metabolitos

PRODUCCION DE METABOLITOS PRIMARIOS Y SECUNDARIOS

TEMA 6. PRODUCCIÓN DE AMINOÁCIDOS

Producción de metabolitos primarios y secundarios

1) Son necesarios para el crecimiento del microorganismo que los produce.2) Se producen como productos únicos3) Son producidos por todos los microorganismos (son universales).4) La producción no puede perderse fácilmente pormutación espontánea

Metabolitos primarios…son moléculas de bajo peso molecular que intervienen, bien como productos finales o intermediarios, en las distintas rutas anabólicas y catabólicas

aminoácidos, vitaminas, nucleotidos,alcoholes, ácidos orgánicos

Metabolitos secundarios….. se producen cuando la velocidadde crecimiento es baja, no tienen pues una función esencial en el crecimiento

antibióticos, toxinas, alcaloides,pigmentos

1) Generalmente se producen como mezclas de productosmuy relacionados químicamente entre sí.2) La producción puede perderse fácilmente por mutaciónespontánea3) Cada uno de estos productos es producido por un grupo muy reducido de organismos

Producción de metabolitos primarios y secundarios

exponenciallatencia estacionaria muerte

Trofofase(metabolismo Primario)

Idiofase(metabolismo secundario). Solo observado en algunos microorganismos

Uso comercial de los aminoácidos

Producción de metabolitos primarios: AMINOÁCIDOS

…en medicina

…en la industria alimentaria …..>90%1) Como aditivos de piensos y de alimentos2) Potenciadores del sabor2) Antioxidantes.3) Edulcorantes

…en la industria química… <10%1) Manufactura de polímeros2) Manufactura de pieles sintéticas3) Fabricación de cosméticos4) En la fabricación de herbicidas

PRODUCCION DE AMINOACIDOS

Por producción microbiologica.1) Biotransformación directa. (L-glutámico, L-lisina)

2) Por conversión de un producto intermediario barato vía biosíntesis. Ej. La glicina es convertida en serina.

3) Enzimas o células inmovilizadas producidas por microorganismos; ejemplo: la amino acilasa específica de Aspegillus orizae para separar una mezcla de aa D, L que ha sido acetilada químicamente (met, ala, gly).

Por síntesis química. D, L-alanina, D, L-metionina, D, L-triptófano, D, L-glicina.

Extracción de aa de hidrolizados de proteínas, (L-cisteína, L-leucina, L-tirosina).

Glutamato Prolina( ) ( )

Enzima activa

Enzima inactiva

Regulación de la biosintesis de aminoácidos por retroalimentación (feedback)

Regulación de la biosíntesis de aminoácidos por represión

argC argB argH

RepresorargR

Inactivo

Activo

Promotor Genes estructurales

+ arginina

A

B

C

A A

P1 P2

()X X

REGULACION PORISOENZIMAS

B

C

A

F

P2

D GHE P3P1

REGULACIÓN ACUMULATIVA

A

B

C

A A

P2

X

REGULACIONCONCERTADA

P1

Metabolitos primarios…

I- ALTERACION DE LA REGULACION POR RETROALIMENTACION…

1) Alteración de la acumulación de productos finalesOrnitina, Lisina, Valina

Mutantes auxótrofos2) Mutantes resistentes a la regulación por retroalimentación

Lisina y Treonina, IsoleucinaMutantes resistentes análogos

II- ALTERACION DE LA PERMEABILIDAD…L-glutámico

Producción de metabolitos primariosI- ALTERACION DE LA REGULACION POR RETROALIMENTACION…

1) Alteración de la acumulación de productos finales….……se acumula un producto intermediario

A B C D EEnzima a Enzima b Enzima c Enzima d

A B C D EEnzima a Enzima b Enzima c Enzima d

Producción de metabolitos primarios


1) Alteración de la acumulación de productos finales

Superproducción de L-ornitina por Corynebacterium glutamicum.Mutante auxótrofo para Arginina

Glutámico N-Acetil-Glutamil-P N-Acetil Ornitina

N-Acetil Glutámico Semiladehido N-Acetil Glutámico ORNITINA

Mutación

Citrulina

ARGININA Arginosuccinato


1) Alteración de la acumulación de productos finalesse acumula otro producto final

A B

P1

P2

Superproducción

Producción de metabolitos primarios

Superproducción de L-lisina por Corynebacterium glutamicum en mutantes auxótrofos para metionina, treonina e isoleucina

MM+ ARGININA

MM+ARGININA

MM+ARGININA

Obtención de mutantes auxótrofos

Medio mínimo

Etilmetanosulfonato

+ARGININA

mutagénesis penicilina

-ARGININA


1) Alteración de la acumulación de productos finalesOrnitina, Lisina, Valina

Mutantes auxótrofos2) Mutantes resistentes a la regulación por retroalimentación de rutas ramificadas

Lisina y Treonina, IsoleucinaMutantes resistentes análogos

ASPARTATO

ASPARTIL FOSFATO

SEMIALDEHIDO ASPARTICO

ACIDODIHIDRODIPICOLINICO HOMOSERINA

METIONINA ISOLEUCINA

ACIDO DIAMINOPIMELICO

LISINA

aspartokinasa12

3

Mutantes resistentes a la regulación por retroalimentación (rutas ramificadas)Biosíntesis de lisina en Escherichia coli

TREONINA

Biosíntesis de lisina en Escherichia coli

ASPARTATO

ASPARTIL FOSFATO



TREONINA



LISINA

aspartokinasa12

3

retroalimentaciónrepresión

Mutantes resistentes a la regulación por retroalimentación (rutas ramificadas)

Biosíntesis de lisina en Corynebacterium glutamicum

ASPARTATO

ASPARTIL FOSFATO



TREONINA



LISINA

aspartokinasaretroalimentaciónrepresión

Homoserinadeshidrogenasa

Mutantes resistentesa AEC


Biosíntesis de lisina en Corynebacterium glutamicum

Características de los microorganismos superproductores de lisina:1.Mutantes con un bloqueo en la homoserina deshidrogenasa (auxotrofos de treonina, metionina e isoleucina)2. Mutantes homoserina deshidrogensa hipersensible a la inhibición por treonina.3. Mutantes resistentes a AEC (s-β-aminoetil-L-cisteína).

NH2-(CH2)2-CH2-CH2-CHNH2-COOH Lisina

NH2-(CH2)2-S-CH2-CHNH2-COOH S-aminoetil cisteina AEC


Mutantes regulatorios,retrocruzamientocon la cepa parental para mejorar su crecimiento

RutaRuta de de biosbiosííntesisntesis de de lisinalisinaGlucosa

Fosfoenol piruvato

Acido oxalacético

L-aspartato

L-Aspartil fosfato

Semialdehido aspartico

L-Lisina

AspartokinasaLysC

Threonina

Isoleucina

Leucina

Se puede aumentar la producción de lisina aumentando la producción de oxalacetatoprecursor del aspartato, mediante la amplificación de la piruvato carboxilasa (pyc)

Ciclo TCA

(1) (2) (3)L-Glutámico ----------- B -------------------- C ---------- D -------------- Prolina

Glutamato kinasa

glutámico semialdehidodeshidrogenasa

pirrolina-S carboxilatoreductasa

No enzimática

Biosíntesis de prolina en Serratia marcensens

Mutantes resistentes a la regulación por retroalimentación (rutas no ramificadas)

prolina 3,4-dehidroprolina

S

Acido 4-tiazolidin carboxilico

1) Se aislaron mutantes resistentes a 3,4-dehidroprolina (análogo de prolina).

2) Se inactivó el gen que codifica la enzima la prolina oxidasa.

Para superproducir prolina

3) Serratia marcensens se cultivo en medio con alta concentración de sales

Cuando una ruta esta regulada a varios niveles, la cepa productora debe llevar una mutación cada nivel.

Mutantes resistentes a la regulación por retroalimentación (rutas no ramificadas)



Uso: potenciador del saborMicroorganismo: Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium, Microbacterium y Artrobacter

Características de los microorganismos superproductores de glutamato:1. Deficiencia en la α–cetoglutarato deshidrogenasa2. Incremento en la glutamato deshidrogenasa3. Requerimiento nutricional de biotina

Corynebacterium glutamicum

glutamato



COOHCH2

HC-COOH

HC-OH

COOH

isocitrato

HC-NH2C=O

COOHCH2

COOH

CH2

α-cetoglutarato

COOHCH2

COOH

CH2

glutamato

IsocitratoDeshidrogenasa(descarboxilaciónoxidativa)

GlutamatoDeshidrogenasa(aminaciónreductiva)

NADP

NADPH2

CO2

NADPH2

NH3NADP

Glucosa

Pirúvico Acetil CoA

Oxalacetato

CO2

CO2

Citrato

MalatoAconitato

Succinato

Succinil CoA

FumaratoIsocitrato

α-cetoglutaratodeshidrogenasa

CO2

Glioxilato

Acetil CoAMalatosintasa

CO2

Enzimamálica

Piruvatocarboxilasa

Isocitrato liasa

IsocitratpdeshidrogenasaDescarbox.

NH4

α-cetoglutarato

Glutamato

Metabolitos primarios…L-glutámico

CICLOTCA

Biosíntesis de ácidos grasos

Concentración de Biotina:1-5 μg/ml: excreción de glutamato15 μg/ml: (no hay excreción de glutamato)

Metabolitos primarios…L-glutámico

Acetil-CoA carboxilasa

PRODUCCIÓN DE AMINOÁCIDOS CON ENZIMAS…L-Aspártico

L-Aspártico Acido fumárico + NH3

Aspartasa

Keq =20mM1mM

2M ácido fumárico 2M NH3+L-AspárticoAspartasa

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