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M a r i n a D e A n d r é s Z a m o r a G r a d o e n I n g e n i e r í a E l e c t r ó n i c a y A u t o m á t i c a I n d u s t r i a l
MARCADOR DE BRECHA MEDIANTE MICROFOTOGRAFÍA SOBRE CÉLULAS EPIDÉRMICAS
CULTIVADAS EN PETRI PARA DETERMINAR EL EFECTO DE
ELECTROTERAPIA
Trabajo Fin de Grado
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Estructura
Proyecto de investigación biomédica
Proyecto de ingeniería
Análisis de los resultados
Conclusiones
Preguntas, dudas…
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Motivación del proyecto
Colaboración entre la Universidad Politécnica y el Laboratorio del Servicio de Bioectromagnetismo del Hospital Universitario Ramón y Cajal de Madrid.
Automatización de una etapa de análisis y procesamiento de imágenes
de microscopía. Técnica experimental laboriosa, monótona y subjetiva. Solución eficaz y objetiva. Ahorro de tiempo al personal especializado y
perfeccionamiento de las técnicas utilizadas.
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Investigación biomédica en Electroterapia
Objetivo del estudio de investigación. • Nivel biológico
¿Qué es la Electroterapia?
Aplicación de energía electromagnética al organismo.
0 Hz - 1.000 Hz (baja frecuencia)
450.000 - 600.000 Hz (alta frecuencia)
Transferencia Eléctrica Capacitiva Resistiva (TECR)
TEC: Transferencia Eléctrica Capacitiva
TER: Transferencia Eléctrica Resistiva
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Protocolo de investigación empleado
1. Cultivo o siembra de células epiteliales.
• Queratinocitos humanos.
• Placas Petri. Una semana.
• Cultivos control y cultivos tratado.
2. Realización del surco en la monocapa.
• Micropipeta P1000 o P200.
• Longitud del surco: ~ 2 ó 3 cm.
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Protocolo de investigación empleado
3. Dibujo de marcas guía en las placas Petri
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Protocolo de investigación empleado
4. Realización de imágenes de microscopia a las cero horas
• Microscopio Nikon. Objetivos 10x.
• Cámara Nikon D90.
• Seis imágenes por placa Seis puntos.
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Protocolo de investigación empleado
5. Electro-Estimulación de las placas Petri • Electrodos conectados en serie.
• 50 ó 100 µA/mm2 aplicados en pulsos de cinco minutos cada, aprox., 4 horas.
• Experimentos a cuatro, seis, doce o veinticuatro horas.
6. Obtención de imágenes de microscopía post-tratamiento / Siguiente estimulación
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Problemática a resolver mediante procesamiento de imágenes
Estado de la técnica antes de automatizarla.
Medida de un área sobre microfotografías
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Objetivos del proyecto de ingeniería
Diseño y búsqueda de algoritmos de procesamiento de imágenes para un determinado tipo de microfotografías.
Interfaz Gráfica de Usuario de uso lo más simple e intuitiva posible. Procesamiento por directorios o carpetas.
Rapidez, precisión y generación/extracción de valores numéricos.
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Herramientas para el procesamiento de microfotografías
Image Processing Toolbox
CMEIAS (Center for Microbial Ecology
Image Analysis System)
Instituto Nacional de Salud Mental (NIMH)
MATrix LABoratory
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Algoritmos de segmentación y procesamiento
Algoritmo empírico
Algoritmo de segmentación por textura
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Algoritmos de segmentación y procesamiento
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Algunos ejemplos…
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…Los algoritmos también cometen errores
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Interfaz de aplicación biomédica.
Posibilidad de intercambiar, de manera sencilla, el algoritmo seleccionado para el procesamiento.
Procesar automáticamente carpetas de microfotografías.
Uso fácil e intuitivo.
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Interfaz de aplicación biomédica. Funcionamiento.
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Interfaz de aplicación biomédica. Funcionamiento.
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Interfaz de aplicación biomédica. Funcionamiento.
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Interfaz de aplicación biomédica. Funcionamiento.
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Interfaz de aplicación biomédica. Funcionamiento.
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Interfaz de aplicación biomédica. Funcionamiento.
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Interfaz de aplicación biomédica. Funcionamiento.
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Interfaz de aplicación biomédica. Funcionamiento.
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Interfaz de aplicación biomédica. Funcionamiento.
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Interfaz de aplicación biomédica. Excel.
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Herramientas y técnica para el análisis estadístico de datos
ANOVA Simple
Distribución t de Student
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Análisis de resultados. Experimentos estimulados a 50 µA/mm2
Porcentaje de superficie de brecha a un tiempo T.
Time = 4 horas
• Variable dependiente: Th
• Numero de observaciones: 164
• Número de niveles: 2 (C = Control = 0, T = Tratado = 1)
CT Casos Media
0 78 58,52
1 66 58,78
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Análisis de resultados. Experimentos estimulados a 50 µA/mm2
Porcentaje de superficie de brecha a un tiempo T.
Time = 6 horas
• Variable dependiente: Th
• Numero de observaciones: 69
• Número de niveles: 2 (C = Control = 0, T = Tratado = 1)
CT Casos Media
0 36 42,99
1 33 46,66
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Análisis de resultados. Experimentos estimulados a 50 µA/mm2
Porcentaje de cicatrización a un tiempo T.
Time = 6 horas
• Variable dependiente: (0h-Th)/0h*100
• Numero de observaciones: 69
• Número de niveles: 2 (C = Control = 0, T = Tratado = 1)
CT Casos Media
0 36 26,61
1 33 25,07
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Análisis de resultados. Experimentos estimulados a 100 µA/mm2
Porcentaje de superficie de brecha a un tiempo T.
Time = 6 horas
• Variable dependiente: Th
• Numero de observaciones: 209
• Número de niveles: 2 (C = Control = 0, T = Tratado = 1)
CT Casos Media
0 106 51,68
1 103 54,47
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Análisis de resultados. Experimentos estimulados a 100 µA/mm2
Porcentaje de cicatrización a un tiempo T.
Time = 6 horas
• Variable dependiente: (0h-Th)/0h*100
• Numero de observaciones: 209
• Número de niveles: 2 (C = Control = 0, T = Tratado = 1)
CT Casos Media
0 106 27,64
1 103 24,52
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Conclusiones proyecto de investigación
Tiempo (h)
I/sup Variable dependiente Razón F Valor - P
6
50 µA/mm2
Porcentaje de brecha 0,94 0,3348
Porcentaje de cicatrización
0,13 0,7166
100 µA/mm2
Porcentaje de brecha 2,24 0,1362
Porcentaje de cicatrización
2,37 0,1252
En general, no existen evidencias de diferencias significativas al comparar los experimentos control con los tratado.
Una inhibición de la emigración de las células epidérmicas puede afectar favorablemente al proceso general de cicatrización de heridas cutáneas, al evitar problemas originados por el cierre prematuro de la epidermis con respecto a la dermis. Cierre en falso.
Posible tendencia a que existan diferencias significativas en los experimentos estimulados a 100 µA/mm2. A partir de esta intensidad por unidad de superficie, la temperatura aumenta y las células sufren hipertermia.
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Conclusiones proyecto de ingeniería
Logro de la automatización de la etapa.
Aplicación informática que facilita el análisis y el procesamiento de imágenes de microscopía.
Implementación de un método medida preciso y objetivo.
Herramienta intuitiva y de fácil uso.
Importante ahorro de tiempo, pudiendo procesar y analizar una cantidad determinada de microfotografías en pocos minutos.
Aporte al gran mundo que engloba lo relacionado con la investigación y el desarrollo.
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Publicitación del Congreso de INDIBA
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FIN
Rueda de preguntas, dudas…
…¡¡GRACIAS!!