ESTADO DEL ARTE EN LA MONITORIZACI ÓN DE F ÁRMACOS
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MONITORIZACIMONITORIZACIÓÓN DE FN DE FÁÁRMACOSRMACOS
Monitorización de fármacos
EVA MENEVA MENÉÉNDEZ ALONSONDEZ ALONSOQIR de 2 año de BIOQUÍMICA
CLÍNICA17 de Marzo 2010
� La evolución de TDM se ha visto facilitada por el desarrollo de nuevas técnicas analíticas de alta Sensibilidad y Especificidad
� MÉTODOS INMUNOQUÍMICOS� MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS� OTROS MÉTODOS� MÉTODOS DE DETERMINACIÓN DE FÁRMACO LIBRE
INMUNOENSAYOS
� Técnicas que utilizan la reacción Ag-Ac para el aná lisis cualitativo/cuantitativo de sustancias en fluidos b iológicos
� Ac policlonales / Ac monoclonales� Competitivos / No competitivos� Heterogéneos / Homogéneos
� RIA ⇒⇒⇒⇒ Radioinmunoanálisis� FPIA ⇒⇒⇒⇒ Inmunoensayo de polarización fluorescente� MEIA ⇒⇒⇒⇒ Inmunoensayo por micropartícula� ECLIA ⇒⇒⇒⇒ Inmunoensayo electroquimioluminiscente � CMIA ⇒⇒⇒⇒ Inmunoensayo magnético quimioluminiscente � EMIT ⇒⇒⇒⇒ Inmunoanálisis de multiplicación enzimática � CEDIA ⇒⇒⇒⇒ Inmunoanálisis por clonado de dador
RADIOINMUNOANÁLISIS
� Años 60 RIA: permitió la cuantificación de fármacos en ng/ml � Inmunoanálisis heterogéneo/competitivo
� Usa isótopos radiactivos como marcaje
� Isótopos actividad específica elevada (125I, 14C, 3H)
� Inconvenientes◦ Gran complejidad◦ Larga duración◦ Problema de eliminación residuos◦ No se puede aplicar a todos los fármacos◦ Radioisótopos se degradan con el tiempo
FLUOROINMUNOANÁLISIS
� Inmunoensayo homogéneo/competitivode polarización fluorescente
◦ Usa 3 conceptos clave para la medición� Fluorescencia: Usa como marcador la
fluoresceína (absorbe luz 490nm y la libera a 520nm como luz polarizada)
� Rotación de moléculas en solución : distintas velocidades de rotación (grandes/lentas)
� Luz polarizada: distintas propiedades de polarización entre Ag-F y Ag-F-Ac
� Años 80 aparecen FPIA
ENZIMOINMUNOANÁLISIS
� Años 90 se introducen plataformas analíticas que consolidan los diferentes tipos de inmunoensayos de 3º generación
� EIA: utiliza las propiedades catalíticas del enzima para la cuantificación
� Enzima: alta actividad específica/no encontrarse en medio reacción◦ EMIT, CEDIA◦ El reactivo se conjuga con un enzima◦ Peroxidasa◦ Fosfatasa alcalina◦ Glucosa-6-P-deshidrogenasa◦ Β-galactosidasa
◦ Medición depende de inhibición, activación o cambio conformacional que sufra el enzima
En los últimos años investigando uso β-lactamasa y pirofosfatasa enzimas con altos números de recambio y buena estabilidad térmica
EMIT
� Homogéneo/Competitivo� Fundamento: la sustancia marcada se une al Ac específico
produciendo inhibición del enzima por impedimentos estéricos
� El enzima libre reacciona con un sustrato generando un producto coloreado
� Sensibilidad determinada por:� Cambios en la actividad enzima� Sustancias que interfieran en la
actividad enzimática� Constante de afinidad del Ac en la reacción
CEDIA
� EIA por clonado del dador: usa los principios de la tecnología recombinante
� Fundamento: fraccionamiento mediante técnicas de ADN recombinante, de la β-galactosidasa
� La sustancia a determinar se liga al dador evitando su unión al fragmento aceptor e inactivando el enzima
� Medición: tasa de hidrólisis
� EIA homogéneo mas sensibles (10-11mol/L)� Semiautomáticos/automáticos
� Bajos tiempos de procesamiento y preparación de la muestra
� Reactividad cruzada
EIA
� VENTAJAS� Alta sensibilidad� Múltiples ensayos� Fácilmente automatizables� Ampliamente utilizados
en laboratorios de rutina para monitorización de fármacos
� DESVENTAJAS� Medición de la actividad
enzimática en algunos casos compleja
� La actividad enzimática puede verse afectada
� Algunos ensayos homogéneos baja Sensibilidad
� Baja Especificidad, posible reactividad cruzada con metabolitos o pro-fármacos (SOBREESTIMACIÓN)
Farm. Hosp. Vol 30.Nº3 pp 142-148-2006
INMUNOENSAYO POR MICROPARTÍCULAS
� MEIA� Micropartículas de látex� Matriz de fibra de vidrio
� Enzima
� Detector de fluorescencia
� CMIA� Micropartícula magnética
� Imán� Compuesto quimioluminiscente
� Detector de quimioluminiscencia
� Reacción quimioluminiscente ofrece alta sensibilidad y facilidad para la medición.
� Técnicas no competitivas tipo sándwich� Micropartículas de fase sólida con Ac� El marcaje, etapa de separación y tecnología de medición difieren
ElectroquimioluminiscenciaECLIA
� Proceso en el que se generan especies reactivas en la superficie de un electrodo a partir de precursores estables (Ru), volviendo luego al estado basal mediante una reacción quimioluminiscente.� Sándwich/competitiva� El complejo tipo sándwich se fija a una fase sólida (micropartículas de
poliestireno)
� Se aplica una corriente eléctrica y se produce la reacción quimioluminiscente.� Rápido y sencillo
� Corto tiempo de análisis� Alta capacidad de amplificación de la señal
a partir de una molécula marcada.
� Bajos límites detección y ampliosintervalos de medición
� Técnicas de separación basada en las distintas velocidades de desplazamiento de los analitos, al ser arrastradas por una fase móvil a través de un lecho cromatográfico que contiene la fase estacionaria
� La separación se logra porque la movilidad de cada analito depende de un equilibrio en la distribución entre ambas fases en base a:� Cargas� Tamaño molecular� Polaridad….
� El proceso cromatográfico, se basa en una compleja
unión de fenómenos tales como hidrodinámica,
cinéticos, termodinámicos, química de superficiey difusión
Gran variedad de técnicas
� Varios sistemas de detección� UV� ESPECTROMETRÍA DE MASAS
� CROMATOGRAMA: recoge la respuesta del detector en función del tiempo que tardan los distintos compuestos en salir de la columna
� Tiempo de retención (cualitativo)� Área de pico (cuantitativo)
Amuestra= Área del analito en el cromatograma de la muestraAstandard= Área del analito en el cromatograma de la calibraciónISmuestra= Área del standard en el cromatograma de la muestra
ISStandard= Área del standard en el cromatograma de la calibraciónCStandard = Concentración que tiene el analito en la calibración
Concentración del analito µg/ml = (Amuestra x ISSt andard ) / (Astandard x ISmuestra ) x CStandard
CROMATOGRAFÍA GASEOSA
� Separación de compuestos volátiles que fluyen en una corriente gaseosa a través de una fase estacionaria fijada a una columna
� Fármacos: mayor aplicación la cromatografía líquido-gas (CGL).� Las columnas empacadas son bastante versátiles y permiten el análisis de un
amplio número de fármacos en fluidos biológicos.
� Las capilares otorgan mucho mayor eficiencia, sensibilidad y resolución
� Los detectores usados son versátiles y de alta sensibilidad: detector de ionización de llama (FID), detector de captura electrónica (ECD) y detector de espectrometría de masa (MSD).
� La optimización de la separación se realizavariando la naturaleza de fase móvil y
la temperatura de trabajo (isotérmica o programada).
� Permite separación del fármaco de sus metabolitos y posibles interferentes
� Se planteó la posibilidad de su implantación sistemática
o Principales ventajas de la CG: o El potencial de separación es enorme gracias a las columnas capilares
o La espectrometría de masa, como detector, le otorga la máxima especificidad y gran sensibilidad
o Cuenta con una escala unificada de tiempos de retención
� La necesidad de:◦ Grandes volúmenes de muestra◦ Derivatización química para garantizar la volatilidad del analito◦ Pretratamiento antes de aplicar la técnica cromatográfica.
� Supuso un freno en su implantaciónen laboratorio clínico
HPLC
� Los componentes de la muestra son llevados a través de la f. estacionaria mediante el flujo de una f. móvil a alta presión
� Para el análisis de los fármacos la técnica más empleada es la Fase Reversa
� Los eluyentes más usados, son mezclas de agua o tampones con metanol, acetonitrilo o tetrahidrofurano.
� Los detectores más empleados: VIS-UV, fluorimétrico, electroquímico y MS
� Es posible trabajar de forma isocrática (una fase móvil) o en gradiente (se varía polaridad, fuerza iónica o pH).
� Características:� Selectividad� Reproducibilidad� Sensibilidad� Rapidez
� Parámetros:� Naturaleza de la f.
estacionaria� Tamaño de partícula� Eluyente (composición y flujo)� Detector
� Tipos :� Fase Directa� Fase Reversa
� Técnica versátil con mínima preparación y bajos volúmenes de muestra
� Eficiencia máxima a bajas velocidades de flujo, bajo tamaño de partícula o altas temperaturas
� Buena Sensibilidad y Especificidad
� ALTERNATIVA A GC frente a los inmunoensayos
� Se puede combinar con espectrómetros de masa en tándem, HPLC-MS, hecho que ha revolucionado el análisis de fármacos
� Se usa actualmente en inmunosupresores, antirretrovirales y cuantificación de fármaco antimicótico
Enferm Infecc Microbiol Clin 2008;26(4):230-9
HPLC-MS método de referencia validado
para ensayos de TDM� La unión de HPLC con espectroscopía de masas ha suministrado
una herramienta con una alta sensibilidad, selectividad y especificidad
� La sensibilidad de la detección depende de la “fuente de ionización”� APCI (ionización química a presión atmosférica)
� ESI (ionización por electrospray)� Su elección depende de propiedades físico-químicas del analito
(polaridad/acidez)� Tras la separación cromatográfica el eluato se introduce en el
detector de masas� Se eliminan los componentes de la fase móvil y se ionizan los
analitos para proceder a su análisisy detección en función de su relación masacarga (m/z)
� Debido a la complejidad de las muestras es frecuente el uso de 2cuadrupolos en serie HPLC-MS-MS
� El ión seleccionado en el 1º cuadrupolo es fragmentado y analizado en el 2º, permitiendo la detección simultánea de iones que coeluyan de la columna
� La identificación del analito se basa en:� Tiempo de retención
� Masa del ión correspondiente al analito( pico base)
� Masa de los iones fragmentados del ión molecular
� La ausencia de iones que interfieran con el ión molecular propicia que la relación señal ruido sea óptima
� HPLC-MS-MS se esta incorporando cada vez más a los laboratorios clínicos� Bajos costos reactivos� Alta disponibilidad de kits comerciales
� Mínima preparación de muestras
� Rendimiento mejorado� Mediciones simultáneas
� Mayor linealidad
� Inconvenientes:◦ Necesidad de personal cualificado y bien
entrenado para su manejo
◦ Alto coste equipos
Ther Drug Monit 2008;30 292-300
Electroforesis capilar
� Técnica de separación basada en la migración diferencial de moléculas sujetas a un campo eléctrico a través de un capilar
� El uso de altos campos eléctricos reduce tiempos de análisis (alta eficiencia y resolución).
� La existencia del flujo electro-osmótico, posibilita el análisis simultáneo de todos los analitos
� Flujo electro-osmótico mueve la disolución extremo + al – separandolas moléculas por su carga� Carga+ > neutras > carga-
� EC es una técnica sensible y altamente
versátil muy utilizada en investigación farmacéutica
� Litio (espectrofotometría de absorción atómica, fotometría de emisión de llama e ICP-MS)
� Técnica de referencia EAA e ICP-MS
� Potenciometría: diferencia de potencial existente entre un electrodo selectivo y un electrodo de referencia en ausencia de corriente externa
� Electrodo de vidrio para cationes monovalentes (Li+) , medida potenciométrica proporcional
a concentración Li en la muestra
Electrodo selectivo iones
CUANTIFICACICUANTIFICACIÓÓN DE LA N DE LA FRACCIFRACCIÓÓN LIBRE DE N LIBRE DE
FFÁÁRMACORMACO
� Fármacos terapéuticos con mas 80% de unión a proteínas
� Determinación de la fracción libre del fármaco complej a.
� Cada vez más habitual en laboratorios de rutina
Clin. Chem. Lab. Med 2010;48(4)
Unión a proteínas de los fármacos mas frecuentement e monitorizados
Fármaco % unión a proteínas Tipo de proteína ¿Monitorizarfármaco libre?
Amicacina
Etosuximida
ProcainamidaTeofilina
Fenobarbital
Fenitoina
CarbamacepinaAcido Valproico
Primidona
< 5%
0 %
10-15 %40 %
40 %
90 %
80 %90-95 %
15 %
__
__
AlbúminaAlbúmina
Albúmina
Albúmina
AlbúminaAlbúmina
Albúmina
No
No
NoNo
No
Si
SiSi
No
Digoxina 25 % Albúmina Si
QuinidinaLidocaina
Ciclosporina
TacrolimusAcido Micofenólico
80 %60-80%
98 %
97 %92 %
α1-glicoproteína ácidaα1-glicoproteína ácida
Lipoproteínas
LipoproteínasAlbúmina
SiSi
Si
SiSi
A. Dasgupta. Clinica Chimica Acta 377 (2007) 1-13
Interés en intoxicaciones tratadas con FAB (DigiBind®)FAB interfieren con inmunoensayos
CUANTIFICACICUANTIFICACIÓÓN DE LA N DE LA FRACCIFRACCIÓÓN LIBRE DE N LIBRE DE
FFÁÁRMACORMACO
� Fármacos terapéuticos con mas 80% de unión a proteínas
� Determinación de la fracción libre del fármaco complej a.
� Cada vez más habitual en laboratorios de rutina
� Métodos� Diálisis en equilibrio , microdiálisis, ultrafiltra ción
y ultracentrifugación
� Recientemente se ha introducido el método SPME
Clin. Chem. Lab. Med 2010;48(4)
� Ultrafiltración/diálisis : Procesos de separación
basados en membranas de polímeros controlados
por la velocidad
� Técnica simple y rápida
� Método actual mas usado, puede combinarse
con detectores UV o MASAS
� Parámetros cruciales:
� Tiempo de centrifugación
� Temperatura
� Volumen de la muestra
� Volumen directamente proporcional a
tiempo de centrifugación e inversamente
proporcional a [ALB] suero
Clinical Biochemistry 40 (2007) 752-764
SPME
� Método prometedor, rápido, simple � Extracción y pre-concentración
� Pequeña fibra de sílice fundida instalada en un soporte, recubierta de una fase polimérica (extractante)
� La SPME esta basada en el reparto de los analitos entre dos fases: la muestra y la fase polimérica. Consiste en la adsorción selectiva de los analitos presentes en la muestra.
� Una vez finalizada la etapa de adsorción, la fibra puede ser inyectada directamente en el detector
� Puede conectarse en línea a un CG, LC o electroforesis capilar
� La combinación de SPME y LC-MS excelente método de screening y determinación de drogas y metabolitos en suero, plasma u orina
� Fácil uso
� Automatización on-line
� Bajos volúmenes de muestra (10µl)� Costes de análisis bajos
� Bajos tiempos de procesamiento
M. Adbel-Rehim, J. Chromatogr.A (2009), doi:10.1016 /j,chroma.2009.09.053
� Optar por HPLC/HPLC-MS, siempre que las condiciones de trabajo lo requieran, cuando se tenga personal bien cualificado y las casascomerciales tengan buen servicio técnico que responda inmediatamente ante cualquier problema
� Los laboratorios deben participar en programas de control de calidad internos y externos que garanticen la validez y utilidad del dato emitido
� Todas las características del método analítico deben ser documentadas en los procedimientos técnicos (PNTs) que utilice el laboratorio. En ellos se indicarán claramente todas las características del método y requerimientos de la muestra a utilizar así como sus limitaciones.
Farm. Hosp. 2008;32(2) 113-123