“Identificación de Carbohidratos y

Proteínas”

Bioquímica - Salud Individual Biolog.

Elaborado por: Departamento Ciencias Fisiológicas.

Revisado por: Dra. Zahira Quiñones, MD

Enero 2004.

Santiago, Rep. Dominicana Área Ciencias Fisiológicas.

Departamento de Medicina. PUCMM

I. Introducción

Los carbohidratos se presentan en forma de azúcares, almidones y fibras, y son uno de los tres principales macronutrientes que aportan energía al cuerpo humano (los otros son los lípidos y las proteínas). Actualmente está comprobado que al menos el 55% de las calorías diarias que ingerimos deberían provenir de los carbohidratos. Los carbohidratos o hidratos de carbono ó glúcidos constituyen compuestos químicos formados principalmente por carbono, hidrógeno y oxígeno, elementos que se conjugan para formar diversos tipos, en una proporción generalmente de 1:2:1, respectivamente. Estas biomoléculas ejercen funciones fundamentales en los seres vivos, como: soporte (celulosa), reserva de alimento (almidón), reserva energética (glucógeno), energía inmediata (glucosa). Pueden clasificarse atendiendo a varios criterios: de acuerdo al número de monómeros que constituyen al carbohidrato, al número de carbonos de sus monómeros, según el grupo funcional que posee ese monómero. Los aminoácidos, por su parte, son las unidades elementales constitutivas de las denominadas proteínas. En ocasiones, la hidrólisis de una proteína da lugar a estructuras que químicamente son diferentes de los 20 aminoácidos codificados por el ADN. En este caso, se trata por lo general de modificaciones postraduccionales. Además, hay aminoácidos no proteicos, que teniendo la misma estructura básica de los aminoácidos no forman parte de las proteínas.

Son sustancias cristalinas, casi siempre de sabor dulce; tienen tanto actividad ácida como propiedad básica y presentan actividad óptica. Químicamente son ácidos carbónicos con, por lo menos, un grupo amino por molécula. En la naturaleza existen unos 20 aminoácidos que pueden ser codificados por el ADN humano. Cada uno de ellos tiene una estructura química diferente, pero tienen en común, un grupo carboxilo y un grupo amino (excepto la prolina que tiene un grupo imino) unidos al denominado carbón quiral (excepto la glicina). La fórmula general para los 20 L- alfa aminoácidos, a pH fisiológico, es la siguiente:

Finalmente, deben mencionarse brevemente las proteínas. El término "proteína" proviene de la palabra griega proteous, que significa primero. Las proteínas son los compuestos bioquímicos más abundantes en los seres vivos. Son verdaderamente especiales por ser las sustancias centrales en casi todos los procesos biológicos.

A primera vista podría pensarse en las proteínas como polímeros lineales de aminoácidos

unidos entre sí por medio de enlaces peptídicos. Sin embargo, la secuencia lineal de aminoácidos puede adoptar múltiples conformaciones en el espacio. La estructura primaria viene determinada por la secuencia de aminoácidos en la cadena proteica, es decir, el número de aminoácidos presentes y el orden en que están enlazados. La conformación espacial de una proteína se analiza en términos de estructura secundaria y estructura terciaria. La estructura secundaria es el plegamiento que la estructura primaria adopta gracias a la formación de puentes de hidrógeno entre los átomos que forman el enlace peptídico. La estructura terciaria, en cambio, se refiere a la disposición tridimensional de todos los átomos que componen la proteína. La asociación de varias cadenas polipeptídicas origina un nivel superior de organización, la llamada estructura cuaternaria. Por último, la asociación de proteínas con otros tipos de biomoléculas para formar asociaciones supramoleculares con carácter permanente da lugar a la estructura quinaria.

Presentan numerosas funciones. Por ejemplo, casi todas las enzimas están compuestas de

estructuras proteicas. Las enzimas son los catalizadores que permiten que ocurran casi todas las reacciones químicas en los seres vivos. La vida, como la conocemos no sería posible sin las enzimas. Junto con los lípidos, las proteínas son los componentes estructurales de las membranas celulares. Las proteínas de las membranas ayudan a transportar sustancias a través de la doble capa lipídica y trabajan como sitios receptores de los neurotransmisores y de las hormonas.

Las proteínas son responsables del soporte estructural y del movimiento del cuerpo

humano. El tejido conectivo está compuesto de fibras proteicas fuertes que ayudan a unir la piel y el hueso. Los tejidos musculares están compuestos de proteínas que se contraen; los huesos se mueven por músculos que se contraen.

Otras funciones de las proteínas incluyen el transporte y almacenamiento de iones y

moléculas; por ejemplo, transportar el oxígeno de los pulmones a las células (hemoglobina). Numerosas hormonas, agentes de comunicación química, son estructuras proteicas. Una de las líneas de defensa más importantes contra los agentes infecciosos son las proteínas denominadas inmunoglobulinas. Las proteínas son polímeros de condensación de los aminoácidos, algunas proteínas contienen cientos de aminoácidos, y en algunos casos miles, en estructuras de cadenas altamente organizadas. La polimerización de los aminoácidos se hace con la formación de enlaces peptídicos (amida), al unirse el grupo carboxilo del ácido de un aminoácido con el grupo amino del siguiente aminoácido y produciendo una molécula de agua. Por eso, la unión de varios aminoácidos origina los oligopéptidos y polipéptidos (proteínas de más de 50 aminoácidos). II. Objetivos

1. Estudiar la estructura, propiedades, funciones y clasificación de los carbohidratos, aminoácidos, péptidos y proteínas.

2. Conocer y demostrar pruebas que identifiquen aminoácidos, proteínas y/o carbohidratos y su utilidad.

III. Equipos, materiales y reactivos

3a. Equipos -Plato caliente 3b. Reactivos -Solución de ovoalbúmina 10% (diluir 10 gramos en 100 mL) -Solución de glicina 0.1 M -Soluciones de carbohidratos al 1%: glucosa, maltosa, manosa, ribosa, galactosa, fructosa, sacarosa, lactosa -Reactivo de Ninhidrina -Reactivo de Biuret -Reactivo de Millón -HNO3 concentrado -NH4OH concentrado -Reactivo de Molish -H2SO4 concentrado -Reactivo de Benedict -Reactivo de Seliwanoff -Agua destilada

3c. Materiales -Tubos de ensayo -Probetas de 10 mL -Vasos de precipitado 50, 500 mL -Goteros -Gradillas -Pinzas para tubos de ensayo -Crayones -Botellín de lavado -Servilletas -Gafas protectoras

IV. Procedimiento Experimento No. 1: Identificación de Aminoácidos y Proteínas

1. Reacción de Ninhidrina

Tiene como objetivo detectar y cuantificar cantidades de aminoácidos libres. Los aminoácidos, en general reaccionan con la ninhidrina (hidrato de hicelohidrandeno) cuando son calentados con un exceso de la misma. Todos los aminoácidos que poseen un grupo amino libre reaccionan y forman dióxido de carbono, amoníaco y un aldehído que contiene un átomo de carbono menos que el compuesto original. Esta reacción da lugar a la formación de un producto color azul o púrpura (que posteriormente puede ser utilizado para cuantificar el aminoácido). En el caso de la prolina, que estructuralmente no posee el grupo amino libre, sino un grupo imino, la

coloración final es amarilla. El amoníaco, la mayoría de los polipéptidos y las proteínas pueden desarrollar coloración en esta reacción, pero a diferencia de los aminoácidos, no liberan CO2. Recuerde que la coloración azulada o violeta será proporcional a la concentración del aminoácido. La reacción entre una aminoácido y la ninhidrina es la siguiente:

Realización de la prueba: se toman y rotulan tres tubos de ensayo Pyrex diferentes (1, 2 y 3). En cada uno de ellos se depositan 2 mL de solución de ovoalbúmina 10%, solución de glicina 0.1 M y agua destilada, respectivamente. Luego se añaden 5 gotas del reactivo de ninhidrina y se colocan los tubos en un baño de María a 100° C por 1 minuto. Deje enfriar. Anote los resultados en la tabla No. 1 al final del formato de práctica.

2. Reacción de Biuret

El nombre de la reacción procede del compuesto coloreado formado por la condensación de dos moléculas de úrea con eliminación de amoníaco. Esta reacción está dada por aquellas sustancias cuyas moléculas contienen dos grupos carbamino (-CO.NH) unidos directamente o a través de un solo átomo de carbono o nitrógeno. El reactivo de Biuret contiene Cu2SO4 en solución acuosa alcalina (gracias a la presencia de NaOH o KOH). La reacción se basa en la formación de un complejo de coordinación entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del nitrógeno que forma parte de los enlaces peptídicos. Esta última reacción provoca un cambio de coloración: violeta púrpura o violeta rosado. Debe señalarse que el color depende de la naturaleza de las proteínas; proteínas y péptidos dan un color rosado; la gelatina da un color azul.

Realización de la prueba: se toman y rotulan tres tubos de ensayo diferentes (1, 2 y 3). En cada uno de ellos se depositan 2 mL de solución de ovoalbúmina 10%, solución de glicina 0.1 M y agua destilada, respectivamente. Luego se añaden 2 mL del reactivo de Biuret. NO SE APLICA CALOR. Anote los resultados en la tabla No. 1 al final del formato de práctica.

3. Reacción de Millón

La reacción del Millón se debe a la presencia del grupo hidroxifenilo en la molécula proteica. Cualquier compuesto fenólico que no esté sustituido en la posición 3,5 como la tirosina, el fenol y el timol producen resultados positivos en esta reacción. De estos compuestos, sólo la tirosina está presente en las proteínas, de manera que sólo las proteínas que tienen este aminoácido ofrecen resultados positivos. En esta prueba los compuestos mercúricos en medio fuertemente ácido (ácido nítrico del reactivo) se condensan con el grupo fenólico formando un compuesto de color rojo ladrillo o rojizo. La prueba no es satisfactoria para soluciones que contienen sales inorgánicas en gran cantidad, ya que el mercurio del reactivo del Millón es precipitado y se vuelve negativo, razón por la cual este reactivo no se usa para medir albúmina en orina. Debe tomarse en cuenta que en el caso de que la solución a examinar sea muy alcalina, debe ser previamente neutralizada, ya que el álcali precipitaría al ion mercurio en forma de óxidos amarillos. Además, proteínas como la ovoalbúmina producen un precipitado blanco que progresivamente por acción del calor se torna rojo; pero, las peptonas, dan solamente una solución de color rojo.

Realización de la prueba: se toman y rotulan tres tubos de ensayo Pyrex diferentes (1, 2 y 3). En cada uno de ellos se depositan 2 mL de solución de ovoalbúmina 10%, solución de glicina 0.1 M y agua destilada, respectivamente. Se añaden 3 ó 4 gotas del reactivo de millón y se colocan los tubos en un baño de María a 100° C por 1-2 minutos. Se observan los cambios. Si no llega a desarrollarse color, pueden añadirse 2 ó 3 gotas más del reactivo de Millón y calentar nuevamente por igual período de tiempo. ¡CUIDADO! Evite el exceso de reactivo ya que puede producir un color amarillo que no es indicativo de positividad. Anote los resultados en la tabla No. 1 al final del formato de práctica.

4. Reacción de Xantoproteica

Esta prueba caracteriza a los aminoácidos aromáticos. Esta reacción se debe la presencia de un grupo fenilo en la molécula proteica. Los complejos de la molécula proteica que son de importancia en esta reacción son la tirosina y el triptófano. La fenilalanina no reacciona en las condiciones que se realiza en el laboratorio. Para esta prueba se produce la nitración del anillo bencénico presente en los aminoácidos obteniéndose nitrocompuestos de color amarillo, que se vuelven anaranjados en medio fuertemente alcalino (formación de ácido picrámico o trinitrofenol). No puede realizarse esa reacción para identificar albúmina en orina, por el color anaranjado de la reacción final.

Realización de la prueba: se toman y rotulan tres tubos de ensayo Pyrex diferentes (1, 2 y 3). En cada uno de ellos se depositan 2 mL de solución de ovoalbúmina 10%, solución de glicina 0.1 M y agua destilada, respectivamente. Se añade 1mL de HNO3 concentrado. ¡CUIDADO AL AGREGAR EL ÁCIDO! Se colocan los tubos en un baño de María a 100° C por 1 minuto. Se observan los cambios. Deje enfriar. Añada cuidadosamente solución de hidróxido de amonio concentrado (hidróxido de sodio concentrado) en exceso. Observe la coloración nuevamente. Anote los resultados en la tabla No. 1 al final del formato de práctica.

Experimento No. 2: Identificación de Carbohidratos

1. Reacción de Molisch

La presencia de carbohidratos en una muestra se pone de manifiesto por la reacción de Molisch, que a cierto punto es la reacción universal para cualquier carbohidrato. Se basa en la acción hidrolizante y deshidratante del ácido sulfúrico sobre los hidratos de carbono. En dicha reacción el ácido sulfúrico cataliza la hidrólisis de los enlaces glucosídicos de la muestra y la deshidratación a furfural (en las pentosas) o hidroximetilfurfural (en las hexosas). Estos furfurales se condensan con el alfa naftol del reactivo de Molisch (reacción de Molisch) dando un producto coloreado.

Realización de la prueba: se toman y rotulan nueve tubos de ensayo Pyrex diferentes (1 al 9). En cada uno de ellos se depositan 2 mL de las distintas soluciones de carbohidratos al 1% (glucosa, fructosa, galactosa, manosa, ribosa, sacarosa, lactosa, maltosa) y agua destilada. Agregue dos gotas de reactivo de Molisch y mezcle bien. Luego incline el tubo y deposite 1 mL de H2SO4 concentrado deslizándolo lentamente por la pared del tubo. No mezcle. Sólo coloque el tubo en posición vertical y observe la formación del anillo rojo violeta que aparece en la zona de contacto de los dos líquidos. Anote los resultados en la tabla No. 2 al final del formato de práctica.

2. Reacción de Benedict

Una de las reacciones más comunes en la identificación de carbohidratos es la reacción de Benedict. Esta reacción es específica para azúcares con grupo reductores libres (C=O). Todos los monosacáridos poseen un grupo reductor libre. Los disacáridos maltosa y lactosa tienen grupos reductores libres, pero la sacarosa no los posee, ya que se pierden los grupos reductores de sus componentes cuando ésta es formada.

Se basa en la capacidad del carbohidrato de reducir el Cu2+ en un medio alcalino. Este Cu1+ se oxida y precipita en forma de Cu2O, lo que proporciona la coloración positiva de la reacción. La coloración dependerá de la concentración de óxido de cobre y ésta a su vez de la reducción del cobre; va desde verde, amarillo, anaranjado o rojizo, dependiendo de la coloración.

Realización de la prueba: se toman y rotulan nueve tubos de ensayo Pyrex diferentes (1 al 9). En cada uno de ellos se depositan 2 mL de las distintas soluciones de carbohidratos al 1% (glucosa, fructosa, galactosa, manosa, ribosa, sacarosa, lactosa, maltosa) y agua destilada. Agregue 2 mL del reactivo de Benedict y proceda a colocar los tubos de ensayo en un baño de María a 100° C durante dos minutos. Deje enfriar y observe la coloración en cada uno de los tubos. Anote los resultados en la tabla No. 2 al final del formato de práctica.

3. Reacción de Seliwanoff

Los carbohidratos se clasifican como cetosas o aldosas. Vale decir, que las cetosas en el carbono 2 tienen una función cetona, que en presencia de un ácido fuerte producen rápidamente

derivados furfúricos que reaccionan con un difenol llamado resorcina que está contenido en el reactivo de Seliwanoff. La sacarosa (un disacárido formado por glucosa y fructosa) y la inulina (un polisacárido de la fructosa) dan positiva la reacción, ya que el HCl del reactivo provoca en caliente la hidrólisis del compuesto liberando fructosa (responsable de la reacción positiva).

Realización de la prueba: se toman y rotulan nueve tubos de ensayo Pyrex diferentes (1 al 9). En cada uno de ellos se depositan 2 mL de las distintas soluciones de carbohidratos al 1% (glucosa, fructosa, galactosa, manosa, ribosa, sacarosa, lactosa, maltosa) y agua destilada. Agregue 2 mL del reactivo de Seliwanoff y proceda a colocar los tubos de ensayo en un baño de María a 100° C durante un minuto. Deje enfriar y observe la coloración en cada uno de los tubos. Anote los resultados en la tabla No. 2 al final del formato de práctica.

Tabla No. 1: Identificación de Aminoácidos y Proteínas

Resultados Tubos Ninhidrina Biuret Millón Xantoproteica

Ovoalbúmina 10%

Glicina 0.1M

Agua destilada

Tabla No. 1: Identificación de Carbohidratos

Resultados Tubos Molisch Benedict Seliwanoff

Glucosa 1% Maltosa 1% Manosa 1% Ribosa 1% Galactosa 1% Fructosa 1% Lactosa 1% Sacarosa 1% Agua destilada