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BBOOGGOOTTÁÁ DD..CC.. 22001100

DETERMINACIÓN DE PERFILES INMUNOFENOTÍPICOS POR CITOMETRÍA DE FLUJO DE LEUCEMIA LINFOBLÁSTICA AGUDA EN NIÑOS Y SU VALOR

EN LA DETECCIÓN DE ENFERMEDAD MÍNIMA RESIDUAL

EDWIN ABRAHAM MEDINA MEDINA CÓDIGO 05-597608

Trabajo presentado para optar al título de especialista en Patología Anatómica y Clínica

DIRIGIDO POR RAFAEL ENRIQUE ANDRADE PÉREZ ADRIANA LINARES BALLESTEROS

CARLOS SAAVEDRA ANDRADE

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA FACULTAD DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE PATOLOGÍA ESPECIALIDAD EN PATOLOGÍA ANATÓMICA Y CLÍNICA

BOGOTÁ D.C. 2010

AGRADECIMIENTOS

A la sección de Oncohematología Pediátrica de la Fundación HOMI Hospital La Misericordia quienes atendieron los pacientes que fueron considerados para la

ejecución de este estudio.

A la sección de Inmunoquímica del Laboratorio Clínico de la Fundación Santa Fe de Bogotá quienes hicieron las adquisiciones de los casos analizados y prestaron

toda su colaboración en la recolección de los registros electrónicos.

A Fredi Alexander Díaz Quijano MD, MSc, PhD(c), por su análisis estadístico de los datos y sus aportes conceptuales para comprender mejor la epidemiología

inmersa en este trabajo.

A mis directores quienes con su constante consejo permitieron llevar a feliz término esta actividad.

Edwin Medina MD

CONTENIDO Pág. INTRODUCCIÓN 12 1. MARCO TEÓRICO 14 1.1 LEUCEMIA LINFOBLÁSTICA AGUDA 14 1.1.1 Definición 14 1.1.2 Epidemiología 15 1.1.3 Etiopatogenia 15 1.1.4 Manifestaciones Clínicas 17 1.1.4.1 Leucemia Linfoblástica B 17 1.1.4.2 Leucemia Linfoblástica T 17 1.1.5 Diagnóstico 18 1.1.5.1 Leucemia Linfoblástica B 19 1.1.5.1.1 Morfología 19 1.1.5.1.2 Citoquímica 19 1.1.5.1.3 Inmunofenotipo 19 1.1.5.1.4 Genética 20 1.1.5.1.5 Diagnóstico diferencial 21 1.1.5.2 Leucemia Linfoblástica T 21 1.1.5.2.1 Morfología 22 1.1.5.2.2 Citoquímica 22 1.1.5.2.3 Inmunofenotipo 22 1.1.5.2.4 Genética 23 1.1.5.2.5 Diagnóstico diferencial 23 1.1.6 Estratificación de riesgo y establecimiento de pronóstico 23 1.1.6.1 Leucemia Linfoblástica B 24 1.1.6.2 Leucemia Linfoblástica T 25 1.1.7 Tratamiento 25 1.1.7.1 Inducción 28 1.1.7.2 Terapia preventiva del Sistema Nervioso Central 28 1.1.7.3 Intensificación 28 1.1.7.4 Terapia de continuación 29 1.1.7.5 Tratamiento de pacientes de muy alto riesgo en primera remisión completa 29 1.1.7.6 Tratamiento de la recurrencia 29 1.1.7.7 Transplante alogénico de células madre hematopoyéticas 30 1.1.7.8 Complicaciones del tratamiento 30 1.1.7.9 Nuevas perspectivas terapéuticas 32 1.1.8 Polimorfismo enzimático 32 1.2 BIOPSIA DE MÉDULA ÓSEA 34 1.2.1 Morfología y maduración normal de médula ósea 34 1.2.1.1 Células Madres Hematopoyéticas 34 1.2.1.2 Línea mieloide/monocítica 35 1.2.1.3 Línea eritroide 36 1.2.1.4 Línea megacariocítica 37

Pág. 1.2.1.5 Línea linfoide B 37 1.2.2 Patrones morfocitométricos clínicamente relevantes 38 1.2.3 Técnicas moleculares de estudio de médula ósea 41 1.3 ESTUDIO DE SANGRE PERIFÉRICA 41 1.4 MEDICIÓN DE ENFERMEDAD MÍNIMA RESIDUAL 41 1.4.1 Definición 42 1.4.2 Técnicas de medición 43 1.4.3 Periodicidad de la medición 45 1.5 PAPEL DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO EN EL ESTUDIO DE ENFERMEDAD RESIDUAL MÍNIMA 50 1.5.1 Descripción de la técnica 50 1.5.1.1 Anticuerpos 51 1.5.1.2 Antígenos 52 1.5.1.3 Reacción antígeno-anticuerpo 52 1.5.1.4 Inmunofenotipificación 53 1.5.1.5 Consideraciones generales de la aplicación clínica del estudio de inmunofenotipo por Citometría de Flujo 54 1.5.2 Detección inmunofenotípica de Enfermedad Mínima Residual 60 1.5.3 Fenotipos asociados a leucemia 63 1.5.3.1 Expresión cruzada de antígenos 64 1.5.3.2 Expresión asincrónica de antígenos 65 1.5.3.3 Sobreexpresión de antígenos 65 1.5.3.4 Fenotipos ectópicos 66 1.5.3.5 Patrones anormales de dispersión de luz 66 1.5.3.6 Vías anormales de maduración 66 1.5.4 Cambios fenotípicos 66 1.5.5 Sensibilidad del inmunofenotipo por citometría para la detección de Enfermedad Mínima Residual 67 1.5.6 Valor clínico del inmunofenotipo en la investigación de Enfermedad Mínima Residual 67 1.6 DETERMINACIÓN DE PLOIDIA POR CITOMETRÍA DE FLUJO 68 1.6.1 Descripción de la técnica 68 1.6.2 Estudios realizados 69 2. JUSTIFICACIÓN 71 3. OBJETIVOS 73 3.1 OBJETIVO GENERAL 73 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 73 4. MATERIALES 74 4.1 DISEÑO 74 4.2 UNIVERSO 74 4.3 MUESTRA 74 4.4 SELECCIÓN DE CASOS 74

Pág. 4.5 CRITERIOS DE INCLUSIÓN 74 4.6 CRITERIOS DE EXCLUSIÓN 75 4.7 SEGUIMIENTO DE PACIENTES 75 4.8 RESULTADOS PRIMARIOS 75 4.9 RESULTADOS SECUNDARIOS Y SUBROGADOS 75 4.10 ANÁLISIS ESTADÍSTICO 75 4.11 FUENTES DE ERROR PREDECIBLES 75 4.12 DIFUSIÓN DE RESULTADOS 76 5. MÉTODOS 77 5.1 MÉTODOS DIAGNÓSTICOS 77 5.1.1 Diagnóstico Clínico de Leucemia Linfoblástica Aguda en niños 77 5.1.2 Diagnóstico Hematopatológico de Leucemia Linfoblástica Aguda en niños 77 5.2 MÉTODOS TERAPÉUTICOS 80 5.3 MÉTODOS DE SEGUIMIENTO 80 5.4 MÉTODOS DE RECOLECCIÓN DE DATOS PARA EJECUCIÓN DEL TRABAJO DE INVESTIGACIÓN 81 6. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES 83 7. CONSIDERACIONES ÉTICAS E IMPACTO AMBIENTAL 84 8. PROPIEDAD INTELECTUAL 86 9. PRESUPUESTO 87 10. RESULTADOS 88 10.1 PERFILES INMUNOFENOTIPOS POR CITOMETRÍA DE

FLUJO EN LEUCEMIA LINFOBLASTICA AGUDA EN NIÑOS 88

10.2 UTILIDAD DEL ESTUDIO DE INMUNOFENOTIPO POR CITOMETRÍA DE FLUJO PARA LA DETECCIÓN DE ENFERMEDAD MÍNIMA RESIDUAL 95

10.3 PARÁMETROS DE ALTERACIONES FENOTÍPICAS ÚTILES PARA LA APROXIMACIÓN DIAGNÓSTICA Y DE SEGUIMIENTO EN LEUCEMIA LINFOBLÁSTICA AGUDA EN NIÑOS 96

10.4 CONCORDANCIA INTEROBSERVADOR Y REPRODUCIBILIDAD METODOLÓGICA 99

10.5 DISCUSIÓN DE RESULTADOS 101 11. CONCLUSIONES 104

REFERENCIAS 106 ANEXOS 114

INDICE DE TABLAS Pág. Tabla 1.1 Síntomas de presentación de LLA por grupos de edad 18 Tabla 1.2 Caracterización de LLA acorde a morfología 18 Tabla 1.3 Caracterización de pronóstico en LLA acorde a variables clínicas 25 Tabla 1.4 Medicamentos empleados en terapéutica de LLA 27 Tabla 1.5 Anticuerpos monoclonales de importancia terapéutica 32 Tabla 1.6 Metodologías útiles en detección de Enfermedad Mínima Residual 44 Tabla 1.7 Calendario de evaluación de médula ósea para detección de EMR 45 Tabla 1.8 Inmunofenotipo básico de líneas hematológicas normales 54 Tabla 1.9 Problemas comunes de la citometría de flujo 60 Tabla 1.10 Aberraciones fenotípicas de mayor utilidad en detección de EMR 64 Tabla 6.1 Cronograma (años 2006-2010) 83 Tabla 9.1 Presupuesto global (en miles de $) 87 Tabla 9.2 Descripción de los equipos por adquirir (en miles de $) 87 Tabla 9.3 Servicios Técnicos (en miles de $) 87 Tabla 9.4 Publicaciones y Patentes (en miles de $) 87 Tabla 10.1 Caracterización de niños con Leucemia Linfoblástica

Aguda 2005-2009 88 Tabla 10.2 Distribución de antígenos en LLA de fenotipo B 89 Tabla 10.3 Distribución de antígenos en LLA de fenotipo T 89 Tabla 10.4 Perfil de antígenos infrecuentes en Leucemia

Linfoblástica Aguda de niños 2005-2009 91 Tabla 10.5 Caracterización de los pacientes con LLA 2005-2009

que presentaron eventos adversos 92 Tabla 10.6 Caracterización de los pacientes con LLA 2005-2009

que presentaron eventos adversos acorde a la presencia de alteraciones fenotípicas 93

Tabla 10.7 Antígenos asociados con la aparición de eventos sobre el total de pacientes 93

Tabla 10.8 Antígenos asociados con la aparición de eventos en niños con Leucemia Linfoblástica Aguda prepreB 94

Tabla 10.9 Características operativas de definiciones de fenotipo según la presencia de antígenos infrecuentes (LLA general) 94

Tabla 10.10 Características operativas de definiciones de fenotipo según la presencia de antígenos infrecuentes (LLA prepreB) 95

Tabla 10.11 Niveles de detección de Enfermedad Mínima Residual asociados a eventos 96

Pág. Tabla 10.12 Distribución de alteraciones fenotípicas útiles para la

aproximación diagnóstica y de seguimiento de Leucemia Linfoblástica Aguda en niños 97

Tabla 10.13 Distribución de infraexpresión de antígenos en Leucemia Linfoblástica Aguda en niños 97

Tabla 10.14 Distribución de sobreexpresión de antígenos en Leucemia Linfoblástica Aguda en niños 98

Tabla 10.15 Distribución de expresión cruzada de antígenos en Leucemia Linfoblástica Aguda en niños 98

Tabla 10.16 Distribución de expresión asincrónica de antígenos en Leucemia Linfoblástica Aguda en niños 98

Tabla 10.17 Concordancia interobservadores en la detección de blastos en estudios de seguimiento por citometría de flujo en niños con LLA 100

INDICE DE GRÁFICAS Pág. Gráfica 10.1 Niveles de detección de blastos en estudios de

seguimiento de niños con Leucemia Linfoblástica Aguda atendidos en el Hospital La Misericordia 2005-2009 96

Gráfica 10.2 Regresión logística de acuerdo entre datos reportados y observados de estudios de seguimiento por citometría de flujo en niños con LLA 99

INTRODUCCIÓN Las neoplasias hematolinfoides son un gran grupo de enfermedades que constituyen una de las principales causas de morbimortalidad en niños y adultos. En el grupo pediátrico generan más de 3000 nuevos casos anuales de enfermedad en los Estados Unidos, acarreando costos en tratamiento superiores a cien mil dólares paciente/año, sin contar el impacto afectivo que genera en los pacientes y sus familiares, y en la comunidad, en la que usualmente se promueven movimientos en pro de la salud de los menores. Los padres, por lo general organizados en sociedades de lucha contra el cáncer, buscan todos los medios para brindar al menor las condiciones que le permitan llevar de la mejor forma posible las penurias y dolencias de su enfermedad. A pesar de los esfuerzos en estudiar e investigar sobre neoplasias infantiles, sólo hasta los últimos años, en los cuales el análisis a nivel molecular de las enfermedades ha logrado un sitial importante, su conocimiento era bastante escaso; sin embargo, ya se conocen genes relacionados con gran cantidad de neoplasias y los factores que desencadenan los cambios celulares necesarios para el desarrollo de un gran número de enfermedades. Igualmente, existe gran interés por establecer las alteraciones del microambiente uterino que predisponen al desarrollo de cáncer posnatal, así como el desarrollo de neoplasias in-útero. En general, el estudio del cáncer en niños es un área de interés creciente y sobre el cual queda aún mucho por decir. En lo particular de las neoplasias hematolinfoides, se ha avanzado mucho con el conocimiento del proceso de maduración en múltiples pasos y se ha comprendido mejor las alteraciones que ocurren para el desarrollo de leucemias. Específicamente, el desarrollo de técnicas moleculares y el estudio de inmunofenotipo ha cambiado por completo los enfoques diagnóstico, terapéutico y pronóstico de las leucemias, y se ha incrementado el interés por establecer los niveles de enfermedad mínima residual. Sin embargo, nuestro conocimiento sobre enfermedad mínima residual es escaso, y nuestro medio carece de estudios propios en los cuales se haya demostrado la real utilidad de estas técnicas en lo concerniente a rendimiento operativo y correlación clínica. Esta coyuntura abre un espacio para la investigación clínica con orientación básica como la que se quiere desarrollar con el presente estudio.

El presente trabajo se articula sobre una somera revisión sobre los tópicos más relevantes en la comprensión de leucemia linfoblástica, su estudio diagnóstico y pronóstico, técnicas de estudio de enfermedad residual y brevemente algunos conceptos de terapéutica. Se hace especial énfasis en el estudio de inmunofenotipo por citometría de flujo y su utilidad en medición de enfermedad mínima residual, debido a que es el enfoque especial del trabajo. Continúa con la

descripción de los puntos más importantes del diseño de la propuesta de investigación y finaliza con los resultados esperados. Se espera que los resultados del presente trabajo permitan a nuestra comunidad médica mejorar los estándares de tratamiento y establecer nuestra definición de riesgo, aplicable a los pacientes, para orientar la terapéutica con base en éste.

1. MARCO TEÓRICO La siguiente revisión engloba los elementos más relevantes para comprender la enfermedad objeto de nuestro estudio. No se busca agotar el tema, puesto que es excesivamente extenso, y resultaría inoficioso recoger la totalidad de conceptos expresados en relación con la enfermedad. Considerando lo anterior, la revisión se orienta a comprender la enfermedad, cómo afecta a la población y cuáles son los puntos básicos en los cuales se presentan las alteraciones que desencadenan el desarrollo de la neoplasia, con una brevísima revisión de los conceptos actuales de terapia y pronóstico basados en el riesgo. 1.1 LEUCEMIA LINFOBLÁSTICA AGUDA Las neoplasias hematolinfoides han sido consideradas históricamente como un gran grupo de enfermedades que comparten entre sí el compromiso de médula ósea, y otros órganos, por la expansión clonal y desordenada de una, o varias, líneas celulares originadas de una célula alterada. Desde las clasificaciones más antiguas, pasando por FAB y REAL, y la actual clasificación de OMS, se ha demostrado la dificultad que plantean estas neoplasias en su comprensión y el incremento en la información disponible para su diagnóstico, pronóstico y tratamiento. Algunos de los avances más significativos en la terapia de leucemias en los últimos veinte años han ocurrido con las leucemias linfoblásticas agudas B y T. La “tasa de cura”, o períodos libres de enfermedad a cinco años, supera para algunas leucemias B el 80%. Sin embargo, algunos tipos están relacionados con bajas tasas de remisión y altas tasas de recurrencia. Los perfiles citogenéticos, el genotipo y el inmunofenotipo de las células malignas han tenido considerable impacto en el reconocimiento de la estratificación de riesgo con el reconocimiento de grupos de bajo y alto riesgos. Esta estratificación ha permitido el desarrollo de regímenes terapéuticos más específicos, logrando tasas de remisión más altas en grupos de alto riesgo, y reduciendo la toxicidad en los grupos de bajo riesgo. (Brunning 2001, Campana 2004, Pui 2000) 1.1.1 Definición. La Leucemia Linfoblástica de precursores B (LLA-B), así como el linfoma linfoblástico, es una neoplasia que compromete el linaje de células B, compuesto de células blásticas de tamaño pequeño a mediano, con escaso citoplasma, cromatinas dispersas o moderadamente condensadas y nucléolos mínimos, que involucra la médula ósea y la sangre. Similar descripción cobija a las neoplasias de precursores T. (Brunning 2001) La Leucemia Linfoblástica y el Linfoma Linfoblástico comparten la misma unidad biológica, por lo que en muchos pacientes la diferenciación entre ellos no se realiza, o se basa simplemente en el compromiso preferente de médula ósea

(leucemia) o ganglios linfáticos (linfoma). Cuando al momento de la presentación el paciente presenta masa o blastos de menos del 25% en médula ósea, se prefiere el término de linfoma. (Brunning 2001) 1.1.2 Epidemiología. La leucemia linfoblástica aguda es la forma más frecuente de neoplasia en niños y jóvenes, representando el 32% de las neoplasias en menores de 15 años y 26% en menores de 20 años. (Ravindranath 2003) El pico de incidencia ocurre entre los 2 y 5 años de edad y es más común en varones blancos, situación que se ha incrementado en las últimas 2 décadas. (Chan 2002) El riesgo de leucemia es más alto en países industrializados como se observa en EEUU, Italia, Australia, Suiza y Japón, y más bajo en África y Asia. (Redaelli 2005) La leucemia representa cerca de la tercera parte de las neoplasias en niños, correspondiendo hasta el 80% a leucemia linfoblástica B, 17% a leucemia mieloide aguda, y el porcentaje restante a leucemias agudas y crónicas poco frecuentes. (Ziegler 2005) La leucemia linfoblástica (LLA) es una enfermedad principalmente de niños y adolescentes, sin embargo un segundo pico más pequeño se observa en mayores de 70 años. (Redaelli 2005) Se estima una incidencia anual en EEUU de 3200 casos, de los cuales el 80-85% corresponde a precursores de fenotipo B, y sólo 15% de precursores T. (Brunning 2001, Ravindranath 2003) Ajustado por edad el riesgo de desarrollo de leucemia en EEUU para el 2000 es de 1.4 por 100000 habitantes en población general, y se eleva a 3 por 100000 en menores de 19 años. (Redaelli 2005) El 75% de las LLA de precursores B se presenta en niños menores de 6 años, sin predominio de ningún género. Por el contrario, las LLA de precursores T se presentan con mayor frecuencia en adolescentes y niños mayores, con predominio de género masculino. (Brunning 2001) En relación con la raza, la LLA es más frecuente en población blanca que negra con razón 10:6, y en los EEUU se observa con mayor frecuencia entre los latinos de Los Ángeles. (Redaelli 2005) Las leucemias linfoblásticas presentan tasas de curación de hasta el 80%, mientras que su contraparte mieloide alcanza escasamente el 40-50% de éxito. (Ravindranath 2003) La mortalidad ha sido calculada en 0.5 por 100000 habitantes ajustado por edad, con ligero incrementó en el género masculino con 0.6 por 100000. La tendencia de incidencia se mantiene para la mortalidad en lo concerniente a raza. (Redaelli 2005) 1.1.3 Etiopatogenia. La etiología de las leucemias linfoblásticas es aún poco conocida, pero se ha postulado que el interjuego de las regulaciones a la baja de genes supresores de tumor y a la alta de oncogenes sumado a un desencadenante medioambiental generan el cambio neoplásico en las células. (Redaelli 2005) Hay evidencia que sugiere un factor genético en algunos casos (Brunning 2001), y otras que están relacionadas con enfermedades específicas

como el síndrome de Down o la anemia de Fanconi, pero ellos cuentan sólo para la minoría de casos. (Ziegler 2005, Chan 2002) Aparentemente, la leucemia se inicia con un evento in-utero, el cual se ha demostrado por análisis molecular de células mononucleares de muestras de sangre de cordón luego del nacimiento; dichas alteraciones, luego de varios años, son expresadas de igual modo en el fenotipo neoplásico. (Ziegler 2005, Rubnitz 2003, Ravindranath 2003) Se ha establecido que el uso por la gestante de ciertas sustancias como marihuana, antihistamínicos, anfetaminas, entre otras, pueden incrementar el riesgo en el hijo de presentar leucemia en la niñez, mientras que el uso sistemático de folato durante el embarazo ha reducido hasta en 60% los casos de neoplasia. (Ziegler 2005) No se ha podido establecer el papel de factores medioambientales tales como campos electromagnéticos, exposición a radón, pesticidas y tabaquismo materno en el desarrollo de la enfermedad. (Chan 2002) Otros factores posiblemente implicados incluyen exposición nuclear residencial u ocupacional en los niños o los padres, radiaciones no ionizantes, pesticidas, benceno, vitamina K, aceite de hígado de bacalao, inhibidores de la topoisomerasa II naturales y manufacturados, nitratos de la dieta (“hot dogs”) y el consumo de agua contaminada con tricloroetilieno. (Redaelli 2005) El estudio por técnicas de citogenética de sangre de cordón ha demostrado translocaciones específicas de leucemia t(12;21) ó la fusión TEL-AML1 hasta en el 1% de los recién nacidos. Se ha reportado similar presentación de lesiones premalignas del neuroblastoma y tumor de Wilms, con lo que se sugiere que la mayoría de las neoplasias infantiles se origina in-utero, pero tienen baja penetrancia (<1%). Acorde a la tasa de presentación de casos, se requiere que el 1% de los niños con dichas alteraciones sufran un segundo golpe durante su infancia para que se desarrolle en ellos leucemia. Este segundo golpe se puede presentar en cualquier momento luego del parto, sin que exista un período de latencia establecido pero que puede llegar a ser hasta de 15 años (Rubnitz 2003, Ravindranath 2003). Igualmente, se han detectado rearreglos de IgH en los casos de hiperploidía de leucemias linfoblásticas, t(4;11) en sangre de cordón, lo que ha demostrado que la no disyunción cromosómica como causa de las hiperploidías se produce in-utero. (Ravindranath 2003) Entre los posibles factores que pueden producir el segundo golpe se estudian químicos (pesticidas) e infecciones. El análisis del segundo golpe se suscitó a partir del reconocimiento de niños con síndrome de Down que padecían de desorden mieloproliferativo transitorio (presente hasta en el 10% de ellos) y desarrollaron leucemia megacarioblástica aguda, en los cuales se encontró mutación del gen GATA1, esencial para el desarrollo de líneas eritroide y megacarioblástica. Sin embargo, otro golpe desconocido aún debe ocurrir para permitir la progresión. (Ziegler 2005)

Otra teoría que ha tomado importancia a raíz de la demostración del potencial oncogénico de ciertas infecciones, corresponde a la infección tardía. Contrario a lo que ocurre en la mayoría de secuencias infección-oncogénesis, en el caso de la leucemia linfoblástica, la carencia de una infección temprana en la infancia retrasaría la maduración del sistema inmune que se da con el cambio de fenotipo Th2 a Th1, el cual es esencial en la respuesta mediada por interferón gamma, con lo que se desarrollaría la neoplasia; esta apreciación se respalda con el hallazgo de susceptibilidad a citotoxicidad y heterofagia por células NK y T que se presenta en casos de leucemia linfoblástica TEL-AML1. (Ravindranath 2003) La enfermedad compromete principalmente médula ósea y sangre. El compromiso extramedular es frecuente con predilección particular por el sistema nervioso central, ganglios linfáticos, bazo, hígado y gónadas. (Brunning 2001) La presentación de linfoma linfoblástico B compromete principalmente piel, hueso, tejidos blandos y ganglios linfáticos, siendo infrecuente las masas mediastinales. Por el contrario, el linfoma linfoblástico T debuta con masa mediastinal hasta en el 50% de los casos, pero compromete también ganglios linfáticos, piel, hígado, bazo, anillo de Waldeyer, sistema nervioso central y gónadas. (Brunning 2001) 1.1.4 Manifestaciones Clínicas. A partir de este aparte se consideran por separado las leucemias de precursores B y T. Sin embargo, comparten los dos tipos de enfermedad que sus síntomas son larvados y son manifestación de la falla de hematopoyesis e infiltración de órganos por la expansión clonal de las células tumorales, y que los síntomas pueden estar ausentes hasta en dos terceras partes de los pacientes. (Chan 2002) 1.1.4.1 Leucemia Linfoblástica B. La mayoría de los pacientes se presentan con falla medular: trombocitopenia, anemia y/o neutropenia. El conteo de leucocitos puede estar disminuido, normal o marcadamente elevado, pero sólo el 50% de los pacientes tienen conteos de blancos mayores de 10000/µl (Chan 2002). Son frecuentes las linfadenopatías y hepatoesplenomegalia. Los dolores óseos y las artralgias pueden ser síntomas cardinales. (Brunning 2001) 1.1.4.2 Leucemia Linfoblástica T. Típicamente se presenta con altos conteos de leucocitos y, frecuentemente, con masa mediastinal o en otros tejidos. Para un conteo de leucocitos y un compromiso tumoral dado, la hematopoyesis puede estar respetada comparada con su contraparte B. (Brunning 2001) La siguiente tabla presenta las frecuencias relativas de los síntomas a la presentación de la enfermedad. Se compara con la población adulta.

Tabla 1.1 Síntomas de presentación de LLA por grupos de edad Niños (%) Adultos (%)

Fiebre 57 33-56 Fatiga 50 - Sangrado 43 33 Dolor osteoarticular 25 25 Linfadenopatía 70 49 Hepatomegalia 66 35 Esplenomegalia 59 44 Masa mediastinal 8 15 Compromiso del SNC 3 2-10 Compromiso testicular 1 0,3

Tomado de Redaelli 2005. 1.1.5 Diagnóstico. Las consideraciones diagnósticas más relevantes son enunciadas a continuación. Se mantiene la separación metodológica de linaje B y T. Tener en cuenta que se presentan alteraciones en los paraclínicos que son comunes a ambos linajes que incluyen leucocitosis con neutropenia, anemia y trombocitopenia variables, elevaciones de LDH, ácido úrico, creatinina, calcio y fosfato, con disminución del nivel de inmunoglobulinas circulantes. (Redaelli 2005) Durante los años anteriores se empleaba la clasificación de la cooperación Franco Americano Británica (FAB), que separaba en 3 grupos pronósticos basados en morfología celular (L1 a L3), donde L2 tenía el peor pronóstico antes de intensificar las terapias, fue remplazada por la clasificación de OMS, que incluye otros parámetros que se exponen en los siguientes apartes. (Chan 2002) La clasificación de FAB se puede resumir con la siguiente tabla. Tabla 1.2 Caracterización de LLA acorde a morfología L1 L2 L3 Frecuencia 80% 17% 3%

Características

Linfoblastos pequeños con

escaso citoplasma, sin nucléolos ni

vacuolas prominentes.

Células más grandes,

heterogéneas, con más citoplasma y

nucléolos, sin vacuolas.

Blastos grandes homogéneos con cromatinas finas,

nucléolos prominentes, citosol

basofílico con vacuolas.

Inmunofenotipo asociado Precursor B ó T Precursor B ó T Células B maduras

(Burkitt) Tomado de Redaelli 2005.

1.1.5.1 Leucemia Linfoblástica B. Se consideran cuatro apartes diagnósticos (morfología, citoquímica, inmunofenotipo y genética) y un quinto aparte de diagnóstico diferencial. 1.1.5.1.1 Morfología. Los linfoblastos en frotis y extendidos varían desde blastos pequeños con escaso citoplasma, cromatina nuclear condensada, y nucléolo mínimo, hasta células más grandes con cantidad moderada de citoplasma azul claro-gris azulado, ocasionalmente vacuolado, cromatina nuclear dispersa, y nucléolos prominentes múltiples variables. Gránulos azurófilos dispersos están presentes en algunos linfoblastos en aproximadamente 10% de los casos. Estos hallazgos se pueden correlacionar con anormalidades genéticas t(9;22)(q34;q11.2). En algunos casos, los linfoblastos tienen pseudópodos citoplasmáticos (células en espejo de mano). (Brunning 2001) En biopsias de médula ósea, los linfoblastos son relativamente uniformes en apariencia, con núcleos redondos, ovales o, indentados y algunas veces convolutos. Los nucléolos variablemente son prominentes, aunque usualmente mínimos o indistintos. La cromatina está finamente dispersa. El número de figuras mitóticas usualmente varía, y son menos numerosas que en su contraparte T. (Brunning 2001) Su presentación en linfoma está generalmente caracterizada por un patrón de compromiso ganglionar difuso, o de otros tejidos, en algunos casos con compromiso parcial del infiltrado linfoblástico en el área paracortical con respeto de los centros germinales. Los linfoblastos son homogéneos en apariencia con núcleos redondos a ovales los cuales pueden manifestar grados variables de convolución en la membrana nuclear. La cromatina nuclear es finamente punteada; los nucléolos son generalmente mínimos. En la mayoría de los casos, las figuras mitóticas son numerosas y en algunos casos puede haber un patrón focal de “cielo estrellado”. Su contraparte T es indistinguible morfológicamente. (Brunning 2001) 1.1.5.1.2 Citoquímica. Los linfoblastos son negativos para mieloperoxidasa y carecen de reactividad tipo mieloide con Sudán Negro B (SBB). Los gránulos linfoblásticos pueden teñir gris claro con la tinción SBB pero menos intenso que los mieloblastos. Los linfoblastos pueden mostrar positividad PAS, siendo en algunos casos el núcleo parcialmente rodeado por un anillo de reactividad PAS. Los linfoblastos pueden reaccionar con esterasa inespecífica con punteado multifocal o patrón de aparato de Golgi con inhibición variable con fluoruro de sodio. (Brunning 2001) 1.1.5.1.3 Inmunofenotipo. Los linfoblastos son deoxinucleotidiltransferasa terminal (TdT) positivos, HLA-DR positivos, y casi siempre positivos para CD19, CD79a citoplásmica y CD38. Son positivos para CD10 y CD24 en la mayoría de casos; en casos t(4;11)(q21;q23) son usualmente CD10 negativos y frecuentemente CD24

negativos. Hay expresión variable de CD20 y CD22. CD45 puede estar ausente. La expresión citoplásmica de CD22 es considerada específica de linaje. Los antígenos mieloides CD13 y CD33 pueden ser de expresión aberrante. (Brunning 2001) El grado de diferenciación de los linfoblastos del linaje B tiene correlación clínica y genética. En el estado más temprano -precursor temprano-, los blastos expresan CD19, CD79a y CD22 citoplásmicos, y TdT nuclear, y en el estado intermedio -común-, los blastos expresan CD10. Estos dos estados representan la mayoría de casos de leucemia (50-70%). Entre 20-30% de los casos corresponden con el estado de diferenciación más maduro -preB-, los blastos expresan cadenas mu citoplásmica (cyt-µ). Es característica la ausencia de inmunoglobulina de superficie, pero su presencia no excluye el diagnóstico de LLA-B, puesto que entre el 2-3% de estas neoplasias presentan esta característica y son CD20+. (Chan 2002, Brunning 2001) 1.1.5.1.4 Genética. Las alteraciones genéticas son marcadores pronósticos importantes, detectándose hasta en el 75% de las leucemias linfoblásticas. (Rubnitz 2003) Las alteraciones citogenéticas en neoplasias de precursores B se consideran en varios grupos: hipoploidías, hipodiploidías <50, hiperdiploidías >50, translocaciones y pseudodiploidías: (Brunning 2001, Chan 2002) LLA- t(9;22)(q34;q11.2); BCR/ABL LLA- (v;11q23); rearreglo MLL LLA- t(12;21)(p13;q22); TEL/AML1 LLA- t(1;19)(q23;p13.3); PBX/E2A LLA- hipodiploide LLA- hiperdiploide >50 Estos hallazgos son de importancia pronóstica y son usados para modificar tratamientos en enfermedad pediátrica. Con los tratamientos actuales, los grupos de buen pronóstico son: hiperploidía entre 51 y 65 cromosomas, correspondiente a DI (contenido de DNA) por citometría de flujo de 1.16 a 1.6; y t(12;21)(p12;q22), la cual es resultado de la fusión del gene TEL en 12p13 con el gen del factor codificante de transcripción AML1 en 21q22. Los hallazgos relacionados con pobre pronóstico son: 1) t(9;22), la cual resulta de la fusión de BCR en 22q11.2 y el gen de tirosina quinasa citoplásmica ABL en 9q34, y produce una proteína de fusión en niños p190kd BCR/ABL y en la mitad de casos de adultos p210kd y los restantes p190 (predomina en LMC). 2) LLA de precursores B en estados tempranos de diferenciación pueden tener t(4;11) con fusión del gen MLL en 11q23 que codifica una proteína putativa que liga DNA y AF4 en 4q21; otra translocación en 11q23 resulta de la fusión del locus MLL con otras parejas de genes. LLA con anormalidades 11q23 pueden surgir también relacionadas a la terapia de leucemia secundaria a etopósido. 3) t(1;19), encontrada en el 25% de las LLA-B de niños con expresión citoplásmica de mu, fusiona el gen que codifica el factor de transcripción E2A en 19p13.3 con PBX en 1q23, asociado con pobre pronóstico. 4)

Hipodiploidía está asociada con pobre pronóstico. Otras anormalidades (del(6q), del(9p), del(12p), hiperploidías <51, triploidía cercana y tetraploidía cercana) se asocian con pronóstico intermedio. (Brunning 2001) Algunas entidades genéticamente definidas tienen inmunofenotipos característicos. Leucemias con rearreglos de MLL son característicamente CD10-, y frecuentemente CD24- y CD15+. LLA-B t(1;19) es CD10+, CD34-, y CD20- o débil y usualmente mu citoplásmica positivas; este fenotipo se relaciona con alta tasa de recurrencia con protocolos basados en edad y conteo de blancos, pero con intensificación de terapia se ha logrado mejorar el panorama (Chan 2002). LLA-B t(12;21) muestra alta densidad de expresión de CD10 y HLA-DR con CD19 y CD20 usualmente negativos. (Brunning 2001) Otras traslocaciones de importancia reconocidas por técnicas moleculares no detectadas por citogenética incluyen la t(12;22) críptica, que confiere buen pronóstico. (Chan 2002) 1.1.5.1.5 Diagnóstico diferencial. Los diagnósticos diferenciales de leucemia linfoblástica B incluyen LLA-T, LMA con mínima diferenciación, y médula ósea reactiva con incremento de hematogonias. Las dos primeras son diferenciables por inmunofenotipo. (Brunning 2001) Las hematogonias se pueden incrementar en niños y en adultos mayores con desórdenes tales como anemia ferropénica, neuroblastoma y púrpura trombocitopénica idiopática, o posterior a terapia citotóxica. Estas células tienen una relación núcleo/citoplasma muy alta y una cromatina nuclear homogénea; los núcleos muestran indentación o hendiduras. No se identifican usualmente nucléolos, son indistinguibles. Estas células no se observan en sangre periférica. En biopsias de médula ósea las hematogonias son distribuidas uniformemente en el intersticio. La cromatina nuclear es muy agrupada; nucléolos y figuras mitóticas son raramente observados. (Brunning 2001) Las hematogonias son difíciles de diferenciar de linfoblastos puesto que expresan en forma similar CD10 y TdT. Sin embargo, en análisis con citometría de flujo de parámetros múltiples, las hematogonias muestran la secuencia de diferenciación normal que incluye CD10, CD19, CD20, CD34 y CD45, observándose predominio de estados intermedio (CD10+, CD19+, TdT- y sIg-) y tardío (CD19+, CD20+, sIg+). Por el contrario, sumado a las aberraciones fenotípicas, los linfoblastos predominan estados inmaduros (TdT+, CD19+, CD20-, sIg-) y reducción de células maduras. (Brunning 2001) 1.1.5.2 Leucemia Linfoblástica T. Se consideran cuatro apartes diagnósticos (morfología, citoquímica, inmunofenotipo y genética) y un quinto aparte de diagnóstico diferencial.

1.1.5.2.1 Morfología. Los linfoblastos T son similares a los B. En frotis las células son de tamaño medio con alta razón núcleo/citoplasma, pudiendo existir un amplio rango de tamaño desde linfoblastos pequeños con cromatina nuclear muy condensada y sin nucléolos evidentes hasta blastos más grandes con cromatina finamente dispersa y nucléolos relativamente prominentes. Se pueden observar vacuolas citoplásmicas. En cortes de médula ósea los linfoblastos tienen una gran relación núcleo/citoplasma, cromatina finamente punteada y nucléolos mínimos. El conteo mitótico se ha reportado alto. (Brunning 2001) El compromiso ganglionar se manifiesta por completo borramiento de la arquitectura habitual, comprometiendo la cápsula. Se puede presentar patrón de “cielo estrellado”. Se puede observar compromiso parcial en localización paracortical con respeto de centros germinales. En algunos casos la población predominante de blastos tiene núcleo convoluto; se pueden observar abundantes figuras mitóticas. (Brunning 2001) Un pequeño número de pacientes con LLA-T, eosinofilia e hiperplasia mieloide han sido descritos. En algunos casos se han asociado anormalidades genéticas en células de médula ósea t(8;13)(p11.2;q11.22). Varios de esos casos desarrollaron neoplasias mieloides tanto leucemias mieloides agudas como síndromes mielodisplásicos o sarcoma mieloide, siendo más frecuentes en varones. (Brunning 2001) 1.1.5.2.2 Citoquímica. Los linfoblastos T muestran actividad focal de fosfatasa ácida en frotis y extendidos. (Brunning 2001) 1.1.5.2.3 Inmunofenotipo. Los linfoblastos en LLA-T expresan TdT y niveles variables de CD1a, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7 y CD8. De éstos, CD7 y CD3 citoplásmico son más frecuentemente positivas, y sólo CD3 es considerado específico de linaje. CD4 y CD8 son frecuentemente coexpresados en blastos, y CD10 puede ser positivo. Se ha observado expresión en algunos casos de CD79a. Es frecuente encontrar expresión aberrante de antígenos mieloides CD13 y/o CD33, y en raras ocasiones CD117 (c-kit), sin que su presencia excluya el diagnóstico. Los linfoblastos T pueden mostrar rearreglos del gen del receptor T (TCR), pero esto no es específico de linaje. (Brunning 2001) Estas neoplasias pueden ser estratificadas acordes a los diferentes estados de diferenciación intratímica (CD3 citoplásmico, CD2 y CD7 son tempranamente expresados, seguidos por CD5 y CD1a, seguido por CD3 de membrana). Algunos estudios han correlacionados esos estados de diferenciación con pronóstico, pero no se ha logrado establecer las alteraciones genéticas específicas. Otros marcadores de inmadurez como HLA-DR y CD38 son usualmente expresados. (Brunning 2001, Chan 2002)

1.1.5.2.4 Genética. Hasta en un tercio de las neoplasias se han detectado translocaciones en locus del receptor T delta y alfa en 14q11.2, locus beta en 7q35, y locus gamma en 7p14.15, con una variedad de genes emparentados. Los genes incluyen los factores de transcripción MYC (8q24.1), TAL1 (1p32), RBTN1 (11p15), RBTN2 (11p13) y HOX11 (10q24) y la tirosina quinasa citoplásmica LCK (1p34.3). En la mayoría de casos esas translocaciones conducen a una desregulación de la transcripción de los genes emparentados por yuxtaposición con la región reguladora del locus del receptor de células T. En cerca del 25% de casos de LLA-T el locus TAL1 es desregulado por una deleción en su región regulatoria 5’ más que por translocación. La deleción 9p, resultante en la pérdida del gen supresor tumoral CDKN2A (inhibidor de la CDK4), ocurre con más frecuencia en LLA-T. (Brunning 2001) 1.1.5.2.5 Diagnóstico diferencial. Corresponde básicamente a los antes descritos para LLA-B. Especialmente señalar, que a diferencia de las hematogonias, los linfoblastos T muestran en todos los casos expresión de antígenos de células T. (Brunning 2001) 1.1.6 Estratificación de riesgo y establecimiento de pronóstico. La estratificación de riesgo se basa en características clínicas, inmunológicas y citogenéticas para predecir el desenlace de la enfermedad y brindar una terapia óptima. Para tal fin se han definido tres estratos de riesgo: estándar, medio y alto, denominados por algunos como bajo, estándar y alto, aunque la mayoría de centros sólo emplea los dos últimos, e incluyen un estrato de altísimo riesgo. En general, los de bajo riesgo tienen mejor desenlace, requieren terapia menos intensiva y tienen menos probabilidad de recurrencia. Anteriormente, se consideraban los criterios clínicos y morfológicos de máxima importancia, pero actualmente han sido complementados por factores genéticos e inmunológicos. (Redaelli 2005, Ravindranath 2003) El grupo BFM popularizó la respuesta a 1 semana de prednisona con metotrexate intratecal como determinante del riesgo asociado a parámetros como edad y conteo de blancos, mientras que el grupo de oncología pediátrica estableció el cariotipo como un indicador básico para establecer el resultado en LLA preB. Los blastos de niños con LLA menores de 1.5 años fueron resistente a prednisona, asparaginasa, y tenopósido, pero más sensible a citarabina. Las LLA CD10- son más resistentes a glucocorticoides, asparaginasa, tiopurinas, antraciclinas e ifosfamide pero más sensible a citarabina comparado a LLA preB. Células de niños mayores de 10 años fueron más resistentes a prednisona, dexametasona, asparaginasa, idarubicina y 6-mercaptopurina. LLA-T con fuerte resistencia a prednisona, asparaginasa, y vincristina y todas las otras drogas excepto tiopurina y tenipósido. El pronóstico favorable de la hiperploidía se relaciona con susceptibilidad mayor a antimetabolitos como metotrexate, 6-mercaptopurina, y asparaginasa. Estudios in-vitro de resistencia a quimioterapia se correlacionaron con respuesta y período libre de enfermedad, y predijeron EMR al final de la

inducción (prednisona). Se sugiere que la terapia se debe individualizar acorde a la resistencia: usar citarabina en niños pequeños, asparaginasa en TEL-AML1. TEL-AML1 es un factor pronóstico favorable relacionado con la terapia intensiva con asparaginasa y la aparición de nuevas líneas tumorales diferentes. Los niños menores de 1 año tienen pésimo pronóstico, relacionado con 11q23 o rearreglo del gen de leucemia de linaje mixto (MLL), fenotipo preB con DR+ CD10-, con marcador mieloide, tiene sensibilidad por citarabina. Se ha asociado polimorfismo NQO1 con rearreglo MLL t(4;11). Los rearreglos MLL se asocian con pobre pronóstico a cualquier edad. En niños mayores de 1 año son de pobre pronóstico t(4;11) y t(9;11) más que 11q23. (Ravindranath 2003) En los últimos años la terapéutica ha mejorado alcanzando tasas de supervivencia a 5 años sin recurrencia de hasta 70%. (Rubnitz 2003) Sin embargo, pese a los esfuerzos, hasta el 20% de los niños recurren y fallecen, y los sobrevivientes presentan serios problemas de salud por los efectos adversos del tratamiento. (Ziegler 2005) Varios trabajos se han publicado al respecto encontrando remisión completa en grupos de riesgo del 99% en bajo, intermedio 98-99% y alto 88-97%. Las tasas de sobrevida a 5 años libres de enfermedad se encuentran en 68%, 63% y 62%, respectivamente. (Redaelli 2005) 1.1.6.1 Leucemia Linfoblástica B. Son generalmente leucemias de buen pronóstico. En el grupo pediátrico la tasa de remisión completa es del 95%, y en adultos entre 60-85%. La tasa de sobrevida libre de eventos es del 70% en niños; aproximadamente, el 80% de los niños aparentan curación. (Brunning 2001) Los grupos de riesgos pediátricos de LLA-B se basan en perfiles citogenéticos, edad, conteo de leucocitos, sexo y respuesta a la terapia inicial. Hay una alta asociación en niños con traslocaciones que involucran el gen MLL en 11q23 con pobre pronóstico independiente de la edad. En edad pediátrica, más del 50% de los pacientes tienen buen pronóstico relacionado con cariotipos de hiperploidías o cambios genéticos t(12;21) con supervivencia a largo plazo del 85-90%. En adultos se carece de estratos de riesgo, aunque las alteraciones citogenéticas presentan un panorama diferente respecto a los niños. (Brunning 2001) Las características genéticas son importantes pero resultan heterogéneas si se tienen en cuenta otros factores. Es conocido que el cromosoma Philadelphia es de pobre pronóstico; sin embargo, la mayoría de niños entre 1-9 años, Ph+, son curados con quimioterapia sola. La t(4;11) es de pobre pronóstico en niños menores de 1 año, no así en mayores de esta edad. (Rubnitz 2003) Factores predictivos para remisión durable y supervivencia prolongada son edad entre 4 y 10 años, hiperploidías (54-62 cromosomas) con trisomías 4, 10 y/o 17, t(12;21)(p13;q22) y conteo normal o bajo de leucocitos al diagnóstico. (Brunning 2001, Rubnitz 2003) Factores adversos incluyen edad <1 año, t(9;22)(q34;q11.2) y t(4;11)(q21;q23). (Brunning 2001) Las hipoploidías presentan relación

directamente proporcional con el pronóstico: a menor número de cromosomas, menor supervivencia. (Rubnitz 2003). Clásicamente se ha considerado como factores pronósticos los que se muestran en la siguiente tabla: Tabla 1.3 Caracterización de pronóstico en LLA acorde a variables clínicas Favorable Desfavorable Edad 1-9 años <1 y >10 años Conteo de blancos <50000/µL >50000/µL* Sexo Femenino Masculino Raza Blanco Negro, hispano Enfermedad “sólida” Ausente Presente Leucemia extramedular Ausente Presente Morfología (FAB) L1 L2, L3 Inmunofenotipo Precursor B B y T

Citogenética t(12;21)

Hiperdiploidía (54-68 cromosomas)

Hipodiploidia (<45 cromosomas)

Cromosoma Philadelphia 11q23*

Respuesta temprana a tratamiento (7 a 14 días) Rápido Lento* * Modificable por el tratamiento. Tomado de Chan 2002. 1.1.6.2 Leucemia Linfoblástica T. En protocolos pediátricos de LLA-T, se trata como enfermedad de alto riesgo, y en adultos el manejo es similar a otros tipos de LLA. Previo al advenimiento de los actuales protocolos terapéuticos el pronóstico fue desfavorable, pero con los actuales es comparable con LLA-B. (Brunning 2001) Se han establecido 4 alteraciones citogenéticas de importancia pronóstica, siendo favorable el gen de fusión MLL-ENL y la expresión de HOX11, mientras que la activación de TAL1 y LYL1 confieren mal pronóstico, así como la expresión de HOX11L2. (Rubnitz 2003) 1.1.7 Tratamiento. El tratamiento inmediato de la LLA requiere manejo efectivo de los efectos colaterales de la enfermedad, destrucción de las células tumorales, y manejo apropiado de los efectos adversos del tratamiento. (Redaelli 2005) Durante muchos años se ha considerado que la terapia de leucemia linfoblástica aguda debe ser diseñada acorde al riesgo. En años anteriores se había establecido que los principales factores de riesgo comprendían la edad y el conteo de blancos; sin embargo, estudios recientes han demostrado que la terapia en sí es el factor pronóstico individual de mayor impacto, y que la intensificación de

terapia acorde a respuesta medida a los 7, 14 y 28 días, lo que ha llegado a ser práctica estándar. (Chan 2002) Acorde a lo concluido por el seminario del Instituto Nacional del Cáncer en 1993, se consideraba que los niños con edades entre 1 y 9 años con conteos de blancos menores a 50000/µL estaban en riesgo estándar, mientras que los que no pertenecían a este grupo eran de alto riesgo. Los primeros correspondían a los 2/3 de los pacientes y presentaban períodos libres de enfermedad a 5 años del 80%, mientras que los segundos recaían incluso durante la inducción. (Chan 2002) En relación con la población adolescente, se ha demostrado que responde mejor a esquemas de tratamiento pediátricos que adultos (64-67%/38-41%), pero se requiere de manejo individualizado para ese grupo de pacientes. (Ziegler 2005) Establecido el grupo de riesgo al que pertenece el paciente se diseña la terapia. En el grupo de bajo riesgo (40%) se emplean antimetabolitos estándar. El tratamiento de intensificación es útil en pacientes con riesgo estándar y alto riesgo empleando medicamentos más fuertes evitando la aparición de resistencias. 51% son pacientes de riesgo estándar que requieren poliquimioterapia de intensificación. Los pacientes de más alto riesgo (9%) son candidatos a trasplante de células madre luego de la primera remisión. (Redaelli 2005) Determinado el riesgo, se establece el tratamiento buscando inducir la remisión, prevenir la infiltración leucémica al sistema nervioso central, y ofrecer terapia de mantenimiento prolongada (2 a 3 años). Estos conceptos han permanecido sin cambios durante más de 30 años, con pequeñas modificaciones que han significado ligeras mejorías en el manejo. Actualmente se ha incrementado el interés en la intensificación de la terapia en el estado postremisión temprana buscando reducir la tasa de resistencia de las células leucémicas. (Chan 2002) El pronóstico se ve modificado por el tipo de terapia instaurado, siendo mejor el resultado con inducción con L-asparaginasa. Los niños mayores presentan menor respuesta a prednisolona y L-asparaginasa, pero responden mejor a citarabina; las células hiperploides T responden mejor al metotrexate. (Rubnitz 2003) A pesar de los adelantos logrados en aras a mejorar los índices de riesgo, los indicadores actuales fallan en establecer el riesgo plenamente puesto que un número significativo de pacientes en bajo riesgo pueden llegar a recurrir (10-30%), así como muchos pacientes son sometidos a terapias altamente tóxicas sin ser del todo necesarias. (Campana 2002, Mandrell 2006, Tzortzatou 2001) Un resumen de los fármacos empleados en el tratamiento de leucemia junto con sus efectos adversos se presenta en la tabla a continuación. Por último, es válido anotar que las recurrencias se correlacionan con dosis inadecuadas más que resistencia tumoral, por lo que la individualización de la terapia ha generado mejores resultados. Sin embargo, la resistencia es un

problema en ciertos casos. La resistencia de novo puede ser analizada in vitro por ensayo de citotoxicidad con metil-tiozol-tetrazolio, in vivo por el tiempo a la depuración de blastos, y la medición de EMR determina la emergencia de nuevas resistencias. (Ravindranath 2003) Los anticonvulsivantes que inducen el metabolismo producen pobre respuesta, mientras que los azoles antifúngicos y macrólidos reducen la toxicidad e incrementan la respuesta. (Rubnitz 2003) Tabla 1.4 Medicamentos empleados en terapéutica de LLA

Tratamiento Tipo Efectos adversos

Prednisona Dexametasona

Glucocorticoides sintéticos

Hiperglicemia, hipertensión, cambios del ánimo, acné, ganancia de peso, hepatomegalia, necrosis avascular del hueso, osteoporosis

Metotrexate Análogo del folato, antimetabolito

Náusea/vómito (NV), disfunción hepática, mielosupresión, fotosensibilidad, leucoencefalopatía, osteoporosis. Administración intratecal: cefalea, fiebre, convulsiones

Vincristina Alcaloide Neuropatía periférica, constipación, convulsiones, pérdida de peso, celulitis química

Doxorrubicina Daunorrubicina Antraciclina

NV, pérdida de peso, mucositis, mielosupresión, celulitis química, cardiomiopatía

L-asparaginasa Enzima NV, reacciones alérgicas, hiperglicemia, pancreatitis, disfunción hepática, trombosis y encefalopatía

6’mercaptopurina Análogo de purinas

NV, mucositis, mielosupresión, fotosensibilidad, disfunción hepática, osteoporosis

Etopósido Epipodofilotoxina NV, pérdida de peso, mucositis, mielosupresión, reacciones alérgicas, LMA

Citarabina Antimetabolito NV, fiebre, rash, mucositis, mielosupresión, disfunción hepática, conjuntivitis, infertilidad

Ciclofosfamida Agente alquilante

NV, cistitis hemorrágica, mielosupresión, SIADH, pérdida de peso, cáncer de vejiga, LMA, infertilidad

Radiación SNC Radiación

Pérdida de peso, somnolencia postratramiento, convulsiones, disfunción neurológica y endocrina, pérdida de peso, osteoporosis, tumores cerebrales

Tomado de Redaelli 2005.

1.1.7.1 Inducción. Casi la totalidad de niños tratados con glucocorticoides, vincristina y L-asparaginasa con o sin daunorrubicina, alcanzan remisión morfológica a las 4 semanas, que se define como la presencia de <5% de blastos en médula ósea (Redaelli 2005). La determinación de blastos circulantes en sangre periférica o en médula ósea, tiene mejor predicción en las primeras 2 semanas que al final de la inducción. Un estudio de Schrappe mostró que los pacientes con blastos mayores de 1000/mL a la semana de inducción presentaron supervivencia libre de enfermedad 43% menos que la de los respondedores tempranos; igualmente, presencia de blastos >25% en médula ósea se relaciona con sobrevida a 5 años de sólo 42%. Estos estudios indicaron la necesidad de modificar las terapias acorde a la respuesta temprana. (Chan 2002; Rubnitz 2003) 1.1.7.2 Terapia preventiva del Sistema Nervioso Central. El tratamiento dirigido contra las células neoplásicas presente en SNC inmediatamente después de la remisión ha mejorado la sobrevida. La irradiación preventiva temprana del SNC es efectiva pero produce efectos adversos al neurodesarrollo y secuelas endocrinas. La reducción de la dosis de radiación no redujo los efectos adversos, como si lo logró la quimioterapia intratecal, con igual respuesta terapéutica. También se demostró que la respuesta se relaciona con los niveles de quimioterapia sistémica que alcanza el SNC, situación que se demostró con el uso de dexametasona en lugar de prednisona, la cual penetra mejor a SNC y tiene vida media más larga logrando mejor protección contra la recurrencia en SNC. La irradiación sólo quedó para casos seleccionados de pacientes con compromiso del SNC al momento del diagnóstico u otros factores de alto riesgo (hiperleucocitosis extrema, cromosoma Ph+, respuesta lenta a terapia inicial); actualmente, la recurrencia de SNC es menor a 5%. La definición de compromiso del SNC se determina con más de 5 células/µL de LCR con presencia de blastos. La combinación de terapia sistémica y radiación dejó al compromiso inicial de SNC fuera de los factores adversos de riesgo. (Chan 2002, Rubnitz 2003, Redaelli 2005, Ziegler 2005) 1.1.7.3 Intensificación. Estudios previos han demostrado que dar uno o más cursos de quimioterapia rotacional multiagente que puede incluir metotrexate y 6-mercaptopurina, L-asparaginasa, dexametasona, vincristina, doxorrubicina, tioguanina y ciclofosfamida, y una epipodofilotoxina y citarabina (Redaelli 2005), durante los primeros 6 a 8 meses del diagnóstico reduce significativamente el riesgo de recurrencia. Estos hallazgos se demostraron primero en pacientes de alto riesgo, pero subsecuentemente se reconoció su utilidad en pacientes incluso con riesgo estándar y altas probabilidades de curación. Hay amplia variación entre los protocolos sobre la elección de drogas, la intensidad de dosis y el tiempo de intensificación. Algunos protocolos la incluyen inmediatamente posterior a la inducción (consolidación), mientras que otros la proponen luego de un período de profilaxis del SNC y terapia de mantenimiento oral (intensificación tardía), sin embargo, no hay evidencia que uno sea superior al otro. Un enfoque adicional con tratamiento intensivo luego de 9 a 10 meses ha sido empleado para pacientes de

alto riesgo como adolescentes y respondedores lentos a la terapia inicial. (Chan 2002, Rubnitz 2003) 1.1.7.4 Terapia de continuación. Se ha definido que las terapias deben ser mantenidas por dos años para niñas, y en niños por tres años para alcanzar similares respuestas. Los esfuerzos por reducir los períodos de terapia han sido infructuosos, así como es inútil la aplicación de terapias por más de 3 años. (Redaelli 2005) Los medicamentos empleados son los antimetabolitos a bajas dosis. La terapia efectiva se determina con subrogados como el conteo de neutrófilos entre 750 y 1500/µL, debido a que la biodisponibilidad de los medicamentos orales es errática. El uso de una dosis de vincristina adicional y el de 5 días de esteroides mensuales mejora los resultados, situación que no se produce con 6-mercaptopurina o metotrexate. (Chan 2002, Rubnitz 2003) 1.1.7.5 Tratamiento de pacientes de muy alto riesgo en primera remisión completa. Se considera de muy alto riesgo el grupo de pacientes que presenta una expectativa de vida a 5 años libre de recurrencia menor del 40%, aun con los tratamientos actuales. Por ejemplo, el uso de trasplante alogénico de células madre ha mostrado utilidad en pacientes con LLA y cromosoma Philadelphia; además, es importante tener en cuenta que ciertos estudios han mostrado que este tipo de pacientes pueden sufrir más enfermedad injerto contra huésped. La intensificación de la terapia no ha demostrado utilidad mayor en pacientes con rearreglos del gen de la leucemia de linaje mixto (MLL) asociado frecuentemente con t(4;11). Otros grupos de alto riesgo comprenden pacientes que alcanzan remisión en más de 4 a 6 semanas, y con anormalidades citogenéticas cercanas a la haploidía; el trasplante de células madre se ha probado con limitado éxito en este grupo de pacientes, y se ha incrementado el interés por el uso en trasplantes de células de sangre de cordón umbilical y otras células no idénticas de donantes no relacionados. (Chan 2002, Rubnitz 2003, Redaelli 2005, Ziegler 2005) 1.1.7.6 Tratamiento de la recurrencia. Actualmente el número de recurrencias es comparable con la incidencia de tumores cerebrales, por lo que sigue siendo un problema en oncología pediátrica. Debido a que los quimioterapéuticos más efectivos son administrados durante el primer tratamiento, estos no pueden ser empleados en la recurrencia. Los predictores de duración de la segunda recurrencia incluyen la duración de la primera remisión, la intensidad de la terapia original y el sitio de recurrencia. La recurrencia en médula ósea es indicativa de falla terapéutica, así como la presencia de enfermedad 18 meses después del diagnóstico, y las que se presentan en los 3 primeros años alcanzan sobrevida a 5 años libre de recurrencias menor al 30%. Las recurrencias medulares y extramedulares combinadas presentan un panorama menos sombrío. Las recurrencias extramedulares (SNC, testículo y ojo) presentes hasta el 30% de los pacientes, poseen un mejor pronóstico, pero algunos pueden ser seguidos de enfermedad sistémica, y el pronóstico empeora si se presenta en los primeros 18

meses. La recurrencia testicular es de lejos la de mejor pronóstico con supervivencias de hasta 60% a 5 años. (Chan 2002, Rubnitz 2003) 1.1.7.7 Trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas. El trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas es fundamentado en 3 objetivos básicos que incluyen el reacondicionamiento medular luego de terapia citotóxica intensiva, la provisión de una fuente limpia de células madre no contaminada con blastos leucémicos, y la capacidad de algunas células donantes de generar respuesta injerto contra huésped y eliminar los blastos residuales. (Goulden 2002) El trasplante no es recomendado en pacientes durante la primera remisión, excepto en los grupos ya mencionados. Si la recurrencia se presenta, el pronóstico cambia radicalmente con la utilización de quimioradioterapia a altas dosis seguido de trasplante debido a que reduce la probabilidad de recurrencia. La respuesta es mejor en pacientes que reciben trasplantes de hermanos, pero su utilidad se reduce cuando la recurrencia se presenta luego de 6 meses de descontinuación de la terapia; para estos pacientes, sólo se indica el trasplante si la respuesta a la quimioterapia es muy lenta. Los riesgos del trasplante de médula ósea se relacionan con la toxicidad del régimen terapéutico de preparación y la enfermedad de injerto contra huésped. La última se relaciona más con trasplantes no idénticos, y esta situación ha generado preocupación sobre el verdadero papel del trasplante en el tratamiento de la recurrencia de LLA. Otra estrategia es la utilización de células madre hematopoyéticas del paciente durante la remisión con purga de la recolección con agentes quimioterapéuticos o anticuerpos contra antígenos relacionados con leucemia para reducir la contaminación con células tumorales, reduciendo la morbimortalidad. Sin embargo, la evidencia no ha podido demostrar aún la eficacia del procedimiento. (Chan 2002, Ziegler 2005) 1.1.7.8 Complicaciones del tratamiento. Las complicaciones pueden ser agudas o de inicio tardío. El manejo de soporte ha mejorado significativamente la morbimortalidad, incluyendo el uso de concentrados de plaquetas y eritrocitos irradiados, para reducir el riesgo de enfermedad injerto contra huésped, mientras que otras intervenciones como la administración de factor estimulante de colonias de granulocitos no ha demostrado mayor utilidad. (Chan 2002) El desarreglo metabólico es frecuente en pacientes con hiperleucocitosis (<100000/µL), linfadenopatía mediastinal masiva, y enfermedad de células T ó B. La urato oxidasa ha demostrado utilidad en la reducción de los niveles de ácido úrico disminuyendo el riesgo de nefrotoxicidad; sin embargo, la diálisis puede llegar a ser necesaria. Estos desórdenes metabólicos no deben retardar una terapia de inducción oportuna. (Chan 2002) Igualmente, la cardiotoxicidad inducida por antraciclinas se ha reducido con el uso de quelantes del hierro como la dexrazoxane que ha demostrado cierta utilidad en adultos y niños. (Ziegler 2005) Las infecciones son la principal causa de muerte en niños en remisión y se puede presentar durante las fases de inducción e intensificación. La administración

temprana de antibióticos es esencial en el manejo de pacientes con neutropenia febril (<500/µL). Durante la fase de consolidación el riesgo de neumonía por pnemocystis jiroveci puede ser limitado por el uso profiláctico de trimetroprim-sulfametoxazol durante 3 días secuenciales por semana. La varicela diseminada puede ser evitada con la administración de inmunoglobulina zóster entre las 72-96 horas después de la exposición, y el uso de aciclovir en caso que se instaure la infección. (Chan 2002) La aparición de segundas neoplasias en niños sobrevivientes a LLA se ha establecido en 1.6% a 15 años, asociado a predisposición y los fármacos usados para tratar la primera neoplasia. (Zielger 2005) Estas neoplasias comprenden dos grupos: segundas leucemias y tumores sólidos, teniendo en general las primeras latencias cortas y las segundas largas. (Hoelzer 2002) Un grupo de pacientes sometidos a irradiación de SNC desarrollarán tumores cerebrales con latencia de 9 años para glioma de alto grado y 19 años para meningioma. Se puede desarrollar LMA secundaria al uso de inhibidores de topoisomerasa II (epipodofilotoxina) o agentes alquilantes, relacionado a la programación de la terapéutica y el uso concomitante de otros fármacos; el pronóstico de estas leucemias es muy pobre y sólo parecen responder a trasplante. (Chan 2002, Hoelzer 2002) Otras neoplasias de riesgo incrementado en pacientes sobrevivientes a LLA son tumores parotídeos, tiroideos, sarcomas de tejidos blandos, linfomas no Hodgkin y su incidencia se incrementa entre 7 y 14 veces respecto al grupo control en varias series publicadas con más de 15 mil pacientes en total. (Hoelzer 2002) El desarrollo neurocognitivo es inferior en estos pacientes especialmente en pacientes irradiados antes de los 5 años, existiendo una relación inversa entre dosis de radiación y coeficiente intelectual. Al contrario, no se ha demostrado deterioro en pacientes con altas dosis de metotrexate sistémico e intratecal. Del mismo modo, se ha descrito un síndrome de disfunción pituitaria en pacientes irradiados caracterizado por estatura corta, obesidad y pubertad precoz predominante en mujeres. (Chan 2002, Ziegler 2005) Aunque la mayoría de pacientes no muestran deterioro gonadal, algunos sufren cierto daño relacionado con dosis escaladas de ciclofosfamida. No se ha demostrado mayor riesgo de alteraciones congénitas en hijos de pacientes con leucemia. (Chan 2002) La necrosis avascular del hueso con destrucción de las articulaciones que soportan peso se ha relacionado con el uso de esteroides (altas dosis de dexametasona), afectando a niñas mayores de 10 años. El diagnóstico se realiza con uso de MRi. Se ha observado disminución de densidad mineral ósea y osteoporosis en cualquier momento hasta por 20 años después de la terapia. Esto conduce a dolor musculoesquelético, fracturas por compresión, cifosis y lordosis. (Chan 2002)

1.1.7.9 Nuevas perspectivas terapéuticas. Con el incremento en la información disponible y el estudio sistemático de las condiciones de peor pronóstico en LLA, se ha logrado establecer nuevas intervenciones terapéuticas específicas para determinadas alteraciones de mal pronóstico, así como la terapia con anticuerpos específicos que se abre camino como estrategia de tratamiento de pacientes de alto riesgo. En pacientes con cromosoma Philadelphia, se ha estudiado la utilidad de un fármaco dirigido contra la tirosina quinasa Abl (STI571, Imatinib, Gleevec®), el cual, aparte de cierto disconfort gástrico no ha demostrado mayores efectos adversos, y ha logrado reducir selectivamente las células que expresan este producto de fusión génico alcanzando remisión completa hasta en el 29% de los pacientes. Sin embargo, a pesar de lo prometedor del fármaco, todavía se requieren estudios adicionales grandes para demostrar su real utilidad. (Hoelzer 2002) Debido a que los blastos leucémicos expresan una serie de antígenos de superficie, ellos pueden llegar a ser blancos de terapia con anticuerpos monoclonales. Se ha descrito que la utilidad de dichos anticuerpos se determina sólo si el antígeno está presente en más del 20% de los blastos. Algunos de los anticuerpos desarrollados se enumeran en la siguiente tabla. A pesar de lo alentador del adelanto científico, se requiere que la evidencia soporte su utilidad clínica. (Hoelzer 2002) Tabla 1.5 Anticuerpos monoclonales de importancia terapéutica

Expresión significativa*

Anticuerpo de aplicación clínica

Estadio n^ Régimen¬ Resultado°

CD19

95% precursor B AntiCD19+PAP de novo 14 QT RC 43% d14

94% células B

14 AB+QT RC 93% d14

AntiCD19+Ricin de novo 46 AB+QT Sin efecto en EMR

AntiCD19+Genistein Recurrencia 15 AB 2 RC, 2 RP

CD20 41% precursor B

Rituximab de novo 19 AB+QT RC 93%

86% células B Supervivencia 1 año 86%

CD52 66% linaje B y T Campath Recurrencia 5 AB Sin respuesta * Se considera significativa la expresión del antígeno en más del 20% de los blastos. ^ número de pacientes tratados. ¬ QT: quimioterapia sola, AB+QT: anticuerpo + quimioterapia, AB: anticuerpo solo. ° RC: remisión completa, RP: remisión parcial. Tomado de Hoelzer 2002. 1.1.8 Polimorfismo enzimático. Mucho se ha estudiado en lo concerniente a la definición individual del riesgo con base en los hallazgos asociados a la enfermedad y relacionados con la terapia, pero en los últimos años ha crecido el interés por entender mejor la respuesta de cada paciente con base en las enzimas

metabólicas tanto en la historia natural de la enfermedad como en las reacciones adversas y la probabilidad de desarrollar segundas neoplasias. La evidencia ha demostrado el papel del polimorfismo en la generación de las neoplasias y la respuesta al tratamiento por el metabolismo diferencial. (Ravindranath 2003) El análisis de las respuestas individuales a los fármacos por variaciones genéticas ha ayudado a dilucidar el papel de enzimas como tiopurina metiltransferasa en el metabolismo de 6-mercaptopurina la cual incrementa la respuesta en heterocigotos para la mutación y aumenta la toxicidad en homocigotos, además los homocigotos presentan mayor neurotoxicidad cuando son sometidos a irradiación. La metilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR) reduce folato y homocisteína; su reducción polimórfica incrementa el riesgo de toxicidad por metotrexato incluyendo mucositis oral, que puede responder a leucovorin. Las mutaciones de MTHFR 677C>T protege del desarrollo de leucemias, con menor incidencia de rearreglos MLL y 1298A>C con hiperploidías, aparentemente mediado por mayor fidelidad en la síntesis de ADN. (Rubnitz 2003) La comprensión de la toxicidad de medicamentos ha mejorado la supervivencia en fases de seguimiento reduciendo la neutropenia. (Ziegler 2005) La glutatión S-transferasa (GST) metaboliza los quimioterapéuticos y su polimorfismo mejora la respuesta al tratamiento pero también incrementa la toxicidad; tumores con altos niveles de GST pueden presentar resistencia; en LMA, pacientes GST-null presentan mayor toxicidad y muerte durante la remisión. (Rubnitz 2003) También GSTM1 y GSTT se asocian con riesgo incrementado para LMA/síndrome mielodisplásico, en particular LMA M3, pero ninguno asociado con incremento del riesgo de LLA. (Ravindranath 2003) El sistema enzimático CYP450 activa las epipodofilotoxinas e inactiva la vincristina. La variante alélica CYP3A4*1B reduce el riesgo de toxicidad en LMA, mientras que CYP1A1 tiene pobre pronóstico en niños con MLH1 Ile219 (variante de reparador de ADN). CYP2E1*5 y CYP1A1*2A presentan mayor riesgo de LLA de novo, mientras que CYPA1*4A parece proteger (Ravindranath 2003). Los polimorfismos de NAD(P)H: quinona oxireductasa (NQO1) que convierte benzoquinona a compuestos hidroxilo, NQO1*2 y NQO1*3 incrementa la toxicidad de los bencenos y ciertas drogas quimioterapéuticas como los inhibidores flavonoides de topoisomerasa II; (Rubnitz 2003) además se correlaciona con el desarrollo de LMA. (Ravindranath 2003) Mutaciones en los receptores de las drogas reducen su efecto como es el caso de la timidilato sintasa, blanco del metotrexato, esto en niños porque en adulto son de bajo riesgo sumado a mutaciones de serina hidroximetiltransferasa. Los transportadores de membrana también son importantes incluida la familia de ligadoras de ATP que incluye las P-glicoproteínas (PGP) y las proteínas asociadas a multirresistencia de drogas (MRP) que parecen generar resistencia a quimioterapia, pero su papel real es desconocido. (Rubnitz 2003)

1.2 BIOPSIA DE MÉDULA ÓSEA El estudio citomorfológico de especímenes obtenidos por biopsia ósea se ha constituido en el estándar diagnóstico de neoplasias hematolinfoides. Gran parte de los conocimientos actuales de maduración normal de líneas hematológicas ha surgido por el estudio de leucemias, y de igual manera ha mejorado la comprensión de las neoplasias facilitando, además, su seguimiento buscando enfermedad residual. En este aparte se presenta una breve descripción de los elementos básicos a tener en cuenta en el estudio de médula ósea de un paciente, prestando especial atención a los patrones normales de maduración, que de su comprensión depende el poder entender las alteraciones que se expresan con el desarrollo de las neoplasias. 1.2.1 Morfología y maduración normal de médula ósea. La hematopoyesis es un proceso continuo que finaliza con la generación de células altamente especializadas con períodos vitales que varían desde horas, incluso hasta años. Este proceso se fundamenta sobre una base de células pluripotenciales que se autorrenuevan, y modifican su velocidad de diferenciación e incrementan ciertas líneas acorde a las necesidades propias del organismo. Por ejemplo, se produce generación horaria de 1010 eritrocitos y 4 X 108 leucocitos. (Moore 2001) El conocimiento acerca de los procesos finos de diferenciación es aún precario, y se fundamenta en el análisis de la función de ciertos productos génicos, citoquinas, quimioquinas, factores de crecimiento hematopoyético y modificaciones microambientales que producen las condiciones necesarias para el desarrollo de las diferentes poblaciones. (Moore 2001) En general, se reconocen 3 niveles celulares o compartimentos de diferenciación. El primero constituido por células pluripotenciales autosostenibles, el segundo por células progenitoras con grados variados de restricción de linaje y con mínima capacidad de autorenovación y, el último constituido por células maduras con actividad mitótica o postmitótica que conforman las poblaciones de granulocitos, eritrocitos y plaquetas. El equilibrio en la diferenciación de las líneas depende de la homeostasis corporal y las necesidad transitorias del organismo ante situaciones de estrés. (Moore 2001) 1.2.1.1 Células Madres Hematopoyéticas. Desde mediados de los años 60 se ha reconocido gracias a estudios en roedores, la presencia de células con capacidad de formar colonias hematopoyéticas luego de ablación medular y esplénica. Estas células en humanos demostraron la presencia de antígenos CD34, y en sangre de cordón umbilical representan hasta el 2% de la población celular, y presentan capacidad regenerativa estromal y vascular (expresión de VEGFR). Igualmente, estas células expresan en escasa cantidad antígenos de maduración terminal, o también pueden estar ausentes. (Moore 2001)

La regulación de las células madre pluripotenciales y su diferenciación está definida por el interjuego de factores de crecimiento hematopoyético y receptores celulares. La presencia de determinados factores favorece la diferenciación ulterior, mientras que la ausencia de receptores conduce a apoptosis. Existe cierta variedad en la población de células madres en lo referente a la velocidad de crecimiento y diferenciación, encontrándose células CD34+ CD38- con alta velocidad de crecimiento y bajo potencial de proliferación, esto presuntamente definido por división asimétrica con formación de células hijas muy parecidas a la madre y otras de estado avanzado de maduración. Estos procesos se hallan regulados por genes maestros de las familias Notch y HOX, demostrando la conservación ontogénica de los mismos. Los últimos se encuentran ubicados en los cromosomas 7p14-7p15 (HOXA), 17q21-17q22 (HOXB), 12q12-12q13 (HOXC) y 2q31-2q37 (HOXD), y tienen relación específica de linaje mielomonocitos (HOXA), mielomonocitos y eritroides (HOXB) y linfoides (HOXC). Igualmente, se ha reconocido funciones específicas a determinados genes como incremento de la producción de IL-3 con incremento de células madre autorrenovadas (HOXB8), incremento numérico de células madres más de 50 veces (HOXB4) e incremento de los progenitores y megacariocitos (HOXA10). (Moore 2001) La capacidad de migración de las células madre CD34 es una capacidad importante desde el desarrollo in-utero, y en el período posnatal para predecir la liberación de estos precursores en sangre periférica en donde se encuentran en proporciones de 40 en 105 células, y se incrementa después del estímulo con factores de crecimiento hematopoyéticos hasta 1%. El mecanismo de salida y regreso de los precursores CD34 está regulado por citoquinas que se liberan de sitios específicos en los cuales los precursores hacen “homing”, y los movimientos se realizan por modificaciones de la forma citoplásmica (pseudópodos). El homing se genera por la interacción de proteínas de adhesión celular como L y E-selectinas, especialmente el VCAM-1. (Moore 2001) Durante la diferenciación se genera también acortamiento de los telómeros que está relacionado con el envejecimiento celular y apoptosis, y se observa en las células CD34 la presencia de telomerasa, sin embargo, en ellos se reconoce también acortamiento de telómeros que se explica por la incapacidad de la enzima de mantener la longitud de los tándem. (Moore 2001) 1.2.1.2 Línea mieloide/monocítica. Los precursores se disponen adyacentes a las trabéculas óseas o alrededor de las arteriolas. Los precursores de la línea mieloide reconocidos más tempranamente son los mieloblastos, los cuales maduran por diversos estados (promielocito, mielocito, metamielocito) hasta llegar a las formas juveniles y maduras en médula que luego son liberados a la circulación. Las divisiones celulares se producen hasta el estado de mielocito, pero no en células más maduras. Los mieloblastos son células de 10-20µ de diámetro, con núcleos grandes redondeados con cromatina finamente dispersa y

dos a cinco nucléolos, con citoplasma no granular y basófilo. Los promielocitos son más grandes que sus precursores y contienen gránulos que tiñen (basófilo, eosinófilo) y de ahí deriva su nombre (los neutrófilos poseen tinción inespecífica), cromatinas ligeramente apiñadas y nucléolos prominentes. Los mielocitos poseen pequeños gránulos con características tincionales similares a sus precursores, pero sus núcleos son ovales o indentados, excéntricos, con cromatinas apiñadas y nucléolos indistintos, con mayor cantidad de citoplasma frente a sus precursores reduciéndose su basofilia por la disminución de RNA citoplásmico. Las formas juveniles poseen núcleos en forma de C con citoplasma acidófilo y gránulos con características tincionales. Las formas más maduras presentan segmentación adicional del núcleo. (Wickramasinghe 1997) Los estados de maduración de la línea monocítica son monoblastos, promonocitos, monocitos medulares y monocitos circulantes. Estos últimos pueden presentar maduración adicional en tejidos periféricos a macrófagos. Los monoblastos son similares a los mieloblastos con ligera indentación nuclear y poca cantidad de citoplasma basófilo agranular. Los promonocitos son más grandes que sus precursores con relación núcleo-citoplasma mayor, citoplasma menos basófilo y ligeramente granular azurófilo; el núcleo es redondeado, grande, lobulado o hendido con cromatina en apariencia de red fina con nucléolos variables. Los monocitos medulares tienen un radio N/C <1, citoplasma menos basófilo y más gránulos azurófilos que sus precursores. El citoplasma es azul grisáceo de aspecto vítreo y puede contener vacuolas. El núcleo es excéntrico con su característica forma arriñonada con cromatina laxa. (Wickramasinghe 1997) 1.2.1.3 Línea eritroide. Los precursores se disponen en una o dos capas que rodean a uno o dos macrófagos centrales, mientras que los estados más tardíos de maduración se ubican cerca de sinusoides. La maduración eritroide sigue los siguientes pasos: pronormoblasto (eritroblasto), normoblasto basófilo, normoblasto policromatófilo temprano, normoblasto policromatófilo tardío, reticulocito medular y reticulocito circulante. Sólo los primeros estadios presentan división celular. Los pronormoblastos son células grandes con diámetros de 12-20µ, núcleo redondeado y moderadas cantidades de citoplasma agranular que tiñe intensamente basófilo. La cromatina nuclear tiene apariencia reticular fina con uno o dos nucléolos prominentes. En el estadio normoblasto basófilo la cromatina se tiende a condensar dando apariencia granular al núcleo. Los normoblastos policromatófilos tempranos son más pequeños con menor relación núcleo-citoplasma; el citoplasma es policromatófilo y agranular y el núcleo contiene condensaciones de cromatina periféricas. La policromatofilia resulta de la presencia de RNA (basófilo) y hemoglobina (acidófilo). Posteriormente, se hacen más pequeños, ortocromáticos, con menor relación N/C y mayor apiñamiento de cromatina (normoblasto policromatófilo tardío) y luego estrujan su núcleo, el cual es rápidamente fagocitado (reticulocito medular) (Wickramasinghe 1997)

1.2.1.4 Línea megacariocítica. Los precursores se ubican próximos a los sinusoides y presentan proyecciones citoplásmicas que protruyen hacia el lumen los cuales descargan plaquetas directamente dentro de la microcirculación. La mayoría de las células de esta línea son mucho más grandes que las otras líneas y son poliploides. Los precursores más tempranos reconocibles son los megacarioblastos. Estos son grandes entre 20-30µ de diámetro y tiene un núcleo grande lobulado o arriñonado con un citoplasma escaso intensamente basófilo y agranular; el núcleo contiene muchos nucléolos. Los megacarioblastos (megacariocitos grupo I) maduran en promegacariocitos (megacariocitos tipo II) y estos en megacariocitos granulares (megacariocitos grupo III). Los promegacariocitos son más grandes que sus precursores con mayor volumen de citoplasma; ellos poseen un núcleo multilobulado arriñonado; el citoplasma es menos basófilo y presenta gránulos azurófilos que predominan en la concavidad formada por el núcleo. Los megacariocitos granulares son mayores a 100µ en diámetro y poseen abundante citoplasma pálido que contiene abundantes gránulos azurófilos. Los núcleos tienen múltiples lobulaciones y apariencia apiñada su cromatina. Las plaquetas resultan de la fragmentación de los procesos citoplásmicos. Estas últimas miden entre 2 y 3 micras en diámetro y son irregulares, el citoplasma tiñe azul pálido con algunos gránulos azurófilos en el centro. Cerca del 40% de los megacarioblastos, 20% de los megacariocitos y 2% de los megacariocitos granulares sintetizan DNA, sin embargo la división celular no se observa en esta línea celular, de ahí que se observe polipliodía (hasta 64n). (Wickramasinghe 1997) 1.2.1.5 Línea linfoide B. En secciones de médula ósea teñidos con HE, se reconocen los precursores linfoplasmocitarios dispuestos en pequeños nódulos junto con linfocitos pequeños y algunos agregados linfoides. Cerca del 20% de dichos agregados son irregulares y mal circunscritos mientras que el 80% restante constituyen verdaderos folículos linfoides y en el 5% se reconocen centros germinales bien desarrollados. En dichos folículos se identifica incremento de reticulina. (Wickramasinghe 1997) Los linfocitos B se originan de células pluripontenciales medulares que maduran a lo largo de una serie de estadios sin respuesta a antígenos específicos; los linfocitos T sufren dicho proceso en el timo. Ambas líneas sufren una maduración final en respuesta al antígeno específico en los folículos linfoides de la médula o de los ganglios linfáticos o tejido linfoide asociado a mucosas. Los precursores linfoides son indistinguibles morfológicamente en linajes, y presentan positividad granular citoplasmática perinuclear con PAS. Las esterasas generan resultados variables. Los plasmocitos exhiben cambios en la tinción citoplásmica y granularidad (cuerpos de Russell) y mayor tamaño comparado con los linfocitos; igualmente, las características nucleares en “rueda de carreta” son específicas. (Wickramasinghe 1997)

1.2.2 Patrones morfocitométricos clínicamente relevantes. El conocimiento del proceso de maduración de las líneas celulares en médula ósea ha resultado del estudio de inmunofenotipo por citometría de flujo usualmente empleado cuando se sospecha hematopoyesis anormal. Este estudio permite la identificación, evaluación de frecuencia y caracterización adicional de las líneas celulares. (van Lochem 2004) Normalmente, la médula ósea contiene gran cantidad de células de diversas líneas en variados estados de diferenciación, las cuales pueden ser identificadas por técnicas de morfología citológica e inmunofenotipo, y su reconocimiento facilita la comprensión de procesos anormales. La hematopoyesis anormal puede resultar de diversos procesos entre los que se puede incluir la detención de la diferenciación del precursor B, la regeneración de la médula ósea después de terapia inmunosupresora o como respuesta a la infección, la displasia de una ó más líneas mieloides, el incremento del recambio celular causado por depleción periférica de células y, la expansión no regulada de células neoplásicas hematopoyéticas. (van Lochem 2004) Las alteraciones hematopoyéticas se manifiestan en la médula ósea como modificaciones significativas de varias líneas celulares o sutiles cambios en sólo una. En el caso de las células B las lesiones neoplásicas mostrarán precursores incrementados sin encontrarse formas maduras, y en las reactivas a terapia inmunosupresora se incrementan las inmaduras pero se halla un buen número de células maduras. Las neoplasias (LLA, LMA) comprometen la casi totalidad de la médula y reducen significativamente las otras líneas; además, poseen un fenotipo anómalo que no es frecuente en médula ósea. (van Lochem 2004) El uso del citómetro de cuatro colores, los anticuerpos monoclonales, y la comprensión de la expresión de los antígenos en las diversas líneas y estados de maduración normal y anómala ha permitido profundizar el estudio de la médula ósea. Van Lochem y colaboradores desarrollaron un trabajo para definir la maduración de las líneas que tienen lugar en médula ósea; se excluyen células T y NK debido a que estas maduran fuera de la médula. (van Lochem 2004) El trabajo buscaba diseñar un sistema de 6 paneles de anticuerpos que permitieran el reconocimiento de las células empleando el citómetro de 4 colores. La selección de los paneles se basa en las propiedades de anticuerpos, antígenos y fluorocromos. Varios clones del mismo CD reconocen diferentes epítopes o el mismo epítope con diferente afinidad (CD15 reconoce sialilado y no sialilado) y CD34 (I, II y III reconocen diferentes epítopes con sensibilidad variable por la enzima). El background generado por ligandos específicos del receptor Fc se puede minimizar seleccionando anticuerpos monoclonales específico de subclase de inmunoglobulina. La mayoría de anticuerpos son asequibles con diferentes fluorocromos y su selección depende de la expresión del antígeno. Ficoeritrina (PE) y aloficocianina (APC), por su alta fluorescencia son empleados para marcar

antígenos de baja expresión. CD13 y CD19 con SSC son útiles para reconocer linaje granulocito/monocito y células B. CD45 se expresa diferencialmente en las líneas celulares: alto en linfocitos y monocitos, y medio en granulocitos, precursores B, granulocíticos y eritroides; los eritrocitos maduros son negativos. CD34 marca precursores de todas las líneas. Los antígenos de desarrollo y diferenciación son útiles en la definición de maduración (CD10/20 linfoides y 13/16 mieloides). (van Lochem 2004) Diferenciación células B: las células CD19 poseen 4 estados de diferenciación basado en análisis CD10/CD20 dado por la pérdida del primero y ganancia del segundo; las células plasmáticas a este nivel son CD10-/CD20- y se emplean fluorocromos tipo APC y PE. En la subpoblación CD10 brillante el marcador TdT ofrece mayor información de la maduración al perderse; la demora que presenta la tinción citoplasmática del TdT se compensa con la mayor información ofrecida. La expresión CD10+ con TdT- marca los precursores B; la razón CD10+TdT+/CD10+TdT- puede indicar regeneración medular inducida por drogas. (van Lochem 2004) Dentro de las células CD19 se distingue toda la maduración B, observando las CD10+TdT+ correspondientes con las CD22+CD34+CD45débil, y se incrementa con la maduración la expresión de CD45 y CD22; las células CD10-CD20+ maduras se corresponden con las CD45fuertesCD22fuertes; se puede observar una diferenciación adicional CD34+CD22+CD19- de células proB. En niños menores de 4 años predominan las células CD10+ y en los adultos las células CD10-CD20+, y en los mayores de 75 años una gran población de CD10-CD20- plasmáticas; luego de terapia de supresión se incrementan las CD10+TdT+ sobre las CD10+TdT- y es mayor a medida de la mayor supresión. Las expresiones aberrantes se corresponden con alteraciones neoplásicas en su mayoría. CD22 puede ser más útil que CD19 para reconocer toda la línea B, aunque su expresión variable y la expresión en basófilos pueden dificultar su interpretación. Otros antígenos de maduración B pueden resultar útiles (IgMcyt, IgMs, SIgM). (van Lochem 2004) Diferenciación monocítica: para su estudio se debe evitar anticuerpos monoclonales IgG2a porque se une inespecíficamente a FcRs (CD64). CD13 y CD33 son antígenos granulocíticos y monocíticos. La discriminación inicial se logra con CD45 y SSC; mieloblastos, monoblastos, precursores B y eritroblastos son CD45débiles. CD34 se expresa en todos los precursores y CD13.33 y CD117 en los granulocíticos/monocíticos. CD117 (CD13.33+CD34débil) se expresa en algunos promielocitos, en poblaciones menores de células B y en altos niveles en mastocitos. Las células CD34+CD117+CD13.33+CD45débil son mieloblastos y monoblastos, mientras que las CD34+CD117-CD13.33-CD45débil son precursores linfoides B. El paso de monoblasto a promocito se evidencia por la pérdida de CD34 y la ganancia de CD33. Los promonocitos CD34-CD33fuerteCD45intermedio tienen bajos niveles de CD15. CD45 se gana con la

ganancia de CD14. HLA-DR está presente en todas las fases de maduración de los monocitos. Los niveles de subpoblaciones varían con las neoplasias (M5a, M5b); marcaciones aberrantes asincrónicas como coexpresión de CD11b/CD34, CD34/CD15, expresión cruzada de CD19, CD2, CD7, e intensidades variables se correlacionan con el pronóstico. Los niveles de monocitos se pueden incrementar o desaparecer en Síndromes Mielodisplásicos. CD36 y CD4débil preceden a CD14 en células CD34+ neoplásicas. CD68 marca el estado final de diferenciación monocítica (macrófago) que tienen alto FSC y SSC. CD15 puede indicar diferenciación monocítica temprana en células neoplásicas CD34+ y marca la maduración de blastos CD34+CD15- a promielocitos CD34-CD15fuerte. (van Lochem 2004) Diferenciación granulocítica: los promielocitos son CD34débilCD117+CD13.33fuerte con SSC alto. CD45/CD13 sumado a la dispersión de luz es útil para definir poblaciones mieloides. CD13 se expresa en precursores mieloblastos y monocitos y decae en expresión en mielocitos para volver a ganar expresión con la segmentación; sumarlo con CD16 y CD11b permite reconocer 4 estadios de maduración (II-V), aumentando estos últimos en los 2 estadios finales. Los mielomonoblastos son CD16-CD13+CD11b-CD45intermedio con SSC intermedio y FSC bajo que corresponden a CD34+CD117+CD45intermedioCD13.33+. El SSC se incrementa con el paso a promielocito y aparece CD15. En la maduración subsecuente se gana CD11b seguido por CD16. En LMC-acelerada se puede observar incremento de basófilos y eosinófilos. En FSC/SSC los eosinófilos tienen más SSC con menor FSC que los granulocitos. Expresión de CD16, CD11b y CD13 es menor que los neutrófilos, siendo CD45 mayor. Los basófilos tienen SSC menor que los otros granulocitos, y es difícil de diferenciar de los linfocitos y monocitos, aunque CD13 es menor que en los monocitos y mayor que en los linfocitos con CD45intermedio, también expresan CD22. La variación en la granulación se puede observar en el SSC. Incrementos en CD13/CD33 y baja expresión de CD11b y CD16 es una expresión aberrante de Síndrome Mielodisplásico. CD13/CD33 puede ser expresado hasta en el 60% de los pacientes con LLA. CD65 es un marcador panmieloide. CD15 no es mieloide específico y se puede observar con baja expresión en promocitos; CD66b precede a CD11b como el CD16 y se expresa en (pro) mielocitos. CD16 y CD11b son una buena pareja para establecer maduración granulocítica, así como otros antígenos inespecíficos como CD64 o CD35 son útiles para definir maduración en combinación con CD13 y/o CD33. (van Lochem 2004) Diferenciación eritroide: la lisis por cloruro de amonio mantiene sólo las células eritroides nucleadas. Las células eritroides a medida que maduran pierden CD45; sólo los precursores CD117+CD71+ marcan CD45débil; durante la maduración se intensifica CD71 y luego se expresa CD235a (glicoforina A); luego, con la pérdida del núcleo, se pierde CD71. El 50% de las células en MO luego de lisis pueden corresponder a eritroides incluyendo reticulocitos y son CD45-CD71+CD235a+; las anemias y SMD pueden alterar el patrón de expresión. (van Lochem 2004)

1.2.3 Técnicas moleculares de estudio de médula ósea. Las muestras de médula ósea han sido empleadas satisfactoriamente para análisis genético por técnicas moleculares. Metodologías como PCR, PCR anidado, PCR en tiempo real, RT-PCR, qPCR, FISH, southern blot, western blot, dot blot, por mencionar sólo algunas, han sido evaluadas y han demostrado utilidad en la detección de aberraciones génicas y productos de fusión génica presente en enfermedades hematolinfoides. Dichas estrategias de análisis han sido también evaluadas para establecer la presencia de Enfermedad Mínima Residual alcanzando en condiciones óptimas niveles de detección de 1 en 105. Actualmente la metodología más empleada y de mayor aceptación por gran número de centros es la detección de rearreglos de IgH en las zonas VDJ y del receptor de células T por técnicas de RqPCR, detectando rearreglos en el 95% de los casos de LLA. (Cazzaniga 2005) 1.3 ESTUDIO DE SANGRE PERIFÉRICA La respuesta al tratamiento citotóxico ha sido evaluada por la presencia de enfermedad residual en muestras de médula ósea. Sin embargo, esta metodología no es del todo práctica, debida al disconfort que genera en los pacientes la realización de las aspiraciones óseas. Pocos autores han demostrado interés en estudios de enfermedad residual en sangre periférica, y sus estudios, lamentablemente, han carecido de poder estadístico que logre demostrar los resultados planteados en sus trabajos. Sin embargo, la escasa información ha señalado que los niveles de detección están 10 veces por debajo de muestras paralelas de médula ósea. Sin embargo, no se descarta la utilidad potencial del estudio de EMR en sangre periférica específicamente en 2 situaciones básicas: LLA-T, cuyo origen es timo y sitios periféricos y la migración es hacia médula, por lo que la detección de precursores en sangre podría preceder a la detección en médula, y en los casos de LLA-B, donde podría demostrar la migración de blastos desde médula ósea, situación que tiene gran interés en remisión temprana, y conferiría mayor riesgo de enfermedad extramedular. (Constan-Smith 2002, Goulden 2001) Campana realizó un estudio sobre 747 pares de muestra de sangre periférica y médula ósea encontrando correlación del 100% en LLA-T, mientras que en LLA-B sólo 37 muestras de sangre periférica fueron positivas de 104 médulas óseas que demostraron niveles de EMR. Los casos negativos en médula ósea fueron negativos en sangre periférica también. (Campana 2004) 1.4 MEDICIÓN DE ENFERMEDAD MÍNIMA RESIDUAL Los avances en terapéutica dirigida contra riesgo han mejorado las perspectivas de manejo de la enfermedad. Sin embargo, como ya se mencionó, es fundamental identificar el comportamiento de la enfermedad a lo largo del tratamiento y reconocer tempranamente la persistencia de enfermedad residual y modificar eficazmente el protocolo terapéutica buscando prevenir la recurrencia. Datos previos han demostrado que los niveles de EMR por debajo de 10-5 no parecen

tener utilidad clínica al no predecir recurrencia, pero los niveles superiores si tienen riesgo incrementado con la presencia de recurrencia, correlacionándose niveles de 10-3 con riesgo de recurrencia a 3 años de 56% y 10-2 con 78%. (Pui 2000) Las técnicas de citometría de flujo (que enumera las células con antígenos relacionados a leucemia) y de reacción en cadena de la polimerasa (que determina los rearreglos genéticos específicos del receptor de células T e inmunoglobulinas) han sido empleadas para este fin, pues logran detectar una célula entre 104-105 células, siendo significativamente inferior a los límites de remisión. Cave reportó que niveles de EMR mayores a 1% al final de la inducción incrementaba en 16 el riesgo de recurrencia que en pacientes sin ese hallazgo; después de la consolidación el límite de EMR es 0,1%. (Chan 2002) 1.4.1 Definición. Actualmente se consideran curables la mayoría de enfermedades hematológicas proliferativas con las estrategias terapéuticas, considerando curación sinónimo de remisión morfológica. Sin embargo, en muchas de ellas persiste cierto número de células neoplásicas a lo que se ha denominado enfermedad residual, y esta condición predispone a la presencia de recurrencias. Muchas veces el nivel de células es indectable por métodos morfológicos y citoquímicos convencionales, situación conocida como enfermedad mínima residual (EMR). (Orfao 2000) Este marcador se ha constituido en un factor de riesgo independiente. (Ziegler 2005, Goulden 2001) La EMR es definida como medición molecular de la leucemia que es capaz de detectar células anormales más allá de la capacidad del estudio morfológico. Se considera que el paciente al momento del diagnóstico puede llegar a tener 1012 células malignas. Se considera en remisión con <5% blastos en el estudio morfológico de médula ósea, lo que equivale a 1010 células no detectables o EMR del 1%. Sin embargo, el estudio de EMR puede detectar 1 célula maligna en 10000 células normales o más, lo que cuantitativamente es 100 veces más sensible que técnicas usuales. (Mandrell 2006, Pui 2000) En aras de erradicar las células leucemias residuales los pacientes son sometidos a consolidación, mantenimiento, y/o protocolos de trasplante de médula ósea con base en la estratificación de riesgo para reducir el sobre o subtratamiento. La determinación del riesgo y de la respuesta al tratamiento requiere de métodos de detección muy sensibles que permitan reconocer la menor cantidad de células persistentes. Este último punto es también útil para el diagnóstico temprano de pacientes con cáncer hematológico, la evaluación del compromiso de leucemia en órganos específicos (sangre periférica o médula ósea comprometida en linfomas no Hodgkin) y el control de la efectividad de la quimioterapia in-vivo o in-vitro para ser usada después de trasplante autólogo. (Orfao 2000) Los puntos fundamentales del estudio que lo hacen de alta utilidad son, entre otros: (Goulden 2001) 1. La definición de riesgo por EMR es más preciso que por clínica.

2. Mayor sensibilidad en el establecimiento de grupo de alto riesgo, llegando al punto que la terapia de intensificación se justificaba en estos niños. 3. La depuración rápida de EMR definió una cohorte más grande de bajo riesgo que el definido por los métodos previos. 4. El sistema EMR es muy seguro. 1.4.2 Técnicas de medición. Cualquiera sea la metodología para detectar Enfermedad Mínima Residual debe cumplir con algunos criterios mínimos: (Izraeli 2004) 1. Capacidad de discriminar entre células normales y malignas; y esto es importante dado que la leucemia se origina de una alteración puntual del desarrollo de las células normales, de ahí su similitud. 2. Sensibilidad mayor que las técnicas morfológicas microscópicas, es decir sensibilidad superior a 1 en 103, pero preferible entre 104-106. 3. Cuantificación clara y precisa de EMR. 4. Persistencia de los antígenos tumorales en las células; sin embargo, dada la inestabilidad de las células tumorales, muchos de los antígenos presentes al momento del diagnóstico se pierden durante la evolución de la enfermedad, de ahí que buscar un marcador que se haya perdido puede resultar en falsos negativos. 5. Reproducibilidad de la técnica en el mismo laboratorio y entre laboratorios que permitan la realización de grandes estudios multicéntricos. 6. Rapidez en la ejecución de la técnica que permita entregar resultados rápidos para tomar decisiones terapéuticas oportunas. 7. Costo-efectividad. Se ha desarrollado un número importante de técnicas útiles en la detección de enfermedad mínima residual, cada una de ellas con ventajas y desventajas, pero todas claramente útiles en la determinación de la clonalidad de las células que generan el proceso mórbido, así como la definición del riesgo de recurrencia con base en los hallazgos de la técnica. Las estrategias actuales de determinación de enfermedad mínima residual se basan en el establecimiento de características fenotípicas al diagnóstico que puedan ser útiles para la posterior identificación de éstas en una población mayor de células normales que no pueden ser discriminadas por técnicas morfológicas solas. (Orfao 2000) Con base en las características de la célula explorada, las técnicas de la enfermedad mínima residual son clasificadas en varios grupos entre los que sobresalen: 1. Métodos basados en morfología. 2. Técnicas de cultivos celulares. 3. Aproximaciones citogenéticas basadas en cariotipo convencional, técnicas moleculares, o análisis de cromosomas por citometría de flujo. 4. Análisis de citometría de flujo del contenido total de DNA de la célula. 5. Técnicas de biología molecular.

6. Inmunofenotipo empleando múltiples tinciones analizadas por citometría de flujo y/o microscopía de fluorescencia. La siguiente tabla compara las características de estás aproximaciones. Tabla 1.6 Metodologías útiles en detección de Enfermedad Mínima Residual Especificidad Sensibilidad Simpleza Reproducibilidad Velocidad Morfología Intermedia Baja Alta Baja Baja Cultivo celular Alta Baja Baja ¿? Baja Estudios citogenéticas Cariotipo convencional Alta Baja Baja Intermedia Baja

Cariotipo por flujo ¿? ¿? Baja ¿? Baja FISH Alta Baja Intermedia Alta Baja Contenido de DNA por CF * Alta Alta** Alta Alta Alta

Inmunofenotipo Alta Alta Alta Alta Alta Técnicas moleculares Southern/Northern Alta Baja Baja Alta Baja PCR Alta Alta Alta Alta Baja PCR, Reacción en cadena de polimerasa; FISH, Hibridación In Situ Fluorescente; CF, Citometría de flujo. * Baja aplicabilidad. ** Si se confirma con marcadores inmunológicos. Tomado de Orfao 2000. De la tabla anterior se deduce que el uso de PCR para la detección de secuencias específicas de DNA que corresponden a los genes de receptores B ó T y regiones de fusión de translocaciones cromosómicas y la identificación de fenotipos asociados a leucemia basados en el uso combinado de múltiples tinciones y citometría de flujo han emergido como las más atractivas (Orfao 2000). Otros autores consideran valores de utilidad diferentes para las técnicas. Moppett compara la citometría de flujo de 3 y 4 colores, con el estudio con sondas específicas de alelos y el rastreo fluorescente de genes asignándole un logaritmo mayor a la capacidad de detección a la técnica PCR frente al inmunofenotipo con 4 colores y 2 logaritmos con el de 3 colores, y le confiere un índice de aplicabilidad mayor al 98% a la técnica molecular mientras que a la técnica inmunológica sólo le da índice mayor al 90%; aunque en precio las técnicas inmunológicas no alcanza a ser la mitad del valor del estudio molecular. (Moppett 2003) Sin embargo, cada una de las técnicas tiene sus promotores y contradictores. En general, se acepta que la Citometría de Flujo detecta perfiles inmunofenotípicos anormales usando marcadores que no son usuales en los linajes de médula ósea y sangre y pueden detectar células anormales 1 en 10000. Este nivel de sensibilidad se obtiene en el 90% de las LLA. Por su lado, PCR detecta EMR con amplificación del receptor de antígenos o de la fusión de

transcritos. El análisis se debe realizar con la muestra al momento del diagnóstico y establecer las mutaciones del receptor o las modificaciones de las cadenas IgH y con base en dichas alteraciones hacer los análisis en las muestras de seguimiento, buscando la misma alteración. Sólo el 40% de LLA tiene rearreglos conocidos. Hay correlación entre las dos técnicas y son de utilidad marcada en combinación detectando la casi totalidad de los casos. (Mandrell 2006, Campana 1999) Otra ventaja aparente de la citometría de flujo sobre las técnicas moleculares, es que la primera puede determinar la viabilidad de las células, eliminando células muertas o detritus de ácidos nucléicos que pueden dar positivos con las segundas. Sin embargo, esta característica se pierde si las células sufren artefactos por la conservación y el transporte y se pueden eliminar células que son viables in-vivo y no así in-vitro. Además, el análisis PCR usualmente es dicotómico mientras que el análisis con citometría de flujo requiere mayor elaboración y experiencia del analista. (Campana 2004) 1.4.3 Periodicidad de la medición. Demostrada la utilidad del estudio de enfermedad residual en el seguimiento de pacientes con leucemia linfoblástica, resta por determinar los puntos clave en los cuales resulta más útil hacer las mediciones. Campana nos ofrece una primera aproximación de la utilidad del estudio de Enfermedad Mínima Residual en el manejo de la leucemia aguda como se muestra en la siguiente tabla. Tabla 1.7 Calendario de evaluación de médula ósea para detección de EMR

Momento del estudio Objetivo

Durante la inducción de la remisión Medición de la respuesta temprana al tratamiento

Finalización de la inducción, temprano en la continuación

Identificación de pacientes en un riesgo más alto de recurrencia

A lo largo del tratamiento Detección de amenaza de recurrencia Identificación de células leucémicas en sitios extramedulares (v.g. SNC)

Antes del trasplante autólogo de células madre

Detección de células leucémicas contaminantes Evaluación de la eficacia de técnicas de “purga”

Tomado de Campana 1999. Algunas observaciones han establecido que los análisis de sangre periférica a la semana y de médula entre la 1-3 semana de tratamiento son indicadores fieles de pronóstico. Cualquier blasto a las 3 semanas en MO es de mal pronóstico. La mayoría de los autores concuerdan en afirmar que el punto de corte para considerar una muestra de médula ósea positiva para enfermedad mínima residual

es de 1 célula en 10000 ó 100000. Sin embargo, persiste aún controversia sobre el momento preciso de mayor costo-efectividad en la predicción de la EMR. Van Wering hizo su estudio para determinar EMR en pacientes con LLA, realizando medición de la presencia de blastos en médula ósea para las semanas 5, 14, 24, 34, 46, 59, 72, 84, 94, 102, 116, 130, 143, 157, 168, 181, 195 y 207, con lo que logró observar disminución de células CD34/TdT frente al incremento de células CD10/CD19, definiendo las primeras como blastos leucémicos residuales y los últimos como hematogonias de médula en regeneración. (van Wering 2000) Kwan realizó su estudio midiendo la presencia de EMR el día 35 del tratamiento, al final de la inducción, logrando establecer en un pequeño número de pacientes la presencia de blastos leucémicos y su cuantificación por técnicas de PCR en tiempo real. Sin embargo, su estudio careció de análisis pronóstico pues no se hizo seguimiento de dichos pacientes. (Kwan 2000) Pui correlacionó la detección de niveles de EMR <10-4 en la semana 7 postremisión con mejor pronóstico que la detección de EMR en niveles más altos. Además, más de la mitad de los pacientes no tuvieron niveles detectables de EMR en la segunda semana de inducción, y fue detectada en el 25% de los pacientes (semana 6) y en 13% durante la semana 14 del tratamiento de continuación y sólo el 4% en la semana 32. Todos los pacientes con EMR en el último punto recurrieron, mientras que los que fueron positivos en la semana 14 pero negativos en la 32 tuvieron un riesgo de recurrencia a 3 años de 14%. (Pui 2000) Rubnitz presenta en su trabajo que detectar EMR a la semana 14 predecía recurrencia en el 70% de los casos, mientras que la negatividad del estudio en el día 19 se correlacionaba con recurrencia del 6%. Estos hallazgos fueron determinados con el uso de citometría de flujo y reacción en cadena de la polimerasa. (Rubnitz 2003) Goulden plantea en su trabajo que es de alta utilidad el análisis de muestras de médula ósea de pacientes en tratamiento para definir enfermedad residual precisando como puntos de corte a los 7 días del inicio de la terapia, al mes y a los 3 meses, o en cualquier momento durante los primeros 6 meses garantizando 2 mediciones. La no detección de enfermedad mínima residual durante estos lapsos es altamente predictivo de no recurrencia. Igualmente, precisa que la detección de EMR antes de trasplante de médula ósea obliga a intensificar la terapia para minimizar el riesgo de recurrencia luego del trasplante. (Goulden 2001) Campana demostró en su trabajo que la detección de EMR >0,01% en médula ósea en la remisión post-inducción se correlaciona con altas tasas de recurrencia, y si dicha EMR es >1% el pronóstico es especialmente pobre. Igual hallazgo se observó con niveles de EMR >0,1% en la semana 14 de terapia continua. La EMR fue detectada con más facilidad al final de la primera inducción (68%) que a la

semana 14 (7%), pero la persistencia de EMR hasta la semana 32 se correlacionó con pobre pronóstico. (Campana 2002) Un estudio previo del mismo autor había demostrado que los resultados obtenidos el día 19 son más fidedignos, puesto que la detección de EMR se correlacionaba con recurrencia en el 28.4% a 3 años, mientras que en ausencia de EMR en este punto la recurrencia era del orden de 1.9%. (Campana 2004) Campana en un estudio previo demostró presencia de células tumorales residuales al final de la inducción (6 semanas) en 23%, número que iba cayendo con el paso de las semanas alcanzando 17% en la 14, 5% en la 32, 4% en la 52, y ninguna al final de la terapia en la semana 120. A su vez, la detección de enfermedad mínima residual se correlacionó con desarrollo de recurrencia en el 32.5% contra 7.5% en el grupo negativo al final de la inducción, y en la semana 14 de 42.2% Vs. 6.6% (Campana 1999) Estudios subsecuentes de Campana mostraron que encontrar Enfermedad Mínima Residual en el día 19 de la terapia de inducción, al final de la misma, y en las semanas 14, 32 y 56, se correlacionaba con tasas más altas de recurrencia, teniendo pobre pronóstico los niveles de EMR ≥1% al final de la inducción y ≥0.1% en la semana 14. (Campana 2004) Igualmente, logró concluir que los pacientes con negativización de EMR en la semana 14 tenían igual riesgo de recurrencia que los que nunca tuvieron EMR después de completar la terapia de inducción, mientras que los que persistían con EMR durante la terapia de continuación incrementaba el riesgo de recurrencia a medida que pasaba del tiempo; de ahí, que considere que los pacientes con EMR al final de la inducción se benefician de la medición periódica de EMR. (Campana 2001) Mandrell en su revisión sobre el tema presenta el resultado de algunos estudios sobre la utilidad del estudio de EMR. Concuerda en afirmar que EMR >1% al final de la inducción es indicador de mal pronóstico. Presenta un estudio del Hospital de St. Jude donde se hace medición de EMR al fin de la terapia de inducción y en 3 momentos durante la terapia de mantenimiento; en éste se encontró correlación entre EMR con altas tasas de recurrencia; la persistencia de EMR al final de la inducción predecía recurrencia en el 43% de los casos contra 10% en los niños sin EMR; el riesgo de recurrencia se incrementaba al 68% si persistía EMR en la semana 14 contra el 7% de los negativos. A la semana 32 EMR fue altamente predictiva. Se estableció 1% como el punto de corte de EMR al final de la inducción. El mismo estudio permitió reconocer que EMR se asocia frecuentemente a edad desfavorable, cromosoma Ph+, y sensibilidad del blasto a la quimioterapia. (Mandrell 2006) Tzortzatou publicó en 2001 un informe del resultado de su investigación donde plantea de alta utilidad realizar la medición de EMR en el día 22 y cada 2 meses luego de la remisión usando técnicas de PCR para detectar rearreglos de IgH alcanzando niveles de detección de hasta 104. (Tzortzatou 2001)

Moppett presenta en su revisión la utilidad del análisis del día 29 (final de la inducción), momento en el cual detectar EMR >0,01% significaba riesgo de recurrencia en 7 años del 52%. El estudio en la semana 14 mostraba que niveles de EMR >0,01% implicaba riesgo de recurrencia en 3 años de 42,1% frente al 6,6% de los pacientes sin EMR, en un primer reporte, y en un segundo reporte los valores se incrementaron a 68% de recurrencia en grupo EMR positivo, y en 10% en el grupo negativo. También anota que detectar niveles absolutos de >10 blastos/µl en el día 33 y >1 blasto/µl en la semana 12 se asoció con recurrencia del 100% comparado con el 6% en pacientes con estudio negativo. En relación con el trasplante de células madre señala que la detección de EMR >10-3 se correlaciona con recurrencia general, mientras que EMR entre 10-3-10-5 se relaciona con recurrencia de 27%. Igualmente, anota que gran parte de las controversias surgidas entre los autores radican en las diferencias propias de las técnicas y el momento de la realización del estudio; cuando el estudio es realizado al final de la inducción, diferencias sutiles en la sensibilidad de la prueba (v.g. 10-4 Vs. 10-4.3) pueden significar diferencias porcentuales de detección de pacientes del 40 al 60%. (Moppett 2003) Sievers publicó en su artículo que la detección de EMR a los 1, 3 y 5 meses en pacientes con recurrencia fue de 82%, 60% y 42%, respectivamente, mientras que en los pacientes que no recurrieron se detectaron niveles de EMR en 32%, 10% y 0%, respectivamente. Igualmente, pacientes con niveles de EMR mayores de 1% al final de la inducción, mayores de 0,1% en la semana 14 son marcadores de alto riesgo y requieren intensificación de la terapéutica. (Sievers 2000, Izraeli 2004) Sandlund estudió la utilidad del análisis de EMR en médula ósea en los días 15 y 22-25 de la terapia. Encontró que la persistencia de >1% de linfoblastos en el día 15 tenían menos remisión completa al día 43 (89%) que los pacientes sin esa condición (99%), y que la presencia del mismo nivel de linfoblastos entre los días 22-25, la remisión completa era del 59%. La supervivencia sin eventos a 5 años en pacientes con y sin EMR>1% al día 15 fue de 40% y 78%, respectivamente, y en los días 22-25 fue de 4% y 76%, respectivamente. En conclusión, el riesgo de recurrencia se consideró entre 3 y 10 veces superior en presencia de EMR a los días 15 y 22-25, respectivamente. (Sandlund 2002) zur Stadt analizó una serie de pacientes al final de la inducción para determinar EMR encontrando niveles de 10-4 en 21% de los pacientes, 10-2-10-3 en 36.8%, y >10-2 en 26.3%, y el estudio fue negativo en 15.8% de los pacientes. Estos datos se obtuvieron por técnicas moleculares y se compararon con los resultados obtenidos por otros autores. (zur Stadt 2001) Seeger trató de identificar la utilidad del estudio de EMR por técnicas moleculares en pacientes de alto riesgo quienes presentan el producto de fusión génica TEL-AML1. Estudió para tal fin muestras de médula ósea al momento del diagnóstico,

durante la inducción (días 15 y 33) y antes de la reintensificación (día 148). El estudio se negativizó en el 35% de los pacientes el día 15, en el 78% después de la inducción (día 33); sólo el 6% de los pacientes siguieron siendo positivos luego de la consolidación. Los pacientes que fueron negativos siguieron siendo negativos por el resto del seguimiento. El papel pronóstico del estudio de EMR en pacientes de alto riesgo no es tan fundamental como en pacientes de riesgo bajo, puesto que en los primeros los otros factores que les imprimen alto riesgo son más ominosos que la misma detección de EMR. (Seeger 2001) Luego de recaída, detectar EMR es también de importancia pronóstica. En la segunda remisión al final de la inducción, 46% fueron EMR negativos, mientras que 54% fueron >0,01%. Se estableció recurrencia de 70,2% en los niños con EMR en la segunda remisión contra el 18,2% de casos negativos, excluyendo las recurrencias extramedulares. El riesgo de recurrencia luego de recurrencia-remisión con EMR fue de 49,1% a 2 años contra 0 en los negativos. En este estudio se estableció que la recurrencia en sí misma constituye un factor de mal pronóstico más fuerte que la detección de EMR. Detectar EMR al final de la segunda remisión es indicativa de trasplante autólogo y EMR negativa al final de la segunda remisión es de buen pronóstico. (Mandrell 2006) Pui y Campana han tratado de establecer el concepto de remisión a partir de EMR, sin embargo, es difícil debido a que no a todos los niños se les realiza el estudio durante la terapia y que falta por establecer un nivel estándar de EMR. Antes se había descrito que niños con >1% al final de la inducción ó >0,1% posteriormente, tenían altísimo riesgo de recurrencia. Otro estudio encontró que EMR >0,01% al día 19, al final de la inducción, y a las semanas 14, 32 y 56 tenían alto riesgo de recurrencia, así como niveles >1% postinducción ó >0,1% a la semana 14 como de pobre resultado. Además, se demostró que en las primeras 2 semanas el 50% de los estudios son EMR negativos, así como el 75% al final de la inducción; de igual modo, los resultados para las semanas 14 y 32 donde seguían positivos 13 y 4%, respectivamente. Todos los EMR a la semana 32 recurrieron. Se podría intuir que niveles de EMR <10-4 al completar la inducción son favorables, mientras que EMR >10-2 tienen alto riesgo de recurrir. (Mandrell 2006) La detección de Enfermedad Mínima Residual es también de importancia en la monitorización del trasplante autólogo. Goulden estudió la utilidad del análisis a los 1, 3, 6, 12, 18 y 24 meses luego del trasplante, pero encontró limitaciones pues la enfermedad fue detectada en el nivel más bajo. En caso de recurrencia, también se analizó la utilidad del estudio en los primeros 2 meses donde se encontró que todas las recurrencias habían sido precedidos por al menos un estudio de EMR positivo. (Goulden 2002)

1.5 PAPEL DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO EN EL ESTUDIO DE ENFERMEDAD MÍNIMA RESIDUAL La citometría de flujo es una herramienta útil para el estudio de Enfermedad Mínima Residual pues permite identificar las células neoplásicas entre poblaciones grandes de médulas óseas en regeneración o postrasplante. En condiciones óptimas, los niveles de detección son similares a las técnicas moleculares, sin embargo, en términos reales dichos niveles no son alcanzables puesto que los volúmenes de células obtenidos por punción de médula ósea son del orden de 106, y se requieren entre 10 y 20 eventos para que la técnica de citometría tenga capacidad de diferenciar los grupos de eventos adecuadamente, por lo que la sensibilidad alcanzable es del orden cercano a 105 en los mejores escenarios. Sin embargo, debido a los cambios sufridos por la población celular por el efecto de la terapéutica, los niveles de EMR detectables por citometría de flujo se consideran ligeramente superiores a 104. (Campana 2004) Las ventajas principales del uso del inmunofenotipo para la detección de enfermedad mínima residual se resumen en: (Izraeli 2004) 1. Adecuada sensibilidad de la técnica (detección de 1 célula en 104). 2. El análisis se realiza con equipos que ya están siendo usados rutinariamente para tipificar leucemias. 3. Capacidad de distinción entre células muertas y vivas. 4. Método rápido y relativamente barato. Algunas de las desventajas anotadas a la técnica incluyen: (Izraeli 2004) 1. El análisis es complejo y depende de la experticia del operador. 2. Es difícil distinguir entre precursores de médula ósea en regeneración de blastos leucémicos pre-B (el tipo más común de leucemia). 3. El análisis debe ser realizado sobre muestras frescas por lo que se requiere cercanía entre el centro de tratamiento y el centro de estudio de las muestras. 4. Inestabilidad en la expresión de antígenos en células leucémicas (cambio de linaje, pérdida de antígenos) durante o posterior al tratamiento. Sin embargo, ya existen algunas luces para resolver algunas de dichas desventajas. Para el ítem 2, van Wering en su estudio presenta los resultados del análisis de múltiples muestras que detectadas por inmunofenotipo y comparadas con los resultados de estudios moleculares logra identificar las células tumorales residuales por su expresión aumentada de CD34 y TdT, frente a la expresión baja de estos antígenos en precursores normales, los cuales son predominantemente CD10 y CD19. (van Wering 2000) 1.5.1 Descripción de la técnica. La citometría de flujo es una técnica descrita hace más de 30 años que permite realizar una evaluación cuantitativas de las propiedades celulares basado en sus propiedades de dispersión de la luz y

características fenotípicas que pueden ser determinadas usando marcadores fluorescentes. Inicialmente, la técnica fue desarrollada con fines de investigación y los primeros instrumentos eran muy grandes, costosos y requerían alta especialización por parte de sus operarios. Diez años después, hacia el inicio de la década del 80, se introdujo en el laboratorio clínico la técnica gracias al desarrollo de anticuerpos monoclonales más baratos, instrumentos más pequeños, asequibles y operables. La técnica se basa en la determinación del inmunofenotipo celular por medio del uso de anticuerpos conjugados con fluorocromos específicos para proteínas expresadas por las células. Para comprender mejor la técnica es útil recordar los conceptos de antígeno, anticuerpo y su interacción. 1.5.1.1 Anticuerpos. Los anticuerpos pertenecen a la clase de proteínas globulares conocidas como inmunoglobulinas (Ig). Su estructura básica se compone por dos cadenas pesadas (55kD) atadas entre sí por puentes disulfuro; a su vez, cada una de estas cadenas está atada a una cadena ligera (25kD) por medio de puentes disulfuro. En el humano se han identificado 5 isotipos de Ig (G, M, A, D, E) acorde a su respectiva cadena pesada (gamma, mu, alpha, delta y épsilon), y pueden ser individualizadas por análisis electroforético. A su vez, se han identificado 4 subclases de IgG, dos de IgA, y de las restantes uno, que tiene importancia en investigación, y recientemente su interés se ha incrementado en el estudio de desórdenes de la respuesta inmune. Las cadenas livianas, denominadas kappa y lambda, nunca se presentan simultáneamente en la misma inmunoglobulina, pero sí tienen normalmente expresión policlonal, es decir, se identifican las dos en moléculas distintas del mismo isotipo de Ig. (Stewart 2000) Las inmunoglobulinas al ser expuestas a la papaína, se dividen en un fragmento Fc (cristaliza a 4°C) y dos fragmentos Fab (unión a anticuerpo); si se digiere con pepsina se produce ruptura a nivel de los puentes disulfuro y se genera un fragmento con dos fracciones (F(ab’)2) aún unidas y pequeños fragmentos de Fc. (Stewart 2000) IgG es la gammaglobulina más abundante en el organismo y se encuentra circulando en plasma. Tiene un peso molecular 154kD y vida media de 23 días; cuando es clivada por la pepsina genera un fragmento F(ab’)2. (Stewart 2000) IgM se encuentra en tejidos y circulando y representa el 5-10% de las Ig. Posee un peso molecular de 900kD y vida media de 5 días. Su digestión genera cinco fragmentos F(ab’)2. (Stewart 2000) IgA ejerce su función en epitelios mucosos, aunque también se encuentra circulando. Tiene peso molecular de 160kD y vida media de 6 días. Se constituye

como un tetrámero o dímero unido a un componente secretorio producido por las células epiteliales que modifica su función. (Stewart 2000) IgE se encuentra ligado al receptor Fc de mastocitos y eosinófilos (anticuerpo reagínico). Pesa 190kD y su vida media es 2-3 días. En mastocitos se encuentra un receptor Fc de alta afinidad (FcΣR1), y en eosinófilos, algunos linfocitos B y plaquetas expresan un receptor de afinidad baja (FcΣR2 ó CD23). (Stewart 2000) IgD es una proteína transmembrana en células B maduras sin mayor componente circulante y confiere especificidad de antígenos a células B de memoria. Pesa 185kD y su vida media es de 2-3 días. (Stewart 2000) 1.5.1.2 Antígenos. Los anticuerpos en los mamíferos se forman cuando una sustancia que entran al organismo y cumple con poseer una estructura química reconocida como extraña al sistema inmune, que dicha estructura sea compleja o diversa y mayor a 100kD. Estas sustancias son conocidas como inmunógenos. Las estructuras químicas contra las cuales se generan los anticuerpos son los antígenos; todos los inmunógenos son antígenos, pero no todos los antígenos son inmunógenos. (Stewart 2000) Las pequeñas áreas o estructuras de bajo peso molecular contra las cuales se dirigen los anticuerpos se denominan epítopes, que en sí mismos son incapaces de desencadenar la producción de anticuerpos, pero cuando forma parte de grandes moléculas con múltiples epítopes, si se establece la respuesta inmune. Existen otras moléculas menos complejas con suficiente tamaño y heterogeneidad estructural que pueden desencadenar reacciones inmunes que se denominan haptenos. (Stewart 2000) 1.5.1.3 Reacción antígeno-anticuerpo. Al inmunizar a un animal con un inmunógeno se producen anticuerpos para cada epítope específicos de clones de células B que maduran en células plasmáticas con diversa afinidad y capacidad de producción de múltiples isotipos de Ig y cadenas ligeras variadas, con lo que se establece una respuesta policlonal. Cada uno de los clones celulares en expansión responde a un solo isotipo de Ig y una sola cadena ligera (respuesta monoclonal), y la suma de todas ellas constituye la respuesta policlonal. Estas células plasmáticas se pueden fusionar con células de mieloma murino generando híbridos inmortales monoclonales (hibridoma). (Stewart 2000) Dada la heterogeneidad interespecie e intraespecie de las proteínas, los epítopes son diferentes y pueden desencadenar respuesta inmune. (Stewart 2000) Se ha establecido y normalizado un sistema de denominación de los principales antígenos y anticuerpos de importancia médica que se conoce como CD (cluster of differentiation) ó grupo de diferenciación. Cada grupo es identificado por un

número que describe el anticuerpo dirigido a un antígeno celular, y no a un epítope en el antígeno. Por ejemplo, CD11a se refiere a todos los anticuerpos que ligan a cualquiera de los epítopes en la cadena alfa de LFA1. El antígeno es explícitamente nombrado, y el anticuerpo contra esa proteína es dado el número CD. La nomenclatura describe el antígeno más que el epítope, puesto que cada investigador produce su propio anticuerpo contra diferentes epítopes del mismo antígeno. (Stewart 2000) 1.5.1.4 Inmunofenotipificación. Para el estudio de inmunofenotipo existen marcadores buenos y malos, y la dificultad radica en escoger los buenos, y saber cómo interpretar los resultados de los malos cuando no hay otros disponibles. Los buenos anticuerpos se caracterizan por tener altas especificidad y afinidad de ligado por sus epítopes. En general, los anticuerpos monoclonales poseen menor afinidad que los policlonales por su proceso de selección en producción masiva. Para la producción de anticuerpos policlonales de alta especificidad se requiere del uso de animales con largos períodos de inmunización y reinmunizados para lograr la mayor afinidad. (Stewart 2000) La fijación de anticuerpos se realiza por dos mecanismos básicos: unión por la región Fab o la fracción Fc. Estos dos mecanismos son saturables a bajas concentraciones de anticuerpos, así que el incremento en la concentración de éste conduce a unión inespecífica eléctrica con otros grupos proteicos contra los cuales no está diseñado. Igualmente, dentro del mismo grupo de receptores, o antígenos, se presentan diferentes niveles de afinidad con el anticuerpo, y puede que dicha especificidad sea tan marcada que anticuerpos del mismo isotipo se liguen en forma diferencial a los receptores (Fc), como es el caso de IgG2, la cual no se une a FcRI (CD64) como si lo hace IgG1 e IgG3, y en menor medida IgG4. (Stewart 2000) Las células hematopoyéticas exhiben un repertorio único de receptores Fc, que permite su diferenciación. Al combinar estas características con la capacidad de dispersión de luz (side scatter), se logran diferenciar todos los elementos de la sangre. La siguiente tabla muestra una aproximación a este enfoque. Los anticuerpos monoclonales son seleccionados por su reacción con el antígeno (receptor) y no se analiza la capacidad de unión inespecífica a las proteínas de la superficie celular y del ambiente intracelular. Muchos anticuerpos resultan “malos” para inmunofenotipificación por esta razón. Sin embargo, los fabricantes han incrementado su interés por establecer la unión inespecífica y mejorar la afinidad de los anticuerpos. Existen múltiples pruebas que permiten identificar los anticuerpos con unión inespecífica pero se escapan al objetivo de ésta revisión. Basta con concluir, que la experiencia de trabajo es la que permite identificar los “mejores” anticuerpos. (Stewart 2000)

Tabla 1.8 Inmunofenotipo básico de líneas hematológicas normales FcRI (CD64) FcRII (CD32) FcRIII (CD16) Side scatter Eritrocitos - - - Baja Granulocitos Basófilos ++ ++ 0 Baja Eosinófilos +/- ++ 0 Alta Neutrófilos ++ ++ * Alta Linfocitos Células B - + - Baja Células NK + - - Baja Células T - - - Baja Monocitos * ++ + Intermedio Plaquetas - ++ - Intermedio *Nulo en células en reposo, pero reguladas al aumento en forma variable durante la inflamación. (Tomado de Stewart 2000) 1.5.1.5 Consideraciones generales de la aplicación clínica del estudio de inmunofenotipo por Citometría de Flujo. El desarrollo de mejores fluorocromos, equipos de medición y software analítico, y en general, con una mayor comprensión del papel del inmunofenotipo en la maduración hematológica, se ha popularizado el uso de esta técnica en estudios variados para distinguir condiciones neoplásicas de condiciones benignas, diagnóstico y clasificación de linfomas y leucemias, evaluación de otros desórdenes neoplásicos y pre-neoplásicos tales como las discrasias de células plasmáticas y síndromes mielodisplásicos y detección de enfermedad mínima residual en pacientes con leucemias aguda y crónica. (Nguyen 2003) El estudio de inmunofenotipo por citometría de flujo ha sido reconocido de gran utilidad por sus altas sensibilidad, especificidad y reproducibilidad, incluso superando la morfología, que ha permitido el reconocimiento de características diagnósticas y pronósticas que se escapaban anteriormente por estudios morfológicos solos. Con base en esta apreciación, actualmente se recomienda la combinación de múltiples técnicas diagnósticas (morfología, inmunofenotipo y biología molecular), más que el uso separado de alguno. (Nguyen 2003) La metodología usual de análisis de poblaciones por citometría de flujo busca establecer el porcentaje de células positivas que expresan de determinado antígeno. Para tal fin, se seleccionan las células por dispersión de luz y se analizan los patrones de fluorescencia por histogramas de uno o múltiples parámetros (fluorocromos); en el histograma se ubica el cursor para seleccionar las células que presenten positividad superior al límite del control, establecido por medición de fluorescencia de un fluorocromo irrelevante, y se reportan los resultados como positividad de células para cada fluorocromo. Este análisis

numérico puede ser empleado como índice para definir razones poblacionales (v.g. CD4/CD8). (Nguyen 2003) A pesar de la utilidad del análisis numérico de positividad de antígenos, en ciertas ocasiones es difícil determinar el punto de corte en la mayoría de células puesto que todas tienen diferentes niveles de expresión de antígenos, y resulta más útil determinar sólo la presencia del antígeno, sin expresarlo numéricamente, puesto que esa cuantificación puede resultar ambigua. Por tanto, la definición multiparámetrica (varios fluorocromos) de una población y su cuantificación es más útil que generar porcentajes de cada antígeno. (Nguyen 2003) La estrategia de selección (gated) es empleada con alta frecuencia para establecer clonalidad. Sin embargo, muchas células con características similares pueden quedar incluidas en el área de selección y modificar los porcentajes de expresión del grupo celular que realmente representa interés. La estrategia de selección es útil para determinar clonalidad y coexpresión de otros antígenos en células B, y caracterizar blastos leucémicos en células CD45. Para lograr estos propósitos es fundamental contar con herramientas de diagnóstico con al menos 2 colores, que sumado al FSC y SSC son herramientas básicas para determinar poblaciones. (Nguyen 2003) El diagnóstico inmunofenotípico debe ser correlacionado con los hallazgos establecidos por otras técnicas, y de esa forma construir un diagnóstico total que sirva al clínico en el establecimiento de terapéutica y pronóstico. Igualmente, se deben eliminar las incongruencias que se puedan presentar entre los diversos métodos, así como emplear los métodos más costo-efectivos que se realicen en el menor tiempo posible. (Nguyen 2003) Otras aplicaciones de la citometría de flujo diferente a su utilidad diagnóstica, es la utilidad pronóstica en detección de enfermedad mínima residual. Ya se determinó su capacidad de establecer ploidía por medición de DNA en fase S en LLA, siendo este índice de alto valor pronóstico. Así mismo, de la mano con las técnicas moleculares con PCR, constituyen dos estrategias no excluyentes que permiten lograr niveles de detección de hasta 1 célula anormal en 104-105 células normales. (Nguyen 2003) Usualmente se han caracterizado los marcadores celulares empleados relacionados con líneas hematológicas en las siguientes categorías: células B, células T, células NK, mieloide/monocítico, eritroide, y antígenos no asociados a linaje (v.g. antígenos de activación CD38 y HLA-DR). Estos antígenos se establecieron con base en estudios de diferenciación y maduración, donde se determinó la presencia de CD34 en precursores, así como la ganancia progresiva con maduración de CD38 y HLA-DR, en precursores linfoides TdT. (Nguyen 2003)

El linaje B inicia con CD22 citoplásmico, el cual es positivo incluso antes que los rearreglos de inmunoglobulinas, con posterior expresión de CD10 y CD19. Prosigue con reducción de CD10 y ganancia concomitante de CD20, con posterior expresión de inmunoglobulina de superficie y silenciamiento de antígenos inmaduros (CD34 y TdT) en células maduras. Las células circulantes muestran inmunoglobulina de superficie junto con CD20 y CD22; la diferenciación ulterior se produce en ganglios linfáticos. (Nguyen 2003) El linaje T se identifica con CD3 de citoplasma, el cual aparece desde los estados tímicos más tempranos, así como CD2 y CD7, sufriendo rearreglo del receptor T durante la maduración (usualmente heterodímeros αβ siendo γδ menos del 5%) acompañado de expresión de otros antígenos asociados al linaje T (CD4, CD8, CD5). Las células γδ migran del timo fetal para ubicarse en piel y mucosas, siendo la mayoría CD4-/CD8-, y sólo la tercera parte CD8+. La determinación de células T maduras es por la carencia de expresión de antígenos inmaduros (TdT, CD1) y sobreexpresión de CD3. (Nguyen 2003) El linaje mieloide es determinado por la identificación de CD13, CD33 y CD117. La maduración a promielocitos se marca por la pérdida de CD34 y HLA-DR con expresión de CD15, CD11b y CD16 en estados mielocitos y metamielocitos. CD14 intenso es característico de monocitos, y la intensidad de expresión de CD33 y CD64 es también característica frente a otras células de la línea mieloide. (Nguyen 2003) La serie eritroide regula a la baja CD45 y sobreexpresa CD71. La glicoforina es característica de células menos maduras reconocidas como eritroblastos. (Nguyen 2003) Ciertos antígenos considerados específicos de linaje pueden ser expresados por células neoplásicas (CD15 en LLA y CD7 en LMA). De este modo el “marcador de linaje” debe ser considerado con precaución, además por la expresión compartida de antígenos (CD11b, CD15 y CD16 no se deben considerar específicos de linaje mieloide). (Nguyen 2003) Otros antígenos no específicos de linaje se han considerado de importancia, como lo es CD56 presente en células NK y neoplasia plasmática, así como en tumores neuroendocrinos y LMA. Igualmente, las células NK se establecen por el análisis combinado de antígenos T y “NK” (CD56, CD57 y CD16). (Nguyen 2003) Aseguramiento de la calidad. Como todos los procesos en el laboratorio clínico, el estudio de una muestra hematológica por citometría de flujo se compone de fases pre-analítica (toma y manejo de la muestra), analítica (corrida en el instrumento) y post-analítica (análisis de datos y entrega de resultado). Si bien, mantener los instrumentos de medición en condiciones óptimas a través de

sistemas de aseguramiento de calidad es de importancia capital, se hace fundamental el manejo adecuado de las muestras desde su toma hasta que son analizados por los equipos. La toma de la muestra, su adecuada manipulación, transporte y disposición, generan las condiciones necesarias para garantizar obtener resultados óptimos en los análisis. Se hace indispensable que los responsables de los laboratorios de citometría de flujo generen protocolos de manejos de muestra que sean distribuidos a los sitios donde se originan las muestras. (Nguyen 2003) Toma de muestras. La sangre periférica puede ser recogida en EDTA o heparina, prefiriendo la primera por su mejor preservación morfológica; se recomienda volumen de 10 mL al menos, y enviar láminas y hemograma para evitar los artefactos de preservación. La médula ósea se prefiere en EDTA y contar con láminas e improntas de la biopsia para evaluación morfológica. Algunos métodos para mejorar la obtención de células han sido descritos para ser realizadas al lado del paciente y obtener células inmaduras que suelen estar adyacentes a las trabéculas óseas. (Nguyen 2003) Los especímenes sólidos son enviados frescos en solución salina fría u otro preservante vital, y cortados para obtener fragmentos intercalados para las técnicas diagnósticas que sean necesarias (biología molecular, citometría de flujo, inmunohistoquímica, entre otras). Se recomienda obtener improntas para evaluación de morfología citológica y marcación de ser necesaria. (Nguyen 2003) Procesamiento de muestras. Las muestras son procesadas para eliminar las células no nucleadas con sustancias lisantes como cloruro de amonio, y las células restantes se pueden eliminar electrónicamente con anticuerpos específicos o “gated”. Es importante evitar la excesiva selección puesto que pueden resultar removidas células claves, como las neoplásicas que no manifiestan las mismas características de las células normales, y esta pérdida puede resultar crítica ante bajos conteos. (Nguyen 2003) La citometría también ayuda a determinar la vitalidad celular por la marcación del DNA con tinciones tales como yoduro de propidio o 7-amino-actinomicina D que son afines a células muertas. Otra metodología empleada es exclusión con azul de tripán. También es útil recordar que las poblaciones heterogéneas donde las células neoplásicas constituyen grupos celulares grandes susceptibles a daño por el procesamiento, lavados y centrifugación, y que los tejidos suelen presentar menor viabilidad que los líquidos, sin embargo, no existe un umbral de viabilidad para establecer cuales muestran resultarán útiles para estudio en citometría de flujo. (Nguyen 2003) Las muestras deben ser procesadas tan pronto como la lisis ha sido completada. Demoras en este procesamiento inducirán modificación de la viabilidad celular y en el resultado de la prueba. La tinción se realiza con fluorocromos estándares

comercialmente asequibles, bajo rutinas de procedimiento normalizadas que permiten garantizar la adecuada interacción de los antígenos con los anticuerpos. La metodología para antígenos de superficie es más sencilla que la necesaria para anticuerpos intracelulares, esta última requiriendo fijación y permeación celular, y a la vez que evite la agregación de la muestra. Cuando se requiere tinción de superficie e intracelular, primero se tiñe superficie, luego se fija y se tiñe internamente. Se prefiere emplear fluorocromos de tamaño pequeño para las tinciones intracelulares como el FITC. (Nguyen 2003) La marcación de DNA es una técnica empleada con frecuencia por ciertos laboratorios en casos de linfomas y leucemias agudas, junto con otros antígenos intracelulares o de superficie útiles para seleccionar las células a estudiar, o simplemente con propiedades de dispersión de luz. La tinción se realiza en células frescas tan pronto como se concluya la lisis para evitar la lesión de DNA, que en últimas modificaría la relación estequiométrica con el fluorocromo. El estudio sobre material fijado incrementa falsamente los índices de DNA. El yoduro de propidio, por su capacidad de intercalarse con el DNA es el fluorocromo de elección para la metodología. Se puede preservar bien el material en etanol, con lo que pierde sus características de tinción superficial, o en paraformaldehído, con lo que puede formar puentes cruzados que incrementan el CV de las muestras. Igualmente, se puede establecer los puntos de corte de picos modales de índices de DNA corriendo muestras patrón. (Nguyen 2003) Control de calidad. Periódicamente se debe realizar calibración de los equipos con ajustes de color usando fluorocromos de importancia que sean mutuamente excluyentes (CD4, CD8, CD20 en FITC, PE y PerCP) para determinar la ganancia necesaria que debe presentar los tubos fotomultiplicadores. Cuando se corren las muestras, existen varias aproximaciones de adquisición; una es ingresar todos los eventos sin eliminar ni detritus ni células no viables y completar conteos altos (entre 30 y 70 mil), también se puede ingresar eventos que cumplan ciertas características definidas como “gated” y completar conteos menores en esos grupos, garantizando así un número suficiente de células para análisis. Luego de este proceso, se puede eliminar por selección los eventos carentes de importancia. (Nguyen 2003) Diseño de paneles. Los anticuerpos a utilizar deben ser seleccionados con base en una exhaustiva búsqueda tratando de obtener el mejor desempeño de las combinaciones de colores, así como la selección de fluorocromos como policlonales frente a monoclonales. Es importante recordar que, dada la variabilidad de ciertos antígenos, es recomendable usar anticuerpos policlonales no selectivos de cadena ligera, a menos que sea ella la que se quiere determinar. Por ejemplo, para determinar población B se recomienda emplear combinaciones de coloraciones que incluyan gamma-FITC/CD19-PE, lambda-FITC/CD19PE, gamma-FITC/CD20PE, lambda-FITC/CD20-PE, más que las populares combinaciones kappa-FITC/lambda-PE. (Nguyen 2003)

La selección de paneles de anticuerpos busca maximizar la información obtenida de corridas simples, encontrando información adicional concerniente con líneas de diferenciación, y en general la ganancia y pérdida de expresión de los antígenos de interés. Igualmente, es importante definir el tipo de fluorocromo concerniente a los niveles de emisión de luz para evitar el silenciamiento que pueda resultar de la interacción de diferentes fluorocromos que emitan en la misma longitud de onda. Algunos autores prefieren usar fluorocromos simples (FITC, PE, APC y PerCP) más que constructos más complejos (PE-Texas Red ó PE-Cy5). Sin embargo, se recomienda contar con más de un fluorocromo para determinados antígenos de importancia para aprovechar la capacidad de detección de múltiples colores y mejorar la discriminación. (Nguyen 2003) Al diseñar los paneles se busca alcanzar diversos objetivos que incluyen determinar el linaje de las células de interés, su estado de maduración, la clonalidad (si existe), el subtipo específico de alteración hematopoyética y el estado de los elementos normales. Los paneles se diseñan tratando de interpretar las enfermedades o acorde al tejido de origen, generándose así paneles estándar que se aplican a todas las muestras acorde al enfoque que se les dé. Una aproximación más lógica establece que se deben examinar morfológicamente las lesiones y aproximarse al diagnóstico, y orientar la marcación con el diagnóstico probable. Otra aproximación es generar pequeños paneles de determinados anticuerpos que buscan reconocer determinadas características que presenta la población celular. Los resultados son presentados como gráficos de puntos donde se ubican los eventos en dos ejes, y se realiza una valoración numérica de la fluorescencia en escala simple o logarítmica, prefiriéndose la última al normalizar los comportamientos de las poblaciones. (Nguyen 2003) Estrategia de análisis. El estudio de Enfermedad Mínima Residual busca establecer la presencia de células neoplásicas sobre un fondo de células normales, luego la técnica debe ser altamente sensible y específica. Una de las necesidades del estudio es establecer las características fenotípicas al momento del diagnóstico para hacer seguimiento a dichas características. Contando con dichas características, se puede hacer una adquisición piloto con 10 a 15 mil eventos y seleccionar dos ventanas: una que identifique las características fenotípicas del diagnóstico, y la otra que evidencia las características de dispersión de luz de las células anormales. Con esta información seleccionada en el citómetro, se adquiere entre 300 y 500 mil eventos guardando la información de los eventos que cumplan con esas características. (Campana 1999) Limitaciones y posibles fuentes de error. El estudio de inmunofenotipo plantea limitaciones dado el proceso manual que se requiere para preparar las células que van a ser analizadas por el citómetro. Dichos artefactos pueden inducir tanto falsos positivos como falsos negativos. La siguiente tabla resume algunos de dichos artefactos y la forma de evitarlos.

Tabla 1.9 Problemas comunes de la citometría de flujo Problema Resultado Prevención/solución

Contaminación de la muestra

Falso positivo

Marcación y manejo cuidadoso de la muestra

Impurezas en buffer de lavado y sistemas de flujos

Falso positivo

Filtración rutinaria y monitorización de la pureza de los buffer Limpieza de los sistemas de flujo del citómetro

Ligado inespecífico de anticuerpos

Falso positivo

Saturación de receptores Fc Titulación cuidadosa de los anticuerpos Uso de anticuerpos de control específicos de isotipo Uso de anticuerpos en la forma de fragmentos F(ab´)2 (no es esencial)

Contaminación o mala colocación del anticuerpo

Falsos positivo o negativo

Almacenaje ordenado y lógico de los anticuerpos Marcación clara de los tubos de muestras Uso de cócteles de anticuerpos premezclados Entorno de trabajo sin distracciones

Cambios en el lote del anticuerpo y/o inestabilidad del instrumento

Falsos positivo o negativo

Análisis frecuente de muestras normales

Pruebas periódicas de configuración del equipo

Muestras de sitios negativos (distribución heterogénea de leucemia)

Falso negativo

Biopsia de médula ósea de varios sitios*

Estudios de sangre periférica*

Cambios inmunofenotípicos

Falso negativo

Uso de múltiples combinaciones de anticuerpo

* Estudios no evaluados formalmente. Tomado de Campana 1999. 1.5.2 Detección inmunofenotípica de Enfermedad Mínima Residual. Existe un especial interés en el estudio de EMR por citometría de flujo dada su velocidad y simplicidad, y la combinación de múltiples antígenos en citometría que ha incrementado la sensibilidad y reproducibilidad del método permitiendo analizar simultáneamente varios parámetros con base en una sola célula, evaluar cuantitativamente la expresión de antígenos, permitir el estudio y almacenamiento de información de un mayor número de células dentro de un corto período de tiempo y, combinar la detección de antígenos de superficie e intracelulares. En contraposición, los principales dos defectos de la técnica son que, contadas excepciones, las células leucémicas no muestran antígenos específicos lo que podría afectar su especificidad y aplicabilidad y que, varios grupos han reportado

la existencia de cambios fenotípicos en la recurrencia que podrían impedir el uso de inmunofenotipo para la detección de EMR debido a la existencia de una proporción incrementada de resultados falsos negativos. El primer punto cuestiona la existencia de fenotipos específicos de leucemia, mientras que el segundo plantea la necesidad de establecer características fenotípicas anormales que permanezcan sin cambios durante el seguimiento. (Orfao 2000) Los parámetros biológicos (inmunofenotipo, ploidía, anormalidades cromosómicas y rearreglo de genes) y parámetros clínicos (edad, conteo de blancos) son usados para predecir comportamiento pero no son exactos, existiendo pacientes de buen riesgo que recurren y otros que se someten a tratamientos muy tóxicos innecesariamente. La variabilidad existente responde a la farmacocinética y farmacogenética que modifica el resultado, además de la susceptibilidad de las células tumorales al tratamiento. Así, el estudio de EMR en médula durante el tratamiento es útil para modular la terapia, y para predecir el riesgo de recurrencia. (Campana 2002) La citometría de flujo es el mejor método inmunofenotípico para detectar EMR, además permite establecer otros parámetros como tamaño, granularidad e intensidad de expresión, sumado a la velocidad de la adquisición de células, la posibilidad de seleccionar células para FISH, o la medición de DNA son útiles para estudiar EMR. Los citómetros con doble láser (FACSCalibur) están equipados con láser argón a 488nM (FITC 495nM, PE 480/565nM, PerCP 488nM) y 655nM diodo rojo (APC 650nM). Los analizadores de 1 láser, 3 colores, son menos eficientes; los nuevos citómetros equipados con láser UV-tinciones tal como Hoechst 33342, DAPI e Indo-1, pueden mejorar la capacidad de detección de EMR. (Campana 2002) La habilidad de detección depende de la diferenciación fenotípica y morfológica entre las células blanco y las normales, y el número de células analizadas. Adquiriendo 10000000 de células la sensibilidad de la técnica es similar al PCR, sin embargo las condiciones de estudio no son ideales y sólo se logra tener adquisiciones con 100000 o menos células logrando límites de detección máximos de 1 en 100000. Los estudios han demostrado detectar hasta 3 células en 100000, con concentraciones mayores la prueba puede presentar mayores variaciones, pero siempre detectará células neoplásicas. Es fundamental contar con el fenotipo de la leucemia para poder determinar EMR, puesto que lo contrario llevaría a la necesidad de usar múltiples antígenos para establecer el fenotipo residual resultando muy caro. El uso del método de separación de mononucleares de Ficoll mejora la sensibilidad al reducir el background inducido por PMN y plaquetas. El estudio se realiza usando los fluorocromos FITC, PE, PerCP y APC, bien sea manteniendo un marcador en cada tubo o empleando combinaciones de antígenos positivos con negativos (células T CD3/TdT CD33/HLA-DR/CD19). Se recomienda realizar un análisis a 10000 células y luego seleccionar sólo células que presenten

el fenotipo esperado para reducir el tamaño de los archivos electrónicos. (Campana 2004, Campana 2002) La capacidad de detección de CF es 10000, útil en la mayoría de estudios, pero en ocasiones se desearía mayor definición; además, los marcadores con los que se hace seguimiento pueden variar con el tiempo generando falsos negativos, igualmente, cuando la enfermedad se manifiesta en parches o luego de terapia se requiere de límites de detección superiores. (Campana 2002) La utilidad de CF en EMR se basa en la precisión por medición directa, mientras que PCR requiere análisis indirecto de la amplificación, además pudiendo discernir tamaño y granularidad celular logrando separar células viables de dañadas por quimioterapia. (Campana 2002) Se requiere evitar al máximo los artefactos que pueden surgir del buffer, del transporte, errores de pipeteo, contaminaciones, etc. (Campana 2002) Consideremos ahora los linajes celulares. El estudio de células T se basa en encontrar fenotipos tímicos fuera de esa localización (CD3/TdT, CD5/TdT). Los precursores B (hematogonias) son abundantes en pacientes jóvenes, luego de quimioterapia o trasplante y se pueden observar en sangre periférica. El objetivo es encontrar fenotipos tumorales ausentes en células normales; en neoplasias con alteraciones conocidas como BCR-ABL, E2A-PBX1, MLL-AF4 y TEL-AML1 es lógico buscar anticuerpos contra receptores que representen dichas alteraciones, sin embargo, no es fácil el desarrollo de dichas sustancias. (Campana 1999) El anticuerpo 7.1 reconoce células con alteración 11q23, ausente en células normales y está relacionado con leucemias de fenotipo proB (CD10 negativas); igualmente hubo gran interés por el marcador KOR-SA3544 que mostraba marcación para células con rearreglos de BCR-ABL y sumado a otros antígenos linfoides específicos resultaba de interés en el estudio de EMR, sin embargo su uso ha decaído significativamente en los últimos años. (Campana 1999) Otros antígenos aberrantes son observados. CD66c marca hasta 1/3 de las células neoplásicas B, ausente en las normales. CD21 se puede observar en células neoplásicas CD34+CD19+ lo cual no se expresa en progenitores normales. CD19, 10 y 34 se pueden sobreexpresar en casos de leucemia y CD45 y CD38 pueden reducirse. Expresión aberrante de CD45RA, CD11a y CD44 se ha mencionado. El estudio por DNAc de arreglos de oligonucleótidos ha permitido establecer la presencia de moléculas que se sobreexpresan identificando 7 proteínas (CD58, creatinkinasa B, ninjurina 1, Ref1, calpastatin, HDJ-2, annexina VI) que se expresan más en células tumorales que en células normales; CD58 se sobreexpresa también en MO con EMR y se correlaciona su análisis por CF y amplificación de rearreglos por PCR, aumentando la sensibilidad del estudio. (Campana 2004, Campana 2002, Campana 1999, Chen 2001)

La combinación de anticuerpos para leucemia T comprende uso de TdT nuclear, CD3 ó CD5 citoplasmático o membrana, cuando es negativo TdT se puede usar CD34, y la presencia de CD19/CD33/HLA-DR se usa como exclusión. (Campana 1999) En neoplasias B la expresión de CD19/CD10/CD34/TdT que logra detectar entre 30-50% de la EMR, como otros antígenos CD38, CD45, CD22 y el recientemente identificado CD58. Las diferencias cualitativas se pueden establecer con antígenos mieloides, NK o antígenos maduros B; dos adicionales son CD66c y anticuerpo 7.1 (NG2); el 90% de los casos se puede estudiar con niveles de detección 10000. (Campana 2004, Campana 2002, Campana 1999) La acción concertada europea BIOMED-I propuso en el 2001 la utilización protocolaria de 5 paneles de triple tinción constituidos por TdT/CD10/CD19, CD10/CD20/CD19, CD34/CD38/CD19, CD34/CD22/CD19 y CD19/CD34/CD45 con los cuales se logra identificar fenotipos aberrantes en el 98% de los casos de leucemia linfoblástica B, a través de la identificación de células que ocupan los espacios vacíos que surgen del conocimiento de la vía normal de maduración obtenido de la comparación de 2 fluorocromos en los ejes x/y. La identificación de dichas aberraciones es de utilidad en la determinación posterior de EMR. (Lucio 2001) Bajo igual metodología se propusieron los paneles CD7/CD5/CD3, CD7/CD4/CD8, CD7/CD2/CD3, CD7/CD38/CD34 y TdT/CD7/CD3 citoplásmico o de superficie para identificar las aberrancias en leucemia de linaje T logrando identificar más del 91% de los pacientes. (Porwit-MacDonald 2000) 1.5.3 Fenotipos asociados a leucemia. Sólo unos pocos antígenos específicos de leucemia han sido identificados resultados de la fusión de genes como el bcr/abl. Reactivos que permitan identificar sin posibilidad de error todos los casos aún no son asequibles. Sin embargo, en años recientes se han realizado estudios comparativos entre las características fenotípicas de individuos sanos y pacientes con leucemia con lo que se evidenció la existencia de múltiples aberraciones antigénicas en estos últimos. Los fenotipos que no se identifican en hematopoyesis normal bien sea por bajo conteo o inexistencia, se consideran asociados a leucemia. Esos fenotipos aberrantes usualmente resultan de expresión cruzada de antígenos (antígenos de otro linaje), expresión asincrónica de antígenos (coexpresión de antígenos de diversos estados de maduración) o, sobreexpresión de antígenos (expresión exagerada de un antígeno). La detección de estas alteraciones es obligatoria al diagnóstico para orientar la búsqueda de Enfermedad Mínima Residual al establecerse la remisión morfológica. (Orfao 2000) Existen otras situaciones en las cuales se puede determinar la presencia de Enfermedad Mínima Residual como la detección ectópica de ciertos fenotipos restringidos a tejidos, la existencia de patrones anormales de dispersión de luz y,

la existencia de una proporción aumentada de células inmaduras con patrones de maduración anormales. (Orfao 2000) La aplicabilidad del inmunofenotipo en la detección de Enfermedad Mínima Residual se fundamenta no sólo en la existencia de fenotipos anormales, sino en la frecuencia de éstos en una muestra biológica. En la literatura existe distribución de niveles de variabilidad en la incidencia de fenotipos asociados a leucemia. Esas discrepancias obedecen a fallas técnicas tales como el uso de diferentes conjugados de fluorocromos, clones de anticuerpos monoclonales, combinaciones de reactivos de múltiples tinciones, también como diferentes protocolos de preparación de muestras y diferentes muestras control. En general, a pesar de las diferencias, se ha demostrado una mejor discriminación de células por la técnica de citometría de flujo, y se ha mejorado el acceso a la técnica para el uso clínico. (Orfao 2000) La incidencia de fenotipos asociados a leucemia varía en cada uno de los subtipos de enfermedad, pero en general es de alta frecuencia que muestra utilidad diagnóstica. Una aproximación a estas proporciones se muestra en la tabla. Tabla 1.10 Aberraciones fenotípicas de mayor utilidad en detección de EMR

Tipo de aberración LLA-B (%)

LLA-T (%)

LMA (%) LLC-B (%)

MM (%)

Expresión cruzada de antígenos 75 60 27 - -

Expresión asincrónica de antígenos 39 38 80 86 49

Sobreexpresión de antígenos 35 - 9 32 74

Fenotipos ectópicos - 70 30 - - Dispersión anormal de luz - - 28 - 60 Total (al menos una aberración) 85 100 88 95 87

LLA, Leucemia Linfoblástica Aguda; LMA, Leucemia Mieloide Aguda; LLC, Leucemia Linfocítica Crónica; MM, Mieloma Múltiple Tomado de Orfao 2000 1.5.3.1 Expresión cruzada de antígenos. La presencia de varios antígenos leucocitarios ha sido asociada con líneas hematopoyéticas celulares específicas que pueden estar presentes o ausentes con muy bajas frecuencias y/o intensidades en otras células. Desde los primeros diseños de paneles de anticuerpos conjugados con fluorocromos, hace mucho tiempo, se demostró la expresión de antígenos leucocitarios en células tumorales de líneas no relacionadas. El conocimiento actual ha demostrado la expresión de antígenos mieloides CD13 y CD33 en linfocitos B CD19, que puede ser normal, pero a niveles muy bajos (<10-3). El estudio de estos antígenos en células leucémicas ha

demostrado variabilidad; en el caso de las leucemias linfoblásticas se ha detectado presencia de CD13 y CD33 con proporción de 7-54%, y en el caso de las leucemias mieloides la presencia de CD7 entre 4-60%. Esta variabilidad puede estar relacionada con modificaciones de la técnica entre los investigadores. Estudios recientes han demostrado la presencia de estos antígenos, usando fluorocromos de alta sensibilidad, en LLA-B (63%) y LLA-T (56%), coexpresando CD13 y CD33, hallazgo que se mantenía en las muestras recolectadas luego de la remisión morfológica en células tumorales residuales. (Orfao 2000) En los trastornos linfoproliferativos crónicos la correlación con antígenos aberrantes es menor, pero en casos de LLC-B se ha determinado la presencia de CD14, CD13 y CD15 en proporciones entre 15-23%, y en casos de mieloma múltiple las células tumorales expresan CD13 (28%) y CD33 (24%). (Orfao 2000) Otros antígenos útiles son CD65, CD66c, CD21 que sumados a CD19/CD34/CD10 ofrecen aplicabilidad en detección del orden de 4%, 31% y 6%, respectivamente. (Campana 2004) 1.5.3.2 Expresión asincrónica de antígenos. En la maduración hematopoyética normal, la expresión de antígenos está finamente regulada de tal forma que la expresión de antígenos está precedida por la regulación a la baja de otros, con lo que determinados antígenos se hacen específicos de cada estado de maduración. Igualmente, la secuencia de expresión y silenciamiento de antígenos está establecida para cada línea celular. El estudio con múltiples marcadores antigénicos de específicos de diferentes estadios de diferenciación, permitió establecer que las células leucémicas expresan antígenos asincrónicamente. Para reconocer estos patrones es esencial el conocimiento de la secuencia de expresión de antígenos durante la diferenciación normal y el uso de marcadores de alta sensibilidad. Estudios previos habían demostrado la coexpresión anormal de CD34 y CD22 en linfocitos B, puesto que este último se expresa tarde en la maduración; sin embargo, estudios recientes con marcadores más sensibles ha demostrado la coexpresión en células tempranas CD34/CD19, de CD22 de superficie. (Orfao 2000) La expresión asincrónica de antígenos es uno de los fenotipos aberrantes asociados a leucemia más comúnmente detectado encontrándose hasta el 80% en LMA y 30% en LLA, también en LLC (85%) y mieloma múltiple (62%). (Orfao 2000) 1.5.3.3 Sobreexpresión de antígenos. Es un hallazgo poco común la presencia de antígenos, que aunque presentes en células normales, se expresan en niveles inusitadamente altos, fenómeno conocido como sobreexpresión de antígenos. El ejemplo más claro de este fenómeno es en LLA-B con CD10 reportado hasta en el 39% de los casos. Otros antígenos han sido también reconocidos en sobreexpresión como son CD34 en LLA (5%), y en LMA CD34 (2%), HLA-DR

(2%), CD33 (2%), y CD117 (1%). En general la sobreexpresión de antígenos se manifiesta en el 35% de las LLA-B y en el 10% de las LMA. En mieloma múltiple se ha reportado sobreexpresión de CD56 (62%) y CD28 (16%). En LLC no se ha reconocido tan claro el fenómeno, encontrando sólo el 1% de sobreexpresión de CD5, pero de escasa utilidad en EMR puesto que las células normales también pueden sobreexpresar este antígeno. (Orfao 2000) 1.5.3.4 Fenotipos ectópicos. La presencia de células hematopoyéticas inmaduras fuera de la médula ósea se considera indicativo de leucemia. Esta observación ha sido útil en el estudio de recurrencia en sistema nervioso central al buscar en LLA células TdT+ en muestras de LCR. Igualmente, la detección de células inmaduras tímicas en médula ósea es indicativa de EMR de LLA-T (90%). De manera similar, la presencia en sangre periférica de células B CD10+ ó CD22 débiles representa fenotipos ectópicos en LLC. (Orfao 2000) 1.5.3.5 Patrones anormales de dispersión de luz. La Citometría de Flujo es una técnica que combina las propiedades de medición de fluorescencia y de dispersión de luz. Esta propiedad se establece en ángulos bajos (dispersión de luz frontal ó FSC) y ángulos de 90° (dispersión de luz lateral). La primera, FSC, se correlaciona con el tamaño e índice de refractariedad, y la segunda, SSC, con la homogeneidad relativa de los componentes celulares que reflejan la luz láser tales como gránulos citoplásmicos y membranas celulares. Junto con los cambios fenotípicos, también existe un SSC/FSC específico de cada estado de maduración. Se ha reportado que las células leucémicas y de mieloma múltiple muestran patrones de dispersión de luz alterada que puede ser útil para identificarlas. Sin embargo, no existen estudios que hayan demostrado con poder estadístico el valor de esta alteración excepto en LMA (32%). (Orfao 2000) 1.5.3.6 Vías anormales de maduración. La citometría de flujo de multiparámetros crea un espacio multidimensional en que las células normales muestran una posición estable. En médula ósea se genera una vía de maduración en la cual se mueven las células en diferentes estadios. Con presencia de células leucémicas en médula se presenta una alteración en esta vía de maduración con presencia de células en áreas “vacías” o incremento de celularidad en un estadio. Este punto se relaciona con el hallazgo de EMR en LMA en casos de incremento en la razón precursores CD34 mieloides/linfoides. (Orfao 2000) 1.5.4 Cambios fenotípicos. Acorde a lo expuesto, la detección de EMR se relaciona con la determinación de fenotipos anormales en muestra de médula ósea en remisión morfológica detectados al diagnóstico, pero estos suelen cambiar. Sin embargo, la mayoría de estos cambios se relacionan con antígenos asociados a diferenciación, mientras que los fenotipos aberrantes cambian con menor frecuencia (LMA 16% y LLA 18%). Se ha detectado en estudios previos que al presentarse aberraciones fenotípicas, al menos una de ellas permanecerá sin cambios, por lo que todas las aberraciones detectadas al diagnóstico deben ser

estudiadas para determinar EMR, evitando de esta forma los falsos negativos. (Orfao 2000) En el momento del diagnóstico, pueden existir diversas modificaciones fenotípicas en grupos minoritarios, los cuales han demostrado ser responsables de la recurrencia y de ese modo mostrar los cambios fenotípicos cuando no se han tenido en cuenta los fenotipos minoritarios. La presencia de variados fenotipos se ha demostrado en LMA (80%), LLA-T (41%), LLA-B (24%), y en menor proporción en LLC. Además, un tercio de las alteraciones fenotípicas en LLA estuvieron relacionadas con variaciones técnicas y de reactivos, al diagnóstico y posteriormente. Por tanto, al elegir el fenotipo de seguimiento es fundamental no sólo tener en cuenta el clon predominante, sino las subpoblaciones relacionadas. (Orfao 2000, Campana 1999) Por otra parte, ciertos cambios fenotípicos no pueden ser detectados por métodos inmunocitométricos en el estudio de enfermedad residual ni pueden ser predecidos al momento del diagnóstico. Esta limitación puede ser superada por métodos moleculares de detección de rearreglos de IgH por PCR que pueden predecir precozmente la aparición de recurrencias. (Campana 1999) 1.5.5 Sensibilidad del inmunofenotipo por citometría para la detección de Enfermedad Mínima Residual. Ya se reconoce la utilidad en investigación de la citometría de flujo para la detección de EMR, pero se requiere definir su utilidad clínica donde los niveles de células anormales son inferiores al orden de 10-3, entre poblaciones de células normales. Ya la citometría había demostrado su utilidad en detectar poblaciones minoritarias en estudios de precursores CD34 pre-trasplante en médula ósea y sangre periférica, así como detectando células minoritarias como mastocitos y células dendríticas. Los resultados de discriminación en detección de EMR han sido obtenidos de estudios dilucionales, donde se demostró sensibilidades de detección de niveles hasta 10-6 células. Sin embargo, se estableció que los niveles de detección dependen de las aberrancias y los fluorocromos empleados en el estudio, y se determinó un rango de detección entre 10-3 y 10-6. (Orfao 2000) 1.5.6 Valor clínico del inmunofenotipo en la investigación de Enfermedad Mínima Residual. A la fecha se han realizado variados estudios para determinar el valor clínico de la determinación de Enfermedad Mínima Residual principalmente para LLA y LMA, no así para LLC y mieloma, usando el inmunofenotipo para establecer la predicción de recurrencia. Los estudios iniciales usando microscopía de fluorescencia con dos marcaciones fueron útiles para demostrar la presencia del incremento en la expresión de fenotipos aberrantes como predictores de recurrencia, y que su ausencia indicaban la persistencia en remisión morfológica. Los estudios con citometría de flujo han sido útiles para demostrar las mismas características, inicialmente los niveles de 0.2% se correlacionaron con recurrencia en LMA, y se demostró también su utilidad en LLA tanto en niños como en adultos. Igualmente, se ha correlacionado la probabilidad de recurrencia con los niveles de células con fenotipo aberrante a determinados puntos de la terapia de la enfermedad como el final de la inducción, mantenimiento y al salir del

tratamiento. En ese sentido, algunos estudios han demostrado una mayor incidencia de recurrencia con niveles mayores a 0,5% de células anormales al final de la inducción y mayor de 0,2% después de la intensificación; la persistencia de niveles de enfermedad mínima residual se considera factor pronóstico independiente para período libre de enfermedad y recurrencia. Los estudios realizados a finales de los noventa, permitieron establecer que niveles de células neoplásicas residuales mayores de 0,1% eran predictoras de recurrencia. Si bien, la técnica es útil para seguimiento requiere de personal altamente entrenado en la determinación de los fenotipos aberrantes, uso de amplios paneles de anticuerpos monoclonales, además de contar con una muestra al momento del diagnóstico. Otros enfoques han sido propuesto para tratar de reducir el impacto de la carencia de los factores anteriores, y ha buscado reconocer alteraciones en la maduración (“espacios vacíos”) de muestras en momentos diferentes al diagnóstico, así como alteraciones de la relación precursores CD34 mieloides/linfoides en LMA, y, además, el incremento en células CD34/CD19 ó CD34/CD22/CD20 en período posterior a la finalización de la inducción. En los últimos años se ha buscado reconocer marcadores de persistencia de células leucémicas por métodos diferentes a los actuales que permitan hacer seguimiento, aun sin poseer muestras al momento de diagnóstico. (Orfao 2000) 1.6 DETERMINACIÓN DE PLOIDIA POR CITOMETRÍA DE FLUJO Ya desde años atrás se ha considerado de utilidad pronóstica la medición de contenido de DNA en células leucémicas y se estableció como de buen pronóstico los índices de ploidía entre 1.16 y 1.6. (Brunning 2001) Esta estrategia de trabajo se utiliza extensamente en gran cantidad de laboratorios como herramienta de diagnóstico y es de alta reproducibilidad empleando metodologías de citometría de flujo. Otras técnicas han sido también empleadas pero con mayor dificultad en su ejecución y sin brindar la información con la precisión que lo hace la citometría. 1.6.1 Descripción de la técnica. El propósito del análisis de DNA es establecer el contenido de DNA (nivel de ploidía) en una población de interés y su tasa de crecimiento (el número de células en cada fase del ciclo celular). El ciclo celular es determinado por la presencia de células 2N (G0 y G1), mezcla de células 2N y 2N+ (S), y células 4N (G2 y M). El análisis de DNA se realiza comparando la distribución FSC contra la fluorescencia del marcador de DNA en la gráfica de 2 ejes y estableciendo los comportamientos modales de la distribución. La ploidía se establece comparando los picos relativos G0/G1 de la muestra frente al pico de las células diploides. Cuando las muestra es aneuploide se logran definir dos picos en el trazado, pero esa capacidad de discriminación depende del número de células y el CV del análisis de DNA. A menor número de células aneuploides se requiere de un CV más preciso para lograr discriminar correctamente las poblaciones. Del mismo modo, cuando la población aneuploide es muy pequeña respecto a una

gran población diploide, resulta útil emplear otros marcadores fenotípicos que permitan definir con más precisión los grupos de interés para el análisis. Emplear antígenos como TdT, CD10, u otros de precursores o específicos del clon maligno, permite identificar con claridad las células malignas y realizar el análisis sobre este subgrupo y no sobre toda la población. (Nguyen 2003) En LLA, establecer un índice de ploidía mayor de 1.16, que corresponde con un cariotipo de 53 ó más cromosomas, se asocia con remisión prolongada. Sin embargo, aunque el estudio de contenido de DNA por citometría de flujo resulta preciso y equiparable generalmente con los estudios citogéneticos, pequeñas deleciones o traslocaciones balanceadas que resultan en pseudodiploidías no son detectables por la primera técnica. (Nguyen 2003) El análisis de contenido de DNA por citometría de flujo requiere de la descomposición del histograma en compartimentos G0/G1, S y G2/M. Resulta técnicamente difícil separa con claridad las células en fase S temprana de su predecesora, así como las de fase S tardía con sus fases subsiguientes; sin embargo, la utilización de software especializado ha permitido conocer con claridad las distribuciones y realizar los cálculos de poblaciones como razones. Cuando el análisis parece más sencillo con una fase S claramente definida y escasos debris, una estrategia de análisis en rectángulo es suficiente. Sin embargo, debido a que las muestras analizadas poseen un gran número de células normales, este grupo de células debe ser sustraído del total, y esto se puede lograr marcando las células tumorales con anticuerpos para otros antígenos, o seleccionándolas por sus características de dispersión de luz, o realizando estudios de inmunohistoquímica sobre la muestra para establecer índices de proliferación (PCNA, Ki67). (Nguyen 2003) 1.6.2 Estudios realizados. Pérez-Vera y su grupo de trabajo en México realizaron un estudio donde comparó la utilidad de las técnicas citogenéticas convencionales en detección de aneuploidías con el análisis del contenido de DNA por citometría de flujo, usando FISH para resolver las inconsistencias, con lo que logró establecer niveles de concordancia del 86% y usó este índice como predictor de recurrencia. (Pérez-Vera 2004) Un estudio previo de Finn había demostrado la utilidad del análisis del contenido de DNA por citometría de flujo en el diagnóstico de leucemia linfoblástica y, al compararlo con la inmunofenotipificación por citometría de flujo, alcanzaba niveles útiles de concordancia hasta del 99% con promedio de 68%. La sensibilidad, especificidad y valores predictivos positivos y negativos se calcularon como 53%, 84%, 78% y 63%, respectivamente. (Finn 2004) Recientemente Zwick publicó un estudio donde comparó la utilidad del estudio de inmunofenotipo por citometría de flujo con la determinación de la ploidía por citometría de flujo e incluso la hibridación in situ fluorescente, logrando niveles de

concordancia del 81%, principalmente debido a los cambios fenotípicos asociados a leucemia y la baja sensibilidad de las técnicas moleculares empleadas. (Zwick 2006)

2. JUSTIFICACIÓN Desde hace más de 15 años se ha difundido el uso de la inmunofenotipificación para el diagnóstico de neoplasias hematolinfoides, y se ha estimulado el empleo de la técnica en la detección de enfermedad mínima residual como una forma de establecer pronóstico y definir el riesgo de recurrencia en cada paciente. Sin embargo, a pesar de la difusión de dicha metodología en nuestro medio, se ha adolecido por la carencia de estudios propios que permitan definir si los criterios de riesgo definidos en otras latitudes del mundo son igualmente válidos para nuestros pacientes. Por otra parte, en el país se cuenta con instituciones de salud de alta complejidad que trabajan en cooperación para el diagnóstico y seguimiento de neoplasias hematolinfoides. Especial interés despierta el convenio Fundación Santa Fe de Bogotá – Fundación HOMI Hospital La Misericordia en Bogotá. La primera institución, centro de referencia nacional en diagnóstico de enfermedades hematolinfoides, cuenta con un staff de patólogos con formación en hematopatología y citometría de flujo, que ha permitido la adecuación de técnicas diagnósticas que han sido aplicadas en el diagnóstico y seguimiento de pacientes desde hace más de 5 años, a través de las cuales se establecieron niveles de enfermedad mínima residual acorde a los criterios publicados por varios centros, con especial referencia a los trabajos del doctor Alberto Orfao y colaboradores de la Universidad de Salamanca. La segunda institución, es un centro de referencia distrital y regional en diagnóstico y tratamiento de cáncer en niños, con un grupo de oncohematología pediátrica en continuo perfeccionamiento y con seguimiento de criterios terapéuticos claros fortalecido por un programa de postgrado en dicha área. Unidas las dos instituciones, garantizan un flujo de trabajo y un ejercicio diagnóstico, pronóstico y terapéutico que genera confianza en la comunidad médica y la población general. Hace un par de años se inició la ejecución de un trabajo de investigación que busca reconocer la correlación entre los desenlaces y la detección de Enfermedad Mínima Residual y se encuentra actualmente en ejecución entre estas dos instituciones (Chaparro, 2005). Dicho trabajo tiene una cohorte de pacientes que se incrementa cada año, y no precisa en sus objetivos el análisis de la citometría como tal, su desempeño analítico y su capacidad diagnóstica, sino que evalúa los criterios clínicos de desenlace y los analiza a la luz de la detección de EMR como única información de la citometría de flujo. Sobre esta información de inmunofenotipo se construye este trabajo para precisar los perfiles epidemiológicos del inmunofenotipo de leucemia linfoblástica aguda e identificar los principales cambios en inmunotipificación en el seguimiento de los pacientes con LLA. Esta información también ayudará a optimizar el estudio de citometría de

flujo en el laboratorio y comprender mejor los cambios fenotípicos surgidos en los blastos leucémicos como respuesta al tratamiento y la historia natural de la enfermedad.

3. OBJETIVOS 3.1 OBJETIVO GENERAL Determinar los perfiles inmunofenotípicos por citometría de flujo de leucemia linfoblástica aguda en niños y su valor en la detección de enfermedad mínima residual. 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 1. Establecer el perfil inmunofenotípico de las leucemias linfoblásticas agudas en

niños de la Fundación HOMI Hospital La Misericordia durante los años 2005 a 2009 y correlacionarlos con eventos adversos (leucemia persistente y recaída hematológica).

2. Determinar los niveles de detección de Enfermedad Mínima Residual por citometría de flujo de muestras de médula ósea en niños con Leucemia Linfoblástica Aguda en la Fundación HOMI Hospital La Misericordia.

3. Identificar los parámetros de aproximación diagnóstica del estudio de Enfermedad Mínima Residual por citometría de flujo de mayor utilidad en el diagnóstico y seguimiento de niños con Leucemia Linfoblástica Aguda de la Fundación HOMI Hospital La Misericordia.

4. Definir la concordancia interobservador y la reproducibilidad del estudio de inmunofenotipo por citometría de flujo para identificar blastos residuales en estudios de médula ósea.

4. MATERIALES En este capítulo se incluye todos los parámetros técnicos tenidos en cuenta para el diseño y ejecución de este trabajo. Cabe recordar que en todos los apartes siguientes se habla de niños, sin embargo, el estudio no tiene injerencia directa sobre los pacientes sino sobre los archivos electrónicos del laboratorio de hematopatología. 4.1 DISEÑO El presente es un estudio observacional, analítico, de corte longitudinal, bidireccional (retrospectivo predominantemente), sobre una cohorte de base hospitalaria monocéntrica. 4.2 UNIVERSO Niños con diagnóstico de Leucemia Linfoblástica Aguda con inmunofenotipo por citometría de flujo de aspirados de médula ósea realizados en el Departamento de Patología y Laboratorios de la Fundación Santa Fe de Bogotá. 4.3 MUESTRA Niños con Leucemia Linfoblástica Aguda atendidos en la Fundación HOMI Hospital La Misericordia durante los años 2005 a 2009 con inmunofenotipos por citometría de flujo realizados en el Laboratorio de Patología de la Fundación Santa Fe de Bogotá con estudios de seguimiento realizados en el mismo laboratorio. 4.4 SELECCIÓN DE CASOS Se revisa los inmunofenotipos por citometría de flujo de LLA en niños identificados en la base de datos del laboratorio de Patología de la Fundación Santa Fe de Bogotá identificados como sitio de procedencia Fundación HOMI Hospital La Misericordia. Se busca los casos que tuvieran estudios de seguimiento. 4.5 CRITERIOS DE INCLUSIÓN Niños de ambos sexos con diagnóstico de Leucemia Linfoblástica Aguda cuyo aspirado de médula ósea inicial fue estudiado en el Laboratorio de Patología de la Fundación Santa Fe de Bogotá desde el año 2005 a 2009 con realización de inmunofenotipificación por Citometría de Flujo, con posteriores estudios de aspirado de médula ósea para detección de Enfermedad Mínima Residual por inmunofenotipo en Citometría de Flujo, con tratamiento realizado en la Fundación HOMI Hospital La Misericordia con terapia ajustada al riesgo.

4.6 CRITERIOS DE EXCLUSIÓN Pacientes con estudios de seguimiento sin inmunofenotipo inicial. 4.7 SEGUIMIENTO DE PACIENTES Se determina por los estudios de médula ósea enviados periódicamente al Laboratorio de Patología de la Fundación Santa Fe de Bogotá desde la Fundación HOMI Hospital La Misericordia. 4.8 RESULTADOS PRIMARIOS Se establece como resultado primario la presencia de Enfermedad Residual durante el seguimiento (nivel de blastos en médula ósea <5%) o niveles de blastos en médula ósea detectados por citometría de flujo mayor o igual a 5% en estudios de seguimiento posteriores al período de inducción. Se debe establecer con claridad el tiempo transcurrido desde el diagnóstico a la presentación del evento. 4.9 RESULTADOS SECUNDARIOS Y SUBROGADOS Se considera resultados secundarios los cambios fenotípicos presentados durante el seguimiento y las modificaciones en la expresión de antígenos detectados por citometría de flujo. 4.10 ANÁLISIS ESTADÍSTICO Los datos obtenidos del seguimiento de los pacientes son almacenados en bases de datos diseñadas sobre plataformas Excel y se genera tablas para cada una de las variables de análisis. Los desenlaces adversos se definen con base en análisis de Kaplan-Meier. Los resultados obtenidos se cruzan para establecer relaciones entre las diferentes variables y se trata de identificar el peso de cada variable en los desenlaces. Los análisis incluyen tratamiento estadístico para significación estableciendo p<0,05. Se emplean las pruebas de Cox, ji cuadrado, T de Student, regresiones logísticas, entre otras, donde sea más adecuado acorde a los resultados obtenidos. Se emplean paquetes estadísticos apropiados para la finalidad. Para dicho análisis se cuenta con la colaboración de MSc epidemiólogo clínico PhD candidato en Salud Pública área de investigación epidemiología. 4.11 FUENTES DE ERROR PREDECIBLES Como es conocido, la realización de estudios retrospectivos limita los resultados debido a la carencia de algunos datos por la toma de ciertos registros de historia clínica. Esto condiciona que cierta cantidad de resultados va a carecer de información para ciertas variables y limitará de igual forma el análisis estadístico y el establecimiento de diferencias. Sin embargo, dado el número significativo de

pacientes que se encuentra en este período, es probable que el efecto de dicha carencia de información se diluya con registros completos de muchos pacientes. 4.12 DIFUSIÓN DE RESULTADOS Los resultados obtenidos del presente estudio se publican en revistas científicas de circulación nacional e internacional de impacto en las áreas de medicina y patología, así como en un congreso de patología de impacto internacional (USCAP Annual Meeting 2010).

5. MÉTODOS En el presente capítulo se consigna la metodología estandarizada que se emplea en cada uno de los procesos diagnósticos y pronósticos pertinentes al estudio. Dado que el estudio es en esencia retrospectivo, dichos procedimientos corresponden a las metodologías aceptadas y empleadas durante años por las instituciones donde se realiza el estudio, por lo que, al ser documentos confidenciales, no son pormenorizados sino considerados en una forma muy global. 5.1 MÉTODOS DIAGNÓSTICOS Los métodos diagnósticos incluyen los procedimientos empleados para hacer el acercamiento preliminar ante la sospecha clínica de Leucemia Linfoblástica Aguda en niños. Las características clínicas, los estudios de laboratorio básicos y la terapéutica inicial sintomática se incluyen dentro de este aparte. De la misma forma, el manejo de los estudios de médula ósea, ganglio o sangre periférica realizados para alcanzar el diagnóstico definitivo se anotan dentro del protocolo diagnóstico. 5.1.1 Diagnóstico Clínico de Leucemia Linfoblástica Aguda en niños. Las neoplasias hematolinfoides son diagnosticadas con base en las alteraciones clínicas que presentan los niños y son enumeradas en el primer capítulo de este trabajo. Usualmente, el médico general o pediatra que conoce inicialmente el caso ordena una serie de paraclínicos donde logra demostrar alteraciones en el cuadro hemático que es la alteración más llamativa en la mayoría de los casos. Los casos sospechosos son analizados por el oncohematólogo pediatra y añade a la batería de paraclínicos otros estudios que incluyen biopsia de médula ósea, estudio de líquido cefalorraquídeo, pruebas de función hepática y renal, así como otras pruebas diseñadas para predecir el comportamiento del paciente frente a la terapéutica, pero en este punto se desconoce la respuesta de la enfermedad a la terapéutica y usualmente se predice con base en los datos clínicos y paraclínicos que se propusieron en el primer capítulo. 5.1.2 Diagnóstico Hematopatológico de Leucemia Linfoblástica Aguda en niños. Ante la sospecha clínica de Leucemia Linfoblástica Aguda en niños, el estudio necesario para definir el diagnóstico es aspirado/biopsia de médula ósea; sin embargo, los estudios de sangre periférica y lesión sólida (ganglionar o mediastínica) puede ofrecer información útil cuando son realizables. Al completarse los estudios clínicos y paraclínicos básicos anotados en el aparte anterior, es fundamental para tener certeza diagnóstica la realización de análisis morfológicos por parte de patólogos expertos en muestras de médula ósea, sangre periférica, masas presentes y líquido cefalorraquídeo.

Antes del procedimiento, el niño es valorado por anestesiólogo quien define el riesgo quirúrgico y se establece la fecha del procedimiento y los requerimientos especiales para el mismo. Se busca tomar todas las biopsias necesarias durante el mismo acto quirúrgico (médula ósea y masas) y recolectar el líquido cefalorraquídeo. La toma de las muestras es realizada por el oncohematólogo pediatra a cargo del caso, y de ser necesaria toma de biopsias de masas cuenta con la colaboración del cirujano pediatra. Se dispone del equipo necesario para toma de biopsias. Para estudios de médula ósea se requiere de trocar óseo para muestras de biopsias con diámetro interno promedio de 1-2 mm y se selecciona el área de la punción. El sitio favorito es la espina iliaca posterosuperior, pero puede usarse la espinas iliacas anteriores, esternón, u otra área que se considere adecuada por la persona que realiza el procedimiento. Las biopsias de masas se realizan por punción con aguja tru-cut o por biopsia abierta, lo que incrementa los riesgos de infección posterior al procedimiento. Siempre se busca obtener material adecuado para estudio histopatológico, así como, material para análisis de inmunofenotipo por citometría de flujo, y en casos necesarios otros estudios moleculares (cariotipo, determinación de rearreglos génicos, etc.). La obtención del líquido cefalorraquídeo se logra por punción estándar entre L4-L5, preferiblemente, y se prepara para estudio de inmunofenotipo (búsqueda de linfoblastos neoplásicos). Las muestras obtenidas por estos procedimientos se embalan adecuadamente en frascos de boca ancha o tubos de ensayo con preservantes adecuados acorde a la muestra y el estudio a realizar: • Tubo vacutainer con EDTA (también se puede emplear heparina): sangre

periférica o médula ósea para estudio de inmunofenotipo. Es importante anotar que se requiere realizar improntas de las muestras en el sitio de la toma debido a la alteración morfológica que produce el preservante sobre las células problema. Estos tubos son también útiles para análisis moleculares pero se pueden usar también tubos secos para tal fin.

• Tubo seco: líquido cefalorraquídeo útil para cualquier análisis (citoquímico, inmunofenotipo, bacteriológico, etc.).

• Frasco con formol tamponado: biopsia de médula ósea o masa para análisis de microscopia de luz (hematoxilina y eosina y tinciones especiales). Importante tomar improntas y hacer extendidos antes de sumergirlo en el preservante-fijador.

• Frasco con fijador B5: biopsia de médula ósea o masa para análisis de microscopia de luz (sólo hematoxilina y eosina). Este fijador mejora el detalle morfológico especialmente definiendo núcleos.

• Frasco con solución salina: biopsia de masas para estudios de inmunofenotipo o estudios moleculares. De estas muestras se pueden obtener adecuadas improntas y extendidos en el laboratorio, pero tienen un período útil muy corto.

El transporte de las muestras se hace por mensajería especializada contratada por las instituciones para garantizar el adecuado manejo de los especímenes en lo concerniente a condiciones de transporte y tiempos de entrega. De esta forma se minimiza el riesgo de pérdida, deterioro o mezcla de muestras y se garantiza la viabilidad de las células en el momento del montaje de las pruebas. Una vez las muestras son dispuestas en el laboratorio toman destinos diferentes. Los tubos son remitidos al laboratorio clínico, específicamente la sección de hematología y los frascos son trasladados a patología. Las improntas y extendidos, que usualmente acompañan a los tubos, son coloreados con tinción hematológica (Diff Quick®) y analizados por la bacterióloga entrenada en hematología especial con el fin de obtener los conteos diferenciales a 100 células (sangre periférica) ó 300 células (médula ósea). Completado este análisis, las láminas y sus respectivos conteos son trasladadas a patología para que el hematopatólogo las examine y determine los paneles de anticuerpos necesarios para el estudio de inmunofenotipo. Los tubos son trasladados directamente a la sección de inmunoquímica para la preparación de las células para el montaje de la técnica de inmunofenotipo. Cuando el patólogo determina el panel más adecuado para el caso en estudio le informa a la bacterióloga encargada del citómetro de flujo para que proceda al montaje. La bacterióloga realiza una serie de lavados de las células para reducir las impurezas y mejorar la exposición antigénica en la superficie celular y procede a incubar las células con los fluoromarcadores. La adquisición inicial se realiza sobre 30000 eventos. De dicho montaje se obtiene un reporte preliminar el cual es impreso y remitido al patólogo para análisis inicial. El patólogo completa el análisis ya sea en la versión impresa o directamente en el programa del citómetro de flujo y determina la necesidad de fluoromarcadores adicionales, los cuales se completan lo más pronto posible y se realiza el análisis final por parte del patólogo. El informe se libera con los resultados obtenidos y se reporta el marcador empleado, el porcentaje de células positivas (puede ser absoluto o relativo a una población específica) y la intensidad de fluoromarcación (débil, intermedia, fuerte y variable); se complementa con el conteo realizado por la bacterióloga de hematología y se genera un diagnóstico con base en criterios de la Organización Mundial de la Salud adaptados al laboratorio. Los frascos remitidos al laboratorio de patología son segregados acorde a la muestra y fijador. Las biopsias de médula ósea fijadas en formol y B5 son sometidas a decalcificación por efecto de ácido nítrico y posteriormente procesadas para embeberlos en parafina. Antes de teñirlos con hematoxilina y

eosina, los bloques obtenidos de muestras fijadas en B5 son sometidos a “dezenkerización”, es decir, eliminación de los residuos de cobre presentes en el B5. Las biopsias son teñidas con hematoxilina y eosina, y se preparan cortes adicionales de los bloques obtenidos de material fijado en formol para tinciones especiales (PAS, retículo y hierro) y niveles para inmunohistoquímica (si se consideran necesarios). Las biopsias de masas pueden venir fijadas en formol, B5 o solución salina. Si vienen en las dos primeras sustancias, se procesa similar a las biopsias de médula ósea, obviando el paso de decalcificación y no se realizan tinciones especiales, pero se guardan niveles para inmunohistoquímica. Las biopsias enviadas en solución salina se procesan para realizar improntas y extendidos que se fijan en alcohol y se tiñen con hematoxilina y eosina o se secan al aire y se tiñen con coloraciones hematológicas. Luego se separa material para inmunofenotipificación que se traslada inmediatamente a la sección de inmunoquímica. El material restante se fija con formol y B5, de haber suficiente muestra, y se realiza proceso estándar. Con base en las improntas y extendidos el patólogo determina el panel de fluoromarcadores a utilizar para el análisis de la muestra y le informa a la bacterióloga encargada del proceso. El proceso continua de la misma forma que con los aspirados para la generación de los reportes. Una vez completado el análisis, el resultado es liberado de la forma descrita anteriormente. Suele reconocerse o dejarse un perfil inmunofenotípico básico que será utilizado como marcador de seguimiento. Se archiva copia del reporte impreso y se guarda registro electrónico analizable con el software propio del equipo. 5.2 MÉTODOS TERAPÉUTICOS Antes de iniciar la terapéutica de los pacientes es esencial establecer el riesgo biológico de la lesión tumoral definido por características clínicas, de laboratorio, y marcadores blásticos definidos por el inmunofenotipo y la biopsia. Con estos datos se prepara un régimen terapéutico acorde a las necesidades buscando alcanzar remisión temprana y mínima toxicidad. Usualmente para tal fin se utilizan las propuestas de trabajo diseñadas con base en estudios realizados en otras latitudes y los grupos que tienen la vanguardia en esta tarea son americanos (sobresale St. Jude en Memphis, TN) y la cooperación europea (BFM). No se pretende presentar dichos protocolos acá, simplemente mencionar que los protocolos ajustados y empleados en la Fundación HOMI Hospital La Misericordia, se ajustan a los estándares internacionales.

5.3 MÉTODOS DE SEGUIMIENTO Para establecer con claridad la respuesta terapéutica y la posibilidad de recurrencia es esencial hacer seguimiento de variables clínicas y paraclínicas de

los pacientes. Dichas mediciones se basan en conteos de blastos circulantes y en médula ósea, así como otros parámetros bioquímicos que expresan la reducción de células tumorales y el comportamiento del organismo del paciente a los agentes quimioterapéuticos. Una vez reconocida alguna alteración significativa a los resultados esperados en el menor se deben modificar las estrategias buscando reducir las células blásticas y minimizar la toxicidad. El seguimiento clínico se basa en el análisis de variables clínicas (estado de salud) y paraclínicos que incluyen hemograma, química sanguínea, pruebas de función renal y hepática, citoquímico de líquido cefalorraquídeo, enzimas séricas y aspirado/biopsia de médula ósea. La evaluación de médula ósea, o en algunos casos sangre periférica, para la detección de linfoblastos leucémicas residuales requiere de un proceso similar al realizado durante la etapa diagnóstica. La muestra se obtiene de las mismas fuentes y se maneja de la misma forma durante la fase preanalítica. La fase analítica presenta algunas modificaciones dado que no se da tanta importancia a los extendidos en lámina, sino que se revisa el reporte inicial, donde se estableció el perfil inmunofenotípico de seguimiento, y se realiza una preparación con dichos fluoromarcadores buscando establecer la presencia del mismo perfil en los blastos residuales y definiendo cuantitativamente la proporción de blastos leucémicos en la muestra. El montaje exige por lo menos 300000 eventos adquiridos para garantizar un mínimo de detección de 0.01%. El reporte se genera expresando los conteos diferenciales definidos en extendido y en inmunofenotipo y se guarda copia del reporte escrito y del registro electrónico para ser analizado en consultas posteriores. 5.4 MÉTODOS DE RECOLECCIÓN DE DATOS PARA EJECUCIÓN DEL TRABAJO DE INVESTIGACIÓN Se realizó una revisión exhaustiva de los archivos físicos y electrónicos de reportes de estudios de inmunofenotipo por Citometría de Flujo de muestras recibidas en el Laboratorio de Patología de la Fundación Santa Fe de Bogotá en el período comprendido entre el 2 de enero de 2005 y el 30 de junio de 2009, buscando los casos correspondientes a menores de 20 años. El registro completo de citometrías durante este período fueron 10219 informes dentro de los cuales se identificaron 2871 registros de menores de 20 años; de este último grupo se tomó información referente a número de identificación de la citometría de flujo, nombre, edad, género, procedencia (cuando estaba disponible), diagnóstico, conteo de blastos y presencia o ausencia de cada uno de los antígenos evaluados, así como el nombre del patólogo que había firmado el caso. Con esta información se construyó una base de datos en Microsoft Excel® versión 2003. Una vez completada la base de datos, se filtraron los datos buscando los casos de menores correspondientes a la Fundación HOMI Hospital La Misericordia. Al

identificarlos se procedió a marcar con color amarillo los registros agrupados y se eliminó el filtro inicial para ordenar los registros por nombre primero y luego por número de identificación, tratando de esta forma de encontrar todos los registros que fueron erróneamente ingresados bajo otra procedencia o simplemente no se ingresó ninguna información en esa casilla, con lo que se logró identificar en total 987 registros. Posteriormente, se buscó dentro de esta población los registros de niños con diagnóstico de Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA), reduciéndose a 810 el número de registros. Acá se incluyeron 530 registros correspondientes a 170 niños que tenían diagnóstico entre 2005 y 2009 y por lo menos un estudio de seguimiento. Se identificó un grupo de niños con desenlaces adversos (persistencia y recaída hematológica), los cuales fueron cotejados contra un listado de la Fundación HOMI Hospital La Misericordia. Sin embargo, no hay forma de garantizar que la totalidad de niños incluidos correspondan al total de niños atendidos en la Fundación HOMI Hospital La Misericordia durante ese período, ni que sean sólo niños de esta institución de salud y no de otros centros, debido a la gran cantidad de niños y que los registros están en construcción y por tanto incompletos. Hay que considerar además una cantidad importantes de niños perdidos durante el tratamiento, así como traslados y con otros problemas administrativos que limita también la precisión de los datos consignados. Sobre la muestra de 530 registros se realizó agrupamiento de tal forma que los casos de cada paciente quedaran incluidos bajo una misma denominación y se establecieron dos desenlaces paraclínicos de importancia: Desenlace adverso, definido como 5% o más de blastos identificados en inmunofenotipo por citometría de flujo en aspirados de médula ósea posteriores a la inducción, que incluían recaídas hematológicas y leucemia persistente y, presencia de Enfermedad Mínima Residual, definida como la detección de menos de 5% de blastos pero más de 1% (10-2), en estudios posteriores al diagnóstico, y posteriormente niveles de 0,1% (10-3) y 0,01% (10-4). A pesar de encontrarse algunos reportes con presencia de blastos entre 0,001% (10-5) o menos y 0,01% (10-4), no se creó una categoría específica para estos casos pues no estaban muy bien caracterizados en el reporte de la citometría y usualmente eran precedidos por la frase “probables blastos del…”. Este último grupo se dejó incluido con el grupo de 0,01% (10-4). De esta población se seleccionó un grupo de 38 niños diagnosticados entre 2008 y 2009 y de ellos se obtuvo el archivo electrónico de la citometría de flujo. En total fueron 82 registros que se analizaron con el software Infinicyt®. Se definieron los parámetros de aproximación diagnóstica y los niveles de blastos detectados en los estudios de seguimiento. Se estableció por último la concordancia interobservadores y la reproducibilidad de la estrategia diagnóstica.

6. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES Para la ejecución de este trabajo se cuenta con 4 años, que son los mismos de duración de la especialidad en Patología Anatómica y Clínica de la Universidad Nacional de Colombia, los cuales han sido divididos en trimestres para facilitar la planeación y evaluación de progresos de las tareas a ejecutar. Tabla 6.1 Cronograma (año 2006-2010)

AÑO I II III IV

TRIMESTRE 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Revisión de literatura X X X X

Diseño del trabajo

X X X X

Preparación BD FSFB

X X X X X X X

Prueba piloto X Ajustes X X Revisión de citometrías

X X

Consolidación de datos

X

Análisis de bases de datos

X

Preparación de publicación

X

7. CONSIDERACIONES ÉTICAS E IMPACTO AMBIENTAL Este proyecto busca identificar los perfiles inmunofenotípicos de los pacientes con Leucemia Linfoblástica Aguda y reconocer su valor en la detección de Enfermedad Mínima Residual. Igualmente, sumado a variables clínicas y otros exámenes paraclínicos, busca reconocer el riesgo de recurrencia y mortalidad por la enfermedad en niños de la Fundación HOMI Hospital La Misericordia de Bogotá de mano del trabajo en ejecución de EMR de la misma institución. La ejecución del presente trabajo está enmarcada dentro de lo dispuesto en la resolución 008430 de 1993 del Ministerio de Salud dado que está encaminada al reconocimiento de procesos biológicos de los seres humanos (artículo 4 literal a), el control de los problemas de salud (artículo 4 literal c) y al estudio de las técnicas y métodos recomendados o empleados en la prestación de servicios de salud (artículo 4 literal e). La evaluación a que son objeto los pacientes en este trabajo es meramente clínica verificando las manifestaciones de su enfermedad y a través de estudio paraclínicos definir otras variables de riesgo. Son sometidos a procedimientos aceptados por la comunidad científica y empleados durante muchos años en la práctica médica. No se exponen a riesgos innecesarios ni se tratan, en lo posible, modificar los tratamientos sustancialmente. Se cuenta siempre con la expresa colaboración de los pacientes y sus cuidadores con la comprensión y firma del consentimiento informado, cuando es posible (Título II Capítulo I). Este estudio es clasificado como de riesgo mayor que el mínimo debido a que las muestras de médula ósea sólo son obtenibles a través de aspirados, y estás quedan catalogadas en este grupo. Sin embargo, dichos aspirados son tomados como parte de la evaluación integral de su enfermedad y no se incrementa en número o frecuencia por la ejecución del presente trabajo, es decir, un paciente fuera del estudio está expuesto al mismo riesgo que un participante (artículo 11). El diseño, firma y cumplimiento del consentimiento informado está acorde a lo dispuesto en la norma (artículos 14, 15 y 16). El modelo de dicho consentimiento se encuentra anexo al protocolo del estudio de EMR de HOMI (Estupiñán, 2005). Sin embargo, debido a que este diseño es meramente retrospectivo, se considera que dicho consentimiento será obtenible sólo en escasos casos y en otros ya fue firmado para el estudio precedente. La Leucemia Linfoblástica Aguda es una condición de alta prevalencia en menores de edad y se han realizado previamente en otras latitudes estudios que han demostrado la utilidad de la técnica para la solución de problemas y el mínimo riesgo a que se exponen los pacientes en este tipo de investigaciones (Título II Capítulo III). De igual manera, se solicitará consentimiento en su participación de

los niños y en los casos donde sea posible se realizará valoración psicológica del menor (artículo 25). Este estudio fue presentado para su aprobación por parte del comité de ética tanto de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Colombia como de la Fundación HOMI Hospital La Misericordia y se cumplió con los parámetros señalados en la norma (Título III Capítulo I). Igualmente, se manejó las muestras teniendo presente las normas de bioseguridad y se dispondrá los desechos acorde a los manuales vigentes en el laboratorio de la Fundación Santa Fe de Bogotá.

8. PROPIEDAD INTELECTUAL La generación de conocimiento que se obtiene con este trabajo es para beneficio de la comunidad científica y a través de ésta, la comunidad general con elementos diagnósticos y de seguimiento, más sólidos y mejor estructurados. Los documentos que genere son propiedad de sus autores y de la institución para la cual estos desarrollan su quehacer académico que en este caso es la Universidad Nacional de Colombia. No se espera obtener desarrollo de nuevas herramientas de trabajo o la generación de innovaciones técnicas mayores. El objeto del trabajo es esencialmente la adaptación de procedimientos técnicos mundialmente aceptados para su utilización masiva en nuestro medio.

9. PRESUPUESTO Para la ejecución del trabajo se plantean varios rubros financieros que se especifican en las siguientes tablas. Tabla 9.1 Presupuesto global (en miles de $) ÍTEM TOTAL PERSONAL 0 EQUIPOS 2.500 SOFTWARE 0 MATERIALES 0 SALIDAS DE CAMPO 0 MATERIAL BIBLIOGRÁFICO 0 PUBLICACIONES Y PATENTES 3.000 SERVICIOS TÉCNICOS 4.500 VIAJES 00 CONSTRUCCIONES 0 MANTENIMIENTO 0

TOTAL 10.000 Tabla 9.2 Descripción de los equipos por adquirir (en miles de $)

EQUIPO JUSTIFICACIÓN TOTAL Monitor LCD Pantalla de 32” que facilite el análisis de citometría 2.500

TOTAL 2.500 Tabla 9.3 Servicios Técnicos (en miles de $)

TIPO DE SERVICIO JUSTIFICACIÓN TOTAL Asesoría epidemiológica Análisis de datos 4.500

TOTAL 4.500 Tabla 9.4 Publicaciones y Patentes (en miles de $)

ÍTEM JUSTIFICACIÓN TOTAL Preparación de artículo científico para revista

Publicación de resultados del estudio

500

Preparación de póster para congreso (incluye viaje)

Publicación de resultados del estudio

2.500

TOTAL 3.000

10. RESULTADOS 10.1 PERFILES INMUNOFENOTIPOS POR CITOMETRÍA DE FLUJO EN LEUCEMIA LINFOBLASTICA AGUDA EN NIÑOS Se identificaron 170 niños con diagnóstico de Leucemia Linfoblástica Aguda que tenían al menos una citometría de seguimiento, pero usualmente dos o más. La distribución de las variables disponibles se resume en la tabla 10.1. Tabla 10.1 Caracterización de niños con Leucemia Linfoblástica Aguda 2005-2009 (n=170)

Variable No. (%)

Sexo masculino 95 (55,88)

Edad (Media±Desviación estándar) 7,13 ± 4,54

Fenotipos

LLA prepreB 139 (81,76) 151

(88,81) LLA proB 9 (5,29)

LLA preB 3 (1,76)

LLA T intermedia 15 (8,38) 19

(11,19) LLA T temprano 3 (1,68)

LLA T tardío 1 (0,56)

Porcentaje de blastos (Media±Desviación estándar) 78,11 ± 23,99 Como se observa en la tabla 10.1, hubo una representación mayor en la muestra de varones con una razón niño a niña de 1,27:1. La edad promedio al diagnóstico fue de 7,13 años, con una desviación estándar de 4,54 años y un rango desde 10 días hasta 17 años. En relación con los fenotipos diagnósticos de Leucemia Linfoblástica Aguda se identificó una representación mayor de fenotipo B (81,76%) en relación con el fenotipo T (11,19%). Considerando sólo el linaje B, la distribución de frecuencias mostró que la Leucemia Linfoblástica Aguda de fenotipo B más frecuente es la prepreB o también denominada fenotipo común (92,05%), seguido por los fenotipos proB (5,96%) y preB (1,99%), estos últimos escasamente representados. En relación con el linaje T, la distribución obtenida de las frecuencias de diagnóstico de Leucemia Linfoblástica Aguda mostró predominio del fenotipo T

tímico cortical o intermedio (78,95%), seguido por los fenotipos T temprano (15,79%) y T tardío (5,26%). El porcentaje de blastos reportado al momento del diagnóstico tuvo una amplitud de rango considerable que se estableció desde 20% hasta 100%, con una media de 78%, pero con una desviación estándar de 24%. Posteriormente, se trató de establecer la frecuencia de los anticuerpos detectados en cada uno de los aspirados de médula ósea empleados para diagnóstico en la muestra de estudio. La tabla 10.2 resume la distribución de antígenos en cada uno de los fenotipos B anotados anteriormente, y la tabla 10.3 muestra la información correspondiente a los fenotipos T. Tabla 10.2 Distribución de antígenos en LLA de fenotipo B (n=151)

Fenotipo CD (Cluster of Differentiation) HLA -

DR IgMcyt 7 10 13 19 20 33 34 38 45

LLA proB 1 0 0 9 2 1 6 9 0 10 0 LLA prepreB 3 139 36 138 58 24 114 131 0 136 0 LLA preB 0 3 0 3 0 0 3 3 0 3 3 Panel empleado: CD7, CD10, CD13, CD19, CD20, CD33, CD34, CD38, CD45, HLA-DR, IgMcyt. En casos especiales se utilizó 7.1 (positivo en 2 casos de LLA proB), mieloperoxidasa (MPO), CD79a, CD22cyt, CD3 y TdT. Esta distribución muestra que existen antígenos expresados con alta frecuencia en fenotipo B como son CD10, CD19, CD34, CD38 y HLA-DR, antígenos frecuentemente ausentes o de expresión débil como CD7 y CD45 y otros de aparición ocasional como CD13, CD33 y CD20. Tabla 10.3 Distribución de antígenos en LLA de fenotipo T (n=19) Fenotipo

CD (Cluster of Differentiation) HLA-DR TdT MPO

1a 2 3sup 3cyt 4 5 7 8 10 13 19 33 34 38 45 LLA T temprano 0 1 2 3 0 1 3 0 1 1 0 0 3 3 3 1 1 0

LLA T intermedio 13 12 11 15 8 15 15 12 2 0 0 0 15 8* 15 0 10* 1

LLA T tardío 0 1 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 0 1 0

* No hay datos disponibles en la totalidad de casos. Todos los casos que tienen información para estos antígenos tienen expresión de los mismos. Panel empleado: CD1a, CD2, CD3sup, CD3cyt, CD4, CD5, CD7, CD8, CD10, CD13, CD19, CD20, CD33, CD34, CD38, CD45, HLA-DR, IgMcyt y TdT. Ocasionalmente se incluye CD79a y mieloperoxidasa (MPO). La distribución antigénica en LLA de fenotipo T muestra expresión bastante preservada de antígenos, con ocasional expresión aberrante (cruzada) de antígenos mieloides (CD13) y ausencia de antígenos B. CD1a es un antígeno que

indica diagnóstico de fenotipo T intermedio, por tanto su expresión exclusiva en este fenotipo. El fenotipo de Leucemia Linfoblástica Aguda de precursores B considerado anteriormente en la tabla 10.2, muestra que hay ciertos antígenos que se expresan frecuentemente en estas leucemias y son CD10, CD19, CD34, CD38 y HLA-DR y otros que están ausentes como CD7, CD13, CD33 y CD45. El fenotipo expresado en este párrafo se puede considerar desde el punto de vista estadístico como fenotipo frecuente o “usual”. Adicional a los antígenos antes mencionados, CD20 fue un antígeno de expresión variable presente en algo más que la tercera parte de ellas, por lo que por frecuencias no podría ser considerado completamente frecuente ni totalmente infrecuente; por tanto, se considerará como un antígeno aparte y se incluirá en el análisis de forma independiente. El fenotipo del linaje T plasmado en la tabla 10.3 se aparta un poco del fenotipo antes mencionado y en él la expresión de los antígenos CD2, CD3 de citoplasma, CD5, CD7, CD34, CD38, CD45, HLA-DR y TdT y la ausencia o infraexpresión de CD3 de superficie, CD10, CD13, CD19, CD20, CD33, IgM de citoplasma y mieloperoxidasa son el fenotipo frecuente. CD1a es marcador de LLA T intermedia, mientras que CD4 y CD8 están ausentes en LLA T temprana. Como se observa en la tabla 10.4 se incluye una categoría relacionada con CD10. Por un lado, incluye casos CD10 negativos en linaje B (excluyendo fenotipo proB en el cual es un hallazgo usual y distintivo) y por otra parte, casos CD10 positivos en linaje T, considerando lo presentado en la tabla 10.3 que 11 de 15 casos fueron CD10 negativos. Sin embargo, sólo se encontraron casos de este último grupo en los datos consignados. La expresión de IgM de citoplasma, la cual por definición es diagnóstica de fenotipo preB o Burkitt, se eliminó de la tabla y de la consideración de fenotipo infrecuente. Para antígenos que frecuentemente están expresados en las leucemias agudas como CD34, CD38 y HLA-DR y en linaje B como CD19, se consideró aberrante no sólo la ausencia del antígeno (positividad del antígeno presente en menos que el 10% de la población celular) sino una expresión disminuida en proporción (positividad del antígeno presente en menos que la mitad de la población celular positiva para los otros marcadores) o en intensidad (nivel logarítmico de expresión del antígeno menor que el usualmente observado), definiendo las anteriores alteraciones como ausencia parcial o infraexpresión, respectivamente. De acuerdo con esos resultados la definición de fenotipo infrecuente se consideró de la siguiente forma: expresión de CD13, CD33 y mieloperoxidasa y ausencia de CD34, CD38 y HLA-DR. Además de los antígenos antes mencionados, para linaje B se consideró infrecuente la expresión de CD7 y la ausencia o infraexpresión de CD19. Para fenotipo T se consideró, además, infrecuente la expresión de CD10. En total, se identificaron 85 niños con alguna alteración de las antes mencionadas, con lo que se hace notar que un mismo caso puede tener más de una alteración.

Tabla 10.4 Perfil de antígenos infrecuentes en Leucemia Linfoblástica Aguda de niños 2005-2009

Alteración Global No.(%) (n=170)

Linaje B No.(%) (n=151)

Linaje T No.(%) (n=19)

Expresión de CD7# 4 (2,36) 4 (2,65) - Ausencia/expresión de CD10* 4 (2,36) 0 4 (21,05) Expresión de CD13 37 (21,76) 36 (23,84) 1 (5,26) Ausencia/infraexpresión de CD19 1 (0,59) 1 (0,66) - Expresión de CD20° 60 (35,29) 60 (39,74) 0 Expresión de CD33 25 (14,70) 25 (16,56) 0 Ausencia/infraexpresión de CD34 28 (16,47) 28 (18,54) 0 Ausencia/infraexpresión de CD38 7 (3,91) 7 (4,64) 0 Ausencia/infraexpresión de HLA-DR 8 (4,71) 7 (4,64) 1 (5,26) Expresión de 7.1 2 (1,18) 2 (1,32) 0 Expresión de mieloperoxidasa 1 (0,59) 0 1 (5,26) # Expresión cruzada de CD7 en leucemias de linaje B. * Incluye casos con ausencia de CD10 en fenotipo B (diferentes a fenotipo proB, el cual es CD10 negativo, por definición) y con expresión de CD10 en casos con fenotipo T. ° No considerado para definición de fenotipo inusual. En estos pacientes se utilizó la expresión aberrante de antígenos para diseñar los tubos de fluoromarcadores que fueron empleados para el seguimiento, y se detectaron 25 casos con eventos adversos que incluían recaídas y persistencia. Sin embargo, no se pudo establecer la utilidad del fenotipo infrecuente o la aberrancia de antígenos en el seguimiento pues, en la mayoría de informes, sólo aparecía el nivel de blastos detectados y el tubo utilizado, pero no se especificaba la expresión de cada uno de los antígenos identificados. Este objetivo se revisará nuevamente en la parte final de los resultados cuando se analizan los parámetros de aproximación diagnóstica por citometría de flujo. Se evaluó la relación existente entre la aparición de fenotipo infrecuente al momento del diagnóstico y la presencia de eventos adversos posteriores a la inducción (enfermedad persistente y recaída). Con base en los hallazgos obtenidos de la base de datos relacionados con la aparición de más de 5% de blastos en estudios posteriores a la inducción, se definieron dos grupos: “con eventos” en la que los pacientes presentaron un porcentaje de blastos de 5% o más en alguno de sus estudios de seguimiento y otro “sin eventos”. Las características de los grupos se resumen en la tabla 10.5. De esta descripción simple presentada en la tabla 10.5 se observa una serie de tendencias no estadísticamente significativas que incluyen mayor riesgo de presencia de eventos adversos en varones, de edad ligeramente mayor, con fenotipo diagnóstico prepreB y T intermedio y de tipo infrecuente. Sin embargo,

cabe mencionar que estas características son las más frecuentes en el grupo de estudio y los resultados ser reflejo de esa frecuencia incrementada. Tabla 10.5 Caracterización de los pacientes con LLA 2005-2009 que presentaron eventos adversos

Variable Con eventos No.(%)

n=25 (14,7%) Sin eventos No.(%)

n=145 (75,3%) Valor

p

Sexo masculino 15 (60) 80 (55,17) 0,83

Edad (Media±desviación estándar) 8,06 ± 4,51 6,97 ± 4,54 0,27

Categorización fenotípica*

Fenotipo B frecuente 7 (28) 65 (44,83) 0,17

Fenotipo B infrecuente 15 (60) 64 (44,14)

Fenotipo T frecuente 2 (8) 11 (7,59) 0,54

Fenotipo T infrecuente 1 (4) 5 (3,45) * La totalidad de eventos se presentó en LLA prepreB (22) y LLA T intermedia (3). Valor p: prueba exacta de Fischer para variables categóricas y T de Student para las continuas. En relación con el fenotipo infrecuente, que es la intención de esta sección de los resultados, tratar de establecer su existencia y caracterizar los antígenos de mayor impacto en la aparición de eventos, es necesario reconocer mejor la distribución de las alteraciones tanto en el grupo de eventos como en su ausencia. La tabla 10.6 resume los hallazgos obtenidos del análisis. Como se observa en el análisis bivariado presentado en la tabla 10.6, sólo la ausencia, infraexpresión o expresión parcial de CD38 es un hallazgo estadísticamente significativo relacionado con la aparición de eventos adversos (recaída o persistencia). Otras alteraciones como ausencia, expresión parcial o infraexpresión de CD34 y HLA-DR, así como la expresión cruzada de CD33, marcador mieloide, tuvieron relación con la aparición de eventos con valores de p menores a 0,25. Como se cuenta con dos o más citometrías de los pacientes considerados en este grupo, existe un lapso de tiempo entre cada uno de ellas, el cual es conocido. Por tanto, aunque no es un seguimiento clínico óptimo controlado como debe ser la fuente de información de estudios actuariales o de sobrevida, se trató de establecer el tiempo transcurrido desde el momento del diagnóstico hasta la aparición del evento adverso o hasta el momento en que se obtuvo la última citometría y se estableció, entonces, un modelo de sobrevida libre de enfermedad que sirviera de base para realizar un análisis multivariado con estos antígenos antes mencionados que podrían tener algún valor en la aparición de eventos adverso. Por tanto, se generó el análisis multivariado considerando para este

todas las alteraciones fenotípicas obtenidas en el análisis bivariado mostrado en la tabla 10.6 que tuvieran un valor p menor de 0.25. Este mismo análisis se realizó para el grupo completo de 170 menores, como para el subgrupo con diagnóstico de fenotipo B común, dado que es el mayoritario. Estos resultados se consignan en la tabla 10.7 y 10.8, respectivamente. Tabla 10.6 Caracterización de los pacientes con LLA 2005-2009 que presentaron eventos adversos acorde a la presencia de alteraciones fenotípicas

Alteración Con eventos No.(%) n=25 (14,7%)

Sin eventos No.(%) n=145 (75,3%) Valor p

Expresión de CD7 1 (4) 3 (2,07) 0,47

Expresión de CD10* 1 (4) 3 (2,07) 0,47

Expresión de CD13 4 (16) 33 (22,76) 0,6

Ausencia/expresión parcial CD19 0 1 (0,69) 1

Expresión de CD20° 9 (36) 51 (35,17) 1

Expresión de CD33 6 (24) 19 (13,1) 0,22

Ausencia/ expresión parcial CD34 7 (28) 21 (14,48) 0,14

Ausencia/ expresión parcial CD38 6 (24) 2 (1,38) <0,001

Ausencia/ expresión parcial HLADR 2 (8) 2 (1,38) 0,1

Expresión de 7.1 0 2 (1,38) 1

Expresión de mieloperoxidasa 0 1 (0,69) 1 # Expresión cruzada de CD7 en leucemias de linaje B. * Incluye casos con expresión de CD10 en fenotipo T. ° No considerado para definición de fenotipo inusual. Valor de p: prueba exacta de Fischer para variables categóricas y T de Student para las continuas. Tabla 10.7 Antígenos asociados con la aparición de eventos sobre el total de pacientes (n=170, 25 eventos, tiempo de riesgo 1490,5 meses)

Variable HR (IC95%) Valor p

Expresión de CD33 5 1,83 – 13,69 0,002

Ausencia/infraexpresión de CD38 6,21 2,34 – 16,48 <0,001 HR: Hazard Ratio. Método multivariado empleando la regresión de Cox. Tanto la expresión cruzada de CD33 como la infraexpresión, ausencia o expresión parcial de CD38 muestran una correlación estadísticamente significativa con la

aparición de eventos adversos en los niños con LLA, considerando para tal fin, el tiempo transcurrido desde el momento del diagnóstico hasta la aparición de la recurrencia. Al considerar sólo el fenotipo prepreB, por ser el más frecuente, el análisis multivariado muestra relación con los mismos antígenos antes mencionados, pero también aparece la infraexpresión, expresión parcial o ausencia de CD34 como marcador útil en pacientes con aparición de blastos >5% en médula ósea posterior a la inducción. Ver tabla 10.8. Tabla 10.8 Antígenos asociados con la aparición de eventos en niños con Leucemia Linfoblástica Aguda prepreB [fenotipo común] (n=139, 22 eventos, tiempo de riesgo 1253 meses)

Variable HR (IC95%) Valor p

Expresión de CD33 6,77 2,22 – 20,58 0,001

Ausencia/infraexpresión de CD34 2,72 1,01 – 7,33 0,047

Ausencia/infraexpresión de CD38 7,17 2,56 – 20,11 <0,001 HR: Hazard Ratio. Método multivariado empleando la regresión de Cox.

Queda claro que hay una correlación entre ciertos antígenos detectados en el momento del diagnóstico y la aparición posterior de blastos en estudios de seguimiento en médula ósea. Por tanto, se quiso anticipar el uso de las definiciones de fenotipo infrecuente, fenotipo infrecuente considerando la expresión de CD20 como una anormalidad adicional y usando los anticuerpos identificados como de alta utilidad en el análisis multivariado, como una prueba diagnóstica para predecir el comportamiento de la Leucemia Linfoblástica Aguda en general, y estos mismos conceptos aplicados a la Leucemia Linfoblástica Aguda de fenotipo prepreB. El rendimiento operativo de cada uno de los modelos se resume en las tablas 10.9 y 10.10. Tabla 10.9 Características operativas de definiciones de fenotipo según la presencia de antígenos infrecuentes (LLA general)

Definición Sensibilidad Especificidad VPP VPN Valor p

Infrecuente 64 52,41 18,82 89,41 <0,001

Infrecuente+CD20 76 32,41 16,24 88,68 <0,001

HR MV* 44 86,21 35,48 89,93 <0,001 *HR MV= Expresión de CD33 y/o ausencia, infraexpresión o expresión parcial de CD38 VPP= Valor Predictivo Positivo. VPN= Valor Predictivo Negativo.

Tabla 10.10 Características operativas de definiciones de fenotipo según la presencia de antígenos infrecuentes (LLA prepreB)

Definición Sensibilidad Especificidad VPP VPN Valor p

Infrecuente 68,18 52,14 21,13 89,71 <0,001

Infrecuente+CD20 81,82 28,21 17,65 89,19 <0,001

HR MV* 68,18 70,09 30 92,13 <0,001 *HR MV= Expresión de CD33 y/o ausencia, infraexpresión o expresión parcial de CD34 y/o CD38 VPP= Valor Predictivo Positivo. VPN= Valor Predictivo Negativo. Las tablas muestran que la sensibilidad del fenotipo infrecuente con y sin incluir CD20 son medianamente útiles para detectar niños con LLA que pueden recaer y, por otro lado, la ausencia de alteraciones en CD33, CD34 y CD38 útil para anticipar un comportamiento favorable. 10.2 UTILIDAD DEL ESTUDIO DE INMUNOFENOTIPO POR CITOMETRÍA DE FLUJO PARA LA DETECCIÓN DE ENFERMEDAD MÍNIMA RESIDUAL Para el establecimiento del nivel de detección de blastos por citometría de flujo se consideraron los siguientes grupos:

• Primer grupo, de 5% o más de blastos que incluye grupo diagnóstico (blastos >20%), de recaída (blastos ≥5% luego de haber alca nzado la remisión morfológica), de enfermedad persistente (blastos ≥5% sin haberse registrado remisión morfológica luego de la inducción) y otros;

• el segundo grupo de Enfermedad Residual mayor que 10-2 (blastos >1% y <5%);

• el tercero, Enfermedad Residual mayor que 10-3 (blastos >0,1% y <1%); • el cuarto, Enfermedad Residual menor que 10-3 (blastos <0,1%), incluyendo

registros con niveles de detección de 10-4 y 10-5, y; • el quinto y último sin detección de blastos. El rendimiento del estudio de inmunofenotipo por citometría de flujo para detectar niveles de blastos se resume en la gráfica 10.1.

Los resultados mostrados en la gráfica 10.1, si bien resaltan la alta cantidad de muestras recibidas informadas con más de 5% de blastos (diagnóstico, recaída, persistencia, entre otras situaciones) también indica que un gran número de casos es informado con niveles de blastos por debajo del nivel de detección de 10-3 y 10-4 (97 registros correspondiente a 18,3%). De igual forma se estableció la correlación entre los niveles de detección de blastos residuales en aspirados de médula ósea y la aparición de recurrencia. Este análisis se muestra en la tabla 10.11.

Gráfica 10.1 Niveles de detección de blastos en estudios de seguimiento de niños con Leucemia Linfoblástica Aguda atendidos en 2005-2009 (n=530)

Tabla 10.11 Niveles de detección de Enfermedad Mínima Residual asociados a eventos adversos

Nivel máximo de detección EMR Eventos HR (IC95%) Valor p >10-2 44% 15,49 (5,31-45,27) <0,001

<10-2 ^ >10-3 20% 1,52 (0,5-4,82) 0,53

<10-3 ^ >10-4 36% 3,67 (0,2-66,12) 0,63

<10-4 0% - -

Se muestra en la tabla que niveles de blastos mayores que 10-2 en estudios de seguimiento (>1%) tienen una correlación estadísticamente significativa con la aparición de eventos adversos en estudios de seguimiento (recaída hematológica); sin embargo, valores inferiores no tienen dicha correlación, y si representaron el 56% del total de eventos adversos. 10.3 PARÁMETROS DE ALTERACIONES FENOTÍPICAS ÚTILES PARA LA APROXIMACIÓN DIAGNÓSTICA Y DE SEGUIMIENTO EN LEUCEMIA LINFOBLÁSTICA AGUDA EN NIÑOS Se quiso establecer cual alteración antigénica posee mayor relevancia diagnóstica dado que permitiera identificar fácil y rápidamente los casos de Leucemia Linfoblástica Aguda de pacientes con otras enfermedades. No se pudo realizar el análisis sobre la totalidad de 170 pacientes por carecerse de los archivos

0

50

100

150

200

250

No detección <0,1% 0,1% a 1% >1% ^ <5% ≥5%

2,7%

34,8%

15,3%

3,7%

43,5%

electrónicos de citometrías previos a 2008. Por tanto, se revisó sólo un grupo de registros electrónicos con diagnósticos posteriores a 2008 disponibles (n=38) buscando identificar los siguientes parámetros: infraexpresión de antígenos, sobreexpresión de antígenos, expresión asincrónica de antígenos, expresión cruzada de antígenos y otras alteraciones. Los datos identificados se presentan en la tabla 10.12. Tabla 10.12 Distribución de alteraciones fenotípicas útiles para la aproximación diagnóstica y de seguimiento de Leucemia Linfoblástica Aguda en niños

Alteración No. (%)

Infraexpresión de antígenos 38 (100)

Sobreexpresión de antígenos 23 (60,5)

Expresión asincrónica de antígenos 12 (31,6)

Expresión cruzada de antígenos 9 (23,68)

Otra alteración 1 (2,63) Como se observa en la tabla 10.12, todas las leucemias presentaban infraexpresión de alguno de sus antígenos. Al revisar que antígenos se encontraban alterados se obtuvieron los datos que se plasman en la tabla 10.13. CD45 estaba ausente o débil en 35 de 35 Leucemias Linfoblásticas Agudas de fenotipo B (100%) y CD3 de superficie estaba débilmente expresado en 3 de 3 Leucemias Linfoblásticas Agudas de fenotipo T. CD34 presenta disminución en menor proporción y otros antígenos son infraexpresados en forma anecdótica. Tabla 10.13 Distribución de infraexpresión de antígenos en Leucemia Linfoblástica Aguda en niños

Infraexpresión (n=38) No. (%)

CD45 ausente 13 (34,2)

CD45 débil 22 (57,9)

CD34 negativo 3 (7,9)

CD3* superficie débil 3 (7,9)

CD2*, CD34 débil 1 (2,6)

CD2*, CD5*, CD7*, CD10 ausente 1 (2,6) * En fenotipo T.

En relación con la sobreexpresión de antígenos la tabla 10.14 resume los hallazgos. Nótese la alta frecuencia de sobreexpresión de CD10 en las Leucemias Linfoblásticas Agudas de fenotipo prepreB. Tabla 10.14 Distribución de sobreexpresión de antígenos en Leucemia Linfoblástica Aguda en niños

Sobreexpresión (n=23) No. (%)

CD10 19 (50)

CD34 5 (13,2)

CD19 3 (7,9) Más de un antígeno podía estar sobreexpresado en un mismo caso.

Expresión asincrónica y cruzada de antígenos también se observó y se resume los hallazgos en las tablas siguientes. Los casos de expresión de CD33 se relacionaban en 4 de 5 con expresión de CD13, similar a lo observado al inicio de estos resultados en el grupo de trabajo. La otra alteración identificada fue expresión de 7.1 (proteína de la alteración 11q23); sin embargo, esta expresión no fue útil para seguimiento pues se perdió en los blastos en estudios subsecuentes. Estos resultados se plasman en las tablas 10.15 y 10.16. Tabla 10.15 Distribución de expresión cruzada de antígenos en Leucemia Linfoblástica Aguda en niños

Cruzada (n=9) No. (%)

CD13 8 (21,1)

CD33 5 (13,2) Más de un antígeno podía tener expresión cruzada en un mismo caso.

Tabla 10.16 Distribución de expresión asincrónica de antígenos en Leucemia Linfoblástica Aguda en niños

Asincrónico(n=12) No. (%)

CD20* 11 (28,9)

CD4, CD8 1 (2,6) * Sólo en un caso estuvo relacionada la expresión de CD20 con ausencia de CD34.

Las alteraciones antigénicas mencionadas con anterioridad se usaron para diseñar los tubos de seguimiento y se observó una alta preservación del perfil antigénico durante el seguimiento. Se registró pérdida de expresión del anticuerpo 7.1 como se anotó anteriormente y un caso con pérdida de expresión de CD13. Sin

embargo, los otros antígenos mantuvieron su expresión idéntica al diagnóstico lo que facilitó la detección de los blastos en estudios de seguimiento. 10.4 CONCORDANCIA INTEROBSERVADOR Y REPRODUCIBILIDAD METODOLÓGICA Se obtuvo una cantidad importante de archivos *.fcs (flow cytometry standard file) desde el año 2008 hasta el 2009. Se seleccionaron 121 registros correspondientes a 38 niños de los cuales se tenía al menos tres estudios (diagnóstico y 2 de seguimiento). En total, los estudios de seguimiento fueron 82. Con base en estos datos se comparó el nivel de detección de Enfermedad Mínima Residual reportado a través de los años por el personal entrenado que regularmente realiza estos estudios utilizando el software Paint-a-gate, contra la medición realizada por el estudiante de postgrado que desarrollaba su tesis, empleando el software Infinicyt® 1.3. La gráfica 10.2 presenta la regresión logística correspondiente. Gráfica 10.2 Regresión logística de acuerdo entre datos reportados y observados de estudios de seguimiento por citometría de flujo en niños con LLA

Reportado corresponde a los datos anotados en el registro electrónico del archivo de la fundación Santa Fe de Bogotá. Observado corresponde a los datos obtenidos por el estudiante de postgrado en su análisis individual de casos.

0.2

.4.6

.8re

porta

do

0 .2 .4 .6 .8 1observado

Como se observa en la gráfica, la concordancia es alta. La correlación obtenida fue de 98,81%, con un coeficiente de correlación de concordancia de 0,987 (IC 95%= 0,981-0,992). Los límites de acuerdo Bland y Altman fueron -0,033 a 0,039 (promedio de diferencia de 0,003) [Lin, L. I-K. 1989. A concordance correlation coefficient to evaluate reproducibility. Biometrics 45: 255-68. ________. 2000. A note on the concordance correlation coefficient. Biometrics 56: 324-25]. Si bien, la concordancia global fue más que satisfactoria, se exploró la correlación entre dos observadores definiendo grupos acorde a los puntos de corte de detección de blastos aceptados en la literatura. Considerando los puntos de corte clínicos de Enfermedad Residual, se verificó el nivel de acuerdo empleando un índice kappa. Se estratificó en los siguientes niveles de detección tanto el grupo de reportado (Paint-a-gate) como el de observado (Infinicyt): <0,1% (<10-3), 0,1%-1% (10-3-10-2), >1% y <5% (>10-2) y >5%. La tabla 10.17 muestra los datos obtenidos de esa concordancia. Tabla 10.17 Concordancia interobservadores en la detección de blastos en estudios de seguimiento por citometría de flujo en niños con LLA

Observado

Tota

l

1 2 3 4

Rep

orta

do 1 31 11 5 0 47

2 3 9 0 0 12

3 0 3 7 0 10

4 0 1 1 11 13

Total 34 24 13 11 8822 Reportado corresponde a los datos anotados en el registro electrónico del archivo de la Fundación Santa Fe de Bogotá. Observado corresponde a los datos obtenidos por el estudiante de postgrado en su análisis individual de casos. Categoría 1= blastos <0,1%, categoría 2= blastos 0,1-1%, categoría 3= blastos >1% y <5% y categoría 4= blastos ≥5%. Acorde a estos cálculos, el nivel de acuerdo fue 70,73% y el índice kappa 0,5689 (acuerdo moderado), resultados con significancia estadística. Cabe anotar que muchos valores limítrofes quedaron en categorías diferentes a pesar de tener diferencias numéricas menores; es decir, algún valor que se reportó originalmente como 0,09% de blastos (observado) quedó registrado en categoría 1 y en el análisis del estudiante de postgrado (reportado) tuvo un valor de 0,1%, por lo cual quedaría incluido en categoría 2, generando discrepancia de categorías, pero que en el acuerdo general numérico no es tan significativo.

Estos datos sugieren que los resultados reportados, indiferentes del momento, software y operario, son similares y se mantienen constantes. Cabe recalcar, que puede llegar a ser importante incluir un margen de error del porcentaje de blastos detectados considerando los puntos de corte y lo estricto que pueda llegar a ser la consideración del clínico que maneja cada caso. 10.5 DISCUSIÓN DE RESULTADOS Las características generales del grupo estudiado, como son mayor proporción de género masculino, edad promedio de 7,13 años y distribución de fenotipos con predominio B son similares a los resultados presentados en estudios previamente publicados. (Ravindranath 2003, Chan 2002) Este predominio de leucemias de fenotipo B se ha atribuido a una mayor tasa de maduración de esta línea celular y consecuente mayor riesgo de desarrollo de aberraciones genéticas que, acompañados por un daño en la maquinaria de preservación genómica, facilita la aparición de clones tumorales y la consecuente enfermedad hematológica. (Ziegler 2005, Brunning 2001) En relación con el conteo de blastos, se estableció que en promedio los pacientes diagnosticados con LLA suelen tener altos porcentajes de células tumorales. Sin embargo, se observó una desviación estándar muy amplia que puede estar relacionado con alteraciones del aspirado de médula ósea que incluyen en algunas ocasiones dilución con sangre periférica, en otros casos presencia de lisis tumoral parcial, lo cual limita la cuantificación de blastos al deberse eliminar gran cantidad de eventos de la citometría; además, los blastos tienen un comportamiento biológico diferente a las otras células del aspirado por lo que su supervivencia se puede modificar diferencialmente en relación con la población celular total, situación que también altera el porcentaje de blastos. Cuando se revisa la expresión antigénica en las leucemias linfoblásticas agudas se identifica una serie de hallazgos importantes para considerar. La distribución de antígenos para linaje B (expresión de CD10, CD19, CD34, CD38, HLA-DR y ausencia de CD7, CD13, CD20, CD33 y mieloperoxidasa) y linaje T (expresión de CD2, CD3 de citoplasma, CD5, CD7, CD34, CD38, CD45, HLA-DR y TdT y ausencia de CD10, CD13, CD19, CD20, CD33) mostró la existencia de un fenotipo frecuente de Leucemia Linfoblástica Aguda, similar a lo publicado previamente (Brunning 2001). De la misma forma, se consideró que de existir un fenotipo frecuente existiría uno no frecuente que se podría definir como la ausencia de antígenos usualmente expresados como CD10, CD34, CD38 y HLA-DR, o la presencia de antígenos no reconocidos con frecuencia como CD7 (en fenotipos B), CD13, CD33 e IgM de citoplasma. Es importante anotar que CD10 fue un marcador que presentó una variabilidad especial en el análisis. En el caso de las LLA de fenotipo B se consideró su ausencia como algo infrecuente, pero se excluyó de este concepto las 9 LLA proB (que tienen por definición ser CD10 negativas). Por el contrario, en LLA de fenotipo T CD10 sólo estuvo presente en 4

de 15 casos, por tanto se consideró infrecuente su expresión. Sin embargo, otros estudios han mostrado que CD10 es un marcador comúnmente observado en LLA sin importar su fenotipo. (Brunning 2001) Este hallazgo de nuestro estudio puede estar señalando que nuestra forma de definir la expresión de este antígeno puede ser diferente a lo realizado en otros centros o que simplemente nuestras leucemias T son realmente diferentes a las antes reportadas. La detección de antígenos inusuales es una herramienta útil para confeccionar tubos de fluoromarcadores más cortos y altamente sensibles y específicos para el seguimiento de los pacientes con leucemia. Este hallazgo ha sido presentado en varias ocasiones por el grupo de Saint Jude (Pui 2008, Pui 2004, Pui 2001) y se siguió como derrotero para las actividades del servicio de patología de la Fundación Santa Fe de Bogotá en las muestras analizadas para este estudio. Se planteó la hipótesis que si alguno de estos antígenos de expresión infrecuente tenía relación con aparición de blastos en médula ósea mayor o igual a 5% en estudios de seguimiento posteriores a la inducción (persistencia y recaída hematológica) o Enfermedad Mínima Residual, como se definió previamente. Los resultados de este análisis mostraron que hay una serie de antígenos que tiene una relación más estrecha con la aparición de los desenlaces adversos que incluyeron expresión de CD33 y ausencia, infraexpresión o expresión parcial de CD34 y/o CD38. Si consideramos que CD13 comúnmente se coexpresa con CD33, sería esperable que la expresión del primero estuviera también relacionada. Sin embargo, los casos CD13 positivos tenían períodos más cortos entre sus estudios citométricos por lo que no se halló relación estadística. No se encontró correlación con detección de niveles de EMR y fenotipo diagnóstico. Los datos no se muestran en los resultados. Previamente los inmunofenotipos habían sido analizados por el grupo de Saint Jude quienes identificaron que la expresión de CD10, CD34 y CD19 eran antígenos relacionados con desenlaces favorables (Coustan-Smith 2006, Pui 1993), hallazgo similar al observado en nuestro trabajo. Por otra parte, este mismo grupo había observado previamente que la expresión cruzada de marcadores mieloides carecía de valor pronóstico en LLA, dato que contradice nuestro hallazgo relacionado con CD33. (Pui 1990) En relación con CD33 queda pendiente definir si realmente el mayor riesgo de recurrir observado en nuestro estudio es debido a la correlación que tiene su coexpresión con CD13 en pacientes con cromosoma Philadelphia y, por ende, alto riesgo de recurrencia. (Tabernero 2001) CD38 no había sido mencionado previamente en la literatura como un marcador de importancia pronóstico y análisis adicionales deben ser realizados para definir su verdadera importancia como aberrancia. El análisis de los niveles de detección de blastos mostró que el estudio de citometría de flujo es una herramienta útil para detectar células en niveles tan bajos como 10-4. Sin embargo, los niveles de detección realmente útiles son

valores mayores a 10-2 (1%) que tiene una alta correlación con aparición de eventos adversos y los niveles inferiores a 10-4 (0,01%) que no presentaron recaídas. Estos datos se parecen en cierta medida a los reportados por el grupo de Saint Jude; sin embargo, la correlación de ese grupo es mucho mayor debido al seguimiento clínico estricto que tienen de esos pacientes. (Pui 2000) La consideración de los parámetros de aproximación diagnóstica mostró que la infraexpresión es el parámetro más constantemente alterado en leucemias y particularmente representado por CD45 en linaje B y CD3 de superficie en linaje T; sin embargo, no había sido considerado en los reportes publicados por Orfao (Orfao 2000), pero sí en los trabajos previos realizados por Borowitz. (Borowitz 1993) Seguramente el grupo español considera sólo las expresiones aberrantes para sus análisis, y siendo infraexpresión tan frecuente puede ser considerada más como un marcador leucémico que aberrancia antigénica. (Borowitz 1993) Sobreexpresión de antígenos y expresión cruzada es menor en nuestro estudio que lo reportado previamente. (Orfao 2000) Este fenómeno puede ocurrir debido diferencias en la forma de establecer la positividad de los antígenos entre los diferentes grupos. Es de mencionar que sólo se encontró expresión de anticuerpo 7.1 en un caso, y la expresión del mismo se perdió durante el seguimiento, por lo que la utilidad teórica de este tipo de anticuerpos no pudo ser demostrada en este estudio. Recordar que el anticuerpo 7.1 reconoce la proteína de fusión de la translocación 4;11, la cual se relaciona a su vez con un fenotipo CD10 negativo. (Campana 1999) Se analizó la concordancia y reproducibilidad del estudio de citometría para la detección de blastos en estudios de seguimiento. Los datos demostraron la alta reproducibilidad del método a pesar de cambiar de software, operario y momento de ejecución de la medición. Además, quedó demostrada la sencillez del método pues permite valorar una gran cantidad de muestras en un corto período con alta precisión; en este caso, el observador gastó entre 5 y 8 minutos analizando cada caso (datos no mostrados). Consideraciones adicionales deben ser tenidas en cuenta al analizar estos datos debido a los diferentes momentos históricos en que se realizaron los estudios y el grado de entrenamiento del operario más que la metodología y el software empleados. Estos resultados muestran ciertas tendencias que deben ser validados con estudios más grandes y con seguimiento clínico estricto, en particular, lo relacionado con la correlación entre expresiones antigénicas y desenlaces adversos.

11. CONCLUSIONES La Leucemia Linfoblástica Aguda es la neoplasia más frecuente en la población pediátrica y su fenotipo diagnóstico más frecuente corresponde al prepreB o común. Se reconoció la expresión frecuente de CD10, CD19, CD34, CD38 y HLA-DR en leucemias de linaje B y CD2, CD5, CD7, CD34, CD45 y HLA-DR en el linaje T. Igualmente, CD13 y CD33 estuvieron frecuentemente ausentes en este tipo de neoplasia. Los fenotipos infrecuentes se relacionaron con desenlaces adversos, pero sólo la expresión de CD33, ausencia o expresión parcial de CD34 y CD38 demostraron diferencias estadísticamente significativas en recaídas de Leucemia Linfoblástica Aguda prepreB. La citometría de flujo es una herramienta útil para detectar blastos en estudios de seguimiento alcanzando niveles hasta de 10-4 y 10-5. Además, hay correlación entre Enfermedad Residual >1% (10-2) al final de la inducción, o en cualquier estudio de seguimiento posterior, con la aparición de recaídas, y niveles de blastos <0,01% (10-4) en el mismo momento con ausencia de recaídas. La infraexpresión de antígenos es el parámetro de aproximación diagnóstica más frecuentemente observado en detección de Leucemia Linfoblástica Aguda, particularmente la expresión débil o ausencia de expresión de CD45 en LLA de linaje B y la infraexpresión de CD3 de superficie en LLA de fenotipo T. Este hallazgo es además útil en la detección de Enfermedad Mínima Residual. Otras alteraciones como sobreexpresión, expresión cruzada y asincrónica son de ocasional aparición, pero también útiles a la hora de describir alteraciones y durante el seguimiento paraclínico de los pacientes. El estudio de inmunofenotipo por citometría de flujo es altamente reproducible como queda demostrado en este estudio. Al emplearse una nueva plataforma informática, un nuevo operador y un momento histórico diferente, los resultados son similares a los reportados en su momento con niveles de concordancia altos y bastante satisfactorios. Como se observa en los enunciados anteriores, el estudio de inmunofenotipo por citometría de flujo es una herramienta diagnóstica y de seguimiento altamente útil en Leucemia Linfoblástica Aguda y el uso de fenotipo diagnóstico en la predicción de aparición de blastos en estudios de seguimiento con niveles superiores o iguales a 5% es una propuesta que surge de este trabajo pero requiere de estudios de validación prospectivos con seguimiento clínico apropiados. Esta utilidad del fenotipo muy seguramente está relacionada con alteraciones genéticas y moleculares que son de aplicación y accesibilidad aún limitada en nuestro medio, por lo que seguirán siendo desconocidas por algún tiempo. Sin embargo, el

estudio de inmunofenotipo podría ayudar como un sustituto de los estudios moleculares para ayudar a definir grupos de riesgo. Quedan planteados muchos interrogantes sobre la verdadera utilidad de estos datos y el valor que el fenotipo tenga realmente en estudios de mayor validez externa que el actual. Se espera que este sea el germen de nuevos trabajos que busque validar estos resultados en espacios clínicos más controlados.

REFERENCIAS

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ANEXO

CONSENTIMIENTO INFORMADO (Artículos 14,15 y 16 de la Resolución 8430 de 1993)

Yo _________________________________ , identificado con ____________________________ En representación legal de ______________________________ manifiesto haber sido informado sobre el objetivo de la recolección de una muestra de sangre de medula ósea (tomada durante los procedimientos de medula ósea (MO) programados dentro del protocolo) y de sangre periférica (la muestra se toma durante la misma punción del cuadro hemático) para evaluar probables marcadores de enfermedad residual no evidente con los exámenes usuales como las biopsias y citologías de medula ósea y hemogramas realizados durante el tratamiento. Las muestras tienen como fin ser evaluadas para unos marcadores que buscan evaluar si hay enfermedad leucémica residual NO evidente con los estudios que se hacen a la fecha. Dado que de los resultados de esta búsqueda aún no sabemos su real utilidad y lo que pretendemos es aclarar si los hallazgos tienen o no relación con el comportamiento futuro de la enfermedad, por ahora estos resultados no serán tenidos en cuenta sino que se verificaran al final del tratamiento buscando si se asociaron a eventos como recaída o persistencia de enfermedad. Seré informado de los resultados en el momento en que yo lo solicite, también podré solicitar información adicional de la evolución del conocimiento y su impacto en estos resultados, podré rehusarme a autorizar que se lleven a cabo los estudios en las muestras posteriores (se han programado entre 2 y 3 muestras), estos procedimientos no representarán riesgo adicional dado que se realizarán en el mismo tiempo anestésico de la quimioterapia intratecal programada dentro de su protocolo de tratamiento.. No se tomaran biopsias de médula ósea ni cuadros hemáíicos adicionales con miras a realizar única y exclusivamente estos marcadores. Podré retirar mi consentimiento para continuar con esta evaluación en el momento que lo considere pertinente. Los resultados de esta evaluación NO tendrán por ahora ningún impacto sobre el tratamiento propuesto a mi hijo. No habrá perjuicio para el paciente en caso de retirar mi consentimiento para continuar con esta evaluación. En constancia de lo anterior y sin dudas o aclaraciones adicionales firmo: __________________________ ____________________________ c.c. c.c. Dirección Dirección En calidad de: Testigo: __________________________ c.c. Dirección Testigo Tomado de Chaparro-Alzogaray M, Estupiñán-Peñaloza FM. (2005) Importancia Clínica de la Enfermedad Mínima Residual en niños con Leucemia Linfoide Aguda del Hospital de la Misericordia (Tesis de grado) Universidad Nacional de Colombia, Facultad de Medicina, Unidad de Oncohematología Pediátrica, Bogota DC