Dr. Luis ZapataUnidad de Histología Normal

HBLT

Histología del griego (histo= tejido y logos= estudio),

Es la ciencia que estudia la estructura microscópica de las células, tejidos y órganos, su desarrollo y sus funciones.

Establece la relación entre forma y función. El desarrollo de la histología está ligado a la

aparición del microscopio

El origen del microscopio es incierto. Varias naciones se atribuyen su invención.

Una breve reseña de hechos nos permite entender que la invención del microscopio proviene de diversos personajes que coincidentemente tuvieron la misma visión en los siglos XVI y XVII en diferentes países.

El primer microscopio compuesto fue inventado, por casualidad en experimentos con lentes.

Los holandeses Hans y Zacharias Janssen (padre e hijo) inventaron en 1590 el microscopio compuesto (2 lentes).

Leonardo Da Vinci se refirió a la necesidad del uso de lentes para facilitar la visión y posterior estudio de imágenes pequeñas.

A Cristian Huygens (holandés) se le atribuye también la invención del microscopio compuesto

Galileo (italiano) y Cornelius Drebbel, por encargo de éste fabricaron un microscopio compuesto.

También se atribuye a Antonie van Leeuwenhoek (holandés),  la invención y en especial el perfeccionamiento del microscopio usando lentes pequeñas, potentes, de calidad, y su artefacto era de menor tamaño.

Trabajando conjuntamente con Cristian Huygens se les atribuye la descripción por primera vez de bacterias, protozoos, espermatozoides y glóbulos rojos mediante el uso de microscopios.

Marcello Malpighi usó del término "sáculos" para identificar a las células y llamó "tubos" a los vasos sanguíneos. Observó riñones y descubrió los glomérulos, exploró el bazo y describió los corpúsculos que llevan su nombre.

Jan Swammerdam describió glóbulos rojos y Crisóstomo Martínez, estructuras óseas

Robert Hooke logró plasmar en su obra "Micrographia" una pormenorizada descripción de la estructura microscópica de tallos y hojas introduciendo por primera vez, el término "cellula" identificando cada una de las celdas iguales (al estilo de un panal de abeja) que había logrado observar en sus trabajos con corcho.

Caspar Wolff describió a sus "glóbulos" como la "fuerza esencial"

Bichat, reconocido como el Padre de la Histología, postuló la importancia de lo funcional más que de lo morfológico, definiéndolo como: "una parte homogénea de los territorios orgánicos que muestra una estructura común e idénticas propiedades".

Su obra, "Anatomía General" se convertiría en un punto de inflexión en esta historia.

Nicol desarrolló la microscopía con luz polarizada. Schleiden y Schwann proponen la teoría de la célula

y declaran que la célula nucleada es la unidad estructural y funcional en plantas y animales.

Virchow completa la teoría celular con su frase “omni cellula et cellula”

J. Quekett publica un tratado práctico sobre el uso del microscopio.

Abbé analiza los efectos de la difracción en la formación de la imagen en el microscopio y diseñó el condensador que permite mejorar la iluminación.

Retzius describe gran número de tejidos animales con un detalle que no ha sido superado por ningún otro microscopista de luz.

Cajal y otros histólogos entre ellos Retzius desarrollan nuevos métodos de tinción y proponen los fundamentos de la anatomía microscópica.

Zeiss fabrica una serie de lentes, diseño de Abbé que permiten al microscopista resolver estructuras en los límites teóricos de la luz visible.

Köhler y Siedentopf desarrollan el microscopio de fluorescencia.

Lebedeff diseña y construye el primer microscopio de interferencia.

Zernike inventa el microscopio de contraste de fases.

Ernst Ruska y Max Knoll, físicos alemanes, construyen el primer microscopio electrónico.

NINIVE

JANSSEN 1590

GALILEO 1610

LEEWENHOEK 1632

HOOKE 1678 FRANCES

1686

s. XVIII / s. XIX

DARWIN 1840 DOLOND

1840

MICROSCOPIOS SIMPLESMICROSCOPIOS COMPUESTOS

1908 1916 s XX

MICROSCOPIO TELESCOPIO

MICROSCOPIO DE BOLSILLO

MICROSCOPIO DE MICROFOTOGRAFIA

MICROSCOPIO BINOCULAR MICROSCOPIO ELECTRONICO

Método de la Histología• La histología, al igual que otras ciencias morfológicas, pertenece a la categoría de las ciencias básicas

• Al formular la concepción científica del mundo sobre la regularidad de la estructura y la actividad vital del organismo en estado normal que se puede alterar en estado patológico.

• El principal método de estudio histológico es el microscópico y su objeto de estudio son los preparados de tejidos fijados y coloreados (técnica histológica).

• La histología desde su surgimiento hasta nuestros días está relacionada con el desarrollo de las técnicas ópticas y los métodos para la microscopia.

• Los logros en las investigaciones microscópicas hicieron posible el bagaje de nuevas informaciones y generalizaciones teóricas.

Serie de pasos que han de darse para obtener un preparado observable con el microscopio óptico

Mediato (post mortem)

Inmediato (in vivo)

Métodos de examen

Toma de muestra

Fijación

Deshidratación

Preparación para la inclusión

Inclusión

Modelado del bloque –

catalogación

Sección con el micrótomo

extendido de los cortes –

pegado

Coloraciones: de rutina o

especiales

Toma de muestra

Fijación

Deshidratación

Preparación para la inclusión

Inclusión

Modelado del bloque –

catalogación

Sección con el micrótomo

extendido de los cortes –

pegado

Coloraciones: de rutina o

especiales

Las glándulas exocrinas y endocrinas lo más rápidamente posible.

El páncreas y el riñón deben extraerse no más de 10 a 15 min.

Otros órganos tales como intestino delgado y/o grueso, estómago, hígado, se deben extraer no más allá de los 30 min.

Los músculos esqueléticos, huesos, piel, encéfalo, médula, ganglios nerviosos no deben extraerse más allá de 60 min.

El muestreo debe realizarse antes de:

Autólisis y/o Putrefacción

Los tejidos y órganos se han de extraer considerando las siguientes prioridades:

24 horas No deben ser mayores de 1 cm de espesor; deben ser tomados en ángulos rectos a la superficie de los órganos.

A veces pueden cortarse trozos de órganos de mayor tamaño, 2 o 3 cm y luego de algunas horas en fijador en que las piezas están más fáciles de manejar, se realizan cortes más pequeños de los mismos.

La cantidad de líquido fijador en microscopia óptica debe ser aproximadamente 10 a 20 veces el volumen de la muestra.

Una buena fijación debe:

1. Actuar con rapidez, matando y fijando a las células antes de que aparezcan los fenómenos agónicos o post-mortem (autólisis, desintegración, etc.)

2. Poseer alto poder de penetración para asegurar la fijación correcta hasta en las capas profundas de la pieza a fijar

3. Conservar, en lo posible, los detalles estructurales que presentaban in vivo

4. Permitir o favorecer el empleo de los procedimientos necesarios para su observación ulterior (ejecución de cortes, coloración, etc.)

5. Impedir la desaparición de los elementos solubles durante la fijación o después de ella

6. No provocar o impedir la producción de estructuras artificiales

7. No retraer excesivamente los tejidos ni volverlos friables o quebradizos

Es una operación destinada a provocar la “MUERTE” de las células, conservándolas, cuanto sea posible en el estado en que están durante la vida.

Coagulando las proteínas sin combinarse con ellas (alcohol, ácido pícrico, yodo, calor)

Formando combinaciones químicas con las sustancias orgánicas (ácido crómico y sus sales)

Reduciéndose en contacto con las mismas y originando en su seno un precipitado sumamente fino (ácido ósmico, bicloruro de mercurio, cloruro de oro)

La mayor parte de los fijadores actúan como oxidantes, favoreciendo así la coloración ulterior de los tejidos

Formol al 10%

Alcohol etílico absoluto o de 96%

Alcohol metílico

Ácido ósmico al 1 ó 2%

Bicromato de potasio al 3-5%

Químicos

SIMPLES

COMPUESTOS

Líquido de Fleming, mezcla cromo-osmio-acética.

Líquido de Zenker, mezcla bicromato-sublimado-

acética.

Líquido de Helly, mezcla Zenker-formol.

Líquido de Bouin, mezcla picro-formos-acética.

Liquido de Duboscq-Brasil, o Bouin alcohólico

FÍSICOS Desecación, Calor seco, Calor húmedo, Frío y Congelación y desecación

Los tejidos contienen grandes cantidades de agua, tanto intracelular como extracelular, que debe ser eliminada y reemplazada por parafina

Lavado en agua o alcohol

Deshidratación

Una lámina en un caja de deshidratación

La deshidratación se hace en forma progresiva con sucesivos baños de alcohol, cada vez menos hidratados 70° – 80° – 90° – 96° – 100°

Tiempos de permanencia en cada líquido:Alcohol 70: las piezas pueden permanecer varios días.Alcohol 96: 2 baños en un lapso de 24 h.Alcohol 100: 3 baños de una hora c/u.

Impregnación por un disolvente de la parafina

Las piezas perfectamente deshidratadas se sumergen en el disolvente (xilol o toluol)

Aclaración

Se sumergen las piezas en parafina (56-58º de punto de fusión), mantenida líquida en la estufa a no más de 62ºC.

Después de 1 a 2 horas se renueva la parafina

Penetración de la Parafina

Inclusión Definitiva o Formación del Bloque

DESHIDRATACIÓN E INCLUSIÓN EN DESHIDRATACIÓN E INCLUSIÓN EN PARAFINAPARAFINA

En moldes de papel, de metal ad-hoc (barras de Leuckart) o cassette ranurados se vierte la parafina fundida, del mismo punto de fusión de la que ha servido para la penetración.

Se colocan las piezas orientándolas y luego se pone el molde en heladera

Deshidratación, aclaramiento y penetración de parafina actualmente se realizan en centros de procesamiento de tejidos

El objeto de la inclusión que hemos descripto anteriormente es hacer posible la reducción del tejido a cortes lo suficientemente delgados como para permitir el paso de la luz para examinarlo al microscopio.

Los cortes más corrientes son los de 4-6 micrones.

Micrótomo de deslizamiento

Micrótomo Tipo Minot

Micrótomo de Congelación

y el Crióstato o Criótomo

CORTES

Micrótomo tipo Minot

Los cortes de parafina se extienden en agua tibia contenida en un cristalizador.

Se introducen portaobjetos, cubiertos con una capa de adhesivo de Mayer y, con la ayuda de una aguja histológica, se colocan los cortes sobre el portaobjetos y a continuación se lo levanta

Montaje

Tinción

Tinción o Coloración de los Tinción o Coloración de los CortesCortes

Corte Deshidratado y Montado en un Portaobjeto

Desparafinar los cortes con xilol

Rehidratar con alcoholes de gradación decreciente (100%, 50%....agua)

Coloración

Aclarar el exceso de colorante con agua

Deshidratar

Montar (Resina + Cubreobjetos)

Coloración Coloración Proceso mediante el cual un cuerpo es teñido por una sustancia colorante, sin perder el color cuando es lavado con el disolvente

ColoranteColoranteSustancias que pueden conferir color a otros cuerpos

Clasificación

COLORANTES NATURALES:

Animales (carmín)

Vegetales (hematoxilina, orceína, azafrán)

COLORANTES ARTIFICIALES O SINTÉTICOS (COLORES DE ANILINA)

Ácidos, Básicos, Neutros e Indiferentes

Sales cuya base es coloreada y el ácido es incoloro (azul de metileno o clorhidrato de azul de metileno).

Reaccionan con los GRUPOS ANIÓNICOS de los componentes texturales, que son los grupos:

Fosfatos de Ácidos nucleicos (ADN y RNA)

Sulfatos se los glucosaminoglucanos

Grupo Carboxilo de las proteínas.

La reacción de estos grupos varía según el pH.

Son colorantes nucleares

Ejemplos:

Verde de Metileno, Azul de Metileno, Pironina G, Azul de toluidina y la Hematoxilina

COLORANTES BÁSICOS

Los tejidos que reaccione con un colorante básico (o con Hematoxilina) se dice que es BASÓFILO y que presenta BASOFILIA. Estos componentes son:

La Heterocromatina y los Nucléolos del Núcleo por los grupos Fosfato ionizados.

Ergatoplasma (parte del citoplasma) por grupos Fosfato ionizados.

Matriz del Cartílago por grupos Sulfato ionizados.

Sales cuya base es incolora y su ácido es coloreado (eosina o eosinato de sodio)

Se unen primariamente a los componentes texturales por medio de enlaces electrostáticos de manera similar pero opuesta a la de los colorantes básicos

Las anilinas ácidas reaccionan con grupos catiónicos, como los GRUPOS AMINO IONIZADOS de las proteínas

Son colorantes citoplasmáticos

Los componentes texturales que se tiñen de colorantes ácidos se dice que son ACIDÓFILOS y que presentan ACIDOFILIA.

Son acidofilos:

La mayor parte del citoplasma no especializado.

Filamentos Citoplasmáticos.

Fibras extracelulares

COLORANTES ÁCIDOS

Hematoxilina – Eosina

1º-Desparafinado. Estufa durante 30 min. a 60º. Sumergimos en xilol durante 10 o 15 min.2º- Hidratación. Alcohol absoluto-5min. Alcohol 96º-5min. Alcohol 70º-5min.3º- Lavar en H2O destilada.4º- Hematoxilina-5min.5º- Lavar en H2O-2min.6º-Eosina alcoholica-1min.7º-Deshidratar. Alcohol de 70º Alcohol de 96º. Alcohol absoluto. Xilol.8º- Montaje.

1º-Desparafinado. Estufa durante 30 min. a 60º. Sumergimos en xilol durante 10 o 15 min.2º- Hidratación. Alcohol absoluto-5min. Alcohol 96º-5min. Alcohol 70º-5min.3º- Lavar en H2O destilada.4º- Hematoxilina-5min.5º- Lavar en H2O-2min.6º-Eosina alcoholica-1min.7º-Deshidratar. Alcohol de 70º Alcohol de 96º. Alcohol absoluto. Xilol.8º- Montaje.

La hematoxilina es un colorante catiónico mientras que la eosina es un colorante aniónico perteneciente a los xantenos.

Se teñirán los núcleos de azul, citoplasmas en rosa, músculo en tonos rojizos a rosados fucsia, glóbulos rojos en naranja o rojo y la fibrina en rosa intenso

Técnica

Micrografía de Piel (5X) H&E

Micrografía de Intestino Delgado(5X) H&E

NEUTROS

AZUL DE METILENO

METACROMÁTICO

AZUL DE TOLUIDINA

Azul de Metileno Azul de Toluidina

CONVENCIONALES:

H-E

TRICRÓMICOS: Van Gieson, Masson,

Gallego.

TÉCNICAS DE PLATA

GIEMSA: Extensiones de sangre, citologías

PAPANICOLAU: Citologías

HISTOQUÍMICOS:

Sudán III Lípidos

Carmín de Best, PAS Glucógeno

Azul de Prusia Hierro

Von Kossa Calcio

Orceína Fibras elásticas INMUNOHISTOQUÍMICOS

CONVENCIONALES:

H-E

TRICRÓMICOS: Van Gieson, Masson,

Gallego.

TÉCNICAS DE PLATA

GIEMSA: Extensiones de sangre, citologías

PAPANICOLAU: Citologías

HISTOQUÍMICOS:

Sudán III Lípidos

Carmín de Best, PAS Glucógeno

Azul de Prusia Hierro

Von Kossa Calcio

Orceína Fibras elásticas INMUNOHISTOQUÍMICOS

Elástica de Van Gieson

Es una técnica para la coloración de fibras colágenas y elásticas.

El colágeno parece que capta un colorante ácido.

Tiñe el colágeno de rojo, núcleos y fibras elásticas de negro y citoplasma de amarillo.

Van Gieson

Pared de la tráquea, Van Gieson.

Van Gieson

Azan (Azocamin + Aniline blue)

Color Rojo

Núcleos celulares

Color Rosa

Citoplasma celular(color rojo-naranja: fibras musculares y hematíes)

Color Azul

MucinógenoFibras de colágeno

Región distal del glande. Coloración: Azan. Escala de reproducción: 200x

Sales de Platacolor negro-marrón oscuro:

Fibras de reticulina,

Dendritas

Axones neuronales

Prolongaciones glialesMicrografía de un corte transversal de músculo liso teñido con sales de plata para la demostración de fibras reticulares.

Micrografía de Mesenterio. Impregnación argéntica.

Micrografía de Lengua (Mastocitos). Impregnación argéntica.

GOMORI (Sales de Plata)

Sustancias específicas mediante reacciones químicas

Sudán III Lípidos

Carmín de Best, PAS Glucógeno

Azul de Prusia Hierro

Von Kossa Calcio

Orceína Fibras elásticas

1º.- Cortes obtenidos por congelación (La inclusión en parafina disuelve las grasas).

2º.- Introducir los cortes en la mezcla a partes iguales de Sudan III y Rojo Escarlata (filtrado). 24 horas.

3º.- Lavar en agua destilada.

4º.- Teñir los nucleos con Hematoxilina de Groat--2 minutos.

5º.- Lavar y secar con papel de filtro.

6º.- Montar en Plasdona.

1º.- Cortes obtenidos por congelación (La inclusión en parafina disuelve las grasas).

2º.- Introducir los cortes en la mezcla a partes iguales de Sudan III y Rojo Escarlata (filtrado). 24 horas.

3º.- Lavar en agua destilada.

4º.- Teñir los nucleos con Hematoxilina de Groat--2 minutos.

5º.- Lavar y secar con papel de filtro.

6º.- Montar en Plasdona.

Sudan Rojo . Arteria muscular

SUDAN ROJO PARA TEÑIR LIPIDOS SIMPLES

PAS o del ácido peryódico de Schiff

Se basa en la rotura de los enlaces -C-C- presentes en los carbohidratos por la acción del ácido peryódico, potente agente oxidante, liberándose grupos aldehído que al combinarse con el reactivo de Schiff dan un compuesto de color rojo púrpura intenso.

Cuerpo Epidídimo de Conejo. PAS 400XCabeza del Epidídimo de Conejo. PAS 400X

color rosa-magenta: carbohidratos, mucoproteínas, proteoglicanoscolor rosa-magenta: carbohidratos, mucoproteínas, proteoglicanos

PAS (Glucógeno)

Azul de Prusia (Hierro)

Von Kossa (Calcio)

Orceína (Fibras elásticas)

Estudia la composición química de la célula y permite detectar la localización topográfica de algunos principios inmediatos, enzimas, metales pesados y otras sustancias.

Se considera como un nexo de unión entre la morfología y la bioquímica

En una reacción bioquímica hay tres pasos fundamentales:

Fijación:

Preservar las estructuras y reactividad funcional celulares

Existen diversos fijadores: metanol, etanol, acetona, glutaraldehído, formaldehído, etc.

Incubación

Consecuencia se liberar unos productos que bien por si mismos, o al combinarse con otra sustancia presente, dan lugar a un precipitado visible en el lugar de la reacción.

Contraste

Para resaltar en lo posible el producto de reacción y permitir una óptima visualización del núcleo y del citoplasma.

Las reacciones deben tener 3 características: sensibilidad, especificidad y reproductibilidadLas reacciones deben tener 3 características: sensibilidad, especificidad y reproductibilidad

Detección de antígenos (biomoléculas) en células/tejidos mediante anticuerpos marcados “in situ”.

INMUNOFLURECESCIA

Fluoresceína

Vimentina

INMUNOFLURECESCIA

Rodamina

GFAP

INMUNOENZIMATICAS Islotes de Langerhans (Páncreas)

Insulina Glucágon

Corteza Cerebral

Isomastotatina VIP

FOSFATASA ALCALINA

FOSFATASA ACIDA

ESTERASAS

INMUNO ORO (ORO COLOIDAL)

NEUROHIPOFISIS

Es la distancia mínima que debe separar a dos objetos para que sean percibidos como dos objetos diferentes al ser observados con el microscopio

Resina Epon / 1 μm

Azul de toluidina

Parafina / 7 μm PAS-

Hematoxilina férrica

Selección de la muestra

Fijación de la muestra

Inclusión de la muestra

Corte de la muestra

Contraste [“tinción”] de los cortes

[Montaje de los cortes]

Examen de los cortes con el M.E.

Selección de la muestra

Fijación de la muestra

Inclusión de la muestra

Corte de la muestra

Contraste [“tinción”] de los cortes

[Montaje de los cortes]

Examen de los cortes con el M.E.

Finalidad

Preservar los tejidos de forma similar a su estado “in

vivo”

Aumentar la dureza de la muestra para facilitar su

posterior corte

FIJADORES USADOS

Solución tamponada de glutaraldehído 2,5-5%

Solución tamponada de tetróxido de osmio 1-2%

La fijación hace que precipiten las proteínas tisulares

Finalidad

Endurecer la muestra homogéneamente para obtener cortes

ultrafinos

Método de inclusión en resina

Lavar el fijador en exceso de la muestra con una solución tampón

Contrastar “en bloque” (con acetato de uranilo, p. ej.)

Deshidratarla muestra con alcoholes de gradación creciente

Pasar la muestra por un disolvente (óxido de propileno...)

Introducir la muestra en una mezcla 1:1 de resina y disolvente a

temperatura ambiente para que la muestra se embeba de resina

Introducir la muestra en resina pura [en una cápsula de gelatina o

plástico] a 60oC para que polimerice y forme un bloque de resina que

contenga la muestra

Finalidad

Endurecer la muestra homogéneamente para obtener cortes

ultrafinos

Método de inclusión en resina

Lavar el fijador en exceso de la muestra con una solución tampón

Contrastar “en bloque” (con acetato de uranilo, p. ej.)

Deshidratarla muestra con alcoholes de gradación creciente

Pasar la muestra por un disolvente (óxido de propileno...)

Introducir la muestra en una mezcla 1:1 de resina y disolvente a

temperatura ambiente para que la muestra se embeba de resina

Introducir la muestra en resina pura [en una cápsula de gelatina o

plástico] a 60oC para que polimerice y forme un bloque de resina que

contenga la muestra

Citrato de plomo

Acetato de uranilo

Interpretación de Cortes Histológicos

El microscopio óptico tiene un limite resolución de cerca de 200 nm (0.2 µm ).

Este limite se debe a la longitud de onda de la luz (0.4-0.7 µm )

Las células observadas bajo el microscopio óptico pueden estar vivas o fijadas y teñidas

Sistema Mecánico

Sistema Óptico

Ópticas:◦ Condensador (8): Concetra los rayos de luz sobre la

preparación.

◦ Objetivos (3): Aumentan el tamaño de la muestra y proyectan la imagen al ocular. Se encuentran montados en el revólver.

◦ Ocular (1): Aumenta la imagen y la proyecta sobre la retina del observador.

◦ Diafragma (6): Regula la cantidad de luz que llega al condensador.

◦ Fuente de luz (7): Puede ser un foco o un espejo que refleje la luz hacia el condensador.

Mecánicas:◦ Base: Pieza rígida encargada de otorgar estabilidad a todo

el conjunto.

◦ Brazo: Pieza que une al sistema óptico con la base.

◦ Platina (9): Plataforma horizontal con un agujero central que permite el paso de la luz. Los portaobjetos con las preparaciones se colocan sobre ella y se fijan con un par de pinzas. Un sistema de tornillos permite desplazar la platina y la muestra hacia adelante, atrás, izquierda y derecha.

◦ Revólver (2): Sistema sobre el que se encuentran los objetivos, al girar permite seleccionar cualquiera de los objetivos disponibles.

◦ Tornillos macrométrico y micrométrico (4 y 5): Tornillos que permiten enfocar la muestra, desplazando la platina haria arriba o abajo.

◦ Tubo: Cámara oscura unida al brazo.

Utiliza un haz de electrones para producir la imagen.

Permite conocer la ultraestructura de las células y de la matriz extracelular

Filamento Calentado

Lente Magnética

Espécimen

Lente Objetivo

Lente Proyector

Imagen sobre Pantalla Fluorescente

El haz de electrones no atraviesa la muestra, sino que choca contra su superficie. Permite una gran magnificación de las imágenes.

Pantalla Visora

Filamento Calentado

Lente

Rayo Deflector

Lente

Detector

1. Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar la platina completamente. Si el microscopio se recogió correctamente en el uso anterior, ya debería estar en esas condiciones.

2. Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas.

3. Comenzar la observación con el objetivo de 4x (ya está en posición) o colocar el de 10 aumentos (10x) si la preparación es de bacterias.

4.  Para realizar el enfoque: a. Acercar al máximo la lente del objetivo a la preparación, empleando el tornillo macrométrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a través del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparación pudiéndose dañar alguno de ellos o ambos.b. Mirando, ahora sí, a través de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la preparación con el macrométrico y, cuando se observe algo nítida la muestra, girar el micrométrico hasta obtener un enfoque fino.

5. Pasar al siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el micrométrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdió por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operación desde el paso 3. El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparación y por ello es fácil que ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la preparación si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con aceite de inmersión si se observa una preparación que ya se enfocó con el objetivo de inmersión.

1. Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar la platina completamente. Si el microscopio se recogió correctamente en el uso anterior, ya debería estar en esas condiciones.

2. Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas.

3. Comenzar la observación con el objetivo de 4x (ya está en posición) o colocar el de 10 aumentos (10x) si la preparación es de bacterias.

4.  Para realizar el enfoque: a. Acercar al máximo la lente del objetivo a la preparación, empleando el tornillo macrométrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a través del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparación pudiéndose dañar alguno de ellos o ambos.b. Mirando, ahora sí, a través de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la preparación con el macrométrico y, cuando se observe algo nítida la muestra, girar el micrométrico hasta obtener un enfoque fino.

5. Pasar al siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el micrométrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdió por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operación desde el paso 3. El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparación y por ello es fácil que ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la preparación si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con aceite de inmersión si se observa una preparación que ya se enfocó con el objetivo de inmersión.

MANEJO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO

Empleo del objetivo de inmersión:

a. Bajar totalmente la platina.b. Subir totalmente el condensador para ver claramente el círculo de luz que nos indica la zona que se va a visualizar y donde habrá que echar el aceite.c. Girar el revólver hacia el objetivo de inmersión dejándolo a medio camino entre éste y el de x40.d. Colocar una gota mínima de aceite de inmersión sobre el círculo de luz.e. Terminar de girar suavemente el revólver hasta la posición del objetivo de inmersión.f.  Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la lente toca la gota de aceite. En ese momento se nota como si la gota ascendiera y se adosara a la lente.g. Enfocar cuidadosamente con el micrométrico. La distancia de trabajo entre el objetivo de inmersión y la preparación es mínima, aun menor que con el de 40x por lo que el riesgo de accidente es muy grande.h. Una vez se haya puesto aceite de inmersión sobre la preparación, ya no se puede volver a usar el objetivo 40x sobre esa zona, pues se mancharía de aceite. Por tanto, si desea enfocar otro campo, hay que bajar la platina y repetir la operación desde el paso 3.i.  Una vez finalizada la observación de la preparación se baja la platina y se coloca el objetivo de menor aumento girando el revólver. En este momento ya se puede retirar la preparación de la platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de inmersión en posición de observación.j. Limpiar el objetivo de inmersión con cuidado empleando un papel especial para óptica. Comprobar también que el objetivo 40x está perfectamente limpio

Empleo del objetivo de inmersión:

a. Bajar totalmente la platina.b. Subir totalmente el condensador para ver claramente el círculo de luz que nos indica la zona que se va a visualizar y donde habrá que echar el aceite.c. Girar el revólver hacia el objetivo de inmersión dejándolo a medio camino entre éste y el de x40.d. Colocar una gota mínima de aceite de inmersión sobre el círculo de luz.e. Terminar de girar suavemente el revólver hasta la posición del objetivo de inmersión.f.  Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la lente toca la gota de aceite. En ese momento se nota como si la gota ascendiera y se adosara a la lente.g. Enfocar cuidadosamente con el micrométrico. La distancia de trabajo entre el objetivo de inmersión y la preparación es mínima, aun menor que con el de 40x por lo que el riesgo de accidente es muy grande.h. Una vez se haya puesto aceite de inmersión sobre la preparación, ya no se puede volver a usar el objetivo 40x sobre esa zona, pues se mancharía de aceite. Por tanto, si desea enfocar otro campo, hay que bajar la platina y repetir la operación desde el paso 3.i.  Una vez finalizada la observación de la preparación se baja la platina y se coloca el objetivo de menor aumento girando el revólver. En este momento ya se puede retirar la preparación de la platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de inmersión en posición de observación.j. Limpiar el objetivo de inmersión con cuidado empleando un papel especial para óptica. Comprobar también que el objetivo 40x está perfectamente limpio

6- No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio (macrométrico, micrométrico, platina, revólver y condensador).

7-  El cambio de objetivo se hace girando el revólver y dirigiendo siempre la mirada a la preparación para prevenir el roce de la lente con la muestra. No cambiar nunca de objetivo agarrándolo por el tubo del mismo ni hacerlo mientras se está observando a través del ocular.

8- Mantener seca y limpia la platina del microscopio. Si se derrama sobre ella algún líquido, secarlo con un paño. Si se mancha de aceite, limpiarla con un paño humedecido en xilol.

9- Es conveniente limpiar y revisar siempre los microscopios al finalizar la sesión práctica y, al acabar el curso, encargar a un técnico un ajuste y revisión general de los mismos.

6- No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio (macrométrico, micrométrico, platina, revólver y condensador).

7-  El cambio de objetivo se hace girando el revólver y dirigiendo siempre la mirada a la preparación para prevenir el roce de la lente con la muestra. No cambiar nunca de objetivo agarrándolo por el tubo del mismo ni hacerlo mientras se está observando a través del ocular.

8- Mantener seca y limpia la platina del microscopio. Si se derrama sobre ella algún líquido, secarlo con un paño. Si se mancha de aceite, limpiarla con un paño humedecido en xilol.

9- Es conveniente limpiar y revisar siempre los microscopios al finalizar la sesión práctica y, al acabar el curso, encargar a un técnico un ajuste y revisión general de los mismos.

MANTENIMIENTO Y PRECAUCIONES

1.  Al finalizar el trabajo, hay que dejar puesto el objetivo de menor aumento en posición de observación, asegurarse de que la parte mecánica de la platina no sobresale del borde de la misma y dejarlo cubierto con su funda.

2. Cuando no se está  utilizando el microscopio, hay que mantenerlo cubierto con su funda para evitar que se ensucien y dañen las lentes. Si no se va a usar de forma prolongada, se debe guardar en su caja dentro de un armario para protegerlo del polvo.

3. Nunca hay que tocar las lentes con las manos. Si se ensucian, limpiarlas muy suavemente con un papel de filtro o, mejor, con un papel de óptica.

4. No dejar el portaobjetos puesto sobre la platina si no se está  utilizando el microscopio.

5- Después de utilizar el objetivo de inmersión, hay que limpiar el aceite que queda en el objetivo con pañuelos especiales para óptica o con papel de filtro (menos recomendable). En cualquier caso se pasará el papel por la lente en un solo sentido y con suavidad. Si el aceite ha llegado a secarse y pegarse en el objetivo, hay que limpiarlo con una mezcla de alcohol-acetona (7:3) o xilol. No hay que abusar de este tipo de limpieza, porque si se aplican estos disolventes en exceso se pueden dañar las lentes y su sujeción.

1.  Al finalizar el trabajo, hay que dejar puesto el objetivo de menor aumento en posición de observación, asegurarse de que la parte mecánica de la platina no sobresale del borde de la misma y dejarlo cubierto con su funda.

2. Cuando no se está  utilizando el microscopio, hay que mantenerlo cubierto con su funda para evitar que se ensucien y dañen las lentes. Si no se va a usar de forma prolongada, se debe guardar en su caja dentro de un armario para protegerlo del polvo.

3. Nunca hay que tocar las lentes con las manos. Si se ensucian, limpiarlas muy suavemente con un papel de filtro o, mejor, con un papel de óptica.

4. No dejar el portaobjetos puesto sobre la platina si no se está  utilizando el microscopio.

5- Después de utilizar el objetivo de inmersión, hay que limpiar el aceite que queda en el objetivo con pañuelos especiales para óptica o con papel de filtro (menos recomendable). En cualquier caso se pasará el papel por la lente en un solo sentido y con suavidad. Si el aceite ha llegado a secarse y pegarse en el objetivo, hay que limpiarlo con una mezcla de alcohol-acetona (7:3) o xilol. No hay que abusar de este tipo de limpieza, porque si se aplican estos disolventes en exceso se pueden dañar las lentes y su sujeción.

MANTENIMIENTO Y PRECAUCIONES