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ELECTROFORESIS
Los procedimientos electroforéticos se basan en la
migración de iones bajo la acción de un campo
eléctrico
La separación se logra por las distintas velocidades
de migración de las partículas cargadas
ELECTROFORESIS
Electroforesis clásica
Electroforesis capilar
ELECTROFORESIS
ELECTROFORESIS CLÁSICA
libre de transportador
con transportador
Muestra en
buffer
buffer buffer
+ -
+ - buffer
diafragma
filtro de papel DV ~ 100 V
TISELIUS 1937
albúmina
a1 a2
b
g
globulinas
a1 a2 b g albúmina
Electroferograma de proteínas del suero
ELECTROFORESIS CLÁSICA
Comprende una familia de técnicas que
emplean como celda capilares que
contienen amortiguadores donde ocurre la
separación electroforética de los
componentes de la muestra
ELECTROFORESIS CAPILAR
CARACTERÍSTICAS GENERALES
Alta eficiencia
Muy bajo volumen de muestra (útil para muestras valiosas)
Poca cantidad de reactivos (económica)
Aplicable a un amplio grupo de compuestos
Incluida dentro de los métodos modernos de detección
Emplea tubo capilar para la separación
Utiliza campo eléctrico muy alto (~60 kV/m)
ELECTROFORESIS CAPILAR
VENTAJAS
CÁTODO
(–) ÁNODO
(+)
D
FUENTE
DE ALTO
VOLTAJE
RESERVORIO
CONFIGURACIÓN INSTRUMENTAL BÁSICA
ELECTROFORESIS CAPILAR
CONFIGURACIÓN INSTRUMENTAL BÁSICA
ELECTROFORESIS CAPILAR
FENÓMENOS
ELECTROCINÉTICOS
Migración electroforética
Electroendoósmosis
(electroósmosis)
PRINCIPIOS DE SEPARACIÓN
ELECTROFORESIS CAPILAR
Electroendoósmosis
SÍLICA
FUNDIDA
LUZ DEL
CAPILAR, 20-200m
CUBIERTA DE
POLIIMIDA
Pared
del
capilar
capa de
Stern
capa
difusa
CÁTODO (-)
F.E.O
Distribución de cargas en capilar de sílica y flujo
electroosmótico resultante
Si-OH Si-O- + H+
ÁNODO (+)
Velocidad electroosmótica
veo = eo E eo = veo
E
= Ld/teo
DV/L =
Ld L
DV teo
dq eo =
√
eo = e
4p
La es igual para todas las especies dentro del capilar eo
movilidad
electroosmótica
campo eléctrico
Unidades
v: longitud/tiempo (ej: cm/s)
eo : superficie/potencial.tiempo (ej: cm2/V.s)
E: potencial/longitud (ej: V/m)
: masa/longitud.tiempo (ej: kg/m.s)
vef = ef E ef = vef
E
= Ld/tef
DV/L =
Ld L
DV tef
movilidad
electroforética
q ef = 6pr f
= q
La depende de la carga y radio del analito ef
campo eléctrico
coeficiente de fricción
Velocidad electroforética
vneta = (eo+ ef) E
vneta = veo + vef
vneta = ap E
ap
Velocidad neta
Velocidades en presencia de F.E.O.
eo
electrodo –
neta = eo+ef
electrodo +
ef
+ +
+ +
+ +
+ N
N
N
N
+ +
+
Migración diferencial de los analitos según su
relación carga/radio
P
Flujo hidrodinámico: inducido por presión
+ –
Flujo electroosmótico
Perfiles de flujo para líquidos
Fenómenos de dispersión–ensanchamiento de picos
Flujo laminar F.E.O
EC HPLC
perfil plano perfil parabólico
Perfiles de flujo para líquidos
Fenómenos de dispersión–ensanchamiento de picos
Flujo electroosmótico Flujo laminar
H = A + B/ + C x x
B = 2 Dt
Otras causas:
Longitud finita de la muestra sembrada
Calentamiento por efecto Joule
Dispersión por asimetría
Efecto “stacking” (apilamiento)
Dispersión debida a la detección
coeficiente de difusión
tiempo migración
Causas de ensanchamiento de las bandas
Fenómenos de dispersión–ensanchamiento de picos
Dispersión total
s2 = s2D + s2
I + s2T + s2
A + s2stac + s2
D
Si consideramos a la difusión longitudinal como la principal
causa de ensanchamiento:
s2 = 2 Dt = 2 DL/vneta
vneta = ap E = ap DV/L
s2 = 2 DL2/ ap DV
Número de platos teóricos: N = L2/s2
Sustituyendo: N = ap DV/2D
RESOLUCIÓN
R = = ap(a)
ap(b)
[ap(a) ap(b)]/ +
N 2
Dap
ap
N
DV
R = Dap
ap
ap DV/2D
Dap
ap D
R =
0.707 ap
N = ap DV/2D recordando que:
Fuente de potencial
Columnas
Recipientes de electrolito
Termostatización
Detectores
Equipo de electroforesis capilar
D
FAV
10 – 30 kV
i = 500 – 1000 A
Pt Pt
ánodo cátodo
dH/dt = k E2/L2
Sílice fundida/poliimida, vidrio Pirex, teflón
50 cm longitud y 50 m d.i.
Detector Z
Inyección de la muestra
Hidrodinámica (gradiente de presión entre extremos del capilar)
w = dgr4 hCti /8L
ley de Poiesuille
w = r4 PCti /8L
cantidad de muestra inyectada
h
Flujo
gravitatorio
(sifón)
radio del
capilar
diferencia de presión
densidad aceleración
gravedad
diferencia de altura
vacío
presión
Cantidad de soluto inyectada
voltaje inyección
w = r2 V t C
L
longitud capilar
tiempo inyección
concentración
radio
capilar
movilidad analito
Inyección de la muestra
Electrocinética (diferencia de potencial entre extremos del capilar)
Técnicas de detección en EC
Fluorescencia
Disponible en algunos instrumentos
comerciales
Muy sensible
Se requiere fluoróforo o derivatización pre o
post columna
Fluorescencia
inducida por
láser
Muy sensible
Longitudes de onda disponibles limitadas
Precio elevado
UV-visible Universal
Disponible comercialmente
Amplia información espectral con detector de
diodos en línea
Potenciometría
Se requiere electrodo selectivo de iones
Se debe aislar el detector de la FAV
Sensible siempre que no hayan iones
interferentes
Conductividad Universal
Bajo costo pero poco sensible
Se debe aislar el detector de la FAV
Amperometría
Muy sensible pero solo utilizable con analitos
electroactivos
Altamente específico
Se debe aislar el detector de la FAV
Técnicas de detección en EC
Espectrometría
de masas
Precio muy elevado
Interfaz EC-EM complicada
Sensible y con información estructural
Otras técnicas
Índice de refracción, absorbancia termoóptica,
dicroismo circular, Raman
Técnicas de detección en EC
Electroforesis capilar de zona
Cromatografía electrocinética micelar
Electroforesis capilar en gel
Electrocromatografía capilar
Enfoque isoelectrónico capilar
Isotacoforesis capilar
Modos de aplicación
MODOS DE APLICACIÓN
USO EN
QUÍMICA
ANALÍTICA
Electroforesis capilar de zona (CZE) Capilar lleno de electrolito de fondo y aplicación de campo eléctrico
Mecanismo: separación de analitos según su movilidad en solución
MODOS DE APLICACIÓN
MODOS DE APLICACIÓN
El pH del buffer de fondo es la clave de la separación ya que determina
el grado de ionización y por lo tanto la movilidad relativa de los
diferentes analitos. Debe tener también baja absortividad a la longitud
de onda de detección y baja movilidad electroforética para minimizar el
paso de corriente.
MODOS DE APLICACIÓN
S S
S S
S S
S S
S S
S
Cromatografía electrocinética micelar (MEKC) Capilar lleno de electrolito de fondo que contiene tensioactivo.
Mecanismo: interacciones hidrofóbicas/iónicas de analitos con micelas
Electrocromatografía capilar Capilar funcionalizado con fase estacionaria
Mecanismo: interacciones diferenciales de un analito en dos fases
MODOS DE APLICACIÓN
Electroforesis capilar en gel Capilar relleno con gel que actúa como tamiz molecular
Mecanismo: diferencia de tamaños y carga
Enfoque isoeléctrico capilar (isoelectroenfoque)
Capilar lleno de distintos buffers. Un extremo del capilar sumergido en solución
ácida y el otro en solución alcalina. Se genera gradiente de pH a lo largo del
capilar. Mecanismo: los analitos migran hasta alcanzar el pH donde son neutros
(punto isoeléctrico). Una vez completada la focalización se alcanza un estado
estacionario (no fluye corriente en el capilar). Para la detección, las zonas son
movilizadas hacia el detector por aplicación de presión al capilar o adición de sal
a uno de los reservorios
MODOS DE APLICACIÓN
MODOS DE APLICACIÓN
Isotacoforesis capilar
Mecanismo: separación en el interior de la zona delimitada por dos buffers
Se usan dos buffers con distinta movilidad. Se separan aniones o cationes,
no ambos. Ej: para separar aniones se elige un “electrolito lider o frontal”
cuya forma aniónica posee la mayor movilidad, mientras que el anión del
“electrolito terminal” es el más lento. Al aplicar el E los aniones comienzan a
migrar al ánodo. El anión lider es el que se mueve más rápidamente, con los
demás aniones siguiéndolo detrás. Los analitos se separan en zonas
determinadas por sus movilidades, con el anión más rápido del analito
moviéndose detrás del electrolito lider.
Significa electroforésis a velocidad uniforme. Esto quiere decir que el tiempo de
recorrido en el capilar bajo condiciones isotacoforética es independiente de la
velocidad. Es una técnica de separación por desplazamiento.
Antes de iniciar la corrida, el capilar se debe llenar con un electrolito líder en un
extremo, de gran movilidad, y debe ser mayor que la de los componentes a
separar. Luego se introduce la muestra seguido del electrolito terminal o cola,
cuya movilidad debe ser menor que cualquiera de los componentes de la
muestra. La selección de los electrolitos guías y terminales depende del
conocimiento de los valores de las movilidades y del pKa para todos los
componentes de la muestra.
En ITP las bandas están siempre en contacto con la zona adyacente. Esta
característica es necesaria para mantener la continuidad eléctrica a lo largo del
sistema, dado que no hay un electrolito de soporte.
ITP puede ser usada para determinar cationes y aniones. Se requiere
usualmente corridas separadas para determinar cada forma iónica.
Los Isotacoferogramas pueden mostrar diferencias en el orden de migración en
presencia o no de EOF.
La detección en ITP es usualmente con detectores de "bulk property" de la
solución electrolítica. Se ha utilizado detección de conductividad . También se
han utilizado detectores térmicos (medida del calor de Joule producido dentro de
cada zona) o detectores que miden la caída de voltaje de cada zona.
Isotacoforesis capilar
Equipos de electroforesis capilar
Detección de aminas halucinogénicas (hidromorfona, morfina y codeína) en sangre
total por EC (nalorfina= estándar interno). Condiciones de separación: capilar 70 cm (60 cm del detector) × 75 um de sílice fundida conteniendo 0.4% de β-CD en
100 nM de fosfato pH = 2.38 a 21 kV; 25 °C, inyección a 10 kV durante 16 s;
detección a 200 nm. La recta muestra la respuesta lineal para hidromorfona.
Ejemplos de electroferogramas
.
Controles de calidad para
drogas básicas en sangre total.
Condiciones de separación:
capilar de 60 cm (50 cm del detector) × 75 mm de sílica
fundida conteniendo 100 nM
fosfato pH= 2.38, a 18 kV, 25 °C,
inyección a 10 kV por 8–16 s,
detección a 200 nm. a) control
de calidad de muestra en agua
pura; b) control de calidad del
extracto, 10 ng de cada droga
en sangre porcina; c) control de
calida del blanco con 50 ng/mL
de estandar interno adicionado