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BIOQUÍMICA – ENFERMERÍA Profesores: Sergio Zepeda, Jaime Molina, Fabiola Jamett

UNIVERSIDAD DE LA SERENA FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA

GUÍA DE CINÉTICA ENZIMÁTICA

ITEM DE DESARROLLO.

1. ¿Qué se entiende por velocidad máxima (V) de una reacción enzimática?

2. ¿Qué se entiende por velocidad inicial (v) de una reacción enzimática?

3. Calcule el valor de Km cuando v = 1/2 de V. Deduzca una definición de Km basado en este resultado.

4. Calcule la velocidad (v) de una reacción enzimática como porcentaje de la velocidad máxima (V) de la reacción cuando:

a) S es igual a km b) S es 1/10 de km

c) S es 10 veces el valor de km d) S es 100 veces el valor de km

5. ¿Con qué concentración de S puede alcanzarse la V de una reacción enzimática?

6. Cuando en una reacción enzimática la concentración de sustrato (S) es mucho mayor que el valor de la Km este puede ser despreciable. Pero si la concentración del sustrato es muy pequeña en relación al Km, ¿puede despreciarse en el denominador de la ecuación de Michaelis?

7. Al poner en una gráfica la ecuación de Michaelis v = (SxV)/(Km + S) se obtiene una hipérbole rectangular. Convierta esta ecuación de modo que pueda expresarse como una función lineal del tipo y = mx + b. Señale en ella las relaciones que definirían a la Km y la V.

8. ¿Qué relación existe entre la concentración de la enzima y la velocidad máxima (V) de la reacción? ¿Influye la concentración de la enzima sobre el valor del Km? Haga una gráfica aproximada de la velocidad en función del sustrato (S) de dos preparaciones de una misma enzima de las cuales una tiene el doble de concentración de la otra. Indique claramente en los valores arbitrarios la Km y la V en ambos casos

9. ¿Qué importancia tiene la determinación del Km en una enzima?

10. ¿Puede una enzima tener diferentes Km para distintos sustratos?

11. ¿En qué unidades deben expresarse las variables que se han medido para la determinación de la Km de una enzima?

12. ¿Cómo debe tabular sus resultados para calcular la Km de una enzima por el método de Lineaweaver-Burk (recíprocos)?

13. ¿Qué valores debería conocer para poder calcular matemáticamente la Km usando directamente la ecuación de Michaelis?



ITEM DE EJERCICIOS 1. 1/v Si la Km es 5,0 x 10-5 , determine el valor de la pendiente : 0,06 - 0,04 - a) 1,50 x 10-2 0,03 - b) 5,00 x 10-5 0,02 - c) 2,00 x 10-2 0,01 - d) 1,00 x 10-6

e) 2,50 x 10-3 1/s

2. En una enzima la constante de afinidad vale 4,5 *10 -5 M y la velocidad inicial en un punto es 10 mmol/L min cuando la concentración del sustrato es de 2,8*10-4 M

a) Calcule la velocidad máxima b) Calcule la concentración de sustrato cuando la velocidad inicial esta en una relación de 1/5 con la velocidad

máxima de reacción c) Si, se aumenta la concentración inicial de sustrato en un 20% (2,8 *10-4), calcule la velocidad de la reacción,

conservando los parámetros de afinidad y actividad?

3. La Km de una enzima es de 3,5 x 10 5 M, se hace reaccionar el sistema enzimático con una concentración de sustrato de 3,5 x10 5 M obteniéndose una velocidad inicial de 20.0 micromoles/litro minuto.

a) Calcule el valor de la Vmáx si se utiliza el doble de la concentración de enzima. b) Con qué concentración de sustrato se obtiene la Vmáx calculada en la pregunta anterior

4. En los siguientes gráficos se muestra la cinética de una de la actividad de una enzima “A” en y luego la enzima

inhibida por la acción de una molécula “B” (fig.n1). En el figura 2 se muestran ambas curvas lineal izadas, por el método de los inversos o de Lineckweber-Burk.

cinetica de la enzima "A" y la cinetica de "A"

enzima con un inhibidor "B"

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

0 5 10 15

sustrato(mmol/L)

Velo

cid

ad

(mm

ol/L

min

)

S.I.

C:I.

y = 0.3395x + 0.0799

R2 = 0.9962

y = 0.2653x + 0.0331

R2 = 0.9931

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

1/sustrato(mmol/L)

1/v

elo

cid

ad

(mm

ol/L

min

)

C.I.

S.I.

Fig.N°1

11111N°

1

Fig.N°2



Al observar la grafica determine que tipo de inhibidor es la molécula “B” para la enzima “A”

Determine los parámetros inherentes (Km y Vmax) en la figura 1 para la enzima “A” y determine Km y Vmax según la curva linealizada y compare.

Determine Ki para el inhibidor “B” si tiene una concentración de 0.01mmol/L.

5. En la tabla se presenta la hidrólisis de lactosa por la actividad de la -galoctosidasa. Grafique los siguientes datos para las funciones v = f(s), 1/v =f (1/s) y s/v=f(s) y determine de las graficas los valores de Vmax y Km según la tabla y compare los valores obtenidos.

sustrato lactosa(M) velocidad(umol/min*min) 1/s 1/v v/s v s s/v

0,01 0,28 100 3,57143 28 0,28 0,01 0,036

0,02 0,54 50 1,85185 27 0,54 0,02 0,037

0,05 1,2 20 0,83333 24 1,2 0,05 0,042

0,1 2,4 10 0,41667 24 2,4 0,1 0,042

0,15 3 6,66667 0,33333 20 3 0,15 0,05

0,2 3,1 5 0,32258 15,5 3,1 0,2 0,065

0,3 3,1 3,33333 0,32258 10,333 3,1 0,3 0,097

ITEM DE SELECCIÓN MULTIPLE.

1. Cuál de las siguientes gráficas representa la velocidad de reacción frente a la concentración de sustrato para una enzima, en ausencia y presencia de un inhibidor competitivo?

a. 1 b. 2 c. 3 d. 4 e. Ninguno de los anteriores

2. Cual de los siguientes enunciados acerca de la velocidad de reacción NO es verdadero?

a. La velocidad de reacción es la velocidad a la que la reacción procede hacia el equilibrio. b. La velocidad de reacción esta gobernada por la barrera de energía entre los reactivos y los productos. c. Las enzimas pueden acelerar la velocidad de reacción. d. Las velocidades de reacción no son sensibles a la temperatura. e. Ninguno de estos.



3. Las enzimas:

a. Están compuestas esencialmente de polipéptidos, que son polímeros de aminoácidos. b. Pueden unir grupos prostéticos tales como iones metálicos que participan en las reacciones enzimáticas. c. Tienen estructuras definidas. d. Unen sus sutratos en el centro activo. e. Todos los enunciados son ciertos.

4. Esta gráfica representa la variación de la velocidad de reacción frente a la concentración del sustrato; la razón por la

que la curva alcanza una meseta y la velocidad no sigue aumentando para mayores concentraciones de sustrato es porque:

a. El centro activo del enzima está saturado de sustrato. b. Hay un inhibidor competitivo presente c. Hay un inhibidor no competitivo presente d. La enzima alostérica está bloqueada en una conformación

inactiva e. Todo el sustrato ha sido convertido en producto

5. Las reacciones que requieren energía pueden ocurrir en los sistemas biológicos porque las enzimas que las catalizan

consiguen el acoplamiento de la reacción con otras reacciones que conllevan:

a. Un incremento en la entropía b. Una baja energía de activación c. No inhibidores d. Productos de menor energía libre que los reactivos e. Oxidación-reducción

6. Cuál de las siguientes gráficas muestra los resultados de la velocidad de una reacción frente a la concentración de sustrato para una enzima no-alostérica, en ausencia y en presencia de un inhibidor no competitivo (los inhibidores no competitivos se unen a la enzima en un lugar diferente del centro activo)?

a. 1 b. 2 c. 3 d. 4 e. Ninguna de las anteriores



Solución

Desarrollo

1. ¿Qué se entiende por velocidad máxima (V) de una reacción enzimática?.

Es la actividad máxima que alcanza una concentración enzimática y una enzima en particular

2. ¿Qué se entiende por velocidad inicial (v) de una reacción enzimática?.

Se entiende como la formación de producto en un tiempo o el consumo de sustrato en un intervalo de tiempo, pero la

saturación enzimática es parcial.

3. Calcule el valor de Km cuando v = 1/2 de Vmax. Deduzca una definición de Km basado en este resultado.

El valor de Km es un valor igual al sustrato.

4. Calcule la velocidad (v) de una reacción enzimática como porcentaje de la velocidad máxima (V) de la reacción cuando:

se resuelven reemplazando s o km según lo indique la proporción despejando los valores de una forma algebraica

sencilla

v/Vmax= S/ S +S

= S/ 2S >> ½ * 100 >>>> 50%

a) S es igual a km= 50% b) S es 1/10 de km = 9%

c) S es 10 veces el valor de km= 90% d) S es 100 veces el valor de km=99%

5. ¿Con qué concentración de S puede alcanzarse la Vmax de una reacción enzimática?

Aproximadamente 100 veces el valor de km en concentración de sustrato

6. Cuando en una reacción enzimática la concentración de sustrato (S) es mucho mayor que el valor de la Km este puede

ser despreciable. Pero si la concentración del sustrato es muy pequeña en relación a la Km, ¿puede despreciarse en el

denominador de la ecuación de Michaelis?

A S muy grande en relación a Km, este se hace despreciable y el valor de velocidad es cercano a Vmax y si el valor de

S es muy, muy pequeño frente Km el valor de la velocidad se acerca a 0

7. Al poner en una gráfica la ecuación de Michaelis v = (SxV)/(Km + S) se obtiene una hipérbole rectangular. Convierta

esta ecuación de modo que pueda expresarse como una función lineal del tipo y = mx + b. Señale en ella las relaciones

que definirían a la Km y la V.

1/v = Km/Vmax*1/s + 1/vamx , v = Vamx –Kma v/s , s/v = 1/vmax* s + Km/Vmax

8. ¿Qué relación existe entre la concentración de la enzima y la velocidad máxima (V) de la reacción? ¿Influye la

concentración de la enzima sobre el valor de la Km? Haga una gráfica aproximada de la velocidad en función del



sustrato (S) de dos preparaciones de una misma enzima de las cuales una tiene el doble de concentración de la otra.

Indique claramente en los valores arbitrarios la Km y la V en ambos casos

La velocidad máxima es dependiente de la concentración de enzima y si se aumenta la concentración de enzima es el

doble la curva será el doble, pero Km es constante para ambos casos

9. ¿Qué importancia tiene la determinación de la Km en una enzima?

Se pueden determinar en que condiciones de saturación se encuentra

10. ¿Puede una enzima tener diferentes Km para distintos sustratos?

Si, porque va depender del sustrato la afinidad de la enzima frente a sustrato

11. ¿En qué unidades deben expresarse las variables que se han medido para la determinación de la Km de una enzima?

Las unidades de concentración es decir las mismas del sustrato

12. ¿Cómo debe tabular sus resultados para calcular la Km de una enzima por el método de Lineaweaver-Burk(

recíprocos)?

1/s y 1/v

13. ¿Qué valores debería conocer para poder calcular matemáticamente el Km usando directamente la ecuación de

Michaelis?

Los valores de v, Vmax y S

Ejercicios de enzimas

1.- 1/v Si la Km es 5,0 x 10-5 , determine el valor de la pendiente : 0,06 - 0,04 - a) 1,50 x 10-2 0,03 - b) 5,00 x 10-5 0,02 - c) 2,00 x 10-2 0,01 - d) 1,00 x 10-6

e) 2,50 x 10-3 1/s

Vmax= 1/ ,02 = 50 ; 5*10e-5/50>>>>> 1e-6

2.-En una enzima la constante de afinidad vale 4,5 *10 -5 M y la velocidad inicial en un punto es 10 mmol/L min

cuando la concentración del sustrato es de 2,8*10-4 M

d) Calcule la velocidad máxima

10*(4,5*10e-5+2,8e-4)/ 2,8e-4 = Vmax == 11,6

e) Calcule la concentración de sustrato cuando la velocidad inicial esta en una relación de 1/5 con la velocidad

máxima de reacción

Vmax* 1/5 = Vmax S/ Km +S > Km +S= 5S > Km = 4S ; S= Km/4



f) Si, se aumenta la concentración inicial de sustrato en un 20% (2,8 *10-4), calcule la velocidad de la reacción,

conservando los parámetros de afinidad y actividad? 2,8e-4* 1,2 = S2 > 3,36e-4 ; v = 11,6* 3,36e-4/( 4,5e-5 *

3,36*10e-4)==== 10 ,22 mmol/Lmin

3.-La Km de una enzima es de 3,5 x 10 5 M, se hace reaccionar el sistema enzimático con una concentración de

sustrato de 3,5 x10 5 M obteniéndose una velocidad inicial de 20.0 micromoles/litro minuto.

c) Calcule el valor de la Vmáx si se utiliza el doble de la concentración de enzima.

80 umol/Lmin , Km es igual a S y la enzima se duplica

d) Con qué concentración de sustrato se obtiene la Vmáx calculada en la pregunta anterior

Misma concentración de sustrato

4.-En los siguientes gráficos se muestra la cinética de una de la actividad de una enzima “A” en y luego la

enzima inhibida por la acción de una molécula “B” (fig.n1). En el figura 2 se muestran ambas curvas linealizadas,

por el método de los inversos o de Lineckweber-Burk.

Al observar la grafica determine que tipo de inhibidor es la molécula “B” para la enzima “A”

No competitivo

Determine los parámetros inherentes ( Km y Vmax) en la figura 1 para la enzima “A” y determine Km y Vax según

la curva linealizada y compare.

Figura 1 el valor de Vmax = 16 yKm= 2,5 aprox. Figura 2 Vmax = 1/0,0331 = 30,2 y Km = 30,2*0,2653 = 8,01

cinetica de la enzima "A" y la cinetica de "A"

enzima con un inhibidor "B"

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

0 5 10 15

sustrato(mmol/L)

Velo

cid

ad

(mm

ol/L

min

)

S.I.

C:I.

y = 0.3395x + 0.0799

R2 = 0.9962

y = 0.2653x + 0.0331

R2 = 0.9931

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

1/sustrato(mmol/L)

1/v

elo

cid

ad

(mm

ol/L

min

)

C.I.

S.I.

Fig.N°1

11111N°

1

fig.N°2



Determine Ki para el inhibidor “B” si tiene una concentración de 0.01mmol/L.

1/0,0799 = Vmax afectada = 12,5= 30,2/ ( 1 + i/ki)= 30,2/12,5= Ki+i/Ki= >>> 2,416*Ki – Ki = 0,01;;;;; Ki = 0,01/ 1,416, Ki === 7,06 *10e-3

5.-En la tabla se presenta la hidrólisis de lactosa por la actividad de la b-galoctosidasa. Grafique los siguientes

datos para las funciones v = f(s), 1/v =f (1/s) y s/v=f(s) y determine de las graficas los valores de Vmax y Km según

la tabla y compare los valores obtenidos.

sustrato lactosa(M) velocidad(umol/min*min) 1/s 1/v v/s v s s/v

0,01 0,28 100 3,57143 28 0,28 0,01 0,036

0,02 0,54 50 1,85185 27 0,54 0,02 0,037

0,05 1,2 20 0,83333 24 1,2 0,05 0,042

0,1 2,4 10 0,41667 24 2,4 0,1 0,042

0,15 3 6,66667 0,33333 20 3 0,15 0,05

0,2 3,1 5 0,32258 15,5 3,1 0,2 0,065

0,3 3,1 3,33333 0,32258 10,333 3,1 0,3 0,097

Selección múltiple.

1.-Cuál de las siguientes gráficas representa la velocidad de reacción frente a la concentración de sustrato para una enzima,

en ausencia y presencia de un inhibidor competitivo?

a. 1

b. 2

c. 3

d. 4

e. Ninguno de los anteriores

2.-Cual de los siguientes enunciados acerca de la velocidad de reacción NO es cierto?

a. La velocidad de reacción es la velocidad a la que la reacción procede hacia el equilibrio. b. La velocidad de reacción esta gobernada por la barrera de energía entre los reactivos y los productos. c. Las enzimas pueden acelerar la velocidad de reacción. d. Las velocidades de reacción no son sensibles a la temperatura.



e. Ninguno de estos.

3.-Las enzimas:

a) Están compuestas esencialmente de polipéptidos, que son polímeros de aminoácidos. b) Pueden unir grupos prostéticos tales como iones metálicos que participan en las reacciones enzimáticas. c) Tienen estructuras definidas. d) Unen sus sustratos en el centro activo. e) Todos los enunciados son ciertos.

4.-Esta gráfica representa la variación de la velocidad de reacción frente a la concentración del sustrato; la razón por la que la curva alcanza una meseta y la velocidad no sigue aumentando para mayores concentraciones de sustrato es porque:

a) El centro activo del enzima está saturado de sustrato. b) Hay un inhibidor competitivo presente c) Hay un inhibidor no competitivo presente d) La enzima alostérica está bloqueada en una conformación

inactiva e) Todo el sustrato ha sido convertido en producto

5.-Las reacciones que requieren energía pueden ocurrir en los sistemas biológicos porque las enzimas que las catalizan consiguen el acoplamiento de la reacción con otras reacciones que conllevan:

a) Un incremento en la entropía b) Una baja energía de activación c) No inhibidores d) Productos de menor energía libre que los reactivos e) Oxidación-reducción

6.-Cuál de las siguientes gráficas muestra los resultados de la velocidad de una reacción frente a la concentración de sustrato para una enzima no-alostérica, en ausencia y en presencia de un inhibidor no competitivo (los inhibidores no competitivos se unen a la enzima en un lugar diferente del centro activo)?

a) 1 b) 2 c) 3 d) 4 e) Ninguna de las anteriores

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