Departamento de Ciencia y Tecnología

http://mgl.scripps.edu/people/goodsell/

Laboratorio de Farmacología Computacional

Diseño Racional de fármacos

Screening Virtual de pequeñas moléculas

Juan Manuel Marengojmarengo@anlis.gov.ar

Servicio de Virosis Congénitas, Perinatales y de Transmisión SexualANLIS-INEI-”Dr Carlos G.Malbran”

Departamento de Virología

¿Cual es el camino habitual en el descubrimiento/desarrollo de un nuevo fármaco?

-Serendipia-Busqueda por screening in vitro (High-throughput screening)-Busqueda screening in silico (Virtual Library Screening)

High-throughput screening(Tamizado de alto rendimiento)

3000 molec./semana Se deben probar todas las moléculas

Virtual Library Screening VLS

Técnica in-silico Técnica de simulación y cómputo mediante software

Evalúa interacción entre una macromolécula diana y una enorme biblioteca de moléculas orgánicas.

Requiere

- Contar con estructura 3D de la macromolécula diana.- Definir la zona específica de interacción.

Ventajas

- Reduce tiempo y costo en el descubrimiento de nuevas drogas

Diseño Racional por Virtual Library Screening (VLS)

Búsqueda y diseño de pequeñas moléculas (Compuestos orgánicos de bajo peso molecular (< 900 daltons - Regla de cinco de Lipinsk)

Actividad buscada

- Interferir el reconocimiento/unión entre macromoléculas: - Modulador una cascada de señalización

Sitios de interés

- Sitios activos- Sitios de regulación alostérica- Sitios de oligomerización- Sitios de unión proteína-proteína - Sitios de union proteinas-DNA/RNA

1.3 M = 1*106 = 1.300.000

molec./semana -Se seleccionan las de mejor

score.-Disponible al investigador

3000molec./semana

-Se deben probar todas las moleculas

-Dificil acceso al investigador

Virtual Library Screening

Reducir tiempo y costo en el descubrimiento de nuevas drogas

High-throughput screening

Biblioteca de drogas-PubChem - CCD - ZINC-NCI -ACD - chEBI -Drug Bank

Bibliotecas estructurales-Protein Data Bank (PDB)-Uniprot

Screening VirtualCompuestos obtenidos

1.3 Mmolec./semana

Filtros

-ADME/tox Models-Absorcion intestinal

-Unión a proteinas de suero-Solubilidad

-Barrera hemato/encefálica

Diagrama de trabajo

Objetivo de la estrategia racional de fármacos

Interrumpir/modular reconocimiento/interacción de dos macromoléculas con el fin de modular su función natural

- Proteína-Proteína (Receptores, Sitios de oligomerización, Transportadores, Proteasas, Canales iónicos)

- Proteína-Ácido Nucleico (Polimerasas, helicasas, Fact ribosomales, RT, Integrasas, Factores de transcripción)

http://pdb101.rcsb.org/motm/92

Estrategia racional para antivirales

ObjetivoBloquear/modular alguna de las vías naturales

de infección

Estrategia racional para antivirales

Objetivo

- Interrumpir un mecanismo /valor terapéutico- Conocer un mecanismo biológico

Interactoma

Desde 1963, se han aprobado 90 drogas, en 9 enfermedades infecciosas virales

HIV, HBV, HCV, HSV, CMV, VZV,, HPV, FLU

Antivirales

Antivirales/ Herpes

Ejemplo 1- Inhibidor de la proteína PB2 de Influenza

FLU: 3.000.000-5.000.000 casos anuales (250.000 y 500000 muertes)

Blanco antivirales en FLU: HA, N1, M2, NS1, Polimerasa (PA, PB1, PB2)PB2: Dominio CDB, muy conocido en estructura y función. Su inhibición suprime el crecimiento y la transcripción de proteínas virales

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0166354216305848

Determinacion de sitio de interes dentro de la macromolecula:- DoGSiteScorer (http://dogsite.zbh.uni-hamburg.de/)- LIGSITEcsc (http://projects.biotec.tu-dresden.de/pocket/)

Ligandos- SPECS library

(21,351 molecules - http://zinc.docking.org/catalogs/specs/)

Ejemplo 1- Inhibidor de la proteína PB2

Metodo- VLS- Clonación de PB2 en plásmido de expresión- Dicroismo Circular (ver conformación adecuada)- Ensayo de resonancia en placa (interacción PB2 y la droga)- Ensayo de citotoxicidad en células MDCK- Ensayo de reconstitución de RNP (PB1-PB2-PA-NP-NSLuci-GFP):Inhibicion de RNP. EC50)- Ensayo de reducción de placa (EC50)

Ejemplo 1- Inhibidor de la proteína PB2 de Influenza

Ejemplo 2 Inhibidor de EBNA1 de EBV

EBNA1-641aa-Rol esencial en latencia de EBV e inmortalización de linfocitos B.-Dimero estable que se une a DNA (C-terminal 459-607) Dos sitios de interacción a DNA

Cristalografia recien disponible

J Comput Aided Mol Des (2016) 30:285–303

J Comput Aided Mol Des (2016) 30:285–303

- Determinacion de posibles sitios drogables: - Analisis de 2381 compuestos probados

previamente para inhibir union EBNA1-DNA- Encontraron que el compuesto 1452563 se une al sitio primario

Ejemplo 2 Inhibidor de EBNA1 de EBV

Ejemplo 3: Inhibidor de Glicoproteina de HCV

-NS3/4A protease inhibitors-NS5A protein inhibitors-NS5B polymerase in-hibitors nucleoside/nucleotide type-NS5B polymerase inhibitors of the nonnucleoside type

Receptor: CD-81 (prot de transmembrana)Interacciona con la glicoproteina E2

http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0111333

- Screening de 1715 moleculas- Se probaron experimentalmente 34- Uno de ellos bloqueo la infeccion

en celulas Huh-7

Ejemplo 3: Inhibidor de receptor de Glicoproteina E2 de HCV

Ejemplo 4 : Inhibidor del receptor de VP1 de JC

En Inmunosuprimidos:

Leucoencefalopatia multifocal progresivaTropismo: Astrocitos-OligodendrocitosMuerte en 6-16 meses

http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/psc.2731/abstract;jsessionid=152B77995636F4F70C0D9F583487647F.f02t03

Ejemplo 4 : Inhibidor del receptor de VP1 de JC

Método:- VLS- Expresion de VP1- Union VP1-Droga (Hipotesis 1)- Ensayo NMR- Ensayo de infección viral (Hipótesis 2)

http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/psc.2731/abstract;jsessionid=152B77995636F4F70C0D9F583487647F.f02t03

Ejemplo 5 : Inhibidor de la proteasa NS2B-NS3 de ZIKV

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0166354217301754

Métodos:-VLS- 8227 compuestos (DrugBank-Drug repurposing programmes)- Expresión proteasa recombinante: Inhibición proteasa- Ensayo de infección viral- Reducción en placa

Drug repurposing programmes: Drogas ya probadas en humanos por otros estudios pero abandonadas por falta de efectividad en su propuesta inicial

Ejemplo 6 : Inhibidor NS5 de Dengue

Ejemplo 7: Inhibidor de Interleukina 18

Ejemplo 8: Inhibidor TLR

Ejemplo 9: Inhibidor IdeR de Mycobacterium Tuberculosis

IdeRProt regulatoria de Fe++ intracelularKnockout del gen ideR da un fenotipo atenuado

Estrategia inhibidores de proteínas huésped

PML nuclear bodies: Regulan inmunidad innata durante la infección viral. Defensa contra una variedad de virus DNA y RNA.

PRR: Pattern Recognition Receptors (TLRs, RIGs): Respuesta inmune innata

NPC: Nuclear pore complex

Canales iónicos

Microtúbulos y actina

CRM: Chromosomal Region Maintenance (exportacion de rRNA, snRNa, mRNA)

Links de interes

Protein Data Bankhttps://www.rcsb.org/pdb/home/home.dohttp://www.uniprot.org/

Bibliotecas de drogas-Bioinformáticahttps://www.click2drug.org/index.html

Biología de los virushttp://viralzone.expasy.org/

Interactoma Huesped-Virushttp://virhostnet.prabi.fr/

Bioinformáticahttps://www.expasy.org/

Ilustracioneshttps://pdb101.rcsb.org

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Laboratorio de Farmacología Computacional

Diseño Racional de fármacos

Screening Virtual de pequeñas moléculas

Juan Manuel Marengojmarengo@anlis.gov.ar

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