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CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA –CONCYT-
SECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA-SENACYT-
FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -FONACYT-
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACIA
UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA
INFORME FINAL
COMPOSICIÓN QUÍMICA Y ACTIVIDAD INMUNOMODULADORA Y
BIOCIDA DE BASIDIOMICETOS COMESTIBLES DE GUATEMALA
PROYECTO FODECYT No. 30-2007
MA. QB. MARGARITA PAZ DE RAMÍREZ
Investigadora Principal
GUATEMALA, JULIO DEL 2011
ii
AGRADECIMIENTOS
La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al apoyo financiero dentro del
Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología -FONACYT-, otorgado por La Secretaría
Nacional de Ciencia y Tecnología -SENACYT- y al Consejo Nacional de Ciencia y
Tecnología –CONCYT-
iii
AGRADECIMIENTOS
A la Universidad de San Carlos de Guatemala y Facultad de Ciencias Químicas y
Farmacia por el aval institucional, la infraestructura brindada, materiales y equipo para la
ejecución del proyecto.
Al Laboratorio de Investigación de Productos Naturales (LIPRONAT), Bioterio y Unidad
de Bioensayos por brindarnos la infraestructura, materiales y personal que colaboró para
la ejecución del proyecto.
Al Servicio de Micología de la Escuela de Química Biológica, especialmente al Lic.
Osberth Morales por su asesoría en el campo de los hongos.
Al Departamento de Citohistología de la Escuela de Química Biológica, en especial a las
Licenciadas Ma. Eugenia Paredes Sánchez e Isabel Gaitán Fernández por su
incondicional colaboración en el desarrollo de todo el proyecto.
A los investigadores asociados del proyecto, Lic. Armando Cáceres y al Dr. Oscar Cóbar
por su asesoría y apoyo.
A los auxiliares de investigación: Licda. Keila Mariana Guerrero, Licda. Egly Alvarez,
Licda. Dina Córdova y Lic. Roberto Cáceres.
A las estudiantes de Química Biológica: Nancy González, Silvia Oliva, Kristel Ramírez,
Claudia Rodríguez y Stephanie Sánchez.
iv
RESUMEN
Las diferentes culturas en el mundo, incluyendo Guatemala, han atribuido a los hongos
muchas propiedades nutricionales y medicinales a lo largo de la historia. Uno de los
aspectos más importantes de los basidiomicetos es la reciente demostración en algunas
especies asiáticas de actividad inmunomoduladora y adaptógena, además de sus
propiedades alimenticias. El presente proyecto generó información sobre seis especies de
hongos macromicetos comestibles que crecen en diferentes regiones del país, evaluando
la actividad de sus extractos acuoso y etanólico, contra diferentes especies microbianas,
así como larvas de insectos y su posible toxicidad a nauplios de Artemia salina. Uno de
los principales objetivos fue también establecer su potencial inmunomodulador,
evaluando su acción sobre dos sistemas inmunes mayores: la linfoproliferación y el
sistema de complemento. Se realizó un tamizaje de sus compuestos químicos,
metabolitos primarios y secundarios, así como su contenido mineral.
Las especies estudiadas fueron los hongos comestibles Armillariella polymyces, Boletus
edulis, Cantharellus lateritius, Neolentinus ponderosus, Lactarius deliciosus y Amanita
garabitoana.
La recolección e identificación de las especies estuvo a cargo de un especialista, quien
preparó muestras de herbario y realizó la caracterización final, generando fichas técnicas
de cada una de las especies.
Los extractos preparados fueron estudiados de acuerdo a procedimientos de operación
estándar que fueron validados oportunamente.
La actividad antimicrobiana, larvicida y citotóxica fue pobre en las seis especies, a
excepción de Amanita garabitoana (extracto acuoso), quien mostró actividad contra
Staphylococcus aureus y Escherichia coli.
El hongo A. polymyces mostró una actividad inhibitoria sobre el sistema de complemento
en sus dos vías con una CI50 de 1.37 µg/mL.y el extracto acuoso de Boletus edulis, fue el
único que mostró una actividad estimuladora de la linfoproliferación a una concentración
efectiva mínima (CEM) de 125 μg/mL.
Los metabolitos secundarios encontrados en las especies estudiadas fueron saponinas,
principios amargos, flavonoides, azúcares reductores y azúcares 2-desoxigenadas. A.
garabitoana presentó dentro de su composición mineral la mayor cantidad de elementos
químicos Potasio (K), Hierro (Fe), Níquel (Ni), Cobre (Cu), Zinc (Zn), Manganeso (Mn),
y Rubidio (Rb). Mientras que C. lateritius presentó los niveles de concentración más
altos de los elementos: Potasio (K), Hierro (Fe), Cobre (Cu), Zinc (Zn). Finalmente N.
ponderosus presentó una menor presencia de elementos químicos, encontrándose Potasio
(K), Hierro (Fe), Níquel (Ni) y Zinc (Zn).
v
ABSTRACT
Different cultures in the world, including Guatemala, have appointed several properties to
mushrooms, namely nutritional and medicinal throughout history. One of the most
important issues regarding to basidiomicetes is the recently demonstration of
immumomodulative and adaptogenic activity in some asian species, added to their edible
properties. This project generated information about six edible macromycetes that grow
wildly in different regions of the country, of which watery and etanol extracts activities
were studied. Such extracts were evaluated against several microbial species, insect
larvae and their possible toxicity against Artemia salina. One of the main tasks was to
establish their immunomodulative potential, by testing their action on two major immune
responses: lymphoproliferation and the complement system. A chemical screening was
performed, for the identification of their metabolites and mineral content.
The species studied were the edible mushrooms Armillariella polymyces, Boletus edulis,
Cantharellus lateritius, Neolentinus ponderosus, Lactarius deliciosus and Amanita
garabitoana.
Collect and identification of species were performed by a specialist who was in charge of
herbarium samples preparation, final characterization, and prepared technical card of
each species.
The extracts obtained were tested according to standard operation procedures (SOP),
previously validated.
Antimicrobial, larvicide and cytotoxic activities were poor in all species, except for
aqueous extract of Amanita garabitoana which showed activity against Staphylococcus
aureus and Escherichia coli.
A. polymyces showed inhibitory activity on both paths of the complement system, with a
CI50 value of 1.37 µg/mL. The aqueous extract of Boletus edulis was the only one that
showed a stimulatory activity on the lymphoproliferation assay, with a Minimal Effective
Concentration (MEC) of 125 μg/mL.
Secondary metabolites found were: saponines, bitter principles, flavonoids, and sugars.
A. garabitoana showed a mineral content of potassium, iron, nickel, copper, zinc,
manganese and rubidium. C. lateritius showed the highest levels of potassium, iron,
copper and zinc. Finally, N. ponderosus showed the least presence of chemical elements,
which were potassium, iron, nickel and zinc.
vi
TABLA DE CONTENIDOS
RESUMEN iv
ABSTRACT v
TABLA DE CONTENIDOS vi
LISTA DE TABLAS viii
LISTA DE FIGURAS ix
PARTE I
I.1 INTRODUCCIÓN 1
I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 3
I.2.1 Antecedentes (Trabajo, experiencias en Guatemala) 3
I.3 OBJETIVOS E HIPÓTESIS 4
I.4 METODOLOGÍA 5
I.4.1 Localización 5
I.4.2 Variables 6
I.4.3 Indicadores 6
I.4.4 Estrategia metodológica 7
I.4.5 Métodos 7
I.4.5.1 Universo 7
I.4.5.2 Muestra 7
I.4.5.3 Exatracción contínua por percolación 7
I.4.5.4 Concentración por rotavapor 8
I.4.5.5 Ensayo hemolítico de actividad sobre la vía alterna de complemento 9
I.4.5.6 Ensayo hemolítico de actividad del complemento en la vía clásica 12
I.4.5.7 Ensayo de Linfoproliferación 16
I.4.5.8 Tamizaje de la actividad antibacteriana in vitro 21
I.4.5.9 Tamizaje de la actividad antimicótica in vitro 23
I.4.5.10 Tamizaje de la actividad antilevadura invitro 26
I.4.5.11 Concentración Inhibitoria Mìnima 27
I.4.5.12 Tamiizaje de la actividad larvicida 28
PARTE II. MARCO TEÓRICO
II.1 Uso de los basidiomicetos en Guatemala
II.2 Los basidiomicetos como inmunomoduladores y biocidas
II.3 Composición química de los basidiomicetos
II.4 Información de los basidiomicetos comestibles del estudio
PARTE III RESULTADOS
40
40
41
48
49
53
PARTE IV
IV.1 CONCLUSIONES 65
IV.2 RECOMENDACIIONES 67
IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 68
IV.4 ANEXOS 74
Anexo 1 Obtención de extractos 74
Anexo 2 Citotoxicidad 74
vii
Anexo 3 Actividad larvicida 75
Anexo 4 Actividad antifúngica 75
Anexo 5 Actividad antimicrobiana 79
Anexo 6 Actividad inmunomoduladora 80
Anexo 7 Cuantificación de linfoproliferación. Ensayo con XTT 81
Anexo 8 Sólidos extraíbles 81
Anexo 9 Tamizaje fitoquímico 83
Anexo 10 Afiche
Anexo 11 Fichas técnicas de los hongos
PARTE V. INFORME FINANCIERO
85
86
92
viii
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Dilusión del suero
Tabla 2. Principales especies de basidiomicetos comestibles detectados en
Guatemala
Tabla 3. Rendimiento de los extractos etanólicos al 95% y acuosos
obtenidos de la materia vegetal de varios hongos comestibles
16
32
45
Tabla 4. DL50 contra Artemia salina de los extractos etanólicos y acuosos
de hongos comestibles
46
Tabla 5. Actividad larvicida contra larvas de A. aegypti y A. albimanus 47
Tabla 6. Actividad antifúngica de extractos etanólicos al 95% 47
Tabla 7. Actividad antifúngica de extractos acuosos de hongos comestibles 48
Tabla 8. Actividad antimicrobiana de extractos etanólicos al 95% 48
Tabla 9. Actividad antimicrobiana de extractos acuosos 48
Tabla 10. Actividad inmunomoduladora para el ensayo linfoproliferativo 49
Tabla 11. Determinación de Concentración Efectiva Mínima de extractos
acuosos de B. edulis y C. lateritius para el ensayo linfoproliferativo
49
Tabla 12. Actividad sobre el Sistema de Complemento 50
Tabla 13. Determinación de CI50 del ensayo hemolítico para la valoración de
la vía clásica del Sistema de Complemento
50
Tabla 14. Determinación de CI50 del ensayo hemolítico para la valoración de
la vía alterna del Sistema de Complemento
51
Tabla 15. Cantidad de sólidos extraíbles con diferentes conc. de solvente 51
Tabla 16. Prueba de alcaloides 52
Tabla 17. Prueba de flavonoides y antocianinas 52
Tabla 18. Prueba de antraquinonas 52
Tabla 19. Prueba de cardenólidos y bufadienólidos 53
Tabla 20. Prueba de esteroides y triterpenoides 53
Tabla 21. Prueba de saponinas 53
Tabla 22. Prueba de taninos 53
Tabla 23. Prueba de glicósidos cianogénicos 54
Tabla 24. Prueba de esteroles insaturados 54
Tabla 25. Prueba de cumarinas 54
Tabla 26. Prueba de azúcares reductores 54
Tabla 27. Prueba de polisacáridos 55
Tabla 28. Cromatografía en capa fina de alcaloides 55
Tabla 29. Cromatografía en capa fina de flavonoides y antocianinas 55
Tabla 30. Cromatografía en capa fina de saponinas 56
Tabla 31. Cromatografía en capa fina de principios amargos 56
Tabla 32. Cromatografía en capa fina de aceites volátiles 57
Tabla 33. Resultados de la investigación de metabolitos secundarios 58
Tabla 34. Resultados de la investigación de metabolitos secundarios 58
Tabla 35. Resultados de la investigación de metabolitos secundarios 59
Tabla 36. Análisis de composición mineral 59
ix
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Cascada del sistema de complemento
Figura 2. Suero Fetal Bovino
Figura 3. Separación de la capa de linfocitos con Histopaque
Figura 4. Placa de inoculación
Figura 5. Resultados de actividad antibacteriana
Figura 6. Lectura de resultados actividad antimicótica
Figura 7. Cajas cuadriplate con control negativo, diferentes concentracionesy
estrías de siembra.
Figura 8. Larvas de Aedes aegypti y ciclo de vida
Figura 9. Obtención de extractos para ensayos
11
17
19
23
23
25
28
30
74
Figura 10. Actividad citotóxica de extractos 74
Figura 11. Actividad larvicida de extractos 75
Figura 12. Actividad antifúngica de extractos contra A. niger 75
Figura 13. Actividad antifúngica de extractos contra M. gypseum 76
Figura 14. Actividad antifúngica de extractos contra T. rubrum 77
Figura 15. Actividad antifúngica de extractos contra T. mentagrophytes 77
Figura 16. Actividad antifúngica de extractos contra A. fumigatus 78
Figura 17. Actividad antifúngica de extractos contra A. flavus 79
Figura 18. Actividad antimicrobiana de los extractos acuosos 79
Figura 19. Fases de separación de linfocitos 80
Figura 20. Placa de revelado con XTT 81
Figura 21. Proceso de percolación de sólidos extraíbles 81
Figura 22. Evaporación a sequedad 82
Figura 23. Cantidad de sólidos extraídos 82
Figura 24. Tamizaje fitoquímico 83
Figura 25. Preparación de cromatoplaca para CCF 83
Figura 26. Placa para investigación de alcaloides 84
Figura 27. Placa cromatográfica vista bajo luz UV 84
1
PARTE I
I.1 INTRODUCCIÓN
Los hongos están ampliamente distribuidos en todo el planeta y prosperan en casi todos
los climas: tropicales, subtropicales, templados y fríos, donde existan los elementos
indispensables para su existencia: materia orgánica y agua. El número de hongos
macroscópicos sobre la tierra es estimado actualmente de unas 140,000 especies, de las
cuales solamente 10% son conocidas por la ciencia (Wasser, 2007).
Los basidiomicetos u hongos macroscópicos son importantes seres en el equilibrio de la
naturaleza. Por un lado, son indicadores de biodiversidad y participan en la degradación
de desechos, y por otro, son una fuente emergente de alimentos sanos a través de
oligoelementos y otros compuestos químicos producidos ecológicamente.
A lo largo de la historia las diferentes culturas y sociedades del mundo han atribuido a
los hongos muchas propiedades. Los hongos comestibles han sido muy apreciados por
su sabor y textura, características que han sido reforzadas por su reconocido valor
alimenticio que ha convertido a muchas especies en un alimento nutricional de primera
clase. En los últimos veinte años se incrementó el interés sobre las especies comestibles
conocidas como hongos de “especialidad”, término aplicado a los hongos distintos al
tradicional y más conocido como hongo botón, Agaricus bisporus, cuya producción
representa más de la mitad de la de todos los hongos en el mundo. Las especies de
hongos de especialidad han incrementado su popularidad y estudios han demostrado en
ellos un contenido de proteína de alta calidad , así como una buena fuente de fibra
dietética, vitaminas B y C y minerales. Sus niveles de lípidos son bajos, pero la relación
entre las grasas insaturadas y las saturadas es alta (Breene, 1990).
Estudios sobre la composición química de varias especies de hongos comestibles han
establecido la necesidad de investigar la actividad biológica de muchos de sus
componentes. Culturas milenarias como la china y japonesa, han atribuido acción
medicinal a los hongos y han sido cultivadoras y consumidoras de algunas especies
particulares de hongos, tales como shiitake (Lentinula edodes), hongo paja (Volvariella
volvacea), hongo ostra (Pleurotus spp.), y enokitake (Flammulina velutipes). Chang en
1996 propuso que algunos hongos comestibles tenían además de su valor nutricional,
efectos saludables y curativos, estimando que alrededor de la mitad de los hongos que
son consumidos como alimento en el mundo podría tener valor nutracéutico y medicinal
e hizo énfasis en la necesidad de más estudios sobre el potencial medicinal de los hongos.
Dado que los datos existentes sobre los hongos no son tan fuertes como los de los
vegetales crucíferos para la prevención y el tratamiento de enfermedades serias como el
cáncer, la hipercolesterolemia, la deficiencia inmune causada por VIH, etc., desde finales
del siglo veinte fue planteada la necesidad de realizar estudios sobre la potencial
capacidad medicinal de estos organismos (Chang, 1996).
2
Los hongos medicinales han establecido historia de su uso en las terapias orientales
tradicionales. La investigación contemporánea ha validado y documentado mucho del
conocimiento ancestral. El campo interdisciplinario de la ciencia que estudia los hongos
medicinales ha florecido y ha ido demostrando crecientemente las propiedades potentes y
únicas de compuestos extraídos de una gran cantidad de especies en las últimas tres
décadas. Actualmente el campo está siendo desarrollado en un área muy fructífera. La
práctica clínica moderna en Japón, China, Corea y otros países asiáticos descansa en
preparaciones derivadas de hongos. La medicina oriental ancestral ha remarcado la
importancia de diversas especies de hongos, principalmente de Ganoderma lucidum
conocido como ling zhi o reishi y de Lentinus edodes o shiitake. Reishi ha sido valorado
tanto por sus propiedades medicinales como espirituales y fue considerado símbolo de
augurio de felicidad y buena fortuna, buena salud y longevidad.
También en Rusia y otros países europeos los hongos han jugado un papel importante
como curativos de enfermedades que afectan a sus poblaciones, especialmente las rurales.
Las especies más importantes en estas áreas rurales han sido Iononotus obliquus,
Fomitopsis officinalis y Fomes fomentarius, las cuales eran usadas en el tratamiento de
enfermedades gastrointestinales, distintas formas de cáncer y asma bronquial, entre otros.
En Mesoamérica existe una larga historia del uso tradicional de hongos curativos,
especialmente especies del género Psilocybe. Hay una gran diversidad de especies de
basidiomicetos que prevalecen en la zona mesoamericana dada la mezcla de condiciones
climáticas que favorecen su crecimiento, a pesar de que la micobiota tropical es muy
pobremente conocida. Según Guzmán, a pesar de que existen grandes tradiciones pre-
hispánicas en el uso de hongos como alimento, medicina y en ceremonias religiosas, éstas
han sido influenciadas por la civilización moderna. Algunas especies comúnmente
comercializadas en los mercados populares de México son también usadas en la medicina
tradicional, tales como Clitocybe gibba, Lactarius indigo, Langermannia gigantea,
Lycoperdon perlatum, Pleurotus djamor y Ustilago maydis, así como varias especies de
poliporos. Describe que hay más de cuarenta tipos de enfermedades que las personas
combaten con hongos, entre ellas: constipación, conjuntivitis, diabetes, diarrea,
disentería, epilepsia, enfermedades de la piel y neumonía (Guzmán 2007).
Con tan basta diversidad en el mundo, los hongos son objeto actualmente de evaluación
tanto por su valor y aceptabilidad nutricional, como por sus propiedades farmacológicas.
Estos constituyen una vasta fuente de potenciales y nuevos productos farmacéuticos.
En la medicina moderna, particularmente, los hongos macroscópicos presentan una
ilimitada fuente de polisacáridos y complejos polisacárido-proteína con propiedades anti-
cáncer e inmunoestimulantes. Muchos, si no todos los basidiomicetos, contienen
polisacáridos biológicamente activos en sus cuerpos fructíferos, en sus micelios y en los
caldos de cultivo.
Las actividades biológicas y medicinales que son actualmente el principal interés de
estudio en estos hongos son sus efectos antitumorales, inmunomoduladores,
antioxidantes, cardiovasculares, anti-hipercolesterolemia, antivirales, antibacterianos,
antiparasitarios, hepatoprotectores y antidiabéticos.
3
En Guatemala gracias a las distintas zonas de vida del país, existe una gran diversidad de
hongos y un consumo heredado por tradición, lo cual es notorio en la población
campesina del altiplano. Sin embargo pocos trabajos de investigación han sido realizados
para conocer la diversidad, distribución, usos, cultivo y mejora de su producción a nivel
comercial. A pesar de que existe un gran depósito de información cultural sobre hongos
en las distintas etnias de Guatemala, éste no ha sido recopilado y debidamente valorado.
Esta información constituye conocimiento científico que debe ser rescatado, desarrollado
y divulgado, para evitar su desaparición y aprovechar este recurso de mejor manera.
I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
I.2.1 Antecedentes (Trabajo, experiencias en Guatemala)
I.2.1.1 Bioensayos de inmunomodulación realizados en Guatemala
Durante la última década, la Unidad de Bioensayos de la Facultad de Ciencias
Químicas y Farmacia, USAC, ha estandarizado y puesto a punto, ensayos in vitro que
han sido aplicados para la investigación del papel inmunomodulador de diversos
extractos vegetales. A través de estos ensayos ha sido posible la estimación del poder
inhibidor o estimulante de muchos extractos de plantas sobre la linfoproliferación
(Alvarez, 2006) y sobre el sistema de complemento (Castillo, Osorio, Paz & Cáceres,
2005). El creciente interés por los hongos macroscópicos en Guatemala nos lleva a la
búsqueda no solamente de sus propiedades nutricionales sino también de sus atributos
como medicinales o como coadyuvantes en el manejo y/o control de enfermedades. Para
ello se hace necesaria la valoración de extractos obtenidos de especies de basidiomicetos
comestibles de Guatemala, aplicando los protocolos de los ensayos de linfoproliferación
y modulación del sistema de complemento.
I.2.1.2 Marco conceptual: La inmunomodulación es la modificación del curso espontáneo
de las reacciones inmunitarias. Las sustancias inmunomoduladoras son aquellas capaces
de promover o deprimir la habilidad de un individuo de establecer una respuesta inmune
o defenderse contra patógenos y tumores. Dichas sustancias competen al estudio de la
inmunofarmacología, la cual explora las alternativas químicas y naturales que representen
una posibilidad terapéutica útil. Su aplicación y desarrollo se debe a la asociación de
desórdenes como alergias, enfermedades infecciosas, enfermedades auto inmunes y
cáncer con un desbalance en el sistema inmune.
Los inmunomoduladores pueden dividirse en dos categorías: los específicos y los no
específicos. Los inmunomoduladores específicos son administrados junto con antígenos
y bajo esta situación son conocidos como adyuvantes. Su función será la de aumentar la
inmunogenicidad específica del antígeno. Los inmunoestimulantes inespecíficos del
antígeno tienen efecto sobre todas las respuestas inducidas durante la fase de actividad
del producto empleado. Los inmunosupresores inespecíficos se aplican simultáneamente
a todas las respuestas inmunitarias mientras dura la acción del producto utilizado; esto se
logra mediante la destrucción de las células linfoides, por irradiación o por inyección de
productos químicos o biológicos (Bomford, 1988).
II.2.1.3 Marco referencial: Desde la antigüedad los hongos desempeñan múltiples e
importantes roles para la humanidad. En países orientales, donde el uso con fines
terapéuticos de hongos comestibles ha sido practicado por generaciones, se ha descrito
4
que los basidiomicetos poseen actividad inmunomoduladora. La importancia de dicha
actividad radica en que estos alimentos pueden ser empleados en el tratamiento o
prevención de enfermedades degenerativas o depresoras del sistema inmune (Masihi,
2002). En los últimos años se ha incrementado el número de publicaciones que destacan
propiedades inmunoestimulantes o acción anti-inflamatoria y anti-cáncer en diversas
especies de hongos macromicetos, validando su uso ancestral. Actualmente existen
productos derivados de estos hongos que han probado su utilidad en la medicina moderna
en condiciones patológicas como enfermedades autoinmunes, hiperlipidemias, tumores
malignos y en el Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA), entre otros
(Mahajna, Yassin, Zaidman, Nevo & Wasser, 2005) (Aung, 2005) (Elisashvili, Asatiani,
Kachlishvili, Kenkebashvili, Khardaziani, Metreveli… Tsiklauri, 2007).
Existe en Guatemala también un gran interés por los hongos; sin embargo, la mayoría de
estudios realizados han sido enfocados en la caracterización taxonómica y mejoramiento
genético, siendo nulos los orientados a la inmunomodulación, ya que este aspecto ha sido
evaluado solamente en plantas.
Seis especies de hongos comestibles, los cuales son comercializados popularmente en los
mercados del país fueron el material de estudio en el presente proyecto. La identidad de
los basidiomicetos recolectados fue confirmada por métodos de identificación
taxonómica del Servicio de Micología de la Escuela de Química Biológica. Tres especies
más fueron estudiadas en un Seminario de Investigación de la misma Escuela.
I.3 OBJETIVOS E HIPOTESIS
I.3.1 Objetivo General
Evaluar la composición química y la actividad inmunomoduladora y biocida de
hongos silvestres y cultivados usados en Guatemala como alimento.
I.3.2 Objetivos Específicos
I.3.2.1 Recolectar seis hongos comestibles (cinco especies silvestres y una
especie cultivada) y determinar su taxonomía.
I.3.2.2 Procesar (secar y esterilizar) en condiciones apropiadas los especímenes
colectados.
I.3.2.3 Establecer bioensayos inmunomoduladores y biocidas para evaluar los
especímenes.
I.3.2.4 Obtener un extracto polar y uno apolar de los especímenes colectados.
I.3.2.5 Caracterizar microscópicamente los basidiomicetos en estudio.
I.3.2.6 Determinar la actividad inmunomoduladora y biocida de los extractos
obtenidos.
I.3.2.7 Caracterizar la composición química y el análisis proximal de los hongos y
extractos.
I.3.2.8 Preparar una Ficha Técnica de cada hongo colectado que incluya los
resultados obtenidos.
I.3.2.9 Difundir los resultados a nivel nacional e internacional.
5
I.3.3 Hipótesis
Por lo menos uno de los basidiomicetos colectados tiene composición química y
actividad biológica interesante para su desarrollo como un alimento funcional novedoso.
I.4 METODOLOGIA
I.4.1 Localización
El presente proyecto fue llevado a cabo en la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia,
de la Universidad de San Carlos en las siguientes instalaciones: Servicio de Micología de
la Escuela de Química Biológica, laboratorio de la Unidad de Bioensayos y Laboratorio
de Productos Naturales (LIPRONAT).
Para la colecta de hongos en estudio, primero se tramitó el permiso para entrar a los
bosques comunales ante las Municipalidades correspondientes y se contactaron a
personas conocedoras y proveedores de hongos de los lugares seleccionados, a quienes se
les retribuye por día de colecta y se les explica el proyecto a fin de poder contar con su
consentimiento para la documentación de sus conocimientos y toma de fotografías.
Para la realización de la colecta de hongos en bosques, se utilizo el protocoló de muestreo
oportunista (Matta 1,999), una vez colectados los ejemplares se empacaron en papel
parafinado y luego se transportaron en hieleras en condiciones de refrigeración al
laboratorio. Los ejemplares colectados en bosques se utilizaron con el único fin de
documentar la presencia de la especie en el lugar, dada la cantidad requerida en peso
seco, no es posible obtenerla en las colectas de campo.
Para la obtención de los hongos utilizados para los análisis del proyecto, se recurrió a los
vendedores de hongos locales, los cuales se contactaron en los mercados Municipales de
cada región, los cuales proporcionaron los volúmenes requeridos.
Se procedió a describir las características macro y microscópicas de los hongos
adquiridos en los mercados. Se midieron las estructuras del píleo, himenio y estípite y se
anotaron las coloraciones y reacciones químicas de los tejidos fúngicos ante diferentes
reactivos específicos (Cifuentes 1,984, Kornerup 1,989).
Las descripciones realizadas se compararon con la bibliografía correspondiente, para
identificar correctamente los hongos colectados (Bessette 1,997 y 2,000, Calonge 1,998,
García, et al 1,998, Phillips 1,991, Læssøe, et al 1,996).
Preservación de los hongos colectados
Los hongos ya descritos se partieron y colocaron en deshidratadoras a 65°C durante tres
días, una vez secos se coloca una muestra (3 a 5 ejemplares) en bolsas de polipapel,
identificadas con el nombre del hongo, número de referencia, lugar y fecha de colecta,
además de su respectiva descripción y se procede a su incorporación en la Micoteca de
Macrohongos de Guatemala “Lic. Rubén Mayorga Peralta”, de la Unidad de
Biodiversidad, Tecnología y Aprovechamiento de Hongos –BioTAH-, del Departamento
6
de Microbiología de la Escuela de Química Biológica de la Facultad de Ciencias
Químicas y Farmacia de la Universidad de San Carlos de Guatemala.
Los hongos restantes se colocaron en bolsas plásticas selladas y rotuladas para ser
utilizadas en la realización de los ensayos de laboratorio.
Localidades de muestreos de hongos
Se seleccionaron los lugares donde los hongos se encuentran con más abundancia y fácil
accesibilidad con los pobladores de la región, siendo estos Ixchiguán, San Marcos, San
Juan Comalapa, Chimaltenango, San Pedro Carcha, Alta Verapaz, San Raymundo,
Guatemala y Técpan, Chimaltenango.
Los ejemplares de Neolentinus ponderosus, fueron cultivados y donados por la Unidad
de Biodiversidad, Tecnología y Aprovechamiento de Hongos –BioTAH, del
Departamento de Microbiología de la Escuela de Química Biológica.
Cantharellus lateritius fue colectado en el municipio de San Raymundo, Departamento
de Guatemala, latitud 14° 45’ 56” N; longitud, 90º 35’ 46” O y 1,570 MSNM,
Temperatura promedio de 24°C.
Armillariella polymyces fue colectado en el municipio de San Pedro Carchá, Alta
Verapaz, latitud 15° 28’ 39” N; longitud, 90° 18’ 38” O y 1,282 MSNM, con un rango de
temperatura de 13°C mínima y 24°C máxima.
Boletus edulis fue adquirido en la cooperativa de Ixchiguán, Depto. de San Marcos,
latitud 15° 09’ 51” N; longitud, 91º 56’ 00” O y 3,200 MSNM. Registra un rango de
temperatura de 8-20°C.
Neolentinus ponderosus proviene del municipio San Mateo Ixtatán, Huehuetenango
latitud 15° 49’ 49” N; longitud, 91º 28' 35” O y 2,540 MSNM y un rango de temperatura
de 9-22°C.
Lactarius deliciosus del municipio de San Juan Comalapa, Chimaltenango, latitud 14°
44’ 24” N; longitud, 90º 53’ 15” O y 2,115 MSNM, temperatura de 13-25°C.
Amanita garabitoana de Tecpán Guatemala, Chimaltenango, latitud 14º 45’ 37” N;
longitud, 90º 59’ 30” O y 2,286 MSNM, rango de temperatura de 12.6-24.8°C.
I.4.2 Variables
I.4.2.1 Variables dependientes: composición química y actividad biológica
I.4.2.2 Variables independientes: basidiomicetos comestibles de Guatemala
I.4.3 Indicadores
I.4.3.1 Publicaciones con la información química y biológica de las especies de
basidiomicetos estudiadas
7
I.4.3.2 Colección de especímenes, registrados y depositados en Micoteca Lic. Rubén
Mayorga Peralta
I.4.3.3 Seis extractos etanólicos de las especies de hongos llevados a sequedad
I.4.3.4 Seis extractos acuosos de las especies estudiadas
I.4.3.5 Presencia de metabolitos secundarios por ensayos fitoquímicos
I.4.3.7 Determinación de la actividad biológica por bioensayos
I.4.3.9 Fichas técnica de las seis especies evaluadas
I.4.4 Estrategia metodológica
I.4.4.1 Recopilar información relevante y elaborar fichas técnicas de las especies
estudiadas para difundir la información, conservar material de referencia para su
utilización en otros sectores, tanto académicos como empresariales.
I.4.4.2 Colectar material micológico en su sitio de origen, identificarlo, secarlo y
almacenarlo adecuadamente para garantizar resultados confiables y
reproducibles.
I.4.4.2 Preparar extractos polares y apolares para identificar la presencia de metabolitos
secundarios por ensayos fitoquímicos y estudiar su actividad biológica.
I.4.4.3 Establecer los procedimientos analíticos para determinar la actividad
inmunomoduladora de linfoproliferación y del sistema de complemento en las
especies estudiadas.
I.4.4.4 Capacitar personal profesional en los procedimientos analíticos y bioensayos
para evaluar la actividad inmunomoduladora y su composición química.
I.4.5 Métodos
I.4.5.1 Universo: Hongos comestibles de Guatemala.
I.4.5.2 Muestra: Extractos etanólicos y acuosos de los hongos comestibles Armillariella
polymyces, Boletus edulis, Cantharellus lateritius, Neolentinus ponderosus, Lactarius
deliciosus y Amanita garabitoana.
I. 4.5.3 Extacción contínua por percolación: La percolación consiste en hacer pasar el
disolvente a través de la materia seca hasta su extracción completa. La percolación
simple comprende la extracción exhaustiva de la droga con el disolvente siempre
renovado. En pequeña escala, la percolación se realiza en aparatos denominados
percoladores los cuales son de cuerpo cilíndrico o cónico y están provistos de un grifo en
la parte inferior para regular el flujo de solvente.
I.4.5.3.1 Equipo y materiales
Algodón
Balanza semianalítica
Erlenmeyers
Papel filtro
Percolador de vidrio o acero inoxidable
Vaso de precipitar
8
I.4.5.3.2 Procedimiento
En un percolador previamente limpio y seco, colocar un poco de algodón en
la parte inferior y papel filtro cortado de acuerdo al diámetro del percolador.
Pesar la cantidad de materia vegetal a utilizar de acuerdo al tamaño del
percolador.
Humedecer el material vegetal con el disolvente adecuado para la extracción,
utilizando un vaso de precipitar.
Transferir todo el material al percolador y agregar disolvente hasta cubrir el
material vegetal (hasta una pulgada sobre el nivel de materia vegetal).
Dejar reposar el tiempo necesario para llevar a cabo la extracción lo que
dependerá la cantidad de la materia vegetal (24-48 horas).
Abrir la llave de la parte inferior y dejar gotear el líquido a una velocidad
adecuada.
Recoger el líquido en un erlenmeyer e ir añadiendo suficiente disolvente
extra, según se requiera, hasta obtener el volumen de disolvente agregado al
inicio.
El material sólido que ha quedado, se presiona fuertemente y el líquido
obtenido se añade al percolado obtenido anteriormente.
La solución obtenida puede utilizarse para producir extractos o tinturas. Para
preparar extractos, el líquido obtenido (menstruo) se concentra en un
rotavapor o en un equipo similar y se repite la operación hasta que se agote la
droga con el disolvente recuperado; las tinturas solo se ajustan a volumen en
función de la concentración deseada (1:5, 1:8 o 1:10).
I.4.5.4 Concentración por rotavapor
La concentración representa la etapa siguiente al proceso de extracción. El proceso de
concentración busca aumentar el contenido de sólidos totales en el extracto con la
finalidad de alcanzar un determinado contenido del residuo seco, producir extractos
blandos, como etapa preliminar en la producción de extractos duros. Los extractos
también pueden ser concentrados para la extracción en contracorriente con disolventes no
miscibles, con miras a la fabricación de extractos purificados o el aislamiento de
sustancias puras.
El equipo necesario para la concentración con recuperación de disolventes es el
evaporador rotatorio, cuyo funcionamiento se basa en los siguientes principios:
colocación de la muestra en un balón de evaporación a 40˚C que rota a una velocidad
constante produciendo una película que aumenta la superficie de evaporación, generación
de vacío entre 30 y 300 mbar con la ayuda de una bomba sin aumentar la temperatura, y
condensación del vapor del disolvente en el refrigerante conectado a un sistema de
enfriamiento que luego es colectado en un balón.
I.4.5.4.1 Materiales y equipo
Balón de 1000 mL
Disolvente (etanol, metanol, diclorometano, hexano, pentano, etc.)
9
Rotavapor (Balón de evaporación, condensador, bomba de vacío, refrigerante
y balón de colecta)
Sistema de enfriamiento o circulación de agua
I.4.5.4.2 Procedimiento
Verificar que estén conectadas todas las conexiones eléctricas.
Colocar el balón colector y fijarlo con la llave respectiva.
Agregar agua al baño de calentamiento.
Encender el baño y mantener la temperatura entre 50-60˚C. Dependiendo del
equipo puede haber pérdidas de 10-20˚C entre el baño de calentamiento y el
interior del balón de evaporación, en todo caso el balón de evaporación no
deberá tener una temperatura mayor de 40˚C.
Revisar que la llave de alimentación del refrigerante esté cerrada.
Llenar el balón con el percolado hasta la mitad.
Colocar el balón con la muestra y sujetar al vástago con la llave
correspondiente.
Encender el botón que permite girar el balón que contiene la muestra a una
revolución adecuada (50 a 80 revoluciones).
Conectar un sistema de enfriamiento (bomba de agua) y agregar hielo a la
hielera. Dejar que enfríe unos cinco minutos.
Mantener siempre el refrigerante frío cambiando regularmente los hielos.
Encender la bomba de vacío durante el tiempo necesario para iniciar la
destilación.
Cuando haya iniciado la destilación, apagar la bomba de vacío.
Encender la bomba de vacío cuantas veces sea necesario hasta que se haya
agotado el disolvente del balón de evaporación o ya no destile ningún líquido,
lo que querrá decir que el vacío de nuestra bomba no es suficiente para
vaporar la mezcla de disolventes contenida en el balón de evaporación.
I.4.5.5 Ensayo hemolítico de actividad sobre la vía alterna del complemento
El sistema de complemento está compuesto por aproximadamente treinta proteínas que
interaccionan entre sí y que amplifican la respuesta humoral. Su activación y fijación a
microorganismos constituye un mecanismo efector del sistema inmune, que facilita la
eliminación del antígeno, genera una respuesta inflamatoria. Este sistema está compuesto por cuatro unidades funcionales: la vía clásica, la vía alterna, la unidad de amplificación y la ruta terminal. Las primeras dos son las principales vías de activación, y funcionan por
interacción de proteínas. La determinación de la activación del complemento por la vía
clásica y alterna se basa en la hemólisis de eritrocitos de carnero sensibilizados con
anticuerpos de conejo anti-eritrocitos de carnero, al activarse este sistema en donde los
eritrocitos actúan como activadores y células blanco. Tras esta activación se produce la
lisis de eritrocitos liberándose hemoglobina, la cual es medida y utilizada como parámetro
en la medida de la actividad del complemento. En la vía alterna se debe inactivar la vía
clásica utilizando ácido etilenglicol tetra-acético (EGTA) como agente quelante de calcio
(necesario para su activación).
10
Figura 1. Cascada del sistema de complemento
1.4.5.5.1 Equipo y material
Autoclave
Balanza Analítica
Campana de flujo laminar
Congelador
Centrifuga
Hemocitómetro de Neubauer
Incubadora
Lector de ELISA
Refrigeradora
Espectrofotómetro
Placas de microtitulación estériles de 96 pozos, fondo en U con tapadera
Pipetas de 10uL, 50uL, 100uL, 200uL, 1000uL
Pipetas Pasteur
Tubos de ensayo
Tubos Eppendorf de 0.5 y 2.0 mL
Tubos de 50 mL
Tubos plásticos de 15 mL
Mezcla de suero humano normal (MSH)
Mezcla de suero humano inactivado
Droga Patrón (Ciclosporina, Levamisol o Difur)
Solución salina
Agua destilada
Agua desmineralizada
Solución Alsever
11
Eritrocitos de conejo y de carnero
Anticuerpo contra eritrocitos de carnero (AMBOCEPTOR) Dilución 1:100
Amortiguador salino de veronal concentrado 5 veces (VSB), como solución
madre
VSB^ (no aditivos)
VSB+2 (0.5mM de Mg+2 y 0.15 mM de Ca+2)
EGTA-VB (2.5 mM de Mg+2 y 8mM de etilenglicol-bis(beta-aminoetileter)-
N,N,N’,N’-ácido tetraacético (EGTA)).
Agua Milli-A
I.4.5.5.2 Procedimiento
Lavado de eritrocitos
Mezclar 4 mL de los eritrocitos con 6 ml de solución salina en un tubo de
plástico de 15 mL.
Centrifugar a 2500 rpm durante 5 minutos.
Eliminar el sobrenadante utilizando una pipeta, resuspender el botón en 10
mL de solución salina y volver a centrifugar a 2500 rpm durante 5 minutos.
Repetir el proceso anterior. Tras la tercera centrifugación guardar el botón de
células en hielo.
Preparación de la suspensión de eritrocitos
Resuspender el botón de células (500 µL) en 9.5ml de EGTA-VB en un tubo
de 50 mL, mantener en hielo.
Mezclar 100 µL de esta suspensión con 4.9 ml de agua desmineralizada en un
tubo de 15 mL.
Determinar la densidad óptica a 410 nm. La concentración de eritrocitos debe
ser ajustada a 4 x 108 células/mL, cuya densidad óptica es de 0.522;
utilizando la siguiente fórmula:
Mantener la suspensión eritrocítica en hielo.
Volumen de EGTA-VB = (V inicial) x [(OD medida – 0.522) / 0.522]
Dilución de las muestras en placas de microtitulación en U
Agregar 50 μL de EGTA-VB a los pozos en las filas B a G.
Agregar 100 μL de muestra en solución en triplicado a la fila A.
Transferir 50 μL de la solución en la fila A a la fila B y después mezclar.
Transferir 50 μL de la fila B a la siguiente fila. Repetir ester procedimiento
hasta la fila G.
Descartar 50 μL de la mezcla final en la fila G.
Preparación de controles de actividad hemolítica
Añadir 50 μL de EGTA-VB a los pocillos H1 a H3. H1-H3 será la actividad
del extracto. H4-H6 será el blanco (suero inactivado).
Añada 100 μL de EGTA-VB a los pocillos H7-H9 (0% de hemólisis).
12
Añadir 100 μL de agua desionizada a los pocillos H10-H12 (100% de
hemólisis).
Preparación de la dilución del suero y preincubación
Añadir 500 μL de la solución de suero inactivado con 500 µl de EGTA-VB.
Agregar 25 μL de esta solución a A3-G3, A6-G6,A9-G9,A12-G12 y H4-H6.
Mezclar 1 mL de suero humano con 1 mL de EGTA-VB. Agregar 25 μL de
esta solución a A1-H1, A2-H2, H3, A4-G4, A5-G5, A7-G7, A8-G8, A10 –
G10 y A11-G11.
Cubrir la placa y preincubar a 37º C durante 30 minutos.
Incubación
Añadir 25 μL de la suspensión de eritrocitos de conejo a cada pozo.
Incubar a 37º C durante 30 minutos.
Medición de la hemólisis
Centrifugar las microplacas a 2500 rpm, durante 2 minutos.
Añadir 200 μL de agua desmineralizada a los pocillos de otra placa de fondo
plano.
Medir la densidad óptica a 405 nm en un lector de ELISA.
Cálculos
Determinación de la actividad sérica
(% lisis) = 100 X Media OD405 (H1, H2, H3) – Media OD405 (H4, H5, H6)
Media OD405 (H10, H11, H12) – Media OD405 (H7, H8, H9)
Actividad inhibidora de la muestra respecto al control
Ejemplo para la concentración más alta de la muestra 1, A1, A2 y A3. Valores de OD405.
(Media de A1-A2) – A3 = Problema – Blanco del problema
(Media de H1-H3) – (media de H4 – H6) = Control – Blanco, será el 100% de Actividad.
% Inhibición = 100 – (Problema – Blanco problema/Control – Blanco) 100
I.4.5.6 Ensayo hemolítico para evaluar actividad del complemento en la vía clásica
El sistema de complemento está compuesto por aproximadamente treinta proteínas que
interaccionan entre sí y que amplifican la respuesta humoral. Su activación y fijación a
microorganismos constituye un mecanismo efector del sistema inmune, que facilita la
eliminación del antígeno, genera una respuesta inflamatoria. Este sistema está compuesto por cuatro unidades funcionales: la vía clásica, la vía alterna, la unidad de amplificación y la ruta terminal. Las primeras dos son las principales vías de activación, y funcionan por
interacción de proteínas. La determinación de la activación del complemento por la vía
clásica y alterna se basa en la hemólisis de eritrocitos de carnero sensiblizados con
anticuerpos de conejo anti-eritrocitos de carnero, al activarse este sistema en donde los
13
eritrocitos actúan como activadores y células blanco. Tras esta activación se produce la
lisis de eritrocitos liberándose hemoglobina, la cual es medida y utilizada como parámetro
en la medida de la actividad del complemento. En la vía alterna se debe inactivar la vía
clásica utilizando ácido etilenglicol tetraacético (EGTA) como agente quelante de calcio
(necesario para su activación).
I.4.5.6.1 Equipo y material
Autoclave
Balanza Analítica
Campana de flujo laminar
Congelador
Centrifuga
Hemocitómetro de Neubauer
Incubadora
Lector de ELISA
Refrigeradora
Espectrofotómetro
Placas de microtitulación estériles de 96 pozos, fondo en U con tapadera
Pipetas de 10uL, 50uL, 100uL, 200uL, 1000uL
Pipetas Pasteur
Tubos de ensayo
Tubos Eppendorf de 0.5 y 2.0 mL
Tubos de 50 mL
Tubos plásticos de 15 mL
Mezcla de suero humano normal (MSH)
Mezcla de suero humano inactivado
Droga Patrón (Ciclosporina, Levamisol o Difur)
Solución salina
Agua destilada
Agua desmineralizada
Solución Alsever
Eritrocitos de conejo y de carnero
Anticuerpo contra eritrocitos de carnero (AMBOCEPTOR) Dilución 1:100
Amortiguador salino de veronal concentrado 5 veces (VSB), como solución
madre
VSB^ (no aditivos)
VSB+2 (0.5mM de Mg+2 y 0.15 mM de Ca+2)
EGTA-VB (2.5 mM de Mg+2 y 8mM de etilenglicol-bis(beta-aminoetileter)-
N,N,N’,N’-ácido tetraacético (EGTA)).
Agua Milli-A
14
I.4.5.6.2 Procedimiento
Preparación de los eritrocitos sensibilizados con el anticuerpo
Lavado
Mezclar 2 mL de los eritrocitos con 8 mL de solución salina en un tubo de
plástico de 15 mL.
Centrifugar a 2500 rpm durante 5 minutos.
Eliminar el sobrenadante utilizando una pipeta, resuspender el botón en 10
mL de solución salina y volver a centrifugar a 2500 rpm durante 5 minutos.
Repetir el proceso del paso c. Tras la tercera centrifugación guardar el botón
de células en hielo.
Preparación de la suspensión de eritrocitos
Resuspender el botón de células (500 µL) en 9.5ml de VSB+2 en un tubo de
50 mL, mantener en hielo.
Mezclar 100 µL de esta suspensión con 4.9 mL de agua desmineralizada en
un tubo de 15 mL.
Determinar la densidad óptica a 410 nm. La concentración de eritrocitos debe
ser ajustada a 4 x 108 células/mL, cuya densidad óptica es de 0.522;
utilizando la siguiente fórmula:
Volumen de VSB+2 = (V inicial) x [ (OD medida – 0.522) / 0.522]
Mantener la suspensión eritrocítica en hielo.
Sensibilización de los eritrocitos (ShEA)
Mezclar 1 mL de la dilución1:100 Amboceptor con 7 ml de VSB+2, en un
tubo de 50 ml.
Añadir 8 mL de la suspensión de eritrocitos e incubar a temperatura ambiente
durante 10 minutos.
Centrifugar a 2500 rpm durante 5 minutos. Eliminar el sobrenadante y
resuspender el botón en 16 mL de VSB+2.
Mantener la solución en hielo.
Dilución de las muestras en placas de microtitulación en U
Agregar 50 μL de VSB +2 a los pozos en las filas B a G.
Agregar 100 μL de muestra en solución en triplicado a la fila A.
Transferir 50 μL de la solución en la fila A a la fila B y después mezclar.
Transferir 50 μL de la fila B a la siguiente fila. Repetir ester procedimiento
hasta la fila G.
Descartar 50 μL de la mezcla final en la fila G.
15
Preparación de controles de actividad hemolítica
Añadir 50 µL de VSB+2 a los pocillos H1 a H3. H1-H3 será la actividad del
extracto. H4-H6 será el blanco (suero inactivado).
Añada 100 µL de VSB+2 a los pocillos H7-H9 (0% de hemólisis).
Añadir 100 µL de agua Milli-A a los pocillos H10-H12 (100% de hemólisis).
Preparación de la dilución del suero y preincubación
Añadir 50 µL de la solución de suero inactivado (63 µL de suero inactivado
+ 5 mL de VSB+2) a los pocillos H4-H6 y blancos de las muestras.
Mezclar 125 µL de extracto con 10 mL de VSB+2 y añadir 50 µL a los
pocillos control y muestras problema(suero mas extracto).
Cubrir la placa y preincubar a 37º C durante 30 minutos.
Tabla 1. Dilusión del suero
Cantidad de
placas
Dilución de Suero Activo Dilución de Suero Inactivo
Suero Activo VSB++
Suero
Inactivo
VSB++
2 150 uL 6 mL 63 uL 5 mL
3 250 uL 10mL 94.5 uL 7.5 mL
4 375 uL 15 mL (alcanza hasta
para 5 placas)
126 uL 10 mL
5 500 uL 20 mL 157.5 uL 12.5 mL
6 625 uL 25 mL 189 uL 15 mL (alcanza hasta
para 8 placas)
7 750 uL 30 mL 220.5 uL 17.5 mL
8 875 uL 35 mL 252 uL 20 mL
9 1000 uL 40 mL 283.5 uL 22.5 mL
10 1125 uL 45 mL 315 uL 25 mL
11 1250 uL 50 mL 346.5 27.5 mL
12 1250 uL de suero activo + 50
mL de VSB++
alcanzan hasta
para 17 placas
346.5 uL de suero inactivo +
27.5 mL de VSB++
alcanzan
hasta para 15 placas
Incubación
Añadir 50 µL de los eritrocitos sensibilizados (ShEA) a cada pocillo
Incubar a 37º C durante 60 minutos.
Medición de la hemólisis
Centrifugar las microplacas a 2500 rpm, durante 2 minutos.
Añadir 200 µL de agua desmineralizada a los pocillos de otra placa de fondo
plano.
16
Medir la densidad óptica a 405 nm en un lector de ELISA.
Cálculos
Determinación de la actividad sérica
(% lisis) = 100 X Media OD405 (H1, H2, H3) – Media OD405 (H4, H5, H6)
Media OD405 (H10, H11, H12) – Media OD405 (H7, H8, H9)
Actividad inhibidora de la muestra respecto al control
Ejemplo para la concentración más alta de la muestra 1, A1, A2 y A3. Valores de OD405.
(Media de A1-A2) – A3 = Problema – Blanco del problema
(Media de H1-H3) – (media de H4 – H6) = Control – Blanco, será el 100% de Actividad.
% Inhibición = 100 – (Problema – Blanco problema/Control – Blanco) 100
Cálculo de la CI50
Se realiza la gráfica de % de inhibición versus Log concentración, con la recta de
regresión obtenida (al menos 4-5 valores significativos) se extrapola el valor del 50% de
inhibición para obtener la CI50.
I.4.5.7 Ensayo de linfoproliferación
El ensayo está basado en la ruptura de una sal de tetrazolio amarilla (XTT) que es
reducida a un producto coloreado y soluble, por la actividad enzimática mitocondrial
presente en células metabólicamente activas. Esto es debido desdoblamiento del XTT
incorporado por los linfocitos viables, tratados con dos lectinas de actividad conocida
(ConA y PHA), que se libera produciendo tal compuesto cromógeno; el cual puede ser
directamente cuantificable mediante la lectura de absorbancia en un espectrofotómetro de
placas a 450 nm, o un lector de ELISA; el aumento de absorbancia es proporcional al
número de linfocitos viables. Así mismo la linforpoliferación puede ser medida al
realizar un conteo directo de los linfocitos presentes en la suspensión de células por
unidad de volumen, en donde se considera como un resultado positivo al aumento o
disminución del recuento comparado con la lectina y un control negativo.
I.4. 5.7.1 Equipo y material
Campana de Flujo laminar
Centrífuga
Espectofotómetro de placas o lector de ELISA
Hemocitómetro de Neubauer
Incubadora 37ºC
Placas estériles de 96 pozos, de fondo plano, con tapadera
Pipetas de, 50 uL, 100 uL, 200 uL
Pipetas Pasteur
Tubos de ensayo
Tubos Vacutainer con EDTA de 5 mL
Tubos de 50 mL
17
Sangre o suspensión de linfocitos
Histopaque
Sal de tetrazolio (XTT ó Hidrato ácido de 3`-[1-(fenilaminocarbonil)-3,4-
tetrazolio]- bis (4-metoxi-6nitro( bencen-sulfónico de sodio)
Lectinas de ConA y PHA
Metosulfato de phenacina (PMS)
Dimetil formamida
Solución de Türk
Acido acético
Cristal violeta
Medio de cultivo Roswell Park Memorial Institute (RPMI)
RPMI-FBS (medio de cultivo más 10 % de suero fetal bovino)
Buffer Salino de Fosfatos (PBS)
Gentamicina
EDTA (sal disódica o tripotásica del ácido etilendiaminotetraacético)
Figura 2. Suero Fetal Bovino
I.4.5.7.2 Procedimiento
I.4.5.7.2.1 FASE I: Preparación de soluciones y suspensiones:
Preparación de PBS
Agregar un sobre de PBS en 1000 mL de agua destilada, usando un balón
aforado. Homogeneizar.
Chequear que el PBS tenga un pH de 7.4 antes de meterlo al autoclave.
Meter al autoclave el PBS preparado.
18
Preparación de RPMI-FBS: cada placa de 96 pozos requiere 7 mL de RPMI-FBS, el cual
se suplementa así:
Descongelar y atemperar suero fetal bovino.
300 mg de L-glutamina + 1000 mL de RPMI-1640 (puede que haya RPMI ya
suplementado con L-glutamina) .
Por cada 90 mL de RPMI suplementado agregar 10 mL de suero fetal bovino
(FBS).
Filtrar en un filtro de 0.20um.
Dilución de Extractos
Para cada placa de 96 pozos se emplea alrededor de 1.5 mL de RPMI-FBS.
Preparar RPMI-FBS de la siguiente forma:
300 mg de L-glutamina + 1000 mL de RPMI-1640 (puede que haya RPMI ya
suplementado con L-glutamina).
Por cada 90 mL de RPMI agregar 10 mL de suero fetal bovino (FBS).
Filtrar el RPMI-FBS en un filtro de 0.20um antes de diluir los extractos.
Pesar 1mg extracto por cada 1 ml RPMI-FBS que se vaya a emplear (es decir,
relación 1:1).
Mezclar el extracto con el RPMI-FBS guardando siempre la relación 1mg
extracto/1 mL RPMI-FBS.
Sellar con parafilm totalmente, previniendo filtraciones, y luego sonicar 45
minutos
Filtrar extracto diluido en un filtro de 0.20um por duplicado.
Sellar con parafilm. Almacenar el restante en refrigeración y verificar
periódicamente ausencia de contaminación.
Preparación de Solución de Trabajo de Lectina (Mitógeno): para cada placa de 96 pozos
se requiere 5 mL de solución de trabajo de lectina.
Preparación de solución Stock de Lectina:
9 mg de lectina (Phaseolus vulgaris) + 1mL de RPMI sin FBS.
Preparación de solución de trabajo de Lectina:
Mezclar 100 uL de Solución Stock de Lectina + 9 mL de RPMI-FBS.
Filtrar solución de trabajo de Lectina en un filtro de 0.20um (esta solución
debe tener una concentración final de 5ug/mL).
Preparación de Suspensión de Linfocitos
Separación de linfocitos:
Extraer al menos 10 mL de sangre con EDTA a un individuo sano. 10 mL de
sangre con EDTA podrían ser suficientes para llenar hasta 3 cajas de 96
pozos.
En un tubo cónico estéril de 50 mL agregar Histopaque y enseguida agregar
SUAVEMENTE sangre con EDTA en relación 1:1. Pueden ser 5mL de
Histopaque + 5 mL de sangre
NO MEZCLAR
Centrifugar 30’ a 1800 rpm (4’ en frío y 26’ a temperatura ambiente)
19
Usando pipeta Pasteur estéril con bulbo, extraer la capa de mononucleares
que queda entre el plasma y el Histopaque.
Colocar los mononucleares en un tubo nuevo estéril de 15 mL, con cuidado
de no aspirar mucha cantidad de plasma.
Procurar obtener de 2 a 3 mL de mononucleares.
Figura 3. Separación de la capa de linfocitos con Histopaque
Lavado de linfocitos:
Agregar a los mononucleares obtenidos, 3 mL de RPMI y homogenizar
suavemente con pipeta estéril.
CON MUCHO CUIDADO, mezclar los linfocitos con el RPMI.
Centrifugar a 1400 rpm por 10’ (2’ en frío y 8’ a temperatura ambiente).
Decantar sobrenadante.
Asépticamente, agregar 2 ml de RPMI, mezclar suavemente con una pipeta
Pasteur estéril.
Agregar RPMI hasta 15 mL.
Mezclar con cuidado y repetir lavado por 2 veces más. A la última
centrifugación, decantar sobrenadante, agregar 2 ml de RPMI-FBS estéril,
mezclar suavemente.
Realizar recuento de blancos haciendo dilución de 1:10.
Calcular el número de linfocitos por mL así:
Linfocitos/mL= # células en 4 cuadros X FD X 1 X 104
Ajustar la concentración de linfocitos a 5X106 cel/mL. En cada cuadrante, lo
ideal es contar 125 ± 5 para alcanzar la concentración de 5X106 cel/mL, o
bien trabajar a doble o triple de esta concentración
20
I.4.5.7.2.2 FASE II: Reto linfoproliferativo
Llenado de placa: usar placas de 96 pozos, estériles y de fondo plano, las cuales se llenan
de la síguete forma:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H
Fila A1→A12: 100 uL de extracto de un mismo hongo.
Filas B→G: 50 uL de RPMI-FBS filtrado (estéril).
H1→H6: 50 uL de RPMI-FBS.
H7→H12: 100 uL de RPMI-FBS.
Transferir 50 uL del extracto de las filas A →G, recordar homogeneizar en
cada pozo antes de transferir.
Descartar 50 uL de toda la fila G.
A TODA LA PLACA: agregar 50 uL de solución de trabajo de Lectina
(solución de trabajo ya filtrada).
Agregar 50 uL de suspensión de Linfocitos:
Filas A →G en las columnas: 1-2, 4-5, 7-8, 10-11
H1→H6
50 uL de RPMI-FBS a las Filas A →G en las columnas: 3, 6, 9 y 12.
Sellar placas con parafilm.
Homogeneizar la placa con golpes suaves.
Incubar placas a 37ºC en microaerofilia, por 4 días.
I.4. 5.7.2.3 FASE III: Revelado de placa
Usando microscopio de luz invertida:
Los pozos sin linfocitos deben estar límpidos.
Los pozos sin linfocitos deben estar turbios y con agregados celulares
Preparar 5ml de solución de trabajo de XTT por cada placa:
Solución Stock de XTT:
Pesar 1mg de XTT por cada 1 mL de RPMI (1mg/1mL)
Mezclar. Proteger de la luz envolviendo en papel aluminio.
Preparar solución Stock de PMS protegiendo siempre de la luz:
Pesar 1.53 mg de PMS por cada 1 mL de agua destilada (esto equivale a
una concentración de 5 mM).
Mezclar, el color adecuado es amarillo. Proteger de la luz envolviendo en
papel aluminio.
21
Preparar solución de trabajo de XTT:
5mL de solución XTT +25 uL de solución de PMS, filtrar en filtro de
0.20um
Mezclar y proteger de la luz
Mezclar los pozos de la placa suavemente Y SIN FORMAR BURBUJAS.
A toda la placa: agregar 50 uL de solución de trabajo de XTT.
Incubar a 37ºC por 2H, protegiendo toda la placa de la luz.
Si se usa RPMI sin rojo de fenol, todos los pozos que contienen linfocitos
deben virar a tonos naranja.
Transcurridas las 2H de incubación, leer las placas a longitud de onda de 450
nm.
Leer una placa idéntica a la empleada en el ensayo la cual servirá de blanco.
Interpretar resultados.
I.4.5.8 Tamizaje de la actividad antibacteriana in vitro
Las bacterias son organismos de vida libre que tienen curvas de crecimiento máximo de
24 a 48 horas en medios artificiales específicamente diseñados. El tamizaje de la
actividad antibacteriana consiste en poner de manifiesto la inhibición del crecimiento de
una bacteria determinada en condiciones estándar con una concentración previamente
determinada como punto de corte (500-1000 mg/mL) de un extracto, fracción o
compuesto obtenidos de una droga vegetal.
I.4.5.8.1 Materiales y equipo
Agar Muller Hinton
Asa de nicromo en argolla
Autoclave
Cajas de petri simples
Caldo tripticasa soya
Campana bacteriológica
Campana bacteriológica con flujo laminar
Etanol al 50%
Etanol al 70%
Incubadora a 36°C
Mechero
Pipetas automáticas
Puntas amarillas de 200 L
Puntas azules de 1000 L
Plantilla para siembra
Refrigeradora
Solución salina
Tubos con tapón de rosca de 15 mL
22
I.4.5.8.2 Procedimiento
Disolución del extracto
En la balanza analítica pesar 30 mg de extracto a ensayar y disolverlo en 3
mL de etanol al 50% (hacer cálculos para determinar el volumen de extracto
necesario para realizar el ensayo).
Agitar en un vortex hasta que este bien disuelto. Si no se disuelve utilizar un
sonicador. En el caso de extractos con disolventes apolares agregar 25uL de
dimetilsulfoxido (DMSO).
Filtrar el extracto.
Filtración de extracto
Trabajar la filtración en la campana de flujo laminar (previamente limpia, ver
PEO de limpieza de campana).
Aspirar el extracto utilizando una jeringa estéril de 5 mL.
Desenroscar la aguja y enroscar en la jeringa el filtro de 0.45 um de diámetro.
En un frasco estéril recibir el filtrado haciendo pasar la disolución del
extracto por el filtro lentamente.
Preparación de Agar-Planta
Preparar tubos con 9.0 mL de agar Mueller Hinton (dos tubos por cada
extracto o compuesto a trabajar). Esterilizar a 121°C durante 15 min, dejar
enfriar a 50°C.
En una caja de petri simple agregar 1.0 mL de la solución del extracto filtrado
(este debe tener una concentración de 10 mg/mL) y los 9 mL de agar Mueller
Hinton. Tapar la caja y homogenizar con movimientos circulares. La
concentración final que se obtiene es de 1 mg/mL.
Dejar solidificar e incubar a 36°C por 24 h, para comprobar esterilidad.
Guardar en refrigeración hasta el momento de usar.
Preparación del inóculo
Purificar el microorganismo a ensayar inoculándolo en una caja de petri con
agar tripticasa soya, incubar 36°C durante 24 h.
Inocular una asada del cultivo puro microbiano en un tubo con 5.0 mL de
caldo Tripticasa soya, incubar a 36°C durante 24 h.
Diluir 0.05 mL de la suspensión anterior en 4.95 mL de solución salina estéril
al 0.85% (dilución 1:100).
Demostración de la actividad antibacteriana
Inocular en las cajas con agar-Planta una asada de cada uno de los
microorganismos siguiendo el patrón de la plantilla. Hacer cuatro repeticiones
por microorganismo. Dejar reposar durante 5-10 min e incubar a 36°C
durante 24 h.
Utilizar como control negativo 9 mL de agar Muller Hinton mezclándole 1
mL de etanol al 50%.
23
Figura 4. Placa de inoculación
Interpretación de resultados
Actividad negativa: crecimiento homogéneo a lo largo del inóculo.
Actividad positiva: no hay crecimiento homogéneo a lo largo del inóculo.
Contaminación: presencia de microorganismos fuera de la inoculación.
Figura 5. Resultados de actividad antibacteriana
I.4.5.9 Tamizaje de la actividad antimicótica in vitro
Los hongos son organismos de vida libre que tienen curvas de crecimiento máximo de 7-
28 días en medios artificiales específicamente diseñados. El tamizaje de la actividad
antimicótica consiste en evidenciar in vitro como un extracto, fracción o compuesto
derivado de una droga vegetal inhibe el crecimiento de un hongo en condiciones estándar.
Siempre y cuando se maneje una concentración previamente determinada conocida como
punto de corte (entre 500-1000 mg/mL).
24
I.4.5.9.1 Materiales y equipo
Agar Saboraud
Agar-agar
Agitador
Alcohol al 50%
Autoclave
Cajas de petri simples
Camara de Neubauer
Campanillas de Durham
Dextrosa
Etanol al 50%
Fosfato diácido de potasio
Incubadora a 27°C
Incubadora a 37°C
Papel parafilm
Peptona
Pipetas automáticas
Puntas amarillas de 200 L
Puntas azules de 1000 L
Refrigeradora
Regla graduada en milimetros
Sulfato de sodio
Tubos con tapón de rosca de 15 mL
Viales
I.4.5.9.2 Procedimiento
Preparación de medio de cultivo
Preparar tubos con 13.5 mL de agar Sabouraud.
Esterilizar durante 15 minutos a 121°C, dejar enfriar a 50˚C y agregar 1.5 mL
del extracto de la planta a probar (Dilución 1:10). Agitar. La concentración
final que se tiene es de 1 mg/mL.
Verter en cajas de Petri estériles, dejar solidificar e incubar a 36˚C durante 24
horas para chequear esterilidad.
Guardar en refrigeración hasta el momento de su uso.
Preparación de inóculo
Preparar medio de Takashio (Sabouraud modificado para producción de
esporas) con los siguientes ingredientes:
Dextrosa 0.6 g
NaSO4 0.3 g
KH2PO4 0.3 g
Peptona 0.3 g
Agar-agar 6.0 g.
25
Agregarlo a 300 mL de agua, disolver, verter 6 mL en tubos con tapón de
rosca, esterilizar en autoclave y dejar solidificar con el mayor declive posible.
Incubar 48 horas a 25oC para descartar contaminación.
Sembrar en este medio los hongos a ensayar e incubar a 27˚C durante 21 días
hasta obtener un crecimiento homogéneo (aproximadamente 15 días).
Agregar a cada tubo 2 mL de agua destilada estéril y desprender el hongo con
ayuda de una varilla.
Trasvasar el material obtenido a viales con tapa de rosca. Agitar 1 minuto en
agitador y hacer un conteo de esporas en cámara de Neubauer.
Llevar la suspensión a 100 esporas/µl = 1 x 105 esporas/mL
(aproximadamente 10 esporas/cuadrante) y almacenar en viales estériles en
refrigeración.
Inoculación de hongos filamentosos en placa
Abrir cuatro agujeros en las cajas con agar-planta, con campanillas de
Durham de 5 mm de diámetro. En forma equidistante.
Tomar 30 µl de la suspensión de esporas y depositar en los agujeros. Incubar
a 27oC por 14 días.
Hacer un total de 4 repeticiones en la misma forma, usar una caja con agar
Sabouraud como control negativo.
Las cajas control constituyen cajas de agar Sabouraud (13.5 ml) con 1.5 ml de
Alcohol al 70%. Es decir que llevan el mismo procedimiento que se emplea
para realizar cajas de agar-planta solamente que en lugar de llevar la
suspensión con el extracto, llevan etanol al 70%.
Lectura e interpretación de los resultados
Medir el diámetro de la colonia del hongo en mm.
Calcular el porcentaje de inhibición, comparando el diámetro contra el de las
colonias en las cajas control.
Tomar como positivos los extractos que reducen el diámetro de la colonia en
un 75%.
Figura 6. Lectura de resultados actividad antimicótica
Caja Control con
crecimiento del
hongo
Caja de agar planta
con inhibición de
crecimiento
26
I.4.5.10 Tamizaje de la actividad antilevadura in vitro
Las levaduras son organismos de vida libre que tienen curvas de crecimiento máximo de
48-72 horas en medios artificiales específicamente diseñados. El tamizaje de la actividad
antilevadura consiste en evidenciar in vitro como un extracto, fracción o compuesto
derivado de una droga vegetal inhibe el crecimiento de un hongo levaduriforme en
condiciones estándar. Siempre y cuando se maneje una concentración previamente
determinada conocida como punto de corte (entre 500-1000 mg/mL).
I.4.5.10.1 Materiales y equipo
Agar Muller Hinton
Agar Saboraud
Agua desmineralizada
Asa de nicromo en argolla
Autoclave
Cajas de petri
Caldo tripticasa soya
Etanol al 50%
Incubadora a 36°C
Pipetas automáticas
Puntas amarillas de 200 L
Puntas azules de 1000 L
Refrigeradora
Solución salina isotónica
Tubos con tapón de rosca
I.4.5.10.2 Procedimiento
Preparación de medio de cultivo
Preparar tubos con 9.0 mL de agar Mueller Hinton.
Esterilizar a 121°C durante 15 minutos, dejar enfriar a 50˚C y agregar 1.0
mL de extracto de la planta a probar (Dilución 1:10) Agitar. La concentración
final que se tiene es de 1 mg/mL.
Verter en cajas de Petri estériles, dejar solidificar, e incubar a 36˚C por 24
horas para chequear esterilidad.
Guardar en refrigeración hasta el momento de uso.
Preparación del inóculo
Sembrar la cepa en una caja con agar Sabouraud e incubar a 36˚C por 48
horas.
Tomar un inóculo del cultivo fresco, sembrar en 5 mL de caldo Tripticasa
Soya e incubar 24-48 horas. Tomar con una pipeta estéril 0.5 mL y suspender
en 4.5 mL de solución salina estéril (dilución 1:10).
Inoculación de levaduras en placa
Inocular con asa la suspensión de levaduras en cada sección según plantilla.
Incubar a 36oC durante 48 horas
27
Para el control negativo, sembrar por estrías la levadura en una caja con agar
Sabouraud.
Lectura e interpretación de los resultados
Actividad negativa: crecimiento homogéneo a lo largo del inóculo.
Actividad positiva: no hay crecimiento homogéneo a lo largo del inóculo.
Contaminación: presencia de microorganismos fuera de la inoculación.
I.4.5.11 Concentración inhibitoria mínima (CIM)
Consiste en la cuantificación de la concentración mínima de un extracto, fracción o
compuesto (originado de una droga vegetal) que previene el crecimiento visible de
microorganismos, es decir, que ha demostrado su actividad en una prueba de tamizaje
previo. Para su realización se emplean diluciones seriadas del extracto y concentraciones
constantes del microorganismo y se evalúa el crecimiento del microorganismo en un
ensayo estandarizado similar al que sirvió de tamizaje.
I.4.5.11.1 Materiales y equipo
Agar Muller Hinton
Asa de nicromo
Autoclave
Cajas de petri cuadriplate
Caldo tripticasa soya
Etanol al 50%
Incubadora a 36°C
Pipetas automáticas
Puntas amarillas de 200L
Puntas azules de 1000L
Refrigeradora
Solución salina isotónica
Tubos de tapón de rosca de 15 mL
I.4.5.11.2 Procedimiento
Preparación de Agar-Planta
Preparar tubos con 3.6, 3.8, 3.9, 4 mL de agar Mueller-Hinton.
Esterilizar a 121°C durante 15 minutos, dejar enfriar a 50°C y agregar la
solución del extracto disuelto (concentración de 10 mg/mL) en una caja
cuadriplate de la siguiente manera:
3.6 mL de agar + 0.4 mL de la solución de extracto = 1.0 mg/mL
3.8 mL de agar + 0.2 mL de la solución de extracto = 0.5 mg/mL
3.9 mL de agar + 0.1 mL de la solución de extracto = 0.25 mg/mL
Un cuadrante con 4.0 mL de agar como control negativo.
Dejar solidificar e incubar a 36°C por 24 horas, para comprobar esterilidad.
Guardar en refrigeración hasta el momento de usar.
28
Preparación del inóculo
Purificar el microorganismo a ensayar inoculándolo en un tubo con 8 mL de
agar Muller Hinton inclinado, incubar 36°C durante 24 horas.
Inocular una asada del cultivo puro microbiano en un tubo con 5.0 mL de
caldo Tripticasa soya, incubar a 36°C durante 48 horas.
Diluir 0.05 mL de la suspensión anterior en 4.95 mL de agua solución salina
estéril (dilución 1: 100).
Demostración de la concentración inhibitoria mínima
Inocular tres estrías en cada uno de los cuadrantes de la caja e incubar a 36oC
por 24 horas. Dejar reposar durante 5-10 minutos e incubar a 36°C durante
24 horas.
Interpretación de resultados
Actividad negativa: crecimiento homogéneo a lo largo del inóculo.
Actividad positiva: no hay crecimiento homogéneo a lo largo del inóculo.
Contaminación: presencia de microorganismos fuera de la inoculación.
Figura 7. Cajas cuadriplate con control negativo, diferentes concentraciones y estrías de
siembra.
I.4.5.12 Tamizaje de la actividad larvicida
Los artrópodos hematófagos (insectos) son importantes transmisores de infecciones por
protozoarios, tienen un ciclo biológico en el que presentan varios estadíos con
características morfológicas y fisiológicas diferentes. Se reproducen por ovoposición en
fuentes de agua estancada donde desarrollan varios estados larvarios. Al madurar se
transforman en insectos voladores que perpetúan la especie y mantienen la enfermedad.
Los diferentes estados de las larvas se pueden enfrentar a diluciones de extractos para
determinar su actividad larvicida en un modelo in vitro usando una concentración de 100
g/mL para el tamizaje y concentraciones decrecientes para determinar la dosis larvicida.
29
I.4.5.12.1 Materiales y equipo
Agua de chorro
Balanza analítica
Estereóscopo
Huevos de Aedes aegypti y Anopheles albimanus
Microplacas
Pipetas automáticas
Puntas amarillas de 200 L
Puntas azules de 1000 L
Vaso de precipitar de 500 mL
I.4.5.12.2 Procedimiento
Cultivo de larvas de Aedes aegypti y Anopheles albimanus
Colocar en un vaso de precipitar 200 mL de agua del chorro y dejar reposar
por 48 horas.
Agregar aproximadamente 40 mg de huevecillos de Aedes aegypti y
Anopheles albimanus
Incubar por 24 horas a temperatura ambiente.
Determinación de la Citotoxicidad
En la balanza analítica pesar 1 mg del extracto a ensayar y disolver con 1 mL
de agua de chorro reposada. Disolver con un vortex.
En la microplaca agregar por triplicado (en tres pozos diferentes) 100 L del
extracto disuelto y 100 L de agua del chorro reposada con 10-15 larvas.
Para preparar en control negativo se coloca en otro pozo 200 l de agua del
chorro reposada con 10-15 larvas.
Incubar a temperatura ambiente (25-28oC) en un lugar oscuro durante 24
horas.
Contar en el estereóscopo el número de larvas muertas y determinar la CL100
(concentración letal al 100%).
Interpretación
La prueba de tamizaje es positiva si todas las larvas están muertas.
Si el % de larvas muertas es 100%, calcular la CL100, para ello repetir la
prueba utilizando dosis de 0.5, 0.15 y 0.124 mg/mL.
30
Figura 8. Larvas de Aedes aegypti y ciclo de vida
31
PARTE II
MARCO TEÓRICO
II.1 Uso de los basidiomicetos en Guatemala
En 1968 se publican varios artículos que hacen referencia a los hongos de piedra,
pequeños monolitos que habían sido descrito por Sapper en 1898 y Borhegyi en 1957 y a
los que se les atribuye concordancia en el simbolismo de algunos hongos en los códices
mayas y que sugieren un importante uso ritual por dichas culturas, principalmente por su
efecto alucinógeno (Lowy, 1968; 1971; 1972). Así mismo, se describe el conocimiento y
uso por la población quiché de A. caesarea (Lowy, 1974). Estos estudios
etnomicológicos concluyen que las poblaciones nativas de Guatemala tienen un amplio
conocimiento y uso de los basidiomicetos, considerándola una cultura micofílica (Lowy,
1975). Estudios posteriores confirman el uso de hongos alucinógenos por las culturas
nativas, juntamente con especímenes botánicos y animales conocidos por estas mismas
propiedades (Torres, 1984).
Con respecto al uso de basidiomicetos en la alimentación, el primer estudio en Guatemala
fue publicado en 1948, donde se describe la venta en mercados de Amanita caesarea,
Cantharellus cibarius y Schizophyllum commune (Sharp, 1948). En 1983 se realiza un
estudio de los macromicetos de venta en mercados de la ciudad de Guatemala y los
municipios de Mixco y San Juan Sacatepéquez, detectándose especies de Cantharellus,
Lactarius, Ramaria y Amanita (Argueta, 1983). Posteriormente, se describe una nueva
especie de hongo comestible en Chimaltenbango, Morchella guatemalensis (Guzmán et
al., 1985) y el comercio de Pseudofistulina radicata en Santiago Atitlán (Guzmán, 1987).
Un estudio importante sobre los macromicetos comestibles de venta en Guatemala fue el
realizado durante 1988-90 en las 22 cabeceras departamentales del país, en búsqueda de
lugares de venta de hongos comestibles en los mercados locales. Este amplio estudio
demostró la presencia de 18 especies correspondientes a 15 géneros de basidiomicetos,
sobresaliendo 9 géneros que fueron detectadas en varios departamentos (Sommerkamp,
1990). Durante 2001-2002 fueron recolectados 600 especímenes de hongos comestibles
en 21 comunidades de 10 departamentos del país, encontrándose los hongos detectados
anteriormente (Tabla 1) y 21 especies no descritas para Guatemala anteriormente (Bran et
al., 2003). Esta información sirvió de base para la selección de las especies de estudio en
el presente proyecto (Tabla 1).
32
Tabla 2. Principales especies de basidiomicetos comestibles detectados en Guatemala
Género Nombre popular Colectas1
Colectas2
Cantharellus cibarius Fr. Anacate 10 Si
Amanita cesarea (Scop. Ex Fr.)
Grev.
San Juan 7 Si
Ramaria botrytis (Fr.) Rick. Manitas, barbas de
conejo
7
Lactarius deliciosus (L. ex Fr.)
S.F.Gray
Shara, cabeza de shara 5 Otras
especies
Agaricus campestres (L. ex Fr. Hongo de mayo, hongo
blanco
4 Si
Pseudofistulina radicata (Schw.) Fr. Hongo de guachipilín 3
Schizophyllum radicata (Schw.)
Burd.
Orejita de palo 2
Boletus edulis Bull. Ex Fr. Pancita 2 Si
Russula lepida Fr., R. virescens Fr. Guacamaya 2 Otra especie
Laccaria major G.M.Mueller Si
Pleurotus ostreatus Pleurotus, hongo ostra Otra especie Fuente:
1 número de departamentos de Guatemala en los que se detectaron según Sommerkamp Y (1990)
Cuaderno DIGI No. 3-90; 2Bran MC et al. (2003) Rev. Cient. Ed Esp. 1(1):5-24
Finalmente es de mencionar que también han sido detectadas algunas intoxicaciones por
la ingestión de hongos, reportándose casos mortales de envenenamiento por hongos
tóxicos (Logemann et al., 1987).
II.2 Los basidiomicetos como inmunomoduladores y biocidas
El uso medicinal de los basidiomicetos ha sido descrito desde la antigüedad. La medicina
tradicional china atribuye propiedades medicinales a varios hongos, describiéndose en el
Pen Ts’ao al menos 16 especies de hongos medicinales [reishi (Ganoderma lucidum),
shiitake (Lentinula edodes), maitake y otros] que son los mejor estudiados. En Occidente,
Plinio recetaba el agárico (Agaricus albus) y Discórides la quinina conk (Fomitopsis
officinalis) como antídotos contra venenos (Hobbs, 1995).
En un estudio reciente de los hongos medicinales sobresale la actividad adaptógena,
inmunomoduladora e inhibidora de la hormona de crecimiento, sobre todo por los
heteropolisacáridos de alto peso molecular.
El concepto de adaptógeno e inmunomodulador, se define como modificador de
respuestas biológicas, su aplicación no debe causar daño o estrés al cuerpo, de ayudar a
adaptarse a los cambiantes retos ambientales y psicológicos y debe tener una acción no
específica, apoyando los sistemas mayores (nervioso, hormonal e inmune) y regulando
funciones fisiológicas.
33
La principal línea de investigación ha sido la actividad inmunomoduladora de las
citocinas, las que tienen efectos sistémicos y locales y juegan un papel importante en el
control de las infecciones.
II.2.1 Interferón: El interferón-α (IFγ) obtenido de suero humano y leucocitos, se
utiliza para tratar leucemia de células peludas, condiloma acuminata causado por el virus
de papiloma humano y el sarcoma de Kaposi en pacientes con VIH. IFα-2A esta
registrado para el tratamiento de la hepatitis B crónica activa y de las infecciones por
hepatitis C, sin embargo solo el 40% de pacientes con hepatitis C responden a esta
terapia. El IFβ obtenido de líneas celulares de fibroblastos FS-4 se utiliza para
enfermedades severas mediadas por virus, así como infecciones virales del oído interno
con pérdida de la audición y está registrado para el tratamiento de esclerosis múltiple. El
IFγ es un potente factor activador de macrófagos, numerosos estudios han demostrado
que confiere protección contra Listeria monocytogens, Francisella tularensis,
Toxoplasma gondii, Pneumocystis carinii, Plasmodium falciparum, Chlamydia
trachomatis, Rickettsia conorii, Paracccidioides brasiliensis y Shigella flexneri (Masihi
et al., 2000).
II.2.2 Factor de necrosis tumoral y estimulador de colonias: Se ha demostrado que
mejoran la actividad contra los virus de encefalomiocarditis, estomatitis vesicular y
sincitial respiratorio. Confiere pro-tección contra Klebsiella pneumoniae, Streptococcus
pneumoniae, Legionella pneumophila, salmone-losis, L. monocytogenes y
Mycobacterium avium. Inhibe infecciones experimentales con especies de Plasmodium,
leishamiasis cutánea, Trypanosoma cruzi y T. gondii en ratones. Están involucrados en la
producción y diferenciación de células de la médula ósea. Se ha demostrado que el M-
CSF induce resistencia contra el virus de la estomatitis vesicular, herpes simple, L.
monocytogenes y Candida albicans; G-CSF estimula la resistencia a infecciones por
Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Serratia marcescens, L. moncytogenes
y C. albicans diseminada (Masihi et al., 2000).
II.2.3 Interleucinas: El tratamiento con IL-1α aumenta la resistencia a infecciones
letales por Brucella abortus, K. pneumoniae, L. monocytogenes, Salmonella
typhimurium, P. aeruginosa y C. albicans en ratones normales y neutropénicos. IL-12
posee actividad protectoras contra Leishmania donovani, L. mayor y L. amazonesnsis;
prolonga la sobrevida de ratones SCID inmunodeficientes infectados con Histoplasma
capsultaum o T. gondii y es critica para la resolución de infección pulmonar por L.
pneumophila. Alivia la anemia inducida por la malaria, inhibe la replicación temprana del
virus de la influenza y cuando se administra intranasalmente con la vacuna de la
influenza, aumenta la sobre-vida luego de un reto letal por el virus de la influenza. La
IL-15 se ha mostrado que sobre regula la respuesta contra C. albicans (Masihi et al.,
2000).
II.2.4 Respuesta celular: Los polisacáridos exhiben efectos terapéuticos por
mecanismos de modulación de la respuesta innata y la proliferación y función de
macrófagos (Masihi et al., 2000). La inyección IV de lentinano aumenta el número
absoluto de monocitos en sangre periférica y el de células progeni-nitoras de macrófago-
34
granulocito en el bazo y médula ósea. El eschizofilano induce la expresión del MSF en
cultivos de médula ósea (Schepetkin & Quinn, 2006). Bao et al. (2001) aislaron esporas
de G. lucidum y sintetizaron seis diferentes derivados del (1→3)-α-D-glucano; los efectos
inmunológi-cos se evaluaron a través de la determinación de su efecto mitógeno en
linfocitos in vivo e in vitro. El estudio demostró que a menor grado de sustitución del
derivado, mayor actividad mitógena presenta-ba el polisacárido, es decir que estimulaba
la proliferación de linfocitos T y B. Los polisacáridos sintetizados más solubles en agua
y con menos sustitución con un grupo carboximetil, son los de elección para estimular
mitogénesis en linfocitos. El polisacárido SHE es un agente inmunomodu-lador aislado
de Salicornia herbacea. Es utilizado con eficiencia en fitomedicamentos por su capa-
cidad de activar a los monocitos e inducir la diferenciación de monocitos a macrófagos.
El efecto de este polisacárido fue medido por Im et al. (2006), usando cultivos de células
RAW de ratones en los que se determinó que la presencia de SHE las activa para que
produzcan citoquinas como TNF-β e IL-1α; los cuales son mediadores en la fagocitosis
de LPS de bacterias y NO el cual puede ser un indicador cuantitativo de la activación de
los macrófagos.
II.2.5 Respuesta humoral: Se han realizado estudios sobre su efecto inmunomodulador
sobre la respuesta humoral, uno de estos fue el desarrollado por Babakhin, quien estudió
la masa micelial del hongo Polyporus squamosus (DPS) como inmunomodulador de la
respuesta IgE (anafilaxis cutánea pasiva) e IgG (ELISA) a la ovoalbúmina (OA) in vivo.
Para esto se utilizaron ratones FI (CBAxC57BL/6). Inyecciones múltiples de DPS en
dosis de 1.5, 15 y 150 mg/Kg, antes de la inmunización primaria o secundaria del ratón
con OA, resultaron en una inhibición dependiente de dosis de ambas respuestas de
anticuerpos. Mientras que la respuesta IgE anti-OA fue suprimida durante todo el
periodo de observación, la respuesta anti-OA IgG fue restaurada al nivel control a la
tercera semana de la inmunización secundaria. Se observó que DPS en diferentes
concentraciones no influenciaron la liberación de histamina de los basófilos de sangre
completa inducida por anti-IgE o alérgenos específicos. Utilizando la metodología
hemolítica de placa, se demostró una supresión significativa de formación de células
IgM-secretoras en ratones F1(CBAxC57BL/6) tratados con diferentes dosis de DPS antes
de la inmunización. DPS inhibió la proliferación in vitro de células humanas
mononucleares sobre-estimulación con PHA. DPS también inhibió, de forma dosis
dependiente, reacción de hipersensibilidad de tipo tardío y reacción GRAFL en la piel,
similar al efecto de la ciclosporina en ratones F1 (CBAxC57BL/6) (Babakhin et al.,
1997].
Ha et al. (2003) alimentaron ratones hembras de 5 semanas de edad a con una dieta que
contenía 0, 0.5, 1, 3 y 5% de micelio de G. lucidum. Luego fueron inmunizadas con 5 μg
de la toxina cólera en los días 7 y 21 de su dieta. La IgA total y específica IgA anti-CT
(antitoxina-cólera) fueron medidas a partir de lavados luminales del intestino delgado,
suero y deposiciones fecales. La respuesta inmune en suero hacia la IgG anti-CT fue
medida por ELISA. Los niveles totales de IgA no se encontraron afectados por la ingesta
del micelio a excepción de la muestra de suero. En contraste, la respuesta de IgA anti-CT
fue reducida en todos las muestras tomadas de los ratones que fueron alimentados con la
dieta conteniendo el micelio a excepción de los las muestras de lavado luminar de
35
intestino delgado de los ratones que tenían dieta de 5% de micelio. La respuesta de IgG
anti-CT del suero fue disminuida únicamente en ratones alimentados con dieta de 3% de
micelio y llegaron a la conclusión que el micelio de G. lucidum reduce la respuesta de
IgA específica de la mucosa en ratones adultos jóvenes inmunizados con la toxina cólera.
II.2.6 Respuesta de citocinas y agentes vasoactivos: Jun-Ho & Yang (1999)
determinaron la presencia de agentes fibrinolíticos en Armillariella mellea, un hongo
comestible de cuyos cuerpos fructíferos se aisló una metaloproteasa capaz de lisar las
cadenas Aα y Bβ del fibrinógeno humano. Los resultados revelaron que la enzima
purificada posee actividad de plasmina y no de activador del plasminógeno. Se observó
que la estabilidad de la enzima se alcanza a pH 7 a 20-80ºC; exhibió inhibición bajo
efectos de EDTA y 1,10-pentantrolina indicando que se trata de una metaloproteasa. No
se observó inhibición por 2-ME y el Hg fue el metal que ejerció inhibición total a
concentración de 1mM. La enzima aislada también mostró actividad fibrinolítica en las
cadenas Aα y Bβ del fibrinógeno humano con la misma eficacia. Estos resultados
indican que la enzima purificada es candidata para ser usada como terapia oral
fibrinolítica. Los polisacáridos aislados de G. frondosa aumentan la producción de IL-2
en pacientes con cáncer de pulmón e hígado como resultado de la activación de
macrófagos (Schepetkin & Quinn, 2006). Kuo et al. (2006) reportaron que G. lucidum
induce la liberación de TNF-α e IL-6 en la sangre. Chen et al. (2004) determinaron por
medio de el uso de ELISA que la fracción F3, de los polisacáridos de G. lucidum, activa
la expresión de IL-1, IL6, IL-12, IFN-γ, TNF-α, GM-CSF, G-CSF y M-CSF, la fracción
F3G1 activa la IL-1, IL-12, TNF-α y G-CSF, F3G2 activa las mismas citocinas que F3 y
F3G3 activa únicamente a IL-1 y TNF-α.
También puede inhibirse la liberación de citocinas. Se determinó que los polisacáridos de
G. lucidum reparan los tejidos ulcerosos de las ratas utilizadas, mediante la inducción de
la ornitina descarboxilasa y la supresión de el FNT-α (Gao et al., 2002). Se encontró que
el extracto acuoso de H. monachella inhibe la liberación de prostaglandina por leucocitos
de rata in vitro (Li et al., 2005).
II.2.7 Efectos radioprotectores: La actividad monocitopoyética de los derivados
polisacáridos fúngicos se ha sugerido que contribuye con efectos radioprotectores. El
tratamiento de ratones con PG101, una fracción soluble en agua aislada del micelio de
Lentinus lepideus, mantiene el número de unidades formadoras de colonias en la médula
ósea irradiada a un nivel similar al no irradiado (Masihi et al., 2000). Lin et al. (2004)
demostraron la utilidad de los hongos comestibles como coadyuvantes en ciertas terapias
por ser hematopoyéticas. La doxorrubricina (DOX), un medicamento quimiotera-péutico
que causa daño a la médula ósea de forma dosis-dependiente, suprime la hematopoyesis
lo cual provoca anemia, linfopenia, trombocitopenia y granulocitopenia. Diferentes
factores de creci-miento y citocinas se han desarrollado para estimular la hematopoyesis
y recuperar los niveles periféricos de los granulocitos luego de la quimioterapia. Se han
aislado glucanos de hongos y bacterias que podrían apoyar directamente la
hematopoyesis aumentando la producción de citocinas.
36
El estudio de Lin et al. (2004) pretendía determinar la factibilidad de utilizar el extracto
de los cuerpos fructíferos de G. frondosa (MDF) como protector de las células madre de
la médula ósea ante la acción de DOX así como determinar si posee la capacidad de
aumentar la recuperación de células progenitoras hematopoyéticas luego de una
depleción por DOX. Para ello, se evaluó la respuesta y efecto dependiente de la dosis en
la médula ósea de ratones, suprimidas utilizando DOX. Se observó que el MDF causa el
incremento de la respuesta CFU-GM de progenitores BMC y la recuperación de la
respuesta CFU-GM luego de la inducción de supresión hematopoyética por DOX, lo cual
demuestra que la toxicidad de DOX en la médula ósea es atenuada por MDF.
II.2.8 Efectos hepatoprotectores: Armillariella tabescens, Artodia camphorat y G.
lucidum demostraron ser hepatoprotectoras al poseer una acción detoxificante sobre la
aflatoxima B1 (AF B1) producida por mohos como Aspergillus flavus y A. parasiticus,
cuya ingestión se produce por los alimentos y está relacionada con cáncer hepático. La
detoxificación de AF B1 se lleva a cabo a través del aislamiento multienzimático de los
extractos (Lu et al., 1998). Liu et al. (2001) realizaron un trabajo para purificar y
caracterizar la enzima ADTZ (Aflatoxina detoxificina) de A. tabescens encargada de
efectuar la actividad detoxificante. Liu et al. (2001) demostraron la efectividad de las
multienzimas de A. tabescens para detoxificar AF B1. Se demostró el efecto
hepatoprotector de A. camphorat mediante un bioensayo utilizando ratas sometidas a
intoxicación por ingestión aguda de etanol. Los datos histológicos de los hígados de las
ratas tratadas con micelio de ambos hongos revelaron tejido cercano a lo normal. El
extracto etanólico de G. lucidum se ha reconocido también como un hepatoprotector, que
puede atribuirse a los polisacáridos de la fracción acuosa y triterpenos de la fracción
alcohólica (Lu et al., 1998; Liu et al., 2001).
II.2.9 Efectos anti-infecciosos: G. lucidum se ha estudiado por su actividad antiviral y
antibacteriana. Otra especie del género, G. tsugae, fue estudiada por su actividad
antiasmática si se consume como suplemento dietario. Se han estudiado también las
actividades de proteínas, péptidos, aminoácidos, nucleósidos, nucleótidos, ARNs,
alcaloides, vitaminas, minerales esenciales, ácidos grasos y sabores; encontrando que
éstos también jugar un papel en la regulación del sistema inmune. Las propiedades
farmacológicas de este hongo se han investigado para determinar si es tóxica o no; y de
serlo, las cantidades y componentes responsables, el cual es un aspecto importante de los
agentes medicinales. Se consume tradicionalmente en formas acuosas cocinadas (sopas,
tes) por lo cual se ha trabajado con el extracto acuoso (Lin et al., 2006; Müller et al.,
2006).
II.2.10 Efectos anticancerígenos: El número de pacientes con cáncer utilizando
suplementos dietarios herbales ha aumentado en la actualidad, por ejemplo, es
recomendado su uso como complemento de las terapias ya aplicadas en pacientes con
cáncer colorectal avanzado (Liu et al., 2007). Se ha enfatizando el uso de constituyentes
dietarios para prevenir la mutagénesis y carcinogénesis por que éstos poseen efectos no
tóxicos. Ha aumenta-do el interés por identificar factores de la dieta que se encuentra
naturalmente presentes en los alimentos y que pueden actuar como anticarcinogénicos
37
potenciales. Los hongos comestibles pueden poseer moléculas con diferentes efectos que
en consecuencia actúan como anticancerígenos.
El hongo más estudiado por su actividad antitumoral es G. lucidum. La investigación se
ha centrado en dos puntos principales: la determinación de las líneas celulares malignas
contra las cuales el hongo tiene acción y la identificación de los compuestos y
mecanismos causantes de la acción, involucrando a los polisacáridos como los
responsables del efecto antitumoral (Kuo et al., 2006). Estos componentes biológicos que
tienen la capacidad de inhibir el crecimiento de células cancerosas y metástasis, son
polisacáridos del extracto acuoso (β-D-glucanos) y triterpenos y su acción se lleva a cabo
por la modulación del sistema inmune, la detención del ciclo celular, disparando la
apoptosis y suprimiendo la angiogénesis (Johnston, 2005). El extracto alcohólico y la
fracción triterpénica de dicho hongo poseen efecto antitumoral a consecuencia de
actividad citotóxica sobre células tumorales; mientras que múltiples estudios confirman
que polisacáridos antitumorales no poseen citotoxicidad directa contra las células
tumorales, sino que muestran profundos efectos inmunomoduladores en el hospedero (Lu
et al., 2004; Kou et al., 2006).
Se han propuesto mecanismos diferentes y complementarios a la modulación del sistema
inmune por los cuales extractos de G. lucidum son capaces de inhibir o disminuir la
proliferación de células cancerígenas; una de ellas es evitando la adhesión de las células
malignas y otra la producción de citocinas. Wu et al. (2006) examinaron los efectos de
diferentes preparaciones de esporas de G. lucidum en la adhesión de células malignas del
carcinoma de pecho humano al tratar monocapas celulares. El experimento indicó que G.
lucidum inhibe la adhesión de las células cancerosas a diferentes niveles. Los
polisacáridos aislados de cuerpos fructíferos que crecieron sobre leños de madera,
exhibieron la mayor actividad inhibitoria de la adhesión celular, un efecto que es
dependiente de la concentración. Los polisacáridos purificados también exhibieron
inhibición de la adhesión celular en varios modelos de matrices moleculares. Un análisis
con Western Blot indicó que la expresión de la 1-integrina fue reducida grandemente,
mientras la expresión de β-actina no fue afectada, lo que sugiere una actividad específica
de los productos de G. lucidum sobre la 1-integrina.
Lakshmi et al. (2006) determinaron la actividad antimutagénica in vivo, de extractos
metabólicos de cuerpos fructíferos de G. lucidum. También evaluaron la
antimutagenicidad in vitro así como el efecto del extracto sobre las fosfatasas alcalinas y
transaminasas a consecuencia de la actividad de benzo [α]pireno. El benzo [α]pireno es
un compuesto que puede atacar las macromoléculas celulares como UNAM RNA,
proteínas y membranas, causando disfunción y daño celular. Los resultados de este
estudio revelaron que el extracto metanólico de G. lucidum es capaz de disminuir los
niveles de mutagénesis inducidos por este compuesto.
Se ha estudiado el efecto de los polisacáridos de PG-S en la función de macrófagos y
linfocitos T y en el crecimiento de células leucémicas. Demostraron que el polisacárido
posee un fuerte efecto estimulador en ambas células para promover la síntesis y
liberación de varias citocinas (IL-1 β, IL-6, IFN-γ , TNFα); las cuales son importantes
para montar una respuesta antitumoral mediada por células efectivas. PG-S y el medio de
38
cultivo de células mononucleares normales no tuvieron actividad tumoricida, pero el
medio condicionado para células mononucleares activadas con PSG inhibieron
fuertemente el crecimiento de células leucémicas. Anticuerpos neutralizantes de IFN γ y
TNFα resaltaron grandemente la inhibición del crecimiento de células tumorales
inducidos por células mononucleares activadas por PSG de medio condicionado. Esto
confirma que la actividad antitumoral de estas últimas fue derivada principalmente de las
citocinas elevadas, especialmente IFN γ y TNFα que indujeron apoptosis y
diferenciación celular en líneas celulares leucémicas tratadas con PSG (Lu et al., 2004).
Los estudios realizados indican que G. lucidum posee acción sobre una gran cantidad de
líneas celulares. Las propiedades antitumorales del cuerpo fructífero, esporas y micelio,
así como los extractos pueden atribuirse a sus diversos constituyentes químicos y puede
implicar su uso como un quimiopreventivo o como agente terapéutico potencial. Los
polisacáridos aislados potencian la producción de citocinas, las cuales suprimen la
proliferación de células leucémicas HL-60 y U937. Müller et al. (2006) analizaron estas
líneas celulares además de Blin-1 y RPMI8226 para apoptosis mediada por G. lucidum
dependiente de dosis y descubrieron que induce apoptosis dependiente de dosis en todas
las líneas celulares analizadas. La habilidad de G. lucidum de alterar la transmembrana
mitocondrial se investigó en células mieloides HL-60 y U937. Se observó una
disminución del potencial de la membrana mitocondrial dependiente de la dosis. El
Western blot mostró un incremento de la proteína p21WAF1
dependiente de la dosis y el
tiempo, comparadas con células U937 tratadas, respecto a las células control. La
preparación de citospina y la tinción a 13 líneas celulares demostró que causa
multinucleación prominente en las células HL-60 y demostró ser capaz de disminuir el
crecimiento de células de sarcoma en ratones y de inducir la expresión de IL1, IL-6,
INFγ, TNFα, GM-CSF, F-CSF, M-CSF en monocitos, macrófagos y linfocitos T. Kim et
al. (2006) estudiaron si G. lucidum y D. chrysantha eran capaces de aumentar el efecto de
apoptosis e inhibición en el crecimiento de células leucémicas HL-60, a través de
compuestos con actividad antitumoral. Los resultados muestran que ambos extractos
individualmente empleados impidieron el crecimiento clonal de células leucémicas HL-
60 a concentraciones específicas (Lu et al., 2004; Müller et al., 2006; Kim et al., 2006;
Liu et al., 2007).
Se han aislado triterpenos de extractos alcohólicos y de la fracción etil acetato de los que
aproximadamente 20 de diversa naturaleza química han mostrado citotoxidad contra un
panel de líneas celulares de tumores humanos y murinos. Los triterpenos pueden inhibir
el crecimiento de células de hematoma Huh-7; además inhibe el crecimiento primario y
metástasis de células de carcinoma de pulmón de Lewis insertadas en ratón (Bao et al.,
2001; Lin et al., 2004).
El extracto alcohólico del cuerpo fructífero de G. lucidum inhibe la proliferación de
células MCF-7 de cáncer de seno a través de la regulación positiva de p21 y de
regulación negativa de la ciclina d1 lo que induce abortos. Los resultados indican que los
extractos son capaces de inhibir el crecimiento y migración in vitro de células
cancerigenas de vejiga humana. Otros estudios indican que G. lucidum inhibe el
crecimiento de líneas celulares cancerígenas tales como células PC-3 de la próstata. Se ha
39
reportado que de forma dependiente del tiempo y dosis, inhibe la proliferación celular e
induce apoptosis de HT-29, una línea celular de carcinoma de colon humano y MDA-
MB-231 y MCF-7 líneas celulares de cáncer de seno, así como actividad antitumoral en
el cáncer colorectal (Lu et al., 2004; Müller et al., 2006; Russell & Paterson, 2006). De
los cuerpos fructíferos de Ganoderma amboiense se aisló el ácido ganodérico X (GAX),
uno de los componentes más potentes. Las células HuH-
durante 24 horas disminu-yeron en un 50% y mostraron menos tumorigenicidad,
sugiriendo que GAX promueve eficientemente la muerte de células cancerígenas que
además, manifestaron la deflación típica de la apoptosis. Li et al. (2005) sugieren que G.
lucidum posee su efecto anticancerígeno mediado por apoptosis.
La fracción D de G. frondosa, una glicoproteína con seis cadenas principales β-1,
frecuentemente unidos con β-1, muestra efectos antitumorales mediante la activación de
células inmunocompetentes. Se ha sugerido que la destrucción tumoral también es
inducida por la infiltración celular local del tumor. Matsui et al. (2001) descubrieron que
la fracción D induce la angiogénesis in vivo y engrandece la capacidad de migración y
proliferación de la células normales HVEC in vitro. Los extractos solubles en etanol de
Lentinula edodes disminuyeron significantemente la proliferación de células CH72 de
carcinoma de piel de ratón, redujeron la proliferación celular e indujeron la apoptosis en
relación dependiente de tiempo y dosis en células de carcinoma pero no tiene efecto sobre
las células no tumorales C50.
II.3 Composición química de los basidiomicetos
II.3.1 Polisacáridos: Los polisacáridos aislados de fuentes botánicas (hongos, algas,
líquenes y plantas superiores) han cobrado importancia debido a su amplio espectro de
propiedades terapéuticas y su relativa baja toxicidad. Se ha aislado una gran cantidad de
polisacáridos inmunoestimuladores con diferente estructura química. La mayoría de
estos polisacáridos son β-glucanos, tales como lentinan de L. edodes, eschizophillano de
Schizophyllum commune, kresitna de Coriolus versicolor, grifolan de G. frondosa y
escleroglucano de Sclerotinia sclerotiorum. Formas modificadas de los mismos, más
solubles, mejoran las actividades microbicidas de los neutrófilos y macrófagos pero
carecen de efectos activadores directos; por lo tanto, aumentan la defensa del hospedero
mediante leucocitos, sin activar completamente estas células, lo que los ha reconocido
como un inmunomodulador útil. Estos compuestos han demostrado que reducen los
porcentajes de infecciones postoperación y reducen el tiempo de hospitalización en
ensayos clínicos (Schepetkin & Quinn, 2006).
Los principales polisacáridos asociados con la inmunomodulación son los glucanos. Se
ha reconocido una gran cantidad de receptores en células inmunes que reconocen y unen
β-glucanos. El poli-(1-6)--glucotriosil-(1–3)--glucopiranoseglucano (PGG-glucano) se
deriva de la pared celular de las levaduras. Se ha administrado a pacientes quirúrgicos
con alto riesgo de infecciones postoperativas para reducir significativamente las
complicaciones infecciosas, disminuir la necesidad de antibiótico administrado por vía
intravenosa y disminución de estadía en la unidad de cuidados intensivos. En un estudio
se demostró que la administración de PGG-glucano, disminuían las infecciones post-
operativas serias o la tasa de mortalidad en un 39% (Misihi et al., 2000).
40
El lentinano es un 1-3-β-glucano que se utiliza en Japón como adyuvante en la terapia
antitumoral; se ha demostrado que puede conferir protección contra el virus de la
influenza, Listeria y prevenir recaídas de M. tuberculosis. Glucanos de levaduras podrían
aumentar la resistencia contra el virus del herpes simple (I y II) y de la hepatitis murina,
inducir respuesta no específica contra infecciones por K. pneumoniae y proteger a
pacientes de sepsis, bacteremia y peritonitis causadas por Escherichia coli, S. aureus y P.
aeruginosa. Se ha sugerido que pueden prolongar la sobrevivencia contra las infecciones
por Plasmodium berghei y L. donovani y reforzar la respuesta antifúngica contra
Candida, Cryptococcus y Sporotichum. Polisacáridos sulfatados, tales como el sulfato de
curdlano han mostrado mejorar la actividad inhibitoria de la replicación del VIH (Misihi
et al., 2000).
II.3.2 Lípidos: Los lípidos de los macromicetos han sido poco estudiados desde los
trabajos iniciales en Agaricus bisporus por Byrne & Brennan (1975) y los estudios
estructurales de sus basidiolípidos derivados (Jennemann et al., 1999). El estudio de la
estructura química de los lípidos de seis basidiomicetos comestibles demostró que son
bastante similares, correspondiendo a glicoinositol-fosfofingolípidos del tipo de
ceramidas (Jennemann et al., 2001). Algunos hongos presentan lectinas con actividades
reguladoras del crecimiento, como proliferativas o antiproliferativas, lo que podría
indicar una actividad reguladora de la linfoproliferación (Wang et al., 2003).
II.4 Información de los basidiomicetos comestibles del estudio
II.4.1 Amanita cesarea (Scop. Ex Fr.) Grev.
Nombre popular: Hongo de San Juan
Descripción: Hongo de píleo de 7-20 cm de diámetro, convexo a plano, subviscoso, liso,
carnoso, margen estriado, amarillo-anaranjado o anaranjado-rojizo, de láminas
subadheridas con bordes ligeramente aserrados, amarillas o amarillentas. Posee anillo
bien definido, membranoso, colgante y amarillo. De estípite de 5-15 cm de largo, liso o
subescamoso, hueco, blanco a amarillento. Presenta volva gruesa, blanca, prominente,
con bordes libres. contexto tierno y blanco; sabor y olor desagradables. Esporada
blanca. La volva se pierde en los ejemplares de mercado pues los recolectores la
eliminan al colectarlo. El anillo puede descolgarse por la forma de la recolecta o
transporte al mercado. Crece en bosques de pinos y de encinos (Sommerkamp, 1990).
Hábitat y distribución: Crece en bosque de pino y encino (Sommerkamp, 1990).
Usos populares: Hongo altamente apetecido por su delicioso sabor. De venta en
mercados.
Estudios farmacológicos y composición química: No se encontró información.
II.4.2 Boletus edulis Bull. ex Fr. (Boletaceae)
Nombre popular: Rusemit kuk (semita de ardilla), boleto comestible
Descripción: Píleo de 8-15 cm de diámetro, convexo, superficie lisa, seca. Color crema,
café pálido o café canela. Himenio poroso, adherido o deprimido, blanco a amarillo
oliváceo, con poros circulares, pequeños a medianos. Estípite de 5-8 cm de alto por 1.5-5
cm de grosor, claviforme a bulboso, reticulado, blanco o de color café canela pálido. Su
olor es agradable y su sabor es dulce. Posee esporas de 9-12 x 4-6 µm , fusiformes a
elipsoidales, lisas y amiloides (Herrera, 1991) .
41
Hábitat y distribución: Crecen en bosques de Pinus-Quercus, con más de 550 mm de
precipitación pluvial anual. Se ha encontrado a la venta en varios mercados del país,
incluyendo, La Terminal zona 4 (Ciudad de Guatemala) y mercado de Chimaltenango. Es
uno de los hongos que más frecuente-mente se encuentran en Mixco y San Juan
Sacatepéquez (Argueta, 1983; Herrera, 1991).
Usos populares: Es uno de los hongos más apreciados en la cocina internacional,
principalmente la francesa e italiana. En Guatemala son igualmente apreciados.
II.4.3 Cantharellus cibarius Fr.
Nombre popular: Anacate; cantarula; q’axul (flauta amarilla, idioma Kaqchikel); q’axuul
(flauta amarilla en idioma K’iche); kanxul (flauta amarilla en idioma Chuj) y xuul (flauta,
en idioma Mam)
Descripción: Presentan color naranja o amarillo en todo el carpóforo. Se caracteriza por
poseer un buen sabor, afrutado y un poco picante; aroma delicado a durazno. Su
sombrero o píleo mide de 42-100 mm de diámetro, es plano convexo de superficie lisa a
finamente fibrilosa y cerosa, posee margen ondulado o lobulado y encorvado, de 3-9 cm
de diámetro. Color amarillo 68/A
en el centro, que se aclara a un tono amarillo 56/A
hacia el
margen. Contexto de 10 mm de grosor, consistencia carnosa-esponjosa color amarillo
pálido 52/A
. Posee venas decurrentes, anastomosadas, de hasta 5 mm de altura, superficie
cerosa, color amarillo opaco 58/A
. Pie o estípite sólido, cónico, inclinado de 47-70 mm de
largo. Primero es convexo, después extendido y más tarde deprimido en el centro, para
acabar en forma de embudo. Su superficie es cerosa y de color amarillo 58/A
. Esporada de
color amarillo intenso. Las esporas miden de 7.0-9.0 x 5.0-6.0 μm; tienen forma elípticas,
apiculadas, con pared lisa, inamiloides y hialinas pero con contenido refringente
multigutulado. Posee basidios de 55-110 por 7-9 µm de diámetro con abundantes fíbulas
(Bran et al., 2003).
Reacciones microquímicas: KOH (3%), NaOH (5%), Fenol y H2SO4 (30%): Negativo en
todas las estructuras. Melzer: cambia a color verde y café en la superficie del píleo (Bran
et al., 2003).
Hábitat y distribución: Es un hongo micorrizógeno que vive asociado a planifolios y
coníferas. Su distribución es extensa en los bosques de Pinus y Pinus-Quercus
(Sommerkamp, 1990; Bran et al., 2003).
Usos: Es un hongo ampliamente usado en Guatemala como alimento, muy conocido,
apreciado y de venta en mercados, inclusive en las calles (Sommerkamp, 1990; Bran et
al., 2003).
Características nutricionales: Contiene un 21.5% de proteína, 5% de grasas, 64.9% de
carbohidratos, 11.2% de fibra y 8.6% de cenizas. Contiene aminoácidos esenciales como
isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptófano y valina. En el
carpóforo se ha encontrado la presencia de vitamina A. Cuando está fresco, contiene
entre un 87-90% de humedad, un 3.7-5% de nitrógeno en peso seco. Sus proteínas son de
alta digestibilidad, lo que aumenta con el cocimiento. El análisis de aminoácidos
demostró que posee todos los aminoácidos esenciales aunque algunos en bajas
cantidades, siendo el más limitante el triptófano; el ácido glutámico es el aminoácido más
abundante. Poseen fibra en mayor cantidad que la presente en otros alimentos
consumidos por la población guatemalteca (Pérez, 1990).
42
Propiedades farmacológicas: Wang et al. (2003) purificaron un péptido tipo ubiquitina,
con actividad ribonucleótida. Wang & Ng (2004) aislaron una enzima lacasa dimérica,
una clase de enzimas lignolítica que poseen aplicaciones en biotecnología.
II.4.4 Lactarius deliciosus (L. ex Fr.) S.F.Gray
Nombre popular: Lactario delicioso, níscalo, hongo de pino, hongo royo, rovellón, seta
de cardenillo, senderilla, senderuela, seta de los corros de bruja y ninfa.
Descripción: Píleo de 4-10 centímetros de diámetro, convexo y a veces deprimido en el
centro, con el margen enrollado hacia abajo, pudiendo extenderse, liso, víscido al estar
húmedo, secándose rápidamente; anaranjado-amarillento con círculos concéntricos más
oscuros. Lámionas apretadas, delgadas, adnadas y algo decurrentes, anaranjado-
amarillentas, se manchan de verde al lastimarse. El estípite es de 2-5 centímetros de
largo, firme, grueso, cilíndrico y poco atenuado en la base, huevo con la edad, anaranjado
pálido. El contexto es duro, compacto, blanco-anaranjado y al corte segrega un látex
anaranjado que cambia a verde al contacto con el aire. La esporada es blanca cremosa.
Las esporas son de 7-10 por 6-8 µm, redondas o poco elípticas y ornamentadas
(Sommerkamp, 1990).
Hábitat y distribución: Ampliamente distribuido en el mundo; sus especies son conocidas
por ser ectomicorrícicas. Es un género de importancia actual no sólo por su función
micorrícica sino por la producción de setas comestibles. Se encuentra distribuido en
muchas partes del planeta, especialmente en el Hemisferio Norte, en el Geotrópico, Sur-
Este de Asia, Oceanía. Se encuentran en África y en América del Sur por su dispersión
evolutiva o por introducción del hombre. Del género se reportan al menos 16 especies en
Guatemala, la mayor parte asociada a pinos (L. deliciosus, L. indigo, L. salmoneus var.
salmoneus, L. subpurpureus), encinos (L. chrysorrheus, L. torminosus, L. fragilis, L.
piperatus, L .rimosellus, L. volemus var. volemus) abetos (L. mexicanus, L. salmonicolor,
L. uvidus).
Usos populares: En Guatemala existe una gran demanda para su consumo, ya que es un
hongo silvestre de fácil recolección, lo cual facilita su obtención y venta. Es muy
frecuente su venta en épocas de fructificación que van de mayo a noviembre.
Estudios farmacológicos: A pesar de su alto consumo como alimento, se conoce poco
sobre su actividad farmacológica, ya que a nivel mundial los estudios han sido enfocados
en caracterización ectomicorrícica durante las fases de formación micelial, así como de
sus metabolitos.
Composición química: Su análisis proximal en peso seco indica; Proteína total 27.42%,
grasa 6.72%, carbohidratos 27.6% y cenizas 5.92%. Entre sus metabolitos mas
caracterizados están las lectinas, sesquiterpenos con actividad antioxidante, e isomerasas
presentes en la biosíntesis de terpenoides.
II.4.5 Neolentinus ponderosus
Las especies que conforman el género Neolentinus estuvieron incluidas dentro del género
Lentinus (Pegler, 1983). Sin embargo, Redhead & Ginns (Redhead & Ginns, 1985),
indicaron que si bien, las especies de Neolentinus no tienen diferencias microscópicas
significativas con las de Lentinus, el primero causa pudrición café en la madera y el
segundo causa pudrición blanca. Esta característica permitió separar ambos géneros
(Redhead & Ginns, 1985).
43
Neolentinus se clasifica taxonómicamente de la manera siguiente (Hawksworth, et al,
1995):
Reino: FUNGI; Phylum: Basidiomycota; Clase: Basidiomycetes, Subclase:
Agaricomycetidae, Orden: Polyporales, Familia: Polyporaceae, Género: Neolentinus
(Redhead & Ginns, 1985)
Características macroscópicas y microscópicas:
La morfología del género es extremadamente variable, en la mayoría de los casos, el
basidiocarpo tiene un estípite bien desarrollado, en posición central, el cual se continúa
con el píleo. El basidiocarpo puede ser grande y robusto en especies tales como N.
lepideus y N. ponderosus (Pegler, 1983).
La superficie del píleo está esencialmente formada por un epicutis; en muchos casos el
píleo es fibriloso radialmente, escamoso o densamente piloso. El pileipellis usualmente
está formado por hifas generativas, con fíbulas, aunque es frecuente encontrar hifas
esclerificadas especialmente hacia el centro del píleo (Redhead & Ginns, 1985).
El himenio es lamelar, decurrente al estípite. Las láminas son triangulares en sección.
Muchas especies desarrollan anastomosis e intervenaciones, resultando en una condición
subporoide que posiblemente indique un ancestro polyporal. Trama lamelar regular
(Redhead & Ginns, 1985).
El sistema hifal generalmente es dimítico, aunque algunas especies pueden presentar un
sistema trimítico. El tipo de hifas secundarias, está constituido por hifas generativas y
esqueléticas o ligadoras-esqueléticas (Pegler, 1983).
Las basidiosporas generalmente son cilíndricas, hialinas, inamiloides, no dextrinoides, de
pared delgada y lisa (Pegler, 1983).
II.4.6 Armillariella polymyces
Descripción: Hongo de píleo globoso, convexo, que va de color café-rosa a café-
amarillento; es de contexto firme y blanco con olor agradable. (Sommerkamp, 1990).
Hábitat y distribución: Puede crecen en conjunto al pie de árboles frutales,
principalmente manzano y durazno (Sommerkamp, 1990).
Usos populares: Hongo de venta en mercados para su consumo en Tactic y San Mateo
Ixtatán en los departamentos de Alta Verapaz y Huehuetenango, respectivamente (Bran,
2003).
Estudios farmacológicos y composición química: el micelio de Armillariella tabescens
(Scop. Ex Fr.) Emel syn. Posee actividad hepatoprotectora por intoxicación con etanol
(Lu 1998). También se ha encontrado actividad detoxificante contra aflatoxinas B1
mediante la acción de enzimas aisladas de esporas de A. tabescens (Liu 2001). Las
multienzimas del hongo han exhibido su capacidad detoxificante contra las aflatoxinas
por medio de la modificación de su estructura química (Liu 2006). Armillariella mellea
también ha sido reportada como fuente de una metaloproteasa capaz de lisar las cadenas
alfa y beta del fibrinógeno humano, postulándose como candidata para la terapia
fibrinolítica (Kim 1999).
44
PARTE III
RESULTADOS
III.1 OBJETIVO I.
Recolectar seis hongos comestibles (cinco especies silvestres y una especie cultivada)
y determinar su taxonomía.
Fueron seleccionados los lugares donde los hongos se encuentran con más abundancia y
fácil accesibilidad: Ixchiguán, San Marcos, San Juan Comalapa, Chimaltenango, San
Pedro Carcha, Alta Verapaz, San Raymundo, Guatemala y Técpan, Chimaltenango.
Los ejemplares de Neolentinus ponderosus, fueron cultivados y donados por la Unidad
de Biodiversidad, Tecnología y Aprovechamiento de Hongos –BioTAH, del
Departamento de Microbiología de la Escuela de Química Biológica.
Cantharellus lateritius fue colectado en el municipio de San Raymundo, Armillariella
polymyces fue colectado en el municipio de San Pedro Carchá, Alta Verapaz, Boletus
edulis fue adquirido en la cooperativa de Ixchiguán, Depto. de San Marcos, Neolentinus
ponderosus proviene del municipio San Mateo Ixtatán, Huehuetenango, Lactarius
deliciosus del municipio de San Juan Comalapa, Chimaltenango y Amanita garabitoana
de Tecpán Guatemala, Chimaltenango.
Para la obtención de los hongos utilizados para los análisis del proyecto, se recurrió a los
vendedores de hongos locales, los cuales se contactaron en los mercados Municipales de
cada región, los cuales proporcionaron los volúmenes requeridos.
III.2 OBJETIVO 2.
Procesar en condiciones apropiadas los especímenes colectados.
Preservación de los hongos colectados: los hongos fueron partidos y colocados en
deshidratadoras a 65°C durante tres días; una vez secos se colocó una muestra (3 a 5
ejemplares) en bolsas de polipapel, identificadas con el nombre del hongo, número de
referencia, lugar y fecha de colecta, además de su respectiva descripción y se procedió a
su incorporación en la Micoteca de Macrohongos de Guatemala “Lic. Rubén Mayorga
Peralta”, de la Unidad de Biodiversidad, Tecnología y Aprovechamiento de Hongos –
BioTAH-, del Departamento de Microbiología de la Escuela de Química Biológica de la
Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia de la Universidad de San Carlos de
Guatemala.
Los hongos restantes se colocaron en bolsas plásticas selladas y rotuladas para ser
utilizadas en la realización de los ensayos de laboratorio.
45
III.3 OBJETIVO 3.
Establecer bioensayos inmunomoduladores y biocidas para evaluar los especímenes.
La unidad de Bioensayos ha estandarizado los ensayos de actividad biocida e
inmunomoduladora de extractos vegetales. En el caso del presente proyecto, los
protocolos de ensayo fueron puestos a punto para la aplicación de los mismos en
extractos provenientes de hongos macroscópicos o basidiomicetos.
III.4 OBJETIVO 4.
Obtener un extracto polar y uno apolar de los especímenes colectados. Las muestras de hongos deshidratadas fueron sometidas a condiciones de maceración,
percolación y extracción.
El porcentaje de rendimiento de extracto con etanol al 95% y con agua fue muy variable,
observándose los resultados en la tabla 3.
Tabla 3. Rendimiento de los extractos etanólicos al 95% y acuosos obtenidos de la materia vegetal de varios
hongos comestibles
HONGO COMESTIBLE SOLVENTE
UTILIZADO
PORCENTAJDE DE
RENDIMIENTO
(%)
Armillariella polymyces Etanol 95% 7.43
Agua 8.20
Boletus edulis Etanol 95% 17.84
Agua 36.00
Cantharellus lateritius Etanol 95% 1.099
Agua 2.50
Neolentinus ponderosus Etanol 95% 19.05
Agua 20.10
Lactarius deliciosus Etanol 95% 28.21
Agua 23.40
Amanita garabitoana Etanol 95% 16.15
Agua 17.30 Fuente: FODECYT 30-2007
III.5 OBJETIVO 5.
Caracterizar microscópicamente los basidiomicetos en estudio.
Se procedió a describir las características microscópicas de los hongos adquiridos en los
mercados. Se midieron las estructuras del píleo, himenio y estípite y se anotaron las
coloraciones y reacciones químicas de los tejidos fúngicos ante diferentes reactivos
específicos (Cifuentes 1,984, Kornerup 1,989).
Las descripciones realizadas se compararon con la bibliografía correspondiente, para
identificar correctamente los hongos colectados (Bessette 1,997 y 2,000, Calonge 1,998,
García, et al 1,998, Phillips 1,991, Læssøe, et al 1,996). Los resultados fueron
consignados en las fichas técnicas que fueron elaboradas de los hongos estudiados
(Anexo
46
III.6 OBJETIVO 6.
Determinar la actividad inmunomoduladora y biocida de los extractos obtenidos.
Los resultados de los ensayos aplicados para determinar la actividad biológica de los
hongos se describen a continuación.
III.6.1 Citotoxicidad
A los extractos analizados se les determinó la actividad citotóxica contra A. salina para
evaluar su inocuidad, encontrándose que la CL50 fue mayor a 1 mg/mL para todos los
extractos (Tabla 4).
Tabla 4. DL50 contra A. salina de los extractos etanólicos 95% y acuosos de hongos
comestibles
HONGO COMESTIBLE SOLVENTE
UTILIZADO CL50
Armillariella polymyces Etanol 95% -
Agua -
Boletus edulis Etanol 95% -
Agua -
Cantharellus lateritius Etanol 95% -
Agua -
Neolentinus ponderous Etanol 95% -
Agua -
Lactarius deliciosus Etanol 95% -
Agua -
Amanita garabitoana Etanol 95% -
Agua - (-) actividad citotóxica >1mg/mL
Fuente: FODECYT 30-2007
III.6.2 Actividad larvicida
A los extractos analizados se les determinó la actividad larvicida contra las larvas de los
cuatro estadíos de los mosquitos A. aegypti y A. albimanus, encontrándose que la CL50
fue mayor a 1 mg/mL para todos los extractos (Tabla 5).
47
Tabla 5. Actividad larvicida contra larvas de A. aegypti y A. albimanus de los extractos
de hongos comestibles.
HONGO COMESTIBLE SOLVENTE
UTILIZADO
CL50
Aedes
aegypti
Anopheles
albimanus
Armillariella polymyces Etanol 95% - -
Agua - -
Boletus edulis Etanol 95% - -
Agua - -
Cantharellus lateritius Etanol 95% - -
Agua - -
Neolentinus ponderous Etanol 95% - -
Agua - -
Lactarius deliciosus Etanol 95% - -
Agua - -
Amanita garabitoana Etanol 95% - -
Agua - - (-) actividad larvicida >1mg/mL
Fuente: FODECYT 30-2007
III.6.3 Actividad antifúngica
A los extractos etanólicos al 95% se les determinó su actividad antifúngica,
encontrándose que ninguno presenta actividad a una concentración de 1mg/mL (Tabla 6).
Tabla 6. Actividad antifúngica de extractos etanólicos al 95% de hongos comestibles
HONGOS
PATÓGENOS
HONGOS COMESTIBLES
A.
polymyces
B.
edulis
C.
lateritius
N.
ponderosus
L.
deliciosus
A.
garabitoana
Aspergillus flavus - - - - - -
Aspergillus fumigatus - - - - - -
Aspergillus niger - - - - - -
Microsporum
gypseum - - - - - -
Trichophyton rubrum - - - - - -
T. mentagrophytes - - - - - - (-) sin actividad 1mg/mL
Fuente: FODECYT 30-2007
A los extractos acuosos se les determinó su actividad antifúngica, encontrándose que
ninguno presenta actividad a una concentración de 1mg/mL (Tabla 7).
48
Tabla 7. Actividad antifúngica de extractos acuosos de hongos comestibles
HONGOS
PATÓGENOS
HONGOS COMESTIBLES
A.
polymyces
B.
edulis
C.
lateritius
N.
ponderosus
L.
deliciosus
A.
garabitoana
Aspergillus flavus - - - - - -
Aspergillus fumigatus - - - - - -
Aspergillus niger - - - - - -
Microsporum gypseum - - - - - -
Trichophyton rubrum - - - - - -
T. mentagrophytes - - - - - - (-) sin actividad 1mg/mL
Fuente: FODECYT 30-2007
III.6.4 Actividad antimicrobiana
A los extractos etanólicos al 95% se les determinó su actividad antimicrobiana,
encontrándose que ninguno presenta actividad a una concentración de 1mg/mL (Tabla 8).
Tabla 8. Actividad antimicrobiana de extractos etanólicos al 95% de hongos comestibles
MICROORGANISMOS
HONGOS COMESTIBLES
A.
polymyces
B.
edulis
C.
lateritius
N.
ponderosus
L.
deliciosus
A.
garabitoana
Staphylococcus aureus - - - - - -
Escherichia coli - - - - - -
Salmonella typhi - - - - - -
Mycobacterium smegmatis - - - - - -
Bacillus subtilis - - - - - -
Pseudomonas aeruginosa - - - - - -
Candida albicans - - - - - -
Cryptococcus neoformans - - - - - - (-) sin actividad 1mg/mL
Fuente: FODECYT 30-2007
A los extractos acuosos se les determinó su actividad antimicrobiana, encontrándose que
ninguno presenta actividad a una concentración de 1mg/mL, excepto A. garabitoana
(Tabla 9).
Tabla 9. Actividad antimicrobiana de extractos acuosos de hongos comestibles
MICROORGANISMOS
HONGOS COMESTIBLES
A.
polymyces
B.
edulis
C.
lateritius
N.
ponderosus
L.
deliciosus
A.
garabitoana
Staphylococcus aureus - - - - - 0.5 mg/dL
Escherichia coli - - - - - 0.5mg/dL
Salmonella typhi - - - - - -
Mycobacterium smegmatis - - - - - -
Bacillus subtilis - - - - - -
Pseudomonas aeruginosa - - - - - -
Candida albicans - - - - - -
Cryptococcus neoformans - - - - - - (-) sin actividad 1mg/mL Fuente: FODECYT 30-2007
49
III.6.5 Actividad inmunomoduladora
En las siguientes tablas se muestran los resultados obtenidos para el ensayo
linfoproliferativo de los extractos etanólicos y acuosos de los basidiomicetos analizados
en el estudio (tablas No. 10 y 11):
Tabla 10. Actividad inmunomoduladora para el ensayo linfoproliferativo
HONGO COMESTIBLE SOLVENTE
UTILIZADO
Actividad
1 mg/mL
Armillariella polymyces Etanol 95% Estimulatoria (33.82 %)
Agua Estimulatoria (53.64%)
Boletus edulis Etanol 95% Inhibitoria (29.76 %)
Agua Estimulatoria (70.26 %)
Cantharellus lateritius Etanol 95% Estimulatoria (17.77 %)
Agua Estimulatoria (59.85%)
Neolentinus ponderosus Etanol 95% Estimulatoria (30.75%)
Agua Inhibitoria (44.47 % )
Lactarius deliciosus Etanol 95% Estimulatoria (13.80%)
Agua Inhibitoria (30.21 %)
Amanita garabitoana Etanol 95% Estimulatoria (25.25%)
Agua Estimulatoria (17.18%) (porcentaje de actividad respecto a la lectina utilizada, en este caso PHA-M)
Fuente: FODECYT 30-2007
Los extractos que presentaron una actividad mayor al 55 % se les determinó la
Concentración Efectiva Mínima (CEM) encontrando que para el extracto de B. edulis es
de 125 μg/mL y en el caso de C. lateritius los porcentajes fueron muy similares en las
diferentes diluciones realizadas y que se muestran en la tabla a continuación:
Tabla 11. Determinación de Concentración Efectiva Mínima (CEM) de extractos
acuosos de B. edulis y C. lateritius para el ensayo linfoproliferativo
HONGO
COMESTIBLE
500
μg/mL
250
μg/mL
125
μg/mL
62.50
μg/mL
31.25
μg/mL
15.62
μg/mL
7.81
μg/mL
Boletus edulis 18.97% 10.50% 3.46% - - - -
Cantharellus lateritius 3.85 % 12.5 % 9.42% 5.38 % 8.72% 4.36 % 7.88 % (porcentaje de actividad respecto a la lectina utilizada, en este caso PHA-M)
Fuente: FODECYT 30-2007
III.6.6 Actividad sobre el Sistema de Complemento
El segundo ensayo in vitro realizado fue el análisis del Sistema de complemento,
evaluándose la actividad tanto de la vía clásica como la vía alterna (Tabla 12 y 13).
50
Tabla 12. Actividad inmunomoduladora de los extractos etanólicos al 95% y acuosos de
hongos comestibles sobre el Sistema de Complemento.
HONGO
COMESTIBLE
SOLVENTE
UTILIZADO
Vía clásica
(1 mg/mL)
Vía alterna
(1 mg/mL)
Armillariella polymyces Etanol 95% Inhibitoria (87.60%) Estimulatoria (103.03%)
Agua Inhibitoria (100.14%) Inhibitoria (54.20%)
Boletus edulis Etanol 95% Inhibitoria (73.70%) Estimulatoria (120.95%)
Agua Inhibitoria (99.60%) Estimulatoria (83.10%)
Cantharellus lateritius Etanol 95% Inhibitoria (109.00%) Estimulatoria (96.95%)
Agua Inhibitoria (99.50%) Estimulatoria (44.30%)
Neolentinus ponderosus Etanol 95% Inhibitoria (86.40%) Estimulatoria (123.25%)
Agua Inhibitoria (64.60%) Estimulatoria (86.00%)
Lactarius deliciosus Etanol 95% Inhibitoria (81.70%) Estimulatoria (87.90%)
Agua Inhibitoria (100.10%) Estimulatoria (60.80%)
Amanita garabitoana Etanol 95% Inhibitoria (65.60%) Estimulatoria (62.30%)
Agua Inhibitoria (71.60%) Estimulatoria (57.60%) Actividad estimulatoria: % de hemolisis producida. Actividad inhibitoria: % de inhibición de hemolisis
Fuente: FODECYT 30-2007
Tabla 13. Determinación de CI50 del ensayo hemolítico para la valoración de la Vía
Clásica del Sistema de Complemento para los extractos etanólicos al 95% y acuosos de
hongos comestibles.
HONGO
COMESTIBLE
SOLVENTE
UTILIZADO
333.33
μg/mL
111.11
μg/mL
37.04
μg/mL
12.34
μg/mL
4.11
μg/mL
1.37
μg/mL
Armillariella polymyces Etanol 95% 88.70% 82.10% 81.00% 81.90% 84.70% 86.10%
Agua 94.80% 90.20% 78.90% 67.20% 66.10% 58.50%
Boletus edulis Etanol 95% 73.10% 70.60% 70.70% 69.50% 69.80% 67.00%
Agua 95.00% 86.10% 71.00% 73.00% 63.00% 60.60%
Cantharellus lateritius Etanol 95% 103.00% 102.00% 102.00% 87.20% 83.00% 85.30%
Agua 85.20% 91.80% 88.70% 82.10% 77.00% 75.40%
Neolentinus ponderosus Etanol 95% 83.00% 82.10% 81.00% 82.90% 81.60% 77.60%
Agua 53.00% 48.20% 43.80% 42.10% 46.20% 40.60%
Lactarius deliciosus Etanol 95% 72.10% 71.30% 73.40% 76.00% 71.70% 80.60%
Agua 91.50% 81.00% 80.9% 68.00% 63.40% 60.90%
Amanita garabitoana Etanol 95% 61.70% 64.30% 61.80% 59.20% 61.40% 59.40%
Agua 68.70% 63.20% 65.10% 63.80% 67.30% 61.40% Los datos de la tabla se utilizan para determinar la CI50 por medio de una regresión lineal, que debe ser igual o
menor a 15 μg/mL .
Fuente: FODECYT 30-2007
Los datos de la tabla anterior muestran que en su mayoría el valor de la CI50 es menor a
1.37 μg/mL. La concentración exacta no es posible determinarla por ser muy pequeña.
51
Tabla 14. Determinación de CI50 del ensayo hemolítico para la valoración de la Vía
Alterna del Sistema de Complemento para los extractos etanólicos al 95% y acuosos de
hongos comestibles.
HONGO
COMESTIBLE
SOLVENTE
UTILIZADO
333.33
μg/mL
111.11
μg/mL
37.04
μg/mL
12.34
μg/mL
4.11
μg/mL
1.37
μg/mL
Armillariella polymyces Etanol 95% 122.72% 121.19% 123.21% 122.04% 134.19% 102.18%
Agua 47.60% 36.00% 33.00% 34.50% 32.10% 37.30%
Boletus edulis Etanol 95% 122.25% 120.61% 122.66% 120.82% 130.02% 137.45%
Agua 88.90% 91.70% 97.20% 93.40% 85.10% 92.50%
Cantharellus lateritius Etanol 95% 135.68% 121.22% 121.49% 130.47% 100.54% 128.04%
Agua 113.00% 107.00% 111.00% 102.00% 109.00% 117.00%
Neolentinus ponderosus Etanol 95% 118.13% 123.04% 117.45% 108.18% 105.85% 129.91%
Agua 86.40% 82.70% 87.00% 80.80% 87.10% 91.80%
Lactarius deliciosus Etanol 95% 178.00% 177.00% 122.00% 132.00% 131.00% 128.00%
Agua 62.40% 77.60% 71.70% 88.80% 84.30% 88.50%
Amanita garabitoana Etanol 95% 87.80% 88.10% 84.90% 80.30% 76.80% 75.70%
Agua 70.40% 92.80% 91.70% 95.60% 91.20% 82.70% Los datos de la tabla se utilizan para determinar la CI50 por medio de una regresión lineal, que debe ser igual o
menor a 15 μg/mL .
Fuente: FODECYT 30-2007
III.7 OBJETIVO 7.
Caracterizar la composición química y el análisis proximal de los hongos y
extractos.
III.7.1 Sólidos extraíbles
La determinación del porcentaje de sólidos extraíbles con diferentes concentraciones de
solvente determina la concentración más adecuada que extrae el mayor porcentaje de
sólidos. En la tabla 13 se puede observar que con la concentración de etanol al 50% se
obtuvo el mayor porcentaje de rendimiento en la mayoría de los hongos, excepto N.
ponderosus (Tabla 15).
Tabla 15. Cantidad de sólidos extraíbles con diferentes concentraciones de solvente
Especie
Etanol
Porcentaje de Sólidos Extraíbles
50% 70% 95%
Armillariella polymyces 14.56 14.15 3.07
Boletus edulis 24.31 18.39 5.71
Cantharellus lateritius 14.70 11.52 2.08
Neolentinus ponderosus 13.78 16.49 5.27
Lactarius deliciosus 14.76 14.62 2.62
Amanita garabitoana 23.82 23.23 7.00 Fuente: FODECYT 30-2007
52
III.7.2 Tamizaje fitoquímico
Resultados de pruebas macro y semimicro
Se realizó el tamizaje fitoquímico mediante ensayos macro y semimicro, utilizando
diversas pruebas preliminares de coloración y precipitación para la identificación de los
metabolitos secundarios, los cuales posteriormente fueron confirmados mediante
cromatografía en capa fina (Tabla 16-27).
Tabla 16. Prueba de alcaloides
Muestra Reactivo de
Mayer’s
Reactivo de
Dragendorff
Reactivo de
Wagner Resultado
A. garabitoana (+) (+) (+) Positivo
A. polymyces (+) (+) (+) Positivo
B. edulis (-) (+) (-) Positivo
C. lateritius (-) (+) (-) Positivo
L. deliciosus (-) (+) (-) Positivo
N. ponderosus (+) (+) (+) Positivo Fuente: FODECYT 30-2007
Tabla 17. Prueba de Flavonoides y Antocianinas
Fuente: FODECYT 30-2007
Tabla 18. Prueba de Antraquinonas
Muestra Bornträger Bornträger
Modificado Resultado
A. garabitoana (-) (-) Negativo
A. polymyces (-) (-) Negativo
B. edulis (-) (-) Negativo
C. lateritius (-) (-) Negativo
L. deliciosus (-) (-) Negativo
N. ponderosus (-) (-) Negativo
Fuente: FODECYT 30-2007
Muestra
Reactivo H2SO4 FeCl3 HCl + Δ Mg + HCl Álcali Resultado
A. garabitoana (-) (-) (-) (-) (+) Positivo
A. polymyces (+) (-) (+) (-) (+) Positivo
B. edulis (-) (+) (+) (-) (+) Positivo
C. lateritius (+) (-) (-) (-) (+) Positivo
L. deliciosus (+) (-) (-) (-) (+) Positivo
N. ponderosus (-) (-) (-) (-) (+) Positivo
53
Tabla 19. Prueba de Cardenólidos y Bufadienólidos
Muestra Lactonas
Insaturadas
Azúcares 2-
desoxigenadas Resultado
A. garabitoana (-) (+) Positivo
A. polymyces (-) (+) Positivo
B. edulis (-) (+) Positivo
C. lateritius (-) (+) Positivo
L. deliciosus (-) (+) Positivo
N. ponderosus (-) (+) Positivo
Fuente: FODECYT 30-2007
Tabla 20. Prueba de Esteroides y Triterpenoides
Muestra Lieberman-
Burchard
Ácido
Tricloroacético Carr-Price Resultado
A. garabitoana (-) (-) (-) Negativo
A. polymyces (-) (-) (-) Negativo
B. edulis (-) (-) (-) Negativo
C. lateritius (-) (-) (-) Negativo
L. deliciosus (-) (-) (-) Negativo
N. ponderosus (-) (-) (-) Negativo
Fuente: FODECYT 30-2007
Tabla 21. Prueba de Saponinas
Muestra Prueba de
Espuma Resultado
A. garabitoana (+) Positivo
A. polymyces (+) Positivo
B. edulis (-) Negativo
C. lateritius (+) Positivo
L. deliciosus (-) Negativo
N. ponderosus (+) Positivo
Fuente: FODECYT 30-2007
Tabla 22.: Prueba de Taninos
Muestra Gelatina 1% Gelatina-Sal FeCl3 10% Resultado
A. garabitoana (-) (-) (-) Negativo
A. polymyces (-) (-) (-) Negativo
B. edulis (-) (-) (-) Negativo
C. lateritius (-) (-) (-) Negativo
L. deliciosus (-) (-) (-) Negativo
N. ponderosus (-) (-) (-) Negativo
Fuente: FODECYT 30-2007
54
Tabla 23. Prueba de Glicósidos Cianogénicos
Fuente: FODECYT 30-2007
Tabla 24. Prueba de Esteroles Insaturados
Muestra Liebermann-
Burchard H2SO4 [ ] Resultado
A. garabitoana (-) (-) Negativo
A. polymyces (-) (-) Negativo
B. edulis (-) (+) Positivo
C. lateritius (-) (+) Positivo
L. deliciosus (-) (+) Positivo
N. ponderosus (-) (+) Positivo Fuente: FODECYT 30-2007
Tabla 25. Prueba de Cumarinas
Fuente: FODECYT 30-2007
Tabla 26. Prueba de Azúcares Reductores
Muestra Reactivo de
Benedict Resultado
A. garabitoana (+) Positivo
A. polymyces (+) Positivo
B. edulis (+) Positivo
C. lateritius (+) Positivo
L. deliciosus (+) Positivo
N. ponderosus (+) Positivo
Fuente: FODECYT 30-2007
Muestra Prueba de
Guignard Resultado
A. garabitoana (-) Negativo
A. polymyces (-) Negativo
B. edulis (-) Negativo
C. lateritius (-) Negativo
L. deliciosus (-) Negativo
N. ponderosus (-) Negativo
Muestra Fluorescencia con
KOH 0.5 N Resultado
A. garabitoana (-) Negativo
A. polymyces (-) Negativo
B. edulis (-) Negativo
C. lateritius (-) Negativo
L. deliciosus (-) Negativo
N. ponderosus (-) Negativo
55
Tabla 27. Prueba de Polisacáridos
Muestra H2SO4 [ ] +Timol Resultado
A. garabitoana (-) Negativo
A. polymyces (-) Negativo
B. edulis (-) Negativo
C. lateritius (-) Negativo
L. deliciosus (-) Negativo
N. ponderosus (-) Negativo
Fuente: FODECYT 30-2007
III.7.3 Resultados de la Cromatografía en capa fina
Para confirmar la presencia de los metabolitos secundarios se realizó la cromatografía en
capa fina para cada una de las especies en estudio (Tabla 28-32).
Tabla 28. Cromatografía en capa fina de Alcaloides
MUESTRA NO. DE
BANDAS VALOR RF
COLORACIÓN DE LA
BANDA
Estándar de Atropina 1 0.30 Naranja
Estándar de Ajmalina 1 0.40 Amarilla
Estándar de Papaverina 1 0.55 Naranja
Estándar de Reserpina 1 0.49 Amarilla
A. garabitoana
No se observó ninguna banda
A. polymyces
B. edulis
C. lateritius
L. deliciosus
N. ponderosus Fuente: FODECYT 30-2007
Fase móvil: Tolueno - Acetato de etilo - Dietilamina (70:20:10)
Detección: Reactivo de Dragendorff.
Tabla 29. Cromatografía en capa fina de Flavonoides y Antocianinas
MUESTRA NO. DE
BANDAS VALOR RF
COLORACIÓN UV DE LA
BANDA RESULTADO
Estándar de Quercetina 1 0.94 Amarilla – naranja ----------
Estándar de Rutina 2 0.56, 0.68 Amarilla, naranja ---------
A. garabitoana 2 0.5, 0.62 Amarilla, amarilla Positivo
A. polymyces No se observó ninguna banda Negativo
B. edulis 3 0.50, 0.63, 0.78 Amarilla, amarilla, amarilla Positivo
C. lateritius No se observó ninguna banda Negativo
L. deliciosus 3 0.37, 0.43, 0.63 Azul, amarilla, amarilla Positivo
N. ponderosus 2 0.29, 0.54 Verde, amarilla Positivo Fuente: FODECYT 30-2007
Fase móvil: acetato de etilo, ácido fórmico, ácido acético glacial-agua (100:11:11:27)
Detección: reactivo de Productos Naturales (NP/PEG).
56
Tabla 30. Cromatografía en capa fina de Saponinas
MUESTRA NO. DE
BANDAS VALOR RF
COLORACIÓN DE LA
BANDA RESULTADO
Estándar
Saponinas 0.1% 1 0.29 Café ---------------
A. garabitoana 5 0.29, 0.38, 0.51, 0.76 Verde, verde, verde,
verde, verde Positivo
A. polymyces 1 0.77 Verde Positivo
B. edulis 7 0.29, 0.34, 0.39, 0.51,
0.57, 0.61, 0.77
Verde, amarilla,
verde, amarilla,
verde, verde, verde
Positivo
C. lateritius 4 0.29, 0.39, 0.5, 0.6 Vede, azul, azul,
verde Positivo
L. deliciosus 5 0.29, 0.34, 0.53,
0.61,0.77
Verde, verde, verde,
verde, verde Positivo
N. ponderosus 4 0.29, 0.34, 0.51, 0.61 Verde, verde, verde,
verde, verde Positivo
Fuente: FODECYT 30-2007
Fase móvil: n-butanol-ácido acético-agua (50:10:40)
Detección: vainillina-ácido sulfúrico.
Tabla 31. Cromatografía en capa fina de Principios Amargos
MUESTRA NO. DE
BANDAS VALOR RF
COLORACIÓN DE LA
BANDA RESULTADO
Estándar Neurolaena
lobata 2 0.19, 0.84 Café, violeta -----------
A. garabitoana 2 0.63, 0.77 Violeta, violeta Positivo
A. polymyces No se observó ninguna banda Negativo
B. edulis 5 0.29, 0.5, 0.59,
0.65, 0.81
Violeta, amarilla,
violeta, amarilla, roja Positivo
C. lateritius 2 0.46, 0.59 Violeta, violeta Positivo
L. deliciosus 3 0.26, 0.59, 0.76 Violeta, violeta,
violeta Positivo
N. ponderosus 5 0.26, 0.47, 0.56,
0.59, 0.84
Violeta, violeta,
violeta, violeta, violeta Positivo
Fuente: FODECYT 30-2007
Fase móvil: Acetato de etilo – Metanol – Agua (39:8:4)
Detección: Vainillina - ácido sulfúrico
57
Tabla 32. Cromatografía en capa fina de Aceites Volátiles
MUESTRA VALOR RF COLORACIÓN UV RESULTADO
Estándar de citral 0.49 Café-azul ------------
Estándar de limoneno 0.59 Azul -----------
A. garabitoana 0.15, 0.82 Café, café Negativo
A. polymyces 0.15 Café Negativo
B. edulis 0.17, 0.79 Café, Café Negativo
C. lateritius No se observó ninguna banda Negativo
L. deliciosus 0.76 Café Negativo
N. ponderosus No se observó ninguna banda Negativo
Fuente: FODECYT 30-2007
Fase móvil: Tolueno:Acetato de Etilo (93:7)
Detección: Vainillina - ácido sulfúrico.
58
Resultados obtenidos en las diferentes pruebas cualitativas realizadas para la investigación de los metabolitos secundarios presentes en
las diferentes especies en estudio.
Tabla 33. Alcaloides, antraquinonas, cumarinas, cardenolidos y bufadenolidos y estreroides y triterpenoides
Alcaloides Antraquinonas Cumarinas Cardenólidos/Bufadienólidos
Esteroides/
Triterpenoides
M CCF M CCF M CCF
Lactonas
Insaturadas
Azúcares
2-desoxigenadas M
Armillariella polymyces + - - - - - - + -
Boletus edulis + - - - - - - + -
Cantharellus lateritius + - - - - - - + -
Neolentinus ponderosus + - - - - - - + -
Lactarius deliciosus + - - - - - - + -
Amanita garabitoana + - - - - - - + - Fuente: FODECYT 30-2007 M: macrométodo. CCF: cromatografía en capa fina
Tabla 34. Principios amargos, taninos, flavonoides y antocianinas, glicocidos cianogénicos, aceites volátiles, saponinas y
esteroides insaturados
Principios
amargos Taninos
Flavonoides/
Antocianinas
Glicósidos
cianogénicos
Aceites
volátiles Saponinas
Esteroles
insaturados
CCF M M CCF M CCF M CCF M
Armillariella polymyces - - - - - + + + -
Boletus edulis + - + + - + - + +
Cantharellus lateritius + - - - - - + + +
Neolentinus ponderosus + - + + - - + + +
Lactarius deliciosus + - + + - + - + +
Amanita garabitoana + - - + - + + + - Fuente: FODECYT 30-2007 M: macrométodo. CCF: cromatografía en capa fina
59
Tabla 35. Azúcares reductores y poliscáridos
Azúcares Reductores Polisacáridos
M M
Armillariella polymyces + -
Boletus edulis + -
Cantharellus lateritius + -
Neolentinus ponderosus + -
Lactarius deliciosus + -
Amanita garabitoana + - M: macrométodo.
Fuente: FODECYT 30-2007
III.7.4 Análisis de composición mineral
Concentraciones de Potasio(K), Hierro(Fe), Níquel(Ni), Cobre (Cu), Zinc (Zn), Manganeso (Mn), y Rubidio (Rb) de las muestras de
basidiomicetos analizadas (mg/kg de peso seco)
Tabla 36. Concentración de potasio (K), hierro (Fe), Niquel (Ni), cobre (Cu), cinc (Zn), manganeso (Mn) y plomo (Pb)
Concentración de Elementos
K Fe Ni Cu Zn Mn Rb
Armillariella polymyces 3289.11 41.11 31.04 13.87 27.61 5.12 14.57
Boletus edulis 965.89 51.99 ND 60.18 30.40 ND 23.81
Cantharellus lateritius 4318.79 184.43 22.37 127.37 85.26 ND ND
Neolentinus ponderosus 1913.74 43.55 37.52 ND 29.09 ND ND
Lactarius deliciosus 1020.87 53.32 19.03 9.56 25.14 ND 22.04
Amanita garabitoana 1826.53 61.02 19.66 14.69 23.22 ND 36.43 Fuente: FODECYT 30-2007. ND: No Detectado
60
III.8 OBJETIVO 8.
Preparar una Ficha Técnica de cada hongo colectado que incluya los resultados
obtenidos.
Fueron elaboradas fichas técnicas de los hongos estudiados. Cada ficha técnica contiene
una fotografía del basidiomiceto en su estado natural sin deshidratación y las datos que lo
describen según características macro y microscópicas. Son incluidos también datos
ambientales y referenciales. (Ver Anexos).
III.9 OBJETIVO 9.
Difundir los resultados a nivel nacional e internacional.
Los resultados obtenidos en la presente investigación deben ser dados a conocer tanto a
nivel nacional como internacional. En la Jornada Científica de la Facultad de CCQQ y
Farmacia en septiembre 2008 se realizó una comunicación en la modalidad de afiche,
para difundir el proyecto que estaba en curso, así como un Seminario de Graduación
realizado por estudiantes de la carrera de Químico Biólogo. (Ver Anexos).
61
III.10 DISCUSIÓN DE RESULTADOS
En el proceso de colecta de los macromicetos, así como la preparación y obtención de
extractos tanto etanólicos como acuosos de las seis especies de hongos, se evidenció la
dificultad de obtener cantidades adecuadas de materia prima, ya que su disponibilidad es
dependiente de múltiples condiciones ambientales imposibles de controlar. El material
fúngico depende principalmente de los ciclos de lluvia que en la actualidad no son
posibles de predecir. Una vez obtenida una cantidad adecuada, se encontró que el
rendimiento de estas especies es muy bajo. De las seis especies en estudio, la que mayor
rendimiento mostró fue Lactarius deliciosus con 28.2% y 23.4% en extracción etanólica
y acuosa, respectivamente. Las especies Armillariela polymyces y Cantharellus lateritius
mostraron el más bajo rendimiento en extracción etanólica y acuosa de 7.4 y 8.2 por
ciento la primera y 1.09 y 2.5 la segunda. A pesar de ello, se obtuvo la cantidad
suficiente para realizar los ensayos propuestos, aunque no es un buen índice para un
posible desarrollo como un producto farmacéutico futuro.
El ensayo de actividad citotóxica contra nauplios de Artemia salina así como el ensayo de
actividad larvicida contra los cuatro estadíos de Aedes aegypti y Anopheles albimanus
mostraron ausencia de actividad en todos los extractos evaluados, habiendo establecido
como punto de corte una concentración de 1 mg/mL (Tablas 2 y 3).
La actividad antimicrobiana y antilevadura fue realizada utilizando la metodología
descrita por Mitcher y colaboradores y la actividad antifúngica miceliar con la
metodología descrita por Brancato & Holding modificada por McRae. De los extractos
etanólicos y acuosos evaluados ninguno presentó actividad a una concentración de 1
mg/mL contra las cepas de bacterias gram positivo (B. subtilis, S. aureus), gram negativo
(S. typhi, , P. aeruginosa, E. coli), micobacterias (M. smegmatis), levaduras (C. albicans,
C. neoformans), hongos filamentosos (A.flavus, A.fumigatus, A.niger) ni hongos
dermatofitos (T. ruburum, T. mentagrophytes, M. gypseum). El único extracto que
presentó alguna actividad antimicrobiana fue el extracto acuoso de Amanita garabitoana,
el cual presentó una actividad inhibitoria contra S. aureus y E. coli a una concentración
inhibitoria mínima (CIM) de 0.5 mg/mL (Tablas 4-7). A pesar de que este basidiomiceto
presentó actividad biológica, dicha concentración no se considera significativa para un
uso farmacéutico, si se toma en cuenta además su limitado rendimiento.
La actividad inmunomoduladora evaluada con respecto a su efecto sobre la proliferación
de linfocitos mostró una actividad significativa de estimulación, en el extracto acuoso de
Boletus edulis, con una actividad estimuladora de la linfoproliferación a una
concentración efectiva mínima (CEM) de 125 μg/mL. Cantharelus lateritius mostró
también actividad estimuladora de la linfoproliferación, pero los resultados obtenidos no
siguen un efecto dosis-respuesta.
Al evaluar los resultados del ensayo linfoproliferativo en las otras especies, se observa
que la mayor parte de los extractos analizados presentan una actividad inespecífica de
estimulación. Dicho hallazgo puede sugerir estudios más exhaustivos de estas especies o
de otras nativas del país; en los que se midan las citocinas que dichos linfocitos puedan
62
estar produciendo y que causen la potenciación de la actividad del mitógeno empleado lo
que apoyaría su uso posterior como nutricéutico inmunoestimulante o
inmunopotenciador.
En cuanto al efecto de los extractos fúngicos sobre el sistema de complemento, tanto por
su vía clásica como la alterna, el extracto acuoso de A. polymyces fue el único que mostró
una actividad inhibitoria estadísticamente significativa, con una CI50 de 1.37 µg/mL.
Como parte del tamizaje fitoquímico se realizaron ensayos macro y semimicro donde se
evaluó la formación de precipitados y complejos coloreados; además en algunos casos se
realizó cromatografía en capa fina (CCF), para caracterizar y confirmar presencia o
ausencia de los metabolitos secundarios, ya que esta es una prueba más específica para la
identificación de determinados compuestos, para ello se cuenta con estándares y
reveladores que permiten diferenciar mediante la comparación de colores y bandas del
cromatograma la presencia o ausencia del metabolito en investigación. Se realizaron
ensayos para determinación de: alcaloides, flavonoides y antocianinas, saponinas,
cumarinas, taninos, esteroides y triterpenoides, glicósidos cianogénicos, antraquinonas,
cardenólidos y bufadienólidos, principios amargos, aceites volátiles, esteroles
insaturados, azúcares reductores y polisacáridos.
El Rf (factor de retención: medida de la migración de una sustancia determinada en un
disolvente dado) obtenido en la cromatografía en capa fina, de algunas muestras no
siempre coincidirá con los Rf’s de los estándares utilizados, ya que no siempre las
muestras poseen los compuestos contenidos en los estándares más comunes, y en el
laboratorio no se cuenta con mucha diversidad de estándares.
Como se puede observar en las tablas 31-33 tras la realización de las diferentes pruebas
para la investigación de los diferentes tipos de metabolitos secundarios, se encontraron
resultados negativos para los siguientes metabolitos secundarios: esteroides o
triterpenoides, taninos, glicósidos cianogénicos, lactonas insaturadas y polisacáridos, ya
que en las pruebas macrométricas no se observaron cambios de coloración o precipitación
característicos.
Se observaron los resultados de los ensayos macro y CCF para determinación de
cumarinas y antraquinonas respectivamente, ninguna de las especies en estudio reportó
resultados positivos al agregar los reactivos, ya que no se observaron cambios de
coloración o formación de precipitados característicos, en ensayo macrométrico, y en la
CCF no se detectaron bandas coloreadas en las muestras tras la aplicación de la solución
reveladora.
En la investigación de alcaloides, en el ensayo macro se obtuvo un resultado positivo en
todas las muestras; sin embargo, tras la realización de la cromatografía en capa fina las
muestras no desarrollaron bandas coloreadas, comparadas con las obtenidas con cada uno
de los estándares utilizados. Los resultados positivos obtenidos en el ensayo
macrométrico pudieron haber sido resultado de posibles interferentes, como proteínas o
63
sustancias que reaccionan con las sales, ya que estos reactivos no son específicos para
alcaloides, son un tipo de prueba presuntiva.
Se puede establecer la presencia de azúcares tanto reductores como azúcares 2-
desoxigenadas en las seis especies en estudio ya que los resultados obtenidos fueron
positivos en cada prueba.
Según los resultados que se muestran en la tabla 31 para el ensayo macrométrico de
flavonoides, se puede sospechar la presencia de flavonas, flavonoles e isoflavonas en A.
polymyces, B. edulis, C. lateritius, L. deliciosus ya que presentaron una coloración
amarilla la cual identifica la presencia de este tipo de compuestos en solución. En la
cromatografía en capa fina sin embargo A. polymyces y C. lateritius no presentaron
bandas por lo que se descarta que sean compuestos de ese tipo y por lo tanto el resultado
es un falso positivo en la prueba macrométrica. Se puede sospechar la presencia de
compuestos del tipo flavonoide en A. garabitoana, B. edulis, L. deliciosus y N.
ponderosus ya que presentaron una intensa fluorescencia en UV de 365 nm, además de
que estas especies desarrollaron una banda amarilla de Rf similar al del estándar de
Rutina.
Se determinó en el ensayo macro que A. garabitoana, A. polymyces, C. lateritius y N.
ponderosus presentaron un poco de formación de espuma característica de saponinas en
la prueba de espuma. En las especies B. edulis y L. deliciosus no se observó ninguna
formación de espuma. La formación de espuma que se observó fue mayor en A.
polymyces y N. ponderosus que el observado en A. garabitoana y C. lateritius. Las
saponinas se caracterizan por su capacidad para producir espuma cuando se agita una
solución acuosa.
La presencia de saponinas se confirmó mediante la cromatografía en capa fina, ya que la
prueba de espuma es un ensayo preliminar para determinar saponinas. Al realizar la
respectiva CCF, se observó que muchas de las bandas obtenidas son características de
saponinas (bandas color violeta, amarillo, verde, azul fluorescente bajo luz UV). La
mayoría de las bandas observadas no coincidieron con el estándar de saponinas, esto
demuestra que posiblemente si hay presencia de saponinas dentro de la composición de
las muestras, pero son de otro tipo de saponina.
Se determinó la presencia de principios amargos positiva para B. edullis, C. lateritius, N.
ponderosus, L. deliciosus y A. garabitoana ya que en la cromatografía en capa fina se
obtuvieron coloraciones similares a la del estándar de Neurolaena lobata, y las especies
B. edullis y N. ponderosus presentaron un Rf similar al estándar. Las demás bandas que
no coinciden con el estándar indican que las muestras poseen principios amargos de otro
tipo dentro de su composición. Se obtuvo resultado negativo para A. polymyces ya que no
se observó ninguna banda.
En la investigación de esteroles se obtuvo resultado positivo en la prueba de anillo en las
especies: B. edulis, C. lateritius, L. deliciosus y N. ponderosus ya que se observó la
64
formación del anillo color rojo en la interfase el cual es positivo para estos compuestos
sin embargo con el reactivo de Liebermann-Burchard las muestras resultaron negativas.
La investigación de aceites volátiles por medio de cromatografía en capa fina evidenció
la posible presencia de estos compuestos en A. garabitoana, A. polymyces, B. edulis y L.
deliciosus por lo que para corroborar los resultados se realizó el proceso de extracción de
aceites volátiles por hidrodestilación en Neoclevenger el cual es un proceso que se basa
en la destilación de agua para arrastrar los compuestos volátiles de la materia vegetal; sin
embargo tras la realización de este proceso no se obtuvo ninguna cantidad de aceite por
lo que se descarta la presencia de aceites volátiles en las especies estudiadas.
El análisis de composición mineral se llevó a cabo por medio de espectrometría de
Fluorescencia de Rayos X por reflexión Total (TXRF); las muestras fueron sometidas a
un proceso de digestión ácida previo para luego ser sometidas al análisis. Para cada
muestra se realizaron tres lecturas, de las cuales los resultados fueron promediados y se
calculó la cantidad, en miligramos, del elemento por cada kilogramo de peso seco de la
muestra. Fueron encontrados 7 elementos, de los cuales como se puede observar, el mas
abundante es el potasio, encontrándose el nivel más alto en C. lateritius y el más bajo en
B. edulis. El hierro se encontró en más alta concentración en C. lateritius y A. polymyces
presentó la concentración más baja para este elemento. El níquel se encontró en mayor
cantidad en N. ponderosus y la menor cantidad en L. deliciosus. C. lateritius presentó la
concentración más alta de cobre y L. deliciosus la más baja, este elemento no fue
encontrado en N. ponderosus. El zinc se encontró en mayor concentración en C. lateritius
y en menor proporcion en A. garabitoana. El manganeso se detectó únicamente en A.
polymyces. A. garabitoana presentó la mayor concentración de rubidio y la más baja la
presentó A. polymyces; en las muestras de C. lateritius y N. ponderosus no se detectó la
presencia de este elemento.
La técnica de Fluorescencia de Rayos X por reflexión Total (TXRF) se basa, en líneas
generales, en el estudio de las emisiones de fluorescencia de rayos X generados después
de la excitación de una muestra mediante una fuente de rayos X. Los átomos presentes
en la muestra analizada son excitados de modo que los electrones de las capas internas
son arrancados o promocionados a niveles de energía superiores. Los electrones de otras
capas minimizan su energía ocupando los huecos electrónicos que quedan libres, de
modo que la energía asociada a dichas transiciones se re-emiten en forma de fotones. A
estas emisiones se las conoce como emisiones de fluorescencia o radiación secundaria y
presentan unas energías características del átomo que las genera y una intensidad que
depende directamente de la concentración de dicho átomo en la muestra. El resultado es
un espectro de dispersión de energía, donde aparecen simultáneamente todas las líneas
asociadas a los elementos químicos presentes. Analizando la posición de los máximos de
intensidad, se identifican los elementos presentes (Análisis Cualitativo), integrando cada uno
de los perfiles elementales se obtienen sus proporciones másicas y añadiendo un elemento
patrón de concentración conocida se obtiene la cuantificación de dichos elementos (Análisis
Cuantitativo).
65
PARTE IV
IV.1 CONCLUSIONES
IV.1.1 Se obtuvieron muestras de seis especímenes de basidiomicetos comestibles de
Guatemala: Armillariella polymyces, Boletus edulis, Cantharellus lateritius, Neolentinus
ponderosus, Lactarius deliciosu y Amanita garabitoana.
IV.1.2 Se procesaron en condiciones apropiadas los especímenes colectados y se
depositaron en la Micoteca “Lic. Rubén Mayorga Peralta” de la Facultad de CCQQ y
Farmacia, USAC.
IV.1.3 Los bioensayos inmunomoduladores y biocidas fueron estandarizados para la
evaluación de extractos de hongos macroscópicos.
IV.1.4 Fueron obtenidos un extracto polares y uno apolar de cada una de las seis especies
de basidiomicetos colectados.
IV.1.5 Las características microscópicas de los basidiomicetos del estudio fueron
registradas e incluidas en la ficha técnica elaborada para cada una de las especies.
IV.1.6 Fueron aplicados los bioensayos para la determinación de la actividad
inmunomoduladora y biocida de los extractos de hongo.
IV.1.7 Se obtuvo la caracterización de la composición química de los hongos estudiados.
IV.1.8 Se obtuvo el mayor rendimiento en los extractos utilizando etanol a una
concentración del 50% como solvente extractor.
IV.1.9 El extracto etanólico al 95% con mayor porcentaje de rendimiento fue el extracto
de Lactarius deliciosus
IV.1.10 El extracto acuoso con mayor porcentaje de rendimiento fue el extracto de
Boletus edulis.
IV.1.11 Ninguno de los extractos etanólicos ni acuosos evaluados presentó actividad
citotóxica contra nauplios de A. salina ni actividad citotóxica contra larvas de A. aegypti
ni A. albimanus.
IV.1.12 El extracto acuoso de A. garabitoana fue el único que presentó una actividad
antimicrobiana contra S. aureus y E. coli a una concentración mínima inhibitoria de 0.5
mg/dL.
IV.1.13 Ninguno de los extractos etanólicos y acuosos evaluados presentó actividad
antifúngica contra hongos filamentosos (A.flavus, A.fumigatus, A.niger) ni hongos
dermatofitos (T. ruburum, T. mentagrophytes, M. gypseum).
66
IV.1.14 El extracto acuoso de Boletus edulis, fue el único que mostró una actividad
estimuladora de la linfoproliferación a una concentración efectiva mínima (CEM) de 125
μg/mL.
IV.1.15 El extracto acuoso de Armillariela polymyces fue el único que mostró una
actividad inhibitoria sobre el sistema de complemento, con una CI50 de 1.37 µg/mL.
IV.1.16 El tamizaje de metabolitos secundarios fue negativo para alcaloides, esteroides o
triterpenoides, taninos, glicósidos cianogénicos, cumarinas, antraquinonas, lactonas
insaturadas y polisacáridos en las seis especies analizadas.
IV.1.17 Los metabolitos secundarios encontrados en las especies estudiadas fueron
saponinas, principios amargos, flavonoides, azúcares reductores y azúcares 2-
desoxigenadas.
IV.1.18 A. garabitoana presentó dentro de su composición mineral la mayor cantidad de
elementos químicos Potasio (K), Hierro (Fe), Níquel (Ni), Cobre (Cu), Zinc (Zn),
Manganeso (Mn), y Rubidio (Rb).
IV.1.19 C. lateritius presentó los niveles de concentración más altos de los elementos:
Potasio (K), Hierro (Fe), Cobre (Cu), Zinc (Zn).
IV.1.20 N. ponderosus presentó una menor presencia de elementos químicos,
encontrándose Potasio (K), Hierro (Fe), Níquel (Ni) y Zinc (Zn).
67
IV.2 RECOMENDACIONES
IV.2.1 Continuar con la búsqueda de actividad inmunomoduladora de los hongos sobre
otros mecanismos inmunes, estandarizando nuevos bioensayos que midan la respuesta
inmune humoral, la actividad de macrófagos y fagocitosis, entre otros.
IV.2.2 Aplicar los mismos bioensayos de inmunomodulación a fracciones y compuestos
aislados de las especies fúngicas.
IV.2.3 Efectuar la búsqueda de actividad inmunomoduladora y biocida en especies
fúngicas susceptibles de cultivo y domesticación, para garantizar la disponibilidad de
materia prima.
68
IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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pseudoaureum y phlebodium decumanum.Facultad de Ciencias Químicas y
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IV.4 ANEXOS
IV.4.1 Extracción fitoquímica
Figura 9. Obtención de extractos para ensayos
Fuente: FODECYT 30-2007
IV.4.2 Citotoxicidad
Figura 10. Actividad citotóxica de extractos de N. ponderosus y A. polymyces (a) y (b),
así como nauplios vivos en un pozo de la placa del ensayo (c).
(a) (b) (c)
Fuente: FODECYT 30-2007
75
IV.4.3 Actividad larvicida
Figura 11. Actividad larvicida de extractos de los hongos a investigar contra larvas del
primer estadío de A. aegypti y A. albimanus (a) y del cuarto estadío (b), (c) y (d).
(a) (b) (c)
(d)
Fuente: FODECYT 30-2007
IV.4.4 Actividad antifúngica
Figura 12. Actividad antifúngica contra A. niger de los extractos etanólicos de A.
polymyces (a)(d)(g), B. edulis (b)(f), C. lateritius/N. ponderosus (c)(e)(h); así como los
extractos acuosos y etanólicos de L. deliciosus (i) y A. garabitoana (j).
(a) (b) (c)
(d) (e) (f)
76
(g) (h) (i)
(j)
Fuente: FODECYT 30-2007
Figura 13. Actividad antifúngica contra M. gypseum de extractos etanólicos de A.
polymyces (a), C. lateritius/N. ponderosus (b) y B. edulis (c), así como de sus extractos
acuosos: A. polymyces (d), B. edulis/C. lateritius (e) y N. ponderosus (f).
(a) (b) (c)
(d) (e) (f)
Fuente: FODECYT 30-2007
77
Figura 14. Actividad antifúngica contra T. rubrum de los extractos etanólicos de
Control/A. polymyces (a), Control/B. edulis (b) y Control/C. lateritius (c), así como los
extractos acuosos de A. polymyces (d), A. polymyces/B. edulis (e), C. lateritius/N.
ponderosus (f) y Control/N. ponderosus (g).
(a) (b) (c)
(d) (e) (f)
(g)
Fuente: FODECYT 30-2007
Figura 15. Actividad antifúngica contra T. mentagrophytes de los extractos acuosos de
Control/A. polymyces (a), B. edulis/C. lateritius (b), N. ponderosus (c).
(a) (b) (c)
Fuente: FODECYT 30-2007
78
Figura 16. Actividad antifúngica contra A. fumigatus de los extractos etanólicos de A.
polymyces/Control/B. edulis (a) y C. lateritius/N. ponderosus (b). Así como los extractos
acuosos de Control/A. polymyces (c), B. edulis/C. lateritius (d)(g), N. ponderosus (e)(f).
Actividad de los extractos etanólicos y acuosos de A. garabitoana (h) y L. deliciosus (i).
(a) (b) (c)
(d) (e) (f)
(g) (h) (i)
Fuente: FODECYT 30-2007
79
Figura 17. Actividad antifúngica contra A. flavus de los extractos etanólicos de
A.polymyces/Control (a), C. lateritius/N. ponderosus (b) y C. lateritius/B. edulis.
Actividad de los extractos acuosos de Control/C. lateritius (d), Control/A. polymyces (e),
Control/N. ponderosus. Actividad de los extractos etanólicos y acuosos de A.
garabitoana (g) y L. deliciosus (h).
(a) (b) (c)
(d) (e) (f)
(g) (h)
Fuente: FODECYT 30-2007 IV.4.5 Actividad antimicrobiana
Figura 18. Actividad antimicrobiana de los extractos acuosos de N. ponderosus (a), B.
edulis (b), C. lateritius (c), A. garabitoana (d), L. deliciosus (e); CIM de extracto acuoso
de A. garabitoana contra M. smegmatis/B. subtilis (f), S. typhi/P. aeruginosa (g), E. coli
(h)(i), S. aureus (h)(j); CIM de extracto acuoso de A. polymyces contra C. neoformans/S.
aureus (k). Actividad de los extractos etanólicos de N. ponderosus (l), A. polymyces (m),
A. garabitoana (n).
80
(a) (b) (c)
(d) (e) (f)
(g) (h) (i)
(j) (k) (l)
(m) (n)
Fuente: FODECYT 30-2007
81
IV.4.6 Actividad inmunomoduladora sobre la proliferación de linfocitos
Figura 19. Fases de separación de linfocitos hasta obtener la capa de mononucleares
Fuente: FODECYT 30-2007
Cuantificación de linfoproliferación, ensayo con XTT
Figura 20. Placa lista para lectura por espectofotometría, revelada con XTT.
Fuente: FODECYT 30-2007
82
IV.4.8 Sólidos extraíbles
Figura 21. Proceso de Precolación para la determinación del Porcentaje de Sólidos
Extraíbles
Fuente: FODECYT 30-2007
Figura 22. Evaporación a sequedad en cápsulas previamente taradas para determinar
sólidos extraíbles
Fuente: FODECYT 30-2007
83
Figura 23. Cantidad de sólidos extraídos después de evaporación a sequedad: (1)
Neolentinus ponderosus, (2) Amanita garabitoana, (3) Lactarius deliciosus
Fuente: FODECYT 30-2007
IV.4.9 Tamizaje fitoquímico
Figura 24. Preparación de soluciones metanólicas para realización de Tamizaje
Fitoquimico por medio de cromatografia en capa fina (CCF): (1) Amanita garabitoana,
(2) Armillariella polymyces, (3) Boletus edulis, (4) Cantharellus lateritius, (5) Lactarius
deliciosus, (6) Neolentinus ponderosus.
Fuente: FODECYT 30-2007
1 2 3 4 5 6
1
2
3
Etanol 50% Etanol 70% Etanol 95%
84
Figura 25. Preparación de la cromatoplaca para la realización de CCF para la
investigación de alcaloides
.
Fuente: FODECYT 30-2007
Figura 26. Placa para investigación de alcaloides colocada en la cámara cromatográfica
previamente saturada con la fase móvil
. Fuente: FODECYT 30-2007
85
Figura 27 .Placa cromatográfica vista bajo luz UV 365 nm. Resultado Negativo para
la presencia de Alcaloides: (1) Amanita garabitoana, (2) Armillariella polymyces, (3)
Boletus edulis, (4) Cantharellus lateritius, (5) Lactarius deliciosus, (6) Neolentinus
ponderosus. Estándar 1 (Std 1): Atropina; Estándar 2 (std 2): Papaverina
Fuente: FODECYT 30-2007
1 2 3 4 5 6 Std 1 Std 2
86
IV.4.10 Afiche presentado en la Jornada Científica de la Facultad de CCQQ y
Farmacia Septiembre de 2008
EVALUACIÓN INMUNOMODULADORA DE
BASIDIOMICETOS COMESTIBLES
Paz AM., Cáceres A., Álvarez E., Cáceres R., Guerrero K., Ramírez K.,
Oliva S., González N., Rodríguez CM., Sánchez S.Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología. Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología.
Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia, Universidad de San Carlos de Guatemala
Email: [email protected]
ANTECEDENTES
La medicina natural en Guatemala se enfocaprincipalmente a las plantas. A los hongosmuchas veces se les considera solamente unafuente alimenticia.Sin embargo, la medicina tradicional chinaatribuye propiedades medicinales a varioshongos comestibles los cuales se han utilizadocomo agentes inmunomoduladores,terapéuticos y profilácticos.
La actividad linfoproliferativa se determinamediante un bioensayo cuyo principioconsiste en la cuantificación de un productocromógeno derivado de la actividad delinfocitos sobre este compuesto, la cual esdirectamente proporcional al número delinfocitos viables. La actividad de losextractos se compara con una lectina(activadora de la linfoproliferación) y con unblanco de suspensión de linfocitos (sinlinfoproliferación).
La activación de las vías clásica y alternadel sistema del complemento se evalúa conlos ensayos hemolíticos descritos por Klerx.
RESUMEN: La ejecución del proyecto consiste en colectar 7 especies silvestres y 2cultivadas de hongos comestibles. Se prepararon extractos etanólicos y acuosos de lasespecies: Amanita garabitoana, Armillariella polymyces, Bolletus edulis, Cantharelluslateritius, Laccaria amethystina, Lactarius deliciosus, Neolentinus ponderosus y Pleurotusostreatus y se realizará la evaluación de su efecto inmunomodulador, buscando actividadsobre el proceso de linfoproliferación y sobre el sistema de complemento. Posteriormente serealizará el tamizaje químico de los mismos.
o
Neolentinusponderosus
j
k
l
m
n
Adicionalmente se evaluará la citotoxicidad y laactividad biocida (antibacteriana y angifúngica)de los extractos y se realizará un tamizajefitoquímico así como un análisis químico sobre lacomposición mineral y bromatológica de losbasidiomicetos.
AGRADECIMIENTOS
Al Depto. de Microbiología de la Facultad de CC. QQ. yFarmacia por su apoyo en la identificación y desecación delos hongos, especialmente al Lic. Osberth Morales.A la Licda. Isabel Gaitán del Depto. de Citohistología unreconocimiento especial.A SENACYT se agradece especialmente por el financiamientootorgado al Proyecto FODECYT 30-2007.
MATERIALES Y METODOS
Los especímenes fueron recolectados endiferentes regiones de la República deGuatemala:
Cantharellus lateritius (Berk.) Singerj,
Armillariella polymyces (Pers.:Letell) Sing. & Clem.k,
Laccaria amethystina (Huds.) Cookel,
Lactarius deliciosus (L.ex Fr.) S.F. Gray l,
Bolletus edulis Bull ex Fr. m,
Neolentinus ponderosus (O.K. Miller) Redh. & Ginnsk
Amanita garabitoana Tullos, Halling & G.M. Muell ln
Pleurotus ostreatus (Fr.) Rickl Se obtuvo en una
cooperativa de cultivo artesanal.
Se confirmó la identidad de cada hongorecolectado para luego desecarlos.
Se realizaron los extractos duros en etanol al95% y los extractos acuosos por sonicación yliofilización.
Cantharellus lateritiusLactarius deliciosus
Extractos etanólicos
Foto: Roberto Cáceres
Foto: Fred Stevens
Cantharelluslateritius
Bolletus edulis
Pleurotusostreatus
Localización geográfica de la colecta de los basidiomicetos.
87
IV.4.11 FICHAS TÉCNICAS DE LAS ESPECIES DE ESTUDIO
Armillariella polymyces Pers. ex Let.) Sing. & Clem.
Píleo: de 10 a 85 mm de diámetro, convexo a plano, centro deprimido, margen estriado,
borde ondulado, superficie viscosa, finamente escamosa principalmente en el centro
atenuándose hacia el borde, de color café naranja o rosáceo en jóvenes a café rojizo en
adultos y café negruzco en ejemplares viejos o dañados. Contexto carnoso, de color
blanquecino, de hasta 2 mm de ancho.
Himenio: láminas, adheridas a subdecurrentes, delgadas, juntas, borde liso, de color
rosado en jóvenes a café rojizo en ejemplares adultos o dañados.
Anillo: colgante como un aro, membranoso, de color blanco, blanco rosáceo o café claro.
Estípite: 30 a 163 mm de longitud, cilíndricos, superficie fibrilosa, finamente escamosa,
de color blanquecino a café naranja o café rojizo y café negruzco hacia la base. Contexto:
lleno, carnoso de color blanco.
Olor y sabor: a hongo.
Microscopia: esporas elipsoides, lisas de pared gruesa, inamiloides, de 7.0-8.0 x 5.0-6.5
µm.
Hábito: gregario.
Hábitat: sobre troncos de árboles frutales.
Lugar de procedencia: San Pedro Carcha, Alta Verapaz.
Observaciones: este hongo es consumido en el Departamento de Alta Verapaz, se conoce
tradicionalmente con el nombre de “Silip”. Su valor puede oscilar entre los Q20.00 y
Q25.00 la medida (canasto pequeño).
88
Boletus edulis Bull.
Píleo: de 64 a 216 mm de diámetro, convexo, margen recto, borde entero de color blanco,
superficie húmeda, de color café a café naranja; cutícula desprendible con contexto
blanco. Contexto lleno carnoso de color blanco, de hasta 22 mm de ancho.
Himenio: poros circulares a hexagonales, de 2 a 3 por mm, de color blanco cuando
jóvenes a amarillo oliva en adultos, al maltrato se tornan cafés a café naranja. Al corte
transversal se observan tubos en forma de flauta, adheridos a subadheridos, fácilmente
desprendibles de hasta 20mm de longitud, de color amarillo oliva en jóvenes a café
naranja en adultos o áreas lastimadas.
Estípite: de hasta 242 mm de longitud, de 23 a 40 mm diámetro ápice y de 60 a 80 mm
diámetro base, superficie reticulosa hacia el ápice de color blanco, café claro a café de
fondo y blanquecino en la base. Contexto lleno, carnoso, fibriloso, de color blanco.
Olor y sabor: a hongo, ligeramente a ajo.
Microscopia: esporas cilíndricas a baciliformes, lisas pared gruesa, dextrinoides, de 10.0-
16.0 x 3.0-5.0 m.
Hábito: solitario o en pequeños grupos espaciados (2 o 3).
Hábitat: sobre el suelo en bosques de Pinus.
Lugar de procedencia: Ixchiguan, San Marcos (cooperativa).
Propiedades medicinales: posee ocho aminoácidos esenciales y promueve una buena
saludad si se consume regularmente.
Farmacología: los extractos de los cuerpos fructíferos han demostrado poseer,
propiedades antitumorales en ratones (una tasa de inhibición del 100% contra el sarcoma
180 y una tasa de inhibición del 90% contra el carcinoma Ehrlich), que podría atribuirse
algún péptido o proteína. El micelio de B. edulis no parece poseer propiedades
antitumorales. Los polisacáridos de B. edulis tuvieron una acción antagónica y
neutralizante sobre los mediadores de inflamación.
Uso tradicional en Medicina: se ha utilizado para tendones y tiene un efecto positivo
sobre el lumbago, dolor de piernas, entumecimiento de las extremidades, incomodidad en
los huesos y tendones, tétanos y leucorrea. Dosis: 9 gramos, 3 veces al día.
Observaciones: este hongo es consumido en las regiones de Huehuetenango y San
Marcos, se conoce tradicionalmente como Panbuk en idioma Chuj. Su valor puede
oscilar entre los Q95 a Q120 la libra.
89
Neolentinus ponderosus (Miller) Redhead & Ginns
Píleo de 47 a 78 mm de diámetro, convexo a plano, margen incurvado a recto, borde
entero, superficie seca, escamosa radialmente acentuándose hacia el borde, color beige a
café naranja, escamas de color café oscuro a café claro. Cutícula desprendible. Contexto
de hasta 15 mm de grosor, color blanco, consistencia carnosa esponjosa que se mancha de
naranja pálido al corte.
Himenio con láminas subdecurrentes, juntas, anchas, denticuladas, las láminas se
continúan con una línea hacia el estípite, color blanco a amarillento a veces tiñéndose de
café naranja. Lamélulas subtruncadas.
Estípite de 55 mm de longitud, 15 mm de diámetro en el ápice y 12 mm de diámetro
hacia la base, cilíndrico, superficie escamosa principalmente en la parte media la base,
color blanco con escamas color café oscuro, se mancha de café naranja pálido.
Olor y sabor: a hongo, suave.
Microscopia: esporas cilíndricas, de pared delgada, inamiloides, de 7.0-10.0 x 3.0-4.0
m.
Hábito: Gregario.
Hábitat: Crece sobre troncos de Pinus spp.
Observaciones: se conoce como comestible en San Mateo Ixtatán, Huehuetenango.
90
Cantharellus lateritius (Berk.) Singer
Píleo: de 15 a 112 mm de diámetro, plano convexo a infundibuliforme, margen
incurvado lobulado, borde entero, superficie lisa, finamente escamosa de color café
naranja en el centro, sobre un fondo de color amarillo a amarillo naranja pálido o café
naranja en adultos. Contexto: carnoso, de color blanco que se torna naranja pálido al
corte, de hasta 9 mm de ancho.
Himenio: liso o ligeramente arrugado, amarillento.
Estípite: 20 a 88 mm de longitud, atenuado hacia la base, superficie lisa o finamente
fibrilosa, de color amarillo pálido hacia el ápice, amarillo naranja pálido en el medio y
café naranja hacia la base. Contexto: lleno, carnoso de color blanco que al corte se torna
naranja pálido.
Olor y sabor: afrutado, ligeramente amargo.
Microscopia: esporas elipsoides, hialinas de 7.0 a 9.0 x 5.0 a 7.0 µm.
Hábito: solitario o en pequeños grupos (2 o 4).
Hábitat: sobre el suelo en bosques de Encino o mixtos Pino-Encino.
Lugar de procedencia: San Raymundo, Guatemala.
Observaciones: este hongo es consumido en casi todo el país, se conoce
tradicionalmente con el nombre de Anacate. Su valor puede oscilar entre los Q20.00 y
Q40.00 la libra.
91
Lactarius deliciosus (L.: Fr.) Gray
Píleo: 30 a 95 mm de diámetro, plano convexo, centro deprimido, margen recto, borde
entero a crenado, superficie de color naranja, con áreas blanquecinas y verdosas,
levemente zonado, cutícula desprendible con contexto naranja. Contexto carnoso,
poroso, de color blanquecino a naranja, de hasta 9 mm de ancho.
Himenio: láminas juntas, subdecurrentes, anchas, con lamélulas subtruncadas, ambas con
bordes lisos y de color naranja, que con el maltrato o paso del tiempo se tornan verdosas.
Estípite: de hasta 66 mm de longitud, cilíndrico, superficie tomentosa, de color naranja a
verdoso en ejemplares dañados o viejos, con algunas áreas blanquecinas, presentan un
anillo tomentoso blanco en la unión con las láminas y escrobículos en la base y en
algunos ejemplares desde el ápice a la base. Contexto canoso, poroso, hueco en el centro,
de color blanco y naranja hacia la cutícula.
Olor y Sabor: a hongo.
Microscopia: esporas subglobosas a ampliamente elipsoides de pared gruesa,
espiculadas, con papila apical reducida, amiloides, de 5 a 8.5 x 7.5 a 8.0 µm.
Hábito: solitario o en pequeños grupos espaciados (2 a 7).
Hábitat: sobre el suelo en bosques de Pinus.
Lugar de procedencia: San Juan Comalapa, Chimaltenango.
Observaciones: es uno de los hongos más consumidos en casi todo el país, es conocido
tradicionalmente como Xara. Su valor puede oscilar entre los Q5 a Q15 la medida.
92
Amanita garabitoana Tulloss, Halling & G. M. Muell. nom. prov. 24.2007
Píleo: de 55 a 186 mm de diámetro, convexo en jóvenes a planoconvexo en adultos,
centro umbonado, superficie seca, margen estriado, borde entero, de color café en el
centro que se decolora a tonos café amarillentos o café naranjas hasta amarillos en el
margen, cutícula poco desprendible con contexto amarillo claro. Contexto lleno, carnoso,
blanco y amarillo naranja en la unión con la cutícula, de hasta 10mm de ancho.
Himenio: láminas, libres, anchas, juntas, con lamélulas subtruncadas de diferentes
longitudes, ambas con bordes aserrulados, de color amarillo pálido.
Anillo: colgante, cara externa finamente estriada, algodonosa, de color amarillo naranja;
cara interna, lisa, algodonosa, de color blanco.
Estípite: de hasta 182 mm de longitud, cilíndrico, con escamas de color café naranja o
amarillo naranja, sobre un fondo blanquecino. Contexto de hasta 3mm de grosor, hueco
en el centro, de color blanco y amarillo naranja hacia la cutícula.
Volva: sacciforme, bilobulada, cara externa con superficie rugosa de color blanco y cara
interna con superficie lisa de color blanco.
Olor y sabor: a hongo.
Hábito: solitario o en pequeños grupos espaciados (2 o 4).
Hábitat: sobre el suelo en bosques de Quercus.
Lugar de procedencia: Tecpán, Chimaltenango.
Observaciones: este hongo es consumido en las regiones de Chimaltenango con bosques
de encinos, se conoce tradicionalmente con el nombre de Q’atzu en idioma Kaqchikel.
Su valor puede oscilar entre los Q15 y Q30 la medida y si el ejemplar es muy grande se
vende individualmente entre Q10 y Q15 la unidad.
93
PARTE V
V.1 INFORME FINANCIERO
AD-R-0013
Nombre del Proyecto:
Numero del Proyecto: 030-2007
Investigador Principal: Licda. Ana Margarita Paz
Monto Autorizado: Q361,735.00
Fecha de Inicio y Finalización: 01/08/2007 AL 31/01/2009 18 MESES
Menos (-) Mas (+)
1 Servicios no personales
181
Estudios, investigaciones y proyectos de
factibilidad 135,750.00Q 128,000.00Q 7,750.00Q
181
Estudios, investigaciones y proyectos de
factibilidad (Evaluación externa de
impacto) 8,000.00Q 8,000.00Q
122 Impresión, encuadernación y reproducción 3,000.00Q 3,000.00Q
133 Viáticos en el interior 3,000.00Q 3,000.00Q
163
Mantenimiento y reparación de equipo
médico-sanitario y de laboratorio 6,000.00Q 6,000.00Q
2 MATERIALES Y SUMINISTROS
213 Productos animales 2,500.00Q 2,500.00Q
214
Productos agroforestales, madera, corcho
y sus manufacturas 1,000.00Q 1,000.00Q
241 Papel de escritorio 600.00Q 600.00Q
243 Productos de papel o cartón 1,000.00Q 1,000.00Q
245 Libros, revistas y periódicos 4,000.00Q 4,000.00Q
249
Otros productos de papel, cartón e
impresos 517.44Q -517.44 Q
261 Elementos y compuestos químicos 53,000.00Q 22,974.53Q 30,025.47Q
262 Combustibles y lubricantes 2,000.00Q 2,000.00Q
267 Tintes, pinturas y colorantes 1,000.00Q Q1,500.00 2,500.00Q
268 Productos plásticos, nylon, vinil y pvc 22,000.00Q Q8,002.00 9,415.64Q 4,582.36Q
269 Otros productos químicos y conexos 2,000.00Q 2,000.00Q
272 Productos de vidrio 4,000.00Q 2,451.81Q 1,548.19Q
283 Productos de metal 4,000.00Q 4,000.00Q
291 Útiles de oficina 1,000.00Q 1,000.00Q
292 Útiles de limpieza y productos sanitarios 1,500.00Q 1,500.00Q
295
Útiles menores, médico-quirúrgicos y de
laboratorio 2,500.00Q Q8,002.00 10,501.43Q 0.57Q
299 Otros materiales y suministros 3,000.00Q Q1,500.00 1,500.00Q
PROPIEDAD, PLANTA, EQUIPO E
INTANGIBLES
323 Equipo médico-quirúrgico y de laboratorio 65,000.00Q Q6,470.00 12,849.18Q 45,680.82Q
324 Equipo educacional, cultural y recreativo 3,000.00Q Q6,470.00 9,470.00Q
GASTOS DE ADMÓN. (10%) 32,885.00Q 32,885.00Q -Q
361,735.00Q Q15,972.00 Q15,972.00 219,595.03Q Q142,139.97
MONTO AUTORIZADO 361,735.00Q Disponibilidad 142,139.97Q
(-) EJECUTADO 219,595.03Q
SUBTOTAL 142,139.97Q
(-) CAJA CHICA
TOTAL POR EJECUTAR 142,139.97Q
CATORCEAVA CON VOCATORIA
LINEA FODECYT
En Ejecuciòn
Grupo
TRANSFERENCIA
Nombre del Gasto Asignacion
Presupuestaria Ejecutado
Composición química y actividad inmunomoduladora y biocida de Basidiomicetos
comestibles de Guatemala.
Renglon Pendiente de
Ejecutar