Manual_Bi

BIOQUÍMICA CLÍNICA

MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO

Área de Terapia Física y Bioingeniería

Rocío Álvarez García

Arturo Cadena Ramírez Liliana González Linares

Primera edición Septiembre 2008

UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE PACHUCA

Rector Dr. Gustavo Núñez Esquer

Secretario Académico

Dr. Juan Luís Díaz de León Santiago

Director de Estudios Profesionales M. en C. Julio César Salgado Ramírez

Coordinador de Ingeniería en Biotecnología

Dra. Rocío Álvarez García

i

INDICE

Introducción ...................................................................................................................... ii

Práctica 1. Identificación del proteínas ............................................................................ 1

Práctica 2 Método de desnaturalización de proteínas en leche, clara de huevo y

grenetina. ........................................................................................................................ 5

Práctica 3. Enzimas………….………………………………………………………………..12

Práctica 4. Estudio de proteínas corporales..………………………………………………19

Práctica 5. Cuantificación de proteínas………..……………………………………………25

Bibliografía......................................................................................................................32

Glosario ......................................................................................................................... 33

ii

INTRODUCCIÓN

Los principios de la bioquímica son, a veces, sorprendentemente sencillos, sin

embargo, el volumen de información y avances experimentales que se deben conocer

para apreciarlos puede ser desalentador.

El primer y principal objetivo de este manual es explicar la biología en términos

químicos, introduciendo el lenguaje de la bioquímica con ensayos que los alumnos

pueden practicar en el laboratorio. De esta forma, proporcionar un conocimiento

equilibrado del contexto físico, químico y biológico en el que opera cada biomolécula.

La comprensión de la bioquímica moderna es imposible sin una introducción a los

métodos experimentales que han permitido los avances más importantes. Por ello, Las

prácticas de este manual, proporcionan las técnicas principales que nos ha brindado el

conocimiento actual que tenemos de la bioquímica, y de igual forma mantener el interés

del estudiante desarrollando las prácticas en etapas que les permita mantener el

enfoque sobre los temas principales y sobre la información esencial con los que se

potenciará su máxima comprensión.

1

PRÁCTICA 1

IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

ANTECEDENTES

Las proteínas son macromoléculas compuestas por una o varias cadenas

polipeptídicas, cada una de las cuales tiene una secuencia característica de

aminoácidos unidos por enlace peptídico.

Las proteínas se encuentran entre los nutrientes más importantes, junto con los lípidos

y los carbohidratos. Esto es así no por su función energética (1 g de proteína = 4,1 kcal

= 17,2 kJ), sino porque son necesarias por su naturaleza nitrogenada, para la síntesis

de compuestos propios del organismo.

Las proteínas que tienen interés en alimentación, se ordenan según su origen de la

siguiente forma:

a) Proteínas de origen animal (carne, leche y huevos).

b) Proteínas de origen marino (pescado, mariscos).

c) Proteínas de origen vegetal (hortalizas, legumbres, cereales y semillas).

d) Nueva fuente de proteínas (organismos unicelulares, extractos de hojas,

concentrados de pescado).

OBJETIVO GENERAL

Identificar la presencia de proteínas en distintos alimentos mediante la reacción de

Biuret.

Práctica 1 Identificación de proteínas

2

METODOLOGÍA

Para la realización de la presente práctica se requieren los si7guientes materiales y

equipos:

Material

1 Matraz volumétrico de 100 ml


1 Vaso de precipitados de 250 ml

1 Vasos de precipitados de 600 ml



1 Cuchillo

5 Tubos de ensayo

1 Embudo vidrio

1 Probeta de 100 ml

1 Gradilla

6 Pipetas graduadas de 10 ml

1 Propipeta

1 Piseta

1 Frasco gotero

10 Pañuelos

Gasa

Equipo

1 Balanza analítica.

1 Parrilla eléctrica

Reactivos

*100 ml de hidróxido de sodio al 10%

*50 ml de sulfato cúprico al 1%

*50 ml de peptona de carne al 10%

Agua destilada

Material biológico

25 ml de leche de vaca ultrapasteurizada

25 ml de clara de huevo al 60%

25 ml de consomé de pollo (Natural)

25 ml de jugo de naranja (Natural)

*25 ml de macerado de papa

Nota : Los reactivos señalados (*) pueden ser preparados por grupo. Cada equipo

llevará el material biológico al laboratorio, así como los pañuelos.


3

PROCEDIMIENTO

1. Preparación de soluciones

1.1 Realizar los cálculos porcentuales necesarios para la preparación de las soluciones

utilizadas.

1.2 Preparar cada una de las soluciones.

1.3 Almacenar las soluciones en un frasco de vidrio etiquetado.

1.4 Macerado de papa. Cortar en trozos 100 g de papa y hervir en 300 ml de agua

durante 10 minutos, posteriormente filtrar a través de gasa. Recuperar el filtrado y dejar

enfriar a temperatura ambiente.

2. Método de identificación de proteínas por el mét odo de Biuret

2.1 Identificación de la presencia de proteínas. Transferir 2.5 ml de cada muestra a

los correspondientes tubos de ensayo etiquetados, agregar a cada tubo 2.5 ml de

NaOH al 10% y dos gotas de sulfato cúprico al 1%. Observar cada uno de los tubos,

describir y dibujar los cambios que ocurran en la apariencia de las muestras

analizadas.

CALCULOS Y RESULTADOS

1. Preparación de soluciones. Describir los cálculos correspondientes a cada solución

preparada.

2. Identificación de la presencia de proteínas. Mostrar en una tabla el pH de cada una

de las muestras analizadas.

En un cuadro comparativo describir y dibujar los cambios observados en las muestras

de alimento.

CUESTIONARIO

1.- ¿Cuál es la función del hidróxido de sodio en ésta técnica?


4

2.- Cómo realizarías el análisis cuantitativo de proteínas por el método de Biuret?

3. Menciona y explica en que consiste cada uno de los siguientes métodos de análisis

de proteínas: Método de Lowry y Método de Bradford.

OBSERVACIONES Y ANÁLISIS DE RESULTADOS

Compara los resultados obtenidos con los datos bibliográficos.

CONCLUSIONES

5

PRÁCTICA 2

MÉTODO DE DESNATURALIZACIÓN DE

PROTEÍNAS EN LECHE, CLARA DE HUEVO

Y GRENETINA

ANTECEDENTES

Las proteínas (del griego protos, que significa “primero y principal”) son

macromoléculas compuestas por una o varias cadenas polipeptídicas, cada una de las

cuales tiene una secuencia característica de aminoácidos unidos por enlace peptídico.

En el organismo las principales funciones de las proteínas son las siguientes:

Estructurales : Colágena (tendones, cartílagos y huesos), Elastina (ligamentos y vasos

sanguíneos), Queratina (piel, pelo, pluma, uñas), Miosina y Actina (músculo).

Funcionales : Enzimas (lipasas, proteasas, etc.), Hormonas (insulina, glucagón,

adenocorticotrópicos), Anticuerpos, Transporte de O2 (hemoglobina y mioglobina),

Toxinas (toxina botulínica).

Las proteínas se encuentran entre los nutrientes más importantes, junto con los lípidos

y los carbohidratos, no por su función energética (1 g de proteína = 4, 1 kcal = 17,2 kJ),

sino porque son necesarias por su naturaleza nitrogenada, para la síntesis de

compuestos propios del organismo. Las proteínas que tienen interés en alimentación,

se ordenan según su origen de la siguiente forma:

Proteínas de origen animal (carne, leche, huevos), proteínas de origen marino

(pescado, mariscos), proteínas de origen vegetal (hortalizas, legumbres, cereales y

semillas). Nuevas fuentes de proteínas (organismos unicelulares, extractos de hojas,

concentrados de pescado).

Práctica 2 Desnaturalización de proteínas

6

La leche es una disolución acuosa de proteínas, lactosa, minerales y ciertas vitaminas,

que lleva emulsionados glóbulos grasos y coloidalmente micelas de caseína. El

contenido proteico de la leche de vaca oscila entre el 3 y 4% según sea la raza y

procedencia del animal, aunque se acepta como normal un valor medio de 3,5%.

Tradicionalmente, se consideran dos clases de proteínas lácteas: la caseína y las

proteínas del suero. La primera es una fracción formada por un grupo heterogéneo de

fosfoproteínas, que tienen la característica común de precipitar en la leche cruda a un

pH 4,6 y a 20ºC. Las proteínas que en estas condiciones permanecen en solución son

las del suero. La caseína representa aproximadamente el 80% del total de las proteínas

de la leche y las del suero el 20% restante.

En el huevo de gallina, la cáscara representa aproximadamente el 11%; la yema, el

31% y la clara, el 58% de la masa total. La yema de huevo contiene cerca de un 50%

de sólidos, de los que un tercio son proteínas y los dos tercios restantes, lípidos. La

clara de huevo esta formada casi completamente por proteínas (11-13%) y agua. En la

Tabla 1 se muestra la composición proteínica de la clara de huevo.

Tabla 1 Proteínas mayoritarias de la clara de huevo

Proteína Porcentaje aproximado del

contenido proteínico total

Ovoalbúmina 54

Conalbúmina

(ovotransferrina) 12

Ovomucoide 11

Ovomucina 1.5 – 3.5

Lisozima 3.4

Ovoglobulinas 8


7

Desnaturalización

Determinados tratamientos, no excesivamente energéticos (que no provoquen la

ruptura del enlace peptídico), son capaces de modificar de manera importante la

estructura de las proteínas, mientras que en iguales condiciones otros compuestos

químicos permanecen inalterados. Estos cambios de las propiedades de las proteínas

se denominan genéricamente “desnaturalización”.

Este proceso comporta las siguientes modificaciones: (1) mayor sensibilidad del enlace

peptídico a los fenómenos de hidrólisis provocados por enzimas proteolíticas (2),

disminución de la solubilidad; (3) descenso o incluso pérdida de la actividad enzimática;

(4) imposibilidad de cristalización; (5) aumento de la viscosidad intrínseca y (6)aumento

del poder rotatorio específico de la proteína.

A medida que aumentan los conocimientos sobre la estructura de las proteínas, el

concepto de desnaturalización se asocia cada vez más a cambios estructurales de la

molécula. De acuerdo con ello, es presumible que se alteren las estructuras

secundarias, terciarias y cuaternarias, excepto la rotura de enlaces covalentes. De

hecho, se produce rotura de puentes de hidrógeno, interacciones hidrófobas y enlaces

salinos, todo lo cual hace que la molécula se despliegue. En algunas ocasiones, la

proteína pierde totalmente su estructura y adquiere una disposición de enrollamiento al

azar, y en este estado origina agregados con mayor facilidad.

La desnaturalización de una proteína mediante distintos agentes no provoca los

mismos cambios. Así, por ejemplo, la desnaturalización de una proteína por el calor no

conduce a las mismas alteraciones que las producidas al someterla a ácidos o álcalis

diluidos. Se consigue la desnaturalización de proteínas mediante agentes físicos y

químicos.


8

Agentes físicos

a) Temperatura . La velocidad de desnaturalización de una proteína depende

mucho de la temperatura. Para la mayoría de las reacciones químicas, la

velocidad de reacción se duplica por cada incremento en 10°C, en la

desnaturalización de proteínas esta velocidad aumenta aproximadamente unas

seiscientas veces para el mismo incremento, debido a esto, la manipulación de

proteínas a temperaturas poco altas evita o reduce de manera considerable

estos fenómenos.

b) Presión. Las presiones elevadas (1000 kg/cm2), es capaz de provocar la

desnaturalización de las proteínas, debido a que se modifican las estructuras de

las moléculas y adquieren mayor densidad.

c) Radiaciones U.V inactivan determinadas enzimas y disminuyen la solubilidad de

ciertas proteínas.

Agentes químicos

a) PH. La mayoría de las proteínas son estables en un reducido intervalo de pH y

valores del mismo que se aparten de este, provocan la desnaturalización. A

medida que el pH del medio se aleja del valor óptimo, aumenta las cargas en los

grupos R y también las que ejercen repulsión entre diferentes zonas de la

molécula. Esto involucra la modificación de la estructura, aunque si estos

cambios no son excesivos, la proteína puede adquirir de nuevo su configuración

normal cuando se restablece el valor de pH óptimo.

b) Sales . Por regla general, las proteínas en solución son menos solubles cuando

se aumenta la fuerza iónica y esto se puede lograr adicionando sales solubles

como el sulfato de amonio.

c) Solventes orgánicos . Los disolventes orgánicos tales como acetona o alcohol,

por ejemplo, son capaces de conseguir la desnaturalización, aunque en este

caso es posible disminuir los efectos trabajando a bajas temperaturas.


9

d) Concentración . Altas concentraciones de solutos (6-8M), tales como urea o

guanidina, son capaces de ocasionar la rotura de enlaces de hidrógeno y, en

último término, la desnaturalización de la proteína. Parece ser que también estos

compuestos neutralizan las interacciones hidrófobas, con lo que aumentan la

solubilidad.

e) Detergentes sintéticos son los agentes más enérgicos para causar la

desnaturalización, debido a su propiedad de neutralizar los grupos hidrófilos e

hidrófobos, bloqueando así las fuerzas necesarias para el mantenimiento de la

estructura.

OBJETIVO

Conocer y demostrar el efecto de factores físico-químicos como: temperatura, pH, sales

y presencia de solventes en las muestras de leche, clara de huevo y grenetina.

METODOLOGÍA

Para la realización de la presente práctica se requieren los siguientes materiales y

equipos:

Material

22 Tubos de ensaye de vidrio

1 Gradilla de metal

1 Probeta de 100 ml

1 Vaso de precipitados de 250 ml




1 Pinza para tubo de ensaye

1 Piseta

2 Frascos de vidrio

1 Propipeta


2 Perlas de ebullición

1 Termómetro


10

Equipo


1 Parrilla de calentamiento

Material biológico

100 ml de leche de vaca ultra pasteurizada

100 ml de clara de huevo al 60% (fresca)

100 ml de solución de grenetina al 5%

Reactivos

*100 ml de hidróxido de sodio 2M

*100 ml de NaHCO3 0.9%

*100 ml de HCl 1.5 M

*100 ml de etanol al 95%

*100 ml de NaCl 1M

*100 ml de solución saturada de NH2SO4

Agua destilada

Nota : Los reactivos señalados (*) pueden ser preparados por grupo. Cada equipo

llevara el material biológico al laboratorio.

PROCEDIMIENTO

1. Preparación de soluciones

1.1 Realizar los cálculos molares y porcentuales necesarios para la preparación de las

soluciones necesarias como reactivos en este ensayo.

1.2 Preparar cada una de las soluciones.

1.3 Almacenar las soluciones en un frasco de vidrio etiquetado.

2. Método de desnaturalización por temperatura, pH, sales y solventes orgánicos

2.1 Temperatura

2.1.1 Transferir 3 ml de muestra (leche, clara de huevo o solución de grenetina) en un

tubo de ensayo de vidrio.

2.1.2 Calentar la muestra en un baño de agua (en un vaso de precipitados de 250 ml)

a ebullición (90°C) durante 5 minutos, teniendo pre caución de utilizar pinzas

para tubo de ensaye, con la finalidad de no sufrir alguna quemadura.

2.1.3 Observar, anotar y dibujar los cambios que ocurran en la apariencia de las

muestras añadidas.


11

2.2 pH

2.2.1 Transferir 3 ml de muestra (leche, clara de huevo y solución de grenetina) en 3

tubos de ensayo y etiquetarlos con el numero correspondiente. Agregar los reactivos de

acuerdo a la tabla 2.


muestras añadidas.

Tabla 2 Volumen de reactivos en el ensayo de desnaturalización por efecto de pH

Muestra No. de tubo de

ensaye

Vol. de NaOH

2M (ml)

Vol. de

NaHCO3

0.9% (ml)

Vol. de HCl 1M

(ml)

Leche

1 3 0 0

2 0 3 0

3 0 0 3

Clara de huevo

1 3 0 0

2 0 3 0

3 0 0 3

Solución de

grenetina

1 3 0 0

2 0 3 0

3 0 0 3

2.3 Sales


tubos de ensayo.

2.3.2 Agregar a cada tubo 3 ml de NaCl 1M.

Observar, anotar y dibujar los cambios que ocurran en la apariencia de las muestras

analizadas.


tubos de ensayo.

2.3.4 Añadir a cada tubo 3 ml de solución saturada de sulfato de amonio, agitar.


12


muestras analizadas.

2.4 Solventes orgánicos


tubos de ensayo.

2.4.2 Estratificando cuidadosamente, agregar a cada tubo 3 ml de alcohol etílico al

95%.

2.4.3 Observa lo que ocurre en la interfase, anotar y dibujar los cambios en la

apariencia de las muestras analizadas.



preparada.

2. Desnaturalización. Para cada efecto evaluado describir y dibujar los cambios

observados en las muestras de leche, clara de huevo y solución de grenetina.

ANÁLISIS DE RESULTADOS

CONCLUSIONES

CUESTIONARIO

1.- Explica la diferencia entre coagulación y desnaturalización.

13

PRÁCTICA 3

ENZIMAS

ANTECEDENTES

Las enzimas son sustancias proteicas que actúan como catalizadores en las

reacciones bioquímicas. Cada célula produce las enzimas necesarias para el

funcionamiento del organismo en el cual se encuentran, de acuerdo con las

“instrucciones” contenidas en el ácido desoxirribonucleico. El número de enzimas en un

organismo puede ser muy grande, dependiendo de su complejidad.

Una característica esencial de cada enzima es su especificidad; o sea, es capaz de

catalizar únicamente en una determinada reacción. Las enzimas actúan formando un

complejo con el sustrato, es decir, la sustancia cuya transformación química van a

catalizar. Entre los factores que afectan la velocidad de las reacciones enzimáticas se

tienen la temperatura, el pH, entre otros. La inactivación o inhibición de una enzima

impide que se efectúe la transformación catalítica supuesta.

En los procesos de digestión de los alimentos, las moléculas grandes de carbohidratos,

proteínas y lípidos son hidrolizadas para convertirlas en moléculas más pequeñas

capaces de atravesar las paredes del intestino, para ser transportadas en el torrente

sanguíneo. Por ejemplo, en el caso del almidón, para ser asimilado es transformado en

moléculas más pequeñas por reacciones de hidrólisis, catalizadas por diferentes

enzimas denominadas amilasas. Las amilasas se encuentran en la saliva y en el

páncreas.

Práctica 3 Enzimas

14

OBJETIVO

Efectuar pruebas para determinar la acción de la amilasa de la saliva, y estudiar la

influencia de la temperatura sobre su actividad.

METODOLOGÍA


equipos:

Material

1 Termómetro.

5 pipetas graduadas de 5 ml.

1 Probeta 100ml.

1 propipeta.

2 vasos de precipitados de 100 ml.

5 tubos de ensaye de 13 x 100 mm

20 portaobjetos.

1 Frasco de residuos.

2 Frascos goteros.

3 vasos de precipitados de 250 ml

1 agitador de vidrio

1 vaso de precipitado de 30 ml.

2 vasos de precipitados de 600ml

3 vasos de precipitados de 50ml

Equipo


1 Parrilla eléctrica de calentamiento

1 Baño maría

Reactivos

1. Solución de almidón al 1%, en una

solución 0.005 molar de cloruro de sodio.

2. Suspensión de almidón al 1%.

3. Frasco gotero con lugol.

4. Hielo.

Práctica 3 Enzimas

15

PROCEDIMIENTO

1.-Preparación de soluciones

1.1 Solución de almidón al 1%

1.1.1 En un vaso de precipitados de 250 ml coloque 100 ml de una solución de cloruro

de sodio (0.28 g de NaCl/L de agua destilada) y caliente hasta ebullición.

1.1.2 Con una varilla de vidrio mezcle en un vaso de precipitado de 30 ml 1 g de

almidón, con unas gotas de agua fría hasta formar una pasta.

1.1.3 Vierta la pasta al agua hirviendo, agitando con la varilla de vidrio.

1.1.4 Una vez fría la solución viértala a un frasco gotero etiquetado.

1.2 Suspensión de almidón al 1%

1.2.1 En un vaso de precipitados de 250 ml coloque 100 ml de agua destilada y

agregue 1g de almidón.

1.2.2 Vierta la solución a un frasco gotero etiquetado.

2. Digestión del almidón mediante la amilasa de la saliva

2.1 Coloque 25 ml de una solución de almidón al 1% en un vaso de precipitados de 100

ml y 25 ml de suspensión de almidón al 1% en otro vaso de 100 ml, previamente

etiquetados.

2.2 Tenga disponibles algunos portaobjetos y la solución de yodo.

2.3 Obtenga dos muestras de saliva de una misma persona, de 1 ml cada una y

viértalas en dos tubos de ensaye.

2.4 Utilice la parrilla de calentamiento y preparé un baño maría a 38°C. Coloque los

dos vasos de precipitados y los dos tubos de ensaye en el baño de agua. Después de 3

o 5 minutos, vierta el contenido de cada tubo de ensaye en cada vaso de precipitados.

Práctica 3 Enzimas

16

2.5 En intervalos de 1 minuto, saque separadamente de cada vaso de precipitados una

gota de la solución, y mézclela con una gota de la solución de yodo colocada sobre un

portaobjetos. Después de 10 minutos, efectúe la prueba cada 5 minutos. Anote sus

resultados en la tabla 1 .

2.6 Indique el tiempo requerido para alcanzar el punto acromático (desaparición del

color) en ambas soluciones, y explique sus resultados.

3. Influencia de la temperatura sobre la amilasa de la saliva

3.1 Etiquete 3 vasos de precipitados de 50 ml (1, 2 y 3) y coloque en cada uno de ellos

5 ml de solución de almidón al 1%.

3.2 Coloque el vaso 1 en un baño de hielo, el vaso 2 en un baño de agua a 38°C y el 3

en un baño de agua a 70°C.

3.3 En otros tres tubos de ensaye coloque respectivamente 2 ml de una solución de

saliva, preparada disolviendo 0.5 ml de saliva en 25 ml de agua destilada. Coloque

cada uno de los tubos con solución de saliva en cada uno de los baños mencionados,

hasta alcanzar la temperatura de equilibrio.

3.4 Cuando esto ocurra vierta las soluciones de saliva en las soluciones respectivas de

almidón; mézclelas bien, saque 2 gotas de cada mezcla y efectúe separadamente la

prueba con la solución de yodo sobre un portaobjetos.

3.5 Efectúe la prueba cada 2 minutos y después de 10 minutos cada 5 minutos, hasta

obtener el punto acromático. Anote sus observaciones en la tabla 2 .

Práctica 3 Enzimas

17



preparada.

Tabla 1 Color producido por la solución de yodo después de añadir saliva al almidón.

Tiempo transcurrido

(minutos) Solución de almidón Suspensión de almidón

1 2 3 4 5 6 7 8 9

10 15 20 25

Tabla 2 Efecto de la temperatura sobre la actividad de la amilasa de la saliva. Tiempo transcurrido

(minutos) Temperatura

0°C Temperatura

38°C Temperatura

70°C 0 2 4 6 8

10 15 20 25

Práctica 3 Enzimas

18

ANALISIS DE RESULTADOS

CONCLUSIONES

CUESTIONARIO

1. ¿Qué reacción cataliza la amilasa de la saliva?

2. Con base en la tabla 1, explique en que forma el almidón es más fácil de digerir.

3. De acuerdo con sus resultados de la tabla 2, deduzca cuál es la temperatura óptima

de acción de la amilasa de la saliva.

4. Diseñe un experimento en el cual podría estudiar la influencia de la concentración de

sustrato sobre la velocidad de la reacción catalizada por la amilasa.

19

PRÁCTICA 4

ESTUDIO DE LAS PROTEÍNAS CORPORALES

ANTECEDENTES

Las proteínas son polímeros lineales constituidos por los aminoácidos, que se unen

entre sí por medio de enlaces tipo amida denominados enlaces peptídicos.

Las proteínas pueden ser clasificadas en función de aspectos tan diversos como su

composición, su disposición espacial, su función biológica y su localización.

Atendiendo a su localización dentro del organismo humano, las proteínas pueden

clasificarse en:

• Hísticas o Titulares, son las proteínas de los tejidos.

• Plasmáticas o Hemáticas, son las proteínas de la sangre.

Proteína total

La suma de las concentraciones de todas y cada una de las proteínas presentes en el

plasma sanguíneo se conoce como proteínas totales y la cifra normal, en promedio, es

de 7.1 g/dl, siendo las cifras límite entre 6 y 8 g/dl.

Las proteínas totales están integradas por albúmina (más de la mitad) y la globulinas;

éstas últimas agrupan a todas las proteínas que no son albúmina.

La concentración de las proteínas plasmáticas en un momento determinado es el

resultado de tres procesos: La velocidad de síntesis, el volumen del líquido en que se

distribuyen y la velocidad de degradación. En diversos estados patológicos estos

procesos pueden superponerse.

La determinación de proteína total es útil en el diagnóstico en enfermedades del

hígado, de los riñones y de la médula ósea.

Práctica 4 Estudio de las proteínas corporales

20

Albúmina

Es la principal proteína plasmática y es sintetizada y secretada por el hígado a razón de

12 gramos al día. Supone alrededor del 25% de la producción proteica hepática total y

la mitad de toda la proteína secretada.

En el adulto normal se degradan diariamente 12 gr de albúmina que pueden proveer de

aminoácidos para la síntesis de otras proteínas. Además de esta función nutritiva la

albúmina ayuda a conservar la distribución normal de agua ya que produce cerca de

80% del efecto osmótico de las proteínas plasmáticas totales, debido a su alta

concentración y bajo peso molecular.

La albúmina interviene en el equilibrio ácido-básico y se encarga también del transporte

de varias sustancias como son los ácidos grasos, la bilirrubina, varias hormonas e

incluso varios fármacos. Las cifras normales de albúmina son de 4.5 g/dl y las cifras

límite entre 3.5 y 5 g/dl. La relación normal A/G es mayor de 1 y es un indicador

importante en algunos estados patológicos.

Método de Biuret

Cuando las sustancias que contienen dos o más uniones peptídicas reaccionan con el

reactivo de Biuret (sulfato de cobre alcalino), se forma un complejo rojizo. El producto

coloreado es el resultado de la coordinación de átomos de nitrógeno peptídicos con

Cu2+. La cantidad de producto formado depende de la concentración de proteína.

En la práctica, se debe utilizar una curva de calibración usando una proteína estándar

en solución, dicho estándar debería ser una preparación de la proteína en estudio.

Dado que ésta situación no siempre es posible, se elige a otra proteína como estándar

relativo. Una solución acuosa de albúmina de suero bovino es un estándar apropiado.

Varias cantidades conocidas de ésta solución son tratadas con el reactivo de Biuret y

se desarrolla un color. En un espectrofotómetro se mide la absorbancia (λ = 540 nm)

utilizando un blanco que contiene el reactivo de Biuret y agua o solución

amortiguadora. Una muestra de proteína de concentración desconocida se trata con el


21

reactivo de Biuret y posteriormente se mide el color producido. La concentración de

proteína se determina utilizando la curva estándar.

OBJETIVO

Que el alumno conozca los métodos generales para el estudio de las proteínas

plasmáticas.

Que el alumno determine la concentración sérica de proteína total y de albúmina e

interpretar los resultados obtenidos.

METODOLOGÍA


equipos:

Material

1 Gradilla

25 Tubos de ensaye

1 matraz aforado de 50 ml

1 matraz aforado de 100 ml

2 Pipetas graduadas de 10mL

1 agitador magnético

Puntas para pipetas automáticas

1 vaso de precipitado de 250 ml

1 vaso de precipitado de 100 ml

1 probeta de 100 ml

1 pipeta de 5 ml

1 Propipeta

1 Piseta

1 pipeta pasteur

Torundas con alcohol

Reactivos

Reactivo de Biuret:

1.- Sulfato de cobre (II) pentahidratado

(CuSO4. 5H2O).

2.-Tartrato de sodio y potasio

(C4H4KNaO6. 4H2O).

3.- Hidróxido de sodio al 10% (NaOH).

Albumina sérica bovina


22

Equipo

Parrilla eléctrica

Espectrofotómetro

Centrifuga

Pipetas automáticas 10-1000 µl

PROCEDIMIENTO

1. Reactivo de Biuret

1.1 Disolver en un vaso de precipitados de 250 ml, 0.15g de CuSO4. 5H2O y 0.805g de

C4H4KNaO6. 4H2O en 50 ml de agua destilada.

1.2 Colocar la solución sobre una parrilla con agitación y adicionar 30 ml de una

solución de hidróxido de sodio al 10%.

1.3 Transferir la solución a un matraz aforado de 100ml y aforar con agua destilada.

1.4 Almacenar la solución en un frasco de vidrio etiquetado.

2. Curva patrón

2.1 Se prepara la curva patrón con albúmina sérica bovina a partir de una solución de

10mg/ml. En 18 tubos de ensaye etiquetados, adicionar los reactivos de acuerdo a la

tabla 2 . Para cada concentración se preparará por triplicado.

2.2 Adicionar 4 ml de reactivo de Biuret. Mezclar y dejar en reposo 30 minutos a

temperatura ambiente.

2.3 Medir en un espectrofotómetro la absorbancia de cada una de las soluciones a 540

nm. Registrar los resultados y realizar la grafica.


23

Tabla 2. Volumen de reactivos en el ensayo de cuantificación de proteínas por el

método de Biuret.

No. Tubo

Concentración

(mg/ml)

Volumen de solución de

albúmina (ml)

Volumen del

diluyente (ml)

1 0 0.0 1.0

2 2 0.2 0.8

3 4 0.4 0.6

4 6 0.6 0.4

5 8 0.8 0.2

6 10 1.0 0.0

3. Cuantificación de proteínas totales

3.1 Realizar la toma de muestra de sangre del paciente y transferir a un tubo de

ensayo.

3.2 Centrifugar la muestra a 1500 revoluciones por minuto durante 10 minutos.

3.3 Con una pipeta pasteur, separar el suero (líquido amarillo) del resto del paquete

globular.

3.4 Realizar dilución de suero 1/10 (10 µl de suero y 90 µl de agua destilada) con una

pipeta automatizada.

3.5 Preparar la siguiente serie de tubos:

No. de tubo 1. Blanco 2. Suero problema

Suero problema - 1 ml

Reactivo de Biuret 4 ml 4 ml

3.6 Mezclar e incubar 15 minutos a temperatura ambiente.

3.7 Leer frente al blanco de reactivos a 540 nm en espectrofotómetro.

3.8 Hacer los cálculos necesarios para obtener la concentración de proteínas.


24

Valores esperados:

Recién nacidos: 5.2 – 9.1 g/dl.

Niños (hasta 3 años): 5.4 – 8.7 g/dl.

Adultos: 6.0 – 8.0 g/dl.

4. Cuantificación de Albúmina

4.1 Preparar la siguiente serie de tubos:

No. de tubo 1. Blanco 2. Suero problema

Suero problema - 100 µ l

Reactivo de Biuret 20 ml 20 ml

4.2 Mezclar e incubar 10 min a temperatura ambiente.

4.3 Leer frente al blanco de reactivos a 630 nm.

4.4 Hacer los cálculos necesarios para la obtención de la concentración de albumina

Valores esperados de 3.5 – 5 g/dl.

CÁLCULOS Y RESULTADOS


preparada.

2. Método de Biuret.

a) Calcula el promedio de las absorbancias para cada concentración.

b) Elabora la curva patrón graficando en el eje de las “x” la concentración de proteína

y en el eje de las “y” la absorbancia promedio (en papel milimétrico). Realiza una

regresión lineal de la curva y reporta su coeficiente de correlación (r).

c) Usa la curva patrón para determina la concentración de proteína de la muestra

analizada.


25

Interprete sus resultados.

CUESTIONARIO

1.- ¿Cuál es la composición proteica de la sangre?

2.- ¿Qué función tiene la albumina en la sangre?

3.- ¿Qué patologías causan proteínas altas en sangre?¿Porque?

CONCLUSIONES

26

PRÁCTICA 5

CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

ANTECEDENTES

Durante la investigación bioquímica se requiere medir cuantitativamente la

concentración en solución. Los medios para la cuantificación del contenido proteico se

basan en distintos principios:

a) Determinación del contenido de nitrógeno total (Método de Kjeldahl).

b) Reacción química del enlace peptídico y posterior medida fotométrica (Método

de Biuret y Método de Ácido Bicincónico (BCA).

c) Reacción química de determinados aminoácidos de la proteína y posterior

medida fotométrica (Método de Lowry reacciona fundamentalmente la tirosina).

d) Medición de la absorción ultravioleta (determinación de los aminoácidos

aromáticos triptófano, tirosina y fenilalanina; los máximos de absorción se

encuentran en torno a los 280 nm).

e) Medida de la turbidez por floculación de la proteína disuelta mediante un

precipitante de proteínas.

Las diferentes técnicas de análisis tienen limitaciones, debido a que no son

suficientemente sensibles o porque se basan en reacciones con aminoácidos

específicos en la proteína. Sin embargo, cada método proporciona resultados

satisfactorios si se utilizan las condiciones experimentales en la selección del método,

se incluye la sensibilidad y exactitud deseada; la presencia de sustancia de

interferencia y el tiempo disponible para el ensayo. En la tabla 1 se comparan distintos

métodos de cuantificación de proteínas.

Práctica 5 Cuantificación de proteínas

27

Método de Biuret

Cuando las sustancias que contienen dos o más uniones peptídicas reaccionan con el

reactivo de Biuret (sulfato de cobre alcalino), se forma un complejo rojizo. El producto

coloreado es el resultado de la coordinación de átomos de nitrógeno peptídicos con

Cu2+. La cantidad de producto formado depende de la concentración de proteína.

En la práctica, se debe utilizar una curva de calibración usando una proteína estándar

en solución, dicho estándar debería ser una preparación de la proteína en estudio.

Dado que ésta situación no siempre es posible, se elige a otra proteína como estándar

relativo. Una solución acuosa de albúmina de suero bovino es un estándar apropiado.

Varias cantidades conocidas de ésta solución son tratadas con el reactivo de Biuret y

se desarrolla un color. En un espectrofotómetro se mide la absorbancia (λ = 540 nm)

utilizando un blanco que contiene el reactivo de Biuret y agua o solución

amortiguadora. Una muestra de proteína de concentración desconocida se trata con el

reactivo de Biuret y posteriormente se mide el color producido. La concentración de

proteína se determina utilizando la curva estándar.

OBJETIVO

Cuantificar el contenido de proteína en una muestra de leche pasteurizada de vaca por

el método de Biuret.

METODOLOGÍA


equipos:


28

Material

1 Matraz volumétrico de 50 ml.

1 Vaso de precipitados de 250 ml.

1 Matraz volumétrico de 100 ml.

1 Probeta de 100 ml.

2 Pipetas graduadas de 1 ml.

1 Propipeta.

1 Gradilla.

1 Espátula.

1 Agitador magnético.

20 tubos de ensaye (15 X 150 mm).

Celdas de plástico.

1 piseta.

Pañuelos desechables.

Equipo


1 Espectrofotómetro

1 Parrilla de calentamiento con agitación

1 Micropipeta automatizada 100-1000 µl

Material biológico

1. Albúmina sérica bovina.

2. Leche pasteurizada de vaca.

Reactivos

1. Sulfato de cobre (II) pentahidratado

(CuSO4 . 5H2O).

2. Tartrato de sodio y potasio (C4H4KNaO6

. 4H2O).

3. Hidróxido de sodio al 10% (NaOH).


29

PROCEDIMIENTO

1. Reactivo de Biuret

1.1 Disolver en un vaso de precipitados de 250 ml, 0.15 g de CuSO4 . 5H2O y 0.805 g

de C4H4KNaO6 . 4H2O en 50 ml de agua destilada.

1.2 Colocar la solución sobre una parrilla con agitación y adicionar 30 ml de una

solución de hidróxido de sodio al 10%.

1.3 Transferir la solución a un matraz aforado de 100 ml y aforar con agua destilada

1.4 Almacenar la solución en un frasco de vidrio etiquetado.

2. Método de cuantificación de proteínas por el mét odo de Biuret.

2.1 Curva patrón

2.1.1 Se prepara la curva patrón con albúmina sérica bovina a partir de una solución de

10mg/ml. En 18 tubos de ensaye etiquetados, adicionar los reactivos de acuerdo a la

tabla 2 . Para cada concentración se preparará un triplicado.

2.1.2 Adicionar 4 ml del reactivo de Biuret. Mezclar y dejar en reposo 30 minutos a


2.1.3 Medir en un espectrofotómetro la absorbancia de cada una de las soluciones a

540 nm. Registrar los resultados.

3. Análisis de la muestra

3.1 Transferir a 1 tubo de ensaye etiquetado 1 ml de la solución problema (leche

pasteurizada de vaca).

3.2 Adicionar 4 ml del reactivo de Biuret. Mezclar y dejar en reposo 30 minutos a



30

3.3 Medir con el espectrofotómetro, la absorbancia de la solución de la muestra a una

longitud de onda de 540 nm contra un blanco preparado con 1 ml de agua en vez de la

solución problema. Registrar los resultados.

Tabla 2 . Volumen de reactivos en el ensayo de cuantificación de proteínas por el

método de Biuret.

No. Tubo Concentración (mg/ml)

Volumen de solución de albúmina (ml)

Volumen del eluyente (ml)

1 0 0.0 1.0 2 2 0.2 0.8 3 4 0.4 0.6 4 6 0.6 0.4 5 8 0.8 0.2 6 10 1.0 0.0

CÁLCULOS Y RESULTADOS


preparada.

2. Método de Biuret.

a) Calcula el promedio de las absorbancias para cada concentración.

b) Elabora la curva patrón graficando en el eje de las “x” la concentración de proteína

y en el eje de las “y” la absorbancia promedio (en papel milimétrico). Realiza una

regresión lineal de la curva y reporta su coeficiente de correlación (r).

c) Usa la curva patrón para determina la concentración de proteína de la muestra

analizada.

ANALISIS DE RESULTADOS


preparada.


31

2. Desnaturalización. Para cada efecto evaluado describir y dibujar los cambios

observados en las muestras de leche, clara de huevo y solución de grenetina.

CONCLUSIONES

CUESTIONARIO

1. ¿Qué se entiende por curva patrón?

2. ¿Qué es una regresión lineal y cuál es la importancia del coeficiente de

correlación?

3. ¿Qué son las proteínas?

4. ¿Cuál es la composición proteica de la leche de vaca?

5. ¿Cuáles son las ventajas y desventajas del método de Biuret?

32

BIBLIOGRAFÍA

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edición. CA, USA : 41 – 47.

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central. PEARSON EDUCACIÓN. México. Novena edición. P: 621 -625.

Fennema. O.R. 2000. Química de los Alimentos. Ed. Acribia, España.

Hicks, J.J. 2000. Bioquímica. Ed. Mc Graw-Hill Interamericana, México.

Kotz, J. C; Treichel, P. M. y Harman, P. A. 2003. Química y reactividad química.

Internacional Thomson Editores, S.A. de C.V. 5ta. Edición. p: 181 – 182.

Lenhinger, A., Nelson, D.L., Cox, M.M. 1993. Principios de Bioquímica. Editorial

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Matissek, R., Schnepel, F-M., Steiner, G. 1998. Análisis de los Alimentos.

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Edición. D.F. México. Páginas consultadas: 46 -48.

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Undécima Reimpresión de la Segunda Edición. Editorial Limusa, S.A. de C.V. pp:

58 - 59.

Zárraga, S.J.C, Velásquez, V. I, Rodríguez, R. A, Casterlls, G. Y. 2002. Química.

Tercera edición. Mc Graw-Hill Interamericana Editores, S.A. de C.V. p 132-133.

33

GLOSARIO

A

Ácido: Sustancia que libera iones

hidrógeno (H+) cuando se disuelven

en agua.

Agua destilada: Agua a la que se le ha

eliminado microorganismos, sales

minerales y otros agentes extraños a

la constitución del agua.

Aminoácidos: Compuestos que

contienen por lo menos un grupo

amino y, por lo menos, un grupo

carboxilo.

Anfotérico: Capaz de dar y aceptar

protones por lo que sirve tanto de

ácido como de base

Anticuerpo: Proteína soluble producida

por los linfocitos B, que interacciona

que interacciona con el antígeno;

también se le conoce como

inmunoglobulina.

B

Base: Sustancia que libera iones

hidróxido (OH-). Cuando se

disuelven en agua

C

Catalizador: Una sustancia que acelera

una reacción química pero que no se

consume en la reacción

Células: Unidad fundamental de la

materia viva

Cristalización: Proceso por el que un

cuerpo adquiere estructura cristalina

D

Desnaturalización: Cambio estructural

de las proteínas, donde pierden su

estructura nativa, y de esta forma su

óptimo funcionamiento

E

Enlace covalente: Enlace en el que

dos átomos comparten dos

electrones

Enzima: Una proteína que tiene la

capacidad de acelerar (catalizar) una

reacción química específica

34

Esterilización: La muerte o eliminación

de todos los organismos vivos y sus

virus en un medio de crecimiento.

H

Hidrólisis: Descomposición de

sustancias orgánicas e inorgánicas

complejas en otras más sencillas por

acción del agua.

I

Inhibición: La reducción del

crecimiento microbiano debido a un

descenso en el numero de

microorganismos presentes o

alteraciones en el ambiente

microbiano.

L

Lípidos: Glicerol unido a ácidos grasos

o a otras moléculas hidrofóbicas por

enlace éster o éter. A menudo,

también contiene otros grupos, como

fosfato.

M

Macromolécula: Polímero formado por

monómeros unidos covalentemente.

Molécula: Dos o más átomos unidos

químicamente entre sí.

P

Plásmido: Molécula pequeña y circular

de DNA que es extracromosómica y

se replica de forma independiente;

se emplea frecuentemente en

ingeniería genética.

Polipéptido: Un polímero de

aminoácidos unidos entre sí por

enlaces peptídico.

Proteínas: Un polipéptido o grupo de

polipéptidos que forman una

molécula con una función biológica

especifica.

S

Síntesis: Formación de una sustancia

compuesta mediante la combinación

de elementos químicos o de

sustancias más sencillas.

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