Manual Del Laboratorio de Biotecnologia Molecular

5/24/2018 Manual Del Laboratorio de Biotecnologia Molecular

Instituto Politcnico NacionalUnidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnologa

Laboratorio de Biotecnologa Molecular

Manual elaborado por Paola Berenice Zrate Segura, Csar Agustn Jimnez Sierra, Jess Agustn Badillo Corona y ClaudioGaribay Orijel

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INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGA

DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS

ACADEMIA DE BIOTECNOLOGA

MANUAL DEL LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA MOLECULAR

ELABORADO POR:

M. en C. Paola Berenice Zrate Segura

I. Bt. Csar A. Jimnez Sierra

Dr. Jess Agustn Badillo Corona

Dr. Claudio Garibay Orijel

Dra. Mara del Carmen Oliver Salvador

Mxico D. F. Agosto 2009





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Relacin de prcticas

PRCTICA 1. Bioseguridad

PRCTICA 2. Cuantificacin de ADN

PRCTICA 3. Extraccin de ADN

PRCTICA 4. Cuantificacin de ADN en gel de agarosa

PRCTICA 5. Extraccin de ARN

PRCTICA 6. Extraccin de ADN plasmdico por lisis alcalina

PRCTICA 7. Insercin de material gentico en un plsmido bacteriano.

PRCTICA 8. Reaccin en cadena de la Polimerasa (PCR).

PRCTICA 9. Mtodo para preparar clulas competentes deEscherichia colicon CaCl2

PRCTICA 10. Transformacin de clulas competentes

PRCTICA 11. Inmunodeteccin en estado slido

PRCTICA 12. Inmuno ensayo Ligado a enzimas (ELISA)

PRCTICA 13. Transformacin gentica de plantas de tabaco (Nicotiana tabacum)utilizandoAgrobacterium tumefaciens





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PRCTICA 1. Bioseguridad

Segn la Ley de Bioseguridad de organismos genticamente modificados publicada en elDiario Oficial de la Federacin el 18 de marzo del 2005 (1), bioseguridad se define como:

Las acciones y medidas de evaluacin, monitoreo, control y prevencin que se debenasumir en la realizacin de actividades con agentes biolgicos, con el objeto de prevenir,evitar o reducir los posibles riesgos que dichas actividades pudieran ocasionar a la saludhumana o al medio ambiente y la diversidad biolgica, incluyendo los aspectos deinocuidad de dichos organismos que se destinen para uso o consumo humano.

Por otra parte, como Biotecnologa moderna se entiende:

la aplicacin de tcnicas in vitro de cidos nucleicos, incluidos el cidodesoxirribonucleico (ADN) y el cido ribonucleico (ARN) recombinante y la inyeccindirecta de cido nucleico en clulas u organelos, o la fusin de clulas ms all de la familiataxonmica, que supera las barreras fisiolgicas naturales de la reproduccin o de larecombinacin y que no son tcnicas utilizadas en la reproduccin y seleccin tradicional,que se aplican para dar origen a organismos genticamente modificados, que se determinenen las normas oficiales mexicanas que deriven de esta Ley (1)

Los principios de BIOSEGURIDAD se pueden resumir en:

A) Universalidad: Todo el personal debe seguir las precauciones estandarizadas de manera

rutinaria para prevenir la exposicin de la piel y de las membranas mucosas, en todas lassituaciones que puedan dar origen a accidentes. Estas precauciones, deben ser aplicadas pory para TODAS las personas.

B) Uso de barreras: Comprende el concepto de evitar la exposicin directa a agentesbiolgicos infecciosos o sustancias potencialmente contaminantes, mediante la utilizacinde materiales adecuados que se interpongan para evitar el contacto con estos agentes ysustancias. La utilizacin de barreras (ej. bata de laboratorio, guantes, lentes de proteccin,mascarillas, etc.) no evitan los accidentes de exposicin a estos fluidos, pero disminuyen lasconsecuencias de dicho accidente.

C) Medios de eliminacin de material contaminado: Comprende el conjunto de dispositivosy procedimientos adecuados a travs de los cuales los materiales biolgicos y qumicosutilizados en los laboratorios son depositados para su almacenamiento y posterioreliminacin sin que se presente ningn riesgo.





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Algunos aspectos importantes en Bioseguridad incluyen (2):

Contencin

El trmino contencin se utiliza para describir mtodos seguros para manejar materialesbiolgico-infecciosos en el medio ambiente del laboratorio donde son manipulados oconservados. El objetivo de la contencin es reducir o eliminar la exposicin de quienestrabajan en laboratorios u otras personas, y del medio ambiente externo a agentespotencialmente peligrosos.

La contencin primaria se refiere a la proteccin del personal y del medio ambienteinmediato del laboratorio a la exposicin a agentes infecciosos, es provista tanto mediantebuenas tcnicas microbiolgicas como a travs del uso de equipos de seguridad adecuados.

La contencin secundaria, se refiere a la proteccin del medio ambiente externo al

laboratorio a la exposicin a materiales infecciosos. Esta contencin se logra utilizando unacombinacin del diseo de la instalacin y de las prcticas operativas. Por lo tanto, los treselementos de contencin incluyen prcticas y tcnicas de laboratorio, equipos de seguridady el diseo de la instalacin. La evaluacin del riesgo del trabajo a realizar con un agenteespecfico determinar la combinacin apropiada de estos elementos.

Equipos de Seguridad (Barreras Primarias)

Los equipos de seguridad incluyen gabinetes de seguridad biolgica (BSCs), recipientescerrados, y otros controles de ingeniera destinados a eliminar o minimizar las exposicionesa materiales biolgicos peligrosos.

Un ejemplo de otra barrera primaria es la cubeta centrfuga de seguridad, un recipientecerrado destinado a prevenir la liberacin de aerosoles durante el centrifugado.

Diseo y Construccin de Instalaciones (Barreras Secundarias)

El diseo y la construccin de la instalacin contribuyen a la proteccin de quienes trabajanen el laboratorio, proporcionan una barrera para proteger a las personas que se encuentranfuera del laboratorio, y protegen a las personas o animales de la comunidad de agentesinfecciosos que pueden ser liberados accidentalmente del laboratorio.

Niveles de Bioseguridad. Existen cuatro niveles de bioseguridad (BSLs), que constan decombinaciones de prcticas y tcnicas de laboratorio, equipos de seguridad e instalacionesde laboratorio. Cada combinacin es especficamente apropiada para las operacionesllevadas a cabo, las vas de transmisin documentadas o sospechosas de los agentesinfecciosos, y la funcin o la actividad del laboratorio (tabla 1).





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Tabla 1. Niveles de bioseguridad recomendados para el trabajo con agentes infecciosos (2)

NIVELGrupo deRiesgo

Agentes PrcticasBarrera Primaria

(Equipos)Barrera Secundaria

(Instalaciones)Tipo de

Laboratorio

I

Bajo riesgoindividualBajo,

RiesgoComunitario

Que no causen

enfermedad enindividuosadultos

saludables(Cepas

silvestres)

Prcticasmicrobiolgicas

comunes

Campana deflujo laminar

Mesa de Laboratorio

con servicio de agua ydrenaje. Enseanza

Bsica

II

Moderadoriesgo

individual,Riesgo

comunitario

limitado

Asociados conenfermedad enhumanos, endonde hayariesgo de

infeccin porheridas

percutneas,ingestin y

exposicin de

membranamucosa

(Shigella,Staphylococcus,

Sporotrix)

NBS 1. AccesoLimitado. Deben

utilizarsesealamientos, se

deben tomar medidasde precaucin enmaterial punzo

cortante. Debe contarcon manual deBioseguridad

definiendo

procedimientos ypolticas de

confinamiento,desinfeccin de zonas

y materiales yatencin mdica.

Gabinetes deBioseguridadClase I o II,equipo paraprevenir

derrames odifusin de

aerosoles. Elpersonal debe

utilizar Bata,guantes y cubrebocas o careta,de ser necesario.

NBS 1. Adems, debeexistir autoclave.

Servicios desalud, Hospital

de nivelprimario,

laboratorios dediagnstico y

Laboratorios de

nivelUniversitario

III

Alto riesgoindividual,Bajo riesgocomunitario

Agentesautctonos oexticos con

riesgo detransmisin poraerosoles y que

causenenfermedadesserias o letales

(Brucilla,

Hystoplasma)

NBS 2. Accesocontrolado.

Procedimientosrutinarios de

desinfeccin de ropa,desechos y materialprevio al lavado.

Todas lasanteriores,incluyendo

proteccin delsistema

respiratorio.

NBS 2, Separacin delos corredores de

acceso, puertas dobles(sistema de exclusa).

Debe evitarse larecirculacin del aire.

Presin de airenegativa en el rea de

trabajo

Laboratorios deDiagnstico

Especializado.

IV

Alto riesgoIndividual,Alto riesgo

Comunitario

Agentespeligrosos o

exticos con altoriesgo de causar

enfermedadmortal por

transmisin poraerosoles o

agentes similarescon forma detransmisindesconocida

(EBOLA, SARS,B. Antracis)

NBS 3. Ropa (trajes)individuales,

equipados en cuartosprevios al rea de

trabajo. Regadera a lasalida del Laboratorio.

Mecanismo dedescontaminacin del

rea de trabajo.

Gabinetes deBioseguridadTipo 3. Trajesindividualessellados consistema derespiracinautnomo y

presin de airepositiva

NBS 3. Debe ser unazona aislada, con

sistemas individualesde obtencin y

liberacin de vaco,sistema de suministroy descontaminacin de

aire, generador deenerga auxiliar.

Laboratoriosque trabajan con

agentespatgenospeligrosos

NBS = Nivel de Bioseguridad





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OBJETIVO

Informar y motivar a los alumnos sobre principios y normas de bioseguridad para suaplicacin activa en el trabajo de laboratorio

ACTIVIDADES

Actividad dinmica por los alumnos para identificar los posibles riesgos en el laboratorio ylas medidas necesarias que se pueden llevar a cabo para minimizarlos.

Identificar y describir los equipoa en el laboratorio. Entender los procedimientos adecuadospara la utilizacin de estos equipos.

REFERENCIAS

1. LEY DE BIOSEGURIDAD DE ORGANISMOS GENTICAMENTEMODIFICADOSNueva Ley DOF 18-03-2005

2. http://www.cdc.gov/od/ohs/pdffiles/bmbl4_spanish.pdf





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PRCTICA 2. Cuantificacin de ADNINTRODUCCIN

En la mayora de los casos cuando se trabaja con ADN es importante realizar una

cuantificacin de la cantidad con la que se dispone. La cuantificacin del ADN se puedellevar a cabo por estimacin de la intensidad de una banda en geles de agarosa en el que elADN es teido por algn colorante como Bromuro de Etidio, Syber Green o Gel Red, obien mediante tcnicas de espectrofotometra de luz ultravioleta.

Los dobles enlaces conjugados de las bases nitrogenadas hacen que los cidosnucleicos absorban luz ultravioleta (UV). El espectro de absorcin caracterstico de ANpresenta un mximo a !~ 260 nm. Si bien el coeficiente de extincin de un cido nucleicoen particular depende de la secuencia de nucletidos, algunas reglas empricas permitenestimar la concentracin a partir del valor de A260 nm. As, una unidad de absorbancia a 260nm corresponde aproximadamente a una concentracin de 50 g/mL de ADN doble hebra,

40 g/mL de ARN o 33 g/mL de fragmentos cortos de ADN monohebra.

En las preparaciones de cidos nucleicos, son frecuentes las impurezas de naturalezaproteca. Dado que los aminocidos aromticos (Phe, Tyr, Trp) absorben luz UV, lapresencia de protenas lleva a sobrestimaciones de la concentracin de cidos nucleicos.Dado que el mximo de absorbancia de las protenas se encuentra en !~ 280 nm, es posibleestimar el grado de impurezas de origen proteico a partir del cociente A260/A280. Lapresencia de protenas en la muestra har que el cociente A260 nm/A280 sea menor que elesperado para cidos nucleicos puros. Para el ADN doble hebra en soluciones de altapureza se espera A260/A280"1.8, y para ARN, A260/A280 "2.0.

Para que la cuantificacin de cidos nucleicos sea adecuada se requiere la habilidadde medir de manera exacta y reproducible. El transferir volmenes pequeos de lquidos escrtico para obtener resultados confiables es por ello que en los laboratorios de biologamolecular para medir volmenes pequeos, se utiliza un dispositivo conocido comomicropipeta (Fig 1). Las micropipetas tienes diferentes capacidades de medida, 0.1-1 #L,0.5-10 #L, 10-100#L, 20-200 #L, 100-1000 #L, 1000-5000 #L. .

OBJETIVOS

Objetivo General

Llevar a cabo al cuantificacin de ADN por mtodos espectrofotomtricosObjetivos especficos

Conocer las partes y el funcionamiento de las micropipetas,

Adquirir destreza en la utilizacin de pipetas para la medicin de volmenespequeos.





)

Figura 1. Micropipeta. Se muestran las diferentes partes de la pipeta as como puntas dediferente tamao para la medicin de diferentes volumenes.

MATERIALES

1 juego de micropipetas P1000, P200 y P10 por equipoAgua desionizadaBalanza analtica con lmite de 0,0001 gTapas de cajas de petri de plsticoPuntas de diferentes capacidades (10, 200 y 1000 #L)Muestra de ADN en solucin de concentracin desconocida





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METODOLOGA EXPERIMENTAL

MANEJO DE LA MICROPIPETA

Importante: Para el uso adecuado de la micropipeta asegrese que est usando lamicropipeta correcta para el volumen que necesita medir. Tambin, asegrese que lamicropipeta est realmente lista para el volumen que necesita revisando la ventana devolumen. Si es necesario, cambiar el volumen mediante el dispositivo del control omando del volumen hasta que la micropipeta corrija el volumen (la micropipeta no lee sumente; varias personas usarn las pipetas, no siempre se encontrar como usted la necesita).

NO trate de colocar la micropipeta para volmenes mayores que el mximo, o para

volmenes menores del cero, esto descalibrar y daar la micropipeta.

1) Partes de la micropipetaa) Identificar las partes de la micropipeta ayudndose de la imagen en la Figura 1.b) Observar las diferencias entre la micropipeta a usar y la mostrada en al Figura

2) Llenado de la pipeta

a) Colocar una punta segn corresponda.b) Colocar el pulgar sobre el mando o mbolo de pipeteado.

c) Oprimir el mbolo hasta el primer un punto de resistencia alto o "tope". Sicontina presionando encontrar un punto donde el mbolo ya no se mueve haciaabajo, este corresponde al segundo punto de resistencia alto o "tope".

d) Oprimir el mbolo hasta el primer tope y colocar la punta dentro del lquido hastauna profundidad menor a 1 mm. De una manera lenta y controlada, disminuya lapresin del mbolo para permitir que se desplace hacia arriba. No suelte el mboloabruptamente, al permitirlo causar que el lquido pueda salpicar dentro de la puntaproduciendo volmenes inexactos y generando contaminacin de la pipeta. Una vezel mbolo se haya desplazado hasta arriba mantenga la micropipeta en el lquidodurante un segundo, esto evita que se aspire aire en la parte final.

3) Expulsin de la muestra

a) Llevar la micropipeta al tubo de polipropileno de 1.5 mL.b) Se apoya la punta en la pared inferior del tubo.c) Oprimir el mbolo hasta el primer tope y luego hasta el segundo tope. Haga este

procedimiento a una velocidad moderada, hacerlo muy rpido har que quedengotas de muestra en la punta. Si observa cuidadosamente, entonces notar que aloprimir hasta el segundo alto se expele todo el lquido de la punta.





"+

d) Lo anterior es cierto para la mayora de soluciones acuosas, excepto para lassoluciones de alta viscosidad como el Glicerol. Si es usada inadecuadamente, lamicropipeta transferir volmenes inexactos.

4) Calibracin de Micropipeta

La micropipeta puede perder su calibracin. Comprobar la calibracin de la pipeta es unprocedimiento simple que puede ahorrar tiempo considerable, energa, y reactivos. En estaprctica aprender a usar la micropipeta de tamaos diversos medir su exactitud, precisiny calibracin.Para cada micropipeta revisar el porcentaje de exactitud (E%) y el coeficiente de variacin(CV%) en todo el rango usando al menos dos volmenes diferentes; por ejemplo: Para lamicropipeta P1000 revisar los volmenes de 300 L y 1000 L. Para P200 revisar losvolmenes de 60 y 200 L. Para P10 revisar 3 y 10 L.

a) Seleccionar la micropipeta y las puntas adecuadas.b) Colocar la tapa de la caja de petri en la balanza y tarar a cero.c) Tomar el volumen de agua destilada con la micropipeta y dispnselo en la tapa de la

caja de petri. Registre el peso del agua aadido. La densidad del agua es 1 g/mL a25C, por lo tanto un volumen de 1 mL corresponde aproximadamente a una masade 1 g, 300 L a 0.3 g, 200 L a 0.2 g, 60 L a 0.06 g, 10 L a 0.01 g y 3 L a0.003 g.

d) Repita el procedimiento cinco veces para cada volumen.e) Repetir todo el procedimiento para glicerol. La densidad del glicerol es de 1,2656

g/mL a 25 C.f) Calcular la masa esperada para cada volumen

5) Clculo de la exactitud (E%) y del coeficiente de variacin (CV%)

Valor medioX = $Xi /n

donde Xi= pesadas, n= numero de pesadas

Volumen medioV=X.Z donde X= valor medio y Z= factor z (1/densidad)

Valore del control a 21,5 C (Z = 1,0032)

Exactitud E(%)= ((V-Vnominal)/Vnominal) *100

Desviacin estndarS = Z . ! $(Xi X)2

n 1





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Coeficiente de Variacin

CV= (S*100)/V

Lmites de tolerancia para micropipetas

Volumen (L) E% nominal CV% nominal

5-101 0.8

20-50 0.7 0.4100-1000 0.5 0.2

Una vez determinadas la exactitud y el coeficiente de variacin de las micropipetasproporcionadas, realice la cuantificacin de las muestras proporcionadas.

6) Cuantificacin de ADN

Preparacin de las muestras.

a) Realice diluciones 1:10, 1:100 y 1:1000 de las muestras proporcionadas portriplicado con agua Milli Q estril, en tubos de polipropileno estriles.

b)c) Encienda el espectrofotmetro al menos 15 minutos antes de iniciar las lecturas.d) Mantenga las muestras en hielo o en refrigeracin hasta ser cuantificadase) Cuantifique las muestras a 260 y 280mnf) Realice los clculos correspondientes

Muestra Dilucin Lectura260 nm

Lectura280 nm

Relacin260/280

ADN(ng/#L)

ADN(fg/#L)

ADN(mg/#L)

ADN1ADN2

REFERENCIAS

Sambrook, J. y Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3 ed. EdCold Spring Harbor Laboratories. Nueva York. USA 2001. 2344 pgs.





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PRCTICA 3. Extraccin de ADN

INTRODUCCIN

Hay diferentes tcnicas que permiten obtener cidos nucleicos con alto grado de pureza.Las ms utilizadas suelen incluir una etapa de ultracentrifugacin en gradientes de CsCl ouna cromatografa de intercambio inico. Sin embargo, muchas aplicaciones de laboratoriono necesitan un grado de pureza tal que justifique incluir estas tcnicas (laboriosas y/ocaras) en los protocolos de purificacin.

Las etapas del procedimiento que se realizan son las siguientes:

Desintegracin del tejido y solubilizacin y homogenizacin de los componentes celulares Precipitacin de los cidos nucleicos y disolucin en un buffer adecuado

Homogenizacin de la muestraEl mtodo para desintegrar el tejido debe estar adaptado a las caractersticas de ste. Paragrandes volmenes de tejidos blandos, suelen usarse licuadoras esencialmente iguales a laslicuadoras domsticas. Para volmenes menores, en general es suficiente unhomogeneizador, el cual consiste en un tubo de vidrio de paredes gruesas y un pistn (devidrio o de tefln). La rotacin del pistn dentro del tubo (propulsin manual o por unmotor), disgrega la muestra. Tejidos ms resistentes, como por ejemplo hueso o diente,necesitan tratamientos mecnicos especiales. Aquellos tejidos con clulas cuya paredcelular es resistente, como por ejemplo vegetales, hongos o bacterias, requieren tambincondiciones drsticas. Uno de los mtodos ms utilizados consiste en congelar la muestra

en nitrgeno lquido y, mantenindola congelada, pulverizarla con un mortero. As, ademsde desintegrar la muestra, se logra que sta se mantenga a muy baja temperatura durante eltratamiento, con lo cual se evita la accin de nucleasas endgenas que pudieran degradar elmaterial de inters.

Como puede deducirse de los prrafos anteriores, se han descrito diversos mtodosparticulares a cada tipo de muestra. Por ejemplo, en el caso particular de clulasbacterianas, se emplea tpicamente la enzima lisozima, que cataliza la degradacin de lapared celular. Para facilitar a la solubilizacin de los componentes celulares, y a la rupturade membranas y complejos proteicos, la solucin de lisis contendr un detergente inico(dodecil sulfato de sodio, SDS). Este detergente dispersa los componentes de las

membranas y desnaturaliza las protenas. La solucin de lisis contiene adems el agentequelante de cationes divalentes EDTA. Esto impide la accin de las ADNasas(dependientes de Mg++), aunque no tiene efectos sobre la mayor parte de las ribonucleasas

Es importante comprender que durante la homogenizacin de la muestra, as como en otrospasos siguientes de la purificacin de cidos nucleicos, las molculas de gran tamao(como por ejemplo las molculas de ADN genmico presentes en los cromosomas, cuyotamao es del orden de millones de pares de bases) es fragmentado mecnicamente en





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forma parcial, por lo que se obtienen fragmentos de tamao mucho menor (tpicamenteentre 20 y 200 kb). El grado de fragmentacin depender, obviamente, de los mtodosutilizados para la homogeneizacin y purificacin. Los mtodos ms vigorosos por logeneral permiten mayores rendimientos, al maximizar el nmero de clulas lisadas, pero

por la misma razn llevan a una mayor fragmentacin del ADN.

Extraccin de protenas y lpidosLos cidos nucleicos son muy solubles en agua debido al fuerte carcter hidroflico de susgrupos fosfato. Dentro de una mezcla de solventes no miscibles, uno acuoso y otro orgnicono polar, los cidos nucleicos tendern a permanecer en la fase acuosa, en tanto que loslpidos y gran parte de las protenas desnaturalizadas se encontrarn en la fase orgnica.En la preparacin de cidos nucleicos, los solventes que se usan ms frecuentemente para laextraccin de protenas y lpidos son el fenol y el cloroformo.

Precipitacin de cidos nucleicos

La precipitacin de los cidos nucleicos permite su purificacin y concentracin. Se basa enla simultnea neutralizacin de las cargas negativas (mediante el aadido de sales), ydeshidratacin de la molcula (mediada por el agregado de alcoholes, tpicamente etanol oisopropanol), lo cual lleva a su precipitacin. La precipitacin es un fenmeno reversible(mediante la disolucin en soluciones acuosas) y no debe ser confundido ni con ladesnaturalizacin (potencialmente reversible) ni con la degradacin (irreversible) de losmismos.

OBJETIVOS

Objetivo General

Extraer ADN de diferentes muestras por mtodos fsico-qumicos

Objetivos especficos

Conocer la metodologa bsica para la extraccin de ADN Adquirir destreza en la manipulacin de diversas muestras biolgicas para la

extraccin de ADN Determinar la integridad del ADN por electroforesis en gel de agarosa

MATERIALES Reactivos y Materiales Acetato de Sodio (3 M) Etanol absoluto Etanol 70% Fenol Cloroformo





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Agua desionizada TE (pH 8.0) 1 juego de micropipetas P1000, P200 y P10 por equipo Gradillas Medio LB lquido Termobloques Tubos de polipropileno 1.5 mL Centrifuga Vortex

Muestras biolgicas

Una alcuota de 3 mL de un cultivo lquido de E. coli incubado por 14-16 h a 37C conagitacin constante de >200 rpm.

Una muestra de suelo.


IMPORTANTE:Adems de los aspectos bsicos de bioseguridad (bata obligatoria, zapatos cerrados) sedeber usar en todo momento guantes de ltex o vinilo.

Primera Sesin. Extraccin de DNA

Extraccin de ADN deE. coli

1. Propagar un cultivo de E. colien medio LB (3 mL) durante toda la noche (14-16 h) a37C con agitacin constante de >200 rpm.

2. Colocar 1 mL del cultivo en un tubo de polipropileno de 1.5 mL.3. Centrifugar el tubo a 7000 g durante 2 min.4. Decantar el sobrenadante.5. Agregar 250 L de agua desionizada estril al paquete celular.6. Agitar vigorosamente utilizando un vortex hasta lograr la resuspensin de las clulas

(aproximadamente 30 s).7. Agregar 250 L de fenol (equilibrado con Tris 1M pH 8.0).8. Agitar vigorosamente durante 30 s utilizando un vortex.9. Agregar 250 L de cloroformo.10.Agitar vigorosamente utilizando un vortex durante 30 s.11.Centrifugar a 19000 g durante 5 min.12.Recuperar la fase acuosa (fase superior, aprox. 225 L) y colocarla en otro tubo de 1.5

mL. En muchas ocasiones en la interfase se presenta un precipitado blanco, este





"&

precipitado no debe de ser recuperado, ya que son protenas que pueden contaminar lamuestra e inhibir reacciones posteriores.

13.Agregar 225 L de cloroformo.14.Agitar vigorosamente durante 30 s utilizando un vortex.

15.Centrifugar a 19000 g durante 5 min.16.Recuperar la fase acuosa (fase superior, aprox. 200 L) y colocarla en otro tubo de 1.5

mL, teniendo las mismas precauciones que en el paso 12.17.Agregar 20 L de Acetato de Sodio (3M) a la fase acuosa.18.Agitar en vortex 20 s.19.Agregar 440 L de etanol Absoluto fro a la fase acuosa.20.Centrifugar a 19000 g durante 30 min. Es importante colocar los tubos un la misma

orientacin siempre, para saber en qu lado del tubo est el ADN precipitado. Mientrasse est llevando a cabo la centrifugacin, se debe hacer el gel de agarosa.

21.Decantar el sobrenadante a un tubo nuevo y mantenerlo en hielo durante el resto delexperimento.

22.Agregar 500 L de etanol al 70% al tubo que ha sido vaciado, evitando resuspender lapastilla.

23.Centrifugar a 19000 g durante 5 min.24.Decantar el sobrenadante a un tubo nuevo y mantenerlo en hielo durante el resto del

experimento.25.Colocar el tubo que ha sido vaciado encima de una servilleta de papel y boca abajo,

hasta que todo el etanol haya sido evaporado.26.Resuspender el ADN en 50 L de TE pH 7.8 o agua desionizada.

Guardar a -20C.

Extraccin de ADN de Suelo1. Pesar 0.1 mg de suelo en un tubo de polipropileno de 1.5 mL.2. Agregar 250 L de agua desionizada estril.3. Agitar vigorosamente utilizando un vortex hasta lograr la resuspensin de las clulas

(aproximadamente 30 s).4. Agregar 250 L de fenol (equilibrado con Tris 1M pH 8.0).5. Agitar vigorosamente durante 30 s utilizando un vortex.6. Agregar 250 L de cloroformo.7. Agitar vigorosamente utilizando un vortex durante 30 s.8. Centrifugar a 19000 G durante 5 min.9. Recuperar la fase acuosa (fase superior, aprox. 225 L) y colocarla en otro tubo de 1.5

mL. En muchas ocasiones en la interfase se presenta un precipitado blanco, esteprecipitado no debe de ser recuperado, ya que son protenas que pueden contaminar lamuestra e inhibir reacciones posteriores.

10.Agregar 225 L de cloroformo.11.Agitar vigorosamente durante 30 s utilizando un vortex.12.Centrifugar a 19000 G durante 5 min.13.Recuperar la fase acuosa (fase superior, aprox. 200 L) y colocarla en otro tubo de 1.5





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mL, teniendo las mismas precauciones que en el paso 12.14.Agregar 20 L de Acetato de Sodio (3M) a la fase acuosa.15.Agitar en vortex 20 s.16.Agregar 440 L de etanol Absoluto fro a la fase acuosa.

17.Centrifugar a 19000 g durante 30 min. Es importante colocar los tubos un la mismaorientacin siempre, para saber en qu lado del tubo est el ADN precipitado. Mientrasse est llevando a cabo la centrifugacin, se debe hacer el gel de agarosa.

18.Decantar el sobrenadante a un tubo nuevo y mantenerlo en hielo durante el resto delexperimento.

19.Agregar 500 L de etanol al 70% al tubo que ha sido vaciado.20.Centrifugar a 19000 g durante 5 min.21.Decantar el sobrenadante a un tubo nuevo y mantenerlo en hielo durante el resto del

experimento.22.Colocar el tubo que ha sido vaciado encima de una servilleta de papel y boca abajo,

hasta que todo el etanol haya sido evaporado.23.Resuspender el ADN en 50 L de TE pH 7.8 o agua desionizada.

Guardar -20C DEPENDIENDO DEL AVANCE CONTINUAR24.Realizar una electroforesis en gel de agarosa para visualizar el ADN (prctica 4).25.Cuantificar el ADN utilizando un espectrofotmetro a una longitud de onda de 260 nm.26.Cuantificar el ADN utilizando un espectrofotmetro a una longitud de onda de 260 nm.27.Realizar una electroforesis en gel de agarosa para visualizar el ADN (prctica 4).

REFERENCIAS






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PRCTICA 4. Cuantificacin de ADN en gel de agarosa

INTRODUCCIN

Una vez que se ha realizado la extraccin de ADN es necesario revisar la integridad y lacantidad del mismo, esto se efecta mediante la separacin por electroforesis en geles deagarosa o de poliacrilamida. La agarosa es ms comnmente utilizada puesto que no estxica. A los valores de pH en los cuales usualmente se trabaja con cidos nucleicos, losgrupos fosfato confieren carga neta negativa a estas molculas. En la electroforesis en gelesde agarosa, las molculas de ADN lineales migran segn su tamao y se pueden visualizarmediante tincin. Los geles son teidos con diferentes colorantes para visualizar el ADN.Los ms comunes son: el bromuro de etidio, el nitrato de plata, y recientemente el SYBERSAFE, Gel Red, Syber Green, Syber Gold, etc.

Los geles de agarosa se preparan fundiendo agarosa en presencia del buffer adecuado hastaque se logre una solucin transparente. La solucin fundida es puesta en un molde dondegelifica. El gel forma una matriz cuya densidad est determinada por la concentracin deagarosa. Cuando se aplica un campo elctrico a travs del gel, el ADN migra hacia elnodo. La velocidad de migracin est determinada por varios parmetros, algunos de loscuales son detallados a continuacin.

(a) Tamao del ADN:

Las molculas de ADN lineal de doble hebra migran a travs del gel a velocidades que soninversamente proporcionales al log del nmero de pares de bases.

Dado que la carga del ADN est dada por los grupos fosfato y que por cada par de baseshay dos grupos fosfato, la relacin carga/masa es la misma para molculas de ADN dediferente tamao. Pero, debido a la friccin que impone la malla del gel de agarosa, lasmolculas de mayor tamao sern retardadas respecto a las de menor tamao.

(b) Concentracin de la agarosa:

Un fragmento de ADN lineal migra a diferentes velocidades dentro de geles con diferentesconcentraciones de agarosa. La tabla siguiente muestra concentraciones de agarosa usadaspara resolver fragmentos de ADN en los intervalos indicados.

Concentracin del gel de agarosa(% w/v)

Intervalo de pesomolecular (kpb)

0.3 5-600.6 1-200.7 0.8-100.9 0.5-71.2 0.4-61.5 0.2-32.0 0.1-2





")

(c) Conformacin del ADN

El ADN circular cerrado de doble hebra superenrollado (forma I), el circular relajado conun corte en una de las hebras (forma II) y la forma lineal (forma III) que tengan idnticopeso molecular y misma secuencia van a migrar a distinta velocidad en los geles deagarosa. Las movilidades relativas de las tres formas dependen primariamente de laconcentracin de agarosa, pero tambin estn influidas por otros factores como la corrienteelctrica aplicada, la fuerza inica del buffer y de la cantidad del colorante presente(fundamentalmente en el caso de la forma I).

(d) Corriente aplicada

A bajo voltaje, la velocidad de migracin de los fragmentos lineales es proporcional alvoltaje aplicado. Sin embargo a medida que la fuerza del campo elctrico aumenta, la

movilidad de los fragmentos de ADN de alto peso molecular se incrementa menos. Por lotanto el intervalo efectivo de separacin en los geles de agarosa disminuye a medida que elvoltaje es incrementado.

(e) Otros factores

Otros factores que influyen (y que no se discutirn en esta INTRODUCCIN) son: ladireccin del campo elctrico, la composicin de bases de los fragmentos a analizar, latemperatura y la composicin del buffer de electroforesis.

OBJETIVOSObjetivo General

Determinar la cantidad de ADN por densitometra de las bandas en un gel deagarosa


Adquirir destreza en el corrimiento de muestras de ADN en geles de agarosa

Cuantificar el ADN en geles de agarosa por densitometra

MATERIALES

Materiales y Reactivos Solucin de Agarosa 0.5% w/v Solucin para teir ADN Regulador para electroforesis TBE 1X





"*

Regulador de carga 6x 1 juego de micropipetas P1000, P200 y P10 por equipo Agua desionizada Puntas de diferentes capacidades (10, 200 y 1000 #L) Muestras de ADN Cmara de Electroforesis Fuente de Poder Marcador de Peso Molecular (100pb)


1. Colocar 20 mL de TBE en un vaso de precipitado de 100 mL (para un volumen degel de 20 mL, si es mayor hacer los clculos conservando la proporcin de laconcentracin del gel)

2. Agregar 100 mg de agarosa

3. Calentar en parrilla de calentamiento hasta fundir completamente4. Adicionar 0.5L de reactivo para teir ADN (Rojo Texas, Syber green, etc.)5. Mezclar6. Verter la solucin en una canastilla para electroforesis7. Colocar el formador de pozos (peine) en la canastilla8. Dejar gelificar (cubrir el gel con papel aluminio)9. Colocar la canastilla adentro de la cmara de electroforesis10. Agregar buffer de corrimiento (TBE)11. Preparar las muestras a analizar (con buffer de carga, no ms de 10 L en total)12. Colocar las muestras adentro de los pozos13. Llevar a cabo la electroforesis a 100 V durante 30 a 45 min

14. Visualizar el gel en el transiluminador y cuantificar segn instrucciones.

REFERENCIAS


COMPOSICIN DE SOLUCIONES

6x Amortiguador de carga

Azul de bomofenol 0.25% (w/v)Glicerina en agua 30% (v/v)

TBEPrepare una solucin madre 5x en 1 litro de H2OTris base 54 g, cido Brico 27.5 g , EDTA 0.5 M (pH 8.0) 20 mL





#+

PRCTICA 5. Extraccin de ARN

En una tcnica sencilla de extraccin de ARN, las clulas son homogenizadas entiocianato de guanidina y posteriormente purificado por fenol-cloroformo a pH reducido. Elrendimiento del ARN total extrado depende del tipo de muestra y generalmente esta en unintervalo de 4-7 g/mL iniciando de 5-10 mg de tejido o 106clulas.

OBJETIVOS

Objetivo General

Extraer ARN de diferentes muestras por mtodos fsico-qumicos


Conocer la metodologa bsica para extraccin de ARN,

Adquirir destreza en la manipulacin de diversas muestras biolgicas para laextraccin de ARN.

Determinar la integridad del ARN por electroforesis en gel de Agarosa

MATERIALES

Cloroformo: alcohol isoamlico (49:1, v/v)

EtanolIsopropanolNitrgeno liquidoFenolAcetato de sodio(2 M, pH 4.0)Solucin D (solucin desnaturalizante)Agua desionizada1 juego de micropipetas P1000, P200 y P10 por equipoGradillasTermobloquesTubos de polipropileno 1.5 mL

CentrifugaVortex

Material biolgico

Una alcuota de 3 mL de un cultivo lquido de E. coli incubado por 14-16 h a 37C conagitacin constante de >200 rpm.Una planta de tabaco o de lechuga fresca.





#"


IMPORTANTE:

Adems de los aspectos bsicos de bioseguridad (bata obligatoria, zapatos cerrados) sedeber usar en todo momento guantes de ltex o vinilo.

Sesin 1. Preparacin de los cultivos de

1. Crecer E. colien medio LB (3 mL) durante toda la noche, incubado por 14-16 h a37C con agitacin constante de >200 rpm.

2. Asegurarse que la planta de tabaco y lechuga estn en condiciones sanas y frescas.

Sesin 2. Extraccin de ARN

Preparacin del cultivo deE. coli

1. Colocar 1 mL del cultivo en un tubo de polipropileno de 1.5 mL.2. Centrifugar el tubo a 12 000 rpm. durante 2 min.3. Decantar el sobrenadante.4. Mantener la pastilla celular en hielo

Preparacin del tejido vegetal

5. Cortar cuidadosamente 1-2 g de tejido foliar.6. Colocar el tejido en un mortero estril libre de RNAsas y adicionar nitrgeno

lquido.7. Usando el pistilo macerar el tejido hasta obtener un polvo fino.8. Transferir el macerado a un tubo nuevo estril.

Extraccin de RNA de clulas bacterianas y vegetalesEl tratamiento siguiente es el mismo tanto para las clulas bacterianas como para eltejido vegetal a menos que se indique lo contrario.

9. Adicionar 3 mL de la solucin D.10.Homogenizar 15-30 segundos a temperatura ambiente en un homogenizador para el

caso del tejido vegetal (en caso de no tener pasar el macerado en una jeringa de

1mL 3 veces). Para el caso de bacterias es suficiente con macerar con un pistilo deplstico pequeo.11.Transferir el homogenizado a un tubo nuevo y adicionar 0.1 mL de Acetato de sodio

2 M, 1 mL de fenol y 0.2 mL de cloroformo-alcohol isoamlico por cada mililitro desolucin D.

12.Mezclar con un vortex vigorosamente por 10 s e incubar en hielo por 15 min.13.Centrifugar a 9000 rpm. por 20 min a 4C.14.Transferir la fase acuosa a un tubo nuevo.





##

15.Adicionar un volumen de isopropanol e invertir el tubo 5 veces para mezclar eincubar a -20C mnimo 1 hr.

16.Centrifugar a 10,000g (9000 rpm.) por 30 min a 4C.17.Cuidadosamente decantar y disolver el ARN en 0.3 mL de la solucin D.

18.Adicionar un volumen de isopropanol e incubar 1 h a -20C.19.Centrifugar 10 min a 4C.20.Decantar y adicionar un volumen de etanol al 70%.21.Centrifugar a mxima velocidad durante 3 min.22.Adicionar 50-100 l de H2O. Almacenar la solucin de ARN a -70C.23.Estimar la concentracin de ARN midiendo la absorbancia de una dilucin 1:200 de

la muestra a 260 nm24. Separar 5 #L de la muestra de ARN por electroforesis en gel de agarosa al 1%.

Solucin D

4 M Tiocianato de guanidina25 mM citrato de sodio0.5% (w/v) Lauril sarcosianato de sodio0.1 M -mercaptoetanol

Disolver 250 g de tiocianato de guanidina en 293 mL de H2O, 17.6 mL de 0.75 M decitrato de sodio (pH 7.0), y 26.4 mL de 10% (w/v) lauril sarcocianato de sodio. En unaparrilla a 65C mezclar los ingredientes con ayuda de agitacin magntica, guardar atemperatura ambiente y adicionar 0.36 mL de 14.4 M mercaptoetanol por cada 50 mL de la

solucin D justo antes de usar.

REFERENCIAS






#$

PRCTICA 6. Extraccin de ADN plasmdico por lisis alcalina

Cuando se desea introducir un gen para expresin en bacterias, es necesario que este gen seencuentre en el vector adecuado para que se obtengan los niveles de expresin deseados. Elvector que se va a utilizar es generalmente amplificado en un cepa de E. coli a partr de lacual se purifica. La extraccin por lisis alcalina consiste en la lisis de las clulas utilizandouna solucin con NaOH y SDS. Posteriormente la separacin entre los restos celulares y elADN se logra por precipitacin mediante la adicin de una solucin de acetato de potasio.Para purificaciones ms exhaustivas se utiliza una solucin de fenol:cloroformo. Los cidosnucleicos se separan en la fase acuosa y las protenas en la fase orgnica.

OBJETIVOS

Objetivo General

Extraer ADN plasmdico deE. coli.


Conocer la metodologa bsica para extraccin de ADN plasmdico de bacterias.Determinar la integridad del ADN plasmdico por electroforesis en gel de agarosa.

MATERIALES

Soluciones

Solucin de lisis alcalina ISolucin de lisis alcalina IISolucin de lisis alcalina IIIAmpicilinaEtanolFenol: cloroformoTE (pH 8.0)

Medios de cultivo

Cajas con medio LB con ampicilina 100 #g/mLCajas con medio LB





#%


IMPORTANTE:Adems de los aspectos bsicos de bioseguridad (bata obligatoria, zapatos cerrados) se

deber usar en todo momento guantes de ltex o vinilo.

Sesin 1. Preparacin de los cultivos de

1. Crecer E. colien medio LB (3 mL) durante toda la noche, incubado por 14-16 h a37C con agitacin constante de >200 rpm.

Sesin 2. Extraccin de ADN plasmdico

Centrifugar a velocidad mxima por 30 segundos 2 mL del cultivo a temperatura ambiente.

7) Remover el sobrenadante dejando la pastilla libre del medio.8) Resuspender la pastilla en 100 L de solucin Alcalina I fra, mezclar

vigorosamente con ayuda del vortex.9) Adicionar 200 L de solucin de lisis II recin preparada, cerrar el tubo y mezclar

invirtiendo el tubo cinco veces, No usar vortex. Poner el tubo en hielo10)Adicionar 150 L de solucin alcalina III fra, cerrar el tubo e invertir el tubo cinco

veces para mezclar. Guardar el tubo en hielo 3-5 minutos (NO CONGELAR).11)Centrifugar a mxima velocidad por cinco minutos a 4C.12)Transferir el sobrenadante a un tubo limpio.13)Adicionar un volumen de fenol: cloroformo (1:1 v/v), mezclar en vortex y

centrifugar a velocidad mxima por 2 min a 4C.14)Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo.15)Precipitar el ADN plasmdico adicionando 2 volmenes de etanol absoluto, incubar

a -20C durante 20 minutos.16)Centrifugar a mxima velocidad 5 minutos a 4C.17)Remover el sobrenadante.18)Adicionar 1 mL de etanol al 70% (tener cuidado de no resuspender la pastilla),19)Centrifugar a mxima velocidad por 2 minutos a 4C.20)Remover el sobrenadante e invertir el tubo sobre una superficie limpia para permitir

que la pastilla quede lo ms seca posible.21)Resuspender la pastilla en 50 L de agua desionizada estril y guardar a -20C.

Soluciones

Solucin de lisis alcalina I

50 mM glucosa25 mM Tris-Cl (pH 8.0)10 mM EDTA (pH 8.0)Guardar a 4C





#&

Solucin de lisis alcalina II

0.2 N NaOH

1% (w/v) SDSPreparar la solucin al momento.

Solucin de lisis alcalina III

5 M acetato de potasio, 60.0 mLcido actico glacial, 11.5 mLH2O, 28.5 mlGuardar a 4C

REFERENCIAS






#'

PRCTICA 7. Insercin de material gentico en un plsmido bacteriano.

La ligacin de fragmentes de inters en plsmidos ha sido una metodologa presente en casi

todos los estudios que tienen que ver con tcnicas de Biologa Molecular. Se han utilizadodiferente sistemas que utilizan diferente vectores, entre los que se encuentran el pUC 19,pBR322, pBlueScript KS II, pTOPO, etc. Para la insercin de un gen o de un fragmento delgen en un vector, generalmente se lineariza el vector con enzimas de restriccin y al mismotiempo se digiere el gen con las misma enzimas de restriccin. Despus de la linearizacindel vector y de la restriccin del gen, ambos fragmentos se incuban con una ligasa enpresencia de ATP para que la enzima catalize la reaccin de ligacin.

Objetivo General

Realizar la insercin de material gentico dentro de un vector plasmdico.


Conocer la metodologa bsica para cortar un vector utilizando enzimas derestriccin.

Conocer la metodologa bsica para insertar material gentico de intersdentro de un plsmido previamente tratado con enzimas de restriccin.

MATERIALES

Plsmido (cuales Enzimas de restriccin Material gentico de inters. T4 ADN Ligasa Buffer de restriccin. Buffer de Ligacin. Termo-Bloque

MTODOLOGASesin 1. Reaccin de restriccin

1. En un tubo estril, adicionar 2 #l de buffer de restriccin.2. Adicionar 200-500 ng de plsmido.3. Adiciona 1 U de la enzima de restriccin.4. Adicionar suficiente cantidad de agua para alcanzar un volumen final de 20 #L





#(

5. Incubar a la temperatura indicada para la enzima durante 30 min en el termobloque.

Sesin 2. Reaccin de ligacin

6. Colocar 2 L de buffer de ligacin en un tubo estril.7. Adicionar 1 #L de T4 ADN ligasa.8. Aadir (100-300 ng) de plsmido previamente tratado con enzima de restriccin.9. Agregar (500-900 ng) del fragmento a insertar deseado.10. Adicionar suficiente cantidad de agua para alcanzar un volumen final de 20 #L11. Incubar a 22C durante 2 horas en el termobloque.12. Almacenar a -20C hasta el momento de su uso.

REFERENCIAS






#)

PRCTICA 8. Reaccin en cadena de la Polimerasa (PCR).

La Reaccin en Cadena de la polimerasa (PCR) permite obtener ms de 10 millonesde copias de una cadena de ADN de inters a partir de pocas molculas de sta. Lasensibilidad de sta tcnica requiere de cuidados para que la muestra no est contaminadapreviamente con otras cadenas de ADN que pudieran generar amplificados.

Existen numerosas tcnicas que emplean la PCR (RAPD, RFLP, RTPCR) condiferentes aplicaciones en campos de diagnstico, criminologa, e investigacin.

Objetivo General

Obtener un producto amplificado por la tcnica de Reaccin en Cadena de laPolimerasa (PCR).


Conocer la metodologa bsica para amplificar una cadena de inters por medio dela reaccin en cadena de la polimerasa.

Identificar la correcta o incorrecta insercin de una cadena de inters en un vectoren base al tamao del amplificado por medio de PCR.

MATERIALES

Termociclador. ADN molde Tubos de polipropileno de 200 #L. Oligonucletidos iniciadores (primers): sentido y anti sentido Taq DNA polimerasa Micro pipetas de diferentes capacidades (1000-100, 200-20 y 10-0.5 #L 10X PCR buffer MgCl2 dNTPs: 1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0.65 mM dTTP.

MTODOLOGA EXPERIMENTAL

1. En condiciones de esterilidad colocar dos tubos de polipropileno de 200#L decapacidad en hielo.

2. Adicionar los reactivos que se indican en la tabla 1.





#*

Tabla 1. Composicin de la Reaccin en cadena de la PolimerasaConcentracin final Muestra (#L) Control negativo(#L)

AND molde 10 pg-1 #g 1 #L* -----

Iniciador Sentido 10 #M 0.1-1 #M 2.5 #L 2.5 #L

Iniciador Antisentido10 #M 0.1-1 #M 2.5 #L 2.5 #L

Buffer PCR 10X 1X 5 #L 5 #L

25 mM MgCl2 1-4 mM 6 #L* 6 #L*

dNTPs 0.2 mM de cada uno 5 #L 5 #L

Agua MilliQ estril 27.6 #L * 28.6 #L *

Taq polimerasa (5U/ #L) 1.25 U / 50 #L 0.2 #L** 0.2 #L**

*El volumen depende de la concentracin final requerida.

** Se coloca al final en la reaccin en fro.

3. Mezclar perfectamente la reaccin por y centrifugar unos segundos en caso de sernecesario.

4. Colocar en el termociclador con el siguiente programa:a) 95C 2 minb) 95C 30s (desnaturalizacin),c) 55C 30 s (alineamiento),d) 72C 1 min (elongacin)e) Repetir los pasos b a d 30 vecesf) 72C 4 min.g) 4C (refrigerar hasta el momento de uso)5. Separar el fragmento amplificado por electroforesis en un gel de agarosa.6. Verificar que el tamao amplificado por PCR sea el esperado.

REFERENCIAS






$+

PRCTICA 9. Mtodo para preparar clulas competentes deEscherichia colicon CaCl2

Uno de las metodologas rutinarias en los laboratorios de Biologa Molecular es lapreparacin de clulas competentes. Las clulas competentes pueden ser almacenadas yusarse para la propagacin de vectores de inters. Hay varios mtodos para preparar clulascompetentes pero quiz el ms utilizado sea el que se realiza con cloruro de calcio ya quees eficiente, barato y generalemente se obtienen clulas con altos niveles de transformacin.

OBJETIVOS

Objetivo General

Aprender a preparar clulas competentes deEscherichia colicon CaCl2.


Conocer la metodologa bsica para hacer clulas competentes de Escherichia colicon CaCl2.

Determinar la viabilidad de las clulas competentes deEscherichia colicon CaCl2.

MATERIALES

- CaCl2 (0.1 M)- Espectrofotmetro- Gradillas para tubos- Hielo- Medio LB lquido- Micropipetas de 200 L y 1000 L- Puntas para micropipetas de 200 L y 1000 L- Termo-bloques- Tubos de polipropileno 1.5 mL estriles- Ultracentrfuga


1. IncubarE. coli a 37C por 16 h en placas de agar LB

2. Transferir una colonia de E. coli a 5 mL de mdio LB e incubar a 37C conagitacin a >200 rpm durante toda la noche (12-16 h).





$"

3. Transferir 0.5 mL del cultivo a 50 mL de medio LB e incubar a 37C con agitacin,hasta que la densidad ptica a 590 nm sea de 0.3 a 0.4 (aproximadamente 3-4 horas)

4. Transferir 50 mL de clulas a un tubo de propileno fro y estril y mantenerlo por

10 min a 4C.5. Centrifugar a 6000 rpm. por 10 min

6. Decantar el sobrenadante

7. Resuspender el paquete celular en 25 mL de CaCl20.1 M esteril y fro)

8. Colocar el tubo en hielo durante 10 min a 4C.

9. Centrifugar a 6000 rpm. por 10 min a 4C.

10.Decantar el sobrenadante

11.Con la ayuda de una pipeta pero con extremo cuidado, resuspender el paquetecelular en 1-2 mL de CaCl20.1 M esteril y fro.

12.Las clulas competentes pueden ser usadas inmediatamente o almacenadas por 24-48 h a 4C.

13. Para periodos de almacenamiento ms largos, guardar en alcuotas de 100 L entubos estriles de 1.5 mL.

14.Guardar la clulas competentes a -70C. Las clulas se mantienen viables poraproximadamente 3 meses.

REFERENCIAS






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PRCTICA 10. Transformacin de clulas competentes

La ligacin de fragmentos de ADN inters en plsmidos ha sido una metodologafundamental en casi todos los estudios de transformacin de organismos. Se han utilizadoeste tipo de plsmidos como el pUC 19 linearizado con enzimas de restriccin especficas,una vez hecho esto se realiza una reaccin de ligacin plsmido-inserto con la enzimaligasa.

El vector obtenido puede entonces ser introducido en una cepa bacteriana para serpropagado. Los metodos ms utilizados para la INTRODUCCIN de DNA en clulascompetentes es la electroporacin y la que involucra choque trmico. Las clulas

preparadas con cloruro de calcio son faciles de preparar y son las que se utilizanmayormente. El proceso consiste en preparar la clulas (Prctica 9) y despus incubarlascon el vector a introducir, seguido de un choque trmico. Este mtodo es eficiente ygeneralmente da rendimientos aceptables para la insercin de vectores despus de unareaccin de ligacin.

Objetivo General

Realizar la transformacin de clulas competentes con un plsmido extradopor lisis alcalina.


Conocer la metodologa bsica para transformar clulas competentes con unplsmido bacteriano

Determinar la eficiencia de transformacin de clulas competentes deEscherichia colipreparadas con CaCl2.

MATERIALES

Clulas competentes Incubadora Placas de agar LB-Ampicilina Reaccin de PCR (Prctica 8) Termo-Bloque (Prctica 7) Plsmido





$$


A. Muestra de inters

1. Adicionar 4 L de reaccin de PCR a un tubo de polipropileno.2. Adicionar 1 L del buffer de ligacin.3. Adicionar 1 L del Plsmido.4. Mezclar la reaccin suavemente.5. Incubar por 16 h a 4C.6. Adicionar todo el contenido del tubo a un tubo que contiene clulas competentes.7. Mezclar el tubo suavemente.8. Incubar a -20C durante 20 min.9. Colocar el tubo en un bao o Termo-bloque a 42C durante 1 min.10. Colocar el tubo a -20C durante 2 min.11. Adicionar 800 L de medio LB.12. Colocar el tubo en un bao o un Termo-bloque a 37C durante 1 hora.13. Agregar 200 L en una placa con medio LB Ampicilina14. Sembrar por extensin con varilla.15. Incubar la caja durante 16 h a 37C

B. Control de viabilidad y control negativo

16. Colocar 200 L de clulas competentes.17. Mezclar el tubo suavemente.18. Incubar a -20C durante 20 min.19. Colocar el tubo en un bao o Termo-bloque a 42C durante 1 min.20. Colocar el tubo a -20C durante 2 min.21. Adicionar 800 L de medio LB.22. Colocar el tubo en un bao o un Termo-bloque a 37C durante 1 hora.23. Agregar 200 L en una placa con medio LB Ampicilina y 200 L a una caja con

medio LB24. Sembrar por extensin con varilla.25. Incubar la caja durante 16 horas a 37C

REFERENCIAS






$%

PRCTICA 11. Inmunodeteccin en estado slido

El western blot es una tcnica inmuno enzimtica utilizada en biologa molecular para ladeteccin de protenas en muestras crudas o extractos celulares. Esta tcnica tiene mltiplesaplicaciones, tanto en el rea de investigacin como en la de diagnstico clnico, en dondees utilizada ya sea independiente o conjuntamente con ELISA.

La tcnica consiste en realizar la separacin de las protenas de la muestra por electroforesisen gel de poli acrilamida (PAGE) y posteriormente transferirlas a una membrana (e.initrocelulosa), ya sea por gravedad, difusin o un campo elctrico.

Una vez en la membrana, la protena es identificada mediante un inmunoensayo, en dondese liga a la protena de inters un anticuerpo especfico contra ella ligado a una enzima, lacual permite la deteccin.

OBJETIVOS

Objetivo General

Conocer y realizar la tcnica de westtern blot para deteccin de protenamediante la reaccin antgeno-anticuerpo.


Conocer la metodologa bsica para realizar electroforesis en gel depoliacrilamida.

Conocer la metodologa bsica para realizar una electrotransferencia. Conocer la metodologa bsica para detectar protenas por medio de un

inmunoensayo.


A. Tratamiento de la muestra.

1. A una muestra de concentracin conocida de protena (ya sea antgeno o anticuerpo)se le adiciona amortiguador de muestra hasta un volumen final de 85 #l.

2. Aadir 10 #l de solucin de azul de bromofenol y 5 #l de -mercaptoetanol.3. Incubar en bao mara a ebullicin durante 5 minutos.





$&

B. Preparacin del Gel.

4. Se limpia con etanol al 70% las placas de vidrio para remover contaminantes.

5. Colocar las placas de vidrio y los separadores en la base para preparar el gel.6. Preparar el gel separador de acuerdo a lo indicado en la tabla 1 del anexo, adicionando

el persulfato de amonio y el temed al final.7. Vaciar el gel separador en los vidrios evitando la formacin de burbujas, y

alcanzando un nivel 3cm por debajo del borde superior. Dejar polimerizar por 20 a30 minutos.

8. Preparar el gel concentrador de acuerdo a la tabla 2 del anexo.9. Vaciar en la parte superior y colocar el peine, evitando la formacin de burbujas.

Dejar polimerizar por 20 a 30 minutos.

C. Montaje de la cmara de electroforesis y corrimiento del gel.

10. Montar las placas de vidrio conteniendo el gel en su base, y esta en la cmara.11. Preparar amortiguador decorrida 1x.12. Llenar con amortiguador de corrida la cmara interna hasta el lmite y la externa hasta

cubrir los electrodos.13. Retirar con cuidado el peine. Cargar aproximadamente 20 #l de muestra y marcador

de peso molecular en los pozos.14. Colocar la tapa de la cmara y conectar a la fuente de poder.15. Correr a 50 V mientras las muestras se encuentren en el gel concentrador.16. Correr a 100 V una vez alcanzado el gel separador y hasta que el frente de corrida

alcance el final del gel.

17. Detener la fuente de poder, recuperar el amortiguador de corrida y desmontar lacmara.

18. Cuidadosamente recuperar el gel de los vidrios y colocar en amortiguador detransferencia.NOTA: En caso de existir un duplicado del gel, este puede ser teido para observarel corrimiento del gel antes de proseguir con la siguiente etapa.

D. Montaje de la cmara de electro transferencia y electro transferencia.

19. Incubar fibras scotch y papel whatmann (0.16 mm de espesor) en amortiguador detransferencia 30 min. antes de iniciar el montaje de los cartuchos.

20. Cortar la membrana de nitrocelulosa a un tamao ligeramente mayor al de los geles.Este procedimiento debe ser llevado a cabo con guantes. Colocar en un recipientecon amortiguador de transferencia.

21. Colocar el gel sobre la membrana de nitrocelulosa, y cuidadosamente, marcar sobre lamembrana, con lpiz, el frente decorrida y el nmero de carril del gel.

22. Para el armado de los cartuchos se colocan dos fibras scotch, dos papeles filtro, el gel,la membrana de nitrocelulosa, dos papeles filtro ms y dos fibras scotch ms. Hayque eliminar cualquier burbuja que se forme al ir adicionando las diferentes capas.





$'

23. Colocar el cartucho en la cmara de electrotransferencia de manera que el gel quedehacia el nodo (-) y la membrana hacia el ctodo (+).

24. Llenar la cmara con amortiguador de transferencia hasta el nivel indicado.25. Cerrar la cmara, conectar a la fuente de poder y transferir a 100 V por una hora,

cuidando que la temperatura del amortiguador no sobrepase los 60C.26. Al terminar la transferencia, recuperar, con guantes, la membrana del cartucho.

NOTA: En caso de tener duplicado de la membrana, teir una de ellas paraobservar la transferencia de las protenas antes de proseguir con el siguiente paso.

E. Reaccin inmunoenzimtica

27. Colocar la membrana de nitrocelulosa en un recipiente, y agregar l solucin debloqueo, de manera que cubra completamente la membrana. Incubar 2 horas atemperatura ambiente con agitacin continua.

28. Retirar la solucin de bloqueo y realizar 3 lavados con PBS-Twen de 5 min. cada uno,

con agitacin contina.29. Incubar la membrana con la solucin de protena complementaria a la que se

encuentre unida en la membrana (si se tiene antgeno en la membrana, incubar consolucin e anticuerpo, y viceversa) durante 2 horas.

30. Retirar la solucin de protenas y repetir el paso 28.31. Se adiciona a la membrana la solucin de avidina HRP (peroxidasa de rbano) y se

incuba por 2 horas con agitacin continua.32. Retirar la solucin de conjugado y repetir el paso 28.33. Se incuba la membrana en la solucin de cromgeno / sustrato en agitacin continua

hasta que aparezcan las bandas.34. Se enjuaga la membrana con agua desionizada y se deja secar.

REFERENCIAS






$(

ANEXO I

Tabla 1. Gel separador (para un volumen de 15 mL)

Sol. stock (mL) / Conc. gel (%) 5 6 7 8 9 10 12 13 15

Sol. Acrilamida bisacrilamida 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 6.0 6.5 7.5

Amortiguador pH 8.8 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75

Agua desionizada 8.75 8.25 7.75 7.25 6.75 6.25 5.25 4.75 3.75

Persulfato de amonio 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05

TEMED 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01

Tabla 2. Gel concentrador (para un volumen de 2 mL)

Sol. Acrilamida bisacrilamida 0.26 mL

Amortiguador pH 6.8 0.5 mL

Agua desionizada 1.22 mL

Persulfato de amonio 0.01 mL

TEMED 0.02

PREPARACIN DE SOLUCIONES

Acrilamida 30% - Bis-acrilamida 0.8%

Pesar 29.2 g de acrilamida (99.9% pureza) ms 0.8 g de bis-acrilamida. Disolver en aguabidestilada y aforar a 100 mL. Filtrar con papel Whatman 1. Guardar en frasco mbar a 4C. Usar guantes al pesar ya que la acrilamida es un compuesto neurotxico.





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Amortiguador del gel separador pH 8.8

Pesar 9.081 g de Tris-base, y 0.2 g de SDS, disolver en poca agua desionizada y ajustar elpH con HCl (aprox. 1 mL). Aforar a 50 mL y almacenar a temperatura ambiente.

Amortiguador del gel separador pH 6.8

Pesar 3.027 g de Tris-base y 0.2 g de SDS, disolver en poca agua desionizada y ajustar elpH con HCl (aprox. 1.5 mL). Aforar a 50 mL y almacenar a temperatura ambiente.

Amortiguador de corrida 5X / SDS

Pesar 7.55 g de Tris-base, 36 g de glicina y 2.5 g de SDS, disolver con agua desionizada yaforar a 500 mL. Al usar ajustar a 1X.

Amortiguador de muestra pH 6.8

Pesar 1.52 g de Tris-base y 2.0 g de SDS. Disolver en 40 mL de agua desionizada y ajustar

el pH a 6.8 con HCl (aprox. 2.0 mL). Adicionar 20 mL de glicerol y ajustar el volumen a100 mL.

Persulfato de amonio al 10%

Se prepara al momento de usarlo. Preparar el volumen mnimo necesario.

Solucin de azul de bromofenol 10 mg/mL

Pesar 100 mg de azul de bromofenol y disolverlo en 10 mL de agua desionizada. Guardaren refrigeracin.

Solucin teidora

Para preparar 100 mL se usan 50 mL de Metanol, 10 mL de cido actico y 40 mL de aguadesionizada y 0.05 g de azul de Coomassie. Disolver el azul de Coomassie en el metanol yadicionar el cido actico. Aforar con el agua desionizada.

Solucin desteidora

Para preparar 500 mL se usan 25 mL de cido actico, 82.5 mL de metanol y 392.5 mL deagua desionizada.

Amortiguador de transferencia

(Tris 0.025M, glicina 0.192M, pH 8.3, metanol 20% v/v). Medir 125 mL de Trizma-base 2

M y agregar 14.49 g de glicina, aadir 200 mL de metanol, aforar a 1000 mL con aguabidestilada. Guardar a 4 C. Nota: No ajustar pH oscila entre 8.1 y 8.4 dependiendo de lacalidad del tris, el metanol debe ser grado analtico, este amortiguador se puede usar hasta 3veces, despus de cada uso filtrar con papel Whatman n 1.

Solucin salina de fosfatos 0.01 M, NaCl 0.15 M, pH 7.2 (PBS)

Medir 800 mL de agua desionizada y agregar 100 mL de PB 10X y 8.75 g de NaCl.Disolver las sales y ajustar el pH. Aforar a 1 L con agua desionizada. La solucin de PB se





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prepara con 2.62 g de fosfato de sodio monobsico monohidratado y 11.5 g de fosfato desodio dibsico anhidro. Disolver en 200 mL de agua desionizada y aforar a 1 L con aguadesionizada.

Amortiguador de lavado (PBS-Tween 20, 0.05%)A un litro de PBS pH 7.2 aadir 500 #L de Tween 20.

Solucin de bloqueo.

Pesar 5 g de leche descremada en polvo y disolverlo en 100 mL de PBS-Tween 20. Guardara 20 C.

Rojo de Ponceau 0.2% en cido tricloroactico 3%

Pesar 200 mg de rojo de Ponceau y aadir 3 g de cido tricloroactico. Aforar a 100 ml conagua desionizada. Mantener a 4 C en frasco color mbar.

Solucin cromgeno / sustrato

Pesar 25 mg de 4-cloro-1-naftol, aadir 5 mL de metanol absoluto y 25 mL de PBS, agregar25 l de perxido de hidrgeno al 3%. Nota: esta solucin se prepara inmediatamente antesde usarla.





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ANEXO II

PURIFICACIN DE GAMMA GLOBULINA POR PRECIPITACIN CON SULFATODE AMONIO.

INTRODUCCIN.

Tiselius y Kabat demostraron que la actividad de anticuerpos est principalmente presenteen la fraccin gamma de las protenas del suero. Desde entonces se han diseado diferentesmtodos para la obtencin de esta fraccin srica.Los anticuerpos pueden purificarse por mtodos especficos e inespecficos. Los mtodos

especficos se basan en la propiedad que tienen los anticuerpos para reaccionar con susantgenos. As, los anticuerpos pueden ser precipitados por la adicin del antgeno enestado soluble, o ser adsorbidos al antgeno previamente insolubilizado. En ambos casos, elcomplejo resultante puede disociarse por modificacin del pH a valores entre 2.5 y 4.0 9.5 y 11.0, o bien por aumento en la concentracin de sales o la concentracin del antgenosoluble. Despus, los anticuerpos se recuperan por alguno de los mtodos de separacininespecfica.Las separaciones inespecficas estn basadas en las propiedades fisicoqumicas de losanticuerpos. Entre estos mtodos, los ms utilizados son la precipitacin con etanol, consulfato de amonio o sulfato de sodio, electroforesis en diversos soportes (papel, acetato decelulosa, gel de almidn, etc.), cromatografa de intercambio inico y filtracin en tamices

moleculares.Uno de los mtodos inespecficos ms empleados de purificacin de gamma globulina es laprecipitacin con sulfato de amonio a una concentracin final de 33%. Generalmente, seconsidera que con tres precipitaciones se obtiene una gamma globulina con un alto grado depureza.La precipitacin de la gamma globulina por este mtodo se debe al fenmeno conocidocomo salting out, el cual consiste en que las molculas de agua que solvatan a lamolcula de anticuerpo son desplazadas por los iones sulfato y amonio, que ademsneutralizan los grupos cargados de la protena, con lo que se insolubiliza y precipita.

OBJETIVO.

Purificar gamma globulinas de conejo y de humano por precipitacin con sulfato de amonioa una saturacin final del 33% y deteccin por medio de un gel de electroforesis congradiente desnaturalizante.





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MATERIALES.

Material por grupo:

1 centrfuga clnica.6 agitadores magnticos5.0 mL de BaCI2 al 10%.1 parrilla con agitacin.

Material por equipo:

10 mL de suero de conejo10 mL de suero de humano.

20 mL de solucin sobresaturada de sulfato de amonio.5.0 mL de NaOH 2N.50 mL de solucin de salina al 0.85% (SS), pH 7.8.20 mL de salina-regulador de boratos (SSRB) 0.1 M, pH 7.8.Papel indicador de pH.Tubo para dilisis.10 cm de hilo grueso.2 tubos falcn de 15 mL, graduados.2 vasos de p.p. de 100 mL2 pipetas serolgicas de 5.0 mL.1 pipeta serolgicas de 1.0 mL.

2 pipetas Pasteur y bulbo de hule.1 matraz Erlenmeyer de 25 mL.


1. Ajustar a 7.8 el pH de la solucin saturada de sulfato de amonio, con NaOH 2N.2. Adicionar a un volumen de suero, contenido en un vaso de p.p., medio volumen de lasolucin sobresaturada de sulfato de amonio, LENTAMENTE Y CON AGITACINCONSTANTE. De esta forma, el sulfato de amonio queda a una saturacin final del 33%.3. Continuar con la agitacin durante 10-15 min despus de terminar la adicin del sulfatode amonio.

4. Traspasar el contenido del vaso de p.p. a un tubo falcn y centrifugar los tubos atemperatura ambiente a 3500 rpm. durante 15 min.5. Decantar y disolver el sedimento en SS pH 7.8, hasta alcanzar el volumen original delsuero.6. Repetir los pasos 2, 3, 4 y 5.7. Repetir nuevamente los pasos 2, 3 y 4.8. Disolver en SSRB el sedimento despus de la ltima centrifugacin hasta alcanzar lamitad o un tercio del volumen original del suero.





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9. Dializar contra SSRB en fro (4 C) y con agitacin, durante 2 das, realizando 2 cambiosdiarios de solucin de dilisis hasta eliminar completamente al sulfato de amonio. Parasaber si efectivamente se elimin el sulfato de amonio, a 5.0 mL de la solucin de dilisisse le agregan unas gotas de cloruro de bario al 10%. La dilisis se considera completa si ya

no se observa la formacin de un precipitado blanco de sulfato de bario.10. Transferir la gamma globulina dializada a un tubo y centrifugar en fro a 2500 rpm.durante 10 min para eliminar el precipitado que se hubiera formado.11. Guardar las gamma globulinas para la separacin de isotipos.12. Determinar la concentracin de protenas por el mtodo de Bradford.13. Correr un gel de SDS-PAGE para observar las gamma globulinas.

REFERENCIAS.

Campbell, D.H.; Garvey, LS.; Cremer, N.E.; Sussdorf, D.H. 1970. Methods inImmunology. 2. ed. W.A. Benjamin. Editor.Kabat, E.A.; Mayer, M.M. 1968. Inmunoqumica Experimental. 1a. ed. Editorial La Prensa

Mdica Mexicana.





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PRCTICA 12. Inmuno ensayo ligado a enzimas (ELISA)

El inmunoensayo enzimtico, conocido como ELISA por sus siglas en ingls (enzymelinked immunosorbant assay) fue descrito en 1971 por Engvall y Perlman.En este mtodose utilizan anticuerpos conjugados a una enzima. El anticuerpo conserva su capacidad deunin especfica al antgeno, mientras la enzima es capaz de catalizar una reaccin deoxido-reduccin, en la cual el sustrato se transforma en un producto colorido. En estesistema el antgeno o el anticuerpo se adsorbe a una fase slida insoluble (micro pozos,tubos o perlas de polivinilo o estireno). El mtodo de ELISA tiene aplicaciones muyvariadas, lo cual lo hace muy verstil: diagnstico de enfermedades infecciosas, virales oparasitarias, cuantificacin de hormonas, cuantificacin de haptenos, titulacin deanticuerpos en bajas concentraciones, determinacin de anticuerpos no precipitantes

Existen diversas variantes del mtodo de ELISA, como son los mtodos directo, indirecto yen sndwich, y el mtodo de ELISA competitivo. Estos permiten la determinacin deantgenos en fluidos biolgicos, a excepcin del mtodo indirecto con que se detectananticuerpos.

En los mtodos directos, el anticuerpo dirigido especficamente contra el antgeno es el quelleva unida la enzima. En cambio en los mtodos indirectos, el conjugado enzima-anticuerpo reacciona con el primer anticuerpo, el cual ya reaccion con el antgeno. En elmtodo de sndwich, el conjugado antgeno anticuerpo reacciona con el antgeno que se haunido antes a un primer anticuerpo, adsorbido a la fase slida. El o los componentes que no

reaccionaron se eliminaron por lavados; por ltimo se adiciona el sustrato de la enzima y semide la intensidad del color desarrollado, el cual es proporcional a la magnitud de lareaccin antgeno-anticuerpo.

OBJETIVOS

Objetivo General

El alumno conocer y realizar la tcnica de ELISA para deteccin de antgeno oanticuerpo.


Conocer la metodologa bsica para adsorber antgenos en micro placas de ELISA.Ligar antgenos o anti anticuerpos conjugados a antgenos adsorbidos en placas de

ELISA.Determinar la presencia del antgeno deseado por la reaccin de una enzima

conjugada a anticuerpo.





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MATERIALES

Estufa regulada a 37 C.Placas de ELISA de poliestireno (fase slida)Antgeno H u O, solucin al 5% en solucin salina 0.85%.Pipetas automticas de 20-200 mlAnticuerpo anti-IgG purificado y conjugado con HRPSuero humano control positivo y suero humano control negativoSustrato: 4 mg de orto-fenilen diamina, 4 ml de H2O2al 30% (v/v) en 10 ml de regulador decitratos 0. XM pH 5.0Regulador de bloqueo: 0.25 % de gelatina 2% de albmina srica bovina (BSA), enregulador de fosfato borato sal (PBS) 0.1M pH 9.6Regulador de lavado: regulador de salina-fosfatos 0.01M pH 7.2 adicionado de 0.05%

Tween 20.Diluyente del suero (PBSG): regulador de salina-fosfatos 0.01M, pH 7.2 adicionado de0.25% de gelatina.


Mtodo de ELISA indirecto.

1. Adicionar 0.2 mL de antgeno en los pozos de poliestireno. Incubar la placa a 4Cdurante 24 horas para permitir la adsorcin del antgeno a la fase slida.

2. Eliminar las soluciones por inversin de la tira de pozos, y desechar el lquido

remanente sacudiendo fuertemente la tira sobre papel absorbente.3. Lavar los pozos con 0.1 mL de solucin de lavado. Dejar los pozos llenos con esta

solucin durante 3 minutos. Al cabo de este tiempo, eliminar la solucin de la maneradescrita en el paso 2. Repetir dos veces ms con el fin de eliminar todo el antgeno noadsorbido.

4. Bloquear con 0.1 mL de una solucin de 0.25% de BSA en PBS e incubar los pozos a37C durante 30 min para permitir el bloqueo de los sitios a los que no se adsorbi elantgeno.

5. Repetir el paso 2.6. Adicionar 0.1mL de los sueros control negativo, positivo y problema uno en cada pozo.

Si lo requiere puede hacer diluciones del suero. Incubar a 37C durante 30 minutos para

permitir la reaccin antgeno-anticuerpo.7. Repetir los pasos 2 y 3 para eliminar el exceso de suero que no reaccion.8. Adicionar 0.1mL de conjugado diluido en PBSG, a todos los pozos. Incubar a 37C

durante 30 min. Para permitir que el conjugado reaccione con los anticuerpos humanosque se hayan unido al antgeno en la fase slida.

9. Repetir los pasos 2 y 3 para eliminar el exceso de conjugado que no haya reaccionado.10.Adicionar 0.1 mL de una solucin recin preparada del sustrato de la enzima: H2O2al

0.04% en regulador de salina-fosfatos pH 5.0 y adicionado de ortofenilendiamina al





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0.04% (como cromgeno). Incubar en oscuridad para permitir la reaccin enzimtica yel consecuente desarrollo de color (Nota: el cromgeno es fotosensible)

11.Detener la reaccin enzimtica adicionando 12 mL de H2SO48N en cada pozo.12.Determinar la presencia o ausencia del antgeno de inters contra los controles de

manera visual, o de contarse, con un lector de placas de ELISA.

REFERENCIAS

1. Avrameas S. (1971) Immunochemistry 6:432. Kemeny D. M. (1991) A practical Guide to ELISA. Pergamon Press. Oxford. Pp 21-

215.3. Voller A., Bidwell D.E. y Bartlett A. (1979) The enzyme linked immunosorbet assay

(ELISA). A guide with abstracts of microplate application. Dynatech Laboratories, Inc.

4. Profesores del Departamento de Inmunologa (1992) Manual de Prcticas deInmunologa. ENCB, IPN pp.47-51.





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Prctica 13. Transformacin gentica de plantas de tabaco (Nicotiana tabacum) utilizandoAgrobacterium tumefaciens

INTRODUCCION

La modificacin gentica de plantas tiene varios objetivos, entre los que se encuentran: lageneracin de especies resistentes a condiciones de estrs (sequa, estrs osmtico, etc), lamejora nutricional de la especies (aumento en el contenido de aminocidos o precursores devitaminas, etc), obtencin de plantas para fitoremediacin (remocin de metales pesados),la obtencin de variedades con flores de color no convencional, la produccin de algunaprotena o metabolito con propiedades teraputicas (vacunas, anticuerpos, alcaloides, etc).Esta ltima es de gran inters para los Ingenieros Biotecnlogos ya que la produccin demetabolitos y protenas en plantas presenta varias ventajas en comparacin con el resto delos sistemas de produccin. Algunas de estas ventajas son: el costo de produccin es en

muchos casos menor, hay una mayor facilidad de escalamiento, protenas ms complejas(anticuerpos, protenas con varios enlaces disulfuro, protena que requieren unprocesamiento postraduccional, etc) pueden ser producidas. Adicionalmente, las semillas ygranos pueden ser utilizados como sitio de almacenamiento.La modificacin gentica de plantas puede llevarse a cabo utilizando diferentes mtodo

Manual Del Laboratorio de Biotecnologia Molecular

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