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UNIVERSIDAD NACIONAL DANIEL ALCIDES CARRION FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS
ESCUELA DE FORMACION PROFESIONAL DE AGRONOMIAOXAPAMPA
TEMA “CULTIVO IN VITRO DE RAICES”
CURSO: BIOTECNOLOGIA AGRICOLA
CICLO: X
OXAPAMPA- 2013
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INTRODUCCION
Las raíces sintetizan, acumulan y secretan una gran
variedad de compuestos. Se conoce que la actividadbiosintética de las raíces también se mantiene en cultivos
in vitro.
El cultivo en vitro de las raíces para la producción de
metabolitos secundario ha adquirido gran interés en losúltimos años. Esto se debe al redescubrimiento de las
raíces no solo por sus funciones tradicionales como
soporte mecánico y captación de agua y sales, sino
también como fuente importante de producto químicos
que luego son traslocados al resto de la planta. Desde laantigüedad, los extractos vegetales de raíces fueron
ampliamente usados en medicina popular como colorante,
alimentos, etc.
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CULTIVO IN VITRO DE RAÍCES
El uso de raíces como una fuente deexplante para propagación in vitro es
limitado a un pequeño número de
especies.
La regeneración de yemas en cultivo deraíces ha sido observada, principalmente
en especies que, normalmente, presentan
esa capacidad en condiciones naturales.
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ETAPAS
Fase 0:
Preparación de la planta madre
Para poder establecer el cultivo en
condiciones de asepsia, se deben
obtener explantes con un nivel
nutricional y un grado de desarrollo
adecuado.
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Fase 1:Desinfección del material vegetal Una vez elegida la planta madre, se extraerán
los fragmentos a partir de los cuales se
obtendrán los explantes.
Antes de extraer los explantes se hará una
desinfección de los fragmentos de plantamadre para eliminar los contaminantes
externos.
Los contaminantes más comunes son los
hongos y las bacterias que habitan en formanatural en el ambiente. Una vez desinfectado
el material vegetal, se debe mantener en
condiciones de asepsia.
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Fase 2:
Introducción del material in vitro Luego de la desinfección superficial, la
raíz, se ponen en medio de cultivo estéril.
En un período de una semana o quince
días, comienza el proceso de germinación o
regeneración de nuevos tejidos vegetales,
iniciando el ciclo de cultivo in vitro.
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Fase 3:
Multiplicación de los brotes
Durante esta fase se espera que los explantes que
sobrevivieron la FASE 1 y 2 originen yemas.
La única función de esta etapa es incrementar y
mantener las cepas o material: los centros
meristemáticos se inducen y desarrollan en
yemas y/o brotes.
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Fase 4:
Elección de un medio de enraizamiento de losexplantos
Para enraizar los explantes se utilizanprincipalmente plantines individuales de un tamaño
aproximado de 2 centímetros. Los brotes o yemas
obtenidos durante la fase de multiplicación se
transfieren a un medio.
Algunas especies de plantas no necesitan pasar por
esta etapa y emiten sus raíces en el mismo medio de
cultivo donde desarrollan yemas nuevas,
por lo tanto el proceso de
multiplicación y enraizamiento
transcurren en forma simultánea.
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Fase 5:
Aclimatación de los explantos enraizados
Los explantes recién enraizados son muy sensibles a
los cambios ambientales, de manera que el éxito o el
fracaso de todo el proceso de pende de la aclimatación.
Los plantines enraizados, deben ser aclimatados a las
condiciones de humedad del invernadero disminuyendo
progresivamente la humedad relativa e incrementando
progresivamente la intensidad de luz. Estos plantinesse plantarán en contenedores (almacigueras) cubiertos
por un plástico, para mantener la humedad relativa
elevada.
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Condiciones ambientales en los cuartos
de cultivo.
Temperatura 18 – 28 ºC, (23 ºC), temperatura
nocturna 1 ó 2 ºC menor.
Luz – Fotoperiodo: oscuridad primeros días en
cultivo de meristemos 14 a 16 h.
Espectro de luz = luz blanca fluorescente.
Humedad relativa: No de fácil control
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La planta Jacob ina spic ig era
Metodología. Se separaron las raíces de plantas
adultas de J.spicigera y se lavaron con agua y
detergente por 1 día; se desinfectaron con hipoclorito
de sodio al 20%-Tween 20 al 0.1 %, etanol al 70% y 10
ml/L de Plant Preservative Mixture (PPM). Las raícesse cultivaron en medio MS conteniendo 1, 2 o 3 mg/L
de ácido indolacético (AIA), ácido indolbutírico (AIB),
ácido naftalenacético (ANA) o ácido 2,4
diclorofenoxiacético (2,4-D). Se probaron medios con el
doble de la concentración de vitaminas, mayorcontenido de sacarosa (40 g/L) o KNO3 (2.5 g/L).
Adicionalmente las raíces se cultivaron en medio
WPM (Woody Plant Media) adicionado con 2 mg/L de
las auxinas antes mencionadas.
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Cultivo de raíz de zanahoria
Nobecourt en 1937: obtuvo cultivo de callos a partir de
la raíz de la zanahoria ( Daucus carota) en un medio de
cultivo con auxinas.
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Procedimiento
Semillas obtenidas de árboles que crecen en laFacultad de Cs. Agrarias (UNNE) fuerondesinfectadas en etanol al 70% (durante 2 min.) + 2gotas de Tween (durante 15 min.) y finalmente,fueron lavadas con agua destilada estéril. Las
semillas fueron asépticamente puestas a germinar enfrascos de vidrio. Las raíces de plantas de 15 díasfueron desinfectadas en etanol 70% (20 segundos) yenjuagadas 4 veces con agua destilada estéril.
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La raíces secundarias (2 cm. de longitud) fueron
cultivadas en tubos de vidrio de 11 cc., conteniendo 3
ml del medio MS (Murashige & Skoog, 1962) diluido 4
veces (3% sacarosa) y suplementado con diferentesconcentraciones y combinaciones entre benciladenina
(BAP), hemisulfato de adenina (SA), cinetina (CIN) y
thidiazuron (TDZ). El pH de los medios fue ajustado a
5,8, antes del agregado de 0,7 % de agar. Los cultivos fueron incubados en oscuridad o luz a 27
± 2oC, con un fotoperiodo de 14 h.
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CULTIVO DE RAÍCES TRANSFORMADAS
Los cultivos in vitro de raíces aplicados al estudio
y producción de metabolitos secundarios se
comenzaron a utilizar hace 40 años; estos
sistemas generalmente obtenidos a través de unbalance hormonal en el medio de cultivo, además
las raíces presentan un crecimiento lento. Este
inconveniente pudo ser solucionado por medio del
cultivo de raíces transformadas, obtenidas a
través de la infección con cepas patogénicas de Agrobacterium rhizogenes (raíces en cabelleras).
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ESTABLECIMIENTO DE CULTIVOS DE RAÍCES TRANSFORMADAS
Se inocularon plántulas que tenían entre dos y
tres semanas de edad con cultivos de 48h de A.
rhizogenes. Estas plántulas fueron mantenidas
en medio MSRT. Aproximadamente entre latercera y cuarta semana de realizada la infección,
aparecieron ápices radicales en los sitios de
inoculación. Estos ápices radicales fueron
transferidos a medio MSRT líquido en presenciade 1g/l de ampicilina con el fin de eliminar las
bacterias.
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CONCLUSIONES
El cultivo in vitro de raíces es una técnica que se
realiza en pocos cultivos ya que es lenta su
regeneración.
Las etapas que se sigue en el cultivo de raíces es
la misma para cualquier explante.
En cuanto al medio de cultivo los reguladores decrecimiento son según el objetivo de la
investigación.
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