“Implementación de pruebas para el Diagnóstico …glifos.concyt.gob.gt/digital/fodecyt/fodecyt...
Transcript of “Implementación de pruebas para el Diagnóstico …glifos.concyt.gob.gt/digital/fodecyt/fodecyt...
CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA -CONCYT-
SECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA -SENACYT- FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA -FONACYT-
UNIVERSIDAD DEL VALLE DE GUATEMALA-UVG-
INFORME FINAL
“Implementación de pruebas para el Diagnóstico
Diferencial de Dengue:
RT-PCR en tiempo Real y ELISA IgG”
PROYECTO FODECYT No.012-2007
Dra. Alejandra Estévez
Investigador Principal
GUATEMALA, Mayo 2011
AGRADECIMIENTOS
La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al apoyo financiero dentro del Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología, -FONACYT-, otorgado por La Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología -SENACYT- y al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología -CONCYT-.
RESUMEN
Introducción: Los métodos convencionales para evaluar una infección por Virus de Dengue
se basan en la detección de anticuerpos IgM e IgG en suero, mediante un ELISA. Sin
embargo, una exposición a otro flavivirus es suficiente para que se detecten anticuerpos con
reacción cruzada.
Antecedentes y objetivo: El proyecto de Vigilancia de Enfermedades Neurológicas Agudas
estudió la incidencia de casos causados por flavivirus, en un esfuerzo coordinado con la
Universidad del Valle de Guatemala, el Ministerio de Salud, el Centro para Control y
Prevención de Enfermedades de Estados Unidos y la Universidad Johns Hopkins. El
presente estudio complementa dicho proyecto con la implementación de ELISA IgG y una
técnica molecular -el RT-PCR en tiempo real- que discrimina por serotipos, con el fin de
analizar si los cuadros febriles de pacientes con síndrome neurológico estaban relacionados
con infecciones por VD.
Resultados: Se trabajaron muestras de suero provenientes de pacientes sospechosos de
infecciones arbovirales (n=497) encontrándose 12 casos positivos: 9 casos IgM positivos y
3 casos PCR positivos (serotipos DEN-1 y DEN-2). El análisis de ELISA IgG en muestras
pareadas reveló un 28% (60/ 213 pares) de infección previa, al presentar IgG anti-VD
positiva, sin cambio en título en la fase convaleciente, con viremia (RTqPCR) e IgM
negativas.
Conclusiones: Si bien la implementación del RT-PCR en tiempo real ha surgido como una
fuerte alternativa al aislamiento viral, ofreciendo una ventaja importante que es la
posibilidad de diferenciar serotipos del VD, el ELISA constituye una fuerte herramienta
aplicable a las instituciones de salud y evaluaciones de rutina.
SUMMARY
Introduction: Traditional methods used to evaluate dengue viral infection rely on the
detection of IgM and IgG antibodies by ELISA. However, a previous exposure to a
different flavivirus will promote the production of antibodies leading to cross reaction.
Background and objectives: In the hallmark of the Acute Infectious Neurologic Diseases
Surveillance project the incidence of neurologic diseases caused by flavivirus was studied,
in an effort coordinated by the Universidad del Valle de Guatemala, the Guatemalan
Ministry of Health, the Centers for Disease Control and Prevention and John Hopkins
University. Thus, the present work aims to complement the latter study by implementing
ELISA technique for the detection of IgG and IgM antibodies and a molecular technique
such as real time reverse transcriptase PCR (real time RT-PCR) that discriminates dengue
serotypes, in order to evaluate whether febrile cases with neurologic syndrome are related
with dengue viral infections.
Results: Serum samples collected from patients with suspected arboviral infection (n=497)
were analyzed by ELISA and real time RT-PCR. We found 12 positive cases: 9 IgM
positive and 3 PCR positive (dengue serotypes 1 and 2). Further IgG testing in paired
serum samples revealed previous dengue infection in 28% of the patients (60/213),
presenting IgG anti-dengue antibodies, no change in title in the convalescent phase and IgM
and PCR negative results.
Conclusions: Although real time RT-PCR implementation has emerged as a powerful
alternative to viral isolation, offering the possibility of identifying dengue serotypes,
ELISA is still a good choice for diagnostic testing in health care facilities and routine
evaluation.
ÍNDICE
PARTE I I.1 INTRODUCCIÓN I.1.1. Historia 1 I.1.2. Qué es el dengue? 1 I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 4 I.3 OBJETIVOS E HIPOTESIS
I.3.1 Objetivos I.3.1.1 General 8 I.3.1.2 Específicos 8 I.3.1.3 Hipótesis 8
I.4 MATERIALES Y METODOS I.4.1. Localización 9 I.4.2. Descripción general del proyecto 10 I.4.3. Pacientes y obtención de muestras 11 I.4.4. Aspectos Éticos 12 I.4.5. Manejo y procesamiento de muestras 12 I.4.6. ELISA IgM / IgG 13 I.4.7. RT-PCR tiempo real 14 I.4.8.Análisis estadístico 15 I.4.9. Variable 15 PARTE II MARCO TEORICO II.1. Características generales del Virus del Dengue 16 II.2. Vector 17 II.3. Transmisión del virus del dengue por el mosquito Aedes aegypti 18 II.4. Antecedentes del Dengue en Guatemala 19 II.5. Manifestaciones clínicas de la enfermedad causada por VD 21 II.5.1. Consideraciones generales 21 II.5.2. Síndromes clínicos 21 II.6. Detección del VD en el laboratorio 25
PARTE III III. RESULTADOS III.1. Implementación 30 III.2. Resultados de la investigación 33 III.3. DISCUSION 37 PARTE IV. IV. CONCLUSIONES
IV. 1. Conclusiones Objetivos específicos y recomendaciones asociadas IV. 1. 1. Conclusiones Objetivos a) y b) 40 IV. 1. 2. Conclusiones Objetivos c) y d) 40 IV. 1. 3. Conclusiones Objetivo e) 41 IV. 1. 4. Conclusión General 42
IV.2 RECOMENDACIONES 43 IV. 3. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 44 PARTE V V. INFORME FINANCIERO 49
1
PARTE I I.1. INTRODUCCION I.1.1. Historia La descripción más temprana de una enfermedad parecida al dengue aparece en
una enciclopedia china del año 992. En América, el dengue fue descrito clínicamente en
1780 luego de una gran epidemia en la ciudad de Filadelfia en los Estados Unidos. Se le
llamaba “fiebre quebranta huesos”, Sin embargo, el uso del término “quebranta huesos”
para describir una enfermedad febril antecede esta epidemia, pues ya figura en un
informe médico en Puerto Rico para el año 1771.
El origen de la palabra “dengue” usualmente se atribuye a una adaptación de la
palabra “dinga”, en Swahili, que pasó de África al Caribe durante una epidemia en el
1827. Sin embargo, el término ya era usado en España en 1801 para describir una
enfermedad febril aguda con dolor en los huesos, dolor en las articulaciones y
hemorragia.
I.1.2. Qué es el dengue?
Los Flavivirus son virus transmitidos por artrópodos que pertenecen a la familia
Flaviviridae. El genero Flavivirus incluye a más de 70 virus de RNA monocatenario, que
presentan determinantes antigénicos comunes. Los flavivirus son responsables de un alto
índice de mortalidad y morbilidad, y causan enfermedades severas en los vertebrados -
incluido el ser humano- tales como encefalitis y fiebre hemorrágica. Entre los virus
patogénicos del género figuran el Virus del Dengue (VD), Virus de la Fiebre Amarilla
(VFA), Virus de Encefalitis Japonesa (VEJ), Virus de Encefalitis de San Luis (VESL) y
el Virus del Oeste del Nilo (VON).
El Dengue es una enfermedad viral que puede ser causada por cuatro diferentes
serotipos (DEN1, DEN2, DEN3 y DEN4) y es transmitida por la picadura de mosquitos
del género Aedes. Actualmente es considerada la arbovirosis con mayor prevalencia en
2
regiones tropicales y subtropicales de Asia, África, Centro y Sur América (Gubler 1997,
Huang JH., et al 2007).
Se ha estimado que 2.5 billones de personas viven en áreas de riesgo de infección
por dengue y se espera que este número vaya en aumento debido a la expansión del
hábitat de vectores competentes, al incremento de hospederos susceptibles humanos y al
aumento de la distribución del virus del dengue por la magnitud de los viajes alrededor
del mundo (Domingo C, et al 2004; Huang JH, et al 2007)
Globalmente, 1 de cada 100 personas son infectadas cada año por uno o más de
los cuatro serotipos del virus del dengue (DEN1-4). Se estima que cada año ocurren 10
millones de casos de fiebre de dengue, incluyendo más de 500,000 casos de dengue
hemorrágico y síndrome del choque de dengue (DH/SCD) (Kyle J.L., and E. Harris,
2008).
Los únicos modos de prevención hasta el momento son la adopción de medidas
vinculadas con la higiene, fundamentalmente la eliminación de los posibles lugares de
depósito de los huevos del insecto. En tal sentido, se recomienda mantener tapados todos
los recipientes en donde se almacene agua. Asimismo, es preciso quitar el agua de los
huecos de árboles, rocas, paredes y tapias, objetos, pozos, letrinas abandonadas,
depresiones de terreno, blocks de construcción, u objetos o instrumentos.
De la misma manera, es necesario llenar con tierra o arena los floreros, macetas y limpiar
canoas y techos.
Todas las medidas que se puedan adoptar es un paso adelante en la lucha contra
esta enfermedad. Evitar la acumulación de agua y eliminar todo tipo de basura sobre
todo aquella que puede almacenar líquidos: botellas, cáscaras, llantas y demás
recipientes.
Los enormes aumentos de la población en los centros urbanos, una deficiente
recolección de la basura y falta de abastecimiento de agua por tuberías, así como el
incremento de recipientes desechables que sirven como hábitats larvarios, se combinan
para convertir al problema hoy en día en un problema de todos. Pocos países disponen de
los recursos para llevar a cabo una campaña vertical basada en insecticidas, similar a las
utilizadas en el pasado, cuando el dengue se había dado a conocer. Así, intentar hoy
3
realizar una campaña de erradicación del Aedes aegypti sería muy difícil. Más aún,
teniendo en cuenta la extensa propagación del mismo.
El desafío que deberán enfrentar aquellos que deseen diseñar programas
comunitarios eficaces es lograr la participación activa, con sugerencias y participación de
la comunidad en el programa.
4
I.2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
El primer brote en América Latina y el Caribe de una enfermedad compatible con
dengue clásico, ocurrió en las Guyanas Francesas en 1635 y en Panamá en 1699
(Bhamarapravati y Yoksan, 1997). Desde entonces, la enfermedad ha sido descrita en
diferentes lugares de América Latina y el mundo. Entre las décadas de los 40s y 60s, los
programas de erradicación para prevenir epidemias urbanas de FA, también fueron
exitosas para reducir el riesgo de dengue. La erradicación del Aëdes aegypti fue posible
en Argentina, Belice, Bermuda, Bolivia, Brasil, Islas Caimán, Chile, Colombia, Costa
Rica, Ecuador, El Salvador, Guatemala, Honduras, México, Nicaragua, Panamá,
Paraguay, Perú, y Uruguay.
Sin embargo, el programa fue interrumpido a inicios de los 70s y la iniciativa de
erradicación del Ae. Aegypti fracasó (OPS, 2000) y como consecuencia de la persistencia
del mosquito en algunos lugares la enfermedad reapareció, debutando con grandes
epidemias de dengue hemorrágico en Cuba en 1981 y Venezuela en 1990. Se ha
evidenciado una amplia distribución del vector, seguida de un aumento en la transmisión
de los múltiples serotipos del virus (Hayes et al, 1992; Gubler et al, 1994; Balmaceda et
al, 1999; OPS, 2000) por lo que actualmente se han encontrado en todos los países de
América Latina, registrándose un aumento en el número de casos y epidemias de fiebre
por VD.
Según la Organización Panamericana de la Salud, en Guatemala el panorama es
preocupante. Desde el año 1991, cuando Guatemala reportaba 10,968 casos de dengue
anuales, múltiples serotipos del virus han circulado en la región, hecho que se corroboró
con el aislamiento de los cuatro serotipos en los últimos años (Usuku et al, 2001). A
pesar de que el Aedes Aegipti fue erradicado de Guatemala en 1959 (OPS, 2001) el vector
fue capaz de re-infestar el país luego de que los programas de erradicación fueran
interrumpidos. Desde el año 1995 los casos han ido en aumento llegando a 6,341 casos en
el 2005 (www.paho.org/english/ad/dpc/cd/Dengue.html). Sin embargo, se especula que
estas cifras representan una subestimación de la incidencia del VD siendo la situación
más grave de lo que parece. Entre los factores que influyen en el sub-registro de casos se
encuentran: la falta de búsqueda de servicios de salud en los casos leves de la
5
enfermedad, las limitaciones en los servicios de salud para brindar un diagnóstico
diferenciado basado en pruebas de laboratorio y en el mejor de los casos, cuando se logra
realizar la toma de muestras, la falta de un diagnóstico de laboratorio oportuno o la
incapacidad de realizar las pruebas debido a limitaciones financieras. Incluso, algunos
casos de infecciones por VD presentan un diagnóstico confuso y no son tomados en
cuenta, por ejemplo, cuando el título de IgM no es lo suficientemente alto como para
arrojar resultados positivos en un ELISA.
De acuerdo a un reporte muy reciente de la Cruz Roja Española (Octubre 2005),
el paso del Huracán Stan por Guatemala ha aumentado el riesgo latente de epidemias,
debido al daño en las infraestructuras en gran parte del país y a las inundaciones que se
traducen en la aparición de más ambientes propicios para el desarrollo del vector (Plan de
Acción, Inundaciones Centroamérica Huracán Stan, El Salvador y Guatemala, 10
Octubre 2005;
http://www.cruzroja.es/pls/portal30/docs/PAGE/SITE_CRE/ARBOL_CARPETAS/DD_
ACCION_INTERNACIONAL/D20OPERACIONES_ESPECIALES/INUNCENTROA
MTIFVIET/PLANHURACANSTAN101005P.PDF)
Este contexto revela cuan determinante constituye el desarrollo de programas
serios de vigilancia y control, y asociado a ello, la implementación de métodos rápidos y
eficaces de detección del VD en el laboratorio.
Hoy en día no existe una vacuna o cura para la enfermedad causada por el VD y
el tratamiento paliativo consiste en reposo, acompañado de administración de analgésicos
y antipiréticos. La detección temprana del VD en un paciente, es la que permite montar
una respuesta rápida en las zonas afectadas, frecuentemente orientada al control del
vector. Por lo tanto, el desarrollo de programas de vigilancia, basados en la detección del
VD por técnicas serológicas y moleculares en el laboratorio, emerge como un asunto de
prioridad en materia de salud pública, no solamente a nivel clínico sino también a nivel
nacional para lograr proveer señales tempranas de una posible epidemia. Además, el
desarrollo de ensayos rápidos de detección viral aporta datos sumamente útiles para los
estudios epidemiológicos y ecológicos enfocados en estudiar la dinámica del vector.
En Guatemala, ya se han realizado investigaciones sobre enfermedades
arbovirales, relacionados con la transmisión de flavivirus en aves, mosquitos y caballos
6
(CES / UVG; Morales et al, 2006; datos no publicados). Además, se están desarrollando
programas de vigilancia de enfermedades arbovirales en humanos en hospitales, con el
fin de estudiar la prevalencia de las infecciones por flavivirus en pacientes con
enfermedades neurológicas y que presentan cuadros febriles. Actualmente en nuestro
laboratorio se ha desarrollado la capacidad de detectar infecciones por flavivirus como el
VON, por medio de RT-PCR en tiempo real (Lanciotti et al, 2000) y mediante ELISA
(Martin et al, 2000) evaluando los niveles de IgM e IgG en suero de aves y equinos. Sin
embargo, no se han desarrollado aun todas las herramientas para apoyar un diagnóstico
de infección por flavivirus, en particular para VD, en los seres humanos. Para hacerlo,
sería necesario estudiar:
a) el perfil de anticuerpos IgG,
b) la presencia del ARN viral del VD
c) el serotipo de VD involucrado
Es por ello que uno de los objetivos del presente estudio es montar el ELISA de
captura para IgG, el cual daría un panorama más amplio de la respuesta inmunológica del
paciente ante una infección por VD y permitiría diferenciar una infección primaria de una
secundaria. Por otro lado, de acuerdo a lo expuesto anteriormente respecto a la naturaleza
antigénica de los flavivirus, para diagnosticar una infección por VD en el laboratorio
sería recomendable complementar el ensayo serológico con un test molecular que permita
detectar el ARN viral. Todos los serotipos de VD desencadenan respuestas
inmunológicas similares y el ensayo serológico no ofrece información respecto al
serotipo de VD involucrado en la infección. Considerando este aspecto, para llegar a
establecer un diagnóstico completo en los pacientes con síntomas febriles (posibles
candidatos a infección por VD), el siguiente objetivo del estudio es la optimización del
RT-PCR en tiempo real para los cuatro serotipos de VD, basado en la técnica descripta
por Johnson y equipo en CDC (2005). Este protocolo ha sido ampliamente utilizado para
detectar infecciones por VD incluso en aquellos casos en los cuales el diagnóstico se
torna confuso, por ejemplo, cuando el título de IgM no es lo suficientemente alto como
para arrojar resultados positivos en un ELISA o cuando el paciente presenta viremias
7
muy bajas como para realizar aislados virales. Cabe señalar que nuestra unidad mantiene
una relación de colaboración con el grupo del CDC mencionado (Johnson y equipo) a
través de la transferencia de tecnología y en lo que se refiere a control de calidad de las
pruebas con las que trabajamos.
8
I.3. OBJETIVOS e HIPOTESIS
I.3.1. OBJETIVOS
I.3.1.1. Objetivo general
Aumentar la capacidad para el diagnóstico diferencial del VD, implementando pruebas
para discriminar por serotipo y las infecciones primarias de secundarias.
I.3.1.2. Objetivos específicos
a) Estandarizar el protocolo de ELISA de captura para IgG con el fin de determinar el
título de anticuerpos para VD en muestras de sueros agudos y convalecientes de pacientes
con síntomas febriles y enfermedades infecciosas neurológicas agudas.
b) Evaluar los niveles de IgM e IgG, mediante un ELISA de captura, en muestras de
suero de pacientes con síntomas febriles, colectados en los departamentos de Zacapa,
Esquintla, Santa Rosa y Guatemala.
c) Estandarizar el protocolo de RT-PCR en tiempo real para los serotipos 1, 2, 3 y 4 de
VD en muestras de pacientes con síntomas febriles.
d) Estudiar, mediante la técnica de RT-PCR en tiempo real para los cuatro serotipos de
VD, la presencia del ARN viral en muestras de liquido cefalorraquídeo (LCR) y suero de
pacientes febriles, colectados en los departamentos de Zacapa, Esquintla, Santa Rosa y
Guatemala.
e) Establecer el tipo de asociación que existe entre la detección de una infección por VD
en muestras de pacientes y las técnicas utilizadas -ELISA y RT-PCR en tiempo real-
como herramientas de diagnóstico.
I.3.1.3. HIPOTESIS
La implementación conjunta de técnicas moleculares y serológicas permite aumentar la
capacidad de detección de infecciones causadas por VD en muestras clínicas de pacientes
con cuadros febriles o neurológicos.
9
I.4. MATERIALES Y METODOS
I.4.1. Localización
Este estudio se realizó con muestras de sueros de pacientes recolectadas en el
marco del Proyecto de Vigilancia de Enfermedades Infecciosas Neurológicas Agudas
(colaboración entre la Universidad del Valle de Guatemala, el Ministerio de Salud y
Acción Social, el Centro para Control y Prevención de Enfermedades de Estados Unidos
y la Universidad John Hopkins) en los departamentos de Guatemala (14°37′22″N,
90°31′53″W, 1592msnm), Zacapa (14°58’21N, 89°31’42W, 220 msnm), Escuintla
(14°17′52″N, 90°47′13″W; 347 msnm) y Santa Rosa (14°16'42"N, 90°18'00"W, 893
msnm).
Fuente google maps 50mi 100km
10
I.4.2. Descripción general del proyecto
En Guatemala se está llevando a cabo un proyecto de Vigilancia de Enfermedades
Infecciosas Neurológicas Agudas (EINA) que tiene como meta estudiar la incidencia de
casos de enfermedades neurológicas causadas por flavivirus, incluyendo infecciones por
VD y VON. Este proyecto se inició en Julio del 2005, sobre la base de una plataforma de
vigilancia en cuatro hospitales situados en distintos departamentos de Guatemala en un
esfuerzo coordinado con la Universidad del Valle de Guatemala (UVG), el Ministerio de
Salud (MS), el Centro para Control y Prevención de Enfermedades de Estados Unidos
(CDC, Fort Collins) y la Universidad John Hopkins. Se han estudiado 321 casos a la
fecha de de los cuales 14 son posibles infecciones por flavivirus. Esto se pudo determinar
estudiando el perfil de IgM en muestras de suero y líquido cefalorraquídeo (LCR)
mediante un ELISA de captura (Martin et al, 2000a). Sin embargo, ante la falta de
métodos adicionales para la confirmación de los casos, se han enviado las muestras al
CDC para un análisis mas exhaustivo (PRNT, RT-PCR en tiempo real) con el fin de
llegar a un diagnóstico definitivo. Dado el alto costo de enviar muestras al CDC para
análisis adicionales, la idea de la presente propuesta es desarrollar algunas herramientas
aquí en Guatemala.
Por otra parte, en marzo del presente año se iniciará en Santa Rosa el proyecto de
Vigilancia Comunitaria (ViCo) que cuenta al MS y al CDC como colaboradores.
Consiste en un sistema integrado de vigilancia para enfermedades febriles, diarreicas y
respiratorias que tiene como fin establecer la línea basal de incidencia de cada
enfermedad en el área e identificar las etiologías de dichos síndromes.
En el marco de ambos proyectos, el presente estudio tiene como meta analizar si los
cuadros febriles en los pacientes están relacionados con infecciones de VD primarias o
secundarias evaluando la respuesta inmunológica del paciente (ELISAs IgM e IgG) y si
están vinculadas a algún serotipo particular de VD (RT-PCR en tiempo real).
11
I.4.3. Pacientes y obtención de muestras
Se utilizarán las muestras ya colectadas para un estudio de Enfermedades
Infecciosas Neurológicas Agudas (EINA) que se realiza actualmente en los laboratorios
del CES/CDC-CAP, cuyo principal objetivo es estudiar la incidencia de flavivirus en
pacientes con encefalitis. Los criterios de elegibilidad para los pacientes figuran a
continuación. Los pacientes se incorporan al estudio en dos hospitales de referencia del
MS de la Ciudad de Guatemala (Hospital San Juan de Dios y Hospital Roosevelt) y en
tres hospitales rurales (Esquintla, Zacapa y Santa Rosa).
Los hospitales de referencia captan alrededor del 70% de los pacientes, referidos
de otros hospitales del interior y de puestos sanitarios, lo que hace que más de la mitad de
los casos provengan de áreas fuera de la Ciudad de Guatemala. Los pacientes son
elegibles para el estudio siempre y cuando hayan presentado síntomas febriles reciente y
en cuando aplica, una indicación clínica de punción lumbar.
En todos los casos se registran los datos clínicos y demográficos del paciente, y se
obtienen muestras de suero y LCR (cuando corresponda) en la visita inicial, al momento
de dar el alta y en el control de rutina subsiguiente, 5 a 15 semanas después. La muestra
de LCR se encuentra dentro del conjunto de pruebas de rutina que ya ha sido pactada el
Ubicación de los Hospitales Guatemala
12
médico, por lo que se solicita una cantidad extra (0.5-1 mL) para fines del estudio en un
consentimiento informado.
Dado que las muestras provienen de otros estudios, la recolección ya está en curso
por lo cual no se han solicitado fondos para ello.
I.4.4. Aspectos Éticos
Para mantener la confidencialidad de la información proporcionada, se asignarán
códigos a cada paciente, los cuales no tendrán vínculo alguno con su identidad. El
análisis de muestras e información que se propone sigue los lineamientos establecidos por
la Declaración de Helsinki y sus enmiendas, y no conlleva ningún riesgo para la
integridad física y mental de los participantes, como tampoco para el medio ambiente. El
proyecto cuenta con la aprobación de los comités de ética de los hospitales participantes,
John Hopkins, CDC y Universidad del Valle. Además contó con la aprobación del
Ministerio de Salud y Acción Social de Guatemala.
I.4.5. Manejo y procesamiento de muestras
Las muestras del estudio permanecerán a -20ºC en cada hospital hasta que sean
debidamente transportadas (4ºC) al laboratorio de la UVG. Se minimizarán los ciclos de
descongelamiento /congelamiento con el fin de conservar la integridad de los
especimenes. Se prepararán alícuotas de LCR y suero en el laboratorio y se guardarán -
20ºC hasta la realización de los distintos ensayos. Además de los cultivos de LCR que se
realizan de rutina en el hospital, se realizarán ensayos de aglutinación latex para
Streptococcus pneumoniae y Haemophilus influenzae tipo b y PCR para herpes simplex y
enterovirus.
13
I.4.6. ELISA IgM / IgG
Se evaluaron las muestras de suero para la detección de anticuerpos IgM
(muestras agudas n=497) e IgG (muestras pareadas de un mismo paciente obtenidas en
las fases aguda y convaleciente; n=213 pares) mediante un ELISA basado en aquel
descrito previamente, con algunas modificaciones menores (Martin y col 2000a b;
Johnson y col, 2000). Los antígenos fueron gentilmente provistos por la Dra Johnson y
colaboradores (CDC, Fort Collins).
Brevemente, se sensibilizaron las placas con anticuerpo de cabra anti -IgM ó -IgG
humanas (Kirkegaard and Perry Laboratories, USA) a 4°C toda la noche. Se bloqueó con
200 µl de solución salina (PBS pH 7.4, Sigma) + 5% Leche descremada (Dos Pinos) +
0.5% Tween20 (Sigma). Después de 5 lavados con PBS 0.05% Tween20, se agregó 50 µl
de las muestras control y desconocidas (en duplicados); los controles negativos y
muestras a evaluar se diluyeron a 1:400, los controles positivos para Dengue a 1:1,800, y
los positivos para VON a 1:800. Se incubó a 37°C por una hora y luego de lavar se
agregó 50 µl de los antígenos (antígenos DEN: DEN 1, 2 y 4 a 1:120 y DEN 3 a 1:80;
antígenos VON: 1:320, control negativo -sin antígeno- células COS-1 se utilizó en
1:160). Se incubó a 4°C por toda la noche. Al día siguiente se lavó 5 veces y se agregó
50 µl de anticuerpo monoclonal 6B6C-1 conjugado con peroxidasa de rábano (dilución
1:3,000; Jackson Immuno Research Laboratories, Inc., West Grove, Pa.). Luego de una
hora a 37°C se lavó 10 veces y se agregó 75 µl de sustrato de peroxidasa TMB (3,3’,5,5`
tetrametilbenzidina, Kirkegaard and Perry Laboratories, USA) . Se incubaron las placas
en oscuridad por 10 minutos y se detuvo la reacción con 50 µl de ácido sulfúrico 1N (EM
Science) y se leyó a 450nm en un lector de ELISA.
Las muestras se corrieron en pares: con antígeno (DEN 1-4) y sin antígeno (Células COS-
1), de manera que cada muestra lleve su respectivo control negativo. Para la
interpretación de los resultados, se calculó un valor de P/N- razón entre la densidad
óptica (DO) de una muestra con antígeno (P) y la DO de su control negativo (COS-1)
(N). Para que una prueba sea válida se deben dar dos condiciones: 1- el P/N de los
controles positivos debe ser mayor que 2, de lo contrario la prueba se considera inválida y
se debe repetir; y 2- el valor promedio de las DO de las muestras y controles positivos
14
debe ser 3 veces mayor que el promedio de las DO de su par sin antígeno (células COS-
1). La interpretación de los valores de P/N de pacientes mayor o igual que 3 debe
notificarse como IgM/IgG positivo y los que presenten valores comprendidos entre 2 y 3
se consideran indeterminados. Los negativos serán aquellos cuyos P/N sean menores a 2.
I.4.7. RT-PCR tiempo real
Para la extracción del ARN se trabajó con el kit comercial QIAamp Viral RNA
Mini Kit (QIAGEN, Valencia, CA) siguiendo las indicaciones recomendadas por el
fabricante. El ARN se guardó a -70ºC hasta la realización de los ensayos.
El protocolo de RT-PCR tiempo real está basado en aquel descripto por Johnson y
colaboradores (2005). La prueba utiliza oligonucleótidos cebadores (primers) y sondas
fluorescentes de hidrólisis doblemente marcadas o sondas TaqMan, específicos para cada
serotipo del VD reportado previamente (Johnson et al, 2005). Las secuencias pueden
apreciarse en la Tabla I. Se realizó una reacción multiplex para detección de serotipos de
VD -2, 3 y 4, en la cual se combinaron 50 pmol de cada primer y 9pmol de sonda en una
reacción de 25ul. Se utilizó el kit iScript One-Step RT-PCR (Bio-Rad, CA). Se realizó
transcripción inversa por 10 minutos a 50°C, seguido de 45 ciclos de amplificación, en un
termociclador Applied Biosystems 7500 Real -Time PCR System. Se utilizó una
temperatura de “annealing” de 60°C. Para la detección de DEN-1 se realizó una reacción
simple con las mismas condiciones antes mencionadas.
Los controles positivos utilizados en este estudio (fluido de cultivo positivo a VD
preparado a partir de sueros de pacientes con diagnóstico confirmado) fueron
amablemente proporcionados por la Lic Leticia Castillo del Laboratorio Nacional de
Salud de Guatemala.
15
Tabla I: secuencias de cebadores y sondas de hidrólisis TaqMan utilizados en el protocolo de RT-PCR tiempo real (Johnson et al, 2005)
Serotipo Secuencia Posición genoma
Fluoróforo/Quencher
DEN-1 F DEN-1 C DEN-1 probe
5’-CAAAAGGAAGTCGTGCAATA-3’ 5’-CTGAGTGAATTCTCTCTACTGAACC-3’
CATGTGGTTGGGAGCACGC
8973 9084 8998
FAM/BQH-1
DEN-2 F DEN-2 C DEN-2 probe
5’-CAGGTTATGGCACTGTCACGAT-3’ 5’-CCATCTGCAGCAACACCATCTC-3’
CTCTCCGAGAACAGGCCTCGACTTCAA
1605 1583 1008
FAM/BQH-1
DEN-3 F DEN-3 C DEN-3 probe
5’-GGACTGGACACACGCACTCA-3’ 5’-CATGTCTCTACCTTCTCGACTTGTCT-3’
ACCTGGATGTCGGCTGAAGGAGCTTG
740 813 762
TR/BHQ-2
DEN-4 F DEN-4 C DEN-4 probe
5’-TTGTCCTAATGATGCTGGTCG-3’ 5’-TCCACCTGAGACTCCTTCCA-3’
TTCCTACTCCTACGCATCGCATTCCG
904 992 960
Cy5/BHQ-3
I.4.8.Análisis estadístico
El análisis estadístico se llevó a cabo utilizando el software SAS. Las
proporciones se compararon utilizando la prueba Fisher Exact de dos colas. Se calcularon
coeficientes de probabilidad (odds ratio) para cada técnica con el fin de analizar la
probabilidad de encontrar un resultado positivo por uno u otro procedimiento. Se utilizó
la prueba U de Mann-Whitney para evaluar diferencias entre medias. En todos los casos,
el nivel de significancia p<0.05 se utilizó para rechazar la hipótesis nula.
I.4.9. Variable
Presencia de VD en muestras de suero de pacientes con síndrome neurológico.
16
PARTE II
MARCO TEORICO
II.1. Características generales del Virus del Dengue
El VD presenta forma esférica de 37-50 mm de diámetro y cuenta en su interior
con una nucleocápside icosaédrica que contiene al genoma constituido por ARN (ácido
ribonucleico) de polaridad positiva. En su genoma existen siete genes que codifican para
proteínas no estructurales y que son expresados por la célula infectada. Estas provocan en
el huésped la respuesta de anticuerpos y los mecanismos de defensa celular, pudiendo
desencadenar en la inmunopatogenia del dengue hemorrágico.
Existen cuatro serotipos conocidos del VD. Sabin y Schlesinger aislaron las cepas
de Hawai y Nueva Guinea en l944, denominadas posteriormente Dengue 1 (Den-1) y
Dengue 2 (Den-2). En 1954, un síndrome “nuevo” denominado fiebre hemorrágica del
dengue fue estudiado en Filipinas procediéndose al aislamiento de los serotipos Dengue 3
(Den-3) y Dengue 4 (Den-4). Aunque generan cuadros clínicos idénticos, la infección por
alguno de los diferentes serotipos estimula la inmunidad homotípica que es completa y
permanente, siendo la protección cruzada muy incompleta y transitoria. Puede existir la
posibilidad de infecciones heterotípicas.
Para la preservación de la patología se requiere la presencia de un vector, siendo
el mosquito del género Aedes su transmisor. Varias son las especies de Aedes conocidas
como vectores de estos virus, pero el A. aegypti es el vector principal. Otro vector, el
Aedes albopictus, ha demostrado capacidad de transmisión transovárica del virus, no
descartándose la misma en el A. aegypti. Comparten áreas urbanas y rurales o selváticas
por lo que pueden resultar de nexo entre una y otra zona, pudiendo inclusive fecundar una
a otra especie. El A. albopictus, implicado en Asia y Oceanía, se ha establecido en
algunas partes del continente americano, como ser, Estados Unidos, México,
Centroamérica (incluyendo Guatemala) y Brasil y se supone que tiene gran capacidad
vectorial, aunque su papel en la transmisión natural aún debe ser evaluado. Otros vectores
que han sido implicados son el A. scutellaris, A. polynesiensis, A. cooki y A. mediovitatus
17
(Henchal and Putnak, 1990). En particular, en Guatemala se ha demostrado la presencia
de A. aegypti y A. albopictus en zonas rurales y urbanas (Ogata et al, 1996; García-
Franco et al. 2002).
La dinámica de transmisión del VD depende de interacciones entre el ambiente, el
virus, la población y el vector, los que coexisten en un hábitat específico. La magnitud e
intensidad de tales interacciones determinará la transmisión del dengue en una
comunidad, región o país. Al conocer que factores están involucrados en esta dinámica,
se puede romper el ciclo y evitar la aparición de epidemias y el incremento de la
incidencia del dengue.
II.2. Vector
El mosquito Aedes aegypti, principal vector del virus del dengue en Puerto Rico,
probablemente fue transportado desde África hasta el Nuevo Mundo durante la trata de
esclavos. Se puede encontrar este mosquito entre las latitudes 35 grados norte y 35 grados
sur y se le identifica por los patrones de escamas en bandas blancas en sus patas y tórax.
El ciclo de vida del mosquito Aedes aegypti se compone de cuatro etapas: huevo,
larva, pupa y mosquito adulto. La hembra deposita sus huevos en los bordes verticales de
lugares donde se acumula agua, usualmente recipientes artificiales. Mientras los huevos
no entren en contacto con agua, pueden durar semanas y meses. Los huevos se abren
cuando los cubre el agua. Entonces surge la larva que luego se convierte en pupa. La
etapa de larva puede durar de siete a nueve días a 77 grados Fahrenheit o 25 grados
Celsius y la pupa puede durar de dos a tres días a esta misma temperatura. De la pupa
sale el mosquito adulto.
El macho Aedes aegypti se alimenta del azúcar de flores y frutas y la hembra se
alimenta de azúcar y sangre, la cual utiliza para desarrollar sus huevos. El Aedes aegypti
suele picar más en las primeras horas de la mañana y durante varias horas antes del
anochecer. Sin embargo, puede picar durante cualquier hora del día en áreas bajo techo o
en áreas protegidas de la luz directa del sol. No es común que el mosquito pique en la
playa durante un día soleado. Por lo general, tampoco se encuentra en bosques tropicales
ni mangles donde no habitan seres humanos.
18
La hembra Aedes aegypti coloca sus huevos en envases caseros artificiales que
puedan retener agua y que se encuentran frecuentemente en ambientes urbanos
domésticos. Esto incluye latas, barriles, cubos, drones, llantas descartadas y floreros. Por
lo general, la hembra no coloca sus huevos en ambientes naturales como quebradas o
ríos.
El mosquito Aedes aegypti es un vector eficiente de dengue porque es altamente
susceptible al virus del dengue, se alimenta de sangre humana y se cría cerca de los seres
humanos.
Otros mosquitos Aedes, incluyendo Aedes albopictus y Aedes polynesiensis
también pueden estar asociados con la transmisión de dengue aunque se consideran
vectores menos eficientes que el Aedes aegypti. El Aedes albopictus ha estado presente en
los Estados Unidos desde por lo menos el 1985. Esta especie nativa de Asia se puede
encontrar ahora en la mayoría de los estados de la mitad oriental de Estados Unidos y en
algunas áreas de Brasil, México, Guatemala, El Salvador y la República Dominicana.
También se han observado ciclos de transmisión de dengue en Malasia con el vector
Aedes niveus y en el oeste de África con el vector Aedes furcifertaylori.
II.3. Transmisión del virus del dengue por el mosquito Aedes aegypti
El ciclo de transmisión de dengue comienza con una persona infectada con el
virus del dengue. El virus circulará en la sangre de esa persona durante aproximadamente
cinco días. Durante ese tiempo, una hembra Aedes aegypti pica a la persona e ingiere
sangre que contiene el virus. El virus se replica dentro de este mosquito durante un
período de ocho a doce días que se conoce como el período de incubación extrínseco, ya
que ocurre fuera del ser humano.
Durante este período el virus se replica en la zona embrionaria del tubo digestivo
del mosquito, en los ovarios, el tejido nervioso y el cuerpo graso. Luego se difunde por la
cavidad corporal, se replica e infecta las glándulas salivares. Cuando este mosquito pica a
una persona susceptible le transmite el virus a través de la saliva a esta segunda persona.
19
El mosquito infectado puede picar varias veces durante el resto de su vida y transmitir el
virus a cualquier otra persona susceptible.
El virus se replica en la segunda persona y produce síntomas que comienzan a
aparecer cerca de cuatro a siete días después de la picada del mosquito, con un máximo
de tres a catorce días. Este período entre la picada y el comienzo de los síntomas se
conoce como período de incubación intrínseco, pues ocurre dentro del ser humano.
Durante este período el virus se aloja y replica en órganos como los nódulos linfáticos y
el hígado.
Luego, sale de estos tejidos y se difunde por la sangre e infecta leucocitos y otros
tejidos linfáticos. Finalmente, millones de virus salen de estos otros tejidos para circular
en la sangre. Los síntomas causados por la infección de dengue pueden durar de tres a
diez días, con un promedio de cinco días después de la aparición de los síntomas
iniciales.
Otro modo de transmisión es la transovárica, donde el mosquito infectado pasa el
virus a sus huevos. Existe evidencia de este modo de transmisión del virus del dengue en
Aedes aegypti. Sin embargo, se entiende que este tipo de transmisión es poco frecuente y
que, en términos generales, los mosquitos sólo son infectados cuando pican a una persona
infectada con el virus del dengue.
II.4. Antecedentes del Dengue en Guatemala
El Dengue es una enfermedad prioritaria en Guatemala con una tasa de 12.26 por
100,000 habitantes para el año 2008, 93.4 por 100,000 habitantes para el 2009 y una tasa
de 52 por 100,000 habitantes para el año 2010. El dengue es endémico en nuestro país,
geográficamente se distribuye en 28 áreas de salud del total de 29, quienes reportan casos
en el transcurso de todo el año, a excepción de Totonicapán que aún no reporta casos. Los
departamentos con mayor número de casos de dengue reportados para el 2008 son: Ixcán,
Peten, Zacapa, Escuintla e Izabal y para el año 20101 Escuintla, Santa Rosa, Zacapa y
Guatemala. Actualmente, continúa el incremento de casos de dengue con un 400% de
1 Los datos del año 2010 son hasta el mes de Julio.
20
aumento en comparación al año 2009, siendo el grupo de edad mas afectado el de 25- 39
años, es decir, la población económicamente activa. (Ministerio de Salud Publica y
Asistencia Social, Centro Nacional de Epidemiología, Semana 20 año 2008, Semana 52
año 2009 y Semana 27 año 2010).
El Dengue es asociado con grandes epidemias urbanas y se ha convertido en uno
de los mayores problemas de salud pública, con un impacto económico, político y social
significativo. Hoy en día no existe una vacuna o cura para la enfermedad causada por el
virus del dengue, por lo que la detección temprana en un paciente es la que permite
establecer una respuesta rápida en las zonas afectadas. Actualmente se están
desarrollando sistemas de alerta temprana que ayuden a predecir una epidemia de dengue,
siendo a vigilancia virológica el sistema de alerta temprana más importante.
Además de la detección temprana del virus, también es importante conocer los
factores de riesgo asociados a la transmisión del dengue. Los determinantes sociales de la
emergencia del virus del dengue incluyen el crecimiento poblacional, la rápida
urbanización, la escasez de servicios públicos, como el agua potable y el descarte de
desechos sólidos, y la migración a áreas endémicas. (Narro-Roble J et al , 1995; Guzmán
MG et al, 2002; Navarrete-Espinoza J et al, 2005) Los factores biológicos asociados con
la transmisión del VD son: la edad, género, raza, estatus nutricional, salud del hospedero,
la competencia y densidad del vector y el origen geográfico de la cepa viral (Gubler
1998; Navarrete-Espinoza J, 2005). Los factores asociados al resurgimiento del VD en su
forma hemorrágica (DH) están asociados a los diferentes serotipos circulantes en una
región. El mecanismo exacto responsable del DH aun no esta completamente
comprendido pero es ampliamente aceptado que las infecciones secundarias son el
principal factor de riesgo (Gubler DJ, 2002; Huang JH, et al 2007). Por lo tanto, la co-
circulación de los diferentes serotipos del VD en un área geográfica, favorece la aparición
de DH y es imprescindible conocer qué serotipos están circulando para tomar las medidas
de prevención mas apropiadas.
21
II.5. Manifestaciones clínicas de la enfermedad causada por VD
II.5.1. Consideraciones generales
Luego de la picadura del mosquito y de un período de incubación de 3 a 14 días
aparecen los síntomas: aparición abrupta de fiebre alta -sobre 39ºC- que coincide con el
periodo de viremia, acompañada de dolor de cabeza, dolores musculares y articulares
obligando en algunos casos al reposo absoluto, dolor retro-orbitario, nauseas, vómitos y
leucopenia.
En países donde circula en forma habitual el VD, la enfermedad puede
complicarse con la forma más grave, el dengue hemorrágico hasta llegar al shock, en el
cual el pulso y la presión sanguínea son muy bajos. Sin embargo, es importante
mencionar que el cuadro clínico difiere entre regiones geográficas debido a las
diferencias culturales y posiblemente al estatus inmunológico de la población afectada
(Henchal y Putnak, 1990).
La Organización Panamericana de la Salud (OPS) ha considerado al dengue como
el mayor problema de salud pública de América luego del SIDA, encontrándose casi dos
tercios de la población mundial en zonas propicias (OPS, 2000). Es posible que cada año
80.000.000 de personas contraigan la enfermedad. Estas cifras son alarmantes, lo que
evidencian la importancia del desarrollo de programas y métodos de control.
II.5.2. Síndromes clínicos
La infección sintomática por virus del dengue puede presentarse como cualquiera
de los siguientes cinco síndromes clínicos: fiebre indiferenciada, fiebre de dengue,
dengue hemorrágico, síndrome de choque por dengue y las manifestaciones inusuales.
Fiebre indiferenciada
La fiebre indiferenciada es la manifestación más común del dengue. Un estudio en
Tailandia, encontró que entre estudiantes de cuatro a dieciséis años de edad infectados
por el virus del dengue, el 87% fueron asintomáticos o levemente sintomáticos. Otros
22
estudios que han incluido participantes de todos los grupos de edad también demuestran
una transmisión silenciosa.
Fiebre de dengue
La fiebre de dengue, conocida también como dengue clásico o fiebre quebranta
huesos, es una enfermedad viral caracterizada por un comienzo súbito en sus síntomas.
Estos incluyen: fiebre, dolor en los músculos y articulaciones, erupciones en la piel, dolor
de cabeza intenso, dolor detrás de los ojos, náuseas, vómitos y manifestaciones
hemorrágicas. Los síntomas asociados con esta fase aguda de la enfermedad usualmente
duran entre cinco a siete días.
Esta fase aguda es seguida por un período de convalecencia de una a dos semanas,
caracterizado por debilidad, malestar y anorexia. Otros síntomas que pueden estar
asociados al período de convalecencia de dengue incluyen picor en la piel y
manifestaciones neurológicas. Más tarde, y con carácter temporero, puede surgir;
depresión, pérdida de visión y pérdida de cabello.
Un diagnóstico definitivo de fiebre de dengue requiere de pruebas específicas de
laboratorio debido a que la presentación clínica del dengue puede parecerse a la de otras
enfermedades como la influenza, el sarampión y la leptospirosis. Las manifestaciones
hemorrágicas de la fiebre de dengue incluyen hemorragias cutáneas como petequias,
púrpura y equimosis, sangrado gingival, sangrado nasal, sangrado gastrointestinal, sangre
en la orina y aumento del flujo menstrual. Hasta una tercera parte de los pacientes pueden
tener manifestaciones hemorrágicas. Estas manifestaciones generalmente son leves, pero
en algunos casos la hemorragia puede ser severa y hasta causar choque por la pérdida de
sangre.
Dengue hemorrágico
De acuerdo con la Organización Mundial de la Salud, un caso de dengue hemorrágico
debe cumplir con cuatro criterios. Éstos son:
- Fiebre o historial reciente de fiebre aguda.
- Alguna manifestación hemorrágica. Ésta puede ser espontánea, como por
ejemplo petequias, sangrado gastrointestinal, sangrado en las encías, sangrado vaginal,
23
sangrado en la orina, o cualquier otro tipo de sangrado, o puede ser provocada por una
prueba de torniquete.
- Trombocitopenia, es decir, un conteo de plaquetas de 100.000/mm3 o menos.
- Evidencia objetiva del problema patofisiológico subyacente en dengue
hemorrágico, es decir, un aumento de la permeabilidad capilar, documentada por un
hematocrito elevado o efusiones, hipoalbuminemia o hipoproteinemia.
A base de estudios clínicos reconocidos por la Organización Mundial de la Salud el
dengue hemorrágico se puede clasificar en cuatro grados de severidad. Éstos son:
--Grado I: La persona experimenta fiebre y síntomas no específicos. La única
manifestación hemorrágica es la provocada por una prueba de torniquete positiva.
--Grado II: Se presentan las manifestaciones del grado I, pero con hemorragia
espontánea en lugar de provocada.
--Grado III: Ocurre un choque incipiente, con señales de insuficiencia
circulatoria, es decir, aceleración y debilitamiento del pulso, hipotensión, estrechamiento
de la tensión arterial y piel húmeda y fría.
--Grado IV: Las manifestaciones más comunes son: choque profundo y presión
arterial y pulso no detectables.
Para cada uno de estos grados de severidad se deben cumplir los cuatro criterios de la
definición de dengue hemorrágico, aunque en estado de choque la prueba de torniquete
no es confiable. Los grados III y IV se consideran síndrome de choque por dengue.
Síndrome de choque por dengue
Un caso clínico de síndrome de choque por dengue debe cumplir con los cuatro criterios
de un caso de dengue hemorrágico y además manifestar insuficiencia circulatoria
evidenciada por la aceleración y debilitamiento del pulso, hipotensión, estado mental
alterado y piel húmeda y fría. El choque franco o la carencia de oxigenación suficiente en
los órganos vitales debido a una presión arterial muy baja es, por supuesto, evidencia de
insuficiencia circulatoria.
24
Existen determinadas señales de alarma en los casos de dengue hemorrágico que
se deben observar para prevenir que evolucionen a síndrome de choque por dengue. La
mayor parte de las personas con dengue hemorrágico no entran en choque. Aquellos
casos que llegan a choque presentan ciertas señales de peligro antes de manifestar
insuficiencia circulatoria. La mayoría de los pacientes que desarrollan el síndrome de
choque por dengue lo hacen de tres a seis días después del comienzo de los síntomas.
Una fiebre que continúa entre tres y seis días después del comienzo de los síntomas es
una señal de alerta y el paciente debe ser observado cuidadosamente. El choque ocurre
con frecuencia en el momento en que la fiebre desaparece. Una disminución en el número
de plaquetas o un aumento de hematocrito también son señales de alerta.
Si se documenta trombocitopenia y hemoconcentración, es decir, un aumento en
el número y producción de células sanguíneas debido a una disminución del volumen de
plasma, y además, el paciente muestra otras señales de dengue hemorrágico y cumple con
los cuatros criterios de la Organización Mundial de la Salud para dengue hemorrágico, se
puede determinar que su riesgo de muerte ha aumentado.
La fiebre de dengue no tiene una mortandad alta. En cambio, el riesgo de muerte
es mayor en pacientes con dengue hemorrágico. En ese caso se debe estar alerta a cuatro
señales de peligro. Éstas son:
-dolor abdominal intenso y mantenido
-vómitos persistentes
-cambio abrupto de fiebre a hipotermia, con sudoración y postración
-cambio en el estado mental del paciente que incluya agitación o letargo.
Cualquiera de estas señales indica una situación de choque inminente. Estos pacientes
necesitan observación cuidadosa y fluidos intravenosos. La meta del tratamiento es evitar
el choque. Si se administran suficientes fluidos como para evitar el choque, la
enfermedad deberá resolverse por sí misma.
25
Manifestaciones inusuales
En los últimos años han aumentado los informes publicados sobre manifestaciones poco
usuales del dengue. Las manifestaciones inusuales que se mencionan con más frecuencia
son: fallo hepático, fiebre de dengue con sangrado y desórdenes neurológicos. Menos
comunes, pero bien documentados, son los casos con síntomas encefalíticos como
convulsiones, alucinaciones, letargo, confusión y coma, y los casos con alteración del
ritmo cardiaco. Aunque no es usual, la fiebre de dengue puede en ocasiones ser grave y el
paciente puede morir, pero sin progresar a través del dengue hemorrágico. Estos
pacientes pueden presentar encefalopatía, insuficiencia hepática o hepatitis fulminante.
II.6. Detección del VD en el laboratorio La detección de anticuerpos por medio de un ELISA (por sus siglas en inglés,
Enzyme -Linked Immunosorbent Assay) y el aislamiento del virus de muestras de
pacientes, son dos procedimientos frecuentemente utilizados en el laboratorio para
evaluar una infección por VD.
El aislamiento viral y las pruebas de neutralización en placa (PRNT) a partir de
Figura 1: Viremia en suero de pacientes con VD en función a días post-síntomas febriles. Fuente: TDR / WHO and PDVI Workshop 4-6 Oct 2004.
Día de desaparición de fiebre
26
muestras de suero utilizando líneas celulares (Komar et al, 2001) o mosquitos vivos
(Kuberski y Rosen, 1977) es considerado el método de referencia ó “gold standard”. En
la enfermedad causada por el VD, la viremia aumenta típicamente antes del comienzo del
cuadro febril, de 4 a 5 días previos a la presencia de síntomas, luego presenta un pico a
los 2 ó 3 días de haberse iniciado la fiebre y finalmente disminuye, coincidiendo con la
desaparición de los síntomas febriles (figura 1, página 17). Cuando el diagnóstico de una
infección primaria por VD se realiza mediante aislado viral, se debe tener en cuenta la
fecha de la toma de la muestra, ya que fuera del período de viremia mencionado la
probabilidad de aislar VD cultivable es mucho menor. Esto suele limitar mucho la
aplicación de este método en el diagnóstico. Sumado a ello, dicho método al igual que el
PRNT, requiere de amplia experiencia por parte del profesional, suele ser muy costoso y
toman mucho tiempo hasta llegar a un resultado. Es por ello que se suele recurrir a las
pruebas serológicas, menos costosas y más rápidas, para elaborar un diagnóstico en el
laboratorio.
Los tests serológicos consisten en ELISAs de captura que evalúan los niveles de
IgM e IgG en muestras de suero (Martin et al, 2000ª; 2000b). En una infección primaria
por VD, los niveles de IgM son detectables al tercer día de iniciado el cuadro febril. El
título de IgM va en aumento en las siguientes 3 semanas y permanece detectable hasta 2
meses post-infección. Los anticuerpos IgG, por el contrario, son producidos
aproximadamente 2 semanas después de una infección y se mantienen circulantes de por
vida. En una infección secundaria por VD, el perfil de anticuerpos IgM e IgG es distinto.
Mientras que el título de IgG aumenta repentinamente a los 3-5 días de presentarse la
fiebre, la IgM registra un aumento más modesto. De acuerdo a ello, la evaluación por
ELISA de los niveles de IgM e IgG en suero a los 5-7 días de iniciado el cuadro febril,
permite diferenciar una infección primaria de una secundaria. Siguiendo este
razonamiento, la presencia de anticuerpos IgM en ausencia de IgG revelará una infección
primaria, mientras que la presencia de IgG acompañada de una modesta cantidad de IgM
desenmascarará una infección secundaria por VD (figuras 2A y 2B, página 18).
Una diferencia relevante entre las ecologías de Guatemala y otras regiones de
Norteamérica como Estados Unidos, es la circulación amplia de otros flavivirus,
incluyendo el patógeno humano VD y otros como VFA y VON. En este escenario, los
27
ensayos serológicos suelen responder a limitaciones relacionadas con la naturaleza
antigénica de los flavivirus. Además de compartir morfología y estructura genómica, los
flavivirus comparten determinantes antigénicos que pueden complicar el diagnóstico de
infecciones por VD mediante los ensayos serológicos clásicos. De hecho, una exposición
a un flavivirus relacionado es suficiente para que en el suero convaleciente del paciente
se detecten anticuerpos con reacción cruzada a VD.
Esta relación serológica entre el VD y otros flavivirus fue demostrada en 1950 por
Sabin, quien reportó reacciones cruzadas de sueros humanos convalecientes anti-dengue
con antígenos de VFA, VEJ y VON (Sabin, 1950).
También se ha demostrado una respuesta inmune anamnésica en pacientes
inmunizados al VFA y posteriormente expuestos al VD o inmunizados con antígenos de
VD (Sabin, 1950). En resumen, los cuatro serotipos de VD pertenecen a la familia
Flaviviridae, junto el VFA y el VON, entre otros.
Durante una infección por VD si bien los anticuerpos IgM producidos tendrán una
alta actividad contra el serotipo de VD involucrado, también tendrán reactividad cruzada
apreciable con otros flavivirus.
Esto sugiere que el ensayo serológico es insuficiente para elaborar un diagnóstico
etiológico concluyente en pacientes previamente expuestos a otros flavivirus o en co-
infecciones.
Teniendo en cuenta que en toda la región Centroamericana, incluyendo
Guatemala, co-circulan distintos miembros de la familia Flaviviridae, esta información
sugiere que los ensayos serológicos deberían complementarse con algún otro ensayo que
permita determinar qué flavivirus es responsable de la infección.
Más aun, la identificación del tipo específico de flavivirus, en este caso VD,
también debería ser parte del diagnóstico ya que conocer qué virus están circulando
podría ayudar a predecir la aparición de la manifestación más severa de la enfermedad, la
cual comienza con síntomas febriles que no se distinguen de una simple fiebre por VD.
De hecho, estudios recientes han demostrado que la presencia de los serotipos
Den-1 y Den-2 pueden influenciar el grado de severidad de la enfermedad (Sangkawibha
et al, 1984). Asociado a ello, esta información permitiría identificar los factores de riesgo
particulares, que siguen siendo controversiales y no congruentes entre regiones
28
posiblemente debido a las diferencias culturales y al estado inmunológico de la población
afectada.
Varios autores han identificado esta dificultad, por lo que se han descrito un
número importante de enfoques moleculares, basados en la detección de una región
específica del ARN viral a través del RT-PCR (por sus siglas en ingles Reverse
Transcription Polymerase Chain Reaction; Lanciotti et al, 1992, Harris et al, 1998, Laue
et al, 1999, Johnson et al, 2005). La implementación de estas pruebas ha surgido como
una fuerte alternativa al aislamiento viral ya que son menos costosas, mas rápidas y muy
Figura 2A: Niveles séricos de IgM e IgG durante una infección primaria por VD en función a días pre- y post-síntomas febriles. Fuente: TDR / WHO and PDVI Workshop 4-6 Oct 2004.
Día de desaparición de fiebre
Figura 2B: Niveles séricos de IgM e IgG durante una infección secundaria por VD en función a días pre- y post-síntomas febriles. Fuente: TDR / WHO and PDVI Workshop 4-6 Oct 2004.
Día de desaparición de fiebre
IgM
IgM
IgG
IgG
29
sensibles y, de acuerdo al protocolo seleccionado, ofrecen ventajas muy importantes
como la posibilidad de diferenciar los cuatro serotipos del VD y la detección del ARN
viral hasta el décimo día de iniciados los síntomas (De Paula et al, 2004).
La utilidad del RT-PCR en tiempo real en sus distintos formatos ya ha sido
demostrada en laboratorios de Centroamérica como Nicaragua, Bolivia y Ecuador
(Balmaceda et al, 1999, Harris et al 1998; Peredo et al, 1999), países donde el VD es
endémico. En Guatemala, el grupo de investigación de enfermedades arbovirales del
Centro de Estudios en Salud de la UVG está llevando a cabo un estudio de transmisión de
VON en animales (aves, caballos y mosquitos) y ha demostrado la gran utilidad de esta
tecnología para identificar infecciones por flavivirus (Morales et al, 2006, en prensa).
En el marco de las limitaciones anteriormente expuestas, nuestro objetivo es
extender dicha tecnología a la detección y tipificación del VD, para aumentar la
capacidad de detección del VD en el laboratorio, con fines inmediatos en salud pública y
a largo plazo para estudios epidemiológicos, como ya se esta haciendo en diversos países.
30
PARTE III
RESULTADOS
III.1. Implementación
Durante la primera fase del proyecto se llevó a cabo la implementación de los
protocolos necesarios para el presente estudio. En primer lugar se trabajó el protocolo de
RT-PCR en tiempo real basado en aquel descripto por Johnson y colaboradores, de CDC
Fort Collins para luego abordar el procedimiento de ELISA IgM/IgG según Martin y
colaboradores. En la sección de Materiales y Métodos se detallan los protocolos
implementados.
Se inició el proceso de estandarización utilizando ARN viral de dengue 2,
obtenido de mosquitos Aedes aegypti infectados. Estos mosquitos infectados fueron
donados por el Dr. Alvaro Molina del Instituto Nacional de Salud de Estados Unidos
(NIH). Como primer paso se extrajo el ARN viral, utilizando el kit QIAamp viral RNA
mini Kit (Qiagen), siguiendo las instrucciones del fabricante. Luego, se utilizó el kit de
Qiagen denominado “QuantiTect Probe RT-PCR kit” para hacer las primeras pruebas de
PCR porque era el único kit con el que se contaba en ese momento, pero no se logró
obtener resultados reproducibles y confiables. Por esta razón fue necesario adquirir el kit
“iScript One-Step RT-PCR” (BIO RAD). Con este kit se logró estandarizar el PCR en
tiempo real para la detección del serotipo 2 de dengue, y posteriormente para los demás
serotipos, con resultados óptimos. Esto se puede observar en las gráficas representativas
que se adjuntan al documento, donde las curvas obtenidas con el kit mencionado de la
casa comercial BioRad son las esperadas (Figuras 1-3).
Con estas pruebas de estandarización también se determinó que la mejor dilución
para el control positivo es de 1/500, porque se obtuvieron resultados con alta
reproducibilidad y no se ve afectada la sensibilidad de la prueba.
31
Debido a los altos costos tanto de la sonda como del kit para PCR, se hicieron
pruebas para tratar de disminuir los volúmenes de reacción, por lo que se logró una
detección óptima del virus utilizando un volumen de 25ul de reacción en lugar de 50ul,
que es el volumen de una reacción de PCR estándar.
Cabe señalar que no se encontraron limitaciones mayores durante el proceso de
implementación de la técnica.
Figura 1: Protocolo Kit QuantiTect Probe RT-PCR casa comercial Qiagen;
concentraciones finales ensayadas- de sonda 0.2uM y cebadores 1uM.
Fuente FODECYT 012-2007
32
Figura 2: Protocolo Kit QuantiTect Probe RT-PCR casa comercial Qiagen.
Concentraciones finales ensayadas- de sonda 0.1uM y cebadores 0.5uM.
Fuente FODECYT 012-2007
Figura 3: Protocolo Kit iScript One-Step RT-PCR casa comercial BIO RAD.
Fuente FODECYT 012-2007
33
III.2. Resultados de la investigación
El diagnóstico de una infección por VD se basó en las técnicas de RT-PCR
tiempo real y ELISA para IgM/IgG. La positividad de alguna de estas pruebas, y no
necesariamente ambas, confirmó el diagnóstico de dengue en un paciente.
En total, se obtuvieron 533 muestras de suero agudo de pacientes sospechosos de
EINAs que participaron del estudio. Como se descartaron aquellos casos presentando
etiología bacteriana, se analizaron un total de 497 muestras por ELISA y RT-PCR tiempo
real, encontrándose 12 positivos para VD (12/497; 2.4%). La edad media del grupo de
pacientes con infección viral fue de 23.3 años (rango 0.1 a 53 años), con 18.2 % mujeres
y 81.8% hombres. El 80% de los casos de VD ocurrió durante la época lluviosa,
abarcando Mayo a Octubre inclusive. Las manifestaciones clínicas de dichos pacientes se
detallan en la Tabla II.
El 25% (3/12) de las infecciones fueron detectadas por medio del RT-PCR tiempo
real, mientras que el restante 75% (9/12) mediante el ensayo serológico. En ningún caso
una muestra de suero fue positiva por ELISA y RT-PCR tiempo real simultáneamente
(Tabla III). Cabe destacar, que si bien no era parte de este estudio, también se analizaron
(por ambas técnicas) las muestras de LCR de los 12 pacientes positivos, obteniéndose
resultados similares. En los LCR de los 3 casos positivos por RT-PCR tiempo real en
suero, también se detectó ARN viral de VD. Además, en las otras 9 muestras de LCR se
detectaron anticuerpos IgM, resultados que concuerdan con los sueros de esos mismos
pacientes (Erica Dueger, resultados no publicados).
Respecto a la distribución de serotipos de VD detectados por RT-PCR tiempo
real, no se registraron infecciones con los serotipos 3 y 4, mientras que se encontraron 2
casos de DEN-1 y 1 caso de DEN-2.
En la Figura 4 se presentan los resultados obtenidos por RT-PCR tiempo real y
ELISA, teniendo en cuenta el tiempo transcurrido entre el inicio de los síntomas y la
34
fecha de toma de la muestra. De acuerdo a ello, se observa que todas las muestras
positivas por RT-PCR tiempo real fueron tomadas hasta 2 días después del inicio de
síntomas (promedio 1.33, rango 1-2) mientras que la ventana de detección del diagnóstico
serológico fue más amplia (promedio 10.77, rango 3-18) siendo significativa la diferencia
entre medias (p=0.01, Mann-Whitney U-Test).
En el estudio, la obtención de muestra convaleciente fue exitosa en un 43% de los
casos. Al examinar los anticuerpos IgG anti-VD en muestras pareadas por ELISA, se
encontró que un 28% (60/ 213 pares) eran positivas. Sin embargo, ninguno de estos
sueros evaluados fue IgM positivo ni presentó viremia activa (PCR negativo) y además,
en ningún caso se registró un aumento en el título de anticuerpos IgG en la muestra
convaleciente.
35
FIGURAS Y TABLAS
Tabla II: Manifestaciones clínicas de los 12 pacientes con infección por VD y síndrome neurológico
Tabla II: Manifestaciones clínicas de los pacientes con VD y síndrome neurológico
n (%) Fiebre 12 (100) Diarrea 8 (66.6) Dolor muscular 8 (66.6) Dificultas para caminar 8 (66.6) Vómitos 7 (58.3) Alteración de la conciencia 7 (58.3) Náusea 6 (50.0) Dolor de articulaciones 6 (50.0) Dolor generalizado 6 (50.0) Cambios en la personalidad 6 (50.0) Dolor de cabeza 6 (50.0) Vértigo 6 (50.0) Dificultad para hablar 5 (41.6) Dolor de garganta 5 (41.6) Convulsiones 4 (33.3)
Fuente: FODECYT 012-2007 Tabla III: Comparación de los resultados obtenidos por RT-PCR tiempo real y ELISA IgM; las casillas reflejan el número de casos; Pos= positivo; Neg=negativo. RT-PCR tiempo real ELISA IgM
Pos Neg Total Pos 0 9 9 Neg 3 485 488 Total 3 494 497
Fisher Exact Test; Odds ratio PCR versus ELISA 0.44; p=0.16 Fuente: FODECYT 012-2007
36
Figura 4: Resultados obtenidos por las técnicas de RT-PCR tiempo real y ELISA IgM, en muestras de suero agudo de pacientes febriles con EINA, de acuerdo a los días de inicio los síntomas.
1 2 3 4 5 6 7 o más
0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.0
%
Días
Días Post- Síntomas 1 2 3 4 5 6 7 ó más
No. Muestras 52 106 68 44 47 34 144 RT-PCR tiempo real (3.80) (0.90) (0) (0) (0) (0) (0) ELISA IgM (0) (0) (1.5) (2.3) (0) (2.9) (4.2)
Fuente: FODECYT 012-2007
RT-PCR tiempo real
ELISA IgM
37
III.3. DISCUSION DE RESULTADOS
La detección temprana del VD en un paciente es lo que permite establecer una
respuesta rápida en las zonas afectadas, respuesta frecuentemente orientada al control del
vector. Hoy en día no existe una vacuna o cura para la enfermedad causada por el VD,
por lo que el desarrollo de programas de vigilancia, basados en la detección del VD por
técnicas de laboratorio adecuadas, emerge como un asunto de prioridad en materia de
salud pública, no solamente a nivel clínico sino también a nivel nacional, para lograr
proveer señales tempranas de una posible epidemia.
Con el fin de aumentar la capacidad de laboratorio para la detección del VD, en el
presente estudio retrospectivo se implementó un abordaje molecular, en combinación con
un ensayo serológico, para apoyar el diagnóstico de pacientes febriles con afección
neurológica. El estudio reveló un 2.4% de infección con VD, en concordancia con
resultados de otros autores, quienes han reconocido manifestaciones anormales del
sistema nervioso central asociadas a un cuadro clínico de dengue (Hendarto y
Hadinegoro, 1992; Patey et al, 1993; Ramos et al, 1998).
En los resultados del presente trabajo, se encontró que sólo una cuarta parte del
total de casos positivos para VD, fueron RT-PCR tiempo real positivos. Es importante
destacar que el tiempo de recolección de las muestras es crucial en la interpretación de
los resultados del RT-PCR tiempo real por la duración de la viremia. En la enfermedad
causada por el VD, la viremia aumenta típicamente antes del comienzo del cuadro febril,
de 4 a 5 días previos a la presencia de síntomas, luego presenta un pico a los 2 ó 3 días de
haberse iniciado la fiebre y finalmente disminuye, coincidiendo con la desaparición de
los síntomas febriles. Por otro lado, los niveles de IgM son detectables a partir del tercer
día de iniciado el cuadro febril y hasta 2 meses post-infección. En consecuencia, es de
esperar que el test serológico sea mas efectivo en muestras tardías, siendo el RT-PCR
tiempo real aplicable a muestras agudas tempranas, tomadas cuando el paciente aun
presenta un cuadro febril y no al acudir al servicio de salud en un estadío más avanzado
de la enfermedad. Nuestros resultados concuerdan con lo anteriormente expuesto, ya que
38
las muestras de los 3 casos detectados por medio del RT-PCR tiempo real habían sido
recolectadas hasta 2 días posteriores de iniciados los síntomas, al tiempo que la prueba de
ELISA IgM evidenció mas de la mitad de las infecciones (75%; 9/12) en muestras
tomadas a partir de los 3 días de iniciados los síntomas.
La utilidad del RT-PCR tiempo real para la detección de VD en muestras clínicas
ya ha sido demostrada en laboratorios de Latinoamérica como Nicaragua, Bolivia y
Ecuador (Balmaceda et al, 1999, Harris et al 1998; Peredo et al, 1999), países donde el
VD es endémico. La ventaja que ofrece esta técnica por sobre otras como la serología,
reside en la identificación del serotipo de VD circulante, información que es de suma
importancia considerando que la infección con un serotipo constituye un factor de riesgo
para el desarrollo del DH (Leong et al, 2007). En nuestro estudio, en los tres casos
analizados se identificó serotipo 1 (2/3) y serotipo 2 (1/3), coincidiendo con los reportes
del Laboratorio Nacional de Salud, laboratorio de referencia en Guatemala, sobre los
serotipos circulantes en los años 2006 y 2007 (WHO). Asimismo, es importante destacar
que en el marco de un Proyecto de Vigilancia de Enfermedades Febriles bajo el Acuerdo
Cooperativo entre el Centro para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC,
Atlanta) y la Universidad del Valle de Guatemala, nuestro grupo de investigación
actualmente está aplicando el protocolo implementado en el presente proyecto para
apoyar el diagnóstico de cuadros febriles de origen desconocido y para identificar el
serotipo de dengue circulante. Esta información es compartida con las autoridades del
Laboratorio Nacional de Salud, contribuyendo así con las autoridades sanitarias en cuanto
a la epidemiología molecular del VD.
El presente estudio reveló un 28% de muestras negativas a IgM pero positivas a
IgG sin cambios en el título de IgG en la muestra convaleciente. Debido a la persistencia
de anticuerpos IgG y su prevalencia en áreas endémicas como la nuestra, una simple
muestra de suero demostrando la presencia de estos anticuerpos tiene significado clínico
limitado. Así, la detección de IgG como método diagnóstico depende de la toma de
muestras pareadas que demuestren un cambio de título de por lo menos cuatro veces,
entre la fase aguda y convaleciente, a menos que la muestra única posea un título
39
sugestivo de infección secundaria (Vordam et al, 1997). Esto sugiere, que la probabilidad
de encontrar pacientes que fueran negativos para IgM pero positivos para IgG son altas y
por tanto, las pruebas serológicas con ambos tipos de anticuerpos es de vital importancia
en zonas endémicas.
Una diferencia relevante entre las ecologías de Guatemala y otras regiones de
Norteamérica como Estados Unidos, es la circulación amplia de otros flavivirus,
incluyendo el patógeno humano VD y otros como el Virus del Oeste del Nilo (Morales-
Betoulle ME et al, 2006). En este escenario, los ensayos serológicos suelen responder a
limitaciones relacionadas con la naturaleza antigénica de los flavivirus ya que, además de
compartir morfología y estructura genómica, los flavivirus comparten determinantes
antigénicos que pueden complicar el diagnóstico de infecciones mediante los ensayos
serológicos clásicos. Esto sugiere que el ensayo serológico es insuficiente para elaborar
un diagnóstico etiológico concluyente en pacientes previamente expuestos a otros
flavivirus o en co-infecciones. Teniendo en cuenta dichos antecedentes, las muestras de
los pacientes con diagnóstico sospechoso de VD del presente estudio, fueron evaluadas
en CDC Fort Collins por otras técnicas serológicas y por la prueba de neutralización por
reducción en placa (PRNT por sus siglas en inglés Plaque Reduction Neutralization Test),
para descartar reactividad cruzada a otros flavivirus y alfavirus. Los resultados negativos
para SLE, WNV y VEE junto con los resultados positivos para VD, respaldaron el
diagnóstico de VD en los 12 casos de nuestra investigación (Erica Dueger, resultados no
publicados).
En resumen, en nuestro estudio se comprueba la hipótesis planteada, demostrando
el valor agregado de la aplicación conjunta de una técnica serológica como el ELISA para
la detección de anticuerpos, y el RT PCR tiempo real para detección del RNA viral. Debe
tenerse en cuenta sin embargo, que la ventana de aplicación de cada una de estas
poderosas herramientas depende en gran medida del momento en que se ha tomado la
muestra, respecto al inicio de síntomas. Esta información tan útil puede guiar al personal
de salud en la lectura de resultados de laboratorio, para poder así brindar un diagnóstico
acertado y oportuno.
40
PARTE IV
IV. CONCLUSIONES
IV. 1. Conclusiones Objetivos específicos y recomendaciones asociadas
IV. 1. 1. Conclusiones Objetivos a) y b)
a) Estandarizar el protocolo de ELISA de captura para IgG con el fin de determinar el
título de anticuerpos para VD en muestras de sueros agudos y convalecientes de pacientes
con síntomas febriles y enfermedades infecciosas neurológicas agudas.
b) Evaluar los niveles de IgM e IgG, mediante un ELISA de captura, en muestras de
suero de pacientes con síntomas febriles, colectados en los departamentos de Zacapa,
Esquintla, Santa Rosa y Guatemala.
La técnica de ELISA para la detección de anticuerpos IgM/IgG ha sido
implementada en el laboratorio del Centro de Estudios en Salud de la Universidad
del Valle de Guatemala.
El ELISA para la detección de anticuerpos IgM/IgG es una herramienta muy
valiosa para el diagnóstico diferencial de enfermedad por VD. La misma se aplicó
exitosamente en pacientes con EINAs, revelando infecciones que no habían sido
detectadas por una técnica sofisticada como el RT PCR tiempo real.
----Recomendación: los reactivos pueden adquirirse en casas comerciales de
Guatemala y el protocolo no presenta mayores dificultades a la hora de ejecutarse.
Se recomienda la incorporación de esta técnica a laboratorios de hospitales y
centros de salud.
IV. 1. 2. Conclusiones Objetivos c) y d)
c) Estandarizar el protocolo de RT-PCR en tiempo real para los serotipos 1, 2, 3 y 4 de
VD en muestras de pacientes con síntomas febriles.
41
d) Estudiar, mediante la técnica de RT-PCR en tiempo real para los cuatro serotipos de
VD, la presencia del ARN viral en muestras de suero de pacientes febriles, colectados en
los departamentos de Zacapa, Esquintla, Santa Rosa y Guatemala.
La técnica de RT PCR tiempo real ofrece la ventaja de ser más rápida y muy
sensible. Además, puede discriminar por serotipo. La misma ha sido
implementada en el laboratorio.
La reactividad cruzada entre Flavivirus representa un gran problema para la
vigilancia epidemiológica, control y prevención del dengue, por lo que nuevas
estrategias de diagnóstico de laboratorio son necesarias para suministrar un
diagnóstico específico así como también para describir el posible patrón de
dispersión de los serotipos circulantes. Es por ello, que la herramienta
implementada apoya fuertemente el estudio de la epidemiología molecular del
virus, en una región endémica donde la enfermedad por V constituye un problema
de gran importancia a nivel de salud pública.
----Recomendación: los reactivos y materiales necesarios para llevar a cabo este
protocolo pueden adquirirse en casas comerciales de Guatemala y luego de una
capacitación breve, la misma puede implementarse en otros laboratorios
dedicados a la salud pública. De hecho, este protocolo fue transferido al
Laboratorio nacional de Salud quienes actualmente están aplicándolo.
----Recomendación: aunque no son comunes las manifestaciones neurológicas en
el marco de una enfermedad por VD, el presente estudio sugiere que en
Guatemala el personal de salud debe tener en mente esta evidencia en el
diagnóstico diferencial de encefalitis y su manejo clínico.
IV. 1. 3. Conclusiones Objetivo e)
e) Establecer el tipo de asociación que existe entre la detección de una infección por VD
en muestras de pacientes y las técnicas utilizadas -ELISA y RT-PCR en tiempo real-
como herramientas de diagnóstico.
42
El análisis estadístico reveló que la ventana de detección del diagnóstico
serológico fue significativamente más amplia respecto de la ventana de detección
del diagnóstico molecular.
----Recomendación: concientizar al personal de salud y al personal de laboratorio
sobre la importancia de obtener datos fieles sobre la fecha de toma de muestra y el
inicio de síntomas para poder establecer conclusiones adecuadas sobre los
resultados obtenidos por diferentes técnicas.
IV. 1. 4. Conclusión General
Muchos casos de enfermedad febril causada por VD no pueden ser diagnosticados
mediante criterios clínicos. Por lo tanto, el diagnóstico diferencial por laboratorio es de
vital importancia, para distinguir un DC y/o DH de otras enfermedades tropicales,
sobretodo en países como Guatemala donde el dengue es endémico. Recurrir a las
pruebas serológicas para elaborar un diagnóstico de infección por VD, sigue siendo la
opción mas acertada, en un contexto donde los escasos recursos financieros y la búsqueda
de servicios de salud en estadios avanzados de la enfermedad, suelen limitar la aplicación
del RT-PCR tiempo real, aun cuando éste ofrezca notables ventajas como la
discriminación por serotipo.
43
IV.2 RECOMENDACIONES
De acuerdo a lo expuesto anteriormente se sugiere implementar las técnicas
serológicas en las instituciones de salud, así como también fortalecer el envío de muestras
al Laboratorio Nacional de Salud, laboratorio de referencia de Guatemala, para que
mediante el protocolo de RT-PCR tiempo real se logre la caracterización de serotipos de
VD circulantes. Asimismo, debe haber coordinación entre el Centro Nacional de
Epidemiología y el Laboratorio Nacional de Salud en cuanto a publicación de resultados
y elaboración de reportes pertinentes.
Es importante señalar que se debe mantener una capacitación continua para los
médicos que toman las muestras y los técnicos de laboratorio, para que aprecien las
limitaciones de cada técnica, en cuanto a la ventana de detección de los virus y
anticuerpos a través de la evolución de la enfermedad. Así, una muestra que se desea
evaluar a través de una técnica de biología molecular como el PCR debe ser tomada
durante el período febril, mientras que para serología se debe esperar unos días para dar
tiempo a que se manifieste la respuesta inmune.
Es muy importante el trabajo en colaboración con otros países de la región para
monitorear la circulación de serotipos ante un eventual situación de brote o re-aparición
de un serotipo particular, sobretodo teniendo en cuenta que la infección con un serotipo
constituye un factor de riesgo para el desarrollo de dengue hemorrágico.
Finalmente, los protocolos implementados en este estudio serán impartidos en un
taller a colegas del Laboratorio Nacional de Salud, cuyo principal contacto ha sido la Lic
Leticia Castillo, quien ha colaborado ampliamente con el proyecto.
44
IV. 3. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
Balmaceda A, Sandoval E, Perez L, Gutierrez CM, Harris E. Application of molecular typing techniques in the 1998 Dengue Epidemia in Nicaragua (1999) Am J Trop Hyg 61(6): 893-897. Bhamarapravati N. & Yoksan S.: Live Attenuated Tetravalent Dengue Vaccine. En Gubler D, Kuno G. Dengue and Dengue Hemorrhagic Fever. London, CAB International, (1997). De Paula SO, Lopes da Fonseca BA. Dengue: a review of the laboratory tests a clinician must know to achieve a correct diagnosis (2004) Brazilian J Infect Diseases 8(6): 390-398. Dietz V., Gubler D., Ortiz S. et al: The 1986 dengue and dengue hemorrhagic fever epidemic in Puerto Rico: Epidemiology and clinical observations. P. R. Health Sci. J. (1996) 15:201.
Domingo C, Palacios G, Niedrig M, Cabrerizo M, Jabado O, Reyes N, Lipkin WI, Tenorio A. 2004. A New Tool for the Diagnosis and Molecular Surveillance of Dengue Infections in Clinical Samples. Dengue Bulletin 28: 87-95
Feigen RD, Cherry JD. Textbook of Pediatric Infectious Diseases, 4th Edn 1998. García-Franco F, Munoz Mde L, Lozano-Fuentes S, Fernandez-Salas I, Garcia-Rejon J, Beaty BJ, Black WC 4th. Large genetic distances among Aedes aegypti populations along the South Pacific coast of Mexico. Am J Trop Med Hyg. (2002) 66(5):594-8. Gubler D. y Trent D.: Emergence of epidemic dengue/dengue hemorrhagic fever as a public health problem in the Americas. Infect. Agents Dis. (1994)2:383.
Gubler, D. 1998. Dengue and dengue hemorrhagic fever. Clinical Microbiology Reviews. 11(3); 480-496 pp.
Gubler DJ. Chapter 2: Dengue and dengue hemorrhagic fever: its history and
resurgence as a global public health problem. In: Gubler DJ, Kuno G, eds. 1997. Dengue and dengue hemorrhagic fever. London: CAB International. 1–22pp.
Harris E, Roberts GT, Smith L, Selle J, Kramer LD, Valle S, Sandoval E, Balmaceda A. Typing of Dengue Viruses in Clinical Specimens and Mosquitoes by
45
Single-Tube Multiplex Reverse Transcriptase PCR (1998) J Clin Microbiol. Sept: 2634-2639. Hayes E. y Gubler D.: Dengue and dengue hemorrhagic fever. Pediatr. Infect. Dis. J. (1992) 11:311. Henchal EA, Putnak JR. The Dengue Virases (1990) Clin Microbiol Rev 3(4):376-396. Henchal EA, Gentry MK, Mc Cown JM, Brandt WE. Dengue virus specific and flavivirus group reactive determinats identified with monoclonal antibodies by indirect immunofluorescence (1982) Am J Trop Med Hyg 31: 830-836. Hendarto SK & Hadinegoro SR. Dengue Encephalopaty. Acta Paedriatr Jpn 1992; 34:350-357.
Huang JH, Liao TL, Chang SF, Su CL, Chien LJ, Kuo YC, Yang CF, Lin CC,
Shu PY. 2007. Laboratory based Dengue Surveillance in Taiwan, 2005: A Molecular Epidemiology Study. Am. J. Trop. Med. Hyg. 77(5):903-909
Johnson, A.J., Martin, D.A., Karabatsos, N. and Roehrig, J.T..: Detection of anti-arboviral immunoglobulin G by using a monoclonal antibody-based capture enzyme-linked immunosorbent assay. Journal of clinical Microbiology 38:1827-1831, 2000. Johnson BW, Russell BJ and Lanciotti RS. Serotype-Specific Detection of Dengue Viruses in a Fourplex Real-Time Reverse Transcriptase PCR Assay. (2005) J Clin Microbiol. 43(10): 4977-4983. Kankirawatana P, Chokephaibulkit K, Puthavathana P, Yoksan S, Apintanapong S, Pongthapisit V. Dengue infection presenting with central nervous system manifestation. J Child Neurol. 2000 Aug;15(8):544-7. Komar N, Panella NA, Burns JE, Dusza SW, Mascarenhas TM, Talbot OT, Serologic Evidence for West Nile Virus Infection in Birds in the New York City Vicinity During an Outbreak in 1999. (2001) Emerging Infectious Diseases 7(4): 621-625.
Kyle, J., and Harris, E. 2008. Global spread and persistence of dengue. Annu.Rev.Microbiol. 62:71-92pp. Kubershi TT y Rosen L. A simple technique for the detection of dengue antigen in mosquitoes by immunofluorescence (1977) Am J Trop Med 26: 533-537. Sabin AB. The dengue group of viruses and its family relationships (1950) Bacteriol Rev 14:225-232
46
Lanciotti RS, Calisher H, Gubler DJ, Chang GJ, Vorndam AV. Rapid detection and typing of dengue viruses from clinical samples by using reverse transcriptase-polymerase chain reaction. (1992) J Clin Microbiol 30: 545-551. Lanciotti RS, Kerst AJ, Nasci RS, Godsey M, Mitchell CJ, Savage HM, Komar N, Panella NA, Allen BC, Volpe KE, Davis BS, Roherig JT. Rapid detection of West Nile Virus from human clinical specimens, field-collected mosquitoes, and avian samples by a TaqMan Reverse-transcriptase-PCR Assay (2000) J Clin Microbiol 38(11): 4066-4071. Laue T, Emmerich P, Schnitz H. Detection of dengue virus RNA in patients after primary or secondary dengue infection by using TaqMan automated amplification system (1999) J Clin Microbiol 37: 2543-2547. Leong AS, Wong KT, Leong TY, Tan PH, Wannakrairot P. The pathology of dengue hemorrhagic fever. Semin Diagn Pathol. 2007 Nov;24(4):227-36. Martin DA, Muth DA, Brown T, Karabatsos N, Roehrig JT. Standarization of immunoglobin M capture enzyme-linked immunosorbent assays (MAC-ELISA) for routine diagnosis of arboviral infections. J. Clin. Microbiol. (2000a) 38:1823-1826. Martin DA, Karabatsos N, Roehrig JT. Detection of anti-arboviral immunoglobin G by using a monoclonal antibody-based capture enzyme-linked immunosorbent assay. (2000 b) J. Clin. Microbiol. 38:1827-1831. Morales-Betoulle ME, Morales H, Blitvich BJ, Powers AM, Davis EA, Klein R, Cordón-Rosales C. West Nile virus in horses, Guatemala. Emerg Infect Dis. 2006 Jun;12(6):1038-9.
Navarrete-Espinoza J, Gómez-Dantés H, Celis-Quintal Juan G, Vazquez-Martínez JL. 2005. Clinical profile of dengue hemorrhagic fever cases in Mexico. Salud Pública de México. 47:193-200
Narro-Robles J, Gómez-Dantes H. 1995. El dengue en México: un problema prioritario de Salud Pública. Salud Pública de México. 37:12-20 Ogata K, Lopez Samayoa A. Discovery of Aedes albopictus in Guatemala. J Am Mosq Control Assoc. (1996);12 (3 Pt 1):503-6. Organización Panamericana de la Salud, Boletín Epidemiológico Diciembre 2000 Vol 21 No 4. Patey O, Ollivaud L, Breuil J, Lafaix C. Unusual neurologic manifestations occurring during dengue fever infection. Am J Trop Med Hyg 1993; 48-793-802. Ramos C, Sanchez G, Pando RH. Dengue virus in the brain of a fatal case of hemorrhagic fever. J Neurovirol 1998; 4:465-468.
47
Peredo C, Garron T, Pelegrino JL, Harris E, Gianella A. Detection and identification of dengue-2 virus from santa cruz-bolivia by a single tube RT-PCR method. Rev Inst Med Trop Sao Paulo. (1999) 41(3):207-8.
Ramos C, Sánchez G, Pando RH, Baquera J, Hernández D, Mota J, Ramos J, Flores A, Llausás E. Dengue virus in the brain of a fatal case of hemorrhagic dengue fever. J Neurovirol. 1998 Aug;4(4):465-8.
Roos KL. Encephalitis. Neurol Clin 1999; 17:813-33.
Richman DD, Whitley RJ, Hayden FG. Clinical Virology 1997.
Sangkawibha N, Rojanasuphot S, Ahandrik S, Viriyapongse S, Jatanasen S, Salitul B, Phanthumachinda B, Halstead SB. Risk factors in dengue shock syndrome: a prospective epidemiolocig study in Rayong, Thailand. I. The 1980 outbreak. (1984) Am J Epidemiol 120: 653-669.
Shu, P. Y., and J. H. Huang. 2004. Current advances in dengue diagnosis. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 11:642–650. Solomon T, Dung NM, Vaughn DW, Kneen R, Thao LT, Raengsakulrach B, Loan HT, Day NP, Farrar J, Myint KS, Warrell MJ, James WS, Nisalak A, White NJ. Neurological manifestations of dengue infection. Lancet. 2000 Mar 25;355(9209):1053-9.
Usuku S, Castillo L, Sugimoto C, Noguchi Y, Yogo Y, Kobayashi N. Phylogenetic analysis of dengue-3 viruses prevalent in Guatemala during 1996-1998. (2001) Arch.Virol. 146: 1381-1390.
Vorndam V, Kuno G. Laboratory diagnosis of dengue virus infections. In:
Dengue and dengue hemorrhagic fever. Gubler DJ, Kuno G. Eds. Wallingford, UK: CAB International. 1997; p 313-334.
Whitley RJ, Gnann JW. Viral encephalitis: familiar infections and emerging
pathogens. Lancet 2002;359:507-13. World Health Organization (WHO) .http://www.paho.org/english/ad/dpc/cd/dengue-cases-2006.htm http://www.paho.org/english/ad/dpc/cd/dengue-cases-2007.htm
World Health Organization (WHO). 2002. Dengue and dengue hemorrhagic fever. Fact sheet No. 117.
48
World Health Organizatio (WHO), 1997 Dengue haemorrhagic fever: diagnosis, treatment, prevention and control, 2nd edition, World Health Organization, Geneva, Switzerland. http://www.who.int/csr/disease/dengue/en/
49
PARTE V V. INFORME FINANCIERO
UNIVERSIDAD DEL VALLE DE GUATEMALA OFICINA ADMINISTRATIVA DEL INSTITUTO DE INVESTIGACIONES
Registros correspondientes al 12 de Febrero del 2009
Nombre del Proyecto: Implementación de Pruebas para el Diagnóstico Diferencial de Dengue: RT-PCR en Tiempo Real y Elisa IgG
Código del Proyecto: FODECYT 012-2007
Investigador Principal : Dra. Alejandra Estevez Fecha: 01 de Septiembre del 2007 al 31 de Agosto del 2008 Prorroga del 01 de Septiembre de 2008 al 28 de Febrero del 2009 Duración 12 Meses Prorroga 6 meses
18 meses
FICHA DE EJECUCIÓN PRESUPUESTARIA DEL PROYECTO
RENGLÓN DESCRIPCIÓN AUTORIZADO TRANSFERENCIAS AUTORIZADAS
AJUSTADO EJECUTADO SALDO
GRUPO 1
181 Estudios, investigaciones y proyectos de factibilidad
78,000.00
-
- 78,000.00 39,000.00 39,000.00
181 Estudios, investigaciones y proyectos de factibilidad: Evaluación externa de Impacto
8,000.00
-
- 8,000.00 8,000.00 -
GRUPO 2
241 Papel de escritorio
5,350.00
(5,350.00)
- - - -
261 Elementos y compuestos químicos
62,061.26
-
- 62,061.26 60,540.54 1,520.72
295 Útiles menores médico-quirúrgicos y de laboratorio
69,989.90
-
- 69,989.90 47,437.21 22,552.69
GRUPO 3
323 Equipo médico-sanitario y de laboratorio
7,550.50
(6,618.00)
5,350.00 6,282.50 5,818.44 464.06
329 Otras maquinarias y equipos
-
6,618.00 6,618.00 6,618.00 -
Gastos Administrativos
23,095.17
-
- 23,095.17 23,095.17 -
TOTALES Q 254,046.83 Q (11,968.00) Q 11,968.00 Q 254,046.83 Q 190,509.36 Q 63,537.47
(-) (+)