DOCTORADO EN CIENCIAS FISIOLÓGICAS CON...
112
UNIVERSIDAD DE COLIMA FACULTAD DE MEDICINA CENTRO UNIVERSITARIO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS DOCTORADO EN CIENCIAS FISIOLÓGICAS CON ESPECIALIDAD EN FISIOLOGÍA PROPIEDADES MECÁNICAS Y MOLECULARES DE TEJIDOS CARDIACOS EN HIPERTROFIA FUNCIONAL DURANTE LA PREÑEZ. TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE DOCTOR EN CIENCIAS FISIOLÓGICAS CON ESPECIALIDAD EN FISIOLOGÍA PRESENTA M. EN C. ADOLFO VIRGEN ORTIZ DIRECTOR DE TESIS DR. J. JESÚS MUÑIZ MURGUÍA COLIMA, COL., MARZO DE 2006
Transcript of DOCTORADO EN CIENCIAS FISIOLÓGICAS CON...
UNIVERSIDAD DE COLIMA FACULTAD DE MEDICINA
CENTRO UNIVERSITARIO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS
DOCTORADO EN CIENCIAS FISIOLÓGICAS CON ESPECIALIDAD EN FISIOLOGÍA
PROPIEDADES MECÁNICAS Y MOLECULARES DE TEJIDOS CARDIACOS EN
HIPERTROFIA FUNCIONAL DURANTE LA PREÑEZ.
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE DOCTOR EN CIENCIAS FISIOLÓGICAS
CON ESPECIALIDAD EN FISIOLOGÍA
PRESENTA
M. EN C. ADOLFO VIRGEN ORTIZ
DIRECTOR DE TESIS
DR. J. JESÚS MUÑIZ MURGUÍA
COLIMA, COL., MARZO DE 2006
DEDICATORIA
Este trabajo realizado lo dedico con mucho amor a mi esposa Liliana, por la
paciencia y el apoyo que me ha otorgado a lo largo de estos años, en los cuales he
sacrificado muchas cosas para dedicarme a realizar experimentos en el laboratorio
que dieron como fruto la obtención de esta tesis doctoral, gracias por permitirme dar
un paso más en mi desarrollo profesional. También, tengo una dedicatoria para mis
dos amados traviesos, mis hijos, Idarita y Haziel, que son una de las razones más
fuertes en esta vida que me impulsan a seguir adelante. Finalmente, este trabajo lo
dedico con mucho cariño a mis padres, Ma. del Carmen y Juan, que fueron los
iniciadores de este camino donde hoy me encuentro.
AGRADECIMIENTOS
A Dios, por permitirme ser lo que hoy soy en esta vida.
Al Dr. Jesús Muñiz, porque además de ser mi asesor fue un amigo, que me otorgó
toda su confianza y en los momentos difíciles ahí estuvo para motivarme y no
dejarme caer ante las dificultades que enfrentamos en esta vida llena de
enseñanzas, en especial en el mundo de la investigación.
A mis compañeros y amigos de laboratorio: Ana, Víctor, Mario y Santiago, con
quienes diariamente compartí experiencias que nos llevaron a mejorar diariamente
en nuestro trabajo.
A los estudiantes: Norma, Enerith, Bertha, Arlet, Yara, Marcela y Uriel, todos ellos
alumnos de la Facultad de Ciencias Químicas, por su valiosa colaboración.
A la Dra, Elena Castro por su asesoría y facilidades otorgadas para la realización de
experimentos de biología molecular en su laboratorio.
A los Drs. Sánchez Chapula y Ricardo Navarro, por enseñarme la técnica de
dispersión de miocitos cardiacos en rata.
Al Dr. Elizalde, por sus valiosos consejos en la realización de experimentos
mecánicos con tiras de músculo cardiaco aislado.
A MVZ. Jesús Dueñas, por su apoyo en la programación de cruzas de ratas para
tener a tiempo ratas en estado de preñez y en posparto.
A la Universidad de Colima, que me permitió estudiar el doctorado en Ciencias
Fisiológicas que ofrece a través de la Facultad de Medicina.
Este proyecto fue desarrollado gracias al financiamiento
CONACYT-MEXICO, 42065M.
FONDO RAMÓN ÁLVAREZ BUYLA DE ALDANA, UNIVERSIDAD DE COLIMA.
CONVENIO UC-MEXUS, 2003.
BECA DE CONACYT PARA ESTUDIAR EL DOCTORADO
INDICE GENERAL
Pág.
Cuadros i
Figuras ii
Abstract vii
Resumen viii
I. Introducción 01
II. Marco teórico 04
La hipertrofia cardiaca 05
El corazón y la preñez 07
La tensión pasiva y la titina cardiaca 09
Cambios de la titina cardiaca durante el desarrollo 14
Tensión pasiva en distintos modelos de disfunción cardiaca 15
La histéresis en tejidos cardiacos 18
III. Hipótesis 20
IV. Objetivos
General 22
Específicos 24
V. Materiales y Métodos 26
Manejo de los animales y obtención de muestras 27
Aislamiento de los miocitos cardiacos para determinar el área de cada
célula.
27
Propiedades mecánicas pasivas 28
Análisis de titina con técnicas bioquímicas y de biología molecular 31
Histología 37
Análisis estadístico 38
VI. Resultados 39
Peso de corazones 40
Área de miocitos cardiacos 42
Desarrollo de la tensión pasiva 45
Correlación entre la longitud de los miocitos cardiacos y la tensión pasiva 54
Histéresis 55
Módulo de elasticidad 57
Electroforesis de titina cardiaca 59
Análisis de Western-blot 60
Niveles de ARNm para titina cardiaca mediante RT-PCR semicuantitativo 63
Cortes histológicos teñidos con Tricromo de Masson 64
VII. Discusión 67
VIII. Conclusiones 75
IX. Perspectivas 78
X. Anexo 81
XI. Bibliografía 85
CUADROS
Cuadro Pág.
1 Cambios en el corazón observados durante el embarazo y
posparto de mujeres sanas.
7
2 Valores hemodinámicos en la preñez de rata. 7
FIGURAS
No. Fig. Pág.
1 Cortes histológicos de paredes miocárdicas
hipertrofiadas por sobrecarga de presión.
6
2 Morfología del corazón durante la preñez y no preñez de
ratón.
6
3 Curso temporal del perfil hormonal plasmático durante la
preñez de rata.
8
4 Esquema de la sarcómera.
10
5 Diferencias de tensión pasiva entre el músculo cardiaco y
esquelético.
11
6 Isoformas de titina N2BA y N2B observadas en músculo
cardiaco.
12
7 Las isoformas de titina modulan la tensión pasiva en el
músculo cardiaco.
13
8 Tensión pasiva y expresión de isoformas de titina en
ventrículo izquierdo de corazón de cerdo.
14
9 Tensión pasiva y expresión de isoformas de titina en
corazón de humano con disfunción en la arteria
coronaria.
15
10 Tensión pasiva en un modelo de cardiomiopatía dilatada
en aves.
16
11 Expresión de isoformas de titina cardiaca asociada a la
tensión pasiva en cardiomiopatía dilatada en humanos.
17
12 Fenómeno de histéresis en miocitos cardiacos aislados.
18
13 Curso temporal de la recuperación de la histéresis en
miocitos cardiacos.
19
14 Sistema utilizado para registrar la tensión pasiva en
cortes de ventrículo cardiaco de rata.
28
15 Registro ilustrativo de tensión pasiva de la pared libre del
ventrículo derecho de rata a una deformación del 10 % L
29
16 Montaje para realizar la electrotransferencia de proteínas.
33
17 Esquema que ilustra los sitios de reconocimiento de los
anticuerpos anti-titina N2B y anti-titina N2BA.
34
18 Relación peso del corazón vs. masa corporal en ratas.
40
19 Peso del corazón de ratas no preñadas, preñadas y en
posparto.
41
20 Área de miocitos cardiacos de la pared libre de ventrículo
derecho, endocardio y epicardio del ventrículo izquierdo
de rata.
42
21 Área de los miocitos cardiacos del ventrículo derecho y
ventrículo izquierdo de ratas no preñadas, preñadas y en
posparto.
43
22 Longitud de los miocitos cardiacos de ratas no preñadas,
preñadas y en posparto.
44
23 Tensión pasiva de la pared libre del ventrículo derecho
en cortes con orientaciones diferentes.
45
24 Tensión pasiva de la pared libre del ventrículo derecho
de ratas no preñadas, preñadas y en posparto.
47
25 Tensión pasiva en ventrículo izquierdo de ratas no
preñadas, preñadas y en posparto
49
26 Tensión pasiva de la pared libre del ventrículo derecho
durante la fase de regreso a su longitud inicial después
de someterse a una deformación.
51
27 Tensión pasiva del ventrículo izquierdo durante la fase de
regreso a su longitud inicial después de someterse a una
deformación.
53
28 Correlación entre la longitud de los miocitos cardiacos y
la tensión pasiva máxima.
54
29 Fenómeno de histéresis en la pared libre del ventrículo
derecho de ratas no preñadas, preñadas y en posparto.
55
30 Fenómeno de histéresis en el ventrículo izquierdo de 56
ratas no preñadas, preñadas y en posparto.
31 Modulo de elasticidad o de Young de la pared libre del
ventrículo derecho.
57
32 Modulo de elasticidad o de Young del ventrículo
izquierdo.
58
33 Curva de calibración con albúmina de suero bovino.
59
34 Western-blot ilustrativo de membranas incubadas con
anticuerpos anti-N2B y anti- N2BA.
60
35 Expresión de isoformas de titina N2B y N2BA en corazón
de ratas no preñadas, preñadas y en posparto.
61
36 Cantidad total de titina respecto a miosina en tejidos
cardiacos de ratas no preñadas, preñadas y en posparto.
62
37 Niveles de expresión de ARNm de las dos isoformas de
titina N2B y N2BA en corazón de ratas no preñadas,
preñadas y en posparto.
63
38 Cortes histológicos de tejidos cardiacos teñidos con
tricromo de Masson.
64
39 Promedio de densidad de colágena ventricular de
corazón de ratas no preñadas, preñadas y en posparto.
65
40 Diferencias en la colágena del pericardio de corazones
de ratas no preñadas, preñadas y en posparto.
66
41 Perspectivas. Probables mecanismos moleculares que
pudieran estar involucrados en el desarrollo de hipertrofia
cardiaca durante la preñez.
81
ABSTRACT
We evaluated changes in passive mechanical properties and titin isoforms expression
in cardiac tissues during rat pregnancy. Left and right ventricles free wall were
dissected from rats heart in non-pregnancy, pregnancy and postpartum. Mechanical
experiments in ventricular strips were done by stretch-release cycles using step
motor. N2B and N2BA titin isoforms expression were measured by western-blotting
(protein) and semiquantitative RT-PCR (mRNA). Besides, collagen was evaluated by
histology. The results show that during the pregnancy a cardiac hypertrophy was
present by increase of myocytes size; passive tension developed by myocardials
walls was decreased; elastic modulus, calculated with Magid and Law equation, and
hysteresis were decreased; and titin isoforms expression levels both, protein and
mRNA, were not altered. Moreover, collagen increased in the pregnancy. All changes
observed in rat pregnancy were reversed during postpartum. The reduction in elastic
modulus means less ventricular rigidity; which could contribute to facilitate the
ventricular filling in conditions of a greater circulating volume, a characteristic of the
pregnancy.
RESUMEN
Evaluamos cambios en las propiedades mecánicas pasivas y expresión de isoformas
de titina en tejidos cardiacos de ratas preñadas. La pared libre de ventrículo derecho
e izquierdo fue disecada del corazón de ratas en preñez, no preñez y posparto. Se
realizaron experimentos mecánicos en tiras ventriculares mediante ciclos de
estiramiento-liberación usando un motor de pasos. La expresión de titina N2B y
N2BA se midió con western-blot (proteína) y RT-PCR semicuantitativo (ARNm).
Además, la colágena fue evaluada por histología. Los resultados muestran que
durante la preñez hay hipertrofia cardiaca por incremento en tamaño de los miocitos;
la tensión pasiva desarrollada por las paredes miocárdicas disminuyó; el modulo
elástico y la histéresis disminuyeron; y los niveles de expresión de las titinas, tanto en
proteína como ARNm, no fueron alterados. Por otra parte, la colágena aumentó en la
preñez. Todos los cambios observados en preñez de rata se revirtieron en el
posparto. La reducción en el módulo elástico significa menos rigidez ventricular que
podría contribuir a facilitar el llenado ventricular en condiciones de mayor volumen
circulante característico del embarazo.
1
INTRODUCCIÓN
2
Durante la preñez, el corazón sufre hipertrofia debido a cambios hemodinámicos
importantes como son el aumento del volumen circulante y la disminución de la
resistencia vascular periférica. Estos cambios se revierten en el posparto (Katz et al.,
1978; Slangen et al., 1997).
En la actualidad, la hipertrofia cardiaca ha sido ampliamente estudiada en modelos
patológicos. También, se han probado distintos fármacos, como los antihipertensivos
(Zakynthinos et al., 2004; Picca et al., 2004) y las estatinas, entre otros (Patel et al.,
2001; Liao, 2004), buscando revertir la hipertrofia; pero aunque hay muchas vías de
señalización estudiadas (Molkentin et al., 2001; Wilkins y Molkentin, 2002 y 2004) y
estudios terapéuticos, todavía no están esclarecidos por completo los mecanismos
de señalización implicados en la hipertrofia. En este aspecto, la hipertrofia cardiaca
funcional que se desarrolla en la preñez y se revierte después del parto, parece ser
un modelo muy interesante de estudio en la búsqueda de mecanismos fisiológicos
que reviertan la hipertrofia cardiaca.
El incremento en la tasa metabólica de la hembra preñada demanda un corazón más
eficiente, con capacidad para expulsar un mayor volumen sistólico. El llenado
diastólico, durante la relajación muscular, es un factor importante para asegurar el
aumento del gasto cardiaco. Las propiedades mecánicas pasivas, a pesar de su
posible papel en este proceso, han sido poco estudiadas. El estudio de la tensión
pasiva y la distensibilidad de los tejidos cardiacos son particularmente interesantes
en los corazones de hembras preñadas, pues un corazón con menor resistencia a la
distensión favorecería el llenado ventricular y aseguraría el aumento en el gasto
cardiaco.
Existen evidencias de que la responsable principal de generar tensión pasiva en
músculo cardiaco y esquelético, es una proteína sarcomérica gigante llamada titina
(Labeit et al., 1992; Squire, 1997; Trinick y Tskhovrebova, 1999; Cazorla et al., 2000;
Freiburg et al., 2000). La región extensible de la titina que regula el desarrollo de
tensión esta formada por: 1) Dominios de Inmunoglobulinas, 2) un segmento PEVK
3
(denominado así, por ser rico en Prolina (P), Glutamato (E), Valina (V) y Lisina (L)) y,
3) una secuencia única de aminoácidos (N2B y/o N2A). En tejidos cardiacos se han
identificado dos isoformas distintas conocidas como N2B y N2BA.
La isoforma N2BA es más larga y menos rígida que la N2B. Se ha propuesto que el
cociente de los niveles de expresión N2BA / N2B, determina las propiedades pasivas
de los tejidos cardiacos en las diferentes especies, y en las distintas regiones de un
mismo corazón (Cazorla et al., 2000; Trombitas et al., 2001; Granzier y Labeit, 2002).
La titina cardiaca en los últimos años despertó gran interés por la contribución que
puede tener en la diástole, y en este punto, no hay datos de los niveles de expresión
de isoformas de titina en la preñez y el posparto.
Dada la escasa información existente acerca de los eventos asociados a la
hipertrofia cardiaca funcional por preñez, fue de particular interés para este estudio,
conocer los cambios en las propiedades mecánicas pasivas y moleculares de titina
(Niveles de expresión de isoformas de N2BA y N2B) de los tejidos ventriculares
izquierdo y derecho durante la preñez y el posparto.
4
MARCO TEÓRICO
5
LA HIPERTROFIA CARDIACA
Las enfermedades cardiacas son de las principales causas de muerte en todo
el mundo. La hipertrofia cardiaca y la fibrosis intersticial son respuestas del corazón a
todas las formas de daño y son las principales determinantes de la morbilidad y
mortalidad por enfermedades cardiacas (Assayag et al., 1997; Haider et al., 1998).
La hipertrofia cardiaca, se define como el incremento en el tamaño del corazón y/o
volumen miofibrilar sin un cambio en el número de miocitos. La hipertrofia le permite
al miocardio adaptarse ante alteraciones funcionales por sobrecarga asociada a un
desafío fisiológico (por ejemplo, un incremento en la demanda de volumen sanguíneo
como ocurre en el embarazo y en atletas de alto rendimiento) o un daño (Wilkins y
Molkentin, 2002). Está ampliamente validado que el entrenamiento físico incrementa
la capacidad cardiovascular y la calidad de vida de los individuos y reduce la
mortalidad en pacientes con falla cardiaca (Belardinelli et al., 1999; Willenheimer et
al., 1998). Estos efectos pueden obtenerse sin un crecimiento importante en el
tamaño del corazón como se ha demostrado en animales experimentales (Mokelke et
al., 1997; Moore et al., 1993). También se sabe que la hipertrofia cardiaca observada
en los atletas profesionales es reversible (Shepard, 1996; Lonhurtst y Stebbins,
1997).
Se han caracterizado dos tipos de la hipertrofia cardiaca, una ocasionada por la
sobrecarga de presión, y otra por la sobrecarga de volumen. La hipertrofia por la
sobrecarga de presión es de forma concéntrica, hay alargamiento del ápex, y
engrosamiento de las paredes miocárdicas (Shimoyama et al., 1999; Van Eickels et
al., 2001). Este tipo de hipertrofia es muy común en situaciones como la hipertensión
arterial (Fig. 1).
6
Fig. 1. Cortes histológicos teñidos con hematoxilina eosina donde se aprecia el
engrosamiento de las paredes miocárdicas durante la hipertrofia por sobrecarga de presión
(panel izquierda), y en el panel de la derecha se observa el alargamiento del ápex.
En la hipertrofia por sobrecarga de volumen, como se puede apreciar en la figura 2,
el corazón tiene un crecimiento excéntrico con un incremento en el diámetro
transverso y se observa un ápex redondeado (Brower y Janicki, 2001; Eghbali et al.,
2005). Este tipo de hipertrofia esta presente en algunas alteraciones como en las
insuficiencias valvulares cardiacas, y en casos fisiológicos adaptativos reversibles
como en el embarazo y en atletas de alto rendimiento.
Fig. 2. Morfología del corazón durante la preñez (P) y no
preñez (NP) de ratón. Se aprecian las diferencias tanto en la
fotografía tomada como en los cortes histológicos teñidos con
hematoxilina-eosina.
7
EL CORAZÓN Y LA PREÑEZ
Tanto en humanos como en ratas, durante la preñez se han observado los siguientes
cambios en el sistema cardiovascular (Cuadros 1 y 2): 1) Desarrollo de hipertrofia
cardiaca, 2) aumento entre el 30 y 40% en el gasto cardiaco, 3) disminución de la
resistencia vascular periférica, 4) incremento del volumen latido, 5) incremento de un
40% en el volumen sanguíneo, 6) aumento de la frecuencia cardiaca, 7) disminución
de la presión sanguínea media en la segunda mitad de la gestación, 8) disminución
del tiempo de eyección del ventrículo izquierdo a lo largo de todo el periodo de
gestación y también, 9) aumento en la actividad del sistema renina-angiotensina-
aldosterona, el flujo sanguíneo renal y la tasa de filtración glomerular (Katz et al.,
1978; Capeless y Clapp, 1989; Gilson et al., 1992; Mabie et al., 1994; Slangen et al.,
1997; Poppas et al., 1997; Chapman et al., 1997; Spaanderman et al., 2000).
Cuadro 1. Cambios en el corazón observados durante el embarazo y posparto de mujeres
sanas.
1er. trimestre 2do. trimestre 3er. Trimestre Posparto
Tiempo de eyección del LV (ms) 302 ± 2.0 290 ± 5.0 281 ± 4.0 310 ± 5.0
Dimensión de LA (mm) 35.4 ± 0.8 38.3 ± 0.9 40.3 ± 0.9 36.1 ± 0.8
Masa del LV (g) 167 ± 8.2 150 ± 8.5 162 ± 8.3 142 ± 6.2
LV = Ventrículo izquierdo, LA = Aurícula izquierda (Katz et al., 1978).
Cuadro 2.Valores hemodinámicos en la preñez de rata
día 4 día 6 día 8 día 10 día 18
HR, latidos / min
P 373 ± 21 375 ± 9 377 ± 10 374 ± 16 408 ± 24
NP 358 ± 21 369 ± 26 365 ± 21 359 ± 11 368 ± 25
MAP, mmHg
P 125 ± 12 112 ± 8 107 ± 9 110 ± 7 101 ± 10
NP 121 ± 8 112 ± 7 109 ± 3 113 ± 6 117 ± 7
Frecuencia cardiaca (HR, pulsos / min) y presión arterial media (MAP, mmHg) en ratas no
preñadas (NP) y preñadas (P) a lo largo del periodo de preñez (Slangen et al., 1997).
8
Se acepta que la hipertrofia cardiaca es iniciada por el estrés mecánico sobre las
paredes miocárdicas (Grossman et al., 1975; Nagatomo et al., 1999); en el caso de la
preñez, la distensión durante el llenado ventricular es una de las señales que inicia la
hipertrofia. La hipertrofia por sobrecarga de volumen generalmente es menor que la
producida por sobrecarga de presión (Nagamoto et al., 1999; Spaanderman et al.,
2000). Otros factores, entre ellos las hormonas esteroideas, cuya tasa de secreción
se incrementa notablemente en la preñez (Fig. 3), podrían ser señales relevantes en
este proceso cardiaco, pero aun no han sido totalmente esclarecidas.
Fig. 3. Curso temporal del perfil hormonal plasmático durante la preñez de rata. Se midieron
los niveles de estradiol (E2), progesterona (P4) y testosterona (T) durante la preñez y un día
después del parto (LaPolt, Matt, Judd, y Lu, 1986).
En resumen, aun cuando la hipertrofia cardiaca durante la preñez este bien
documentada, los mecanismos moleculares que la producen o que están asociados
a ella se desconocen.
LA TENSIÓN PASIVA Y LA TITINA CARDIACA
9
Además, de los cambios hemodinámicos y de la hipertrofia cardiaca, también se
esperarían cambios en la contractilidad del corazón que aumenten su eficiencia
durante la preñez, sin embargo, hay pocos trabajos al respecto que documenten esta
posibilidad. Algunos de estos estudios en ratas han encontrado un aumento en la
velocidad de contracción de fibras musculares cardiacas en la tercera semana de
preñadas (Buttrick, Schaible, Malhotra, Mattioli y Scheuer, 1987), asimismo en
humanos durante el tercer trimestre (Katz et al., 1978); estos datos son muy
importantes, pero hace falta más investigación básica aplicando técnicas invasivas
en animales de experimentación que aporten detalles sobre los eventos asociados a
la hipertrofia cardiaca que se desarrolla durante la preñez.
Otro componente que no ha sido estudiado durante la preñez y el posparto se
relaciona con las propiedades mecánicas pasivas de los tejidos cardiacos. Es
conocido que durante la diástole el miocardio se estira y genera tensión pasiva. La
tensión pasiva se define como la tensión que genera un tejido cuando es estirado o
deformado. Desde los años 70’s se sugería que el origen de la tensión pasiva se
encontraba en el interior de las miofibrillas (Rapoport, 1972 y 1973). Trabajos más
recientes confirman que el principal responsable de producir esta tensión en el
músculo esquelético y cardiaco es una proteína sarcomérica llamada titina (Labeit et
al., 1992; Squire, 1997; Trinick y Tskhovrebova, 1999; Cazorla et al., 2000; Freiburg
et al., 2000). LeWinter (2000), llamo a la titina como el eslabón perdido de la diástole.
La titina (también llamada conectina), fue aislada por Wang, McClure y Tu (1979); y
fue caracterizada bioquímicamente por Maruyama, Kimura, Ohashi y Kuwano (1981),
mientras que Trinick, Knight y Whiting (1984) estudiaron sus propiedades elásticas.
La titina es la tercera proteína más abundante en la sarcómera del músculo cardiaco
pues representa el 10 % de la masa miofibrilar, se extiende desde la línea M hasta el
10
disco Z en las sarcómeras (Fig. 4). Es la proteína más grande identificada hasta la
fecha en el reino animal, esta formada de alrededor de 2700 aminoácidos con una
masa molecular promedio de 2.97-3.3 MDa (Trinick et al., 1984; Skeie, 2000;
Cazorla et al., 2000; Wu et al., 2002).
Fig. 4. Esquema de la sarcómera donde se ilustra la posición de la Titina (Clark et al., 2002).
La titina es una proteína codificada por un gen localizado en el brazo largo del
cromosoma 2 de humanos y roedores (Labeit et al., 1990; Rossi et al., 1994). La
región que actúa como un resorte está formada por dominios de Inmunoglobulinas
(Igs) y, un dominio PEVK denominado así por contener un alto porcentaje de
residuos de los aminoácidos: Prolina (P), Glutamina (E), Valina (V) y Lisina (K).
La titina que se encuentra en el corazón se conoce como titina N2B y la de los
músculos esqueléticos como N2A. La primera posee el elemento N2B formado por 3
monómeros de Ig y una secuencia única (no repetida) de unos 572 aminoácidos,
mientras que el elemento N2A está formado por 4 monómeros de Ig y una secuencia
única de 106 residuos de aminoácidos.
11
La titina cardiaca es más corta que la esquelética, haciendo que sea menos
distensible, por tanto, los tejidos cardiacos son más rígidos en comparación con el
músculo esquelético (Fig. 5).
Fig. 5. Diferencias de tensión pasiva entre el músculo cardiaco y esquelético. Registros
realizados en tiras musculares (Granzier e Irving, 1995).
En el músculo cardiaco, se ha encontrado una isoforma de titina, denominada N2BA
por contener secuencias de N2B y N2A. La titina N2BA tiene un segmento PEVK
más largo y un dominio de Ig mayor que la titina N2B (ver Fig. 6). También, se ha
encontrado que los niveles de expresión de ambas isoformas de titina varían en las
diferentes especies y en las distintas regiones del corazón.
La titina N2B predomina en el ventrículo izquierdo de los roedores (rata y ratón), con
niveles menores de N2BA; y en la aurícula izquierda de bovino domina la expresión
de titina N2BA; mientras que en otros mamíferos más grandes, como el humano,
coexpresan niveles similares de ambas isoformas de titina (Cazorla et al., 2000;
Trombitas et al., 2001).
12
Fig. 6. Isoformas de titina N2BA y N2B observadas en músculo cardiaco (Granzier y Labeit,
2002).
Se ha encontrado que los miocitos cardiacos que expresan principalmente titina N2B
tienen mayor rigidez que aquellos que expresan N2BA (Fig. 7), mientras que, los que
expresan ambas isoformas de titina desarrollan tensión pasiva a niveles intermedios
(Trombitas et al., 2001; Granzier y Labeit, 2002).
13
Fig. 7. El desarrollo de tensión pasiva de miocitos cardiacos es dependiente de la especie y
el tipo de isoforma de titina que expresen (Granzier y Labeit, 2002).
14
CAMBIOS EN LA TITINA CARDIACA DURANTE EL DESARROLLO.
Durante el desarrollo general de un organismo ocurren cambios en la carga
hemodinámica para el corazón, y estos, inducen modificaciones en la contractilidad
debido a alteraciones en los patrones de expresión de proteínas sarcoméricas
(Siedner et al., 2003). Además, se ha encontrado que los tejidos cardiacos de
mamíferos neonatos desarrollan menor tensión pasiva, es decir, son más
distensibles que en etapas posteriores. Recientemente, como se aprecia en la Fig. 8,
se ha reportado que este incremento en tensión pasiva observado durante el
desarrollo es debido a una alteración en los patrones de expresión de isoformas de
titina cardiaca, disminuye el cociente de N2BA / N2B (Lahmers, Wu, Call, Labeit y
Granzier, 2004).
Fig. 8. Desarrollo de la tensión pasiva en ventrículo izquierdo de corazón de cerdo adulto (6
meses) comparado con cerdo neonato (1 día de nacido, d1) (Panel de la izquierda). Curso
temporal de los niveles de expresión de las isoformas de titina N2BA / N2B en ventrículo
izquierdo de cerdo (Panel de la derecha, Lahmers et al., 2004).
15
TENSIÓN PASIVA EN DISTINTOS MODELOS DE DISFUNCIÓN
CARDIACA.
Son muy pocos los estudios sobre los cambios en las propiedades mecánicas
pasivas presentes durante la sístole y la diástole, los cuales regulan el desempeño
del corazón. Neagoe et al. (2002), realizaron un estudio en humanos con disfunción
de arteria coronaria (CAD) y encontraron una disminución del desarrollo de la tensión
pasiva el cual fue asociado a un incremento en los niveles de expresión de la
isoforma de titina N2BA y una disminución en la isoforma de titina N2B (Fig. 9).
Fig. 9. Desarrollo de tensión pasiva (panel izquierda) y niveles de expresión de isoformas de
titina N2BA y N2A (Panel derecha), en corazones de humanos normales y con disfunción en
la arteria coronaria (CAD).
En modelos animales existen controversias al compararlos con humanos; en un
modelo de falla cardiaca inducida por alteraciones en el ritmo cardiaco en perros, se
observó un incremento en el desarrollo de la tensión pasiva asociado a una
disminución en el cociente de isoformas de titina N2BA / N2B (Wu et al., 2002).
16
Por otra parte, en ratas espontáneamente hipertensas que sufren hipertrofia
cardiaca, se ha observado que hay una disminución en los niveles de expresión de
isoformas de titina N2BA / N2B, sugiriendo que los niveles altos de la presión arterial
que cambian los niveles de expresión de isoformas de titina puede resultar en
alteraciones del desempeño cardiaco (Warren, Jordan, Roos, Krzesinski y Greaser,
2003).
Un estudio más reciente, también apoya lo observado en animales, en un modelo de
cardiomiopatía dilatada (DCM) en aves, encontraron que en los tejidos cardiacos
hipertrofiados aumenta el desarrollo de tensión pasiva (Fig. 10) y consecuentemente,
las paredes miocárdicas son más rígidas, alterando la función diastólica del corazón
(Wu, Tobias, Bell, Barry, Helmes, Trombitas, Tucker, Campbell y Granzier, 2004).
Fig. 10. Tensión pasiva desarrollada por trabéculas cardiacas de aves en un modelo
de cardiomiopatía dilatada (DCM).
17
Estudios de DCM en humanos (Fig. 11), muestran que existe una disminución en el
desarrollo de la tensión pasiva y la asocian a cambios moleculares de la titina,
observando un incremento en los niveles de expresión de la relación de isoformas
N2BA / N2B (Nagueh et al., 2004). Además, estudios previos sugerían una
disminución en la cantidad de titina total en pacientes con DCM (Morano et al.,1994),
mientras que Nagueh et al. (2004) demostraron que la titina total no cambia,
apoyando otros trabajos realizados en animales (Cazorla, 2000). El grupo de Nagueh
et al. (2004), proponen que solo cambia la proporción de isoformas de titina cardiaca.
Fig. 11. Niveles de expresión de isoformas de titina cardiaca asociadas al desarrollo de
tensión pasiva en cardiomiopatía dilatada (DCM) en humanos.
En resumen, aun cuando se han realizado numerosos estudios de cambios en la
tensión pasiva asociados a alteraciones cardiacas, no hay ninguno que haya
estudiado los cambios de tensión pasiva y de isoformas de titina en un modelo de
hipertrofia cardiaca reversible, como lo es la preñez, que además podría ayudar a
explicar las adaptaciones en la distensibilidad ventricular que sufre el corazón para
favorecer un mayor llenado diastólico que demanda la preñez.
18
LA HISTÉRESIS EN TEJIDOS CARDIACOS
Durante los latidos del corazón, los miocitos están sujetos a ciclos repetidos de
estiramiento-relajación. En cada ciclo, durante el estiramiento (diástole) aumenta el
desarrollo de tensión pasiva debido a que los elementos elásticos de la sarcómera se
extienden; y durante la contracción (sístole) el desarrollo de tensión pasiva
disminuye, por tanto, es de esperar que pueda influir sobre el llenado y vaciado
ventricular. Además, durante los ciclos de deformación de los miocitos se presenta el
fenómeno de histéresis, es decir, la fuerza que se desarrolla durante el estiramiento
no es la misma que durante la relajación a una misma longitud de la sarcómera (Fig.
12). Se ha propuesto que la histéresis depende de la velocidad de desdoblamiento y
de la velocidad de redoblamiento de la molécula de titina (Li, et al., 2002).
Fig. 12. Fenómeno de histéresis. Desarrollo de tensión pasiva a distintas deformaciones en
miocitos cardiacos. La velocidad de deformación fue de 0.1 L/s y el reposo entre cada ciclo
de deformación fue de 15 min (Helmes et al.,1999).
19
Se ha observado que cuando se aplican ciclos de deformación repetidos con
intervalos de reposo, la histéresis disminuye (ver Fig. 13), para lo cual se sugiere que
la titina pueda ajustar su longitud para evitar la perdida de energía en forma de calor
generada durante la histéresis (Kellermayer, Smith, Granzier y Bustamante, 1997).
Fig. 13. Curso temporal de la recuperación de la histéresis. Los miocitos fueron estirados con
la misma deformación y velocidad a distintos tiempos de reposo, 0 seg, 12 seg y 120 seg.
Por otro parte, durante la preñez, hay un incremento en la frecuencia cardiaca, es
decir, los miocitos cardiacos son sometidos a mayor frecuencia de ciclos de
deformación; por lo tanto, podríamos esperar que durante la preñez, disminuya la
histéresis, actuando como un mecanismo de adaptación ante el incremento de
latidos por minuto, así el mecanismo de deformación relajación de los miocitos sería
más eficiente con menor perdida de energía en forma de calor; sin embargo, a la
fecha se desconoce, por lo que forma parte de este trabajo de investigación conocer
el grado de histéresis que presentan los tejidos cardiacos durante la preñez usando
como modelo experimental la rata.
20
HIPÓTESIS
21
Durante la preñez, los tejidos cardiacos hipertrofiados, desarrollan menor tensión
pasiva, debido a que aumenta el cociente de la expresión de titina N2BA/N2B, lo cual
provoca que las paredes miocárdicas tengan una mayor distensibilidad (menor
rigidez).
22
OBJETIVO GENERAL
23
Estudiar las propiedades mecánicas pasivas y los niveles de expresión de la titina en
tejidos cardiacos que desarrollan hipertrofia funcional durante la preñez.
24
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
25
1) Determinar la existencia de la hipertrofia cardiaca funcional en ratas preñadas.
2) Caracterizar los cambios en el área de los miocitos cardiacos de ventrículo
derecho e izquierdo obtenidos de dispersiones celulares de corazones de
ratas no preñadas (NP), preñadas (P18) y en posparto (PP).
3) Estudiar el desarrollo de la tensión pasiva del ventrículo derecho e izquierdo a
diferentes deformaciones en corazones de ratas NP, P18 y PP, y comparar
mediante curvas de esfuerzo-deformación.
4) Determinar y comparar el módulo de elasticidad del ventrículo derecho e
izquierdo en corazones de ratas no preñadas, preñadas y en posparto.
5) Valorar el fenómeno de histéresis en ventrículo derecho e izquierdo en
corazones de ratas NP, P18 y PP.
6) Determinar la cantidad de expresión (a nivel de proteína) de las isoformas de
titina N2B y N2BA en ventrículo derecho e izquierdo de corazones de ratas
NP, P18 y PP, usando western-blot.
7) Medir los niveles de expresión de ARNm de las isoformas de titina N2B y
N2BA de ventrículo derecho e izquierdo de corazones de ratas NP, P18 y PP,
mediante RT-PCR.
8) Estudiar cambios en la colágena mediante técnica histológica en tejidos
cardiacos de ratas NP, P18 y PP.
26
MATERIALES Y MÉTODOS
27
MANEJO DE LOS ANIMALES Y OBTENCIÓN DE MUESTRAS.
Ratas hembra de la cepa Sprague-Dawley de 200 - 250 g de peso corporal, no
preñadas en diestro (grupo control, NP), preñadas de 18 días (P18), y 7 días
posparto (PP) fueron sacrificadas con sobredosis de anestésico (Pentobarbital
Sódico). Los animales fueron manejados de acuerdo con la “Guide for the Care and
Use of Laboratory Animals (US Department of Health, NIH)”. El corazón fue extirpado
rápidamente por medio de una toracotomía medial y sumergido en solución de
Tyrode normal (véase composición en anexo) oxigenado con una mezcla de 95 % O2
+ 5 % CO2 a la temperatura ambiente (24 C). Después de obtener el peso húmedo
en una balanza de pesada rápida (Sartorius Corporation, Edgewood, NY, USA), se
procedió a la disección de la pared libre del ventrículo derecho y ventrículo izquierdo
con el corazón sumergido en la solución de Tyrode normal en una caja de Petri con
fondo cubierto con sylgard. Se obtuvieron tiras de aproximadamente 4 mm de
longitud, 2 mm de ancho y 0.5 mm de espesor cortadas desde la base (anillo fibroso)
hacia la región del ápex. De cada corazón, se obtuvieron preparaciones para
estudiar: 1) las propiedades mecánicas pasivas y, 2) la composición molecular de
titina (a nivel de proteína con electroforesis y western blot, y a nivel de ARNm con
RT-PCR semicuantitativo.
AISLAMIENTO DE LOS MIOCITOS CARDIACOS PARA DETERMINAR EL ÁREA
DE CADA CÉLULA.
El corazón fue rápidamente extraído y montado en un sistema de perfusión de
Langendorff. Se perfundió con solución de Tyrode normal por 5 min seguido de
Tyrode libre de Calcio por 5 min. Posteriormente, se perfundió por 15 min con una
mezcla de enzimas: 0.5 mg/ml de Colagenasa tipo I y 0.05 mg/ml de Proteasa XIV
(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) diluidas en Tyrode libre de Calcio
(Sánchez-Chapula, Salinas-Stefanon, Torres-Jácome, Benavides-Haro, Navarro-
Polanco, 2001). Finalmente, la enzima se lavó por 10 min con medio KB (Kraftbihue,
ver composición en anexo) (Isenberg y Klockner, 1982). Se obtuvieron cortes de la
28
pared libre del ventrículo derecho, y del epicardio y endocardio del ventrículo
izquierdo.
Las preparaciones fueron almacenadas a 4 ºC en medio KB durante 1 hora y
posteriormente los miocitos fueron observados con un microscopio Olympus
BX51WI, se adquirieron imágenes y fueron analizadas con el programa 1D Image
Analysis versión 3.0 (Kodak, Rochester, NY, USA) con el fin de determinar el área y
la longitud y latitud de cada miocito cardiaco.
PROPIEDADES MECÁNICAS PASIVAS
Las preparaciones fueron incubadas en solución cardiopléjica oxigenada (ver
composición en anexo) y la temperatura fue regulada a 37 °C con un baño de
recirculación (Techne, UK). Las preparaciones se ataron por sus extremos a dos
soportes de acero inoxidable en forma de L con hilo seda 8 ceros. Posteriormente, se
transfirieron a una cámara para órgano aislado horizontal de doble pared con
circulación interna (Radnoti, WPI Inc, Florida, USA). Uno de los soportes se fijó a un
transductor de tensión (Kent Sci Corporation, TRN011) y el otro, al actuador de un
motor (Ultramotion HT2340I4IK, Bimba, Illinois, USA) controlado por computadora
(Fig. 14).
Fig. 14. Sistema utilizado para registrar la tensión pasiva en cortes de ventrículo derecho e
izquierdo de ratas no preñadas, preñadas y en posparto. La cámara donde se colocó la
preparación se mantuvo con temperatura constante de 37 °C.
29
El protocolo de registro mecánico consistió en ajustar la tensión basal
progresivamente hasta 500 mg (tensión de reposo de tejidos cardiacos; Gando et al.,
1997; Hattori et al., 2000).
Las preparaciones permanecieron en estas condiciones una hora recambiando la
solución del baño cada 15 minutos. Después, mediante el motor comandado por
computadora se aplicaron ciclos de deformación del 5, 10 y 20 % a una velocidad de
0.2 L/s (L es la longitud de la tira).
La tensión pasiva generada por estos ciclos de deformación fue amplificada y
digitalizada para su posterior análisis (ver registro ilustrativo en la Fig. 15).
Fig. 15. Tensión pasiva registrada a una deformación del 10 % L. Este es un registro
ilustrativo de la pared libre del ventrículo derecho de rata no preñada, donde se puede
apreciar el protocolo utilizado en los grupos experimentales.
2000
N /
m2
O.05 L
30
Posteriormente, los registros de tensión fueron estudiados comparativamente
mediante curvas de esfuerzo–deformación (Muñiz, Del Río, Huerta y Marín, 2001).
Estas curvas se construyeron calculando el esfuerzo () con la siguiente ecuación:
= Fuerza / CSA
Donde, la Fuerza es la tensión registrada con el transductor y, CSA es el área de
corte transversal de la preparación calculada a partir de la siguiente ecuación:
CSA = m / (L * ),
Donde, m es la masa del músculo (g); L, la longitud del músculo (cm) y, la densidad
muscular cardiaca (1.05 g / cm3) (Katz et al., 1988; Perhonen et al., 2001).
Por otro lado, la deformación () fue calculada con la ecuación:
Li
LiLf
Donde, Li y Lf corresponden a la longitud inicial y final respectivamente.
Finalmente, las curvas de esfuerzo-deformación fueron ajustadas a la ecuación de
Magid y Law (1985) con la finalidad de calcular el modulo de elasticidad del tejido
cardiaco en cada grupo experimental.
Ln () = α + Ln (E0 / α)
Donde , es el esfuerzo (Pascales = N / m2); , es la deformación; α, corresponde a la
tasa de deformación y es una medida de la velocidad de crecimiento de la curva y;
E0, es el Modulo de elasticidad o de Young el cual se calculó de la parte lineal de la
curva que corresponde entre el 50 y 95 % de la tensión máxima alcanzada (De Zee,
Bojsen-Møller, y Voigt, 2000).
También, se midió la histéresis entre la curva del desarrollo de tensión pasiva del
estiramiento y la relajación a partir de la longitud inicial. Esta histéresis fue medida
como el área entre las dos curvas (Helmes et al., 1999; Minajeva, Kulke, Fernandez y
Linke, 2001), y se expresó en Joules (J).
31
ANÁLISIS DE LA TITINA CARDIACA CON TÉCNICAS DE BIOQUÍMICA Y
BIOLOGÍA MOLECULAR
A) Estudios sobre las isoformas de la titina a nivel de proteína
Preparación de Muestras y Solubilización
Las preparaciones de ventrículos fueron pesadas y pulverizadas en nitrógeno líquido
usando un mortero con pistilo. Se adicionó amortiguador de solubilización en una
dilución 90:1 (50 mM Tris-Cl, 2 % dodecil sulfato de sodio (SDS), 80 mM de
ditiotreitol (DTT), 10 % de Glicerol) pH 6.8 a 0 °C. Se agitaron los homogenados en
un Vortex (Thermolyne Iowa, USA) y se sometieron a centrifugación a 2500 rpm por
2 minutos para favorecer la extracción. Se guardaron duplicados de las muestras a -
70 °C para su posterior análisis (Granzier y Wang, 1993).
Determinación de Proteínas en los Homogenados
Para determinar la cantidad de proteína que se cargaría en los carriles de los geles
se realizó una curva estándar con Albúmina de Suero Bovino (BSA, Sigma-Aldrich,
Missouri, USA). Se preparó una solución madre de 10 mg/ml y se realizaron
diluciones en agua desionizada para alcanzar un rango de concentración de 0.1 a 1
μg/μL. Se midió la absorbancia de las diluciones a 280 nm en un Biofotómetro
(Eppendor, Hamburg, Alemania) y se graficó la concentración versus absorbancia
ajustando la curva a una recta (Ausubel et al., 2003).
Electroforesis en Geles de Poliacrilamida
Los homogenados se diluyeron en amortiguador de carga (Tris 0.075 M, SDS 3 %,
DTT 0.12 M, Glicerol 15 %, Pyronin Y 55 mg/ml) e inhibidores de proteasas
(Leupeptina 0.04 mmol/L, y E64 0.01 mmol/L, pH 6.8). Las muestras se aplicaron
sobre geles de poliacrilamida con gradiente de concentración del 3 % al 12 % (ver
composición en anexo) y se utilizó como amortiguador para el corrimiento: Tris-
acetato 0.04 M, acetato de sodio 0.020 M, EDTA 0.002 M, SDS 0.1 %, pH 7.6 a
15°C.
32
La electroforesis se corrió a 120 V durante 3 horas en una cámara vertical con
sistema de enfriamiento (≈10 ºC). Las huellas fueron fijadas con una solución de
isopropanol al 25 % y ácido acético al 10 % durante 15 minutos.
Los geles se tiñeron con azul de Coomassie R al 0.5 % durante toda la noche,
posteriormente se decoloraron y finalmente los geles fueron escaneados a una
resolución de 300 dpi (HP Scanjet 4070, Photosmart Scanner) y analizados por
densitometría con el programa 1D Image Analysis versión 3.0 (Kodak, Rochester,
NY, USA).
Cuantificación de proteínas por Western blot
Después de la separación electroforética de las proteínas, los geles teñidos se
lavaron con agua desionizada durante 15 min y fueron decolorados con las
siguientes soluciones: solución 25 mM Tris base / 192 mM glicina/1 % SDS durante
una hora en agitación suave, seguida de 25 mM Tris base/192 mM glicina / 0.1 %
SDS por 30 min, y finalmente para incrementar la eficiencia de la transferencia en el
caso de proteínas grandes como la titina (≈ 3 MDa), se colocó en una solución de
urea 6 M durante 30 min (Perides, Plagens y Traub,1986; Dionisi, Checa y
Viale,1995).
Los geles decolorados, el papel trans-blot (Bio-Rad laboratorios CA, USA) y la
membrana de PVDF (ImmobilonTM-P, Millipore Corporation, Bedford MA, USA),
previamente tratada con metanol durante un minuto, fueron sumergidos en
amortiguador de transferencia (ver composición en anexo) por un tiempo de 30 min.
Posteriormente, se realizó un sándwich como se ilustra en la figura 16.
33
El sándwich se colocó en una cámara de transferencia vertical (Trans-Blot Cell, Bio-
Rad, USA) y se llenó con amortiguador de transferencia. La cámara fue montada
sobre un sistema con agitación magnética, y los electrodos se conectaron a una
fuente de poder (Consort E865, Bélgica) y la electrotransferencia se realizó a 100 V
durante una hora o a 14 V toda la noche en un cuarto frío. Terminada la transferencia
se lavó la membrana varias veces con agua desionizada, y para determinar la
eficiencia de esta, se tiñó con solución de Ponceau S durante 5 min a temperatura
ambiente, una vez visualizadas las bandas de las proteínas en la membrana, se
decoloró con agua desionizada por 15 min (Ausubel et al., 2003).
La membrana fue prehibridada con solución de bloqueo (ver composición en anexo)
durante una hora a temperatura ambiente en agitación suave, en seguida se le
realizaron 3 lavados de 5 min con amortiguador PBS. Después, se dejó 15 min en
solución de Avidina y 15 min en solución de Biotina, lavando con PBS entre cada
solución.
Fig. 16. Montaje para realizar la electrotransferencia de proteínas
de un gel SDS-PAGE a membrana de PVDF.
34
Posteriormente, la membrana fue hibridada con anticuerpo primario específico anti-
titina N2B (I16/I17, Fig. 17) y otras membranas con anti-titina N2A (I72/I73, Fig. 17)
donados amablemente por el Dr. Siegfried Labeit (European Molecular Biology
Laboratory, Heidelberg, Alemania), diluidos 1:1000 en solución de bloqueo durante 2
horas a temperatura ambiente o toda la noche en un cuarto frío.
Fig. 17. Esquema de la estructura de Titina conformada por dominios de Inmunoglobulina (I),
elementos N2B y N2A, y la región del PEVK. En este esquema se muestran los sitios de
reconocimiento de los anticuerpos anti-titina N2B (I16/I17) y anti-titina N2BA (I72/73)
donados amablemente por el Dr. Labeit (Modificado de Granzier y Labeit, 2004).
Después del tratamiento con anticuerpo primario, la membrana se lavó con
amortiguador PBS y se marcó con un anticuerpo secundario anti-conejo policlonal
biotinilado (Amersham Biosciences, UK) diluido 1:400 en solución de bloqueo, se
dejó durante 30 min a temperatura ambiente y se lavó con PBS.
35
Para el revelado, la membrana fue tratada con el complejo ABC peroxidasa durante
30 min (kit de Vectastain, Vector Laboratorios Inc. Burlingame, CA, USA) y con el
substrato DAB (Roche Applied Science, Penzberg, Alemania) hasta la aparición de
bandas, el DAB en presencia de peroxidasa formó un precipitado café fácil de
visualizar. Las bandas inmnoreactivas fueron analizadas por densitometría con el
programa 1D Image Analysis versión 3.0 (Kodak, Rochester, NY, USA). La cantidad
de la titina se determinó como el área integrada de la banda para cada grupo
experimental (n=8).
B) Estudio de las isoformas de la titina a nivel de ARNm
Extracción de ARN total
Se siguió el protocolo basado en el Trizol (Isotiocianato de Guanidina y Fenol de
Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). El tejido se pulverizó en Nitrógeno
líquido y se agregó 1 ml de Trizol por cada 100 mg de tejido, se incubó 5 min a
temperatura ambiente y después se adicionó 0.2 ml de Cloroformo por cada mililitro
de Trizol, se agitó en el vortex y se incubó a temperatura ambiente durante 3 min.
Posteriormente, fue centrifugado a 12, 000 rpm a 4 ºC durante 15 min. La fase
acuosa fue transferida a un tubo nuevo y se agregó 0.5 ml de isopropanol por cada
mililitro de Trizol, se dejó en incubación durante 10 min y después, nuevamente fue
centrifugado a 12, 000 rpm a 4 ºC durante 10 min. El sobrenadante fue eliminado por
decantación y se agregó 1 ml de Etanol al 75 % preparado en agua-DEP (agua libre
de ARNasas, ver preparación en anexo). El etanol fue eliminado con un sistema de
vacío, se secó y el ARN fue resuspendido en 200 μl de agua-DEP (Ausubel et al.,
2003).
RT-PCR (Retrotranscripción seguida de una amplificación de ADN por medio de la
Reacción en Cadena de la Polimerasa).
Se diseñaron primers u oligos en nuestro laboratorio y posteriormente fueron
construidos por GibcoBRL/Life Technologies (Grand Island, NY, USA). Los primers
fueron gen-específicos para las isoformas de titina en estudio, N2BA y N2B; así
36
como de un gen control GAPDH (gen que codifica para la enzima Gliceraldehido 3-
Fosfato Deshidrogenasa).
Las secuencias fueron tomadas de Entrez Nucleotide del Nacional Center of
Biotechnology information. Las claves de acceso fueron: titina N2BA, AF525411;
titina N2B, AF525412; y la enzima GAPDH, X02231. Los primers diseñados fueron:
N2BA
PRIMER F (Forward o sentido): 5’-ATACAGAACATCGTGGTGAGC-3’
8227-8247, Tm = 62 ºC
PRIMER R (Reverse o anti-sentido): 5’-CTTCCGGGACTTTAGGTGGG-3’
9327-9346, Tm = 64 ºC, Fragmento = 1119 pb.
N2B
PRIMER F: 5’-TGAGCAGATCGGCCAGCAAAT-3’ 154–174, Tm = 64 ºC
PRIMER R: 5’-GGACATGATAACGGGTTGCAG-3’ 1204–1224, Tm = 64 ºC
Fragmento = 1070 pb
GAPDH
PRIMER F: 5’-GCATCTTCTTGTGCAGTGCCA-3’ 32 – 52, Tm = 66 ºC
PRIMER R: 5’-CCACCCTGTTGCTGTAGCC-3’ 1020 – 1038, Tm = 62 ºC
Fragmento = 1006 pb
Con los primers, se realizó la RT-PCR siguiendo las recomendaciones del kit
SuperScript One Step RT-PCR with Platinum Taq (Invitrogen Life Technologies,
Carlsbad, CA, USA). Para una reacción de 50 μl se agregó a un tubo eppendorf: 25
μl de buffer Mix 2x (0.4 mM por cada dNTP, 2.4 mM MgSO4), 1 μg de RNA, 1 μl de
primer F, 1 μl de primer R, 1 μl de RT / Platinum Taq y se aforó con agua esterilizada
hasta 50 μl.
La reacción de RT-PCR se llevó a cabo en un termociclador (iCycler, Bio-Rad
laboratorios CA, USA) en tres etapas:
37
1) Síntesis de cDNA y pre-desnaturalización:
1 ciclo de: 50 ºC por 30 min y 94 ºC por 2 min.
2) Amplificación de cDNA:
30 ciclos de: desnaturalización, 94 ºC por 15 segundos; Alineamiento, 62 ºC por 30
min; Extensión, 72 ºC por 1.06 min.
3) Extensión final:
1 ciclo de 72 ºC por 5 min.
Los cDNAs amplificados y un marcador de 100 pb (Invitrogen Life Technologies,
Carlsbad, CA, USA) se mezclaron con buffer de carga y se corrieron en geles de
agarosa al 1 % durante 2 horas a 110 V en una cámara horizontal. Como buffer de
corrimiento se utilizó TBE 1X (ver composición en anexo). Posteriormente, los geles
fueron teñidos con Bromuro de Etidio y se adquirieron imágenes en un
transiluminador U.V con el sistema gel doc (Bio-Rad, USA) y fueron analizados con
el programa Quantity One versión 9.2.1 (Bio-Rad, USA).
HISTOLOGÍA
Corazones de ratas NP, P18 y PP, fueron fijados en formol al 10% amortiguado a pH
de 7.0, posteriormente se embebieron en parafina y se realizaron cortes de 4 µm de
espesor con un micrótomo (Leica). Los cortes se tiñeron con la técnica tricrómica de
Masson la cual consistió en: hidratar los tejidos con agua destilada; colorear con
fucsina ácida; lavar con agua destilada y colorear con ácido fosfotúngstico-
fosfomolíbdico; contrastar con azul de anilina; lavar con agua destilada y diferenciar
con ácido acético al 1%; deshidratar y aclarar con alcohol etílico al 95%, alcohol
absoluto y xileno; finalmente hacer el montaje en medio resinoso (Prophet el al.,
1992). Posteriormente, los cortes fueron examinados con microscopía óptica, las
imágenes fueron adquiridas con un microscopio Axioscop provisto de cámara digital
MR5 (Carl Zeiss, Gottingen, Germany).
38
La densidad de colágena fue cuantificada como la cantidad de píxeles de color azul
(colágena) entre el total de píxeles por área de tejido cardiaco (Hill et al., 2002),
utilizando el programa Image 1.6 del Nacional Institute of Health USA.
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Los datos fueron expresados como medias ± error estándar. Las medias fueron
comparadas con la prueba de Mann-Whitney, y la comparación entre curvas se
realizó con un análisis de varianza de un factor con una prueba post hoc de Tukey.
Para evaluar asociaciones se utilizó el coeficiente de correlación de Pearson. Las
diferencias fueron consideradas significativas cuando se obtenía una p < 0.05.
39
RESULTADOS
40
Peso del Corazón
Se midió la relación masa del corazón (mg) / peso corporal de la rata (g), y se
encontró que las ratas después de 18 días de preñez desarrollaron hipertrofia
cardiaca de manera significativa (p < 0.05) en comparación con las ratas no
preñadas. Además, como se puede apreciar en la figura 18, 7 días después del
parto, se observó reversión significativa (p < 0.05) de la hipertrofia cardiaca en ratas
que concluyeron la preñez.
Fig. 18. Relación peso del corazón vs. Masa corporal. Variación del peso del corazón en
relación al peso corporal de la rata en tres grupos experimentales: ratas no preñadas (NP),
ratas de 18 días de preñez (P18) y ratas 7 días después del parto (PP). Esta relación indica
que el corazón crece en un 16 % durante la preñez. Los valores corresponden a medias ±
error estándar, n = 16 por grupo. * p < 0.05.
Pes
o de
l Cor
azón
(m
g) /
Pes
o co
rpor
al d
e la
rat
a (g
r)
0
1
2
3
4
5
NPP18PP
Grupos Experimentales
*
41
La variación promedio del peso de los corazones de ratas preñadas es muy grande
como se aprecia en la Fig. 19.
Grupos Experimentales
Pe
so d
el C
oraz
ón (
mg)
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600 NPP18PP*
Fig. 19. Peso del corazón de ratas en tres grupos experimentales: no preñadas (NP), de 18
días de preñez (P18) y, 7 días después del parto (PP). El incremento relativo en las P18 es
de 28 % respecto al NP o PP. Los valores corresponden a medias ± error estándar, n = 16
por grupo. * p < 0.05.
42
Área de los Miocitos Cardiacos.
Para determinar si el incremento en masa cardiaca observado en las ratas preñadas
se asocia a cambios en el tamaño de los miocitos, se midió el área de cada miocito
en una dispersión celular. Se evaluaron: la pared libre del ventrículo derecho, y el
endocardio y epicardio del ventrículo izquierdo. Para todas las regiones se encontró
que en la preñez hay un incremento significativo (p 0.05) en el área de los miocitos
(Fig. 20). También, se observó que 7 días después del parto hay una disminución del
área de los miocitos respecto a la preñez.
Áre
a de
los
Mio
cito
s C
ardi
acos
( m
2 )
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
NPP18PP
PLVD ENDO EPI
**
*
Fig. 20. Área de los miocitos cardiacos de la pared libre de ventrículo derecho (PLVD),
endocardio (ENDO) y epicardio (EPI) del ventrículo izquierdo, de ratas no preñadas (NP),
preñadas de 18 días (P18) y en posparto (7 días después del parto, PP). Los datos
corresponden a 200 células y una n = 4 animales por grupo y están expresados en medias ±
error estándar. * p < 0.05.
43
Además, los miocitos cardiacos fueron agrupados en dos regiones: ventrículo
derecho (los miocitos de la pared libre del ventrículo derecho) y ventrículo izquierdo
(miocitos del endocardio y epicardio del ventrículo izquierdo) y al graficar los
promedios, se puede apreciar como aumenta de forma significativa (p 0.05) el área
de los miocitos de ambos ventrículos durante la preñez, mientras que en el posparto
tiende a revertirse este incremento (Fig. 21). También se observó que el aumento en
el área de los miocitos es mayor en el ventrículo derecho en comparación con el
izquierdo, misma tendencia se aprecia en la reversibilidad, es decir, el área de los
miocitos del ventrículo derecho se revierte más que los del ventrículo izquierdo
durante el posparto.
Áre
a de
los
Mio
cito
s C
ardi
acos
( m
2 )
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
NPP18PP
VD VI
**
Fig. 21. Área de los miocitos cardiacos del ventrículo derecho (VD) y ventrículo izquierdo
(VI), de ratas no preñadas (NP), preñadas de 18 días (P18) y en posparto (7 días después
del parto, PP). Los datos corresponden a 200 células y una n = 4 animales por grupo y están
expresados en medias ± error estándar. * p < 0.05.
44
Para conocer si el cambio en el área de los miocitos cardiacos es resultado de un
cambio en su longitud, medimos el eje longitudinal y transversal, encontrando que
este último no muestra cambios significativos entre los tres grupos, en cambio si
observamos cambios notables en el eje longitudinal, lo cual esta graficado en la Fig.
22. Estos resultados indican que el aumento en el tamaño de los miocitos durante la
preñez se debe a un aumento en la longitud. Lo
ngi
tud
de lo
s M
ioci
tos
Car
diac
os
(m
)
0
20
40
60
80
100
120
140
160 NPP18PP
PLVD ENDO EPI
*
**
Lo
ngi
tud
de
los
Mio
cito
s C
ard
iaco
s (
m)
0
20
40
60
80
100
120
140
160 NPP18PP
VD VI
*
*
Fig. 22. Longitud de los miocitos cardiacos. Panel de arriba, subdivididos en 3 regiones
PLVD, ENDO y EPI. Panel de abajo, divididos en ventrículo derecho (VD = PLVD) y
ventrículo izquierdo (VI = ENDO + EPI); en diferentes condiciones experimentales: ratas no
preñadas (NP), preñadas de 18 días (P18) y en posparto (7 días después del parto, PP). Los
datos corresponden a 200 células y una n = 4 animales por grupo y están expresados en
medias ± error estándar. * p < 0.05.
45
Desarrollo de la Tensión Pasiva
Uno de nuestros objetivos fue estudiar si la hipertrofia cardiaca observada en la
preñez esta asociada a cambios en la tensión pasiva desarrollada por los tejidos
miocárdicos (pared libre del ventrículo derecho y ventrículo izquierdo), por lo que se
realizaron deformaciones del 5 %, 10 % y 20 % de la longitud de la tira muscular
cardiaca a una velocidad de 0.2 L / s.
Se realizaron registros de tiras musculares cardiacas obtenidas de cortes en tres
orientaciones: 1) corte vertical desde la base del anillo hasta el ápex, 2) corte
diagonal desde la base del anillo hasta el ápex, y 3) corte horizontal por la parte
ecuatorial de la pared ventricular. Los resultados encontrados (Fig. 23), muestran
diferencias en el desarrollo de la tensión pasiva con las distintas orientaciones
estudiadas.
Fig. 23. Tensión pasiva desarrollada por la pared libre del ventrículo derecho de una rata no
preñada con una deformación del 10 % L, en tres orientaciones: Vertical, Diagonal y
Horizontal.
0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12
Ten
sión
pas
iva
(N /
m2)
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
VerticalHorizontalDiagonal
46
Los resultados encontrados en la pared libre del ventrículo derecho, nos indican que
de forma significativa (p < 0.05), durante la fase de deformación del 5 %, 10 % y 20
%, el desarrollo de tensión pasiva es menor en el grupo de las ratas preñadas al
compararlo con las ratas no preñadas, mientras que las ratas del grupo en posparto
desarrollan tensión pasiva cardiaca similar al grupo de no preñadas (Fig. 24, panel A,
B y C). También, se observó un incremento de la tensión pasiva en los tres grupos
estudiados conforme se incremento el porcentaje de deformación.
Fig. 24 A
Deformación ()
0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05
Te
nsió
n pa
siva
(N
/ m
2 )
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
NPP18PP
47
Fig. 24. Desarrollo de la tensión pasiva en la pared libre del ventrículo derecho de ratas no
preñadas (NP), preñadas de 18 días (P18) y en posparto (7 días después del parto, PP), a
distintas deformaciones: Panel A, 5 %; Panel B, 10 %; y Panel C, 20 % de la longitud de la
tira muscular. Los datos corresponden a medias error estándar (n = 16).
Fig. 24 B
Deformación ()
0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10
Ten
sión
pas
iva
(N /
m2 )
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
NPP18PP
Fig. 24 C
Deformación ()
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20
Ten
sió
n pa
siva
(N
/ m
2 )
0
5000
10000
15000
20000
25000
NPP18PP
48
La tensión pasiva desarrollada por el ventrículo izquierdo durante la preñez es
significativamente menor (p 0.05) en comparación con el ventrículo de ratas no
preñadas. Además, se encontró que los ventrículos de ratas en posparto desarrollan
tensión pasiva muy similar al grupo de las no preñadas (Fig. 25, panel A, B y C). Con
el incremento de deformación aumentó de forma muy significativa (p 0.05), el
desarrollo de la tensión pasiva para los 3 grupos en estudio.
Fig. 25 A
Deformación ()
0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05
Ten
sión
pas
iva
(N /
m2 )
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
NPP18PP
49
Fig. 25. Desarrollo de la tensión pasiva en el ventrículo izquierdo de ratas no preñadas (NP),
preñadas de 18 días (P18) y en posparto (7 días después del parto, PP), a distintas
deformaciones: Panel A, 5 %; Panel B, 10 %; y Panel C, 20 % de la longitud de la tira
muscular. Los datos corresponden a medias error estándar (n = 16).
Fig. 25 B
Deformación ()
0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10
Ten
sión
pas
iva
(N /
m2)
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
NPP18PP
Fig. 25 C
Deformación ()
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20
Te
nsió
n p
asi
va (
N /
m2)
0
5000
10000
15000
20000
25000
NPP18PP
50
Por otra parte, resultó de interés estudiar el desarrollo de la tensión pasiva durante la
fase de regreso a su longitud inicial, después de la fase de estiramiento. Los
resultados indican que de manera significativa (p 0.05), la pared libre del ventrículo
derecho de ratas preñadas desarrolla menor tensión pasiva que la pared del grupo
de ratas no preñadas, mientras que no hay diferencias significativas en el desarrollo
de la tensión entre la pared del grupo de ratas en posparto y el de las no preñadas
(Fig. 26, panel A, B y C).
Fig. 26 A
Esfuerzo ()
0.000.010.020.030.040.05
Ten
sión
pas
iva
(N /
m2)
-1000
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
NPP18PP
51
Fig. 26. Desarrollo de tensión pasiva durante la fase de regreso a su longitud inicial, en la
pared libre del ventrículo derecho de ratas no preñadas (NP), preñadas de 18 días (P18) y
en posparto (7 días después del parto, PP), a distintas deformaciones: Panel A, 5 %; Panel
B, 10 %; y Panel C, 20 % de la longitud de la tira muscular. Los datos corresponden a
medias error estándar (n = 16).
Fig. 26 B
Esfuerzo ()
0.000.020.040.060.080.10
Ten
sión
pas
iva
(N/m
2 )
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
NPP18PP
Fig. 26 C
Esfuerzo ()
0.000.050.100.150.20
Te
nsió
n p
asiv
a (N
/ m
2 )
0
5000
10000
15000
20000
25000
NPP18PP
52
Para el ventrículo izquierdo, el desarrollo de la tensión pasiva durante la fase de
regreso a la longitud inicial de la tira fue significativamente mucho menor en las ratas
preñadas en comparación con las no preñadas (p 0.05), mientras que entre el grupo
de ratas en posparto y el de no preñadas el desarrollo de la tensión fue similar (Fig.
27, panel A, B y C). Estas observaciones fueron muy claras en las tres
deformaciones en estudio, 5 %, 10 % y 20 % de la longitud de la tira.
Fig. 27 A
Esfuerzo ()
0.000.010.020.030.040.05
Ten
sión
pas
iva
(N /
m2)
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
NPP18PP
53
Fig. 27. Desarrollo de la tensión pasiva durante la fase de regreso a su longitud inicial, en el
ventrículo izquierdo de ratas no preñadas (NP), preñadas de 18 días (P18) y en posparto (7
días después del parto, PP), a distintas deformaciones: Panel A, 5 %; Panel B, 10 %; y Panel
C, 20 % de la longitud de la tira muscular. Los datos corresponden a medias error estándar
(n = 16).
Fig. 27 B
Esfuerzo ()
0.000.020.040.060.080.10
Te
nsió
n pa
siva
( N
/ m
2 )
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
NPP18PP
Fig. 27 C
Esfuerzo ()
0.000.050.100.150.20
Ten
sión
pa
siva
(N
/ m
2)
0
5000
10000
15000
20000
25000
NPP18PP
54
Correlación entre la Longitud de los Miocitos Cardiacos y la Tensión Pasiva
En el grupo P18 se observó una disminución en el desarrollo de la tensión pasiva de
tejidos cardiacos y un aumento en el tamaño de los miocitos cardiacos aislados. Para
determinar dicha asociación de observaciones se determinó el coeficiente de
correlación de Pearson y los datos encontrados nos sugieren una fuerte correlación
entre la longitud promedio de los miocitos cardiacos y el desarrollo de tensión pasiva
máxima que desarrollan como tejido, tanto en el ventrículo derecho como el izquierdo
(Ver Fig. 28).
Ventrículo Derecho
Longitud de los Miocitos Cardiacos (m)
105 110 115 120 125 130 135
Ten
sión
Pas
iva
Máx
ima
(KP
a)
4
6
8
10
12
Coeficiente de Correlación de Pearson = 0.92
Ventrículo Izquierdo
Longitud de los Miocitos Cardiacos (m)
100 102 104 106 108 110 112 114 116
Te
nsió
n P
asiv
a M
áxi
ma
(K
Pa
)
0
2
4
6
8
10
12
14Coeficiente de Correlación de Pearson = 0.87
Fig. 28. Correlación entre la longitud promedio de los miocitos cardiacos aislados y la tensión
pasiva máxima desarrollada como tejido en ambos ventrículos cardiacos.
55
Histéresis
Otro fenómeno interesante que se presenta en nuestros resultados es el fenómeno
de histéresis. A deformación del 5 %, no se observan diferencias entre los grupos de
ratas no preñadas (36 9 J), preñadas (23 6 J) y en posparto (43 6 J), pero a
deformaciones del 10 % hay una disminución en el grupo de ratas preñadas (NP, 154
22 J; P18, 79 21 J; PP, 172 25 J), y a 20 %, la disminución en la histéresis es
más significativa (p 0.05) durante la preñez, en la pared libre del ventrículo derecho
(Fig. 29; NP, 788 100 J; P18, 496 80 J; PP, 791 106 J).
.
Fig. 29. Fenómeno de histéresis en la pared libre del ventrículo derecho de ratas no
preñadas (NP), preñadas de 18 días (P18) y en posparto (7 días después del parto, PP), a
una deformación del 20 % de la longitud de la tira muscular. Los datos corresponden a
medias error estándar (n = 16).
Deformación ()
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20
Te
nsió
n p
asi
va (
N /
m2)
0
5000
10000
15000
20000
25000
NPP18PP
56
En el ventrículo izquierdo, a deformaciones del 5 % no hay diferencias entre los
grupos en estudio (NP, 5 1 J; P18, 9 3 J; PP, 14 6 J). La histéresis, con
deformación del 10 % decayó ligeramente durante la preñez (NP, 98 7 J; P18, 88
3 J; PP, 103 5 J). Mientras que, a deformación del 20 %, significativamente (p
0.05), la histéresis es mucho menor durante la preñez (Fig. 30; NP, 663 10 J; P18,
420 19 J; PP, 643 40 J). Además, estos resultados indican que no hay diferencias
entre el grupo posparto y el de no preñadas.
Fig. 30. Fenómeno de histéresis en el ventrículo izquierdo de ratas no preñadas (NP),
preñadas de 18 días (P18) y en posparto (7 días después del parto, PP), a una deformación
del 20 % de la longitud de la tira muscular. Los datos corresponden a medias error
estándar (n = 16).
Deformación ()
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20
Ten
sión
pas
iva
(N /
m2 )
0
5000
10000
15000
20000
25000
NPP18PP
57
Módulo de Elasticidad
Las curvas de esfuerzo-deformación fueron ajustadas a la ecuación de Magid y Law
(1985) con la finalidad de calcular el módulo de elasticidad o módulo de Young (E0)
de los tejidos cardiacos en cada grupo experimental, el cual es una medida de la
rigidez que presentan los tejidos.
Como se aprecia en la Fig. 31, los resultados indican que, con una deformación del
10 %, la pared libre del ventrículo derecho del grupo de preñadas tiene un E0
estadísticamente menor (p 0.05) al del grupo de no preñadas o en posparto.
Fig. 31. Módulo de elasticidad o de Young de la pared libre del ventrículo derecho, calculado
a partir de la ecuación de Magid y Law, ajuste realizado a las curvas de esfuerzo-
deformación del 10 %, en los 3 grupos experimentales: ratas no preñadas (NP), preñadas de
18 días (P18) y en posparto (7 días después del parto, PP). Los datos corresponden a
medias error estándar (n = 16). * p < 0.05.
Grupos experimentales
Mod
ulo
de E
last
icid
ad (
Pa
)
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
NPP18PP
*
58
Para el ventrículo izquierdo, también se aprecia de forma significativa (p 0.05) un
E0 mucho menor durante la preñez de las ratas (Fig. 32).
Fig. 32. Módulo de elasticidad o de Young del ventrículo izquierdo, calculado a partir de la
ecuación de Magid y Law, ajuste realizado a las curvas de esfuerzo-deformación del 10 %,
en los 3 grupos experimentales: ratas no preñadas (NP), preñadas de 18 días (P18) y en
posparto (7 días después del parto, PP). Los datos corresponden a medias error estándar
(n = 16). * p < 0.05.
Si comparamos los ventrículos, es evidente que en ambos el E0 disminuye durante la
preñez, y además, el E0 del ventrículo izquierdo es menor que el de la pared libre del
ventrículo derecho.
Grupos experimentales
Mod
ulo
de E
last
icid
ad (
Pa
)
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
NPP18PP
*
59
Electroforesis de la Titina Cardiaca
Se realizó una curva de calibración de proteínas (Fig. 33), para asegurar que la carga
de proteína fuera similar en los carriles.
Fig. 33. Curva de calibración con albúmina de suero bovino. Las mediciones fueron hechas
con método espectrofotométrico a 280 nm. Los datos fueron ajustados a una recta para
conocer las concentraciones de las muestras problemas (homogenado de proteínas), con el
ajuste se obtuvo un coeficiente de correlación aceptable de 0.998.
Al realizar el análisis electroforético de la pared libre del ventrículo derecho y
ventrículo izquierdo, se apreció la separación de las distintas proteínas musculares
(titina, nebulina, miosina); sin observar cambios en movilidad de las proteínas al
comparar los grupos experimentales de no preñez, preñez y posparto.
Concentración de proteínas (g/l)
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
Abs
orba
ncia
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
60
Análisis de la Titina por Western-Blot
Otro punto importante de nuestra investigación, consistió en determinar, si había
cambios en la cantidad de expresión de las isoformas de la titina N2B y N2BA, para
lo cual se utilizó la técnica del western-blot con marcajes específicos. Los resultados
indican la presencia de ambas isoformas en los 3 grupos en estudio (ver Fig. 34 A y
B).
(A)
(B)
Fig. 34. Western-blot ilustrativo de membranas incubadas con anticuerpo anti-N2B (Panel A)
y anti- N2BA (Panel B) para los grupos en estudio: NP (No preñadas), P18 (preñadas) y PP
(posparto), en dos regiones del corazón, VD (ventrículo derecho) y VI (Ventrículo izquierdo).
N2B
VD VI
NP PP P18NPP18 PP
N2B
VD VI
NP PP P18NPP18 PP
NP P18 PPNP P18PP
VD VI
NP P18 PPNP P18PP
VD VI
61
Al cuantificar cada isoforma de la titina, es decir N2B y N2BA, no se observaron
diferencias significativas entre los grupos estudiados (NP, P18 y PP), en ambos
ventrículos, derecho e izquierdo. Los resultados sugieren, que para todos los casos
se expresan en cantidades aproximadamente iguales ambas isoformas de la titina
cardiaca (Fig. 35).
Expresión de Titina en Ventrículo Derecho
0%
20%
40%
60%
80%
100%
NP P18 PP
Grupos experimentales
Co
mp
osi
ció
n d
e T
itin
a (%
)
N2BA
N2B
Expresión de Titina en Ventrículo Izquierdo
0%
20%
40%
60%
80%
100%
NP P18 PP
Grupos experimentales
Co
mp
osi
ció
n
de
Tit
ina
(%)
N2BA
N2B
Fig. 35. Porcentaje de expresión de las isofornas de la titina N2B y N2BA en los grupos en
estudio: NP (No preñadas), P18 (preñadas) y PP (posparto), en ventrículo derecho (Panel de
arriba) y ventrículo izquierdo (Panel de abajo). Los datos fueron obtenidos del análisis de
densitometría de los western-blot y corresponden a medias error estándar.
62
También, se realizó la cuantificación de la titina total (suma de ambas isoformas)
respecto a la cantidad de miosina cardiaca (M) y los resultados encontrados (Fig.
36), nos sugieren que durante la preñez y el posparto de la rata no cambia de forma
significativa la cantidad total de la titina cardiaca en ninguno de los dos ventrículos,
derecho e izquierdo.
Titi
na to
tal r
esp
ecto
a M
iosi
na
(u.a
)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
NPP18PP
VD VI
Fig. 36. Cantidad total de la Titina respecto a la Miosina en tejidos cardiacos (ventrículo
derecho, VD; e Izquierdo, VI) de ratas: NP (No preñadas), P18 (preñadas) y PP (posparto).
Los datos corresponden a medias error estándar.
63
Niveles de ARNm mediante RT-PCR semicuantitativo En el ventrículo derecho, como se aprecia en la figura 37, se encontraron niveles
similares de ARNm para ambas isoformas de la titina, en las tres condiciones
estudiadas (no preñez, preñez y en posparto). Para el caso del ventrículo izquierdo
se encontraron los mismos resultados que el ventrículo derecho (50 % de ARNm de
N2B y 50 % de N2BA).
Fig. 37. Panel superior, niveles de ARNm de las dos isoformas de la titina N2B y N2BA
normalizados con respecto al gen constitutivo de GAPDH, en los grupos experimentales de
no preñadas (NP), preñadas (P18) y en posparto (PP). Panel inferior, bandas ilustrativas de
un gel de agarosa al 1%, donde se corrieron muestras de ADN del gen control GAPDH (1),
gen de la isoforma N2B (2) y gen de la isoforma N2BA (3) en los tres grupos experimentales.
Niv
el d
e A
RN
m d
e ti
tina
/ AR
Nm
de
GA
PD
H (
%)
0
10
20
30
40
50
60
NP P18 PP
Isoforma de titina N2B
Isoforma de titina N2BA
64
Cortes histológicos teñidos con Tricromo de Masson
Al no encontrar datos significativos en la expresión de la titina que explicaran los
cambios de tensión pasiva observados durante la preñez, estudiamos la matriz
extracelular en busca de modificaciones en la densidad de colágena mediante la
técnica histológica descrita en métodos. Observaciones al microscopio demuestran
que durante la preñez hay un aumento en la cantidad de colágena (ver Fig. 38),
mientras que en el posparto se revierten dichos cambios.
Fig. 38. Cortes histológicos de tejidos cardiacos teñidos con tricromo de Masson, donde se
puede apreciar diferencias en la colágena (teñida de azul) de los corazones de ratas no
preñadas (Panel A), preñadas (Panel B) y posparto (Panel C). Estas imágenes fueron
tomadas con el objetivo 20x.
Los datos obtenidos respecto a la densidad de colágena indican que en los cortes de
tejidos de corazones del grupo P18 hay 67% más de colágena que en los animales
de los grupos NP y PP (Fig. 39).
A B C
65
Grupos experimentales
Den
sid
ad d
e co
láge
na (
%)
0
1
2
3
4
5 NPP18PP*
Fig. 39. Promedio de densidad de colágena de ambos ventrículos cardiacos durante la
preñez de rata y el posparto en comparación con ratas sin preñar. Los datos corresponden a
medias ± error estándar. * p < 0.05.
Además, también se puede apreciar que en la preñez hay una mayor cantidad de
colágena en la región del pericardio (ver Fig. 40).
66
Fig. 40. Cortes histológicos de tejidos cardiacos teñidos con tricromo de Masson, donde se
puede apreciar diferencias en la colágena (teñida de azul) del pericardio de corazones de
ratas no preñadas (NP), preñadas (P18) y posparto (PP). Estas imágenes fueron tomadas
con el objetivo 100x.
NP
P18
PP
67
DISCUSIÓN
68
El objetivo principal de esta tesis fue, estudiar los cambios en las propiedades
mecánicas pasivas de los tejidos cardiacos que han sufrido hipertrofia funcional
durante la preñez, y evaluar los cambios de isoformas de la titina (N2B y N2BA), a
nivel de ARNm y como proteína expresada, en un modelo experimental de rata.
Hipertrofia Cardiaca.
Existen pocas investigaciones que estudien la hipertrofia cardiaca fisiológica
relacionada con la preñez; por lo tanto, los cambios fisiológicos y los mecanismos
moleculares asociados a la hipertrofia son pobremente entendidos. Se ha establecido
que durante la preñez el corazón desarrolla hipertrofia como un mecanismo de
adaptación ante un incremento en la sobrecarga de volumen sanguíneo.
Recientemente en la preñez de ratón se encontró un incremento significativo en el
tamaño del corazón, sin embargo, la relación entre la masa del corazón y el peso
corporal no aumento significativamente (Eghbali et al., 2005). Nuestros resultados
muestran que para el caso de la rata, durante su preñez, se observa un aumento
significativo en la relación masa del corazón / peso corporal, coincidiendo con lo
reportado por otros autores, tanto en humanos como en animales (Katz et al., 1978;
Capeless y Clapp, 1989; Gilson et al., 1992; Mabie et al., 1994; Slangen et al., 1997;
Poppas et al., 1997; Spaanderman et al., 2000); Además, en cuanto a la
reversibilidad de la hipertrofia cardiaca en ratas, se ha reportado que pocos días
después del parto regresa a su tamaño original (Buttrick et al., 1987); en nuestro
estudio, 7 días después del parto, la hipertrofia se revirtió por completo. Estos
hallazgos hacen sugerir que la hipertrofia cardiaca puede ser un mecanismo
compensatorio activado durante la preñez para mejorar la capacidad de bombeo del
corazón y satisfacer la demanda hemodinámica.
Por otra parte, es aceptado que el crecimiento del corazón inducido por sobrecarga
de volumen está asociado a un incremento en el tamaño de los miocitos cardiacos,
tal como ha sido demostrado en distintas condiciones experimentales como son: el
ejercicio, modelo de fístula arteriovenosa y la preñez de ratón (Chen, Torry,
69
Baumbach, y Tomanek, 1994; Natali, Turner, Harrison y White, 2001; Wang, Ren,
Liu, Sentex, Tappia, y Dhalla, 2003; Eghbali et al., 2005); en este punto, nuestros
experimentos indican que la hipertrofia cardiaca desarrollada en la preñez de la rata,
también esta asociada a un incremento en el área de los miocitos cardiacos en las
distintas regiones de los ventrículos; además, nuestros resultados indican que el
aumento en el área de los miocitos es a expensas del aumento en su eje longitudinal,
lo cual explica la hipertrofia excéntrica observada en la preñez de la rata. También,
en la investigación realizada recientemente por Eghbali et al. (2005) encontraron que
el área de la cavidad del ventrículo derecho aumentó más que en el ventrículo
izquierdo durante la preñez, esto podría ser explicado por nuestros resultados, que
muestran que la longitud de los miocitos aumenta más en el ventrículo derecho en
comparación con el ventrículo izquierdo.
Propiedades Mecánicas Pasivas.
La elasticidad es una propiedad inherente del músculo estriado, cuando un músculo
es estirado genera tensión pasiva. En el músculo cardiaco, las propiedades
mecánicas pasivas son de suma importancia ya que influyen en la velocidad de
acortamiento de las fibras (De Tombe y Ter Keurs, 1992; Sweitzer y Moss, 1993), y
es un factor que determina el límite de volumen sanguíneo que entra al corazón y por
lo tanto del volumen sistólico final (Brady, 1991).
En la preñez, el corazón debe ser capaz de manejar un mayor volumen sanguíneo,
es decir, las paredes miocárdicas deben ser más distensibles, y esto lo pueden
lograr, disminuyendo la resistencia a la distensión, la cual es detectable a través del
registro de la tensión pasiva. Los resultados de este trabajo apoyan esta idea, ya que
durante la preñez, cuando las preparaciones musculares fueron estiradas al 5, 10 y
20 % de su longitud inicial, desarrollaron menor tensión pasiva en comparación con
el grupo control (no preñez). Además, el desarrollo de tensión pasiva durante el
posparto fue similar al grupo control, lo cual hace sugerir que el corazón durante la
preñez disminuye el desarrollo de tensión pasiva de sus paredes miocárdicas,
70
actuando como un mecanismo de adaptación que mejora el desempeño cardiaco
para manejar el incremento de volumen sanguíneo al cual esta expuesto.
Un parámetro importante que ayuda a determinar la rigidez o distensibilidad de un
tejido es el módulo de Young (E0); a mayor módulo de elasticidad, más rígido es un
tejido. A menor módulo implica que es más distensible. Magid y Law (1985) proponen
que, si las curvas de esfuerzo-deformación de un tejido muscular son ajustadas a la
ecuación: Ln () = α + Ln (E0 / α), se puede obtener el módulo de elasticidad inicial
que determina las propiedades mecánicas pasivas de estos tejidos. Haciendo el
ajuste con la ec. de Magid y Law, encontramos en nuestros resultados que el
ventrículo derecho tiene un módulo de elasticidad mayor que el ventrículo izquierdo,
es decir, la pared libre del ventrículo derecho es menos elástica que la pared
miocárdica del ventrículo izquierdo; además, durante la preñez el módulo de
elasticidad disminuye en ambos ventrículos. Estos resultados del módulo de
elasticidad explicarían como el ventrículo izquierdo es más distensible, lo cual podría
favorecer que la longitud sarcomérica de arranque para la contracción permita un
mayor desarrollo de fuerza durante la sístole, expulsando un mayor volumen
sanguíneo hacía el sistema arterial que le permita satisfacer todas las necesidades
metabólicas del organismo incluyendo los requerimientos fetales.
Estos cambios en las propiedades mecánicas del corazón durante la preñez
sugieren el requerimiento de una fuente energética más eficiente. En los tejidos
cardiacos hipertrofiados por sobrecarga de volumen se han encontrado cambios en
la actividad mitocondrial aumentando la oxidación de la glucosa (Huss y Nelly, 2004;
Ingwall y Weiss, 2004). En este sentido, hacen falta futuras investigaciones que
ayuden a esclarecer como se administran energéticamente los tejidos cardiacos
durante la preñez.
71
HISTERESIS.
Cuando un tejido es sometido a ciclos de deformación, la tensión que se genera
durante el estiramiento es mayor que en la relajación, observándose el fenómeno de
histéresis (Helmes et al., 1999; Minajeva, Kulke, Fernández y Linke, 2001), en donde
se puede evaluar la cantidad de calor que se pierde durante el proceso, es decir, el
área entre las dos curvas (estiramiento y relajación).
En nuestros experimentos observamos que el calor que se pierde durante la
histéresis se incrementa con la amplitud de los ciclos de deformación, resultados que
son consistentes con lo observado en estudios previos realizados en moléculas
individuales de titina (Kellermayer et al., 1997) o en miocitos cardiacos donde
midieron la cantidad de calor que se disipa durante la histéresis a distintas longitudes
sarcoméricas (Helmes et al., 1999).
Se ha propuesto que durante la fase de estiramiento, hay un desdoblamiento de la
molécula de titina en el segmento PEVK y probablemente en algunos monómeros de
Ig; y en la fase de relajación, la molécula de titina recuperan su plegamiento original.
La histéresis puede ser explicada por diferencias entre las velocidades de
desdoblamiento y plegamiento (Minajeva et al., 2001). Se ha reportado que la
velocidad de plegamiento es menor que la de desdoblamiento (Li et al., 2002), sin
embargo, cuando ha terminado un ciclo estiramiento-relajación, la molécula de titina
parece contener regiones en estado de predesdoblamiento, haciendo todo el proceso
de plegamiento más lento; además, si inmediatamente se inicia un nuevo ciclo de
deformación, la molécula de titina al contener regiones en estado de
predesdoblamiento ocasiona que la tensión pasiva producida en este nuevo ciclo sea
menor que la anterior, de esta forma reduciría la cantidad de energía que se pierde
en forma de calor durante la histéresis de cada ciclo de deformación-relajación
(Kellermayer et al., 1997; Helmes et al., 1999; Trombitas, Freiburg, Centner, Labeit, y
Granzier, 1999). En nuestros experimentos encontramos que durante la preñez la
72
cantidad de calor que se pierde durante la histéresis es menor en comparación con el
control (no preñez).
Si consideramos que tanto en humanos como en animales, durante la preñez
aumenta la frecuencia cardiaca (ciclos deformación-relajación) (Katz et al., 1978;
Gilson et al., 1992; Mabie et al., 1994; Slangen et al., 1997); entonces, esta
disminución en la perdida de calor durante la histéresis podría ser un mecanismo
protector que se presentaría durante la preñez con el fin de disminuir la energía que
se pierde durante cada latido, aunque faltan más investigaciones que detallen los
cambios en estructura y conformación que ocurren al interior de la titina y su
interacción con otras proteínas sarcoméricas.
ISOFORMAS DE LA TITINA.
El principal responsable de la generación de la tensión pasiva en el músculo estriado
es la titina, proteína sarcomérica que va desde la banda Z hasta la línea M (Granzier
y Labeit, 2004). La región extensible de la molécula de titina está localizada en la
banda I (Granzier y Labeit, 2002). En tejidos cardiacos, se expresan dos isoformas
conocidas como la N2B y la N2BA que difieren en su composición y peso molecular
(Freiburg et al., 2000; Granzier y Labeit, 2004). Además, es conocido que los tejidos
que expresan la isoforma de titina N2B desarrollan más tensión pasiva que los que
expresan la isoforma N2BA (Cazorla et al., 2000). También, es importante mencionar
que recientes investigaciones sugieren que el desarrollo de tensión pasiva en los
tejidos cardiacos podría estar regulado por la relación entre los niveles de expresión
de isoformas N2BA / N2B (Neagoe et al., 2002; Wu et al., 2002; Warren et al., 2003;
Lahmers et al., 2004; Wu et al., 2004; Nagueh et al., 2004).
En nuestros experimentos se observó disminución significativa en el desarrollo de
tensión pasiva durante la preñez, por lo que formulamos la hipótesis que podría ser
causada por un incremento en los niveles de expresión de la isoforma de titina N2BA
y/o disminución de titina N2B, sin embargo, los resultados obtenidos en esta
73
investigación no muestran diferencias significativas en los niveles de expresión de las
isoformas de titina N2B y N2BA; pero si consideramos que el gen de la titina tiene la
facilidad de producir “splicing” (Un mismo gen codifica para la formación de proteínas
distintas) y formar titinas de distintos tamaños moleculares (Granzier y Labeit, 2002 y
2004), entonces no podríamos descartar la posibilidad de que la disminución en la
tensión pasiva observada en la preñez se debe a cambios en la longitud de titina sin
necesariamente modificar los niveles de expresión de las isoformas de titina N2B y
N2BA, dejando para futuras investigaciones la exploración de esta hipótesis usando
técnicas como la espectrometría de masas. Además, en nuestros experimentos los
cambios en tensión pasiva no los podemos atribuir a una variación en la titina total,
ya que también nuestros datos de titina total (0.22) están dentro del rango reportado
por otros autores (Cazorla et al., 2000; Nagueh et al., 2004). Con respecto al nivel de
expresión de los transcriptos para las dos isoformas de titina fueron muy similares
coincidiendo con la expresión de proteínas. Estos datos de ARNm son consistentes
con lo obtenido por Opitz et al. (2004), mediante estudios de RT-PCR en tiempo real
mientras que nosotros usamos RT-PCR semicuantitativo.
Un mecanismo que sería interesante explorar a futuro y que podría contribuir a la
reducción en la tensión pasiva de los tejidos cardiacos observada en la preñez sería
un aumento en la actividad de la proteína cinasa A (PKA) la cual se ha encontrado
que fosforila titina cardiaca y disminuye el desarrollo de tensión pasiva (Fukuda et al.,
2005) sin cambiar los niveles de expresión de las isoformas de la titina. Además,
durante la preñez hay un aumento en la duración del potencial de acción cardiaco
(Eghbali et al., 2005), esto facilita la entrada de calcio al interior celular para
favorecer una mayor actividad contráctil que se demanda en esta condición
fisiológica; pero por otro lado, el aumento de calcio intracelular podría activar a la
Calpaina 3, una proteasa dependiente de calcio, la cual posee sitios de unión a titina
cardiaca (Granzier y Labeit, 2002; Ono et al., 2004) y podría también contribuir a la
reducción de la tensión pasiva sin cambiar la expresión de las isoformas de titina.
74
COLAGENA
Otra proteína involucrada en regular la tensión pasiva de las paredes ventriculares es
la colágena, principal proteína de la matriz extracelular. En tejidos cardiacos
predominan los tipos I y III; el tipo I forma una estructura resistente a la extensión,
mientras que el tipo III forma una estructura muy flexible (Medugorac, 1982). En la
hipertrofia cardiaca de origen patológico también se ha reportado que existe un
aumento en la rigidez ventricular asociado a un incremento en el contenido de la
colágena, en particular de la colágena tipo I (Marijianowski et al., 1995; Wu et al.,
2002; Wu et al., 2004), y como resultado afecta negativamente la función diastólica
del corazón. En nuestros experimentos, un modelo de hipertrofia cardiaca funcional
reversible, mostramos evidencia histológica de un aumento en el contenido de
colágena cardiaca durante la preñez, la cual se revierte en el posparto. Dichos
cambios pueden explicar los cambios en la rigidez ventricular observados en los
experimentos mecánicos. Este hallazgo de la colágena, nos abre una excelente
perspectiva de una futura investigación a nivel molecular para probar si durante la
preñez hay un aumento en la expresión de colágena tipo III lo cual daría como
resultado una menor rigidez ventricular durante la preñez para facilitar el llenado
diastólico.
75
CONCLUSIONES
76
1) Durante la preñez el corazón sufre hipertrofia funcional y 7 días después del
parto se revierte; además, la hipertrofia esta asociada a un incremento en el
área y longitud de los miocitos cardiacos.
2) Los tejidos cardiacos durante la preñez desarrollan menor tensión pasiva en
comparación con los tejidos cardiacos de ratas no preñadas o en fase de
posparto. Al comparar ambos ventrículos, la pared libre del izquierdo
desarrolla menor tensión pasiva que la pared libre del derecho.
3) Existe una correlación negativa entre los cambios de longitud de los miocitos
cardiacos y los cambios de la tensión pasiva que ocurren como tejido cardiaco
durante la preñez.
4) El módulo de elasticidad durante la preñez disminuye en ambos ventrículos
haciéndolos más distensibles. De ambos ventrículos, el izquierdo es más
distensible que el derecho.
5) Las paredes miocárdicas del corazón de ratas no preñadas y en posparto
presentan niveles similares de histéresis, mientras que en la preñez la
histéresis es menor.
6) Los niveles de ARNm y la expresión de las isoformas de titina N2BA y N2B no
cambian durante la preñez.
7) La cantidad de colágena en los tejidos cardiacos aumenta durante la preñez y
se revierte en el posparto.
77
En general, durante la preñez los miocitos cardiacos crecen longitudinalmente
conduciendo a la formación de una hipertrofia cardiaca excéntrica; las paredes
ventriculares desarrollan una menor tensión pasiva, son menos rígidas y
presentan una menor histéresis, pero dichos cambios no están asociados a una
alteración en el patrón de expresión de isoformas de la titina. Finalmente, la
histología reveló un incremento en el contenido de colágena.
Por tanto, los resultados de este trabajo favorecen la noción de una asociación
dinámica con el citoesqueleto al presentarse cambios en el tamaño de los
miocitos y de las paredes miocárdicas (tensión pasiva y módulo elástico) durante
la preñez. Así, estos hallazgos toman importancia en el contexto de que a nivel
molecular están participando elementos que regulan tanto el crecimiento como la
mecánica pasiva del corazón y que aun no se sabe como participan, por lo que el
presente trabajo sienta las bases para estudiar las complejas cascadas de
señalización que deben de estar regulando el desarrollo de la hipertrofia cardiaca
y los cambios en las propiedades mecánicas pasivas durante la preñez.
78
PERSPECTIVAS
79
1) Caracterizar en la preñez, el mecanismo molecular implicado en el desarrollo
de hipertrofia cardiaca. Uno de estos mecanismos, podría ser vía activación
hormonal mediante receptores a estradiol acoplados a proteínas G los cuales
activarían la vía Ras desencadenando cambios a nivel de factores de
transcripción (Fig. 41).
Fig. 41. Probables mecanismos moleculares involucrados en el desarrollo de hipertrofia
cardiaca durante la preñez. Et (Receptores a Endotelina), AT1 (Receptores a Angiotensina),
AR (Receptores adrenérgicos), MusAcR (Receptores muscarínicos a acetilcolina), ER
(Receptor a estradiol), Gq, s, i y (Subunidades de proteínas G), PLC (Fosfolipasa C),
IP3 (Inositol trifosfato), DAG (Diacilglicerol), PKC (Proteína cinasa C), PKA (Proteína cinasa
A), AC (Adenilato ciclasa), RGS (Regulador de la señalización de proteínas G), cAMP
(Adenosina monofosfato cíclico), MAPK (Proteínas cinasas activadas por mitogenos), β ARK
(Receptor cinasa beta adrenérgico), PI3K (Fosfatidil 3-Inositol cinasa), Akt (Proteína cinasa
B), Ras (Superfamilia de GTPasas monoméricas), Raf (Proteína con actividad cinasa-cinasa-
cinasa activada por mitogenos), ERK (Cinasa reguladora de señales extracelulares), JNK
(Cinasa de c-Jun), NFAT (Factor nuclear activado por células T).
80
Otras vías de señalización muy interesantes que podrían estar implicadas en el
desarrollo de la hipertrofia cardiaca son la Endotelina y la Angiotensina activando
cascadas de señalización mediadas por Calcineurina y Ras (Fig. 41).
2) Estudiar los cambios en las propiedades contráctiles y su relación con la carga
energética de las células cardiacas, en busca de entender los mecanismos que
regulan el incremento de la frecuencia cardiaca y el gasto cardiaco durante la preñez.
3) Investigar si otras proteínas del citoesqueleto y de la matriz extracelular participan
en los cambios de la tensión pasiva de las paredes miocárdicas durante la preñez, en
particular las proteínas: α y β tubulina, desmina, fibronectina, vimentina, las cuales
han sido asociadas a hipertrofia cardiaca.
4) Establecer si la fosforilación de titina cardiaca vía proteína cinasa A (PKA) es
responsable de regular los cambios en las propiedades mecánicas pasivas que
ocurren durante la preñez y el posparto.
5) Estudiar la participación de la Calpaína 3, la cual posee dominios de unión a titina
cardiaca, como un posible mecanismo regulador de las propiedades mecánicas
pasivas que ocurren durante la preñez y el posparto.
6) Estudiar si el TGF esta participando en el aumento de expresión de colágena, vía
algunos factores de transcripción como NFK.
81
ANEXO
82
A) Soluciones de registro mecánico y dispersión celular de miocitos cardiacos
1. Solución Tyrode Normal (mM): NaCl 125, KCl 5.4, MgCl2 1.05, NaHCO3 24,
NaH2PO4 0.42, CaCl2 1.8 y Dextrosa 11. pH = 7.4 con NaOH.
2. Solución Cardiopléjica (mM): NaCl 121.9, KCl 8.5, MgCl2 1.05, NaHCO3 24,
NaH2PO4 0.42, CaCl2 1.8 y Dextrosa 11. pH = 7.4 con NaOH.
3. Medio KB (mM): Glutamato de potasio 100, Ácido aspártico 10, KCl 25,
KH2PO4 10, MgSO4 2, Taurina 20, Creatina base 5, EGTA 0.5, Hepes 5 y
Glucosa 20. pH 7.2 con KOH.
B) Geles de SDS-PAGE
Gel al 10%.
Sustancia Volumen final del gel
5.5 ml Glicerol (15%) 0.8250 ml
Amortiguador de corrimiento STOCK (10X)
0.5500 ml
PAGE (20%) 2.7500 ml Agua destilada (fría) 1.0340 ml
APS (0.06% de sol’n 1%) 0.3300 ml TEMED 9.9000 μL
Gel al 3%.
Sustancia Volumen final del gel
4.8 ml Glicerol (15%) 0.24 ml
Amortiguador de corrimiento STOCK (10X)
0.45 ml
PAGE (20%) 0.72 ml Agua destilada (fría) 2.6304 ml
APS (0.15% de sol’n 1%) 0.72 ml TEMED 9.6 μL
83
C) Western-blot.
Amortiguador de transferencia (25 mM de Tris, 190 mM de glicina, 20% de
metanol, pH de 8.2-8.3).
Ponceau S (se disuelve 0.5 g de Ponceau S en 1 ml de ácido acético
glacial y se afora a 100 ml con agua desionizada).
Solución de bloqueo (5 % de Leche en polvo sin grasa, 0.02 % de azida de
sodio, 0.02 % de Tween-20).
PBS 10X (240 g de NaCl, 6 g de KCl, 81.6 g de Na2HPO4-7H20, 7.2 g de
KHPO4 para 3 litros, pH de 7.4 con NaOH 10 N).
TBS 10X (66.55 g de Tris, 45 g de NaCl para 500 ml, pH de 7.5 con HCl).
TBST (5 ml de TBS 10X, 10 μL de Tween 20, 45 ml de agua desionizada).
Avidina (Diluir avidina 1:25 en TBST).
Biotina (Diluir biotina 1:25 en TBST).
Complejo Avidina-Biotina (100 μL de solución A, 100 μL de solución B, 9.8
ml de TBST).
Reactivo DAB (4.5 ml de buffer peroxido y 5 ml de sustrato DAB)
84
D) Extracción de RNA
Agua-DEP (Se agrega 1 μl de Dietil Pirocarbonato por cada ml de agua
desionizada, se agita y se deja en reposo toda la noche. Finalmente, se esteriliza
en autoclave).
E) Electroforesis de DNA
TBE 10X (Tris base 500 mM, H3BO3 500 mM, EDTA 25 mM, pH = 8.3).
Gel de agarosa al 1 % (La agarosa se disuelve en buffer TBE 1X calentando
hasta ebullición en un horno de microondas).
Amortiguador de carga 5X (Ficoll 20 %, EDTA 500 mM pH de 8.0, Azul de
bromofenol 0.05 % y Azul de Xilencianol 0.1 %).
Solución madre de Bromuro de Etidio (10 mg / ml, Mantener en refrigeración y
oscuridad).
85
BIBLIOGRAFÍA
86
1. Assayag, P., Carre, F., Chevalier, B., Delcayre, C., Mansier, P., y
Swynghedauw, B. (1997). Compensated cardiac hypertrophy:
Arrhythmogenicity and the new myocardial phenotype. I. Fibrosis. Cardiovasc.
Res., 34 (3), 439-44.
2. Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith,
J.A., y Struhl, K. (2003). Current protocols in molecular biology. Vol. 2 (Cap. 4,
10 y 14), New York, USA: John Wiley Sons, In.
3. Belardinelli, R., Georgiou, D., Cianci, G., y Purcaro, A. (1999). Randomized,
controlled trial of long-term moderate exercise training in chronic heart failure:
Effects on functional capacity, quality of life, and clinical outcome. Circulation.,
99, 1173–82.
4. Brady, A.J. (1991). Mechanical properties of isolated cardiac myocytes.
Physiol. Rev., 71, 413-24.
5. Brower, G.L., y Janicki, J.S. (2001). Contribution of ventricular remodeling to
pathogenesis of heart failure in rats. Am J Physiol Heart Circ Physiol., 280 (2),
H674-83.
6. Buttrick, P.M., Schaible, T.F., Malhotra, A., Mattioli, S., y Scheuer, J. (1987).
Effects of pregnancy on cardiac function and myosin enzymology in the rat.
Am J Physiol., 252 (4 Pt 2), H846-50.
7. Capeless, E.L., y Clapp, J.F. (1989). Cardiovascular changes in early phase of
pregnancy. Am. J Obstet. Gynecol., 161, 1449–53.
8. Cazorla, O., Freiburg, A., Helmes, M., Centner, T., McNabb, M., Wu, Y.,
Trombitas, K., Labeit, S., y Granzier, H. (2000). Differential expression of
87
cardiac titin isoforms and modulation of cellular stiffness. Circ. Res., 86 (1), 59-
67.
9. Chapman, A.B., Zamudio, S., Woodmansee, W., Merouani, A., Osorio, F.,
Johnson, A., Moore, L.G., Dahms, T., Coffin. C., Abraham, W.T., y Schrier,
R.W. (1997). Systemic and renal hemodynamic changes in the luteal phase of
the menstrual cycle mimic early pregnancy. Am. J. Physiol. Renal Physiol.,
273, F777–F782.
10. Chen, Y., Torry, R.J., Baumbach, G.L., y Tomanek, R.J. (1994). Proportional
arteriolar growth accompanies cardiac hypertrophy induced by volume
overload. Am J Physiol., 267 (6 Pt 2), H2132-7.
11. Clark, K.A., McElhinny, A.S., Beckerle, M.C. y Gregorio, C.C. (2002). Striated
muscle cytoarchitecture: an intricate web of form and function. Annu Rev Cell
Dev Biol. 18, 637-706.
12. De Tombe, P.P., y Ter Keurs, H.E. (1992). An internal viscous element limits
unloaded velocity of sarcomere shortening in rat myocardium. J Physiol., 454,
19-42.
13. De Zee, M., Bojsen-Moller, F., y Voigt, M. (2000). Dynamic viscoelastic
behavior of lower extremity tendons during simulated running. J Appl Physiol.,
89 (4), 1352-9.
14. Dionisi, H.M., Checa, S.K., y Viale, A.M. (1995). Protein immunoblotting of
stained gels. Biotechniques., 19 (3), 348-50.
15. Duvekot, J.J., Cheriex, E.C., Pieters, F.A.A., y Peeters, L.L.H. (1993). Early
pregnancy changes in hemodynamics and volume homeostasis are
88
consecutive adjustments triggered by a primary fall in systemic vascular tone.
Am. J. Obstet. Gynecol., 169, 1382–92.
16. Eghbali, M., Deva, R., Alioua, A., Minosyan, T.Y., Ruan, H., Wang, Y., Toro,
L., y Stefani, E. (2005). Molecular and Functional Signature of Heart
Hypertrophy during Pregnancy. Circ Res., 96:1208-16.
17. Freiburg, A., Trombitas, K., Hell, W., Cazorla, O., Fougerousse, F., Centner,
T., Kolmerer, B., Witt, C., Beckmann, J.S., Gregorio, C.C., Granzier, H., y
Labeit, S. (2000). Series of exon-skipping events in the elastic spring region of
titin as the structural basis for myofibrillar elastic diversity. Circ. Res., 86 (11),
1114-21.
18. Fukuda, N., Wu, Y., Nair P. Y Granzier, H.L. (2005). Phosphorilation of Titin
Modulates Passive Stiffness of Cardiac Muscle in a Titin Isoform-dependent
Manner. J. Gen. Physiol., 125, 257-71.
19. Gando, S., Hattori, Y., Akaishi, Y., Nishihira, J. y Kanno, M. (1997). Impaired
contractile response to beta adrenoceptor stimulation in diabetic rat hearts:
Alterations in beta adrenoceptors-G protein-adenylate cyclase system and
phospholamban phosphorylation. Journal of Pharmacology and Experimental
Therapeutics., 282, 475-84.
20. Gilson, G.J., Mosher, M.D., y Conrad, K.P. (1992). Systemic hemodynamics
and oxygen transport during pregnancy in chronically instrumented, conscious
rats. Am. J. Physiol., 263 (6 Pt 2), H1911-8.
21. Granzier, HL., y Labeit, S. (2002). Cardiac titin: An adjustable multi-functional
spring. J. Physiol., 41 (Pt 2), 335-42.
89
22. Granzier, H.L., Labeit, S. (2004). The giant protein titin: a major player in
myocardial mechanics, signaling, and disease. Circ Res., 94 (3), 284-95.
23. Granzier, H.L., y Wang, K. (1993). Gel electrophoresis of giant proteins:
Solubilization and silver-staining of titin and nebulin from single muscle fiber
segments. Electrophoresis., 14, 56-64.
24. Granzier, H.L., e Irving, T.C. (1995). Passive tension in cardiac muscle:
Contribution of collagen, titin, microtubules, and intermediate filaments.
Biophys. J., 68, 1027-44.
25. Granzier, H., Helmes, M., y Trombitas, K. (1996). Nonuniform elasticity of titin
in cardiac myocytes: A study using immunoelectron microscopy and cellular
mechanics. Biophys J., 70 (1), 430-42.
26. Grossman, W., Jones, D., y McLaurin, L.P. (1975). Wall stress and patterns of
hypertrophy in the human left ventricle. J. Clin. Invest., 56, 56–64.
27. Haider, A.W., Larson, M.G., Benjamin, E.J., y Levy, D. (1998). Increased left
ventricular mass and hypertrophy are associated with increased risk for
sudden death. J. Am. Coll. Cardiol., 32 (5), 1454-9.
28. Hattori, Y., Matsuda, N., Kimura, J., Ishitani, T., Tamada, A., Gando, S.,
Kemmotsu, O., y Kanno, M. (2000). Diminished function and expression of the
cardiac Na+-Ca2+ exchanger in diabetic rats: implication in Ca2+ overload. J
Physiol., 527 (Pt 1), 85-94.
29. Helmes, M., Trombitas, K., Centner, T., Kellermayer, M., Labeit, S., Linke,
W.A., y Granzier, H. (1999). Mechanically driven contour-length adjustment in
rat cardiac titin's unique N2B sequence: Titin is an adjustable spring. Circ Res.,
84 (11), 1339-52.
90
30. Hill, J.A., Rothermel, B., Yoo, K.D., Cabuay, B., Demetroulis, E., Weiss, R.M.,
Kutschke, W., Bassel-Duby, B., y Sanders, W. (2002). Targeted inhibition of
calcineurin in pressure-overload cardiac hypertrophy. J. Biol. Chem., 277 (12),
10251-5.
31. Huss, J.M., y Kelly, D.P. (2004). Nuclear receptor signaling and cardiac
energetics. Circ Res., 95(6), 568-78.
32. Isenberg, G., y Klockner, U. (1982). Calcium tolerant ventricular myocytes
prepared by pre-incubation in a KB-medium. Pfluegers Arch., 395, 6–18.
33. Ingwall, J.S., y Weiss, R.G. (2004). Is the failing heart energy starved? On
using chemical energy to support cardiac function. Circ Res., 95 (2), 135-45..
34. Katz, R., Karliner, J.S., y Resnik, R. (1978). Effects of a natural volume
overload state (pregnancy) on left ventricular performance in normal human
subjects. Circulation., 58 (3), 434-41.
35. Katz, J., Milliken, M.C., Stray-Gundersen, J., Buja, L.M., Parkey, R.W.,
Mitchell J.H., y Peshock, R.M. (1988). Estimation of human myocardial mass
with MR imaging. Radiology., 2, 495-8.
36. Kellermayer, M.S., Smith, S.B., Granzier, H.L., y Bustamante, C. (1997).
Folding-unfolding transitions in single titin molecules characterized with laser
tweezers. Science., 276 (5315), 1112-6.
37. Labeit, S., Barlow, D.P., Gautel, M., Gibson, T., Holt, J., Hsieh, C.L., Francke,
U., Leonard, K., Wardale, J., y Whiting, A. (1990). A regular pattern of two
types of 100-residue motif in the sequence of titin. Nature., 345 (6272), 273-6.
38. Labeit, S., Gautel, M., Lakey, A., y Trinick, J. (1992). Towards a molecular
understanding of titin. EMBO J., 11 (5), 1711-6.
91
39. Lahmers, S., Wu, Y., Call, D.R., Labeit, S., y Granzier, H. (2004).
Developmental control of titin isoform expression and passive stiffness in fetal
and neonatal myocardium. Circ Res., 94 (4), 505-13.
40. LaPolt, P.S., Matt, D.W., Judd, H.L., y Lu, J.K.H. (1986). The relation of
ovarian steroid levels in young female rats to subsequent estrous cyclicity and
reproductive function during aging. Biol. Reprod., 35, 1131–39.
41. LeWinter, M.M. (2000). Titin: The "missing link" of diastole. J Mol Cell Cardiol.,
32 (12), 2111-4.
42. Li, H., Linke, W.A., Oberhauser, A.F., Carrion-Vazquez, M., Kerkvliet, J.G., Lu,
H., Marszalek, P.E., y Fernandez, J.M. (2002). Reverse engineering of the
giant muscle protein titin. Nature., 418 (6901), 998-1002.
43. Liao, J.K. (2004). Statin therapy for cardiac hypertrophy and heart failure.
J Investig Med., 52 (4), 248-53.
44. Longhurst, J.C., y Stebbins, C.L. (1997). The power athlete. Cardiol. Clin., 15,
413–29.
45. Mabie, W.C., DiSessa, T.G., Crocker, L.G., Sibai, B.M., y Arheart, K.L. (1994).
A longitudinal study of cardiac output in normal human pregnancy. Am. J.
Obstet. Gynecol., 170 (3), 849-56.
46. Magid, A., y Law, D.J. (1985). Myofibrils bear most of the resting tension in
frog skeletal muscle. Science., 230 (4731), 1280-2.
47. Marijianowski, M.M., Teeling, P., Mann, J., y Becker, A.E. (1995). Dilated
cardiomyopathy is associated with an increase in the type I/type III collagen
ratio: a quantitative assessment. J Am Coll Cardiol., 25(6), 1263-72.
92
48. Maruyama, K., Kimura, S., Ohashi, K., y Kuwano, Y. (1981). Connectin, an
elastic protein of muscle. Identification of "titin" with connectin. J Biochem
(Tokyo)., 89 (3), 701-9.
49. Medugorac, I. (1982). Characterization of intramuscular collagen in
mammalian left ventricle. Basic Res Cardiol., 77(6), 589-98.
50. Minajeva, A., Kulke, M., Fernandez, J.M., y Linke, W.A. (2001). Unfolding of
titin domains explains the viscoelastic behavior of skeletal myofibrils. Biophys
J., 80 (3)., 1442-51.
51. Mokelke, E.A., Palmer, B.M., Cheung, J.Y., y Moore, R.L. (1997). Endurance
training does not affect intrinsic calcium current characteristics in rat
myocardium. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., 273, H1193–H1197.
52. Molkentin, J.D., y Dorn, II. G.W. 2nd. (2001). Cytoplasmic signaling pathways
that regulate cardiac hypertrophy. Annu Rev Physiol., 63, 391-426.
53. Moore, R.L., Musch, T.I., Yelamarty, R.V., Scaduto-RC, J., Se-manchick,
A.M., Elensky, M., y Cheung, J.Y. (1993). Chronic exercise alters contractility
and morphology of isolated rat cardiac myocytes. Am. J. Physiol. Cell. Physiol.,
264, C1180–C1189.
54. Morano, I., Hadicke, K., Grom, S., Koch, A., Schwinger, R.H., Bohm, M.,
Bartel, S., Erdmann, E., y Krause, E.G. (1994). Titin, myosin light chains and
C-protein in the developing and failing human heart. J. Mol. Cell. Cardiol., 26
(3), 361-8.
55. Muñiz, J., Del Rio, J., Huerta, M., y Marín, J.L. (2001). Effects of sprint and
endurance training on passive stress-strain relation of fast- and slow-twitch
skeletal muscle in Wistar rat. Acta Physiol. Scand., 173, 207–12.
93
56. Nagatomo, Y., Carabello, B.A., Hamawaki, M., Nemoto, S., Matsuo, T., y
McDermott, P.J. (1999). Translational mechanisms accelerate the rate of
protein synthesis during canine pressure-overload hypertrophy. Am. J.
Physiol., 277, H2176–H2184.
57. Nagueh, S.F., Shah, G., Wu, Y., Torre-Amione, G., King, N.M., Lahmers, S.,
Witt, C.C., Becker, K., Labeit, S., y Granzier, H.L. (2004). Altered titin
expression, myocardial stiffness, and left ventricular function in patients with
dilated cardiomyopathy. Circulation, 110 (2)., 155-62.
58. Natali, A., Turner, D., Harrison, S., y White, E. (2001). Regional effects of
voluntary exercise on cell size and contraction-frequency responses in rat
cardiac myocytes. Exp. Biol., 204 (6), 1191–9.
59. Neagoe, C., Kulke, M., del Monte, F., Gwathmey, J.K., de Tombe, P.P.,
Hajjar, R.J., y Linke, W.A. (2002). Titin isoform switch in ischemic human heart
disease. Circulation., 106 (11), 1333-41.
60. Ono, Y., Kakinuma, K., Torii, F., Irie, A., Nakagawa, K., Labeit, S., Abe, K.,
Suzuki, K., y Sorimachi, H. (2004). Possible regulation of the conventional
calpain system by skeletal muscle-specific calpain, p94/calpain 3. J Biol
Chem., 279:2761–71.
61. Opitz, C.A., Leake, M.C., Makarenko, I., Benes, V., y Linke, W.A. (2004).
Developmentally regulated switching of titin size alters myofibrillar stiffness in
the perinatal heart. Circ Res., 94 (7), 967-75.
62. Patel, R., Nagueh, S.F., Tsybouleva, N., Abdellatif, M., Lutucuta, S., Kopelen,
H.A., Quinones, M.A., Zoghbi, W.A., Entman, M.L., Roberts, R., y Marian, A.J.
(2001). Simvastatin induces regression of cardiac hypertrophy and fibrosis and
94
improves cardiac function in a transgenic rabbit model of human hypertrophic
cardiomyopathy. Circulation., 104 (3), 317-24.
63. Perhonen, M.A., Franco, F., Lane, L.D., Buckey, J.C., Blomqvist, C.G.,
Zerwekh, J.E., Peshock, R.M., Weatherall, P.T., y Levine, B.D. (2001). Cardiac
atrophy after bed rest and spaceflight. J Appl Physiol., 91 (2), 645-53.
64. Perides, G., Plagens, U., y Traub, P. (1986). Protein transfer from fixed,
stained, and dried polyacrylamide gels and immunoblot with protein A-gold.
Anal Biochem., 152 (1), 94-9.
65. Picca, M., Agozzino, F., y Pelosi, G. (2004). Effects of losartan and valsartan
on left ventricular hypertrophy and function in essential hypertension.
Adv Ther., 21 (2), 76-86.
66. Poppas, A., Shroff, S.G., Korcarz, C.E., Hibbard, J.U., Berger, D.S.,
Lindheimer, M.D., y Lang, R.M. (1997). Serial assessment of the
cardiovascular system in normal pregnancy. Role of arterial compliance and
pulsatile arterial load. Circulation., 95, 2407-15.
67. Prophet, E.B., Mills, B., Arrington J.B., y Sobin L.H. (1992). Laboratory
Methods in Histotechnology. American Registry of Pathology, Washington D.C.
68. Rapoport, S.I. (1972). Mechanical properties of the sarcolemma and
myoplasm in frog muscle as a function of sarcomere length. J Gen Physiol., 59
(5), 559-85.
69. Rapoport, S.I. (1973). The anisotropic elastic properties of the sarcolemma of
the frog semitendinosus muscle fiber. Biophys J., 13 (1), 14-36.
95
70. Rossi, E., Faiella, A., Zeviani, M., Labeit, S., Floridia, G., Brunelli, S.,
Cammarata, M., Boncinelli, E., y Zuffardi, O. (1994). Order of six loci at 2q24-
q31 and orientation of the HOXD locus. Genomics., 24 (1), 34-40.
71. Sanchez-Chapula, J.A., Salinas-Stefanon, E., Torres-Jacome, J., Benavides-
Haro, D.E., y Navarro-Polanco, R.A. (2001). Blockade of currents by the
antimalarial drug chloroquine in feline ventricular myocytes. J Pharmacol Exp
Ther., 297 (1), 437-45.
72. Shepard, R.J. (1996). The athlete's heart: is big beautiful? Br. J. Sports. Med.,
30, 5–10.
73. Shimoyama, M., Hayashi, D., Takimoto, E., Zou, Y., Oka, T., Uozumi, H.,
Kudoh, S., Shibasaki, F., Yazaki, Y., Nagai, R., y Komuro, I. (1999).
Calcineurin plays a critical role in pressure overload-induced cardiac
hypertrophy. Circulation., 100 (24), 2449-54.
74. Siedner, S., Kruger, M., Schroeter, M., Metzler, D., Roell, W., Fleischmann,
B.K., Hescheler, J., Pfitzer, G., y Stehle, R. (2003). Developmental changes in
contractility and sarcomeric proteins from the early embryonic to the adult
stage in the mouse heart. J Physiol., 548 (Pt 2), 493-505.
75. Skeie, G.O. (2000). Skeletal muscle titin: physiology and pathophysiology.
Cell. Mol. Life Sci., 57 (11), 1570-6.
76. Slangen, B.F., Out, I.C., Janssen, B.J., y Peeters, L.L. (1997). Blood pressure
and heart rate variability in early pregnancy in rats. Am. J. Physiol., 273 (4 Pt
2), H1794-9.
77. Spaanderman, M.E., Meertens, M., van Bussel, M., Ekhart, T.H., y Peeters,
L.L. (2000). Cardiac output increases independently of basal metabolic rate in
96
early human pregnancy. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., 278, H1585–
H1588.
78. Squire, J.M. (1997). Architecture and function in the muscle sarcomere. Curr.
Opin. Struct. Biol., 7 (2), 247-57.
79. Sweitzer, N.K., y Moss, R.L (1993). Determinants of loaded shortening
velocity in single cardiac myocytes permeabilized with alpha-hemolysin. Circ
Res., 73(6), 1150-62.
80. Trinick, J., y Tskhovrebova, L. (1999). Titin: a molecular control freak. Trends
Cell. Biol., 9 (10), 377-80.
81. Trinick, J., Knight, P., y Whiting, A. (1984). Purification and properties of
native titin. J. Mol. Biol., 180 (2), 331-56.
82. Trombitas, K., Freiburg, A., Centner, T., Labeit, S., y Granzier, H. (1999).
Molecular dissection of N2B cardiac titin's extensibility. Biophys J., 77 (6),
3189-96.
83. Trombitas, K., Wu, Y., Labeit, D., Labeit, S., y Granzier, H. (2001). Cardiac
titin isoforms are coexpressed in the half-sarcomere and extend independently.
Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., 281 (4), H1793-9.
84. Van Eickels, M., Grohe, C., Cleutjens, J.P., Janssen, B.J., Wellens, H.J., y
Doevendans, P.A. (2001). 17beta-estradiol attenuates the development of
pressure-overload hypertrophy. Circulation, 104 (12), 1419-23.
85. Wang, K., McClure, J., y Tu, A. (1979). Titin: major myofibrillar components of
striated muscle. Proc Natl Acad Sci., 76 (8), 3698-702.
97
86. Wang X., Ren B., Liu S., Sentex E., Tappia P.S., y Dhalla NS. (2003).
Characterization of cardiac hypertrophy and heart failure due to volume
overload in the rat. J Appl Physiol., 94 (2), 752-63.
87. Warren, C.M., Jordan, M.C., Roos, K.P., Krzesinski, P.R., y Greaser, M.L.
(2003). Titin isoform expression in normal and hypertensive myocardium.
Cardiovasc Res., 59 (1), 86-94.
88. Wilkins, B.J., y Molkentin, J.D. (2002). Calcineurin and cardiac hypertrophy:
Where have we been? Where are we going? J. Physiol., 15, 541 (Pt 1), 1-8.
89. Wilkins, B.J., y Molkentin, J.D. (2004). Calcium-calcineurin signaling in the
regulation of cardiac hypertrophy. Biochem Biophys Res Commun., 322
(4),1178-91.
90. Willenheimer, R., Erhardt, L., Cline, C., Rydberg, E., y Is-raelsson, B. (1998).
Exercise training in heart failure improves quality of life and exercise capacity.
Eur. Heart J., 19, 774–81.
91. Wu, Y., Bell, S.P., Trombitas, K., Witt, C.C., Labeit, S., LeWinter, M.M., y
Granzier, H. (2002). Changes in titin isoform expression in pacing-induced
cardiac failure give rise to increased passive muscle stiffness. Circulation., 106
(11), 1384-9.
92. Wu, Y., Tobias, A.H., Bell, K., Barry, W., Helmes, M., Trombitas, K., Tucker,
R., Campbell, K.B., y Granzier, H.L. (2004). Cellular and molecular
mechanisms of systolic and diastolic dysfunction in an avian model of dilated
cardiomyopathy. J Mol Cell Cardiol., 37 (1), 111-9.
93. Zakynthinos, E., Pierutsakos, C.H., Konstantinidis, K., Zakynthinos, S., y
Papadogiannis, D. (2004). Losartan reduces left ventricular hypertrophy
98
proportionally to blood pressure reduction in hypertensives, but does not affect
diastolic cardiac function. Angiology., 55 (6), 669-78.
![Universidad de Colima “ANÁLISIS, DISEÑO Y …digeset.ucol.mx/tesis_posgrado/Pdf/Carlos_Alberto_Perez_Ovando.pdf · Los dispositivos computacionales móviles de bolsillo [Butler2001]](https://static.fdocuments.mx/doc/165x107/5bad0dc209d3f29b4f8ce3de/universidad-de-colima-analisis-diseno-y-los-dispositivos-computacionales.jpg)
