Estudio a nivel de moléculas individuales de la actividad ...

-Tesis Doctoral-

Estudio a nivel de moléculas individuales de la

actividad de replicación del ADN de la

polimerasa del bacteriófago Phi29

José Alberto Morin Lantero

Julio de 2013

Universidad Autónoma de Madrid

Facultad de Ciencias

Departamento de Física de la Materia Condensada

Memoria presentada para obtar al grado de Doctor en Biofísica

José Alberto Morin Lantero

Junio, 2013

Universidad Autónoma de Madrid

Facultad de Ciencias

Departamento de Física de la Materia Condensada

Directores de tesis:

Dr. Borja Ibarra

IMDEA Nanociencia

Dr. José L. Carrascosa

CNB - CSIC

3

Abstract

The accurate replication of DNA is essential to keep genetic integrity. Replicative DNA polymerases

are the enzymes responsible for DNA synthesis; they work as molecular motors that translocates

along DNA through a series of conformational changes fuelled by dNTP binding and hydrolysis. This

process requires overcoming the energetic barrier associated with the base pair melting of its double

helix and a �ne tuned coordination between the processes of DNA unwinding and replication. One

intriguing question that remains poorly understood is the exact mechanism of the coupling of these

two reactions. Moreover, little is known about the mechanochemistry of translocation: How thermal

and chemical energies are converted to movement? Or more speci�cally, which step of the dNTP

binding and incorporation cycle lead to translocation? In the bacteriophage Phi29 the processes of

replication and unwinding are tightly coupled within the same protein: the Phi29 DNA polymerase.

This polymerase also presents the basic architecture of the polymerase domain, common to all known

polymerases, and the basic features of Family B DNA polymerases.

In this thesis we use optical tweezers to characterize, at a single molecule level, the basis for the

tight coupling between replication and unwinding and the mechanochemistry of translocation in

the Phi29 DNA polymerase. We found, after including the pause kinetic in a model to quantify

the unwinding mechanism, that the wild type and an unwinding de�cient polymerase variant both

destabilize the fork with the same active mechanism: the polymerase destabilize at least two base

pairs in the junction with an energy per base pair of 4Gd = 2 kBT .

We also found that this polymerase presents a robust mechanism, capable of processing DNA at

high opposing forces. For all conditions tested (opposing and aiding forces (−50 to 20 pN)) the

velocity without pauses follows a Michaelis-Menten relation (for dNTP concentrations of 5, 10, 50,

100, 200, 500 µM). The force dependence of the Michaelis-Menten parameters (Vmax and Km)

indicates that the force dependent step in the polymerization cycle is related to the binding step,

suggesting a Brownian ratchet type of mechanism.

5

Índice general

Abstract 5

1. Introducción 5

1.1. La Replicación del ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

1.1.1. El ciclo de Polimerización . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

1.2. Mecanoquímica de la translocación. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

1.3. Estudios a nivel de moléculas indviduales. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

1.3.1. Técnicas experimentales de molécula individual . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

1.3.2. Aplicaciones al estudio de la replicación del ADN . . . . . . . . . . . . . . . . 19

1.4. La polimerasa de ADN de Phi29 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

2. Objetivos 29

3. Materiales y Métodos 31

3.1. El instrumento de pinzas ópticas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

3.1.1. Diseño de la celda de �uidos y sistema de �uidos. . . . . . . . . . . . . . . . . 33

3.2. Diseño de las moléculas de ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

3.2.1. Estudio del acoplamiento de las actividades de extensión del primer y despla-

zamiento de banda . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

3.2.2. Estudio del mecanismo de translocación. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

3.2.3. Preparación de las asas con digoxigeninas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

3.3. Protocolo experimental . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

3.3.1. Protocolo para unir las moléculas de ADN entre las microesferas. . . . . . . . 38

3.3.2. Tampones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

3.3.3. Obtención de las microesferas recubiertas con antidigoxigenina. . . . . . . . . 39

3.4. Polimerasa de ADN de Phi29 salvaje, mutante D12AD66A y biotinilada. . . . . . . . 39

i

3.5. Dependencia del tiempo de residencia con la secuencia de la horquilla. . . . . . . . . 40

4. Resultados 41

4.1. Acoplamiento entre polimerización y desplazamiento de banda. . . . . . . . . . . . . 41

4.1.1. Diseño experimental . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

4.1.2. Caracterización de la horquilla . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

4.1.3. Detección de Actividad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

4.1.4. Efecto de la estabilidad de la horquilla en la velocidad de replicación . . . . . 47

4.1.5. Cinética de Pausas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

4.1.6. Cuanti�cación del mecanismo de apertura de la doble hebra. . . . . . . . . . . 58


4.2.1. Diseño experimental . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66

4.2.2. Detección de Actividad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67

4.2.3. Efecto de la fuerza y la concentración de nucleótidos en la actividad de repli-

cación. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71

5. Discusión 77

5.1. Acoplamiento entre polimerización y desplazamiento de banda. . . . . . . . . . . . . 77


6. Conclusiones 85

Agradecimientos 87

7. Anexos 89

7.1. Ensayo bioquímico de actividad de polimerización, exonucleólisis y desplazamiento de

banda de la polimerasa de Phi29 etiquetada con biotina en el extremo amino-termial. 90

7.1.1. Ensayo acoplado de polimerización/exonucleólisis (pol/exo). . . . . . . . . . . 90

7.1.2. Ensayo de desplazamiento de banda acoplado a la replicación del ADN M13. . 91

7.2. Determinación de las energías de enlace entre pares de bases AT y GC. . . . . . . . . 91

7.3. Modelo de Betterton y Julicher . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95

7.4. Artículos publicados durante el periodo de tesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97

Bibliografía 99

Nomenclatura 109

ii

Índice de �guras

1.1. Proteínas que componen la horquilla de replicación. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

1.2. El ciclo de polimerización . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

1.3. Transición de la con�guración abierta a cerrada en el dominio dedos de la polimerasa Klentaq1. . . 10

1.4. Diagrama de energía libre de una reacción afectada por una fuerza inhibitoria. . . . . . . . . . . 12

1.5. Elasticidad del ADN de cadena doble y sencilla . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

1.6. Ejemplo de aplicaciones de las técnicas de manipulación de moléculas individuales al estudio de

polimerasas de ADN, ARN y helicasas a nivel de moléculas individuales. . . . . . . . . . . . . . 21

1.7. Estructura del complejo binario de la polimerasa de Phi29 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

3.1. Construcción de la celda de �uidos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

3.2. Representación esquemática (no a escala) de la horquilla construida para el estudio de la replicación

acoplada al desplazamiento de banda . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

3.3. Representación esquemática del diseño y componentes de las moléculas de ADN utilizadas para

formar el complejo ADNp-ADN. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

4.1. Diseño experimental. Acoplamiento entre polimerización y desplazamiento de banda . . . . . . . . 42

4.2. Detección de las actividades de desplazamiento de banda y extensión del primer. . . . . . . . . . 43

4.3. Determinación de la curva de fuerza-extensión del ssDNA para el estudio de la replicación acoplada

al desplazamiento de banda. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

4.4. Dependencia con la tensión de las velocidades medias para la polimerasa salvaje y el mutante ddb. . 48

4.5. Dependencia del tiempo de residencia con la secuencia para la polimerasa salvaje y el mutante ddb. 49

4.6. Procedimiento de detección de pausas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

4.7. Procesividad de las polimerasas salvaje y mutante ddb. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

4.8. Dependencia de la duración de pausas con la concentración de polimerasa para las polimerasas salvaje

y mutante ddb. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

1

4.9. Comportamiento de la frecuencia de pausas para la polimerasa salvaje. Estudio del acoplamiento

entre las actividades de desplazamiento de banda y replicación . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55

4.10. Comportamiento de la frecuencia de pausas para el mutante ddb. Estudio del acoplamiento entre las

actividades de desplazamiento de banda y replicación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56

4.11. Duración de pausas para las polimerasas salvaje y mutante ddb. . . . . . . . . . . . . . . . . . 57

4.12. Representación esquemática y notación del modelo utilizado para describir el avance de la polimerasa

en las condiciones de desplazamiento de banda. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

4.13. Predicción de la velocidad media de desplazamiento de banda con valores alternativos de ∆Gd y M . 64

4.14. Diseño experimental. Estudio del mecanismo de translocación. Con�guración fuerza a favor. . . . . 68

4.15. Diseño experimental. Estudio del mecanismo de translocación. Con�guración fuerza en contra. . . . 69

4.16. Actividad de replicación de la polimerasa inmovilizada. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70

4.17. Determinación de la curva de fuerza-extensión del ssDNA. Mecanismo de translocación. . . . . . . 70

4.18. Procedimiento de detección de pausas. Mecanismo de translocación . . . . . . . . . . . . . . . 72

4.19. Frecuencia y duración de pausas. Mecanismo de translocación . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73

4.20. Dependencia de la velocidad de replicación con la fuerza a diferentes concentraciones de dNTP en

los modods de extensión del primer y desplazamiento de banda. . . . . . . . . . . . . . . . . . 74

4.21. Dependencia de la velocidad sin pausas con la concentración de nucleótidos . . . . . . . . . . . . 75

4.22. Dependencia de de Km, Vmax y Kb con la fuerza. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76

5.1. Mecanismo de apertura del ADN propuesto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79

5.2. Efecto de la fuerza en la estabilidad del complejo binario/terciario . . . . . . . . . . . . . . . . 82

7.1. Ensayo acoplado de polimerización/exonucleólisis (pol/exo) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90

7.2. esplazamiento de banda acoplado a la replicación del ADN M13 . . . . . . . . . . . . . . . . . 91

7.3. Determinación de las energías de enlace entre pares de bases AT y GC . . . . . . . . . . . . . . 93

7.4. Alineamiento de las curvas experimentales de apertura mecánica de la doble hebra. . . . . . . . . 95

2

Índice de tablas

4.1. Rates y cambios conformacionales durante las reacciones de extensión del primer (e. p.) y despla-

zamiento de banda (d. b.) determinados a partir de ajustes independientes a la dependencia de la

frecuencia y duración de pausas con la tensión. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60

4.2. Rates de entrada y salida durante las reacciones de polimerización y desplazamiento de banda (poldb)

y solo polimerización (pol) determinados a partir de la distribución de frecuencia de duración de pausas. 61

4.3. Rates de entrada a pausa por unidad de tiempo sin pausa, (a f = 0), y cambios conformacionales

durante las reacciones de polimerización y desplazamiento de banda (poldb) y solo polimrización (pol)

determinados a partir de la dependencia de tensión de la longitud y la frecuencia de pausas. . . . . 63

3

1 Introducción

1.1. La Replicación del ADN

La molécula de ADN contiene toda la información genética necesaria para la vida. Antes de cada

evento de división celular, se deben hacer nuevas copias de cada una de las muchas moléculas que

forman la célula, incluyendo la duplicación de todas las moléculas de ADN. La replicación es el

proceso de duplicación de la información genética (los genes), que permite que esta información pase

de cada célula a las dos células hijas producto de la división celular y por tanto de un organismo a

su descendencia (Alberts (2003)).

La estructura del ADN, una doble hélice formada por cadenas complementarias antiparalelas (Wat-

son (1953)), tiene consecuencias notables en el proceso de replicación. El hecho de que cada nucleótido

en una de las cadenas esté apareado con un nucleótido complementario de la cadena opuesta, signi�ca

que cualquier parte de la secuencia podría actuar como una plantilla para la parte correspondiente

de la cadena complementaria. Esta estructura ofrece además, la estabilidad física necesaria, en las

condiciones del interior celular, a una molécula cuya función principal es la de contener la informa-

ción genética. Al mismo tiempo, cualquier mecanismo de lectura, ya sea durante la replicación o la

transcripción de genes, requiere el acceso dinámico a la secuencia de bases escondidas en el interior

de la doble hélice. Por esta razón, el proceso de apertura de las dos cadenas no puede ser espontá-

neo, sino que requiere de proteínas especializadas capaces de vencer el conjunto de interacciones que

mantienen unidas las dos cadenas.

La replicación en el interior celular es llevada a cabo por un complejo de proteínas llamado �repliso-

ma�, que se ensambla para formar una estructura en forma de �Y� llamada horquilla de replicación

(Cairns (1963)) y de la cual la polimerasa replicativa de ADN, la enzima responsable de copiar el

ADN, es su componente fundamental, Figura 1.1.

Esta proteína utiliza la energía proveniente de la unión e hidrólisis de los nucleótidos trifosfato (dATP,

dTTP, dGTP, dCTP) para desplazarse, en la dirección 3' a 5' de la cadena molde, incorporando

5

Capítulo 1 Introducción

AbrazaderaMdeslizante

Helicasa

PolimerasaMenMlaMcadenaMlíder

PrimasaPrimosoma

Topoisomerasa

ParentalMDNAMhelix

ProteínaMdeMuniónMaMcadenaMsencilla

FragmentoMdeMOkazakiM

MoldeMlíder

CargadorMdeMabrazadera

CebadorMdeMARN

MoldeMretrasado

Figura 1.1: Reproducido de Alberts (2003). Proteínas que componen la horquilla de replicación. La maquinaria

de replicación en organismos tan variados como virus, bacterias y eucariotas posee un conjunto de proteínas que

realizan funciones similares. Cada sistema consiste en una molécula de polimerasa de ADN en la hebra líder y

una en la retrasada, una primasa, proteínas de unión a cadena sencilla que revisten al ADN molde y lo mantienen

abierto y con las bases expuestas, una helicasa que junto a la topoisomerasa promueven la apertura la doble hélice y

proteínas accesorias adicionales que mantienen las polimerasas unidas entre si y al molde de ADN . Adicionalmente,

se necesitan un conjunto de proteínas (no se muestran) que promueven la formación de la horquilla en el origen de

replicación, una enzima ARNasaH para eliminar los primers de ARN de los fragmentos de Okazaki y una ligasa de

ADN para sellar los fragmentos de Okazaki adyacentes entre sí para formar una cadena de ADN continua.

secuencialmente el nucleótido seleccionado, de acuerdo a su emparejamiento con el complementario

(T, A, C o G, respectivamente), al extremo 3' de la cadena naciente. La direccionalidad química

de la cadena sencilla de ADN y el hecho de que las dos cadenas que forman la doble hebra sean

antiparalelas implica que sólo una de las cadenas hija pueda ser sintetizada de manera continua, por

una polimerasa que se mueve a lo largo de la cadena líder, mientras otra copia de la polimerasa es

necesaria para la síntesis de la cadena retrasada, a través de la síntesis una serie de fragmentos cortos

de ADN llamados fragmentos de Okazaki (Okazaki et al. (1968)). Además del molde, las polimerasas

de ADN necesitan un extremo de una cadena de ADN o ARN preexistente (un cebador, en inglés

primer) al cual unir el nucleótido incorporado. Por esta razón la polimerasa de la cadena retrasada

necesita la acción de una enzima llamada primasa que produce una molécula corta de ARN que

actúa como primer de cada fragmento de Okazaki.

La �delidad del proceso de replicación es crucial para mantener la estabilidad genética. En general,

este proceso se lleva a cabo cometiendo un error por cada 109 - 1010 bases replicadas. Esta alta

6

1.1 La Replicación del ADN

precisión se logra mediante la combinación de diferentes mecanismos que funcionan al unísono: i) La

selectividad del nucleótido correcto durante la síntesis procesiva, ii) la capacidad de corrección de

errores que tienen muchas polimerasas y iii) mecanismos de eliminación de errores una vez el error

ha sido incorporado.

Ante el evento de incorporación de un nucleótido incorrecto, muchas polimerasas poseen una activi-

dad de corrección exonucleasa asociada que hidroliza los nucleótidos de la cadena primer apareados

de forma incorrecta, mejorando la �delidad en más de 100 veces (Kunkel (2004)). En el caso en que

un error se sella y queda incorporado en el genoma, existen mecanismos de reparación que eliminan

la/s base/s erróneas. La mayor contribución a la �delidad en el proceso de replicación la aporta la

actividad de la polimerasa de ADN.

La helicasa replicativa de ADN es la enzima encargada de abrir la doble hebra. Esta proteína se

mueve a lo largo de una de las cadenas forzando a la doble hélice a abrirse por delante de la horquilla

de replicación de manera que la juntura (frontera entre la región de cadena doble y de cadena sencilla)

de la horquilla se desplaza en la dirección de replicación de la cadena líder al tiempo que las bases

del ADN queden expuestas para ser copiadas por la polimerasa. Estas proteínas poseen actividad

ATP-asa, lo que les permite convertir la energía química proveniente de la hidrólisis dATP en trabajo

mecánico capaz de generar movimiento unidireccional y aportar energía al proceso de separación de

las cadenas de la doble hebra(Lohman and Bjornson (1996)).

La maquinaria replicativa se alinea de manera especí�ca de modo que cada paso sucesivo está

�namente regulado por el anterior dando lugar a un proceso extremadamente complejo, pero a su

vez rápido e increíblemente preciso. La caracterización de un sistema biológico como la replicación del

ADN, requiere responder preguntas fundamentales sobre la mecánica, dinámica y mecanoquímica

del proceso: ¾Cómo modulan las propiedades físicas del ADN la organización y actividad de la

maquinaria replicativa?, ¾Cómo están acopladas las reacciones de apertura y replicación del ADN?

¾Cuál es el mecanismo físico que utilizan las polimerasas y helicasas replicativas para replicar y

desestabilizar la juntura al mismo tiempo?

Por otra parte, poco se sabe acerca de la dinámica y mecanoquímica de translocación de las polime-

rasas replicativas: ¾Cómo convierten estas proteínas las energías térmica y química en movimiento

a lo largo del ADN? ¾Qué paso del proceso de unión e incorporación de dNTP conlleva a la translo-

cación? O de manera más general, ¾Presenta la polimerasa un mecanismo de `Brownian ratchet' en

el cual la unión de dNTP solo es capaz de capturar y estabilizar el estado translocado o presenta un

mecanismo de `power stroke' en el cual la hidrólisis de dNTP, o la liberación del producto, induce

7


un cambio conformacional en la proteína que �empuja� la enzima hacia delante (Steitz (2006))?

1.1.1. El ciclo de Polimerización

Todas las polimerasas de ADN de una sola unidad, de las cuales se conoce su estructura, a pesar de

provenir de organismos que cubren toda la gama de seres vivos (Archaea, Bacteria, Eukaria y virus)

y de presentar una gran disparidad en su secuencia, presentan un dominio de polimerización con

una arquitectura básica y una relación espacial similar, que asemeja la forma de una mano derecha

formada por subdominios identi�cados como palma, pulgar y dedos (Rothwell and Waksman (2005)).

Los subdominios pulgar y dedos forman una hendidura en forma de �U� debajo de la cual se encuentra

el subdominio catalítico palma. El subdominio pulgar estabiliza el dúplex primer-molde, producto de

la síntesis, mientras que el subdominio dedos contiene residuos básicos que unen la región trifosfáto

del nucleótido entrante y el pirofosfato, producto de la reacción de transferencia fosforil.

Un mecanismo cinético estándar, basado principalmente en estudios de pre-steady state kinetics of

nucleotide turnover, (Johnson (1993)), también se ha propuesto para todas las polimerasas conocidas

y se inicia una vez la enzima se ha unido al extremo terminal del primer (p/t) para formar el

complejo enzima-p/t (E:p/t) (paso 1), Figura 1.2. La unión de la proteína al sitio p/t redunda en

cambios conformacionales en la proteína fundamentalmente localizados en el dominio pulgar y cuyo

resultado global es el de formar un cilindro que rodea completamente al ADN. Las interacciones

que se establecen entre la proteína y la porción corriente arriba del ADN, además de mantener el

extremo 3' del primer alineado con el sitio activo de polimerización, permiten que la proteína se

mantenga unida al ADN durante el proceso de polimerización procesiva.

El siguiente paso del ciclo de incorporación es la unión del nucleótido (dNTP) al complejo E:p/t (paso

2). Estudios estructurales sugieren que las polimerasas de la familia A (polimerasas de reparación

en bacterias, la mayoría de las polimerasas replicativas en bacteriófagos, y la polimerasa de ARN de

T7) unen el nucleótido entrante a un sitio de pre-inserción localizado cerca del dominio dedos antes

de acompañarlo al sitio de inserción, estando la base de cada nucleótido apuntando hacia la zona de

unión a ADN. Por otra parte, debido a que las polimerasas de la familia B (replicación del genoma

en virus y eucariota) presentan una discriminación mucho mayor entre el nucleótido correcto y el

incorrecto, se ha propuesto que estas polimerasas unen el nucleótido directamente en el sitio activo.

En todo momento el subdominio dedos �uctúa entre una conformación abierta y cerrada, estando la

conformación abierta favorecida en ausencia del nucleótido entrante o del producto pirofosfato (Dahl

8

1.1 La Replicación del ADN

3'

5'

-10

+15'

sitio)de)inserciónMolde

Primer5'

3'-10

+15'

dNTP)entrante5'

3'-10

+15'

Pol)+)p/t)DNA))))(binario)))

3'

5'

-10+1

5'

3'

5'

Translocación)?

Pol+p/t+dNTPpre-inserción)

-10

+15'

Pol+p/t+dNTPpost-inserción

(ternario)

Liberación)depirofosfáto

Pol+p+1/t)pre-traslocación)))))))))))))

Moldecorriente)abajo

Pol+p+1/tpost-traslocación)

(binario)

Figura 1.2: El ciclo de polimerización. Reproducido de Berman et al. (2007). La polimerasa (círculo gris) se

une a un molde con un extremo 3' (azul y rojo) para formar el complejo binario E:p/t , seguido de lo cual el

nucleótido entrante (verde) se une al sitio de inserción (naranja) para formar el complejo ternario (E:p/t:dNTP).

La incorporación del dNTP al la hebra primer, catalizada por la polimerasa, resulta en la extensión del primer un

nucleótido más una molécula de pirofosfato unida cerca del sitio activo. La liberación de pirofosfato es necesaria

para que el nucleótido recién incorporado se mueva desde el sitio de inserción al sitio de priming.

et al. (2012); Rothwell et al. (2005)). Adicionalmente, en la con�guración abierta de los dedos, un

impedimento estérico se inserta en el sitio activo de polimerización y se posiciona encima del primer

par de bases del dúplex, Figura 1.3a, bloqueando el acceso directo del nucleótido entrante a la base

molde. En la conformación cerrada los dedos se mueven hacia adentro y se posicionan mucho más

cerca del sitio activo de polimerización, lo que facilita que los grupos fosfato del nucleótido entrante

actúen como un intermediario electrostático1 entre residuos básicos en la punta de los dedos y los

iones metálicos catalíticos quelados por los residuos conservados del subdominio palma, estabilizando

de esta forma la conformación cerrada (Rothwell and Waksman (2005)), Figura 1.3b. Durante esta

transición, el impedimento estérico es liberado del sitio activo, lo que permite a la primera base de la

cadena sencilla (la base molde) posicionarse en frente del nucleótido entrante en una con�guración

espacial similar a la que tendría si formara parte de la doble hebra. Una de las características más

llamativas de esta conformación es que contiene, universalmente, una interfase plana con la cual

veri�car la disposición de planos paralelos inherente al apareamiento de Watson y Crick (Steitz

1Corsslink

9


(2006)).

(a)

Tyr 671

Base MoldeMoldeMolde

(b)

Figura 1.3: Transición de la con�guración abierta a cerrada en el dominio dedos de la polimerasa Klentaq1. En la

con�guración abierta de los dedos 1.3a, la Tirosina 671 se inserta en el sitio activo de polimerización bloqueando

el acceso directo del nucleótido entrante a la base molde (violeta). En la conformación cerrada 1.3b los dedos se

mueven hacia adentro y se posicionan mucho más cerca del sitio activo de polimerización, lo que facilita que los

grupos fosfato del nucleótido entrante (gris) actúen como un intermediario electrostático entre residuos básicos en

la punta de los dedos y los iones metálicos catalíticos quelados por los residuos conservados del subdominio palma

(naranja). Durante esta transición, el impedimento estérico es liberado del sitio activo.

Como se ha mencionado, la �delidad en la replicación de la información genética es un requerimiento

esencial del ciclo de polimerización. La idea inicial, propuesta por Watson y Crick y basada en

la estructura del ADN, fue que la selección estaba determinada por el apareamiento basado en

los enlaces de hidrógeno de las bases A-T y G-C. Sin embargo, la diferencia de energía, debida

exclusivamente a los enlaces de hidrógeno, entre la formación de un par de bases A-T y uno G-C

podría explicar a lo sumo una frecuencia de error de 10−2, (Loeb and Kunkel (1982)), en clara

contradicción con la frecuencia observada (∼ 10−3 - 10−6). La estructura del sitio de unión en la

conformación cerrada de los dedos provee una lectura estérica mucho más estricta y se piensa que

juega el papel fundamental en la discriminación entre el nucleótido correcto y el incorrecto.

Una vez en la con�guración cerrada de los dedos, ocurre una transición estructural, presumiblemente

el paso limitante de la reacción, en la cual todos los componentes del sitio activo son ensamblados y

organizados en una con�guración topológica y geométrica que le permite a la enzima llevar a cabo el

paso de la reacción química: una reacción de transferencia fosforil que implica el ataque nucleofílico

del grupo 3'-OH del extremo terminal del primer al fosfato alpha del dNTP entrante (paso 4).

10

1.2 Mecanoquímica de la translocación.

El sitio activo de polimerización se de�ne por un conjunto de grupos carboxilato y otros residuos

polares conservados en la hendidura de la base de la polimerasa. En particular, los grupos carboxilato

sirven para anclar dos iones metálicos divalentes (generalmente Magnesio) uno de los cuales promueve

la deprotonación del grupo 3' OH del extremo del primer, mientras que el otro estabiliza la carga

negativa que surge debido a la salida del oxigeno y se une a los fosfatos β y γ, facilitando la salida

del grupo PPi, promovida por un segundo cambio conformacional en el dominio dedos (paso 5). La

necesidad de tener un grupo 3'- OH para catalizar la inserción de un nuevo nucleótido explica el por

qué las polimerasas de ADN necesitan un primer, o lo que es lo mismo, no pueden iniciar la síntesis

de novo. Una vez que ocurre la reacción, el nucleótido recién incorporado se mueve desde el sitio

de inserción al sitio priming, liberando el sitio de inserción para que un nuevo nucleótido pueda ser

incorporado (síntesis procesiva).

Como resultado global del ciclo, la polimerasa ha incorporado un nuevo nucleótido y se ha desplaza-

do (translocado) sobre la cadena molde una base corriente abajo. En otras palabras, las polimerasas

de ADN transforman la energía química, proveniente de la unión y/o hidrólisis del nucleótido incor-

porado o la liberación del producto PPi en el trabajo mecánico asociado al desplazamiento sobre la

cadena sencilla molde. En cierto sentido la fuerza desarrollada por la polimerasa puede ser consi-

derada como un producto de la reacción química de polimerización. Por tanto, una fuerza externa

que se opone al movimiento puede actuar como un inhibidor de la reacción y una que asista puede

promover la reacción y actuar como un activador. Como resultado, la velocidad del motor frecuen-

temente depende de la fuerza externa y de la concentración de substrato de una manera dictada

por el mecanismo de operación. Por esta razón, la fuerza desarrollada por, o aplicada sobre el motor

resulta una variable natural para la descripción de estas proteínas en cuanto a su carácter mecánico,

así como las concentraciones de substrato y producto lo son en cuanto a sus propiedades catalíticas.

1.2. Mecanoquímica de la translocación.

Papel de la fuerza en la termodinámica y cinética de la reacción. De manera general la aplicación

de una fuerza externa sobre un sistema molecular tiene dos efectos inmediatos: i) Primeramente

introduce una dirección privilegiada que se convierte en la coordenada de reacción natural a lo largo

de la cual la reacción va a proceder, por lo que el diagrama de energía de la reacción puede ser descrito

como función de la posición a lo largo de esta coordenada, Figura 1.4. y ii) si el trabajo asociado se

realiza de manera reversible, a temperatura y presión constante, todo el trabajo entregado al sistema

11


va a ser empleado en alterar la energía libre de la reacción, ∆G0 (Tinoco and Bustamante (2002);

Bustamante et al. (2004)).

Gx

A

B

∆G‡

∆x‡A

∆xAB

f ∆x AB

f ∆x‡A

∆G0

Figura 1.4: Diagrama de energía libre hipotético de una

reacción afectada por una fuerza inhibitoria. La �gura

muestra un diagrama de energía hipotético (línea sólida

roja) que conecta los estados A (inicial) y B (�nal) con

la coordenada mecánica, x , correspondiente al desplaza-

miento a lo largo de la dirección de translocación. En

este ejemplo, una fuerza inhibitoria f , inclina el per�l de

energía una cantidad igual al trabajo realizado en con-

tra de la fuerza aplicada, produciendo un cambio (línea

discontinua azul) en el per�l original. El estado de tran-

sición de la reacción se incrementa la cantidad f ·∆x‡A,donde ∆x‡A es la distancia al estado de transición locali-

zado entre A y B. La fuerza también afecta la termodiná-

mica del equilibrio entre los estados, elevando la energía

relativa del estado B la cantidad f ·∆xAB , donde ∆xAB

es la distancia de equilibrio entre A y B .

La Figura 1.4 muestra un diagrama de energía

libre, a lo largo de la coordenada establecida por

la aplicación de una fuerza externa, de una reac-

ción en la cual la especie A se convierte en la

especie B. Los estados A y B son observables

del sistema con mínimos en las posiciones xA y

xB, que en el caso de los motores moleculares

que translocan sobre el ADN de cadena sencilla

se corresponden a posiciones de bases contiguas.

En este ejemplo, la aplicación de una fuerza (f)

inhibidora cambia el per�l de energía libre ori-

ginal de la reacción (línea sólida roja) de modo

que la constante de equilibrio se ve afectada de

la forma:

K (f) = K (0) · exp

[−f ·∆xAB

kBT

](1.1)

donde K (0) es la constante de equilibrio de la

reacción en ausencia de fuerza externa y está to-

talmente de�nida por el cociente entre las pro-

babilidades de ocupación de los estados B y A,

que a su vez viene determinado por la diferencia de energía estándar entre estos estados (∆G0).

∆xAB = xB − xA es el cambio conformacional asociado a la transición A → B; kB es la constante

de Boltzmann y T es la temperatura absoluta.

Además de afectar la diferencia de energía estándar ∆G0 entre los estados A y B, si una fuerza

externa se opone a la reacción en un determinado sentido, por ejemplo en el sentido A → B,

entonces la energía libre del estado de transición ∆G‡ relativa a ese estado aumenta la cantidad

f · ∆x‡A, siendo ∆x‡A = x‡ − xA la distancia al estado de transición desde el estado A. Por el

contrario, la diferencia de energía entre el estado B y el estado de transición disminuye una cantidad

f ·∆x‡B con ∆x‡B = xB − x‡. En consecuencia, los rates de transición a través de la barrera también

12


se ven afectados por la fuerza, según (para la transición A→ B):

kA→B (f) = kA→B (0) · exp

[−f ·∆x‡AkBT

](1.2)

donde kA→B (0) es el rate de transición del estado A al B en ausencia de fuerza. Una expresión

similar se aplica a la transición B → A.

Por lo tanto, la aplicación de una fuerza externa hace posible modular el equilibrio de una reacción

en la cual ocurre un cambio conformacional, así como afectar los rates independientes en uno u

otro sentido de la reacción. Adicionalmente, permite conocer las distancias características entre los

estados así como la distancia al estado de transición.

Efecto combinado de la fuerza y la concentración de substrato. Como se ha mencionado, la

característica fundamental que de�ne a una proteína como un motor molecular es que utiliza alguna

fuente de energía química para realizar trabajo mecánico. La manera en que se insertan los cambios

conformacionales en el ciclo catalítico de la enzima, o más directamente, la identidad de los pasos

de este ciclo asociados a la generación de fuerza, de�nen la mecanoquímica del motor. Para la

descripción apropiada del ciclo mecanoquímico característico de estos sistemas se deben tener en

cuenta pasos catalíticos que conecten los distintos estados químicos y pasos mecánicos que conecten

los diferentes estados conformacionales. Un camino de reacción debe incluir al menos un paso de

unión del sustrato, un paso de reacción química (hidrólisis), un paso de liberación de productos y

un paso mecánico, asociado a un cambio conformacional (que puede coincidir o no con alguno de los

pasos químicos) (Keller and Bustamante (2000); Bustamante et al. (2004)).

Asumiendo un ciclo mecanoquímico irreversible (como es el caso en el límite cuando la concentración

de productos de la reacción tiende a cero), la velocidad a la que la enzima completa un ciclo, kt, (en

inglés turnover rate) viene dada por la ecuación de Michaelis-Menten:

kt =kcat · [S]

KM + [S](1.3)

donde [S] es la concentración de sustrato, kcat es la velocidad catalítica máxima en unidades de

moles · sec−1 y KM la constante de Michaelis-Menten. En los experimentos en los que se aplica una

fuerza externa, ya sea opuesta o a favor de la dirección de movimiento del motor, la determinación

de la velocidad del motor, dada por v = δ ·kt2, donde δ es el tamaño del paso, en función de la fuerza2En esta de�nición se ha asumido, por simplicidad, que cada evento de catálisis produce un evento de movimiento

13


informa sobre el paso del ciclo mecanoquímico implicado en la generación de fuerza (sólo el paso

que conlleva a un cambio conformacional genera una señal observable). Sin embargo, dado que sólo

se puede ver el efecto una vez completado el ciclo, esta curva no nos informa sobre la localización

de este paso (acoplamiento entre la reacción química y el paso mecánico), por lo que es necesario

conocer el comportamiento de esta magnitud a diferentes concentraciones de substrato y producto.

A concentraciones saturantes de substrato ([S] � KM ), la velocidad máxima, v ∼ Vmax = δ · kcat,

es independiente de substrato por lo que va a depender, en general, de todos los rates de transición

excepto aquellos asociados al paso de unión a substrato. A bajas concentraciones ([S] < KM ), la

velocidad está limitada por la unión de substrato, v ∼ δ · kcatKM·[S], donde kcat/KM es una constante de

unión (binding) efectiva, por lo que va a depender de todos los rates que conectan reversiblemente los

estados de la enzima conectados con el estado de unión a substrato y del rate de entrada al primer

estado irreversible posterior a la unión. En consecuencia, la localización del paso dependiente en

fuerza dentro del ciclo mecanoquímico, o lo que es lo mismo, la identidad de los rates de transición

que dependen de fuerza, dicta como va a ser la dependencia en fuerza de las magnitudes Vmax y kcatKM

.

La presencia de un paso ireversible introduce una separación muy clara entre los estados anteriores,

relacionados con la unión a substrato y los posteriores, completamente separados de estos. Tres

casos se pueden dar, en dependencia de donde se localiza el paso dependiente de fuerza (paso de

movimiento) con respecto al paso irreversible del ciclo.

El paso dependiente de fuerza coincide con el paso de unión a substrato. En este caso, una

fuerza que se opone al movimiento del motor actúa como un inhibidor competitivo para el substrato,

desplazando el equilibrio hacia el estado de la enzima libre y reduciendo por tanto la constante

de unión efectiva (kcat/KM ). Sin embargo, la adición de mas substrato contrarresta este efecto,

desplazando el equilibrio de vuelta al estado enzima-substrato. Como resultado, la velocidad a una

concentración in�nita de substrato (Vmax) no se ve afectada por la fuerza mientras que KM aumenta

con la fuerza, ya que cada vez hace falta más substrato para compensar el efecto de la fuerza.

El paso dependiente de fuerza está después del primer paso irreversible y precede al próximo

evento de unión. En este caso, una fuerza opuesta al movimiento del motor afecta el equilibrio

entre estados que no están conectados a la unión de substrato, como un inhibidor no competitivo.

Como resultado, cuando la unión de sustrato es limitante ([S] < KM ), la velocidad (v ∼ δ · kcatKM· [S])

(acoplamiento uno a uno)

14

1.3 Estudios a nivel de moléculas indviduales.

no depende de la fuerza3. En el otro extremo ([S] � KM ), la velocidad (v = Vmax) disminuye con

la fuerza, dado que el paso dependiente de fuerza (translocación) no está asociado a la unión de

substrato, por lo que el efecto de la fuerza permanece aun en condiciones de saturación. En este

caso, KM y Vmax deben tener la misma dependencia en fuerza, para garantizar la independencia de

fuerza de kcat/KM .

El paso dependiente de fuerza coincide con el primer paso irreversible. Este es un caso in-

termedio entre los dos anteriores, en el que una fuerza opuesta actúa como un inhibidor mixto (no

competitivo). Debido a que el paso irreversible está conectado de manera indirecta tanto a los pasos

relacionados con la unión a substrato, como a los posteriores a ésta (corriente abajo del paso irrever-

sible), tanto la constante de unión efectiva kcat/KM como la velocidad a concentraciones saturantes,

Vmax, van a estar afectadas por la fuerza. En este casoKM puede aumentar o disminuir como función

de la fuerza dependiendo de cómo la fuerza afecte relativamente a Vmax y a kcat/KM .

A pesar de la gran cantidad de estudios estructurales y cinéticos disponibles sobre polimerasas

replicativas, existe debate acerca de cuál de los pasos del ciclo de polimerización conduce a la

translocación []. Dos modelos, el power stroke y el browninan ratchet, han sido propuestos para

explicar el acoplamiento de la energía química y térmica a la translocación. En el contexto del ciclo

de polimerización, un mecanismo de power stroke implicaría que la energía para la translocación

se obtiene de la disociación del producto pirofosfato y es empleada para generar el movimiento

de translocación o lo que es lo mismo, que el paso dependiente de fuerza se corresponde con un

paso posterior a la hidrólisis del nucleótido (paso irreversible). Por otra parte en un mecanismo de

brownian ratchet la unión del nucleótido entrante serviría para �jar la posición translocada en un

sistema que está oscilando, potenciado por las �uctuaciones térmicas, entre las posiciones post- y

pre-translocadas (Guajardo and Sousa (1997); Dahl et al. (2012)), por lo que el paso dependiente

de fuerza sería anterior a la hidrólisis.

1.3. Estudios a nivel de moléculas indviduales.

El estudio de los motores moleculares vinculados al metabolismo de los ácidos nucléicos se ha abor-

dado desde diversas perspectivas experimentales. Por un lado, existe un gran número de estudios

estructurales que proporcionan información detallada sobre las distintas conformaciones del motor

3y por tanto kcat/KM

15


en cada paso del ciclo mecanoquímico (Steitz (2006); Keller and Brozik (2005)). Sin embargo, aun-

que imprescindibles, estas imágenes son estáticas y no informan sobre los cambios dinámicos que

ocurren entre estados conformacionales del motor. Más aún, en estos estudios sólo es posible observar

uno de los múltiples estados accesibles al sistema, aquel que es más estable en la vencindad de las

condiciones de cristalización, por lo que se escapa la posibilidad de observar intermediarios de vida

corta difíciles de cristalizar.

Por ejemplo, hasta muy recientemente se pensó que los cambios conformacionales observados en el

dominio dedos de las polimerasas de ADN eran responsables de generar el movimiento necesario

para la translocación y que el paso limitante observado en experimentos cinéticos se debía a esta

transición. Posteriormente se ha observado que las conformaciones abierta y cerradas del dominio

dedos se encuentran en un equilibrio rápido (en comparación con el paso limitante) en todo momento,

por lo que este paso no debe ser el limitante.

Por otra parte, ensayos bioquímicos de motilidad y cinética proporcionan una imagen más dinámica

de estos sistemas []. Sin embargo, esta aproximación implica el promediado de señales provenientes

de todas las moléculas presentes en la muestra. Esta aproximación tiene limitaciones debido a tres

aspectos fundamentales: i) Dado que la reacción ocurre de manera estocástica (activada térmica-

mente) una vez comenzada, el alcance de la reacción en el momento de realizar la medición va a

ser diferente, en general, para cada molécula, por lo que la medición va a ser un promediado tem-

poral del estado de avance de la reacción; ii) una vez alcanzado el equilibrio químico, el proceso

de conversión de productos a reaccionantes y viceversa no cesa, sólo se mantiene constante en el

tiempo la proporción de moléculas que están en uno u otro estado. Visualizando el sistema como

un conjunto de reacciones químicas que ocurren en paralelo, en un momento determinado, cierta

proporción de estas reacciones habrán ocurrido en sentido directo (de reaccionantes a productos) y

cierta en sentido inverso. El equilibrio químico es el estado en el cual la proporción de reacciones

que se encuentran en un estado y en otro no cambia y iii) la presencia de molécuals inactivas o

�defectuosas� o de estados inactivos intrínsecos (como por ejemplo las pausas transcripcionales [])

puede llevar a una subdeterminación de las velocidades de catálisis. El resultado de lo anterior es

que al realizar una medición coexisten en la muestra moléculas en diversos estados (en el caso mas

simple, reaccionantes y productos), por lo que la señal pudiera corresponder a estados intermedios

que no se corresponden con ninguno de los estados accesibles al sistema. El efecto inmediato de este

tipo de medición es la observación de trayectorias de reacción suaves, en las cuales no se aprecia el

carácter estocástico intrínseco de las reacciones moleculares.

16


Adicionalmente, como ha sido explicado, la fuerza es una variable muy relevante en el estudio de las

propiedades de sistemas macromoleculares, ya sea porque es un producto de la reacción, como en el

caso de los motores moleculares, o porque la aplicación de una fuerza externa permite la exploración

de estados conformacionales no accesibles de otra manera, como es el caso del estudio del plegamiento

de proteínas o las propiedades mecánicas de ácidos nucléicos. Las técnicas estructurales y bioquímicas

no permiten el acceso a esta variable. Sólo investigando una molécula a la vez es posible ejercer fuerza

y/o medir las fuerzas desarrolladas por estos sistemas. Más aún, el acceso a la dinámica de una sola

molécula permite, en principio, la observación directa de las �uctuaciones inherentes a las reacciones

moleculares, así como a todos los intermediarios cinéticos presentes en la reacción a lo largo de la

coordenada mecánica establecida (sólo limitado por la resolución experimental). Como consecuencia

de lo anterior, también es posible observar estados no representativos de la media, pero que ocurren

de manera sistemática así como seleccionar del conjunto sólo las moléculas activas.

Finalmente, debido al carácter estocástico de las reacciones moleculares, las propiedades del siste-

ma determinadas a nivel de molécula única presentarán grandes �uctuaciones. Por esta razón, es

necesario realizar un gran número de mediciones (sobre diferentes moléculas) para obtener una idea

acerca del comprtamiento medio de la magnitud en cuestión. La diferencia entre el promedio que se

realiza en este caso, y el promedio temporal y poblacional que se realiza en los estudios de muchas

moléculas (bulk) radica en que en el primero se promedia sobre propiedades reales del sistema.

1.3.1. Técnicas experimentales de molécula individual

Existe una gran variedad de técnicas experimentales que permiten el estudio de moléculas a nivel

individual (Greenleaf et al. (2007)). De manera general, todas estas técnicas requieren un método

de seguimiento o identi�cación de la molécula en cuestión. Los métodos en los que solamente se

sigue la posición de la molécula, o en general, se monitorea alguna propiedad del sistema sin in�uir

activamente sobre este, se conocen como métodos de seguimiento pasivo. Por otra parte, las técnicas

que permiten la manipulación de moléculas individuales requieren, además de un modo de localizar

espacialmente las moléculas, una sonda, normalmente de tamaño microscópico, capaz de generar o

detectar fuerzas y desplazamientos en la escala molecular(Neuman and Nagy (2008)).

Las pinzas ópticas Las pinzas ópticas es una de las técnicas de manipulación de moléculas in-

dividuales más versátiles. Esta técnica se puede utilizar como una herramienta cuantitativa capaz

17


de ejercer fuerzas calibradas sobre sistemas moleculares de interés, así como para medir con gran

precisión y sensibilidad las fuerzas y desplazamientos generados por estos sistemas.

Debido a que la luz porta momento lineal y angular, es capaz de ejercer fuerzas y torques en su

interacción con la materia. Las pinzas ópticas explotan esta propiedad fundamental para atrapar

objetos en un pozo de potencial tridimensional (Ashkin (1970); Ashkin et al. (1986)). Las trampas

ópticas involucran el balance de dos fuerzas: las fuerzas de dispersión, las cuales empujan los objetos

a lo largo de la dirección de propagación de la luz y las fuerzas de gradiente, las cuales atraen a

los objetos dieléctricos a lo largo de un gradiente espacial de intensidad de la luz [Ricardo]. En

las implementaciones prácticas de trampas ópticas, un haz láser de longitud de onda en el infrarojo

cercano es fuertemente enfocado por un objetivo de microscopio de alta apertura numérica para crear

el gradiente espacial de intensidad necesario para formar una trampa estable (Neuman and Block

(2004)). En la vecindad de este foco, la trampa óptica se comporta como un resorte lineal, generando

fuerzas sobre el objeto atrapado, en el rango de 0,1 a 100 pN4, proporcionales al desplazamiento de

este con respecto al centro de la trampa. Esta escala de fuerzas, en comparación con otras técnicas de

manipulación basadas en fuerza, (Neuman and Nagy (2008)), es de especial relevancia en el estudio

de los motores asociados al metabolismo del ADN (Mo�tt et al. (2008)).

La magnitud de las fuerzas ópticas es generalmente insu�ciente para atrapar establemente macro-

moléculas biológicas directamente, pero son más que su�ciente para atrapar objetos dieléctricos

microscópicos, tales como microesferas de polyestireno, las cuales pueden ser unidas bioquímica-

mente a las macromoléculas de interés. En la mayoría de los experimentos de molécula individual

utilizando pinzas ópticas, estas microesferas sirven como agarraderas del sistema biológico, permi-

tiendo su manipulación en el interior de una celda de reacción. Ejercer fuerzas calibradas sobre la

molécula de interés, generalmente requiere que esta se una a otro punto de manipulación por el

otro extremo. Típicamente, este segundo punto consiste en la super�cie de la celda de reacción, una

segunda microesfera mantenida mediante succión en la punta de una micropipeta o una miroesfera

mantenida en una segunda trampa óptica ( Bustamante et al. (2000a, 2003); Greenleaf et al. (2007)).

De esta manera, es posible estirar el sistema mediante el movimiento relativo de la trampa óptica

con respecto al segundo punto de unión. Una vez establecida una coordenada mecánica de reacción,

y gracias a los muy sensibles métodos de detección de la posición y la fuerza, es posible seguir en

�tiempo real� la evolución del sistema molecular en determinadas condiciones de reacción.

41 pN = 10−12 Newtons

18


1.3.2. Aplicaciones al estudio de la replicación del ADN

A nivel de moléculas individuales, la actividad de los motores implicados en la replicación se puede

investigar a través de los cambios conformacionales que estos imponen sobre el ADN durante su

actividad, por lo que el conocimiento de las propiedades físicas, y en particular elásticas de este

biopolímero resulta esencial. Las propiedades físicas de la doble hélice de ADN son diferentes a

los de cualquier otro polímero natural o sintético. El apilamiento de las bases y la arquitectura

trenzada le con�eren una rigidez inusual. Más aún, el esqueleto de fosfatos lo convierten en uno de

los polímeros conocidos con mayor densidad de carga lineal.

Propiedades mecánicas del ADN. Aunque las propiedades mecánicas varían con la secuencia local

y la estructura de la hélice, las propiedades físicas más relevantes en el contexto biológico se pueden

describir utilizando un modelo de grano-grueso conocido como worm-like chain (WLC ) Kratky and

Porod (1949), el cual caracteriza al polímero como una línea continua que se dobla suavemente

bajo la in�uencia de las �uctuaciones térmicas aleatorias. En su variante más simple, este modelo

caracteriza la elasticidad del ADN a través de un único parámetro, la longitud de persistencia P , que

de�ne la distancia promedio a la que se pierde la linealidad local del polímero. De acuerdo con este

modelo, es energéticamente más favorable doblar la molécula suavemente, distribuyendo el estrés a

lo largo de distancias grandes que doblarlo localmente en regiones más pequeñas que la longitud de

persistencia (P ∼ 50 nm para el dsDNA y P ∼ 1,5 nm para el ssDNA, en condiciones �siológicas)

(Schellman (1974)). El modelo WLC conecta explícitamente la elasticidad local con la conformación

global de la molécula: un polímero con menor oposición a la �exión (menor longitud de persistencia)

tiende a adoptar una estructura de ovillo más compacta.

Un polímero �exible se enrolla aleatoriamente en solución, dando como resultado una distancia entre

extremos mucho más corta que su longitud de contorno. Estirar la molécula hacia un estado más

extendido es entrópicamente desfavorable, ya que el número de conformaciones disponibles disminuye

a extensiones más largas, siendo el límite una sola conformación posible (una línea recta perfecta)

para la extensión máxima (Bustamante et al. (1994)). La distancia entre extremos de la molécula,

y la fuerza necesaria para estirarla, son las variables con las que comúnmente se describe, a nivel de

moléculas individuales la elasticidad del ADN (Smith et al. (1992, 1996); Wang et al. (1997b)).

Para el ADN de doble cadena, la curva de fuerza extensión muestra un comportamiento no lineal:

por debajo de 6 pN, la fuerza se emplea para vencer el enrollamiento entrópico causado por las

19


Fue

rza

(pN

) 60

40

20

0

80

0 0.5 1 1.5 2Extensión Normlizada

dsDNA

ssDNA

WLCinextensible

Sobreestiramiento

pol

dsDNA = ssDNA

Figura 1.5: Adaptado de Bustamante et al. (2003). Curva de fuerza extensión experimental, por par de bases, del

ADN de cadena doble (línea discontínua azul) y sencilla (línea discontínua verde) con los respectivos ajustes del

modelo WLC (línea sólida roja). La �echa horizontal muestra el cambio en distancia observado, por par de bases,

al mantener la tensión en el ADN constante durante la reacción de polimerización (pol).

�uctuaciones térmicas. Por encima de 6 pN, la molécula se extiende como un resorte lineal hasta

llegar a aprox 65pN, fuerza a la que ocurre una transición de sobre estiramiento. Por el contrario,

el ADN de cadena sencilla es un polímero mucho más �exible, por lo que adopta una con�guración

más compacta a bajas fuerzas, como resultado de lo cual se establecen numerosas interacciones

intramoleculares débiles que conducen a una extensión de extremo a extremo más corta. En el límite

opuesto, donde la fuerza de estiramiento es su�ciente para romper las interacciones intramoleculares,

el ssDNA se extiende considerablemente más que su homólogo de doble cadena, debido a que no

está restringido a adoptar una estructura helicoidal Smith et al. (1996), Figura 1.5.

Efecto de la tensión en el molde sobre la actividad de polimerización Como se ha mencionado

las polimerasa de ADN son motores moleculares que translocan sobre el ADN de cadena sencilla al

tiempo que incorporan el nucleótido complementario al extremo 3' de la cadena naciente. Dicho de

otra manera, estas proteínas convierten secuencialmente una molécula de ADN de cadena sencilla en

ADN de cadena doble, Figura 1.5. Esta propiedad ha sido explotada para observar la actividad de

replicación de polimerasas de ADN individuales, Figura 1.6 (a). En estos experimentos, una molécula

de ADN de cadena sencilla es estirada entre dos super�cies al tiempo que una polimerasa replica

la molécula, mantenida a una tensión constante. La actividad de replicación se puede monitorear

en tiempo real mediante el seguimiento de la extensión (por debajo de 6 pN) o contracción (por

encima de 6 pN) de la molécula anclada entre los dos puntos. Estos estudios mostraron que el

20


paso limitante de la velocidad de replicación, es sensible a la tensión en el ADN y es capaz de

generar fuerzas tan altas como 35 pN . Un resultado sorprendente fue la inducción de actividad de

exonucleólisis procesiva a tensiones por encima de 40 pN Wuite et al. (2000); Maier et al. (2000).

En un estudio relacionado, utilizando la polimerasa de ADN de Phi29 salvaje y dos mutantes,

fue posible proponer dos intermediarios de la reacción de transferencia intramolecular del primer,

uno correspondiente a una conformación funcional sensible a la tensión y uno inactivo que pudiera

funcionar como punto de control para la reacción de corrección de errores Ibarra et al. (2009).

Figura 1.6: Ejemplo de aplicaciones de las técnicas de manipulación de moléculas individuales al estudio de

polimerasas de ADN , ARN y helicasas a nivel de moléculas individuales. (a) Adaptado de Wuite et al. (2000) y

Ibarra et al. (2009). Una molécula de ssDNA con un inicio de replicación es mantenida a tensión constante entre una

microesfera en la trampa óptica y una microesfera en la punta de una micropipeta. La actividad de polimerización

se observa como un cambio en distancia, a tensión constante, en la molécula de ADN . (b) Adaptado de Manosas

et al. (2012b). Mediante la utilización de imanes, es posible ejercer fuerzas sobre una molécula de ADN anclada

entre una super�cie funcionalizada y una micoresfera magnética para observar en tiempo real el acoplamiento entre

las actavidades de desplazamiento de banda (en este estudio con la helicasa de T4) y la actividad de replicación

de la polimerasa de ADN (en este estudio de T4 , T7 y Phi29 ). (c) Adaptado de Thomen et al. (2008). Al unir la

polimerasa de ARN de T7 directamente a una supre�cie funcionalizada y el extremo corriente abajo de la molécula

de ADN a una micoresfera atrapada ópticamente los autores pudieron ejercer tensión mecánica directamente sobre

la enzima a diferentes concentraciones de substrato e iones Magnesio.

Efecto de la tensión en la juntura de la horquilla en la actividad helicasa. Además de estirar

la molécula linealmente, es posible aplicar tensión en cada una de las cadenas que forman una

21


horquilla de ADN, promoviendo la apertura mecánica de la doble hebra Essevaz-Roulet et al. (1997);

Bockelmann et al. (2002). El patrón de apertura mecánica del ADN tiene una forma de diente de

sierra cuyos picos guardan una relación muy estrecha con la secuencia de la horquilla. Este tipo de

experimentos ofrecen información de primera mano sobre el papel que juegan las interacciones entre

pares de bases y entre pares de bases vecinos (apilamiento de las bases) en la estabilidad global de

la molécula Huguet et al. (2010).

La desnaturalización mecánica del ADN tiene especial relevancia en el estudio de la actividad he-

licasa. Las helicasas son motores moleculares que se mueven a lo largo de una de las cadenas del

ADN, promoviendo la separación de la cadena complementaria. En este proceso, la interacción entre

la helicasa y la horquilla tiene carácter local: ocurre en la interface entre la porción de cadena doble

(corriente abajo) y sencilla. A diferencia de los procesos de desnaturalización térmica o por pH,

en los cuales toda la molécula está expuesta al agente desnaturalizante, la aplicación de tensión en

cada una de las cadenas, en la dirección de apertura, interroga especí�camente la estabilidad de la

juntura, por lo que simula de manera simpli�cada la forma en que las helicasas abren el ADN.

Este hecho ha sido explotado para interrogar si las helicasas interactúan con la horquilla de mane-

ra activa: los cambios conformacionales provocados por la hidrólisis del ATP son su�cientes para

translocar y a la vez desestabilizar la horquilla completamente; o pasiva: sólo tienen la capacidad

de translocación y necesitan que los primeros pares de bases de la horquilla se abran espontánea-

mente para avanzar y de esta manera evitar que se cierren Betterton and Julicher (2005). En la

con�guración experimental típica, la horquilla se mantiene a una tensión inferior a la necesaria para

abrirla (aprox 14 pN). Dado que la tensión en esta con�guración asiste la reacción de apertura de

la doble hebra, un mecanismo pasivo se vería favorecido por la aplicación de tensiones crecientes,

mientras uno activo no (cualquiera sea la tensión, una enzima activa sería capaz de abrir la doble

hebra e�cientemente). Los resultados más relevantes muestran que las helicasas utilizan mecanismos

de apertura que van desde prácticamente activo, como es el caso de la helicasa NS3 del virus de la

hepatitis C Cheng et al. (2007), parcialmente activo, como en el caso de la helicasa gp4 del fago T7

Johnson et al. (2007) hasta un mecanismo prácticamente pasivo, como es el caso de la helicasa gp41

del fago T4 Lionnet et al. (2007).

Acoplamiento entre apertura de la doble hebra y replicación. Este diseño experimental (en

este caso con pinzas magnéticas De Vlaminck and Dekker (2012)) ha sido utilizado para elucidar

el acoplamiento entre la actividad de polimerización de las polimerasas de los fagos T4, T7 y del

22


bacteriófago Phi29 y la actividad de desplazamiento de banda de la helicasa gp41 de T4 Manosas

et al. (2012a). Experimentos con las polimerasas aisladas mostraron la síntesis rápida y procesiva

de la cadena líder unido a una capacidad de apertura de la doble hebra de�ciente. Adicionalmente,

se observa una actividad exonucleasa procesiva a bajas fuerzas, que se debe, según los autores, a

que la horquilla corriente abajo de la polimerasa genera una presión de regresión (ver) que inhibe

el movimiento de la polimerasa hacia adelante (en sentido de polimerización). Por el contrario, en

presencia de la helicasa de T4 el sistema acoplado (polimerasa más helicasa) es capaz de sintetizar

el ADN a la velocidad máxima5, excepto en el caso de Phi 29 en el que la velocidad de replicación

se observó muy similar en presencia y en ausencia de la horquilla. Finalmente, los autores proponen

un modelo de colaboración en el cual la helicasa libera la presión de regresión de la horquilla sobre

la polimerasa, permitiéndole adoptar una conformación de polimerización procesiva y a su vez, la

polimerasa desestabiliza las primeras bases de la horquilla y por tanto incrementa la e�ciencia de

apertura de la doble hebra mediada por la helicasaManosas et al. (2012b). Este último aspecto ya

había sido observado para el sistema de T7 Stano et al. (2005).

Mecanoquímica de RNAp de T7 El estudio experimental de la mecanoquímica de motores mo-

leculares requiere acceder a la coordenada mecánica de translocación al tiempo que se varía la

concentración de los cofactores químicos. En los experimentos de molécula individual descritos hasta

ahora, la coordenada mecánica con la que se interroga al sistema polimerasa-ADN (o Helicasa-ADN

o Helicasa-Polimerasa-ADN) es la distancia entre extremos de la molécula de ADN, en una con�gura-

ción geométrica u otra. Por esta razón, los cambios conformacionales detectados experimentalmente

sólo informan del efecto que tiene la actividad de estos motores sobre el ADN y no sobre los grados

de libertad internos de los mismos. Por el contrario, la aplicación de una fuerza directamente sobre

el motor, hace posible acceder a la coordenada mecánica de translocación.

Para lograr esto, la estrategia más utilizada consiste en unir la proteína en complejo con el ADN

directamente, o a través de una molécula espaciadora, a la super�cie pasiva y unir el otro extremo

del ADN a la microesfera localizada en la trampa óptica. De esta manera, el movimiento relativo

entre la super�cie pasiva y la trampa óptica, genera una tensión mecánica que es trasmitida a la

proteína a través del ADN.

Estudios de la polimerasa de ARN de T7, estructuralmente similar a las polimerasas de ADN Sousa

et al. (1993), bajo el efecto de una fuerza opuesta al movimiento y variando la concentración de

5Velocidad de extensión del primer en ausencia de la horquilla

23


nucleótidos y magnesio revelaron que la fuerza actúa como un inhibidor competitivo para la unión

de nucleótidos y que los iones de de magnesio están involucrados en un paso que no depende de la

fuerza externa Thomen et al. (2005, 2008). Utilizando la información obtenida en los experimentos

de molécula individual, junto a la información bioquímica, de mutagénesis y estructural disponible

para este sistema Yin et al. (2004), los autores proponen un mecanismo de translocación del tipo

Brownian ratchet, en el cual la polimerasa �uctúa entre los estados pre- y post-translocados y la

hidrólisis de los NTP y la posterior liberación del producto, �ja a la polimerasa irreversiblemente

en el estado post-translocado. Un mecanismo de Power stroke, en el cual la translocación está

promovida directamente por la liberación de producto resulta incompatible con las observaciones

experimentales.

1.4. La polimerasa de ADN de Phi29

En esta tesis hemos escogido a la polimerasa de ADN de Phi29 (Phi29DNAp) como sistema modelo

para el estudio, a nivel de moléculas individuales, de la mecanoquímica de las polimerasas de ADN de

la familia B y del acoplamiento entre las actividades de polimerización y desplazamiento de banda.

Esta elección se basa en cuatro aspectos fundamentales: i) Este sistema está muy bien caracterizado

a nivel bioquímico Blanco and Salas (1996) y ii) estructural Kamtekar et al. (2004); Berman et al.

(2007); iii) es una polimerasa replicativa altamente procesiva, lo cual facilita la observación de

trazas de replicación largas (con muchos pasos del ciclo de polimerización) y iv) posee actividad de

desplazamiento de banda acoplada a replicación en la misma proteína, lo cual resulta ideal para el

estudio del acoplamiento entre estas actividades. Adicionalmente, existen estudios previos, a nivel de

moléculas individuales, del efecto que tiene la tensión en el ADN sobre la actividad de esta proteína

Ibarra et al. (2009).

Phi29 es un bacteriófago de B. subtilis con un genoma lineal de 19.2 kb de dsDNA. En este sistema la

replicación se inicia de manera no sincronizada desde cada extremo del genoma, cuando la polimerasa

de Phi29 se une a una proteína primer unida a cada extremo 5' del genoma (TP del inglés Terminal

Portein) Salas et al. (1978). Después de la adición de 10 nucleótidos, la polimerasa se disocia de la

TP y replica procesivamente el resto del genoma del fago Blanco and Salas (1985); Blanco et al.

(1989); Mendez et al. (1997). Según avanza desde cada origen de replicación, la polimerasa va

generando grandes cantidades de ADN de cadena sencilla (la cadena desplazada) que es protegido

de la degradación por la proteína de unión a cadena sencilla de Phi29 (Phi29 SSB, del inglés Single

24

1.4 La polimerasa de ADN de Phi29

stranded binding protein) hasta que la cadena desplazada se convierte en molde y es replicada por

la polimerasa que avanza desde el origen de replicación opuesto, por lo que en este sistema no existe

el equivalente a síntesis de la cadena retrasada.

La polimerasa de ADN de Phi29 consiste en un dominio de exonucleólisis (exo) N-terminal y un

dominio de polimerización (pol) C-terminal. A pesar de que no contiene el dominio regulatorio N-

terminal observado en otras polimerasas de la famila B cuyas estructuras se conocen Wang et al.

(1997a); Zhao et al. (1999); Hopfner et al. (1999); Rodriguez et al. (2000); Hashimoto et al. (2001),

la estructura y orientación relativa de los dominios exo y pol encajan bien en la arquitectura global

de las polimerasas de ADN de esta familia. El dominio de exo está estructuralmente conservado a

lo largo de las familias A, B y C y comparte un mecanismo común de catálisis mediada por dos

iones metálicos que se unen a la enzima a través de cuatro grupos carboxilatos. Estos grupos han

sido indenti�cados en el dominio exo de la Phi29 ADNp Bernad et al. (1990); Soengas et al. (1992);

Esteban et al. (1994).

Molde

Molde

Nucleótido entrante

Túnel corriente

abajoNucleótido +1(a) (b)

Figura 1.7: Estructura de la polimerasa de Phi29. (a) Representación tipo cinta de la organización de dominios

de la polimerasa de Phi29: dominio de exonucleólisis (rojo), palma (rosa), TPR1 (dorado), dedos (azul), TPR2

(cian) y pulgar (verde). El ADN que se muestra proviene del complejo ternario de RB69 (Franklin et al. (2001)) y

ha sido modelado sobre la estructura de la polimerasa de Phi29 usando como único elemento de alineamiento los

dominios palma de las estructuras de RB69 y Phi29 (Kamtekar et al. (2004)). Las posiciones del primer modelado

(gris claro), el molde (gris oscuro) y el nucleótido entrante (amarillo, representación de esferas sólidas) se indican.

(b): Representación tipo espacio-relleno de la polimerasa cortada a través de un plano que muestra el substrato

primer-molde y el ADN de cadena sencilla 5' en el túnel corriente abajo. El nucleótido +1 se muestra en amarillo,

el nucleótido entrante en magenta, la cadena primer en verde y la cadena molde en azul.

Adicionalmente a los subdominios encontrados en la arquitectura general del dominio de polime-

25


rización de las polimerasas replicativas Joyce and Steitz (1994), la polimerasa de Phi29 posee dos

inserciones de secuencia asociadas con la interacción con la TP llamadas regiones de proteína ter-

minal 1 y 2 (TPR1 y TPR2, del inglés terminal protein region). Estos dominios, que son especí�cos

de polimerasas que inician la replicación mediada por proteínas, Salas et al. (1978), interactúan con

los dominios intermedio y primer de la TP respectivamente Dufour et al. (2000).

Residuos del subdominio palma, pulgar, TPR1 y TPR2 y del dominio exo encierran una apertura

hacia el sitio activo que envuelve el dsDNA corriente arriba. Un giro beta en la punta del dominio

pulgar, que es pequeño en comparación con el de otras polimerasas de la misma familia, contacta la

punta del dominio TPR2 para formar un arco capaz de envolver el ADN y mejorar la procesividad,

de manera análoga a como lo hacen los sliding clamps (Abrazadera, pinza, mordaza) presentes como

proteínas independientes en otros replisomas Kamtekar et al. (2004).

Un segundo túnel formado por residuos del dominio TPR2, exo, palma y dedos rodea la cadena

molde corriente abajo del sitio activo pol. Las pequeñas dimensiones de este túnel, menos de 10Å de

largo y aproximadamente 10Å de diámetro, obliga a las cadenas molde y complementaria a separarse

para que la cadena molde pueda entrar al sitio activo, proporcionado una base estructural para la

actividad de desplazamiento de banda observada en Phi29 Kamtekar et al. (2004). Por otra parte,

una conformación abierta del túnel sería necesaria para ensartar el molde durante la replicación

ssDNA circular []. Adicionalmente, in vivo la última base de la cadena molde se encuentra unida

covalentemente a la proteína terminal y el túnel, en su con�guración cerrada no permite el paso de

la TP al interior de la polimerasa por lo que la disociación de la polimerasa del ADN requiere una

conformación abierta también.

El dominio TPR2 presenta una con�guración espacial que se enfrenta directamente a la juntura de

la horquilla corriente abajo. Esta conformación está estabilizada por los contactos que se establecen

entre el dominio pulgar y TPR2. Por otra parte el sitio activo exo, de�nido por la presencia de

los aminoácidos que unen iones metálicos (Asp12 y Glu14 del motivo Exo I, Asp66 del Exo II,

Asp169 del Exo III y Lys143 del Kx2hxA), está formado por residuos de los dominios exo y por

residuos pertenecientes a la punta del subdominio pulgar. Mutaciones introducidas en los residuos

catalíticos responsables de la actividad de exonucleólisis, además de inactivar esta actividad, afectan

severamente la actividad de desplazamiento de banda Soengas et al. (1992); de Vega et al. (1997).

Sorprendentemente, estas mutaciones no afectan la capacidad de síntesis procesiva en ausencia de

cadena doble. El hecho de que ninguna de las mutaciones introducidas en los residuos vinculados

con la unión de la proteína a ssDNA en el sitio activo exo afecten la capacidad de desplazamiento

26

1.4 La polimerasa de ADN de Phi29

de banda y que los datos cristalográ�cos descarten contactos entre la cadena desplazada y el sitio

activo exo hace suponer que la estabilidad de la interacción exo-pulgar esté fuertemente in�uida por la

unión de iones metálicos en esa región Esteban et al. (1994).Una distorsión sutil en el dominio pulgar

pudiera causar una orientación inapropiada del dominio TPR2 y explicar por tanto la pérdida de la

capacidad de desplazamiento de banda. En esta tesis, hemos escogido el doble mutante D12AD66A

(Soengas et al. (1992)) para estudiar el proceso de acoplamiento entre las actividades de replicación y

desplazamiento de banda en una polimerasa de�ciente en desplazamiento de banda pero que conserva

las propiedades de extensión del primer y compararla con la polimerasa salvaje.

27

2 Objetivos

Los objetivos de esta tesis se centran en dos proyectos diferentes, pero estrechamente relacionados.

1. Estudio del mecanismo de acoplamiento entre las actividades de repli-

cación y apertura del ADN. Utilizando la técnica de pinzas ópticas y la polimerasa

de ADN de Phi29 como modelo, pretendemos estudiar a nivel de moléculas individuales el

mecanismo de acoplamiento entre las actividades de replicación y desplazamiento de banda

de esta proteína y elucidar el mecanismo físico que utiliza esta enzima para desestabilizar la

doble hebra de ADN que encuentra a su paso. Para ello planteamos los siguientes objetivos

especí�cos:

a) Desarrollar un sistema experimental, utilizando pinzas ópticas, que permita detectar, a

nivel de moléculas individuales, las actividades de replicación y desplazamiento de banda

de manera diferenciada.

b) Determinar la dependencia de la velocidad de replicación y sus �uctuaciones (pausas) con

factores que afectan la estabilidad de la juntura de la doble hélice tales como la secuencia

y la fuerza externa aplicada sobre la juntura en la dirección de apertura.

c) Implementar un modelo teórico que explique la dependencia de la velocidad de replica-

ción con los factores que modulan la estabilidad de la juntura y que permita cuanti�car

la capacidad de la polimerasa de desestabilizar la doble hélice durante el proceso de

replicación.

2. Estudio del mecanismo de translocación de las polimerasas replicativas

de ADN. Para abordar el estudio de la dinámica y mecanoquímica del proceso de translo-

cación de la polimerasa de Phi29 sobre la cadena sencilla del ADN planteamos los siguientes

objetivos especí�cos:

a) Desarrollar un sistema experimental que permita inmovilizar la polimerasa de Phi29 en

una super�cie de modo que sea posible aplicar fuerzas externas directamente sobre la

29

Capítulo 2 Objetivos

proteína. Detectar a nivel de moléculas individuales la actividad de polimerización de la

polimerasa de Phi29 unida a la super�cie pasiva del instrumento de pinzas ópticas.

b) Determinar la dependencia de la cinética de replicación con la aplicación de fuerzas ex-

ternas en las direcciones a favor y en contra del movimiento a diferentes concentraciones

de dNTP.

30

3 Materiales y Métodos

3.1. El instrumento de pinzas ópticas.

Los experimentos mostrados en esta tesis se realizaron utilizando un instrumento de pinzas ópticas

de doble haz, diseñado por Smith et al. (2003) y construido en nuestro laboratorio por Hormeño... El

uso de haces contrapropagantes permite generar una trampa óptica estable combinando la utilización

de haces de baja apertura numérica y objetivos de alta apertura numérica a la vez que hace posible

colectar y analizar toda la luz que sale de la trampa en ambas direcciones. Esta última condición

permite aplicar el principio de conservación del momento lineal para determinar la fuerza externa

que actúa sobre una partícula atrapada: la variación del cambio de momento de todos los fotones

que entran y salen de la trampa es igual a la fuerza que actúa sobre la partícula atrapada.

Determinación de la Fuerza Cuando una fuerza externa actúa sobre la partícula, la distribución

angular de intensidad, colectada en detectores fotodiodo sensibles a posición de tipo continuo (DL-10,

United Detector Technology) colocados en los planos principales imagen de los objetivos (nikon..)

varía. A partir de las señales reportadas por los detectores y de constantes conocidas, es posible

calcular las componentes transversales de la fuerza como (Smith et al. (2003)):

Fx =DxRDcΨRL

Fy =DyRDcΨRL

(3.1)

donde Dx y Dy son las señales del detector en las direcciones x e y, proporcionales a la sensibilidad

Ψ del detector y a la suma de las irradiancias locales multiplicadas por sus distancias relativas al

centro del detector xRD

o yRD

siendo RD la mitad de la anchura del detector. RL es un radio efectivo

para la lente igual a su distancia focal y c la velocidad de la luz en el vacío.

La calibración de este sistema es independiente de la potencia del láser, del índice de refracción del

tampón, del tamaño, forma o índice de refracción de la partícula atrapada. Más aun, las pérdidas de

31

Capítulo 3 Materiales y Métodos

luz en las lentes de los objetivos y la óptica asociada se pueden incluir, siempre que sean constantes,

en una sensibilidad efectiva de los detectores.

Medición de distancias La distancia entre una microesfera en la trampa óptica y otra localizada

en la punta de una micropipeta móvil se determinó utilizando dos métodos complementarios para

determinar la posición de cada microesfera por separado.

Por un lado, se utilizó la imagen de video microscopía del plano imagen, coincidente con la posición

en la dirección z de la trampa óptica y con la posición de la microesfera localizada en la pipeta

(enfocada con este propósito), captada en una cámara ccd. Sobre las imágenes capturadas se aplica

un algoritmo que localiza el centro de las esferas y devuelve la posición promedio en píxeles en x e

y. Este método requiere la calibración previa de la cámara ccd para conocer la relación pı́xel/µm.

Por otra parte, para determinar la posición de la microesfera ubicada en la pipeta con mayor re-

solución se utilizó un sistema basado en la refracción de luz (en inglés light-lever). Este dispositivo

está compuesto por una �bra óptica unida a un láser de diodo (LPF-3224-635-FC, Thorlabs), un

detector sensible a la posición (DL-10, United Detector Technology) y una lente (C140TM-B, Nikon,

f = 1,45 mm) insertada en el marco de la cámara de �uidos. Esta lente colima la luz desde la �bra y

dirige el haz de salida sobre el fotodetector. Puesto que la distancia focal de la lente es muy pequeña

en comparación con su distancia al detector (640 mm), un desplazamiento pequeño de la lente (y,

por lo tanto, de la micropipeta �jada en la cámara de �uidos) se traduce en un movimiento ∼ 420

veces mayor de la luz sobre el detector. Finalmente se construye una curva de calibración con las

medidas en µm provenientes de la imagen de video-microscopia y las medidas a mayor resolución

provenientes del foto-detector sensible a la posición del dispositivo ligth-lever.

Para determinar con mayor resolución la posición de la microesfera atrapada ópticamente, se cons-

truyó una curva de calibración con las posiciones obtenidas a partir de la imagen de videomicroscopía

y la lectura del detector destinado al cálculo de la fuerza en la dirección y, Dy. Este método permi-

tió además comprobar, en cada experimento, la validez de la asunción de linealidad entre fuerza y

distancia en la trampa óptica Jahnel et al. (2011).

La mayoría de los experimentos se realizaron en un régimen de retroalimentación de fuerza, con-

sistente en corregir la distancia entre las micreosferas con el �n de mantener la tensión en el ADN

constante. La frecuencia de adquisición de datos está determinada por el límite que impone el ré-

gimen de retroalimentación, 60 Hz. Todos los experimentos se realizaron a temperatura ambiente

(23± 2 ºC)

32

3.1 El instrumento de pinzas ópticas.

3.1.1. Diseño de la celda de �uidos y sistema de �uidos.

Las celdas de micro�uidos utilizadas se construyeron manualmente en nuestro laboratorio y fueron

diseñadas especí�camente para nuestros experimentos.

El montaje se realiza siguiendo los siguientes pasos secuencialmente: Sobre un cubreobjetos (24 mm×

60 mm, Menzel Gläser) con seis agujeros (como muestra la �gura) se coloca una lámina de Nesco�lm

(Karlan) con tres canales grabados, haciendo coincidir el extremo de los canales con los agujeros

del cubreobjetos. Sobre los separadores de los canales se colocan tubos de cristal (dext : 100 µm;

dint : 25 µm, Garner Glass Company) para conectar los canales superior e inferior con el canal central;

una micropipeta y un tubo dispensador externo se colocan siguiendo la disposición geométrica que

muestra la Figura 3.1. Posteriormente se coloca otra lámina de Nesco�lm, idéntica a la anterior y se

sellan los tres canales formados colocando un cubreobjetos sin agujeros. Después de ensamblada, la

celda se coloca sobre una placa térmica a una temperatura de 120 ºC mientras se aplica presión sobre

la misma. Cuando el Nesco�lm se ha fundido de manera homogénea, formando un sello hermético

con el cristal, la celda está lista. La distancia entre las caras internas de la celda es de ∼ 200 µm.

Cubreobjetos

Parafilm

Soporte

Tornillos huecos

Tubos conectores

Succión

Tampón de Reacción

Figura 3.1: Diseño de la celda de �uidos y montaje so-

bre el marco de sujeción. Tanto los agujeros practicados

sobre el cubreobjetos, como los canales en las láminas de

Nesco�lm se realizaron con una grabadora y cortadora

láser (C-200 , Universal Laser Systems).

Las micropipetas se construyeron utilizando un

aparato de tracción de pipetas fabricado a me-

dida (U. Berkeley). Un capilar hueco de cristal

(dext : 80 µm; dint : 40 µm, Garner Glass Com-

pany) se calienta localmente utilizando un �la-

mento de platino incandescente con forma cir-

cular. Al fundirse el cristal, los dos extremos del

capilar se separan debido a un peso sujeto a uno

de los extremos del mismo. Esto da lugar a una

micropipeta cuya abertura disminuye gradual-

mente hasta alcanzar 0, 5 − 1 µm de diámetro

en la punta.

Tanto el extremo posterior de la micropipeta co-

mo el tubo dispensador externo, sobresalen de la

celda de micro�uidos. Se utilizaron tubos de polietileno para conectar la micropipeta a una jeringa

mediante la cual se le hizo succión y el extremo del tubo dispensador externo a una jeringa mediante

la cual se introdujo a la celda el tampón de reacción. Se utilizó un pegamento (características. . . )

33


para sellar la unión entre los tubos de cristal y de polietileno.

La celda se coloca en un marco de sujeción que la �ja y evita su ruptura. A través de agujeros en

el marco y de tornillos agujereados se colocan tubos de polietileno que conectan las tres entradas

de la celda y sus salidas correspondientes a jeringas y botes con los tampones necesarios en cada

experimento. El �ujo se puede controlar manualmente, utilizando el émbolo de las jeringas, o desde

un sistema de �uidos controlado por ordenador.

Todo el conjunto se sitúa sobre una plataforma piezoeléctrica que permite el movimiento tridimen-

sional de la celda, de manera manual a través de tornillos micrométricos, o controlado por ordenador,

a través de elementos piezoeléctricos. Mediante el movimiento en el plano x− y, o plano transversal

a la dirección de propagación de la luz, es posible generar desplazamiento relativo entre la posición

de la trampa óptica (�ja en todo momento) y la micropipeta. El movimiento en el eje z, permite

hacer coincidir el plano de la micropipeta con el de la trampa óptica.

3.2. Diseño de las moléculas de ADN

3.2.1. Estudio del acoplamiento de las actividades de extensión del primer y

desplazamiento de banda

Para estos experimentos, se diseñó una molécula de ADN en forma de horquilla con los siguientes re-

querimientos: i) poseer dos puntos de anclaje diferenciados químicamente; ii) tener un único extremo

3' para ofrecer un punto de inicio de replicación único; iii) contar con una región de doble cadena, en

una con�guración geométrica en la que sea posible ejercer tensión mecánica externa sobre la juntura

en la dirección de apertura; iv) poseer una secuencia con regiones ricas en pares de bases AT y GC

bien diferenciadas; v) ofrecer la posibilidad de seguir la actividad de polimerización acoplada a la de

desplazamiento de banda y en ausencia de esta sobre la misma secuencia.

Como segmento de replicación (azul, Figura 3.2) se utilizó un fragmento de ADN de 515 pb con

cuatro agrupaciones de la secuencia GCC (señalados en rojo, cuadro azul, Figura 3.2) de longitud

creciente (3, 6, 9 y 12) separados por segmentos de 97 pb con bajo contenido en pares GC (∼ 80 %

AT ) hecha a medida (Genscript Corp.). Esta fue digerida con las endonucleasas de restriccion EcoRI

y SalI. El extremo digerido con SalI fue ligado con un oligonucleótido que se auto hibrida formando

un penta-lazo (gris, Figura 3.2). El extremo digerido con EcoRI fue ligado con el extremo digerido

con EcoRI de un segmento enlazador pequeño de dsDNA (naranja, Figura 3.2). El otro extremo

34

3.2 Diseño de las moléculas de ADN

Segmento8de8replicación:85158pb5'atgttcattctaatctattctattgattgaagattttactaattacaaacatctaattttaaacaaatgtttatttgattatgaatgtatcataattcggatgttcattctaatctattctattgattgaagattttactaattacaaacatctaattttaaacaaatgtttatttgattatgaatgtatcataattcggcggatgttcattctaatctattctattgattgaagattttactaattacaaacatctaattttaaacaaatgtttatttgattatgaatgtatcataattcggcggcggatgttcattctaatctattctattgattgaagattttactaattacaaacatctaattttaaacaaatgtttatttgattatgaatgtatcataattcggcggcggcggatgttcattctaatctattctattgattgaagattttactaattacaaacatctaattttaaacaaatgtttatttgattatgaatgtatcataatt3'

Enlace

5'Biotina-ttttcaatcacttcaggtagcatc3' 3’acgtagtcggttagtgaagtccatcgtagttaa5’

5’tcgagcagatgcacgaataacgtgcatctgc3’

Lazo

Sitio8de8unión83'

Dig

2686dsDNA

Figura 3.2: Representación esquemática (no a escala) de la horquilla construida para el estudio de la replicación

acoplada al desplazamiento de banda. En la �gura se muestra el segmento de replicación principal (azul), el lazo

(gris) y la molécula de enlace de dsDNA (naranja) con la biotina en el extremo 5' (rojo) y 5 bases no hibridadas

corriente abajo del extremo 3' (rectángulos naranja) con sus respectivas secuencias. A esta construcción se le une

una molécula espaciadora de dsDNA (negro), marcada con antidigoxigenina (verde) en su extremo 5'.

del fragmento enlazador contiene una región pequeña de hebras no complementarias, estando el

extremo 5' marcado con biotina (círculo rojo, Figura 3.2) mientras que el 3' contiene la secuencia

de reconocimiento generada por la endonucleasa de restricción PstI. La longitud �nal de la horquilla

es de 556 pb. Los productos de la ligación fueron puri�cados siguiendo un procedimiento estándar

(Qiagen PCR Puri�cation Kit) y posteriormente un asa de ADN de cadena doble, de 2686 pb, cortado

con PstI y etiquetado con digoxigenina en el extremo 5' fue ligado al extremo 3', cortado con PstI,

de la región no hibridada del segmento enlazador. El etiquetado con digoxigenina se describe más

abajo (Ibarra et al. (2009)).

El asa de ADN de cadena doble proporciona una separación entre los dos puntos de anclaje de la

molécula (a cada una de las microesferas) y una zona de unión a extremo 3' único para la polimerasa.

Para facilitar la unión funcional de la polimerasa al extremo 3', el sitio de unión presenta 5 nucleótidos

de la cadena sencilla molde no hibridados, en la dirección corriente abajo del primer 3'.

35


3.2.2. Estudio del mecanismo de translocación.

Para el estudio del mecanismo de translocación, se diseñaron dos moléculas de ADN, una para la

con�guración de fuerza a favor y una para la con�guración de fuerza en contra.

Fuerza en contra Al vector de ADN pBacgus11 (Novagen) (8041 pb) se le hizo una escisión (en in-

glés nick) en la posición 564 con NBbvIA (New England Biolabs) y fue digerido en la posición 315 por

la endonucleasa de restricción BstXI (New England Biolabs), dejando un extremo 3' protuberante

de 4 nucleótidos. Esta molécula fue tratada con la Exonucleasa III (New England Biolabs), la cual

tienen muy baja a�nidad por el extremo 3' protuberante de 4 nucleótidos de longitud pero degrada

la cadena que contiene la en la dirección 3' − 5', desde la posición 564 a la 315. La reacción de la

Exonucleasa III se detiene añadiendo EDTA (10 mM) y Proteinasa K (0,1 µg/µl). Posteriormente,

el ADN es digerido con BamHI para obtener �nalmente una molécula de dsDNA de 3400 pb con

un extremo 3' protuberante de 249 nucleótidos. Una agarradera de ADN marcada con digoxigenina

(Ibarra et al. (2009)) fue ligada al extremo cortado con BamHI y un oligonucleótido de 20 bases,

complementario al extremo 3' protuberante (5'−GTGTGTGGGTGAAGTCATGC−3') fue ligado

para actuar como primer para la replicación del ADN .

DirecciónNdeNreplicación

EtiquetaNdeNDigoxigenina

229Nnt

3'3400Npb

DesplazamientoNdeNbanda

2686NpbagarraderaNdsDNA

229Nnt

EtiquetaNdeNDigoxigenina 3'

3400NpbDesplazamientoNdeNbanda

(a)

(b)

Figura 3.3: Representación esquemática del diseño y componentes de las moléculas de ADN utilizadas para

formar el complejo ADNp-ADN y ejercer fuerzas en contra Figura 3.3a y a favor Figura 3.3b de la dirección de

polimerización.

Fuerza a favor A la molécula de 3400 pb, con un extreme protuberante 3' de 249 nt, descrita ante-

riormente, se le unió un oligonucleótido de 24 bases (5'−CTAGGTGTGTGGGTGAAGTCATGC−

36

3.3 Protocolo experimental

3') en el extremo protuberante 3' dejando un saliente 5' de 4 nucleótidos (5' − CTAG) el cual fue

usado para ligar el vector de dsDNA pUC19 (Novagen) digerido previamente con Xbal y etiquetado

con digoxigenina en un extremo (Ibarra et al. (2009)). Esta molécula larga de dsDNA, añadida al

extremo corriente arriba del primer provee separación entre las microesferas (∼ 1 µm) y puede ser

usada como agarradera para aplicar fuerzas sobre el complejo ADN-ADNp a favor del movimiento.

3.2.3. Preparación de las asas con digoxigeninas.

Para construir estas asas se partió del vector pUC19 (2686 pb) y se introdujeron nucleótidos modi-

�cados con digoxigeninas (digoxigenina-11-dUTP, Roche) por PCR. Se usaron como cebadores dos

oligos (5'-CCT CTG ACA CAT GCA GCT CC-3' y 5'-CGC GGC CTT TTT ACG GTT CC-3') y se

preparó una mezcla de dTTP, dATP, dCTP y dGTP (10 mM) y MgCl2 en el tampón de reacción.

Se utilizó la enzyma TaqPol Platinum® (Invitrogen) en las condiciones de PCR apropiadas y un

volumen �nal de reacción de 100 µl. Las asas de ADN con digoxigeninas se puri�caron utilizando el

kit de puri�cación de fragmentos de PCR QIAquick de QIAGEN, siguiendo el protocolo estándar

descrito en el kit. Posteriormente, las asas se digirieron con BamHI y se volvieron a puri�car con

el mencionado kit. La puri�cación �nal de las asas se realizó por extracción de la banda de un gel

de agarosa con bajo punto de fusión, utilizando el kit QIAquick Gel Extraction. Según sus instruc-

ciones, se procedió inicialmente a fundir el bloque de agarosa que contenía la banda de interés por

incubación a 50 ºC. Una vez completada la fusión, se añadió rápidamente 1 volumen de isopropanol

(considerando el volumen del fragmento del gel según 100mg ≈ 100µl). Posteriormente, la muestra

se añadió a una columna y se procesó según las instrucciones hasta la elución �nal de las asas con

digoxigeninas puri�cadas.

3.3. Protocolo experimental

Para manipular moléculas individuales de ADN, se utilizaron dos tipos micreosferas con un recubri-

miento químico diferente: unas recubiertas con estreptavidina (Spherotech) y otras de antidigoxige-

nina (ver abajo). En todos los casos, las construcciones de ADN (Sección 3.2) poseen un extremo

marcado con digoxigenina y otro marcado con biotina (en el caso del estudio de la translocación este

papel lo desempeña la propia polimerasa). El extremo etiquetado con biotina se une expecí�camente

a su molécula complementaria (estreptavidina) en la super�cie de la microesfera correspondiente,

a través de un enlace fuerte no covalente. Por otra parte, la digoxigenina en el otro extremo de

37


la molécula reconoce especí�camente su anticuerpo, anti-dig, en la super�cie de la otra microes-

fera. El marcaje diferenciado de los extremos de la construcción de ADN y del recubrimiento de

las microesferas permite evitar enlaces dobles entre los dos extremos de una molécula y la misma

microesfera.

3.3.1. Protocolo para unir las moléculas de ADN entre las microesferas.

Las microesferas recubiertas de estreptavidina se �uyeron al interior de la celda de �uidos del instru-

mento de pinzas ópticas sin ninguna modi�cación, disueltas en el tampón principal. Una de estas,

es capturada en la trampa óptica y colocada (mediante el dezplasamiento relativo de la celda de

�uidos con la trampa óptica) en la punta de la micropipeta, donde se mantiene gracias a la succión

de aire. Posteriormente, se �uyen las microesferas recubiertas de moléculas de ADN a través de un

conducto distinto y una de estas es capturada. Moviendo la cámara con respecto a la trampa, las

dos microesferas se aproximan hasta que se logra una conexión entre la biotina en un extremo de la

construcción y la microesfera en la micropipeta. El protocolo para unir las moléculas de ADN a las

microesferas recubiertas de antidigoxigenina varía según el caso, pero en todos fue optimizado hasta

conseguir aproximadamente una molécula de ADN por microesfera:

Estudio de la replicación acoplada al desplazamiento de banda. En este caso, la relación óptima

se consiguió mezclando ∼ 3 µl de microesferas recubiertas con anti-digoxigenina, ∼ 3 µl de la

horquilla de replicación (∼ 3 ng/µl) y ∼ 3 µl del tampón principal. La mezcla fue incubada durante

∼ 5 minutos a temperatura ambiente (23± 2 ºC) y disuelta en∼ 300 µl del tampón principal.

Estudio del mecanismo de translocación En este caso se siguieron dos pasos de incubación secuen-

ciales. Primeramente se formaron los complejos ADN -polimerasa mezclando 3 µl de la construcción

de ADN (∼ 3µg/µl) con 1 µl de la polimerasa biotinilada (x ng/ul). Esta mezcla se incubó durante

∼ 5 minutos a temperatura ambiente y se le añadió 3 µl de las micreosferas recubiertas con anti-

digoxigenina. Esta última mezcla fue incubada durante ∼ 5 minutos y posteriormente disuelta en

300 µl del tampón principal.

3.3.2. Tampones

En ambos estudios se utilizó el mismo tampón principal:50 mM Tris-HCL (pH 7, 5 ), 20 nM

Sulfato de Amonio, 7 mM 2-mercaptoetanol, 4 % Glycerol (peso/volúmen), 0, 025 % Tween20 (pe-

38

3.4 Polimerasa de ADN de Phi29 salvaje, mutante D12AD66A y biotinilada.

so/volúmen), 0, 1 µg/ml BSA).

En el caso del estudio dela replicación acoplada al desplazamiento de banda, la polimerasa se in-

trodujo en la celda de reacción a través del dispensador externo, disuelta en el tampón de racción

(al tampón principal se le añade 50 µM dNTP, 10 mM MgCl2). Todos los experimentos se realiza-

ron con una concentración de polimerasa de 20 nM , exepto los mostrados en la Figura 4.8, que se

realizaron con una concentración de 2 , 20 y 200 nM .

En el caso del estudio del mecanismo de translocación, a través del dispensador externo solo se

introdujo el bu�er de reacción: al tampón principal se le añade 10 mM MgCl2 y 5, 10, 50, 100, 200

y 500 µM dNTP según el caso.

3.3.3. Obtención de las microesferas recubiertas con antidigoxigenina.

Las microesferas recubiertas con anti-digoxigenina se obtuvieron a partir de microesferas recubiertas

de proteína G (Spherotech) según el protocolo que se describe a continuación. En primer lugar, el

tampón inicial de las microesferas se sustituyó por una solución de 100 mM fosfato sódico y 100 mM

NaCl. Después, las microesferas se mezclaron con dimetil pimelimidato dihidrocloruro (DMP) y con

anticuerpos de anti-digoxigenina (1 µg/µl), previamente disueltos en tampón fosfato salino (PBS ) a

pH 7. El DMP une covalentemente la antidigoxigenina a la proteína G de las microesferas mediante

la incubación durante 1 h a temperatura ambiente. Transcurrido este tiempo, las microesferas se

precipitaron por centrifugación a 3000 rpm durante 3 min y se resuspendieron en 2 M Tris para

parar la reacción de unión. Tras 2 h las microesferas se centrifugaron de nuevo, se resuspendieron

en PBS y se conservaron a 4 ºC.

3.4. Polimerasa de ADN de Phi29 salvaje, mutante D12AD66A y

biotinilada.

Todas las polimerasa utilizadas fueron suministradas por el grupo de M. Salas en el Centro de

Biología Molecular Severo Ochoa, C. S. I. C. Para los experimentos del estudio del mecanismo de

apertura se utilizaron la polimerasa de Phi29 salvaje y el mutante D12AD66A, cuyo protocolo de

generación y puri�cación ha sido descrito previamente (Lazaro et al. (1995); Soengas et al. (1992)).

39


Biotinilación in vivo de la polimerasa de ADN de Phi29 La biotinilación in vivo del dominio

amino terminal de la polimerasa de Phi29 con una sola biotina fue realizada por José M. Lázaro,

perteneciente al grupo de M. Salas en el Centro de Biología Molecular Severo Ochoa, C. S. I. C.

utilizando un set comercial de biotinilación (Avidity). De manera resumida: El gen que contiene la

secuencia de la polimerasa de Phi29 se insertó en un vector pAN corriente abajo de la secuencia

GLNDIFEAQKIEWHE (secuencia Avitag). La proteína recombinate fue expresada en la sepa de E.

coli K12 (AVB100), que contiene la ligasa BirA, la cual une covalentemente una sola biotina a la

secuencia Avitag. La proteína etiquetada fue puri�cada siguiendo métodos estándar (Lazaro et al.

(1995)).

Para veri�car posibles efectos de la etiqueta de biotina en la actividad de la proteína, se llevaron a

cabo ensayos bioquímicos estándar para examinar las actividades de polimerización, exonucleólisis

y desplazamiento de banda de la polimerasa recombinante. La comparación con la actividad de la

polimerasa salvaje muestra que la biotina en el extremo amino-terminal no afecta signi�cativamente

las actividades principales de la polimerasa de Phi29 (Sección 7.1).

3.5. Dependencia del tiempo de residencia con la secuencia de la

horquilla.

Para determinar el tiempo de residencia promedio en cada posición de la secuencia, se seleccionaron

trazas en un rango de fuerzas de 2−4 pN y se calculó, mediante un ajuste lineal, el tiempo promedio

que pasa la polimerasa en segmentos de 10 bases de longitud a lo largo de la traza. Posteriormen-

te, las trazas de tiempo de residencia fueron alineadas siguiendo el procedimiento descrito en la

Subsección 4.1.2 y se determinó la curva promedio, Figura 4.5.

La velocidad en función de la secuencia se calculó como el inverso del tiempo de residencia multipli-

cado por la longitud del segmento (10 bases). El porcentage de pares de bases GC se determinó de

manera directa a partir de la secuencia de la horquilla en intervalos de igual longitud. La asociación

entre los valores de velocidad y tiempo de residencia con la posición de la secuencia se realizó a

través del alineamiento entre las trazas calculadas (velocidad y tiempo) y el porcentaje de secuencia,

considerando sólo las actividades totales y haciendo coincidir los puntos de inicio y �nal de las trazas

con los de la secuencia.

40

4 Resultados

4.1. Acoplamiento entre polimerización y desplazamiento de

banda.

4.1.1. Diseño experimental

Para abordar el estudio del acoplamiento entre las actividades de desplazamiento de banda (db)

y polimerización (pol) de la polimerasa de ADN de Phi29, se aislaron horquillas de replicación

individuales entre dos microesferas localizadas en el interior de la cámara de reacción del instrumento

de pinzas ópticas Figura 4.1a. Una de las microesferas fue atrapada ópticamente y la otra mantenida

mediante succión mecánica en la punta de una micropipeta móvil. Cada una de las cadenas de la

horquilla fue modi�cada de manera complementaria con el recubrimiento químico de cada una de las

micreoesferas, lográndose la unión especí�ca de cada hebra a una microesfera. De esta manera fue

posible, desplazando la micropipeta con respecto a la trampa óptica, ejercer tensión mecánica sobre

la juntura de la doble hebra en la dirección de apertura. Para determinar el efecto de la secuencia en

la actividad de polimerización, la horquilla fue diseñada con cuatro regiones de 100 pares de bases

rica en pares AT (∼ 80 % AT ) separadas por cuatro regiones con de una a cuatro repeticiones de la

secuencia GCC. La inclusión de una lazo de unión entre las dos hebras al �nal de la horquilla, hizo

posible estudiar el proceso de replicación en presencia y en ausencia del proceso de desplazamiento

de banda, sobre la misma secuencia y en el mismo contexto experimental. Este diseño experimental

nos permitió por tanto estudiar la medida del efecto particular que tiene la tensión mecánica en la

juntura y la secuencia de la horquilla en las reacciones de replicación y desplazamiento de banda de

la polimerasa salvaje de Phi29 y el mutante de�ciente en desplazamiento de banda (ddb) D12AD66A.

El efecto de la estabilidad mecánica de la horquilla en la velocidad de replicación, comparada con

la velocidad de extensión del primer en las polimerasas salvaje y mutante permitió entender y

cuanti�car el mecanismo de apertura del ADN utilizado por esta polimerasa y su acoplamiento con

41

Capítulo 4 Resultados

el proceso de replicación.

(a)T

ensi

ón (pN

)Distancia (μm)

0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6

10

15

20

25

30

5

0

dsDNAfinal

HorquillaAbierta

Δx1(f,t) Δx2(f,t)Espaciador dsADN

Linker

Lazo

(b)

Figura 4.1: Diseño experimental. 4.1a: Representación esquemática del montaje experimental (no a escala). Una

única horquilla de replicación fue unida a microesferas funcionalizadas en el interior de la cámara de reacción del

instrumento de pinzas ópticas. Una de las hebras (azul) se unió, a través de un espaciador de ADN de doble

cadena, a la microesfera localizada en la trampa óptica, mientras que la hebra complementaria (rojo) fue unida

a la microesfera inmovilizada en la punta de una micropipeta móvil. La distancia entre ambas microesferas y la

fuerza que actúa sobre la microesfera atrapada fueron monitoreadas a una frecuencia de 60 Hz. 4.1b: Experimento

representativo que muestra la curva de apertura mecánica (negro) y relajación (rojo) de la horquilla de ADN . Los

elementos que componen la horquilla son fácilmente identi�cables: el linker, el lazo y las agrupaciones de repeticiones

de la secuencia GCC (picos equiespaciados de altura creciente). Al abrir toda la horquilla, se observa el patrón

de fuerza extensión típico de una molécula lineal híbrida de ADN de cadena sencilla y doble. Las actividades de

desplazamiento de banda ∆x1 (f, t) y extensión del primer ∆x2 (f, t) se detectan como una variación de la distancia

entre las microesferas (�echas horizontales) manteniendo la fuerza constante a un valor inferior a 14 pN . El producto

�nal de ambas reacciones consiste en una molécula lineal de dsDNA de 3800 pb.

4.1.2. Caracterización de la horquilla

Al estirar la molécula diseñada es posible identi�car todos los elementos que la componen, Figura 4.1b.

Por debajo de ∼ 14 pN , se observa la curva de fuerza extensión característica de una molécula de

ADN de doble cadena con una longitud de contorno que corresponde a 2686 pares de bases. Una vez

se supera cierto umbral, la fuerza aplicada es su�ciente para vencer los enlaces de Hidrógeno y el

resto de las interacciones que mantienen unidas las dos hebras de la doble cadena. En esta región se

observa el patrón de apertura mecánica de la doble hebra, el cual guarda una relación muy estrecha

con la secuencia del segmento de enlace, la horquilla, y el lazo, mostrando zonas más estables en

las posiciones donde existe una mayor concentración de pares de bases GC. Una vez se ha abierto

42

4.1 Acoplamiento entre polimerización y desplazamiento de banda.

toda la molécula, y gracias al lazo colocado al �nal de la horquilla, es posible incrementar la fuerza

aun más. En este caso, el patrón de fuerza extensión corresponde al estiramiento de una molécula

lineal híbrida, que contiene 2686 pares de bases de dsDNA y 1000(515*2 + linker + lazo) bases

de ssDNA. Si el proceso de estiramiento se ha realizado a una velocidad su�cientemente lenta, es

posible disminuir la fuerza gradualmente y obtener una curva de relajación idéntica a la curva de

apertura1.

4.1.3. Detección de Actividad

Una vez comprobado que tenemos la molécula deseada, se le instruye al aparato que mantenga

la fuerza constante a un valor determinado, inferior a la fuerza de apertura. En estas condiciones,

cualquier cambio registrado en la fuerza sobre la partícula situada en la trampa óptica, será corregido

por el aparato acercando o alejando la microesfera ubicada en la pipeta.

(a)

0 5 10 15 20 25 30

1,0

1,1

1,2

1,3

1,4

1,5

Dis

tanc

ia (μm

)

Tiempo (segundos)

Salvaje Mutante ddb

Δx1(f,t) Δx2(f,t)

d. b. e. p. d. b. e. p.

(b)

Figura 4.2: Detección de las actividades de desplazamiento de banda y extensión del primer. 4.2a: Representa-

ción esquemática del diseño experimental. A fuerza constante y en presencia de dNTPs, la polimerasa de Phi29

(triángulo rojo) se une al único extremo 3' libre en la horquilla y comienza la actividad de polimerización acoplada

al desplazamiento de banda (poldb), seguida de la actividad exclusiva de polimerización (pol). Las actividades se

detectan como el cambio en distancia entre las microesferas en el tiempo, ∆x1 (f, t) y ∆x2 (f, t) respectivamente.

4.2b: Trazas representativas de la actividad de replicación de las polimerasa salvaje (azul) y mutante (verde) que

muestran en detalle el cambio en distancia durante las actividades poldb (∆x1 (f, t)) y pol (∆x2 (f, t)) (f ∼ 11 pN).

Al mantener la fuerza constante durante un tiempo aproximado de 5 minutos se comprueba que el

1El hecho de que relaje por la misma curva de subida es prueba de lo �su�cientemente�

43


sistema es estable en una escala temporal superior a la típica de un experimento (20 segundos a una

velocidad de 60 nt/s) y que no existen transiciones que puedan ser activadas térmicamente o por

algún otro factor no controlado, como las vibraciones mecánicas trasmitidas a través de la pipeta.

Posteriormente se �uye al interior de la celda, a través del dispensador externo, una solución que

contiene la polimerasa de ADN de Phi29 en el tampón de reacción (que contiene los dNTPs). Una

vez que la solución alcanza la región de la celda de reacción donde se encuentra anclado el ADN, la

polimerasa se une al único extremo 3' libre de la horquilla y comienza la actividad de replicación,

Figura 4.2a.

Podemos identi�car dos regímenes de actividad: En un primer momento, la polimerasa se mue-

ve a través de la horquilla utilizando una de las hebras como molde para incorporar el nucleótido

complementario al extremo 3' del primer, a la vez que desplaza la hebra complementaria hacia ade-

lante. La apertura del ADN que antes formaba parte de la horquilla provoca que la longitud de ADN

entre las dos microesferas aumente gradualmente a lo largo de la actividad. Debido al régimen de

retroalimentación en fuerzas impuesto, el sistema está obligado a corregir la posición de la microes-

fera en la pipeta, para garantizar la fuerza constante en la trampa. Esto provoca un incremento de

la distancia entre las dos microesferas, ∆x1 (f, t), evidencia de la actividad de polimerización aco-

plada al desplazamiento de banda (poldb) de la polimerasa en el tiempo, Figura 4.2. El número de

nucleótidos replicados en el tiempo Xnuclt (f, t) se determinó como el cambio en distancia observado

dividido por la contribución debida a la elasticidad de los polímeros de ADN de cadena sencilla y

doble a la fuerza a la que se realiza el experimento. En este régimen, el efecto que tiene el avance de

la enzima sobre el substrato se puede explicar como la generación de dos bases de ssDNA, debido

a la apertura de un par de bases de la juntura, y la incorporación de una de estas al primer, o lo

que es lo mismo, la conversión de una de las bases de ssDNA a dsDNA. El número de nucleótidos

replicados en este caso viene dado por:

Xnuclt (f, t) =∆x1 (f, t)

2 · xss (f)− (xss (f)− xds (f))=

∆x1 (f, t)

xss (f) + xds (f)(4.1)

donde xss (f) y xds (f) son las características fuerza-extensión promedio por nucleótido para el ADN

de cadena sencilla y doble respectivamente, Figura 4.3.

Una vez que la enzima ha terminado la replicación de la horquilla, procede con la replicación de

la cadena sencilla complementaria previamente desplazada. La actividad de polimerización ocurre

ahora sin necesidad de abrir la doble hebra (pol). La conversión de la porción de 521 bases de ssDNA

44


en pares de bases de dsDNA provoca un cambio en la estructura de la molécula lineal híbrida anclada

entre las microesferas, debido a las diferentes propiedades mecánicas entre ambos polímeros Smith

et al. (1996); Bustamante et al. (2000b).

A fuerzas bajas predomina el régimen de elasticidad entrópica, en el cual la distancia entre los extre-

mos de la molécula está determinada por la capacidad que tiene el polímero de curvarse localmente

como resultado de las �uctuaciones térmicas. El efecto que tiene la actividad de replicación (con-

versión de ADN de cadena sencilla a doble), en este régimen, es el de convertir un polímero con

cierta �exibilidad en uno más rígido (Lp_ssDNA vs Lp_dsDNA=50 nm Fiosológicas), por lo que,

manteniendo la fuerza constante, la actividad se detecta como un aumento de la distancia entre

extremos de la molécula híbrida, ∆x2 (f, t).

Fuerzas más altas aplicadas en los extremos de la molécula, son capaces de vencer las �uctuaciones

térmicas y linealizar el polímero. En este régimen predomina la elasticidad intrínseca por lo que la

distancia entre extremos de la molécula viene dada por la estructura química de la molécula, a saber,

la distancia entre monómeros y la elasticidad longitudinal intrínseca (referencia). La actividad de

replicación en este caso se detecta como una disminución de la distancia, ∆x2 (f, t), Figura 4.2b,

entre los extremos de la molécula híbrida debido a la relación entre la distancia promedio entre

monómeros para las moléculas de ADN de cadena sencilla y doble (xss/xds = >1 poner número,

F=10pN, en nuestras condiciones experimentales).

A cierta fuerza, ambos efectos se compensan, y las características fuerza extensión para los polímeros

de ssDNA y dsDNA se igualan. En este rango de fuerzas (en nuestras condiciones 7 ± 2 pN ¾) es

imposible detectar actividad de replicación utilizando este método. En este régimen, para todo el

rango de fuerzas (excepto 7 ± 2 pN ¾), el número de nucleótidos replicados viene dado por Ibarra

et al. (2009):

Xnuclt (f, t) =∆x2 (f, t)

xss (f)− xds (f)(4.2)

Las magnitudes Xnuclt (f, t) calculadas de esta forma, están libres del efecto de la elasticidad del

substrato, por lo que responden intrínsecamente a características cinéticas del proceso de replicación

y desplazamiento de banda. Sin embargo, en el cálculo de las mismas no se ha asumido ningún modelo

cinético, número de estados o interconexión especí�ca entre estos: independientemente del esquema

cinético subyacente, el efecto total en el cambio en distancia que se detecta experimentalmente, se

propone viene dado por las expresiones Ecuación 4.1 y Ecuación 4.2. Una comprobación directa de

45


la aplicabilidad de estas expresiones viene dada por el hecho de que la longitud total (en número de

nucleótidos replicados) de la mayoría de las actividades grabadas coincide con la longitud esperada

para el substrato diseñado bioquímicamente, Figura 4.7a.

Tensió

n (

pN

)

Distancia ( m)

0,6 0,8 1,0 1,2 1,40

2

4

6

8

10

12

(a)

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,50

2

4

6

8

10

12

14

Ten

sión

(pN

)

Extensión (nm) / ssDNA (nt)(b)

Figura 4.3: Determinación de la curva de fuerza-extensión del ssDNA para el estudio de la replicación acoplada

al desplazamiento de banda. 4.3a: La inclusión de un sitio abásico (naranja) en el vértice del lazo colocado al �nal

de la horquilla de replicación, impide que la polimerasa replique la cadena desplazada en la primera parte de la

actividad, generando una molécula lineal híbrida compuesta por 3242 pb de dsDNA y 556 nt de ssDNA. Las curvas

de fuerza extensión representativas muestran la extension de la molécula espaciadora inicial (antes de la apertura

mecánica) (negro), ajustada con el modelo wlc (rojo) y la extensión de la molécula híbrida �nal (azul). 4.3b:

Extensión promedio (a partir de 21 moléculas independientes) entre nucleótidos de ssDNA en nuestras condiciones

experimentales. Las barras corresponden al error estándar.

Determinación de xds (f) y xss (f). La característica fuerza-extensión por nucleótido del ADN

de cadena doble, xds(F ), se calculó utilizando el modelo de física de polímeros llamado WLC (del

inglés, worm-like chain) Bustamante et al. (1994). En particular se utilizó la aproximación re�nada

ofrecida por (Bouchiat et al. (1999)(silvia)�> en matlab: Brochard & Croquette, Biophys J. 1998,

no aparece la referencia), con valores de longitud de persistencia de 53 nm y módulo de estiramiento

de 1200 pN/nm y valores de las constantes α de −56,70872, 157,99776, −155,50428, 64,29988,

−10,949672, −2,0656912, 4 y −1.

Para determinar la característica fuerza-extensión por nucleótido del ADN de cadena sencilla, en

nuestras condiciones experimentales, se utilizó un método basado en la reacción de replicación media-

da por la polimerasa, Figura 4.3. Se construyó una horquilla de replicación muy similar a la utilizada

en los ensayos de replicación, en la que se sustituyó la timina localizada en el vértice del lazo de

46


unión al �nal de la horquilla por un nucleótido abásico. Sobre este substrato, una vez la enzima ha

terminado la actividad de replicación y desplazamiento de banda, le es imposible continuar con la

actividad de extensión del primer. El resultado �nal de la reacción consiste en una molécula híbrida

que contiene Nds = 3242 pares de bases de dsDNA y Nss = 556 bases de ssDNA. Gracias a que

la hebra complementaria al segmento libre ha sido replicada, es posible relajar esta molécula por

debajo de ∼ 14 pN sin que ocurra la rehibridación y determinar así los valores de fuerza-extensión

xhı́b (f) de la molécula híbrida en el rango de fuerzas de interés. Los valores de xss(f) se obtienen

substrayendo a esta curva, la contribución debida a la porción de cadena doble y normalizando el

resultado al número total de nucleótidos de ssDNA, según la expresión:

xss (f) =xhı́b (f)− xds (f) ·Nds

Nss(4.3)

Nuestro diseño experimental permite la identi�cación inequívoca de los puntos de inicio y �nal de

cada reacción. La actividad poldb comienza en el único extremo 3' libre que posee la horquilla, el cual

coincide con la extensión de la molécula espaciadora de doble cadena. El punto �nal, se determina a

partir del cambio en la pendiente durante la actividad, Figura 4.2b, el cual también marca el inicio

de la actividad pol. Adicionalmente, este punto se puede identi�car a través de la distancia esperada

para una molécula hibrida con característica fuerza extensión xhı́b (f). El �nal de la actividad

de extensión del primer es fácilmente identi�cable a través de la extensión de la molécula de ADN

de cadena doble que resulta de procesar todo el substrato (dsDNA de 3798 pb, Figura 4.1b).

4.1.4. Efecto de la estabilidad de la horquilla en la velocidad de replicación

Tensión en la juntura La velocidad media de polimerización y desplazamiento de banda de la

polimerasa salvaje aumenta moderadamente con la fuerza, de Vpoldb = 80 nt/s (3,5 pN) a Vpoldb =

120 nt/s (13 pN), una velocidad similar a la velocidad de polimerización a lo largo de la hebra

complementaria (Vpol = 128 nt/s), Figura 4.4a. Por el contrario, la velocidad media de poldb de la

polimerasa mutante ddb presenta una dependencia en fuerza mucho más marcada, incrementándose

en un factor 9, de Vpoldb = 10 nt/s (4,2 pN) a Vpoldb = 90 nt/s (12 pN), también aproximándose

a su velocidad de pol Vpol = 128 nt/s, Figura 4.4b. Ambas polimerasas presentan una velocidad

de polimerización idéntica e independiente de la tensión por debajo de 14 pN , lo que indica que la

tensión en la hebra molde no afecta el paso limitante de la reacción de replicación, de acuerdo con lo

que ha sido reportado anteriormente para estas polimerasas Ibarra et al. (2009). Por lo tanto, estos

47


datos indican que durante el proceso de desplazamiento de banda, la apertura de la doble hebra es

el paso dependiente de fuerza de la reacción, el cual limita moderadamente el avance a través de

la horquilla de la polimerasa salvaje y fuertemente el avance del mutante ddb (Vpoldb/Vpol= 0,67 vs

0,08 respectivamente).

Vep

Vdb

Vel

ocid

ad M

edia

(nt/s

)

12108642 14

140

120

100

80

60

40

20

0

Tensión (pN)(a)

Vep

Vdbsin pausas

Vdbcon pausas

140

120

100

80

60

40

20

012108642 14

Vel

ocid

ad M

edia

(nt/s

)

Tensión (pN)(b)

Figura 4.4: Dependencia con la tensión de las velocidades medias para la polimerasa salvaje y el mutante ddb. Sólo

se consideraron actividades totales. 4.4a: La dependencia con la tensión de la velocidad media de desplazamiento

de banda (Vpoldb) de la polimerasa salvaje con y sin pausas (círculos azules rellenos y vacíos respectivamente) se

explica correctamente con nuestro modelo activo (linea sólida azul). 4.4b: Las diferencias en la dependencia con la

tensión entre las velocidades medias de desplazamiento de banda Vpoldb del mutante ddb con y sin pausas (círculos

verdes rellenos y vacíos respectivamente) pueden ser explicadas con el mismo modelo activo cuando se tiene en

cuenta la cinética de pausas (línea sólida verde) (crossreference ecuación) o cuando ésta se excluye del modelo

(linea discontinua verde) (crossreference ecuación). 4.4a y 4.4b: Para ambas polimerasas los círculos rojos rellenos

y vacíos representan las velocidades medias de extensión del primer (Vpol) con y sin pausas respectivamente. La

línea roja discontinua representa la velocidad de extensión del primer independiente de tensión y secuencia utilizada

en el modelo (128 nt/s). Las barras de error representan el error estándar.

Efecto de la secuencia A continuación, determinamos el efecto de la secuencia en las velocidades

de desplazamiento de banda y extensión del primer de ambas polimerasas. Para la polimerasa salvaje,

durante la reacción poldb, una comparación directa entre el tiempo de residencia promedio que

pasa la proteína en cada posición de la horquilla y el patrón de apertura mecánica de la horquilla

muestra que esta pasa más tiempo en las posiciones con mayor concentración de pares de base

GC, Figura 4.5a. La cuanti�cación de este efecto reveló que la velocidad de apertura de los pares

GC es aproximadamente tres veces menor que la de los pares AT (VpoldbGC/VpoldbAT = 0,36), la

cual a su vez es similar a la velocidad de extensión del primer (VpoldbAT /Vpol = 0,86). Durante la

reacción pol, el tiempo de residencia promedio de ambas polimerasas, no presenta un incremento

48


preferencial en la regiones más estables de la horquilla (o en ninguna otra), Figura 4.5b, sugiriendo

que la secuencia de la hebra molde no tiene un efecto signi�cativo en la velocidad de extensión del

primer de las polimerasas salvaje y mutante. Curiosamente, la polimerasa mutante ddb presenta,

durante el desplazamiento de banda, pausas largas localizadas en la regiones de la horquilla con

mayor concentración de pares GC, Figura 4.6b.

Posición en el Molde (nucleótidos)

14

18

16

Te

ns

ión

(p

N)

segu

ndo

s / 1

0 nt

0 100 200 300 400 5000,0

0,1

0,2

0,3

(a)

9 GC 12 GC6 GC3 GC

0 100 200 300 400 5000,0

0,1

0,2

0,3

segu

ndos

/ 10

nt

Posición en el Molde (nucleótidos)(b)

Figura 4.5: Dependencia del tiempo de residencia con la secuencia para la polimerasa salvaje y el mutante ddb.

4.5a: Durante la actividad de desplazamiento de banda, la polimerasa salvaje pasa más tiempo (azul, f ∼ 4 pN ,

N = 15, ventana w = 10 nt) en las regiones más estables de la horquilla. El modelo propuesto (naranja) describe

correctamente este comportamiento. Para comparar, el patrón de fuerza-extensión experimental del proceso de

apertura mecánica de la horquilla se muestra en negro. 4.5b: Dependencia del tiempo de residencia durante la

reacción de extensión del primer con la secuencia para las polimerasas salvaje (azul, N = 17) y mutante (verde,

N = 12, w = 10 nt).

Estos datos indican que la apertura de las regiones más estables de la horquilla tiene diferentes

efectos en cada polimerasa: (i) Ralentiza la translocación de la polimerasa salvaje y (ii) promueve

la entrada del mutante ddb en un estado de pausa de larga duración. El efecto diferenciado de la

estabilidad de la horquilla en la reacción de polimerización acoplada al desplazamiento de banda de

cada polimerasa sugiere diferencias en sus mecanismos de apertura de la doble hebra Betterton and

Julicher (2005).

4.1.5. Cinética de Pausas

Nuestros datos indican que los estados inactivos de pausa pueden ser relevantes durante la reacción

de apertura de la doble hebra. Por lo tanto, para profundizar aun más en el mecanismo de despla-

49


zamiento de banda de cada polimerasa, analizamos en detalle la dinámica de pausas y su relación

con las velocidades de desplazamiento de banda y extensión del primer.

Pos

ició

n en

el M

olde

Tiempo (segundos)

Velocidad (nt/s)

500

400

0

300

200

100

0 6 108

1000

0.06

0.03Pro

bab

ilid

ad

42 12

(a)

Pos

ició

n en

el M

olde

Tiempo (segundos)

Velocidad (nt/s)

500

400

0

300

200

100

0 40 12080

1000

0.08

0.04Pro

bab

ilid

ad

(b)

Figura 4.6: Procedimiento de detección de pausas. 4.6a: Trazas representativas (negro) y distribución de proba-

bilidad de velocidades (interior, azul, f ∼ 7,5 pN , N = 8) de la actividad de desplazamiento de banda para la

polimerasa salvaje. El ajuste a la función doble gaussiana revela un peso del pico centrado en 0 nt/s de A1 = 0,09,

una media x1 = 4,18 nt/s y una desviación estándar s1 = 4,58 nt/s. Para el estado de movimiento A2 = 0,92,

x2 = 93,98 nt/s y s2 = 1,12 nt/s 4.6b: Trazas representativas (negro) y distribución de probabilidad de velocidades

(interior, verde, f ∼ 5 pN , N = 8) de la actividad de desplazamiento de banda para la polimerasa mutante. En

este caso se detectan pausas largas localizadas en las regiones ricas en bases GC de la horquilla. El ajuste a la

distribución de probabilidad de velocidades revela para el pico del estado de pausa: A1 = 0,50, x1 = 0,00 nt/s y

s1 = 0,24 nt/s y para el del estado de movimiento: A2 = 0,50, x2 = 76,05 nt/s y s2 = 2,70 nt/s. �> Ver bondad

de los �ts. El umbral para determinar los eventos de pausa (interior, linea discontinua gris). Los eventos de pausas

detectados se muestran en rojo sobre las trazas, así como las posiciones de las cuatro regiones de la horquilla ricas

en pares GC (líneas discontínuas horizontales).

Detección de pausas El procedimiento de detección de pausas, Ibarra et al. (2009), se inicia

con la unión de las trazas grabadas a fuerzas similares (en un rango de ±1, 6 pN), con el �n de

aumentar el tamaño de la muestra. A partir de las trazas catenadas, se determinó la velocidad de

replicación instantánea mediante un ajuste lineal al número de nucleótidos replicados en un intervalo

de tiempo pequeño (ver, depende del caso t = 0, 7 s, equivalente a Nwin puntos), que se desplaza

secuencialmente sobre cada punto de la traza. Este procedimiento, conocido como media móvil

(�moving average� en inglés) devuelve un valor de velocidad correspondiente a cada punto (excepto

los últimos Nwin) que contiene información de los anteriores t segundos tomados en consideración,

por lo que además de permitir el cálculo de magnitudes medias a lo largo de la serie temporal,

constituye en si mismo un procedimiento de �ltrado, equivalente a un �ltro pasa bajo que elimina,

50


mediante el promediado, las �uctuaciones que ocurren en una escala temporal menor que t (o sea, a

una frecuencia mayor que 1/t).

A partir del histograma de velocidades se calculó la distribución de probabilidad de velocidades como

el número de conteos para un valor determinado de velocidad dividido por la suma total de conteos,

Figura( 4.6a y 4.6b, interior). En todos los casos estudiados (para ambas polimerasas y para todas

las tensiones) la distribución de probabilidad de velocidades presentó una distribución bimodal, en

la que fue posible asignar un pico (centrado en la vecindad de 0 nt/s) al estado de pausa y otro

(centrado en algún valor de velocidad positivo) al estado de movimiento. Un ajuste a una función

doble gaussiana permitió parametrizar este comportamiento:

y = A1 exp

(− (x− x1)2

2s21

)+A2 exp

(− (x− x2)2

2s22

)(4.4)

Donde A1 y A2 son las amplitudes, x1 y x2 los valores medios y s1, s2 las desviaciones estándar de

cada una de las funciones de Gauss, Figuras( 4.6a y 4.6b, interior linea sólida roja).

A partir del ajuste, se puede de�nir la velocidad del estado de movimiento, o velocidad sin pausas,

como el valor medio de la distribución correspondiente a la segunda gausiana: Vsin−pausas = x2 y la

velocidad media, Vmedia, como el promedio de todas las velocidades.

A partir de la posición x1, se de�nió un umbral, localizado 2 veces la desviación estándar (s1)

a la derecha, por debajo del cual se considera que la polimerasa atraviesa un estado de pausa,

Figuras( 4.6a y 4.6b, interior, línea discontinua gris). Posteriormente se determinó en la curva de

velocidad instantánea las porciones de la actividad con velocidad inferior al umbral y se procedió a

recuperar las regiones de la traza de nucleótidos replicados en el tiempo a las cuales corresponden

estos intervalos, Figuras( 4.6a y 4.6b, segmentos rojos sobre la traza).

Con este procedimiento fue posible identi�car y estudiar la cinética de pausas de ambas polimerasas,

con una resolución de 0, 4-0, 8 s segundos, en los dos regímenes de actividad (poldb y pol) y en todo

el rango de tensión.

Procesividad Previo a un análisis detallado de la cinética de pausas, veri�camos que para ambas

polimerasas, el comportamiento de pausas observado no se debe al reemplazo de moléculas de po-

limerasa en el extremo 3' del primer. En nuestros experimentos, la polimerasa salvaje de ADN de

Phi29 (altamente procesiva, REFERENCIA) replica la totalidad de la horquilla en todo el rango

51


de tensión estudiado. Por el contrario, a tensiones bajas (menores que 4 pN) solo se detectaron

actividades parciales para la polimerasa mutante ddb. Sin embargo, la aplicación creciente de ten-

sión desestabilizadora en la juntura de la horquilla permitió rescatar mecánicamente la actividad

de la polimerasa mutante: a 6 pN el 90 % de las moléculas fue capaz de replicar toda la horquilla,

Figura 4.7a.

Como actividad parcial consideramos un evento de replicación en el cual la polimerización no se

recupera en un tiempo de 5 min después de un evento de pausa. Esta ventana de tiempo es apro-

ximadamente 10 veces mayor que la duración media de pausas para la polimerasa mutante durante

el desplazamiento de banda (a baja tensión) y aproximadamente 300 veces mayor que la duración

media de las pausas cortas encontradas para ambas polimerasas durante la actividad pol.

12108642

600

550

500

450

400

350

300

250

Tensión (pN)

Nuc

leót

idos

rep

licad

os

(a)

3 GC 6 GC 9 GC 12 GC

5004003002001000

Posición en el molde (nucleótidos)

30

25

20

15

10

5

0

% A

ctiv

idad

es p

arc

iale

s

(b)

Figura 4.7: Procesividad de las polimerasas salvaje y mutante ddb. 4.7a: Polimerasa salvaje, desplazamiento

de banda (círculos rellenos azules, N = 76 actividades), extensión del primer (círculos rellenos rojos, N = 50).

Cerca del 98 % de las actividades completan la replicación de la horquilla. Para el mutante ddb, desplazamiento de

banda (círculos rellenos verdes, N = 81), extensión del primer (círculos vacíos rojos, N = 45). La concentración de

proteína para ambas polimerasas es de 20 nM . Las barras de error muestran el error estándar. La línea negra señala

la longitud total de la horquilla (556 pb). 4.7b: El 93 % de las actividades parciales del mutante ddb se detienen en

las posiciones de la horquilla con mayor densidad de pares GC (N = 20).

Curiosamente, el número de actividades parciales no depende de la concentración de polimerasa. Esto

se puede deber a al menos dos situaciones: i) El complejo inactivo polimerasa - ADN es muy estable

(más de 5 min). ii) Después de la replicación parcial, la polimerasa eventualmente se desprende de

la horquilla. La rápida rehibridación de la horquilla obstruye el sitio de unión de la polimerasa (el

cual requiere entre 3 y 4 nucleótidos de la hebra molde libres), previniendo la unión de moléculas

adicionales de polimerasa y por tanto evitando que se reanude la actividad de polimerización.

52


Estas observaciones sugieren que, dado que la polimerización generalmente se reanuda después de una

pausa de duración igual o menor que 30 s, la cinética de pausas observada no se debe al reemplazo

de moléculas de proteína en el extremo 3' del primer. La independencia de la duración de pausas

con la concentración de proteína (en un rango entre 2 y 200 nM), determinada experimentalmente,

refuerza aún más esta hipótesis, Figura 4.8.

Concentración de Polimerasa (nM)

Dur

ació

n de

pau

sas

(s)

1,2

0,8

0,4

0,01000100101

(a)

Concentración de Polimerasa (nM)

1000100101

12

8

4

0

Dur

ació

n de

pau

sas

(s)

(b)

Figura 4.8: Dependencia de la duración de pausas con la concentración de polimerasa para las polimerasas salvaje

y mutante ddb. 4.8a: Duración media del estado de pausas cortas (segundos): Polimerasa salvaje: desplazamiento

de banda, circulos rellenos azules y extensión del primer, circulos rellenos rojos. La polimerasa mutante: extensión

del primer, circulos rellenos verdes. La línea roja corresponde a un ajuste lineal a los datos (pendiente = −0, 45×10−4± 8, 33× 10−4 s

nM). 4.8b: Duración media del estado de pausas largas de la polimerasa mutante. Cada punto

representa el promedio de muchas actividades tomadas a 8 ± 1 pN , la línea roja corresponde a un ajuste lineal a

los datos (pendiente = −0, 004± 0, 006 snM

).En ambos paneles las barras de error representan el error estándard.

Cuanti�cación de la cinética de pausas. Tres magnitudes caracterizan la cinética de pausas ob-

servada. i) La frecuencia de pausas, FP =np

tnp,[

1s

], donde np es el número promedio de pausas de

cada tipo (cortas y largas) por actividad, en actividades dentro de un rango de tensión similar y

tnp el tiempo medio sin pausas en cada actividad, de�ne la frecuencia de ocurrencia de cada tipo de

evento de pausa. ii) En el cálculo de la frecuencia se seleccionan y agrupan las pausas de cada tipo.

Debido a que la frecuencia de ocurrencia de los eventos de corta duración es mucho mayor que los de

larga duración, decidimos calcular la distribución de frecuencias de duración de pausas, FDP[

1s2

],

de�nida como la frecuencia de ocurrencia de una determinada duración de pausas dividida por el

tiempo sin pausas. iii) La duración de pausas, que se obtiene de manera directa a partir del proceso

de detcción de pausas.

53


Para la polimerasa salvaje, solo se detectaron pausas cortas durante las condiciones de poldb y pol.

En ambos casos las pausas presentaron características similares: La distribución de frecuencia de

duración de pausas, FDP (f, t), es consistente con una estadística de Poisson correspondiente a un

solo tipo de evento. La frecuencia de pausas, FP decrece exponencialmente con la tensión y crece

linealmente con la densidad de pares GC en la horquilla, Figura( 4.9b y 4.9c), mientras que la

longitud media de pausas (aproximadamente 0,6 s) es independiente de la tensión y de la secuencia,

Figura( 4.11a y 4.11c).

Estas similitudes indican que la presencia de la juntura no altera signi�cativamente la cinética de

pausas características de la replicación del ADN y no promueve la entrada en ningún estado de

pausas alternativo, sugiriendo que estos estados de pausas cortas están relacionados con el ciclo

bioquímico de replicación y no con la reacción de apertura de la doble hebra.

Durante la reacción de extensión del primer (pol) el mutante ddb también presenta pausas cortas

con iguales proporciones (rates) y dependencia de tensión y secuencia que la polimerasa salvaje,

Figura( 4.10a - 4.10c) y Figura( 4.11b y 4.11c), sugiriendo que la naturaleza del estado inactivo de

corta duración, durante el ciclo de replicación, es la misma para ambas polimerasas. Este resultado es

consistente con los observados en ensayos bioquímicos, en los que este mutante presenta las mismas

propiedades de extensión del primer que la polimerasa salvaje Esteban et al. (1994).

Sin embargo, durante la reacción de desplazamiento de banda, las propiedades del comportamiento

de pausas del mutante ddb son diferentes. En este caso, la distribución de frecuencia de duración

de pausas se ajusta mejor a una doble exponencial, indicando que al menos dos tipos de eventos

de pausas, cortas (típicamente menores de 4 s) y largas (típicamente mayores de 4 s), coexisten,

Figura 4.10a. El análisis de los eventos de pausas de corta duración revela que estas presentan casi

las mismas características que las pausas observadas durante la extensión del primer y las descritas

para la polimerasa salvaje, sugiriendo que estas pausas corresponden al estado de corta duración

característico de la replicación del molde, y que no están relacionadas con la apertura de la doble

hebra. Las pausas largas, por el contrario, presentan propiedades muy diferentes a las de las cortas:

Sólo ocurren durante la apertura de la doble hebra y no durante la extensión del primer. Su duración

es aproximadamente 50 veces mayor que la de las cortas (a bajas fuerzas), Figura 4.11d y lo más

importante, presentan una marcada dependencia con la tensión, decreciendo, exponencialmente al

incrementarse la tensión externa que desestabiliza la horquilla, Figura 4.11b. Adicionalmente, su

frecuencia decrece exponencialmente con la tensión, Figura 4.10b y aumenta linealmente con el

aumento de la densidad de pares GC en la horquilla, Figura 4.10c. En su conjunto, estos datos

54


0.010

1.000

0.0010 321

Tiempo (s)

0.100

exp[FLP(f,t)

(s-2 )

]

(a)

0.10

1.00

0.01

2 1210864 14exp[FP(f,t)

(s-1 )

]Tensión (pN)(b)

FP(f,t)

(s-1 )

-1

%GC

0 60402010 30 50 70

1

1,5

0

0,5

2

(c)

Estado Activo

Pausa

Corta P1

k1a

ka1(f)

(d)

Figura 4.9: Comportamiento de la frecuencia de pausas para la polimerasa salvaje. 4.9a - 4.9c: Los puntos

rojos representan la reacción de extensión del primer y los azules la reacción de desplazamiento de banda. 4.9a:

La distribución de frecuencia duración de pausas (FDP (f, t)[s−2

]) puede ser ajustada con una exponencial simple

(f ∼ 5 pN). Extensión del primer, línea roja (R2 = 0,89, N = 22) y desplazamiento de banda, línea azul (R2 = 0,87,

N = 38). 4.9b: La frecuencia de pausas[s−1

]decrece exponencialmente con la tensión (las líneas sólidas representan

un ajuste a los datos con la Ecuación 4.5) y 4.9c: aumenta linealmente con el aumento del contenido de pares de

bases GC en el ADN (f ∼ 5 pN). Extensión del primer, línea roja (R2 = 0,81, N = 38) y desplazamiento de banda,

línea azul (R2 = 0,78, N = 22). 4.9d: Modelo cinético propuesto para explicar el comportamiento de las pausas

cortas (Pausa Corta P1). Véase la Tabla 4.1 con los valores de los rates transición y la dependencia en tensión

asociada, da1.

55


0.010

1.000

1E-4

0 352010

Tiempo (s)

0.100

exp[

FL

P(f

,t) (

s-2)]

5 15 25 30

1E-3

Corta Larga

(a)

0.10

1.00

0.01

2 1210864 14

exp[FP(f,t)

(s-1 )

]Tensión (pN)(b)

FP(f,t)

(s-1 )

-1

1

1,5

0

0 604020

%GC

10 30 50 70

0,5

2

(c)

Estado Activo

Pausa

Corta P1

Pausa

Larga P2

k1a k2a(f)

ka2(f)ka1(f)

(d)

Figura 4.10: Comportamiento de la frecuencia de pausas para el mutante ddb. 4.10a: La distribución de frecuencia

longitudes de de pausas (FLP (f, t)[s−2

]) durante la reacción de extensión del primer (f ∼ 6,5 pN , círculos rojos)

es compatible con una exponencial sencilla (línea sólida roja, R2 = 0,97, N = 25) y es similar a la distribución de

frecuencias de pausas cortas durante el desplazamiento de banda y la extensión del primer de la polimerasa salvaje

(linea gris), Figura 4.9a. Durante la reacción de desplazamiento de banda (f ∼ 6,5, círculos verdes) se requiere una

doble exponencial para ajustar los datos (línea sólida verde, R2 = 0,93, N = 41). 4.10b - 4.10c: Los círculos verdes

representan las pausas cortas durante el desplazamiento de banda, los círculos rojos las pausas cortas durante la

extensión del primer y los círculos negros las pausas largas durante el desplazamiento de banda. 4.10b: Para ambos

tipos de pausas, la frecuencia (FP

[s−1

]) decrece exponencialmente con la tensión (las líneas sólidas representan un

ajuste de los datos a la Ecuación 4.5) y 4.10c: crece linealmente con el porcentaje de pares GC en la horquilla (las

líneas sólidas representan ajustes lineales, R2 = 0,98, 0,99, 0,92). 4.10d: Modelo cinético propuesto para explicar

el comportamiento pausas de la polimerasa mutante durante el desplazamiento de banda. Véase Tabla 4.1 con los

valores de los rates transición y las dependencias en tensión asociadas.

56


2 1210864 14

Tensión (pN)

1.5

Long

itud

de

Pau

sas

(s)

1.0

0.5

0.0

2.0

(a)

2 1210864 14

Tensión (pN)

1

10

0.1Long

itud

de

Pau

sas

(s)

(b)

1.5

Long

itud

de

Pau

sas

(s)

1.0

0.5

0.0

2.0

%GC

40 602010 30 50 70

(c)

%GC

40 602010 30 50 70

30

Long

itud

de

Pau

sas

(s)

20

10

0

80

40

50

60

70

(d)

Figura 4.11: Duración de pausas para las polimerasas salvaje y mutante. 4.11a: Para la polimerasa salvaje la

duración media de pausas [s] es independiente de la tensión, tanto durante la actividad poldb (círculos azules) como

durante la pol (círculos rojos). La línea roja muestra un ajuste lineal a los datos (pendiente: 0,001 ± 0,016 spN

).

4.11b: Para la polimerasa mutante ddb la duración media de las pausas cortas, tanto durante poldb (círculos verdes)

como durante pol (círculos rojos) es independiente de tensión mientras que la duración media de las pausas largas

durante poldb (círculos negros) decrece exponencialmente con la tensión (La línea negra representa un ajuste a la

Ecuación 4.5). 4.11c: Dependencia de la duración media de las pausas cortas con el porcentaje de pares GC en la

horquilla (ventana de 20 pb). Para la polimerasa salvaje: poldb, círculos azules rellenos, pol , círculos azules vacíos.

Para la polimerasa mutante ddb: poldb, cuadrados verdes rellenos y pol , cuadrados verdes vacíos. La línea roja

representa un ajuste lineal a los datos (pendiente: 0,00± 0,17 s%GC

). 4.11d: Dependencia de la duración media de

pausas con el contenido de pares GC, del estado inactivo de larga duración para la polimerasa mutante durante

poldb (ventana de 20 pb, f ∼ 6 pN). La línea roja muestra un ajuste lineal a los datos (pendiente: 0,19±0,27 s%GC

).

En todas las �guras las barras de error representan la desviación estándar.

57


indican que las pausas largas corresponden a un estado inactivo del complejo ADN -polimerasa

inducido durante la apertura de las regiones más estables de la horquilla (agrupaciones de GC )

y que la desestabilización mecánica externa de la juntura promueve la salida de este estado. Estas

observaciones explican la incapacidad del mutante ddb de replicar in vitro el genoma de doble cadena

del fago Phi29 mas allá de la región inicial rica en bases GC Esteban et al. (1994).

El comportamiento de pausas de la polimerasa salvaje (durante las reacciones poldb y pol) y de la

polimerasa mutante durante la reacción pol puede ser explicado con un modelo cinético simple en el

cual las pausas cortas corresponden a un estado único o�-pathway que se bifurca del estado activo

principal de la proteína durante la replicación de las regiones del molde ricas en pares GC (Pausa

Corta P1, Figura 4.9d). En cambio, el modelo más simple que puede explicar el comportamiento de

pausas del mutante durante la apertura de la doble hebra requiere que los estados de pausas cortas

y largas bifurquen de manera independiente del estado activo principal de la polimerasa (Pausa

Corta P1 y Pausa Larga P2 respectivamente, Figura 4.10d). Modelos alternativos también fueron

considerados ANEXO?.

En estos modelos, los rates dependientes de tensión, de entrada y salida a los estados de pausa, k (f)

varían con la tensión según Bustamante et al. (2004):

k (f) = k (0) exp

(−f · dkBT

)(4.5)

donde f es la tensión aplicada, k(0) es el rate de transición entre los estados activos y de pausa

en ausencia de fuerza aplicada (f = 0) y d es la distancia al estado de transición a lo largo de la

coordenada mecánica de�nida por la dirección de aplicación de la tensión externa.

4.1.6. Cuanti�cación del mecanismo de apertura de la doble hebra.

Nuestros datos revelan que las pausas modulan fuertemente la velocidad media de desplazamiento de

banda del mutante. De manera similar, ha sido descrito que las pausas forman parte del mecanismo

de apertura de numerosos motores especializados de ácidos nucleicos Cheng et al. (2007); Sun et al.

(2008); Kim et al. (2010a); Ribeck et al. (2010). Por lo tanto, para la correcta interpretación de las

dependencias en secuencia y tensión, de las velocidades de apertura de la doble hebra, la cinética de

eventos de pausa debe ser considerada. Hemos extendido la descripción física Betterton and Julicher

(2005); Johnson et al. (2007), Sección 7.3, en la cual el grado de actividad de un motor de ácidos

nucleicos capaz de abrir la doble hebra depende de la energía de interacción ∆Gint entre la proteína

58


y la juntura de la doble hélice, para incluir el efecto de las pausas en la reacción de apertura de la

doble hebra de la polimerasa de ADN de Phi29. Esta parte del trabajo se hizo en colaboración con

F. J. Cao del departamento de Física Atómica, Molecular y Nuclear de la Universidad Complutense

de Madrid.

5'

3'

3'

5'

5'

l m

M

L

Replicación

Figura 4.12: Representación esquemática y notación

del modelo utilizado para describir el avance de la poli-

merasa (triángulo rojo) en las condiciones de desplaza-

miento de banda. M de�ne el rango de interacción entre

la polimerasa y la juntura; m es el número de nucleóti-

dos disponibles entre la la posición de la polimerasa (l,

número de nucleótidos replicados) y la juntura. L es la

longitud total de la horquilla.

Generalización del modelo La generalización

para incluir la cinética de pausas se hizo de ma-

nera directa, en términos del tiempo de residen-

cia de la polimerasa en cada posición del molde.

El tiempo de residencia teniendo en cuenta las

pausas T (f) está determinado por el tiempo de

residencia en ausencia de pausas Ta (f) mas la

contribución de cada tipo de evento de pausa

Ti (f) según T (f) = Ta (f) +∑

i Ti (f)

En ausencia de pausas, el tiempo de residencia

promedio en la posición l viene dado por:

ta (f) =1

ka (l, f)

y el tiempo de residencia promedio por nucleó-

tido para toda la secuencia viene dado por:

Ta (f) =1

L

L∑l=1

1

ka (l, f)

De acuerdo a nuestros modelos cinéticos, la contribución al tiempo de residencia debido a los eventos

de pausa viene dado por:∑

i Ti (f) = T1 + T2 donde los tiempos de residencia adicionales T1 y T2

vienen dados por los rates de entrada y salida (ka1 (f), ka2 (f) y k1a, k2a (f)) a los estados de pausas

de corta y larga duración según T1 (f) = Ta (f) · ka1(f)k1a

y T2 (f) = Ta (f) · ka2(f)k2a(f) .

Determinación de los rates De acuerdo con el modelo, encontramos que tanto la frecuencia como

la duración de pausas dependen de tensión según la Ecuación 4.5. Los rates dependientes de tensión,

de entrada y salida a los estados de pausa P1 (ka1 (f, t), k1a) y P2 (ka2 (f, t), k2a (f, t)), así como

sus respectivos cambios conformacionales asociados (da1, da2 y d2a), se determinaron a partir de un

59


ajuste a la Ecuación 4.5 (ka1 (f) = ka1 (0) exp [−da1·f/kBT ] para el rate de entrada al estado de pausa

P1, de manera análoga para los otros rates) a los datos de dependencia de la frecuencia (entrada) y

duración (salida) de pausas con la tensión, (Figura 4.9b y 4.10b), Tabla 4.1. La frecuencia de salida

del estado de pausa corta, k1a puede ser calculada directamente como el inverso de la longitud de

pausas cortas, independiente de tensión y secuencia, (Tabla 4.1).

salvaje e. p salvaje d. b. ddb e. p. ddb d. b.

ka1 (0) 0,80± 0,12 0,35± 0,05 0,7± 0,3 0,7± 0,3

da1 0,50± 0,08 0,45± 0,08 0,6± 0,2 0,5± 0,2

k1a 1,5± 0,9 1,5± 1,4 1,4± 1,1 1,4± 1,2

ka2 (0) n.a. n.a. n.a. 0,4± 0,3

da2 n.a. n.a. n.a. 0,7± 0,3

k2a (0) n.a. n.a. n.a. 0,02± 0,02

d2a n.a. n.a. n.a. −0,7± 0,4

Tabla 4.1: Rates y cambios conformacionales durante las reacciones de extensión del primer (e. p.) y desplazamiento

de banda (d. b.) determinados a partir de ajustes independientes a la dependencia de la frecuencia y duración de

pausas con la tensión. Los rates (k) están en s−1, las dependencias de tensión de Arrenius (d) en nm y los errores

representan el error estándar. n. a., no se aplica.

Por otra parte, el efecto de las pausas en los tiempos de residencia y la velocidad global de replicación

también determina la distribución de frecuencia de duración de pausas FDP (f, t). En nuestro modelo

cinético, la probabilidad de ocurrencia de un evento de pausa tipo P1 y duración t viene dada

por: PP1 = k1a · exp [−k1a · t]. De manera similar, para un evento de pausa de tipo P2: PP2 =

k2a · exp [−k2a · t]. La frecuencia media de ocurrencia de los eventos de pausa P1 y P2 viene dada

por ka1 y ka2 respectivamente por lo que si efectivamente solo existe un estado de pausa (Pausa

corta P1) (Figura 4.9d), la distribución de frecuencias de duración de pausas tiene la forma:

FDP (f, t) = ka1 · PP1 = ka1 (f) · k1a · exp [−k1a · t] (4.6)

donde ka1 (f) es el rate de transición entre el estado de polimerización activo y el estado de pausa

P1, y k1a es el rate de salida del estado de pausa P1 hacia el estado activo. Este simple modelo

explica la distribución de frecuencias de longitudes de las pausas cortas para la polimerasa salvaje

(en ambas condiciones de replicación, Figura 4.9a) y para el mutante ddb en las condiciones de solo

polimerización, Figura 4.10a, círculos rojos. El ajuste a estos datos proporcionó los valores de los

rates de entrada y salida, ka1 y k1a, al estado de pausa cortas para ambas polimerasas (Tabla 4.2).

Si efectivamente existen dos estados de pausa, (Pausa Corta P1 y Pausa Larga P2), sin transiciones

entre ellos, Figura 4.10d, la distribución de frecuencias de duración de pausas tiene la forma de una

60


doble exponencial:

FDP (f, t) = ka1 (f) · k1a · exp [−k1a (f) · t] + ka2 (f) · k2a (f) · exp [−k2a (f) · t]

donde ka2 (f) y k2a (f) son los rates de transición entre el estado activo de polimerización y el estado

de pausa P2.

La distribución de frecuencias de duración de pausas para el mutante ddb durante el desplazamiento

de banda se ajustó directamente con esta función de cuatro parámetros (Figura 4.10a), devolviendo

los valores para los rates de entrada y salida al estado de pausa P2 (Tabla 4.2). Estos valores se en-

cuentran dentro del rango de error de aquellos hallados mediante el análisis de los rates dependientes

de tensión (Tabla 4.1).

salvaje pol salvaje poldb ddb pol ddb poldb

ka1 0,70± 0,33 0,35± 0,10 0,87± 0,37 0,60± 0,05

k1a 2,0± 0,3 2,2± 0,4 2,35± 0,46 2,25± 0,60

ka2 n.a. n.a. n.a. 0,30± 0,14

k2a n.a. n.a. n.a. 0,02± 0,02

Tabla 4.2: Rates de entrada y salida durante las reacciones de polimerización y desplazamiento de banda (poldb)

y solo polimerización (pol) determinados a partir de la distribución de frecuencia de duración de pausas. Los rates

(k) están en s−1, las dependencias de tensión de Arrenius (d) en nm y los errores representan el error estándar. n.

a., no se aplica.

Una doble exponencial también se obtiene en el caso en que se permitan transiciones entre los estados

de pausa:

Sin embargo, los 6 rates de transición que surgen de este modelo más general, no pueden ser deter-

minados a partir de los cuatro coe�cientes que de�nen la doble exponencial. Este ejemplo pone de

mani�esto que distintos modelos cinéticos pueden conllevar a la misma distribución de frecuencias

de longitudes pausas, aunque con el modelo más sencillo (sin transiciones entre los estados de pausa)

es su�ciente para explicar nuestros datos.

61


Las frecuencias de entrada a los estados de pausa corta (ka1(f)) y larga (ka2(f)), además de ser

dependientes de tensión, lo son de la secuencia (Figura 4.9c y Figura 4.10c), por lo que calculamos

las frecuencias particulares de entrada de ambos estados de pausa en las posiciones ricas en GC,

ka1GC(f) y ka2GC(f) teniendo en cuenta que el tiempo de residencia también puede ser expresado

en función del tiempo de residencia promedio por nucleótido en un par de base GC o AT (TaAT y

TaGC respectivamente) como:

Ta (f) = (1−XGC) · TaAT (f) +XGC · TaGC

siendo XGC la fracción de pares de bases GC que han sido replicados,

TaGC (f) = 1XGC ·L ·

∑pb(l+1)=GC

1ka(l,f)

el tiempo de residencia promedio por nucleótido en una base G o C y

TaAT (f) = 1(1−XGC)·L ·

∑pb(l+1)=AT

1ka(l,f)

en una base A o T. Debido a que solo hemos observado pausas asociadas con los nucleótidos G o C (la

frecuencia de pausas es aproximadamente 0 pausas/s en las posiciones con 100 % de pares de bases

AT, Figura 4.9c y 4.10c) podemos rede�nir los rates de entrada en términos de una frecuencia por

tiempo sin pausa en GC, corrigiendo ka1 (0) y ka2 (0) con la proporción de tiempo que la polimerasa

pasa en las posiciones GC del molde. Este nuevo rate, ka1GC (f) (para el caso del estado de pausa

P1), está relacionado con el anterior según: ka1GC (f) = Ta(f)TaGC(f) · ka1 (f), lo que conduce a que

T1 (f) = TaGC (f) · ka1GC(f)k1a(f) . De manera análoga se determina el rate de entrada al estado de pausa

P2. Los valores de estos rates se obtuvieron a partir del ajuste a la frecuencia y duración de pausas

dependiente de tensión, Tabla 4.3.

Ajuste del modelo Hemos utilizado este modelo para cuanti�car la actividad de apertura de la

doble hebra de ambas polimerasas, teniendo en cuenta las pausas en la velocidad media de despla-

zamiento de banda y eliminando las mismas. En el caso particular de una polimerasa de ADN, la

62


salvaje pol salvaje poldb ddb pol ddb poldb

ka1GC (0) 3,20± 0,11 0,72± 0,11 3,0± 1,3 1,5± 0,6

da1GC 0,53± 0,18 0,28± 0,18 0,6± 0,2 0,4± 0,2

ka2GC (0) n.a. n.a. n.a. 0,8± 0,6

da2GC n.a. n.a. n.a. 0,5± 0,3

Tabla 4.3: Rates de entrada a pausa por unidad de tiempo sin pausa, (a f = 0), y cambios conformacionales durante

las reacciones de polimerización y desplazamiento de banda (poldb) y solo polimrización (pol) determinados a partir

de la dependencia de tensión de la longitud y la frecuencia de pausas. Los rates (k) están en s−1, las dependencias

de tensión de Arrenius (d) en nm y los errores representan el error estándar. n. a., no se aplica.

translocación ocurre en pasos discretos de 1 nt (tamaño del paso, δ = 1 nt)Berman et al. (2007) y

la tranaslocacion en dirección corriente arriba no se espera y no ha sido observada con la resolución

de nuestros experimentos. Además, la polimerasa solo se puede mover hacia adelante cuando hay

nucleótidos de cadena sencilla de la hebra molde disponible, m ≥ 1. En nuestras condiciones experi-

mentales, hemos determinado que el rate de translocación hacia adelante es k0 ∼ 128 nt/s mientras

que el de translocación hacia atrás puede ser considerado 0 nt/s y su efecto ser despreciado en el

cómputo de la velocidad de replicación.

Sólo dos variables determinan los ajustes: la energía de interacción por par de bases entre la polime-

rasa y la juntura, ∆Gd, y el alcance de esta interacción M . El mejor ajuste al modelo (ECUACION

V(F)), para la velocidad de polimerización y desplazamiento de banda dependiente de tensión de

la polimerasa salvaje (con y sin pausas) se obtiene para un valor del incremento del potencial de

interacción por par de bases de ∆Gd = 2 kBT y M = 2, Figura 4.4a. Además, estos valores predi-

cen correctamente el tiempo de residencia (y velocidad) dependiente de secuencia de la polimerasa

durante la actividad de desplazamiento de banda, lo cual refuerza la validez de nuestro modelo,

Figura 4.5a. Por lo tanto, la velocidad (con y sin pausas) dependiente de fuerza y secuencia de la

polimerasa de ADN de Phi29 salvaje respalda un mecanismo de apertura de la doble hélice activo,

en el cual la polimerasa desestabiliza al menos dos pares de bases en la juntura facilitando de esta

forma la apertura de la misma.

La fuerte dependencia de tensión y secuencia en la velocidad de apertura de la doble hebra del

mutante ddb sugiere que esta proteína utiliza un mecanismo de apertura diferente, o menos activo

que el de la polimerasa salvaje. Sin embargo, cuando la cinética de pausas es considerada, los valores

∆Gd = 2 kBT y M = 2 predicen muy bien la velocidad media de desplazamiento de banda del

mutante, Figura 4.4b. Por lo tanto, nuestros datos indican que ambas enzimas utilizan el mismo

mecanismo activo de apertura de la doble hebra, pero el mecanismo del mutante ddb falla en la

63


Tensión (pN)

Vel

ocid

ad M

edia

(nt/s

)

12108642 14

140

120

100

80

60

40

20

0

(a)

140

70

130

120

110

100

90

80Vel

ocid

ad M

edia

(nt/s

)12108642 14

Tensión (pN)(b)

5

30

25

20

15

10

97 8642 3 510

mse

M(c)

Figura 4.13: Predicción de la velocidad media de desplazamiento de banda con valores alternativos de ∆Gd y

M . 4.13a: Un modelo pasivo no reproduce los datos. Hemos considerado la posibilidad de que la polimerasa no

interactúe con la juntura. En este caso la energía de desestabilización es ∆Gd ∼ 0 kBT y el rango de interacción

M ∼ 0. Este modelo (curva negra) no explica la dependencia en tensión de la velocidad de desplazamiento de

banda de la polimerasa salvaje (círculos azules) y el mutante ddb (círculos verdes) con y sin pausas (círculos

rellenos y vacíos respectivamente). 4.13b: Solo un modelo activo ajusta la dependencia de tensión de la velocidad

de desplazamiento de banda sin pausas de la polimerasa salvaje (círculos vacíos azules). El mejor ajuste se obtiene

con a = 0, 01, ∆Gd = 2 kBT y M = 2 (línea azul). Otros valores de M ajustan peor los datos, dando saturación

a diferentes alturas y con diferentes pendientes entre ellas, M = 1, (curva negra) y M = 4, (curva roja). 4.13c:

El mejor ajuste, con el menor error estándar medio (mse, del inglés mean standard error) se obtiene para M = 2

(a = 0, 01). Un incremento gradual del valor de M conlleva a un incremento gradual del mse del ajuste.

64


apertura de las regiones más estables de la horquilla, lo cual promueve la entrada al estado inactivo de

pausa de larga duración. Por otra parte, los valores de las dependencias de tensión de la velocidad de

desplazamiento de banda sin pausas, hallados para ambas polimerasas, son idénticos lo cual refuerza

aún mas esta hipótesis.

65



Como se ha mencionado, para el estudio experimental de la mecanoquímica de motores moleculares

se requiere acceder a la coordenada mecánica de translocación. A diferencia de los experimentos en

que se observan los cambios producidos por la enzima sobre una molécula de ADN, en este caso

se requiere aplicar fuerza directamente sobre la proteína. Adicionalmente, es necesario acceder a la

variable química, que en el límite de baja concentración de producto consiste en la concentración de

dNTP.

4.2.1. Diseño experimental

Para abordar el estudio del mecanismo de translocación de la polimerasa de ADN de Phi29, se

aislaron complejos binarios ADN-polimerasa (ADNp-ADN) entre las dos microesferas localizadas en

el interior de la cámara de reacción del instrumento de pinzas ópticas, Figura 4.14 y Figura 4.15. En

estos experimentos se utilizó una variante de la polimerasa salvaje de Phi29 que contiene una biotina

en su extremo N-terminal (Sección 3.4). Esto permitió unir el complejo, a través de la polimerasa,

directamente a la microesfera recubierta con estreptavidina localizada en la micropipeta. El otro

extremo de la molécula de ADN se unió, a través de enlaces digoxigenina-antidigoxigenina, a la

microesfera localizada en la trampa óptica.

Se utilizaron dos construcciones de ADN diferentes, pero con un segmento de replicación idéntico:

una región de cadena sencilla de 229 nucleótidos seguida de una región de cadena doble de 3400 pb

a partir de un único punto de inicio de la replicación (extremo 3'). La diferencia entre una molécula

y otra radica en la posición de la etiqueta de digoxigenina: i) con el �n de aplicar fuerzas sobre la

proteína a favor de la dirección de movimiento, se colocó la etiqueta de digoxigenina en el extremo

de la porción corriente arriba del primer y ii) con el �n de aplicar fuerzas opuestas al movimiento,

se colocó la etiqueta en el extremo de la porción corriente abajo (Sección 3.2).

Este diseño experimental permitió por tanto seguir en tiempo real la actividad de replicación en

presencia y en ausencia de la actividad de desplazamiento de banda de polimerasas individuales

sujetas a fuerzas opuestas o a favor del movimiento así como el efecto combinado de la fuerza con la

variación de la concentración de dNTP.

66


4.2.2. Detección de Actividad

Para unir los complejos ADN-polimerasa a las microesferas primeramente se formaron los complejos

ADNp-ADN que fueron unidos, en solución, a las microesferas recubiertas con antidigoxigenina.

Esta solución se �uyó al interior de la cámara de reacción del instrumento. Al poner en contacto

las microesferas (una recubierta con las moléculas de ADN unidas a la polimerasa y otra recubierta

de estreptavidina), se logra la unión de la biotina en el extremo N-terminal de la polimerasa y la

estreptavidina que recubre la microesfera en la pipeta. Una ventaja inicial de este diseño, es que

impone que sólo cuando la polimerasa está unida al ADN se logren enlaces, aunque no se garantiza

que esta unión sea funcional.

Una vez logrado un enlace, se comprueban las características de la curva de fuerza extensión de la

construcción y que la longitud de contorno experimental (extensión de la molécula a aproximada-

mente 10 pN) se corresponde con la molécula diseñada. Posteriormente se �uye al interior de la

celda una solución que contiene los dNTP y el MgCL2 y comienza la actividad de replicación, que

se observa de manera diferente según se trate de la con�guración de fuerza a favor u opuesta.

Fuerza a favor En este caso, la molécula de ADN está unida a la microesfera localizada en la

trampa óptica a través del extremo corriente arriba de la polimerasa Figura 4.14a. El segmento de

replicación no contribuye a la curva de fuerza extensión inicial, correspondiéndose esta a la de una

molécula de ADN de cadena doble de 2686 pb (f1(x) en la Figura 4.14, Sección 3.2) utilizada como

agarradera.

Al �uir los nucleótidos, la polimerasa comienza la actividad de replicación en la dirección corriente

abajo de modo que, a medida que el producto de la síntesis se incorpora a la molécula inicial, f1(x),

Figura 4.14, la longitud de la molécula anclada entre las microesferas aumenta (segmento verde,

panel inferior Figura 4.14a). En un régimen de retroalimentación en fuerza, esta actividad se detecta

como un aumento de la distancia entre las microesferas, ∆x (f, t), Figura 4.14 y Figura 4.16a.

En esta con�guración, el número de nucleótidos replicados en el tiempo se determinó como el cambio

en distancia observado dividido por la distancia promedio entre pares de bases para el ADN de

cadena doble a la fuerza en que se grabó la actividad (xds (f)), correspondiéndose los primeros

229 nucleótidos a la actividad de extensión del primer (sobre cadena sencilla, segmento rojo, panel

superior Figura 4.14a) y el resto a la actividad de desplazamiento de banda.

67


Figura 4.14: Detección de la actividad de replicación de la polimerasa de Phi29 en la con�guración de fuerza a

favor. a) Representación esquemática (no a escala) del diseño experimental. El complejo ADNp-ADN se une a la

microesfera en la punta de la micropiepta a través de la polimerasa de Phi29 (triángulo rojo) biotinilada (círculo

naranja). El extremo corriente arriba de la molécula de ADN se une, a través de una etiqueta de digoxigenina

(cuadrado verde) a la microesfera localizada en la trampa óptica. En presencia de los dNTPs la polimerasa comienza

la actividad de extensión del primer (segmento rojo) seguida de la de desplazamiento de banda. El aumento de la

longitud de la molécula inicial (f1(x)), en un régimen de retroalimentación en fuerzas, se observa como un incremento

en la separación entre las microesferas (∆x (f, t), segmento verde, transición horizontal verde, Figura 4.14 b) en el

tiempo. b) La curva de fuerza extensión de la molécula inicial (f1(x)) se corresponde con la curva esperada, según

el modelo WLC , para una molécula de dsDNA de 2686 pb (línea sólida azul). La curva de fuerza extensión f2(x),

muestra un paso intermedio de la actividad de replicación y se corresponde con la curva esperada, según el modelo

WLC , para una molécula de dsDNA de 4300 pb.

Fuerza en contra En este caso, la molécula está unida a través del extremo corriente abajo, por lo

que la curva de fuerza extensión inicial se corresponde con el segmento de replicación: una molécula

hibrida con 229 nt de ADN de cadena sencilla y 3400 pb de ADN de cadena doble.

La síntesis del segmento corriente abajo, provoca un acortamiento de la molécula anclada, por lo que

la actividad en esta con�guración se detecta como una disminución en la distancia, necesaria para

mantener la tensión en el ADN constante, Figura 4.16b. Como resultado de la replicación de toda

la molécula, la distancia entre las microesferas llega a cero y las microesferas entran en contacto,

observándose el comportamiento lineal esperado para la curva de fuerza extensión de una microesfera

en la trampa óptica (Figura 4.15b, línea discontinua roja).

En este caso, aunque en teoría sería posible observar un cambio en la elasticidad de la molécula

anclada al producirse el cambio en el modo de actividad (de extensión del primer a desplazamiento

68


Figura 4.15: Detección de la actividad de replicación de la polimerasa de Phi29 en la con�guración de fuerza en

contra. a) Representación esquemática del diseño experimental. El complejo ADNp-ADN se une a la microesfera

en la punta de la micropipeta a través de la polimerasa de Phi29 (triángulo rojo) biotinilada (círculo naranja). El

extremo corriente abajo de la molécula de ADN se une, a través de una etiqueta de digoxigenina (cuadrado verde)

a la microesfera localizada en la trampa óptica. En presencia de los dNTPs la polimerasa comienza la actividad de

extensión del primer (segmento rojo) seguida de la de desplazamiento de banda. El acortamiento de la molécula

inicial (f1 (x)), en un régimen de retroalimentación en fuerzas, se observa como una disminución en la separación

entre las microesferas (4x (f, t), segmento verde) en el tiempo. b) La curva de fuerza extensión de la molécula

inicial (f1 (x)) se corresponde con la curva esperada, según el modelo WLC, para una molécula híbrida formada

por 3400 pb de dsDNA y 229 bases de ssDNA (línea sólida azul). Una vez la enzima ha replicado toda la molécula,

la curva de fuerza extensión observada se corresponde con la relación lineal entre la fuerza y el desplazamiento de

la micreosfera en la trampa óptica. La línea roja discontinua corresponde a un ajuste lineal a esta porción de la

curva (pendiente = 0,14± 0,51 · 10−3 pNnm

; R2 = 0,994).

de banda), la proporción entre las cantidades de ADN de cadena doble (3400 pb) y de cadena

sencilla (229 nt) es tan baja, que no permite la determinación inequívoca de este punto. Por esta

razón, el punto de cambio de modo de actividad se determinó a partir de la distancia esperada,

desde el inicio de la actividad, para una molécula de ssDNA con 229 nt. La conversión a número

de nucleótidos replicados en el tiempo se realizó dividiendo el cambio en distancia observado por la

distancia promedio entre bases para el ssDNA (xss (f)) en esta región y por la distancia promedio

entre pares de bases de dsDNA (xds(f)) para el resto de la actividad.

Determinación de xss (f) La distancia promedio entre bases para el ssDNA en estas condiciones

experimentales se determinó a partir de la curva de fuerza extensión de la construcción de ADN

utilizada en la con�guración de fuerza en contra, utilizando la Ecuación 4.3 con valores de Nds =

69


Tiempo (segundos)6 12 180 24 30 36

1.1

1.2

1.3

1.4

Ext

ensi

ón (μm

)

F= 14 pN

F= 4 pN

F= 2 pN

A favor

(a)

1.0

1.2

0.6

0.8

0.4

0.2

0.050 100 1500 200 250 300

Tiempo (segundos)

Ext

ensi

ón (μm

)

F= 5 pN

F= 15 pN

F= 25 pN

F= 10 pN

En contra

(b)

Figura 4.16: Cambio en distancia observado durante la actividad de deplazamiento de banda a diferentes fuerzas

a favor ( 4.16a) y en contra ( 4.16b).

3400,Nss = 229 y tomando xhı́b (f) como los valores de la curva de fuerza extensión de la construcción

híbrida en este caso. Como curva de fuerza extensión promedio entre pares de bases para el dsDNA

se utilizó la descrita en la Sección 4.1.3.

(a)

0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

0

5

10

15

20

Fue

rza

(pN

)

Extensión (nm)/ssDNA(nt)(b)

Figura 4.17: Determinación de la curva de fuerza-extensión del ssDNA en nuestras condiciones experimentales.

4.17a: A partir de la curva de fuerza extensón de la molécula híbrida (xhib (f), línea azul) , compuesta por

un segemento de 3400 pb de dsDNA (diagrama, segemento rojo) y 229 nt de ssDNA se determina la curva de

fuerza extensión por nucleótido para el ssDNA según la Ecuación 4.3. Como referencia se muestra la curva de

fuerza extensón predicha por el modelo WLC para una molécula de 3400 pb de dsDNA (línea roja, P = 53 nm,

S = 1200 pN/nm) 4.17b: Curva de fuerza extensión por nucleótido para el ssDNA. Los puntos representan la

media de calculada a partir de 20 moléculas independientes. Los errores representan el error estándar. La línea roja

muestra la curva de fuerza extensión predicha por el modelo WLC con valores de P = 0,75 nm y S = 800 pN/nm.

70


4.2.3. Efecto de la fuerza y la concentración de nucleótidos en la actividad de

replicación.

A partir de las trazas de nucleótidos replicados en el tiempo se determinó la velocidad de replicación

(MM) en un amplio rango de fuerzas (20 a −50 pN) y para seis concentraciones de dNTP (5, 10,

50, 100, 200 y 500 µM) con una concentración de pirofosfato inorgánico de 1 µM (a no ser que se

especi�que lo contrario).

Efecto de la biotinilación e inmovilización sobre la actividad de polimerización. La velocidad

media de replicación a bajas fuerzas (Vave = 60 nt/s, 3,7 pN , 50 µM dNTP) es similar a la

observada en los experimentos descritos en la sección anterior, para la polimerasa salvaje a baja

tensión desestabilizadora Vpoldb = 80 nt/s (3,5 pN , 50 µM dNTP). Adicionalmente, esta velocidad

es compatible con la observada en los experimentos previos a este trabajo, en los que se estudió la

actividad de replicación de la polimerasa de Phi29 bajo el efecto de tensión en el ADN (Ibarra et al.

(2009)), en las mismas condiciones de concentración de dNTP y a bajas tensiones (∼ 60− 80 nt/s,

4 pN , 50 µM dNTP). Estos resultados, unido a experimentos bioquímicos que muestran que la

biotinilación en el extremo N-terminal de la proteína no cambia la procesividad, la velocidad media

de replicación ni el equilibrio pol-exo indican que la biotinilación y la inmovilizción de la Phi29 DNAp

en la super�cie de la microesfera no alteran signi�cativamente la actividad de replicación normal

(salvaje, en solución).

Cinética de Pausas La actividad de replicación en estas condiciones también presenta pausas

cortas ocasionales. Siguiendo un procedimiento similar al descrito en la Sección 4.1.5, analizamos la

dependencia del comportamiento de pausas con la fuerza y con la concentración de dNTP, así como

de manera independiente para las reacciones de extensión del primer y desplazamiento de banda.

A todas las fuerzas y para todas las concentraciones de dNTP, el histograma de velocidad instantánea

muestra una distribución bimodal, con un pico centrado en ∼ 0 nt/s, asociado con el estado de pausa

y uno centrado en valores positivos de velocidad asociados con el estado activo de la proteína.

Con nuestra resolución experimental (∼ 0,4 s), la duración de pausas se observa independiente

de fuerza (Figura 4.19b) y ocurren con una probabilidad por unidad de tiempo �ja, Figura 4.19a,

indicando que pudieran corresponder a un estado inactivo transitorio separado del camino principal

del ciclo (o�-pathway) de adición de nucleótidos y por tanto no afectar la dependencia en fuerza de

71


Tiempo (segundos)

Nuc

leót

idos

rep

lica

dos

(nt)

0 10 20 30 40 50 60

0

200

400

600

(a)

-20 0 20 40 60 800,00

0,02

0,04

0,06

Pro

babi

lida

d

Velocidad (nt/s)(b)

Figura 4.18: Procedimiento de detección de pausas. 4.18a: Trazas de nucleótidos replicados en el tiempo en las

condiciones de desplazamiento de banda, a una fuerza opuesta al movimiento de 15 pN y 50 uM dNTP . Las zonas

rojas muestran los eventos de pausas identi�cados. 4.18b: Distribución de probabilidad de velocidades observada

para las condiciones de 4.18a ajustada con una función doble gaussiana (Ecuación 4.4, linea sólida roja). Los

eventos de pausa se de�nieron como aquellas porciones de la actividad con una velocidad inferior a la establecida

por el umbral (linea discontinua gris) localizado 2 veces la desviación estandar (s1) a la derecha del pico centrado en

la vecindad de 0 nt/s (línea sólida verde, A1 = 0,03u0,10, x1 = 2,10±0,21 nt/s, s1 = 8,32 ±0,64nt/s). La velocidad

sin pausas se de�nió como el pico de movimiento (línea sólida azul, A2 = 0,04 ± 0,05, x2 = 25.,73 ± 0,63 nt/s,

s2 = 27.,41± 1,28 nt/s)

éste. Adicionalmente, la frecuencia y duración de pausas no afecta signi�cativamente la velocidad

media de replicación, en comparación con la velocidad sin pausas.

En ningún caso se observa actividad de exonucleólisis procesiva, aunque es probable que existan

eventos exo cortos no detectados con nuestra resolución a fuerzas superiores a 20 pN (en Ibarra

et al. (2009) solo se detecta actividad exo procesiva a partir de 25 pN).

Efecto de la fuerza sobre la translocación. Nuestros resultados muestran que para todas las

concentraciones de dNTP, la velocidad de replicación sin pausas se ve favorecida ligeramente por

la fuerza a favor del movimiento, Figura 4.20a. Fuerzas mayores de 20 pN provocan la ruptura

del contacto entre las dos microesferas, presumiblemente por la pérdida de la interacción ADN-

polimerasa, en un estado en el que la polimerasa trabaja a alta velocidad (la máxima para cada

condición de dNTP).

En el régimen de fuerza opuesta, la velocidad decrece gradualmente con el incremento de la fuerza,

hasta la perdida de la interacción ADN-ADNp. En este caso, aunque la velocidad se ve reducida

drásticamente (hasta ∼ 5 ± 2 nt/s), la polimerasa no llega a frenarse por completo, Figura 4.20a.

72


-30 -20 -10 0 10 20

0,0

0,2

0,4

0,6

Fre

cuen

cia

de p

ausa

s (p

ausa

s/se

gund

o)

Fuerza (pN)(a)

Fuerza (pN)

-30 -20 -10 0 10 200,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

Dur

ació

n de

Pau

sa(s

egun

dos)

(b)

Fre

cuen

cia

de p

ausa

s (p

ausa

s/se

gund

o)

-25 -20 -15 -10 -5 00,0

0,2

0,4

0,6

Fuerza (pN)(c)

-25 -20 -15 -10 -5 0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

Dur

ació

n de

Pau

sa(s

egun

dos)

Fuerza (pN)(d)

Figura 4.19: Dependencia de 4.19a: la frecuencia (pausas /segundo) y 4.19b: duración de pausas con la fuerza a

diferentes concentraciones de dNTP en las condiciones de desplazamiento de banda. 4.19a: la línea roja representa

un ajuste lineal a los datos (pendiente = −0,001±0,001 s−1 ·pN−1). 4.19b: la línea roja representa un ajuste lineal

a los datos (pendiente = −0,009 ± 0,003 s · pN−1). En ambas �guras la concentración de dNTP se corresponde

con: 500 µM (triángulos azules), 200 µM (círculos rojos), 100 µM (cuadrados negros), 50 µM (cuadrados negros

vacíos), 10 µM (círculos rojos vacios), 5 µM (triángulos azules vacios). 4.19c y 4.19d Durante las condiciones de

extensión del primer y de desplazamiento de banda se observa un comportamiento de pausas similar. Frecuencia

( 4.19c) y la duración de pausas ( 4.19d) en función de la fuerza durante las reacciones de desplazamiento de banda

(círculos llenos) y extensión del primer (círculos vacíos). Para ambas �guras las concentraciones de dNTP son:

100 µM (círculos verdes), 50 µM (círculos negros), 5 µM (círculos azules). En todas las �guras las barras de error

representan el error estándar.

73


Adicionalmente, la fuerza máxima, fuerza a la cual la unión entre el complejo DNAp-DNA se rompe

con mayor probabilidad, decrece con la concentración de dNTP .

Fuerza (pN)

0

40

20

60

80

100

120

140

Vel

ocid

ad (

nt/s

)

-40 -30 -20-50 -10 10 20

(a)

-30 -20 -10 0 10 200

10

20

30

40

50

60

70

80

Vel

ocid

ad (

nt/s

)Fuerza (pN)(b)

Figura 4.20: Dependencia de la velocidad de replicación con la fuerza a diferentes concentraciones de dNTP en los

modods de extensión del primer y desplazamiento de banda. 4.20a: Velocidad de replicación con (símbolos vaciós) y

sin (símbolos sólidos) pausas en función de la fuerza para diferentes concentraciones de dNTP en las condiciones de

desplazamiento de banda. Las concentraciones de dNTP son: 500 µM (triángulos rojos), 200 µM (rombos azules),

100 µM (cuadrados grises), 50 µM (triángulos azules), 10 µM (hexágonos naranja), 5 µM (triángulos verdes).

4.20b: El modo de replicación no afecta la dependencia en fuerza de la velocidad media de replicación. La �gura

muestra la dependencia en fuerza de la velocidad media (sin pausas) en las condiciones de desplazamiento de banda

(círculos sólidos) y extensión del primer (círculos vacíos) a diferentes concentraciones de dNTP: 50 µM (círculos

negros), 10 µM (círculos verde olivo), 5 µM (círculos azules). En ambas �guras las barras de error representan el

error estándar.

Llamativamente, a concentraciones saturantes de dNTPs, la ADNp de Phi29 es capaz de replicar en

contra de fuerzas muy altas, en el orden de aprox 46 pN , lo cual re�eja la extraordinaria robustez del

complejo ADN -polimerasa. En este extremo no se observan, de manera consistente, pausas largas o

movimientos en sentido contrario al de polimerización (actividad exo inducida por fuerza), contrario

a lo reportado en Ibarra et al. (2009) para tensiones en el ADN molde superiores a 25 pN .

La comparación entre las actividades de extensión del primer y desplazamiento de banda no re�eja

diferencias signi�cativas en la velocidad media en todo el rango de fuerzas (opuestas y a favor)

y para todas las concentraciones de dNTP estudiadas, Figura 4.20b. Este hecho, unido a que el

comportamiento de pausas en ambos modos de replicación es similar, Figura 4.19c y 4.19d, sugiere

que bajo la acción de una fuerza mecánica (a favor o en contra) el proceso de translocación, y no el

proceso de desplazamiento de banda, es el paso limitante de la reacción.

74


Efecto de la concentración de nucleótidos sobre la translocación. La disminución de la concen-

tración de dNTP reduce la velocidad de replicación a todas las fuerzas estudiadas. Para todas las

fuerzas, la velocidad media de replicación sin pausas, Vsp, sigue una relación de Michaelis-Menten,

Ecuación 1.3:

Vsp =Vmax · [dNTP ]

KM + [dNTP ](4.7)

donde Vmax es la velocidad máxima de reacción y Km la constante aparente de unión de nucleóti-

dos. La baja concentración de producto utilizada en este trabajo asegura que esta contribución sea

despreciable.

0 100 200 300 400 500[dNTP] (μM)

0

20

40

60

80

100

120

Vel

ocid

ad s

in p

ausa

s (n

t/s)

(a)

0 100 200 300 400 500[dNTP] (μM)

0

20

40

60

80

100V

eloc

idad

sin

pau

sas

(nt/

s)

(b)

Figura 4.21: Dependencia de la velocidad sin pausas con la concentración de nucleótidos a diferentes fuerzas a

favor ( 4.21a: 5 pN , círculos vacíos rojos, 10 pN , triángulos vacíos verdes, 15 pN , cuadrados vacíos naranja y 20 pN ,

rombos vacíos azules) y en contra ( 4.21b: −5 pN , triánguos sólidos verdes, −10 pN , cuadrados sólidos naranja,

−15 pN , rombos sólidos azules, −20 pN , círculos sólidos rojos y −25 pN , pentágonos sólidos grises). Las líneas

sólidas corresponde al ajuste de los datos a la Ecuación 4.7 ( 4.21a: R2 = 0,998, 0,997, 0,998, 0,998, fuerza de

menor a mayor), ( 4.21b: R2 = 0,998, 0,995, 0,98, 0,98, 0,98, 0,993, fuerza de menor a mayor) . En ambas �guras

las barras de error representan el error estándar.

La dependencia de fuerza de los parámetros de Michaelis-Menten Vmax y Km puede ser usada para

identi�car el modo de inhibición de la fuerza y la identidad del paso dependiente de fuerza dentro del

ciclo de incorporación de nucleótidos. Un ajuste a los datos de velocidad sin pausas (Vsp) en función

de la concentración de dNTP, a diferentes fuerzas a favor y en contra (Figura 4.21) revela que Vmax

y Km presentan diferentes dependencias en fuerza: mientras que Vmax disminuye, Km aumenta con

la fuerza en contra.

75


20

40

60

80

100

Vm

ax (

nt/s

)

Fuerza (pN)-25 -20 -15 -10 -5 0 5 10 15 20

20

40

60

80

100

120

140

Km

(μM)

(a) (b)

Figura 4.22: Dependencia de Km, Vmax y Kb con la fuerza. 4.22a: Dpendencia de Vmax(círculos vacíos rojos) y

Km (cuadrados vacíos verdes) en función de la fuerza, obtenidas a partir del ajuste de la Ecuación 4.7 a los datos

en la Figura 4.21. 4.22b: Dependencia de kb (Vmax/Km) con la fuerza. La lína roja representa un ajuste lineal a

los datos (pendiente = 0,065± 0,002 s−1µM−1pN−1).

Dado que la tasa de unión de nucleótidos efectiva se de�ne como kb = Vmaxε·d·Km (donde ε es la e�ciencia

de acoplamiento y δ el paso de translocación), la disminución de Vmax y el aumento de Km implica

que kb decrece sustancialmente con el aumento de la fuerza en contra (valores más negativos),

asumiendo ε = 1 hisdrólisis/pasos e independiente de fuerza (no existen reportes de hidrólisis fútil

en el caso de polimerasas de ADN ). Por tanto, la aplicación de una fuerza opuesta al movimiento

provoca la disminución tanto de la velocidad máxima de translocación (Vmax) como de la tasa efectiva

de unión de dNTP (la tasa a la que las moléculas de dNTP se incorporan al resto del camino de

hidrólisis) de la polimerasa.

76

5 Discusión

5.1. Acoplamiento entre polimerización y desplazamiento de

banda.

Nuestros datos muestran que el paso que limita la velocidad del ciclo de polimerización de la po-

limerasa de ADN de Phi29 no esta afectado por la tensión (por debajo de 14 pN) o la secuencia.

Sin embargo, la replicación a través de regiones del molde ricas en GC promueve la entrada a un

estado de pausa de corta duración (Pausa Corta P1), que es más frecuente (aproximadamente entre

2 y 4 veces) y presenta una dependencia en tensión más fuerte (aproximadamente 2 veces mayor)

en las condiciones de polimerización comparado con las condiciones de polimerización acoplada a

desplazamiento de banda (ka1GC (0) y da1GC ; Tabla 4.3). Estos resultados sugieren que la transloca-

ción a lo largo del molde de ADN puede verse interrumpida por arreglos particulares de las regiones

ricas en GC del molde (dígase, apilamiento de bases GG), el cual ocurría con menor probabilidad e

involucraría menos bases en las condiciones de desplazamiento de banda, debido al limitado número

de bases abiertas delante de la polimerasa. La extensión mecánica de la hebra molde podría prevenir

el apilamiento de las bases, limitando de esta manera la entrada en el estado de pausa de corta du-

ración. De hecho, otros factores conocidos por afectar la estabilidad del ADN, tales como la betaína

y el aumento de la temperatura, también disminuyen la frecuencia de pausas en las regiones ricas en

GC durante la extensión del primer, para la de Phi29 y otras polimerasas de ADN, apoyando esta

hipótesis Mytelka and Chamberlin (1996); Schwartz and Quake (2009); Kim et al. (2010a).

Por el contrario, la apertura de la doble hebra limita la translocación hacia adelante, tanto de la

polimerasa salvaje como la mutante ddb, aunque de manera diferente: Las posiciones más estables

de la horquilla provocan una disminución de la velocidad de la polimerasa salvaje pero pausan el

avance de la polimerasa mutante. A pesar de estas diferencias, la inclusión de la cinética de pausas en

un modelo utilizado para cuanti�car el mecanismo de apertura de la doble hebra reveló que ambas

polimerasas desestabilizan activamente las dos bases mas próximas en la juntura (M = 2) con una

77

Capítulo 5 Discusión

energía de desestabilización ∆Gd = 2 kBT por par de bases, Figura 4.4. La extensión del modelo de

Betterton y Jullicher, Betterton and Julicher (2005), presentada en este trabajo señala la importancia

de considerar la cinética de pausas y puede ser aplicada a la cuanti�cación del mecanismo de apertura

de otros motores de ácidos nucleicos con actividad de desplazamiento de banda en los que se conoce

que la cinética de pausas es relevante o que se espera que estas ocurran durante su actividad, Cheng

et al. (2007); Sun et al. (2008); Kim et al. (2010a); Ribeck et al. (2010).

Para explicar las observaciones anteriores proponemos un modelo para el mecanismo de acoplamien-

to entre la apertura de la doble hebra y la replicación del ADN. La desestabilización activa de la

juntura, promovida por la polimerasa de ADN de Phi29 es probable que se deba a las interacciones

particulares ADN - polimerasa en la juntura de la doble hebra ya que, a diferencia de otras poli-

merasas, el dominio de los dedos no parece estar involucrado en la reacción de apertura de la doble

hebra Fisher et al. (2003); Yin et al. (2004); Singh et al. (2007). Adicionalmente, no existe evidencia

de interacción entre la hebra desplazada y la polimerasa o de la existencia de diferentes modos de

translocación entre las actividades de desplazamiento de banda y extensión del primer Kamtekar

et al. (2004); Berman et al. (2007). Estudios estructurales de polimerasas replicativas durante la ac-

tividad de extensión del primer, incluida la polimerasa de ADN de Phi29, muestran que durante la

replicación, la hebra molde se encuentra fuertemente doblada (aproximadamente 90º) en el interior

de la polimerasa Berman et al. (2007), Figura 5.1. En el caso de la polimerasa de ADN de Phi29,

esta torsión de la hebra molde en el interior de la proteína se mantendría durante la actividad de

desplazamiento de banda gracias a la estabilidad del complejo ADN - polimerasa, resultado del paso

de dos nucleótidos de la hebra molde por el interior del estrecho túnel formado entre los dominios

TPR2 y exo, Berman et al. (2007). Por otra parte, el pequeño tamaño del túnel (10Å) promovería la

exclusión esteárica de la hebra complementaria, probablemente forzando una torsión en la vecindad

de la entrada del túnel. Debido a las propiedades elásticas del ADN de cadena sencilla Smith et al.

(1996), el doblamiento de las dos hebras podría conllevar a la generación de estrés mecánico en la

juntura de la doble hebra, promoviendo su desestabilización en las condiciones de desplazamiento

de banda, Figura 5.1.

Nuestros datos muestran que el mecanismo activo de apertura de la doble hebra del mutante ddb

falla (Pausa Corta P2) en los pares de bases más estables (regiones ricas en pares de bases GC )

de la horquilla, los cuales se encontrarán cerrados con mayor probabilidad Leroy et al. (1988). La

78


m=0

Estado Activo

TúnelTPR2-exo

TorsiónNdelNMolde

Exclusiónestérica

Estrés Mecánico

3m

5m3m

5m

1)

m=0

Pausa Larga P23)

m>0

Estado Activo2)

3m

5m3m

f

f5m

3m

5m3m

5m

PerturbaciónNdeNlaNInteracciónNADN-Proteína

AperturaNdelNADN

f

f

pRescateNMecánicop

ReplicaciónN+NDesplazamientoNdeNBanda

Figura 5.1: Mecanismo de apertura del ADN propuesto. La �gura muestra una representación esquemática de

la polimerasa de ADN de Phi29 con el substrato de ADN durante la actividad de apertura de la doble hebra

Kamtekar et al. (2004). La proteína se muestra en dos niveles. El nivel superior contiene los dominios exo (verde),

TPR2 (azul) y pulgar (naranja). El resto de la proteína se muestra como un círculo gris. 1) y 2): La torsión de la

hebra molde en el túnel TPR2 -exo y la exclusión estérica de la hebra complementaria pudiera promover la apertura

de los primeros dos pares de bases (azul, OTRO COLOR) debido al estrés mecánico generado en la vecindad de la

juntura de la horquilla. La unión e hidrólisis de dNTPs potencia la translocación de la polimerasa hacia adelante.

3) Para el mutante ddb, el estrés mecánico en la juntura durante la apertura de las posiciones más estables de la

horquilla (donde m = 0) pudiera conllevar a la desestabilización de la interacción entre la hebra molde y el túnel,

favoreciendo la entrada al estado de Pausa Larga P2. La desestabilización de la horquilla, mediada por la tensión

externa (f ), favorece la apertura del ADN previniendo la entrada al estado inactivo de pausa larga y promoviendo

la salida de éste. En 2) y 3) se muestra la posición inicial de la horquilla en línea discontinua gris.

dependencia de tensión del rate de entrada al estado de pausa larga P2 en las posiciones de la

horquilla ricas en GC, da2GC = 0, 5 ± 0, 3 nm (Tabla 4.3), se encuentra dentro del margen de

error de la dependencia de tensión encontrada cuando se considera toda la secuencia (da2 = 0, 7 ±

0, 3 nm, Tabla 4.1). En nuestras condiciones experimentales, la distancia promedio entre nucleótidos

de ssDNA (entre 3 y 13 pN) es de 0, 25 nm (Figura( 4.3b)). Por tanto, un cambio conformacional

de 0, 5 nm es compatible con la ganancia de 2 nucleótidos de ssDNA a lo largo de la coordenada

mecánica, de�nida por la dirección de estiramiento. En otras palabras, la apertura de 1 pb previene

la entrada al estado de Pausa Larga P2. De hecho, de acuerdo con nuestro modelo, la dependencia de

tensión del rate de entrada al estado de pausa larga puede ser explicada si se considera exclusivamente

que la entrada a este estado ocurre cuando el siguiente par de bases en la horquilla se encuentra

79


cerrado (m = 0).

Las pausas de larga duración solo ocurren en el régimen de desplazamiento de banda, sugiriendo que,

al contrario de lo que se ha considerado en las ecuaciones anteriores, el rate de entrada a este estado

pudiera depender del número de pares de bases abiertos delante de la polimerasa, m. El escenario

más simple sería aquel en el que la entrada al estado de pausa P2 solo ocurriera cuando el siguiente

par de base se encuentra cerrado (m = 0), permitiendo la de�nición de un rate de entrada nuevo:

k̃a2GC (f) =ka2GC (f)

P0 (GC,m = 0, f)

donde P0 (GC,m = 0, f) = 1XGC ·L

∑pb(l+1)=GC P0 (l,m = 0, f). Este nuevo rate representa cuantas

veces la polimerasa entra en un estado de pausa larga P2 por tiempo sin pausa, en una posición

previa a un par GC cuando este se encuentra cerrado. El cálculo de este nuevo rate da k̃a2GC (0) =

0, 7± 0, 6 s−1 y d̃a2GC (0) = 0, 1± 0, 4 nm, indicando que cuando m = 0 el rate de entrada al estado

de pausa larga no presenta una dependencia de tensión signi�cativa. En otras palabras, nuestros

datos son compatibles con un modelo en el cual la entrada en el estado de pausa de larga duración

solo ocurre cuando el siguiente par de base en la juntura de la horquilla se encuentra cerrado.

Las mutaciones D12A y D66A en el dominio exo del mutante ddb utilizado en este trabajo presumi-

blemente perturban el arreglo especí�co de los dominios TPR2 y exo Perez-Arnaiz et al. (2009), lo

cual a su vez afectaría la estabilidad del túnel que encierra a la hebra molde. De acuerdo con nuestro

modelo, este defecto le pudiera impedir al mutante mantener el estrés mecánico en la juntura cuando

esta se encuentra cerrada, lo cual provocaría la pérdida de las interacciones correctas con el molde

y favorecería la entrada al estado inactivo de pausa de larga duración (Figura 5.1). Una vez en el

estado de pausa, la presión de la juntura impediría el retorno de la hebra molde a al dominio de

polimerización lo cual evitaría esta unión funcional y di�cultaría la salida del estado de pausa.

De acuerdo con esta hipótesis la polimerasa mutante podría salir del estado de Pausa Larga P2 sólo

cuando la juntura se encuentra abierta (m > 0) y la polimerasa tiene la oportunidad de recuperar

el control de la hebra molde. En efecto, el rate de salida del estado de pausa de larga duración, k2a,

presenta una dependencia de tensión muy fuerte, d2a = −0, 7 ± 0, 4 nm, (Tabla 4.1), compatible

con el cambio conformacional resultante de la ganancia de entre dos y cuatro nucleótidos de ssDNA

a lo largo de la coordenada mecánica, lo cual sugiere que la salida del estado de Pausa Larga P2

está promovida por la apertura mecánica de aproximadamente 2 pb de la juntura. De acuerdo con

nuestro modelo, la dependencia de tensión del rate de salida del estado inactivo de larga duración

80


puede explicarse cuando se considera que la salida solo ocurre cuando la juntura se encuentra abierta

delante de la polimerasa (m > 0). En este caso, podemos de�nir un nuevo rate,

k̃2a (f) =k2a (f)

1− P0 (GC,m = 0, f)

que representa cuantas veces la polimerasa sale de un estado de Pausa Larga P2 por tiempo sin pausas

cuando el siguiente par de bases está abierto. El cálculo de este nuevo rate da k̃2a (0) = 0, 14±0, 14 s−1

y d̃2a = −0, 2±0, 5 nm, indicando que cuandom > 0 el rate de salida de las pausas largas no depende

signi�cativamente de la tensión.

La polimerasa de ADN de Phi29 presenta una actividad de desplazamiento de banda más e�ciente

que otras polimerasas replicativas, tales como las de los bacteriófagos T4 y T7 o la procariota Pol III

Canceill et al. (1999); Yuan and McHenry (2009). Debido a que la interacción entre el dominio de

polimerización y la hebra molde en estas polimerasas es a través de un túnel abierto DoubliÃ© et al.

(1998); Franklin et al. (2001), es posible que al encontrarse un par de base cerrado en la juntura de

la horquilla, estas no puedan mantener la torsión de la hebra molde, lo cual impediría la progresión

de la actividad de polimerización (como ha sido observado en nuestros experimentos con el mutante

ddb). Por tanto, para poder replicar a través del ADN de doble cadena, estas polimerasas necesitan

trabajar en coordinación con sus respectivas helicasas que, mediante la exclusión esteárica de la

hebra adelantada (líder, conductora. ver traducción), aumentarían la probabilidad de apertura de

la juntura. El efecto combinado de la exclusión esteárica mediada por la helicasa y la fuerte torsión

inducida por la polimerasa en la hebra adelantada puede explicar la desestabilización e�ciente de la

juntura de la doble cadena durante la replicación del ADN.

En el caso de la polimerasa de ADN de Phi29 el túnel TPR2 - exo, que se anilla fuertemente a la he-

bra molde, le permite a esta proteína mantener tanto la torsión del molde como la exclusión esteárica

de la hebra complementaria en presencia de la juntura cerrada, promoviendo su desestabilización ac-

tiva. De hecho, la energía de desestabilización de la juntura (∆Gd = 2 kBT ) es aparentemente mayor

que las reportadas para helicasas de ADN hexaméricas, ∆Gd = 0, 05−1, 6 kBT Ribeck et al. (2010);

Johnson et al. (2007); Donmez et al. (2007); Lionnet et al. (2007) y polimerasas, ∆Gd = 1, 4 kBT

Kim et al. (2010b), estudiadas por separado. Estas características, además de la energía proveniente

de la hidrólisis e incorporación de dNTPs durante la replicación, le permitirían a la polimerasa de

ADN de Phi29 trabajar como un híbrido polimerasa-helicasa y acoplar e�cientemente las actividades

de replicación del ADN y apertura de la doble hebra en un mismo polipéptido.

81



Asimetría del efecto de la fuerza. Nuestros resultados muestran que la fuerza aplicada afecta de

manera diferente según sea favor o en contra de la dirección de translocación. En la con�guración a

favor la fuerza favorece la actividad ligeramente, mejorando la velocidad de replicación. Sin embargo,

la aplicación de fuerzas superiores a 20 pN provoca la pérdida de actividad. Curiosamente, esto no

signi�ca necesariamente la pérdida de la interacción ADNp-ADN.

Figura 5.2: Efecto de la fuerza en la estabilidad del complejo binario/terciario. La fuerza aplicada sobre la polime-

rasa y el AND (�echas azules) tiene diferentes efectos en la estabilidad del complejo ADNp-ADN según sea a favor

(Figura 5.2a) o en contra (Figura 5.2b) del movimiento. Un incremento de la fuerza, en la con�guración a favor,

provoca la pérdida del primer, lo que se traduce en la observación de una molécula híbrida de dsDNA y ssDNA

(fds (x) + fss (x)), en comparación con la molécula de dsDNA que se observa en el estado activo de polimerización

(fds (x)). En la con�guración de fuerza en contra no se observan cambios en la molécula anclada (en este caso

fds (x), terminada la actividad de extensión del primer) hasta que una fuerza muy alta rompe el enlace ADNp-

ADN . Figura 5.2c y Figura 5.2d Representación tipo cintas de la estructura de la polimerasa de Phi29 (Rodriguez

et al. (2005)). Las regiones donde se aplica la fuerza se muestran sombreadas en azul. La las �echas rojas señalan

la dirección de polimerización. Los dominios están representados con el mismo código de colores de la Figura 1.7.

El ADN modelado se muestra en la representación de esferas sólidas con los colores: cadena primer creciente en

gris, cadena molde en amarillo y cadena desplazada en verde.

Como ha sido reportado para la polimerasa de Phi29 (Ibarra et al. (2009)), la tensión mecánica en

82


el ADN promueve una actividad exo procesiva, presumiblemente debido a que altera la estructura

correcta del primer en el interior de la polimerasa y simula de esta forma la presencia de un nucleótido

incorrecto. La transición del estado pol al exo implica la transferencia intramolecular del primer,

pasando presumiblemente por un estado intermedio de polimerización sensible a tensión y unido

más débilmente al ADN. En nuestros experimentos, en la con�guración de fuerza a favor, es posible

que la tensión en el ADN, a partir de 20 pN tenga un efecto similar en la actividad de la proteína.

Sin embargo, en este contexto mecánico, un estado de unión débil al ADN sería incapaz de soportar

la tensión, provocando la pérdida del primer. Curiosamente, la gran estabilidad del túnel corriente

abajo del primer, permitiría que la proteína se mantuviera unida al ADN, Figura 5.2c. En esta

con�guración, al estirar la molécula de ADN, se observa un aumento de la distancia que puede ser

asociado a un deslizamiento del ADN por el interior de la polimerasa, Figura 5.2a.

En la con�guración de fuerza en contra, la fuerza tiene un efecto más marcado en la velocidad. En

los mismos primeros 20 pN la velocidad decae mucho más. Sn embargo, en esta con�guración, la

polimerasa es capaz de replicar en contra de 45 pN como promedio, a 50 µM , habiéndose observado

eventos de replicación en contra de 53 pN . Esta es una fuerza alta, comparada con la fuerza de aper-

tura mecánica del ADN (∼ 14 pN); la fuerza máxima que desarrolla el motor de empaquetamiento

viral de Phi29 (∼ 57 pN), que trabaja en contra de una alta presión interna al empaquetar el ADN

en el interior de la cápsida de forma cuasi cristalina y comparada con la fuerza máxima desarrollada

por polimerasas de ARN (15-25 pN) en contextos experimentales similares. Curiosamente, en esta

con�guración, sólo se pierde la interacción funcional cuando se rompe la unión entre el ADN y la

polimerasa (los múltiples enlaces dig-antidig han sido probados anteriormente y resisten fuerzas su-

periores a 80 pN y la interacción biotina-estreptavidina soporta tensiones aun mayores) y se pierde

por tanto el enlace, Figura 5.2b.

Es probable que los planos paralelos que forman las bases apiladas de la doble hélice de ADN corriente

arriba del sitio activo y la misma forma que tiene el sitio activo, provean de un asiento más estable

al aplicar una fuerza en contra, por lo que no se observa pérdida de actividad. Adicionalmente,

en esta con�guración el túnel corriente abajo impediría que el dúplex saliera del interior de la

proteína. Esto solo ocurriría a altas fuerza y provocaría la pérdida total de la unión del complejo

ADNp-ADN,Figura 5.2c. Estas observaciones sugieren que la base estructural para la unión fuerte

del complejo binario ADNp-ADN, se encuentra en el túnel corriente abajo y no en la región del

dúplex corriente arriba.

83


Mecanoquímica de la translocación El efecto de la tensión en el ADN en el rango de 0 a 25 pN

es el de linealizar el polímero. A partir de 30 pN , para describir correctamente la curva de fuerza

extensión del ADN de cadena doble hay que tener en cuenta a pérdida de helicidad. Adicionalmente,

en los experimentos de tensión en el ADN (Ibarra et al. (2009)) la tensión no parece afectar la

estructura del ADN en el interior de la polimerasa en el rango de 0 a ∼ 20 pN . Por otra parte

en nuestros experimentos, en la con�guración de fuerza a favor, la interacción funcional se pierde

de manera abrupta. Lo anterior hace suponer que en el rango de −20 a 20 pN , la polimerasa no

siente la deformación del ADN en su interior, por lo que la coordenada mecánica, en este rango, se

corresponde con la translocación de la proteína a lo largo de la cadena molde de ADN.

El ciclo de polimerización varía de una polimerasa a otra, pero tiene elementos comunes: Un paso

reversible de unión débil a nucleótido para seleccionar entre el correcto y el incorrecto, un paso

irreversible de unión fuerte, presumiblemente después de la transición de cierre de los dedos, un paso

de hidrólisis (irreversible) y un paso de liberación del producto pirofosfato (irreversible en nuestras

condiciones):

E : p/t + dNTP+1−1E : p/t : dNTP

2⇀ E′ : p/t : dNTP

3⇀ E′ : p+1/t : PPi

4⇀ E : p+1/t + PPi

El efecto de la fuerza en cada uno de estos pasos va a dar como resultado un comportamiento distinto

de los parámetros cinéticos con la fuerza. Nuestros datos indican que Vmax disminuye con la fuerza en

contra y Km aumenta. El hecho de que la constante de unión aparente aumente con la fuerza indica

que la fuerza está actuando como un competidor al proceso de unión a substrato. Sin embargo, la

velocidad máxima, Vmax disminuye con la fuerza, lo que indica que a concentraciones saturantes de

substrato no se corrige este efecto, como sería el caso si sólo el paso reversible de unión a substrato

dependiera de fuerza.

Enmarcados en el ciclo de polimerización, esta combinación de efectos sería compatible con que la

fuerza actúa en alguno de los pasos intermedios entre la unión débil a nucleótidos (no incluida) y

el paso irreversible de liberación de pirofosfato (no incluida). Por otra parte, el efecto de la fuerza

sobre el ciclo de polimerización, debido al diseño experimental, es exclusivamente sobre el paso que

genera movimiento. Esto implicaría que el paso que genera el movimiento es el paso de unión fuerte

a nucleótido y que cuando ocurre la hidrólisis la polimerasa ya ha translocado.

84

6 Conclusiones

1. Hemos desarrollado un sistema experimental basado en la técnica de pinzas ópticas, que per-

mite detectar, a nivel de moléculas individuales, el efecto que tiene la tensión desestabilizadora

en la juntura de la doble hebra y la secuencia del ADN en las actividades de extensión del

primer y desplazamiento de banda de la polimerasa de ADN de Phi29 salvaje y un mutante

de�ciente en desplazamiento de banda.

2. Durante el proceso de desplazamiento de banda, la apertura de la doble hebra es el paso

limitante y dependiente de fuerza de la reacción, el cual limita moderadamente el avance

a través de la horquilla de la polimerasa salvaje y fuertemente el avance del mutante. Se

detectaron pausas cortas con características similares en las actividades de extensión del primer

y desplazamiento de banda de la polimerasa salvaje y en la de extensión del primer de la

polimerasa mutante, lo que sugiriere que la naturaleza del estado inactivo de corta duración es

el mismo para ambas polimerasas y está relacionado con el ciclo bioquímico de replicación. La

apertura de las regiones más estables de la horquilla (mayor concentración de pares de bases

GC) ralentiza la translocación de la polimerasa salvaje y promueve la entrada del mutante en

un estado de pausa de larga duración.

3. Hemos extendido la descripción física de Betterton y Jullicher para cuanti�car la actividad de

apertura de la doble hebra de la polimerasa salvaje y del mutante de�ciente en desplazamiento

de banda incluyendo la cinética de pausas observada. El ajuste del modelo a la dependencia en

fuerza y secuencia de la velocidad de replicación de las polimerasas salvaje y mutante reveló

que ambas enzimas utilizan el mismo mecanismo activo de apertura de la doble hebra: la

polimerasa desestabiliza al menos dos pares de bases en la juntura con una energía por par de

bases de ∆Gd = 2 kbT .

4. Hemos desarrollado un sistema experimental basado en la técnica de pinzas ópticas, que permi-

te inmovilizar a la polimerasa de Phi29 en una super�cie y detectar la actividad de replicación

85

Capítulo 6 Conclusiones

mientras se aplican fuerzas directamente sobre la polimerasa en las direcciones a favor y en

contra del movimiento y a diferentes concentraciones de dNTPs.

5. Hemos encontrado que la velocidad catalítica máxima, Vmax, disminuye y la constante de

unión de nucleótidos aparente, Km, aumenta con la fuerza en contra de modo que la constante

efectiva de unión, kb = Vmax/Km, también disminuye con la fuerza en contra. Estos resultados

indican que el paso dependiente de fuerza en el ciclo de polimerización está relacionado con el

proceso de unión de nucleótido y no con el de liberación de pirofosfato.

86

Agradecimientos

En estos momentos toca hacer recuento de estos años y de todas las personas e instituciones que han

aportado a la consecución de esta tesis. Es imposible mencionar a todos, pero sí me gustaría decir que

con todas las personas con las que he interactuado en este período, ya sea directamente relacionadas

con mi trabajo o simplemente porque hemos coincidido en espacio, he tenido una relación siempre

positiva.

Quiero agradecer explícitamente a mis directores de tesis, Borja Ibarra y José L. Carrascosa. Espe-

cialmente a Borja, por todo, por la paciencia, por enfocar los esfuerzos, por la certeza del camino a

seguir y por enseñarme lo que signi�ca el método cientí�co.

Quiero agradecer también a los colaboradores con que hemos contado en la realización de este

trabajo. Al grupo de Margarita Salas y en especial a José Mari Lázaro, del CBMSO-CSIC, por

cedernos amablemente las muestras con las que se realizó esta tesis. A nuestro colaborador Fran

J. Cao, del departamento de Física Atómica, Molecular y Nuclear de la Universidad Complutense

de Madrid, por su aporte a la compresión y cuanti�cación de los problemas que hemos tratado y

de manera particular, por las interminables y muy estimulantes discusiones de física. A José M.

Valpuesta, del CNB-CSIC por su apoyo a la construcción de las pinzas ópticas. A Stephan Grill del

Instituto Max Plank de Biología Celular y Genética por permitirnos utilizar su sistema de pinzas

ópticas de alta resolución. A Ricardo Arias por ser un apoyo y por introducirme en el mundo del

instrumento de pinzas ópticas. Al departamento de instrumentación del CNB, especialmente a Carlos

por su ayuda en el mantenimiento del equipo.

Me gustaría mencionar a los miembros del grupo de pinzas ópticas: Elías, Rebeca, Adriana y es-

pecialmente a Silvia, por estar ahí en el día a día del laboratorio. Al grupo de Fernando Moreno,

especialmente a Benjamín, Carolina y Maru por hacer piña alrededor del tema de single molecule

en los seminarios de grupo. A todos los integrantes del S0 y S1 que siempre han tenido una cara

amable que ofrecer. A las personas del S5, del despacho, J.R. Castón, Dani Luque y especialmente

a Jaime, capaz de sacarme una sonrisa aun en los momentos más agobiantes. A los compañeros de

87

Agradecimientos

poyata, Ana, Mariana y Carlos, por la música, las bromas y en general por hacer del ambiente de

trabajo un lugar placentero.

A los amigos, por las comidas, las barbacoas y por estar ahí en los momentos difíciles. A Álvaro y

Amy, por su atención y cariño para con un recién llegado a un país extranjero. A Elena, por los

cigarros. . . y lo que se habla en los cigarros. A Jorge, por su apoyo leal y siempre constructivo. A

Srdja simplemente por �estar � un buen amigo y �ser � siempre ahí y a Mateja, por su complicidad.

A Josué, por ser un buen compañero de viaje y no dejarme olvidar mi parte cubana, a pesar de

sus gustos deportivos. A Sara, por ser mi pareja de baile, siempre atenta a los estudios teóricos. A

David, Djorge y Milena, Bego y Pedro.

Finalmente, quiero agradecer al Instituto Madrileño de Estudios Avanzados en Nanociencia (IMDEA

Nanociencia) por la �nanciación otorgada para la realización de esta tesis doctoral. Al CNB-CSIC

por proporcionar el soporte material con el que se ha realizado esta investigación. A la Organización

Europea de Biología Molecular (EMBO) por concederme una beca de tres meses (ASTF 276 � 2012)

para ir al MPI-CBG. Al proyecto CEAC por concederme, en colaboración con el CSIC, un año de

entrenamiento previo a la realización de esta tesis.

A mis padres, artí�ces silenciosos de lo que soy hoy. A Lari y Mauro, por ser la razón por la que me

levanto todos los días.

88

Capítulo 7 Anexos

7 Anexos

7.1. Ensayo bioquímico de actividad de polimerización,

exonucleólisis y desplazamiento de banda de la polimerasa de

Phi29 etiquetada con biotina en el extremo amino-termial.

7.1.1. Ensayo acoplado de polimerización/exonucleólisis (pol/exo).

Figura 7.1: Ensayo acoplado de polimerización/exonucleólisis (pol/exo). Una molécula de dsDNA (15bp) marcada

con 32P con extremo protuberante de 6 nucleotidos se usó como substrato para la polimerización dependiente de

ADN. La mezcla de incubación contiene, en un volumen de 12,5 ul, 50 mM Tris�HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl2, 1

mM DTT, 4% (v/v) glycerol, 0.1 mg/ml albúmina del serum bovino (BSA), 1.2 nM del dsDNA etiquetado en el

extremo 5´, 30.3 nM de la polimerasa salvaje o biotinilada de Phi29 y las concentraciones crecientes de los cuatro

dNTPs indicadas. Después de incubar a 25ºC por 10 min, la reacción fue detenida añadiendo EDTA hasta una

concentración �nal de 10nM.Las muestras fueron analizadas por autoradiografía después de electroforesis en gel de

acrilamida al 20% con 8 M de urea. La polimerización o la exonucleólisis en la dirección 3'-5' se detecto como una

aumento o disminución, respectivamente, en el tamaño del (15mer) primer marcado en el extremo 5' con 32P.90

7.2 Determinación de las energías de enlace entre pares de bases AT y GC.

7.1.2. Ensayo de desplazamiento de banda acoplado a la replicación del ADN M13.

Figura 7.2: Desplazamiento de banda acoplado a la replicación del ADN M13. La mezcla de reacción contiene, en

un volumen �nal de 25 ul, 50 mM Tris�HCl (pH 7.5), 1 mM DTT, 4% (v/v) glicerol, 0.1 mg/ml albúmina del serum

bovino (BSA), 10 mM MgCl2, 40ul de cada uno de los cuatro dNTPs, [α-32P]dATP (1 μCi), 4.2 nM de M13 ssDNA

con un solo primer y 16.8 nM de la polimerasa salvaje o biotinilada de Phi29. Después de incubar a 25ºC durante el

tiempo indicado, la reacción fue detenida añadiendo EDTA hasta una concentración �nal de 10nM y SDS a 0.1%

(w/v). Después de �ltrar a través de una columna giratoria Sephadex G-50, se determinó la radiación �erenkov del

volumen excluido para calcular los valores de actividad relativa. Para el análisis de tamaño, el ADN etiquetado fue

desnaturalizado mediante un tratamiento con 0.7 M NaOH y sometido a electroforesis en gel de agarosa alcalina

0.7% (w/v) y posteriormente las muestras fueron analizadas por autoradiografía. La posición indicada, en unidades

de la longitud del ADN de M13 (7250 bp), de la migración se detectó mediante tinción con bromuro de etidio.

7.2. Determinación de las energías de enlace entre pares de bases

AT y GC.

A partir de las curvas experimentales de apertura mecánica de la doble hebra (en ausencia de la

polimerasa), se determinaron las energías de enlaces promedio para los pares de bases AT y GC

mediante el ajuste de estas a un modelo, basado en mecánica estadística del equilibrio. El modelo

describe la fuerza que experimenta la microesfera en la trampa óptica en función de la distancia entre

91

Capítulo 7 Anexos

ambas microesferas, xexp, en la con�guración geométrica típica de estos experimentos, Figura 7.3a,

a partir de la función de partición Huguet et al. (2010); Bockelmann et al. (1997, 1998):

Z (x0) =∑

j,d exp(−ETot(j,d,x0)

kBT

)(7.1)

determinada por la energía libre, ETot (j, d, x0) = Epb (j) + 2Eext (j, d) + Etrampa (j, d, x0) como

función del estado del sistema, determinado éste por el número de bases abiertas, j (pares de bases,

pb), la extensión entre extremos de la molécula de ADN abierta, xss (d) (nm), y la distancia entre la

posición de equilibrio de la microesfera en la trampa óptica y la posición de la microesfera localizada

en la micropipeta, x0. kB es la constante de Boltzmann y T la temperatura absoluta.

La energía necesaria para separar las dos hebras de la doble hélice (Epb (j)) incluye las contribuciones

de las energía de apareamiento, apilamiento y reordenamiento de las bases, así como la interacción

de cada par de bases con sus vecinos más próximos, Huguet et al. (2010). Por simplicidad hemos

considerado este término sólo dependiente de la identidad del par de bases, introduciendo los valores

efectivos de las energías de apareamiento de un par AT (EAT ) y GC (EGC) como parámetros de

ajuste en el modelo: Epb (j) =∑j

i=1Epb (i), siendo Ebp (i) = EAT o Ebp (i) = EGC según se

trate de un par de bases AT o GC.

La segunda contribución se debe a la energía elástica almacenada en las hebras de ADN de cadena

sencilla liberadas progresivamente durante el proceso de apertura: Eext (j, d) = f (xss (d))xss (d) −

j´ f

0 df′xss (f ′), siendo f (xss (d)) la característica fuerza-extensión promedio por nucleótido para el

ADN de cadena sencilla. Esta magnitud se determinó experimentalmente, Figura 4.3 y en el cálculo

de Eext se despreció la contribución a la extensión total debida a la molécula espaciadora de doble

hebra entre la microesfera atrapada y el inicio de la horquilla, Figura y MM.

La tercera contribución corresponde a la energía elástica de la trampa óptica, modelada con un

potencial cuadrado Jahnel et al. (2011): Etrampa (j, d, x0) = 12ktot · (x0 − 2jxss (d))2, siendo ktot

(pN/nm) la constante elástica efectiva de la trampa, Figura 7.3a.

A partir de la función de partición (Ecuación 7.1) es posible calcular la fuerza de equilibrio, f teo,

para el proceso de apertura mecánica según:

< f teo >=

∑j,d−ktot · (2jxss (d)− x0) · exp

[−ETot(j,d,xo)

kBT

]Z (x0)

(7.2)

Los valores de EAT y EGC que mejor se ajustan a las curvas experimentales se determinaron mini-

92

7.2 Determinación de las energías de enlace entre pares de bases AT y GC.

x0

(a)

0,60,50,40,30,20,10,0

20

18

16

14

12

10

6

8

Ten

sión

(pN

)

Distancia (μm)

f teof exp

100 200 300 4000 500

% G

C

Posición en el Molde (nucleótidos)

(b)

100

80

60

40

20

0

120

1,61,41,21,00,8 1,8 2,0

EAT (kBT)

Conteos

(c)

40

20

04,54,03,53,02,5

Conteos

EGC (kBT)(d)

Figura 7.3: Determinación de las energías de enlace entre pares de bases AT y GC . 7.3a: Representación esque-

mática (no a escala) y notación del modelo utilizado para calcular el patrón de fuerza-extensión del proceso de

apertura mecánica de la doble hebra en nuestras condiciones experimentales. La respuesta mecánica del sistema

molecular anclado entre las microesferas atrapada ópticamente y sujeta en la micropipeta depende de el número de

pares de bases abiertos, j, de la característica fuerza-extensión de la porción de ADN de cadena sencilla liberada

progresivamente (j · .xss (f)) y de la desviación de la microesfera en la trampa óptica con respecto a su posición de

equilibrio, x0− 2 · j · xss (f). 7.3b: Curvas de fuerza-extensión experimentales (negro, Nexp = 5) y predichas por el

modelo, con distintas combinaciones de EAT y EGC , (naranja, Nteo = 10) de un total de Nexp = 44 y Nteo = 662.

El patrón presenta picos espaciados que concuerdan con las regiones ricas en pares GC de la horquilla (interior,

azul, cálculo en una ventana de X nueclótidos). 7.3c: Histograma de los valores de EAT seleccionados según el

criterio DCM ≤ 0, 3 pN2 (Ecuación 7.3). El ajuste a la función gaussiana (rojo, R2 = 0, 991) revela una media

de EAT = 1, 44 kBT y una desviación estándar de σEAT = 0, 17 kBT . 7.3d: Histograma de los valores de EGC

seleccionados según el criterio DCM ≤ 0, 3 pN2 (Ecuación 7.3). El ajuste a la función gaussiana (rojo, R2 = 0, 98)

revela una media de EGC = 3, 23 kBT y una desviación estándar de σEGC = 0, 52 kBT . 7.3c y 7.3d: La escala del

eje de las abscisas se corresponde con el rango de valores simulados en cada caso.

93

Capítulo 7 Anexos

mizando la desviación cuadrática media entre las curvas experimentales (fexpi ) y las curvas teóricas

f teoi (EAT , EGC , ktot):

DCM =1

N

N∑i=1

(fexpi − f teoi (EAT , EGC , ktot)

)2 (7.3)

donde N es el total de puntos experimentales y simulados.

El espacio de parámetros fue muestreado de manera homogénea (NC ∼ 5887 combinaciones) para

valores de EAT entre 0, 50 y 2, 46 kBT y EGC entre 2, 50 y 4, 46 kBT , Johnson et al. (2007); Cocco

et al. (2001); Strick et al. (1999), con un paso de 0, 07 kBT . Los valores de la constante elástica

efectiva de la trampa óptica (ktot) se seleccionaron de acuerdo con el orden de magnitud de los valores

experimentales observados en experimentos individuales, en un rango entre 0, 1 y 0, 4 pN/nm con un

paso de 0, 05 pN/nm. Las curvas teóricas fueron comparadas con curvas experimentales individuales

(Nfexp = 44) alineadas previamente (Figura 7.4) y se seleccionaron aquellas con un valor de DCM

menor que 0, 3 pN2. Los valores obtenidos de EAT = 1, 44 ± 0, 17 kBT y EGC = 3, 23 ± 0, 52 kBT

están en concordancia con los reportados en otros estudios con condiciones experimentales similares

a las nuestras Johnson et al. (2007).

La discrepancia entre las curvas teóricas y experimentales (acentuada en el último pico, Figura 7.3b)

se puede explicar teniendo en cuenta que en el modelo no se han considerado las interacciones entre

vecinos más próximos. Debido a que la secuencia de la horquilla contiene pares de bases GC aislados

a lo largo de las regiones ricas en AT y pares de bases GC agrupados, el procedimiento de ajuste

es incapaz de reproducir ambas situaciones, observándose la mayor discrepancia en la barrera de

12 GC s (existen más regiones con pares aislados que agrupados). Esta desviación conlleva a una

subdeterminación de EGC , la cual es más importante en las barreras de GC. Este comportamiento

también explica la forma más dispersa del histograma de EGC , (σEGCσEAT

∼ 3).

Alineamiento de las curvas experimentales de apertura mecánica Previo a la comparación con

las curvas generadas con el modelo, las curvas experimentales de apertura mecánica fueron alineadas

entre sí. La dispersión entre diferentes curvas proviene de tres causas fundamentales: i) En el proceso

de unión de la molécula a la microesfera inmovilizada en la micropipeta, diferentes puntos de unión

generan curvas ligeramente desplazadas entre sí; ii) el efecto no homogéneo que tienen las variaciones

en la concentración de sales en el tampón sobre la elasticidad de la molécula de ssDNA genera

curvas que, a pesar de tener todos los elementos que identi�can la horquilla diseñada (Figura 4.1b),

94

7.3 Modelo de Betterton y Julicher

0,50,40,30,20,10,0

20

18

16

14

12

Ten

sión

(pN

)

Distancia (μm)(a)

0,50,40,30,20,10,0

20

18

16

14

12

Distancia (μm)

Ten

sión

(pN

)

(b)

Figura 7.4: Alineamiento de las curvas experimentales de apertura mecánica de la doble hebra. El proceso de

alineamiento selecciona, de un conjunto de ∼ 30000 curvas modi�cadas a partir de cada curva experimental (Nexp =

44), aquella que minimiza la Ecuación 7.3. 7.4a: Selección de 15 curvas experimentales antes de aplicar el proceso

de alineamiento. En rojo y azul se señalan las curvas más separadas entre sí. 7.4b: Resultado del procedimiento de

alineamiento.

presentan longitudes �nales diferentes y iii) las variaciones, entre experimentos independientes, de

la constante elástica efectiva de la trampa óptica provoca que tanto la altura como el ancho de los

picos característicos varíe entre experimentos, Bockelmann et al. (1997, 1998); Huguet et al. (2010).

Para corregir estos efectos, se determinaron, a partir de las curvas experimentales, fexpj , curvas

modi�cadas fexp−modij según la expresión: fexp−modij (xi) = fexpj (xi) con xi = xj + g (i) · xj + h (i),

donde xj contiene los valores de las abscisas experimentales y xi los modi�cados según un factor

de escala g (i) y un factor de desplazamiento h(i). Los valores de tensión no fueron alterados. La

elección de este procedimiento de modi�cación permite aplicar desplazamientos puros (g (i) = 0),

escalados puros (h (i) = 0) así como escalados crecientes a lo largo de la curva (g (i) 6= 0). Para cada

curva experimental se seleccionó aquella modi�cada que minimiza la Ecuación 7.3 con respecto a un

molde preseleccionado. Como molde, se utilizó primeramente una curva experimental arbitraria y

posteriormente el promedio de todas las experimentales.

7.3. Modelo de Betterton y Julicher

Durante el ciclo de replicación del ADN la polimerasa se mueve hacia adelante con un rate k+, pro-

pulsada por la energía obtenida de la unión, hidrólisis e incorporación del nucleótido complementario

95

Capítulo 7 Anexos

al que encuentra a su paso. En las condiciones de desplazamiento de banda, para poder avanzar, es

necesario que uno o varios pares de bases de la doble hebra que encuentra a su paso se abran. Este

proceso pudiera ser independiente de la polimerasa o por el contrario pudiera estar favorecido por

la interacción entre la juntura y la enzima. La velocidad de replicación global, si no consideramos el

efecto de las pausas, viene dada por: ka (l, f) =∑L−l

m=0 k+ (l,m, f) · P0 (l,m, f) donde k+ (l,m, f) es

el rate de translocación de la polimerasa hacia delante cuando esta se encuentra en la posición l de

la hebra molde, m bases se encuentran abiertas delante de ella y la tensión aplicada en el ADN es

f . P0 (l,m, f) es la probabilidad de encontrar a la polimerasa en el estado con valores l, m y tensión

aplicada f y L es la longitud del substrato. Esta magnitud está determinada por la energía de Gibbs

∆G (l,m, f) necesaria para abrir m pares de bases por delante de la posición l del molde:

P0 (l,m, f) =exp [−∆G(l,m,f)/kBT ]∑L−lm=0 exp [−∆G(l,m,f)/kBT ]

(7.4)

estando ∆G compuesta por tres contribuciones:

∆G (l,m, f) =l+m∑i=l+1

∆Gpb (i)− 2m

ˆ f

0xss(f ′)df ′ −

m∑i=1

∆Gint (l, i, f)

i. La energía de apareamiento de las m bases abiertas, ∆Gpb.

ii. La tensión desestabilizadora externa aplicada sobre la juntura: ∆Gf = 2m´ f

0 xss (f ′) df ′.

iii. La energía de interacción entre la polimerasa y la juntura de la doble hélice ∆Gint.

Mecanismo de apertura pasivo El modelo pasivo asume que la polimerasa no interactúa con los

pares de base en la juntura, aumentando la probabilidad de que estos se abran, i.e., ∆Gint = 0. Por

el contrario, la enzima espera a que el par de bases se abra de manera espontánea para avanzar y de

esta manera estabilizar la posición translocada. En este caso, el rate al que se da un paso de longitud

δ viene dado por:

k+ (l,m, f) =

0, m < δ

k0, m ≥ δ

siendo k0 la velocidad de replicación en la actividad pol. El modelo pasivo no ajusta los datos

obtenidos para ninguna de las polimerasas en estudio.

96

7.4 Artículos publicados durante el periodo de tesis

Mecanismo de apertura activo Un modelo activo, asume que existe una interacción entre la

polimerasa y la juntura de la doble hélice en frente de su posición, dentro de un rango de longitud

M (pares de bases), i.e, ∆Gint(l,m, f) para 0 < m ≤ M . En particular, siguiendo el criterio de

Johnson et al:

∆Gint (l,m, f) =

∆Gd, 0 < m ≤M

0, m > M

donde ∆Gd parametriza la intensidad de la interacción e implica:

m∑l=1

∆Gint (l,m, f) =

m ·∆Gd, 0 < m ≤M

M ·∆Gd, m > M

La interacción entre la polimerasa y la juntura, además de aumentar la probabilidad de apertura

de la juntura, implica una reducción en la velocidad de translocación hacia adelante de la enzima,

según:

k+ (l,m, f) =

0, m < δ

k0 · exp [−a·min(M,δ)·∆Gd/kBT ] , δ ≤ m < max (M, δ)

k0 · exp [−a·(M+δ−m)·∆Gd/kBT ] , max (M, δ) ≤ m < M + δ

k0, M + δ ≤ m

donde a (0 < a < 1) es un coe�ciente adimensional determinado por localización relativa de la

barrera de activación del proceso de dar un paso.

7.4. Artículos publicados durante el periodo de tesis

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Capítulo 7 Anexos

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Nomenclatura

ADN Acido Desoxiribnucléico

db Desplazamiento de Banda

ddb De�ciente en Desplazamiento de Banda

DMP Dimetil pimelimidato dihidrocloruro

dNTP deoxy Nucleotido Tri Fosfato

nt Nucleótidos

pb Pares de bases

PBS Tampón fosfato salino

pol Polimerización

ssADN ADN de cadena sencilla

wlc Worm Like Chain

109

Estudio a nivel de moléculas individuales de la actividad ...

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