Regional Distrito CapitalSistema de Gestión de la Calidad

Informe de Laboratorio No 03ENSAYOS DE ECOTOXICIDAD CON SEMILLAS DE LECHUGA LACTUCA

SATIVA L EMPRESA CUART’S LTDA.

AprendicesGINA LIZZETH MORENO CORDERO

ELIANA MILENA SANCHEZ JUISAMAYRA ALEJANDRA SOTO TABIMBA

InstructorSONIA MARCELA BUITRAGO MORALES

Centro de Gestión Industrial

Marzo 2015

MARCO TEORICO

Introducción.........................................................................................................2Objetivos.............................................................................................................3Objetivo General................................................................................................3Objetivos Específicos.......................................................................................3Procedimiento.....................................................................................................43.1 Preparación de la solución ácido bórico al 2,5% p/v...............................43.2.2 Calculos....................................................................................................7Solucio acido borico al 2.5 % p/v.....................................................................83.3 Lectura de resultados.................................................................................84. Resultados......................................................................................................94.1.2 control negativo.......................................................................................94.1.2 control positivo........................................................................................94.1.3 Dilución 0.3%..........................................................................................104.1. dilución 10 %............................................................................................114.1.3 Dilución 30%...........................................................................................125. Análisis de resultados...................................................................................13Conclusiones.....................................................................................................13Anexos..............................................................................................................14Anexo A “Análisis Fisicoquímico de agua residual industria curtiembres”14Bibliografía........................................................................................................15

Introducción

Se tomó una muestra de agua en el proceso de pelambre de la empresa Cuart’s

Ltda. Para realizar un bioensayo de ecotoxicidad con semillas de lechuga

Lactuca sativa L, a fin de determinar el grado de afectación que puede producir

los vertimientos de la organización sobre una especie vegetal en su entorno

natural.

La lechuga Lactuca sativa L es una es una planta herbácea propia de las

regiones semitempladas que se cultiva con fines alimenticios, tiene unas

condiciones óptimas de crecimiento, a una temperatura entre -6°C y 30°C, pH

entre 6 - 7, humedad del 60 - 80%. Se utilizan semillas de lechuga para el

montaje del ensayo debido a que en el período de germinación y los primeros

días de desarrollo de la plántula ocurren numerosos procesos fisiológicos en los

que la presencia de una sustancia tóxica puede interferir alterando la

supervivencia y el desarrollo normal de la planta, lo cual facilita medir los efectos

morfológicos sobre el crecimiento e inhibición de la misma. (Feliz Perez Garcia-

Universidad politecnica de madrid)

Los bioensayos de eco toxicidad se realizan con la finalidad de conocer los

efectos tóxicos de sustancias químicas puras o complejas, sobre organismos

vivos, y las concentraciones a las cuales se pueden ver una mortalidad del 50%

de una población. (Maria Cecilia Sombrero y Alicia Ronco, 2008)

Objetivos

Objetivo General

Realizar un bioensayo de ecotoxicidad en la muestra de agua de la empresa

Cuart’s Ltda. con semillas de lechuga Lactuca sativa L, para determinar grado

de toxicidad de los vertimientos de la organización.

Objetivos Específicos

Realizar la metodología y procedimientos para la siembra de las semillas

en las cajas Petri, con las diferentes concentraciones de la muestra.

Realizar el conteo de las semillas germinadas y la caracterización de los

efectos citotóxicos, a fin de determinar el grado de toxicidad de la muestra.

Determinar la concentración efectiva 50 en la muestra.

Procedimiento

A continuación se presentan mediante diagramas de flujo los pasos a seguir para

llevar a cabo el montaje del bioensayo de eco toxicidad, además del control

positivo y negativo.

3.1 Preparación de la solución ácido bórico al 2,5% p/v

Se prepara la para el control positivo, donde la inhibición de las semillas debe

ser de un 99 a 100%.

Fuente: autores

3.2 Preparación de la muestras a evaluar

Se realizan diluciones de la muestra, para poder determinar a qué

concentraciones es afectada la población, y a cual se da la inhibición de un 50 %

de los organismos.

Fuente: autores

3.2.1 Montaje de la prueba

En el montaje de la prueba se realizó un control positivo con ácido bórico, para

tener una inhibición de la germinación, y un control negativo con solo agua

destilada para el crecimiento normal de la población una inhibición total

Fuente: autores

3.2.2 Cálculos

Preparación de solución ácido bórico para el control negativo.

Solucion acido borico al 2.5 % p/v

Cantidad: 50 ml solución

2.5 g x 50 ml: 1.25 g ácido bórico a pesar.

100 ml

Preparacion diluciones de la muestra

Preparación de solución ácido bórico para el control negativo.

Solucion acido borico al 2.5 % p/v

Cantidad: 50 ml solución

2.5 g x 50 ml: 1.25 g ácido bórico a pesar.

100 ml

Preparacion diluciones de la muestra

Prepara 5 diluciones de 10 ml cada una

Se realizaron concentraciones de 100, 30, 10, 3 y 1 % v/v respectivamente.

Para realizar los calculos se multiplaca el volumen de la dilucion (10ml) por el

porcentanje (100,30,10,1%) dividido en cien, dando como resultado la cantidad

de muestra a pipetear en cada tubo de ensayo, posteriormente aforar con agua

destilada.

10x 100/ 100= 10 ml

10x30/100= 3 ml

10x10/100=1 ml

10x3/100=0.3 ml

10x1/100=0.1 ml

Porcentajes de germinación

A continuación se muestran los cálculos de las diluciones de referencia los

cuales serán control negativo y control positivo

Control Negativo: (control de referencia)

Promedio de semillas germinadas.

Control negativo

% de germinación 59

3

X 100 = 19.6 %

Control positivo

Porcentaje de inhibición

Se determina el porcentaje de inhibición a partir de la siguiente fórmula:

% de inhibición = % de germinación de control (+) - % de germinación de la

dilución 30%

Porcentaje de germinación

A partir de los datos obtenidos se determina de la siguiente manera:

% de germinación = = 0

Dilución 0.1%

X 100

Dilución 0.1 %

% de germinación 33

3

X 100 = 11%

Dilución 0.1% sobre muestra de referencia

% de germinación 11

19.6

X 100 = 56.1%

Dilución 0.1%

% de inhibición 100- 56.1 X100 = 43.9%

Dilución 0.3%

X 100

Dilución 0.3%

% de germinación 59

3

X100 =19.6%

Dilución 0.3 %

% de inhibición No se obtiene ya que él % de germinación es

de 100%

Dilución 10 %

X 100

Dilución 10%

% de germinación 57

3

X 100 = 19.0%

Dilución 10% sobre muestra de referencia

% de germinación 19

19.6

X 100 = 97%

Dilución 0.3 % sobre muestra de referencia

% de

germinación

19.6

19.6

X100 = 100%

Dilución 10%

% de inhibición 100- 97 X100 = 3%

Dilución 30%

Dilución 30%

% de germinación 50

3

X100 =16,6

Dilución 30% sobre muestra de referencia

% de germinación 16,6

19,6

X 100 = 84.6

Dilución 30%

% de inhibición 100 – 84.6 X100 = 16.4

Dilución 100

X 100

Dilución 100%

% de germinación 1

3

X 100 = 0.33%

Dilución 100% sobre muestra e referencia

% de germinación 0.33

19.6

X100 = 1.70%

Dilución 100%

% de inhibición 100- 1.70 X100 = 98.3

3.3 Lectura de resultados

Pasado el tiempo de exposición de la semilla con la muestra, se procede a

cuantificar los efectos sobre la plántula, (cambios en el crecimiento normal del

hipocotilo y radícula, daños morfológicos o inhibición).

Fuente: autores

4. Resultados

Terminado el tiempo de exposición se procedió a cuantificar los efectos sobre

las plántulas, a continuación se presentan los resultados obtenidos

4.1.2 Control negativo

Se realizó el montaje en tres cajas Petri de solo agua destilada, y se colocaron

20 semillas por caja.

Porcentaje de germinación

Control

negativo

Número de semillas

germinadas

Replica 1 20

Replica 2 20

Replica 3 19

Total 59

Crecimiento y elongación de la radícula e hipocotilo (promedio de las dos

plántulas más grandes por replica)

4.1.2 Control positivo

Se realizó el montaje de tres cajas Petri con ácido bórico y se colocaron 20

semillas por caja.

Porcentaje de germinación.

Control positivo Número de semillas

germinadas

Número de

semillas no

germinadas

Replica 1 0 20

Replica 2 0 20

Replica 3 0 20

Total 0 60

4.1.2. Dilución 0.1%

Porcentaje de germinación

Dilución

0.1 %

Número de

semillas

germinadas

Número de

semillas no

germinadas

Replica 1 13 7

Caja Hipocótilo 1 Radícula 1

Replica 1 3,5 cm 7 cm

Replica 2 2,5 cm 5 cm

Replica 3 2,5 cm 3,2 cm

Replica 2 20 0

Replica 3 0 20

Total 33 27

Crecimiento y elongación de la radícula e hipocotilo

Replica Radícula Hipocotilo

1 7 cm 3,5 cm

2 0 cm 0 cm

3 5 cm 3 cm

4.1.3 Dilución 0.3%

Porcentaje de germinación.

Dilución

0.3%

Número de

semillas

germinadas

Número de

semillas no

germinadas

Replica 1 19 1

Replica 2 20 0

Replica 3 20 0

Total 59 1

Crecimiento y elongación de la radícula e hipocotilo

Replica Radícula Hipocotilo

1 4.4 cm 4 cm

2 3.5 cm 3 cm

3 5.5 cm 4 cm

4.1. Dilución 10 %

Porcentaje de germinación.

Dilución 10% Número de

semillas

germinadas

Número de

semillas no

germinadas

Replica 1 19 1

Replica 2 19 1

Replica 3 19 1

Total 57 3

Crecimiento y elongación de la radícula e hipocotilo

4.1.3 Dilución 30%

Porcentaje germinación

Dilución 30% Número de

semillas

germinadas

Número de

semillas no

germinadas

Replica 1 18 2

Replica 2 15 5

Caja Radícula 1 Hipocótilo 1

Replica 1 2.5 2.5

Replica 2 5 3

Replica 3 6 2.5

Replica 3 17 3

Total 50 8

Además se toma en cuenta el porcentaje de germinación del control negativo

que en este caso fue de 59 semillas germinadas

.

Dilución 30% Hipocolito 1 Radícula 1

Replica 1 5 cm 1,5 cm

Replica 2 4,5 cm 1,5 cm

Replica 3 5 cm 1,5 cm

Dilución 100%

En esta dilución la cual es la más concentrada hubo un % de germinación del 0%

y % de inhibición del 100%

Dilución Número de

semillas

germinadas

Número de

semillas no

germinadas

Replica 1 1 19

Replica 2 0 20

Replica 3 0 20

Tabla de resultados

Concentración

de la muestra

Calculo

1

Calculo 2 Resultado

semillas

germinadas

Resultado

semillas no

germinadas

100% 1/3 0,33%/19,6*100 1,70 98,3

30% 50/3 16,67%/19,6%100 85,03 14,47

10% 57/3 19%/19,6%100 97 3

0,30% 59/3 19,6%/19,6%100 100  0

0,10% 33/3 11%/19,6100 56,12 43,88

Descripción cambios morfológicos

Dentro de las características encontradas se observó un color marrón en las

semillas germinadas, enrollamiento del hipocolito en algunos casos,

engrosamiento de la radícula, por otra parte se pudo observar que habían

algunas que tenían radículas y cotiledones demasiado secos que presentaban

rompimiento, en otros casos se presentaron radículas e hipocolitos muy cortos.

5. Análisis de resultados

El control negativo es usado como punto de referencia para el crecimiento

adecuado de las semillas, según el protocolo para ensayos de toxicidad con

lechuga Lactuca Sativa L, el porcentaje de germinación debe ser superior al

95%. (Patricia Ramirez Romero - Ania Mendoza Cantú, 2008). En el ensayo

realizado se obtuvo un porcentaje de germinación del 98.33%, esto es debido a

que las semillas, estuvieron en su medio óptimo de crecimiento como lo es el

sustrato húmedo, temperatura, disponibilidad de oxígeno y oscuridad para el

crecimiento de la raíz. (Casanova, 2013)

En el control positivo se obtuvo una inhibición del 100% las semillas, estas

presentan mayor sensibilidad en su etapa de germinación, donde empiezan los

procesos metabólicos para su transformación en plántula, en esta etapa se da

la absorción de nutrientes y agua. Cuando están en una solución de ácido bórico

este inhibe su crecimiento debido a que es un compuesto químico, ligeramente

ácido que es usado como antiséptico. Los antisépticos son sustancias

antimicrobianas, que inhiben el desarrollo de microorganismos por medio de

desnaturalización de proteínas (es un cambio estructural de las proteínas o

ácidos nucleicos, donde pierden su estructura nativa, y de esta forma su óptimo

funcionamiento), rotura de membrana celular, eliminación de grupos sulfhídricos

y oxidación. Lo que indica que las semillas son un buen indicador de toxicidad en

una muestra. (Maria Cecilia Sombrero y Alicia Ronco)

En la concentración del 1% de la muestra se obtuvo un resultado del 56.12% de

semillas germinadas, esto es debido a que el medio es extremo para el

crecimiento de la plántula, ya que las condiciones de disponibilidad de oxígeno,

pH, y contenido de químicos tóxicos (Ver anexo A) que presenta la misma,

afectan los procesos de metabolización de la plántula, por absorción y

acumulación de sustancias toxicas (UNIVERSIDAD POLITECNICA DE

VALENCIA, 2003).

En la réplica número dos de la dilución del 1% se presentó contaminación

cruzada, la cual se evidencio en el crecimiento de hongos y la inhibición total de

las semillas, por lo tanto para conservar la integridad y veracidad de los

resultados no se toma en cuenta para la concentración efectiva 50.

(Autores, 2015)

En la concentración de 3% de la muestra, se presentó un crecimiento del 100%

de las semillas, lo que indica que el contenido de contaminante por cada ml no

es lo suficientemente alto como para afectar el desarrollo normal de la

germinación.

En la concentración de 10% de la muestra, se presentó un crecimiento del 97%

de las semillas, lo que indica que el contenido del contaminante no afecta el

crecimiento normal de la plántula. (Maria Cecilia Sombrero y Alicia Ronco).

En la concentración de 30% de la muestra, se presentó un crecimiento del 85%

de las semillas, lo que indica que a pesar de la toxicidad presente se necesitan

mayores concentraciones para lograr alterar de forma significativa las

condiciones óptimas de crecimiento de la población vegetal. Para una

concentración efectiva 50, se deben sobre pasar una concentración del 50% de

la muestra.

En la concentración 100% de la muestra, se presentó una inhibición del 98.33

de las semillas, esta es la concentración efectiva 50, ya que logra inhibir a más

del 50% de la población, lo que indica que el agua tiene un alto grado de

toxicidad para el desarrollo de una población vegetal. (Maria Cecilia Sombrero y

Alicia Ronco)

Conclusiones

Se realizó el bioensayo con semillas de lechuga lactuca sativa L, donde se

determinó la toxicidad de los vertimientos generados por la organización y se

encontró una concentración efectiva 50 en la concentración del 100% de la

muestra, esto nos indica que se deben tratar los vertimientos de la organización

antes de ser dispuestos a fin de reducir o eliminar las concentraciones de los

contaminantes debido a que estos vertimientos pueden degradar de manera

significativa un ecosistema.

Anexos

Anexo A “Análisis Fisicoquímico de agua residual industria curtiembres”

Parámetro Método Resultado Límites

permisibles

PH 4500 H 9.5 4.5-9

Conductividad 2510 10 siemens

OD 4500-O 4.03 ppm

SAAM 5540-C 0.44 mg/l 10 mg/l

Cr (V) 3500-Cr 155 mg/l 0.1 mg/l

Grasas y aceites 5520 155 mg/l 100 mg/l

Sol. Sedimentadles 2540 D 3 mg/l 2 mg/l

Sol. Disueltos 2540 D 400 mg/l 600 mg/l

Sol. Totales 1191 mg/l 800 mg/l

DQO 5220 2400 mg/l 1500 mg/l

DBO 1000 mg/l 800 mg/l

Fuentes: autores.

Bibliografía

Felix Perez Garcia- Universidad politecnica de madrid. (s.f.). Vitalidad, vigor,

longevidad y conservación de semillas. Obtenido de

http://servicios.educarm.es/templates/portal/ficheros/websDinamicas/20/

conservaci%C3%B3n%20semillas.pdf

M. Macedo, M. Vola . (2008). Principales grupos de bacilos Gram positivos

aerobios . btenido de

http://www.higiene.edu.uy/cefa/2008/grampositivosaerobios.pdf

Maria Cecilia Sombrero y Alicia Ronco. (s.f.). Ensayo de toxicidad aguda con

semillas de lechuga Lactuca Sativa L. Obtenido de

http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones/libros/573/cap4.pdf

Salle, D. E.-U. (2009).

Obtenido de

http://repository.lasalle.edu.co/bitstream/handle/10185/14030/

T41.09%20D85d.pdf?sequence=1&isAllowed=y

Universidad politecnica de valencia. (2003).

Lección 17 Germinación de Semillas.

Obtenido de http://www.euita.upv.es/varios/biologia/temas/tema_17.htm