FACULTAD DE CIENCIAS EXPERIMENTALES GRADO EN …dspace.umh.es/bitstream/11000/4345/1/TFG...

FACULTAD DE CIENCIAS EXPERIMENTALES

GRADO EN BIOTECNOLOGÍA

TRABAJO DE FIN DE GRADO

Variación morfológica en la arquitectura

radicular en una colección de líneas de

introgresión de tomate (S. pennellii S. lycopersicum)

Alfonso Azorín Guaita

Directores: José Manuel Pérez Pérez

Aurora Alaguero Cordovilla

Departamento de Biología Aplicada

Área de Genética

Curso 2016‐17

JOSÉ MANUEL PÉREZ‐PÉREZ, Profesor Titular de Universidad en el área de conocimiento de Genética

de la Universidad Miguel Hernández de Elche, y

AURORA ALAGUERO CORDOVILLA, Titulada Superior del Instituto de Bioingeniería de la Universidad

Miguel Hernández de Elche,

HACEMOS CONSTAR

que el presente trabajo ha sido realizado bajo nuestra dirección y recoge fielmente la labor realizada

por el alumno Alfonso Azorín Guaita. Las investigaciones reflejadas en esta memoria se han

desarrollado íntegramente en la Unidad de Genética del Instituto de Bioingeniería de la Universidad

Miguel Hernández de Elche.

José Manuel Pérez‐Pérez Aurora Alaguero Cordovilla

Elche, 6 de septiembre de 2017

RESUMEN

Con este Trabajo de Fin de Grado se pretende contribuir a la disección genética de la

formación y el desarrollo del sistema radicular en tomate (Solanum lycopersicum L.). Se ha

caracterizado la morfología de la raíz principal en una colección de 11 líneas de introgresión

derivadas del cruzamiento S. pennellii × S. lycopersicum, así como en las raíces laterales y las

adventicias en respuesta a herida. Hemos determinado la formación de órganos de novo en

respuesta a la adición exógena de auxinas o citoquininas en las líneas que mostraron valores

extremos para algunos de los parámetros estudiados de la arquitectura radicular. Nuestros

resultados indican la participación de múltiples genes en la determinación de los parámetros

básicos de la arquitectura radicular, tales como la densidad de raíces laterales y adventicias,

su longitud y su ángulo de crecimiento.

PALABRAS CLAVE: raíces adventicias, arquitectura radicular, organogénesis de novo,

caracteres cuantitativos, Solanum lycopersicum

ABSTRACT

The aim of this work is to contribute to the genetic dissection of root system architecture in

tomato (Solanum lycopersicum L.). Some morphological traits of the primary root have been

measured in a collection of 11 introgression lines derived from an S. pennellii × S.

lycopersicum cross, as well as of the lateral and adventitious root architecture after

wounding. We analyzed de novo organ formation in response to exogenous auxin or

cytokinin treatments in the lines that showed extreme values for some of the studied root

system parameters. Our results indicate the eventual participation of multiple genes to

determine basic root architecture traits, such as lateral and adventitious root density, its

length and its growing angle.

KEY WORDS: adventitious roots, root architecture, de novo organogenesis, quantitative

traits, Solanum lycopersicum

ÍNDICE GENERAL Página

1. . INTRODUCCIÓN……………………………….……………………………………………………………………1

1.1 EL TOMATE…………….…………………………………………………………………………………………1

1.2 EL TOMATE COMO SISTEMA MODELO………………………………………………………………2

1.2.1 SOLANUN LYCOPERSICUM………………………………………………………………………2

1.2.2 SOLANUM PENNELLII……………………………………………………………………………..3

1.3 LÍNEAS DE INTROGRESIÓN…………………………………………………………………………………4

1.4 SISTEMA RADICULAR EN LAS PLANTAS DE TOMATE …………………………………………5

1.5 REGULACIÓN HORMONAL DE LA FORMACIÓN DE RAÍCES …………………………………6

2. . ANTECEDENTES Y OBJETIVOS……………………………………………………………………..…………8

3. . MATERIALES Y MÉTODOS………………..……………………..……………………………………………9

3.1 MATERIAL VEGETAL…………………….…………………………………………………………………..…9

3.2 FENOTIPADO DE LAS LÍNEAS DE INTROGRESIÓN……………………………………………….10

3.3 ESTUDIO CELULAR DE LA MORFOLOGÍA RADICULAR POR EL MÉTODO

DE TINCIÓN PS‐PI……………………………………………………………………………………………12

3.4 ANÁLISI DE LA FORMACIÓN DE RAÍCES ADVENTICIAS EN EXPLANTOS EN MEDIO

CON HORMONAS…………………………………………………………………………………………...12

3.5 ANALISIS DE IMÁGENES………………………………………….………………………………………...14

3.5.1 ANALISIS DEL FENOTIPADO RADICULAR…………………………………………….....14

3.5.2 ANÁLISIS DE REGENERACIÓN CON HORMONAS………………………………………16

3.6 ANALISIS DE DATOS……………………………………………………………………………………………16

4. . RESULTADOS………..………...……………………………………………..…………….……………………..19

4.1 SELECCIÓN DE LAS LÍNEAS DE INTROGRESIÓN……………………………………………………19

4.2 GERMINACIÓN……………………………………….…………………………………………………………19

4.3 CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA DE LA ARQUITECTURA RADICULAR………………20

4.3.1 RAÍZ PRINCIPAL….………………………………………………………………………………….20

4.3.2 RAÍCES LATERALES……………………………………………………..……………………………22

4.3.3 RAÍCES ADVENTICIAS…………………………………………………………..…………………27

4.4 REGENERACIÓN EN MEDIO SUPLEMENTADO CON HORMONAS…………………………30

5. . DISCUSIÓN…………………………………….…………………………………………………….………………32

6. . CONCLUSIONES Y PROYECCIÓN FUTURA…………………………………………………………….…34

7. . BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………………………………………………………35

8. . ANEXO………………………………………………………………………………………………………………….38

ÍNDICE DE TABLAS Página

Tabla 1 Valor de P en los parámetros de la raíz principal en

S. lycopersicum…………………………………………………………………………………………20

Tabla 2 Valor de P en los parámetros de las raíces laterales en

S. lycopersicum……………….…………………..…………………………….........................22

Tabla 3 Valor de P en los parámetros de las raíces adventicias en

S. lycopersicum………….…………………………………………………….……………………….27

ÍNDICE DE FIGURAS Página

Figura 1 Diferencias morfológicas en frutos y hojas entre el tomate doméstico, S.

lycopersicum, y la especie silvestre S. pennellii………….................................3

Figura 2 Estructura del sistema radicular en tomate………………….…………..………………5

Figura 3 Líneas de introgresión empleadas en este trabajo………………………………..……9

Figura 4 Esquema sobre el protocolo seguido para la realización del fenotipado

de las líneas de introgresión.........................................................................11

Figura 5 Corte y distribución de los explantos de tomate….......................................13

Figura 6 Etapas del procesado de imágenes para el fenotipado radicular…………….…15

Figura 7 Porcentaje de germinación de las líneas de introgresión estudiadas…………19

Figura 8 Caracterización morfológica de la raíz principal……………………..….………………21

Figura 9 Caracterización morfológica de la arquitectura radicular secundaria………..23

Figura 10 Gráficos de correlación entre algunos parentales estudiados…...................24

Figura 11 Caracterización morfológica de las raíces laterales.….……..……………………….25

Figura 12 Ápice radicular de las raíces laterales...........................................................26

Figura 13 Caracterización morfológica de las raíces adventicias I……….……………………28

Figura 14 Caracterización morfológica de las raíces adventicias II………………….….…….29

Figura 15 Regeneración en medio suplementado con hormonas….............................31

Introducción 1

1. INTRODUCCIÓN

1.1. El tomate

El tomate cultivado (Solanum lycopersicum L.), es una planta herbácea de la familia de las

solanáceas (Solanaceae), orden Solanales, subclase Asteridae, clase Magnoliopsida, división

Magnoliophyta, superdivisión Spermatophyta y subreino Traqueobionta

(http://solgenomics.net/). Con esta clasificación taxonómica se puede describir al tomate

como una planta vascular angiosperma (ya que posee flor y semilla) y dicotiledónea. Dentro

de la familia de las solanáceas podemos encontrar más de 3000 especies, distribuidas en 90

géneros con muy diversos usos, entre las que destacan la berenjena (Solanum melongena

L.), la patata (Solanum tuberosum L.), el pimiento (Capsicum annuum L.), el tabaco

(Nicotiana tabacum L.), la belladona (Atropa belladonna L.), la mandrágora (Mandragora

officinarum L.), y la petunia (Petunia hybrida) (Knapp et al., 2014; Mueller et al., 2005b).

La familia de las solanáceas es una de las más destacadas tanto en su cultivo como en el

número de especies hortícolas que abarca, siendo la tercera con mayor importancia

económica dentro del cultivo vegetal detrás de las familias Poaceae y Fabaceae. (Ghatak et

al., 2017). Además, esta familia incluye una fuente importante de plantas modelo para la

investigación científica (Mueller et al., 2005a). Entre las plantas de este taxón se puede

destacar el papel que juega el tomate, siendo su cultivo y su consumo para alimentación

generalizados a lo largo de todo el mundo, constituyendo el segundo vegetal más consumido

dentro de la familia de las solanáceas detrás de la patata, y el noveno a nivel mundial con un

consumo total de 159 millones de toneladas por año. (Foolad, 2007; Ghatak et al., 2017)

(http://faostat.fao.org/).

Existen 17 especies distintas de tomate, todas ellas originarias del continente americano,

pero solo una de ellas, Solanum lycopersicum L., ha sufrido un proceso de domesticación a lo

largo de los siglos. Las especies silvestres presentan una gran diversidad genética, que

contrasta con la poca diversidad de la especie cultivada, estimada en sólo el 5% en

comparación con las silvestres (Bai y Lindhout, 2007). Por ello, el estudio de la diversidad

genética de estas especies silvestres es de gran interés para la investigación y mejora del

tomate cultivado.

Introducción 2

1.2. El tomate como sistema modelo

1.2.1. Solanum lycopersicum

El tomate (S. lycopersicum L.) puede ser considerado como un buen sistema modelo tanto

para el estudio básico como para el estudio aplicado de los diferentes procesos vegetales en

plantas (Gerszberg et al., 2015). Entre las características que hacen posible el empleo del

tomate como sistema modelo vegetal podemos destacar su corto ciclo de vida (entre 3 y 6

meses dependiendo de la variedad), su facilidad de cultivo en muy diversas condiciones

ambientales y su reproducción por autogamia con posibilidad de polinización e hibridación

controlada (Gerszberg et al., 2015). Además, con sus 12 pares de cromosomas, se considera

que posee un genoma relativamente pequeño, de aproximadamente 950 Mb, presentando

ausencia de duplicación génica o poliploidías genómicas, así como facilidad para la

transformación genética (Mueller et al., 2005a; Foolad, 2007). Actualmente se dispone de

numerosas herramientas genéticas para el estudio del tomate, como son unas amplias

colecciones de mutantes, multitud de marcadores génicos, mapas de ligamiento saturados y

un gran número de variedades caracterizadas (Arikita et al., 2013; Gerszberg et al., 2015).

Otro de los motivos que confieren al tomate su gran potencial como sistema modelo es la

información disponible sobre su genoma, secuenciado por un consorcio internacional

conocido como The International Solanaceae Genome Project (SOL), constituido por 10

países entre los que se encuentra España. Este proyecto se inició en 2004, y sus objetivos

incluían tanto la investigación en genómica funcional como la investigación de la evolución

de los genomas en la familia de las solanáceas (Mueller et al., 2005a). De los datos

disponibles podemos destacar que al menos el 75% de las 950 Mb que conforman el genoma

está constituido por heterocromatina desprovista en gran parte de genes. Por otro lado,

muchos de los genes de esta especie se pueden encontrar en grandes agrupaciones en las

secciones distales de los brazos cromosómicos, constituyendo la eucromatina (Mueller et al.,

2005a y 2005b). De esta forma, aproximadamente el 59% de su genoma corresponde a

secuencias no codificantes, el 28% a secuencias codificantes, el 11% a transposones y el 2%

restante a secuencias de los genomas de los orgánulos (Foolad, 2007). Con esta

configuración, el tomate cuenta con alrededor de 35.000 genes, con una densidad genética

de 6,7 genes por kilobase, densidad similar a la del arroz (Oryza sativa L.) y la planta modelo

por excelencia Arabidopsis thaliana L. (Foolad, 2007).

Introducción 3

Toda esta información disponible, junto con las características biológicas del tomate,

aportan las herramientas necesarias para el empleo de esta especie como sistema modelo

en el estudio de numerosos procesos fisiológicos a nivel genético.

1.2.2. Solanum pennellii

La especie Solanum pennelli (Correll), originaria de la región de los Andes en Sudamérica

es una de las especies de tomate silvestre (Figura 1). Presenta frutos pequeños de color

verde y posee una gran tolerancia al estrés, es autógama y se caracteriza por presentar una

gran facilidad para hibridar con S. lycopersicum, actuando como donante de material génico

y confiriéndole de esta forma mayor tolerancia en respuesta al estrés. Estas características la

convierten en una especie ideal para la construcción de líneas de introgresión y para el

estudio del genoma mediante análisis de caracteres cuantitativos (Eshed et al., 1991; Bolger

et al., 2014).

Su importancia en los estudios moleculares es también notable, ya que juega un papel

básico en el clado Lycopersicon, siendo un intermediario filogenético entre S. lycopersicum y

otras especies como S. lycopersicoides (Canady et al., 2006). También es importante el hecho

de que es la única especie del clado que puede hibridar con estas dos especies, sirviendo, a

su vez, de puente para la introgresión entre ambas.

Figura 1. Diferencias morfológicas en frutos y hojas entre el tomate cultivado, S. lycopersicum, y la especie silvestre S. pennellii. Imagen tomada de Lockhart (2013), con modificaciones.

HojasFrutos

Introducción 4

1.3. Líneas de introgresión

Un locus de carácter cuantitativo o QTL (Quantitative Trait Locus), se puede definir como

una región del genoma que ejerce un efecto cuantitativo, es decir, medible, sobre un

carácter fenotípico concreto (Salvi y Tuberosa, 2005). Los genes que están implicados en la

variación fenotípica de rasgos cuantitativos conforman la gran mayoría de la diversidad

genética (Price, 2007). Asimismo, estos loci pueden ser cartografiados o detectados

mediante la identificación de marcadores polimórficos ligados a dichos QTL, pudiendo de

esta forma localizar todas las regiones génicas que participan de forma cuantitativa en un

carácter concreto (van Eeuwijk et al., 2010; Price, 2007). Con este propósito es posible

emplear líneas en las que son conocidos tanto los marcadores como los genotipos que las

componen. El estudio de los caracteres cuantitativos mediante QTL se utiliza en gran

variedad de especies y con diversos fines, como por ejemplo para la mejora del cultivo de

alto rendimiento en arroz (Oryza sativa L.) (Miura et al., 2011) o para la identificación de

genes de resistencia a patógenos en maíz (Zea mays L.) (Cao et al., 2017), en la colza (Yu et

al., 2017) o en chopo (Populus nigra L.) (Carletti et al., 2016).

Las líneas de introgresión o ILs (Introgression Lines), están formadas por un conjunto de

NILs (Nearly Isogenic Lines o líneas casi isogénicas) construidas a partir de un proceso de

retrocruzamiento, de tal manera que cada línea es homocigótica para un solo fragmento

cromosómico del parental donante en el fondo genético del parental recurrente (Lippman et

al., 2007). Así, una población completa de líneas de introgresión alberga todo el genoma del

parental donante contenido en fragmentos cromosómicos mínimamente solapantes.

Estas líneas también poseen una gran estabilidad genética debido a su carácter autógamo

y a la ausencia de segregación de los caracteres a estudio, y las diferencias fenotípicas

observadas entre el parental recurrente y las ILs pueden ser atribuidas exclusivamente al gen

o genes que constituyen el fragmento cromosómico de la línea donante (Lippman et al.,

2007). Por estos motivos, las líneas de introgresión constituyen una herramienta muy eficaz

tanto para la construcción e identificación de QTL como para la realización de estudios

genéticos con diferentes objetivos. Algunos ejemplos de estas aplicaciones pueden ser el

estudio de las bases genéticas de la capacidad de formación de órganos adventicios en

tomate (Arikita et al., 2013), el aumento de la productividad (Sasaki et al., 2017) y la

resistencia a la salinidad en arroz (De león et al., 2017), así como la mejora del desarrollo del

sistema radicular en condiciones de sequía en el trigo (Triticum) (Merchuk‐Ovnat et al.,

Introducción 5

2017), la composición lipídica de la cutícula en tomate (Fernández‐Moreno et al., 2017) o la

longitud de la fibra en el algodón (Gossypium) (Xu et al., 2017).

1.4. Sistema radicular en las plantas de tomate

Las raíces son estructuras de gran importancia para las plantas vasculares, ya que

participan en funciones esenciales como la absorción y transporte de agua, nutrientes y

solutos hacia la parte aérea, además de constituir el anclaje de la planta al suelo

contribuyendo a su soporte (Bellini et al., 2014; Ron et al., 2013).

El sistema radicular en tomate está formado por una raíz principal que se establece

durante la embriogénesis (Scheres et al., 1994). Tras la germinación de la semilla, la raíz

principal emerge y crece de forma gravitrópica hacia el suelo, gracias a su elongación

producida por la divisiones celulares que se dan en el meristemo apical (Beemster y Baskin,

1998). Este meristemo apical funciona como un centro de organización del crecimiento

radicular, y está constituido por células quiescentes, que permanecen indiferenciadas para

seguir promoviendo las sucesivas divisiones celulares del resto de células del meristemo

(Verstraeten et al., 2014).

Figura 2. Estructura del sistema radicular en tomate. (A) Sistema radicular en S. lycopersicum,

raíz principal y laterales. (B) Raíces adventicias en respuesta a herida. La barra de escala indica 10

mm. (C) Esquema del ápice radicular en S. lycopersicum var. M82 a la izquierda y S. pennellii a la

derecha. Imagen tomada de Ron et al. (2013), con modificaciones.

De la raíz principal pueden surgir otras raíces postembrionarias, denominadas raíces

laterales (Figura 2A) (Nibau et al., 2008). En el caso de Arabidopsis thaliana, se ha estudiado

que estas raíces laterales se desarrollan a partir de tres filas de células del periciclo en el

C B A

Introducción 6

polo del xilema (Casimiro et al., 2003). En estas células fundadoras del xilema se reactiva el

ciclo celular y se inicia un primordio de raíz lateral (De Smet, 2012). Tras la formación del

primordio se producen dos divisiones asimétricas que llevan a la formación de una única

capa de primordio, y divisiones periclinales posteriores terminan de conformar el primordio

de la raíz lateral (Benková y Bielach, 2010).

Además, existe un tercer tipo de raíces conocidas como raíces adventicias (Figura 2B), que

se desarrollan en tejidos no radiculares, sobretodo en partes aéreas como hipocótilos, hojas

o tallos (Verstraeten et al., 2014). El primordio de la raíz adventicia se desarrolla y emerge de

callos indiferenciados, o a partir de la reprogramación de células residentes. A pesar de los

estudios disponibles, el origen celular de las raíces adventicias no se conoce con detalle, y

varios tejidos han sido propuestos como fuente de las células formadoras de raíces

adventicias, tales como el cámbium (Davis y Haissing, 1994; Naija et al., 2008; Bellini et al.,

2014).

La formación de raíces adventicias es un proceso complejo en el que influyen múltiples

factores tanto endógenos como exógenos, entre los que se encuentran las hormonas

vegetales, la intensidad lumínica, las heridas y el estrés entre otros (Verstraeten et al., 2014).

Las raíces están compuestas por numerosos tipos de células, las cuales contribuyen a que

el desarrollo radicular sea un proceso dinámico, plástico y con gran sensibilidad a los

cambios en el ambiente para garantizar, de esta forma, un correcto desarrollo de la planta

(Ron et al., 2013). Entre las capas de células que componen la raíz podemos encontrar, del

interior hacia el exterior; los haces vasculares (xilema y floema), procámbium, periciclo,

endodermis, córtex y epidermis (Ron et al., 2013), figura 2C.

1.5. Regulación hormonal de la formación de raíces

Los cambios en factores bióticos y abióticos tienen repercusiones en el desarrollo de la

planta, más concretamente estos cambios pueden afectar al sistema radicular debido a una

alteración de la regulación de la homeostasis o del transporte de los factores endógenos.

Dentro de estos factores endógenos podemos destacar el papel que juegan las hormonas en

la regulación del desarrollo radicular (Bellini et al., 2014).

Las auxinas son hormonas que participan en múltiples procesos dentro del desarrollo

normal de la planta. En el desarrollo radicular, en concreto, participan en etapas tan

importantes como la iniciación y el proceso de emergencia, la formación del patrón del

Introducción 7

meristemo apical, el gravitropismo y la elongación, siendo claves para el desarrollo de las

raíces laterales y adventicias (De Klerk et al., 1999; Pop et al., 2011). Utilizando mutantes de

arroz, Arabidopsis y maíz se han identificado los componentes del transporte polar de

auxinas y de la vía de señalización de auxinas requeridos en todos los pasos del desarrollo de

las raíces laterales (Courdert et al., 2010; von Behrens et al., 2011; Lavenus et al., 2013) y en

el inicio de la formación de las raíces adventicias (da Costa et al., 2013; Sukumar et al.,

2013). Por ello, las líneas mutantes en el transporte polar de las auxinas dan como resultado

defectos en la formación tanto de raíces laterales como adventicias (Li et al., 2012).

Las citoquininas son un tipo de fitohormonas requeridas en el proceso de división celular

y en el desarrollo de los tallos, siendo antagonistas de las auxinas y por tanto suprimiendo la

formación de raíces laterales y adventicias (Bellini et al., 2014). Estas hormonas promueven

una modificación de la expresión de los transportadores polares de auxinas, impidiendo de

este modo la formación del gradiente de auxinas necesario para la formación del primordio

de la raíz lateral (Laplace et al., 2007). En estudios con líneas que sobreexpresan los genes

codificantes de la oxidasa/deshidrogenasa de las citoquininas en Arabidopsis thaliana, se ha

observado, consecuentemente, una disminución en los niveles de citoquininas, aumentado

así la formación de raíces laterales y adventicias (Werner et al., 2003). De esta forma,

mutantes en los receptores de citoquininas ven aumentada la cantidad de raíces laterales

(Riefler et al., 2006). Por otra parte también se ha visto que niveles bajos de citoquininas,

sumados a la acción de las auxinas, son beneficiosos durante los primeros estadios de la

formación de raíces adventicias en plantas como el pino de Monterrey (Pinus radiata D.) o el

algarrobo (Ceratonia siliqua L.) (Ricci et al., 2008; 2016; Brunoni et al., 2014).

Antecedentes y objetivos 8

2. ANTECEDENTES Y OBJETIVOS

A pesar de la relevancia de los factores genéticos en la regulación de la arquitectura y la anatomía

radicular en distintas especies vegetales (Wachsman et al., 2015), los estudios genéticos destinados a

la identificación de los factores moleculares implicados en la formación de raíces en tomate son

escasos (Ron et al., 2013). Entender estos factores podría ser de gran importancia en la identificación

de características deseables en líneas de tomate y en la mejora de variedades, procesos pueden ser

de gran interés en los sectores tanto de la agricultura, como en la investigación básica.

En el laboratorio del Prof. José Manuel Pérez Pérez y en el marco del proyecto “Genómica

comparada de la formación de raíces adventicias en tomate y clavel (BIO2015‐64255‐R)”, se están

llevando a cabo distintas aproximaciones experimentales para entender las bases genéticas de la

formación de raíces adventicias en las plantas. Este Trabajo de Fin de Grado se centra en el estudio

de algunos parámetros relevantes de la arquitectura radicular en una selección de líneas de

introgresión obtenidas a partir del cruzamiento de una especie silvestre de tomate con una variedad

comercial de tomate (Eshed y Zamir, 1995). Existen estudios previos en esta población para la

formación de raíces y tallos adventicios en respuesta a la adición de hormonas vegetales (Arikita et

al., 2013) que se han utilizado como punto de partida para la selección de las líneas a estudio.

Los objetivos específicos de este Trabajo de Fin de Grado son:

Diseñar y evaluar un protocolo adecuado para el análisis fenotípico de la arquitectura

radicular en plántulas de tomate que se han cultivado in vitro.

Caracterizar la variación fenotípica existente en la morfología del sistema radicular (raíz

primaria y raíces laterales) durante el desarrollo temprano en una selección de líneas de

introgresión de tomate.

Caracterizar la variación fenotípica existente en la morfología del sistema radicular

adventicio en respuesta a herida en una selección de líneas de introgresión de tomate.

Estudiar la estructura tisular del meristemo apical en alguna de las líneas estudiadas.

Materiales y métodos 9

3. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1. Material vegetal

La colección de líneas de introgresión o ILs, derivadas del retrocruzamiento de Solanum

lycopersicum cv. M82 x Solanum pennelii LA716, así como también las F1 derivadas de los

distintos cruzamientos entre las líneas de introgresión y S. lycopersicum cv. M82, utilizadas

en este trabajo han sido cedidas por el Dr. Lázaro Eustáquio Pereira Peres, de la Universidad

de São Paulo (Brasil). En la Figura 3 se puede observar un esquema de los genotipos

utilizados. Estos se dividieron en tres series de trabajo; la serie 1 contenía las líneas IL1‐3,

IL2‐6, IL3‐2, IL3‐4, e IL11‐4; en la serie 2 se englobaron las líneas IL6‐2, IL7‐5, IL7‐5‐5 e IL12‐2;

y en la serie 3 se encontraban las líneas IL5‐4, IL8‐1, IL8‐1‐1 e IL11‐4‐1. En las tres series de

trabajo siempre se añadieron como control las líneas parentales S. lycopersicum y S.

pennellii.

Figura 3. Líneas de introgresión empleadas en este trabajo. (A) Esquema de los cromosomas de

tomate y las diferentes líneas de introgresión (derecha). (B) Listado de líneas estudiadas (izquierda).

Tomado de http://solgenomics.net/, con ligeras modificaciones. Se destacan en verde las distintas

líneas de introgresión utilizadas en este trabajo.

A B


3.2. Fenotipado de las líneas de introgresión

El primer paso fue llevar a cabo una esterilización de semillas de cada genotipo a estudio

(20 semillas de cada genotipo), que se depositaron en el interior de un tubo Eppendorf de

1,5 mL. Posteriormente se preparó una disolución de hipoclorito de sodio (lejía comercial

que contenía 37 gramos de cloro activo por litro) diluida al 50% con agua destilada, de la

cual se añadió 1 ml en cada uno de los tubos Eppendorf que contenía las semillas para

proceder a su desinfección. Se realizó un primer lavado con hipoclorito sódico agitando los

tubos constantemente durante 10 min. Tras esto, se realizaron 4 lavados con 1 mL de agua

destilada estéril, con tiempos de lavado de 5, 5, 10 y 10 min, consecutivamente. Una vez

esterilizadas y sin restos de lejía, las semillas de cada genotipo se traspasaron a una caja de

Petri cuadrada de 120x120x20 mm, sobre un papel de filtro humedecido con agua destilada

estéril, a modo de cámara húmeda, incubándolas durante 48 h a una temperatura de 28°C

en oscuridad. Tras estas primeras 48 h, las semillas que hubieron germinado se transfirieron

a cajas de Petri estériles de 240x240x25 mm que contenían 150 mL de medio de cultivo

previamente autoclavado (20 min a 121°C), que contenía: 2,15 g/L de la mezcla básica de

sales Murashige y Skoog (Duchefa); 20 g/L de sacarosa, y una disolución de 2mL/L de la

mezcla de vitaminas “Gamborg B5” (Duchefa), pH ajustado a 5,8 utilizando para ello KOH

1M, usando como tampón MES monohidrato (Duchefa) a una concentración de 0,5 g/L. Por

último se añadió el agente gelificante Gelrite (Duchefa) a una concentración de 2,5 g/L.

Debido a la necesidad de un ambiente estéril todo el proceso se realizó en una cabina de

flujo laminar Tesltar H‐100. Con ayuda de unas pinzas estériles, se trasfirieron 12 semillas

germinadas de cada genotipo siguiendo una disposición de 6 semillas equidistantes por fila

con un total de dos filas por caja, como se muestra en la Figura 4.

Una vez completado este proceso, las cajas de Petri se sellaron y se colocaron

posteriormente en una cámara de crecimiento Bioclim a una temperatura de 20‐24°C

durante 72 h con periodo de día largo, es decir un total de 16 h de luz y 8 h de oscuridad. Las

cajas de disponían de manera vertical para favorecer el crecimiento gravitrópico de las

plantas y se cambiaban de posición diariamente en la cámara de cultivo para evitar

diferencias de temperatura o iluminación dentro de la cámara.

Después de pasar 72 h en la cámara de crecimiento, las plántulas de cada placa fueron

numeradas y se escanearon. A continuación se llevó a cabo el corte del ápice radicular. Para


ello, con la ayuda de un bisturí estéril, se realizó un corte de unos 5 mm del ápice de la raíz

que una vez seccionado se retiró del medio de cultivo. Del mismo modo, se llevó a cabo un

segundo escaneado de las placas tras realizar este proceso de corte. A las 72 horas tras el

corte del ápice se procedió a la escisión de la raíz principal, escaneando previamente cada

una de las cajas de Petri. Para eliminar la raíz principal se realizó un corte en el tercio inferior

del hipocótilo, eliminando así, por un lado la raíz principal y las raíces laterales, y asegurando

por otro, la eliminación de los posibles primordios de raíces adventicias ya formados en este

tiempo. Los hipocótilos cortados se trasladaron a nuevas cajas de Petri de 240x240x25 mm

con medio de cultivo con la misma composición descrita anteriormente, realizando un

escaneado de las nuevas placas tras la correcta colocación de los hipocótilos cortados. Las

raíces laterales retiradas tras el corte del hipocótilo, se fijaron para su posterior uso.

Figura 4. Esquema del protocolo seguido para la realización del fenotipado de las líneas de introgresión. Esquema del procedimiento de fenotipado seguido en este trabajo, desde la siembra de semillas hasta el desarrollo de las plantas en el invernadero. Las líneas discontinuas en rojo representan cortes efectuados. E1-E8 simbolizan el momento de la toma de imágenes de las distintas placas mediante su escaneado.

Una vez crecidas las raíces adventicias, se llevó a cabo un seguimiento visual de éstas,

realizando recuentos periódicos del número de raíces adventicias por explanto en cada

genotipo así como toma de imágenes con el escáner de forma periódica (Figura 4). Al

finalizar el experimento, se seleccionaron plantas para su crecimiento en el invernadero,

cultivándose estas plantas con una proporción 1:1 de sustrato comercial (J&P Viverismo) y

perlita (Proquilab), en macetas de 3 L, con riego automático de 4 min cada 6 horas, así como

con un rango de temperatura de 25‐35°C, y fotoperiodo de 11 h luz/13 h oscuridad, durante

el tiempo necesario hasta que maduraron los frutos y se obtuvieron nuevas semillas.


3.3. Estudio celular de la morfología radicular por el método de tinción

pseudo Schiff con yoduro de propidio (PS‐PI)

Después del corte del sistema radicular siguiendo el protocolo anteriormente descrito, las

raíces laterales cortadas se introdujeron en un tubo Eppendorf con una disolución fijadora

(50% de metanol y 10% de ácido acético) durante 12 h a 4°C (Truernit et al., 2008).

Tras la fijación, se realizó un lavado con 1 mL de agua destilada, y posteriormente se

añadió al tejido 1mL de una dilución al 1% de ácido periódico en agua destilada, dejando

actuar durante 40 min a temperatura ambiente. Una vez transcurrido este tiempo, se realizó

un nuevo lavado con agua destilada y se incubaron las muestras durante 2 h con 1 mL del

reactivo de Schiff a temperatura ambiente; este reactivo contiene 1,9 g de metabisulfito de

sodio en 0,54% de ácido clorhídrico y 0,1 mg/mL de yoduro de propidio, en un volumen final

de 100 mL. Pasado este tiempo de incubación se retiró el reactivo de Schiff y se añadió 1 mL

de una disolución que contenía hidrato de cloral (80 g de hidrato de cloral en 20 mL de agua

destilada), dejándolo a temperatura ambiente durante toda la noche para eliminar el exceso

de yoduro de propidio de las muestras.

Al día siguiente, con la ayuda de unas pinzas, se depositó el tejido a estudio en un

portaobjetos de 76x26 mm y se le añadió una gota de reactivo de Hoyer (20 mL de agua

destilada, 30 g de goma arábiga, 20 g de glicerol y 200 g de hidrato de cloral), colocando

sobre la muestra el cubreobjetos y sellando los portaobjetos con laca de uñas para su

posterior visualización con el microscopio confocal.

Para la visualización de las muestras se ha empleado un microscopio láser confocal Leica

TCS‐SPE. La longitud de onda de excitación para las muestras teñidas por el método PS‐PI fue

de 488 nm, la longitud de onda de emisión se recogió entre 485 y 491nm.

3.4. Análisis de la formación de raíces adventicias en explantos de cotiledón e

hipocótilo en medio con hormonas

El ensayo de regeneración consistió en el estudio de la formación de raíces adventicias en

explantos de hipocótilo y cotiledón en medios con presencia de hormonas exógenas. Se

utilizaron tres medios de cultivo para la realización de estos ensayos; 1) medio de cultivo

MS, descrito en el apartado 3.2; (2) medio MS suplementado con 0,1 M de la auxina ácido

1‐naftalenacético o ANA, y (3) medio MS suplementado con 2,25 M de la citoquinina 6‐

benzilaminopurina o 6‐BAP.


Las semillas utilizadas en este ensayo se esterilizaron y germinaron del mismo modo que

el descrito en el apartado 3.2. Las plántulas germinadas se pasaron a cajas de Petri

240x240x25 mm en la disposición descrita en el apartado 3.2 con medio de cultivo MS,

donde se desarrollaron durante 10 días antes de proceder al corte de la planta. Para obtener

la muestra de hipocótilo de la parte superior o apical se realizó un corte transversal por

debajo de los peciolos de los cotiledones y otro inferior, obteniendo un explanto de

aproximadamente 5 mm como se observa en la Figura 5A. Del mismo modo, para obtener el

fragmento de hipocótilo de la parte inferior o basal, se seccionó el sistema radicular y se

realizó otro corte superior de 5 mm. Por otro lado, se eliminó el peciolo de ambos

cotiledones, y se realizó un corte transversal dividiendo el cotiledón en dos partes de igual

tamaño, obteniéndose de esta forma dos muestras diferenciadas por cada uno de los dos

cotiledones, una de las partes contenía el ápice del cotiledón mientras que la otra contenía

la base del mismo.

Figura 5. Corte y distribución de los explantos de tomate. (A) Esquema de una plántula de tomate a los 12 días de la germinación, las líneas discontinuas representan los cortes efectuados. (B) Distribución de los explantos en las cajas de Petri de 90 mm de diámetro.

Como se muestra en la Figura 5B, se utilizaron cajas de Petri redondas de 90 mm de

diámetro que se dividieron en 4 secciones equivalentes en tamaño, y en cada sección se

colocó una planta. Cada sección se divide en dos subsecciones, donde el lado izquierdo

contiene el fragmento de la parte inferior del hipocótilo (numerado como 1), así como dos

de cotiledón (3 y 5), correspondientes a la base de los dos cotiledones de la planta, y el lado

5 mm región apical

5 mm regiónbasal

Cotiledón región basal

Cotiledón región apical

A B


derecho contiene la muestra de la parte superior del hipocótilo (numerado como 2), y los

fragmentos pertenecientes al ápice de cada uno de los cotiledones (4 y 6).

Las muestras de hipocótilo se colocaron de forma vertical de tal modo que sólo la parte

basal de cada fragmento, correspondiente a uno de los cortes, estaba en contacto con el

medio. Además, los explantos de cotiledón se posicionaron procurando maximizar el

contacto de la superficie abaxial y la zona de corte con el medio de cultivo.

Tras la colocación de los explantos se realizó un escaneado de las cajas de Petri,

dejándolas posteriormente en la cámara de crecimiento a una temperatura de 20‐24°C

durante 25 días, con período de día largo (16 h de luz y 8 h de oscuridad), con luz procedente

de la parte superior de la cámara, disponiéndose las placas en la cámara de manera

horizontal con la parte adaxial de los cotiledones (cara sin contacto con el medio) hacia la

fuente de luz. Se mantuvieron los explantos en contacto con el medio con diferentes

hormonas durante 25 días, realizándose escaneados periódicos hasta el día de finalización

del ensayo en el que se escanearon de nuevo cada una de las cajas de Petri.

3.5. Análisis de imágenes

3.5.1. Análisis del fenotipado radicular

Las imágenes se obtuvieron mediante el escaneo de las distintas cajas de Petri utilizando

un escáner HP Epson V330, con una resolución de imagen tanto vertical como horizontal de

800 ppp (píxeles por pulgada). El protocolo de escaneado comenzó con una primera toma de

imagen el día de la colocación en las cajas de Petri de las semillas germinadas procedente de

cámara húmeda. Posteriormente se realizaron dos escaneos el día del corte del ápice, uno

antes y otro después de este proceso; de igual forma se procedía en el momento del corte

del sistema radicular, tomando dos imágenes, siendo la segunda de los hipocótilos ya

cortados. Tras este proceso se realizaban tomas de imágenes de los hipocótilos

periódicamente cada 3‐4 días, hasta el último escaneo a los 10 días del corte.

Para la recogida de datos cuantitativos se han utilizado las imágenes de los escáneres

realizados el día 5 después de la germinación, en este caso para el estudio de la raíz

principal; las imágenes del día 8 después de la germinación se utilizaron para el estudio de

las raíces laterales y las del día 10 después del corte de la raíz principal para el estudio de las

adventicias. En la Figura 6 se pueden observar las distintas fases del editado de las imágenes

que se llevó a cabo para el ensayo de las líneas de introgresión. En la Figura 6A se detalla el


sistema radicular de una plántula a los 8 días desde su germinación, proveniente de la

imagen tomada antes del corte de la raíz principal. El procedimiento que se ha utilizado es

igual para el análisis de la raíz principal y laterales, así como para raíces adventicias. Esta

imagen se editó con el programa ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/); para ello, el primer

paso fue la separación de los canales primarios que forman la imagen, seleccionando el canal

rojo, por ser el que presentaba la imagen más clara, obteniendo de esta forma una imagen

en escala de grises. Posteriormente se ajustó el contraste y el brillo de la imagen, así como el

balance de color, para conseguir una mejor calidad de la imagen disminuyendo el ruido de

esta (Figura 6B).

Figura 6. Etapas del procesado de imágenes para el fenotipado radicular. (A) Imagen original obtenida del escaneado de las placas, (B) Imagen en escala de grises, (C) Conversión de la imagen a píxeles binarios, (D) Eliminación manual de ruido, (E) Esqueletonización o conversión a línea única de píxeles. La barra de escala indica 10 mm.

La imagen obtenida se introduce en el programa EZ Rhizo (Armengaud et al., 2009),

donde se llevó a cabo un proceso de conversión de la imagen en la que los pixeles de esta,

según su intensidad luminosa se transforman, bajo un umbral ajustable, en pixeles binarios,

obteniéndose de esa forma la imagen “C” a partir de la anterior (Figura 6C). Tras este primer

paso, se llevó a cabo un proceso de editado manual de la imagen, con el fin de disminuir el

ruido alrededor de la raíz, así como una suavización tanto de las raíces laterales una a una,

como de la raíz principal. Se realizó también una definición de todas las raíces, de tal forma

que el programa pudiera detectarlas correctamente, así como una separación de las raíces

superpuestas. Una vez terminado este proceso de editado manual se obtuvo la imagen “D”

(Figura 6D), posteriormente se llevó a cabo un proceso de “esqueletonización”, en el que

cada raíz se transformó en una única fila de pixeles, requiriendo en este caso, un segundo

A B C D E


editado manual. El último paso fue la detección de la raíz principal y de las raíces laterales

(Figura 6E), destacándose en diferentes colores, y obteniendo posteriormente un archivo de

texto plano con los datos de longitud, posición y ángulo de crecimiento de las raíces, tanto

principal como lateral, así como también el número de raíces laterales.

3.5.2. Análisis de regeneración con hormonas

En el ensayo de regeneración se realizó una primera toma de imágenes tras la colocación

de los explantos en las cajas de Petri, tras ello se obtuvieron escaneos de las cajas

periódicamente cada 5‐7 días, hasta los 25 días, utilizando tanto el primero como el último

de ellos para obtener los datos necesarios para completar el ensayo.

En las placas suplementadas con citoquininas, las imágenes se analizaron con el programa

ImageJ, midiendo el área del callo formado a día 0 y día 25. Los datos de las gráficas se

obtuvieron restando el área del día 25 menos el área del día 0. En las placas suplementadas

con auxina se realizó un recuento de raíces periódicamente, y se utilizaron los datos

obtenidos a día 25.

3.6. Análisis de datos

Una vez recopilados todos los datos de cada una de las imágenes, y agrupados por

características a estudio, se obtuvieron distintos parámetros como longitud, numero de

raíces laterales y adventicias, distancia entre raíces, distancia al hipocótilo de las raíces

laterales, distancia entre raíces adventicias y ángulo de crecimiento de los tres tipos de

raíces estudiados.

Los valores de la longitud de la raíz principal, de raíces laterales y raíces adventicias se

obtuvieron del archivo de texto plano proporcionado, por el programa EZ Rhizo. Para realizar

el gráfico correspondiente a estos parámetros, se agruparon los datos por planta y genotipo,

realizando en el caso de raíces laterales y adventicias una media de cada una de las plantas,

obteniéndose de esta forma la longitud media de raíz para cada planta. Posteriormente se

realizó una media de la longitud para cada genotipo en los tres tipos de raíces estudiadas,

aplicando en ambos procesos el tratamiento de los datos descritos posteriormente. Estos

cálculos se llevaron a cabo con ayuda del programa Excel de Microsoft Office 2010.

En las imágenes correspondientes al análisis de las raíces adventicias se tomó el

hipocótilo como referencia para la obtención de los datos correspondientes a las raíces

adventicias. Los datos del número de raíces laterales y adventicias se obtuvieron


directamente del archivo proporcionado por el programa EZ Rhizo. El tratamiento de los

datos fue similar al seguido en el cálculo de la longitud de las raíces.

El ángulo de crecimiento de los tres tipos de raíces estudiadas se ha obtenido agrupando

los valores por planta y genotipo, siguiendo el mismo protocolo de tratamiento de datos que

se ha utilizado para la longitud de las raíces. Sin embargo, en este caso el programa EZ Rhizo

nos proporcionaba el valor del ángulo referido a la vertical de la imagen, dato que se utilizó

directamente en el caso de la raíz principal y adventicias, pero que en el caso de las raíces

laterales se ha decidido referenciar a su respectiva raíz principal; de esta forma se ha

procedido con la resta del valor del ángulo de la raíz principal al de la raíz lateral,

obteniéndose el valor del ángulo de crecimiento de estas raíces con respecto al de su raíz

principal.

La distancia al hipocótilo de las raíces laterales se obtuvo directamente de su posición en

la raíz principal, dato que proporciona el programa EZ Rhizo. La distancia entre raíces

laterales y raíces adventicias se ha calculado mediante la resta de las posiciones de raíces

contiguas. Tras la obtención de los datos para cada uno de los parámetros, se procedió a una

ponderación de los mismos, referenciándolos a los datos obtenidos para los mismos

parámetros en el genotipo de referencia en cada serie y obteniendo así valores relativos en

los casos en los que se observaron diferencias entre series en las líneas control.

Para todos los parámetros descritos anteriormente se han realizado distintos análisis

estadísticos. En primer lugar, se ha procedido con una detección y descarte de valores

atípicos previa al cálculo de los distintos promedios. Posteriormente, para identificar

diferencias significativas entre los valores de los distintos genotipos, se han llevado a cabo

análisis ANOVA entre los valores de las medias de cada planta, para cada parámetro,

referenciados a sus genotipos. Estos dos procedimientos se han realizado con el programa

de estadística Statgraphics Centurion XII.

En el caso del ensayo de regeneración, los datos del número de raíces en los explantos se

agruparon por tipo de explanto, tipo de tratamiento, número de planta, y genotipo al que

pertenecían. Para el estudio de los datos de realizó un análisis estadístico ANOVA con el

programa Statgraphics Centurion XII, para destacar las diferencias significativas en la

formación de raíces adventicias, dentro de un mismo tipo de explanto y genotipo, y entre los

explantos depositados en medio MS y en medio MS con hormonas.


De la misma forma se procedió con los datos de las áreas de los explantos, agrupándolos

por tipo, tratamiento, planta y genotipo, además, de en este caso, por día de la medición, es

decir, si fue tomada al principio o al final del ensayo. Realizando una media en cada uno de

estos grupos para cada planta, e identificando a su vez los datos atípicos con el programa

Statgraphics Centurion XII, con el que se realizó posteriormente un análisis ANOVA, para

destacar las diferencias significativas existentes entre el área al principio y al final del ensayo

dentro un mismo tipo de medio de cultivo; y las diferencias existentes en el área entre el

medio MS y el medio MS con hormonas al finalizar el ensayo.

Resultados 19

4. RESULTADOS

4.1. Selección de las líneas de introgresión

Las líneas de introgresión seleccionadas para este trabajo fueron cedidas por el Dr. Lázaro

Eustáquio Pereira Peres de la Universidad de São Paulo (Brasil). Estas líneas contienen

pequeños fragmentos de los cromosomas de Solanum pennellii, una especie silvestre de

tomate que mostró una elevada capacidad de regeneración in vitro (Arikita et al., 2013), y

que fueron introgresados en el cultivar comercial M82 de S. lycopersicum. Con el fin de

encontrar variaciones genéticas naturales que controlen la capacidad de formar raíces

adventicias tras una herida, se seleccionaron las 11 líneas de introgresión de la población

derivada del cruzamiento S .pennellii × S. lycopersicum que presentaron valores extremos en

su capacidad de regeneración de tallo a partir de explantos de cotiledón y en respuesta a la

adición exógena de auxinas y citoquininas (Arikita et al., 2013).

4.2. Germinación

Para determinar si la introgresión de un fragmento cromosómico de S. pennellii podría

afectar a la germinación de las líneas a estudio, se evaluó el porcentaje de germinación en

cada línea y en los parentales S. lycopersicum M82 y S. pennellii. Los resultados obtenidos se

muestran en la Figura 7.

Figura 7. Porcentaje de germinación de las líneas de introgresión estudiadas.

El porcentaje de germinación de las líneas parentales fue del 60% en el caso de S.

lycopersicum y del 74% en el caso de S. pennellii, sin encontrar demasiada variación en los

Resultados 20

porcentajes de germinación de las líneas parentales entre las distintas siembras realizadas.

La mayoría de las líneas de introgresión presentaron valores de germinación similares a los

de sus parentales, a excepción de la línea IL3‐4, con un 15% de germinación, y la IL8‐1 en el

que todas la semillas germinaron (Figura 7).

4.3. Caracterización morfológica de la arquitectura radicular

4.3.1. Raíz principal

El estudio de la raíz principal se llevó a cabo a las 72 h de la germinación de las semillas (5

días después de la siembra). A partir de las imágenes obtenidas se analizaron los siguientes

parámetros: (1) longitud de la raíz principal, (2) ángulo de la raíz principal respecto a la

vertical, y (3) dirección de crecimiento de la raíz principal, considerando el valor 1 si crece

hacia la izquierda de la imagen y el valor 0 si crece hacia la derecha. Estos tres parámetros se

cuantificaron tal cómo se describe en el apartado de materiales y métodos.

Debido a que hemos encontrado diferencias significativas en la longitud de la raíz

principal de los parentales en función de la siembra (Tabla 1), se procedió a corregir los

resultados de cada serie respecto a la línea M82 de S. lycopersicum, lo que nos ha permitido

comparar entre sí los resultados obtenidos en las distintas siembras.

Tabla 1. Valor de P en los parámetros de la raíz principal en S. lycopersicum

Parámetro estudiado Factor: siembraa

Longitud <0,001

Ángulo 0,122

Dirección 0,623

a Se indican en negrita y cursiva los valores de P<0,01.

El valor promedio de la longitud de la raíz principal en las plántulas de S. lycopersicum a

los 5 días tras la siembra fue de 33,2 11,9 mm, mientras que en S. pennellii este valor fue

significativamente mayor. En lo que respecta a las líneas de introgresión estudiadas, se

observaron diferencias significativas con el parental S. lycopersicum en las líneas IL1‐3 e IL3‐

4, que mostraron una raíz principal significativamente más corta (Figura 8A y 8D). Por otro

lado, el valor promedio de longitud de la raíz principal fue significativamente mayor que el

del parental de referencia en las líneas IL7‐5, IL7‐5‐5, IL8‐1, IL11‐4 e IL12‐2 (Figura 8A y 8D).

No se encontraron diferencias significativas en la longitud de la raíz principal de estas líneas

Resultados 21

entre sí y con respecto al parental S. pennellii, a excepción de la línea IL7‐5 que mostró una

raíz principal significativamente más larga que S. pennellii.

Figura 8. Caracterización morfológica de la raíz principal. (A) Longitud promedio de la raíz principal respecto a S. lycopersicum. (B) Valor promedio del ángulo de la raíz principal con respecto a la vertical. (C) Dirección de crecimiento de la raíz principal. Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas con S. lycopersicum (P<0,05). En rojo valores inferiores y en verde valores superiores. (D) Imágenes representativas de plántulas de S. lycopersicum (M82) (izquierda), IL7-5 (centro) e IL3-4 (derecha) a los 5 días después de la siembra. La barra de escala indica 10 mm.

El ángulo de la raíz principal respecto a la vertical fue de 14,4 6,8 en S. lycopersicum y

de 12,1 9,7 en S. pennelli (Figura 8B). Dos líneas, la IL7‐5 y la IL8‐1, mostraron un ángulo

de crecimiento de la raíz principal menor de 10. En el caso de las líneas IL3‐2 y IL3‐4, ambas

mostraron un ángulo mayor de 40 (Figura 8B).

Respecto a la dirección de crecimiento de la raíz principal, no se encontraron diferencias

estadísticamente significativas entre las líneas analizadas y con respecto a sus parentales,

A

B

C

D IL7‐5 M82 IL3‐4

Resultados 22

observándose que en la mitad de los casos la raíz principal crecía hacia la derecha y en la

otra mitad crecía hacia la izquierda (Figura 8C).

4.3.2. Raíces laterales

Para el análisis del sistema radicular secundario se indujo la formación de raíces laterales

mediante la escisión del ápice de la raíz primaria, de manera similar a cómo se había descrito

previamente en Arabidopsis thaliana (Van Norman et al., 2014) y tal cómo se indica en

materiales y métodos. A los 3 días tras la escisión del ápice radicular (8 días tras la siembra),

se analizaron los siguientes parámetros: (1) número de raíces laterales; (2) densidad,

definida como la distancia entre dos raíces laterales consecutivas; (3) longitud promedio de

las raíces laterales; (4) ángulo promedio de las raíces laterales respecto a la raíz principal; y

(5) dirección de crecimiento de las raíces laterales. Además se introdujo un parámetro

adicional que hemos denominado: (6) profundidad mínima del sistema radicular secundario,

y que se define como la distancia, en la raíz principal, entre la base del hipocótilo y la raíz

lateral más próxima a ésta.

Hemos encontrado diferencias estadísticamente significativas en los parentales para

algunos de los parámetros cuantificados en el sistema radicular secundario en función de la

siembra (Tabla 2), por lo que se procedió a corregir los resultados de cada serie respecto a la

línea M82 de S. lycopersicum, de manera similar a cómo se ha descrito en el apartado

anterior.

Tabla 2. Valor de P en los parámetros de las raíces laterales en S. lycopersicum


Número <0,001

Densidad <0,001

Longitud <0,001

Ángulo <0,001

Dirección 0,488

Profundidad mínima 0,024


El número de raíces laterales en el parental de referencia S. lycopersicum fue de 10,8

6,5 raíces, mientras que en S. pennelli no se observó un número significativamente distinto

Resultados 23

de raíces laterales aunque su número era algo mayor (Figura 9A). Tres de las líneas de

introgresión analizadas, IL2‐6, IL7‐5 e IL11‐4, presentaron un número de raíces laterales

significativamente mayor que el parental S. lycopersicum y dos de ellas (IL2‐6 e IL11‐4)

superaron los valores de S. pennellii (Figura 9A y 9D). En otras especies, como Arabidopsis, el

número de raíces laterales se correlaciona de manera positiva con la longitud de la raíz

principal (Lupini et al., 2014). En nuestra población a estudio hemos determinado que

también existe correlación entre la longitud de la raíz principal y el número de raíces

laterales tras la escisión del ápice radicular en tomate (Figura 10).

Figura 9. Caracterización morfológica de la arquitectura radicular secundaria. (A) Número promedio de raíces laterales respecto a S. lycopersicum. (B) Densidad del sistema radicular secundario. (C) Profundidad mínima del sistema radicular secundario. (D) Imágenes representativas de plántulas de S. lycopersicum M82 (izquierda), IL7-5 (centro) e IL8-1 (derecha) a los 8 días después de la siembra. Se siguen las pautas indicadas en la Figura 8.

DA

B

C

DM82 IL11‐4 IL8‐1 D

Resultados 24

Respecto a la densidad del sistema radicular secundario, hemos determinado que el valor

promedio de distancia entre dos raíces laterales consecutivas en los parentales fue de 1,7

1,1 mm y 2,0 0,8 mm en S. lycopersicum y S. pennellii, respectivamente. La mayoría de

líneas estudiadas presentaron una menor densidad del sistema radicular secundario que el

parental S. lycopersicum (Figura 9B).

Hemos observado que tres de las líneas estudiadas presentaron valores promedio de

profundidad mínima del sistema radicular significativamente distintos de sus parentales

(Figura 9C). Es de destacar el caso de la línea IL7‐5, que presentó el valor promedio más alto

(6,5 3,3 mm), en comparación con el del parental de referencia S. lycopersicum (3,3 1,4

mm). En el otro extremo, la línea IL2‐6 presentó los valores mínimos para este parámetro

(0,4 0,2 mm). IL2‐6 e IL7‐5 presentaron un mayor número de raíces laterales que sus

parentales, que en el primer caso (IL2‐6) podría deberse a una disminución en la

profundidad mínima del sistema radicular, mientras que en el segundo caso (IL7‐5) este

aumento en el número de raíces laterales podría deberse a un alargamiento de la raíz

principal.

Figura 10. Gráficos de correlación entre algunos parentales estudiados. (A) Gráfico de correlación entre los valores de longitud de la raíz principal y el número de raíces laterales en todas las líneas analizadas. (B) Gráficos de correlación entre los valores de longitud de la raíz principal y el número de raíces laterales en el parental S. pennellii.

La longitud de las raíces laterales en una misma planta depende, en gran medida, del

estadio de desarrollo de las mismas, de tal forma que las raíces laterales viejas son más

largas que las raíces laterales más jóvenes. Existe, por tanto, un gradiente posicional por el

que las raíces laterales inician su desarrollo desde las regiones más próximas a la base del

hipocótilo. A pesar de estas diferencias locales entre las longitudes de las raíces laterales

A B

Resultados 25

dentro de cada plántula, hemos determinado que existen diferencias estadísticamente

significativas entre algunas de las líneas analizadas y sus parentales (Figura 11A). Las líneas

IL5‐4, IL8‐1 e IL11‐4‐1 presentaron un valor promedio de la longitud de raíces laterales

superior al de sus parentales, que en el caso de S. lycopersicum supone 4,1 2,6 mm de

longitud (Figura 11D). De estas tres líneas, solo la IL8‐1 presentó también una mayor

longitud de la raíz principal (Figura 8A).

Figura 11. Caracterización morfológica de las raíces laterales. (A) Longitud promedio de las raíces laterales respecto a S. lycopersicum. (B) Valor promedio del ángulo de crecimiento de las raíces laterales con respecto a la raíz principal del parental S. lycopersicum M82. (C) Dirección de crecimiento de las raíces laterales. Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas con S. lycopersicum (P<0,05); en rojo se muestran los valores inferiores y en verde los superiores. La barra de escala indica 10 mm.

DA

B

C

Resultados 26

A B C

D FE

El ángulo de crecimiento de las raíces laterales en el parental S. lycopersicum fue de 60,3

12,9 y algo menor (53,5 18,9) en S. pennelli (Figura 11B). Es interesante destacar que

un gran número de líneas presentó valores significativamente superiores o inferiores al

parental S. lycopersicum (Figura 11B), lo que sugiere el carácter multigénico de este

parámetro, tan relevante para la mejora genética del sistema radicular en condiciones de

estrés.

No se han observado diferencias significativas en la dirección de crecimiento de las raíces

laterales (Figura 11C).

Para comprobar si las diferencias observadas en las raíces laterales podrían tener su

origen en la morfología celular, se fijaron, se tiñeron y se visualizaron las raíces laterales

mediante microscopía confocal (véase el apartado correspondiente de materiales y

métodos). Las líneas parentales así como aquellas en las que se han visto los fenotipos más

pronunciados se representan en la Figura 12. Se indican las células que conforman el centro

quiescente, las células iniciadoras del córtex y la endodermis, la endodermis, el córtex y la

epidermis.

Figura 12. Ápice radicular de las raíces laterales. (A) S. lycopersicum. (B) S. pennellii. (C) IL11-4, (D) IL12-2, (E) IL7-5, (F) IL2-6. Epi: epidermis; Co: córtex; En: endodermis; CEI: células iniciadoras

de córtex y endodermis; CQ: centro quiescente. La barra de escala indica 100 m.

Resultados 27

4.3.3. Raíces adventicias

Para el análisis del sistema radicular adventicio se indujo la formación de raíces

adventicias mediante la escisión del sistema radicular completo, (la raíz principal y las raíces

laterales), tal como se indica en materiales y métodos. A los 10 días después de la escisión

del sistema radicular (18 días tras la siembra) se analizaron los siguientes parámetros: (1)

número de raíces adventicias; (2) densidad, definida como la distancia entre dos raíces

adventicias consecutivas; (3) longitud de las raíces adventicias; (4) ángulo de las raíces

adventicias respecto a la vertical; y (5) dirección de crecimiento de las raíces adventicias.

Hemos encontrado diferencias estadísticamente significativas en algunos de los

parámetros cuantificados en el sistema radicular adventicio en los parentales en función de

la siembra (Tabla 3), por lo que se procedió a corregir los resultados de cada serie respecto a

la línea M82 de S. lycopersicum, de manera similar a cómo se ha descrito previamente. No

obtuvimos resultados de la línea IL7‐5‐5 porque no había datos suficientes.

Tabla 3. Valor de P en los parámetros de las raíces adventicias en S. lycopersicum


Número 0,316

Densidad <0,001

Longitud 0,023

Ángulo 0,811

Dirección 0,947


El número de raíces adventicias en el parental de referencia S. lycopersicum fue de 4,9

1,2 raíces, mientras que en S. pennelli presentó un número de raíces adventicias de 8,7 ± 2,3,

siendo estas diferencias estadísticamente significativas (Figura 13A). Tres de las líneas de

introgresión analizadas, IL5‐4, IL8‐1 e IL11‐4‐1, presentaron un número de raíces adventicias

significativamente mayor que el parental S. lycopersicum y una de ellas (IL11‐4‐1) superó los

valores de S. pennellii (Figura 13A y 13D).

Respecto a la densidad del sistema radicular adventicio, hemos determinado que el valor

promedio de distancia entre dos raíces adventicias consecutivas en los parentales fue de 0,5

0,2 mm y 0,3 0,1 mm en S. lycopersicum y S. pennellii, respectivamente. Las líneas IL1‐3,

Resultados 28

C DM82 S. pennellii IL3‐2 IL11‐4‐1

IL3‐4, IL5‐4 e IL11‐4 presentaron una menor densidad del sistema radicular adventicio que el

parental S. lycopersicum (Figura 13B).

Figura 13. Caracterización morfológica de las raíces adventicias I. (A) Número de raíces adventicias. (B) Valor promedio de la densidad de raíces adventicias. Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas con S. lycopersicum (P<0,05), en rojo se muestran los valores inferiores y en verde los superiores. (C) Imágenes representativas de plántulas de las líneas S. lycopersicum M82 (izquierda) y S. pennellii (derecha). (D) Imágenes representativas de plántulas IL3-2 (izquierda) e IL11-4-1 (derecha). Las barras de escala indican 10 mm.

La longitud de las raíces adventicias se representa en la Figura 14A. La longitud promedio

de las raíces adventicias de las plantas S. lycopersicum fue de 36,9 ± 18,5 mm, mientras que

C

A

B

Resultados 29

las plantas S. pennellii presentaron un valor promedio en la longitud de raíces adventicias

significativamente menor, de 14,9 ± 6,9 mm. También se observaron raíces adventicias

significativamente más cortas en las líneas IL5‐4, IL8‐1 e IL11‐4‐1. Estas mismas líneas

presentaban un número significativamente mayor de raíces adventicias. La línea IL3‐2

presentó mayor longitud de raíces adventicias que el control, siendo la única que presentaba

menor número de raíces adventicias de manera significativa.

El ángulo de crecimiento de las raíces adventicias en el parental S. lycopersicum fue

de 49,0 19,9 y algo mayor (56,2 20,8) en S. pennellii (Figura 14B). Únicamente IL7‐5

poseía un ángulo de raíces adventicias similar al de S. pennellii, 57,0 ± 19,3, mientras que

varias líneas poseían un ángulo significativamente menor al observado en el parental S.

lycopersicum (Figura 14B).

Figura 14. Caracterización morfológica de las raíces adventicias II. (A) Longitud de las raíces adventicias. (B) Valor del ángulo de crecimiento de las raíces adventicias con respecto a la vertical. (C) Dirección de crecimiento de las raíces adventicias. Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas con S. lycopersicum M82 (P<0,05), en rojo se muestran los valores inferiores y en verde los superiores.

A

B

C

Resultados 30

No se han observado diferencias significativas en la dirección de crecimiento de las raíces

adventicias (Figura 14C).

4.4. Regeneración en medio suplementado con hormonas

Para el estudio de la regeneración en la parte basal del hipocótilo en medio

suplementado con hormonas se llevaron a cabo dos ensayos: (1) en medio suplementado

con la citoquinina 6‐benzilaminopurina (6‐BAP) y (2) en medio suplementado con la auxina

ácido naftalenacético (ANA), tal y como se indica en el apartado de materiales y métodos. En

el medio suplementado con citoquininas se observó la aparición de callos, conjunto de

células sin estructura organizada aparente y con capacidad pluripotente (Ikeuchi et al.,

2013), en la base de los fragmentos de hipocótilo. Al no observarse diferencias

estadisticamente significativas en el área de la base de los explantos de en función de la

región estudiada, apical o basal, los datos se combinaron para su análisis.

En la Figura 15A se representa el aumento del área de la base de los explantos de

hipocótilo en las diferentes líneas estudiadas en el medio de cultivo suplementado con

citoquininas (en rojo) y en medio sin citoquininas (en azul). El área de la base de los

explantos de hipocótilos del parental S. lycopersicum en medio sin hormonas aumentó 3,6 ±

2,4 mm2 y no se observaron diferencias estadísticamente significativas entre las líneas

estudiadas en el medio sin suplemento. El valor del aumento del área de los callos en el

medio de cultivo con citoquininas para S. lycopersicum fue de 12,9 ± 2,4 mm2. Al igual que S.

lycopersicum, la mayoría de las líneas de introgresión estudiadas también mostraron

diferencias estadísticamente significativas cuando comparábamos el área de la base de los

explantos de hipocótilo en los dos tratamientos (con y sin citoquininas). La línea IL12‐2

presentó la mayor diferencia en el área de los explantos de los hipocótilos entre

tratamientos, 4,4 ± 3.3 mm2 en el medio de cultivo sin hormonas y 26,2 ± 4,3 mm2 en el

medio de cultivo con hormonas.

Para el estudio de la respuesta a las auxinas, se observó el número de raíces adventicias a

los 25 días tras la colocación de los explantos de hipocótilo en los tratamientos (medio de

cultivo MS y medio de cultivo suplementado con 0,1 µM de ANA auxinas), no se observaron

diferencias estadisticamente significativas entre la parte de arriba y la de debajo de los

explantos y por tanto se combinaron los datos para su análisis estadístico.

El número de raíces adventicias en los explantos de hipocótilo de S. lycopersicum en el

medio sin hormonas fue de 2,6 ± 2,2. No observándose diferencias estadísticamente

Resultados 31

significativas cuando comparamos el número de raíces adventicias en los explantos de

hipocótilo de S. lycopersicum y las demás líneas estudiadas en el medio sin hormonas (Figura

15B). Solo las líneas IL11‐4, IL3‐2 e IL5‐4 mostraron diferencias estadísticamente

significativas entre tratamientos.

Figura 15. Regeneración en medio suplementado con hormonas. (A) Incremento en el área del callo en medio de cultivo con y sin citoquininas. (B-C) Número de raíces adventicias en explantos de hipocótilo (B) o de cotiledón. CH: medio con hormonas.

A

B

Explantos de hipocótilo

Explantos de hipocótilo

** *

2,5 µm 6-BAP

0,1 µM ANA

*

*

*

*

*

*

Área del callo

Número de raíces adventicias

Discusión 32

5. DISCUSIÓN

Los estudios genéticos sobre la formación y el desarrollo de las raíces en Arabidopsis thaliana

han dado cuenta de la simplicidad del proceso a nivel celular que presenta esta planta modelo (Dolan

et al., 1993), habiéndose identificado en estos estudios genéticos distintos loci o genes que

intervienen en la regulación de los diferentes parámetros que intervienen en la formación y

desarrollo del sistema radicular, como pueden ser la longitud, el número de raíces laterales o el

patrón a nivel celular (Benfey and Scheres, 2000; Mähönen et al., 2000; Schiefelbein et al., 2009). A pesar

del mayor conocimiento de estos procesos en Arabidopsis, existen factores que difieren con respecto a

otras especies, por ello es necesario estudiar estos procesos desarrollo del sistema radicular en otros

sistemas vegetales. Una de las líneas seguidas en el laboratorio del Prof. José Manuel Pérez Pérez es el

estudio de la formación y desarrollo de raíces adventicias en distintas especies vegetales, entre ellas

el tomate, habiéndose establecido un protocolo previo para este propósito (Alaguero., 2016).

En este Trabajo de Fin de Grado se pretende aportar información sobre los procesos genéticos

relacionados con la formación y el desarrollo del sistema radicular en tomate utilizando para ello una

colección de 11 líneas de introgresión de tomate derivadas del cruzamiento de S. lycopersicum y S.

pennellii. Se han llevado a cabo tres ensayos diferentes. En el primero de ellos se ha realizado un

análisis fenotípico de la morfología de la raíz principal, las raíces laterales y las raíces adventicias en la

colección de líneas estudiadas. A continuación se visualizó mediante microscopia confocal la

estructura celular del meristemo en las raíces laterales de algunas de las líneas que mostraron

valores extremos en los parámetros estudiados del sistema radicular. Por último, se estudió la

formación de raíces adventicias o callos en explantos de hipocótilo y cotiledón expuestos a un

estímulo hormonal de auxina o citoquinina, respectivamente.

En el trabajo de Ron et al. (2013) se llevó a cabo un estudio detallado de la morfología radicular

en S. lycopersicum M82 y S. pennellii. En sus condiciones de cultivo, el S. lycopersicum presentó una

mayor longitud de la raíz principal que S. pennellii, que se correlacionó además con las diferencias

observadas en la estructura celular del meristemo de la raíz principal (Ron et al., 2013). En nuestras

condiciones sin embargo, apenas se observaron diferencias en el crecimiento de la raíz principal o de

las laterales entre S. lycopersicum y S. pennellii, aunque sí que se observó un número

significativamente mayor de raíces adventicias (y de menor longitud) en S. pennellii en respuesta a

herida. A nivel histológico, no hemos apreciado diferencias apreciables en la estructura del

meristemo de las raíces laterales entre S. lycopersicum y S. pennellii, aunque harán falta

experimentos adicionales para confirmar estos resultados.

Discusión 33

Hemos observado fenotipos transgresivos en las líneas de introgresión analizadas para algunos

parámetros relevantes de la arquitectura radicular como son la longitud de la raíz principal (IL3‐2 e

IL7‐5) o de las laterales (IL8‐1) o en la profundidad mínima de aparición del sistema radicular

secundario (IL2‐6 e IL7‐5). Es notable la variación existente en los parámetros analizados del sistema

radicular adventicio, con los extremos representados por las líneas IL3‐2 (pocas raíces adventicias

pero muy largas) e IL11‐4‐1 (muchas raíces adventicias pero cortas). Sería interesante obtener la

descendencia del cruzamiento entre ambas líneas para determinar la eventual interacción genética

entre ambos segmentos cromosómicos. Todos estos resultados se explicarían debido al carácter

cuantitativo de los rasgos analizados y a la combinación de alelos favorables o desfavorables en la

región introgresada del parental S. pennellii con respecto a la variedad comercial M82.

En lo que respecta a algunos de los parámetros analizados, como la dirección de crecimiento de

las raíces, nuestros resultados indican que no existe variación genética suficiente en la población

analizada para identificar los factores genéticos que podrían estar implicados en este rasgo.

En el trabajo de Arikita et al. (2013), se llevó a cabo un estudio con una población de 46 líneas

de introgresión del cruzamiento S. lycopersicum M82 S. pennellii para determinar la variación

genética existente en la formación de raíces y tallos adventicios en explantos cultivados in vitro en

respuesta a la adición de 5 M 6‐BAP o 0,4 M de ANA (Arikita et al., 2013). Hemos utilizado estos

resultados y otros proporcionados por el Dr. Lázaro Eustáquio Pereira Pére para la selección de

nuestras líneas a estudio. De manera similar a lo encontrado en este trabajo, hemos observado que

algunas líneas presentaban una menor formación de callo en respuesta a citoquininas, a expensas de

presentar una mayor respuesta a la formación de auxinas en la formación de raíces adventicias (caso

de la IL12‐2), mientras que en otros casos la elevada respuesta a citoquininas se contrarrestó por la

respuesta limitada a las auxinas (como en la IL2‐6). Estos resultados están en consonancia con la

interacción de auxinas y citoquininas para la formación de órganos durante el cultivo in vitro de

plantas (Pacifici et al., 2015)

Conclusiones y proyección futura 34

6. CONCLUSIONES Y PROYECCIÓN FUTURA

Se ha establecido un protocolo estandarizado para el análisis morfológico de la arquitectura

radicular en tomate y se ha evaluado éste en una población de 11 líneas de introgresión y sus

parentales, S. lycopersicum y S. pennellii.

Se han encontrado diferencias estadísticamente significativas entre S. lycopersicum y S.

pennelli. Para longitud de raíz principal, longitud de raíces laterales y raíces adventicias y

número de raíces adventicias, entre otros parámetros.

Se han encontrado diferencias estadísticamente significativas entre alguna de las líneas de

introgresión y el parental recurrente S. lycopersicum para la longitud y ángulo, entre otros

parámetros, tanto en la raíz principal, como en las raíces laterales y adventicias.

Los resultados obtenidos indican que la mayoría de los caracteres estudiados están

determinados por múltiples loci distribuidos de manera diferencial en los genomas de los

parentales.

No se han observado diferencias apreciables en la estructura tisular del meristemo apical

radicular en las líneas que presentaron valores extremos entre sí y con sus parentales.

Algunas de las líneas analizadas presentan una mayor capacidad de formación de raíces

adventicias en respuesta al tratamiento con la auxina ácido 1‐naftalenacético.

Algunas de las líneas analizadas presentan una mayor capacidad de formación de callos en

respuesta al tratamiento con la citoquinina 6‐benzilaminopurina.

En este trabajo se han sentado las bases para la caracterización de la arquitectura radicular en

las líneas de introgresión de tomate y se han identificado algunas regiones genómicas que podrían

contribuir a las diferencias cuantitativas en algunos parámetros de la arquitectura radicular entre los

parentales S. lycopersicum y S. pennellii. En un trabajo futuro del laboratorio del Prof. José Manuel

Pérez Pérez, se pretende llevar a cabo la identificación de algunos de los loci implicados en las

diferencias observadas en el número de raíces laterales y adventicias, mediante el análisis detallado

de las nuevas poblaciones de líneas de introgresión que se han generado recientemente (Ofner et al.,

2016; Fulop et al., 2016).

Bibliografía 35

7. BIBLIOGRAFÍA

Arikita, F.N., Azevedo, M.S., Scotton, D.C., Pinto, M. de S., Figueira, A., Peres, L.E. (2013). Novel natural

genetic variation controlling the competence to form adventitious roots and shoots from the tomato wild

relative Solanum pennellii. Plant Sci. 199‐200:121‐30.

Armengaud, P. (2009). EZ‐Rhizo software: The gateway to root architecture analysis. Plant Signal Behav. 4,

139–141.

Alaguero A. (2016). Estudio funcional de la señalización hormonal en la formación de raíces adventicias en

tomate. Trabajo Fin de Máster.

Bai, Y., & Lindhout, P. (2007). Domestication and Breeding of Tomatoes: What have We Gained and What Can

We Gain in the Future? Annals of Botany 100, 1085–1094.

Beemster, G. T. S., and Baskin, T. I. (1998). Analysis of cell division and elongation underlying the

developmental acceleration of root growth in Arabidopsis thaliana. Plant Physiol. 116, 1515–1526.

Bellini, C., Pacurar, D. I., Perrone, I. (2014). Adventitious roots and lateral roots: similarities and

differences. Annu. Rev. Plant Biol. 65, 639–666.

Benfey, P.N. and Scheres, B. (2000) Root development. Curr Biol. 10, R813 ‐ R815.

Benková, E., and Bielach, A. (2010). Lateral root organogenesis – from cell to organ. Curr. Opin. Plant Biol. 13,

677–683.

Bolger, A., Scossa, F., Bolger, M.E., Lanz, C., Maumus, F. et al. (2014). The genome of the stress‐

tolerant wild tomato species Solanum pennellii. Nat Genet. 46, 1034‐8.

Brunoni, F., Rolli, E., Dramis, L., Incerti, M., Abarca, D., Pizarro, A., Diaz‐Sala, C., Ricci, A. (2014) Adventitious

rooting adjuvant activity of 1,3‐di(benzo[d]oxazol‐5‐yl)urea (5‐BDPU) and 1,3‐di(benzo[d]oxazol‐6‐yl)urea:

new insights and perspectives. Plant Cell Tissue Organ Cult 118, 111–124.

Canady, M. A., Ji, Y., & Chetelat, R. T. (2006). Homologous Recombination in Solanum

lycopersicoides Introgression Lines of Cultivated Tomato. Genetics 174, 1775–1788.

Cao, S., Loladze, A., Yuan, Y., Wu, Y., Zhang, A., Chen, J., Huestis, G., Cao, J., Chaikam, V., Olsen,

M., Prasanna, B. M., San Vicente, F., Zhang, X. (2017). Genome‐Wide Analysis of Tar Spot Complex

Resistance in Maize Using Genotyping‐by‐Sequencing SNPs and Whole‐Genome Prediction. Plant

Genome. 10.

Carletti, G., Carra, A., Allegro, G., Vietto, L., Desiderio, F., Bagnaresi, P., Nervo, G. (2016). QTLs for Woolly

Poplar Aphid (Phloeomyzus passerinii L.) Resistance Detected in an Inter‐Specific Populus

deltoides x P. nigra Mapping Population. PLoS ONE 11, e0152569.

Casimiro, I., Beeckman, T., Graham, N., Bhalerao, R., Zhang, H. M., et al. (2003). Dissecting Arabidopsis lateral

root development. Trends Plant Sci. 8, 165–171.

Coudert, Y., Perin, C., Courtois, B., Khong, N. G., Gantet, P. (2010). Genetic control of root development in rice,

the model cereal. Trends Plant Sci. 15, 219–26.

da Costa, C. T., de Almeida, M. R., Ruedell, C. M., Schwambach, J., Maraschin, F.S., Fett‐Neto, A. G. (2013).

When stress and development go hand in hand: main hormonal controls of adventitious rooting in

cuttings. Front. Plant Sci. 4, 133.

Davis, T. D., and Haissig, B. E. (1994). Biology of Adventitious Root Formation. Basic Life Sci 62, 275‐331.

De Klerk, G. J., Van Der Krieken, W., and De Jong, J. C. (1999). Review – The formation of adventitious roots:

new concepts, new possibilities. In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant 35, 189–199.

De Leon, T. B., Linscombe, S., & Subudhi, P. K. (2017). Identification and validation of QTLs for seedling salinity

tolerance in introgression lines of a salt tolerant rice landrace “Pokkali.” PLoS ONE 12, e0175361.

De Smet, I. (2012). Lateral root initiation: one step at a time. New Phytol. 193, 867–873.

Dolan, L., Janmaat, K., Willemsen, V., Linstead, P., Poethig, S., Roberts, K., Scheres B. (1993). Cellullar

organisation fo the Arabidopsis thaliana root. Development 119, 71‐84.

Bibliografía 36

Eshed, Y., Abu‐Abied, M., Saranga, Y., Zamir, D. (1992). Lycopersicon

esculentum lines containing small overlapping introgressions from L. pennellii. Theor Appl Genet. 83,

1027‐34.

Fernandez‐Moreno, J.P., Levy‐Samoha, D., Malitsky, S., Monforte, A. J., Orzaez, D., Aharoni, A., Granell, A.

(2017). Uncovering quantitative trait loci and candidate genes for tomato fruit cuticular lipid composition

using the Solanum pennellii introgression line population. J Exp Bot. 68, 2703-2716.

Fulop, D., Ranjan, A., Ofner, I., Covington, M. F., Chitwood, D. H., West, D., Sinha, N. R. (2016). A New

Advanced Backcross Tomato Population Enables High Resolution Leaf QTL Mapping and Gene

Identification. G3 (Bethesda) 6, 3169–3184.

Foolad, M. R. (2007). Genome Mapping and Molecular Breeding of Tomato. Int J Plant Genomics, 2007, 64358.

Gerszberg, A., Hnatuszko‐Konka., K., Kowalczyk, T., Kononowicz, A. K. (2015). Tomato (Solanum

lycopersicum L.) in the service of biotechnology. Plant Cell Tiss Organ Cult. 120, 881–902.

Ikeuchi, M., Sugimoto, K., Iwase, A. (2013). Plant Callus: Mechanisms of Induction and Repression. Plant Cell.

25, 3159–3173.

Knapp, S., Bohs, L., Nee, M., & Spooner, D. M. (2004). Solanaceae—A Model for Linking Genomics With

Biodiversity. Comp. Funct. Genomics 5, 285–291.

Laplaze, L., Benkova, E., Casimiro, I., Maes, L., Vanneste, S., et al. (2007). Cytokinins act directly on lateral root

founder cells to inhibit root initiation. Plant Cell 19, 3889–900.

Lavenus, J., Goh, T., Roberts, I., Guyomarc’h, S., Lucas, M., et al. (2013). Lateral root development in

Arabidopsis: fifty shades of auxin. Trends Plant Sci. 18, 450–58.

Li, S. W., Xue, L. G., Xu, S. J., Feng, H. Y., An, L. Z. (2009). Mediators, genes and signaling in adventitious

rooting. Bot. Rev. 75, 230–247.

Lippman, Z. B., Semel, Y., Zamir, D. (2007). An integrated view of quantitative trait variation usin tomato

interspecific introgression lines. Curr Opin Genet Dev. 17, 545‐52

Lockhart, J. (2013). A Quantitative Genetic Basis for Leaf Morphology is Revealed in a Set of Precisely Defined

Tomato Introgression Lines. Plant Cell 25, 2379.

Lupini, A., Araniti, F., Sunseri, F., Abenavoli, M. R. (2014). Coumarin interacts with auxin polar transport to

modify root system architecture in Arabidopsis thaliana. Plant Growth Regul. 74, 23–31.

Mähönen, A. P., Bonke, M., Kauppinen, L., Riikonen, M., Benfey, P. N., Helariutta, Y. (2000). A novel two‐

component hybrid molecule regulates vascular morphogenesis of the Arabidopsis root. Genes Dev. 14,

2938–2943.

Merchuk‐Ovnat, L., Fahima, T., Ephrath, J. E., Krugman, T., Saranga, Y. (2017). Ancestral QTL Alleles from Wild

Emmer Wheat Enhance Root Development under Drought in Modern Wheat. Front Plant Sci. 8, 703.

Miura, K., Ashikari, M., Matsuoka, M. (2011). The role of QTLs in the breeding of high‐yielding rice. Trends

Plant Sci. 16, 319‐26.

Mueller, L. A., Solow, T. H., Taylor, N., Skwarecki, B., Buels, R., et al. (2005a). The SOL Genomics Network. A

Comparative Resource for Solanaceae Biology and Beyond. Plant Physiology, 138, 1310–1317.

Mueller, L. A., Tanksley, S. D., Giovannoni, J. J., van Eck, J., Stack, S., et al. (2005b). The Tomato Sequencing

Project, the First Cornerstone of the International Solanaceae Project (SOL). Comp. Funct. Genomics 6,

153–158.

Naija, S., Elloumi, N., Jbir, N., Ammar, S., and Kevers, C. (2008). Anatomical and biochemical changes during

adventitious rooting of apple rootstocks MM 106 cultured in vitro. C. R. Biol. 331, 518–525.

Nibau, C., Gibbs, D. J., and Coates, J. C. (2008). Branching out in new directions: the control of root

architecture by lateral root formation. New Phytol. 179, 595–614.

Ofner, I., Lashbrooke, J., Pleban, T., Aharoni, A., Zamir D. (2016). Solanum pennellii backcross inbred lines

(BILs) link small genomic bins with tomato traits. Plant J. 87, 151‐60.

Pacifici, E., Polverari, L., Sabatini, S. (2015). Plant hormone cross‐talk: the pivot of root growth. J Exp Bot. 66,

1113‐21.

Pop, T. I., Pamfil, D., Bellini, C. (2011). Auxin control in the formation of adventitious roots. Not. Bot. Horti

Agrobot. Cluj Napoca 39, 307–316.

Bibliografía 37

Price, A.H. (2006) Believe it or not, QTLs are accurate!. Trends Plant Sci. 11, 213‐6.

Ricci, A., Rolli, E., Dramis, L., Diaz‐Sala, C. (2008) N,N‐bis‐(2,3‐Methylenedioxyphenyl)urea and N,N’‐bis‐(3,4‐

methylenedioxyphenyl)urea enhance adventitious rooting in Pinus radiata and affect expression of genes

induced during adventitious rooting in the presence of exogenous auxin. Plant Sci. 175, 356‐363.

Ricci, A., Rolli, E., Brunoni F., Dramis, L., Sacco E., Fattorini L., Ruffoni B., Diaz‐Sala, C., Altamura M.M. (2016)

1,3‐di(benzo[d]oxazol‐5‐yl)urea acts as either adventitious rooting adjuvant or xylogenesis enhancer in

carob and pine microcuttings depending on the presence/absence of exogenous indole‐3‐butyric acid.

Plant Cell Tiss Organ Cult. 126, 411–427.

Riefler, M., Novak, O., Strnad, M., Schmulling, T. (2006). Arabidopsis cytokinin receptor mutants reveal

functions in shoot growth, leaf senescence, seed size, germination, root development, and cytokinin

metabolism. Plant Cell 18, 40–54.

Ron, M., Dorrity, M. W., de Lucas, M., Toal, T., Hernandez, R. I., Little, S. A., Brady, S. M. (2013). Identification

of Novel Loci Regulating Interspecific Variation in Root Morphology and Cellular Development in

Tomato. Plant Physiology 162, 755–768.

Salvi, S., Tuberosa, R. (2005). To clone or not to clone plant QTLs: present and future challenges. Trends Plant

Sci. 10, 297‐304.

Sasaki, K., Fujita, D., Koide, Y., Lumanglas, P.D., Gannaban, R.B., Tagle, A.G., Obara, M., Fukuta,Y, Kobayashi,

N., Ishimaru, T. (2017). Fine mapping of a quantitative trait locus for spikelet number per panicle in a new

plant type rice and evaluation of a near‐isogenic line for grain productivity. J Exp Bot. 68, 2693-2702.

Scheres, B., Wolkenfelt, H., Willemsen, V., Terlouw, M., Lawson, E., et al. (1994). Embryonic origin of the

Arabidopsis primary root and root meristem initials. Development 120, 2475–2487.

Schiefelbein, J., Kwak, S. H., Wieckowski, Y., Barron, C., Bruex, A. (2009). The gene regulatory network for root

epidermal cell‐type pattern formation in Arabidopsis. J Exp Bot. 60, 1515‐21.

Sukumar, P., Maloney, G.S., Muday, G.K. (2013). Localized induction of the ATP‐binding cassette B19 auxin

transporter enhances adventitious root formation in Arabidopsis. Plant Physiol. 162, 1392–405.

Truernit, E., Bauby, H., Dubreucq, B., Grandjean, O., Runions, J., Barthélémy, J., & Palauqui, J.C. (2008). High‐

Resolution Whole‐Mount Imaging of Three‐Dimensional Tissue Organization and Gene Expression Enables

the Study of Phloem Development and Structure in Arabidopsis. The Plant Cell 20, 1494–1503.

van Eeuwijk, F. A., Bink, M. C., Chenu, K., Chapman, S. C. (2010). Detection and use of QTL for complex traits in

multiple environments. Curr Opin Plant Biol. 13, 193‐205.

Van Norman, J. M., Zhang, J., Cazzonelli, C. I., Pogson, B. J., Harrison, P. J., et al. (2014). Periodic root

branching in Arabidopsis requires synthesis of an uncharacterized carotenoid derivative. Proc Natl Acad

Sci USA 111, E1300–E1309.

Verstraeten, I., Schotte, S., & Geelen, D. (2014). Hypocotyl adventitious root organogenesis differs from lateral

root development. Front Plant Sci. 5, 495.

von Behrens, I., Komatsu, M., Zhang, Y., Berendzen K. W., Niu X., et al. (2011). Rootless with

undetectablemeristem1 encodes a monocot‐specific AUX/IAA protein that controls embryonic seminal

and post‐embryonic lateral root initiation in maize. Plant J. 66, 341–53.

Wachsman, G., Sparks, E.E., Benfey, P.N. (2015). Genes and networks regulating root anatomy and

architecture. New Phytol. 208, 26– 38.

Werner, T., Motyka, V., Laucou, V., Smets, R., Van Onckelen, H., Schmulling, T. (2003). Cytokinin‐deficient

transgenic Arabidopsis plants show multiple developmental alterations indicating opposite functions of

cytokinins in the regulation of shoot and root meristem activity. Plant Cell 15, 2532–50.

Xu P., Gao J., Cao Z., Chee PW., Guo Q., Xu Z., Paterson AH., Zhang X., Shen X. (2017). Fine mapping and

candidate gene analysis of qFL‐chr1, a fiber length QTL in cotton. Theor Appl Genet. 130, 1309‐1319.

Yu, F., Zhang, X., Peng, G., Falk, K. C., Strelkov, S. E., Gossen, B. D. (2017). Genotyping‐by‐sequencing reveals

three QTL for clubroot resistance to six pathotypes of Plasmodiophora brassicae in Brassica rapa. Scientific

Reports 7, 4516.

Morphological characterization and assessment of variability in adventitious root formation in diverse tomato genotypes

Alaguero, A.1, Azorín., A.1, Gran, F.J.1, Peres, L.E.2, and Pérez‐Pérez, J.M.1 1Instituto de Bioingeniería, Universidad Miguel Hernández de Elche, Avda. de la Universidad s/n, 03202 Elche, Spain

2Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” (ESALQ), Universidade de São Paulo, 13418‐900 Piracicaba, Brasil

Adventitious roots (ARs) are ectopic roots that arise either naturally or in response to stress from various plant tissues, such as stems and leaves; they may also be induced by mechanical damage or following in vitro tissue culture regeneration.

Tomato is an attractive model to study the genetic basis of adventitious organ formation. To explore the phenotypic space of this trait in tomato, we characterized AR formation in excised hypocotyls in a genotypically diverse set of 10 wild tomato species, 7 commercial cultivars, and 20 tomato mutants affected in known genes involved in light or hormonal signaling. A combination of semi‐automated image capture and quantitative histology methods allowed us to define the cellular dynamics during the early stages of AR initiation. By studying a collection of Solanum pennellii introgression lines (1), we identified several genomic regions that might include genes involved in AR development.

Mendelization of the causal genes will allow us to understand the genetic basis of AR variability within the tomato clade. (1) Arikita et al. (2013) Plant Sci 199‐200: 121 Work funded by MINECO/FEDER (AGL2012‐33610 and BIO2015‐64255‐R)

8. ANEXO

0,0

0,4

0,8

1,2

1,6

Re

lative

AR

le

ng

th

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

1 Instituto de Bioingeniería, Universidad Miguel Hernández, Avda. de la Universidad s/n, 03202 Elche, Spain

2 Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” (ESALQ), Universidade de São Paulo (Piracicaba) Brasil

[email protected]

Aurora Alaguero1, Alfonso Azorin1, F.rancisco Javier Gran1, Lazaro E. P. Peres2, José Manuel Pérez-Pérez1

Morphological characterization and assessment of variability

in adventitious root formation in diverse tomato genotypes

References

1.- Bellini et al. (2014). Annu Rev Plant Biol 65: 639

2.- Arikita et al. (2013). Plant Sci 199-200: 121

3.- Bedinger et al. (2010). Sex Plant Reprod 24: 171

Introduction

Adventitious roots (ARs) are ectopic roots that arise either naturally or in

response to stress from various plant tissues, such as stems and leaves;

they may also be induced by mechanical damage or following in vitro tissue

culture regeneration1.

Results

To explore the phenotypic space of AR morphology in tomato, we

characterized AR formation in excised hypocotyls in a genotypically diverse

set of wild tomato species, commercial cultivars, and previously-described

tomato mutants affected in known genes involved in light or hormonal

signaling. A combination of semi-automated image capture and quantitative

histology methods allowed us to define the cellular dynamics during the

early stages of AR initiation. By studying a collection of Solanum

pennellii introgression lines2, we identified several genomic regions that

might include genes involved in AR development.

Conclusion

We have initiated the genetic dissection of AR formation in tomato. Mendelization of the causal genes

will allow us to understand the genetic basis of the observed variability in AR traits within the tomato

clade.

Figure 1.- Adventitious root (AR)

formation in tomato hypocotyls after

root excision

(A) Hypocotyl base at 5 days after excision

(dae). (B) Transverse section of vascular

bundle at 4 dae showing initiation of an AR

primordium. (C) Phenotyping of AR growth.

(D) Emergence time between consecutive

ARs. (E) Growth speed of ARs. Scale bars:

5 mm (A, C), 100 m (B). 0 hae 90 hae 129 hae 198 hae 240 hae

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

Re

lative

AR

nu

mb

er

a

ab bc

d

f

e

f

cd cd

ef

Growth speed (mm/h)

0,0

0,4

0,8

1,2

Re

lative

AR

le

ng

th

e

d

c abc

ab a

bc

ab b b

c

Figure 2.- AR growth in

wild tomato species and

cultivars

(A) Phylogenetic tree of

allied Solanum species in

the tomato clade as

described in 3. (B) Relative

AR number in 10 wild

tomato species and 6

commercial cultivars at 12

dae. (C) Relative AR length

at 12 dae. Reference

genotypes are depicted in

blue. (D) Hypocotyl base at

5 dae in Craigella (left) and

Micro-Tom (right) cultivars.

Scale bar: 5 mm.

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

Re

lative

AR

nu

mb

er

*

*

**

*

* *

**

Figure 3.- AR growth in a selection of tomato mutants affected in known

pathways

(A) AR number and (B) AR length in 20 previously-described tomato mutants at 12

dae. (C) AR phenotype at 8 dae in some tomato mutants. Scale bar: 5 mm.

0,0

0,4

0,8

1,2b b ab

a ab

ab

ab

bc

a

c

a a

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

*

*

*

0,0

0,4

0,8

1,2

1,6

* *

* *

Figure 4.- AR growth in a

selection of tomato

introgression lines

(A) AR number and (B) AR

length in a selection of

introgression lines (IL) of S.

pennellii into a S.

lycopersicum background.

S. lycopersicum

S. pimpinellifolium

S. galapagense

S. cheesmaniae

S. chmielewskii

S. arcanum

S. neorickii

S. huaylasense

S. chilense

S. peruvianum

S. corneliomulleri

S. penellii

S. habrochaites

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

Re

lative

AR

nu

mb

er

b

e

d

b

a

bc

a

cd

a

bc

d

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

Re

lative

AR

le

ng

th

bc

a

ab b

cd

bc bc

e

d

bc

e

B

C

D

A C

B

A

B

C

D

IL12-2 IL1-3 IL7-5

*

*

Emergence time (h)

E

AR4

3

4

AR2

AR3

AR4

AR1 AR2

AR3

A B

C

a

D

*

CCD7 RNAi Micro-Tom

entire diageotropica

aerial roots rosette

S. pennellii S. lycopersicum IL12-2

(C) AR phenotype at 10 dae in IL12-2 and its

parental genotypes. Scale bar: 5 mm. (D) Ils

selected for further studies; blue, S. pennellii;

orange, S. lycopersicum.

Acknowledgements

Work in the laboratory of J.M.P.-P. (AGL2012-33610 and BIO2015-64255-R) is financed by the Ministry of Economy and Competitiveness

(MINECO) and by FEDER funds of the EC - "A way to build Europe"

AGRADECIMIENTOS

La realización de este Trabajo de Fin de Grado ha sido posible gracias a la financiación

por el Ministerio de Economía y Competitividad en el proyecto “Genómica comparada de la

formación de raíces adventicias en tomate y clavel (BIO2015-64255-R)”.

A José Manuel Pérez, por haberme permitido realizar este trabajo en su laboratorio y

haberme guiado de la mejor manera posible, haciendo que aprenda en cada momento.

A Aurora Alaguero, Sergio Ibañez, María Salud Justamante, Ana Belén Sánchez, Francisco

Javier Gran y José Manuel Pérez, por hacerme sentir tan integrado en el equipo.

A Aurora Alaguero, por haberme enseñado todo durante mis primeros pasos en el

laboratorio y por toda su ayuda durante la realización de este TFG.

A mi padre, a mi madre, a mis hermanos y a esa persona especial, por todo su cariño y apoyo

durante estos años.

FACULTAD DE CIENCIAS EXPERIMENTALES GRADO EN …dspace.umh.es/bitstream/11000/4345/1/TFG...

Documents

Transcript of FACULTAD DE CIENCIAS EXPERIMENTALES GRADO EN …dspace.umh.es/bitstream/11000/4345/1/TFG...