Facultad de

Ciencias Exactas y

Naturales

Modificación de moléculas con actividad biológica mediante

biocatálisis

Lucas E. Braun

- 2013 -

PREFACIO

Esta Tesina es presentada como parte de los requisitos para optar al grado Académico de

Licenciado en Química, de la Universidad Nacional de La Pampa y no ha sido presentada

previamente para la obtención de otro título en esta Universidad ni en otra Institución

Académica. Se llevó a cabo en el Laboratorio de Biocatálisis, dependiente de INCITAP-

CONICET- Departamento de Química-FCEyN-UNLPam durante el período comprendido

entre noviembre de 2010 y Febrero de 2013, bajo la codirección de la Dra. Laura

Mazzaferro y la dirección del Dr. Javier D. Breccia.

Santa Rosa, Febrero de 2013 Lucas E. Braun

Agradecimientos

En las siguientes líneas, deseo dar las gracias a quienes de alguna manera han colaborado

en la realización de este trabajo, tanto por sus aportes científicos como humanos.

En primer lugar a la Universidad Nacional de La Pampa (UNLPam), por otorgarme el lugar

físico y los conocimientos necesarios para llevar a cabo este trabajo.

Al personal docente y técnico del Departamento de Química de la FCEyN (UNLPam) por su

colaboración.

Al Director y Co-Directora del presente trabajo.

A mis compañeros de laboratorio, presentes y pasados, por su solidaridad.

A mis amigos por el aguante.

A Daniela por el día a día.

A mi familia por estar siempre.

Contenidos

RESUMEN 1

ABSTRACT

2

INTRODUCCIÓN

1. GLICÓSIDOS BIOACTIVOS 3

2. ENZIMAS CARBOHIDRATO-ACTIVAS COMO HERRAMIENTAS PARA LA GLICOSILACIÓN 4

3. COMPUESTOS POLIFENOLICOS COMO ACEPTORES GLICOSIDICOS 7

4. OBJETIVOS 9

MATERIALES Y MÉTODOS

1. REACTIVOS QUÍMICOS 10

2. SOLUCIONES STOCK 10

3. MEDICIÓN DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA 10

4. SELECCIÓN DE ACEPTORES 10

5. SÍNTESIS DE RUTINÓSIDOS 11

6. CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA 11

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

1. ESPECIFICIDAD DE LA CATALIZADOR α-RAMNOSIL-β-GLUCOSIDASA CON DIFERENTES

ACEPTORES BIOACTIVOS

12

2. RUTINOSILACIÓN DE HIDROQUINONA 14

3. ESTABILIDAD QUÍMICA DEL ACEPTOR HIDROQUINONA 15

4. CONCENTRACIÓN DEL CATALIZADOR Y LA CINÉTICA DE TRANSGLICOSILACIÓN A

DISTINTOS VALORES DE PH

16

5. AGREGADO DE CO-SOLVENTES MISCIBLES EN AGUA 17

6. EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE HIDROQUINONA EN LA SÍNTESIS DE

HIDROQUINONA RUTINÓSIDO

18

CONCLUSIONES

19

REFERENCIAS

20

RESUMEN

En esta tesis se estudió la capacidad de transglicosilación del catalizador fúngico α-

ramnosil-β-glucosidasa sobre distintos fármacos –clindamicina, metronidazol, epinefrina,

hidroquinona y rifampicina–. Estos se eligieron por la presencia de oxidrilos aceptores en

posiciones primaria, secundaria y también fenólicos. Utilizando hesperidina como donor

del disacárido rutinosa, el catalizador fue capaz de glicosilar hidroquinona en solución

acuosa.

La síntesis de hidroquinona rutinosilada alcanzó la máxima conversión de sustrato (10%)

luego de 24 h, por lo que se aplicó un diseño factorial para optimizar las variables del

proceso de biocatálisis.

La hidroquinona se oxida fácilmente a p-benzoquinona en solución acuosa neutra, por lo

que se midió su estabilidad a diferentes valores de pH. Se encontró que la formación de p-

benzoquinona fue baja a pH ligeramente ácido (pH ≤ 6,0), por lo que se estudió la cinética

de transglicosilación en el rango de pH (4,0-6,0), donde se obtuvo la mayor conversión de

sustrato a pH 5,0. El incremento de 5 veces la concentración del catalizador (0,011 U/g de

hidroquinona) permitió establecer un máximo de producción de hidroquinona rutinósido

luego de 1-2 h de reacción a 30°C.

La presencia de co-solventes (dimetilformamida y dimetilsulfóxido) en el rango de

concentración de 0-5%v/v, incrementaron el rendimiento, mientras que concentraciones

mayores al 10%v/v fueron deletéreas para la reacción. Cuando se ensayaron diferentes

concentraciones de aceptor, el mayor rendimiento se alcanzó con una concentración inicial

de hidroquinona de 36 mM.

Gracias a la optimización realizada en este trabajo se obtuvo un incremento de 47,5 veces

en la productividad del proceso de biocatálisis.

ABSTRACT

In this thesis we studied the ability of the catalyst transglycosylation fungal α-rhamnosyl-

β-glucosidase on different drugs, clindamycin, metronidazole, epinephrine, hydroquinone

and rifampicin. These were chosen because of the presence of hydroxyl positions acceptors

primary, secondary and phenolic. Using hesperidin as rutinose disaccharide donor, the

catalyst was able to glycosylate hydroquinone in aqueous solution.

Rutinosilada hydroquinone synthesis reached maximum substrate conversion (10%) after

24 h, therefore factorial design was applied to optimize the biocatalytic process variables.

Hydroquinone is easily oxidized to p-benzoquinone in neutral aqueous solution, so that its

stability was measured at different pH values. It was found that the formation of p-

benzoquinone was low at slightly acid pH (pH ≤ 6.0), so that transglycosylation Kinetics in

the pH range (4.0-6.0), which yielded higher conversion of the substrate to pH 5.0. The

increase of 5 times the concentration of catalyst (0.011 U / g of hydroquinone) allowed

production set up rutinoside hydroquinone after 1-2 h of reaction at 30 ° C.

The presence of co-solvents (dimethylformamide and dimethylsulfoxide) in the

concentration range of 0-5% v/v, increased yield, while concentrations greater than 10%

v/v were deleterious to the reaction. When tested different concentrations of acceptor, the

highest yield was achieved with an initial concentration of 36 mM hydroquinone.

Thanks to the optimization performed in this study there was an increase of 47.5 times in

the biocatalysis process productivity.

Introducción

1. GLICÓSIDOS BIOACTIVOS

Muchos productos naturales biológicamente activos contienen carbohidratos en su

estructura. En algunos casos, el residuo glicosídico es crucial para su actividad; en otros, la

glicosilación altera los parámetros farmacocinéticos (Toshima, 2006). Como ejemplo,

podemos citar los bioflavonoides los cuales son metabolitos secundarios de las plantas,

pertenecientes al grupo de los polifenoles, se hallan en la mayoría de los alimentos como

glicósidos y como tales son parte de la dieta humana (Robards & Antolovich, 1997). Estos

son potentes antioxidantes, scavengers de radicales libres y quelantes de metales, y

exhiben numerosas actividades fisiológicas como, antiinflamatorios, antialérgicos,

anticarcinogénicos, entre otras (Robards & Antolovich, 1997).

Los desarrollos recientes en glicobiología molecular han permitido comprender mejor las

actividades de glicósidos y sus correspondientes agliconas; basados en estos

descubrimientos es posible desarrollar nuevas glicodrogas, más activas o más efectivas

(Bojarová & Kren, 2009; Kren & Martinková L. 2001)

La glicosilación se utiliza frecuentemente para la modificación estructural de compuestos

con actividad biológica, obteniéndose en ciertos casos productos con modificaciones en sus

propiedades. Sin embargo, es prácticamente imposible definir un patrón general de las

actividades biológicas de los glicósidos en comparación con sus respectivas agliconas. En

algunos casos, la introducción de un residuo glicosídico aumenta la solubilidad de

compuestos hidrofóbicos, lo que influye principalmente en su transporte a través de

membranas. En otros casos, las moléculas glicosiladas son menos lábiles que sus

agliconas. Tal es el caso del ácido ascórbico, una vitamina muy sensible, cuyo

almacenamiento a largo plazo se logró mediante la síntesis de un derivado glucosilado

(Yamamoto et al., 1990). Y por último pero, no menos importante, ha sido posible modular

el espectro de actividad de los antibióticos glicopéptidos mediante la variación de su

fracción glicosídica (Kren y Rezanka, 2008).

Con este escenario, la síntesis eficiente de glicoconjugados se está volviendo cada vez más

importante en el campo de la química orgánica y biológica (Toshima, 2006).

2. ENZIMAS CARBOHIDRATO-ACTIVAS COMO HERRAMIENTAS PARA LA

GLICOSILACIÓN

Los compuestos químicos con estructuras complejas y múltiples grupos hidroxilos

requieren del uso de reacciones altamente selectivas para su modificación química.

Frecuentemente requiere numerosas etapas de protección y desprotección de grupos

funcionales y el uso de metales pesados como catalizadores (Papanikolaou, 2001;

Perugino et al., 2004). La manipulación de los grupos protectores es necesaria para la

obtención de compuestos puros en vez de una mezcla anomérica (Perugino et al., 2004).

Dado que las enzimas son capaces de producir sustancias anoméricamente puras en una

sola etapa, dadas su estéreo y regioespecificidad, son consideradas cada vez más como una

clase útil de catalizadores para síntesis orgánica (van Rantwijik et al. 1999). Los

inconvenientes que se presentan en la síntesis química pueden ser evitados por la síntesis

enzimática (Ichikawa et al., 1992). Los procesos biocatalíticos pueden alcanzar altas

velocidades en condiciones suaves de temperatura, presión y pH, con la consiguiente

disminución del gasto de energía y producción de desechos. Esto implica que pueden

constituirse en tecnologías sustentables y compatibles con el ambiente (Cherry &

Fidantsef, 2003).

Los oligosacáridos y derivados pueden obtenerse por hidrólisis de polisacáridos o por

síntesis a partir de azúcares pequeños o glicósidos usando glicosiltransferasas o

glicosidasas (GH):

Glicosiltransferasas. Las glicosiltransferasas (EC 2.4.x.y) son las enzimas responsables de

la biosíntesis de los oligosacáridos y glicósidos en los organismos vivientes. Las mismas

catalizan la síntesis de uniones glicosídicas de una manera regio- y estereo-selectiva con

alto rendimiento. Sin embargo, éstas no han sido usadas ampliamente in vitro dado que se

requieren reactivos fosforilados –como UDP- demasiado costosos (van Rantwijk et al.,

1999; Liese et al., 2000).

Glicosidasas o glicosilhidrolasas. Las glicosidasas (EC 3.2.1.-) son enzimas hidrolíticas

que catalizan la ruptura de uniones glicosídicas. Si bien in vivo dichas enzimas operan en

una vía catalítica, in vitro también pueden ser usadas para la síntesis de glicósidos ya sea

mediante hidrólisis reversa –control termodinámico- o transglicosilación –control cinético-

(Watts & Withers, 2004). La unión puede realizarse por transferencia del residuo

glicosídico unido a la enzima a un aceptor glicosídico en vez de la molécula de agua, esto

se conoce como transglicosilación o por condensación directa de las unidades de azúcar en

condiciones de baja actividad acuosa y alta concentración de sustrato, llamada hidrólisis

reversa (Fig. 1). La diferencia entre las dos formas de síntesis depende de la naturaleza del

donor glicosídico. En la hidrólisis inversa, la reacción se realiza con un monosacárido (por

ejemplo glucosa), mientras que en la transglicosilación un glicósido (por ejemplo

disacárido, o un azúcar unido a una aglicona) se utiliza como el dador de glicósido. Ambas

reacciones pueden llevarse a cabo ya sea en sistemas monofásicos o bifásicos (Ismail Ali et

al., 1999).

Figura 1. Glicosilación enzimática mediada por glicosidasas (van Rantwijk et al., 1999)

Las glicosidasas son características por su alta estereoselectividad, son más accesibles,

termoestables, de bajo costo, usan dadores glicosídicos simples, en su mayoría no

necesitan cofactores y generalmente son más estables que las glicosiltransferasas

(Fernandez-Mayoralas, 1997). En los casos en que es posible, se opta por la

transglicosilación, dado que es relativamente eficiente en medios acuosos y bajas

concentraciones de sustratos.

Por ello, las glicosidasas son enzimas que a pesar de tener menos especificidad por el

grupo aceptor del glicósido que las glicosiltransferasas, han adquirido importancia en la

síntesis de glicósidos y oligosacáridos in vitro para la obtención de glicoconjugados en

medios acuosos con rendimientos moderados (Kouame et al., 2001).

Aunque estas enzimas tienen absoluto control sobre la configuración anomérica de la unión

creada recientemente, ellas frecuentemente no son regioselectivas como las transferasas.

La principal desventaja es la formación de mezclas de productos, debido a la selectividad

limitada de las glicosidasas con respecto al aceptor glicosídico (Faber, 2004).

2.1 Mecanismos de acción catalítica

La hidrólisis enzimática del enlace glicosídico tiene lugar mediante una hidrólisis ácido-

base. Dicha hidrólisis ocurre por medio de dos mecanismos principales, dando por

resultado una inversión (glicosidasas “inverting”) o bien una conservación (glicosidasas

“retaining") de la configuración anomérica. A continuación se describen los dos

mecanismos clásicos (Koshland, 1953) aunque existen variantes a dichos mecanismos. Una

variante en particular descubierta recientemente involucra el cofactor NADH (Yip et al.,

2004).

Glicosidasas “inverting”. Las glicosidasas que llevan a una inversión de la configuración

anomérica lo hacen mediante una sustitución nucleofílica que ocurre en un único paso e

involucra un estado de transición iónico (Fig. 2). La hidrólisis de un enlace glicosídico

da un producto de configuración , y viceversa. La reacción ocurre con asistencia

ácido/base de las cadenas laterales de dos residuos aminoacídicos, normalmente, ácido

aspártico o glutámico, que están localizados a 6-11 Å de distancia entre sí.

Figura 2. Mecanismo inverting para una α-glicosidasa.

Glicosidasas “retaining". Las glicosidasas que llevan a una conservación de la

configuración anomérica lo hacen mediante un mecanismo de desplazamiento doble. Estas

enzimas a menudo poseen la capacidad de transglicosilación. En el primer paso –

glicosilación-, un grupo carboxílico cataliza la remoción del grupo saliente, al mismo

tiempo que el otro carboxilato realiza un ataque nucleofílico sobre el sustrato para formar

un intermediario covalente de la enzima glicosilada. En el segundo paso –desglicosilación-

, el primer carboxilato funciona como una base para activar al nucleófilo atacante (una

molécula de agua en el caso de hidrólisis, o un alcohol en el caso de una

transglicosilación), el cual hidroliza el intermediario formado (Fig. 3).

ácido

base Estado de transición

3. COMPUESTOS POLIFENOLICOS COMO ACEPTORES GLICOSIDICOS

Los compuestos fenólicos se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza y

pueden tener múltiples funciones fisiológicas, tales como la actividad antioxidante de las

catequinas y la actividad antileucémica del avarol. La glicosilación de compuestos

fenólicos aumenta su solubilidad en agua y podría mejorar las propiedades farmacológicas.

La actividad fisiológica y la biodisponibilidad de los glicósidos también suele depender del

tipo o posiciones de azúcares unidos. Por ejemplo, la actividad blanqueadora de la piel

(“skin whitening”) de la de -arbutina es ocho veces mayor que la de -arbutina. Por lo

tanto, nuevos compuestos fenólicos glicosilados podrían tener diferentes propiedades

farmacológicas (Prodanovic et al., 2005).

A lo largo de las últimas décadas, las glicosidasas han sido las enzimas más

frecuentemente descriptas para la glicosilación de alcoholes primarios y secundarios,

mientras que la glicosilación de compuestos fenólicos raramente se han abordado (Mena-

Arizmendi et al., 2011).

La mayor parte de las glicosidasas tienen mayor afinidad para glicosilar grupos oxidrilos

primarios respecto a los otros hidroxilos con mayor impedimento estérico (MacManus y

Vulfson, 2000). La actividad de transglicosilación de las glicosidasas normalmente sigue el

orden OH primarios>OH secundarios>OH aromáticos, y son en general inactivas frente a

Figura 3. Mecanismo retaining para una β-glicosidasa.

Estado de transición

Estado de transición

Enzima glicosilada

ácido/base

nucleófilo

oxidrilos terciarios. La transglicosilación de oxidrilos fenólicos, por lo tanto, no es sencilla

y existen pocos ejemplos exitosos. Nuestro grupo describió una nueva actividad enzimática

producida por Acremonium sp. DSM24697, la α-ramnosil-β-glucosidasa (EC 3.2.1.168),

que es capaz de transglicosilar el disacárido rutinosa a terpenos (Minig et al., 2011) y

alcoholes aromáticos (Mazzaferro et al., 2012). Sin embargo, no se han estudiado

sistemáticamente los parámetros de reacción respecto a moléculas de importancia

farmacológica. En el presente trabajo se estudió la capacidad de la enzima α-ramnosil-β-

glucosidasa para la síntesis de rutinósidos de moléculas bioactivas, con especial énfasis en

la rutinosilación de alcoholes fenólicos. Particularmente, el compuesto hidroquinona fue

elegido tanto por sus propiedades bioactivas, como por su estructura química la cual consta

de dos oxidrilos fenólicos.

La hidroquinona inhibe la melanogénesis in vitro e in vivo y es ampliamente utilizada

cosméticamente como un agente blanqueador de la piel, para el tratamiento de melasma,

hiperpigmentación post-inflamatoria y otros trastornos de hiperpigmentación. La

hidroquinona disminuye fuertemente la actividad tirosinasa e inhibe el metabolismo celular

al afectar tanto la síntesis de ADN como de ARN. Sin embargo, la hidroquinona tiene

efectos secundarios tales como irritación de la piel o dermatitis de contacto y se oxida

fácilmente en solución acuosa (Eun-Seong Seo et al., 2009). Para evitar tales efectos

secundarios, en los últimos años se ha dedicado un intenso esfuerzo para la búsqueda de

una alternativa a la hidroquinona para propósitos tanto farmacéuticos como cosméticos

(Zhi-Ming Hu et al., 2009). Un desarrollo reciente es el uso de arbutina (hidroxifenil- -D-

glucopiranósido) en lugar de hidroquinona, la cual es capaz de suprimir la síntesis de

melanina en la piel humana reduciendo los efectos secundarios (Eun-Seong Seo et al.,

2009). La arbutina es un glucósido natural de la hidroquinona que se encuentra presente

en las planta de guayaba, y es menos citotóxica en comparación con la misma

hidroquinona (Zhi-Ming Hu et al., 2009; Chao-Hsun Yang et al., 2010) (Fig. 4). Por otro

lado, arbutina- -glucosido (4-hidroxifenil- D-glucopiranósido) fue sintetizada

enzimáticamente utilizando arbutina como aceptor glicosídico, y almidón como donor

(Kazuhisa Sugimoto et al., 2003). También fueron sintetizados enzimáticamente derivados

glicosilados de hidroquinona como son hidroquinona- -isomaltosido e hidroquinona- -

glucosido utilizando hidroquinona como aceptor y maltosa como donor de glicósido

(Prodanovic et al., 2005).

La glicosilación de arbutina e hidroquinona se ha llevado a cabo para intentar fortalecer la

inhibición de la síntesis de melanina (Kazuhisa Sugimoto et al., 2003; Eun-Seong Seo et

al., 2009) disminuyendo aun más los efectos secundarios.

Figura 4. Estructura química de Hidroquinona (1), Arbutina (2) y -Arbutina (3).

La hidroquinona rutinosilada sería una nueva alternativa al uso de hidroquinona y arbutina.

El estudio de sus parámetros de síntesis es necesario para su potencial producción y uso en

farmacología, a la vez que proporcionan indicios para la síntesis de rutinosidos de

compuestos con estructura arílica similar.

4. OBJETIVOS

El objetivo general de este trabajo fue la glicosilación de moléculas de actividad

farmacologica para modificar su solubilidad, estabilidad y/o actividad biológica mediante

el uso de la enzima α-ramnosil-β-glucosidasa.

- Objetivos específicos

a. Determinación de la capacidad de la enzima α-ramnosil-β-glucosidasa para la

rutinosilación de diversos aceptores bioactivos

b. Optimización de las condiciones de síntesis enzimática en función de las

características bioquímicas de la enzima y las propiedades químicas de los sustratos y

productos.

(1) (2) (3)

Materiales y

Métodos

1. Reactivos químicos

Hesperidina, hesperetina, hesperidina metilchalcona, hidroxiquinona (HQ) se compraron

en Sigma Chemical (St. Louis). El metanol grado HPLC LiChrosolv® se obtuvo de Merck

(Darmstadt). El resto de los reactivos fueron de fuentes standard.

2. Soluciones stock

Las soluciones stock de hidroquinona y hesperidina (180 mM) para los ensayos de

transglicosilación y cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) se prepararon

solubilizando estos compuestos en dimetilformamida (DMF).

El pH se ajustó utilizando los siguientes buffers (50 mM): citrato de sodio (pH 3,0; 4,0 y

5,0), fosfato de sodio (pH 6,0 y 8,0) y Tris-HCl (pH 6,8 – 8,8).

3. Medición de actividad enzimática

Actividad α-ramnosil-β-glucosidasa. Se incubaron 450 µl de sustrato (1,8 mM

hesperidina en 50 mM buffer citrato de sodio pH 5,0) con 50 µl de solución enzimática

adecuadamente diluida. La reacción se realizó durante 1 h a 60°C y se finalizó agregando

500 µl de ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) (Miller et al. 1959). Los tubos se colocaron en

un baño de agua hirviendo por 10 min y se enfriaron antes de medir la absorbancia a 540

nm. Una unidad de actividad α-ramnosil-β-glucosidasa se definió como la cantidad de

enzima requerida para liberar 1 µmol de azúcares reductores por minuto.

4. Selección de Aceptores

Para la reacción de transglicosilación se utilizó hesperidina como donor de disacárido, y

los aceptores hidroxilados metronidazol, clindamicina, hidroquinona, rifampicina y

epinefrina. La mezcla de reacción (500 µl) contenía: 1,8 mM hesperidina, 1,8 mM aceptor,

0,004 U/ml α-ramnosil-β-glucosidasa, 50 mM buffer fosfato pH 6,0; 2 % de co-solvente

(DMF); y se incubó a 30 ºC durante 25 h. La reacción se finalizó en baño maría hirviente

por 10 min.

5. Síntesis de rutinósido

Estabilidad química de hidroquinona y pH óptimo de reacción enzimática

La determinación de estabilidad de hidroquinona se realizó midiendo el espectro UV-

visible a 30 ºC a diferentes valores de pH.

La reacción de transglicoilación se llevó a cabo a distintos valores de pH, el cual se ajustó

utilizando los siguientes buffers (50 mM): citrato de sodio (pH 4,0 y 5,0), fosfato de sodio

(pH 6,0).

La mezcla de reacción (1000 µl) contenía: 1,8 mM hesperidina, 1,8 mM hidroquinona,

0,02 U/ml α-ramnosil-β-glucosidasa, 50 mM buffer, 2% de co-solvente (DMF); y se

incubó a 30 ºC durante 24 h.

Reacción en diferentes concentraciones de Co-solvente (DMF/DMSO).

Se utilizaron dos co-solventes (DMF y DMSO) para la reacción de transglicosilación en

distintos proporciones (0-50% v/v). La mezcla de reacción (1000 µl) contenía: 1,8 mM

hesperidina, 1,8 mM hidroquinona, 0,02 U/ml α-ramnosil-β-glucosidasa, 50 mM buffer

citrato de sodio pH 5,0; co-solvente (0-50% v/v); y se incubó a 30 ºC durante 2 h.

Reacción en diferentes concentraciones de aceptor.

Para determinar la concentración óptima de aceptor, se utilizaron distintas concentraciones

de hidroquinona. La mezcla de reacción (1000 µl) contenía: 1,8 mM hesperidina,

hidroquinona (1,8-90 mM ), 0,02 U/ml α-ramnosil-β-glucosidasa, 50 mM buffer citrato de

sodio pH 5,0; 5 % co-solvente; y se incubó a 30 ºC durante 2 h.

6. Cromatografía en capa delgada. Los productos de las reacciones enzimáticas se

analizaron por cromatografía en capa delgada (silica gel 60 W) usando acetato de etilo/2-

propanol/agua (3:2:2) como fase móvil y se revelaron con el reactivo de antrona. Las

imágenes a color 32-bit se descompusieron en los componentes rojo, verde y azul (RGB)

usando el software ImageJ 1.38x (National Institutes of Health, USA). Las imágenes

correspondientes al componente rojo se eligieron debido a la mayor relación señal/ruido.

Luego, la densidad óptica integrada se usó para la cuantificación de azúcares y glicósidos.

Resultados y

Discusión

1. Especificidad del catalizador α-ramnosil-β-glucosidasa con diferentes

aceptores bioactivos

Se estudió la capacidad de transglicosilación del catalizador α-ramnosil-β-glucosidasa

hacia distintos aceptores con aplicaciones farmacológicas. Se eligieron cinco compuestos –

clindamicina, metronidazol, epinefrina, hidroquinona y rifampicina– en base a sus

actividades biológicas y presencia de grupos oxidrilos fenólicos u oxidrilos en posiciones

primaria o secundaria (Tabla 1).

Tabla 1. Fármacos usados como aceptores del glicósido

Fármaco

Indicación Solubilidad en agua

logP

Clindamicina

Tratamiento de infecciones serias causadas por bacterias anaeróbicas susceptibles incluyendo Bacteroides spp., Peptostreptococcus, Clostridium spp., Streptococos anaeróbicos y microaerofílicos.

30.6 mg/l (a 25 ºC)

2,16

Metronidazol

Tratamiento de infecciones anaeróbicas e infecciones mixtas, incluyendo las causadas por Clostridium difficile, Helicobacter pylori, Giardia spp., amebiasis provocada por Entamoeba histolytica, e infecciones con Trichomonas.

950 mg/l (a 25 ºC)

-0,02

Epinefrina

Tratamiento de hipersensibilidad aguda, ataques asmáticos agudos, síndrome de Stokes-Adams.

180 mg/l (a 20 ºC)

-1,37

Rifampicina

Tratamiento de las infecciones por Mycobacterium, incluyendo la tuberculosis y la lepra; juega un papel en el tratamiento de Staphylococcus aureus meticilina-resitente (MRSA) en combinación con el ácido fucsídico. Se usa en la profilaxis de Neisseria meningitidis (meningitis).

1400 mg/l (a 25 ºC)

2.7

Hidroquinona Agente blanqueador de la piel. Se usa para aclarar áreas localizadas de piel oscurecida, ya que es un agente despigmentador débil.

59 mg/l (a 15 ºC)

0.59

Fuente: DrugBank, http://www.drugbank.ca; Wikipedia, http://es.wikipedia.org

La reacción de transglicosilación se realizó utilizando dichos fármacos como aceptores y

hesperidina como donor de rutinosa en cantidades equimolares, en distintas condiciones de

pH, tiempo de reacción y temperatura. Los productos de reacción se analizaron por

cromatografía en capa delgada. Se encontró que el biocatalizador es capaz de

transglicosilar hidroquinona, en solución acuosa (Fig. 5).

En cuanto a los demás aceptores, estos no pudieron ser glicosilados o presentaron

eficiencias menores en la reacción de síntesis, probablemente debido a que en las

condiciones empleadas no se veía favorecida su transglicosilación. La modificación de las

distintas variables del sistema, para cada aceptor en particular podría dar lugar a la síntesis

de su derivado glicosilado.

Se ha descripto la glicosilación de alcoholes primarios y secundarios (Minig et al., 2011;

Martearena, 2007; van Rantwijk et al, 1999), mientras que la glicosilación de compuestos

fenólicos es menos común (Mena-Arizmendi et al., 2011; Mazzaferro et al., 2012). En este

caso, hidroquinona resultó glicosilada, en concordancia con estudios previos que mostraron

la glicosilación de un oxidrilo fenólico en la cumarina 4-metilumbeliferona (Mazzaferro et

al., 2012). El fármaco hidroquinona se eligió como molécula modelo para ensayos

posteriores por poseer en su estructura dos oxidrilos fenólicos.

Hesperidina Rutinosa

Figura 5. Transglicosilación de rutinosa desde hesperidina a distintos fármacos. El signo (+) denota la presencia del catalizador en la mezcla de reacción, mientras que el signo (-) denota control. El aceptor etanol se añadió como control. Las flechas azules indican productos de transglicosilación. La mancha extra que se observa en el caso de clindamicina corresponde al fármaco, que presenta un residuo glicosídico per se.

+

Hid

rolis

is

+ − + − + − + − + − +

Etan

ol

Met

ron

idaz

ol

Clin

dam

icin

a

Epin

efri

na

Hid

roq

uin

on

a

Rif

amp

icin

a

Ru

tin

osa

2. Rutinosilación de hidroquinona

La hidroquinona (Tabla 1) posee en su estructura dos grupos oxidrilos arílicos, y por su

comportamiento como inhibidor de la enzima tirosinasa encuentra aplicación en productos

cosméticos para el blanqueamiento de la piel.

Sin embargo, esta no es químicamente estable y las cremas que la contienen sufren de

pardeamiento.

Fue descripta una mayor resistencia al pardeamiento del derivado glucosilado -arbutina

(4-hidroxifenil- D-glucopiranósido) respecto a la hidroquinona, cuando estos

compuestos fueron irradiados con luz ultravioleta (Eun-Seong Seo et al., 2009). También

existen descripciones de glucosilación de -arbutina para incrementar su estabilidad

química (Zhi-Ming Hua et al., 2009). Si bien la cromatografía nos indica la presencia de

hidroquinona rutinosilada, donde estaríamos logrando el derivado disacarídico en un solo

paso, es evidente que la reacción presenta una baja eficiencia y debería ser optimizada.

La síntesis de glicósidos depende de las distintas variables en el sistema como pH,

contenido de solvente, del aceptor glicosídico, concentración de catalizador, tipo de grupo

hidroxilo del aceptor, etc (Vic y Thomas, 1992; Chahid et al., 1992). Como ya se ha

mencionado anteriormente, la transglicosilacion de oxidrilos fenólicos no es sencilla, por

lo tanto, las condiciones de la reacción deben modificadas para aumentar la eficiencia del

proceso (Martearena, 2007).

Se analizó la producción de hidroquinona rutinosilada utilizando 0,004 U/ml α-ramnosil-β-

glucosidasa. La mayor concentración de producto se obtuvo al cabo de 25 h de reacción,

con rendimientos de aproximadamente 10% (Figura 6).

Figura 6. Curva de producción de hidroquinona-rutinósido catalizada por α-ramnosil-β-glucosidasa de Acremonium sp. DSM24697. La mezcla de reacción contenía 1,8 mM hidroquinona, 1,8 mM hesperidina, 50 mM buffer fosfato de sodio pH 6,0; 2%v/v DMF. Se incubó a 30°C con 0,004 U/ml α-ramnosil-β-glucosidasa. 0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0.14

0.16

0.18

0.2

0 5 10 15 20 25

Hid

roq

uin

on

a ru

tin

ósi

do

(m

M)

Tiempo (h)

3. Estabilidad química del aceptor hidroquinona

Con el fin de optimizar la reacción de transglicosilación, y teniendo en cuenta que la

hidroquinona se oxida fácilmente a p-benzoquinona en solución acuosa, su estabilidad se

midió a diferentes valores de pH (Fig. 7).

Figura 7. Efecto del pH en la oxidación de hidroquinona a p-benzoquinona (■ ) y actividad de α-ramnosil-β-glucosidasa a diferentes valores de pH (■ ). La intersección del sombreado azul y rojo indica el rango utilizado para continuar la optimización del proceso ( ).

La auto-oxidación de la hidroquinona a p-benzoquinona es dependiente del pH, ocurre

rápidamente a pH alcalino para producir compuestos coloreados (color marrón), pero

lentamente en solución ácida (Sirajuddin et al 2006). Se encontró que la formación de p-

benzoquinona fue baja a valores de pH ligeramente ácidos (pH ≤ 6,0), correspondiente al

sombreado azul en la figura 7. Estudios previos mostraron que los valores máximos de

actividad (>80%) del catalizador α-ramnosil-β-glucosidasa se encuentran en el rango de pH

4,0-7,0, lo cual esta indicado en la figura 7 con un sombreado rosa.

Teniendo en cuenta ambos rangos de pH, se seleccionó el intervalo de pH 4,0-6,0 para la

reacción de transglicosilación.

0

20

40

60

80

100

120

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Ac

tivid

ad

en

zim

átic

a (%

)Ab

s2

45/t

iem

po

(1

/min

)

pH

4. Concentración del catalizador y la cinética de transglicosilación a distintos

valores de pH

La eficacia de transglicosilación depende en gran medida de la relación cinética entre

síntesis/hidrólisis, que describe de manera eficiente cómo el intermediario de la enzima

glicosilada se transforma en producto. Es por ello que las condiciones de pH, tiempo y

temperatura requeridas para un máximo rendimiento de la hidrólisis no suelen ser las

mismas que las requeridas para la transglicosilación (van Rantwijk et al., 1999).

Otra variable importante es la selección de la concentración de enzima, dado que juega un

papel importante en el rendimiento y la productividad de la síntesis. De acuerdo con la

literatura, a mayor actividad de la enzima, mayor es la tasa de producto inicial, pero a su

vez este producto puede ser también hidrolizado por la enzima (Mena-Arizmendi et al.,

2011; Martearena, 2007; Jing Quan et al., 2007). Con el fin de incrementar la eficiencia

del proceso se decidió aumentar 5 veces la concentración del catalizador. La figura 8

muestra la influencia de ambas variables en la síntesis de hidroquinona rutinosilada dentro

del rango de pH donde la oxidación química de hidroquinona no es significativa.

Figura 8. Cinética de producción de hidroquinona rutinósilada a diferentes valores de pH, utilizando 0,02 U/ml de enzima.

En todos los casos se encontró que la producción era máxima luego de 1-2 h cuando se

utilizaban 0,02 U/ml de enzima, para luego disminuir, probablemente porque hidroquinona

rutinosilada funciona como sustrato de la enzima.

El mayor rendimiento 12,2 % se logró a pH 5,0 luego de 2 h de reacción. Dicho pH es el

pH óptimo para la reacción de transglicosilación, el cual coincide con el pH óptimo de la

enzima para la desglicosilación del flavonoide hesperidina (Fig. 7).

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0 4 8 12 16 20 24

Hid

roq

uin

on

a ru

tin

ósi

do

(m

M)

Tiempo (h)

pH 4

pH 5

pH 6

5. Agregado de co-solventes miscibles en agua

Una de las estrategias más utilizadas para mejorar los rendimientos en los procesos

enzimáticos que implican sustratos hidrófobos en medios acuosos es el uso de co-

disolventes orgánicos. Estos disolventes orgánicos pueden aumentar la solubilidad de los

sustratos y, por lo tanto, su disponibilidad para la reacción enzimática (Mena-Arizmendi et

al., 2011). Se estudió el efecto del agregado de los disolventes dimetilformamida (DMF) y

dimetilsulfóxido (DMSO) en el medio de reacción (Fig. 9).

La presencia del co-solvente aumentó la síntesis de producto en el rango 0-5%v/v, pero en

concentraciones mayores al 10%v/v estos fueron deletéreos para el proceso (Fig. 9).

El uso de solventes orgánicos en el medio de reacción aumenta la solubilidad de los

sustratos hidrófobos y/o cambia el equilibrio cinético (Kwon et al., 2006), lo cual, en

algunos casos puede mejorar la productividad del proceso (Mazzaferro et al., 2012). Sin

embargo, en las concentraciones de solvente utilizadas, el sistema continúa siendo

homogéneo, por lo que no se puede explicar la disminución dada por una menor

disponibilidad del aceptor o donor del glicósido. Es por esta razón que sugerimos que la

disminución en el rendimiento fué básicamente debida a una desestabilización del

catalizador.

Las glicosidasas a menudo muestran una falta de actividad en medios orgánicos, aunque

los efectos son generalmente reversibles, por lo que se requiere de la estabilización de las

enzimas, mediante la inmovilización u otras estrategias, para poder utilizar concentraciones

elevadas de solventes (Piñuel et al., 2011).

Figura 9. Efecto del co-solvente en la síntesis de hidroquinona rutinósido.

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

Co-Solvente (% v/v)

Hid

roq

uin

on

a ru

tin

ósi

do

(m

M)

DMF

DMSO

6. Efecto de la concentración de hidroquinona en la síntesis de hidroquinona

rutinósido

Para estudiar el efecto de la concentración de aceptor en la reacción de síntesis, se varió la

concentración de hidroquinona en el rango 1,8-90 mM (Fig. 10)

Figura 10. Efecto de la concentración de aceptor en la síntesis de hidroquinona rutinósido.

Se encontró que 36 mM es la concentración más adecuada para la síntesis con un

rendimiento del 38% (Fig. 10). En concentraciones mayores no se observa un aumento en

la síntesis de producto y si bien no tenemos grandes diferencias la curva muestra una

tendencia a disminuir. Esto fenómeno podría deberse a la inestabilidad de la enzima en

elevadas concentraciones del aceptor glicosídico, el cual puede inducir la agregación de la

proteína por disminución de la constante dieléctrica o debido a las modificaciones

químicas producidas por la oxidación de la hidroquinona (Prodanovic et al., 2005).

En este tipo de reacciones, generalmente se propone emplear concentraciones del aceptor

más altas que las del donor para minimizar las autoglicosilaciones. Otra estrategia sería

mediante la síntesis en un reactor alimentado, para evitar la presencia de altas

concentraciones del dador glicosídico durante todo el proceso (Balogh et al. 2004).

Inicialmente el rendimiento de la reacción fue de un 10% al cabo de 25 h. Luego de

optimizar las variables del sistema como pH, contenido de co-solvente, concentración de

catalizador y aceptor glicosídico se obtuvo un rendimiento del 38% en tan solo 2 h de

proceso. Si consideramos la productividad de la biotransformación (productividad =

producción/tiempo) esta se incremento 47,5 veces. Esto señala el punto de partida para la

síntesis en mayor escala, la purificación y los estudios farmacológicos sobre hidroquinona

rutinósido.

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Hid

roq

uin

on

a ru

tin

ósi

do

(m

M)

Hidroquinona (mM)

Conclusiones

En el presente trabajo se utilizó el catalizador α-ramnosil-β-glucosidasa de Acremonium sp.

DSM24697 para rutinosilar distintos aceptores hidroxilados de uso farmacológico. A partir

de los estudios realizados, se pueden alcanzar las siguientes conclusiones:

Hidroquinona resulto ser el aceptor del glicósido más eficiente respecto a los otros

fármacos estudiados en las condiciones de trabajo empleadas.

El catalizador α-ramnosil-β-glucosidasa fue capaz de transglicosilar un compuesto

fenólico.

Se determinó un rango de pH para el proceso que considera la estabilidad química

del aceptor glicosídico y la actividad del catalizador. Dicho rango se hallo entre

entre los valores de pH 4,0-6,0.

La presencia del co-solvente incrementó el rendimiento del proceso en el rango de

concentraciones 0-5%v/v.

El incremento de cinco veces la concentración del catalizador permitió reducir el

proceso de síntesis a sólo 2 h de reacción.

Se determinó 36 mM hidroquinona como la concentración más adecuada para la

síntesis en lote hidroquinona rutinosido, con un rendimiento del 38%.

La productividad del proceso se incremento 47,5 veces a través de las variables

optimizadas, por lo cual dichos parámetros permitirían la obtención de

hidroquinona rutinosilada a mayor escala.

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