Seguridad de los Hemoderivados. Métodos de inactivaciónDra. C. Alonso VerdurasAgencia Española de Medicamentos y Productos Sanitarios

1. Introducción

El plasma humano es el material de partida de una amplia gama de medicamentos, los hemoderivados, utilizados en el tratamiento y prevención de múltiples enfermedades, pudiéndose utilizar además como excipientes. Los hemoderivados se producen a escala industrial a partir de grandes volúmenes de plasma mediante diversos procedimientos de separación y purificación. Cuando se mezclan grandes cantidades de plasma para fabricar estos productos se incrementa la probabilidad de que un virus, que esté presente en una sola donación, pueda contaminar a todo un lote y transmitir una enfermedad viral a un gran número de receptores. Por ello, a pesar de las medidas tomadas para seleccionar a los donantes y analizar las donaciones, el plasma y sus derivados se deben considerar un riesgo potencial para los pacientes. En los últimos años ha desaparecido prácticamente la transmisión de los virus históricamente asociados a estos productos: VHB (virus de la hepatitis B), VHC (virus de la hepatitis C) y VIH (virus de la inmunodeficiencia humana). Esto es consecuencia de las mejoras en el cribado de las donaciones y de las mezclas de plasma, del establecimiento de buenas prácticas de fabricación y de procedimientos específicos de eliminación/inactivación viral. Otros virus potencialmente transmisibles son el VHA (virus de la hepatitis A), el parvovirus B19 y el WNV (West Nile Virus). Actualmente la mayor preocupación es la potencial transmisión por derivados sanguíneos del prión, responsable de la variante de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (vCJD), ante la cual se han tomado ya medidas preventivas. La metodología utilizada para asegurar la ausencia de virus consiste en tres etapas complementarias: selección de donantes, análisis de las donaciones y aplicación durante la fabricación de procedimientos de eliminación/inactivación viral. Ninguna de estas etapas se considera por sí sola suficiente, y es la combinación de las tres la que proporciona un alto nivel de seguridad. En la Directriz de medicamentos derivados de plasma, elaborada por la Agencia Europea de Medicamentos (EMA) (1), y las recomendaciones de la OMS (2,3) se recogen todos los aspectos de calidad y seguridad en la fabricación y control de estos productos con particular atención a la seguridad viral. Continuamente se están desarrollando nuevas recomendaciones y actualizando las existentes conforme al progreso de los conocimientos científicos, con especial atención a los temas de seguridad. 2. Material de partida

La procedencia del plasma, los métodos de recogida, su manipulación y control, son factores esenciales para la seguridad de los hemoderivados:2.1. La selección de donantes: juega un papel primordial en la seguridad transfusional. Su objetivo es la exclusión de donantes potencialmente portadores de un germen que todavía es indetectable en el laboratorio o para el que no se hace un test de detección. Se han de seguir las recomendaciones del Consejo de Europa, de la OMS así como las Directivas de la Unión Europea (4-9) sobre recogida y control de calidad de sangre y derivados, así como los criterios de aceptación de donantes. Además, la EMA ha emitido recomendaciones de exclusión por residencia en países de acúmulo de casos de vCJD, básicamente el Reino Unido (10). Por ello, en el expediente de registro de un hemoderivado (11-12) debe proporcionarse información actualizada de los Centros de Donación y de los procedimientos estandarizados que garanticen la idoneidad de los donantes, así como asegurar que los Centros de Donación no recogen muestras de zonas de alta prevalencia de virus transmisibles por sangre. La Directiva Europea 2002/98/CE establece normas de calidad y garantiza en todos los Estados miembros un nivel comparable de calidad y de seguridad en todos los pasos de la cadena de transfusión sanguínea y en el conjunto de las etapas desde la recogida de la sangre humana y sus componentes hasta su utilización. 2.2. Cribado de donaciones: cada donación debe ser analizada y no reactiva para HBsAg, anti-VIH1/VIH2 y anti-VHC utilizando métodos sensibles, específicos y validados. Para optimizar estos procesos se deben aplicar procedimientos reproducibles según un sistema de aseguramiento de calidad efectivo (1). La sensibilidad de estos métodos, el periodo ventana, y el riesgo de error son

limitaciones de este filtro. Debe establecerse el procedimiento que describa el sistema de información mutua entre el Centro de recogida de plasma y el fabricante de forma que, si después de una donación negativa un donante seroconvierte, desarrolla una enfermedad transmisible o está implicado en una infección postransfusional de un receptor, deben analizarse, si existieran, las donaciones de los 6 meses anteriores y evaluar la seguridad de los productos afectados. Los Centros de Donación deben ser informados si un donante desarrolla la CJD o se encuentra, posteriormente a la donación, que tenía un factor de riesgo para esta enfermedad. No se considera necesaria la retirada de lotes de hemoderivados fabricados a partir de ese plasma en el caso de CJD clásico, pero si el donante es diagnosticado por un centro de referencia de la nueva variante de CJD, como medida de precaución, se retirarán los lotes afectados (10).Han de figurar también en el expediente el tipo de bolsas para la recogida del plasma, con el cumplimiento de las especificaciones de la monografía de la Farmacopea sobre plasma para fraccionamiento (13), así como las condiciones de transporte y conservación del mismo.

3. Fabricación

Los métodos usados en la fabricación de hemoderivados son críticos para asegurar tanto su calidad como su seguridad. Un proceso de fabricación de un hemoderivado no se considera satisfactorio a no ser que además de dar lugar a un producto de alta calidad, sea también capaz de eliminar o inactivar agentes infecciosos. En los hemoderivados hay que tener en cuenta además de los principios generales comunes de normas de correcta fabricación de todo medicamento, las directrices específicas de derivados plasmáticos (14). Los requerimientos y especificaciones de los diferentes hemoderivados se establecen en las monografías respectivas de la Farmacopea. Por otro lado, hay que tener en cuenta que si se utiliza algún reactivo que provenga de rumiantes debe cumplir las medidas que minimizan el riesgo de transmisión de encefalopatía espongiforme (15).3.1. Mezclas de plasma: la fabricación de hemoderivados comienza con la mezcla de las unidades de plasma, que deben estar identificadas y con los controles correspondientes.Para paliar el riesgo de error en el cribado de donaciones y/o en la preparación de las mezclas de plasma, una muestra representativa y homogénea de éstas no debe ser reactiva para los mismos marcadores (excepto anti-VHC) que las donaciones individuales, utilizando métodos de adecuada sensibilidad y especificidad (13). 3.1.1 Técnicas de amplificación genómica: la técnica de PCR (polymerase chain reaction) permite la detección de genomas virales en el periodo ventana antes del desarrollo de anticuerpos, siendo útil para analizar las mezclas de plasma con el objeto de reducir la carga viral a la que se enfrentará el proceso de producción. El ensayo de PCR para VHC se requiere en todas las mezclas de plasma para fraccionamiento (16,17). La tecnología de la PCR está en continuo desarrollo, y muchos fabricantes, mediante estrategias de “minipooles”, la utilizan para otros virus. 3.2. Métodos de fraccionamiento y purificación: los más habituales son:a) Métodos de precipitación:*físicos: la crioprecipitación ha sido generalmente la etapa inicial para la producción de concentrados de Factor VIII. Se realizan técnicas posteriores de purificación que incluyen precipitación y adsorción, así como técnicas cromatográficas.*físico-químicos: entre éstos los procedimientos de fraccionamiento con etanol, derivados del método clásico de Cohn, son los más empleados para la producción de albúmina e inmunoglobulinas. El etanol, agente bactericida y virucida, puede contribuir a la reducción efectiva de posibles contaminantes virales.b) Métodos cromatográficos: básicamente se realizan tres procedimientos cromatográficos en la elaboración de hemoderivados: filtración en gel, intercambio iónico e interacción hidrofóbica y afinidad. Los métodos cromatográficos en general se consideran inseguros por sí solos, aunque contribuyen a la eliminación viral.c) Procedimientos complementarios: la adición resinas y otros productos tales como heparina o antitrombina que se utilizan durante la purificación, contribuyen a la seguridad viral.

4. Procedimientos de inactivación / eliminación viral

En la fabricación de hemoderivados es obligatoria la introducción de etapas específicas de inactivación/eliminación viral. Las condiciones de estos procesos y su monitorización deben estar bien definidas. Para evitar contaminaciones cruzadas es esencial delimitar las zonas de material ya inactivado de las de material no tratado. Los métodos más utilizados son:4.1. Inactivación:a) Pasteurización: el calor en solución acuosa a 60ºC durante 10 h en el envase final es el método usado en la albúmina, descrito en la farmacopea. Es el procedimiento más antiguo y mejor documentado de inactivación viral y ha probado su eficacia en mas de 40 años de uso clínico, utilizándose también para inactivar soluciones líquidas de otros hemoderivados. Su eficacia depende de la composición de la solución. La distribución del calor es uniforme y la humedad ayuda a que el calor sea más efectivo en capacidad virucida, pero ejerce un efecto adverso sobre la función proteica desnaturalizando muchas proteínas, de forma que puede ser necesaria la adición de un estabilizante que también “estabilizaría” el virus.b) Calor seco: su efectividad varía según las condiciones de la liofilización (tiempo y temperatura). La humedad es un factor crítico: si se realiza en el producto final el contenido de agua debe estar bien delimitado. c) Calor húmedo: se usa calor en condiciones de vapor húmedo a presión siendo crítica la presión parcial de vapor de agua. d) Tratamiento con solvente-detergente: Se basa en la adición al preparado de un solvente orgánico (éter, TNBP) y un detergente no iónico (tween, colato sódico, tritón X-100). Ha permitido inactivar virus envueltos como VIH, VHC y VHB sin que se pierda actividad biológica. Es uno de los tratamientos preferidos para anular la capacidad infecciosa del virus, al destruir la membrana lipídica o el sitio de reconocimiento del receptor celular, y mantener la función proteica sin necesidad de añadir estabilizantes. Este método no inactiva virus sin envuelta.e) Bajo pH: el bajo pH (aproximadamente 4) puede inactivar algunos virus. Los factores que deben monitorizarse son: el valor de pH, el tiempo, la temperatura y la composición de la solución.f) Otros métodos: la betapropiolactona es un agente alquilante que inactiva virus actuando por desnaturalización de ácidos nucleicos o proteínas. Se ha descrito una preparación de Factor IX que transmitió VIH, sin que se conozca la causa exacta de este accidente. Otros métodos tales como la fotoinactivación, radiaciones o el tratamiento con ozono han sido de menor uso4.2. Eliminación: además de los descritos en la propia purificación, como la precipitación y la cromatografía, se utiliza:a) Nanofiltración: es una técnica especialmente diseñada para eliminar virus que está en continuo desarrollo. Algunos tipos de filtros pueden producir activación de los factores de coagulación por lo que éstos se deben controlar antes y después de la filtración. Da buenos resultados con moléculas pequeñas como el Factor IX.

5. Estudios de validación

El objetivo de los estudios de validación es evaluar el grado de reducción de la infectividad viral durante la fabricación (18-19). Estos estudios han de realizarse por cada fabricante, para cada proceso específico y para cada sitio de producción. Consisten en simular una etapa de la fabricación introduciendo previamente virus en la muestra y evaluar la efectividad de ese proceso para eliminarlos o inactivarlos. No siempre es posible trabajar con los mismos virus que pueden encontrarse en el plasma y puede ser imposible modelizar completamente las condiciones de fabricación. La evaluación de la capacidad de inactivación/eliminación viral ha de considerar: a) el factor de reducción de los virus inoculados, b) la velocidad y la forma de la curva de inactivación, c) la selectividad de la inactivación para distintos tipos de virus, y d) la robustez del proceso. Si los estudios implican hacer modelos del proceso a escala reducida, debe demostrarse que éstos mimetizan exactamente las condiciones del proceso de producción a gran escala. Estos estudios de validación se realizarán en lugares separados de la planta de producción para evitar riesgo de contaminación cruzada. Además, recientemente se han evaluado los procedimientos de inactivación que se utilizan habitualmente, respecto al WNV (20).5.1 Diseño del procedimiento de fabricación: además de considerar los principios generales de validación de estudios de inactivación viral de todos los productos biológicos, se tendrán en cuenta los siguientes principios adicionales:a) Incorporación de etapas específicas para eliminación/inactivación durante el proceso de

fabricación: es un objetivo que todos los hemoderivados incorporen etapas efectivas en la eliminación/inactivación de un amplio espectro de virus de diversas características físico-químicas. Para ello es deseable incorporar dos etapas distintas y efectivas complementarias en su modo de acción, y al menos una de ellas debe ser efectiva contra virus no envueltos. Aunque sería suficiente el uso de una sola etapa específica, si ésta se demuestra efectiva para un amplio rango de virus incluyendo envueltos y no envueltos y de diversas características físico-químicas, si además existen etapas adicionales efectivas durante la fabricación que contribuyen a la inactivación viral.b) Contribución de la distribución al proceso de eliminación viral: Se reconoce que el efecto de distribución (“partitioning”) a través del proceso de fraccionamiento y fabricación puede contribuir a la eliminación de virus. Sin embargo, ha habido casos de transmisión viral por inmunoglobulinas y factores de coagulación que dependían exclusivamente de este efecto de separación. Estos procesos implican variables difíciles de controlar y de extrapolar en los estudios de validación.c) Selección de etapas específicas: se debe justificar la elección de las etapas específicas, y los fabricantes deben revisar constantemente estas técnicas a la luz de los nuevos conocimientos y ante la posibilidad de aparición de un nuevo virus transmisible por sangre. d) Efecto de las etapas de inactivación/eliminación sobre el producto: debe considerarse especialmente el mantenimiento de la integridad de los componentes plasmáticos y su eficacia clínica, especialmente la formación de neoantígenos, la posibilidad de aumentar la trombogenicidad por la activación de factores de la coagulación, la presencia de residuos tóxicos de reactivos utilizados en el proceso, así como la seguridad viral. e) Aspectos específicos en cada producto:*Factores de coagulación: Son indispensables etapas efectivas específicas para virus envueltos. Con sólo estos procedimientos estos productos han transmitido virus no envueltos como VHA y parvovirus B19 y es prioritario introducir métodos que excluyan también virus no envueltos. Aunque haya etapas de inactivación para estos virus se reconoce la dificultad de eliminar el parvovirus, y si no se logra una reducción efectiva debe reflejarse esta limitación en la ficha técnica del producto.*Inmunoglobulinas: algunas inmunoglobulinas intravenosas que no tenían etapas específicas de eliminación de virus envueltos han transmitido hepatitis C, por lo que es esencial el que haya etapas de eliminación para estos virus.Las inmunoglobulinas intramusculares se han considerado productos seguros, sin embargo la relación de contenido de virus y anticuerpos está cambiando por el cribado de las donaciones y por cambios en la epidemiología de las infecciones virales en las poblaciones de donantes. Por ello, los procesos de inactivación que se han ido introduciendo en las inmunoglobulinas intravenosas se deben aplicar a las intramusculares. Las inmunoglobulinas se utilizan para el tratamiento o la prevención de virus no envueltos como el parvovirus o la hepatitis A. Si el nivel de anticuerpos protectores se mantiene es poco probable que se produzca infección por tales virus. Sin embargo la posible transmisión de un nuevo virus no envuelto o la disminución de anticuerpos a niveles no protectores en los donantes no puede excluirse, por lo que es deseable la adición de etapas específicas para virus no envueltos.*Albúmina: se fabrica por un procedimiento que incluye la pasteurización en el producto terminado y es un producto seguro. No obstante deben realizarse también estudios de validación de su efectividad. Se utiliza ampliamente como estabilizante en la formulación de otros productos plasmáticos o como excipiente en otros medicamentos como vacunas o proteínas recombinantes. Su calidad ha de ser la misma que si es principio activo. 5.2. Diseño y elección de virus en los estudios de validación : se seguirán las mismas reglas generales que para cualquier producto biológico(19). Los estudios de validación en hemoderivados se llevarán al cabo al menos con los siguientes virus:a) VIH1 : No es necesario hacer estudios adicionales con VIH2.b) Modelo de VHC: ante la imposibilidad de cultivar in vitro VHC, caracterizado bioquímicamente como de la familia Flaviridae, se utilizan varios modelos de este virus que incluyen togavirus (Sindbis), flavivirus (la fiebre amarilla), o pestivirus (diarrea bovina).c) Virus no envueltos: Se debe utilizar el propio VHA para factores de coagulación ya que se comporta diferente a otros picornavirus. Los estudios de validación para factores de coagulación también deben incluir un modelo apropiado para el parvovirus como parvovirus porcino, bovino o canino. Sin embargo en el caso de las inmunoglobulinas no se requieren estudios con VHA y

parvovirus humano ya que hay niveles protectores de anticuerpos en el producto y que interferirían en el ensayo. En este caso deben realizarse los estudios con virus no envueltos, para los que la presencia de anticuerpos sea poco probable, con el fin de evaluar la capacidad del proceso para eliminar/inactivar otros posibles virus no envueltos.d) Virus DNA envueltos: No se pueden realizar estudios con el VHB y hasta ahora no se han asociado transmisiones de herpesvirus con el uso de derivados sanguíneos no celulares. Sin embargo, se deben realizar estudios con virus DNA envuelto, por ejemplo con un herpesvirus como pseudorabia ya que continúan apareciendo nuevos herpervirus linfotrópicos que pueden ocasionar viremia.Además los fabricantes de hemoderivados deben de evaluar la capacidad del proceso de fabricación para la eliminación/inactivación de virus, conocidos o posibles emergentes, teniendo en cuanto una serie de factores (p.e. epidemiología, título virémico) que puedan determinar el nivel potencial de partículas virales que podría haber en una dosis de producto final según cada tipo de virus (21).

6. Variante de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob

Se han documentado en el Reino Unido cuatro casos de probable transmisión del prión asociado a la vCJD por transfusión de hematíes de donantes que posteriormente a la donación desarrollaron la enfermedad (22-26), que incluyen tres casos clínicos confirmados y uno en que se encontró el prión en tejido linfoide post-mortem sin síntomas clínicos. Ello plantea un riesgo teórico para los hemoderivados: sin embargo, el riesgo tiene que ser menor que para los componentes sanguíneos, tanto por el efecto de dilución en la mezcla de plasma como por la comprobada eliminación de priones durante las etapas de fraccionamiento del plasma. En febrero del 2009 (27-30) se ha notificado la presencia del prión anómalo en el bazo de un paciente con hemofilia, asintomático y fallecido por otra causa, pero tratado con dos lotes de Factor VIII en los que había intervenido plasma de un donante que desarrolló posteriormente vCJD. Es la primera vez que se ha encontrado el agente de vCJD en una persona tratada con un producto plasmático. Sólo fue positiva una muestra de un estudio de 17 pacientes hemofílicos asíntomaticos de vCJD y tratados con productos obtenidos de plasma del Reino Unido. Los estudios de estimación de riesgo relativo frente a exposición por otras causas, incluyendo la dieta y otros procedimientos médicos, sugieren que la causa más probable de la infección se debe a otros lotes “no implicados” de Factor VIII (31-32). Aunque varias compañías están trabajando en un ensayo para detectar el prión en el plasma, todavía no hay un método validado. Pese a que el prión es muy resistente a la inactivación las etapas de precipitación con etanol, las cromatografías y la nanofiltración son muy efectivas en su eliminación (33). Según las recomendaciones de la EMA cada fabricante debe evaluar sus procedimientos de fabricación respecto a la eliminación del prión para reducir el riesgo de vCJD, de forma similar a los estudios de validación viral (34-35). Hay que tener en cuenta que en hemoderivados es difícil una clara demostración experimental de la efectividad de los procesos de inactivación/eliminación viral o priónica así como la interpretación de los resultados de su validación. Dado que la experiencia ha demostrado que el plasma puede contener virus/agentes emergentes (36), es necesario continuar trabajando en el desarrollo de procesos innovadores que inactiven o eliminen virus/priones de forma efectiva. En último término el seguimiento clínico de los receptores de estos productos es indispensable para la prueba definitiva de su seguridad.

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