron capaces de reducir

*

** * * *

*

**

**

*

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*

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220

%

Compuesto Crecimiento Biofilm



115 | P á g i n a

VII

significativamente la formación de biofilm por parte de S. aureus en 37, 27, 30, 28 y 38

% respectivamente. Mientras que 13, 14 y 15 estimularon significativamente la

formación de biofilm en 30, 33 y 88 % a la misma concentración. Los compuestos 17 y

20 no produjeron modificaciones en relación al control.

El único de los compuestos testeados capaz de modificar tanto el crecimiento

bacteriano como la formación de biofilm, fue el aromadendrano viridiflorol (21),

mientras que 12 y 18 produjeron una disminución en la formación de biofilm (37 y 30

%) sin alterar el crecimiento bacteriano.

7.4.2.3 Relación estructura – actividad

Los ácidos oleanólico, ursólico y betulínico (13 – 15) produjeron estimulaciones en

la formación de biofilm y no así taraxerol (12), indicando que la presencia del grupo

carboxílico es importante para dicha estimulación.

Con respecto a los dammaranos (16 - 20), sólo tres de ellos (16, 18 y 19) fueron

capaces de inhibir la formación de biofilm de S. aureus. Esto indica que el anillo THF

sobre C-17 unido a un grupo isopropilol en C-24 son requeridos para la actividad.

Tanto los aromadendranos de P. chilensis como de L. chordulifera inhiben la

formación de biofilm y el crecimiento bacteriano de P. aeruginosa.

Vistos los resultados expuestos sobre los efectos antipatogénicos de los terpenoides

evaluados, consideramos que se deben ampliar los estudios con un grupo de

terpenoides con mayor diversidad estructural a fin de establecer relaciones más

precisas entre la estructura y la actividad.



116 | P á g i n a

VII

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Capítulo VIII

Resumen de resultados y

conclusiones

VII

VIII



119 | P á g i n a

VIII

Capítulo VIII

Resumen de resultados y conclusiones

Este trabajo de tesis nos planteó el desafío de continuar con el trabajo pionero, en

nuestro país, en las investigaciones químicas y de actividad biológica de especies de la

clase Hepaticae.

Las investigaciones de hepáticas en Tucumán se iniciaron con el estudio de las

especies talosas endémicas en el Norte Argentino, pertenecientes al orden

Marchantiales, Dumortiera hirsuta, Plagiochasma rupestre y Marchantia plicata. A

continuación se estudiaron las hepáticas foliosas pertenecientes al orden

Jungermaniales Frullania brasiliensis y Porella swartziana también endémicas del

Norte Argentino.

Esta tesis doctoral tuvo como objetivo la investigación de dos especies foliosas,

también pertenecientes al orden Jungermaniales: Porella chilensis y Lepidozia

chordulifera, que crecen en la Patagonia Argentina.

Se aislaron e identificaron 21 metabolitos secundarios. Dichos productos constituían

mezclas complejas resueltas mediante el empleo exhaustivo de cromatografía líquida

de alta performance en fase normal y reversa.

8.1 Porella chilensis

Del estudio del extracto etéreo de P. chilensis resultó el aislamiento e identificación

de los diterpenos de tipo fusicoccano 1-4, de los cuales 1 y 2 fueron descriptos por

primera vez. Se aislaron e identificaron seis sesquiterpenoides conocidos, cuatro de

tipo pinguisano (5 - 8) y dos aromadendranos (9 y 10), siendo norpinguisona (6) el

compuesto mayoritario.

Anadensina (3)

(Huneck y col., 1983), fusicoauritona (4) (Zapp y col., 1994),

pinguisenol (5) (Asakawa, 1982), norpinguisona (6) (Asakawa, 1982), norpinguisona

acetato (7) (Van Klink y col., 2002), norpinguisona metil éster (8) (Tori y col., 1993), ent-



120 | P á g i n a

VIII

spathulenol (9) (Asakawa y col., 2012; Nagashima y col., 1993),

y ent-4β,10α-

dihidroxiaromadendrano (10) (Nagashima y col., 1993) fueron identificados por sus

características espectroscópicas en comparación con los datos de literatura

previamente reportados.

Figura 8.1. Terpenoides aislados de Porella chilensis

La configuración absoluta de los nuevos fusicoccanos 1 y 2 se obtuvo mediante el

análisis de dicroísmo circular (DC) en la zona del espectro de UV y posterior

comparación con espectros de dicroísmo circular de moléculas estructuralmente

relacionadas con 1 y 2, de configuración absoluta conocida. La estereoquímica

absoluta de 1 y 2 resultó ser la misma que la previamente establecida para los

compuestos 3 y 4, determinada por síntesis total (Kato y col., 1994; Williams y col.,

2007). Adicionalmente, y para apuntalar la propuesta estereoquímica, se realizaron

cálculos computacionales que permitieron deducir los espectros de DC teóricos que

coincidieron con los datos experimentales de DC (figura 8.2), confirmando así la

configuración absoluta de los nuevos compuestos.



121 | P á g i n a

VIII


Desde el punto de vista de la quimiotaxonomía, las especies de Porella fueron

divididas en nueve quimiotipos: drimano-aromadendrano-pinguisano (tipo I),

sacculatano (tipo II), pinguisano (tipo III), pinguisano-sacculatano (tipo IV), africano

(tipo V), santalano-africano-ciclofarnesano (tipo VI), guaiano (tipo VII), germacrano-

pinguisano-sacculatano (VIII), germacrano-africano-guaiano (tipo IX). (Asakawa, 2004)

Basado en los terpenoides presentes en P. chilensis, esta especie puede estar

ubicada en un nuevo quimiotipo (X), que contiene pinguisanos, aromadendranos y

también fusicoccanos.

Tal como se esperaría según lo descripto en bibliografía, los aromadendranos

aislados de P. chilensis, efectivamente son enantiómeros de los encontrados en plantas

superiores. Sin embargo, los diterpenos aislados (fusicoccanos) de esta planta poseen

la misma configuración absoluta que los hallados en plantas superiores.

8.2 Lepidozia chordulifera

Del estudio del extracto etéreo de L. chordulifera resultó el aislamiento e

identificación de diez triterpenoides y dos sesquiterpenoides, todos conocidos. Los

-15

-10

-5

0

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10

15

20

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30

200 250 300 350 400

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λλλλ (nm)

Compuesto 2 (2αααα-hidroxifusicocc-3-en-5-ona)

DC teórico

DC experimental



122 | P á g i n a

VIII

triterpenoides aislados fueron dos taraxanos, taraxerona (11) y taraxerol (12)

(Hernandez-Chavez y col., 2012); los ácidos oleanólico (13) (Gohari y col., 2009),

ursólico (14) (Ayatollahi y col., 2011) y betulínico (15) (Muhit y col., 2010); y los

dammaranos ácido shoerico (16) (Govindachari y col., 1994), eichlerialactona (17) (Rao

y col., 1975), cabraleona (18), cabraleadiol (19) (Hisham y col., 1996) y 3β-

hidroxihexanordammaran-20-ona (20) (Tanaka y col., 1987). Los sesquiterpenos

aislados fueron los aromadendranos viridiflorol (21) (Bombarda y col., 2001) y ent-

spathulenol aislado también de P. chilensis.

Figura 8.3. Terpenoides aislados de Lepidozia chordulifera



123 | P á g i n a

VIII

Es la primera vez que los compuestos ácido oleanólico (13), eichleralactona (17), y

cabraleona (18) se aíslan de una especie de la clase Hepaticae.

También es importante remarcar que ni la actual investigación de L. chordulifera, ni

la realizada previamente por Zapp y col. (2008) arrojó como resultado el aislamiento

de β-bazzaneno, considerado un marcador químico del género. Teniendo en cuenta

que la presencia de β-bazzaneno en las especies de Lepidozia fue registrada para

especies asiáticas, sugerimos reconsiderar la presencia de este como marcador

químico del género, o por lo menos considerarlo solo para las especies asiáticas y no

así para las americanas, dado que ambos estudios, el actual y el realizado por Zapp y

col. (2008), fueron realizados sobre material vegetal recolectado en sud-América.

Otro aspecto a resaltar es que la presencia de triterpenoides en hepáticas es

bastante poco habitual, por lo que se ha sugerido que la biosíntesis de triterpenoides

se encuentra bloqueada tanto en hepáticas como en algas (Asakawa, 1986). Sin

embargo, la cantidad de trierpenoides aislados de esta especie pone a prueba esta

hipótesis. Este tipo de triterpenos son más comunes en musgos y evidencia la cercanía

evolutiva entre ambas clases.

8.3 Actividad biológica

Cuando se estudiaron los efectos de los compuestos aislados de P. chilensis sobre la

formación de biofilm de Pseudomonas aeruginosa, sólo el fusicoccano 3 a 5 µg/ml

resultó tan potente como el antibiótico ciprofloxacina a la misma concentración,

mientras que los aromadendranos 9 y 10 son menos potentes que el antibiótico a la

misma concentración. Los tres compuestos fueron capaces de inhibir

significativamente, además de la formación de biofilm, el crecimiento bacteriano y la

producción de autoinductores de QS.

Es importante destacar que los aromadendranos 9 y 10, no están estructuralmente

relacionados a ningún compuesto previamente reportado como capaz de inhibir la

formación de biofilm o el proceso de QS de P. aeruginosa. Mientras que los

fusicoccanos comparten algunas características estructurales con algunos productos



124 | P á g i n a

VIII

naturales capaces de inhibir la producción de autoinductores de P. aeruginosa (Givskov

y col., 1996; Manefield y col., 2002; Rasmussen y col., 2005).

En cuanto a la capacidad de los compuestos de L. chordulifera para inhibir la

formación de biofilm de P. aeruginosa, el compuesto más potente fue el

aromadendrano viridiflorol (21) a 50 µg/ml, aunque no resultó tan activo como el

antibiótico ciprofloxacina utilizado como control positivo a 5 µg/ml. Todos los

compuestos dammaranos (16 - 20) a 50 µg/ml también fueron capaces de inhibir la

formación de biofilm indicando que tanto el esqueleto dammarano como el

aroadendrano son importantes para esta actividad.

Con respecto a la actividad elastasa, actividad relacionada a la patogenicidad de

Pseudomonas aeruginosa, todos los compuestos fueron capaces de inhibirla

significativamente, siendo los ácidos ursólico y betulínico (14 - 15) los más potentes

produciendo inhibiciones superiores al 90 %. a 50 µg/ml.

El aromadendrano viridiflorol (21) inhibió el desarrollo bacteriano y la formación de

biofilm de Staphylococcus aureus. Los aromadendranos de Porella chilensis también

produjeron los mismos efectos sobre P. aeruginosa, indicando que los compuestos de

esta familia son promisorios como antibacterianos de cepas patógenas humanas.

El pinguisano 6, aislado de P. chilensis, produjo el mayor porcentaje de mortalidad

de larvas de Spodoptera frugiperda entre los compuestos evaluados. Esta importante

actividad se relaciona con la capacidad de alterar fuertemente el epitelio del intestino

medio de las larvas.

Los compuestos que fueron más activos contra los microorganismos no provocaron

efectos tóxicos importantes a las células eucariotas del epitelio intestinal de S.

frugiperda. Estos resultados pueden ser alentadores en la postulación de sustancias

anti-patogénicas bacterianas que, para ser usadas como fármacos, no deberían afectar

células eucariotas.

Si bien nuestros resultados mostraron que los terpenoides evaluados producen

efectos moderados sobre los sistemas biológicos estudiados, los logros obtenidos

plantean un futuro promisorio para la aplicación de los constituyentes químicos de

hepáticas argentinas en formulaciones farmacéuticas e insecticidas.



125 | P á g i n a

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Apéndice

Espectros

VII

A

I |

Pá

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A

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Relative Abundance

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77

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121

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VII

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9081

1100

254

#111

1-11

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-650

.00]

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100

120

140

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220

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260

280

300

320

m/z

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Relative Abundance

225

243

201

305

9118

310

713

714

779

121

159

7714

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150

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119

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9517

613

181

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726

111

726

821

065

8921

697

306

196

5128

928

525

322

855

XII

I |

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A

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3_C

2-17

#10

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220

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280

300

320

340

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91

7977

149

9567

81

136

109

121 12

315

110

730

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105

119

6513

317

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324

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713

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797

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324

423

328

626

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985

XIX

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179

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530

665

201

6928

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555

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244

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823

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C1_

1c2_

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9

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596

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8413

320

670

139

XX

VII

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-48-

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9

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953

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133

161

117

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XIV

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_c1_

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2-8-

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108

203

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5

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207

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146

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233

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9

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ab83

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317

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8314

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119

115

712

459

9722

723

729

322

184

263

283

186

271

253

239

165

297

73

XLV

III

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A

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187

205

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163

123

149

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217

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164

188

57

L |

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11

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12

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75

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LIII

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in

a

A

Co

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sto

12

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HS

QC

RM

N

Bru

ke

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00

MH

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3C

75

MH

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3C

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LVI

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1

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LVII

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LVII

I |

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LX |

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LXII

I |

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H

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3C

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LXIV

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H

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3C

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LXV

| P

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A

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pa

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AB84

C18

P3C

#12

0-16

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015

020

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035

040

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050

055

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/z

0102030405060708090100

Relative Abundance

133

105

203

91

119

248

189

147

7717

523

521

916

193

207

6722

032

524

943

936

739

155

457

269

302

339

287

411

LXV

I |

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A

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II |

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3C

RM

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3C

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LXV

III

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a

A

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MH

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LXIX

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a

A

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3C

75

MH

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LXX

| P

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A

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(A

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3C

75

MH

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LXX

I |

Pá

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Ab8

4C18

P3A

#70

-207

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015

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030

035

040

045

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/z

0102030405060708090100

Relative Abundance

91

235

176

105

189

149

119

133

325

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739

179

203

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333

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339

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342

337

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341

045

748

149

5

LXX

II |

Pá

gi

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A

Co

mp

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16

(A

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RM

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LXX

III

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A

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(A

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co)

13C

RM

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MH

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3C

50

MH

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LXX

IV |

Pá

gi

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A

Co

mp

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sto

16

(A

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co)

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Po

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pa

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AB84

C19

P1

#284

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030

035

040

045

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/z

0102030405060708090100

Relative Abundance

91

107

105

79

77

119 12

515

981

9345

714

513

317

367

6595

149

439

175

199

5520

121

518

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545

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724

341

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728

339

130

144

131

832

737

145

9

LXX

V |

Pá

gi

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A

Co

mp

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sto

17

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)

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RM

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LXX

VI

| P

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a

A

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17

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ich

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)

1

3C

RM

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MH

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3C

50

MH

z)

LXX

VII

| P

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a

A

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17

(E

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)

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M-I

E

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pa

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s3 #

128-

235

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020

025

030

035

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045

050

055

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0102030405060708090100

Relative Abundance

91

105

77

7911

923

593

133 14

567

313

159

175

6529

518

920

343

121

332

524

927

739

155

217

357

413

331

297

433

395

359

349

415

LXX

VII

I |

Pá

gi

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A

Co

mp

ue

sto

18

(C

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1H

RM

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LXX

IX |

Pá

gi

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A

Co

mp

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sto

18

(C

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13C

RM

N

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00

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z (1

3C

75

MH

z)

LXX

X |

Pá

gi

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A

Co

mp

ue

sto

18

(C

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a)

1H

CO

SY

RM

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MH

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LXX

XI

| P

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a

A

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18

(C

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HS

QC

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3C

75

MH

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LXX

XII

| P

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a

A

Co

mp

ue

sto

18

(C

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a)

HM

BC

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r 3

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MH

z (1

3C

75

MH

z)

LXX

XII

I |

Pá

gi

na

A

Co

mp

ue

sto

18

(C

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a)

EM

-IE

*T

he

rmo

Po

lari

s Q

(tr

am

pa

de

io

ne

s)

AB84

C16

P5

#105

-131

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-1.3

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c Full m

s [ 5

0.00

-600

.00]

5010

015

020

025

030

035

040

045

050

0m

/z

0102030405060708090100

Relative Abundance

441

143

107

126

205

442

145

109

423

175

9296

120

161

177

207

7956

203

279

6713

514

938

139

921

759

459

424

7030

140

031

322

142

524

525

528

527

3

LXX

XIV

| P

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in

a

A

Co

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ue

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19

(C

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1H

RM

N

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LXX

XV

| P

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a

A

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ue

sto

19

(C

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13C

RM

N

Bru

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r 3

00

MH

z (1

3C

75

MH

z)

LXX

XV

I |

Pá

gi

na

A

Co

mp

ue

sto

19

(C

ab

rale

ad

iol)

HS

QC

RM

N

Bru

ke

r 3

00

MH

z (1

3C

75

MH

z)

LXX

XV

II |

Pá

gi

na

A

Co

mp

ue

sto

19

(C

ab

rale

ad

iol)

HM

BC

RM

N

Bru

ke

r 3

00

MH

z (1

3C

75

MH

z)

LXX

XV

III

| P

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in

a

A

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ue

sto

20

(3

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idro

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no

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1H

RM

N

Bru

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MH

z

LXX

XIX

| P

ág

in

a

A

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mp

ue

sto

20

(3

β-h

idro

xih

exa

no

rda

mm

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n-2

0-o

na

)

1

3C

RM

N

Bru

ke

r 3

00

MH

z (1

3C

75

MH

z)

XC

| P

ág

in

a

A

Co

mp

ue

sto

20

(3

β-h

idro

xih

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no

rda

mm

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n-2

0-o

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1H

CO

SY

RM

N

Bru

ke

r 3

00

MH

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XC

I |

Pá

gi

na

A

Co

mp

ue

sto

20

(3

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xih

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no

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H

SQ

C R

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Bru

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MH

z (1

3C

75

MH

z)

XC

II |

Pá

gi

na

A

Co

mp

ue

sto

20

(3

β-h

idro

xih

exa

no

rda

mm

ara

n-2

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na

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H

MB

C R

MN

Bru

ke

r 3

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MH

z (1

3C

75

MH

z)

XC

III

| P

ág

in

a

A

Co

mp

ue

sto

20

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no

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E

M-I

E

*T

he

rmo

Po

lari

s Q

(tr

am

pa

de

io

ne

s)

Ab8

84c1

8p1

#212

-232

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1.91

-2.1

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2.05

E5

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c Full m

s [ 5

0.00

-550

.00]

5010

015

020

025

030

035

040

045

050

0m

/z

0102030405060708090100

Relative Abundance

343

189

325

95

9181

191

121

6710

930

534

413

529

936

014

777

341

175

287

163

207

6521

720

331

736

222

932

728

535

9

XC

IV |

Pá

gi

na

A

Co

mp

ue

sto

21

(V

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iflo

rol)

1H

RM

N

Bru

ke

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00

MH

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XC

V |

Pá

gi

na

A

Co

mp

ue

sto

21

(V

irid

iflo

rol)

1

3C

RM

N

Bru

ke

r 2

00

MH

z (1

3C

50

MH

z)

XC

VI

| P

ág

in

a

A

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ítu

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METABOLITOS SEC LA PATAGONIA AR BIOLÓGICA ...

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