DESARROLLO DE MÉTODOS MULTIANALITO PARA LA …
Transcript of DESARROLLO DE MÉTODOS MULTIANALITO PARA LA …
UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA
FACULTAD DE QUIacuteMICA
DEPARTAMENTO DE QUIacuteMICA ANALIacuteTICA NUTRICIOacuteN Y BROMATOLOGIacuteA
INSTITUTO DE INVESTIGACIOacuteN Y ANAacuteLISIS ALIMENTARIO (IIAA)
GRADO EN QUIacuteMICA
DESARROLLO DE MEacuteTODOS
MULTIANALITO PARA LA DETERMINACIOacuteN
DE RESIDUOS DE FITOSANITARIOS EN
VINO MEDIANTE LC-MSMS
TRABAJO DE FIN DE GRADO
Curso 20162017
Andrea Blanco Codeso Santiago de Compostela Julio 2017
DEPARTAMENTO DE QUIacuteMICA ANALIacuteTICA
NUTRICIOacuteN Y BROMATOLOGIacuteA
Facultad de Quiacutemica
15782 Santiago de Compostela
Telf 981 591 079 Fax 981 547 141
Correo electroacutenico qnsecusces
Isaac Rodriacuteguez Pereiro Profesor Titular de Universidad del Aacuterea de Quiacutemica Analiacutetica y Rafael
Cela Torrijos Catedraacutetico de la misma Aacuterea de conocimiento de la Universidad de Santiago de Com-
postela
Autorizan
A la alumna Andrea Blanco Codeso a la presentacioacuten del estudio ldquoDesarrollo de meacutetodos multiana-
lito para la determinacioacuten de residuos de fitosanitarios en vino mediante LC-MSMSrdquo que ha
realizado bajo su direccioacuten en el Laboratorio de Quiacutemica Analiacutetica del Instituto de Investigacioacuten y Anaacuteli-
sis Alimentario (IIAA) de la Universidad de Santiago de Compostela como Trabajo de Fin de Grado en
Quiacutemica
Para que conste firmamos la presente autorizacioacuten en Santiago de Compostela a 13 de Julio de 2017
Isaac Rodriacuteguez Pereiro Rafael Cela Torrijos
Iacutendice
IacuteNDICE ABSTRACTRESUMEN RESUMO helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip1
CAPIacuteTULO I INTRODUCCIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip3
1 FITOSANITARIOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip3
11 Tipos de fitosanitarios empleados en viticulturahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip3
12 Estructura propiedades fiacutesico-quiacutemicas y clasificacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip6
13 Toxicidad de los pesticidashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip9
14 Legislacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip10
2 MEacuteTODOS DE PREPARACIOacuteN DE MUESTRA APLICADOS
A MUESTRAS DE VINOhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip11
21 Extraccioacuten liacutequido-liacutequido (LLE)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip11
22 Extraccioacuten en fase soacutelida (SPE)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip11
23 Teacutecnicas de microextraccioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip12
231 Microextraccioacuten en fase soacutelida (SPME)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip12
232 Microextraccioacuten en fase liacutequida (LPME)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip13
24 QuEChERShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip13
3 METODOLOGIacuteA ANALIacuteTICA PARA LA DETERMINACIOacuteN
DE PESTICIDAShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip14
31 Meacutetodos de GC-MS (MSMS)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip14
32 Meacutetodos de LC-MS (MSMS)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip15
33 Espectrometriacutea de masashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip15
4 RESUMEN BIBLIOGRAacuteFICO DE LAS TEacuteCNICAS DE EXTRACCIOacuteN Y
DETERMINACIOacuteN DE PESTICIDAS EN VINOhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip16
5 DISTRIBUCIOacuteN DE PESTICIDAS EN VINOS COMERCIALEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip19
CAPIacuteTULO II OBJETIVOS Y JUSTIFICACIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip22
Iacutendice
CAPIacuteTULO III PARTE EXPERIMENTALhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip23
1 MATERIAL Y REACTIVOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip23
11 Materialhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip23
12 Reactivos y disolventeshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip23
13 Patroneshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip23
14 Patrones internoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip24
15 Gaseshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip25
2 INSTRUMENTACIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip25
3 PREPARACIOacuteN DE LAS DISOLUCIONEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip25
4 LAVADO DEL MATERIALhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip26
5 EXTRACCIOacuteN DE MUESTRAS MEDIANTE SPEhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip26
6 CONDICIONES DE DETERMINACIOacuteN MEDIANTE UPLC-MSMShelliphelliphelliphelliphellip28
CAPIacuteTULO IV RESULTADOS Y DISCUSIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 29
1 IDENTIFICACIOacuteN DE LOS COMPUESTOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip29
2 CARACTERIZACIOacuteN DEL PROCEDIMIENTO DE
DETERMINACIOacuteN (UPLC-ESI-MSMS)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip30
3 ESTUDIO DEL MEacuteTODO SPEhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33
4 CARACTERIZACIOacuteN DEL MEacuteTODO DE DETERMINACIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip39
5 APLICACIOacuteN A MUESTRAS DE VINOS COMERCIALEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip42
CAPIacuteTULO V CONCLUSIONESCONCLUSIOacuteNSCONCLUSIONShelliphellip 48
VI BIBLIOGRAFIacuteAhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip51
ResumenResumoAbstract
bull RESUMEN
Los pesticidas son compuestos que se emplean en vintildeedos de todo el mundo para garantizar una proteccioacuten en la
cosecha con escasas peacuterdidas producidas por diferentes organismos en uvas empleadas para la elaboracioacuten del
vino El modo de accioacuten de estos compuestos se basa en la interferencia sobre el metabolismo de diferentes
organismos sin afectar a la vid Un incremento en el empleo de estos compuestos puede determinar la existencia
de residuos en las uvas en el momento de la cosecha desde donde pueden alcanzar el vino que se elabora con las
mismas Por ese motivo se ha establecido una legislacioacuten que regule la cantidad maacutexima de residuos de pesticidas
en uvas y aunque a diacutea de hoy no hay valores regulados en el vino se recomienda que no excedan al 10 de los
liacutemites en uvas En este estudio se ha trabajado con distintos tipos de fitosanitarios fungicidas principalmente
aunque tambieacuten alguacuten insecticida con el objetivo de poder detectar la mayor cantidad de estas sustancias en vinos
comerciales optimizando la extraccioacuten mediante extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) y deteccioacuten mediante
cromatografiacutea de liacutequidos acoplada a espectrometriacutea de masas en taacutendem (LC-ESI-MSMS) Se presenta una
metodologiacutea analiacutetica sencilla raacutepida y robusta que puede ser implementada en laboratorios de control de
alimentos
bull RESUMO
Os pesticidas son compostos empregados en vintildeas arredor do mundo para garantir unha proteccioacuten na colleita
con poucas perdas producidas por distintos organismos en uvas utilizadas para a fabricacioacuten do vintildeo O modo de
accioacuten destes compostos baseacutease na intromisioacuten sobre o metabolismo de diferentes organismos sen afectar aacute vide
Un acrecentamento no uso destos compostos pode fixar a existencia de residuos nas uvas no momento da colleita
onde poden chegar ao vintildeo que se produce coas mesmas Por ese motivo estipulouse unha lexislacioacuten que regula a
cantidade maacutexima de residuos de pesticidas en uvas e aiacutenda que a diacutea de hoxe non hay valores regulamentados no
vintildeo recomeacutendase que non superen ao 10 dos liacutemites en uvas Neste estudo traballouse con diferentes tipos de
pesticidas funxicidas principalmente aiacutenda que tameacuten alguacuten insecticida co obxecto de poder detectar a maior
cantidade destas sustancias en vintildeos comerciais optimizando a extraccioacuten por medio da extraccioacuten en fase soacutelida
(SPE) e deteccioacuten por medio de cromatografiacutea de liacutequidos acoplada a espectrometriacutea de masas en taacutendem (LC-
MSMS) Preseacutentase unha metodoloxiacutea analiacutetica simple raacutepida e robusta que pode ser aplicada en laboratorios de
control de alimentos
1
ResumenResumoAbstract
bull ABSTRACT
Pesticides are compounds that are used in vineyards around the world to ensure protection at harvest with a few
loss produced by different organisms in grapes used to make wine The mode of action of these compounds is
based on the interference on the metabolism of different organisms without affecting the vine An increase in the
use of these compounds can determine the existence of residues in grapes at the time of harvest from where
they can reach the wine that is elaborated with the same ones For this reason legislation has been established to
regulate the maximum amount of pesticide residues in grapes and although there are currently no regulated
values in wine it is recommended that they do not exceed 10 of the limits on grapes In this study we have
worked with different types of pesticides mainly fungicides but also some insecticide with the purpose of being
able to detect the greatest amount of these substances in commercial wines extraction has been optimized by
solid phase extraction (SPE) and detection has been optimized by liquid chromatography coupled to tandem mass
spectrometry (LC-ESI-MSMS) It is presented a simple fast and robust analytical methodology that can be
implemented in food control laboratories
2
Capitulo I Introduccioacuten
CAPIacuteTULO I INTRODUCCIOacuteN
1 FITOSANITARIOS
11 Tipos de fitosanitarios empleados en viticultura
De acuerdo con el Ministerio de Agricultura y Pesca Alimentacioacuten y Medio Ambiente los fitosanitarios se definen
como una o varias sustancias activas u otros ingredientes conformando una mezcla con el fin de proteger los
productos de origen vegetal de organismos nocivos tanto de tipo vegetal como animal que conforman plagas
Dentro de estos fitosanitarios tambieacuten se encuentran las sustancias que destruyen regulan o inhiben la
germinacioacuten de las plantas pero no se contemplan dentro de este grupo vacunas medicamentos y antibioacuteticos
para uso humano o veterinario o agentes utilizados en el control bioloacutegico Los productos fitosanitarios ayudan a
asegurar una buena calidad en los alimentos asiacute como contribuyen al aumento de los rendimientos en la
agricultura [1]
Seguacuten la OMS (Organizacioacuten Mundial de la Salud) los fitosanitarios se pueden clasificar atendiendo a los
organismos a los que esteacuten destinados siendo estos insectos (insecticidas) aacutecaros (acaricidas) moluscos
(molusquicidas) roedores (rodenticidas o raticidas) hongos (fungicidas) gusanos y larvas (nematicidas) malas
hierbas (herbicidas) bacterias (antibioacuteticos pero sin comprender los de uso humano y bactericidas) y otras formas
de vida perjudiciales para la salud puacuteblica y tambieacuten para la agricultura consideradas como plagas animales o
vegetales que puedan ser generadas durante la produccioacuten almacenamiento transporte distribucioacuten y elaboracioacuten
de productos agriacutecolas y sus derivados Actualmente no se puede pensar en un cultivo racional sin el uso de alguacuten
tipo de pesticida ya que la peacuterdida de cosechas en todo el mundo debido a causa de insectos enfermedades de las
plantas y malas hierbas es equivalente a un tercio de la produccioacuten total [2] [3]
Para el estudio de los productos de fitosanitarios en vino nos centraremos solamente en los tres tipos maacutes
importantes en eacuteste aacuterea herbicidas insecticidas y sobre todo fungicidas
Los herbicidas son sustancias destinadas a destruir las malas hierbas cuyo meacutetodo de accioacuten es la interferencia
en los procesos bioquiacutemicos como la fotosiacutentesis que tienen lugar en el sistema vivo de eacutestas Generalmente se
aplican en solucioacuten o suspensioacuten acuosa en forma de nube de pequentildeas gotas dirigidas hacia el objetivo de la
aplicacioacuten Los herbicidas ofrecen los medios maacutes efectivos para el control de las plagas siendo en los paiacuteses
industrializados aplicados sobre el 85-100 de todos los cultivos principales Este tipo de sustancias son
propensas a la descomposicioacuten por microbios plantas y animales y no son comunes los problemas de residuos de
herbicidas si se utilizan de acuerdo a las instrucciones de las etiquetas [4] A pesar de todos los beneficios que nos
aportan un mal uso de estos puede convertirse en un serio problema ya que toda sustancia quiacutemica usada en
3
Capiacutetulo I Introduccioacuten
agricultura puede provocar un efecto negativo en el ambiente si es utilizada en altas dosis El uso prolongado de
un mismo herbicida puede causar problemas de resistencia de malezas fenoacutemeno que consiste en la aparicioacuten de
biotipos tolerantes de una especie la cual anteriormente era controlada por el herbicida [5]
Por otro lado los insecticidas son fitosanitarios destinados a controlar el ataque de insectos y para eso existen
distintos caminos a traveacutes de los que pueden actuar siendo envenenamiento por contacto en doacutende el insecticida
penetra a traveacutes de la cutiacutecula del insecto hasta alcanzar el sitio activo envenenamiento oral en doacutende el
insecticida es ingerido y absorbido a traveacutes del intestino o tambieacuten por fumigaciones en doacutende el insecticida
penetra en el cuerpo del insecto a traveacutes de los espiraacuteculos del sistema respiratorio Pero al igual que pasa con los
herbicidas los insectos tambieacuten desarrollan resistencia a los insecticidas debido al contacto continuo con estos
Esta resistencia puede ser expresada por varios caminos que el insecto no entre en contacto con la deposicioacuten del
insecticida que se modifique la composicioacuten del exoesqueleto inhibiendo asiacute la penetracioacuten del insecticida la
modificacioacuten del sitio activo para el fitosanitario reduciendo la sensibilidad a la forma activa del insecticida o que
la viacutea metaboacutelica del insecto se modifique negando el metabolismo del compuesto aplicado en su forma toacutexica
[6] Aunque por lo general otros aspectos de la agricultura moderna tienen un mayor impacto en el medio
ambiente los insecticidas se encuentran entre las herramientas agriacutecolas que estaacuten maacutes asociadas con el dantildeo
ambiental Su objetivo especiacutefico es matar a plagas de insectos por lo que puede que tenga un impacto letal en
organismos que no son su objetivo [7]
Por uacuteltimo los fungicidas estaacuten destinados tanto a combatir las plagas de hongos como a combatir las
enfermedades fungosas de las plantas ya sea matando retrasando el desarrollo o inhibiendo la reproduccioacuten de
los hongos Los fungicidas en general se dividen atendiendo al modo de accioacuten de eacutestos en fungicidas de
contacto fungicidas penetrantes o fungicidas sistemaacuteticos
Los fungicidas de contacto protegen uacutenicamente el sitio de aplicacioacuten contra las plagas quedando en el exterior de
la planta de eacutesta manera sin penetrar en el tejido vegetal forman una peliacutecula protectora Cuando alguna espora
de un hongo llega a su superficie se encuentra con esa peliacutecula que le impide penetrar o en su defecto germinar
En el caso de que atraviesen el tejido vegetal bien sea por una alta dosis o por una rotura en las paredes de la
planta se convierten en un producto toacutexico para ella llegando a quemarla
Otro tipo de fungicidas los fungicidas penetrantes como su nombre indica se introducen en el tejido vegetal y
una vez dentro cuentan con muy poca movilidad es decir no circulan por los vasos conductores Al tener la
capacidad de entrar en la planta pueden combatir a los hongos que ya se encuentren dentro de eacutesta pero no
pueden ser toacutexicos para ella porque de lo contrario la dantildeariacutean
Por uacuteltimo nos encontramos con los fungicidas sistemaacuteticos Este tipo de fungicidas actuacutean protegiendo a la
planta contra las plagas en distintas zonas por transfusioacuten del fitosanitario dentro de la misma Esto sucede porque
penetran en el tejido vegetal y circulan por ella a traveacutes de la corriente de los vasos conductores
El meacutetodo de accioacuten de los fungicidas se basa en interferir en el metabolismo de los hongos ya sea por un
4
Capiacutetulo I Introduccioacuten
ataque en la produccioacuten de energiacutea la inhibicioacuten de la mitosis o inhibiendo la formacioacuten de quitina que se trata
del compuesto principal de la pared celular de los hongos y que por ende influye en la permeabilidad de la
membrana [8] [9]
Las enfermedades fuacutengicas fundamentales que nos podemos encontrar en las uvas de la vid son la botritis el oiacutedio
y el mildium las cuales pueden llegar a causar peacuterdidas importantes en viticultura
La enfermedad de la botritis tambieacuten llamada moho gris estaacute causada
por el hongo Botrytis cineacuterea y se puede encontrar en todo el mundo
infectando a un amplio nuacutemero de plantas Se trata de uno de los
patoacutegenos fuacutengicos maacutes interesantes debido a que puede vivir tanto
de forma patoloacutegica produciendo la enfermedad como
alimentaacutendose de materia orgaacutenica en descomposicioacuten La accioacuten
fuacutengica del hongo se lleva a cabo cuando las uvas empiezan a
acumular azuacutecar pudiendo ser muy devastador en algunas
condiciones sobre todo en cultivos empapados por la lluvia o
localizados en un ambiente huacutemedo y con viento produciendo la peacuterdida de los racimos de uvas que son
infectados O por el contrario en otro tipo de condiciones ambientales de sequedad despueacutes de unas
condiciones de humedad dicho hongo le confiere beneficios a ciertos tipos de vino blanco [10]
El oiacutedio es una enfermedad causada por la especie Uncinula necator la cual afecta tanto al rendimiento como a la
calidad de las uvas y altera las cualidades de sus derivados vino mosto etc El proceso de infeccioacuten del oiacutedio
tiene lugar siguiendo un ciclo de reproduccioacuten en las distintas estaciones del antildeo El riesgo de infeccioacuten viene
dado en funcioacuten de la temperatura oacuteptima entre 25-30ordmC humedad del ambiente en el que se encuentre y
tambieacuten en funcioacuten de la temporada siendo maacutes resistentes los racimos de uvas a medida que van madurando El
hongo afecta a todas las parte de la vid hojas tallo y racimos las cuales presentan siacutentomas distintos Las hojas se
vuelven de un color amarillento y se cubren de un polvo fino blanco grisaacuteceo En el tallo el oiacutedio se manifiesta a
traveacutes de manchas difuminadas con coloracioacuten inicial verde oscuro volvieacutendose cada vez maacutes oscuras al final y si
ocurre un ataque fuerte puede desembocar en que el tallo se acabe secando y por consiguiente disminuye la
produccioacuten Pero el ataque maacutes fuerte se produce en los racimos empezando por cubrirse del polvillo blanco
grisaacuteceo y continuando con que el oiacutedio detiene el crecimiento de la piel de la uva con la consecuencia que la uva
se agrieta Esta enfermedad produce unos dantildeos directos en la cantidad y calidad de la cosecha y si no se toman
medidas de prevencioacuten las peacuterdidas pueden llegar a ser totales [12] [13]
Figura I1Enfermedad de botritis en un racimo de uvas [11]
Figura I2 Enfermedad del oiacutedio en hoja tallo y racimo de izquierda a derecha [14] 5
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Por uacuteltimo el mildium o mildiu es una enfermedad producida por el hongo Plasmopara vitiacutecola considerada como
una de las peores enfermedades del cultivo siempre y cuando esteacuten en las condiciones ambientales favorables para
su desarrollo Dichas condiciones oacuteptimas para la propagacioacuten de la enfermedad son las lluvias al amanecer o al
anochecer con una temperatura en un rango de 20-25 ordmC El periacuteodo sensible de la vegetacioacuten de la vintildea es a
partir de una longitud de 10 cm en adelante siendo maacutexima en el periacuteodo de mayor crecimiento de la planta Por
otro lado la sensibilidad del racimo empieza desde su formacioacuten hasta que las uvas al florecer alcanzan el tamantildeo
similar al de un guisante pero de ahiacute en adelante la sensibilidad se ve disminuida Dicho hongo cuenta con un
ciclo reproductivo abarcando varias fases desde la fase de contaminacioacuten siendo el principio hasta la fase de pro-
pagacioacuten Afecta a todos los oacuterganos verdes de la vid y sus siacutentomas son variados en las distintas zonas de eacutesta
En las caras de las hojas aparecen unas manchas amarillentas en los racimos cuando se aproxima la floracioacuten los
que se encuentran infectados se curvan secaacutendose y cubrieacutendose de una pelusa blanquecina y cuando alcanzan el
tamantildeo de un guisante en adelante las uvas de los racimos afectados se van oscureciendo y secando sin que apa-
rezca la fructificacioacuten del hongo ademaacutes de oscurecerse el tallo [15]
12 Estructura propiedades fiacutesico-quiacutemicas y clasificacioacuten
En este trabajo nos centramos en estudiar los residuos de veintitreacutes fitosanitarios tipo fungicida principalmente
aunque tambieacuten alguacuten residuo tipo insecticida Las caracteriacutesticas maacutes importantes de dichos compuestos seraacuten
recogidas en la Tabla I1 que incluye estructuras clasificacioacuten (se ha usado el acroacutenimo ldquoFrdquo en caso de ser
fungicidas e ldquoIrdquo en caso de ser insecticidas) y propiedades fiacutesico-quiacutemicas Las propiedades fiacutesico-quiacutemicas que
pueden resultar maacutes relevantes para este estudio son el pKa ya que la mayoriacutea se trata de compuestos baacutesicos
aunque se encuentre alguacuten aacutecido deacutebil como es por ejemplo el Fenhexamid y Kow describiendo el coeficiente de
reparto entre octanolagua empleado para medir el grado de hidrofobidad que proporciona una estimacioacuten de
la posible distribucioacuten del analito entre materia orgaacutenica y agua
Figura I3 Enfermedad del mildium en la imagen de la izquierda coacutemo afecta a las hojas imagen central coacutemo
afecta a los racimos cuaacutendo estaacuten infectados al comenzar la floracioacuten y en la imagen de la derecha coacutemo afecta a
los racimos en doacutende las uvas tienen tamantildeo mayor al de un guisante [16]
6
Compuesto Estructura Nombre sistemaacutetico Foacutermula CAS Uso ordflog (kow) pKa
Ametoctradin
(AME)
5-ethyl-6-
octyl[124]triazolo[15-
a]pyrimidin-7-amine
C15H25N5 865318-97-4 F 440 278
Benalaxyl
(BEN)
Methyl-N-(phenylacetyl)-N-
(26-xylyl)-D-alaninate C20H23NO3 98243-83-5 F 368 -
Boscalid
(BOS)
2-Chloro-N-(4rsquo-
chlorobiphenyl-2-yl)-
nicotinamide
C18H12Cl2N2O 188425-85-6 F 296 -
Carbendazim
(CAR)
Methyl 2-benzimidazole
carbamate C9H9N3O2 10605-21-7 F 148 420
Cyprodinil
(CYP)
4-Cyclopropyl-6-methyl-N-
phenilpyrimidin-2-amine C14H15N3 121552-61-2 F 400 309
Dimethomorph
(DIM)
(2E)-3-(4-chlorophenyl)-3-(34-
dimethoxyphenyl)-1-
(morpholin-4-yl)prop-2-en-1-
one
C21H22ClNO4 110488-70-5 F 268 -13
Fenhexamid
(FEH)
N-(23-dichloro-4-
hydroxyphenyl)-1-methyl-
cyclohexanecarboxamide
C14H17Cl2NO2 126833-17-8 F 351 73
Fenpropidin
(FEP)
1-[(RS)-3-(4-tert-butylphenyl)-
2-methylpropyl]piperidine C19H31N 67306-00-7 F 26 1013
Fluopicolid
(FLU)
26-dichloro-N-[3-chloro-5-
(trifluoromethyl)-2-
pyridylmethyl]benzamide
C14H8Cl3F3N2O 239110-15-7 F 29 -
Imidacloprid
(IMI)
(E)-1-(6-chloro-3-
pyridylmethyl)-N-
nitroimidazolidin-2-
ylideneamine
C9H10ClN5O2 138261-41-3 I 057 -
Iprovalicarb
(IPR)
Isopropyl (S)-2-methyl-1-[1-(p-
tolyl)ethylcarbamoyl]propyl-
carbamate
C18H28N2O3 140923-17-7 F 32 -
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Tabla I1 Estructura clasificacioacuten y propiedades fiacutesico-quiacutemicas de intereacutes para los analitos de estudio
7
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Compuesto Estructura Nombre sistemaacutetico Foacutermula CAS Uso ordflog (kow) pKa
Mandipropamid
(MAN)
2-(4-chlorophenyl)-N-[3-
methoxy-4-(2-
propynyloxy)phenethyl]-2-(2-
propynyloxy)acetamide
C23H22ClNO4 374726-62-2 F 32 -
Metalaxyl
(MET)
N-(26-dimethylphenyl)-N-
(methoxyacetyl)-DL-alanine
methyl ester
C15H21NO4 57837-19-1 F 175 000
Myclobutanil
(MYC)
2-(4-chlorophenyl)-2-(1H-
124-triazol-1-
ylmethyl)hexanentrile
C15H17ClN4 88671-89-0 F 289 230
Penconazol
(PEN)
1-[2-(24-
dichlorophenyl)pentyl]-1H-
124-triazole
C13H15Cl2N3 66246-88-6 F 372 151
Pyraclostrobin
(PYC)
Methyl2-[1-(4-chlorophenyl)-
1H-pyrazol-3-
yloxymethyl]phenylmetoxy-
carbamate
C19H18ClN3O4 175013-18-0 F 399 -
Pyrimethanil
(PYM)
4-6-dimethyl-N-phenyl-2-
pyrimidinamine C12H13N3 53112-28-0 F 284 352
Tebuconazol
(TEC)
1-(4-chlorophenyl)-44-
dimethyl-3-(1H-124-triazol-1-
ylmethyl)-3-pentanol
C16H22ClN3O 107534-96-3 F 370 500
Tebufenozid
(TEF)
35-dimethylbenzoic acid 1-
(11-dimethylethyl)-2-(4-
ethylbenzoyl)hidrazide
C22H28N2O2 112410-23-8 I 425 -
Thiabendazol
(TBZ)
2-(13-thiazol-4-yl)-1H-
benzimidazole C10H7N3S 148-79-8 F 239 473
Thiamethoxam
(TME)
3-[(2-chloro-5-
thiazolyl)methyl]tetrahydro-5-
methyl-N-nitro-4H-135-
oxadiazin-4-imine
C8H10ClN5O3S 153719-23-4 I -013 -
Thiophanate-
methyl
(THI-M)
DimethylNNrsquo-[12-
phenylenebis(azanediylcarbono
thioyl)] dicarbamate
C12H14N4O4S2 23564-05-8 F 145 728
Triadimenol
(TRI)
1-(4-chlorophenoxy)-33-
dimethyl-1-(1H-124-triazol-1-
yl)-2-butanol
C14H18ClN3O2 55219-65-3 F 318
-
ordf Valores para la forma neutra 8
Capiacutetulo I Introduccioacuten
13 Toxicidad de los pesticidas
En los uacuteltimos antildeos el uso indiscriminado de pesticidas de siacutentesis en agricultura ha creado graves problemas de
salud y medioambientales ya que su uso debido al aumento de la poblacioacuten y por consiguiente de la actividad
agraria se ha incrementado considerablemente Durante las tres uacuteltimas deacutecadas una estimacioacuten dada por la
Organizacioacuten Mundial de la Salud y el Programa de las Naciones Unidas para el Medio Ambiente revela que
aproximadamente cerca de 20000 personas al antildeo mueren generalmente agricultores por exposicioacuten continuada
a alguno de estos toacutexicos En la mayoriacutea de los casos los agricultores utilizan los pesticidas de forma que las
cantidades se desviacutean significativamente de las recomendadas ya que asocian cantidades maacutes altas con mayor
efectividad y velocidad de accioacuten El mal uso de dichos toacutexicos se ve en los signos presentes en los ecosistemas
afectados pudiendo llegar a ser perjudiciales para la salud humana Estos riesgos que causan tanto en la salud
como en el medioambiente pueden ser reducidos o en su defecto evitados mediante la educacioacuten sobre este tipo
de toacutexicos con el fin de frenar su uso excesivo y descontrolado [17]
Desde el punto de vista medioambiental los fitosanitarios empleados en un cultivo pueden persistir en los
distintos medios tierra aire o agua y afectar tanto a ecosistemas terrestres como acuaacuteticos En los sistemas
terrestres los suelos son contaminados mediante la aplicacioacuten del toacutexico de forma directa o como deposicioacuten del
resultado de una suspensioacuten aeacuterea Eacutestos pueden persistir desde varios diacuteas hasta varios antildeos ya que el suelo
retiene y moviliza el toacutexico despueacutes de su emisioacuten Los que persisten maacutes tiempo en el medioambiente tienen una
mayor probabilidad de interaccionar con otros elementos del sistema y si su vida media es mayor a la frecuencia
con la que se aplica el pesticida tienden a acumularse tanto en el suelo como en las especies que habitan en eacutel Por
otro lado el agua es contaminada por pesticidas bien por aplicacioacuten directa por estar presentes en las
precipitaciones de la atmoacutesfera o bien por la movilidad que tienen desde el suelo Tanto los pesticidas solubles
como los insolubles interaccionan con los ecosistemas acuaacuteticos los hidrosolubles persisten maacutes tiempo
solubilizados en agua mientras que los otros se asocian a los sedimentos y se concentran en las especies que
habitan el medio acuaacutetico [18]
Como consecuencia de la amplia distribucioacuten de los toacutexicos en aire suelo y agua se produce una acumulacioacuten de
ellos en los elementos que contribuyen a la alimentacioacuten humana ya que su amplio uso hace que el contacto con
los plaguicidas por parte de personas y animales sea inevitable La contaminacioacuten de los alimentos se puede
presentar por aplicacioacuten directa de los pesticidas el uso de eacutestos durante el manejo transporte y almacenamiento
de los productos comestibles o por su acumulacioacuten en la cadena troacutefica Son bioacumulables en el organismo
debido a su caraacutecter lipofiacutelico lo que les confiere una vida media en los tejidos larga La exposicioacuten a pesticidas
persistentes no tiene la misma repercusioacuten en cada uno de los individuos expuestos sino que se considera criacutetica la
exposicioacuten durante la etapas embrionaria fetal y primeros antildeos de vida en doacutende se transmite de madres a hijos
mediante la gestacioacuten y la lactancia como resultado de la acumulacioacuten en el tejido graso de la madre [19]
9
Capiacutetulo I Introduccioacuten
14 Legislacioacuten
El aumento del uso de fitosanitarios en actividades relacionadas con la produccioacuten de alimentos para consumo
humano o animal tambieacuten desembocoacute en una preocupacioacuten social debido a su toxicidad y bioacumulacioacuten En
respuesta la Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura (FAO) en colaboracioacuten
con la Organizacioacuten Mundial de la Salud (OMS) pusieron en marcha un programa Codex Alimentarius cuyo
objetivo a traveacutes de sus normas y coacutedigos de praacutecticas alimentarias internacionales es garantizar la calidad e
inocuidad de los alimentos que estaacuten al alcance de cualquier persona Con estas normas internacionales los
consumidores pueden confiar en la calidad de los alimentos independientemente de su origen geograacutefico [20]
Todos los alimentos destinados al consumo humano o animal en la Unioacuten Europea estaacuten sujetos a un liacutemite
maacuteximo de residuos de plaguicidas para la proteccioacuten de la salud humana y animal Actualmente en lo referente a
legislacioacuten para el control de la cantidad del toacutexico en la uva estaacute vigente el Reglamento 3962005 del Parlamento
Europeo y del Consejo de 23 de febrero de 2005 referido a la regulacioacuten de los liacutemites maacuteximos de residuos de
plaguicidas en alimentos y piensos de origen vegetal y animal El liacutemite maacuteximo de residuos (LMR) se define co-
mo el nivel maacutes alto de un residuo de un pesticida que se tolera de manera legal sobre los alimentos o piensos
cuando se aplican correctamente Las cantidades de residuos que se encuentren deben ser lo maacutes bajas posible
para garantizar la seguridad en la alimentacioacuten de los consumidores Dichos liacutemites maacuteximos de residuos estaacuten
fijados por la Comisioacuten Europea pudieacutendose encontrar en su base de datos LMR [21]
A continuacioacuten en la Tabla I2 se resumen los LMRs de los compuestos de este estudio en uvas de vinificacioacuten
en unidades de mgkg de uva En el caso del vino no hay legislacioacuten en lo referente a estos pesticidas solamente
la recomendacioacuten de no superar el 10 del valor del LMR en uva
Compuesto LMRs (mgkg uva) Compuesto LMRs (mgkg uva)
AME 6 MET 1
BEN 03 MYC 1
BOS 5 PEN 02
CAR 05 PYC 2
CYP 3 PYM 5
DIM 3 TEC 1
FEH 15 TEF 3
FEP 001 TBZ 005
FLU 2 TME 04
IMI 1 THI-M 3
IPR 2 TRI 2
MAN 2
Tabla I2 Liacutemites maacuteximos de residuos permitidos para los compuestos estudiados en uvas
10
Capiacutetulo I Introduccioacuten
2 MEacuteTODOS DE PREPARACIOacuteN DE MUESTRA APLICADOS A MUESTRAS DE VINO
21 Extraccioacuten liacutequido-liacutequido (LLE)
Se entiende por extraccioacuten liacutequido-liacutequido al meacutetodo mediante el cual un analito de intereacutes se separa por el
contacto con otra fase en la cual tiene mayor afinidad de la matriz en la que se halle Los procesos de extraccioacuten
implican dos fases y requieren tres pasos sucesivos mezcla de materia prima y disolvente separacioacuten de las dos
fases despueacutes del contacto y eliminacioacuten del disolvente que contiene el analito [22]
La extraccioacuten liacutequido-liacutequido (LLE) se basa en la distribucioacuten
de un analito entre dos fases liacutequidas inmiscibles en las
cuales analito y matriz tienen solubilidades diferentes
Principalmente una de las fases es un medio acuoso en
general se trata de la muestra y la otra un disolvente
orgaacutenico La selectividad y eficacia de este meacutetodo vienen
determinadas por la eleccioacuten del disolvente y por los factores
que pueden afectar al proceso de equilibrio (pH adiccioacuten de
sales neutras en la fase acuosa para reducir la solubilidad del
analito etc) [23] Esta teacutecnica permite llevar a cabo extracciones para un rango muy amplio de analitos siendo
una de las maacutes antiguas para la preparacioacuten de muestras en el anaacutelisis cualitativo y cuantitativo Ofrece grandes
capacidades de muestreo lineal y cuenta con la ventaja de la cantidad de informacioacuten existente sobre este meacutetodo
[24]
22 Extraccioacuten en fase soacutelida (SPE)
En 1978 aparecieron los primeros cartuchos desechables para la extraccioacuten en fase soacutelida y actualmente casi 40
antildeos despueacutes la extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) es la teacutecnica de preparacioacuten de muestras maacutes empleada en los
laboratorios Es una teacutecnica de preparacioacuten y tratamiento de muestras que se basa en la retencioacuten en una fase
adsorbente del analito de intereacutes presente en una muestra liacutequida que pasa a traveacutes de ella Debido a la variedad de
formatos (discos cartuchos y jeringas) y tipos de adsorbentes (los maacutes comunes carboacuten activo aluacutemina siacutelica gel
silicato de magnesio siacutelices enlazadas y poliacutemeros como por ejemplo estinero-divinilbenceno) o la facilidad de
automatizacioacuten y acoplamiento con otras teacutecnicas como por ejemplo una conexioacuten directa con un sistema de
Figura I4 Fundamentos teoacutericos de la LLE [25]
11
Capiacutetulo I Introduccioacuten
cromatografiacutea este meacutetodo le fue ganando terreno a la LLE Otra ventaja muy importante de la SPE frente a la
LLE es la disminucioacuten en la cantidad de disolvente orgaacutenico empleada Cada vez se va innovando maacutes sobre esta
teacutecnica llegando a encontrarse fases adsorbentes formadas por poliacutemeros capaces de retener en un uacutenico
cartucho un amplio abanico de analitos lipofiacutelicos o hidrofoacutebicos aacutecidos baacutesicos o neutros [26]
El fundamento de esta extraccioacuten como se puede en la Figura I6
consiste en cuatro etapas acondicionamiento adiccioacuten de muestra
retencioacuten y elucioacuten de los analitos de intereacutes En primer lugar antes
de empezar la extraccioacuten se requiere una etapa de acondicionamiento
para preparar el adsorbente haciendo pasar un poco de disolvente
para asiacute interaccionar mejor con la muestra Luego se hace pasar la
muestra liacutequida por la fase soacutelida Idealmente el adsorbente retiene
los analitos selectivamente a medida que va pasando la muestra y la
matriz pasa sin ser retenida Por uacuteltimo los analitos se eluyen del
adsorbente con un disolvente con el que tenga mayor afinidad [27]
23 Teacutecnicas de microextraccioacuten
231 Microextraccioacuten en fase soacutelida (SPME)
En la microextraccioacuten en fase soacutelida (SPME) se utilizan fibras de siacutelice fundida revestidas con un poliacutemero en un
disentildeo en forma de jeringa para la extraccioacuten de los analitos de intereacutes El principio por el que se rige esta
extraccioacuten es el reparto del analito entre la matriz de la muestra y el revestimiento de la fibra mediante un proceso
no competitivo Se trata de un meacutetodo que cuenta con muchas ventajas ya que se elimina completamente el uso de
disolventes y aparte no son necesarios voluacutemenes de muestra grandes pero tambieacuten cuenta con algunas
desventajas ya que tanto la capacidad como la sensibilidad se ven limitadas [29]
En la figura I7 podemos ver las etapas de la extraccioacuten En un
vial cerrado con una caacutepsula y un seacuteptum tenemos la muestra
liacutequida o bien soacutelida que contenga los analitos de intereacutes
volaacutetiles Con la jeringa se perfora el seacuteptum y una vez dentro
se acciona el eacutembolo para la exposicioacuten de la fibra con los
analitos introducieacutendola en la muestra liacutequida o en su defecto
en el espacio de cabeza para la extraccioacuten de analitos volaacutetiles
de una muestra soacutelida Despueacutes de la extraccioacuten dentro del vial
Figura I6 Etapas de una SPE [28]
Figura I7 Etapas de una SPME [30]
12
Capiacutetulo I Introduccioacuten
la fibra se introduce de nuevo en la jeringa y se retira del vial [27]
232 Microextraccioacuten en fase liacutequida (LPME)
La microextraccioacuten en fase liacutequida se desarrolloacute como una alternativa a la LLE para la reduccioacuten en la cantidad de
disolventes orgaacutenicos siendo rentable tanto para el medioambiente como econoacutemicamente Entre las modalidades
maacutes populares de esta teacutecnica se encuentran microextraccioacuten con gota suspendida (SDME) y microextraccioacuten
liacutequido-liacutequido dispersiva (DLLME) En la SDME una gota de disolvente orgaacutenico es expuesta al espacio de
cabeza situado sobre una muestra en un vial dicha gota es suspendida del extremo de una microjeringa Por otro
lado la DLLME sobre una muestra acuosa se inyecta un pequentildeo volumen de una mezcla de disolventes en la
cual es dispersada formando una solucioacuten en la que se establece el equilibrio El disolvente de extraccioacuten debe
presentar una densidad inferior a la de la muestra para facilitar su recuperacioacuten normalmente despueacutes de
centrifugar el vial doacutende se realiza la extraccioacuten [31]
24 QuEChERS
La extraccioacuten QuEChERS de las palabras en ingleacutes Quick Easy Cheap Effective Rugged and Safe es un meacutetodo
de extraccioacuten que se desarrolloacute entre 2000 y 2002 para el anaacutelisis de pesticidas Como su nombre indica raacutepido
faacutecil barato eficaz robusto y seguro son las principales
caracteriacutesticas de esta preparacioacuten de muestra Se realiza en dos
etapas en primer lugar una extraccioacuten simple y una segunda fase
de purificacioacuten En la primera etapa tenemos el vial con la
muestra en el cual se antildeade un disolvente generalmente
acetonitrilo para la extraccioacuten de los analitos de intereacutes en
presencia de diferentes sales (en el meacutetodo original se utiliza
sulfato de magnesio y cloruro de sodio) para facilitar la separacioacuten
de las fases En la segunda parte se realiza la purificacioacuten de la
fraccioacuten del extracto orgaacutenico Para eso se lleva a cabo una
limpieza de los analitos eliminando el agua y los compuestos
presentes en la matriz de la muestra empleando un adsorbente PSA (amina primaria y secundaria) C18 carboacuten
negro grafitizado (GCB) o una combinacioacuten de eacutestas [32]
Figura I8 Etapas de QuEChERS [33]
13
Capiacutetulo I Introduccioacuten
3 METODOLOGIacuteA ANALIacuteTICA PARA LA DETERMINACIOacuteN DE PESTICIDAS
31 Meacutetodos de GC-MS (MSMS)
La combinacioacuten de cromatografiacutea de gases (GC) teacutecnica de separacioacuten con espectrometriacutea de masas (MS) como
sistema de deteccioacuten representa un potente meacutetodo para la identificacioacuten determinacioacuten y cuantificacioacuten de
analitos orgaacutenicos en concentraciones traza presentes en muestras complejas Esta teacutecnica de anaacutelisis cuenta con
muchas ventajas en sensibilidad multifuncionalidad buena reproducibilidad robustez asiacute como facilidad en el
manejo pero con una gran desventaja este meacutetodo no es apto para ser utilizado con todos los analitos sino que
se ve limitado a aquellos que sean termoestables y no se descompongan a temperaturas elevadas antes de ser
volatilizados La muestra es introducida a traveacutes del inyector en el cromatoacutegrafo de gases doacutende impulsada por
una corriente de gas inerte como fase moacutevil pasa a traveacutes de la columna que contiene la fase estacionaria en la
cual se separan los compuestos debido a una distribucioacuten de estos entre fase moacutevil-fase estacionaria Mediante
una interfase son introducidos para su deteccioacuten en el espectroacutemetro de masas que cuenta con una fuente de
iones analizador de masas y un detector [34]
La combinacioacuten de analizadores de masas en taacutendem (MSMS) como sistema de deteccioacuten en GC es una teacutecnica
altamente selectiva mejorando la sensibilidad y la relacioacuten sentildeal-ruido en los espectros experimentando una
mejora por lo que se logran unos liacutemites de deteccioacuten inferiores Esta teacutecnica GC-MSMS comprende maacutes
pasos despueacutes de la separacioacuten por cromatografiacutea se lleva a cabo la deteccioacuten con MSMS que consta de varias
etapas generacioacuten de iones en la fuente de ionizacioacuten seleccioacuten de los iones precursores de una determinada
masa disociacioacuten causada por colisioacuten con moleacuteculas de gas inerte de los iones precursores y por uacuteltimo el
anaacutelisis de los fragmentos en relacioacuten a su masacarga (mz) En el caso de que un espectro de MS no permita
confirmar la identidad de un determinado compuesto quiacutemico la obtencioacuten de su espectro de MSMS permite
mejorar la confianza en su identificacioacuten [36]
Figura I9 Acoplamiento GC-MS [35]
14
Capiacutetulo I Introduccioacuten
32 Meacutetodos LC-MS (MSMS)
La teacutecnica de LC-MS se desarrolloacute para minimizar las desventajas del acoplamiento GC-MS y asiacute resolver los
problemas que este uacuteltimo acarreaba con los analitos termolaacutebiles permitiendo el anaacutelisis de eacutestos sin tener que
realizar una etapa previa de derivatizacioacuten La interfase de unioacuten de cromatografiacutea liacutequida (LC) con espectrometriacutea
de masas (MS) acarrea una dificultad significativa siendo responsable de transformar los analitos que se
encontraban en la fase moacutevil liacutequida en iones en fase gas sin que se produzca su degradacioacuten teacutermica La
sensibilidad de las determinaciones por LC-MS va a depender de la interfase empleada Las principales interfases
empleadas actualmente son las ionizaciones a presioacuten atmosfeacuterica electrospray (ES) e ionizacioacuten quiacutemica a
presioacuten atmosfeacuterica (APCI) [37]
Con los antildeos la cromatografiacutea liacutequida se ha ido innovando y mediante la disminucioacuten del tamantildeo de partiacutecula en
la columna se fue mejorando la eficiencia asiacute como aumentando la selectividad y resolucioacuten del pico en el
cromatograma Para este nuevo sistema llamado UPLC Ultra-Performance Liquid Chromatography se desarrolloacute
una nueva instrumentacioacuten capaz de trabajar a altas presiones generando flujos mayores sin peacuterdidas de
resolucioacuten utilizando inyectores automaacuteticos maacutes raacutepidos y detectores con mayor velocidad de adquisicioacuten de
datos disminuyendo asiacute el tiempo de anaacutelisis [39]
33 Espectrometriacutea de masas
La espectrometriacutea de masas es el meacutetodo de deteccioacuten y cuantificacioacuten maacutes fiable a la hora de la determinacioacuten de
compuestos en matrices complejas (tales como alimentos) ya que otros detectores maacutes tradicionales como UV-
visible o fluorescencia cuentan con una gran incertidumbre en los resultados llegando incluso a ofrecer falsos
Figura I10 Acoplamiento LC-MS [38]
15
Capiacutetulo I Introduccioacuten
positivos o negativos Un espectrometro de masas cuenta con un dispositivo de introduccioacuten de muestra una
caacutemara de ionizacioacuten un sistema para la aceleracioacuten de los iones uno o varios analizadores de masas y un detector
[40]
El fundamento de la espectrometriacutea de masas se basa en la separacioacuten de iones en base a la relacioacuten masacarga
(mz) El proceso consta fundamentalmente de cuatro etapas La
primera es la ionizacioacuten de la muestra los iones formados se aceleran
debido a la accioacuten de un campo eleacutectrico variable separacioacuten de los
iones seguacuten su masacarga deteccioacuten de los iones y produccioacuten de la
sentildeal eleacutectrica El analizador de masas es el encargado de la separacioacuten
de los iones en funcioacuten a su mz entre los que maacutes destacan
analizador de masas cuadrupolar que dispersa simultaacuteneamente todos
los iones en funcioacuten de la relacioacuten mz analizador de masas de
tiempo de vuelo (TOF) consta de un tubo a alto vaciacuteo sobre el que no
actuacutea ninguacuten campo eleacutectrico al cual llegan todos los iones acelerados con la misma energiacutea cineacutetica y en el tubo
las velocidades variacutean seguacuten mz y analizador de trampa de iones en doacutende los iones gaseosos quedan aislados
durante largos periacuteodos de tiempo por la accioacuten del campo eleacutectrico [41]
4RESUMEN BIBLIOGRAacuteFICO DE LAS TEacuteCNICAS DE EXTRACCIOacuteN Y
DETERMINACIOacuteN DE PESTICIDAS EN VINO
En la bibliografiacutea se han descrito diversas teacutecnicas y diferentes combinaciones entre teacutecnicas de extraccioacuten y
distintas teacutecnicas de cuantificacioacuten e identificacioacuten para esos analitos Entre estas teacutecnicas los valores de los liacutemites
de cuantificacioacuten (LOQs) y las recuperaciones relativas pueden diferir en el resultado en un rango de valores asiacute
como el tiempo total empleado para el anaacutelisis y para la preparacioacuten de la muestra
Por lo general el meacutetodo de extraccioacuten de los analitos de intereacutes maacutes empleado es la extraccioacuten en fase soacutelida
(SPE) la cuaacutel le ha estado ganando terreno a la extraccioacuten liacutequido-liacutequido aunque tambieacuten se estaacute viendo cada vez
maacutes desplazada debido al creciente uso de la teacutecnica QuEChERS
Figura I11 Etapas de la espectrometriacutea de masas [42]
16
Capiacutetulo I Introduccioacuten
En el estudio de ECONOMOU et al [43] realizado en el antildeo 2009 en Grecia se empleoacute la extraccioacuten en fase
soacutelida con deteccioacuten en cromatografiacutea de liacutequidos acoplada a espectrometriacutea de masas en taacutendem (SPE-LC-ESI-
MSMS) Para la preparacioacuten de la muestra diluyeron 10 mL de vino (tanto blanco como tinto) a un volumen
final de 100 mL con agua ultrapura antes de la SPE Determinaron las recuperaciones de la extraccioacuten para dos
niveles de concentracioacuten 0010 y 0050 mgL realizando 8 medidas diarias durante 3 diacuteas consecutivos
encontraacutendose unos valores que variacutean dentro del rango 70-110 para todos los pesticidas en los dos niveles Para
la determinacioacuten y cuantificacioacuten de 46 pesticidas emplearon la teacutecnica de cromatografiacutea de liacutequidos con
espectrometriacutea de masas con un volumen de inyeccioacuten de 20 microL y un flujo de fase moacutevil de 02 mLmin
aclopada a espectrometriacutea de masas en taacutendem
Con la misma teacutecnica de extraccioacuten PELAJIĆ et al [45] durante el antildeo 2015 en Croacia llevaron a cabo la
determinacioacuten de 25 residuos de plaguicidas en vino tinto El meacutetodo que desarrollaron para dicha finalidad fue el
acoplamiento SPE-GC-MS Para la preparacioacuten de la muestra emplearon 10 mL de vino diluidos 11 con agua
ultrapura hasta un volumen final de 20 mL Calcularon las recuperaciones de la extraccioacuten y se encontroacute un rango
para todos los pesticidas en las muestras de 70-120 Para la determinacioacuten en cromatografiacutea de gases-
espectrometriacutea de masas se empleoacute un volumen de inyeccioacuten de 5 μL y un flujo de fase moacutevil de 10 mLmin
Mediante el acoplamiento de teacutecnicas SPE dispersiva-GC-MS WALORCZYK et al [48] en el antildeo 2011 en
Polonia llevaron a cabo la cuantificacioacuten de 160 pesticidas en diferentes clases de vino tinto rosado y blanco Con
10 g de vino y 10 mL de acetonitrilo se realizaron pruebas de recuperacioacuten en la fase de extraccioacuten para vino
tinto con los niveles de concentracioacuten 001 005 y 02 mgkg y para los vinos rosado y blanco con el nivel de
concentracioacuten 005mgkg y encontraron que a todos los niveles de concentracioacuten los valores de recuperacioacuten
rondan el rango 80-110 Para la teacutecnica cromatograacutefica se utilizoacute un volumen de inyeccioacuten de 5 microL
El acoplamiento LLE-SPE-LCDAD fue desarrollado por GONZAacuteLEZ-RODRIacuteGUEZ et al [50] en el antildeo
2010 en la provincia de Orense para la determinacioacuten de nuevos fungicidas propuestos para combatir el hongo
que provoca la enfermedad del mildium En la preparacioacuten de la muestra emplearon 15 mL de vino blanco para la
extraccioacuten en la cual fueron calculadas las recuperaciones relativas para dos niveles de concentracioacuten 005 y 05
mgkg en donde se establece un rango de entre 70-110 para todos los analitos Para la determinacioacuten mediante
cromatografiacutea de liacutequidos se empleoacute un volumen de inyeccioacuten de 2 μL y como meacutetodo de deteccioacuten utilizaron un
detector de diodos array
La microextraccioacuten sorptiva en fase soacutelida fue empleada en la publicacioacuten de FONTANA et al [44] junto con un
acoplamiento entre cromatografiacutea de liacutequidos y espectrometriacutea de masas para la determinacioacuten de 15 fungicidas
en vino realizada durante el 2010 en el noroeste de Espantildea Para la preparacioacuten de la muestra emplearon 10 mL
17
Capiacutetulo I Introduccioacuten
de vino diluiacutedos con el mismo volumen de agua ultrapura y un sorbente en forma de disco de silicona con un
volumen de 12 microL La recuperacioacuten de la extraccioacuten se calculoacute para vino tinto (Menciacutea) y vino blanco (Godello)
realizando tres replicas dentro de un mismo diacutea para los niveles de concentracioacuten 10 y 50 ngmL y nueve reacuteplicas
realizando el anaacutelisis en tres diacuteas consecutivos para el nivel de concentracioacuten de 25 ngmL y los resultados
obtenidos dan unos valores de recuperacioacuten dentro del rango 75-117 En el sistema LC-QTOF-MS el volumen
de inyeccioacuten fue de 15 microL
El otro meacutetodo de extraccioacuten mencionado anteriormente es QuEChERS estaacute en auge como meacutetodo de extracioacuten
de residuos de pesticidas en matrices como la del vino o la uva ya que incrementa la velocidad del anaacutelisis y reduce
el efecto de matriz BUERGE et al [46] seguido de una deteccioacuten mediante GC-MSMS realizaron una estapa
de extraccioacuten QuEChERS con alguna modificacioacuten acetato de sodio en lugar de cloruro soacutedico y acetato de etilo
en lugar de acetonitrilo utilizando 5 g de uva para la determinacioacuten de residuos de 4 pesticidas durante el antildeo
2016 Las recuperaciones de extraccioacuten resultaron ser valores entre 91-149 en uva a distintos niveles de
concentracioacuten 005 05 y 5 mgkg
Para la determinacioacuten de Ametoctradin HU et al [47] llevaron a cabo una extraccioacuten QuEChERS empleando 10
g de uva con deteccioacuten mediante el acoplamiento UPLC-MSMS utilizando un volumen de inyeccioacuten de 5 μL y
un flujo de fase moacutevil de 03 mLmin Las recuperaciones de la extraccioacuten se calcularon para tres niveles de
concentracioacuten 1 10 100 μgL de dos formas distintas en tres diacuteas consecutivos realizando 5 reacuteplicas al diacutea o en
dentro de un mismo diacutea realizando 15 reacuteplicas los resultados de todos los caacutelculos se encuentran dentro del rango
818-1001
Siguiendo con el mismo modo de extraccioacuten GUO et al [49] publicaron sus estudios para la determinacioacuten de
50 pesticidas y 12 adulterantes en vino tinto Para la extraccioacuten QuEChERS se utilizaron 10 mL de vino tinto con
10 mL de acetonitrilo y calcularon las recuperaciones para tres niveles de concentracioacuten 50 100 y 250 ngmL
encontraacutendose un rango de valores entre 75-120 El meacutetodo de deteccioacuten se llevoacute a cabo mediante un anaacutelisis
directo en tiempo real junto con espectrometriacutea de masas en tandem con un cuadrupolo (DART-MSMS) la
teacutecnica DART es un meacutetodo raacutepido para cribar y cuantificar los analitos de estudio que prescinde de la etapa de
separacioacuten cromatograacutefica
A continuacioacuten se recogen en la Tabla I3 los liacutemites de cuantificacioacuten (LOQs) de los analitos de intereacutes en este
trabajo caacutelculados por los diferentes meacutetodos encontrados en bibliografiacutea citados anteriormente en este apartado
18
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Tabla I3 LOQs de los analitos de intereacutes descritos para los distintos meacutetodos encontrados en la bibliografiacutea
Compuesto LOQs
Compuesto LOQs
V Blanco V Tinto Uva V Blanco V Tinto Uva
AME - - 0032μgkg[47] MET 86 μgL[43]
22 μgL[44]
89 μgL[43]
22 μgL[44]
5 μgL[45]
259 ngmL[49]
001mgkg[48]
BEN 02 μgL[44]
0001 mgL[50]
02 μgL[44]
001 μgL[45]
280ngmL[49]
005 mgkg[48] MYC 30 μgL[43]
08 μgL[44]
36 μgL[43]
10 μgL[44]
025 μgL[45]
331ngmL[49]
001 mgkg[48]
BOS 0065 mgL[50] 05 μgL[45]
1076 ngmL[49] 001 mgkg[48] PEN
56 μgL[43]
05 μgL[44]
49 μgL[43]
04 μgL[44]
220ngmL[49]
001 mgkg[48]
CAR - 386 ngmL[49] - PYC 0003mgL[50] 07 μgL[45] 001 mgkg[48]
CYP 15 μgL[43]
04 μgL[44]
0001 mgL[50]
22 μgL[43]
06 μgL[44]
312 ngmL[49]
001 mgkg[48] PYM 17 μgL[43] 22 μgL[43]
10 μgL[45] 001 mgkg[48]
DIM 18 μgL[43] 20 μgL[43] 001 mgkg[48] TEC 03 μgL[44]
03 μgL[44]
10 μgL[45]
160ngmL[49]
001 mgkg[48]
FEH 17 μgL[43] 22 μgL[43]
938 ngmL[49] 001 mgkg[48] TEF - 876ngmL[49] -
FEP - - 002mgkg[46] TBZ 15μgL [43] 29μgL[43] 001 mgkg[48]
FLU 005 μgL[45] TME - 25 μgL[45] 001 mgkg[48]
IMI 21 μgL[43] 22 μgL[43]
225 ngmL[49] - THI-M 92 μgL[43] 89 μgL[43] -
IPR 07 μgL[44] 07 μgL[44] 001 mgkg[48] TRI 10 μgL[44] 12 μgL[44] 001 mgkg[48]
MAN 0011 mgL[50] - -
5 DISTRIBUCIOacuteN DE PESTICIDAS EN VINOS COMERCIALES
En algunos de los meacutetodos descritos en el apartado anterior se procesaron vinos comerciales encontraacutendose
resultados positivos para muchos residuos de pesticidas y algunos hasta en gran concentracioacuten
ECONOMOU et al [43] mediante el meacutetodo LC-ESI-MSMS realizaron el anaacutelisis de 60 muestras de vino tinto
y blanco recogidos en supermercados locales en Grecia a lo largo de un antildeo El meacutetodo se habiacutea desarrollado
19
Capiacutetulo I Introduccioacuten
para la determinacioacuten de 46 pesticidas pero la mayoriacutea se encuentran con una concentracioacuten por debajo de
001mgL solo ocho plaguicidas se obtuvieron con resultados de concentracioacuten mayores Se muestran los
resultados en la Tabla I4 de los analitos de intereacutes en este estudio
Tabla I4 Nuacutemero de muestras positivas de distintos pesticidas en el anaacutelisis de 60 muestras de vino [43]
Compuesto Positivos con concentracioacuten entre 001-01
mgL
Positivos con concentracioacuten entre 01-1
mgL
PYM 2 (3) 2 (3)
MYC 2 (3) 0 (0)
CAR 11 (18) 7 (12)
THI-M 7 (12) 5 (8)
FEH 5 (8) 0 (0)
MET 1 (2) 0 (0)
Mediante el meacutetodo de microextraccioacuten en fase soacutelida-LC-TOF-MS FONTANA et al [44] aplicaron el
desarrollo del procedimiento a un total de 12 vinos joacutevenes elaborados en el 2010 y correspondientes a diferentes
denominaciones geograacuteficas del noroeste de Espantildea En la Tabla I5 se muestran los datos que han obtenido
Tabla I5 Determinacioacuten de fitosanitarios en vinos comerciales mediante Microextraccioacuten en fase soacutelida-LC-TOF-MS
Valores de concentracioacuten en ngmL [44]
Pesticidas
W 1
Albarintildeo
W5
Ribeiro
W6
Valdeorras
R1
Ribeira Sacra
R3
Ribeiro
R4
Valdeorras
MET 404plusmn06 223plusmn05 311plusmn007 25plusmn03 31plusmn03 74plusmn10
TRI nd nd 36plusmn06 nd nd ltLOQ
IPR 394plusmn03 324plusmn02 324plusmn02 071plusmn007 31plusmn02 28plusmn05
MYC nd nd nd ltLOQ 39plusmn02 nd
TEC 25plusmn01 nd nd nd nd nd
CYP 179plusmn08 ltLOQ ltLOQ 562plusmn002 083plusmn001 nd
BEN 042plusmn001 nd ltLOQ nd 032plusmn001 ltLOQ
ndNo detectados ltLOQ por debajo del liacutemite de cuantificacioacuten del meacutetodo los coacutedigos W y R corresponden respecti-vamente a los vinos blanco y tinto
20
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Por uacuteltimo PELAJIĆ et al [45] aplicaron su meacutetodo SPE dispersiva-GC-MS mediante el cual determinaron 25
residuos de plaguicidas en vino tinto a un total de 32 muestras de vino adquiridos en supermercados locales de
Croacia pero de diversos oriacutegenes de procedencia Los resultados que han obtenido se muestran en la Tabla I6
en doacutende un total de 15 plaguicidas han sido detectados y 7 de los cuales se encontraban en una alta
concentracioacuten
Tabla I6 Resultados de los vinos con positivos en pesticidas y sus concentraciones [45]
Vino Paiacutes Residuos de pesticidas (mgKg)
Tinto Francia DIM (0013) MET (0009) IPR (001)
Tinto Alemania BOS (0011)
Tinto Alemania IPR (0009)
Tinto Macedonia MET (0015)
Tinto Moldavia IPR (0008)
Tinto Polonia MET (004)
Tinto Rumania PYM (0058)
Tinto Espantildea TRI (0005) MET (0011)
Tinto Estados Unidos BOS (001)
Rosado Francia BOS (0005)
Blanco Chile TEC (0008)
Blanco Georgia MET (0057)
Blanco Alemania DIM (001) IPR (0054) PYM (0056)
Blanco Sudaacutefrica DIM (0011) IPR (0011)
21
Capiacutetulo II Objetivos y discusioacuten
CAPIacuteTULO II OBJETIVOS Y DISCUSIOacuteN
El objetivo principal que se persigue en este trabajo es el desarrollo de un meacutetodo analiacutetico raacutepido basado en la
extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) y deteccioacuten mediante cromatografiacutea de liacutequidos en la modalidad de UPLC
acoplada a la espectrometriacutea de masas en taacutendem (UPLC-MSMS) para la determinacioacuten multianalito de residuos
de fitosanitarios principalmente fungicidas aunque tambieacuten alguacuten insecticida en muestras de vino blanco y tinto
Para llevar a cabo la finalidad de lo dicho se consideran unos objetivos maacutes especiacuteficos
Minimizar la manipulacioacuten de la muestra para asiacute reducir la cantidad de disolventes y tiempo empleado
Optimizacioacuten de los factores que afectan en la extraccioacuten en la SPE tales como tipo y cantidad de
adsorbente volumen de eluyente etc
Estudio de las condiciones en UPLC-MSMS para una separacioacuten y cuantificacioacuten oacuteptimas
Caracterizacioacuten y validacioacuten del meacutetodo propuesto
Por uacuteltimo una vez cumplidos todos los objetivos anteriores y fijadas las condiciones oacuteptimas el meacutetodo
estudiado se aplica en el anaacutelisis de muestras de vino comercial (blanco y tinto) para determinar si se encuentran
residuos presentes asiacute como conocer en queacute concentracioacuten se encuentran los pesticidas objeto de este estudio
22
Capiacutetulo III Parte experimental
CAPIacuteTULO III PARTE EXPERIMENTAL
1 MATERIAL Y REACTIVOS
11 Material
Material de vidrio de uso comuacuten en el laboratorio vasos de precipitados matraces aforados etc
Micropipetas automaacuteticas de 20-200 microL 20-200 microL 100-1000 microL 1000-5000 microL Eppendorf
Puntas de plaacutestico para micropipetas
Encapsulador y desencapsulador
Soportes y pinzas
Viales de 15 mL transparentes para muestreador automaacutetico de cromatografiacutea (Sugelabor)
Caacutepsulas de aluminio con seacuteptum de Tefloacuten (Sugelabor) y tapones pre-slit para viales
Tubos y conectores de tefloacuten
Cartuchos de divinilbenceno-N-vinilpirrolidona 200 mg Oasis HLB Waters
Cartuchos de divinilbenceno-N-vinilpirrolidona funcionalizados con grupos amina cuaternaria 150 mg
Oasis MAX Waters
Cartuchos de divinilbenceno-N-vinilpirrolidona 60 mg Oasis HLB Waters
12 Reactivos y disolventes
Agua ultrapura Milli-Q
Aacutecido foacutermico (Sigma Aldrich) 95
Acetonitrilo (LichrosolvregMerck) Gradient grade for liquid chromatography
Metanol (LichrosolvregMerck) Gradient grade for liquid chromatography
Etanol (LichrosolvregMerck) Gradient grade for liquid chromatography
13 Patrones
Ametoctradin (AME) Dr Ehrenstrorfer 990
Benalaxyl (BEN) Pestanal Sigma- Aldrich 999
23
Capiacutetulo III Parte experimental
Boscalid (BOS) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Carbendazim (CAR) Pestanal Sigma- Aldrich 992
Cyprodinil (CYP) Pestanal Sigma- Aldrich 998
Dimethomorph (DIM) mezcla de isoacutemeros E + Z Pestanal Sigma- Aldrich 989
Fenhexamid (FEH) Pestanal Sigma- Aldrich 997
Fenpropidin (FEP) Dr Ehrenstrorfer 980
Fluopicolide (FLU) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Imidacloprid (IMI) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Iprovalicarb (IPR) mezcla de isoacutemeros Pestanal Sigma- Aldrich 985
Mandipropamid (MAN) Pestanal Sigma- Aldrich 991
Metalaxyl (MET) Pestanal Sigma- Aldrich 990
Myclobutanil (MYC) Pestanal Sigma- Aldrich 994
Penconazole (PEN) Pestanal Sigma- Aldrich 991
Pyraclostrobin (PYC) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Pyrimethanil (PYM) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Tebuconazol (TEC) Pestanal Sigma- Aldrich 996
Tebufenozide (TEF) Dr Ehrenstrorfer 988
Thiabendazole (TBZ) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Thiamethoxam (TME) Pestanal Sigma- Aldrich 996
Thiophanate-methyl (THI-M) Dr Ehrenstrofer 990
Triadimenol (TRI) Mezcla de diastereoisoacutemeros Pestanal Sigma- Aldrich 994
14 Patrones internos
Carbendazim-d3 (CAR-d3) Pestanal Sigma- Aldrich 998
Cyprodinil-d5 (CYP-d5) Pestanal Sigma- Aldrich
Imidacloprid-d4 (IMID-d4) Pestanal Sigma- Aldrich
Metalaxyl 13C6 (MET13C6) Pestanal Sigma-Aldrich 99
24
Capiacutetulo III Parte experimental
15 Gases
Nitroacutegeno 99999 como gas de colisioacuten en el espectroacutemetro de masas
Nitroacutegeno en los sistemas de concentracioacuten y secado por corriente de nitroacutegeno de los cartuchos SPE
2 INSTRUMENTACIOacuteN
Balanza analiacutetica de precisioacuten Sartorius
Granatario Sartorius
Bantildeo de ultrasonidos P-Selecta
Equipo de purificacioacuten de agua Millipore modelo Milli-Q gradient A-10ZMQSSVOT4
Estacioacuten de concentracioacuten por corriente de nitroacutegeno Mini-Vap Supelco
Sistema de secado de cartuchos de SPE por corriente de nitroacutegeno VisiDry Supelco
Sistema distribuidor de vaciacuteo Visiprep reg Supelco
Cromatoacutegrafo de liacutequidos de ultra-alta resolucioacuten Waters AcquityUPLC reg y espectroacutemetro de masas
Acquity TQD con analizador de triple quadrupolo (QqQ) equipado con una fuente de ionizacioacuten a
presioacuten atmosfeacuterica del tipo Z-spray (ESI)
3 PREPARACIOacuteN DE LAS DISOLUCIONES
Los patrones de pesticidas se prepararon individualmente a partir de los compuestos soacutelidos comerciales por
pesada excepto en el caso del fenpropidin (FEP) que se preparoacute a partir del compuesto liacutequido comercial Estos
compuestos soacutelidos se disolvieron en metanol y se obtuvieron unas disoluciones iniciales con concentraciones
recogidas en la Tabla III1
25
Capiacutetulo III Parte experimental
Tabla III1 Concentracioacuten de las disoluciones patroacuten stock
Compuesto Concentracioacuten (microgmL) Compuesto Concentracioacuten (microgmL)
AME 102201 MET 118912
BEN 138330 MYC 102017
BOS 99474 PEN 129791
CAR 17105 PYC 104581
CYP 131075 PYM 141386
DIM 103009 TEC 134729
FEH 99584 TEF 137769
FEP 100000 TBZ 105928
FLU 126859 TME 112283
IMI 101123 THI-M 124202
IPR 106739 TRI 118933
MAN 101021
4 LAVADO DEL MATERIAL
La limpieza del material de vidrio utilizado en el laboratorio se realizoacute utilizando jaboacuten y aclarando con agua de
grifo Luego en primer lugar se realiza un enjuague con agua Milli-Q finalmente un segundo enjuague con
acetona para eliminar posibles restos de compuestos orgaacutenicos y se deja secar sobre papel
Para la limpieza de los conectores de tefloacuten empleados en el proceso de SPE se introducen en un vaso de
precipitados con metanol y este en un bantildeo de ultrasonidos durante 10 minutos Al finalizar con el bantildeo de
ultrasonidos se realiza un enjuague con acetona y se pone a secar
5 EXTRACCIOacuteN DE MUESTRAS MEDIANTE SPE
El meacutetodo de extraccioacuten utilizado para la determinacioacuten de pesticidas fue la extraccioacuten en fase soacutelida (SPE)
mediante cartuchos Oasis HLB de 200 mg A continuacioacuten se describe el protocolo de extraccioacuten en las
condiciones oacuteptimas
26
Capiacutetulo III Parte experimental
1 Acondicionamiento del cartucho Oasis HLB de 200 mg con 2 mL de acetonitrilo seguidos de otros 2 mL de
vino sinteacutetico formado por la mezcla etanolagua MilliQ (1288)
2 Paso de la muestra 2 mL de vino diluiacutedos con 2 mL de agua MilliQ a traveacutes del cartucho por gravedad
3 Lavado del cartucho con 2 mL de agua MilliQ
4 Secado del cartucho durante 45 minutos en el VisiDry mediante el paso de una corriente de nitroacutegeno
5 Elucioacuten del cartucho con la mezcla metanolacetonitrilo en proporcioacuten 2080 hasta un volumen final de 2
mL
6 Anaacutelisis mediante cromatografiacutea liacutequida acoplada a espectrometriacutea de masas en taacutendem UPLC-MSMS
(volumen de inyeccioacuten 15 microL)
Representacioacuten esquematizada en la Figura III1
Figura III1 Extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) de las muestras de vino
27
Capiacutetulo III Parte experimental
6 CONDICIONES DE DETERMINACIOacuteN MEDIANTE UPLC-MSMS
En la Tabla III2 se indican las condiciones utlizadas en la determinacioacuten de los pesticidas de intereacutes mediante
LC-MSMS y en la Tabla III3 se muestra el gradiente de la fase moacutevil utilizado para la separacioacuten
cromatograacutefica
Tabla III2 Condiciones experimentales de determinacioacuten en LC-MSMS
UPLC Acquity UPLC-I-Class IVD System
bull Columna cromatograacutefica Zorbax Eclipse Plus C18 Rapid Resolution HD
Fase estacionaria C18
Dimensiones 21 x 50 mm
Tamantildeo de partiacutecula 18 microm
Temperatura del horno 40ordmC
bull Inyector
Volumen de inyeccioacuten 15 microL
bull Fase moacutevil
Flujo 04 mLmin
Fase acuosa (A) Agua MilliQ con 01 aacutecido foacutermico
Fase orgaacutenica (B) Acetonitrilo con 01 aacutecido foacutermico
MSMS WatersXevo TQD
Modo de ionizacioacuten ESI positivo
Voltaje del capilar 15 kV
Voltaje de cono 50 V
Temperatura de gas de secado (N2) 450ordmC
Flujo de gas de secado (N2) 1000 Lh
Modo de adquisicioacuten Centroide
Tabla III3 Gradiente de fase moacutevil utilizado en la separacioacuten cromatograacutefica (LC)
Tiempo min 0 13 28 64 75 76 10
A 98 50 50 0 0 98 98
B 2 50 50 100 100 2 2
28
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
CAPIacuteTULO IV RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
1 IDENTIFICACIOacuteN DE LOS COMPUESTOS
Para empezar el estudio en primer lugar se realizoacute la caracterizacioacuten de las condiciones de determinacioacuten de los
analitos en el modo Multiple Reaction Monitoring (MRM) mediante UPLC-ESI-MSMS Para llevarla a cabo se
tomaron patrones individuales de cada fitosanitario y mediante infusioacuten se estudiaron las posibles transiciones y
voltajes oacuteptimos para su determinacioacuten (Tabla IV1)
La ionizacioacuten por electrospray (ESI) se estudioacute tanto en modo positivo como en modo negativo encontraacutendose
que para todos los pesticidas de nuestro intereacutes se obteniacutea sentildeal en el modo positivo mientras el modo negativo
no presentaba respuesta significativa
A continuacioacuten se estudia el efecto del voltaje de cono en la respuesta del ioacuten molecular [M+H]+ aumentaacutendolo
hasta alcanzar el valor maacuteximo de la sentildeal correspondiente a dicho ioacuten y luego se optimiza la energiacutea de colisioacuten
variaacutendola para cada analito hasta obtener la sentildeal de mayor intensidad para cada uno de los iones producto Por
uacuteltimo una vez optimizado el voltaje de cono y la energiacutea de colisioacuten se seleccionan las dos transiciones maacutes
intensas para llevar a cabo la cuantificacioacuten y cualificacioacuten de cada analito en modo MRM Este procedimiento se
realizoacute para la totalidad de los compuestos confirmando los datos obtenidos con los facilitados por la base de
datos Quanpedia que estaacute disponible en el software del equipo utilizado para algunos de los compuestos
considerados
Compuesto Tr (min) Ion precursor (mz Da)
Voltaje de cono (V)
Ion producto 1 (CEv)
cuantificacioacuten
Ion producto 2 (CEv)
cualificacioacuten
Relacioacuten IP2IP1
AME 325 2760 60 176 (35) 70 (50) 016
BEN 485 3261 26 148 (20) 91 (34) 067
BOS 387 3429 41 140 (20) 307 (20) 011
CAR 167 1921 33 160 (18) 132 (28) 014
CYP 311 2260 56 93 (33) 108 (25) 061
DIM 322 3881 40 301 (20) 165 (30) 057
FEH 386 3021 41 97 (22) 55 (38) 044
FEP 257 2742 55 147 (28) 86 (28) 093
FLU 401 3830 40 173 (20) 365 (15) 010
IMI 218 2561 34 209 (15) 175 (20) 091
IPR 358 3211 28 119 (16) 203 (10) 042
Tabla IV1 Tiempos de retencioacuten (Tr) relacioacuten de iones precursores (mz) voltaje de cono (V) energiacuteas de colisioacuten (CE) y relacioacuten de intensidades entre transiciones (IP2IP1)
29
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Compuesto Tr (min) Ion precursor (mz Da)
Voltaje de cono (V)
Ion producto 1 (CEv)
cuantificacioacuten
Ion producto 2 (CEv)
cualificacioacuten
Relacioacuten IP2IP1
MAN 392 4120 25 328 (16) 125 (35) 063
MET 283 2801 26 220 (13) 192 (17) 057
MYC 365 2891 34 70 (18) 125 (32) 029
PEN 417 2840 34 70 (16) 159 (34) 031
PYC 523 3881 31 194 (12) 163 (25) 066
PYM 266 2000 51 107 (24) 82 (24) 071
TEC 397 3080 40 70 (22) 125 (40) 007
TEF 473 3531 19 133 (20) 297 (8) 072
TBZ 182 2020 51 175 (25) 131 (30) 062
TME 203 2920 28 211 (12) 132 (22) 047
THI-M 257 3430 28 151 (46) 93 (19) 0001
TRI 319 2961 21 70 (10) 99 (15) 013
El dwell time para cada una de las transiciones se ajustoacute de manera automaacutetica por el software (MassLinx) con
objeto de obtener doce puntos espectrales por compuesto tomando un valor promedio de cuatro segundos como
ancho de pico a liacutenea de base
2 CARACTERIZACIOacuteN DEL PROCEDIMIENTO DE DETERMINACIOacuteN (UPLC-ESI-
MSMS)
Una vez optimizados los paraacutemetros que afectan a la separacioacuten cromatograacutefica (UPLC) y a la determinacioacuten por
espectrometriacutea de masas en taacutendem (MSMS) se lleva a cabo la evaluacioacuten de la repetibilidad de inyeccioacuten y
determinacioacuten en esas condiciones Se expresa por medio de la desviacioacuten estaacutendar relativa (RSD) paraacutemetro que
nos indica el grado de correlacioacuten que existe entre varias medidas del mismo patroacuten realizadas por el mismo
operador en el laboratorio y en el mismo equipo de medida a lo largo de un diacutea Para el estudio se realizan diez
inyecciones con volumen de 15 microL de dos patrones con distintos niveles de concentracioacuten 5 y 20 ngmL Los
datos de RSD (Tabla IV2) para las aacutereas de pico de los analitos se situacutean para el nivel de concentracioacuten 5 ngmL
en el rango 2-13 y en el nivel de concentracioacuten 20 ngmL en el rango 1-7
30
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten Tabla IV2 Desviacioacuten estaacutendar relativa (RSD) del aacuterea de pico (transicioacuten de cuantificacioacuten) para evaluar la repetivilidad del proceso de LC-MSMS
Compuesto RSD
5 ngmL
RSD
20 ngmL Compuesto
RSD
5 ngmL
RSD
20 ngmL
AME 5 2 MET 3 2
BEN 2 2 MYC 9 2
BOS 4 5 PEN 4 4
CAR 4 2 PYC 3 1
CYP 5 7 PYM 7 3
DIM 6 5 TEC 3 2
FEH 7 4 TEF 4 2
FEP 4 2 TBZ 2 1
FLU 5 3 TME 6 6
IMI 13 7 THI-M a 6
IPR 8 2 TRI 8 6
MAN 3 2
A continuacioacuten tambieacuten se evaluoacute la repetibilidad de los tiempos de retencioacuten (Tr) para diez inyecciones de
patrones a los dos niveles de concentracioacuten 5 y 20 ngmL situaacutendose las RSD para todos los compuestos en el
rango 01-03 En base a este dato la ventana de tiempo en la que se registran las transiciones de MRM de cada
compuesto se fijoacute en 05 min lo que es lo mismo 025 min alrededor del valor medio de su tiempo de retencioacuten
Por otro lado la linealidad del meacutetodo se estudioacute a nueve niveles de concentracioacuten diferentes comprendidos ente
los niveles 05 ngmL y 200 ngmL mediante la inyeccioacuten de disoluciones patroacuten de los distintos compuestos de
estudio Se realizoacute una evaluacioacuten sin y otra con patroacuten interno (IS) antildeadiendo una concentracioacuten fija de patrones
internos a nivel de 25 ngmL y pudimos observar que los resultados mejoran notablemente al realizar una
correccioacuten con el IS En la Tabla IV3 se muestran los coeficientes de determinacioacuten (R2) obtenidos al realizar la
correccioacuten mediante IS observando que para todos los compuestos excepto para THI-M y para TRI los
coeficientes de correlacioacuten son superiores a 0990 por lo que existe una respuesta lineal en el rango de
concentraciones que hemos estudiado
Aparte del estudio de la linealidad tambieacuten se han estudiado los liacutemites de cuantificacioacuten instrumentales del
meacutetodo (LOQs) Para ello los LOQs se evaluacutean como la miacutenima cantidad de analito que origina una sentildeal 10
veces superior a la desviacioacuten estaacutendar del ruido Los valores anteriores se estimaron a partir del patroacuten de
a no evaluado ya que se encuentra por debajo del liacutemite de cuantificacioacuten del meacutetodo
31
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
concentracioacuten maacutes baja que presenta un pico con una relacioacuten SN superior a 10 En la Tabla IV3 tambieacuten se
recogen estos LOQs en doacutende podemos ver que variacutean en el rango 01-1 ngmL excepto para THI-M que se
desviacutea a valores de 10 ngmL
Tabla IV3 Coeficientes de determinacioacuten (R2) y liacutemites de cuantificacioacuten instrumentales (LOQs) de los analitos para nueve
niveles de concentracioacuten de 05 a 200 ngmL
Compuesto Coeficiente de
correlacioacuten (R2)
LOQs (ngmL) Compuesto
Coeficiente de correlacioacuten
(R2)
LOQs (ngmL)
AME 09951 04 MET 09933 01
BEN 09949 01 MYC 09950 04
BOS 09979 02 PEN 09945 02
CAR 09923 02 PYC 09955 02
CYP 09878 02 PYM 09931 01
DIM 09938 07 TEC 09958 05
FEH 09959 05 TEF 09957 01
FEP 09931 01 TBZ 09942 02
FLU 09965 02 TME 09903 01
IMI 09979 05 THI-M 09580 100
IPR 09938 01 TRI 09867 07
MAN 09979 01
En la Figura IV1 y Figura IV2 se muestran dos ejemplo de curvas de calibrado para dos compuestos IMI y
MAN respectivamente
Figura IV1 Curva de calibrado y coeficiente de determinacioacuten de IMI para UPLC-ESI-MSMS
32
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Figura IV2 Curva de calibrado y coeficiente de determinacioacuten de MAN para UPLC-ESI-MSMS
3 ESTUDIO DEL MEacuteTODO SPE
La extraccioacuten de pesticidas se llevoacute a cabo mediante extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) en doacutende se realizaron
diversos estudios con diferentes condiciones para dar con las oacuteptimas En primer lugar se llevaron a cabo los
experimentos de retencioacuten y elucioacuten sobre dos tipos distintos de adsorbentes cartuchos OASIS HLB (200mg) y
cartuchos OASIS MAX (150 mg) como fases potenciales en las que llevar a cabo la extraccioacuten de manera
selectiva Los dos tipos de cartuchos son de fase reversa pero difieren entre siacute en el fundamento de retencioacuten de
los analitos En los cartuchos OASIS HLB (200 mg) formados por divinilbenceno-N-vinilpirrolidona (DVB-VP)
la retencioacuten de los diferentes analitos tiene lugar por interacciones π-π o de Van der Waals mientras que los
cartuchos OASIS MAX (150 mg) que se probaron como alternativa para mejorar la selectividad en la extraccioacuten
cuentan con un adsorbente polimeacuterico de modo mixto formado por divinilbenceno-N-vinilpirrolidona (DVB-VP)
funcionalizado con grupos amina cuaternaria siendo el fundamento de la extraccioacuten la combinacioacuten de las
propiedades adsorbentes del cartucho HLB con un mecanismo adicional de intercambio ioacutenico (anioacutenico) [27]
Algunos autores han empleado este mecanismo para mejorar la selectividad de la extraccioacuten de forma que en la
etapa de elucioacuten ciertos pigmentos del vino quedan fuertemente retenidos en el adsorbente a diferencia de lo que
ocurre con los adsorbentes de fase reversa [51]
Para llevar a cabo la eleccioacuten del tipo de adsorbente se realizaron pruebas con 10 mL de vino blanco y tinto
conectando en serie los dos tipos de cartuchos HLB (200 mg) y MAX (150 mg) a un segundo cartucho OASIS
HLB (60 mg) La elucioacuten de los analitos se hace de forma independiente para cada cartucho y se evaluacutea si los
analitos pasan del primer cartucho hacia el segundo cartucho es decir si se supera el volumen de corte o si por
33
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
otro lado se quedan retenidos en el primero y no eluyen hacia el segundo En estas pruebas de estudio
preliminares de preparacioacuten de la muestra no se ha incluido el CYP
En la Figura IV3 podemos ver la eficacia de la extraccioacuten para vino blanco y tinto que obtenemos empleando
cartuchos OASIS MAX (150 mg) conectados en serie con cartuchos OASIS HLB (60 mg) realizando la
extraccioacuten de tres fracciones de 2 mL cada una del cartucho OASIS MAX (150 mg) y una cuarta fraccioacuten de 2
mL del cartucho OASIS HLB (60 mg)
Por otro lado en la Figura IV4 podemos ver un graacutefico de columnas en el cual comparamos la eficacia de
extraccioacuten de los cartuchos OASIS HLB (200 mg) con dos disolventes de elucioacuten distintos En dicho graacutefica el
acroacutenimo de cada compuesto consta de dos barras cuyo significado es el siguiente la barra de la izquierda indica
la eficacia de la extraccioacuten empleando acetonitrilo (ACN) como disolvente de elucioacuten y la barra de la derecha
indica la eficacia de la extraccioacuten empleando la combinacioacuten MetanolAcetonitrilo (2080) (MeOHACN) como
disolvente de elucioacuten Para este adsorbente no se detectoacute ninguacuten compuesto en la extraccioacuten del segundo
cartuchos OASIS HLB (60 mg) empleando 2 mL de metanol
Figura IV3 Distribucioacuten de los compuestos en cada fraccioacuten obtenidas con cartuchos OASIS MAX (150 mg)
utilizando 10 mL de vino tinto y blanco sacando cuatro fracciones de 2 mL cada una con metanol como
disolvente de elucioacuten
34
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Figura IV4 Distribucioacuten de los compuestos en cada fraccioacuten obtenidas con cartuchos OASIS HLB (200 mg) utilizando 10
mL de vino tinto y blanco sacando 3 fracciones de 2 mL cada una con acetonitrilo (ACN) (columna de la izquierda) y una
combinacioacuten MetanolAcetonitrilo (2080) (MeOHACN) (columna de la derecha) como disolventes de elucioacuten
A la vista de los resultados reflejados en las graacuteficas podemos afirmar que cuando se utiliza el cartucho OASIS
HLB (200 mg) eluyendo con acetonitrilo o la combinacioacuten metanolacetonitrilo (2080) los extractos son limpios
y se eluyen la mayoriacutea de los compuestos en la primera fraccioacuten Pero utilizando acetonitrilo como disolvente de
elucioacuten se encuentran problemas en la extraccioacuten de CAR FEH y TBZ para los que es necesario emplear un
volumen mayor de elucioacuten o bien seleccionar otro disolvente de elucioacuten como es la combinacioacuten
metanolacetonitrilo
35
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Por otro lado los extractos en los cartuchos OASIS MAX (150 mg) son maacutes limpios incluso utilizando metanol en
la elucioacuten pero se detecta la presencia de CAR FEP TBZ y TME en el segundo cartucho OASIS HLB (60 mg)
significando la rotura del primer cartucho para dichos analitos considerando un volumen de 10 mL de vino Los
demaacutes compuestos se podriacutean recuperar cuantitativamente en la primera fraccioacuten sacada pero la peacuterdida de estos
compuestos inclina la eleccioacuten hacia los cartuchos OASIS HLB (200 mg) con metanolacetonitrilo (2080) como
disolvente de elucioacuten para continuar con el estudio
Una vez fijado el adsorbente y el volumen de elucioacuten se prueba la eficacia de la SPE independiente de los efectos
de matriz En la Tabla IV4 se muestran las recuperaciones de la SPE tomando 10 mL de vino blanco y tinto
con un nivel de adicioacuten de 15 ngmL sacando una sola fraccioacuten de 2 mL con la combinacioacuten
metanolacetonitrilo (2080) y n=3 reacuteplicas
Tabla IV4 Recuperaciones (R plusmn SD) de SPE para 10 mL de vino (blanco y tinto) con un nivel de adicioacuten de 15 ngmL y
n=3 reacuteplicas
Compuesto Vino Tinto
R plusmn SD
Vino Blanco
R plusmnSD Compuesto
Vino Tinto
R plusmn SD
Vino Blanco
R plusmn SD
AME 82 plusmn 7 100 plusmn 1 MET 92 plusmn 6 94 plusmn 3
BEN 89 plusmn 6 97 plusmn 3 MYC 90 plusmn 9 86 plusmn 4
BOS 95 plusmn 1 100 plusmn 2 PEN 84 plusmn 10 103 plusmn 3
CAR 91 plusmn 6 104 plusmn 6 PYC 86 plusmn 5 106 plusmn 1
CYP 81 plusmn 7 102 plusmn 3 PYM 87 plusmn 12 94 plusmn 3
DIM 97 plusmn 3 86 plusmn 4 TEC 83 plusmn 10 103 plusmn 1
FEH 89 plusmn 3 88 plusmn 3 TEF 84 plusmn 5 108 plusmn 4
FEP 91 plusmn 7 104 plusmn 3 TBZ 88 plusmn 7 92 plusmn 5
FLU 91 plusmn 2 97 plusmn 4 TME 101 plusmn 1 110 plusmn 13
IMI 117 plusmn 8 101 plusmn 11 THI-M 85 plusmn 9 110 plusmn 4
IPR 89 plusmn 7 112 plusmn 4 TRI 85 plusmn 10 110 plusmn 4
MAN 88 plusmn 2 87 plusmn 2
Algunos compuestos de la matriz en el vino pueden competir con los analitos durante el proceso de ionizacioacuten
que tiene lugar en la interfase entre UPLC-MSMS por lo que para la cuantificacioacuten del rendimiento de la
ionizacioacuten por electrospray (ESI) se estudian los efectos de matriz (EM) para vino blanco y tinto considerando
dos voluacutemenes de muestra distintos 2 y 10 mL y un volumen final del extracto de 2 mL En la Tabla IV5 se
36
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
exponen los valores para cada compuesto notando que al aumentar el volumen de muestra tambieacuten se aumentan
los efectos de matriz y eacutestos siempre son mayores en vino tinto Para el caacutelculo de estos efectos de matriz (EM)
se emplea la siguiente ecuacioacuten
Donde Am Ab y Ap representan el aacuterea de pico en la sentildeal medida del analito en el extracto de la muestra con
adicioacuten en el extracto de la muestra sin adicioacuten (o blanco) y en el patroacuten antildeadido respectivamente El nivel de
adicioacuten en extracto fue de 50 ngmL por compuesto
Tabla IV5 Efectos de matriz para vino blanco y tinto con un volumen inicial de 2 y 10 mL evaluados para un nivel de adicioacuten de 50 ngmL en extracto
Compuesto
Vino blanco Vino tinto
2 mL 10 mL 2mL 10 mL
EM () CV () EM () CV () EM () CV () EM () CV()
AME 93 3 95 2 99 3 101 7
BEN 99 1 93 2 101 3 100 6
BOS 97 5 98 1 108 2 96 0
CAR 62 2 50 3 58 2 55 6
CYP 94 3 91 1 97 2 95 7
DIM 105 2 95 3 100 3 108 3
FEH 100 4 102 4 105 4 94 3
FEP 95 3 88 2 96 2 92 7
FLU 98 2 93 2 106 1 101 2
IMI 84 4 46 3 48 10 18 8
IPR 99 3 92 3 105 1 100 7
MAN 100 1 94 3 109 4 107 2
MET 98 1 89 1 99 2 99 6
MYC 105 1 100 1 103 2 96 9
PEN 98 3 97 1 101 3 99 10
PYC 98 2 92 3 102 2 98 5
PYM 95 2 87 1 94 3 85 12
TEC 95 3 99 1 101 1 102 10
TEF 99 1 92 3 101 2 104 5
TBZ 45 0 40 5 43 2 30 7
TME 60 6 19 16 36 4 16 1
THI-M 107 2 109 2 103 1 96 9
TRI 97 3 118 4 104 5 117 10
37
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Al observar los resultados podemos ver que la mayoriacutea de los compuestos dan resultados de EM en torno al
100 lo que significa que no sufren una modificacioacuten importante en la eficacia de ionizacioacuten para las muestras
con respecto a los patrones Pero tambieacuten por el contrario podemos observar que algunos compuestos como
por ejemplo en el caso de CAR TBZ IMI y TME experimentan una gran supresioacuten de sentildeal es decir EM bajos
que se acentuacutean al aumentar el volumen de muestra La atenuacioacuten en la eficacia de variacioacuten para estos cuatro
compuestos no solo se ve incrementada con el volumen de muestra si no que ademaacutes es maacutes significativa para
vino tinto que para vino blanco En base a estos resultados aunque la eficacia de la SPE fue cuantitativa para
muestras de 10 mL se limitoacute el volumen de muestra a extraer a 2 mL
Las condiciones oacuteptimas de extraccioacuten se esquematizan en un resumen en la Figura IV5
Figura IV5 Condiciones optimizadas para la extraccioacuten de pesticidas en vino
38
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
4 CARACTERIZACIOacuteN DEL MEacuteTODO DE DETERMINACIOacuteN
Con las condiciones de extraccioacuten y determinacioacuten citadas anteriormente se llevaron a cabo pruebas de
recuperaciones absolutas de los compuestos a nivel de adicioacuten de 5 y 20 ngmL sobre las muestras Para cada
muestra y nivel de adicioacuten se realizaron tres reacuteplicas de las muestras con adicioacuten y los blancos aliacutecuotas de las
mismas muestras sin adicioacuten se procesaron en duplicado Los IS se antildeadieron a nivel de 25 ngmL y cada uno se
utiliza para corregir unos determinados compuestos CAR-d3 se emplea para CAR y TBZ el CYP-d5 para CYP y
PYM el IMID-d4 para IMI y TME y el MET13C6 para el resto de compuestos Los resultados para vino blanco
comprenden en el nivel de concentracioacuten 5 ngmL el rango entre 79-122 y en el nivel de concentracioacuten 20
ngmL el rango entre 84-109 Por otro lado en el caso del vino tinto las recuperaciones se encuentran para el
nivel de concentracioacuten 5 ngmL en el rango 67-112 y para el nivel de concentracioacuten 20 ngmL entre el rango
73-132 Los resultados obtenidos en las pruebas con vino blanco y vino tinto se muestran en la Tabla IV6
Los resultados son satisfactorios ya que la mayoriacutea de los compuestos se ajustan en todos los casos al rango de
recuperacioacuten entre 70-120 Para la realizacioacuten de estas pruebas se ha eliminado de los resultados el compuesto
THI-M debido a que las concentraciones utilizadas se encuentran en el liacutemite o por debajo del LOQ en los
experimentos con muestras adicionadas a 5 ngmL
Para calcular las recuperaciones (R) se recurrioacute a la siguiente ecuacioacuten
Donde Cm Cb y Cp son la concentracioacuten medida de analito en el extracto de la muestra con adicioacuten en el extracto
de la muestra sin adicioacuten (o blanco) y en el patroacuten antildeadido respectivamente
Tabla IV6 Recuperaciones (R) para vino tinto y vino blanco evaluadas para dos niveles de concentracioacuten 5 y 20 ngmL
Compuesto
Vino tinto Vino Blanco
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
AME 97 3 105 6 104 9 96 5
BEN 88 11 105 3 101 1 98 4
BOS 91 13 110 2 88 13 97 3
39
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Compuesto
Vino tinto Vino blanco
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
CAR 99 6 99 3 122 3 109 1
CYP 91 2 111 1 101 4 100 6
DIM 112 3 110 9 102 24 99 11
FEH 91 4 108 0 102 20 95 2
FEP 89 8 102 7 94 5 84 1
FLU 95 10 104 4 109 5 100 8
IMI 73 11 115 9 80 13 100 2
IPR 84 13 99 3 111 3 99 4
MAN 88 22 112 8 112 3 99 4
MET 99 3 106 5 106 3 98 2
MYC 84 9 106 13 88 17 86 3
PEN 84 9 102 5 84 8 90 5
PYC 96 6 105 4 100 2 95 4
PYM 90 12 112 14 106 4 97 1
TEC 89 8 101 6 98 12 94 1
TEF 93 10 102 5 107 2 97 3
TBZ 94 17 115 8 79 5 106 2
TME 67 2 101 7 84 18 90 11
THI-M ne - 74 7 ne - 89 24
TRI 88 12 97 6 102 6 92 2
ne No evaluado El nivel de adicioacuten es inferior al LOQ del meacutetodo para este compuesto
Para estudiar la reproducibilidad del meacutetodo analiacutetico global (correspondientes a los datos de preparacioacuten de
muestra y determinacioacuten) es decir la concordancia de varias medidas realizadas en diacuteas diferentes se procedioacute a la
extraccioacuten en las condiciones oacuteptimas tanto de vino blanco como tinto Las extracciones y determinaciones se
realizaron durante tres diacuteas consecutivos realizando tres reacuteplicas por vino y por diacutea con un nivel de adicioacuten en
muestra de 10 ngmL un blanco de muestra cada diacutea En la Tabla IV7 se muestran los resultados como
recuperaciones (R) en condiciones de reproducibilidad obtenidos para ambos tipos de vino dando valores entre
64-116 para muestras de vino blanco y valores situados entre 68-108 para muestras de vino tinto con la
excepcioacuten del TME para el que se ha obtenido un valor no aceptable en cuanto a la exactitud medida en
condiciones de reproducibilidad A la vista de los resultados obtenidos con estas pruebas se considera necesario el
empleo de IS adicionales para la mejora en la exactitud del meacutetodo para algunos compuestos por ejemplo el
TME
40
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Tabla IV7 Recuperaciones en condiciones de reproducibilidad (R plusmn SD) para vino blanco y tinto
Compuesto
Vino tinto Vino blanco
R
10 ngmL CV ()
R
10 ngmL CV ()
AME 90 5 101 13
BEN 96 5 102 7
BOS 97 6 100 8
CAR 97 3 94 5
CYP 103 3 105 12
DIM 104 7 106 8
FEH 90 16 83 15
FEP 91 5 90 4
FLU 103 7 102 6
IMI 99 14 101 14
IPR 91 5 100 13
MAN 108 5 108 13
MET 101 5 101 5
MYC 105 16 102 14
PEN 96 11 92 10
PYC 99 12 97 12
PYM 102 4 116 8
TEC 99 9 97 16
TEF 99 8 105 11
TBZ 68 4 84 5
TME 47 13 64 10
THI-M 107 11 104 16
TRI 95 14 103 4
En la Tabla IV8 se muestran los liacutemites de cuantificacioacuten (LOQs) del meacutetodo del meacutetodo de SPE-UPLC-ESI-
MSMS obtenidos para los diferentes pesticidas Los valores obtenidos son ideacutenticos a los LOQs instrumentales
excepto en el caso de aquellos compuestos para los que se observaronfuertes efectos de matriz (Tabla IV5) En
estos casos (CAR TBZ IMI y TME) los LOQs del meacutetodo se incrementan seguacuten la atenuacioacuten de sentildeal
observada
41
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Tabla IV8 Liacutemites de cuantificacioacuten LOQs (ngmL) del meacutetodo obtendos para cada compuesto
Compuesto LOQ (ngmL) Compuesto LOQ (ngmL)
AME 04 MET 01
BEN 01 MYC 04
BOS 02 PEN 02
CAR 03 PYC 02
CYP 02 PYM 01
DIM 07 TEC 05
FEH 05 TEF 01
FEP 01 TBZ 04
FLU 02 TME 02
IMI 06 THI-M 10
IPR 01 TRI 07
MAN 01
5 APLICACIOacuteN A MUESTRAS DE VINO COMERCIALES
Una vez optimizadas las condiciones del meacutetodo y estudiadas las caracteriacutesticas del meacutetodo desarrollado se aplicoacute
a la determinacioacuten de los compuestos de intereacutes estudiados en muestras de vino blanco y vino tinto comerciales
producidos en diferentes paiacuteses En la Tabla IV9 se muestra el paiacutes de origen de cada muestra comercial
identificadas con un coacutedigo alfanumeacuterico y antildeo de produccioacuten
42
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Tabla IV9 Coacutedigo asignado para los diferentes vinos comerciales blancos y tintos analizados Indicando el paiacutes de origen y
antildeo de produccioacuten
Coacutedigo Denominacioacuten de origen Antildeo de produccioacuten
bull Vinos Blancos
W1 Alemania 2014
W2 Espantildea 2012
W3 Espantildea 2016
W4 Portugal Desconocido
W5 Francia 2015
W6 Francia 2015
W7 Espantildea 2016
bull Vinos Tintos
R1 Espantildea 2015
R2 Sudaacutefrica 2015
R3 Chile 2015
R4 Francia 2015
R5 China Desconocido
R6 Espantildea 2016
R7 Australia 2014
R8 Francia 2013
R9 Francia 2015
A continuacioacuten en la Tabla IV10 y la Tabla IV11 se recogen los resultados obtenidos en el anaacutelisis de las
muestras comerciales Los datos obtenidos corresponden en todos los casos al uso de patrones de calibracioacuten
como teacutecnica de cuantificacioacuten
Tabla IV10 Concentracioacuten (ngmL) encontradas en las diferentes muestras de vino blanco comercial analizadas mediante
SPE-UPLC-MSMS n=2 reacuteplicas y al final el sumatorio de las concentraciones encontradas
Compuesto W1 W2 W3 W4 W5 W6 W7
AME 04 nd nd nd 41 nd nd
BEN nd nd 14 nd nd nd nd
BOS 84 102 520 54 197 nd nd
CAR nd 115 56 nd nd nd nd
CYP 08 59 112 nd nd 26 nd
43
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Compuesto W1 W2 W3 W4 W5 W6 W7
DIM 14 84 400 09 32 50 nd
FEH 85 809 639 15 187 nd nd
FLU 11 05 92 nd 77 32 nd
IMI nd 136 88 29 nd nd 69
IPR 30 749 1144 14 nd nd nd
MAN nd nd nd nd nd 30 nd
MET 04 273 494 63 nd nd 172
MYC 09 nd 35 nd nd nd nd
PYM 15 469 584 08 24 35 nd
TEC 11 nd 58 nd nd nd nd
TRI nd 67 61 nd nd nd nd
sumconcentracioacuten
(ngmL) 274 2868 4358 192 558 173 862
nd no detectado
Tabla IV11 Concentracioacuten (ngmL) encontradas en las diferentes muestras de vino tinto comercial analizadas mediante
SPE-UPLC-MSMS n= 2 reacuteplicas y al final el sumatorio de las concentraciones encontradas
Compuesto R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9
AME nd nd nd 30 nd nd nd nd 16
BEN nd nd nd 07 nd nd nd nd nd
BOS nd 55 21 196 nd nd nd 73 21
CAR nd nd 04 17 249 20 nd nd nd
CYP 34 08 02 22 nd 136 nd 85 nd
DIM nd 33 nd 52 233 46 nd 61 23
FEH nd nd nd 1070 nd 10 nd 1307 14
FLU nd nd nd 20 nd nd nd nd nd
IPR 16 nd nd 17 nd 22 nd nd nd
MAN nd nd nd 17 nd nd nd 20 nd
MET 126 nd nd 14 55 313 30 44 39
MYC nd nd nd 05 nd 32 nd nd nd
PYM 19 nd 03 185 49 281 nd 24 nd
TEC 25 06 39 29 nd nd nd 21 20
TEF nd 01 12 nd nd nd nd nd nd
sumconcentracioacuten
(ngmL) 220 48 81 1681 586 860 30 1635 133
nd no detectado 44
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
En los resultados de los anaacutelisis podemos observar que en ninguna de las muestras comerciales de vino blanco
aparecieron los siguientes compuestos FEP PEN PYC TEF TBZ THI-M y TME y en los vinos tintos
comerciales no aparece a ninguna concentracioacuten FEP IMI PEN PYC TBZ TME THI-M y TRI No se
detectaron para dichas muestras de vino a niveles superiores a los LOQs del meacutetodo propuesto
Cuando se detecta un compuesto positivo se compara el pico cromatograacutefico del compuesto con el de un patroacuten
verificando la coincidencia del tiempo de retencioacuten (maacutexima diferencia 01 min) y la relacioacuten entre transiciones
(maacutexima diferencia 30 ) En la Figura IV6 y la Figura IV7 se muestran los cromatogramas para el compuesto
CYP obtenido en condiciones oacuteptimas para la muestra de vino blanco W6 y en un patroacuten de 5 ngmL
respectivamente En este caso el intervalo de tolerancia para la relacioacuten de intensidad entre transiciones es
IP2IP1=061plusmn018
Figura IV6 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el CYP en la muestra W6 (26 ngmL) Transicioacuten
superior 226gt93 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 226gt108 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades IP2IP1= 066
Figura IV7 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el CYP en un patroacuten de 5 ngmL Transicioacuten
superior 226gt93 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 226gt108 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades IP2IP1=061plusmn018
45
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Otro ejemplo de compuesto positivo en abundantes muestras comerciales de estudio es el Metalaxyl positivo con
una concentracioacuten de 04 ngmL en el vino con referencia W1 (Figura IV8) y positivo con una concentracioacuten de
313 ngmL en el vino con referencia R6 (Figura IV9) Ambas se comparan con el cromatograma de un patroacuten
de Metalaxyl de 1 ngmL (Figura IV10) El grado de concordancia en los tiempos de retencioacuten y la relacioacuten de
intensidades entre transiciones es satisfactorio
Figura IV8 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el MET en la muestra W1 (04 ngmL) Transicioacuten
superior 2801gt2201 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 2801gt1921 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades
IP2IP1=056
Figura IV9 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el MET en la muestra R6 (313 ngmL) Transicioacuten
superior 2801gt2201 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 2801gt1921 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades IP2IP1=
056
46
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Figura IV10 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el MET en un patroacuten de 1 ngmL Transicioacuten
superior 2801gt2201 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 2801gt1921 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades
IP2IP1=057plusmn017
Es de destacar que aunque se detectaron bastantes pesticidas en las diferentes muestras de vino comerciales pero
en ninguacuten caso superaron el 10 de los LMRs permitidos en uvas tal y como se recomienda ya que todaviacutea no
existen LMRs para vino en la legislacioacuten vigente No obstante el nivel total de concentracioacuten (sumatorio de
concentraciones Tabla IV10 y Tabla VI11) es significativo para varias muestras tanto de vinos blancos (W2 y
W3) como tintos (R4 y R8)
47
Capiacutetulo V Conclusiones
CAPIacuteTULO V CONCLUSIONES
En este trabajo se ha estudiado un meacutetodo para la cuantificacioacuten de pesticidas concretamente veinte fungicidas y
tres insecticidas en vino blanco y tinto En la etapa de preparacioacuten de muestra se optimizoacute la extraccioacuten en fase
soacutelida (SPE) utilizando cartuchos OASIS HLB (200 mg) compuestos por divinilbenceno-N-vinilpirrolidona
(DVB-VP) como adsorbente Como teacutecnica de determinacioacuten se utilizoacute cromatografiacutea de liacutequidos con una
interfase de electroespray acoplada a espectrometriacutea de masas (UPLC-ESI-MSMS)
Las conclusiones generales obtenidas a partir de los resultados de este proyecto relativo a la determinacioacuten de
fitosanitarios en vino son
Ante los problemas de retencioacuten que presentan los cartuchos OASIS MAX (150 mg) para algunos
compuestos los cartuchos OASIS HLB (200 mg) junto con la combinacioacuten metanolacetonitrilo (2080)
como disolvente de elucioacuten son elegidos como mejor opcioacuten en la extraccioacuten en fase soacutelida de pesticidas
en muestras con matrices complejas como es el caso del vino Asiacute se consigue la retencioacuten selectiva de
componentes de la matriz y proporciona extractos con menor porcentaje de interferencias
El meacutetodo estudiado y optimizado se puede aplicar tanto a vinos blancos como a vinos tintos procesados
a partir de distintas variedades de uvas
Los liacutemites de cuantificacioacuten (LOQs) del estudio se situacutean la mayoriacutea por debajo de 10 ngmL excepto
en el caso de THI-M que asciende al valor de 20 ngmL El rango de respuesta lineal abarca hasta 200
ngmL y el tiempo de anaacutelisis ha sido de solo 10 minutos por muestra
En todas las muestras de vino (blancos y tintos) comerciales analizadas se han detectado la presencia de
varios pesticidas sin embargo todas las concentraciones encontradas se encuentran por debajo del 10
de los LMRs fijados en uvas tal y como recomienda la legislacioacuten por lo que no se considera
preocupante
48
Capiacutetulo V Conclusioacutens
CAPIacuteTULO V CONCLUSIOacuteNS
Neste traballo estudouse un meacutetodo para a cuantificacioacuten de pesticidas en particular vinte funxicidas e tres
insecticidas en vintildeo branco e maacuteis tinto No paso da preparacioacuten da mostra optimizouse a extraccioacuten en fase
soacutelida (SPE) empregando cartuchos OASIS HLB (200 mg) compostos por divinilbenceno-N-pirrolidona (DVB-
VP) como adsorbente Para a teacutecnica de determinacioacuten utilizouse cromatografiacutea de liacutequidos con unha interfase de
electroespray acoplada a espectrometriacutea de masas (UPLC-ESI-MSMS)
As conclusioacutens xerais a obtidas a partir dos resultados deste proxecto relativo aacute determinacioacuten de pesticidas en
vintildeo son
Ante os problemas de retencioacuten que mostraban os cartuchos OASIS MAX (150 mg) para alguacuten
compostos os cartuchos OASIS HLB (200 mg) en conxunto coa mistura metanolacetonitrilo (2080)
como disolvente de elucioacuten son elexidos como mellor opcioacuten na extraccioacuten en fase soacutelida de pesticidas
en mostras con matrices complexas como eacute o caso do vintildeo Asiacute eacute conseguida a retencioacuten selectiva de
componentes da matriz e proporciona extractos con menos porcentaxe de interferencias
O meacutetodo estudado e optimizado poacutedese aplicar tanto a vintildeos brancos coma tintos procesados a partir de
diferentes variedades de uvas
Os liacutemites de cuantificacioacuten do estudo (LOQs) son maacuteis baixos de 10 ngmL agaacutes no caso do THI-M
que ascende ao valor de 20 ngmL O rango de resposta lineal cobre ata 200 ngmL e o tempo de anaacutelise
foi de soacute 10 minuacutetos por mostra
En todas as mostras de vintildeo (brancos e tintos) comercial analizadas detectouse a presenza de varios
pesticidas maacuteis poreacuten todas as concentracioacutens atopadas son inferiores ao 10 dos LMR fixados en uvas
tal e como recomenda a lexislacioacuten polo que non se considera preocupante
49
Chapter V Conclusions
CHAPTER V CONCLUSIONS
In this work we have studied a method for the quantification of pesticides specifically twenty fungicides and
three insecticides in white and red wine In the sample preparation step the solid phase extraction was optimized
using cartridges OASIS HLB (200 mg) containing divinylbenzene-N-vinylpyrrolidone (DVB-VP) as adsorbent
As determination technique ultraperformance liquid chromatography was used with an electrospray interface
coupled to mass spectrometry (UPLC-ESI-MS7MS)
The general conclusions drawn from the results of this project concerning the determination of pesticides in wine
are
Due to the retention problems presented by the OASIS MAX sorbent (150 mg) for some compounds of
this project the cartridges OASIS HLB (200 mg) together with the methanolacetonitrile (2080) mixture
are chosen as the best option in the solid phase extraction of pesticides in samples with complex
matrices as is the case with the wine
The method studied and optimized can be applied to both white and red wines obtained from different
varieties of grapes
The limits of quantification (LOQs) were below 10 ngmL for most of the compounds except in the
case of THI-M with a LOQ of to 10 ngmL The linear response range covers up to 200 ngmL and the
analysis time was only 10 minutes per sample
In all commercial wine samples (white and red) analyzed the presence of several pesticides was
conformed however all the concentrations obtained are below 10 of the Maximum residue
levels(MRLs) fixed in grapes as recommended by legislation
50
VI Bibliografiacutea VI BIBLIOGRAFIacuteA [1] Ministerio de agricultura y pesca alimentacioacuten y medio ambiente mhttpwwwmapamagobesescalidad-y-evaluacion-ambientaltemasproductos-quimicosfitosanitarios (Acceso el diacutea 11052017) [2] httpwwwcricyteduarenciclopediaterminosProducFitohtm (Acceso el diacutea 11052017) [3] WERNER BALTES ldquoQuiacutemica de los alimentosrdquo Editorial Acribia SA 2007 Capiacutetulo 11 ldquoResiduos en los alimentosrdquo paacuteginas 206-217
[4] RLabrada JCCaseley CParker ldquoESTUDIO FAO PRODUCCIOacuteN Y PROTECCIOacuteN VEGETAL 120rdquo Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentacioacuten Roma 1996 ISSN 1014- Capiacutetulo 10 Herbicidas httpwwwfaoorgdocrepT1147St1147s00htmContents (Acceso el diacutea 12052017)
[5] Taberner Palou Andreu Cirujeda Ranzenberger Alicia Zaragoza Larios Carlos ldquoManejo de poblaciones de malezas resistentes a herbicidasrdquo (FAO Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura) 100 preguntas sobre resistencia PDF sacado de httpwwwfaoorg3a-a1422spdf (Acceso el diacutea 12052017) [6] BISSET Juan A Uso correcto de insecticidas control de la resistencia Revista Cubana de Medicina Tropical 2002 vol 54 no 3 p 202-219 [7] DEVINE Gregor J EZA Dominique Ogusuku Elena FURLONGMichael J Uso de insecticidas contexto y consecuencias ecoloacutegicas Revista peruana de medicina experimental y Salud Puacuteblica 2008 vol 25 no 1 p 74-100 [8] Ministerio de agricultura y ganaderiacutea (proteccioacuten agropecuaria servicio de diagnoacutestico fitosanitario) de costa Rica httpwwwmaggocrbibliotecavirtualH20-5054pdf (Acceso el diacutea 11052017) [9] GEPP V MONDINO P Control quiacutemico 2011 PDF obtenido de httpwwwpvfagroeduuyfitopatodocscursosfitopatoMaterialesGuiasC-QUIMICOpdf (Acceso el diacutea 772017) [10] ROSSLENBROICH Hans-Juergen STUEBLER Dietrich Botrytis cinereamdashhistory of chemical control and novel fungicides for its management Crop Protection 2000 vol 19 no 8 p 557-561 [11] Figura 11 httpwwwvitiviniculturanetbotritis-o-podredumbre-gris-botrytis-cinerea-pershtml (Acceso el diacutea 12052017) [12] CAMPBELL Paul BENDEK Carlos LATORRE Bernardo A Riesgo de oiacutedio (Erysiphe necator) de la vid en relacioacuten con el desarrollo de los racimos Ciencia e investigacioacuten agraria 2007 vol 34 no 1 p 5-11 [13] ldquoCoacutemo combatir el oiacutedio de la vidrdquo Jose Javier Peacuterez de Obanos Castillo PDF sacado de httpswwwnavarraesNRrdonlyres05E65D9B-D1A2-4EAD-9A63-AFF1D3215552135109Comocombatireloidiodelavidpdf (Acceso el diacutea 12052017) [14] Imagen 12 sacadas las 3 de httpwwwvitiviniculturanetoidio-de-la-vidhtml (Acceso el diacutea 12052017) [15] BARRIOS Gonccedilal REYES Joan Modelizacioacuten del Mildiu de la Vid 2004 httpwwwruralcatnetmigracio_resources617683_mildiusPDF (Acceso el diacutea 12052017) [16] Imaacutegenes sacadas de httpwwwvitiviniculturanetmildiu-de-la-vid-enfermedades-vinahtml (Acceso el diacutea 13052017) [17] HUQ Mainul MEISNER Craig DASGUPTA Susmita Health effects and pesticide perception as determinants of pesticide use evidence from Bangladesh httpagrisfaoorgagris-searchsearchdorecordID=US2012411738 (Acceso el diacutea 13052017)
51
IV Bibliografiacutea [18] BADII Mohammad H LANDEROS Jeroacutenimo Plaguicidas que afectan a la salud humana y la sustentabilidad CULCyT 2015 no 19 Revista vista en httpopenjournaluacjmxojsindexphpculcytarticleview454 (Acceso el diacutea 772017) [19] OLEA Nicolaacutes FERNAacuteNDEZ Mariana F Plaguicidas persistentes En Congreso Implementacioacuten del Convenio de Contaminantes Orgaacutenicos Persistentes Madrid 2001 p 26-27 [20] httpwwwfaoorgfao-who-codexalimentariusabout-codexes (Acceso el diacutea 14052017) [21] httpeceuropaeufoodplantpesticidesmax_residue_levels_en (Acceso el diacutea 14052017 [22] ORDONtildeEZ Juan A Cambero Rodriacuteguez MI Fernaacutendez Aacutelvarez L Garciacutea Sanz ML Garciacutea de Fernando Minguilloacuten GD de la Hoz Perales L Selgas Cortecero MD Tecnologiacutea de los alimentos Volumen 1 Componentes de los Alimentos y Procesos Siacutentesis Madrid 1998paacutegs 349-351 [23] CELA Rafael Casais Maria del Carmen Lorenzo Rosa Antonia Teacutecnicas de separacioacuten en quiacutemica analiacutetica Siacutentesis 2002 Capiacutetulo 11 Extraccioacuten y lixiviacioacuten por disolvente (paacutegs206-260) [24] CANTWELL Frederick F LOSIER Manon Liquidmdashliquid extraction Comprehensive Analytical Chemistry 2002 vol 37 p 297-340 [25] Imagen de LLE sacada de httpprocesosbiowikispacescomExtracciC3B3n+liquido-liquido (Acceso el diacutea 15052017) [26] HENNION Marie-Claire Solid-phase extraction method development sorbents and coupling with liquid chromatography Journal of Chromatography A 1999 vol 856 no 1 p 3-54 [27] CELA Rafael Casais Maria del Carmen Lorenzo Rosa Antonia Teacutecnicas de separacioacuten en quiacutemica analiacutetica Siacutentesis 2002 Capiacutetulo 16 Teacutecnicas de adsorcioacuten y absorcioacuten en la preparacioacuten de muestras Extraccioacuten y microextraccioacuten en fase soacutelida (paacutegs520-555) [28] Imagen spe sacada httptoxicocbblogspotcomes201310las-intoxicaciones-con-farmacoshtml (Acceso el diacutea 15052017) [29] Chaacutefer Pericaacutes Consuelo Acoplamiento microextraccioacuten en fase soacutelida-cromatografiacutea (2006) httprodericuveshandle1055014940 (Acceso el diacutea 16052017) [30] Imagen SPME httpwwwscieloorgcoscielophpscript=sci_arttextamppid=S0122-53832002000100005 (Acceso el diacutea 16052017) [31] MONTES GOYANES Rosa Mariacutea Avances en teacutecnicas de microextraccioacuten para la determinacioacuten de compuestos traza en muestras medioambientales y alimentarias Teacutesis doctoral Noviembre 2009 (Paacutegs 34-55) [32] LEHOTAY Steven J Ae Son Kyung KwonHyeyoung Koesukwiwat Urairat Fu Wusheng Mastovska Katerina Hoh Eunha Leepipatpiboon Natchanun Comparison of QuEChERS sample preparation methods for the analysis of pesticide residues in fruits and vegetables Journal of Chromatography A 2010 vol 1217 no 16 p 2548-2560 [33] Imagen QueChERS httpswwwresearchgatenetpublication279221361_QuEChERS_A_Sample_Preparation_for_Extraction_of_Carbaryl_from_Rat_Feces (Acceso el diacutea 16052017) [34] STASHENKO Elena E MARTIacuteNEZ Jairo Reneacute Preparacioacuten de la muestra un paso crucial para el anaacutelisis por GC-MS Uma publicaccedilatildeo trimestral do Instituto Internacional de Cromatografia (IIC) Ciecircncia Cromatograacutefica 2011 vol 3 no 1 [35] Imagen GC-MS httpsorgspectroscopyintblogspotcomes201411gas-chromatography-mass-spectrometry-gchtml (Acceso el diacutea 17052017) [36] httpwwwactlabscompageaspxmenu=65ampapp=221ampcat1=534amptp=2amplk=no (Acceso el diacutea 17052017)
52
IV Bibliografiacutea [37] Quintela O Cruz A Concheiro M De Castro A amp Loacutepez-Rivadulla M (2005) Metodologiacutea LC-MS Aspectos generales de la teacutecnica y sus aplicaciones en el campo de la toxicologiacutea Rev Toxicol 22 paacutegs7-14 [38] Imagen LC-MS httpsuploadwikimediaorgwikipediaenff9Liquid_chromatography_tandem_Mass_spectrometry_diagrampng (visto 18052017) [39] Vargas de la Cruz Celia Bertha Adaptacioacuten de la Metodologiacutea Analiacutetica para la determinacioacuten de residuos de plaguicidas en frutas nativas de exportacioacuten mediante Uplc-MsMs (2012) Tesis obtenida en http20062146130handlecybertesis2331 (Acceso el diacutea 772017) [40] ROMERO GONZAacuteLEZ Roberto Fernaacutendez Moreno Joseacute Luis Plaza Bolantildeos Patricia Garrido Frenich Antonia Martiacutenez Vidal Joseacute Luis Empleo de la espectrometriacutea de masas como herramienta para la determinacioacuten de toacutexicos en alimentos hacia la seguridad alimentaria Revista Espantildeola de salud puacuteblica 2007 vol 81 no 5 p 461-474 [41] PAYAacute Andrus Fundamento y Funciones de la Espectrometriacutea de Masas Universidad de Valencia Espantildea 2006 httpmuraluvescaloan (Acceso el diacutea 19052017) [42] Imagen MS sacada de httpsesslidesharenetMaYaTorrezespectrometria-demasas (Acceso el diacutea 21052017) [43] ECONOMOU Anastasios Botitsi Helen Antoniou Spyros Tsipi Despina Determination of multi-class pesticides in wines by solid-phase extraction and liquid chromatography-tandem mass spectrometry Journal of Chromatography A 2009 vol 1216 no 31 p 5856-5867 [44] FONTANA A R Rodriacuteguez I Ramil M Altamirano JC Cela R Liquid chromatography time-of-flight mass spectrometry following sorptive microextraction for the determination of fungicide residues in wine Analytical and bioanalytical chemistry 2011 vol 401 no 2 p 767-775 [45] PELAJIĆ Maja G Peček DM Pavlović DV Čepo Novel multiresidue method for determination of pesticides in red wine using gas chromatographyndashmass spectrometry and solid phase extraction Food chemistry 2016 vol 200 p 98-106 [46] Ignaz J Buerge Juumlrgen Krauss Rociacuteo Loacutepez-Cabeza Werner Siegfried Michael Stuumlssi Felix E Wettstein Thomas Poiger Stereoselective Metabolism of the Sterol Biosynthesis Inhibitor Fungicides Fenpropidin Fenpropimorph and Spiroxamine in Grapes Sugar Beets and Wheat Journal of Agricultural and Food Chemistry 2016 vol 64 no 26 p 5301-5309 [47] M Hu X Liu F Dong J Xu S Li H Xu Y Zheng Determination of ametoctradin residue in fruits and vegetables by modified quick easy cheap effective rugged and safe method using ultra-performance liquid chromatographytandem mass spectrometry Food chemistry 2015 vol 175 p 395-400 [48] WALORCZYK Stanisław DROŻDŻYŃSKI Dariusz GNUSOWSKI Bogusław Multiresidue determination of 160 pesticides in wines employing mixed-mode dispersive-solid phase extraction and gas chromatographyndashtandem mass spectrometry Talanta 2011 vol 85 no 4 p 1856-1870 [49] Tianyang Guo Pingping Fang Juanjuan Jiang Feng Zhan Wei Yong Jiahui Liu YiYang Dong Rapid screening and quantification of residual pesticides and illegal adulterants in red wine by direct analysis in real time mass spectrometry Journal of Chromatography A 2016 vol 1471 p 27-3 [50] GONZAacuteLEZ-RODRIacuteGUEZ R M CANCHO-GRANDE B SIMAL-GAacuteNDARA J Decay of fungicide residues during vinification of white grapes harvested after the application of some new active substances against downy mildew Food chemistry 2011 vol 125 no 2 p 549-560 [51] CARPINTEIRO I Ramil M Rodriacuteguez I Cela R Determination of fungicides in wine by mixed-mode solid phase extraction and liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry Journal of Chromatography A 2010 vol 1217 no 48 p 7484-7492
53
DEPARTAMENTO DE QUIacuteMICA ANALIacuteTICA
NUTRICIOacuteN Y BROMATOLOGIacuteA
Facultad de Quiacutemica
15782 Santiago de Compostela
Telf 981 591 079 Fax 981 547 141
Correo electroacutenico qnsecusces
Isaac Rodriacuteguez Pereiro Profesor Titular de Universidad del Aacuterea de Quiacutemica Analiacutetica y Rafael
Cela Torrijos Catedraacutetico de la misma Aacuterea de conocimiento de la Universidad de Santiago de Com-
postela
Autorizan
A la alumna Andrea Blanco Codeso a la presentacioacuten del estudio ldquoDesarrollo de meacutetodos multiana-
lito para la determinacioacuten de residuos de fitosanitarios en vino mediante LC-MSMSrdquo que ha
realizado bajo su direccioacuten en el Laboratorio de Quiacutemica Analiacutetica del Instituto de Investigacioacuten y Anaacuteli-
sis Alimentario (IIAA) de la Universidad de Santiago de Compostela como Trabajo de Fin de Grado en
Quiacutemica
Para que conste firmamos la presente autorizacioacuten en Santiago de Compostela a 13 de Julio de 2017
Isaac Rodriacuteguez Pereiro Rafael Cela Torrijos
Iacutendice
IacuteNDICE ABSTRACTRESUMEN RESUMO helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip1
CAPIacuteTULO I INTRODUCCIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip3
1 FITOSANITARIOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip3
11 Tipos de fitosanitarios empleados en viticulturahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip3
12 Estructura propiedades fiacutesico-quiacutemicas y clasificacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip6
13 Toxicidad de los pesticidashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip9
14 Legislacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip10
2 MEacuteTODOS DE PREPARACIOacuteN DE MUESTRA APLICADOS
A MUESTRAS DE VINOhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip11
21 Extraccioacuten liacutequido-liacutequido (LLE)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip11
22 Extraccioacuten en fase soacutelida (SPE)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip11
23 Teacutecnicas de microextraccioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip12
231 Microextraccioacuten en fase soacutelida (SPME)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip12
232 Microextraccioacuten en fase liacutequida (LPME)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip13
24 QuEChERShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip13
3 METODOLOGIacuteA ANALIacuteTICA PARA LA DETERMINACIOacuteN
DE PESTICIDAShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip14
31 Meacutetodos de GC-MS (MSMS)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip14
32 Meacutetodos de LC-MS (MSMS)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip15
33 Espectrometriacutea de masashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip15
4 RESUMEN BIBLIOGRAacuteFICO DE LAS TEacuteCNICAS DE EXTRACCIOacuteN Y
DETERMINACIOacuteN DE PESTICIDAS EN VINOhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip16
5 DISTRIBUCIOacuteN DE PESTICIDAS EN VINOS COMERCIALEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip19
CAPIacuteTULO II OBJETIVOS Y JUSTIFICACIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip22
Iacutendice
CAPIacuteTULO III PARTE EXPERIMENTALhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip23
1 MATERIAL Y REACTIVOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip23
11 Materialhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip23
12 Reactivos y disolventeshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip23
13 Patroneshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip23
14 Patrones internoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip24
15 Gaseshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip25
2 INSTRUMENTACIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip25
3 PREPARACIOacuteN DE LAS DISOLUCIONEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip25
4 LAVADO DEL MATERIALhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip26
5 EXTRACCIOacuteN DE MUESTRAS MEDIANTE SPEhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip26
6 CONDICIONES DE DETERMINACIOacuteN MEDIANTE UPLC-MSMShelliphelliphelliphelliphellip28
CAPIacuteTULO IV RESULTADOS Y DISCUSIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 29
1 IDENTIFICACIOacuteN DE LOS COMPUESTOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip29
2 CARACTERIZACIOacuteN DEL PROCEDIMIENTO DE
DETERMINACIOacuteN (UPLC-ESI-MSMS)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip30
3 ESTUDIO DEL MEacuteTODO SPEhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33
4 CARACTERIZACIOacuteN DEL MEacuteTODO DE DETERMINACIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip39
5 APLICACIOacuteN A MUESTRAS DE VINOS COMERCIALEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip42
CAPIacuteTULO V CONCLUSIONESCONCLUSIOacuteNSCONCLUSIONShelliphellip 48
VI BIBLIOGRAFIacuteAhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip51
ResumenResumoAbstract
bull RESUMEN
Los pesticidas son compuestos que se emplean en vintildeedos de todo el mundo para garantizar una proteccioacuten en la
cosecha con escasas peacuterdidas producidas por diferentes organismos en uvas empleadas para la elaboracioacuten del
vino El modo de accioacuten de estos compuestos se basa en la interferencia sobre el metabolismo de diferentes
organismos sin afectar a la vid Un incremento en el empleo de estos compuestos puede determinar la existencia
de residuos en las uvas en el momento de la cosecha desde donde pueden alcanzar el vino que se elabora con las
mismas Por ese motivo se ha establecido una legislacioacuten que regule la cantidad maacutexima de residuos de pesticidas
en uvas y aunque a diacutea de hoy no hay valores regulados en el vino se recomienda que no excedan al 10 de los
liacutemites en uvas En este estudio se ha trabajado con distintos tipos de fitosanitarios fungicidas principalmente
aunque tambieacuten alguacuten insecticida con el objetivo de poder detectar la mayor cantidad de estas sustancias en vinos
comerciales optimizando la extraccioacuten mediante extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) y deteccioacuten mediante
cromatografiacutea de liacutequidos acoplada a espectrometriacutea de masas en taacutendem (LC-ESI-MSMS) Se presenta una
metodologiacutea analiacutetica sencilla raacutepida y robusta que puede ser implementada en laboratorios de control de
alimentos
bull RESUMO
Os pesticidas son compostos empregados en vintildeas arredor do mundo para garantir unha proteccioacuten na colleita
con poucas perdas producidas por distintos organismos en uvas utilizadas para a fabricacioacuten do vintildeo O modo de
accioacuten destes compostos baseacutease na intromisioacuten sobre o metabolismo de diferentes organismos sen afectar aacute vide
Un acrecentamento no uso destos compostos pode fixar a existencia de residuos nas uvas no momento da colleita
onde poden chegar ao vintildeo que se produce coas mesmas Por ese motivo estipulouse unha lexislacioacuten que regula a
cantidade maacutexima de residuos de pesticidas en uvas e aiacutenda que a diacutea de hoxe non hay valores regulamentados no
vintildeo recomeacutendase que non superen ao 10 dos liacutemites en uvas Neste estudo traballouse con diferentes tipos de
pesticidas funxicidas principalmente aiacutenda que tameacuten alguacuten insecticida co obxecto de poder detectar a maior
cantidade destas sustancias en vintildeos comerciais optimizando a extraccioacuten por medio da extraccioacuten en fase soacutelida
(SPE) e deteccioacuten por medio de cromatografiacutea de liacutequidos acoplada a espectrometriacutea de masas en taacutendem (LC-
MSMS) Preseacutentase unha metodoloxiacutea analiacutetica simple raacutepida e robusta que pode ser aplicada en laboratorios de
control de alimentos
1
ResumenResumoAbstract
bull ABSTRACT
Pesticides are compounds that are used in vineyards around the world to ensure protection at harvest with a few
loss produced by different organisms in grapes used to make wine The mode of action of these compounds is
based on the interference on the metabolism of different organisms without affecting the vine An increase in the
use of these compounds can determine the existence of residues in grapes at the time of harvest from where
they can reach the wine that is elaborated with the same ones For this reason legislation has been established to
regulate the maximum amount of pesticide residues in grapes and although there are currently no regulated
values in wine it is recommended that they do not exceed 10 of the limits on grapes In this study we have
worked with different types of pesticides mainly fungicides but also some insecticide with the purpose of being
able to detect the greatest amount of these substances in commercial wines extraction has been optimized by
solid phase extraction (SPE) and detection has been optimized by liquid chromatography coupled to tandem mass
spectrometry (LC-ESI-MSMS) It is presented a simple fast and robust analytical methodology that can be
implemented in food control laboratories
2
Capitulo I Introduccioacuten
CAPIacuteTULO I INTRODUCCIOacuteN
1 FITOSANITARIOS
11 Tipos de fitosanitarios empleados en viticultura
De acuerdo con el Ministerio de Agricultura y Pesca Alimentacioacuten y Medio Ambiente los fitosanitarios se definen
como una o varias sustancias activas u otros ingredientes conformando una mezcla con el fin de proteger los
productos de origen vegetal de organismos nocivos tanto de tipo vegetal como animal que conforman plagas
Dentro de estos fitosanitarios tambieacuten se encuentran las sustancias que destruyen regulan o inhiben la
germinacioacuten de las plantas pero no se contemplan dentro de este grupo vacunas medicamentos y antibioacuteticos
para uso humano o veterinario o agentes utilizados en el control bioloacutegico Los productos fitosanitarios ayudan a
asegurar una buena calidad en los alimentos asiacute como contribuyen al aumento de los rendimientos en la
agricultura [1]
Seguacuten la OMS (Organizacioacuten Mundial de la Salud) los fitosanitarios se pueden clasificar atendiendo a los
organismos a los que esteacuten destinados siendo estos insectos (insecticidas) aacutecaros (acaricidas) moluscos
(molusquicidas) roedores (rodenticidas o raticidas) hongos (fungicidas) gusanos y larvas (nematicidas) malas
hierbas (herbicidas) bacterias (antibioacuteticos pero sin comprender los de uso humano y bactericidas) y otras formas
de vida perjudiciales para la salud puacuteblica y tambieacuten para la agricultura consideradas como plagas animales o
vegetales que puedan ser generadas durante la produccioacuten almacenamiento transporte distribucioacuten y elaboracioacuten
de productos agriacutecolas y sus derivados Actualmente no se puede pensar en un cultivo racional sin el uso de alguacuten
tipo de pesticida ya que la peacuterdida de cosechas en todo el mundo debido a causa de insectos enfermedades de las
plantas y malas hierbas es equivalente a un tercio de la produccioacuten total [2] [3]
Para el estudio de los productos de fitosanitarios en vino nos centraremos solamente en los tres tipos maacutes
importantes en eacuteste aacuterea herbicidas insecticidas y sobre todo fungicidas
Los herbicidas son sustancias destinadas a destruir las malas hierbas cuyo meacutetodo de accioacuten es la interferencia
en los procesos bioquiacutemicos como la fotosiacutentesis que tienen lugar en el sistema vivo de eacutestas Generalmente se
aplican en solucioacuten o suspensioacuten acuosa en forma de nube de pequentildeas gotas dirigidas hacia el objetivo de la
aplicacioacuten Los herbicidas ofrecen los medios maacutes efectivos para el control de las plagas siendo en los paiacuteses
industrializados aplicados sobre el 85-100 de todos los cultivos principales Este tipo de sustancias son
propensas a la descomposicioacuten por microbios plantas y animales y no son comunes los problemas de residuos de
herbicidas si se utilizan de acuerdo a las instrucciones de las etiquetas [4] A pesar de todos los beneficios que nos
aportan un mal uso de estos puede convertirse en un serio problema ya que toda sustancia quiacutemica usada en
3
Capiacutetulo I Introduccioacuten
agricultura puede provocar un efecto negativo en el ambiente si es utilizada en altas dosis El uso prolongado de
un mismo herbicida puede causar problemas de resistencia de malezas fenoacutemeno que consiste en la aparicioacuten de
biotipos tolerantes de una especie la cual anteriormente era controlada por el herbicida [5]
Por otro lado los insecticidas son fitosanitarios destinados a controlar el ataque de insectos y para eso existen
distintos caminos a traveacutes de los que pueden actuar siendo envenenamiento por contacto en doacutende el insecticida
penetra a traveacutes de la cutiacutecula del insecto hasta alcanzar el sitio activo envenenamiento oral en doacutende el
insecticida es ingerido y absorbido a traveacutes del intestino o tambieacuten por fumigaciones en doacutende el insecticida
penetra en el cuerpo del insecto a traveacutes de los espiraacuteculos del sistema respiratorio Pero al igual que pasa con los
herbicidas los insectos tambieacuten desarrollan resistencia a los insecticidas debido al contacto continuo con estos
Esta resistencia puede ser expresada por varios caminos que el insecto no entre en contacto con la deposicioacuten del
insecticida que se modifique la composicioacuten del exoesqueleto inhibiendo asiacute la penetracioacuten del insecticida la
modificacioacuten del sitio activo para el fitosanitario reduciendo la sensibilidad a la forma activa del insecticida o que
la viacutea metaboacutelica del insecto se modifique negando el metabolismo del compuesto aplicado en su forma toacutexica
[6] Aunque por lo general otros aspectos de la agricultura moderna tienen un mayor impacto en el medio
ambiente los insecticidas se encuentran entre las herramientas agriacutecolas que estaacuten maacutes asociadas con el dantildeo
ambiental Su objetivo especiacutefico es matar a plagas de insectos por lo que puede que tenga un impacto letal en
organismos que no son su objetivo [7]
Por uacuteltimo los fungicidas estaacuten destinados tanto a combatir las plagas de hongos como a combatir las
enfermedades fungosas de las plantas ya sea matando retrasando el desarrollo o inhibiendo la reproduccioacuten de
los hongos Los fungicidas en general se dividen atendiendo al modo de accioacuten de eacutestos en fungicidas de
contacto fungicidas penetrantes o fungicidas sistemaacuteticos
Los fungicidas de contacto protegen uacutenicamente el sitio de aplicacioacuten contra las plagas quedando en el exterior de
la planta de eacutesta manera sin penetrar en el tejido vegetal forman una peliacutecula protectora Cuando alguna espora
de un hongo llega a su superficie se encuentra con esa peliacutecula que le impide penetrar o en su defecto germinar
En el caso de que atraviesen el tejido vegetal bien sea por una alta dosis o por una rotura en las paredes de la
planta se convierten en un producto toacutexico para ella llegando a quemarla
Otro tipo de fungicidas los fungicidas penetrantes como su nombre indica se introducen en el tejido vegetal y
una vez dentro cuentan con muy poca movilidad es decir no circulan por los vasos conductores Al tener la
capacidad de entrar en la planta pueden combatir a los hongos que ya se encuentren dentro de eacutesta pero no
pueden ser toacutexicos para ella porque de lo contrario la dantildeariacutean
Por uacuteltimo nos encontramos con los fungicidas sistemaacuteticos Este tipo de fungicidas actuacutean protegiendo a la
planta contra las plagas en distintas zonas por transfusioacuten del fitosanitario dentro de la misma Esto sucede porque
penetran en el tejido vegetal y circulan por ella a traveacutes de la corriente de los vasos conductores
El meacutetodo de accioacuten de los fungicidas se basa en interferir en el metabolismo de los hongos ya sea por un
4
Capiacutetulo I Introduccioacuten
ataque en la produccioacuten de energiacutea la inhibicioacuten de la mitosis o inhibiendo la formacioacuten de quitina que se trata
del compuesto principal de la pared celular de los hongos y que por ende influye en la permeabilidad de la
membrana [8] [9]
Las enfermedades fuacutengicas fundamentales que nos podemos encontrar en las uvas de la vid son la botritis el oiacutedio
y el mildium las cuales pueden llegar a causar peacuterdidas importantes en viticultura
La enfermedad de la botritis tambieacuten llamada moho gris estaacute causada
por el hongo Botrytis cineacuterea y se puede encontrar en todo el mundo
infectando a un amplio nuacutemero de plantas Se trata de uno de los
patoacutegenos fuacutengicos maacutes interesantes debido a que puede vivir tanto
de forma patoloacutegica produciendo la enfermedad como
alimentaacutendose de materia orgaacutenica en descomposicioacuten La accioacuten
fuacutengica del hongo se lleva a cabo cuando las uvas empiezan a
acumular azuacutecar pudiendo ser muy devastador en algunas
condiciones sobre todo en cultivos empapados por la lluvia o
localizados en un ambiente huacutemedo y con viento produciendo la peacuterdida de los racimos de uvas que son
infectados O por el contrario en otro tipo de condiciones ambientales de sequedad despueacutes de unas
condiciones de humedad dicho hongo le confiere beneficios a ciertos tipos de vino blanco [10]
El oiacutedio es una enfermedad causada por la especie Uncinula necator la cual afecta tanto al rendimiento como a la
calidad de las uvas y altera las cualidades de sus derivados vino mosto etc El proceso de infeccioacuten del oiacutedio
tiene lugar siguiendo un ciclo de reproduccioacuten en las distintas estaciones del antildeo El riesgo de infeccioacuten viene
dado en funcioacuten de la temperatura oacuteptima entre 25-30ordmC humedad del ambiente en el que se encuentre y
tambieacuten en funcioacuten de la temporada siendo maacutes resistentes los racimos de uvas a medida que van madurando El
hongo afecta a todas las parte de la vid hojas tallo y racimos las cuales presentan siacutentomas distintos Las hojas se
vuelven de un color amarillento y se cubren de un polvo fino blanco grisaacuteceo En el tallo el oiacutedio se manifiesta a
traveacutes de manchas difuminadas con coloracioacuten inicial verde oscuro volvieacutendose cada vez maacutes oscuras al final y si
ocurre un ataque fuerte puede desembocar en que el tallo se acabe secando y por consiguiente disminuye la
produccioacuten Pero el ataque maacutes fuerte se produce en los racimos empezando por cubrirse del polvillo blanco
grisaacuteceo y continuando con que el oiacutedio detiene el crecimiento de la piel de la uva con la consecuencia que la uva
se agrieta Esta enfermedad produce unos dantildeos directos en la cantidad y calidad de la cosecha y si no se toman
medidas de prevencioacuten las peacuterdidas pueden llegar a ser totales [12] [13]
Figura I1Enfermedad de botritis en un racimo de uvas [11]
Figura I2 Enfermedad del oiacutedio en hoja tallo y racimo de izquierda a derecha [14] 5
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Por uacuteltimo el mildium o mildiu es una enfermedad producida por el hongo Plasmopara vitiacutecola considerada como
una de las peores enfermedades del cultivo siempre y cuando esteacuten en las condiciones ambientales favorables para
su desarrollo Dichas condiciones oacuteptimas para la propagacioacuten de la enfermedad son las lluvias al amanecer o al
anochecer con una temperatura en un rango de 20-25 ordmC El periacuteodo sensible de la vegetacioacuten de la vintildea es a
partir de una longitud de 10 cm en adelante siendo maacutexima en el periacuteodo de mayor crecimiento de la planta Por
otro lado la sensibilidad del racimo empieza desde su formacioacuten hasta que las uvas al florecer alcanzan el tamantildeo
similar al de un guisante pero de ahiacute en adelante la sensibilidad se ve disminuida Dicho hongo cuenta con un
ciclo reproductivo abarcando varias fases desde la fase de contaminacioacuten siendo el principio hasta la fase de pro-
pagacioacuten Afecta a todos los oacuterganos verdes de la vid y sus siacutentomas son variados en las distintas zonas de eacutesta
En las caras de las hojas aparecen unas manchas amarillentas en los racimos cuando se aproxima la floracioacuten los
que se encuentran infectados se curvan secaacutendose y cubrieacutendose de una pelusa blanquecina y cuando alcanzan el
tamantildeo de un guisante en adelante las uvas de los racimos afectados se van oscureciendo y secando sin que apa-
rezca la fructificacioacuten del hongo ademaacutes de oscurecerse el tallo [15]
12 Estructura propiedades fiacutesico-quiacutemicas y clasificacioacuten
En este trabajo nos centramos en estudiar los residuos de veintitreacutes fitosanitarios tipo fungicida principalmente
aunque tambieacuten alguacuten residuo tipo insecticida Las caracteriacutesticas maacutes importantes de dichos compuestos seraacuten
recogidas en la Tabla I1 que incluye estructuras clasificacioacuten (se ha usado el acroacutenimo ldquoFrdquo en caso de ser
fungicidas e ldquoIrdquo en caso de ser insecticidas) y propiedades fiacutesico-quiacutemicas Las propiedades fiacutesico-quiacutemicas que
pueden resultar maacutes relevantes para este estudio son el pKa ya que la mayoriacutea se trata de compuestos baacutesicos
aunque se encuentre alguacuten aacutecido deacutebil como es por ejemplo el Fenhexamid y Kow describiendo el coeficiente de
reparto entre octanolagua empleado para medir el grado de hidrofobidad que proporciona una estimacioacuten de
la posible distribucioacuten del analito entre materia orgaacutenica y agua
Figura I3 Enfermedad del mildium en la imagen de la izquierda coacutemo afecta a las hojas imagen central coacutemo
afecta a los racimos cuaacutendo estaacuten infectados al comenzar la floracioacuten y en la imagen de la derecha coacutemo afecta a
los racimos en doacutende las uvas tienen tamantildeo mayor al de un guisante [16]
6
Compuesto Estructura Nombre sistemaacutetico Foacutermula CAS Uso ordflog (kow) pKa
Ametoctradin
(AME)
5-ethyl-6-
octyl[124]triazolo[15-
a]pyrimidin-7-amine
C15H25N5 865318-97-4 F 440 278
Benalaxyl
(BEN)
Methyl-N-(phenylacetyl)-N-
(26-xylyl)-D-alaninate C20H23NO3 98243-83-5 F 368 -
Boscalid
(BOS)
2-Chloro-N-(4rsquo-
chlorobiphenyl-2-yl)-
nicotinamide
C18H12Cl2N2O 188425-85-6 F 296 -
Carbendazim
(CAR)
Methyl 2-benzimidazole
carbamate C9H9N3O2 10605-21-7 F 148 420
Cyprodinil
(CYP)
4-Cyclopropyl-6-methyl-N-
phenilpyrimidin-2-amine C14H15N3 121552-61-2 F 400 309
Dimethomorph
(DIM)
(2E)-3-(4-chlorophenyl)-3-(34-
dimethoxyphenyl)-1-
(morpholin-4-yl)prop-2-en-1-
one
C21H22ClNO4 110488-70-5 F 268 -13
Fenhexamid
(FEH)
N-(23-dichloro-4-
hydroxyphenyl)-1-methyl-
cyclohexanecarboxamide
C14H17Cl2NO2 126833-17-8 F 351 73
Fenpropidin
(FEP)
1-[(RS)-3-(4-tert-butylphenyl)-
2-methylpropyl]piperidine C19H31N 67306-00-7 F 26 1013
Fluopicolid
(FLU)
26-dichloro-N-[3-chloro-5-
(trifluoromethyl)-2-
pyridylmethyl]benzamide
C14H8Cl3F3N2O 239110-15-7 F 29 -
Imidacloprid
(IMI)
(E)-1-(6-chloro-3-
pyridylmethyl)-N-
nitroimidazolidin-2-
ylideneamine
C9H10ClN5O2 138261-41-3 I 057 -
Iprovalicarb
(IPR)
Isopropyl (S)-2-methyl-1-[1-(p-
tolyl)ethylcarbamoyl]propyl-
carbamate
C18H28N2O3 140923-17-7 F 32 -
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Tabla I1 Estructura clasificacioacuten y propiedades fiacutesico-quiacutemicas de intereacutes para los analitos de estudio
7
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Compuesto Estructura Nombre sistemaacutetico Foacutermula CAS Uso ordflog (kow) pKa
Mandipropamid
(MAN)
2-(4-chlorophenyl)-N-[3-
methoxy-4-(2-
propynyloxy)phenethyl]-2-(2-
propynyloxy)acetamide
C23H22ClNO4 374726-62-2 F 32 -
Metalaxyl
(MET)
N-(26-dimethylphenyl)-N-
(methoxyacetyl)-DL-alanine
methyl ester
C15H21NO4 57837-19-1 F 175 000
Myclobutanil
(MYC)
2-(4-chlorophenyl)-2-(1H-
124-triazol-1-
ylmethyl)hexanentrile
C15H17ClN4 88671-89-0 F 289 230
Penconazol
(PEN)
1-[2-(24-
dichlorophenyl)pentyl]-1H-
124-triazole
C13H15Cl2N3 66246-88-6 F 372 151
Pyraclostrobin
(PYC)
Methyl2-[1-(4-chlorophenyl)-
1H-pyrazol-3-
yloxymethyl]phenylmetoxy-
carbamate
C19H18ClN3O4 175013-18-0 F 399 -
Pyrimethanil
(PYM)
4-6-dimethyl-N-phenyl-2-
pyrimidinamine C12H13N3 53112-28-0 F 284 352
Tebuconazol
(TEC)
1-(4-chlorophenyl)-44-
dimethyl-3-(1H-124-triazol-1-
ylmethyl)-3-pentanol
C16H22ClN3O 107534-96-3 F 370 500
Tebufenozid
(TEF)
35-dimethylbenzoic acid 1-
(11-dimethylethyl)-2-(4-
ethylbenzoyl)hidrazide
C22H28N2O2 112410-23-8 I 425 -
Thiabendazol
(TBZ)
2-(13-thiazol-4-yl)-1H-
benzimidazole C10H7N3S 148-79-8 F 239 473
Thiamethoxam
(TME)
3-[(2-chloro-5-
thiazolyl)methyl]tetrahydro-5-
methyl-N-nitro-4H-135-
oxadiazin-4-imine
C8H10ClN5O3S 153719-23-4 I -013 -
Thiophanate-
methyl
(THI-M)
DimethylNNrsquo-[12-
phenylenebis(azanediylcarbono
thioyl)] dicarbamate
C12H14N4O4S2 23564-05-8 F 145 728
Triadimenol
(TRI)
1-(4-chlorophenoxy)-33-
dimethyl-1-(1H-124-triazol-1-
yl)-2-butanol
C14H18ClN3O2 55219-65-3 F 318
-
ordf Valores para la forma neutra 8
Capiacutetulo I Introduccioacuten
13 Toxicidad de los pesticidas
En los uacuteltimos antildeos el uso indiscriminado de pesticidas de siacutentesis en agricultura ha creado graves problemas de
salud y medioambientales ya que su uso debido al aumento de la poblacioacuten y por consiguiente de la actividad
agraria se ha incrementado considerablemente Durante las tres uacuteltimas deacutecadas una estimacioacuten dada por la
Organizacioacuten Mundial de la Salud y el Programa de las Naciones Unidas para el Medio Ambiente revela que
aproximadamente cerca de 20000 personas al antildeo mueren generalmente agricultores por exposicioacuten continuada
a alguno de estos toacutexicos En la mayoriacutea de los casos los agricultores utilizan los pesticidas de forma que las
cantidades se desviacutean significativamente de las recomendadas ya que asocian cantidades maacutes altas con mayor
efectividad y velocidad de accioacuten El mal uso de dichos toacutexicos se ve en los signos presentes en los ecosistemas
afectados pudiendo llegar a ser perjudiciales para la salud humana Estos riesgos que causan tanto en la salud
como en el medioambiente pueden ser reducidos o en su defecto evitados mediante la educacioacuten sobre este tipo
de toacutexicos con el fin de frenar su uso excesivo y descontrolado [17]
Desde el punto de vista medioambiental los fitosanitarios empleados en un cultivo pueden persistir en los
distintos medios tierra aire o agua y afectar tanto a ecosistemas terrestres como acuaacuteticos En los sistemas
terrestres los suelos son contaminados mediante la aplicacioacuten del toacutexico de forma directa o como deposicioacuten del
resultado de una suspensioacuten aeacuterea Eacutestos pueden persistir desde varios diacuteas hasta varios antildeos ya que el suelo
retiene y moviliza el toacutexico despueacutes de su emisioacuten Los que persisten maacutes tiempo en el medioambiente tienen una
mayor probabilidad de interaccionar con otros elementos del sistema y si su vida media es mayor a la frecuencia
con la que se aplica el pesticida tienden a acumularse tanto en el suelo como en las especies que habitan en eacutel Por
otro lado el agua es contaminada por pesticidas bien por aplicacioacuten directa por estar presentes en las
precipitaciones de la atmoacutesfera o bien por la movilidad que tienen desde el suelo Tanto los pesticidas solubles
como los insolubles interaccionan con los ecosistemas acuaacuteticos los hidrosolubles persisten maacutes tiempo
solubilizados en agua mientras que los otros se asocian a los sedimentos y se concentran en las especies que
habitan el medio acuaacutetico [18]
Como consecuencia de la amplia distribucioacuten de los toacutexicos en aire suelo y agua se produce una acumulacioacuten de
ellos en los elementos que contribuyen a la alimentacioacuten humana ya que su amplio uso hace que el contacto con
los plaguicidas por parte de personas y animales sea inevitable La contaminacioacuten de los alimentos se puede
presentar por aplicacioacuten directa de los pesticidas el uso de eacutestos durante el manejo transporte y almacenamiento
de los productos comestibles o por su acumulacioacuten en la cadena troacutefica Son bioacumulables en el organismo
debido a su caraacutecter lipofiacutelico lo que les confiere una vida media en los tejidos larga La exposicioacuten a pesticidas
persistentes no tiene la misma repercusioacuten en cada uno de los individuos expuestos sino que se considera criacutetica la
exposicioacuten durante la etapas embrionaria fetal y primeros antildeos de vida en doacutende se transmite de madres a hijos
mediante la gestacioacuten y la lactancia como resultado de la acumulacioacuten en el tejido graso de la madre [19]
9
Capiacutetulo I Introduccioacuten
14 Legislacioacuten
El aumento del uso de fitosanitarios en actividades relacionadas con la produccioacuten de alimentos para consumo
humano o animal tambieacuten desembocoacute en una preocupacioacuten social debido a su toxicidad y bioacumulacioacuten En
respuesta la Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura (FAO) en colaboracioacuten
con la Organizacioacuten Mundial de la Salud (OMS) pusieron en marcha un programa Codex Alimentarius cuyo
objetivo a traveacutes de sus normas y coacutedigos de praacutecticas alimentarias internacionales es garantizar la calidad e
inocuidad de los alimentos que estaacuten al alcance de cualquier persona Con estas normas internacionales los
consumidores pueden confiar en la calidad de los alimentos independientemente de su origen geograacutefico [20]
Todos los alimentos destinados al consumo humano o animal en la Unioacuten Europea estaacuten sujetos a un liacutemite
maacuteximo de residuos de plaguicidas para la proteccioacuten de la salud humana y animal Actualmente en lo referente a
legislacioacuten para el control de la cantidad del toacutexico en la uva estaacute vigente el Reglamento 3962005 del Parlamento
Europeo y del Consejo de 23 de febrero de 2005 referido a la regulacioacuten de los liacutemites maacuteximos de residuos de
plaguicidas en alimentos y piensos de origen vegetal y animal El liacutemite maacuteximo de residuos (LMR) se define co-
mo el nivel maacutes alto de un residuo de un pesticida que se tolera de manera legal sobre los alimentos o piensos
cuando se aplican correctamente Las cantidades de residuos que se encuentren deben ser lo maacutes bajas posible
para garantizar la seguridad en la alimentacioacuten de los consumidores Dichos liacutemites maacuteximos de residuos estaacuten
fijados por la Comisioacuten Europea pudieacutendose encontrar en su base de datos LMR [21]
A continuacioacuten en la Tabla I2 se resumen los LMRs de los compuestos de este estudio en uvas de vinificacioacuten
en unidades de mgkg de uva En el caso del vino no hay legislacioacuten en lo referente a estos pesticidas solamente
la recomendacioacuten de no superar el 10 del valor del LMR en uva
Compuesto LMRs (mgkg uva) Compuesto LMRs (mgkg uva)
AME 6 MET 1
BEN 03 MYC 1
BOS 5 PEN 02
CAR 05 PYC 2
CYP 3 PYM 5
DIM 3 TEC 1
FEH 15 TEF 3
FEP 001 TBZ 005
FLU 2 TME 04
IMI 1 THI-M 3
IPR 2 TRI 2
MAN 2
Tabla I2 Liacutemites maacuteximos de residuos permitidos para los compuestos estudiados en uvas
10
Capiacutetulo I Introduccioacuten
2 MEacuteTODOS DE PREPARACIOacuteN DE MUESTRA APLICADOS A MUESTRAS DE VINO
21 Extraccioacuten liacutequido-liacutequido (LLE)
Se entiende por extraccioacuten liacutequido-liacutequido al meacutetodo mediante el cual un analito de intereacutes se separa por el
contacto con otra fase en la cual tiene mayor afinidad de la matriz en la que se halle Los procesos de extraccioacuten
implican dos fases y requieren tres pasos sucesivos mezcla de materia prima y disolvente separacioacuten de las dos
fases despueacutes del contacto y eliminacioacuten del disolvente que contiene el analito [22]
La extraccioacuten liacutequido-liacutequido (LLE) se basa en la distribucioacuten
de un analito entre dos fases liacutequidas inmiscibles en las
cuales analito y matriz tienen solubilidades diferentes
Principalmente una de las fases es un medio acuoso en
general se trata de la muestra y la otra un disolvente
orgaacutenico La selectividad y eficacia de este meacutetodo vienen
determinadas por la eleccioacuten del disolvente y por los factores
que pueden afectar al proceso de equilibrio (pH adiccioacuten de
sales neutras en la fase acuosa para reducir la solubilidad del
analito etc) [23] Esta teacutecnica permite llevar a cabo extracciones para un rango muy amplio de analitos siendo
una de las maacutes antiguas para la preparacioacuten de muestras en el anaacutelisis cualitativo y cuantitativo Ofrece grandes
capacidades de muestreo lineal y cuenta con la ventaja de la cantidad de informacioacuten existente sobre este meacutetodo
[24]
22 Extraccioacuten en fase soacutelida (SPE)
En 1978 aparecieron los primeros cartuchos desechables para la extraccioacuten en fase soacutelida y actualmente casi 40
antildeos despueacutes la extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) es la teacutecnica de preparacioacuten de muestras maacutes empleada en los
laboratorios Es una teacutecnica de preparacioacuten y tratamiento de muestras que se basa en la retencioacuten en una fase
adsorbente del analito de intereacutes presente en una muestra liacutequida que pasa a traveacutes de ella Debido a la variedad de
formatos (discos cartuchos y jeringas) y tipos de adsorbentes (los maacutes comunes carboacuten activo aluacutemina siacutelica gel
silicato de magnesio siacutelices enlazadas y poliacutemeros como por ejemplo estinero-divinilbenceno) o la facilidad de
automatizacioacuten y acoplamiento con otras teacutecnicas como por ejemplo una conexioacuten directa con un sistema de
Figura I4 Fundamentos teoacutericos de la LLE [25]
11
Capiacutetulo I Introduccioacuten
cromatografiacutea este meacutetodo le fue ganando terreno a la LLE Otra ventaja muy importante de la SPE frente a la
LLE es la disminucioacuten en la cantidad de disolvente orgaacutenico empleada Cada vez se va innovando maacutes sobre esta
teacutecnica llegando a encontrarse fases adsorbentes formadas por poliacutemeros capaces de retener en un uacutenico
cartucho un amplio abanico de analitos lipofiacutelicos o hidrofoacutebicos aacutecidos baacutesicos o neutros [26]
El fundamento de esta extraccioacuten como se puede en la Figura I6
consiste en cuatro etapas acondicionamiento adiccioacuten de muestra
retencioacuten y elucioacuten de los analitos de intereacutes En primer lugar antes
de empezar la extraccioacuten se requiere una etapa de acondicionamiento
para preparar el adsorbente haciendo pasar un poco de disolvente
para asiacute interaccionar mejor con la muestra Luego se hace pasar la
muestra liacutequida por la fase soacutelida Idealmente el adsorbente retiene
los analitos selectivamente a medida que va pasando la muestra y la
matriz pasa sin ser retenida Por uacuteltimo los analitos se eluyen del
adsorbente con un disolvente con el que tenga mayor afinidad [27]
23 Teacutecnicas de microextraccioacuten
231 Microextraccioacuten en fase soacutelida (SPME)
En la microextraccioacuten en fase soacutelida (SPME) se utilizan fibras de siacutelice fundida revestidas con un poliacutemero en un
disentildeo en forma de jeringa para la extraccioacuten de los analitos de intereacutes El principio por el que se rige esta
extraccioacuten es el reparto del analito entre la matriz de la muestra y el revestimiento de la fibra mediante un proceso
no competitivo Se trata de un meacutetodo que cuenta con muchas ventajas ya que se elimina completamente el uso de
disolventes y aparte no son necesarios voluacutemenes de muestra grandes pero tambieacuten cuenta con algunas
desventajas ya que tanto la capacidad como la sensibilidad se ven limitadas [29]
En la figura I7 podemos ver las etapas de la extraccioacuten En un
vial cerrado con una caacutepsula y un seacuteptum tenemos la muestra
liacutequida o bien soacutelida que contenga los analitos de intereacutes
volaacutetiles Con la jeringa se perfora el seacuteptum y una vez dentro
se acciona el eacutembolo para la exposicioacuten de la fibra con los
analitos introducieacutendola en la muestra liacutequida o en su defecto
en el espacio de cabeza para la extraccioacuten de analitos volaacutetiles
de una muestra soacutelida Despueacutes de la extraccioacuten dentro del vial
Figura I6 Etapas de una SPE [28]
Figura I7 Etapas de una SPME [30]
12
Capiacutetulo I Introduccioacuten
la fibra se introduce de nuevo en la jeringa y se retira del vial [27]
232 Microextraccioacuten en fase liacutequida (LPME)
La microextraccioacuten en fase liacutequida se desarrolloacute como una alternativa a la LLE para la reduccioacuten en la cantidad de
disolventes orgaacutenicos siendo rentable tanto para el medioambiente como econoacutemicamente Entre las modalidades
maacutes populares de esta teacutecnica se encuentran microextraccioacuten con gota suspendida (SDME) y microextraccioacuten
liacutequido-liacutequido dispersiva (DLLME) En la SDME una gota de disolvente orgaacutenico es expuesta al espacio de
cabeza situado sobre una muestra en un vial dicha gota es suspendida del extremo de una microjeringa Por otro
lado la DLLME sobre una muestra acuosa se inyecta un pequentildeo volumen de una mezcla de disolventes en la
cual es dispersada formando una solucioacuten en la que se establece el equilibrio El disolvente de extraccioacuten debe
presentar una densidad inferior a la de la muestra para facilitar su recuperacioacuten normalmente despueacutes de
centrifugar el vial doacutende se realiza la extraccioacuten [31]
24 QuEChERS
La extraccioacuten QuEChERS de las palabras en ingleacutes Quick Easy Cheap Effective Rugged and Safe es un meacutetodo
de extraccioacuten que se desarrolloacute entre 2000 y 2002 para el anaacutelisis de pesticidas Como su nombre indica raacutepido
faacutecil barato eficaz robusto y seguro son las principales
caracteriacutesticas de esta preparacioacuten de muestra Se realiza en dos
etapas en primer lugar una extraccioacuten simple y una segunda fase
de purificacioacuten En la primera etapa tenemos el vial con la
muestra en el cual se antildeade un disolvente generalmente
acetonitrilo para la extraccioacuten de los analitos de intereacutes en
presencia de diferentes sales (en el meacutetodo original se utiliza
sulfato de magnesio y cloruro de sodio) para facilitar la separacioacuten
de las fases En la segunda parte se realiza la purificacioacuten de la
fraccioacuten del extracto orgaacutenico Para eso se lleva a cabo una
limpieza de los analitos eliminando el agua y los compuestos
presentes en la matriz de la muestra empleando un adsorbente PSA (amina primaria y secundaria) C18 carboacuten
negro grafitizado (GCB) o una combinacioacuten de eacutestas [32]
Figura I8 Etapas de QuEChERS [33]
13
Capiacutetulo I Introduccioacuten
3 METODOLOGIacuteA ANALIacuteTICA PARA LA DETERMINACIOacuteN DE PESTICIDAS
31 Meacutetodos de GC-MS (MSMS)
La combinacioacuten de cromatografiacutea de gases (GC) teacutecnica de separacioacuten con espectrometriacutea de masas (MS) como
sistema de deteccioacuten representa un potente meacutetodo para la identificacioacuten determinacioacuten y cuantificacioacuten de
analitos orgaacutenicos en concentraciones traza presentes en muestras complejas Esta teacutecnica de anaacutelisis cuenta con
muchas ventajas en sensibilidad multifuncionalidad buena reproducibilidad robustez asiacute como facilidad en el
manejo pero con una gran desventaja este meacutetodo no es apto para ser utilizado con todos los analitos sino que
se ve limitado a aquellos que sean termoestables y no se descompongan a temperaturas elevadas antes de ser
volatilizados La muestra es introducida a traveacutes del inyector en el cromatoacutegrafo de gases doacutende impulsada por
una corriente de gas inerte como fase moacutevil pasa a traveacutes de la columna que contiene la fase estacionaria en la
cual se separan los compuestos debido a una distribucioacuten de estos entre fase moacutevil-fase estacionaria Mediante
una interfase son introducidos para su deteccioacuten en el espectroacutemetro de masas que cuenta con una fuente de
iones analizador de masas y un detector [34]
La combinacioacuten de analizadores de masas en taacutendem (MSMS) como sistema de deteccioacuten en GC es una teacutecnica
altamente selectiva mejorando la sensibilidad y la relacioacuten sentildeal-ruido en los espectros experimentando una
mejora por lo que se logran unos liacutemites de deteccioacuten inferiores Esta teacutecnica GC-MSMS comprende maacutes
pasos despueacutes de la separacioacuten por cromatografiacutea se lleva a cabo la deteccioacuten con MSMS que consta de varias
etapas generacioacuten de iones en la fuente de ionizacioacuten seleccioacuten de los iones precursores de una determinada
masa disociacioacuten causada por colisioacuten con moleacuteculas de gas inerte de los iones precursores y por uacuteltimo el
anaacutelisis de los fragmentos en relacioacuten a su masacarga (mz) En el caso de que un espectro de MS no permita
confirmar la identidad de un determinado compuesto quiacutemico la obtencioacuten de su espectro de MSMS permite
mejorar la confianza en su identificacioacuten [36]
Figura I9 Acoplamiento GC-MS [35]
14
Capiacutetulo I Introduccioacuten
32 Meacutetodos LC-MS (MSMS)
La teacutecnica de LC-MS se desarrolloacute para minimizar las desventajas del acoplamiento GC-MS y asiacute resolver los
problemas que este uacuteltimo acarreaba con los analitos termolaacutebiles permitiendo el anaacutelisis de eacutestos sin tener que
realizar una etapa previa de derivatizacioacuten La interfase de unioacuten de cromatografiacutea liacutequida (LC) con espectrometriacutea
de masas (MS) acarrea una dificultad significativa siendo responsable de transformar los analitos que se
encontraban en la fase moacutevil liacutequida en iones en fase gas sin que se produzca su degradacioacuten teacutermica La
sensibilidad de las determinaciones por LC-MS va a depender de la interfase empleada Las principales interfases
empleadas actualmente son las ionizaciones a presioacuten atmosfeacuterica electrospray (ES) e ionizacioacuten quiacutemica a
presioacuten atmosfeacuterica (APCI) [37]
Con los antildeos la cromatografiacutea liacutequida se ha ido innovando y mediante la disminucioacuten del tamantildeo de partiacutecula en
la columna se fue mejorando la eficiencia asiacute como aumentando la selectividad y resolucioacuten del pico en el
cromatograma Para este nuevo sistema llamado UPLC Ultra-Performance Liquid Chromatography se desarrolloacute
una nueva instrumentacioacuten capaz de trabajar a altas presiones generando flujos mayores sin peacuterdidas de
resolucioacuten utilizando inyectores automaacuteticos maacutes raacutepidos y detectores con mayor velocidad de adquisicioacuten de
datos disminuyendo asiacute el tiempo de anaacutelisis [39]
33 Espectrometriacutea de masas
La espectrometriacutea de masas es el meacutetodo de deteccioacuten y cuantificacioacuten maacutes fiable a la hora de la determinacioacuten de
compuestos en matrices complejas (tales como alimentos) ya que otros detectores maacutes tradicionales como UV-
visible o fluorescencia cuentan con una gran incertidumbre en los resultados llegando incluso a ofrecer falsos
Figura I10 Acoplamiento LC-MS [38]
15
Capiacutetulo I Introduccioacuten
positivos o negativos Un espectrometro de masas cuenta con un dispositivo de introduccioacuten de muestra una
caacutemara de ionizacioacuten un sistema para la aceleracioacuten de los iones uno o varios analizadores de masas y un detector
[40]
El fundamento de la espectrometriacutea de masas se basa en la separacioacuten de iones en base a la relacioacuten masacarga
(mz) El proceso consta fundamentalmente de cuatro etapas La
primera es la ionizacioacuten de la muestra los iones formados se aceleran
debido a la accioacuten de un campo eleacutectrico variable separacioacuten de los
iones seguacuten su masacarga deteccioacuten de los iones y produccioacuten de la
sentildeal eleacutectrica El analizador de masas es el encargado de la separacioacuten
de los iones en funcioacuten a su mz entre los que maacutes destacan
analizador de masas cuadrupolar que dispersa simultaacuteneamente todos
los iones en funcioacuten de la relacioacuten mz analizador de masas de
tiempo de vuelo (TOF) consta de un tubo a alto vaciacuteo sobre el que no
actuacutea ninguacuten campo eleacutectrico al cual llegan todos los iones acelerados con la misma energiacutea cineacutetica y en el tubo
las velocidades variacutean seguacuten mz y analizador de trampa de iones en doacutende los iones gaseosos quedan aislados
durante largos periacuteodos de tiempo por la accioacuten del campo eleacutectrico [41]
4RESUMEN BIBLIOGRAacuteFICO DE LAS TEacuteCNICAS DE EXTRACCIOacuteN Y
DETERMINACIOacuteN DE PESTICIDAS EN VINO
En la bibliografiacutea se han descrito diversas teacutecnicas y diferentes combinaciones entre teacutecnicas de extraccioacuten y
distintas teacutecnicas de cuantificacioacuten e identificacioacuten para esos analitos Entre estas teacutecnicas los valores de los liacutemites
de cuantificacioacuten (LOQs) y las recuperaciones relativas pueden diferir en el resultado en un rango de valores asiacute
como el tiempo total empleado para el anaacutelisis y para la preparacioacuten de la muestra
Por lo general el meacutetodo de extraccioacuten de los analitos de intereacutes maacutes empleado es la extraccioacuten en fase soacutelida
(SPE) la cuaacutel le ha estado ganando terreno a la extraccioacuten liacutequido-liacutequido aunque tambieacuten se estaacute viendo cada vez
maacutes desplazada debido al creciente uso de la teacutecnica QuEChERS
Figura I11 Etapas de la espectrometriacutea de masas [42]
16
Capiacutetulo I Introduccioacuten
En el estudio de ECONOMOU et al [43] realizado en el antildeo 2009 en Grecia se empleoacute la extraccioacuten en fase
soacutelida con deteccioacuten en cromatografiacutea de liacutequidos acoplada a espectrometriacutea de masas en taacutendem (SPE-LC-ESI-
MSMS) Para la preparacioacuten de la muestra diluyeron 10 mL de vino (tanto blanco como tinto) a un volumen
final de 100 mL con agua ultrapura antes de la SPE Determinaron las recuperaciones de la extraccioacuten para dos
niveles de concentracioacuten 0010 y 0050 mgL realizando 8 medidas diarias durante 3 diacuteas consecutivos
encontraacutendose unos valores que variacutean dentro del rango 70-110 para todos los pesticidas en los dos niveles Para
la determinacioacuten y cuantificacioacuten de 46 pesticidas emplearon la teacutecnica de cromatografiacutea de liacutequidos con
espectrometriacutea de masas con un volumen de inyeccioacuten de 20 microL y un flujo de fase moacutevil de 02 mLmin
aclopada a espectrometriacutea de masas en taacutendem
Con la misma teacutecnica de extraccioacuten PELAJIĆ et al [45] durante el antildeo 2015 en Croacia llevaron a cabo la
determinacioacuten de 25 residuos de plaguicidas en vino tinto El meacutetodo que desarrollaron para dicha finalidad fue el
acoplamiento SPE-GC-MS Para la preparacioacuten de la muestra emplearon 10 mL de vino diluidos 11 con agua
ultrapura hasta un volumen final de 20 mL Calcularon las recuperaciones de la extraccioacuten y se encontroacute un rango
para todos los pesticidas en las muestras de 70-120 Para la determinacioacuten en cromatografiacutea de gases-
espectrometriacutea de masas se empleoacute un volumen de inyeccioacuten de 5 μL y un flujo de fase moacutevil de 10 mLmin
Mediante el acoplamiento de teacutecnicas SPE dispersiva-GC-MS WALORCZYK et al [48] en el antildeo 2011 en
Polonia llevaron a cabo la cuantificacioacuten de 160 pesticidas en diferentes clases de vino tinto rosado y blanco Con
10 g de vino y 10 mL de acetonitrilo se realizaron pruebas de recuperacioacuten en la fase de extraccioacuten para vino
tinto con los niveles de concentracioacuten 001 005 y 02 mgkg y para los vinos rosado y blanco con el nivel de
concentracioacuten 005mgkg y encontraron que a todos los niveles de concentracioacuten los valores de recuperacioacuten
rondan el rango 80-110 Para la teacutecnica cromatograacutefica se utilizoacute un volumen de inyeccioacuten de 5 microL
El acoplamiento LLE-SPE-LCDAD fue desarrollado por GONZAacuteLEZ-RODRIacuteGUEZ et al [50] en el antildeo
2010 en la provincia de Orense para la determinacioacuten de nuevos fungicidas propuestos para combatir el hongo
que provoca la enfermedad del mildium En la preparacioacuten de la muestra emplearon 15 mL de vino blanco para la
extraccioacuten en la cual fueron calculadas las recuperaciones relativas para dos niveles de concentracioacuten 005 y 05
mgkg en donde se establece un rango de entre 70-110 para todos los analitos Para la determinacioacuten mediante
cromatografiacutea de liacutequidos se empleoacute un volumen de inyeccioacuten de 2 μL y como meacutetodo de deteccioacuten utilizaron un
detector de diodos array
La microextraccioacuten sorptiva en fase soacutelida fue empleada en la publicacioacuten de FONTANA et al [44] junto con un
acoplamiento entre cromatografiacutea de liacutequidos y espectrometriacutea de masas para la determinacioacuten de 15 fungicidas
en vino realizada durante el 2010 en el noroeste de Espantildea Para la preparacioacuten de la muestra emplearon 10 mL
17
Capiacutetulo I Introduccioacuten
de vino diluiacutedos con el mismo volumen de agua ultrapura y un sorbente en forma de disco de silicona con un
volumen de 12 microL La recuperacioacuten de la extraccioacuten se calculoacute para vino tinto (Menciacutea) y vino blanco (Godello)
realizando tres replicas dentro de un mismo diacutea para los niveles de concentracioacuten 10 y 50 ngmL y nueve reacuteplicas
realizando el anaacutelisis en tres diacuteas consecutivos para el nivel de concentracioacuten de 25 ngmL y los resultados
obtenidos dan unos valores de recuperacioacuten dentro del rango 75-117 En el sistema LC-QTOF-MS el volumen
de inyeccioacuten fue de 15 microL
El otro meacutetodo de extraccioacuten mencionado anteriormente es QuEChERS estaacute en auge como meacutetodo de extracioacuten
de residuos de pesticidas en matrices como la del vino o la uva ya que incrementa la velocidad del anaacutelisis y reduce
el efecto de matriz BUERGE et al [46] seguido de una deteccioacuten mediante GC-MSMS realizaron una estapa
de extraccioacuten QuEChERS con alguna modificacioacuten acetato de sodio en lugar de cloruro soacutedico y acetato de etilo
en lugar de acetonitrilo utilizando 5 g de uva para la determinacioacuten de residuos de 4 pesticidas durante el antildeo
2016 Las recuperaciones de extraccioacuten resultaron ser valores entre 91-149 en uva a distintos niveles de
concentracioacuten 005 05 y 5 mgkg
Para la determinacioacuten de Ametoctradin HU et al [47] llevaron a cabo una extraccioacuten QuEChERS empleando 10
g de uva con deteccioacuten mediante el acoplamiento UPLC-MSMS utilizando un volumen de inyeccioacuten de 5 μL y
un flujo de fase moacutevil de 03 mLmin Las recuperaciones de la extraccioacuten se calcularon para tres niveles de
concentracioacuten 1 10 100 μgL de dos formas distintas en tres diacuteas consecutivos realizando 5 reacuteplicas al diacutea o en
dentro de un mismo diacutea realizando 15 reacuteplicas los resultados de todos los caacutelculos se encuentran dentro del rango
818-1001
Siguiendo con el mismo modo de extraccioacuten GUO et al [49] publicaron sus estudios para la determinacioacuten de
50 pesticidas y 12 adulterantes en vino tinto Para la extraccioacuten QuEChERS se utilizaron 10 mL de vino tinto con
10 mL de acetonitrilo y calcularon las recuperaciones para tres niveles de concentracioacuten 50 100 y 250 ngmL
encontraacutendose un rango de valores entre 75-120 El meacutetodo de deteccioacuten se llevoacute a cabo mediante un anaacutelisis
directo en tiempo real junto con espectrometriacutea de masas en tandem con un cuadrupolo (DART-MSMS) la
teacutecnica DART es un meacutetodo raacutepido para cribar y cuantificar los analitos de estudio que prescinde de la etapa de
separacioacuten cromatograacutefica
A continuacioacuten se recogen en la Tabla I3 los liacutemites de cuantificacioacuten (LOQs) de los analitos de intereacutes en este
trabajo caacutelculados por los diferentes meacutetodos encontrados en bibliografiacutea citados anteriormente en este apartado
18
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Tabla I3 LOQs de los analitos de intereacutes descritos para los distintos meacutetodos encontrados en la bibliografiacutea
Compuesto LOQs
Compuesto LOQs
V Blanco V Tinto Uva V Blanco V Tinto Uva
AME - - 0032μgkg[47] MET 86 μgL[43]
22 μgL[44]
89 μgL[43]
22 μgL[44]
5 μgL[45]
259 ngmL[49]
001mgkg[48]
BEN 02 μgL[44]
0001 mgL[50]
02 μgL[44]
001 μgL[45]
280ngmL[49]
005 mgkg[48] MYC 30 μgL[43]
08 μgL[44]
36 μgL[43]
10 μgL[44]
025 μgL[45]
331ngmL[49]
001 mgkg[48]
BOS 0065 mgL[50] 05 μgL[45]
1076 ngmL[49] 001 mgkg[48] PEN
56 μgL[43]
05 μgL[44]
49 μgL[43]
04 μgL[44]
220ngmL[49]
001 mgkg[48]
CAR - 386 ngmL[49] - PYC 0003mgL[50] 07 μgL[45] 001 mgkg[48]
CYP 15 μgL[43]
04 μgL[44]
0001 mgL[50]
22 μgL[43]
06 μgL[44]
312 ngmL[49]
001 mgkg[48] PYM 17 μgL[43] 22 μgL[43]
10 μgL[45] 001 mgkg[48]
DIM 18 μgL[43] 20 μgL[43] 001 mgkg[48] TEC 03 μgL[44]
03 μgL[44]
10 μgL[45]
160ngmL[49]
001 mgkg[48]
FEH 17 μgL[43] 22 μgL[43]
938 ngmL[49] 001 mgkg[48] TEF - 876ngmL[49] -
FEP - - 002mgkg[46] TBZ 15μgL [43] 29μgL[43] 001 mgkg[48]
FLU 005 μgL[45] TME - 25 μgL[45] 001 mgkg[48]
IMI 21 μgL[43] 22 μgL[43]
225 ngmL[49] - THI-M 92 μgL[43] 89 μgL[43] -
IPR 07 μgL[44] 07 μgL[44] 001 mgkg[48] TRI 10 μgL[44] 12 μgL[44] 001 mgkg[48]
MAN 0011 mgL[50] - -
5 DISTRIBUCIOacuteN DE PESTICIDAS EN VINOS COMERCIALES
En algunos de los meacutetodos descritos en el apartado anterior se procesaron vinos comerciales encontraacutendose
resultados positivos para muchos residuos de pesticidas y algunos hasta en gran concentracioacuten
ECONOMOU et al [43] mediante el meacutetodo LC-ESI-MSMS realizaron el anaacutelisis de 60 muestras de vino tinto
y blanco recogidos en supermercados locales en Grecia a lo largo de un antildeo El meacutetodo se habiacutea desarrollado
19
Capiacutetulo I Introduccioacuten
para la determinacioacuten de 46 pesticidas pero la mayoriacutea se encuentran con una concentracioacuten por debajo de
001mgL solo ocho plaguicidas se obtuvieron con resultados de concentracioacuten mayores Se muestran los
resultados en la Tabla I4 de los analitos de intereacutes en este estudio
Tabla I4 Nuacutemero de muestras positivas de distintos pesticidas en el anaacutelisis de 60 muestras de vino [43]
Compuesto Positivos con concentracioacuten entre 001-01
mgL
Positivos con concentracioacuten entre 01-1
mgL
PYM 2 (3) 2 (3)
MYC 2 (3) 0 (0)
CAR 11 (18) 7 (12)
THI-M 7 (12) 5 (8)
FEH 5 (8) 0 (0)
MET 1 (2) 0 (0)
Mediante el meacutetodo de microextraccioacuten en fase soacutelida-LC-TOF-MS FONTANA et al [44] aplicaron el
desarrollo del procedimiento a un total de 12 vinos joacutevenes elaborados en el 2010 y correspondientes a diferentes
denominaciones geograacuteficas del noroeste de Espantildea En la Tabla I5 se muestran los datos que han obtenido
Tabla I5 Determinacioacuten de fitosanitarios en vinos comerciales mediante Microextraccioacuten en fase soacutelida-LC-TOF-MS
Valores de concentracioacuten en ngmL [44]
Pesticidas
W 1
Albarintildeo
W5
Ribeiro
W6
Valdeorras
R1
Ribeira Sacra
R3
Ribeiro
R4
Valdeorras
MET 404plusmn06 223plusmn05 311plusmn007 25plusmn03 31plusmn03 74plusmn10
TRI nd nd 36plusmn06 nd nd ltLOQ
IPR 394plusmn03 324plusmn02 324plusmn02 071plusmn007 31plusmn02 28plusmn05
MYC nd nd nd ltLOQ 39plusmn02 nd
TEC 25plusmn01 nd nd nd nd nd
CYP 179plusmn08 ltLOQ ltLOQ 562plusmn002 083plusmn001 nd
BEN 042plusmn001 nd ltLOQ nd 032plusmn001 ltLOQ
ndNo detectados ltLOQ por debajo del liacutemite de cuantificacioacuten del meacutetodo los coacutedigos W y R corresponden respecti-vamente a los vinos blanco y tinto
20
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Por uacuteltimo PELAJIĆ et al [45] aplicaron su meacutetodo SPE dispersiva-GC-MS mediante el cual determinaron 25
residuos de plaguicidas en vino tinto a un total de 32 muestras de vino adquiridos en supermercados locales de
Croacia pero de diversos oriacutegenes de procedencia Los resultados que han obtenido se muestran en la Tabla I6
en doacutende un total de 15 plaguicidas han sido detectados y 7 de los cuales se encontraban en una alta
concentracioacuten
Tabla I6 Resultados de los vinos con positivos en pesticidas y sus concentraciones [45]
Vino Paiacutes Residuos de pesticidas (mgKg)
Tinto Francia DIM (0013) MET (0009) IPR (001)
Tinto Alemania BOS (0011)
Tinto Alemania IPR (0009)
Tinto Macedonia MET (0015)
Tinto Moldavia IPR (0008)
Tinto Polonia MET (004)
Tinto Rumania PYM (0058)
Tinto Espantildea TRI (0005) MET (0011)
Tinto Estados Unidos BOS (001)
Rosado Francia BOS (0005)
Blanco Chile TEC (0008)
Blanco Georgia MET (0057)
Blanco Alemania DIM (001) IPR (0054) PYM (0056)
Blanco Sudaacutefrica DIM (0011) IPR (0011)
21
Capiacutetulo II Objetivos y discusioacuten
CAPIacuteTULO II OBJETIVOS Y DISCUSIOacuteN
El objetivo principal que se persigue en este trabajo es el desarrollo de un meacutetodo analiacutetico raacutepido basado en la
extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) y deteccioacuten mediante cromatografiacutea de liacutequidos en la modalidad de UPLC
acoplada a la espectrometriacutea de masas en taacutendem (UPLC-MSMS) para la determinacioacuten multianalito de residuos
de fitosanitarios principalmente fungicidas aunque tambieacuten alguacuten insecticida en muestras de vino blanco y tinto
Para llevar a cabo la finalidad de lo dicho se consideran unos objetivos maacutes especiacuteficos
Minimizar la manipulacioacuten de la muestra para asiacute reducir la cantidad de disolventes y tiempo empleado
Optimizacioacuten de los factores que afectan en la extraccioacuten en la SPE tales como tipo y cantidad de
adsorbente volumen de eluyente etc
Estudio de las condiciones en UPLC-MSMS para una separacioacuten y cuantificacioacuten oacuteptimas
Caracterizacioacuten y validacioacuten del meacutetodo propuesto
Por uacuteltimo una vez cumplidos todos los objetivos anteriores y fijadas las condiciones oacuteptimas el meacutetodo
estudiado se aplica en el anaacutelisis de muestras de vino comercial (blanco y tinto) para determinar si se encuentran
residuos presentes asiacute como conocer en queacute concentracioacuten se encuentran los pesticidas objeto de este estudio
22
Capiacutetulo III Parte experimental
CAPIacuteTULO III PARTE EXPERIMENTAL
1 MATERIAL Y REACTIVOS
11 Material
Material de vidrio de uso comuacuten en el laboratorio vasos de precipitados matraces aforados etc
Micropipetas automaacuteticas de 20-200 microL 20-200 microL 100-1000 microL 1000-5000 microL Eppendorf
Puntas de plaacutestico para micropipetas
Encapsulador y desencapsulador
Soportes y pinzas
Viales de 15 mL transparentes para muestreador automaacutetico de cromatografiacutea (Sugelabor)
Caacutepsulas de aluminio con seacuteptum de Tefloacuten (Sugelabor) y tapones pre-slit para viales
Tubos y conectores de tefloacuten
Cartuchos de divinilbenceno-N-vinilpirrolidona 200 mg Oasis HLB Waters
Cartuchos de divinilbenceno-N-vinilpirrolidona funcionalizados con grupos amina cuaternaria 150 mg
Oasis MAX Waters
Cartuchos de divinilbenceno-N-vinilpirrolidona 60 mg Oasis HLB Waters
12 Reactivos y disolventes
Agua ultrapura Milli-Q
Aacutecido foacutermico (Sigma Aldrich) 95
Acetonitrilo (LichrosolvregMerck) Gradient grade for liquid chromatography
Metanol (LichrosolvregMerck) Gradient grade for liquid chromatography
Etanol (LichrosolvregMerck) Gradient grade for liquid chromatography
13 Patrones
Ametoctradin (AME) Dr Ehrenstrorfer 990
Benalaxyl (BEN) Pestanal Sigma- Aldrich 999
23
Capiacutetulo III Parte experimental
Boscalid (BOS) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Carbendazim (CAR) Pestanal Sigma- Aldrich 992
Cyprodinil (CYP) Pestanal Sigma- Aldrich 998
Dimethomorph (DIM) mezcla de isoacutemeros E + Z Pestanal Sigma- Aldrich 989
Fenhexamid (FEH) Pestanal Sigma- Aldrich 997
Fenpropidin (FEP) Dr Ehrenstrorfer 980
Fluopicolide (FLU) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Imidacloprid (IMI) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Iprovalicarb (IPR) mezcla de isoacutemeros Pestanal Sigma- Aldrich 985
Mandipropamid (MAN) Pestanal Sigma- Aldrich 991
Metalaxyl (MET) Pestanal Sigma- Aldrich 990
Myclobutanil (MYC) Pestanal Sigma- Aldrich 994
Penconazole (PEN) Pestanal Sigma- Aldrich 991
Pyraclostrobin (PYC) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Pyrimethanil (PYM) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Tebuconazol (TEC) Pestanal Sigma- Aldrich 996
Tebufenozide (TEF) Dr Ehrenstrorfer 988
Thiabendazole (TBZ) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Thiamethoxam (TME) Pestanal Sigma- Aldrich 996
Thiophanate-methyl (THI-M) Dr Ehrenstrofer 990
Triadimenol (TRI) Mezcla de diastereoisoacutemeros Pestanal Sigma- Aldrich 994
14 Patrones internos
Carbendazim-d3 (CAR-d3) Pestanal Sigma- Aldrich 998
Cyprodinil-d5 (CYP-d5) Pestanal Sigma- Aldrich
Imidacloprid-d4 (IMID-d4) Pestanal Sigma- Aldrich
Metalaxyl 13C6 (MET13C6) Pestanal Sigma-Aldrich 99
24
Capiacutetulo III Parte experimental
15 Gases
Nitroacutegeno 99999 como gas de colisioacuten en el espectroacutemetro de masas
Nitroacutegeno en los sistemas de concentracioacuten y secado por corriente de nitroacutegeno de los cartuchos SPE
2 INSTRUMENTACIOacuteN
Balanza analiacutetica de precisioacuten Sartorius
Granatario Sartorius
Bantildeo de ultrasonidos P-Selecta
Equipo de purificacioacuten de agua Millipore modelo Milli-Q gradient A-10ZMQSSVOT4
Estacioacuten de concentracioacuten por corriente de nitroacutegeno Mini-Vap Supelco
Sistema de secado de cartuchos de SPE por corriente de nitroacutegeno VisiDry Supelco
Sistema distribuidor de vaciacuteo Visiprep reg Supelco
Cromatoacutegrafo de liacutequidos de ultra-alta resolucioacuten Waters AcquityUPLC reg y espectroacutemetro de masas
Acquity TQD con analizador de triple quadrupolo (QqQ) equipado con una fuente de ionizacioacuten a
presioacuten atmosfeacuterica del tipo Z-spray (ESI)
3 PREPARACIOacuteN DE LAS DISOLUCIONES
Los patrones de pesticidas se prepararon individualmente a partir de los compuestos soacutelidos comerciales por
pesada excepto en el caso del fenpropidin (FEP) que se preparoacute a partir del compuesto liacutequido comercial Estos
compuestos soacutelidos se disolvieron en metanol y se obtuvieron unas disoluciones iniciales con concentraciones
recogidas en la Tabla III1
25
Capiacutetulo III Parte experimental
Tabla III1 Concentracioacuten de las disoluciones patroacuten stock
Compuesto Concentracioacuten (microgmL) Compuesto Concentracioacuten (microgmL)
AME 102201 MET 118912
BEN 138330 MYC 102017
BOS 99474 PEN 129791
CAR 17105 PYC 104581
CYP 131075 PYM 141386
DIM 103009 TEC 134729
FEH 99584 TEF 137769
FEP 100000 TBZ 105928
FLU 126859 TME 112283
IMI 101123 THI-M 124202
IPR 106739 TRI 118933
MAN 101021
4 LAVADO DEL MATERIAL
La limpieza del material de vidrio utilizado en el laboratorio se realizoacute utilizando jaboacuten y aclarando con agua de
grifo Luego en primer lugar se realiza un enjuague con agua Milli-Q finalmente un segundo enjuague con
acetona para eliminar posibles restos de compuestos orgaacutenicos y se deja secar sobre papel
Para la limpieza de los conectores de tefloacuten empleados en el proceso de SPE se introducen en un vaso de
precipitados con metanol y este en un bantildeo de ultrasonidos durante 10 minutos Al finalizar con el bantildeo de
ultrasonidos se realiza un enjuague con acetona y se pone a secar
5 EXTRACCIOacuteN DE MUESTRAS MEDIANTE SPE
El meacutetodo de extraccioacuten utilizado para la determinacioacuten de pesticidas fue la extraccioacuten en fase soacutelida (SPE)
mediante cartuchos Oasis HLB de 200 mg A continuacioacuten se describe el protocolo de extraccioacuten en las
condiciones oacuteptimas
26
Capiacutetulo III Parte experimental
1 Acondicionamiento del cartucho Oasis HLB de 200 mg con 2 mL de acetonitrilo seguidos de otros 2 mL de
vino sinteacutetico formado por la mezcla etanolagua MilliQ (1288)
2 Paso de la muestra 2 mL de vino diluiacutedos con 2 mL de agua MilliQ a traveacutes del cartucho por gravedad
3 Lavado del cartucho con 2 mL de agua MilliQ
4 Secado del cartucho durante 45 minutos en el VisiDry mediante el paso de una corriente de nitroacutegeno
5 Elucioacuten del cartucho con la mezcla metanolacetonitrilo en proporcioacuten 2080 hasta un volumen final de 2
mL
6 Anaacutelisis mediante cromatografiacutea liacutequida acoplada a espectrometriacutea de masas en taacutendem UPLC-MSMS
(volumen de inyeccioacuten 15 microL)
Representacioacuten esquematizada en la Figura III1
Figura III1 Extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) de las muestras de vino
27
Capiacutetulo III Parte experimental
6 CONDICIONES DE DETERMINACIOacuteN MEDIANTE UPLC-MSMS
En la Tabla III2 se indican las condiciones utlizadas en la determinacioacuten de los pesticidas de intereacutes mediante
LC-MSMS y en la Tabla III3 se muestra el gradiente de la fase moacutevil utilizado para la separacioacuten
cromatograacutefica
Tabla III2 Condiciones experimentales de determinacioacuten en LC-MSMS
UPLC Acquity UPLC-I-Class IVD System
bull Columna cromatograacutefica Zorbax Eclipse Plus C18 Rapid Resolution HD
Fase estacionaria C18
Dimensiones 21 x 50 mm
Tamantildeo de partiacutecula 18 microm
Temperatura del horno 40ordmC
bull Inyector
Volumen de inyeccioacuten 15 microL
bull Fase moacutevil
Flujo 04 mLmin
Fase acuosa (A) Agua MilliQ con 01 aacutecido foacutermico
Fase orgaacutenica (B) Acetonitrilo con 01 aacutecido foacutermico
MSMS WatersXevo TQD
Modo de ionizacioacuten ESI positivo
Voltaje del capilar 15 kV
Voltaje de cono 50 V
Temperatura de gas de secado (N2) 450ordmC
Flujo de gas de secado (N2) 1000 Lh
Modo de adquisicioacuten Centroide
Tabla III3 Gradiente de fase moacutevil utilizado en la separacioacuten cromatograacutefica (LC)
Tiempo min 0 13 28 64 75 76 10
A 98 50 50 0 0 98 98
B 2 50 50 100 100 2 2
28
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
CAPIacuteTULO IV RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
1 IDENTIFICACIOacuteN DE LOS COMPUESTOS
Para empezar el estudio en primer lugar se realizoacute la caracterizacioacuten de las condiciones de determinacioacuten de los
analitos en el modo Multiple Reaction Monitoring (MRM) mediante UPLC-ESI-MSMS Para llevarla a cabo se
tomaron patrones individuales de cada fitosanitario y mediante infusioacuten se estudiaron las posibles transiciones y
voltajes oacuteptimos para su determinacioacuten (Tabla IV1)
La ionizacioacuten por electrospray (ESI) se estudioacute tanto en modo positivo como en modo negativo encontraacutendose
que para todos los pesticidas de nuestro intereacutes se obteniacutea sentildeal en el modo positivo mientras el modo negativo
no presentaba respuesta significativa
A continuacioacuten se estudia el efecto del voltaje de cono en la respuesta del ioacuten molecular [M+H]+ aumentaacutendolo
hasta alcanzar el valor maacuteximo de la sentildeal correspondiente a dicho ioacuten y luego se optimiza la energiacutea de colisioacuten
variaacutendola para cada analito hasta obtener la sentildeal de mayor intensidad para cada uno de los iones producto Por
uacuteltimo una vez optimizado el voltaje de cono y la energiacutea de colisioacuten se seleccionan las dos transiciones maacutes
intensas para llevar a cabo la cuantificacioacuten y cualificacioacuten de cada analito en modo MRM Este procedimiento se
realizoacute para la totalidad de los compuestos confirmando los datos obtenidos con los facilitados por la base de
datos Quanpedia que estaacute disponible en el software del equipo utilizado para algunos de los compuestos
considerados
Compuesto Tr (min) Ion precursor (mz Da)
Voltaje de cono (V)
Ion producto 1 (CEv)
cuantificacioacuten
Ion producto 2 (CEv)
cualificacioacuten
Relacioacuten IP2IP1
AME 325 2760 60 176 (35) 70 (50) 016
BEN 485 3261 26 148 (20) 91 (34) 067
BOS 387 3429 41 140 (20) 307 (20) 011
CAR 167 1921 33 160 (18) 132 (28) 014
CYP 311 2260 56 93 (33) 108 (25) 061
DIM 322 3881 40 301 (20) 165 (30) 057
FEH 386 3021 41 97 (22) 55 (38) 044
FEP 257 2742 55 147 (28) 86 (28) 093
FLU 401 3830 40 173 (20) 365 (15) 010
IMI 218 2561 34 209 (15) 175 (20) 091
IPR 358 3211 28 119 (16) 203 (10) 042
Tabla IV1 Tiempos de retencioacuten (Tr) relacioacuten de iones precursores (mz) voltaje de cono (V) energiacuteas de colisioacuten (CE) y relacioacuten de intensidades entre transiciones (IP2IP1)
29
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Compuesto Tr (min) Ion precursor (mz Da)
Voltaje de cono (V)
Ion producto 1 (CEv)
cuantificacioacuten
Ion producto 2 (CEv)
cualificacioacuten
Relacioacuten IP2IP1
MAN 392 4120 25 328 (16) 125 (35) 063
MET 283 2801 26 220 (13) 192 (17) 057
MYC 365 2891 34 70 (18) 125 (32) 029
PEN 417 2840 34 70 (16) 159 (34) 031
PYC 523 3881 31 194 (12) 163 (25) 066
PYM 266 2000 51 107 (24) 82 (24) 071
TEC 397 3080 40 70 (22) 125 (40) 007
TEF 473 3531 19 133 (20) 297 (8) 072
TBZ 182 2020 51 175 (25) 131 (30) 062
TME 203 2920 28 211 (12) 132 (22) 047
THI-M 257 3430 28 151 (46) 93 (19) 0001
TRI 319 2961 21 70 (10) 99 (15) 013
El dwell time para cada una de las transiciones se ajustoacute de manera automaacutetica por el software (MassLinx) con
objeto de obtener doce puntos espectrales por compuesto tomando un valor promedio de cuatro segundos como
ancho de pico a liacutenea de base
2 CARACTERIZACIOacuteN DEL PROCEDIMIENTO DE DETERMINACIOacuteN (UPLC-ESI-
MSMS)
Una vez optimizados los paraacutemetros que afectan a la separacioacuten cromatograacutefica (UPLC) y a la determinacioacuten por
espectrometriacutea de masas en taacutendem (MSMS) se lleva a cabo la evaluacioacuten de la repetibilidad de inyeccioacuten y
determinacioacuten en esas condiciones Se expresa por medio de la desviacioacuten estaacutendar relativa (RSD) paraacutemetro que
nos indica el grado de correlacioacuten que existe entre varias medidas del mismo patroacuten realizadas por el mismo
operador en el laboratorio y en el mismo equipo de medida a lo largo de un diacutea Para el estudio se realizan diez
inyecciones con volumen de 15 microL de dos patrones con distintos niveles de concentracioacuten 5 y 20 ngmL Los
datos de RSD (Tabla IV2) para las aacutereas de pico de los analitos se situacutean para el nivel de concentracioacuten 5 ngmL
en el rango 2-13 y en el nivel de concentracioacuten 20 ngmL en el rango 1-7
30
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten Tabla IV2 Desviacioacuten estaacutendar relativa (RSD) del aacuterea de pico (transicioacuten de cuantificacioacuten) para evaluar la repetivilidad del proceso de LC-MSMS
Compuesto RSD
5 ngmL
RSD
20 ngmL Compuesto
RSD
5 ngmL
RSD
20 ngmL
AME 5 2 MET 3 2
BEN 2 2 MYC 9 2
BOS 4 5 PEN 4 4
CAR 4 2 PYC 3 1
CYP 5 7 PYM 7 3
DIM 6 5 TEC 3 2
FEH 7 4 TEF 4 2
FEP 4 2 TBZ 2 1
FLU 5 3 TME 6 6
IMI 13 7 THI-M a 6
IPR 8 2 TRI 8 6
MAN 3 2
A continuacioacuten tambieacuten se evaluoacute la repetibilidad de los tiempos de retencioacuten (Tr) para diez inyecciones de
patrones a los dos niveles de concentracioacuten 5 y 20 ngmL situaacutendose las RSD para todos los compuestos en el
rango 01-03 En base a este dato la ventana de tiempo en la que se registran las transiciones de MRM de cada
compuesto se fijoacute en 05 min lo que es lo mismo 025 min alrededor del valor medio de su tiempo de retencioacuten
Por otro lado la linealidad del meacutetodo se estudioacute a nueve niveles de concentracioacuten diferentes comprendidos ente
los niveles 05 ngmL y 200 ngmL mediante la inyeccioacuten de disoluciones patroacuten de los distintos compuestos de
estudio Se realizoacute una evaluacioacuten sin y otra con patroacuten interno (IS) antildeadiendo una concentracioacuten fija de patrones
internos a nivel de 25 ngmL y pudimos observar que los resultados mejoran notablemente al realizar una
correccioacuten con el IS En la Tabla IV3 se muestran los coeficientes de determinacioacuten (R2) obtenidos al realizar la
correccioacuten mediante IS observando que para todos los compuestos excepto para THI-M y para TRI los
coeficientes de correlacioacuten son superiores a 0990 por lo que existe una respuesta lineal en el rango de
concentraciones que hemos estudiado
Aparte del estudio de la linealidad tambieacuten se han estudiado los liacutemites de cuantificacioacuten instrumentales del
meacutetodo (LOQs) Para ello los LOQs se evaluacutean como la miacutenima cantidad de analito que origina una sentildeal 10
veces superior a la desviacioacuten estaacutendar del ruido Los valores anteriores se estimaron a partir del patroacuten de
a no evaluado ya que se encuentra por debajo del liacutemite de cuantificacioacuten del meacutetodo
31
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
concentracioacuten maacutes baja que presenta un pico con una relacioacuten SN superior a 10 En la Tabla IV3 tambieacuten se
recogen estos LOQs en doacutende podemos ver que variacutean en el rango 01-1 ngmL excepto para THI-M que se
desviacutea a valores de 10 ngmL
Tabla IV3 Coeficientes de determinacioacuten (R2) y liacutemites de cuantificacioacuten instrumentales (LOQs) de los analitos para nueve
niveles de concentracioacuten de 05 a 200 ngmL
Compuesto Coeficiente de
correlacioacuten (R2)
LOQs (ngmL) Compuesto
Coeficiente de correlacioacuten
(R2)
LOQs (ngmL)
AME 09951 04 MET 09933 01
BEN 09949 01 MYC 09950 04
BOS 09979 02 PEN 09945 02
CAR 09923 02 PYC 09955 02
CYP 09878 02 PYM 09931 01
DIM 09938 07 TEC 09958 05
FEH 09959 05 TEF 09957 01
FEP 09931 01 TBZ 09942 02
FLU 09965 02 TME 09903 01
IMI 09979 05 THI-M 09580 100
IPR 09938 01 TRI 09867 07
MAN 09979 01
En la Figura IV1 y Figura IV2 se muestran dos ejemplo de curvas de calibrado para dos compuestos IMI y
MAN respectivamente
Figura IV1 Curva de calibrado y coeficiente de determinacioacuten de IMI para UPLC-ESI-MSMS
32
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Figura IV2 Curva de calibrado y coeficiente de determinacioacuten de MAN para UPLC-ESI-MSMS
3 ESTUDIO DEL MEacuteTODO SPE
La extraccioacuten de pesticidas se llevoacute a cabo mediante extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) en doacutende se realizaron
diversos estudios con diferentes condiciones para dar con las oacuteptimas En primer lugar se llevaron a cabo los
experimentos de retencioacuten y elucioacuten sobre dos tipos distintos de adsorbentes cartuchos OASIS HLB (200mg) y
cartuchos OASIS MAX (150 mg) como fases potenciales en las que llevar a cabo la extraccioacuten de manera
selectiva Los dos tipos de cartuchos son de fase reversa pero difieren entre siacute en el fundamento de retencioacuten de
los analitos En los cartuchos OASIS HLB (200 mg) formados por divinilbenceno-N-vinilpirrolidona (DVB-VP)
la retencioacuten de los diferentes analitos tiene lugar por interacciones π-π o de Van der Waals mientras que los
cartuchos OASIS MAX (150 mg) que se probaron como alternativa para mejorar la selectividad en la extraccioacuten
cuentan con un adsorbente polimeacuterico de modo mixto formado por divinilbenceno-N-vinilpirrolidona (DVB-VP)
funcionalizado con grupos amina cuaternaria siendo el fundamento de la extraccioacuten la combinacioacuten de las
propiedades adsorbentes del cartucho HLB con un mecanismo adicional de intercambio ioacutenico (anioacutenico) [27]
Algunos autores han empleado este mecanismo para mejorar la selectividad de la extraccioacuten de forma que en la
etapa de elucioacuten ciertos pigmentos del vino quedan fuertemente retenidos en el adsorbente a diferencia de lo que
ocurre con los adsorbentes de fase reversa [51]
Para llevar a cabo la eleccioacuten del tipo de adsorbente se realizaron pruebas con 10 mL de vino blanco y tinto
conectando en serie los dos tipos de cartuchos HLB (200 mg) y MAX (150 mg) a un segundo cartucho OASIS
HLB (60 mg) La elucioacuten de los analitos se hace de forma independiente para cada cartucho y se evaluacutea si los
analitos pasan del primer cartucho hacia el segundo cartucho es decir si se supera el volumen de corte o si por
33
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
otro lado se quedan retenidos en el primero y no eluyen hacia el segundo En estas pruebas de estudio
preliminares de preparacioacuten de la muestra no se ha incluido el CYP
En la Figura IV3 podemos ver la eficacia de la extraccioacuten para vino blanco y tinto que obtenemos empleando
cartuchos OASIS MAX (150 mg) conectados en serie con cartuchos OASIS HLB (60 mg) realizando la
extraccioacuten de tres fracciones de 2 mL cada una del cartucho OASIS MAX (150 mg) y una cuarta fraccioacuten de 2
mL del cartucho OASIS HLB (60 mg)
Por otro lado en la Figura IV4 podemos ver un graacutefico de columnas en el cual comparamos la eficacia de
extraccioacuten de los cartuchos OASIS HLB (200 mg) con dos disolventes de elucioacuten distintos En dicho graacutefica el
acroacutenimo de cada compuesto consta de dos barras cuyo significado es el siguiente la barra de la izquierda indica
la eficacia de la extraccioacuten empleando acetonitrilo (ACN) como disolvente de elucioacuten y la barra de la derecha
indica la eficacia de la extraccioacuten empleando la combinacioacuten MetanolAcetonitrilo (2080) (MeOHACN) como
disolvente de elucioacuten Para este adsorbente no se detectoacute ninguacuten compuesto en la extraccioacuten del segundo
cartuchos OASIS HLB (60 mg) empleando 2 mL de metanol
Figura IV3 Distribucioacuten de los compuestos en cada fraccioacuten obtenidas con cartuchos OASIS MAX (150 mg)
utilizando 10 mL de vino tinto y blanco sacando cuatro fracciones de 2 mL cada una con metanol como
disolvente de elucioacuten
34
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Figura IV4 Distribucioacuten de los compuestos en cada fraccioacuten obtenidas con cartuchos OASIS HLB (200 mg) utilizando 10
mL de vino tinto y blanco sacando 3 fracciones de 2 mL cada una con acetonitrilo (ACN) (columna de la izquierda) y una
combinacioacuten MetanolAcetonitrilo (2080) (MeOHACN) (columna de la derecha) como disolventes de elucioacuten
A la vista de los resultados reflejados en las graacuteficas podemos afirmar que cuando se utiliza el cartucho OASIS
HLB (200 mg) eluyendo con acetonitrilo o la combinacioacuten metanolacetonitrilo (2080) los extractos son limpios
y se eluyen la mayoriacutea de los compuestos en la primera fraccioacuten Pero utilizando acetonitrilo como disolvente de
elucioacuten se encuentran problemas en la extraccioacuten de CAR FEH y TBZ para los que es necesario emplear un
volumen mayor de elucioacuten o bien seleccionar otro disolvente de elucioacuten como es la combinacioacuten
metanolacetonitrilo
35
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Por otro lado los extractos en los cartuchos OASIS MAX (150 mg) son maacutes limpios incluso utilizando metanol en
la elucioacuten pero se detecta la presencia de CAR FEP TBZ y TME en el segundo cartucho OASIS HLB (60 mg)
significando la rotura del primer cartucho para dichos analitos considerando un volumen de 10 mL de vino Los
demaacutes compuestos se podriacutean recuperar cuantitativamente en la primera fraccioacuten sacada pero la peacuterdida de estos
compuestos inclina la eleccioacuten hacia los cartuchos OASIS HLB (200 mg) con metanolacetonitrilo (2080) como
disolvente de elucioacuten para continuar con el estudio
Una vez fijado el adsorbente y el volumen de elucioacuten se prueba la eficacia de la SPE independiente de los efectos
de matriz En la Tabla IV4 se muestran las recuperaciones de la SPE tomando 10 mL de vino blanco y tinto
con un nivel de adicioacuten de 15 ngmL sacando una sola fraccioacuten de 2 mL con la combinacioacuten
metanolacetonitrilo (2080) y n=3 reacuteplicas
Tabla IV4 Recuperaciones (R plusmn SD) de SPE para 10 mL de vino (blanco y tinto) con un nivel de adicioacuten de 15 ngmL y
n=3 reacuteplicas
Compuesto Vino Tinto
R plusmn SD
Vino Blanco
R plusmnSD Compuesto
Vino Tinto
R plusmn SD
Vino Blanco
R plusmn SD
AME 82 plusmn 7 100 plusmn 1 MET 92 plusmn 6 94 plusmn 3
BEN 89 plusmn 6 97 plusmn 3 MYC 90 plusmn 9 86 plusmn 4
BOS 95 plusmn 1 100 plusmn 2 PEN 84 plusmn 10 103 plusmn 3
CAR 91 plusmn 6 104 plusmn 6 PYC 86 plusmn 5 106 plusmn 1
CYP 81 plusmn 7 102 plusmn 3 PYM 87 plusmn 12 94 plusmn 3
DIM 97 plusmn 3 86 plusmn 4 TEC 83 plusmn 10 103 plusmn 1
FEH 89 plusmn 3 88 plusmn 3 TEF 84 plusmn 5 108 plusmn 4
FEP 91 plusmn 7 104 plusmn 3 TBZ 88 plusmn 7 92 plusmn 5
FLU 91 plusmn 2 97 plusmn 4 TME 101 plusmn 1 110 plusmn 13
IMI 117 plusmn 8 101 plusmn 11 THI-M 85 plusmn 9 110 plusmn 4
IPR 89 plusmn 7 112 plusmn 4 TRI 85 plusmn 10 110 plusmn 4
MAN 88 plusmn 2 87 plusmn 2
Algunos compuestos de la matriz en el vino pueden competir con los analitos durante el proceso de ionizacioacuten
que tiene lugar en la interfase entre UPLC-MSMS por lo que para la cuantificacioacuten del rendimiento de la
ionizacioacuten por electrospray (ESI) se estudian los efectos de matriz (EM) para vino blanco y tinto considerando
dos voluacutemenes de muestra distintos 2 y 10 mL y un volumen final del extracto de 2 mL En la Tabla IV5 se
36
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
exponen los valores para cada compuesto notando que al aumentar el volumen de muestra tambieacuten se aumentan
los efectos de matriz y eacutestos siempre son mayores en vino tinto Para el caacutelculo de estos efectos de matriz (EM)
se emplea la siguiente ecuacioacuten
Donde Am Ab y Ap representan el aacuterea de pico en la sentildeal medida del analito en el extracto de la muestra con
adicioacuten en el extracto de la muestra sin adicioacuten (o blanco) y en el patroacuten antildeadido respectivamente El nivel de
adicioacuten en extracto fue de 50 ngmL por compuesto
Tabla IV5 Efectos de matriz para vino blanco y tinto con un volumen inicial de 2 y 10 mL evaluados para un nivel de adicioacuten de 50 ngmL en extracto
Compuesto
Vino blanco Vino tinto
2 mL 10 mL 2mL 10 mL
EM () CV () EM () CV () EM () CV () EM () CV()
AME 93 3 95 2 99 3 101 7
BEN 99 1 93 2 101 3 100 6
BOS 97 5 98 1 108 2 96 0
CAR 62 2 50 3 58 2 55 6
CYP 94 3 91 1 97 2 95 7
DIM 105 2 95 3 100 3 108 3
FEH 100 4 102 4 105 4 94 3
FEP 95 3 88 2 96 2 92 7
FLU 98 2 93 2 106 1 101 2
IMI 84 4 46 3 48 10 18 8
IPR 99 3 92 3 105 1 100 7
MAN 100 1 94 3 109 4 107 2
MET 98 1 89 1 99 2 99 6
MYC 105 1 100 1 103 2 96 9
PEN 98 3 97 1 101 3 99 10
PYC 98 2 92 3 102 2 98 5
PYM 95 2 87 1 94 3 85 12
TEC 95 3 99 1 101 1 102 10
TEF 99 1 92 3 101 2 104 5
TBZ 45 0 40 5 43 2 30 7
TME 60 6 19 16 36 4 16 1
THI-M 107 2 109 2 103 1 96 9
TRI 97 3 118 4 104 5 117 10
37
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Al observar los resultados podemos ver que la mayoriacutea de los compuestos dan resultados de EM en torno al
100 lo que significa que no sufren una modificacioacuten importante en la eficacia de ionizacioacuten para las muestras
con respecto a los patrones Pero tambieacuten por el contrario podemos observar que algunos compuestos como
por ejemplo en el caso de CAR TBZ IMI y TME experimentan una gran supresioacuten de sentildeal es decir EM bajos
que se acentuacutean al aumentar el volumen de muestra La atenuacioacuten en la eficacia de variacioacuten para estos cuatro
compuestos no solo se ve incrementada con el volumen de muestra si no que ademaacutes es maacutes significativa para
vino tinto que para vino blanco En base a estos resultados aunque la eficacia de la SPE fue cuantitativa para
muestras de 10 mL se limitoacute el volumen de muestra a extraer a 2 mL
Las condiciones oacuteptimas de extraccioacuten se esquematizan en un resumen en la Figura IV5
Figura IV5 Condiciones optimizadas para la extraccioacuten de pesticidas en vino
38
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
4 CARACTERIZACIOacuteN DEL MEacuteTODO DE DETERMINACIOacuteN
Con las condiciones de extraccioacuten y determinacioacuten citadas anteriormente se llevaron a cabo pruebas de
recuperaciones absolutas de los compuestos a nivel de adicioacuten de 5 y 20 ngmL sobre las muestras Para cada
muestra y nivel de adicioacuten se realizaron tres reacuteplicas de las muestras con adicioacuten y los blancos aliacutecuotas de las
mismas muestras sin adicioacuten se procesaron en duplicado Los IS se antildeadieron a nivel de 25 ngmL y cada uno se
utiliza para corregir unos determinados compuestos CAR-d3 se emplea para CAR y TBZ el CYP-d5 para CYP y
PYM el IMID-d4 para IMI y TME y el MET13C6 para el resto de compuestos Los resultados para vino blanco
comprenden en el nivel de concentracioacuten 5 ngmL el rango entre 79-122 y en el nivel de concentracioacuten 20
ngmL el rango entre 84-109 Por otro lado en el caso del vino tinto las recuperaciones se encuentran para el
nivel de concentracioacuten 5 ngmL en el rango 67-112 y para el nivel de concentracioacuten 20 ngmL entre el rango
73-132 Los resultados obtenidos en las pruebas con vino blanco y vino tinto se muestran en la Tabla IV6
Los resultados son satisfactorios ya que la mayoriacutea de los compuestos se ajustan en todos los casos al rango de
recuperacioacuten entre 70-120 Para la realizacioacuten de estas pruebas se ha eliminado de los resultados el compuesto
THI-M debido a que las concentraciones utilizadas se encuentran en el liacutemite o por debajo del LOQ en los
experimentos con muestras adicionadas a 5 ngmL
Para calcular las recuperaciones (R) se recurrioacute a la siguiente ecuacioacuten
Donde Cm Cb y Cp son la concentracioacuten medida de analito en el extracto de la muestra con adicioacuten en el extracto
de la muestra sin adicioacuten (o blanco) y en el patroacuten antildeadido respectivamente
Tabla IV6 Recuperaciones (R) para vino tinto y vino blanco evaluadas para dos niveles de concentracioacuten 5 y 20 ngmL
Compuesto
Vino tinto Vino Blanco
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
AME 97 3 105 6 104 9 96 5
BEN 88 11 105 3 101 1 98 4
BOS 91 13 110 2 88 13 97 3
39
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Compuesto
Vino tinto Vino blanco
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
CAR 99 6 99 3 122 3 109 1
CYP 91 2 111 1 101 4 100 6
DIM 112 3 110 9 102 24 99 11
FEH 91 4 108 0 102 20 95 2
FEP 89 8 102 7 94 5 84 1
FLU 95 10 104 4 109 5 100 8
IMI 73 11 115 9 80 13 100 2
IPR 84 13 99 3 111 3 99 4
MAN 88 22 112 8 112 3 99 4
MET 99 3 106 5 106 3 98 2
MYC 84 9 106 13 88 17 86 3
PEN 84 9 102 5 84 8 90 5
PYC 96 6 105 4 100 2 95 4
PYM 90 12 112 14 106 4 97 1
TEC 89 8 101 6 98 12 94 1
TEF 93 10 102 5 107 2 97 3
TBZ 94 17 115 8 79 5 106 2
TME 67 2 101 7 84 18 90 11
THI-M ne - 74 7 ne - 89 24
TRI 88 12 97 6 102 6 92 2
ne No evaluado El nivel de adicioacuten es inferior al LOQ del meacutetodo para este compuesto
Para estudiar la reproducibilidad del meacutetodo analiacutetico global (correspondientes a los datos de preparacioacuten de
muestra y determinacioacuten) es decir la concordancia de varias medidas realizadas en diacuteas diferentes se procedioacute a la
extraccioacuten en las condiciones oacuteptimas tanto de vino blanco como tinto Las extracciones y determinaciones se
realizaron durante tres diacuteas consecutivos realizando tres reacuteplicas por vino y por diacutea con un nivel de adicioacuten en
muestra de 10 ngmL un blanco de muestra cada diacutea En la Tabla IV7 se muestran los resultados como
recuperaciones (R) en condiciones de reproducibilidad obtenidos para ambos tipos de vino dando valores entre
64-116 para muestras de vino blanco y valores situados entre 68-108 para muestras de vino tinto con la
excepcioacuten del TME para el que se ha obtenido un valor no aceptable en cuanto a la exactitud medida en
condiciones de reproducibilidad A la vista de los resultados obtenidos con estas pruebas se considera necesario el
empleo de IS adicionales para la mejora en la exactitud del meacutetodo para algunos compuestos por ejemplo el
TME
40
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Tabla IV7 Recuperaciones en condiciones de reproducibilidad (R plusmn SD) para vino blanco y tinto
Compuesto
Vino tinto Vino blanco
R
10 ngmL CV ()
R
10 ngmL CV ()
AME 90 5 101 13
BEN 96 5 102 7
BOS 97 6 100 8
CAR 97 3 94 5
CYP 103 3 105 12
DIM 104 7 106 8
FEH 90 16 83 15
FEP 91 5 90 4
FLU 103 7 102 6
IMI 99 14 101 14
IPR 91 5 100 13
MAN 108 5 108 13
MET 101 5 101 5
MYC 105 16 102 14
PEN 96 11 92 10
PYC 99 12 97 12
PYM 102 4 116 8
TEC 99 9 97 16
TEF 99 8 105 11
TBZ 68 4 84 5
TME 47 13 64 10
THI-M 107 11 104 16
TRI 95 14 103 4
En la Tabla IV8 se muestran los liacutemites de cuantificacioacuten (LOQs) del meacutetodo del meacutetodo de SPE-UPLC-ESI-
MSMS obtenidos para los diferentes pesticidas Los valores obtenidos son ideacutenticos a los LOQs instrumentales
excepto en el caso de aquellos compuestos para los que se observaronfuertes efectos de matriz (Tabla IV5) En
estos casos (CAR TBZ IMI y TME) los LOQs del meacutetodo se incrementan seguacuten la atenuacioacuten de sentildeal
observada
41
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Tabla IV8 Liacutemites de cuantificacioacuten LOQs (ngmL) del meacutetodo obtendos para cada compuesto
Compuesto LOQ (ngmL) Compuesto LOQ (ngmL)
AME 04 MET 01
BEN 01 MYC 04
BOS 02 PEN 02
CAR 03 PYC 02
CYP 02 PYM 01
DIM 07 TEC 05
FEH 05 TEF 01
FEP 01 TBZ 04
FLU 02 TME 02
IMI 06 THI-M 10
IPR 01 TRI 07
MAN 01
5 APLICACIOacuteN A MUESTRAS DE VINO COMERCIALES
Una vez optimizadas las condiciones del meacutetodo y estudiadas las caracteriacutesticas del meacutetodo desarrollado se aplicoacute
a la determinacioacuten de los compuestos de intereacutes estudiados en muestras de vino blanco y vino tinto comerciales
producidos en diferentes paiacuteses En la Tabla IV9 se muestra el paiacutes de origen de cada muestra comercial
identificadas con un coacutedigo alfanumeacuterico y antildeo de produccioacuten
42
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Tabla IV9 Coacutedigo asignado para los diferentes vinos comerciales blancos y tintos analizados Indicando el paiacutes de origen y
antildeo de produccioacuten
Coacutedigo Denominacioacuten de origen Antildeo de produccioacuten
bull Vinos Blancos
W1 Alemania 2014
W2 Espantildea 2012
W3 Espantildea 2016
W4 Portugal Desconocido
W5 Francia 2015
W6 Francia 2015
W7 Espantildea 2016
bull Vinos Tintos
R1 Espantildea 2015
R2 Sudaacutefrica 2015
R3 Chile 2015
R4 Francia 2015
R5 China Desconocido
R6 Espantildea 2016
R7 Australia 2014
R8 Francia 2013
R9 Francia 2015
A continuacioacuten en la Tabla IV10 y la Tabla IV11 se recogen los resultados obtenidos en el anaacutelisis de las
muestras comerciales Los datos obtenidos corresponden en todos los casos al uso de patrones de calibracioacuten
como teacutecnica de cuantificacioacuten
Tabla IV10 Concentracioacuten (ngmL) encontradas en las diferentes muestras de vino blanco comercial analizadas mediante
SPE-UPLC-MSMS n=2 reacuteplicas y al final el sumatorio de las concentraciones encontradas
Compuesto W1 W2 W3 W4 W5 W6 W7
AME 04 nd nd nd 41 nd nd
BEN nd nd 14 nd nd nd nd
BOS 84 102 520 54 197 nd nd
CAR nd 115 56 nd nd nd nd
CYP 08 59 112 nd nd 26 nd
43
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Compuesto W1 W2 W3 W4 W5 W6 W7
DIM 14 84 400 09 32 50 nd
FEH 85 809 639 15 187 nd nd
FLU 11 05 92 nd 77 32 nd
IMI nd 136 88 29 nd nd 69
IPR 30 749 1144 14 nd nd nd
MAN nd nd nd nd nd 30 nd
MET 04 273 494 63 nd nd 172
MYC 09 nd 35 nd nd nd nd
PYM 15 469 584 08 24 35 nd
TEC 11 nd 58 nd nd nd nd
TRI nd 67 61 nd nd nd nd
sumconcentracioacuten
(ngmL) 274 2868 4358 192 558 173 862
nd no detectado
Tabla IV11 Concentracioacuten (ngmL) encontradas en las diferentes muestras de vino tinto comercial analizadas mediante
SPE-UPLC-MSMS n= 2 reacuteplicas y al final el sumatorio de las concentraciones encontradas
Compuesto R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9
AME nd nd nd 30 nd nd nd nd 16
BEN nd nd nd 07 nd nd nd nd nd
BOS nd 55 21 196 nd nd nd 73 21
CAR nd nd 04 17 249 20 nd nd nd
CYP 34 08 02 22 nd 136 nd 85 nd
DIM nd 33 nd 52 233 46 nd 61 23
FEH nd nd nd 1070 nd 10 nd 1307 14
FLU nd nd nd 20 nd nd nd nd nd
IPR 16 nd nd 17 nd 22 nd nd nd
MAN nd nd nd 17 nd nd nd 20 nd
MET 126 nd nd 14 55 313 30 44 39
MYC nd nd nd 05 nd 32 nd nd nd
PYM 19 nd 03 185 49 281 nd 24 nd
TEC 25 06 39 29 nd nd nd 21 20
TEF nd 01 12 nd nd nd nd nd nd
sumconcentracioacuten
(ngmL) 220 48 81 1681 586 860 30 1635 133
nd no detectado 44
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
En los resultados de los anaacutelisis podemos observar que en ninguna de las muestras comerciales de vino blanco
aparecieron los siguientes compuestos FEP PEN PYC TEF TBZ THI-M y TME y en los vinos tintos
comerciales no aparece a ninguna concentracioacuten FEP IMI PEN PYC TBZ TME THI-M y TRI No se
detectaron para dichas muestras de vino a niveles superiores a los LOQs del meacutetodo propuesto
Cuando se detecta un compuesto positivo se compara el pico cromatograacutefico del compuesto con el de un patroacuten
verificando la coincidencia del tiempo de retencioacuten (maacutexima diferencia 01 min) y la relacioacuten entre transiciones
(maacutexima diferencia 30 ) En la Figura IV6 y la Figura IV7 se muestran los cromatogramas para el compuesto
CYP obtenido en condiciones oacuteptimas para la muestra de vino blanco W6 y en un patroacuten de 5 ngmL
respectivamente En este caso el intervalo de tolerancia para la relacioacuten de intensidad entre transiciones es
IP2IP1=061plusmn018
Figura IV6 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el CYP en la muestra W6 (26 ngmL) Transicioacuten
superior 226gt93 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 226gt108 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades IP2IP1= 066
Figura IV7 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el CYP en un patroacuten de 5 ngmL Transicioacuten
superior 226gt93 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 226gt108 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades IP2IP1=061plusmn018
45
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Otro ejemplo de compuesto positivo en abundantes muestras comerciales de estudio es el Metalaxyl positivo con
una concentracioacuten de 04 ngmL en el vino con referencia W1 (Figura IV8) y positivo con una concentracioacuten de
313 ngmL en el vino con referencia R6 (Figura IV9) Ambas se comparan con el cromatograma de un patroacuten
de Metalaxyl de 1 ngmL (Figura IV10) El grado de concordancia en los tiempos de retencioacuten y la relacioacuten de
intensidades entre transiciones es satisfactorio
Figura IV8 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el MET en la muestra W1 (04 ngmL) Transicioacuten
superior 2801gt2201 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 2801gt1921 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades
IP2IP1=056
Figura IV9 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el MET en la muestra R6 (313 ngmL) Transicioacuten
superior 2801gt2201 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 2801gt1921 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades IP2IP1=
056
46
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Figura IV10 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el MET en un patroacuten de 1 ngmL Transicioacuten
superior 2801gt2201 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 2801gt1921 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades
IP2IP1=057plusmn017
Es de destacar que aunque se detectaron bastantes pesticidas en las diferentes muestras de vino comerciales pero
en ninguacuten caso superaron el 10 de los LMRs permitidos en uvas tal y como se recomienda ya que todaviacutea no
existen LMRs para vino en la legislacioacuten vigente No obstante el nivel total de concentracioacuten (sumatorio de
concentraciones Tabla IV10 y Tabla VI11) es significativo para varias muestras tanto de vinos blancos (W2 y
W3) como tintos (R4 y R8)
47
Capiacutetulo V Conclusiones
CAPIacuteTULO V CONCLUSIONES
En este trabajo se ha estudiado un meacutetodo para la cuantificacioacuten de pesticidas concretamente veinte fungicidas y
tres insecticidas en vino blanco y tinto En la etapa de preparacioacuten de muestra se optimizoacute la extraccioacuten en fase
soacutelida (SPE) utilizando cartuchos OASIS HLB (200 mg) compuestos por divinilbenceno-N-vinilpirrolidona
(DVB-VP) como adsorbente Como teacutecnica de determinacioacuten se utilizoacute cromatografiacutea de liacutequidos con una
interfase de electroespray acoplada a espectrometriacutea de masas (UPLC-ESI-MSMS)
Las conclusiones generales obtenidas a partir de los resultados de este proyecto relativo a la determinacioacuten de
fitosanitarios en vino son
Ante los problemas de retencioacuten que presentan los cartuchos OASIS MAX (150 mg) para algunos
compuestos los cartuchos OASIS HLB (200 mg) junto con la combinacioacuten metanolacetonitrilo (2080)
como disolvente de elucioacuten son elegidos como mejor opcioacuten en la extraccioacuten en fase soacutelida de pesticidas
en muestras con matrices complejas como es el caso del vino Asiacute se consigue la retencioacuten selectiva de
componentes de la matriz y proporciona extractos con menor porcentaje de interferencias
El meacutetodo estudiado y optimizado se puede aplicar tanto a vinos blancos como a vinos tintos procesados
a partir de distintas variedades de uvas
Los liacutemites de cuantificacioacuten (LOQs) del estudio se situacutean la mayoriacutea por debajo de 10 ngmL excepto
en el caso de THI-M que asciende al valor de 20 ngmL El rango de respuesta lineal abarca hasta 200
ngmL y el tiempo de anaacutelisis ha sido de solo 10 minutos por muestra
En todas las muestras de vino (blancos y tintos) comerciales analizadas se han detectado la presencia de
varios pesticidas sin embargo todas las concentraciones encontradas se encuentran por debajo del 10
de los LMRs fijados en uvas tal y como recomienda la legislacioacuten por lo que no se considera
preocupante
48
Capiacutetulo V Conclusioacutens
CAPIacuteTULO V CONCLUSIOacuteNS
Neste traballo estudouse un meacutetodo para a cuantificacioacuten de pesticidas en particular vinte funxicidas e tres
insecticidas en vintildeo branco e maacuteis tinto No paso da preparacioacuten da mostra optimizouse a extraccioacuten en fase
soacutelida (SPE) empregando cartuchos OASIS HLB (200 mg) compostos por divinilbenceno-N-pirrolidona (DVB-
VP) como adsorbente Para a teacutecnica de determinacioacuten utilizouse cromatografiacutea de liacutequidos con unha interfase de
electroespray acoplada a espectrometriacutea de masas (UPLC-ESI-MSMS)
As conclusioacutens xerais a obtidas a partir dos resultados deste proxecto relativo aacute determinacioacuten de pesticidas en
vintildeo son
Ante os problemas de retencioacuten que mostraban os cartuchos OASIS MAX (150 mg) para alguacuten
compostos os cartuchos OASIS HLB (200 mg) en conxunto coa mistura metanolacetonitrilo (2080)
como disolvente de elucioacuten son elexidos como mellor opcioacuten na extraccioacuten en fase soacutelida de pesticidas
en mostras con matrices complexas como eacute o caso do vintildeo Asiacute eacute conseguida a retencioacuten selectiva de
componentes da matriz e proporciona extractos con menos porcentaxe de interferencias
O meacutetodo estudado e optimizado poacutedese aplicar tanto a vintildeos brancos coma tintos procesados a partir de
diferentes variedades de uvas
Os liacutemites de cuantificacioacuten do estudo (LOQs) son maacuteis baixos de 10 ngmL agaacutes no caso do THI-M
que ascende ao valor de 20 ngmL O rango de resposta lineal cobre ata 200 ngmL e o tempo de anaacutelise
foi de soacute 10 minuacutetos por mostra
En todas as mostras de vintildeo (brancos e tintos) comercial analizadas detectouse a presenza de varios
pesticidas maacuteis poreacuten todas as concentracioacutens atopadas son inferiores ao 10 dos LMR fixados en uvas
tal e como recomenda a lexislacioacuten polo que non se considera preocupante
49
Chapter V Conclusions
CHAPTER V CONCLUSIONS
In this work we have studied a method for the quantification of pesticides specifically twenty fungicides and
three insecticides in white and red wine In the sample preparation step the solid phase extraction was optimized
using cartridges OASIS HLB (200 mg) containing divinylbenzene-N-vinylpyrrolidone (DVB-VP) as adsorbent
As determination technique ultraperformance liquid chromatography was used with an electrospray interface
coupled to mass spectrometry (UPLC-ESI-MS7MS)
The general conclusions drawn from the results of this project concerning the determination of pesticides in wine
are
Due to the retention problems presented by the OASIS MAX sorbent (150 mg) for some compounds of
this project the cartridges OASIS HLB (200 mg) together with the methanolacetonitrile (2080) mixture
are chosen as the best option in the solid phase extraction of pesticides in samples with complex
matrices as is the case with the wine
The method studied and optimized can be applied to both white and red wines obtained from different
varieties of grapes
The limits of quantification (LOQs) were below 10 ngmL for most of the compounds except in the
case of THI-M with a LOQ of to 10 ngmL The linear response range covers up to 200 ngmL and the
analysis time was only 10 minutes per sample
In all commercial wine samples (white and red) analyzed the presence of several pesticides was
conformed however all the concentrations obtained are below 10 of the Maximum residue
levels(MRLs) fixed in grapes as recommended by legislation
50
VI Bibliografiacutea VI BIBLIOGRAFIacuteA [1] Ministerio de agricultura y pesca alimentacioacuten y medio ambiente mhttpwwwmapamagobesescalidad-y-evaluacion-ambientaltemasproductos-quimicosfitosanitarios (Acceso el diacutea 11052017) [2] httpwwwcricyteduarenciclopediaterminosProducFitohtm (Acceso el diacutea 11052017) [3] WERNER BALTES ldquoQuiacutemica de los alimentosrdquo Editorial Acribia SA 2007 Capiacutetulo 11 ldquoResiduos en los alimentosrdquo paacuteginas 206-217
[4] RLabrada JCCaseley CParker ldquoESTUDIO FAO PRODUCCIOacuteN Y PROTECCIOacuteN VEGETAL 120rdquo Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentacioacuten Roma 1996 ISSN 1014- Capiacutetulo 10 Herbicidas httpwwwfaoorgdocrepT1147St1147s00htmContents (Acceso el diacutea 12052017)
[5] Taberner Palou Andreu Cirujeda Ranzenberger Alicia Zaragoza Larios Carlos ldquoManejo de poblaciones de malezas resistentes a herbicidasrdquo (FAO Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura) 100 preguntas sobre resistencia PDF sacado de httpwwwfaoorg3a-a1422spdf (Acceso el diacutea 12052017) [6] BISSET Juan A Uso correcto de insecticidas control de la resistencia Revista Cubana de Medicina Tropical 2002 vol 54 no 3 p 202-219 [7] DEVINE Gregor J EZA Dominique Ogusuku Elena FURLONGMichael J Uso de insecticidas contexto y consecuencias ecoloacutegicas Revista peruana de medicina experimental y Salud Puacuteblica 2008 vol 25 no 1 p 74-100 [8] Ministerio de agricultura y ganaderiacutea (proteccioacuten agropecuaria servicio de diagnoacutestico fitosanitario) de costa Rica httpwwwmaggocrbibliotecavirtualH20-5054pdf (Acceso el diacutea 11052017) [9] GEPP V MONDINO P Control quiacutemico 2011 PDF obtenido de httpwwwpvfagroeduuyfitopatodocscursosfitopatoMaterialesGuiasC-QUIMICOpdf (Acceso el diacutea 772017) [10] ROSSLENBROICH Hans-Juergen STUEBLER Dietrich Botrytis cinereamdashhistory of chemical control and novel fungicides for its management Crop Protection 2000 vol 19 no 8 p 557-561 [11] Figura 11 httpwwwvitiviniculturanetbotritis-o-podredumbre-gris-botrytis-cinerea-pershtml (Acceso el diacutea 12052017) [12] CAMPBELL Paul BENDEK Carlos LATORRE Bernardo A Riesgo de oiacutedio (Erysiphe necator) de la vid en relacioacuten con el desarrollo de los racimos Ciencia e investigacioacuten agraria 2007 vol 34 no 1 p 5-11 [13] ldquoCoacutemo combatir el oiacutedio de la vidrdquo Jose Javier Peacuterez de Obanos Castillo PDF sacado de httpswwwnavarraesNRrdonlyres05E65D9B-D1A2-4EAD-9A63-AFF1D3215552135109Comocombatireloidiodelavidpdf (Acceso el diacutea 12052017) [14] Imagen 12 sacadas las 3 de httpwwwvitiviniculturanetoidio-de-la-vidhtml (Acceso el diacutea 12052017) [15] BARRIOS Gonccedilal REYES Joan Modelizacioacuten del Mildiu de la Vid 2004 httpwwwruralcatnetmigracio_resources617683_mildiusPDF (Acceso el diacutea 12052017) [16] Imaacutegenes sacadas de httpwwwvitiviniculturanetmildiu-de-la-vid-enfermedades-vinahtml (Acceso el diacutea 13052017) [17] HUQ Mainul MEISNER Craig DASGUPTA Susmita Health effects and pesticide perception as determinants of pesticide use evidence from Bangladesh httpagrisfaoorgagris-searchsearchdorecordID=US2012411738 (Acceso el diacutea 13052017)
51
IV Bibliografiacutea [18] BADII Mohammad H LANDEROS Jeroacutenimo Plaguicidas que afectan a la salud humana y la sustentabilidad CULCyT 2015 no 19 Revista vista en httpopenjournaluacjmxojsindexphpculcytarticleview454 (Acceso el diacutea 772017) [19] OLEA Nicolaacutes FERNAacuteNDEZ Mariana F Plaguicidas persistentes En Congreso Implementacioacuten del Convenio de Contaminantes Orgaacutenicos Persistentes Madrid 2001 p 26-27 [20] httpwwwfaoorgfao-who-codexalimentariusabout-codexes (Acceso el diacutea 14052017) [21] httpeceuropaeufoodplantpesticidesmax_residue_levels_en (Acceso el diacutea 14052017 [22] ORDONtildeEZ Juan A Cambero Rodriacuteguez MI Fernaacutendez Aacutelvarez L Garciacutea Sanz ML Garciacutea de Fernando Minguilloacuten GD de la Hoz Perales L Selgas Cortecero MD Tecnologiacutea de los alimentos Volumen 1 Componentes de los Alimentos y Procesos Siacutentesis Madrid 1998paacutegs 349-351 [23] CELA Rafael Casais Maria del Carmen Lorenzo Rosa Antonia Teacutecnicas de separacioacuten en quiacutemica analiacutetica Siacutentesis 2002 Capiacutetulo 11 Extraccioacuten y lixiviacioacuten por disolvente (paacutegs206-260) [24] CANTWELL Frederick F LOSIER Manon Liquidmdashliquid extraction Comprehensive Analytical Chemistry 2002 vol 37 p 297-340 [25] Imagen de LLE sacada de httpprocesosbiowikispacescomExtracciC3B3n+liquido-liquido (Acceso el diacutea 15052017) [26] HENNION Marie-Claire Solid-phase extraction method development sorbents and coupling with liquid chromatography Journal of Chromatography A 1999 vol 856 no 1 p 3-54 [27] CELA Rafael Casais Maria del Carmen Lorenzo Rosa Antonia Teacutecnicas de separacioacuten en quiacutemica analiacutetica Siacutentesis 2002 Capiacutetulo 16 Teacutecnicas de adsorcioacuten y absorcioacuten en la preparacioacuten de muestras Extraccioacuten y microextraccioacuten en fase soacutelida (paacutegs520-555) [28] Imagen spe sacada httptoxicocbblogspotcomes201310las-intoxicaciones-con-farmacoshtml (Acceso el diacutea 15052017) [29] Chaacutefer Pericaacutes Consuelo Acoplamiento microextraccioacuten en fase soacutelida-cromatografiacutea (2006) httprodericuveshandle1055014940 (Acceso el diacutea 16052017) [30] Imagen SPME httpwwwscieloorgcoscielophpscript=sci_arttextamppid=S0122-53832002000100005 (Acceso el diacutea 16052017) [31] MONTES GOYANES Rosa Mariacutea Avances en teacutecnicas de microextraccioacuten para la determinacioacuten de compuestos traza en muestras medioambientales y alimentarias Teacutesis doctoral Noviembre 2009 (Paacutegs 34-55) [32] LEHOTAY Steven J Ae Son Kyung KwonHyeyoung Koesukwiwat Urairat Fu Wusheng Mastovska Katerina Hoh Eunha Leepipatpiboon Natchanun Comparison of QuEChERS sample preparation methods for the analysis of pesticide residues in fruits and vegetables Journal of Chromatography A 2010 vol 1217 no 16 p 2548-2560 [33] Imagen QueChERS httpswwwresearchgatenetpublication279221361_QuEChERS_A_Sample_Preparation_for_Extraction_of_Carbaryl_from_Rat_Feces (Acceso el diacutea 16052017) [34] STASHENKO Elena E MARTIacuteNEZ Jairo Reneacute Preparacioacuten de la muestra un paso crucial para el anaacutelisis por GC-MS Uma publicaccedilatildeo trimestral do Instituto Internacional de Cromatografia (IIC) Ciecircncia Cromatograacutefica 2011 vol 3 no 1 [35] Imagen GC-MS httpsorgspectroscopyintblogspotcomes201411gas-chromatography-mass-spectrometry-gchtml (Acceso el diacutea 17052017) [36] httpwwwactlabscompageaspxmenu=65ampapp=221ampcat1=534amptp=2amplk=no (Acceso el diacutea 17052017)
52
IV Bibliografiacutea [37] Quintela O Cruz A Concheiro M De Castro A amp Loacutepez-Rivadulla M (2005) Metodologiacutea LC-MS Aspectos generales de la teacutecnica y sus aplicaciones en el campo de la toxicologiacutea Rev Toxicol 22 paacutegs7-14 [38] Imagen LC-MS httpsuploadwikimediaorgwikipediaenff9Liquid_chromatography_tandem_Mass_spectrometry_diagrampng (visto 18052017) [39] Vargas de la Cruz Celia Bertha Adaptacioacuten de la Metodologiacutea Analiacutetica para la determinacioacuten de residuos de plaguicidas en frutas nativas de exportacioacuten mediante Uplc-MsMs (2012) Tesis obtenida en http20062146130handlecybertesis2331 (Acceso el diacutea 772017) [40] ROMERO GONZAacuteLEZ Roberto Fernaacutendez Moreno Joseacute Luis Plaza Bolantildeos Patricia Garrido Frenich Antonia Martiacutenez Vidal Joseacute Luis Empleo de la espectrometriacutea de masas como herramienta para la determinacioacuten de toacutexicos en alimentos hacia la seguridad alimentaria Revista Espantildeola de salud puacuteblica 2007 vol 81 no 5 p 461-474 [41] PAYAacute Andrus Fundamento y Funciones de la Espectrometriacutea de Masas Universidad de Valencia Espantildea 2006 httpmuraluvescaloan (Acceso el diacutea 19052017) [42] Imagen MS sacada de httpsesslidesharenetMaYaTorrezespectrometria-demasas (Acceso el diacutea 21052017) [43] ECONOMOU Anastasios Botitsi Helen Antoniou Spyros Tsipi Despina Determination of multi-class pesticides in wines by solid-phase extraction and liquid chromatography-tandem mass spectrometry Journal of Chromatography A 2009 vol 1216 no 31 p 5856-5867 [44] FONTANA A R Rodriacuteguez I Ramil M Altamirano JC Cela R Liquid chromatography time-of-flight mass spectrometry following sorptive microextraction for the determination of fungicide residues in wine Analytical and bioanalytical chemistry 2011 vol 401 no 2 p 767-775 [45] PELAJIĆ Maja G Peček DM Pavlović DV Čepo Novel multiresidue method for determination of pesticides in red wine using gas chromatographyndashmass spectrometry and solid phase extraction Food chemistry 2016 vol 200 p 98-106 [46] Ignaz J Buerge Juumlrgen Krauss Rociacuteo Loacutepez-Cabeza Werner Siegfried Michael Stuumlssi Felix E Wettstein Thomas Poiger Stereoselective Metabolism of the Sterol Biosynthesis Inhibitor Fungicides Fenpropidin Fenpropimorph and Spiroxamine in Grapes Sugar Beets and Wheat Journal of Agricultural and Food Chemistry 2016 vol 64 no 26 p 5301-5309 [47] M Hu X Liu F Dong J Xu S Li H Xu Y Zheng Determination of ametoctradin residue in fruits and vegetables by modified quick easy cheap effective rugged and safe method using ultra-performance liquid chromatographytandem mass spectrometry Food chemistry 2015 vol 175 p 395-400 [48] WALORCZYK Stanisław DROŻDŻYŃSKI Dariusz GNUSOWSKI Bogusław Multiresidue determination of 160 pesticides in wines employing mixed-mode dispersive-solid phase extraction and gas chromatographyndashtandem mass spectrometry Talanta 2011 vol 85 no 4 p 1856-1870 [49] Tianyang Guo Pingping Fang Juanjuan Jiang Feng Zhan Wei Yong Jiahui Liu YiYang Dong Rapid screening and quantification of residual pesticides and illegal adulterants in red wine by direct analysis in real time mass spectrometry Journal of Chromatography A 2016 vol 1471 p 27-3 [50] GONZAacuteLEZ-RODRIacuteGUEZ R M CANCHO-GRANDE B SIMAL-GAacuteNDARA J Decay of fungicide residues during vinification of white grapes harvested after the application of some new active substances against downy mildew Food chemistry 2011 vol 125 no 2 p 549-560 [51] CARPINTEIRO I Ramil M Rodriacuteguez I Cela R Determination of fungicides in wine by mixed-mode solid phase extraction and liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry Journal of Chromatography A 2010 vol 1217 no 48 p 7484-7492
53
Iacutendice
IacuteNDICE ABSTRACTRESUMEN RESUMO helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip1
CAPIacuteTULO I INTRODUCCIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip3
1 FITOSANITARIOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip3
11 Tipos de fitosanitarios empleados en viticulturahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip3
12 Estructura propiedades fiacutesico-quiacutemicas y clasificacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip6
13 Toxicidad de los pesticidashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip9
14 Legislacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip10
2 MEacuteTODOS DE PREPARACIOacuteN DE MUESTRA APLICADOS
A MUESTRAS DE VINOhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip11
21 Extraccioacuten liacutequido-liacutequido (LLE)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip11
22 Extraccioacuten en fase soacutelida (SPE)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip11
23 Teacutecnicas de microextraccioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip12
231 Microextraccioacuten en fase soacutelida (SPME)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip12
232 Microextraccioacuten en fase liacutequida (LPME)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip13
24 QuEChERShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip13
3 METODOLOGIacuteA ANALIacuteTICA PARA LA DETERMINACIOacuteN
DE PESTICIDAShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip14
31 Meacutetodos de GC-MS (MSMS)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip14
32 Meacutetodos de LC-MS (MSMS)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip15
33 Espectrometriacutea de masashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip15
4 RESUMEN BIBLIOGRAacuteFICO DE LAS TEacuteCNICAS DE EXTRACCIOacuteN Y
DETERMINACIOacuteN DE PESTICIDAS EN VINOhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip16
5 DISTRIBUCIOacuteN DE PESTICIDAS EN VINOS COMERCIALEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip19
CAPIacuteTULO II OBJETIVOS Y JUSTIFICACIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip22
Iacutendice
CAPIacuteTULO III PARTE EXPERIMENTALhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip23
1 MATERIAL Y REACTIVOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip23
11 Materialhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip23
12 Reactivos y disolventeshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip23
13 Patroneshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip23
14 Patrones internoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip24
15 Gaseshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip25
2 INSTRUMENTACIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip25
3 PREPARACIOacuteN DE LAS DISOLUCIONEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip25
4 LAVADO DEL MATERIALhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip26
5 EXTRACCIOacuteN DE MUESTRAS MEDIANTE SPEhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip26
6 CONDICIONES DE DETERMINACIOacuteN MEDIANTE UPLC-MSMShelliphelliphelliphelliphellip28
CAPIacuteTULO IV RESULTADOS Y DISCUSIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 29
1 IDENTIFICACIOacuteN DE LOS COMPUESTOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip29
2 CARACTERIZACIOacuteN DEL PROCEDIMIENTO DE
DETERMINACIOacuteN (UPLC-ESI-MSMS)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip30
3 ESTUDIO DEL MEacuteTODO SPEhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33
4 CARACTERIZACIOacuteN DEL MEacuteTODO DE DETERMINACIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip39
5 APLICACIOacuteN A MUESTRAS DE VINOS COMERCIALEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip42
CAPIacuteTULO V CONCLUSIONESCONCLUSIOacuteNSCONCLUSIONShelliphellip 48
VI BIBLIOGRAFIacuteAhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip51
ResumenResumoAbstract
bull RESUMEN
Los pesticidas son compuestos que se emplean en vintildeedos de todo el mundo para garantizar una proteccioacuten en la
cosecha con escasas peacuterdidas producidas por diferentes organismos en uvas empleadas para la elaboracioacuten del
vino El modo de accioacuten de estos compuestos se basa en la interferencia sobre el metabolismo de diferentes
organismos sin afectar a la vid Un incremento en el empleo de estos compuestos puede determinar la existencia
de residuos en las uvas en el momento de la cosecha desde donde pueden alcanzar el vino que se elabora con las
mismas Por ese motivo se ha establecido una legislacioacuten que regule la cantidad maacutexima de residuos de pesticidas
en uvas y aunque a diacutea de hoy no hay valores regulados en el vino se recomienda que no excedan al 10 de los
liacutemites en uvas En este estudio se ha trabajado con distintos tipos de fitosanitarios fungicidas principalmente
aunque tambieacuten alguacuten insecticida con el objetivo de poder detectar la mayor cantidad de estas sustancias en vinos
comerciales optimizando la extraccioacuten mediante extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) y deteccioacuten mediante
cromatografiacutea de liacutequidos acoplada a espectrometriacutea de masas en taacutendem (LC-ESI-MSMS) Se presenta una
metodologiacutea analiacutetica sencilla raacutepida y robusta que puede ser implementada en laboratorios de control de
alimentos
bull RESUMO
Os pesticidas son compostos empregados en vintildeas arredor do mundo para garantir unha proteccioacuten na colleita
con poucas perdas producidas por distintos organismos en uvas utilizadas para a fabricacioacuten do vintildeo O modo de
accioacuten destes compostos baseacutease na intromisioacuten sobre o metabolismo de diferentes organismos sen afectar aacute vide
Un acrecentamento no uso destos compostos pode fixar a existencia de residuos nas uvas no momento da colleita
onde poden chegar ao vintildeo que se produce coas mesmas Por ese motivo estipulouse unha lexislacioacuten que regula a
cantidade maacutexima de residuos de pesticidas en uvas e aiacutenda que a diacutea de hoxe non hay valores regulamentados no
vintildeo recomeacutendase que non superen ao 10 dos liacutemites en uvas Neste estudo traballouse con diferentes tipos de
pesticidas funxicidas principalmente aiacutenda que tameacuten alguacuten insecticida co obxecto de poder detectar a maior
cantidade destas sustancias en vintildeos comerciais optimizando a extraccioacuten por medio da extraccioacuten en fase soacutelida
(SPE) e deteccioacuten por medio de cromatografiacutea de liacutequidos acoplada a espectrometriacutea de masas en taacutendem (LC-
MSMS) Preseacutentase unha metodoloxiacutea analiacutetica simple raacutepida e robusta que pode ser aplicada en laboratorios de
control de alimentos
1
ResumenResumoAbstract
bull ABSTRACT
Pesticides are compounds that are used in vineyards around the world to ensure protection at harvest with a few
loss produced by different organisms in grapes used to make wine The mode of action of these compounds is
based on the interference on the metabolism of different organisms without affecting the vine An increase in the
use of these compounds can determine the existence of residues in grapes at the time of harvest from where
they can reach the wine that is elaborated with the same ones For this reason legislation has been established to
regulate the maximum amount of pesticide residues in grapes and although there are currently no regulated
values in wine it is recommended that they do not exceed 10 of the limits on grapes In this study we have
worked with different types of pesticides mainly fungicides but also some insecticide with the purpose of being
able to detect the greatest amount of these substances in commercial wines extraction has been optimized by
solid phase extraction (SPE) and detection has been optimized by liquid chromatography coupled to tandem mass
spectrometry (LC-ESI-MSMS) It is presented a simple fast and robust analytical methodology that can be
implemented in food control laboratories
2
Capitulo I Introduccioacuten
CAPIacuteTULO I INTRODUCCIOacuteN
1 FITOSANITARIOS
11 Tipos de fitosanitarios empleados en viticultura
De acuerdo con el Ministerio de Agricultura y Pesca Alimentacioacuten y Medio Ambiente los fitosanitarios se definen
como una o varias sustancias activas u otros ingredientes conformando una mezcla con el fin de proteger los
productos de origen vegetal de organismos nocivos tanto de tipo vegetal como animal que conforman plagas
Dentro de estos fitosanitarios tambieacuten se encuentran las sustancias que destruyen regulan o inhiben la
germinacioacuten de las plantas pero no se contemplan dentro de este grupo vacunas medicamentos y antibioacuteticos
para uso humano o veterinario o agentes utilizados en el control bioloacutegico Los productos fitosanitarios ayudan a
asegurar una buena calidad en los alimentos asiacute como contribuyen al aumento de los rendimientos en la
agricultura [1]
Seguacuten la OMS (Organizacioacuten Mundial de la Salud) los fitosanitarios se pueden clasificar atendiendo a los
organismos a los que esteacuten destinados siendo estos insectos (insecticidas) aacutecaros (acaricidas) moluscos
(molusquicidas) roedores (rodenticidas o raticidas) hongos (fungicidas) gusanos y larvas (nematicidas) malas
hierbas (herbicidas) bacterias (antibioacuteticos pero sin comprender los de uso humano y bactericidas) y otras formas
de vida perjudiciales para la salud puacuteblica y tambieacuten para la agricultura consideradas como plagas animales o
vegetales que puedan ser generadas durante la produccioacuten almacenamiento transporte distribucioacuten y elaboracioacuten
de productos agriacutecolas y sus derivados Actualmente no se puede pensar en un cultivo racional sin el uso de alguacuten
tipo de pesticida ya que la peacuterdida de cosechas en todo el mundo debido a causa de insectos enfermedades de las
plantas y malas hierbas es equivalente a un tercio de la produccioacuten total [2] [3]
Para el estudio de los productos de fitosanitarios en vino nos centraremos solamente en los tres tipos maacutes
importantes en eacuteste aacuterea herbicidas insecticidas y sobre todo fungicidas
Los herbicidas son sustancias destinadas a destruir las malas hierbas cuyo meacutetodo de accioacuten es la interferencia
en los procesos bioquiacutemicos como la fotosiacutentesis que tienen lugar en el sistema vivo de eacutestas Generalmente se
aplican en solucioacuten o suspensioacuten acuosa en forma de nube de pequentildeas gotas dirigidas hacia el objetivo de la
aplicacioacuten Los herbicidas ofrecen los medios maacutes efectivos para el control de las plagas siendo en los paiacuteses
industrializados aplicados sobre el 85-100 de todos los cultivos principales Este tipo de sustancias son
propensas a la descomposicioacuten por microbios plantas y animales y no son comunes los problemas de residuos de
herbicidas si se utilizan de acuerdo a las instrucciones de las etiquetas [4] A pesar de todos los beneficios que nos
aportan un mal uso de estos puede convertirse en un serio problema ya que toda sustancia quiacutemica usada en
3
Capiacutetulo I Introduccioacuten
agricultura puede provocar un efecto negativo en el ambiente si es utilizada en altas dosis El uso prolongado de
un mismo herbicida puede causar problemas de resistencia de malezas fenoacutemeno que consiste en la aparicioacuten de
biotipos tolerantes de una especie la cual anteriormente era controlada por el herbicida [5]
Por otro lado los insecticidas son fitosanitarios destinados a controlar el ataque de insectos y para eso existen
distintos caminos a traveacutes de los que pueden actuar siendo envenenamiento por contacto en doacutende el insecticida
penetra a traveacutes de la cutiacutecula del insecto hasta alcanzar el sitio activo envenenamiento oral en doacutende el
insecticida es ingerido y absorbido a traveacutes del intestino o tambieacuten por fumigaciones en doacutende el insecticida
penetra en el cuerpo del insecto a traveacutes de los espiraacuteculos del sistema respiratorio Pero al igual que pasa con los
herbicidas los insectos tambieacuten desarrollan resistencia a los insecticidas debido al contacto continuo con estos
Esta resistencia puede ser expresada por varios caminos que el insecto no entre en contacto con la deposicioacuten del
insecticida que se modifique la composicioacuten del exoesqueleto inhibiendo asiacute la penetracioacuten del insecticida la
modificacioacuten del sitio activo para el fitosanitario reduciendo la sensibilidad a la forma activa del insecticida o que
la viacutea metaboacutelica del insecto se modifique negando el metabolismo del compuesto aplicado en su forma toacutexica
[6] Aunque por lo general otros aspectos de la agricultura moderna tienen un mayor impacto en el medio
ambiente los insecticidas se encuentran entre las herramientas agriacutecolas que estaacuten maacutes asociadas con el dantildeo
ambiental Su objetivo especiacutefico es matar a plagas de insectos por lo que puede que tenga un impacto letal en
organismos que no son su objetivo [7]
Por uacuteltimo los fungicidas estaacuten destinados tanto a combatir las plagas de hongos como a combatir las
enfermedades fungosas de las plantas ya sea matando retrasando el desarrollo o inhibiendo la reproduccioacuten de
los hongos Los fungicidas en general se dividen atendiendo al modo de accioacuten de eacutestos en fungicidas de
contacto fungicidas penetrantes o fungicidas sistemaacuteticos
Los fungicidas de contacto protegen uacutenicamente el sitio de aplicacioacuten contra las plagas quedando en el exterior de
la planta de eacutesta manera sin penetrar en el tejido vegetal forman una peliacutecula protectora Cuando alguna espora
de un hongo llega a su superficie se encuentra con esa peliacutecula que le impide penetrar o en su defecto germinar
En el caso de que atraviesen el tejido vegetal bien sea por una alta dosis o por una rotura en las paredes de la
planta se convierten en un producto toacutexico para ella llegando a quemarla
Otro tipo de fungicidas los fungicidas penetrantes como su nombre indica se introducen en el tejido vegetal y
una vez dentro cuentan con muy poca movilidad es decir no circulan por los vasos conductores Al tener la
capacidad de entrar en la planta pueden combatir a los hongos que ya se encuentren dentro de eacutesta pero no
pueden ser toacutexicos para ella porque de lo contrario la dantildeariacutean
Por uacuteltimo nos encontramos con los fungicidas sistemaacuteticos Este tipo de fungicidas actuacutean protegiendo a la
planta contra las plagas en distintas zonas por transfusioacuten del fitosanitario dentro de la misma Esto sucede porque
penetran en el tejido vegetal y circulan por ella a traveacutes de la corriente de los vasos conductores
El meacutetodo de accioacuten de los fungicidas se basa en interferir en el metabolismo de los hongos ya sea por un
4
Capiacutetulo I Introduccioacuten
ataque en la produccioacuten de energiacutea la inhibicioacuten de la mitosis o inhibiendo la formacioacuten de quitina que se trata
del compuesto principal de la pared celular de los hongos y que por ende influye en la permeabilidad de la
membrana [8] [9]
Las enfermedades fuacutengicas fundamentales que nos podemos encontrar en las uvas de la vid son la botritis el oiacutedio
y el mildium las cuales pueden llegar a causar peacuterdidas importantes en viticultura
La enfermedad de la botritis tambieacuten llamada moho gris estaacute causada
por el hongo Botrytis cineacuterea y se puede encontrar en todo el mundo
infectando a un amplio nuacutemero de plantas Se trata de uno de los
patoacutegenos fuacutengicos maacutes interesantes debido a que puede vivir tanto
de forma patoloacutegica produciendo la enfermedad como
alimentaacutendose de materia orgaacutenica en descomposicioacuten La accioacuten
fuacutengica del hongo se lleva a cabo cuando las uvas empiezan a
acumular azuacutecar pudiendo ser muy devastador en algunas
condiciones sobre todo en cultivos empapados por la lluvia o
localizados en un ambiente huacutemedo y con viento produciendo la peacuterdida de los racimos de uvas que son
infectados O por el contrario en otro tipo de condiciones ambientales de sequedad despueacutes de unas
condiciones de humedad dicho hongo le confiere beneficios a ciertos tipos de vino blanco [10]
El oiacutedio es una enfermedad causada por la especie Uncinula necator la cual afecta tanto al rendimiento como a la
calidad de las uvas y altera las cualidades de sus derivados vino mosto etc El proceso de infeccioacuten del oiacutedio
tiene lugar siguiendo un ciclo de reproduccioacuten en las distintas estaciones del antildeo El riesgo de infeccioacuten viene
dado en funcioacuten de la temperatura oacuteptima entre 25-30ordmC humedad del ambiente en el que se encuentre y
tambieacuten en funcioacuten de la temporada siendo maacutes resistentes los racimos de uvas a medida que van madurando El
hongo afecta a todas las parte de la vid hojas tallo y racimos las cuales presentan siacutentomas distintos Las hojas se
vuelven de un color amarillento y se cubren de un polvo fino blanco grisaacuteceo En el tallo el oiacutedio se manifiesta a
traveacutes de manchas difuminadas con coloracioacuten inicial verde oscuro volvieacutendose cada vez maacutes oscuras al final y si
ocurre un ataque fuerte puede desembocar en que el tallo se acabe secando y por consiguiente disminuye la
produccioacuten Pero el ataque maacutes fuerte se produce en los racimos empezando por cubrirse del polvillo blanco
grisaacuteceo y continuando con que el oiacutedio detiene el crecimiento de la piel de la uva con la consecuencia que la uva
se agrieta Esta enfermedad produce unos dantildeos directos en la cantidad y calidad de la cosecha y si no se toman
medidas de prevencioacuten las peacuterdidas pueden llegar a ser totales [12] [13]
Figura I1Enfermedad de botritis en un racimo de uvas [11]
Figura I2 Enfermedad del oiacutedio en hoja tallo y racimo de izquierda a derecha [14] 5
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Por uacuteltimo el mildium o mildiu es una enfermedad producida por el hongo Plasmopara vitiacutecola considerada como
una de las peores enfermedades del cultivo siempre y cuando esteacuten en las condiciones ambientales favorables para
su desarrollo Dichas condiciones oacuteptimas para la propagacioacuten de la enfermedad son las lluvias al amanecer o al
anochecer con una temperatura en un rango de 20-25 ordmC El periacuteodo sensible de la vegetacioacuten de la vintildea es a
partir de una longitud de 10 cm en adelante siendo maacutexima en el periacuteodo de mayor crecimiento de la planta Por
otro lado la sensibilidad del racimo empieza desde su formacioacuten hasta que las uvas al florecer alcanzan el tamantildeo
similar al de un guisante pero de ahiacute en adelante la sensibilidad se ve disminuida Dicho hongo cuenta con un
ciclo reproductivo abarcando varias fases desde la fase de contaminacioacuten siendo el principio hasta la fase de pro-
pagacioacuten Afecta a todos los oacuterganos verdes de la vid y sus siacutentomas son variados en las distintas zonas de eacutesta
En las caras de las hojas aparecen unas manchas amarillentas en los racimos cuando se aproxima la floracioacuten los
que se encuentran infectados se curvan secaacutendose y cubrieacutendose de una pelusa blanquecina y cuando alcanzan el
tamantildeo de un guisante en adelante las uvas de los racimos afectados se van oscureciendo y secando sin que apa-
rezca la fructificacioacuten del hongo ademaacutes de oscurecerse el tallo [15]
12 Estructura propiedades fiacutesico-quiacutemicas y clasificacioacuten
En este trabajo nos centramos en estudiar los residuos de veintitreacutes fitosanitarios tipo fungicida principalmente
aunque tambieacuten alguacuten residuo tipo insecticida Las caracteriacutesticas maacutes importantes de dichos compuestos seraacuten
recogidas en la Tabla I1 que incluye estructuras clasificacioacuten (se ha usado el acroacutenimo ldquoFrdquo en caso de ser
fungicidas e ldquoIrdquo en caso de ser insecticidas) y propiedades fiacutesico-quiacutemicas Las propiedades fiacutesico-quiacutemicas que
pueden resultar maacutes relevantes para este estudio son el pKa ya que la mayoriacutea se trata de compuestos baacutesicos
aunque se encuentre alguacuten aacutecido deacutebil como es por ejemplo el Fenhexamid y Kow describiendo el coeficiente de
reparto entre octanolagua empleado para medir el grado de hidrofobidad que proporciona una estimacioacuten de
la posible distribucioacuten del analito entre materia orgaacutenica y agua
Figura I3 Enfermedad del mildium en la imagen de la izquierda coacutemo afecta a las hojas imagen central coacutemo
afecta a los racimos cuaacutendo estaacuten infectados al comenzar la floracioacuten y en la imagen de la derecha coacutemo afecta a
los racimos en doacutende las uvas tienen tamantildeo mayor al de un guisante [16]
6
Compuesto Estructura Nombre sistemaacutetico Foacutermula CAS Uso ordflog (kow) pKa
Ametoctradin
(AME)
5-ethyl-6-
octyl[124]triazolo[15-
a]pyrimidin-7-amine
C15H25N5 865318-97-4 F 440 278
Benalaxyl
(BEN)
Methyl-N-(phenylacetyl)-N-
(26-xylyl)-D-alaninate C20H23NO3 98243-83-5 F 368 -
Boscalid
(BOS)
2-Chloro-N-(4rsquo-
chlorobiphenyl-2-yl)-
nicotinamide
C18H12Cl2N2O 188425-85-6 F 296 -
Carbendazim
(CAR)
Methyl 2-benzimidazole
carbamate C9H9N3O2 10605-21-7 F 148 420
Cyprodinil
(CYP)
4-Cyclopropyl-6-methyl-N-
phenilpyrimidin-2-amine C14H15N3 121552-61-2 F 400 309
Dimethomorph
(DIM)
(2E)-3-(4-chlorophenyl)-3-(34-
dimethoxyphenyl)-1-
(morpholin-4-yl)prop-2-en-1-
one
C21H22ClNO4 110488-70-5 F 268 -13
Fenhexamid
(FEH)
N-(23-dichloro-4-
hydroxyphenyl)-1-methyl-
cyclohexanecarboxamide
C14H17Cl2NO2 126833-17-8 F 351 73
Fenpropidin
(FEP)
1-[(RS)-3-(4-tert-butylphenyl)-
2-methylpropyl]piperidine C19H31N 67306-00-7 F 26 1013
Fluopicolid
(FLU)
26-dichloro-N-[3-chloro-5-
(trifluoromethyl)-2-
pyridylmethyl]benzamide
C14H8Cl3F3N2O 239110-15-7 F 29 -
Imidacloprid
(IMI)
(E)-1-(6-chloro-3-
pyridylmethyl)-N-
nitroimidazolidin-2-
ylideneamine
C9H10ClN5O2 138261-41-3 I 057 -
Iprovalicarb
(IPR)
Isopropyl (S)-2-methyl-1-[1-(p-
tolyl)ethylcarbamoyl]propyl-
carbamate
C18H28N2O3 140923-17-7 F 32 -
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Tabla I1 Estructura clasificacioacuten y propiedades fiacutesico-quiacutemicas de intereacutes para los analitos de estudio
7
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Compuesto Estructura Nombre sistemaacutetico Foacutermula CAS Uso ordflog (kow) pKa
Mandipropamid
(MAN)
2-(4-chlorophenyl)-N-[3-
methoxy-4-(2-
propynyloxy)phenethyl]-2-(2-
propynyloxy)acetamide
C23H22ClNO4 374726-62-2 F 32 -
Metalaxyl
(MET)
N-(26-dimethylphenyl)-N-
(methoxyacetyl)-DL-alanine
methyl ester
C15H21NO4 57837-19-1 F 175 000
Myclobutanil
(MYC)
2-(4-chlorophenyl)-2-(1H-
124-triazol-1-
ylmethyl)hexanentrile
C15H17ClN4 88671-89-0 F 289 230
Penconazol
(PEN)
1-[2-(24-
dichlorophenyl)pentyl]-1H-
124-triazole
C13H15Cl2N3 66246-88-6 F 372 151
Pyraclostrobin
(PYC)
Methyl2-[1-(4-chlorophenyl)-
1H-pyrazol-3-
yloxymethyl]phenylmetoxy-
carbamate
C19H18ClN3O4 175013-18-0 F 399 -
Pyrimethanil
(PYM)
4-6-dimethyl-N-phenyl-2-
pyrimidinamine C12H13N3 53112-28-0 F 284 352
Tebuconazol
(TEC)
1-(4-chlorophenyl)-44-
dimethyl-3-(1H-124-triazol-1-
ylmethyl)-3-pentanol
C16H22ClN3O 107534-96-3 F 370 500
Tebufenozid
(TEF)
35-dimethylbenzoic acid 1-
(11-dimethylethyl)-2-(4-
ethylbenzoyl)hidrazide
C22H28N2O2 112410-23-8 I 425 -
Thiabendazol
(TBZ)
2-(13-thiazol-4-yl)-1H-
benzimidazole C10H7N3S 148-79-8 F 239 473
Thiamethoxam
(TME)
3-[(2-chloro-5-
thiazolyl)methyl]tetrahydro-5-
methyl-N-nitro-4H-135-
oxadiazin-4-imine
C8H10ClN5O3S 153719-23-4 I -013 -
Thiophanate-
methyl
(THI-M)
DimethylNNrsquo-[12-
phenylenebis(azanediylcarbono
thioyl)] dicarbamate
C12H14N4O4S2 23564-05-8 F 145 728
Triadimenol
(TRI)
1-(4-chlorophenoxy)-33-
dimethyl-1-(1H-124-triazol-1-
yl)-2-butanol
C14H18ClN3O2 55219-65-3 F 318
-
ordf Valores para la forma neutra 8
Capiacutetulo I Introduccioacuten
13 Toxicidad de los pesticidas
En los uacuteltimos antildeos el uso indiscriminado de pesticidas de siacutentesis en agricultura ha creado graves problemas de
salud y medioambientales ya que su uso debido al aumento de la poblacioacuten y por consiguiente de la actividad
agraria se ha incrementado considerablemente Durante las tres uacuteltimas deacutecadas una estimacioacuten dada por la
Organizacioacuten Mundial de la Salud y el Programa de las Naciones Unidas para el Medio Ambiente revela que
aproximadamente cerca de 20000 personas al antildeo mueren generalmente agricultores por exposicioacuten continuada
a alguno de estos toacutexicos En la mayoriacutea de los casos los agricultores utilizan los pesticidas de forma que las
cantidades se desviacutean significativamente de las recomendadas ya que asocian cantidades maacutes altas con mayor
efectividad y velocidad de accioacuten El mal uso de dichos toacutexicos se ve en los signos presentes en los ecosistemas
afectados pudiendo llegar a ser perjudiciales para la salud humana Estos riesgos que causan tanto en la salud
como en el medioambiente pueden ser reducidos o en su defecto evitados mediante la educacioacuten sobre este tipo
de toacutexicos con el fin de frenar su uso excesivo y descontrolado [17]
Desde el punto de vista medioambiental los fitosanitarios empleados en un cultivo pueden persistir en los
distintos medios tierra aire o agua y afectar tanto a ecosistemas terrestres como acuaacuteticos En los sistemas
terrestres los suelos son contaminados mediante la aplicacioacuten del toacutexico de forma directa o como deposicioacuten del
resultado de una suspensioacuten aeacuterea Eacutestos pueden persistir desde varios diacuteas hasta varios antildeos ya que el suelo
retiene y moviliza el toacutexico despueacutes de su emisioacuten Los que persisten maacutes tiempo en el medioambiente tienen una
mayor probabilidad de interaccionar con otros elementos del sistema y si su vida media es mayor a la frecuencia
con la que se aplica el pesticida tienden a acumularse tanto en el suelo como en las especies que habitan en eacutel Por
otro lado el agua es contaminada por pesticidas bien por aplicacioacuten directa por estar presentes en las
precipitaciones de la atmoacutesfera o bien por la movilidad que tienen desde el suelo Tanto los pesticidas solubles
como los insolubles interaccionan con los ecosistemas acuaacuteticos los hidrosolubles persisten maacutes tiempo
solubilizados en agua mientras que los otros se asocian a los sedimentos y se concentran en las especies que
habitan el medio acuaacutetico [18]
Como consecuencia de la amplia distribucioacuten de los toacutexicos en aire suelo y agua se produce una acumulacioacuten de
ellos en los elementos que contribuyen a la alimentacioacuten humana ya que su amplio uso hace que el contacto con
los plaguicidas por parte de personas y animales sea inevitable La contaminacioacuten de los alimentos se puede
presentar por aplicacioacuten directa de los pesticidas el uso de eacutestos durante el manejo transporte y almacenamiento
de los productos comestibles o por su acumulacioacuten en la cadena troacutefica Son bioacumulables en el organismo
debido a su caraacutecter lipofiacutelico lo que les confiere una vida media en los tejidos larga La exposicioacuten a pesticidas
persistentes no tiene la misma repercusioacuten en cada uno de los individuos expuestos sino que se considera criacutetica la
exposicioacuten durante la etapas embrionaria fetal y primeros antildeos de vida en doacutende se transmite de madres a hijos
mediante la gestacioacuten y la lactancia como resultado de la acumulacioacuten en el tejido graso de la madre [19]
9
Capiacutetulo I Introduccioacuten
14 Legislacioacuten
El aumento del uso de fitosanitarios en actividades relacionadas con la produccioacuten de alimentos para consumo
humano o animal tambieacuten desembocoacute en una preocupacioacuten social debido a su toxicidad y bioacumulacioacuten En
respuesta la Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura (FAO) en colaboracioacuten
con la Organizacioacuten Mundial de la Salud (OMS) pusieron en marcha un programa Codex Alimentarius cuyo
objetivo a traveacutes de sus normas y coacutedigos de praacutecticas alimentarias internacionales es garantizar la calidad e
inocuidad de los alimentos que estaacuten al alcance de cualquier persona Con estas normas internacionales los
consumidores pueden confiar en la calidad de los alimentos independientemente de su origen geograacutefico [20]
Todos los alimentos destinados al consumo humano o animal en la Unioacuten Europea estaacuten sujetos a un liacutemite
maacuteximo de residuos de plaguicidas para la proteccioacuten de la salud humana y animal Actualmente en lo referente a
legislacioacuten para el control de la cantidad del toacutexico en la uva estaacute vigente el Reglamento 3962005 del Parlamento
Europeo y del Consejo de 23 de febrero de 2005 referido a la regulacioacuten de los liacutemites maacuteximos de residuos de
plaguicidas en alimentos y piensos de origen vegetal y animal El liacutemite maacuteximo de residuos (LMR) se define co-
mo el nivel maacutes alto de un residuo de un pesticida que se tolera de manera legal sobre los alimentos o piensos
cuando se aplican correctamente Las cantidades de residuos que se encuentren deben ser lo maacutes bajas posible
para garantizar la seguridad en la alimentacioacuten de los consumidores Dichos liacutemites maacuteximos de residuos estaacuten
fijados por la Comisioacuten Europea pudieacutendose encontrar en su base de datos LMR [21]
A continuacioacuten en la Tabla I2 se resumen los LMRs de los compuestos de este estudio en uvas de vinificacioacuten
en unidades de mgkg de uva En el caso del vino no hay legislacioacuten en lo referente a estos pesticidas solamente
la recomendacioacuten de no superar el 10 del valor del LMR en uva
Compuesto LMRs (mgkg uva) Compuesto LMRs (mgkg uva)
AME 6 MET 1
BEN 03 MYC 1
BOS 5 PEN 02
CAR 05 PYC 2
CYP 3 PYM 5
DIM 3 TEC 1
FEH 15 TEF 3
FEP 001 TBZ 005
FLU 2 TME 04
IMI 1 THI-M 3
IPR 2 TRI 2
MAN 2
Tabla I2 Liacutemites maacuteximos de residuos permitidos para los compuestos estudiados en uvas
10
Capiacutetulo I Introduccioacuten
2 MEacuteTODOS DE PREPARACIOacuteN DE MUESTRA APLICADOS A MUESTRAS DE VINO
21 Extraccioacuten liacutequido-liacutequido (LLE)
Se entiende por extraccioacuten liacutequido-liacutequido al meacutetodo mediante el cual un analito de intereacutes se separa por el
contacto con otra fase en la cual tiene mayor afinidad de la matriz en la que se halle Los procesos de extraccioacuten
implican dos fases y requieren tres pasos sucesivos mezcla de materia prima y disolvente separacioacuten de las dos
fases despueacutes del contacto y eliminacioacuten del disolvente que contiene el analito [22]
La extraccioacuten liacutequido-liacutequido (LLE) se basa en la distribucioacuten
de un analito entre dos fases liacutequidas inmiscibles en las
cuales analito y matriz tienen solubilidades diferentes
Principalmente una de las fases es un medio acuoso en
general se trata de la muestra y la otra un disolvente
orgaacutenico La selectividad y eficacia de este meacutetodo vienen
determinadas por la eleccioacuten del disolvente y por los factores
que pueden afectar al proceso de equilibrio (pH adiccioacuten de
sales neutras en la fase acuosa para reducir la solubilidad del
analito etc) [23] Esta teacutecnica permite llevar a cabo extracciones para un rango muy amplio de analitos siendo
una de las maacutes antiguas para la preparacioacuten de muestras en el anaacutelisis cualitativo y cuantitativo Ofrece grandes
capacidades de muestreo lineal y cuenta con la ventaja de la cantidad de informacioacuten existente sobre este meacutetodo
[24]
22 Extraccioacuten en fase soacutelida (SPE)
En 1978 aparecieron los primeros cartuchos desechables para la extraccioacuten en fase soacutelida y actualmente casi 40
antildeos despueacutes la extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) es la teacutecnica de preparacioacuten de muestras maacutes empleada en los
laboratorios Es una teacutecnica de preparacioacuten y tratamiento de muestras que se basa en la retencioacuten en una fase
adsorbente del analito de intereacutes presente en una muestra liacutequida que pasa a traveacutes de ella Debido a la variedad de
formatos (discos cartuchos y jeringas) y tipos de adsorbentes (los maacutes comunes carboacuten activo aluacutemina siacutelica gel
silicato de magnesio siacutelices enlazadas y poliacutemeros como por ejemplo estinero-divinilbenceno) o la facilidad de
automatizacioacuten y acoplamiento con otras teacutecnicas como por ejemplo una conexioacuten directa con un sistema de
Figura I4 Fundamentos teoacutericos de la LLE [25]
11
Capiacutetulo I Introduccioacuten
cromatografiacutea este meacutetodo le fue ganando terreno a la LLE Otra ventaja muy importante de la SPE frente a la
LLE es la disminucioacuten en la cantidad de disolvente orgaacutenico empleada Cada vez se va innovando maacutes sobre esta
teacutecnica llegando a encontrarse fases adsorbentes formadas por poliacutemeros capaces de retener en un uacutenico
cartucho un amplio abanico de analitos lipofiacutelicos o hidrofoacutebicos aacutecidos baacutesicos o neutros [26]
El fundamento de esta extraccioacuten como se puede en la Figura I6
consiste en cuatro etapas acondicionamiento adiccioacuten de muestra
retencioacuten y elucioacuten de los analitos de intereacutes En primer lugar antes
de empezar la extraccioacuten se requiere una etapa de acondicionamiento
para preparar el adsorbente haciendo pasar un poco de disolvente
para asiacute interaccionar mejor con la muestra Luego se hace pasar la
muestra liacutequida por la fase soacutelida Idealmente el adsorbente retiene
los analitos selectivamente a medida que va pasando la muestra y la
matriz pasa sin ser retenida Por uacuteltimo los analitos se eluyen del
adsorbente con un disolvente con el que tenga mayor afinidad [27]
23 Teacutecnicas de microextraccioacuten
231 Microextraccioacuten en fase soacutelida (SPME)
En la microextraccioacuten en fase soacutelida (SPME) se utilizan fibras de siacutelice fundida revestidas con un poliacutemero en un
disentildeo en forma de jeringa para la extraccioacuten de los analitos de intereacutes El principio por el que se rige esta
extraccioacuten es el reparto del analito entre la matriz de la muestra y el revestimiento de la fibra mediante un proceso
no competitivo Se trata de un meacutetodo que cuenta con muchas ventajas ya que se elimina completamente el uso de
disolventes y aparte no son necesarios voluacutemenes de muestra grandes pero tambieacuten cuenta con algunas
desventajas ya que tanto la capacidad como la sensibilidad se ven limitadas [29]
En la figura I7 podemos ver las etapas de la extraccioacuten En un
vial cerrado con una caacutepsula y un seacuteptum tenemos la muestra
liacutequida o bien soacutelida que contenga los analitos de intereacutes
volaacutetiles Con la jeringa se perfora el seacuteptum y una vez dentro
se acciona el eacutembolo para la exposicioacuten de la fibra con los
analitos introducieacutendola en la muestra liacutequida o en su defecto
en el espacio de cabeza para la extraccioacuten de analitos volaacutetiles
de una muestra soacutelida Despueacutes de la extraccioacuten dentro del vial
Figura I6 Etapas de una SPE [28]
Figura I7 Etapas de una SPME [30]
12
Capiacutetulo I Introduccioacuten
la fibra se introduce de nuevo en la jeringa y se retira del vial [27]
232 Microextraccioacuten en fase liacutequida (LPME)
La microextraccioacuten en fase liacutequida se desarrolloacute como una alternativa a la LLE para la reduccioacuten en la cantidad de
disolventes orgaacutenicos siendo rentable tanto para el medioambiente como econoacutemicamente Entre las modalidades
maacutes populares de esta teacutecnica se encuentran microextraccioacuten con gota suspendida (SDME) y microextraccioacuten
liacutequido-liacutequido dispersiva (DLLME) En la SDME una gota de disolvente orgaacutenico es expuesta al espacio de
cabeza situado sobre una muestra en un vial dicha gota es suspendida del extremo de una microjeringa Por otro
lado la DLLME sobre una muestra acuosa se inyecta un pequentildeo volumen de una mezcla de disolventes en la
cual es dispersada formando una solucioacuten en la que se establece el equilibrio El disolvente de extraccioacuten debe
presentar una densidad inferior a la de la muestra para facilitar su recuperacioacuten normalmente despueacutes de
centrifugar el vial doacutende se realiza la extraccioacuten [31]
24 QuEChERS
La extraccioacuten QuEChERS de las palabras en ingleacutes Quick Easy Cheap Effective Rugged and Safe es un meacutetodo
de extraccioacuten que se desarrolloacute entre 2000 y 2002 para el anaacutelisis de pesticidas Como su nombre indica raacutepido
faacutecil barato eficaz robusto y seguro son las principales
caracteriacutesticas de esta preparacioacuten de muestra Se realiza en dos
etapas en primer lugar una extraccioacuten simple y una segunda fase
de purificacioacuten En la primera etapa tenemos el vial con la
muestra en el cual se antildeade un disolvente generalmente
acetonitrilo para la extraccioacuten de los analitos de intereacutes en
presencia de diferentes sales (en el meacutetodo original se utiliza
sulfato de magnesio y cloruro de sodio) para facilitar la separacioacuten
de las fases En la segunda parte se realiza la purificacioacuten de la
fraccioacuten del extracto orgaacutenico Para eso se lleva a cabo una
limpieza de los analitos eliminando el agua y los compuestos
presentes en la matriz de la muestra empleando un adsorbente PSA (amina primaria y secundaria) C18 carboacuten
negro grafitizado (GCB) o una combinacioacuten de eacutestas [32]
Figura I8 Etapas de QuEChERS [33]
13
Capiacutetulo I Introduccioacuten
3 METODOLOGIacuteA ANALIacuteTICA PARA LA DETERMINACIOacuteN DE PESTICIDAS
31 Meacutetodos de GC-MS (MSMS)
La combinacioacuten de cromatografiacutea de gases (GC) teacutecnica de separacioacuten con espectrometriacutea de masas (MS) como
sistema de deteccioacuten representa un potente meacutetodo para la identificacioacuten determinacioacuten y cuantificacioacuten de
analitos orgaacutenicos en concentraciones traza presentes en muestras complejas Esta teacutecnica de anaacutelisis cuenta con
muchas ventajas en sensibilidad multifuncionalidad buena reproducibilidad robustez asiacute como facilidad en el
manejo pero con una gran desventaja este meacutetodo no es apto para ser utilizado con todos los analitos sino que
se ve limitado a aquellos que sean termoestables y no se descompongan a temperaturas elevadas antes de ser
volatilizados La muestra es introducida a traveacutes del inyector en el cromatoacutegrafo de gases doacutende impulsada por
una corriente de gas inerte como fase moacutevil pasa a traveacutes de la columna que contiene la fase estacionaria en la
cual se separan los compuestos debido a una distribucioacuten de estos entre fase moacutevil-fase estacionaria Mediante
una interfase son introducidos para su deteccioacuten en el espectroacutemetro de masas que cuenta con una fuente de
iones analizador de masas y un detector [34]
La combinacioacuten de analizadores de masas en taacutendem (MSMS) como sistema de deteccioacuten en GC es una teacutecnica
altamente selectiva mejorando la sensibilidad y la relacioacuten sentildeal-ruido en los espectros experimentando una
mejora por lo que se logran unos liacutemites de deteccioacuten inferiores Esta teacutecnica GC-MSMS comprende maacutes
pasos despueacutes de la separacioacuten por cromatografiacutea se lleva a cabo la deteccioacuten con MSMS que consta de varias
etapas generacioacuten de iones en la fuente de ionizacioacuten seleccioacuten de los iones precursores de una determinada
masa disociacioacuten causada por colisioacuten con moleacuteculas de gas inerte de los iones precursores y por uacuteltimo el
anaacutelisis de los fragmentos en relacioacuten a su masacarga (mz) En el caso de que un espectro de MS no permita
confirmar la identidad de un determinado compuesto quiacutemico la obtencioacuten de su espectro de MSMS permite
mejorar la confianza en su identificacioacuten [36]
Figura I9 Acoplamiento GC-MS [35]
14
Capiacutetulo I Introduccioacuten
32 Meacutetodos LC-MS (MSMS)
La teacutecnica de LC-MS se desarrolloacute para minimizar las desventajas del acoplamiento GC-MS y asiacute resolver los
problemas que este uacuteltimo acarreaba con los analitos termolaacutebiles permitiendo el anaacutelisis de eacutestos sin tener que
realizar una etapa previa de derivatizacioacuten La interfase de unioacuten de cromatografiacutea liacutequida (LC) con espectrometriacutea
de masas (MS) acarrea una dificultad significativa siendo responsable de transformar los analitos que se
encontraban en la fase moacutevil liacutequida en iones en fase gas sin que se produzca su degradacioacuten teacutermica La
sensibilidad de las determinaciones por LC-MS va a depender de la interfase empleada Las principales interfases
empleadas actualmente son las ionizaciones a presioacuten atmosfeacuterica electrospray (ES) e ionizacioacuten quiacutemica a
presioacuten atmosfeacuterica (APCI) [37]
Con los antildeos la cromatografiacutea liacutequida se ha ido innovando y mediante la disminucioacuten del tamantildeo de partiacutecula en
la columna se fue mejorando la eficiencia asiacute como aumentando la selectividad y resolucioacuten del pico en el
cromatograma Para este nuevo sistema llamado UPLC Ultra-Performance Liquid Chromatography se desarrolloacute
una nueva instrumentacioacuten capaz de trabajar a altas presiones generando flujos mayores sin peacuterdidas de
resolucioacuten utilizando inyectores automaacuteticos maacutes raacutepidos y detectores con mayor velocidad de adquisicioacuten de
datos disminuyendo asiacute el tiempo de anaacutelisis [39]
33 Espectrometriacutea de masas
La espectrometriacutea de masas es el meacutetodo de deteccioacuten y cuantificacioacuten maacutes fiable a la hora de la determinacioacuten de
compuestos en matrices complejas (tales como alimentos) ya que otros detectores maacutes tradicionales como UV-
visible o fluorescencia cuentan con una gran incertidumbre en los resultados llegando incluso a ofrecer falsos
Figura I10 Acoplamiento LC-MS [38]
15
Capiacutetulo I Introduccioacuten
positivos o negativos Un espectrometro de masas cuenta con un dispositivo de introduccioacuten de muestra una
caacutemara de ionizacioacuten un sistema para la aceleracioacuten de los iones uno o varios analizadores de masas y un detector
[40]
El fundamento de la espectrometriacutea de masas se basa en la separacioacuten de iones en base a la relacioacuten masacarga
(mz) El proceso consta fundamentalmente de cuatro etapas La
primera es la ionizacioacuten de la muestra los iones formados se aceleran
debido a la accioacuten de un campo eleacutectrico variable separacioacuten de los
iones seguacuten su masacarga deteccioacuten de los iones y produccioacuten de la
sentildeal eleacutectrica El analizador de masas es el encargado de la separacioacuten
de los iones en funcioacuten a su mz entre los que maacutes destacan
analizador de masas cuadrupolar que dispersa simultaacuteneamente todos
los iones en funcioacuten de la relacioacuten mz analizador de masas de
tiempo de vuelo (TOF) consta de un tubo a alto vaciacuteo sobre el que no
actuacutea ninguacuten campo eleacutectrico al cual llegan todos los iones acelerados con la misma energiacutea cineacutetica y en el tubo
las velocidades variacutean seguacuten mz y analizador de trampa de iones en doacutende los iones gaseosos quedan aislados
durante largos periacuteodos de tiempo por la accioacuten del campo eleacutectrico [41]
4RESUMEN BIBLIOGRAacuteFICO DE LAS TEacuteCNICAS DE EXTRACCIOacuteN Y
DETERMINACIOacuteN DE PESTICIDAS EN VINO
En la bibliografiacutea se han descrito diversas teacutecnicas y diferentes combinaciones entre teacutecnicas de extraccioacuten y
distintas teacutecnicas de cuantificacioacuten e identificacioacuten para esos analitos Entre estas teacutecnicas los valores de los liacutemites
de cuantificacioacuten (LOQs) y las recuperaciones relativas pueden diferir en el resultado en un rango de valores asiacute
como el tiempo total empleado para el anaacutelisis y para la preparacioacuten de la muestra
Por lo general el meacutetodo de extraccioacuten de los analitos de intereacutes maacutes empleado es la extraccioacuten en fase soacutelida
(SPE) la cuaacutel le ha estado ganando terreno a la extraccioacuten liacutequido-liacutequido aunque tambieacuten se estaacute viendo cada vez
maacutes desplazada debido al creciente uso de la teacutecnica QuEChERS
Figura I11 Etapas de la espectrometriacutea de masas [42]
16
Capiacutetulo I Introduccioacuten
En el estudio de ECONOMOU et al [43] realizado en el antildeo 2009 en Grecia se empleoacute la extraccioacuten en fase
soacutelida con deteccioacuten en cromatografiacutea de liacutequidos acoplada a espectrometriacutea de masas en taacutendem (SPE-LC-ESI-
MSMS) Para la preparacioacuten de la muestra diluyeron 10 mL de vino (tanto blanco como tinto) a un volumen
final de 100 mL con agua ultrapura antes de la SPE Determinaron las recuperaciones de la extraccioacuten para dos
niveles de concentracioacuten 0010 y 0050 mgL realizando 8 medidas diarias durante 3 diacuteas consecutivos
encontraacutendose unos valores que variacutean dentro del rango 70-110 para todos los pesticidas en los dos niveles Para
la determinacioacuten y cuantificacioacuten de 46 pesticidas emplearon la teacutecnica de cromatografiacutea de liacutequidos con
espectrometriacutea de masas con un volumen de inyeccioacuten de 20 microL y un flujo de fase moacutevil de 02 mLmin
aclopada a espectrometriacutea de masas en taacutendem
Con la misma teacutecnica de extraccioacuten PELAJIĆ et al [45] durante el antildeo 2015 en Croacia llevaron a cabo la
determinacioacuten de 25 residuos de plaguicidas en vino tinto El meacutetodo que desarrollaron para dicha finalidad fue el
acoplamiento SPE-GC-MS Para la preparacioacuten de la muestra emplearon 10 mL de vino diluidos 11 con agua
ultrapura hasta un volumen final de 20 mL Calcularon las recuperaciones de la extraccioacuten y se encontroacute un rango
para todos los pesticidas en las muestras de 70-120 Para la determinacioacuten en cromatografiacutea de gases-
espectrometriacutea de masas se empleoacute un volumen de inyeccioacuten de 5 μL y un flujo de fase moacutevil de 10 mLmin
Mediante el acoplamiento de teacutecnicas SPE dispersiva-GC-MS WALORCZYK et al [48] en el antildeo 2011 en
Polonia llevaron a cabo la cuantificacioacuten de 160 pesticidas en diferentes clases de vino tinto rosado y blanco Con
10 g de vino y 10 mL de acetonitrilo se realizaron pruebas de recuperacioacuten en la fase de extraccioacuten para vino
tinto con los niveles de concentracioacuten 001 005 y 02 mgkg y para los vinos rosado y blanco con el nivel de
concentracioacuten 005mgkg y encontraron que a todos los niveles de concentracioacuten los valores de recuperacioacuten
rondan el rango 80-110 Para la teacutecnica cromatograacutefica se utilizoacute un volumen de inyeccioacuten de 5 microL
El acoplamiento LLE-SPE-LCDAD fue desarrollado por GONZAacuteLEZ-RODRIacuteGUEZ et al [50] en el antildeo
2010 en la provincia de Orense para la determinacioacuten de nuevos fungicidas propuestos para combatir el hongo
que provoca la enfermedad del mildium En la preparacioacuten de la muestra emplearon 15 mL de vino blanco para la
extraccioacuten en la cual fueron calculadas las recuperaciones relativas para dos niveles de concentracioacuten 005 y 05
mgkg en donde se establece un rango de entre 70-110 para todos los analitos Para la determinacioacuten mediante
cromatografiacutea de liacutequidos se empleoacute un volumen de inyeccioacuten de 2 μL y como meacutetodo de deteccioacuten utilizaron un
detector de diodos array
La microextraccioacuten sorptiva en fase soacutelida fue empleada en la publicacioacuten de FONTANA et al [44] junto con un
acoplamiento entre cromatografiacutea de liacutequidos y espectrometriacutea de masas para la determinacioacuten de 15 fungicidas
en vino realizada durante el 2010 en el noroeste de Espantildea Para la preparacioacuten de la muestra emplearon 10 mL
17
Capiacutetulo I Introduccioacuten
de vino diluiacutedos con el mismo volumen de agua ultrapura y un sorbente en forma de disco de silicona con un
volumen de 12 microL La recuperacioacuten de la extraccioacuten se calculoacute para vino tinto (Menciacutea) y vino blanco (Godello)
realizando tres replicas dentro de un mismo diacutea para los niveles de concentracioacuten 10 y 50 ngmL y nueve reacuteplicas
realizando el anaacutelisis en tres diacuteas consecutivos para el nivel de concentracioacuten de 25 ngmL y los resultados
obtenidos dan unos valores de recuperacioacuten dentro del rango 75-117 En el sistema LC-QTOF-MS el volumen
de inyeccioacuten fue de 15 microL
El otro meacutetodo de extraccioacuten mencionado anteriormente es QuEChERS estaacute en auge como meacutetodo de extracioacuten
de residuos de pesticidas en matrices como la del vino o la uva ya que incrementa la velocidad del anaacutelisis y reduce
el efecto de matriz BUERGE et al [46] seguido de una deteccioacuten mediante GC-MSMS realizaron una estapa
de extraccioacuten QuEChERS con alguna modificacioacuten acetato de sodio en lugar de cloruro soacutedico y acetato de etilo
en lugar de acetonitrilo utilizando 5 g de uva para la determinacioacuten de residuos de 4 pesticidas durante el antildeo
2016 Las recuperaciones de extraccioacuten resultaron ser valores entre 91-149 en uva a distintos niveles de
concentracioacuten 005 05 y 5 mgkg
Para la determinacioacuten de Ametoctradin HU et al [47] llevaron a cabo una extraccioacuten QuEChERS empleando 10
g de uva con deteccioacuten mediante el acoplamiento UPLC-MSMS utilizando un volumen de inyeccioacuten de 5 μL y
un flujo de fase moacutevil de 03 mLmin Las recuperaciones de la extraccioacuten se calcularon para tres niveles de
concentracioacuten 1 10 100 μgL de dos formas distintas en tres diacuteas consecutivos realizando 5 reacuteplicas al diacutea o en
dentro de un mismo diacutea realizando 15 reacuteplicas los resultados de todos los caacutelculos se encuentran dentro del rango
818-1001
Siguiendo con el mismo modo de extraccioacuten GUO et al [49] publicaron sus estudios para la determinacioacuten de
50 pesticidas y 12 adulterantes en vino tinto Para la extraccioacuten QuEChERS se utilizaron 10 mL de vino tinto con
10 mL de acetonitrilo y calcularon las recuperaciones para tres niveles de concentracioacuten 50 100 y 250 ngmL
encontraacutendose un rango de valores entre 75-120 El meacutetodo de deteccioacuten se llevoacute a cabo mediante un anaacutelisis
directo en tiempo real junto con espectrometriacutea de masas en tandem con un cuadrupolo (DART-MSMS) la
teacutecnica DART es un meacutetodo raacutepido para cribar y cuantificar los analitos de estudio que prescinde de la etapa de
separacioacuten cromatograacutefica
A continuacioacuten se recogen en la Tabla I3 los liacutemites de cuantificacioacuten (LOQs) de los analitos de intereacutes en este
trabajo caacutelculados por los diferentes meacutetodos encontrados en bibliografiacutea citados anteriormente en este apartado
18
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Tabla I3 LOQs de los analitos de intereacutes descritos para los distintos meacutetodos encontrados en la bibliografiacutea
Compuesto LOQs
Compuesto LOQs
V Blanco V Tinto Uva V Blanco V Tinto Uva
AME - - 0032μgkg[47] MET 86 μgL[43]
22 μgL[44]
89 μgL[43]
22 μgL[44]
5 μgL[45]
259 ngmL[49]
001mgkg[48]
BEN 02 μgL[44]
0001 mgL[50]
02 μgL[44]
001 μgL[45]
280ngmL[49]
005 mgkg[48] MYC 30 μgL[43]
08 μgL[44]
36 μgL[43]
10 μgL[44]
025 μgL[45]
331ngmL[49]
001 mgkg[48]
BOS 0065 mgL[50] 05 μgL[45]
1076 ngmL[49] 001 mgkg[48] PEN
56 μgL[43]
05 μgL[44]
49 μgL[43]
04 μgL[44]
220ngmL[49]
001 mgkg[48]
CAR - 386 ngmL[49] - PYC 0003mgL[50] 07 μgL[45] 001 mgkg[48]
CYP 15 μgL[43]
04 μgL[44]
0001 mgL[50]
22 μgL[43]
06 μgL[44]
312 ngmL[49]
001 mgkg[48] PYM 17 μgL[43] 22 μgL[43]
10 μgL[45] 001 mgkg[48]
DIM 18 μgL[43] 20 μgL[43] 001 mgkg[48] TEC 03 μgL[44]
03 μgL[44]
10 μgL[45]
160ngmL[49]
001 mgkg[48]
FEH 17 μgL[43] 22 μgL[43]
938 ngmL[49] 001 mgkg[48] TEF - 876ngmL[49] -
FEP - - 002mgkg[46] TBZ 15μgL [43] 29μgL[43] 001 mgkg[48]
FLU 005 μgL[45] TME - 25 μgL[45] 001 mgkg[48]
IMI 21 μgL[43] 22 μgL[43]
225 ngmL[49] - THI-M 92 μgL[43] 89 μgL[43] -
IPR 07 μgL[44] 07 μgL[44] 001 mgkg[48] TRI 10 μgL[44] 12 μgL[44] 001 mgkg[48]
MAN 0011 mgL[50] - -
5 DISTRIBUCIOacuteN DE PESTICIDAS EN VINOS COMERCIALES
En algunos de los meacutetodos descritos en el apartado anterior se procesaron vinos comerciales encontraacutendose
resultados positivos para muchos residuos de pesticidas y algunos hasta en gran concentracioacuten
ECONOMOU et al [43] mediante el meacutetodo LC-ESI-MSMS realizaron el anaacutelisis de 60 muestras de vino tinto
y blanco recogidos en supermercados locales en Grecia a lo largo de un antildeo El meacutetodo se habiacutea desarrollado
19
Capiacutetulo I Introduccioacuten
para la determinacioacuten de 46 pesticidas pero la mayoriacutea se encuentran con una concentracioacuten por debajo de
001mgL solo ocho plaguicidas se obtuvieron con resultados de concentracioacuten mayores Se muestran los
resultados en la Tabla I4 de los analitos de intereacutes en este estudio
Tabla I4 Nuacutemero de muestras positivas de distintos pesticidas en el anaacutelisis de 60 muestras de vino [43]
Compuesto Positivos con concentracioacuten entre 001-01
mgL
Positivos con concentracioacuten entre 01-1
mgL
PYM 2 (3) 2 (3)
MYC 2 (3) 0 (0)
CAR 11 (18) 7 (12)
THI-M 7 (12) 5 (8)
FEH 5 (8) 0 (0)
MET 1 (2) 0 (0)
Mediante el meacutetodo de microextraccioacuten en fase soacutelida-LC-TOF-MS FONTANA et al [44] aplicaron el
desarrollo del procedimiento a un total de 12 vinos joacutevenes elaborados en el 2010 y correspondientes a diferentes
denominaciones geograacuteficas del noroeste de Espantildea En la Tabla I5 se muestran los datos que han obtenido
Tabla I5 Determinacioacuten de fitosanitarios en vinos comerciales mediante Microextraccioacuten en fase soacutelida-LC-TOF-MS
Valores de concentracioacuten en ngmL [44]
Pesticidas
W 1
Albarintildeo
W5
Ribeiro
W6
Valdeorras
R1
Ribeira Sacra
R3
Ribeiro
R4
Valdeorras
MET 404plusmn06 223plusmn05 311plusmn007 25plusmn03 31plusmn03 74plusmn10
TRI nd nd 36plusmn06 nd nd ltLOQ
IPR 394plusmn03 324plusmn02 324plusmn02 071plusmn007 31plusmn02 28plusmn05
MYC nd nd nd ltLOQ 39plusmn02 nd
TEC 25plusmn01 nd nd nd nd nd
CYP 179plusmn08 ltLOQ ltLOQ 562plusmn002 083plusmn001 nd
BEN 042plusmn001 nd ltLOQ nd 032plusmn001 ltLOQ
ndNo detectados ltLOQ por debajo del liacutemite de cuantificacioacuten del meacutetodo los coacutedigos W y R corresponden respecti-vamente a los vinos blanco y tinto
20
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Por uacuteltimo PELAJIĆ et al [45] aplicaron su meacutetodo SPE dispersiva-GC-MS mediante el cual determinaron 25
residuos de plaguicidas en vino tinto a un total de 32 muestras de vino adquiridos en supermercados locales de
Croacia pero de diversos oriacutegenes de procedencia Los resultados que han obtenido se muestran en la Tabla I6
en doacutende un total de 15 plaguicidas han sido detectados y 7 de los cuales se encontraban en una alta
concentracioacuten
Tabla I6 Resultados de los vinos con positivos en pesticidas y sus concentraciones [45]
Vino Paiacutes Residuos de pesticidas (mgKg)
Tinto Francia DIM (0013) MET (0009) IPR (001)
Tinto Alemania BOS (0011)
Tinto Alemania IPR (0009)
Tinto Macedonia MET (0015)
Tinto Moldavia IPR (0008)
Tinto Polonia MET (004)
Tinto Rumania PYM (0058)
Tinto Espantildea TRI (0005) MET (0011)
Tinto Estados Unidos BOS (001)
Rosado Francia BOS (0005)
Blanco Chile TEC (0008)
Blanco Georgia MET (0057)
Blanco Alemania DIM (001) IPR (0054) PYM (0056)
Blanco Sudaacutefrica DIM (0011) IPR (0011)
21
Capiacutetulo II Objetivos y discusioacuten
CAPIacuteTULO II OBJETIVOS Y DISCUSIOacuteN
El objetivo principal que se persigue en este trabajo es el desarrollo de un meacutetodo analiacutetico raacutepido basado en la
extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) y deteccioacuten mediante cromatografiacutea de liacutequidos en la modalidad de UPLC
acoplada a la espectrometriacutea de masas en taacutendem (UPLC-MSMS) para la determinacioacuten multianalito de residuos
de fitosanitarios principalmente fungicidas aunque tambieacuten alguacuten insecticida en muestras de vino blanco y tinto
Para llevar a cabo la finalidad de lo dicho se consideran unos objetivos maacutes especiacuteficos
Minimizar la manipulacioacuten de la muestra para asiacute reducir la cantidad de disolventes y tiempo empleado
Optimizacioacuten de los factores que afectan en la extraccioacuten en la SPE tales como tipo y cantidad de
adsorbente volumen de eluyente etc
Estudio de las condiciones en UPLC-MSMS para una separacioacuten y cuantificacioacuten oacuteptimas
Caracterizacioacuten y validacioacuten del meacutetodo propuesto
Por uacuteltimo una vez cumplidos todos los objetivos anteriores y fijadas las condiciones oacuteptimas el meacutetodo
estudiado se aplica en el anaacutelisis de muestras de vino comercial (blanco y tinto) para determinar si se encuentran
residuos presentes asiacute como conocer en queacute concentracioacuten se encuentran los pesticidas objeto de este estudio
22
Capiacutetulo III Parte experimental
CAPIacuteTULO III PARTE EXPERIMENTAL
1 MATERIAL Y REACTIVOS
11 Material
Material de vidrio de uso comuacuten en el laboratorio vasos de precipitados matraces aforados etc
Micropipetas automaacuteticas de 20-200 microL 20-200 microL 100-1000 microL 1000-5000 microL Eppendorf
Puntas de plaacutestico para micropipetas
Encapsulador y desencapsulador
Soportes y pinzas
Viales de 15 mL transparentes para muestreador automaacutetico de cromatografiacutea (Sugelabor)
Caacutepsulas de aluminio con seacuteptum de Tefloacuten (Sugelabor) y tapones pre-slit para viales
Tubos y conectores de tefloacuten
Cartuchos de divinilbenceno-N-vinilpirrolidona 200 mg Oasis HLB Waters
Cartuchos de divinilbenceno-N-vinilpirrolidona funcionalizados con grupos amina cuaternaria 150 mg
Oasis MAX Waters
Cartuchos de divinilbenceno-N-vinilpirrolidona 60 mg Oasis HLB Waters
12 Reactivos y disolventes
Agua ultrapura Milli-Q
Aacutecido foacutermico (Sigma Aldrich) 95
Acetonitrilo (LichrosolvregMerck) Gradient grade for liquid chromatography
Metanol (LichrosolvregMerck) Gradient grade for liquid chromatography
Etanol (LichrosolvregMerck) Gradient grade for liquid chromatography
13 Patrones
Ametoctradin (AME) Dr Ehrenstrorfer 990
Benalaxyl (BEN) Pestanal Sigma- Aldrich 999
23
Capiacutetulo III Parte experimental
Boscalid (BOS) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Carbendazim (CAR) Pestanal Sigma- Aldrich 992
Cyprodinil (CYP) Pestanal Sigma- Aldrich 998
Dimethomorph (DIM) mezcla de isoacutemeros E + Z Pestanal Sigma- Aldrich 989
Fenhexamid (FEH) Pestanal Sigma- Aldrich 997
Fenpropidin (FEP) Dr Ehrenstrorfer 980
Fluopicolide (FLU) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Imidacloprid (IMI) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Iprovalicarb (IPR) mezcla de isoacutemeros Pestanal Sigma- Aldrich 985
Mandipropamid (MAN) Pestanal Sigma- Aldrich 991
Metalaxyl (MET) Pestanal Sigma- Aldrich 990
Myclobutanil (MYC) Pestanal Sigma- Aldrich 994
Penconazole (PEN) Pestanal Sigma- Aldrich 991
Pyraclostrobin (PYC) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Pyrimethanil (PYM) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Tebuconazol (TEC) Pestanal Sigma- Aldrich 996
Tebufenozide (TEF) Dr Ehrenstrorfer 988
Thiabendazole (TBZ) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Thiamethoxam (TME) Pestanal Sigma- Aldrich 996
Thiophanate-methyl (THI-M) Dr Ehrenstrofer 990
Triadimenol (TRI) Mezcla de diastereoisoacutemeros Pestanal Sigma- Aldrich 994
14 Patrones internos
Carbendazim-d3 (CAR-d3) Pestanal Sigma- Aldrich 998
Cyprodinil-d5 (CYP-d5) Pestanal Sigma- Aldrich
Imidacloprid-d4 (IMID-d4) Pestanal Sigma- Aldrich
Metalaxyl 13C6 (MET13C6) Pestanal Sigma-Aldrich 99
24
Capiacutetulo III Parte experimental
15 Gases
Nitroacutegeno 99999 como gas de colisioacuten en el espectroacutemetro de masas
Nitroacutegeno en los sistemas de concentracioacuten y secado por corriente de nitroacutegeno de los cartuchos SPE
2 INSTRUMENTACIOacuteN
Balanza analiacutetica de precisioacuten Sartorius
Granatario Sartorius
Bantildeo de ultrasonidos P-Selecta
Equipo de purificacioacuten de agua Millipore modelo Milli-Q gradient A-10ZMQSSVOT4
Estacioacuten de concentracioacuten por corriente de nitroacutegeno Mini-Vap Supelco
Sistema de secado de cartuchos de SPE por corriente de nitroacutegeno VisiDry Supelco
Sistema distribuidor de vaciacuteo Visiprep reg Supelco
Cromatoacutegrafo de liacutequidos de ultra-alta resolucioacuten Waters AcquityUPLC reg y espectroacutemetro de masas
Acquity TQD con analizador de triple quadrupolo (QqQ) equipado con una fuente de ionizacioacuten a
presioacuten atmosfeacuterica del tipo Z-spray (ESI)
3 PREPARACIOacuteN DE LAS DISOLUCIONES
Los patrones de pesticidas se prepararon individualmente a partir de los compuestos soacutelidos comerciales por
pesada excepto en el caso del fenpropidin (FEP) que se preparoacute a partir del compuesto liacutequido comercial Estos
compuestos soacutelidos se disolvieron en metanol y se obtuvieron unas disoluciones iniciales con concentraciones
recogidas en la Tabla III1
25
Capiacutetulo III Parte experimental
Tabla III1 Concentracioacuten de las disoluciones patroacuten stock
Compuesto Concentracioacuten (microgmL) Compuesto Concentracioacuten (microgmL)
AME 102201 MET 118912
BEN 138330 MYC 102017
BOS 99474 PEN 129791
CAR 17105 PYC 104581
CYP 131075 PYM 141386
DIM 103009 TEC 134729
FEH 99584 TEF 137769
FEP 100000 TBZ 105928
FLU 126859 TME 112283
IMI 101123 THI-M 124202
IPR 106739 TRI 118933
MAN 101021
4 LAVADO DEL MATERIAL
La limpieza del material de vidrio utilizado en el laboratorio se realizoacute utilizando jaboacuten y aclarando con agua de
grifo Luego en primer lugar se realiza un enjuague con agua Milli-Q finalmente un segundo enjuague con
acetona para eliminar posibles restos de compuestos orgaacutenicos y se deja secar sobre papel
Para la limpieza de los conectores de tefloacuten empleados en el proceso de SPE se introducen en un vaso de
precipitados con metanol y este en un bantildeo de ultrasonidos durante 10 minutos Al finalizar con el bantildeo de
ultrasonidos se realiza un enjuague con acetona y se pone a secar
5 EXTRACCIOacuteN DE MUESTRAS MEDIANTE SPE
El meacutetodo de extraccioacuten utilizado para la determinacioacuten de pesticidas fue la extraccioacuten en fase soacutelida (SPE)
mediante cartuchos Oasis HLB de 200 mg A continuacioacuten se describe el protocolo de extraccioacuten en las
condiciones oacuteptimas
26
Capiacutetulo III Parte experimental
1 Acondicionamiento del cartucho Oasis HLB de 200 mg con 2 mL de acetonitrilo seguidos de otros 2 mL de
vino sinteacutetico formado por la mezcla etanolagua MilliQ (1288)
2 Paso de la muestra 2 mL de vino diluiacutedos con 2 mL de agua MilliQ a traveacutes del cartucho por gravedad
3 Lavado del cartucho con 2 mL de agua MilliQ
4 Secado del cartucho durante 45 minutos en el VisiDry mediante el paso de una corriente de nitroacutegeno
5 Elucioacuten del cartucho con la mezcla metanolacetonitrilo en proporcioacuten 2080 hasta un volumen final de 2
mL
6 Anaacutelisis mediante cromatografiacutea liacutequida acoplada a espectrometriacutea de masas en taacutendem UPLC-MSMS
(volumen de inyeccioacuten 15 microL)
Representacioacuten esquematizada en la Figura III1
Figura III1 Extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) de las muestras de vino
27
Capiacutetulo III Parte experimental
6 CONDICIONES DE DETERMINACIOacuteN MEDIANTE UPLC-MSMS
En la Tabla III2 se indican las condiciones utlizadas en la determinacioacuten de los pesticidas de intereacutes mediante
LC-MSMS y en la Tabla III3 se muestra el gradiente de la fase moacutevil utilizado para la separacioacuten
cromatograacutefica
Tabla III2 Condiciones experimentales de determinacioacuten en LC-MSMS
UPLC Acquity UPLC-I-Class IVD System
bull Columna cromatograacutefica Zorbax Eclipse Plus C18 Rapid Resolution HD
Fase estacionaria C18
Dimensiones 21 x 50 mm
Tamantildeo de partiacutecula 18 microm
Temperatura del horno 40ordmC
bull Inyector
Volumen de inyeccioacuten 15 microL
bull Fase moacutevil
Flujo 04 mLmin
Fase acuosa (A) Agua MilliQ con 01 aacutecido foacutermico
Fase orgaacutenica (B) Acetonitrilo con 01 aacutecido foacutermico
MSMS WatersXevo TQD
Modo de ionizacioacuten ESI positivo
Voltaje del capilar 15 kV
Voltaje de cono 50 V
Temperatura de gas de secado (N2) 450ordmC
Flujo de gas de secado (N2) 1000 Lh
Modo de adquisicioacuten Centroide
Tabla III3 Gradiente de fase moacutevil utilizado en la separacioacuten cromatograacutefica (LC)
Tiempo min 0 13 28 64 75 76 10
A 98 50 50 0 0 98 98
B 2 50 50 100 100 2 2
28
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
CAPIacuteTULO IV RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
1 IDENTIFICACIOacuteN DE LOS COMPUESTOS
Para empezar el estudio en primer lugar se realizoacute la caracterizacioacuten de las condiciones de determinacioacuten de los
analitos en el modo Multiple Reaction Monitoring (MRM) mediante UPLC-ESI-MSMS Para llevarla a cabo se
tomaron patrones individuales de cada fitosanitario y mediante infusioacuten se estudiaron las posibles transiciones y
voltajes oacuteptimos para su determinacioacuten (Tabla IV1)
La ionizacioacuten por electrospray (ESI) se estudioacute tanto en modo positivo como en modo negativo encontraacutendose
que para todos los pesticidas de nuestro intereacutes se obteniacutea sentildeal en el modo positivo mientras el modo negativo
no presentaba respuesta significativa
A continuacioacuten se estudia el efecto del voltaje de cono en la respuesta del ioacuten molecular [M+H]+ aumentaacutendolo
hasta alcanzar el valor maacuteximo de la sentildeal correspondiente a dicho ioacuten y luego se optimiza la energiacutea de colisioacuten
variaacutendola para cada analito hasta obtener la sentildeal de mayor intensidad para cada uno de los iones producto Por
uacuteltimo una vez optimizado el voltaje de cono y la energiacutea de colisioacuten se seleccionan las dos transiciones maacutes
intensas para llevar a cabo la cuantificacioacuten y cualificacioacuten de cada analito en modo MRM Este procedimiento se
realizoacute para la totalidad de los compuestos confirmando los datos obtenidos con los facilitados por la base de
datos Quanpedia que estaacute disponible en el software del equipo utilizado para algunos de los compuestos
considerados
Compuesto Tr (min) Ion precursor (mz Da)
Voltaje de cono (V)
Ion producto 1 (CEv)
cuantificacioacuten
Ion producto 2 (CEv)
cualificacioacuten
Relacioacuten IP2IP1
AME 325 2760 60 176 (35) 70 (50) 016
BEN 485 3261 26 148 (20) 91 (34) 067
BOS 387 3429 41 140 (20) 307 (20) 011
CAR 167 1921 33 160 (18) 132 (28) 014
CYP 311 2260 56 93 (33) 108 (25) 061
DIM 322 3881 40 301 (20) 165 (30) 057
FEH 386 3021 41 97 (22) 55 (38) 044
FEP 257 2742 55 147 (28) 86 (28) 093
FLU 401 3830 40 173 (20) 365 (15) 010
IMI 218 2561 34 209 (15) 175 (20) 091
IPR 358 3211 28 119 (16) 203 (10) 042
Tabla IV1 Tiempos de retencioacuten (Tr) relacioacuten de iones precursores (mz) voltaje de cono (V) energiacuteas de colisioacuten (CE) y relacioacuten de intensidades entre transiciones (IP2IP1)
29
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Compuesto Tr (min) Ion precursor (mz Da)
Voltaje de cono (V)
Ion producto 1 (CEv)
cuantificacioacuten
Ion producto 2 (CEv)
cualificacioacuten
Relacioacuten IP2IP1
MAN 392 4120 25 328 (16) 125 (35) 063
MET 283 2801 26 220 (13) 192 (17) 057
MYC 365 2891 34 70 (18) 125 (32) 029
PEN 417 2840 34 70 (16) 159 (34) 031
PYC 523 3881 31 194 (12) 163 (25) 066
PYM 266 2000 51 107 (24) 82 (24) 071
TEC 397 3080 40 70 (22) 125 (40) 007
TEF 473 3531 19 133 (20) 297 (8) 072
TBZ 182 2020 51 175 (25) 131 (30) 062
TME 203 2920 28 211 (12) 132 (22) 047
THI-M 257 3430 28 151 (46) 93 (19) 0001
TRI 319 2961 21 70 (10) 99 (15) 013
El dwell time para cada una de las transiciones se ajustoacute de manera automaacutetica por el software (MassLinx) con
objeto de obtener doce puntos espectrales por compuesto tomando un valor promedio de cuatro segundos como
ancho de pico a liacutenea de base
2 CARACTERIZACIOacuteN DEL PROCEDIMIENTO DE DETERMINACIOacuteN (UPLC-ESI-
MSMS)
Una vez optimizados los paraacutemetros que afectan a la separacioacuten cromatograacutefica (UPLC) y a la determinacioacuten por
espectrometriacutea de masas en taacutendem (MSMS) se lleva a cabo la evaluacioacuten de la repetibilidad de inyeccioacuten y
determinacioacuten en esas condiciones Se expresa por medio de la desviacioacuten estaacutendar relativa (RSD) paraacutemetro que
nos indica el grado de correlacioacuten que existe entre varias medidas del mismo patroacuten realizadas por el mismo
operador en el laboratorio y en el mismo equipo de medida a lo largo de un diacutea Para el estudio se realizan diez
inyecciones con volumen de 15 microL de dos patrones con distintos niveles de concentracioacuten 5 y 20 ngmL Los
datos de RSD (Tabla IV2) para las aacutereas de pico de los analitos se situacutean para el nivel de concentracioacuten 5 ngmL
en el rango 2-13 y en el nivel de concentracioacuten 20 ngmL en el rango 1-7
30
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten Tabla IV2 Desviacioacuten estaacutendar relativa (RSD) del aacuterea de pico (transicioacuten de cuantificacioacuten) para evaluar la repetivilidad del proceso de LC-MSMS
Compuesto RSD
5 ngmL
RSD
20 ngmL Compuesto
RSD
5 ngmL
RSD
20 ngmL
AME 5 2 MET 3 2
BEN 2 2 MYC 9 2
BOS 4 5 PEN 4 4
CAR 4 2 PYC 3 1
CYP 5 7 PYM 7 3
DIM 6 5 TEC 3 2
FEH 7 4 TEF 4 2
FEP 4 2 TBZ 2 1
FLU 5 3 TME 6 6
IMI 13 7 THI-M a 6
IPR 8 2 TRI 8 6
MAN 3 2
A continuacioacuten tambieacuten se evaluoacute la repetibilidad de los tiempos de retencioacuten (Tr) para diez inyecciones de
patrones a los dos niveles de concentracioacuten 5 y 20 ngmL situaacutendose las RSD para todos los compuestos en el
rango 01-03 En base a este dato la ventana de tiempo en la que se registran las transiciones de MRM de cada
compuesto se fijoacute en 05 min lo que es lo mismo 025 min alrededor del valor medio de su tiempo de retencioacuten
Por otro lado la linealidad del meacutetodo se estudioacute a nueve niveles de concentracioacuten diferentes comprendidos ente
los niveles 05 ngmL y 200 ngmL mediante la inyeccioacuten de disoluciones patroacuten de los distintos compuestos de
estudio Se realizoacute una evaluacioacuten sin y otra con patroacuten interno (IS) antildeadiendo una concentracioacuten fija de patrones
internos a nivel de 25 ngmL y pudimos observar que los resultados mejoran notablemente al realizar una
correccioacuten con el IS En la Tabla IV3 se muestran los coeficientes de determinacioacuten (R2) obtenidos al realizar la
correccioacuten mediante IS observando que para todos los compuestos excepto para THI-M y para TRI los
coeficientes de correlacioacuten son superiores a 0990 por lo que existe una respuesta lineal en el rango de
concentraciones que hemos estudiado
Aparte del estudio de la linealidad tambieacuten se han estudiado los liacutemites de cuantificacioacuten instrumentales del
meacutetodo (LOQs) Para ello los LOQs se evaluacutean como la miacutenima cantidad de analito que origina una sentildeal 10
veces superior a la desviacioacuten estaacutendar del ruido Los valores anteriores se estimaron a partir del patroacuten de
a no evaluado ya que se encuentra por debajo del liacutemite de cuantificacioacuten del meacutetodo
31
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
concentracioacuten maacutes baja que presenta un pico con una relacioacuten SN superior a 10 En la Tabla IV3 tambieacuten se
recogen estos LOQs en doacutende podemos ver que variacutean en el rango 01-1 ngmL excepto para THI-M que se
desviacutea a valores de 10 ngmL
Tabla IV3 Coeficientes de determinacioacuten (R2) y liacutemites de cuantificacioacuten instrumentales (LOQs) de los analitos para nueve
niveles de concentracioacuten de 05 a 200 ngmL
Compuesto Coeficiente de
correlacioacuten (R2)
LOQs (ngmL) Compuesto
Coeficiente de correlacioacuten
(R2)
LOQs (ngmL)
AME 09951 04 MET 09933 01
BEN 09949 01 MYC 09950 04
BOS 09979 02 PEN 09945 02
CAR 09923 02 PYC 09955 02
CYP 09878 02 PYM 09931 01
DIM 09938 07 TEC 09958 05
FEH 09959 05 TEF 09957 01
FEP 09931 01 TBZ 09942 02
FLU 09965 02 TME 09903 01
IMI 09979 05 THI-M 09580 100
IPR 09938 01 TRI 09867 07
MAN 09979 01
En la Figura IV1 y Figura IV2 se muestran dos ejemplo de curvas de calibrado para dos compuestos IMI y
MAN respectivamente
Figura IV1 Curva de calibrado y coeficiente de determinacioacuten de IMI para UPLC-ESI-MSMS
32
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Figura IV2 Curva de calibrado y coeficiente de determinacioacuten de MAN para UPLC-ESI-MSMS
3 ESTUDIO DEL MEacuteTODO SPE
La extraccioacuten de pesticidas se llevoacute a cabo mediante extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) en doacutende se realizaron
diversos estudios con diferentes condiciones para dar con las oacuteptimas En primer lugar se llevaron a cabo los
experimentos de retencioacuten y elucioacuten sobre dos tipos distintos de adsorbentes cartuchos OASIS HLB (200mg) y
cartuchos OASIS MAX (150 mg) como fases potenciales en las que llevar a cabo la extraccioacuten de manera
selectiva Los dos tipos de cartuchos son de fase reversa pero difieren entre siacute en el fundamento de retencioacuten de
los analitos En los cartuchos OASIS HLB (200 mg) formados por divinilbenceno-N-vinilpirrolidona (DVB-VP)
la retencioacuten de los diferentes analitos tiene lugar por interacciones π-π o de Van der Waals mientras que los
cartuchos OASIS MAX (150 mg) que se probaron como alternativa para mejorar la selectividad en la extraccioacuten
cuentan con un adsorbente polimeacuterico de modo mixto formado por divinilbenceno-N-vinilpirrolidona (DVB-VP)
funcionalizado con grupos amina cuaternaria siendo el fundamento de la extraccioacuten la combinacioacuten de las
propiedades adsorbentes del cartucho HLB con un mecanismo adicional de intercambio ioacutenico (anioacutenico) [27]
Algunos autores han empleado este mecanismo para mejorar la selectividad de la extraccioacuten de forma que en la
etapa de elucioacuten ciertos pigmentos del vino quedan fuertemente retenidos en el adsorbente a diferencia de lo que
ocurre con los adsorbentes de fase reversa [51]
Para llevar a cabo la eleccioacuten del tipo de adsorbente se realizaron pruebas con 10 mL de vino blanco y tinto
conectando en serie los dos tipos de cartuchos HLB (200 mg) y MAX (150 mg) a un segundo cartucho OASIS
HLB (60 mg) La elucioacuten de los analitos se hace de forma independiente para cada cartucho y se evaluacutea si los
analitos pasan del primer cartucho hacia el segundo cartucho es decir si se supera el volumen de corte o si por
33
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
otro lado se quedan retenidos en el primero y no eluyen hacia el segundo En estas pruebas de estudio
preliminares de preparacioacuten de la muestra no se ha incluido el CYP
En la Figura IV3 podemos ver la eficacia de la extraccioacuten para vino blanco y tinto que obtenemos empleando
cartuchos OASIS MAX (150 mg) conectados en serie con cartuchos OASIS HLB (60 mg) realizando la
extraccioacuten de tres fracciones de 2 mL cada una del cartucho OASIS MAX (150 mg) y una cuarta fraccioacuten de 2
mL del cartucho OASIS HLB (60 mg)
Por otro lado en la Figura IV4 podemos ver un graacutefico de columnas en el cual comparamos la eficacia de
extraccioacuten de los cartuchos OASIS HLB (200 mg) con dos disolventes de elucioacuten distintos En dicho graacutefica el
acroacutenimo de cada compuesto consta de dos barras cuyo significado es el siguiente la barra de la izquierda indica
la eficacia de la extraccioacuten empleando acetonitrilo (ACN) como disolvente de elucioacuten y la barra de la derecha
indica la eficacia de la extraccioacuten empleando la combinacioacuten MetanolAcetonitrilo (2080) (MeOHACN) como
disolvente de elucioacuten Para este adsorbente no se detectoacute ninguacuten compuesto en la extraccioacuten del segundo
cartuchos OASIS HLB (60 mg) empleando 2 mL de metanol
Figura IV3 Distribucioacuten de los compuestos en cada fraccioacuten obtenidas con cartuchos OASIS MAX (150 mg)
utilizando 10 mL de vino tinto y blanco sacando cuatro fracciones de 2 mL cada una con metanol como
disolvente de elucioacuten
34
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Figura IV4 Distribucioacuten de los compuestos en cada fraccioacuten obtenidas con cartuchos OASIS HLB (200 mg) utilizando 10
mL de vino tinto y blanco sacando 3 fracciones de 2 mL cada una con acetonitrilo (ACN) (columna de la izquierda) y una
combinacioacuten MetanolAcetonitrilo (2080) (MeOHACN) (columna de la derecha) como disolventes de elucioacuten
A la vista de los resultados reflejados en las graacuteficas podemos afirmar que cuando se utiliza el cartucho OASIS
HLB (200 mg) eluyendo con acetonitrilo o la combinacioacuten metanolacetonitrilo (2080) los extractos son limpios
y se eluyen la mayoriacutea de los compuestos en la primera fraccioacuten Pero utilizando acetonitrilo como disolvente de
elucioacuten se encuentran problemas en la extraccioacuten de CAR FEH y TBZ para los que es necesario emplear un
volumen mayor de elucioacuten o bien seleccionar otro disolvente de elucioacuten como es la combinacioacuten
metanolacetonitrilo
35
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Por otro lado los extractos en los cartuchos OASIS MAX (150 mg) son maacutes limpios incluso utilizando metanol en
la elucioacuten pero se detecta la presencia de CAR FEP TBZ y TME en el segundo cartucho OASIS HLB (60 mg)
significando la rotura del primer cartucho para dichos analitos considerando un volumen de 10 mL de vino Los
demaacutes compuestos se podriacutean recuperar cuantitativamente en la primera fraccioacuten sacada pero la peacuterdida de estos
compuestos inclina la eleccioacuten hacia los cartuchos OASIS HLB (200 mg) con metanolacetonitrilo (2080) como
disolvente de elucioacuten para continuar con el estudio
Una vez fijado el adsorbente y el volumen de elucioacuten se prueba la eficacia de la SPE independiente de los efectos
de matriz En la Tabla IV4 se muestran las recuperaciones de la SPE tomando 10 mL de vino blanco y tinto
con un nivel de adicioacuten de 15 ngmL sacando una sola fraccioacuten de 2 mL con la combinacioacuten
metanolacetonitrilo (2080) y n=3 reacuteplicas
Tabla IV4 Recuperaciones (R plusmn SD) de SPE para 10 mL de vino (blanco y tinto) con un nivel de adicioacuten de 15 ngmL y
n=3 reacuteplicas
Compuesto Vino Tinto
R plusmn SD
Vino Blanco
R plusmnSD Compuesto
Vino Tinto
R plusmn SD
Vino Blanco
R plusmn SD
AME 82 plusmn 7 100 plusmn 1 MET 92 plusmn 6 94 plusmn 3
BEN 89 plusmn 6 97 plusmn 3 MYC 90 plusmn 9 86 plusmn 4
BOS 95 plusmn 1 100 plusmn 2 PEN 84 plusmn 10 103 plusmn 3
CAR 91 plusmn 6 104 plusmn 6 PYC 86 plusmn 5 106 plusmn 1
CYP 81 plusmn 7 102 plusmn 3 PYM 87 plusmn 12 94 plusmn 3
DIM 97 plusmn 3 86 plusmn 4 TEC 83 plusmn 10 103 plusmn 1
FEH 89 plusmn 3 88 plusmn 3 TEF 84 plusmn 5 108 plusmn 4
FEP 91 plusmn 7 104 plusmn 3 TBZ 88 plusmn 7 92 plusmn 5
FLU 91 plusmn 2 97 plusmn 4 TME 101 plusmn 1 110 plusmn 13
IMI 117 plusmn 8 101 plusmn 11 THI-M 85 plusmn 9 110 plusmn 4
IPR 89 plusmn 7 112 plusmn 4 TRI 85 plusmn 10 110 plusmn 4
MAN 88 plusmn 2 87 plusmn 2
Algunos compuestos de la matriz en el vino pueden competir con los analitos durante el proceso de ionizacioacuten
que tiene lugar en la interfase entre UPLC-MSMS por lo que para la cuantificacioacuten del rendimiento de la
ionizacioacuten por electrospray (ESI) se estudian los efectos de matriz (EM) para vino blanco y tinto considerando
dos voluacutemenes de muestra distintos 2 y 10 mL y un volumen final del extracto de 2 mL En la Tabla IV5 se
36
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
exponen los valores para cada compuesto notando que al aumentar el volumen de muestra tambieacuten se aumentan
los efectos de matriz y eacutestos siempre son mayores en vino tinto Para el caacutelculo de estos efectos de matriz (EM)
se emplea la siguiente ecuacioacuten
Donde Am Ab y Ap representan el aacuterea de pico en la sentildeal medida del analito en el extracto de la muestra con
adicioacuten en el extracto de la muestra sin adicioacuten (o blanco) y en el patroacuten antildeadido respectivamente El nivel de
adicioacuten en extracto fue de 50 ngmL por compuesto
Tabla IV5 Efectos de matriz para vino blanco y tinto con un volumen inicial de 2 y 10 mL evaluados para un nivel de adicioacuten de 50 ngmL en extracto
Compuesto
Vino blanco Vino tinto
2 mL 10 mL 2mL 10 mL
EM () CV () EM () CV () EM () CV () EM () CV()
AME 93 3 95 2 99 3 101 7
BEN 99 1 93 2 101 3 100 6
BOS 97 5 98 1 108 2 96 0
CAR 62 2 50 3 58 2 55 6
CYP 94 3 91 1 97 2 95 7
DIM 105 2 95 3 100 3 108 3
FEH 100 4 102 4 105 4 94 3
FEP 95 3 88 2 96 2 92 7
FLU 98 2 93 2 106 1 101 2
IMI 84 4 46 3 48 10 18 8
IPR 99 3 92 3 105 1 100 7
MAN 100 1 94 3 109 4 107 2
MET 98 1 89 1 99 2 99 6
MYC 105 1 100 1 103 2 96 9
PEN 98 3 97 1 101 3 99 10
PYC 98 2 92 3 102 2 98 5
PYM 95 2 87 1 94 3 85 12
TEC 95 3 99 1 101 1 102 10
TEF 99 1 92 3 101 2 104 5
TBZ 45 0 40 5 43 2 30 7
TME 60 6 19 16 36 4 16 1
THI-M 107 2 109 2 103 1 96 9
TRI 97 3 118 4 104 5 117 10
37
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Al observar los resultados podemos ver que la mayoriacutea de los compuestos dan resultados de EM en torno al
100 lo que significa que no sufren una modificacioacuten importante en la eficacia de ionizacioacuten para las muestras
con respecto a los patrones Pero tambieacuten por el contrario podemos observar que algunos compuestos como
por ejemplo en el caso de CAR TBZ IMI y TME experimentan una gran supresioacuten de sentildeal es decir EM bajos
que se acentuacutean al aumentar el volumen de muestra La atenuacioacuten en la eficacia de variacioacuten para estos cuatro
compuestos no solo se ve incrementada con el volumen de muestra si no que ademaacutes es maacutes significativa para
vino tinto que para vino blanco En base a estos resultados aunque la eficacia de la SPE fue cuantitativa para
muestras de 10 mL se limitoacute el volumen de muestra a extraer a 2 mL
Las condiciones oacuteptimas de extraccioacuten se esquematizan en un resumen en la Figura IV5
Figura IV5 Condiciones optimizadas para la extraccioacuten de pesticidas en vino
38
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
4 CARACTERIZACIOacuteN DEL MEacuteTODO DE DETERMINACIOacuteN
Con las condiciones de extraccioacuten y determinacioacuten citadas anteriormente se llevaron a cabo pruebas de
recuperaciones absolutas de los compuestos a nivel de adicioacuten de 5 y 20 ngmL sobre las muestras Para cada
muestra y nivel de adicioacuten se realizaron tres reacuteplicas de las muestras con adicioacuten y los blancos aliacutecuotas de las
mismas muestras sin adicioacuten se procesaron en duplicado Los IS se antildeadieron a nivel de 25 ngmL y cada uno se
utiliza para corregir unos determinados compuestos CAR-d3 se emplea para CAR y TBZ el CYP-d5 para CYP y
PYM el IMID-d4 para IMI y TME y el MET13C6 para el resto de compuestos Los resultados para vino blanco
comprenden en el nivel de concentracioacuten 5 ngmL el rango entre 79-122 y en el nivel de concentracioacuten 20
ngmL el rango entre 84-109 Por otro lado en el caso del vino tinto las recuperaciones se encuentran para el
nivel de concentracioacuten 5 ngmL en el rango 67-112 y para el nivel de concentracioacuten 20 ngmL entre el rango
73-132 Los resultados obtenidos en las pruebas con vino blanco y vino tinto se muestran en la Tabla IV6
Los resultados son satisfactorios ya que la mayoriacutea de los compuestos se ajustan en todos los casos al rango de
recuperacioacuten entre 70-120 Para la realizacioacuten de estas pruebas se ha eliminado de los resultados el compuesto
THI-M debido a que las concentraciones utilizadas se encuentran en el liacutemite o por debajo del LOQ en los
experimentos con muestras adicionadas a 5 ngmL
Para calcular las recuperaciones (R) se recurrioacute a la siguiente ecuacioacuten
Donde Cm Cb y Cp son la concentracioacuten medida de analito en el extracto de la muestra con adicioacuten en el extracto
de la muestra sin adicioacuten (o blanco) y en el patroacuten antildeadido respectivamente
Tabla IV6 Recuperaciones (R) para vino tinto y vino blanco evaluadas para dos niveles de concentracioacuten 5 y 20 ngmL
Compuesto
Vino tinto Vino Blanco
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
AME 97 3 105 6 104 9 96 5
BEN 88 11 105 3 101 1 98 4
BOS 91 13 110 2 88 13 97 3
39
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Compuesto
Vino tinto Vino blanco
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
CAR 99 6 99 3 122 3 109 1
CYP 91 2 111 1 101 4 100 6
DIM 112 3 110 9 102 24 99 11
FEH 91 4 108 0 102 20 95 2
FEP 89 8 102 7 94 5 84 1
FLU 95 10 104 4 109 5 100 8
IMI 73 11 115 9 80 13 100 2
IPR 84 13 99 3 111 3 99 4
MAN 88 22 112 8 112 3 99 4
MET 99 3 106 5 106 3 98 2
MYC 84 9 106 13 88 17 86 3
PEN 84 9 102 5 84 8 90 5
PYC 96 6 105 4 100 2 95 4
PYM 90 12 112 14 106 4 97 1
TEC 89 8 101 6 98 12 94 1
TEF 93 10 102 5 107 2 97 3
TBZ 94 17 115 8 79 5 106 2
TME 67 2 101 7 84 18 90 11
THI-M ne - 74 7 ne - 89 24
TRI 88 12 97 6 102 6 92 2
ne No evaluado El nivel de adicioacuten es inferior al LOQ del meacutetodo para este compuesto
Para estudiar la reproducibilidad del meacutetodo analiacutetico global (correspondientes a los datos de preparacioacuten de
muestra y determinacioacuten) es decir la concordancia de varias medidas realizadas en diacuteas diferentes se procedioacute a la
extraccioacuten en las condiciones oacuteptimas tanto de vino blanco como tinto Las extracciones y determinaciones se
realizaron durante tres diacuteas consecutivos realizando tres reacuteplicas por vino y por diacutea con un nivel de adicioacuten en
muestra de 10 ngmL un blanco de muestra cada diacutea En la Tabla IV7 se muestran los resultados como
recuperaciones (R) en condiciones de reproducibilidad obtenidos para ambos tipos de vino dando valores entre
64-116 para muestras de vino blanco y valores situados entre 68-108 para muestras de vino tinto con la
excepcioacuten del TME para el que se ha obtenido un valor no aceptable en cuanto a la exactitud medida en
condiciones de reproducibilidad A la vista de los resultados obtenidos con estas pruebas se considera necesario el
empleo de IS adicionales para la mejora en la exactitud del meacutetodo para algunos compuestos por ejemplo el
TME
40
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Tabla IV7 Recuperaciones en condiciones de reproducibilidad (R plusmn SD) para vino blanco y tinto
Compuesto
Vino tinto Vino blanco
R
10 ngmL CV ()
R
10 ngmL CV ()
AME 90 5 101 13
BEN 96 5 102 7
BOS 97 6 100 8
CAR 97 3 94 5
CYP 103 3 105 12
DIM 104 7 106 8
FEH 90 16 83 15
FEP 91 5 90 4
FLU 103 7 102 6
IMI 99 14 101 14
IPR 91 5 100 13
MAN 108 5 108 13
MET 101 5 101 5
MYC 105 16 102 14
PEN 96 11 92 10
PYC 99 12 97 12
PYM 102 4 116 8
TEC 99 9 97 16
TEF 99 8 105 11
TBZ 68 4 84 5
TME 47 13 64 10
THI-M 107 11 104 16
TRI 95 14 103 4
En la Tabla IV8 se muestran los liacutemites de cuantificacioacuten (LOQs) del meacutetodo del meacutetodo de SPE-UPLC-ESI-
MSMS obtenidos para los diferentes pesticidas Los valores obtenidos son ideacutenticos a los LOQs instrumentales
excepto en el caso de aquellos compuestos para los que se observaronfuertes efectos de matriz (Tabla IV5) En
estos casos (CAR TBZ IMI y TME) los LOQs del meacutetodo se incrementan seguacuten la atenuacioacuten de sentildeal
observada
41
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Tabla IV8 Liacutemites de cuantificacioacuten LOQs (ngmL) del meacutetodo obtendos para cada compuesto
Compuesto LOQ (ngmL) Compuesto LOQ (ngmL)
AME 04 MET 01
BEN 01 MYC 04
BOS 02 PEN 02
CAR 03 PYC 02
CYP 02 PYM 01
DIM 07 TEC 05
FEH 05 TEF 01
FEP 01 TBZ 04
FLU 02 TME 02
IMI 06 THI-M 10
IPR 01 TRI 07
MAN 01
5 APLICACIOacuteN A MUESTRAS DE VINO COMERCIALES
Una vez optimizadas las condiciones del meacutetodo y estudiadas las caracteriacutesticas del meacutetodo desarrollado se aplicoacute
a la determinacioacuten de los compuestos de intereacutes estudiados en muestras de vino blanco y vino tinto comerciales
producidos en diferentes paiacuteses En la Tabla IV9 se muestra el paiacutes de origen de cada muestra comercial
identificadas con un coacutedigo alfanumeacuterico y antildeo de produccioacuten
42
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Tabla IV9 Coacutedigo asignado para los diferentes vinos comerciales blancos y tintos analizados Indicando el paiacutes de origen y
antildeo de produccioacuten
Coacutedigo Denominacioacuten de origen Antildeo de produccioacuten
bull Vinos Blancos
W1 Alemania 2014
W2 Espantildea 2012
W3 Espantildea 2016
W4 Portugal Desconocido
W5 Francia 2015
W6 Francia 2015
W7 Espantildea 2016
bull Vinos Tintos
R1 Espantildea 2015
R2 Sudaacutefrica 2015
R3 Chile 2015
R4 Francia 2015
R5 China Desconocido
R6 Espantildea 2016
R7 Australia 2014
R8 Francia 2013
R9 Francia 2015
A continuacioacuten en la Tabla IV10 y la Tabla IV11 se recogen los resultados obtenidos en el anaacutelisis de las
muestras comerciales Los datos obtenidos corresponden en todos los casos al uso de patrones de calibracioacuten
como teacutecnica de cuantificacioacuten
Tabla IV10 Concentracioacuten (ngmL) encontradas en las diferentes muestras de vino blanco comercial analizadas mediante
SPE-UPLC-MSMS n=2 reacuteplicas y al final el sumatorio de las concentraciones encontradas
Compuesto W1 W2 W3 W4 W5 W6 W7
AME 04 nd nd nd 41 nd nd
BEN nd nd 14 nd nd nd nd
BOS 84 102 520 54 197 nd nd
CAR nd 115 56 nd nd nd nd
CYP 08 59 112 nd nd 26 nd
43
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Compuesto W1 W2 W3 W4 W5 W6 W7
DIM 14 84 400 09 32 50 nd
FEH 85 809 639 15 187 nd nd
FLU 11 05 92 nd 77 32 nd
IMI nd 136 88 29 nd nd 69
IPR 30 749 1144 14 nd nd nd
MAN nd nd nd nd nd 30 nd
MET 04 273 494 63 nd nd 172
MYC 09 nd 35 nd nd nd nd
PYM 15 469 584 08 24 35 nd
TEC 11 nd 58 nd nd nd nd
TRI nd 67 61 nd nd nd nd
sumconcentracioacuten
(ngmL) 274 2868 4358 192 558 173 862
nd no detectado
Tabla IV11 Concentracioacuten (ngmL) encontradas en las diferentes muestras de vino tinto comercial analizadas mediante
SPE-UPLC-MSMS n= 2 reacuteplicas y al final el sumatorio de las concentraciones encontradas
Compuesto R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9
AME nd nd nd 30 nd nd nd nd 16
BEN nd nd nd 07 nd nd nd nd nd
BOS nd 55 21 196 nd nd nd 73 21
CAR nd nd 04 17 249 20 nd nd nd
CYP 34 08 02 22 nd 136 nd 85 nd
DIM nd 33 nd 52 233 46 nd 61 23
FEH nd nd nd 1070 nd 10 nd 1307 14
FLU nd nd nd 20 nd nd nd nd nd
IPR 16 nd nd 17 nd 22 nd nd nd
MAN nd nd nd 17 nd nd nd 20 nd
MET 126 nd nd 14 55 313 30 44 39
MYC nd nd nd 05 nd 32 nd nd nd
PYM 19 nd 03 185 49 281 nd 24 nd
TEC 25 06 39 29 nd nd nd 21 20
TEF nd 01 12 nd nd nd nd nd nd
sumconcentracioacuten
(ngmL) 220 48 81 1681 586 860 30 1635 133
nd no detectado 44
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
En los resultados de los anaacutelisis podemos observar que en ninguna de las muestras comerciales de vino blanco
aparecieron los siguientes compuestos FEP PEN PYC TEF TBZ THI-M y TME y en los vinos tintos
comerciales no aparece a ninguna concentracioacuten FEP IMI PEN PYC TBZ TME THI-M y TRI No se
detectaron para dichas muestras de vino a niveles superiores a los LOQs del meacutetodo propuesto
Cuando se detecta un compuesto positivo se compara el pico cromatograacutefico del compuesto con el de un patroacuten
verificando la coincidencia del tiempo de retencioacuten (maacutexima diferencia 01 min) y la relacioacuten entre transiciones
(maacutexima diferencia 30 ) En la Figura IV6 y la Figura IV7 se muestran los cromatogramas para el compuesto
CYP obtenido en condiciones oacuteptimas para la muestra de vino blanco W6 y en un patroacuten de 5 ngmL
respectivamente En este caso el intervalo de tolerancia para la relacioacuten de intensidad entre transiciones es
IP2IP1=061plusmn018
Figura IV6 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el CYP en la muestra W6 (26 ngmL) Transicioacuten
superior 226gt93 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 226gt108 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades IP2IP1= 066
Figura IV7 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el CYP en un patroacuten de 5 ngmL Transicioacuten
superior 226gt93 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 226gt108 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades IP2IP1=061plusmn018
45
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Otro ejemplo de compuesto positivo en abundantes muestras comerciales de estudio es el Metalaxyl positivo con
una concentracioacuten de 04 ngmL en el vino con referencia W1 (Figura IV8) y positivo con una concentracioacuten de
313 ngmL en el vino con referencia R6 (Figura IV9) Ambas se comparan con el cromatograma de un patroacuten
de Metalaxyl de 1 ngmL (Figura IV10) El grado de concordancia en los tiempos de retencioacuten y la relacioacuten de
intensidades entre transiciones es satisfactorio
Figura IV8 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el MET en la muestra W1 (04 ngmL) Transicioacuten
superior 2801gt2201 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 2801gt1921 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades
IP2IP1=056
Figura IV9 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el MET en la muestra R6 (313 ngmL) Transicioacuten
superior 2801gt2201 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 2801gt1921 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades IP2IP1=
056
46
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Figura IV10 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el MET en un patroacuten de 1 ngmL Transicioacuten
superior 2801gt2201 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 2801gt1921 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades
IP2IP1=057plusmn017
Es de destacar que aunque se detectaron bastantes pesticidas en las diferentes muestras de vino comerciales pero
en ninguacuten caso superaron el 10 de los LMRs permitidos en uvas tal y como se recomienda ya que todaviacutea no
existen LMRs para vino en la legislacioacuten vigente No obstante el nivel total de concentracioacuten (sumatorio de
concentraciones Tabla IV10 y Tabla VI11) es significativo para varias muestras tanto de vinos blancos (W2 y
W3) como tintos (R4 y R8)
47
Capiacutetulo V Conclusiones
CAPIacuteTULO V CONCLUSIONES
En este trabajo se ha estudiado un meacutetodo para la cuantificacioacuten de pesticidas concretamente veinte fungicidas y
tres insecticidas en vino blanco y tinto En la etapa de preparacioacuten de muestra se optimizoacute la extraccioacuten en fase
soacutelida (SPE) utilizando cartuchos OASIS HLB (200 mg) compuestos por divinilbenceno-N-vinilpirrolidona
(DVB-VP) como adsorbente Como teacutecnica de determinacioacuten se utilizoacute cromatografiacutea de liacutequidos con una
interfase de electroespray acoplada a espectrometriacutea de masas (UPLC-ESI-MSMS)
Las conclusiones generales obtenidas a partir de los resultados de este proyecto relativo a la determinacioacuten de
fitosanitarios en vino son
Ante los problemas de retencioacuten que presentan los cartuchos OASIS MAX (150 mg) para algunos
compuestos los cartuchos OASIS HLB (200 mg) junto con la combinacioacuten metanolacetonitrilo (2080)
como disolvente de elucioacuten son elegidos como mejor opcioacuten en la extraccioacuten en fase soacutelida de pesticidas
en muestras con matrices complejas como es el caso del vino Asiacute se consigue la retencioacuten selectiva de
componentes de la matriz y proporciona extractos con menor porcentaje de interferencias
El meacutetodo estudiado y optimizado se puede aplicar tanto a vinos blancos como a vinos tintos procesados
a partir de distintas variedades de uvas
Los liacutemites de cuantificacioacuten (LOQs) del estudio se situacutean la mayoriacutea por debajo de 10 ngmL excepto
en el caso de THI-M que asciende al valor de 20 ngmL El rango de respuesta lineal abarca hasta 200
ngmL y el tiempo de anaacutelisis ha sido de solo 10 minutos por muestra
En todas las muestras de vino (blancos y tintos) comerciales analizadas se han detectado la presencia de
varios pesticidas sin embargo todas las concentraciones encontradas se encuentran por debajo del 10
de los LMRs fijados en uvas tal y como recomienda la legislacioacuten por lo que no se considera
preocupante
48
Capiacutetulo V Conclusioacutens
CAPIacuteTULO V CONCLUSIOacuteNS
Neste traballo estudouse un meacutetodo para a cuantificacioacuten de pesticidas en particular vinte funxicidas e tres
insecticidas en vintildeo branco e maacuteis tinto No paso da preparacioacuten da mostra optimizouse a extraccioacuten en fase
soacutelida (SPE) empregando cartuchos OASIS HLB (200 mg) compostos por divinilbenceno-N-pirrolidona (DVB-
VP) como adsorbente Para a teacutecnica de determinacioacuten utilizouse cromatografiacutea de liacutequidos con unha interfase de
electroespray acoplada a espectrometriacutea de masas (UPLC-ESI-MSMS)
As conclusioacutens xerais a obtidas a partir dos resultados deste proxecto relativo aacute determinacioacuten de pesticidas en
vintildeo son
Ante os problemas de retencioacuten que mostraban os cartuchos OASIS MAX (150 mg) para alguacuten
compostos os cartuchos OASIS HLB (200 mg) en conxunto coa mistura metanolacetonitrilo (2080)
como disolvente de elucioacuten son elexidos como mellor opcioacuten na extraccioacuten en fase soacutelida de pesticidas
en mostras con matrices complexas como eacute o caso do vintildeo Asiacute eacute conseguida a retencioacuten selectiva de
componentes da matriz e proporciona extractos con menos porcentaxe de interferencias
O meacutetodo estudado e optimizado poacutedese aplicar tanto a vintildeos brancos coma tintos procesados a partir de
diferentes variedades de uvas
Os liacutemites de cuantificacioacuten do estudo (LOQs) son maacuteis baixos de 10 ngmL agaacutes no caso do THI-M
que ascende ao valor de 20 ngmL O rango de resposta lineal cobre ata 200 ngmL e o tempo de anaacutelise
foi de soacute 10 minuacutetos por mostra
En todas as mostras de vintildeo (brancos e tintos) comercial analizadas detectouse a presenza de varios
pesticidas maacuteis poreacuten todas as concentracioacutens atopadas son inferiores ao 10 dos LMR fixados en uvas
tal e como recomenda a lexislacioacuten polo que non se considera preocupante
49
Chapter V Conclusions
CHAPTER V CONCLUSIONS
In this work we have studied a method for the quantification of pesticides specifically twenty fungicides and
three insecticides in white and red wine In the sample preparation step the solid phase extraction was optimized
using cartridges OASIS HLB (200 mg) containing divinylbenzene-N-vinylpyrrolidone (DVB-VP) as adsorbent
As determination technique ultraperformance liquid chromatography was used with an electrospray interface
coupled to mass spectrometry (UPLC-ESI-MS7MS)
The general conclusions drawn from the results of this project concerning the determination of pesticides in wine
are
Due to the retention problems presented by the OASIS MAX sorbent (150 mg) for some compounds of
this project the cartridges OASIS HLB (200 mg) together with the methanolacetonitrile (2080) mixture
are chosen as the best option in the solid phase extraction of pesticides in samples with complex
matrices as is the case with the wine
The method studied and optimized can be applied to both white and red wines obtained from different
varieties of grapes
The limits of quantification (LOQs) were below 10 ngmL for most of the compounds except in the
case of THI-M with a LOQ of to 10 ngmL The linear response range covers up to 200 ngmL and the
analysis time was only 10 minutes per sample
In all commercial wine samples (white and red) analyzed the presence of several pesticides was
conformed however all the concentrations obtained are below 10 of the Maximum residue
levels(MRLs) fixed in grapes as recommended by legislation
50
VI Bibliografiacutea VI BIBLIOGRAFIacuteA [1] Ministerio de agricultura y pesca alimentacioacuten y medio ambiente mhttpwwwmapamagobesescalidad-y-evaluacion-ambientaltemasproductos-quimicosfitosanitarios (Acceso el diacutea 11052017) [2] httpwwwcricyteduarenciclopediaterminosProducFitohtm (Acceso el diacutea 11052017) [3] WERNER BALTES ldquoQuiacutemica de los alimentosrdquo Editorial Acribia SA 2007 Capiacutetulo 11 ldquoResiduos en los alimentosrdquo paacuteginas 206-217
[4] RLabrada JCCaseley CParker ldquoESTUDIO FAO PRODUCCIOacuteN Y PROTECCIOacuteN VEGETAL 120rdquo Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentacioacuten Roma 1996 ISSN 1014- Capiacutetulo 10 Herbicidas httpwwwfaoorgdocrepT1147St1147s00htmContents (Acceso el diacutea 12052017)
[5] Taberner Palou Andreu Cirujeda Ranzenberger Alicia Zaragoza Larios Carlos ldquoManejo de poblaciones de malezas resistentes a herbicidasrdquo (FAO Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura) 100 preguntas sobre resistencia PDF sacado de httpwwwfaoorg3a-a1422spdf (Acceso el diacutea 12052017) [6] BISSET Juan A Uso correcto de insecticidas control de la resistencia Revista Cubana de Medicina Tropical 2002 vol 54 no 3 p 202-219 [7] DEVINE Gregor J EZA Dominique Ogusuku Elena FURLONGMichael J Uso de insecticidas contexto y consecuencias ecoloacutegicas Revista peruana de medicina experimental y Salud Puacuteblica 2008 vol 25 no 1 p 74-100 [8] Ministerio de agricultura y ganaderiacutea (proteccioacuten agropecuaria servicio de diagnoacutestico fitosanitario) de costa Rica httpwwwmaggocrbibliotecavirtualH20-5054pdf (Acceso el diacutea 11052017) [9] GEPP V MONDINO P Control quiacutemico 2011 PDF obtenido de httpwwwpvfagroeduuyfitopatodocscursosfitopatoMaterialesGuiasC-QUIMICOpdf (Acceso el diacutea 772017) [10] ROSSLENBROICH Hans-Juergen STUEBLER Dietrich Botrytis cinereamdashhistory of chemical control and novel fungicides for its management Crop Protection 2000 vol 19 no 8 p 557-561 [11] Figura 11 httpwwwvitiviniculturanetbotritis-o-podredumbre-gris-botrytis-cinerea-pershtml (Acceso el diacutea 12052017) [12] CAMPBELL Paul BENDEK Carlos LATORRE Bernardo A Riesgo de oiacutedio (Erysiphe necator) de la vid en relacioacuten con el desarrollo de los racimos Ciencia e investigacioacuten agraria 2007 vol 34 no 1 p 5-11 [13] ldquoCoacutemo combatir el oiacutedio de la vidrdquo Jose Javier Peacuterez de Obanos Castillo PDF sacado de httpswwwnavarraesNRrdonlyres05E65D9B-D1A2-4EAD-9A63-AFF1D3215552135109Comocombatireloidiodelavidpdf (Acceso el diacutea 12052017) [14] Imagen 12 sacadas las 3 de httpwwwvitiviniculturanetoidio-de-la-vidhtml (Acceso el diacutea 12052017) [15] BARRIOS Gonccedilal REYES Joan Modelizacioacuten del Mildiu de la Vid 2004 httpwwwruralcatnetmigracio_resources617683_mildiusPDF (Acceso el diacutea 12052017) [16] Imaacutegenes sacadas de httpwwwvitiviniculturanetmildiu-de-la-vid-enfermedades-vinahtml (Acceso el diacutea 13052017) [17] HUQ Mainul MEISNER Craig DASGUPTA Susmita Health effects and pesticide perception as determinants of pesticide use evidence from Bangladesh httpagrisfaoorgagris-searchsearchdorecordID=US2012411738 (Acceso el diacutea 13052017)
51
IV Bibliografiacutea [18] BADII Mohammad H LANDEROS Jeroacutenimo Plaguicidas que afectan a la salud humana y la sustentabilidad CULCyT 2015 no 19 Revista vista en httpopenjournaluacjmxojsindexphpculcytarticleview454 (Acceso el diacutea 772017) [19] OLEA Nicolaacutes FERNAacuteNDEZ Mariana F Plaguicidas persistentes En Congreso Implementacioacuten del Convenio de Contaminantes Orgaacutenicos Persistentes Madrid 2001 p 26-27 [20] httpwwwfaoorgfao-who-codexalimentariusabout-codexes (Acceso el diacutea 14052017) [21] httpeceuropaeufoodplantpesticidesmax_residue_levels_en (Acceso el diacutea 14052017 [22] ORDONtildeEZ Juan A Cambero Rodriacuteguez MI Fernaacutendez Aacutelvarez L Garciacutea Sanz ML Garciacutea de Fernando Minguilloacuten GD de la Hoz Perales L Selgas Cortecero MD Tecnologiacutea de los alimentos Volumen 1 Componentes de los Alimentos y Procesos Siacutentesis Madrid 1998paacutegs 349-351 [23] CELA Rafael Casais Maria del Carmen Lorenzo Rosa Antonia Teacutecnicas de separacioacuten en quiacutemica analiacutetica Siacutentesis 2002 Capiacutetulo 11 Extraccioacuten y lixiviacioacuten por disolvente (paacutegs206-260) [24] CANTWELL Frederick F LOSIER Manon Liquidmdashliquid extraction Comprehensive Analytical Chemistry 2002 vol 37 p 297-340 [25] Imagen de LLE sacada de httpprocesosbiowikispacescomExtracciC3B3n+liquido-liquido (Acceso el diacutea 15052017) [26] HENNION Marie-Claire Solid-phase extraction method development sorbents and coupling with liquid chromatography Journal of Chromatography A 1999 vol 856 no 1 p 3-54 [27] CELA Rafael Casais Maria del Carmen Lorenzo Rosa Antonia Teacutecnicas de separacioacuten en quiacutemica analiacutetica Siacutentesis 2002 Capiacutetulo 16 Teacutecnicas de adsorcioacuten y absorcioacuten en la preparacioacuten de muestras Extraccioacuten y microextraccioacuten en fase soacutelida (paacutegs520-555) [28] Imagen spe sacada httptoxicocbblogspotcomes201310las-intoxicaciones-con-farmacoshtml (Acceso el diacutea 15052017) [29] Chaacutefer Pericaacutes Consuelo Acoplamiento microextraccioacuten en fase soacutelida-cromatografiacutea (2006) httprodericuveshandle1055014940 (Acceso el diacutea 16052017) [30] Imagen SPME httpwwwscieloorgcoscielophpscript=sci_arttextamppid=S0122-53832002000100005 (Acceso el diacutea 16052017) [31] MONTES GOYANES Rosa Mariacutea Avances en teacutecnicas de microextraccioacuten para la determinacioacuten de compuestos traza en muestras medioambientales y alimentarias Teacutesis doctoral Noviembre 2009 (Paacutegs 34-55) [32] LEHOTAY Steven J Ae Son Kyung KwonHyeyoung Koesukwiwat Urairat Fu Wusheng Mastovska Katerina Hoh Eunha Leepipatpiboon Natchanun Comparison of QuEChERS sample preparation methods for the analysis of pesticide residues in fruits and vegetables Journal of Chromatography A 2010 vol 1217 no 16 p 2548-2560 [33] Imagen QueChERS httpswwwresearchgatenetpublication279221361_QuEChERS_A_Sample_Preparation_for_Extraction_of_Carbaryl_from_Rat_Feces (Acceso el diacutea 16052017) [34] STASHENKO Elena E MARTIacuteNEZ Jairo Reneacute Preparacioacuten de la muestra un paso crucial para el anaacutelisis por GC-MS Uma publicaccedilatildeo trimestral do Instituto Internacional de Cromatografia (IIC) Ciecircncia Cromatograacutefica 2011 vol 3 no 1 [35] Imagen GC-MS httpsorgspectroscopyintblogspotcomes201411gas-chromatography-mass-spectrometry-gchtml (Acceso el diacutea 17052017) [36] httpwwwactlabscompageaspxmenu=65ampapp=221ampcat1=534amptp=2amplk=no (Acceso el diacutea 17052017)
52
IV Bibliografiacutea [37] Quintela O Cruz A Concheiro M De Castro A amp Loacutepez-Rivadulla M (2005) Metodologiacutea LC-MS Aspectos generales de la teacutecnica y sus aplicaciones en el campo de la toxicologiacutea Rev Toxicol 22 paacutegs7-14 [38] Imagen LC-MS httpsuploadwikimediaorgwikipediaenff9Liquid_chromatography_tandem_Mass_spectrometry_diagrampng (visto 18052017) [39] Vargas de la Cruz Celia Bertha Adaptacioacuten de la Metodologiacutea Analiacutetica para la determinacioacuten de residuos de plaguicidas en frutas nativas de exportacioacuten mediante Uplc-MsMs (2012) Tesis obtenida en http20062146130handlecybertesis2331 (Acceso el diacutea 772017) [40] ROMERO GONZAacuteLEZ Roberto Fernaacutendez Moreno Joseacute Luis Plaza Bolantildeos Patricia Garrido Frenich Antonia Martiacutenez Vidal Joseacute Luis Empleo de la espectrometriacutea de masas como herramienta para la determinacioacuten de toacutexicos en alimentos hacia la seguridad alimentaria Revista Espantildeola de salud puacuteblica 2007 vol 81 no 5 p 461-474 [41] PAYAacute Andrus Fundamento y Funciones de la Espectrometriacutea de Masas Universidad de Valencia Espantildea 2006 httpmuraluvescaloan (Acceso el diacutea 19052017) [42] Imagen MS sacada de httpsesslidesharenetMaYaTorrezespectrometria-demasas (Acceso el diacutea 21052017) [43] ECONOMOU Anastasios Botitsi Helen Antoniou Spyros Tsipi Despina Determination of multi-class pesticides in wines by solid-phase extraction and liquid chromatography-tandem mass spectrometry Journal of Chromatography A 2009 vol 1216 no 31 p 5856-5867 [44] FONTANA A R Rodriacuteguez I Ramil M Altamirano JC Cela R Liquid chromatography time-of-flight mass spectrometry following sorptive microextraction for the determination of fungicide residues in wine Analytical and bioanalytical chemistry 2011 vol 401 no 2 p 767-775 [45] PELAJIĆ Maja G Peček DM Pavlović DV Čepo Novel multiresidue method for determination of pesticides in red wine using gas chromatographyndashmass spectrometry and solid phase extraction Food chemistry 2016 vol 200 p 98-106 [46] Ignaz J Buerge Juumlrgen Krauss Rociacuteo Loacutepez-Cabeza Werner Siegfried Michael Stuumlssi Felix E Wettstein Thomas Poiger Stereoselective Metabolism of the Sterol Biosynthesis Inhibitor Fungicides Fenpropidin Fenpropimorph and Spiroxamine in Grapes Sugar Beets and Wheat Journal of Agricultural and Food Chemistry 2016 vol 64 no 26 p 5301-5309 [47] M Hu X Liu F Dong J Xu S Li H Xu Y Zheng Determination of ametoctradin residue in fruits and vegetables by modified quick easy cheap effective rugged and safe method using ultra-performance liquid chromatographytandem mass spectrometry Food chemistry 2015 vol 175 p 395-400 [48] WALORCZYK Stanisław DROŻDŻYŃSKI Dariusz GNUSOWSKI Bogusław Multiresidue determination of 160 pesticides in wines employing mixed-mode dispersive-solid phase extraction and gas chromatographyndashtandem mass spectrometry Talanta 2011 vol 85 no 4 p 1856-1870 [49] Tianyang Guo Pingping Fang Juanjuan Jiang Feng Zhan Wei Yong Jiahui Liu YiYang Dong Rapid screening and quantification of residual pesticides and illegal adulterants in red wine by direct analysis in real time mass spectrometry Journal of Chromatography A 2016 vol 1471 p 27-3 [50] GONZAacuteLEZ-RODRIacuteGUEZ R M CANCHO-GRANDE B SIMAL-GAacuteNDARA J Decay of fungicide residues during vinification of white grapes harvested after the application of some new active substances against downy mildew Food chemistry 2011 vol 125 no 2 p 549-560 [51] CARPINTEIRO I Ramil M Rodriacuteguez I Cela R Determination of fungicides in wine by mixed-mode solid phase extraction and liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry Journal of Chromatography A 2010 vol 1217 no 48 p 7484-7492
53
Iacutendice
CAPIacuteTULO III PARTE EXPERIMENTALhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip23
1 MATERIAL Y REACTIVOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip23
11 Materialhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip23
12 Reactivos y disolventeshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip23
13 Patroneshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip23
14 Patrones internoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip24
15 Gaseshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip25
2 INSTRUMENTACIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip25
3 PREPARACIOacuteN DE LAS DISOLUCIONEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip25
4 LAVADO DEL MATERIALhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip26
5 EXTRACCIOacuteN DE MUESTRAS MEDIANTE SPEhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip26
6 CONDICIONES DE DETERMINACIOacuteN MEDIANTE UPLC-MSMShelliphelliphelliphelliphellip28
CAPIacuteTULO IV RESULTADOS Y DISCUSIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 29
1 IDENTIFICACIOacuteN DE LOS COMPUESTOShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip29
2 CARACTERIZACIOacuteN DEL PROCEDIMIENTO DE
DETERMINACIOacuteN (UPLC-ESI-MSMS)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip30
3 ESTUDIO DEL MEacuteTODO SPEhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33
4 CARACTERIZACIOacuteN DEL MEacuteTODO DE DETERMINACIOacuteNhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip39
5 APLICACIOacuteN A MUESTRAS DE VINOS COMERCIALEShelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip42
CAPIacuteTULO V CONCLUSIONESCONCLUSIOacuteNSCONCLUSIONShelliphellip 48
VI BIBLIOGRAFIacuteAhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip51
ResumenResumoAbstract
bull RESUMEN
Los pesticidas son compuestos que se emplean en vintildeedos de todo el mundo para garantizar una proteccioacuten en la
cosecha con escasas peacuterdidas producidas por diferentes organismos en uvas empleadas para la elaboracioacuten del
vino El modo de accioacuten de estos compuestos se basa en la interferencia sobre el metabolismo de diferentes
organismos sin afectar a la vid Un incremento en el empleo de estos compuestos puede determinar la existencia
de residuos en las uvas en el momento de la cosecha desde donde pueden alcanzar el vino que se elabora con las
mismas Por ese motivo se ha establecido una legislacioacuten que regule la cantidad maacutexima de residuos de pesticidas
en uvas y aunque a diacutea de hoy no hay valores regulados en el vino se recomienda que no excedan al 10 de los
liacutemites en uvas En este estudio se ha trabajado con distintos tipos de fitosanitarios fungicidas principalmente
aunque tambieacuten alguacuten insecticida con el objetivo de poder detectar la mayor cantidad de estas sustancias en vinos
comerciales optimizando la extraccioacuten mediante extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) y deteccioacuten mediante
cromatografiacutea de liacutequidos acoplada a espectrometriacutea de masas en taacutendem (LC-ESI-MSMS) Se presenta una
metodologiacutea analiacutetica sencilla raacutepida y robusta que puede ser implementada en laboratorios de control de
alimentos
bull RESUMO
Os pesticidas son compostos empregados en vintildeas arredor do mundo para garantir unha proteccioacuten na colleita
con poucas perdas producidas por distintos organismos en uvas utilizadas para a fabricacioacuten do vintildeo O modo de
accioacuten destes compostos baseacutease na intromisioacuten sobre o metabolismo de diferentes organismos sen afectar aacute vide
Un acrecentamento no uso destos compostos pode fixar a existencia de residuos nas uvas no momento da colleita
onde poden chegar ao vintildeo que se produce coas mesmas Por ese motivo estipulouse unha lexislacioacuten que regula a
cantidade maacutexima de residuos de pesticidas en uvas e aiacutenda que a diacutea de hoxe non hay valores regulamentados no
vintildeo recomeacutendase que non superen ao 10 dos liacutemites en uvas Neste estudo traballouse con diferentes tipos de
pesticidas funxicidas principalmente aiacutenda que tameacuten alguacuten insecticida co obxecto de poder detectar a maior
cantidade destas sustancias en vintildeos comerciais optimizando a extraccioacuten por medio da extraccioacuten en fase soacutelida
(SPE) e deteccioacuten por medio de cromatografiacutea de liacutequidos acoplada a espectrometriacutea de masas en taacutendem (LC-
MSMS) Preseacutentase unha metodoloxiacutea analiacutetica simple raacutepida e robusta que pode ser aplicada en laboratorios de
control de alimentos
1
ResumenResumoAbstract
bull ABSTRACT
Pesticides are compounds that are used in vineyards around the world to ensure protection at harvest with a few
loss produced by different organisms in grapes used to make wine The mode of action of these compounds is
based on the interference on the metabolism of different organisms without affecting the vine An increase in the
use of these compounds can determine the existence of residues in grapes at the time of harvest from where
they can reach the wine that is elaborated with the same ones For this reason legislation has been established to
regulate the maximum amount of pesticide residues in grapes and although there are currently no regulated
values in wine it is recommended that they do not exceed 10 of the limits on grapes In this study we have
worked with different types of pesticides mainly fungicides but also some insecticide with the purpose of being
able to detect the greatest amount of these substances in commercial wines extraction has been optimized by
solid phase extraction (SPE) and detection has been optimized by liquid chromatography coupled to tandem mass
spectrometry (LC-ESI-MSMS) It is presented a simple fast and robust analytical methodology that can be
implemented in food control laboratories
2
Capitulo I Introduccioacuten
CAPIacuteTULO I INTRODUCCIOacuteN
1 FITOSANITARIOS
11 Tipos de fitosanitarios empleados en viticultura
De acuerdo con el Ministerio de Agricultura y Pesca Alimentacioacuten y Medio Ambiente los fitosanitarios se definen
como una o varias sustancias activas u otros ingredientes conformando una mezcla con el fin de proteger los
productos de origen vegetal de organismos nocivos tanto de tipo vegetal como animal que conforman plagas
Dentro de estos fitosanitarios tambieacuten se encuentran las sustancias que destruyen regulan o inhiben la
germinacioacuten de las plantas pero no se contemplan dentro de este grupo vacunas medicamentos y antibioacuteticos
para uso humano o veterinario o agentes utilizados en el control bioloacutegico Los productos fitosanitarios ayudan a
asegurar una buena calidad en los alimentos asiacute como contribuyen al aumento de los rendimientos en la
agricultura [1]
Seguacuten la OMS (Organizacioacuten Mundial de la Salud) los fitosanitarios se pueden clasificar atendiendo a los
organismos a los que esteacuten destinados siendo estos insectos (insecticidas) aacutecaros (acaricidas) moluscos
(molusquicidas) roedores (rodenticidas o raticidas) hongos (fungicidas) gusanos y larvas (nematicidas) malas
hierbas (herbicidas) bacterias (antibioacuteticos pero sin comprender los de uso humano y bactericidas) y otras formas
de vida perjudiciales para la salud puacuteblica y tambieacuten para la agricultura consideradas como plagas animales o
vegetales que puedan ser generadas durante la produccioacuten almacenamiento transporte distribucioacuten y elaboracioacuten
de productos agriacutecolas y sus derivados Actualmente no se puede pensar en un cultivo racional sin el uso de alguacuten
tipo de pesticida ya que la peacuterdida de cosechas en todo el mundo debido a causa de insectos enfermedades de las
plantas y malas hierbas es equivalente a un tercio de la produccioacuten total [2] [3]
Para el estudio de los productos de fitosanitarios en vino nos centraremos solamente en los tres tipos maacutes
importantes en eacuteste aacuterea herbicidas insecticidas y sobre todo fungicidas
Los herbicidas son sustancias destinadas a destruir las malas hierbas cuyo meacutetodo de accioacuten es la interferencia
en los procesos bioquiacutemicos como la fotosiacutentesis que tienen lugar en el sistema vivo de eacutestas Generalmente se
aplican en solucioacuten o suspensioacuten acuosa en forma de nube de pequentildeas gotas dirigidas hacia el objetivo de la
aplicacioacuten Los herbicidas ofrecen los medios maacutes efectivos para el control de las plagas siendo en los paiacuteses
industrializados aplicados sobre el 85-100 de todos los cultivos principales Este tipo de sustancias son
propensas a la descomposicioacuten por microbios plantas y animales y no son comunes los problemas de residuos de
herbicidas si se utilizan de acuerdo a las instrucciones de las etiquetas [4] A pesar de todos los beneficios que nos
aportan un mal uso de estos puede convertirse en un serio problema ya que toda sustancia quiacutemica usada en
3
Capiacutetulo I Introduccioacuten
agricultura puede provocar un efecto negativo en el ambiente si es utilizada en altas dosis El uso prolongado de
un mismo herbicida puede causar problemas de resistencia de malezas fenoacutemeno que consiste en la aparicioacuten de
biotipos tolerantes de una especie la cual anteriormente era controlada por el herbicida [5]
Por otro lado los insecticidas son fitosanitarios destinados a controlar el ataque de insectos y para eso existen
distintos caminos a traveacutes de los que pueden actuar siendo envenenamiento por contacto en doacutende el insecticida
penetra a traveacutes de la cutiacutecula del insecto hasta alcanzar el sitio activo envenenamiento oral en doacutende el
insecticida es ingerido y absorbido a traveacutes del intestino o tambieacuten por fumigaciones en doacutende el insecticida
penetra en el cuerpo del insecto a traveacutes de los espiraacuteculos del sistema respiratorio Pero al igual que pasa con los
herbicidas los insectos tambieacuten desarrollan resistencia a los insecticidas debido al contacto continuo con estos
Esta resistencia puede ser expresada por varios caminos que el insecto no entre en contacto con la deposicioacuten del
insecticida que se modifique la composicioacuten del exoesqueleto inhibiendo asiacute la penetracioacuten del insecticida la
modificacioacuten del sitio activo para el fitosanitario reduciendo la sensibilidad a la forma activa del insecticida o que
la viacutea metaboacutelica del insecto se modifique negando el metabolismo del compuesto aplicado en su forma toacutexica
[6] Aunque por lo general otros aspectos de la agricultura moderna tienen un mayor impacto en el medio
ambiente los insecticidas se encuentran entre las herramientas agriacutecolas que estaacuten maacutes asociadas con el dantildeo
ambiental Su objetivo especiacutefico es matar a plagas de insectos por lo que puede que tenga un impacto letal en
organismos que no son su objetivo [7]
Por uacuteltimo los fungicidas estaacuten destinados tanto a combatir las plagas de hongos como a combatir las
enfermedades fungosas de las plantas ya sea matando retrasando el desarrollo o inhibiendo la reproduccioacuten de
los hongos Los fungicidas en general se dividen atendiendo al modo de accioacuten de eacutestos en fungicidas de
contacto fungicidas penetrantes o fungicidas sistemaacuteticos
Los fungicidas de contacto protegen uacutenicamente el sitio de aplicacioacuten contra las plagas quedando en el exterior de
la planta de eacutesta manera sin penetrar en el tejido vegetal forman una peliacutecula protectora Cuando alguna espora
de un hongo llega a su superficie se encuentra con esa peliacutecula que le impide penetrar o en su defecto germinar
En el caso de que atraviesen el tejido vegetal bien sea por una alta dosis o por una rotura en las paredes de la
planta se convierten en un producto toacutexico para ella llegando a quemarla
Otro tipo de fungicidas los fungicidas penetrantes como su nombre indica se introducen en el tejido vegetal y
una vez dentro cuentan con muy poca movilidad es decir no circulan por los vasos conductores Al tener la
capacidad de entrar en la planta pueden combatir a los hongos que ya se encuentren dentro de eacutesta pero no
pueden ser toacutexicos para ella porque de lo contrario la dantildeariacutean
Por uacuteltimo nos encontramos con los fungicidas sistemaacuteticos Este tipo de fungicidas actuacutean protegiendo a la
planta contra las plagas en distintas zonas por transfusioacuten del fitosanitario dentro de la misma Esto sucede porque
penetran en el tejido vegetal y circulan por ella a traveacutes de la corriente de los vasos conductores
El meacutetodo de accioacuten de los fungicidas se basa en interferir en el metabolismo de los hongos ya sea por un
4
Capiacutetulo I Introduccioacuten
ataque en la produccioacuten de energiacutea la inhibicioacuten de la mitosis o inhibiendo la formacioacuten de quitina que se trata
del compuesto principal de la pared celular de los hongos y que por ende influye en la permeabilidad de la
membrana [8] [9]
Las enfermedades fuacutengicas fundamentales que nos podemos encontrar en las uvas de la vid son la botritis el oiacutedio
y el mildium las cuales pueden llegar a causar peacuterdidas importantes en viticultura
La enfermedad de la botritis tambieacuten llamada moho gris estaacute causada
por el hongo Botrytis cineacuterea y se puede encontrar en todo el mundo
infectando a un amplio nuacutemero de plantas Se trata de uno de los
patoacutegenos fuacutengicos maacutes interesantes debido a que puede vivir tanto
de forma patoloacutegica produciendo la enfermedad como
alimentaacutendose de materia orgaacutenica en descomposicioacuten La accioacuten
fuacutengica del hongo se lleva a cabo cuando las uvas empiezan a
acumular azuacutecar pudiendo ser muy devastador en algunas
condiciones sobre todo en cultivos empapados por la lluvia o
localizados en un ambiente huacutemedo y con viento produciendo la peacuterdida de los racimos de uvas que son
infectados O por el contrario en otro tipo de condiciones ambientales de sequedad despueacutes de unas
condiciones de humedad dicho hongo le confiere beneficios a ciertos tipos de vino blanco [10]
El oiacutedio es una enfermedad causada por la especie Uncinula necator la cual afecta tanto al rendimiento como a la
calidad de las uvas y altera las cualidades de sus derivados vino mosto etc El proceso de infeccioacuten del oiacutedio
tiene lugar siguiendo un ciclo de reproduccioacuten en las distintas estaciones del antildeo El riesgo de infeccioacuten viene
dado en funcioacuten de la temperatura oacuteptima entre 25-30ordmC humedad del ambiente en el que se encuentre y
tambieacuten en funcioacuten de la temporada siendo maacutes resistentes los racimos de uvas a medida que van madurando El
hongo afecta a todas las parte de la vid hojas tallo y racimos las cuales presentan siacutentomas distintos Las hojas se
vuelven de un color amarillento y se cubren de un polvo fino blanco grisaacuteceo En el tallo el oiacutedio se manifiesta a
traveacutes de manchas difuminadas con coloracioacuten inicial verde oscuro volvieacutendose cada vez maacutes oscuras al final y si
ocurre un ataque fuerte puede desembocar en que el tallo se acabe secando y por consiguiente disminuye la
produccioacuten Pero el ataque maacutes fuerte se produce en los racimos empezando por cubrirse del polvillo blanco
grisaacuteceo y continuando con que el oiacutedio detiene el crecimiento de la piel de la uva con la consecuencia que la uva
se agrieta Esta enfermedad produce unos dantildeos directos en la cantidad y calidad de la cosecha y si no se toman
medidas de prevencioacuten las peacuterdidas pueden llegar a ser totales [12] [13]
Figura I1Enfermedad de botritis en un racimo de uvas [11]
Figura I2 Enfermedad del oiacutedio en hoja tallo y racimo de izquierda a derecha [14] 5
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Por uacuteltimo el mildium o mildiu es una enfermedad producida por el hongo Plasmopara vitiacutecola considerada como
una de las peores enfermedades del cultivo siempre y cuando esteacuten en las condiciones ambientales favorables para
su desarrollo Dichas condiciones oacuteptimas para la propagacioacuten de la enfermedad son las lluvias al amanecer o al
anochecer con una temperatura en un rango de 20-25 ordmC El periacuteodo sensible de la vegetacioacuten de la vintildea es a
partir de una longitud de 10 cm en adelante siendo maacutexima en el periacuteodo de mayor crecimiento de la planta Por
otro lado la sensibilidad del racimo empieza desde su formacioacuten hasta que las uvas al florecer alcanzan el tamantildeo
similar al de un guisante pero de ahiacute en adelante la sensibilidad se ve disminuida Dicho hongo cuenta con un
ciclo reproductivo abarcando varias fases desde la fase de contaminacioacuten siendo el principio hasta la fase de pro-
pagacioacuten Afecta a todos los oacuterganos verdes de la vid y sus siacutentomas son variados en las distintas zonas de eacutesta
En las caras de las hojas aparecen unas manchas amarillentas en los racimos cuando se aproxima la floracioacuten los
que se encuentran infectados se curvan secaacutendose y cubrieacutendose de una pelusa blanquecina y cuando alcanzan el
tamantildeo de un guisante en adelante las uvas de los racimos afectados se van oscureciendo y secando sin que apa-
rezca la fructificacioacuten del hongo ademaacutes de oscurecerse el tallo [15]
12 Estructura propiedades fiacutesico-quiacutemicas y clasificacioacuten
En este trabajo nos centramos en estudiar los residuos de veintitreacutes fitosanitarios tipo fungicida principalmente
aunque tambieacuten alguacuten residuo tipo insecticida Las caracteriacutesticas maacutes importantes de dichos compuestos seraacuten
recogidas en la Tabla I1 que incluye estructuras clasificacioacuten (se ha usado el acroacutenimo ldquoFrdquo en caso de ser
fungicidas e ldquoIrdquo en caso de ser insecticidas) y propiedades fiacutesico-quiacutemicas Las propiedades fiacutesico-quiacutemicas que
pueden resultar maacutes relevantes para este estudio son el pKa ya que la mayoriacutea se trata de compuestos baacutesicos
aunque se encuentre alguacuten aacutecido deacutebil como es por ejemplo el Fenhexamid y Kow describiendo el coeficiente de
reparto entre octanolagua empleado para medir el grado de hidrofobidad que proporciona una estimacioacuten de
la posible distribucioacuten del analito entre materia orgaacutenica y agua
Figura I3 Enfermedad del mildium en la imagen de la izquierda coacutemo afecta a las hojas imagen central coacutemo
afecta a los racimos cuaacutendo estaacuten infectados al comenzar la floracioacuten y en la imagen de la derecha coacutemo afecta a
los racimos en doacutende las uvas tienen tamantildeo mayor al de un guisante [16]
6
Compuesto Estructura Nombre sistemaacutetico Foacutermula CAS Uso ordflog (kow) pKa
Ametoctradin
(AME)
5-ethyl-6-
octyl[124]triazolo[15-
a]pyrimidin-7-amine
C15H25N5 865318-97-4 F 440 278
Benalaxyl
(BEN)
Methyl-N-(phenylacetyl)-N-
(26-xylyl)-D-alaninate C20H23NO3 98243-83-5 F 368 -
Boscalid
(BOS)
2-Chloro-N-(4rsquo-
chlorobiphenyl-2-yl)-
nicotinamide
C18H12Cl2N2O 188425-85-6 F 296 -
Carbendazim
(CAR)
Methyl 2-benzimidazole
carbamate C9H9N3O2 10605-21-7 F 148 420
Cyprodinil
(CYP)
4-Cyclopropyl-6-methyl-N-
phenilpyrimidin-2-amine C14H15N3 121552-61-2 F 400 309
Dimethomorph
(DIM)
(2E)-3-(4-chlorophenyl)-3-(34-
dimethoxyphenyl)-1-
(morpholin-4-yl)prop-2-en-1-
one
C21H22ClNO4 110488-70-5 F 268 -13
Fenhexamid
(FEH)
N-(23-dichloro-4-
hydroxyphenyl)-1-methyl-
cyclohexanecarboxamide
C14H17Cl2NO2 126833-17-8 F 351 73
Fenpropidin
(FEP)
1-[(RS)-3-(4-tert-butylphenyl)-
2-methylpropyl]piperidine C19H31N 67306-00-7 F 26 1013
Fluopicolid
(FLU)
26-dichloro-N-[3-chloro-5-
(trifluoromethyl)-2-
pyridylmethyl]benzamide
C14H8Cl3F3N2O 239110-15-7 F 29 -
Imidacloprid
(IMI)
(E)-1-(6-chloro-3-
pyridylmethyl)-N-
nitroimidazolidin-2-
ylideneamine
C9H10ClN5O2 138261-41-3 I 057 -
Iprovalicarb
(IPR)
Isopropyl (S)-2-methyl-1-[1-(p-
tolyl)ethylcarbamoyl]propyl-
carbamate
C18H28N2O3 140923-17-7 F 32 -
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Tabla I1 Estructura clasificacioacuten y propiedades fiacutesico-quiacutemicas de intereacutes para los analitos de estudio
7
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Compuesto Estructura Nombre sistemaacutetico Foacutermula CAS Uso ordflog (kow) pKa
Mandipropamid
(MAN)
2-(4-chlorophenyl)-N-[3-
methoxy-4-(2-
propynyloxy)phenethyl]-2-(2-
propynyloxy)acetamide
C23H22ClNO4 374726-62-2 F 32 -
Metalaxyl
(MET)
N-(26-dimethylphenyl)-N-
(methoxyacetyl)-DL-alanine
methyl ester
C15H21NO4 57837-19-1 F 175 000
Myclobutanil
(MYC)
2-(4-chlorophenyl)-2-(1H-
124-triazol-1-
ylmethyl)hexanentrile
C15H17ClN4 88671-89-0 F 289 230
Penconazol
(PEN)
1-[2-(24-
dichlorophenyl)pentyl]-1H-
124-triazole
C13H15Cl2N3 66246-88-6 F 372 151
Pyraclostrobin
(PYC)
Methyl2-[1-(4-chlorophenyl)-
1H-pyrazol-3-
yloxymethyl]phenylmetoxy-
carbamate
C19H18ClN3O4 175013-18-0 F 399 -
Pyrimethanil
(PYM)
4-6-dimethyl-N-phenyl-2-
pyrimidinamine C12H13N3 53112-28-0 F 284 352
Tebuconazol
(TEC)
1-(4-chlorophenyl)-44-
dimethyl-3-(1H-124-triazol-1-
ylmethyl)-3-pentanol
C16H22ClN3O 107534-96-3 F 370 500
Tebufenozid
(TEF)
35-dimethylbenzoic acid 1-
(11-dimethylethyl)-2-(4-
ethylbenzoyl)hidrazide
C22H28N2O2 112410-23-8 I 425 -
Thiabendazol
(TBZ)
2-(13-thiazol-4-yl)-1H-
benzimidazole C10H7N3S 148-79-8 F 239 473
Thiamethoxam
(TME)
3-[(2-chloro-5-
thiazolyl)methyl]tetrahydro-5-
methyl-N-nitro-4H-135-
oxadiazin-4-imine
C8H10ClN5O3S 153719-23-4 I -013 -
Thiophanate-
methyl
(THI-M)
DimethylNNrsquo-[12-
phenylenebis(azanediylcarbono
thioyl)] dicarbamate
C12H14N4O4S2 23564-05-8 F 145 728
Triadimenol
(TRI)
1-(4-chlorophenoxy)-33-
dimethyl-1-(1H-124-triazol-1-
yl)-2-butanol
C14H18ClN3O2 55219-65-3 F 318
-
ordf Valores para la forma neutra 8
Capiacutetulo I Introduccioacuten
13 Toxicidad de los pesticidas
En los uacuteltimos antildeos el uso indiscriminado de pesticidas de siacutentesis en agricultura ha creado graves problemas de
salud y medioambientales ya que su uso debido al aumento de la poblacioacuten y por consiguiente de la actividad
agraria se ha incrementado considerablemente Durante las tres uacuteltimas deacutecadas una estimacioacuten dada por la
Organizacioacuten Mundial de la Salud y el Programa de las Naciones Unidas para el Medio Ambiente revela que
aproximadamente cerca de 20000 personas al antildeo mueren generalmente agricultores por exposicioacuten continuada
a alguno de estos toacutexicos En la mayoriacutea de los casos los agricultores utilizan los pesticidas de forma que las
cantidades se desviacutean significativamente de las recomendadas ya que asocian cantidades maacutes altas con mayor
efectividad y velocidad de accioacuten El mal uso de dichos toacutexicos se ve en los signos presentes en los ecosistemas
afectados pudiendo llegar a ser perjudiciales para la salud humana Estos riesgos que causan tanto en la salud
como en el medioambiente pueden ser reducidos o en su defecto evitados mediante la educacioacuten sobre este tipo
de toacutexicos con el fin de frenar su uso excesivo y descontrolado [17]
Desde el punto de vista medioambiental los fitosanitarios empleados en un cultivo pueden persistir en los
distintos medios tierra aire o agua y afectar tanto a ecosistemas terrestres como acuaacuteticos En los sistemas
terrestres los suelos son contaminados mediante la aplicacioacuten del toacutexico de forma directa o como deposicioacuten del
resultado de una suspensioacuten aeacuterea Eacutestos pueden persistir desde varios diacuteas hasta varios antildeos ya que el suelo
retiene y moviliza el toacutexico despueacutes de su emisioacuten Los que persisten maacutes tiempo en el medioambiente tienen una
mayor probabilidad de interaccionar con otros elementos del sistema y si su vida media es mayor a la frecuencia
con la que se aplica el pesticida tienden a acumularse tanto en el suelo como en las especies que habitan en eacutel Por
otro lado el agua es contaminada por pesticidas bien por aplicacioacuten directa por estar presentes en las
precipitaciones de la atmoacutesfera o bien por la movilidad que tienen desde el suelo Tanto los pesticidas solubles
como los insolubles interaccionan con los ecosistemas acuaacuteticos los hidrosolubles persisten maacutes tiempo
solubilizados en agua mientras que los otros se asocian a los sedimentos y se concentran en las especies que
habitan el medio acuaacutetico [18]
Como consecuencia de la amplia distribucioacuten de los toacutexicos en aire suelo y agua se produce una acumulacioacuten de
ellos en los elementos que contribuyen a la alimentacioacuten humana ya que su amplio uso hace que el contacto con
los plaguicidas por parte de personas y animales sea inevitable La contaminacioacuten de los alimentos se puede
presentar por aplicacioacuten directa de los pesticidas el uso de eacutestos durante el manejo transporte y almacenamiento
de los productos comestibles o por su acumulacioacuten en la cadena troacutefica Son bioacumulables en el organismo
debido a su caraacutecter lipofiacutelico lo que les confiere una vida media en los tejidos larga La exposicioacuten a pesticidas
persistentes no tiene la misma repercusioacuten en cada uno de los individuos expuestos sino que se considera criacutetica la
exposicioacuten durante la etapas embrionaria fetal y primeros antildeos de vida en doacutende se transmite de madres a hijos
mediante la gestacioacuten y la lactancia como resultado de la acumulacioacuten en el tejido graso de la madre [19]
9
Capiacutetulo I Introduccioacuten
14 Legislacioacuten
El aumento del uso de fitosanitarios en actividades relacionadas con la produccioacuten de alimentos para consumo
humano o animal tambieacuten desembocoacute en una preocupacioacuten social debido a su toxicidad y bioacumulacioacuten En
respuesta la Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura (FAO) en colaboracioacuten
con la Organizacioacuten Mundial de la Salud (OMS) pusieron en marcha un programa Codex Alimentarius cuyo
objetivo a traveacutes de sus normas y coacutedigos de praacutecticas alimentarias internacionales es garantizar la calidad e
inocuidad de los alimentos que estaacuten al alcance de cualquier persona Con estas normas internacionales los
consumidores pueden confiar en la calidad de los alimentos independientemente de su origen geograacutefico [20]
Todos los alimentos destinados al consumo humano o animal en la Unioacuten Europea estaacuten sujetos a un liacutemite
maacuteximo de residuos de plaguicidas para la proteccioacuten de la salud humana y animal Actualmente en lo referente a
legislacioacuten para el control de la cantidad del toacutexico en la uva estaacute vigente el Reglamento 3962005 del Parlamento
Europeo y del Consejo de 23 de febrero de 2005 referido a la regulacioacuten de los liacutemites maacuteximos de residuos de
plaguicidas en alimentos y piensos de origen vegetal y animal El liacutemite maacuteximo de residuos (LMR) se define co-
mo el nivel maacutes alto de un residuo de un pesticida que se tolera de manera legal sobre los alimentos o piensos
cuando se aplican correctamente Las cantidades de residuos que se encuentren deben ser lo maacutes bajas posible
para garantizar la seguridad en la alimentacioacuten de los consumidores Dichos liacutemites maacuteximos de residuos estaacuten
fijados por la Comisioacuten Europea pudieacutendose encontrar en su base de datos LMR [21]
A continuacioacuten en la Tabla I2 se resumen los LMRs de los compuestos de este estudio en uvas de vinificacioacuten
en unidades de mgkg de uva En el caso del vino no hay legislacioacuten en lo referente a estos pesticidas solamente
la recomendacioacuten de no superar el 10 del valor del LMR en uva
Compuesto LMRs (mgkg uva) Compuesto LMRs (mgkg uva)
AME 6 MET 1
BEN 03 MYC 1
BOS 5 PEN 02
CAR 05 PYC 2
CYP 3 PYM 5
DIM 3 TEC 1
FEH 15 TEF 3
FEP 001 TBZ 005
FLU 2 TME 04
IMI 1 THI-M 3
IPR 2 TRI 2
MAN 2
Tabla I2 Liacutemites maacuteximos de residuos permitidos para los compuestos estudiados en uvas
10
Capiacutetulo I Introduccioacuten
2 MEacuteTODOS DE PREPARACIOacuteN DE MUESTRA APLICADOS A MUESTRAS DE VINO
21 Extraccioacuten liacutequido-liacutequido (LLE)
Se entiende por extraccioacuten liacutequido-liacutequido al meacutetodo mediante el cual un analito de intereacutes se separa por el
contacto con otra fase en la cual tiene mayor afinidad de la matriz en la que se halle Los procesos de extraccioacuten
implican dos fases y requieren tres pasos sucesivos mezcla de materia prima y disolvente separacioacuten de las dos
fases despueacutes del contacto y eliminacioacuten del disolvente que contiene el analito [22]
La extraccioacuten liacutequido-liacutequido (LLE) se basa en la distribucioacuten
de un analito entre dos fases liacutequidas inmiscibles en las
cuales analito y matriz tienen solubilidades diferentes
Principalmente una de las fases es un medio acuoso en
general se trata de la muestra y la otra un disolvente
orgaacutenico La selectividad y eficacia de este meacutetodo vienen
determinadas por la eleccioacuten del disolvente y por los factores
que pueden afectar al proceso de equilibrio (pH adiccioacuten de
sales neutras en la fase acuosa para reducir la solubilidad del
analito etc) [23] Esta teacutecnica permite llevar a cabo extracciones para un rango muy amplio de analitos siendo
una de las maacutes antiguas para la preparacioacuten de muestras en el anaacutelisis cualitativo y cuantitativo Ofrece grandes
capacidades de muestreo lineal y cuenta con la ventaja de la cantidad de informacioacuten existente sobre este meacutetodo
[24]
22 Extraccioacuten en fase soacutelida (SPE)
En 1978 aparecieron los primeros cartuchos desechables para la extraccioacuten en fase soacutelida y actualmente casi 40
antildeos despueacutes la extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) es la teacutecnica de preparacioacuten de muestras maacutes empleada en los
laboratorios Es una teacutecnica de preparacioacuten y tratamiento de muestras que se basa en la retencioacuten en una fase
adsorbente del analito de intereacutes presente en una muestra liacutequida que pasa a traveacutes de ella Debido a la variedad de
formatos (discos cartuchos y jeringas) y tipos de adsorbentes (los maacutes comunes carboacuten activo aluacutemina siacutelica gel
silicato de magnesio siacutelices enlazadas y poliacutemeros como por ejemplo estinero-divinilbenceno) o la facilidad de
automatizacioacuten y acoplamiento con otras teacutecnicas como por ejemplo una conexioacuten directa con un sistema de
Figura I4 Fundamentos teoacutericos de la LLE [25]
11
Capiacutetulo I Introduccioacuten
cromatografiacutea este meacutetodo le fue ganando terreno a la LLE Otra ventaja muy importante de la SPE frente a la
LLE es la disminucioacuten en la cantidad de disolvente orgaacutenico empleada Cada vez se va innovando maacutes sobre esta
teacutecnica llegando a encontrarse fases adsorbentes formadas por poliacutemeros capaces de retener en un uacutenico
cartucho un amplio abanico de analitos lipofiacutelicos o hidrofoacutebicos aacutecidos baacutesicos o neutros [26]
El fundamento de esta extraccioacuten como se puede en la Figura I6
consiste en cuatro etapas acondicionamiento adiccioacuten de muestra
retencioacuten y elucioacuten de los analitos de intereacutes En primer lugar antes
de empezar la extraccioacuten se requiere una etapa de acondicionamiento
para preparar el adsorbente haciendo pasar un poco de disolvente
para asiacute interaccionar mejor con la muestra Luego se hace pasar la
muestra liacutequida por la fase soacutelida Idealmente el adsorbente retiene
los analitos selectivamente a medida que va pasando la muestra y la
matriz pasa sin ser retenida Por uacuteltimo los analitos se eluyen del
adsorbente con un disolvente con el que tenga mayor afinidad [27]
23 Teacutecnicas de microextraccioacuten
231 Microextraccioacuten en fase soacutelida (SPME)
En la microextraccioacuten en fase soacutelida (SPME) se utilizan fibras de siacutelice fundida revestidas con un poliacutemero en un
disentildeo en forma de jeringa para la extraccioacuten de los analitos de intereacutes El principio por el que se rige esta
extraccioacuten es el reparto del analito entre la matriz de la muestra y el revestimiento de la fibra mediante un proceso
no competitivo Se trata de un meacutetodo que cuenta con muchas ventajas ya que se elimina completamente el uso de
disolventes y aparte no son necesarios voluacutemenes de muestra grandes pero tambieacuten cuenta con algunas
desventajas ya que tanto la capacidad como la sensibilidad se ven limitadas [29]
En la figura I7 podemos ver las etapas de la extraccioacuten En un
vial cerrado con una caacutepsula y un seacuteptum tenemos la muestra
liacutequida o bien soacutelida que contenga los analitos de intereacutes
volaacutetiles Con la jeringa se perfora el seacuteptum y una vez dentro
se acciona el eacutembolo para la exposicioacuten de la fibra con los
analitos introducieacutendola en la muestra liacutequida o en su defecto
en el espacio de cabeza para la extraccioacuten de analitos volaacutetiles
de una muestra soacutelida Despueacutes de la extraccioacuten dentro del vial
Figura I6 Etapas de una SPE [28]
Figura I7 Etapas de una SPME [30]
12
Capiacutetulo I Introduccioacuten
la fibra se introduce de nuevo en la jeringa y se retira del vial [27]
232 Microextraccioacuten en fase liacutequida (LPME)
La microextraccioacuten en fase liacutequida se desarrolloacute como una alternativa a la LLE para la reduccioacuten en la cantidad de
disolventes orgaacutenicos siendo rentable tanto para el medioambiente como econoacutemicamente Entre las modalidades
maacutes populares de esta teacutecnica se encuentran microextraccioacuten con gota suspendida (SDME) y microextraccioacuten
liacutequido-liacutequido dispersiva (DLLME) En la SDME una gota de disolvente orgaacutenico es expuesta al espacio de
cabeza situado sobre una muestra en un vial dicha gota es suspendida del extremo de una microjeringa Por otro
lado la DLLME sobre una muestra acuosa se inyecta un pequentildeo volumen de una mezcla de disolventes en la
cual es dispersada formando una solucioacuten en la que se establece el equilibrio El disolvente de extraccioacuten debe
presentar una densidad inferior a la de la muestra para facilitar su recuperacioacuten normalmente despueacutes de
centrifugar el vial doacutende se realiza la extraccioacuten [31]
24 QuEChERS
La extraccioacuten QuEChERS de las palabras en ingleacutes Quick Easy Cheap Effective Rugged and Safe es un meacutetodo
de extraccioacuten que se desarrolloacute entre 2000 y 2002 para el anaacutelisis de pesticidas Como su nombre indica raacutepido
faacutecil barato eficaz robusto y seguro son las principales
caracteriacutesticas de esta preparacioacuten de muestra Se realiza en dos
etapas en primer lugar una extraccioacuten simple y una segunda fase
de purificacioacuten En la primera etapa tenemos el vial con la
muestra en el cual se antildeade un disolvente generalmente
acetonitrilo para la extraccioacuten de los analitos de intereacutes en
presencia de diferentes sales (en el meacutetodo original se utiliza
sulfato de magnesio y cloruro de sodio) para facilitar la separacioacuten
de las fases En la segunda parte se realiza la purificacioacuten de la
fraccioacuten del extracto orgaacutenico Para eso se lleva a cabo una
limpieza de los analitos eliminando el agua y los compuestos
presentes en la matriz de la muestra empleando un adsorbente PSA (amina primaria y secundaria) C18 carboacuten
negro grafitizado (GCB) o una combinacioacuten de eacutestas [32]
Figura I8 Etapas de QuEChERS [33]
13
Capiacutetulo I Introduccioacuten
3 METODOLOGIacuteA ANALIacuteTICA PARA LA DETERMINACIOacuteN DE PESTICIDAS
31 Meacutetodos de GC-MS (MSMS)
La combinacioacuten de cromatografiacutea de gases (GC) teacutecnica de separacioacuten con espectrometriacutea de masas (MS) como
sistema de deteccioacuten representa un potente meacutetodo para la identificacioacuten determinacioacuten y cuantificacioacuten de
analitos orgaacutenicos en concentraciones traza presentes en muestras complejas Esta teacutecnica de anaacutelisis cuenta con
muchas ventajas en sensibilidad multifuncionalidad buena reproducibilidad robustez asiacute como facilidad en el
manejo pero con una gran desventaja este meacutetodo no es apto para ser utilizado con todos los analitos sino que
se ve limitado a aquellos que sean termoestables y no se descompongan a temperaturas elevadas antes de ser
volatilizados La muestra es introducida a traveacutes del inyector en el cromatoacutegrafo de gases doacutende impulsada por
una corriente de gas inerte como fase moacutevil pasa a traveacutes de la columna que contiene la fase estacionaria en la
cual se separan los compuestos debido a una distribucioacuten de estos entre fase moacutevil-fase estacionaria Mediante
una interfase son introducidos para su deteccioacuten en el espectroacutemetro de masas que cuenta con una fuente de
iones analizador de masas y un detector [34]
La combinacioacuten de analizadores de masas en taacutendem (MSMS) como sistema de deteccioacuten en GC es una teacutecnica
altamente selectiva mejorando la sensibilidad y la relacioacuten sentildeal-ruido en los espectros experimentando una
mejora por lo que se logran unos liacutemites de deteccioacuten inferiores Esta teacutecnica GC-MSMS comprende maacutes
pasos despueacutes de la separacioacuten por cromatografiacutea se lleva a cabo la deteccioacuten con MSMS que consta de varias
etapas generacioacuten de iones en la fuente de ionizacioacuten seleccioacuten de los iones precursores de una determinada
masa disociacioacuten causada por colisioacuten con moleacuteculas de gas inerte de los iones precursores y por uacuteltimo el
anaacutelisis de los fragmentos en relacioacuten a su masacarga (mz) En el caso de que un espectro de MS no permita
confirmar la identidad de un determinado compuesto quiacutemico la obtencioacuten de su espectro de MSMS permite
mejorar la confianza en su identificacioacuten [36]
Figura I9 Acoplamiento GC-MS [35]
14
Capiacutetulo I Introduccioacuten
32 Meacutetodos LC-MS (MSMS)
La teacutecnica de LC-MS se desarrolloacute para minimizar las desventajas del acoplamiento GC-MS y asiacute resolver los
problemas que este uacuteltimo acarreaba con los analitos termolaacutebiles permitiendo el anaacutelisis de eacutestos sin tener que
realizar una etapa previa de derivatizacioacuten La interfase de unioacuten de cromatografiacutea liacutequida (LC) con espectrometriacutea
de masas (MS) acarrea una dificultad significativa siendo responsable de transformar los analitos que se
encontraban en la fase moacutevil liacutequida en iones en fase gas sin que se produzca su degradacioacuten teacutermica La
sensibilidad de las determinaciones por LC-MS va a depender de la interfase empleada Las principales interfases
empleadas actualmente son las ionizaciones a presioacuten atmosfeacuterica electrospray (ES) e ionizacioacuten quiacutemica a
presioacuten atmosfeacuterica (APCI) [37]
Con los antildeos la cromatografiacutea liacutequida se ha ido innovando y mediante la disminucioacuten del tamantildeo de partiacutecula en
la columna se fue mejorando la eficiencia asiacute como aumentando la selectividad y resolucioacuten del pico en el
cromatograma Para este nuevo sistema llamado UPLC Ultra-Performance Liquid Chromatography se desarrolloacute
una nueva instrumentacioacuten capaz de trabajar a altas presiones generando flujos mayores sin peacuterdidas de
resolucioacuten utilizando inyectores automaacuteticos maacutes raacutepidos y detectores con mayor velocidad de adquisicioacuten de
datos disminuyendo asiacute el tiempo de anaacutelisis [39]
33 Espectrometriacutea de masas
La espectrometriacutea de masas es el meacutetodo de deteccioacuten y cuantificacioacuten maacutes fiable a la hora de la determinacioacuten de
compuestos en matrices complejas (tales como alimentos) ya que otros detectores maacutes tradicionales como UV-
visible o fluorescencia cuentan con una gran incertidumbre en los resultados llegando incluso a ofrecer falsos
Figura I10 Acoplamiento LC-MS [38]
15
Capiacutetulo I Introduccioacuten
positivos o negativos Un espectrometro de masas cuenta con un dispositivo de introduccioacuten de muestra una
caacutemara de ionizacioacuten un sistema para la aceleracioacuten de los iones uno o varios analizadores de masas y un detector
[40]
El fundamento de la espectrometriacutea de masas se basa en la separacioacuten de iones en base a la relacioacuten masacarga
(mz) El proceso consta fundamentalmente de cuatro etapas La
primera es la ionizacioacuten de la muestra los iones formados se aceleran
debido a la accioacuten de un campo eleacutectrico variable separacioacuten de los
iones seguacuten su masacarga deteccioacuten de los iones y produccioacuten de la
sentildeal eleacutectrica El analizador de masas es el encargado de la separacioacuten
de los iones en funcioacuten a su mz entre los que maacutes destacan
analizador de masas cuadrupolar que dispersa simultaacuteneamente todos
los iones en funcioacuten de la relacioacuten mz analizador de masas de
tiempo de vuelo (TOF) consta de un tubo a alto vaciacuteo sobre el que no
actuacutea ninguacuten campo eleacutectrico al cual llegan todos los iones acelerados con la misma energiacutea cineacutetica y en el tubo
las velocidades variacutean seguacuten mz y analizador de trampa de iones en doacutende los iones gaseosos quedan aislados
durante largos periacuteodos de tiempo por la accioacuten del campo eleacutectrico [41]
4RESUMEN BIBLIOGRAacuteFICO DE LAS TEacuteCNICAS DE EXTRACCIOacuteN Y
DETERMINACIOacuteN DE PESTICIDAS EN VINO
En la bibliografiacutea se han descrito diversas teacutecnicas y diferentes combinaciones entre teacutecnicas de extraccioacuten y
distintas teacutecnicas de cuantificacioacuten e identificacioacuten para esos analitos Entre estas teacutecnicas los valores de los liacutemites
de cuantificacioacuten (LOQs) y las recuperaciones relativas pueden diferir en el resultado en un rango de valores asiacute
como el tiempo total empleado para el anaacutelisis y para la preparacioacuten de la muestra
Por lo general el meacutetodo de extraccioacuten de los analitos de intereacutes maacutes empleado es la extraccioacuten en fase soacutelida
(SPE) la cuaacutel le ha estado ganando terreno a la extraccioacuten liacutequido-liacutequido aunque tambieacuten se estaacute viendo cada vez
maacutes desplazada debido al creciente uso de la teacutecnica QuEChERS
Figura I11 Etapas de la espectrometriacutea de masas [42]
16
Capiacutetulo I Introduccioacuten
En el estudio de ECONOMOU et al [43] realizado en el antildeo 2009 en Grecia se empleoacute la extraccioacuten en fase
soacutelida con deteccioacuten en cromatografiacutea de liacutequidos acoplada a espectrometriacutea de masas en taacutendem (SPE-LC-ESI-
MSMS) Para la preparacioacuten de la muestra diluyeron 10 mL de vino (tanto blanco como tinto) a un volumen
final de 100 mL con agua ultrapura antes de la SPE Determinaron las recuperaciones de la extraccioacuten para dos
niveles de concentracioacuten 0010 y 0050 mgL realizando 8 medidas diarias durante 3 diacuteas consecutivos
encontraacutendose unos valores que variacutean dentro del rango 70-110 para todos los pesticidas en los dos niveles Para
la determinacioacuten y cuantificacioacuten de 46 pesticidas emplearon la teacutecnica de cromatografiacutea de liacutequidos con
espectrometriacutea de masas con un volumen de inyeccioacuten de 20 microL y un flujo de fase moacutevil de 02 mLmin
aclopada a espectrometriacutea de masas en taacutendem
Con la misma teacutecnica de extraccioacuten PELAJIĆ et al [45] durante el antildeo 2015 en Croacia llevaron a cabo la
determinacioacuten de 25 residuos de plaguicidas en vino tinto El meacutetodo que desarrollaron para dicha finalidad fue el
acoplamiento SPE-GC-MS Para la preparacioacuten de la muestra emplearon 10 mL de vino diluidos 11 con agua
ultrapura hasta un volumen final de 20 mL Calcularon las recuperaciones de la extraccioacuten y se encontroacute un rango
para todos los pesticidas en las muestras de 70-120 Para la determinacioacuten en cromatografiacutea de gases-
espectrometriacutea de masas se empleoacute un volumen de inyeccioacuten de 5 μL y un flujo de fase moacutevil de 10 mLmin
Mediante el acoplamiento de teacutecnicas SPE dispersiva-GC-MS WALORCZYK et al [48] en el antildeo 2011 en
Polonia llevaron a cabo la cuantificacioacuten de 160 pesticidas en diferentes clases de vino tinto rosado y blanco Con
10 g de vino y 10 mL de acetonitrilo se realizaron pruebas de recuperacioacuten en la fase de extraccioacuten para vino
tinto con los niveles de concentracioacuten 001 005 y 02 mgkg y para los vinos rosado y blanco con el nivel de
concentracioacuten 005mgkg y encontraron que a todos los niveles de concentracioacuten los valores de recuperacioacuten
rondan el rango 80-110 Para la teacutecnica cromatograacutefica se utilizoacute un volumen de inyeccioacuten de 5 microL
El acoplamiento LLE-SPE-LCDAD fue desarrollado por GONZAacuteLEZ-RODRIacuteGUEZ et al [50] en el antildeo
2010 en la provincia de Orense para la determinacioacuten de nuevos fungicidas propuestos para combatir el hongo
que provoca la enfermedad del mildium En la preparacioacuten de la muestra emplearon 15 mL de vino blanco para la
extraccioacuten en la cual fueron calculadas las recuperaciones relativas para dos niveles de concentracioacuten 005 y 05
mgkg en donde se establece un rango de entre 70-110 para todos los analitos Para la determinacioacuten mediante
cromatografiacutea de liacutequidos se empleoacute un volumen de inyeccioacuten de 2 μL y como meacutetodo de deteccioacuten utilizaron un
detector de diodos array
La microextraccioacuten sorptiva en fase soacutelida fue empleada en la publicacioacuten de FONTANA et al [44] junto con un
acoplamiento entre cromatografiacutea de liacutequidos y espectrometriacutea de masas para la determinacioacuten de 15 fungicidas
en vino realizada durante el 2010 en el noroeste de Espantildea Para la preparacioacuten de la muestra emplearon 10 mL
17
Capiacutetulo I Introduccioacuten
de vino diluiacutedos con el mismo volumen de agua ultrapura y un sorbente en forma de disco de silicona con un
volumen de 12 microL La recuperacioacuten de la extraccioacuten se calculoacute para vino tinto (Menciacutea) y vino blanco (Godello)
realizando tres replicas dentro de un mismo diacutea para los niveles de concentracioacuten 10 y 50 ngmL y nueve reacuteplicas
realizando el anaacutelisis en tres diacuteas consecutivos para el nivel de concentracioacuten de 25 ngmL y los resultados
obtenidos dan unos valores de recuperacioacuten dentro del rango 75-117 En el sistema LC-QTOF-MS el volumen
de inyeccioacuten fue de 15 microL
El otro meacutetodo de extraccioacuten mencionado anteriormente es QuEChERS estaacute en auge como meacutetodo de extracioacuten
de residuos de pesticidas en matrices como la del vino o la uva ya que incrementa la velocidad del anaacutelisis y reduce
el efecto de matriz BUERGE et al [46] seguido de una deteccioacuten mediante GC-MSMS realizaron una estapa
de extraccioacuten QuEChERS con alguna modificacioacuten acetato de sodio en lugar de cloruro soacutedico y acetato de etilo
en lugar de acetonitrilo utilizando 5 g de uva para la determinacioacuten de residuos de 4 pesticidas durante el antildeo
2016 Las recuperaciones de extraccioacuten resultaron ser valores entre 91-149 en uva a distintos niveles de
concentracioacuten 005 05 y 5 mgkg
Para la determinacioacuten de Ametoctradin HU et al [47] llevaron a cabo una extraccioacuten QuEChERS empleando 10
g de uva con deteccioacuten mediante el acoplamiento UPLC-MSMS utilizando un volumen de inyeccioacuten de 5 μL y
un flujo de fase moacutevil de 03 mLmin Las recuperaciones de la extraccioacuten se calcularon para tres niveles de
concentracioacuten 1 10 100 μgL de dos formas distintas en tres diacuteas consecutivos realizando 5 reacuteplicas al diacutea o en
dentro de un mismo diacutea realizando 15 reacuteplicas los resultados de todos los caacutelculos se encuentran dentro del rango
818-1001
Siguiendo con el mismo modo de extraccioacuten GUO et al [49] publicaron sus estudios para la determinacioacuten de
50 pesticidas y 12 adulterantes en vino tinto Para la extraccioacuten QuEChERS se utilizaron 10 mL de vino tinto con
10 mL de acetonitrilo y calcularon las recuperaciones para tres niveles de concentracioacuten 50 100 y 250 ngmL
encontraacutendose un rango de valores entre 75-120 El meacutetodo de deteccioacuten se llevoacute a cabo mediante un anaacutelisis
directo en tiempo real junto con espectrometriacutea de masas en tandem con un cuadrupolo (DART-MSMS) la
teacutecnica DART es un meacutetodo raacutepido para cribar y cuantificar los analitos de estudio que prescinde de la etapa de
separacioacuten cromatograacutefica
A continuacioacuten se recogen en la Tabla I3 los liacutemites de cuantificacioacuten (LOQs) de los analitos de intereacutes en este
trabajo caacutelculados por los diferentes meacutetodos encontrados en bibliografiacutea citados anteriormente en este apartado
18
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Tabla I3 LOQs de los analitos de intereacutes descritos para los distintos meacutetodos encontrados en la bibliografiacutea
Compuesto LOQs
Compuesto LOQs
V Blanco V Tinto Uva V Blanco V Tinto Uva
AME - - 0032μgkg[47] MET 86 μgL[43]
22 μgL[44]
89 μgL[43]
22 μgL[44]
5 μgL[45]
259 ngmL[49]
001mgkg[48]
BEN 02 μgL[44]
0001 mgL[50]
02 μgL[44]
001 μgL[45]
280ngmL[49]
005 mgkg[48] MYC 30 μgL[43]
08 μgL[44]
36 μgL[43]
10 μgL[44]
025 μgL[45]
331ngmL[49]
001 mgkg[48]
BOS 0065 mgL[50] 05 μgL[45]
1076 ngmL[49] 001 mgkg[48] PEN
56 μgL[43]
05 μgL[44]
49 μgL[43]
04 μgL[44]
220ngmL[49]
001 mgkg[48]
CAR - 386 ngmL[49] - PYC 0003mgL[50] 07 μgL[45] 001 mgkg[48]
CYP 15 μgL[43]
04 μgL[44]
0001 mgL[50]
22 μgL[43]
06 μgL[44]
312 ngmL[49]
001 mgkg[48] PYM 17 μgL[43] 22 μgL[43]
10 μgL[45] 001 mgkg[48]
DIM 18 μgL[43] 20 μgL[43] 001 mgkg[48] TEC 03 μgL[44]
03 μgL[44]
10 μgL[45]
160ngmL[49]
001 mgkg[48]
FEH 17 μgL[43] 22 μgL[43]
938 ngmL[49] 001 mgkg[48] TEF - 876ngmL[49] -
FEP - - 002mgkg[46] TBZ 15μgL [43] 29μgL[43] 001 mgkg[48]
FLU 005 μgL[45] TME - 25 μgL[45] 001 mgkg[48]
IMI 21 μgL[43] 22 μgL[43]
225 ngmL[49] - THI-M 92 μgL[43] 89 μgL[43] -
IPR 07 μgL[44] 07 μgL[44] 001 mgkg[48] TRI 10 μgL[44] 12 μgL[44] 001 mgkg[48]
MAN 0011 mgL[50] - -
5 DISTRIBUCIOacuteN DE PESTICIDAS EN VINOS COMERCIALES
En algunos de los meacutetodos descritos en el apartado anterior se procesaron vinos comerciales encontraacutendose
resultados positivos para muchos residuos de pesticidas y algunos hasta en gran concentracioacuten
ECONOMOU et al [43] mediante el meacutetodo LC-ESI-MSMS realizaron el anaacutelisis de 60 muestras de vino tinto
y blanco recogidos en supermercados locales en Grecia a lo largo de un antildeo El meacutetodo se habiacutea desarrollado
19
Capiacutetulo I Introduccioacuten
para la determinacioacuten de 46 pesticidas pero la mayoriacutea se encuentran con una concentracioacuten por debajo de
001mgL solo ocho plaguicidas se obtuvieron con resultados de concentracioacuten mayores Se muestran los
resultados en la Tabla I4 de los analitos de intereacutes en este estudio
Tabla I4 Nuacutemero de muestras positivas de distintos pesticidas en el anaacutelisis de 60 muestras de vino [43]
Compuesto Positivos con concentracioacuten entre 001-01
mgL
Positivos con concentracioacuten entre 01-1
mgL
PYM 2 (3) 2 (3)
MYC 2 (3) 0 (0)
CAR 11 (18) 7 (12)
THI-M 7 (12) 5 (8)
FEH 5 (8) 0 (0)
MET 1 (2) 0 (0)
Mediante el meacutetodo de microextraccioacuten en fase soacutelida-LC-TOF-MS FONTANA et al [44] aplicaron el
desarrollo del procedimiento a un total de 12 vinos joacutevenes elaborados en el 2010 y correspondientes a diferentes
denominaciones geograacuteficas del noroeste de Espantildea En la Tabla I5 se muestran los datos que han obtenido
Tabla I5 Determinacioacuten de fitosanitarios en vinos comerciales mediante Microextraccioacuten en fase soacutelida-LC-TOF-MS
Valores de concentracioacuten en ngmL [44]
Pesticidas
W 1
Albarintildeo
W5
Ribeiro
W6
Valdeorras
R1
Ribeira Sacra
R3
Ribeiro
R4
Valdeorras
MET 404plusmn06 223plusmn05 311plusmn007 25plusmn03 31plusmn03 74plusmn10
TRI nd nd 36plusmn06 nd nd ltLOQ
IPR 394plusmn03 324plusmn02 324plusmn02 071plusmn007 31plusmn02 28plusmn05
MYC nd nd nd ltLOQ 39plusmn02 nd
TEC 25plusmn01 nd nd nd nd nd
CYP 179plusmn08 ltLOQ ltLOQ 562plusmn002 083plusmn001 nd
BEN 042plusmn001 nd ltLOQ nd 032plusmn001 ltLOQ
ndNo detectados ltLOQ por debajo del liacutemite de cuantificacioacuten del meacutetodo los coacutedigos W y R corresponden respecti-vamente a los vinos blanco y tinto
20
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Por uacuteltimo PELAJIĆ et al [45] aplicaron su meacutetodo SPE dispersiva-GC-MS mediante el cual determinaron 25
residuos de plaguicidas en vino tinto a un total de 32 muestras de vino adquiridos en supermercados locales de
Croacia pero de diversos oriacutegenes de procedencia Los resultados que han obtenido se muestran en la Tabla I6
en doacutende un total de 15 plaguicidas han sido detectados y 7 de los cuales se encontraban en una alta
concentracioacuten
Tabla I6 Resultados de los vinos con positivos en pesticidas y sus concentraciones [45]
Vino Paiacutes Residuos de pesticidas (mgKg)
Tinto Francia DIM (0013) MET (0009) IPR (001)
Tinto Alemania BOS (0011)
Tinto Alemania IPR (0009)
Tinto Macedonia MET (0015)
Tinto Moldavia IPR (0008)
Tinto Polonia MET (004)
Tinto Rumania PYM (0058)
Tinto Espantildea TRI (0005) MET (0011)
Tinto Estados Unidos BOS (001)
Rosado Francia BOS (0005)
Blanco Chile TEC (0008)
Blanco Georgia MET (0057)
Blanco Alemania DIM (001) IPR (0054) PYM (0056)
Blanco Sudaacutefrica DIM (0011) IPR (0011)
21
Capiacutetulo II Objetivos y discusioacuten
CAPIacuteTULO II OBJETIVOS Y DISCUSIOacuteN
El objetivo principal que se persigue en este trabajo es el desarrollo de un meacutetodo analiacutetico raacutepido basado en la
extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) y deteccioacuten mediante cromatografiacutea de liacutequidos en la modalidad de UPLC
acoplada a la espectrometriacutea de masas en taacutendem (UPLC-MSMS) para la determinacioacuten multianalito de residuos
de fitosanitarios principalmente fungicidas aunque tambieacuten alguacuten insecticida en muestras de vino blanco y tinto
Para llevar a cabo la finalidad de lo dicho se consideran unos objetivos maacutes especiacuteficos
Minimizar la manipulacioacuten de la muestra para asiacute reducir la cantidad de disolventes y tiempo empleado
Optimizacioacuten de los factores que afectan en la extraccioacuten en la SPE tales como tipo y cantidad de
adsorbente volumen de eluyente etc
Estudio de las condiciones en UPLC-MSMS para una separacioacuten y cuantificacioacuten oacuteptimas
Caracterizacioacuten y validacioacuten del meacutetodo propuesto
Por uacuteltimo una vez cumplidos todos los objetivos anteriores y fijadas las condiciones oacuteptimas el meacutetodo
estudiado se aplica en el anaacutelisis de muestras de vino comercial (blanco y tinto) para determinar si se encuentran
residuos presentes asiacute como conocer en queacute concentracioacuten se encuentran los pesticidas objeto de este estudio
22
Capiacutetulo III Parte experimental
CAPIacuteTULO III PARTE EXPERIMENTAL
1 MATERIAL Y REACTIVOS
11 Material
Material de vidrio de uso comuacuten en el laboratorio vasos de precipitados matraces aforados etc
Micropipetas automaacuteticas de 20-200 microL 20-200 microL 100-1000 microL 1000-5000 microL Eppendorf
Puntas de plaacutestico para micropipetas
Encapsulador y desencapsulador
Soportes y pinzas
Viales de 15 mL transparentes para muestreador automaacutetico de cromatografiacutea (Sugelabor)
Caacutepsulas de aluminio con seacuteptum de Tefloacuten (Sugelabor) y tapones pre-slit para viales
Tubos y conectores de tefloacuten
Cartuchos de divinilbenceno-N-vinilpirrolidona 200 mg Oasis HLB Waters
Cartuchos de divinilbenceno-N-vinilpirrolidona funcionalizados con grupos amina cuaternaria 150 mg
Oasis MAX Waters
Cartuchos de divinilbenceno-N-vinilpirrolidona 60 mg Oasis HLB Waters
12 Reactivos y disolventes
Agua ultrapura Milli-Q
Aacutecido foacutermico (Sigma Aldrich) 95
Acetonitrilo (LichrosolvregMerck) Gradient grade for liquid chromatography
Metanol (LichrosolvregMerck) Gradient grade for liquid chromatography
Etanol (LichrosolvregMerck) Gradient grade for liquid chromatography
13 Patrones
Ametoctradin (AME) Dr Ehrenstrorfer 990
Benalaxyl (BEN) Pestanal Sigma- Aldrich 999
23
Capiacutetulo III Parte experimental
Boscalid (BOS) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Carbendazim (CAR) Pestanal Sigma- Aldrich 992
Cyprodinil (CYP) Pestanal Sigma- Aldrich 998
Dimethomorph (DIM) mezcla de isoacutemeros E + Z Pestanal Sigma- Aldrich 989
Fenhexamid (FEH) Pestanal Sigma- Aldrich 997
Fenpropidin (FEP) Dr Ehrenstrorfer 980
Fluopicolide (FLU) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Imidacloprid (IMI) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Iprovalicarb (IPR) mezcla de isoacutemeros Pestanal Sigma- Aldrich 985
Mandipropamid (MAN) Pestanal Sigma- Aldrich 991
Metalaxyl (MET) Pestanal Sigma- Aldrich 990
Myclobutanil (MYC) Pestanal Sigma- Aldrich 994
Penconazole (PEN) Pestanal Sigma- Aldrich 991
Pyraclostrobin (PYC) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Pyrimethanil (PYM) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Tebuconazol (TEC) Pestanal Sigma- Aldrich 996
Tebufenozide (TEF) Dr Ehrenstrorfer 988
Thiabendazole (TBZ) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Thiamethoxam (TME) Pestanal Sigma- Aldrich 996
Thiophanate-methyl (THI-M) Dr Ehrenstrofer 990
Triadimenol (TRI) Mezcla de diastereoisoacutemeros Pestanal Sigma- Aldrich 994
14 Patrones internos
Carbendazim-d3 (CAR-d3) Pestanal Sigma- Aldrich 998
Cyprodinil-d5 (CYP-d5) Pestanal Sigma- Aldrich
Imidacloprid-d4 (IMID-d4) Pestanal Sigma- Aldrich
Metalaxyl 13C6 (MET13C6) Pestanal Sigma-Aldrich 99
24
Capiacutetulo III Parte experimental
15 Gases
Nitroacutegeno 99999 como gas de colisioacuten en el espectroacutemetro de masas
Nitroacutegeno en los sistemas de concentracioacuten y secado por corriente de nitroacutegeno de los cartuchos SPE
2 INSTRUMENTACIOacuteN
Balanza analiacutetica de precisioacuten Sartorius
Granatario Sartorius
Bantildeo de ultrasonidos P-Selecta
Equipo de purificacioacuten de agua Millipore modelo Milli-Q gradient A-10ZMQSSVOT4
Estacioacuten de concentracioacuten por corriente de nitroacutegeno Mini-Vap Supelco
Sistema de secado de cartuchos de SPE por corriente de nitroacutegeno VisiDry Supelco
Sistema distribuidor de vaciacuteo Visiprep reg Supelco
Cromatoacutegrafo de liacutequidos de ultra-alta resolucioacuten Waters AcquityUPLC reg y espectroacutemetro de masas
Acquity TQD con analizador de triple quadrupolo (QqQ) equipado con una fuente de ionizacioacuten a
presioacuten atmosfeacuterica del tipo Z-spray (ESI)
3 PREPARACIOacuteN DE LAS DISOLUCIONES
Los patrones de pesticidas se prepararon individualmente a partir de los compuestos soacutelidos comerciales por
pesada excepto en el caso del fenpropidin (FEP) que se preparoacute a partir del compuesto liacutequido comercial Estos
compuestos soacutelidos se disolvieron en metanol y se obtuvieron unas disoluciones iniciales con concentraciones
recogidas en la Tabla III1
25
Capiacutetulo III Parte experimental
Tabla III1 Concentracioacuten de las disoluciones patroacuten stock
Compuesto Concentracioacuten (microgmL) Compuesto Concentracioacuten (microgmL)
AME 102201 MET 118912
BEN 138330 MYC 102017
BOS 99474 PEN 129791
CAR 17105 PYC 104581
CYP 131075 PYM 141386
DIM 103009 TEC 134729
FEH 99584 TEF 137769
FEP 100000 TBZ 105928
FLU 126859 TME 112283
IMI 101123 THI-M 124202
IPR 106739 TRI 118933
MAN 101021
4 LAVADO DEL MATERIAL
La limpieza del material de vidrio utilizado en el laboratorio se realizoacute utilizando jaboacuten y aclarando con agua de
grifo Luego en primer lugar se realiza un enjuague con agua Milli-Q finalmente un segundo enjuague con
acetona para eliminar posibles restos de compuestos orgaacutenicos y se deja secar sobre papel
Para la limpieza de los conectores de tefloacuten empleados en el proceso de SPE se introducen en un vaso de
precipitados con metanol y este en un bantildeo de ultrasonidos durante 10 minutos Al finalizar con el bantildeo de
ultrasonidos se realiza un enjuague con acetona y se pone a secar
5 EXTRACCIOacuteN DE MUESTRAS MEDIANTE SPE
El meacutetodo de extraccioacuten utilizado para la determinacioacuten de pesticidas fue la extraccioacuten en fase soacutelida (SPE)
mediante cartuchos Oasis HLB de 200 mg A continuacioacuten se describe el protocolo de extraccioacuten en las
condiciones oacuteptimas
26
Capiacutetulo III Parte experimental
1 Acondicionamiento del cartucho Oasis HLB de 200 mg con 2 mL de acetonitrilo seguidos de otros 2 mL de
vino sinteacutetico formado por la mezcla etanolagua MilliQ (1288)
2 Paso de la muestra 2 mL de vino diluiacutedos con 2 mL de agua MilliQ a traveacutes del cartucho por gravedad
3 Lavado del cartucho con 2 mL de agua MilliQ
4 Secado del cartucho durante 45 minutos en el VisiDry mediante el paso de una corriente de nitroacutegeno
5 Elucioacuten del cartucho con la mezcla metanolacetonitrilo en proporcioacuten 2080 hasta un volumen final de 2
mL
6 Anaacutelisis mediante cromatografiacutea liacutequida acoplada a espectrometriacutea de masas en taacutendem UPLC-MSMS
(volumen de inyeccioacuten 15 microL)
Representacioacuten esquematizada en la Figura III1
Figura III1 Extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) de las muestras de vino
27
Capiacutetulo III Parte experimental
6 CONDICIONES DE DETERMINACIOacuteN MEDIANTE UPLC-MSMS
En la Tabla III2 se indican las condiciones utlizadas en la determinacioacuten de los pesticidas de intereacutes mediante
LC-MSMS y en la Tabla III3 se muestra el gradiente de la fase moacutevil utilizado para la separacioacuten
cromatograacutefica
Tabla III2 Condiciones experimentales de determinacioacuten en LC-MSMS
UPLC Acquity UPLC-I-Class IVD System
bull Columna cromatograacutefica Zorbax Eclipse Plus C18 Rapid Resolution HD
Fase estacionaria C18
Dimensiones 21 x 50 mm
Tamantildeo de partiacutecula 18 microm
Temperatura del horno 40ordmC
bull Inyector
Volumen de inyeccioacuten 15 microL
bull Fase moacutevil
Flujo 04 mLmin
Fase acuosa (A) Agua MilliQ con 01 aacutecido foacutermico
Fase orgaacutenica (B) Acetonitrilo con 01 aacutecido foacutermico
MSMS WatersXevo TQD
Modo de ionizacioacuten ESI positivo
Voltaje del capilar 15 kV
Voltaje de cono 50 V
Temperatura de gas de secado (N2) 450ordmC
Flujo de gas de secado (N2) 1000 Lh
Modo de adquisicioacuten Centroide
Tabla III3 Gradiente de fase moacutevil utilizado en la separacioacuten cromatograacutefica (LC)
Tiempo min 0 13 28 64 75 76 10
A 98 50 50 0 0 98 98
B 2 50 50 100 100 2 2
28
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
CAPIacuteTULO IV RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
1 IDENTIFICACIOacuteN DE LOS COMPUESTOS
Para empezar el estudio en primer lugar se realizoacute la caracterizacioacuten de las condiciones de determinacioacuten de los
analitos en el modo Multiple Reaction Monitoring (MRM) mediante UPLC-ESI-MSMS Para llevarla a cabo se
tomaron patrones individuales de cada fitosanitario y mediante infusioacuten se estudiaron las posibles transiciones y
voltajes oacuteptimos para su determinacioacuten (Tabla IV1)
La ionizacioacuten por electrospray (ESI) se estudioacute tanto en modo positivo como en modo negativo encontraacutendose
que para todos los pesticidas de nuestro intereacutes se obteniacutea sentildeal en el modo positivo mientras el modo negativo
no presentaba respuesta significativa
A continuacioacuten se estudia el efecto del voltaje de cono en la respuesta del ioacuten molecular [M+H]+ aumentaacutendolo
hasta alcanzar el valor maacuteximo de la sentildeal correspondiente a dicho ioacuten y luego se optimiza la energiacutea de colisioacuten
variaacutendola para cada analito hasta obtener la sentildeal de mayor intensidad para cada uno de los iones producto Por
uacuteltimo una vez optimizado el voltaje de cono y la energiacutea de colisioacuten se seleccionan las dos transiciones maacutes
intensas para llevar a cabo la cuantificacioacuten y cualificacioacuten de cada analito en modo MRM Este procedimiento se
realizoacute para la totalidad de los compuestos confirmando los datos obtenidos con los facilitados por la base de
datos Quanpedia que estaacute disponible en el software del equipo utilizado para algunos de los compuestos
considerados
Compuesto Tr (min) Ion precursor (mz Da)
Voltaje de cono (V)
Ion producto 1 (CEv)
cuantificacioacuten
Ion producto 2 (CEv)
cualificacioacuten
Relacioacuten IP2IP1
AME 325 2760 60 176 (35) 70 (50) 016
BEN 485 3261 26 148 (20) 91 (34) 067
BOS 387 3429 41 140 (20) 307 (20) 011
CAR 167 1921 33 160 (18) 132 (28) 014
CYP 311 2260 56 93 (33) 108 (25) 061
DIM 322 3881 40 301 (20) 165 (30) 057
FEH 386 3021 41 97 (22) 55 (38) 044
FEP 257 2742 55 147 (28) 86 (28) 093
FLU 401 3830 40 173 (20) 365 (15) 010
IMI 218 2561 34 209 (15) 175 (20) 091
IPR 358 3211 28 119 (16) 203 (10) 042
Tabla IV1 Tiempos de retencioacuten (Tr) relacioacuten de iones precursores (mz) voltaje de cono (V) energiacuteas de colisioacuten (CE) y relacioacuten de intensidades entre transiciones (IP2IP1)
29
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Compuesto Tr (min) Ion precursor (mz Da)
Voltaje de cono (V)
Ion producto 1 (CEv)
cuantificacioacuten
Ion producto 2 (CEv)
cualificacioacuten
Relacioacuten IP2IP1
MAN 392 4120 25 328 (16) 125 (35) 063
MET 283 2801 26 220 (13) 192 (17) 057
MYC 365 2891 34 70 (18) 125 (32) 029
PEN 417 2840 34 70 (16) 159 (34) 031
PYC 523 3881 31 194 (12) 163 (25) 066
PYM 266 2000 51 107 (24) 82 (24) 071
TEC 397 3080 40 70 (22) 125 (40) 007
TEF 473 3531 19 133 (20) 297 (8) 072
TBZ 182 2020 51 175 (25) 131 (30) 062
TME 203 2920 28 211 (12) 132 (22) 047
THI-M 257 3430 28 151 (46) 93 (19) 0001
TRI 319 2961 21 70 (10) 99 (15) 013
El dwell time para cada una de las transiciones se ajustoacute de manera automaacutetica por el software (MassLinx) con
objeto de obtener doce puntos espectrales por compuesto tomando un valor promedio de cuatro segundos como
ancho de pico a liacutenea de base
2 CARACTERIZACIOacuteN DEL PROCEDIMIENTO DE DETERMINACIOacuteN (UPLC-ESI-
MSMS)
Una vez optimizados los paraacutemetros que afectan a la separacioacuten cromatograacutefica (UPLC) y a la determinacioacuten por
espectrometriacutea de masas en taacutendem (MSMS) se lleva a cabo la evaluacioacuten de la repetibilidad de inyeccioacuten y
determinacioacuten en esas condiciones Se expresa por medio de la desviacioacuten estaacutendar relativa (RSD) paraacutemetro que
nos indica el grado de correlacioacuten que existe entre varias medidas del mismo patroacuten realizadas por el mismo
operador en el laboratorio y en el mismo equipo de medida a lo largo de un diacutea Para el estudio se realizan diez
inyecciones con volumen de 15 microL de dos patrones con distintos niveles de concentracioacuten 5 y 20 ngmL Los
datos de RSD (Tabla IV2) para las aacutereas de pico de los analitos se situacutean para el nivel de concentracioacuten 5 ngmL
en el rango 2-13 y en el nivel de concentracioacuten 20 ngmL en el rango 1-7
30
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten Tabla IV2 Desviacioacuten estaacutendar relativa (RSD) del aacuterea de pico (transicioacuten de cuantificacioacuten) para evaluar la repetivilidad del proceso de LC-MSMS
Compuesto RSD
5 ngmL
RSD
20 ngmL Compuesto
RSD
5 ngmL
RSD
20 ngmL
AME 5 2 MET 3 2
BEN 2 2 MYC 9 2
BOS 4 5 PEN 4 4
CAR 4 2 PYC 3 1
CYP 5 7 PYM 7 3
DIM 6 5 TEC 3 2
FEH 7 4 TEF 4 2
FEP 4 2 TBZ 2 1
FLU 5 3 TME 6 6
IMI 13 7 THI-M a 6
IPR 8 2 TRI 8 6
MAN 3 2
A continuacioacuten tambieacuten se evaluoacute la repetibilidad de los tiempos de retencioacuten (Tr) para diez inyecciones de
patrones a los dos niveles de concentracioacuten 5 y 20 ngmL situaacutendose las RSD para todos los compuestos en el
rango 01-03 En base a este dato la ventana de tiempo en la que se registran las transiciones de MRM de cada
compuesto se fijoacute en 05 min lo que es lo mismo 025 min alrededor del valor medio de su tiempo de retencioacuten
Por otro lado la linealidad del meacutetodo se estudioacute a nueve niveles de concentracioacuten diferentes comprendidos ente
los niveles 05 ngmL y 200 ngmL mediante la inyeccioacuten de disoluciones patroacuten de los distintos compuestos de
estudio Se realizoacute una evaluacioacuten sin y otra con patroacuten interno (IS) antildeadiendo una concentracioacuten fija de patrones
internos a nivel de 25 ngmL y pudimos observar que los resultados mejoran notablemente al realizar una
correccioacuten con el IS En la Tabla IV3 se muestran los coeficientes de determinacioacuten (R2) obtenidos al realizar la
correccioacuten mediante IS observando que para todos los compuestos excepto para THI-M y para TRI los
coeficientes de correlacioacuten son superiores a 0990 por lo que existe una respuesta lineal en el rango de
concentraciones que hemos estudiado
Aparte del estudio de la linealidad tambieacuten se han estudiado los liacutemites de cuantificacioacuten instrumentales del
meacutetodo (LOQs) Para ello los LOQs se evaluacutean como la miacutenima cantidad de analito que origina una sentildeal 10
veces superior a la desviacioacuten estaacutendar del ruido Los valores anteriores se estimaron a partir del patroacuten de
a no evaluado ya que se encuentra por debajo del liacutemite de cuantificacioacuten del meacutetodo
31
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
concentracioacuten maacutes baja que presenta un pico con una relacioacuten SN superior a 10 En la Tabla IV3 tambieacuten se
recogen estos LOQs en doacutende podemos ver que variacutean en el rango 01-1 ngmL excepto para THI-M que se
desviacutea a valores de 10 ngmL
Tabla IV3 Coeficientes de determinacioacuten (R2) y liacutemites de cuantificacioacuten instrumentales (LOQs) de los analitos para nueve
niveles de concentracioacuten de 05 a 200 ngmL
Compuesto Coeficiente de
correlacioacuten (R2)
LOQs (ngmL) Compuesto
Coeficiente de correlacioacuten
(R2)
LOQs (ngmL)
AME 09951 04 MET 09933 01
BEN 09949 01 MYC 09950 04
BOS 09979 02 PEN 09945 02
CAR 09923 02 PYC 09955 02
CYP 09878 02 PYM 09931 01
DIM 09938 07 TEC 09958 05
FEH 09959 05 TEF 09957 01
FEP 09931 01 TBZ 09942 02
FLU 09965 02 TME 09903 01
IMI 09979 05 THI-M 09580 100
IPR 09938 01 TRI 09867 07
MAN 09979 01
En la Figura IV1 y Figura IV2 se muestran dos ejemplo de curvas de calibrado para dos compuestos IMI y
MAN respectivamente
Figura IV1 Curva de calibrado y coeficiente de determinacioacuten de IMI para UPLC-ESI-MSMS
32
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Figura IV2 Curva de calibrado y coeficiente de determinacioacuten de MAN para UPLC-ESI-MSMS
3 ESTUDIO DEL MEacuteTODO SPE
La extraccioacuten de pesticidas se llevoacute a cabo mediante extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) en doacutende se realizaron
diversos estudios con diferentes condiciones para dar con las oacuteptimas En primer lugar se llevaron a cabo los
experimentos de retencioacuten y elucioacuten sobre dos tipos distintos de adsorbentes cartuchos OASIS HLB (200mg) y
cartuchos OASIS MAX (150 mg) como fases potenciales en las que llevar a cabo la extraccioacuten de manera
selectiva Los dos tipos de cartuchos son de fase reversa pero difieren entre siacute en el fundamento de retencioacuten de
los analitos En los cartuchos OASIS HLB (200 mg) formados por divinilbenceno-N-vinilpirrolidona (DVB-VP)
la retencioacuten de los diferentes analitos tiene lugar por interacciones π-π o de Van der Waals mientras que los
cartuchos OASIS MAX (150 mg) que se probaron como alternativa para mejorar la selectividad en la extraccioacuten
cuentan con un adsorbente polimeacuterico de modo mixto formado por divinilbenceno-N-vinilpirrolidona (DVB-VP)
funcionalizado con grupos amina cuaternaria siendo el fundamento de la extraccioacuten la combinacioacuten de las
propiedades adsorbentes del cartucho HLB con un mecanismo adicional de intercambio ioacutenico (anioacutenico) [27]
Algunos autores han empleado este mecanismo para mejorar la selectividad de la extraccioacuten de forma que en la
etapa de elucioacuten ciertos pigmentos del vino quedan fuertemente retenidos en el adsorbente a diferencia de lo que
ocurre con los adsorbentes de fase reversa [51]
Para llevar a cabo la eleccioacuten del tipo de adsorbente se realizaron pruebas con 10 mL de vino blanco y tinto
conectando en serie los dos tipos de cartuchos HLB (200 mg) y MAX (150 mg) a un segundo cartucho OASIS
HLB (60 mg) La elucioacuten de los analitos se hace de forma independiente para cada cartucho y se evaluacutea si los
analitos pasan del primer cartucho hacia el segundo cartucho es decir si se supera el volumen de corte o si por
33
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
otro lado se quedan retenidos en el primero y no eluyen hacia el segundo En estas pruebas de estudio
preliminares de preparacioacuten de la muestra no se ha incluido el CYP
En la Figura IV3 podemos ver la eficacia de la extraccioacuten para vino blanco y tinto que obtenemos empleando
cartuchos OASIS MAX (150 mg) conectados en serie con cartuchos OASIS HLB (60 mg) realizando la
extraccioacuten de tres fracciones de 2 mL cada una del cartucho OASIS MAX (150 mg) y una cuarta fraccioacuten de 2
mL del cartucho OASIS HLB (60 mg)
Por otro lado en la Figura IV4 podemos ver un graacutefico de columnas en el cual comparamos la eficacia de
extraccioacuten de los cartuchos OASIS HLB (200 mg) con dos disolventes de elucioacuten distintos En dicho graacutefica el
acroacutenimo de cada compuesto consta de dos barras cuyo significado es el siguiente la barra de la izquierda indica
la eficacia de la extraccioacuten empleando acetonitrilo (ACN) como disolvente de elucioacuten y la barra de la derecha
indica la eficacia de la extraccioacuten empleando la combinacioacuten MetanolAcetonitrilo (2080) (MeOHACN) como
disolvente de elucioacuten Para este adsorbente no se detectoacute ninguacuten compuesto en la extraccioacuten del segundo
cartuchos OASIS HLB (60 mg) empleando 2 mL de metanol
Figura IV3 Distribucioacuten de los compuestos en cada fraccioacuten obtenidas con cartuchos OASIS MAX (150 mg)
utilizando 10 mL de vino tinto y blanco sacando cuatro fracciones de 2 mL cada una con metanol como
disolvente de elucioacuten
34
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Figura IV4 Distribucioacuten de los compuestos en cada fraccioacuten obtenidas con cartuchos OASIS HLB (200 mg) utilizando 10
mL de vino tinto y blanco sacando 3 fracciones de 2 mL cada una con acetonitrilo (ACN) (columna de la izquierda) y una
combinacioacuten MetanolAcetonitrilo (2080) (MeOHACN) (columna de la derecha) como disolventes de elucioacuten
A la vista de los resultados reflejados en las graacuteficas podemos afirmar que cuando se utiliza el cartucho OASIS
HLB (200 mg) eluyendo con acetonitrilo o la combinacioacuten metanolacetonitrilo (2080) los extractos son limpios
y se eluyen la mayoriacutea de los compuestos en la primera fraccioacuten Pero utilizando acetonitrilo como disolvente de
elucioacuten se encuentran problemas en la extraccioacuten de CAR FEH y TBZ para los que es necesario emplear un
volumen mayor de elucioacuten o bien seleccionar otro disolvente de elucioacuten como es la combinacioacuten
metanolacetonitrilo
35
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Por otro lado los extractos en los cartuchos OASIS MAX (150 mg) son maacutes limpios incluso utilizando metanol en
la elucioacuten pero se detecta la presencia de CAR FEP TBZ y TME en el segundo cartucho OASIS HLB (60 mg)
significando la rotura del primer cartucho para dichos analitos considerando un volumen de 10 mL de vino Los
demaacutes compuestos se podriacutean recuperar cuantitativamente en la primera fraccioacuten sacada pero la peacuterdida de estos
compuestos inclina la eleccioacuten hacia los cartuchos OASIS HLB (200 mg) con metanolacetonitrilo (2080) como
disolvente de elucioacuten para continuar con el estudio
Una vez fijado el adsorbente y el volumen de elucioacuten se prueba la eficacia de la SPE independiente de los efectos
de matriz En la Tabla IV4 se muestran las recuperaciones de la SPE tomando 10 mL de vino blanco y tinto
con un nivel de adicioacuten de 15 ngmL sacando una sola fraccioacuten de 2 mL con la combinacioacuten
metanolacetonitrilo (2080) y n=3 reacuteplicas
Tabla IV4 Recuperaciones (R plusmn SD) de SPE para 10 mL de vino (blanco y tinto) con un nivel de adicioacuten de 15 ngmL y
n=3 reacuteplicas
Compuesto Vino Tinto
R plusmn SD
Vino Blanco
R plusmnSD Compuesto
Vino Tinto
R plusmn SD
Vino Blanco
R plusmn SD
AME 82 plusmn 7 100 plusmn 1 MET 92 plusmn 6 94 plusmn 3
BEN 89 plusmn 6 97 plusmn 3 MYC 90 plusmn 9 86 plusmn 4
BOS 95 plusmn 1 100 plusmn 2 PEN 84 plusmn 10 103 plusmn 3
CAR 91 plusmn 6 104 plusmn 6 PYC 86 plusmn 5 106 plusmn 1
CYP 81 plusmn 7 102 plusmn 3 PYM 87 plusmn 12 94 plusmn 3
DIM 97 plusmn 3 86 plusmn 4 TEC 83 plusmn 10 103 plusmn 1
FEH 89 plusmn 3 88 plusmn 3 TEF 84 plusmn 5 108 plusmn 4
FEP 91 plusmn 7 104 plusmn 3 TBZ 88 plusmn 7 92 plusmn 5
FLU 91 plusmn 2 97 plusmn 4 TME 101 plusmn 1 110 plusmn 13
IMI 117 plusmn 8 101 plusmn 11 THI-M 85 plusmn 9 110 plusmn 4
IPR 89 plusmn 7 112 plusmn 4 TRI 85 plusmn 10 110 plusmn 4
MAN 88 plusmn 2 87 plusmn 2
Algunos compuestos de la matriz en el vino pueden competir con los analitos durante el proceso de ionizacioacuten
que tiene lugar en la interfase entre UPLC-MSMS por lo que para la cuantificacioacuten del rendimiento de la
ionizacioacuten por electrospray (ESI) se estudian los efectos de matriz (EM) para vino blanco y tinto considerando
dos voluacutemenes de muestra distintos 2 y 10 mL y un volumen final del extracto de 2 mL En la Tabla IV5 se
36
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
exponen los valores para cada compuesto notando que al aumentar el volumen de muestra tambieacuten se aumentan
los efectos de matriz y eacutestos siempre son mayores en vino tinto Para el caacutelculo de estos efectos de matriz (EM)
se emplea la siguiente ecuacioacuten
Donde Am Ab y Ap representan el aacuterea de pico en la sentildeal medida del analito en el extracto de la muestra con
adicioacuten en el extracto de la muestra sin adicioacuten (o blanco) y en el patroacuten antildeadido respectivamente El nivel de
adicioacuten en extracto fue de 50 ngmL por compuesto
Tabla IV5 Efectos de matriz para vino blanco y tinto con un volumen inicial de 2 y 10 mL evaluados para un nivel de adicioacuten de 50 ngmL en extracto
Compuesto
Vino blanco Vino tinto
2 mL 10 mL 2mL 10 mL
EM () CV () EM () CV () EM () CV () EM () CV()
AME 93 3 95 2 99 3 101 7
BEN 99 1 93 2 101 3 100 6
BOS 97 5 98 1 108 2 96 0
CAR 62 2 50 3 58 2 55 6
CYP 94 3 91 1 97 2 95 7
DIM 105 2 95 3 100 3 108 3
FEH 100 4 102 4 105 4 94 3
FEP 95 3 88 2 96 2 92 7
FLU 98 2 93 2 106 1 101 2
IMI 84 4 46 3 48 10 18 8
IPR 99 3 92 3 105 1 100 7
MAN 100 1 94 3 109 4 107 2
MET 98 1 89 1 99 2 99 6
MYC 105 1 100 1 103 2 96 9
PEN 98 3 97 1 101 3 99 10
PYC 98 2 92 3 102 2 98 5
PYM 95 2 87 1 94 3 85 12
TEC 95 3 99 1 101 1 102 10
TEF 99 1 92 3 101 2 104 5
TBZ 45 0 40 5 43 2 30 7
TME 60 6 19 16 36 4 16 1
THI-M 107 2 109 2 103 1 96 9
TRI 97 3 118 4 104 5 117 10
37
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Al observar los resultados podemos ver que la mayoriacutea de los compuestos dan resultados de EM en torno al
100 lo que significa que no sufren una modificacioacuten importante en la eficacia de ionizacioacuten para las muestras
con respecto a los patrones Pero tambieacuten por el contrario podemos observar que algunos compuestos como
por ejemplo en el caso de CAR TBZ IMI y TME experimentan una gran supresioacuten de sentildeal es decir EM bajos
que se acentuacutean al aumentar el volumen de muestra La atenuacioacuten en la eficacia de variacioacuten para estos cuatro
compuestos no solo se ve incrementada con el volumen de muestra si no que ademaacutes es maacutes significativa para
vino tinto que para vino blanco En base a estos resultados aunque la eficacia de la SPE fue cuantitativa para
muestras de 10 mL se limitoacute el volumen de muestra a extraer a 2 mL
Las condiciones oacuteptimas de extraccioacuten se esquematizan en un resumen en la Figura IV5
Figura IV5 Condiciones optimizadas para la extraccioacuten de pesticidas en vino
38
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
4 CARACTERIZACIOacuteN DEL MEacuteTODO DE DETERMINACIOacuteN
Con las condiciones de extraccioacuten y determinacioacuten citadas anteriormente se llevaron a cabo pruebas de
recuperaciones absolutas de los compuestos a nivel de adicioacuten de 5 y 20 ngmL sobre las muestras Para cada
muestra y nivel de adicioacuten se realizaron tres reacuteplicas de las muestras con adicioacuten y los blancos aliacutecuotas de las
mismas muestras sin adicioacuten se procesaron en duplicado Los IS se antildeadieron a nivel de 25 ngmL y cada uno se
utiliza para corregir unos determinados compuestos CAR-d3 se emplea para CAR y TBZ el CYP-d5 para CYP y
PYM el IMID-d4 para IMI y TME y el MET13C6 para el resto de compuestos Los resultados para vino blanco
comprenden en el nivel de concentracioacuten 5 ngmL el rango entre 79-122 y en el nivel de concentracioacuten 20
ngmL el rango entre 84-109 Por otro lado en el caso del vino tinto las recuperaciones se encuentran para el
nivel de concentracioacuten 5 ngmL en el rango 67-112 y para el nivel de concentracioacuten 20 ngmL entre el rango
73-132 Los resultados obtenidos en las pruebas con vino blanco y vino tinto se muestran en la Tabla IV6
Los resultados son satisfactorios ya que la mayoriacutea de los compuestos se ajustan en todos los casos al rango de
recuperacioacuten entre 70-120 Para la realizacioacuten de estas pruebas se ha eliminado de los resultados el compuesto
THI-M debido a que las concentraciones utilizadas se encuentran en el liacutemite o por debajo del LOQ en los
experimentos con muestras adicionadas a 5 ngmL
Para calcular las recuperaciones (R) se recurrioacute a la siguiente ecuacioacuten
Donde Cm Cb y Cp son la concentracioacuten medida de analito en el extracto de la muestra con adicioacuten en el extracto
de la muestra sin adicioacuten (o blanco) y en el patroacuten antildeadido respectivamente
Tabla IV6 Recuperaciones (R) para vino tinto y vino blanco evaluadas para dos niveles de concentracioacuten 5 y 20 ngmL
Compuesto
Vino tinto Vino Blanco
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
AME 97 3 105 6 104 9 96 5
BEN 88 11 105 3 101 1 98 4
BOS 91 13 110 2 88 13 97 3
39
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Compuesto
Vino tinto Vino blanco
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
CAR 99 6 99 3 122 3 109 1
CYP 91 2 111 1 101 4 100 6
DIM 112 3 110 9 102 24 99 11
FEH 91 4 108 0 102 20 95 2
FEP 89 8 102 7 94 5 84 1
FLU 95 10 104 4 109 5 100 8
IMI 73 11 115 9 80 13 100 2
IPR 84 13 99 3 111 3 99 4
MAN 88 22 112 8 112 3 99 4
MET 99 3 106 5 106 3 98 2
MYC 84 9 106 13 88 17 86 3
PEN 84 9 102 5 84 8 90 5
PYC 96 6 105 4 100 2 95 4
PYM 90 12 112 14 106 4 97 1
TEC 89 8 101 6 98 12 94 1
TEF 93 10 102 5 107 2 97 3
TBZ 94 17 115 8 79 5 106 2
TME 67 2 101 7 84 18 90 11
THI-M ne - 74 7 ne - 89 24
TRI 88 12 97 6 102 6 92 2
ne No evaluado El nivel de adicioacuten es inferior al LOQ del meacutetodo para este compuesto
Para estudiar la reproducibilidad del meacutetodo analiacutetico global (correspondientes a los datos de preparacioacuten de
muestra y determinacioacuten) es decir la concordancia de varias medidas realizadas en diacuteas diferentes se procedioacute a la
extraccioacuten en las condiciones oacuteptimas tanto de vino blanco como tinto Las extracciones y determinaciones se
realizaron durante tres diacuteas consecutivos realizando tres reacuteplicas por vino y por diacutea con un nivel de adicioacuten en
muestra de 10 ngmL un blanco de muestra cada diacutea En la Tabla IV7 se muestran los resultados como
recuperaciones (R) en condiciones de reproducibilidad obtenidos para ambos tipos de vino dando valores entre
64-116 para muestras de vino blanco y valores situados entre 68-108 para muestras de vino tinto con la
excepcioacuten del TME para el que se ha obtenido un valor no aceptable en cuanto a la exactitud medida en
condiciones de reproducibilidad A la vista de los resultados obtenidos con estas pruebas se considera necesario el
empleo de IS adicionales para la mejora en la exactitud del meacutetodo para algunos compuestos por ejemplo el
TME
40
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Tabla IV7 Recuperaciones en condiciones de reproducibilidad (R plusmn SD) para vino blanco y tinto
Compuesto
Vino tinto Vino blanco
R
10 ngmL CV ()
R
10 ngmL CV ()
AME 90 5 101 13
BEN 96 5 102 7
BOS 97 6 100 8
CAR 97 3 94 5
CYP 103 3 105 12
DIM 104 7 106 8
FEH 90 16 83 15
FEP 91 5 90 4
FLU 103 7 102 6
IMI 99 14 101 14
IPR 91 5 100 13
MAN 108 5 108 13
MET 101 5 101 5
MYC 105 16 102 14
PEN 96 11 92 10
PYC 99 12 97 12
PYM 102 4 116 8
TEC 99 9 97 16
TEF 99 8 105 11
TBZ 68 4 84 5
TME 47 13 64 10
THI-M 107 11 104 16
TRI 95 14 103 4
En la Tabla IV8 se muestran los liacutemites de cuantificacioacuten (LOQs) del meacutetodo del meacutetodo de SPE-UPLC-ESI-
MSMS obtenidos para los diferentes pesticidas Los valores obtenidos son ideacutenticos a los LOQs instrumentales
excepto en el caso de aquellos compuestos para los que se observaronfuertes efectos de matriz (Tabla IV5) En
estos casos (CAR TBZ IMI y TME) los LOQs del meacutetodo se incrementan seguacuten la atenuacioacuten de sentildeal
observada
41
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Tabla IV8 Liacutemites de cuantificacioacuten LOQs (ngmL) del meacutetodo obtendos para cada compuesto
Compuesto LOQ (ngmL) Compuesto LOQ (ngmL)
AME 04 MET 01
BEN 01 MYC 04
BOS 02 PEN 02
CAR 03 PYC 02
CYP 02 PYM 01
DIM 07 TEC 05
FEH 05 TEF 01
FEP 01 TBZ 04
FLU 02 TME 02
IMI 06 THI-M 10
IPR 01 TRI 07
MAN 01
5 APLICACIOacuteN A MUESTRAS DE VINO COMERCIALES
Una vez optimizadas las condiciones del meacutetodo y estudiadas las caracteriacutesticas del meacutetodo desarrollado se aplicoacute
a la determinacioacuten de los compuestos de intereacutes estudiados en muestras de vino blanco y vino tinto comerciales
producidos en diferentes paiacuteses En la Tabla IV9 se muestra el paiacutes de origen de cada muestra comercial
identificadas con un coacutedigo alfanumeacuterico y antildeo de produccioacuten
42
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Tabla IV9 Coacutedigo asignado para los diferentes vinos comerciales blancos y tintos analizados Indicando el paiacutes de origen y
antildeo de produccioacuten
Coacutedigo Denominacioacuten de origen Antildeo de produccioacuten
bull Vinos Blancos
W1 Alemania 2014
W2 Espantildea 2012
W3 Espantildea 2016
W4 Portugal Desconocido
W5 Francia 2015
W6 Francia 2015
W7 Espantildea 2016
bull Vinos Tintos
R1 Espantildea 2015
R2 Sudaacutefrica 2015
R3 Chile 2015
R4 Francia 2015
R5 China Desconocido
R6 Espantildea 2016
R7 Australia 2014
R8 Francia 2013
R9 Francia 2015
A continuacioacuten en la Tabla IV10 y la Tabla IV11 se recogen los resultados obtenidos en el anaacutelisis de las
muestras comerciales Los datos obtenidos corresponden en todos los casos al uso de patrones de calibracioacuten
como teacutecnica de cuantificacioacuten
Tabla IV10 Concentracioacuten (ngmL) encontradas en las diferentes muestras de vino blanco comercial analizadas mediante
SPE-UPLC-MSMS n=2 reacuteplicas y al final el sumatorio de las concentraciones encontradas
Compuesto W1 W2 W3 W4 W5 W6 W7
AME 04 nd nd nd 41 nd nd
BEN nd nd 14 nd nd nd nd
BOS 84 102 520 54 197 nd nd
CAR nd 115 56 nd nd nd nd
CYP 08 59 112 nd nd 26 nd
43
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Compuesto W1 W2 W3 W4 W5 W6 W7
DIM 14 84 400 09 32 50 nd
FEH 85 809 639 15 187 nd nd
FLU 11 05 92 nd 77 32 nd
IMI nd 136 88 29 nd nd 69
IPR 30 749 1144 14 nd nd nd
MAN nd nd nd nd nd 30 nd
MET 04 273 494 63 nd nd 172
MYC 09 nd 35 nd nd nd nd
PYM 15 469 584 08 24 35 nd
TEC 11 nd 58 nd nd nd nd
TRI nd 67 61 nd nd nd nd
sumconcentracioacuten
(ngmL) 274 2868 4358 192 558 173 862
nd no detectado
Tabla IV11 Concentracioacuten (ngmL) encontradas en las diferentes muestras de vino tinto comercial analizadas mediante
SPE-UPLC-MSMS n= 2 reacuteplicas y al final el sumatorio de las concentraciones encontradas
Compuesto R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9
AME nd nd nd 30 nd nd nd nd 16
BEN nd nd nd 07 nd nd nd nd nd
BOS nd 55 21 196 nd nd nd 73 21
CAR nd nd 04 17 249 20 nd nd nd
CYP 34 08 02 22 nd 136 nd 85 nd
DIM nd 33 nd 52 233 46 nd 61 23
FEH nd nd nd 1070 nd 10 nd 1307 14
FLU nd nd nd 20 nd nd nd nd nd
IPR 16 nd nd 17 nd 22 nd nd nd
MAN nd nd nd 17 nd nd nd 20 nd
MET 126 nd nd 14 55 313 30 44 39
MYC nd nd nd 05 nd 32 nd nd nd
PYM 19 nd 03 185 49 281 nd 24 nd
TEC 25 06 39 29 nd nd nd 21 20
TEF nd 01 12 nd nd nd nd nd nd
sumconcentracioacuten
(ngmL) 220 48 81 1681 586 860 30 1635 133
nd no detectado 44
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
En los resultados de los anaacutelisis podemos observar que en ninguna de las muestras comerciales de vino blanco
aparecieron los siguientes compuestos FEP PEN PYC TEF TBZ THI-M y TME y en los vinos tintos
comerciales no aparece a ninguna concentracioacuten FEP IMI PEN PYC TBZ TME THI-M y TRI No se
detectaron para dichas muestras de vino a niveles superiores a los LOQs del meacutetodo propuesto
Cuando se detecta un compuesto positivo se compara el pico cromatograacutefico del compuesto con el de un patroacuten
verificando la coincidencia del tiempo de retencioacuten (maacutexima diferencia 01 min) y la relacioacuten entre transiciones
(maacutexima diferencia 30 ) En la Figura IV6 y la Figura IV7 se muestran los cromatogramas para el compuesto
CYP obtenido en condiciones oacuteptimas para la muestra de vino blanco W6 y en un patroacuten de 5 ngmL
respectivamente En este caso el intervalo de tolerancia para la relacioacuten de intensidad entre transiciones es
IP2IP1=061plusmn018
Figura IV6 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el CYP en la muestra W6 (26 ngmL) Transicioacuten
superior 226gt93 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 226gt108 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades IP2IP1= 066
Figura IV7 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el CYP en un patroacuten de 5 ngmL Transicioacuten
superior 226gt93 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 226gt108 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades IP2IP1=061plusmn018
45
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Otro ejemplo de compuesto positivo en abundantes muestras comerciales de estudio es el Metalaxyl positivo con
una concentracioacuten de 04 ngmL en el vino con referencia W1 (Figura IV8) y positivo con una concentracioacuten de
313 ngmL en el vino con referencia R6 (Figura IV9) Ambas se comparan con el cromatograma de un patroacuten
de Metalaxyl de 1 ngmL (Figura IV10) El grado de concordancia en los tiempos de retencioacuten y la relacioacuten de
intensidades entre transiciones es satisfactorio
Figura IV8 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el MET en la muestra W1 (04 ngmL) Transicioacuten
superior 2801gt2201 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 2801gt1921 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades
IP2IP1=056
Figura IV9 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el MET en la muestra R6 (313 ngmL) Transicioacuten
superior 2801gt2201 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 2801gt1921 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades IP2IP1=
056
46
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Figura IV10 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el MET en un patroacuten de 1 ngmL Transicioacuten
superior 2801gt2201 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 2801gt1921 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades
IP2IP1=057plusmn017
Es de destacar que aunque se detectaron bastantes pesticidas en las diferentes muestras de vino comerciales pero
en ninguacuten caso superaron el 10 de los LMRs permitidos en uvas tal y como se recomienda ya que todaviacutea no
existen LMRs para vino en la legislacioacuten vigente No obstante el nivel total de concentracioacuten (sumatorio de
concentraciones Tabla IV10 y Tabla VI11) es significativo para varias muestras tanto de vinos blancos (W2 y
W3) como tintos (R4 y R8)
47
Capiacutetulo V Conclusiones
CAPIacuteTULO V CONCLUSIONES
En este trabajo se ha estudiado un meacutetodo para la cuantificacioacuten de pesticidas concretamente veinte fungicidas y
tres insecticidas en vino blanco y tinto En la etapa de preparacioacuten de muestra se optimizoacute la extraccioacuten en fase
soacutelida (SPE) utilizando cartuchos OASIS HLB (200 mg) compuestos por divinilbenceno-N-vinilpirrolidona
(DVB-VP) como adsorbente Como teacutecnica de determinacioacuten se utilizoacute cromatografiacutea de liacutequidos con una
interfase de electroespray acoplada a espectrometriacutea de masas (UPLC-ESI-MSMS)
Las conclusiones generales obtenidas a partir de los resultados de este proyecto relativo a la determinacioacuten de
fitosanitarios en vino son
Ante los problemas de retencioacuten que presentan los cartuchos OASIS MAX (150 mg) para algunos
compuestos los cartuchos OASIS HLB (200 mg) junto con la combinacioacuten metanolacetonitrilo (2080)
como disolvente de elucioacuten son elegidos como mejor opcioacuten en la extraccioacuten en fase soacutelida de pesticidas
en muestras con matrices complejas como es el caso del vino Asiacute se consigue la retencioacuten selectiva de
componentes de la matriz y proporciona extractos con menor porcentaje de interferencias
El meacutetodo estudiado y optimizado se puede aplicar tanto a vinos blancos como a vinos tintos procesados
a partir de distintas variedades de uvas
Los liacutemites de cuantificacioacuten (LOQs) del estudio se situacutean la mayoriacutea por debajo de 10 ngmL excepto
en el caso de THI-M que asciende al valor de 20 ngmL El rango de respuesta lineal abarca hasta 200
ngmL y el tiempo de anaacutelisis ha sido de solo 10 minutos por muestra
En todas las muestras de vino (blancos y tintos) comerciales analizadas se han detectado la presencia de
varios pesticidas sin embargo todas las concentraciones encontradas se encuentran por debajo del 10
de los LMRs fijados en uvas tal y como recomienda la legislacioacuten por lo que no se considera
preocupante
48
Capiacutetulo V Conclusioacutens
CAPIacuteTULO V CONCLUSIOacuteNS
Neste traballo estudouse un meacutetodo para a cuantificacioacuten de pesticidas en particular vinte funxicidas e tres
insecticidas en vintildeo branco e maacuteis tinto No paso da preparacioacuten da mostra optimizouse a extraccioacuten en fase
soacutelida (SPE) empregando cartuchos OASIS HLB (200 mg) compostos por divinilbenceno-N-pirrolidona (DVB-
VP) como adsorbente Para a teacutecnica de determinacioacuten utilizouse cromatografiacutea de liacutequidos con unha interfase de
electroespray acoplada a espectrometriacutea de masas (UPLC-ESI-MSMS)
As conclusioacutens xerais a obtidas a partir dos resultados deste proxecto relativo aacute determinacioacuten de pesticidas en
vintildeo son
Ante os problemas de retencioacuten que mostraban os cartuchos OASIS MAX (150 mg) para alguacuten
compostos os cartuchos OASIS HLB (200 mg) en conxunto coa mistura metanolacetonitrilo (2080)
como disolvente de elucioacuten son elexidos como mellor opcioacuten na extraccioacuten en fase soacutelida de pesticidas
en mostras con matrices complexas como eacute o caso do vintildeo Asiacute eacute conseguida a retencioacuten selectiva de
componentes da matriz e proporciona extractos con menos porcentaxe de interferencias
O meacutetodo estudado e optimizado poacutedese aplicar tanto a vintildeos brancos coma tintos procesados a partir de
diferentes variedades de uvas
Os liacutemites de cuantificacioacuten do estudo (LOQs) son maacuteis baixos de 10 ngmL agaacutes no caso do THI-M
que ascende ao valor de 20 ngmL O rango de resposta lineal cobre ata 200 ngmL e o tempo de anaacutelise
foi de soacute 10 minuacutetos por mostra
En todas as mostras de vintildeo (brancos e tintos) comercial analizadas detectouse a presenza de varios
pesticidas maacuteis poreacuten todas as concentracioacutens atopadas son inferiores ao 10 dos LMR fixados en uvas
tal e como recomenda a lexislacioacuten polo que non se considera preocupante
49
Chapter V Conclusions
CHAPTER V CONCLUSIONS
In this work we have studied a method for the quantification of pesticides specifically twenty fungicides and
three insecticides in white and red wine In the sample preparation step the solid phase extraction was optimized
using cartridges OASIS HLB (200 mg) containing divinylbenzene-N-vinylpyrrolidone (DVB-VP) as adsorbent
As determination technique ultraperformance liquid chromatography was used with an electrospray interface
coupled to mass spectrometry (UPLC-ESI-MS7MS)
The general conclusions drawn from the results of this project concerning the determination of pesticides in wine
are
Due to the retention problems presented by the OASIS MAX sorbent (150 mg) for some compounds of
this project the cartridges OASIS HLB (200 mg) together with the methanolacetonitrile (2080) mixture
are chosen as the best option in the solid phase extraction of pesticides in samples with complex
matrices as is the case with the wine
The method studied and optimized can be applied to both white and red wines obtained from different
varieties of grapes
The limits of quantification (LOQs) were below 10 ngmL for most of the compounds except in the
case of THI-M with a LOQ of to 10 ngmL The linear response range covers up to 200 ngmL and the
analysis time was only 10 minutes per sample
In all commercial wine samples (white and red) analyzed the presence of several pesticides was
conformed however all the concentrations obtained are below 10 of the Maximum residue
levels(MRLs) fixed in grapes as recommended by legislation
50
VI Bibliografiacutea VI BIBLIOGRAFIacuteA [1] Ministerio de agricultura y pesca alimentacioacuten y medio ambiente mhttpwwwmapamagobesescalidad-y-evaluacion-ambientaltemasproductos-quimicosfitosanitarios (Acceso el diacutea 11052017) [2] httpwwwcricyteduarenciclopediaterminosProducFitohtm (Acceso el diacutea 11052017) [3] WERNER BALTES ldquoQuiacutemica de los alimentosrdquo Editorial Acribia SA 2007 Capiacutetulo 11 ldquoResiduos en los alimentosrdquo paacuteginas 206-217
[4] RLabrada JCCaseley CParker ldquoESTUDIO FAO PRODUCCIOacuteN Y PROTECCIOacuteN VEGETAL 120rdquo Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentacioacuten Roma 1996 ISSN 1014- Capiacutetulo 10 Herbicidas httpwwwfaoorgdocrepT1147St1147s00htmContents (Acceso el diacutea 12052017)
[5] Taberner Palou Andreu Cirujeda Ranzenberger Alicia Zaragoza Larios Carlos ldquoManejo de poblaciones de malezas resistentes a herbicidasrdquo (FAO Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura) 100 preguntas sobre resistencia PDF sacado de httpwwwfaoorg3a-a1422spdf (Acceso el diacutea 12052017) [6] BISSET Juan A Uso correcto de insecticidas control de la resistencia Revista Cubana de Medicina Tropical 2002 vol 54 no 3 p 202-219 [7] DEVINE Gregor J EZA Dominique Ogusuku Elena FURLONGMichael J Uso de insecticidas contexto y consecuencias ecoloacutegicas Revista peruana de medicina experimental y Salud Puacuteblica 2008 vol 25 no 1 p 74-100 [8] Ministerio de agricultura y ganaderiacutea (proteccioacuten agropecuaria servicio de diagnoacutestico fitosanitario) de costa Rica httpwwwmaggocrbibliotecavirtualH20-5054pdf (Acceso el diacutea 11052017) [9] GEPP V MONDINO P Control quiacutemico 2011 PDF obtenido de httpwwwpvfagroeduuyfitopatodocscursosfitopatoMaterialesGuiasC-QUIMICOpdf (Acceso el diacutea 772017) [10] ROSSLENBROICH Hans-Juergen STUEBLER Dietrich Botrytis cinereamdashhistory of chemical control and novel fungicides for its management Crop Protection 2000 vol 19 no 8 p 557-561 [11] Figura 11 httpwwwvitiviniculturanetbotritis-o-podredumbre-gris-botrytis-cinerea-pershtml (Acceso el diacutea 12052017) [12] CAMPBELL Paul BENDEK Carlos LATORRE Bernardo A Riesgo de oiacutedio (Erysiphe necator) de la vid en relacioacuten con el desarrollo de los racimos Ciencia e investigacioacuten agraria 2007 vol 34 no 1 p 5-11 [13] ldquoCoacutemo combatir el oiacutedio de la vidrdquo Jose Javier Peacuterez de Obanos Castillo PDF sacado de httpswwwnavarraesNRrdonlyres05E65D9B-D1A2-4EAD-9A63-AFF1D3215552135109Comocombatireloidiodelavidpdf (Acceso el diacutea 12052017) [14] Imagen 12 sacadas las 3 de httpwwwvitiviniculturanetoidio-de-la-vidhtml (Acceso el diacutea 12052017) [15] BARRIOS Gonccedilal REYES Joan Modelizacioacuten del Mildiu de la Vid 2004 httpwwwruralcatnetmigracio_resources617683_mildiusPDF (Acceso el diacutea 12052017) [16] Imaacutegenes sacadas de httpwwwvitiviniculturanetmildiu-de-la-vid-enfermedades-vinahtml (Acceso el diacutea 13052017) [17] HUQ Mainul MEISNER Craig DASGUPTA Susmita Health effects and pesticide perception as determinants of pesticide use evidence from Bangladesh httpagrisfaoorgagris-searchsearchdorecordID=US2012411738 (Acceso el diacutea 13052017)
51
IV Bibliografiacutea [18] BADII Mohammad H LANDEROS Jeroacutenimo Plaguicidas que afectan a la salud humana y la sustentabilidad CULCyT 2015 no 19 Revista vista en httpopenjournaluacjmxojsindexphpculcytarticleview454 (Acceso el diacutea 772017) [19] OLEA Nicolaacutes FERNAacuteNDEZ Mariana F Plaguicidas persistentes En Congreso Implementacioacuten del Convenio de Contaminantes Orgaacutenicos Persistentes Madrid 2001 p 26-27 [20] httpwwwfaoorgfao-who-codexalimentariusabout-codexes (Acceso el diacutea 14052017) [21] httpeceuropaeufoodplantpesticidesmax_residue_levels_en (Acceso el diacutea 14052017 [22] ORDONtildeEZ Juan A Cambero Rodriacuteguez MI Fernaacutendez Aacutelvarez L Garciacutea Sanz ML Garciacutea de Fernando Minguilloacuten GD de la Hoz Perales L Selgas Cortecero MD Tecnologiacutea de los alimentos Volumen 1 Componentes de los Alimentos y Procesos Siacutentesis Madrid 1998paacutegs 349-351 [23] CELA Rafael Casais Maria del Carmen Lorenzo Rosa Antonia Teacutecnicas de separacioacuten en quiacutemica analiacutetica Siacutentesis 2002 Capiacutetulo 11 Extraccioacuten y lixiviacioacuten por disolvente (paacutegs206-260) [24] CANTWELL Frederick F LOSIER Manon Liquidmdashliquid extraction Comprehensive Analytical Chemistry 2002 vol 37 p 297-340 [25] Imagen de LLE sacada de httpprocesosbiowikispacescomExtracciC3B3n+liquido-liquido (Acceso el diacutea 15052017) [26] HENNION Marie-Claire Solid-phase extraction method development sorbents and coupling with liquid chromatography Journal of Chromatography A 1999 vol 856 no 1 p 3-54 [27] CELA Rafael Casais Maria del Carmen Lorenzo Rosa Antonia Teacutecnicas de separacioacuten en quiacutemica analiacutetica Siacutentesis 2002 Capiacutetulo 16 Teacutecnicas de adsorcioacuten y absorcioacuten en la preparacioacuten de muestras Extraccioacuten y microextraccioacuten en fase soacutelida (paacutegs520-555) [28] Imagen spe sacada httptoxicocbblogspotcomes201310las-intoxicaciones-con-farmacoshtml (Acceso el diacutea 15052017) [29] Chaacutefer Pericaacutes Consuelo Acoplamiento microextraccioacuten en fase soacutelida-cromatografiacutea (2006) httprodericuveshandle1055014940 (Acceso el diacutea 16052017) [30] Imagen SPME httpwwwscieloorgcoscielophpscript=sci_arttextamppid=S0122-53832002000100005 (Acceso el diacutea 16052017) [31] MONTES GOYANES Rosa Mariacutea Avances en teacutecnicas de microextraccioacuten para la determinacioacuten de compuestos traza en muestras medioambientales y alimentarias Teacutesis doctoral Noviembre 2009 (Paacutegs 34-55) [32] LEHOTAY Steven J Ae Son Kyung KwonHyeyoung Koesukwiwat Urairat Fu Wusheng Mastovska Katerina Hoh Eunha Leepipatpiboon Natchanun Comparison of QuEChERS sample preparation methods for the analysis of pesticide residues in fruits and vegetables Journal of Chromatography A 2010 vol 1217 no 16 p 2548-2560 [33] Imagen QueChERS httpswwwresearchgatenetpublication279221361_QuEChERS_A_Sample_Preparation_for_Extraction_of_Carbaryl_from_Rat_Feces (Acceso el diacutea 16052017) [34] STASHENKO Elena E MARTIacuteNEZ Jairo Reneacute Preparacioacuten de la muestra un paso crucial para el anaacutelisis por GC-MS Uma publicaccedilatildeo trimestral do Instituto Internacional de Cromatografia (IIC) Ciecircncia Cromatograacutefica 2011 vol 3 no 1 [35] Imagen GC-MS httpsorgspectroscopyintblogspotcomes201411gas-chromatography-mass-spectrometry-gchtml (Acceso el diacutea 17052017) [36] httpwwwactlabscompageaspxmenu=65ampapp=221ampcat1=534amptp=2amplk=no (Acceso el diacutea 17052017)
52
IV Bibliografiacutea [37] Quintela O Cruz A Concheiro M De Castro A amp Loacutepez-Rivadulla M (2005) Metodologiacutea LC-MS Aspectos generales de la teacutecnica y sus aplicaciones en el campo de la toxicologiacutea Rev Toxicol 22 paacutegs7-14 [38] Imagen LC-MS httpsuploadwikimediaorgwikipediaenff9Liquid_chromatography_tandem_Mass_spectrometry_diagrampng (visto 18052017) [39] Vargas de la Cruz Celia Bertha Adaptacioacuten de la Metodologiacutea Analiacutetica para la determinacioacuten de residuos de plaguicidas en frutas nativas de exportacioacuten mediante Uplc-MsMs (2012) Tesis obtenida en http20062146130handlecybertesis2331 (Acceso el diacutea 772017) [40] ROMERO GONZAacuteLEZ Roberto Fernaacutendez Moreno Joseacute Luis Plaza Bolantildeos Patricia Garrido Frenich Antonia Martiacutenez Vidal Joseacute Luis Empleo de la espectrometriacutea de masas como herramienta para la determinacioacuten de toacutexicos en alimentos hacia la seguridad alimentaria Revista Espantildeola de salud puacuteblica 2007 vol 81 no 5 p 461-474 [41] PAYAacute Andrus Fundamento y Funciones de la Espectrometriacutea de Masas Universidad de Valencia Espantildea 2006 httpmuraluvescaloan (Acceso el diacutea 19052017) [42] Imagen MS sacada de httpsesslidesharenetMaYaTorrezespectrometria-demasas (Acceso el diacutea 21052017) [43] ECONOMOU Anastasios Botitsi Helen Antoniou Spyros Tsipi Despina Determination of multi-class pesticides in wines by solid-phase extraction and liquid chromatography-tandem mass spectrometry Journal of Chromatography A 2009 vol 1216 no 31 p 5856-5867 [44] FONTANA A R Rodriacuteguez I Ramil M Altamirano JC Cela R Liquid chromatography time-of-flight mass spectrometry following sorptive microextraction for the determination of fungicide residues in wine Analytical and bioanalytical chemistry 2011 vol 401 no 2 p 767-775 [45] PELAJIĆ Maja G Peček DM Pavlović DV Čepo Novel multiresidue method for determination of pesticides in red wine using gas chromatographyndashmass spectrometry and solid phase extraction Food chemistry 2016 vol 200 p 98-106 [46] Ignaz J Buerge Juumlrgen Krauss Rociacuteo Loacutepez-Cabeza Werner Siegfried Michael Stuumlssi Felix E Wettstein Thomas Poiger Stereoselective Metabolism of the Sterol Biosynthesis Inhibitor Fungicides Fenpropidin Fenpropimorph and Spiroxamine in Grapes Sugar Beets and Wheat Journal of Agricultural and Food Chemistry 2016 vol 64 no 26 p 5301-5309 [47] M Hu X Liu F Dong J Xu S Li H Xu Y Zheng Determination of ametoctradin residue in fruits and vegetables by modified quick easy cheap effective rugged and safe method using ultra-performance liquid chromatographytandem mass spectrometry Food chemistry 2015 vol 175 p 395-400 [48] WALORCZYK Stanisław DROŻDŻYŃSKI Dariusz GNUSOWSKI Bogusław Multiresidue determination of 160 pesticides in wines employing mixed-mode dispersive-solid phase extraction and gas chromatographyndashtandem mass spectrometry Talanta 2011 vol 85 no 4 p 1856-1870 [49] Tianyang Guo Pingping Fang Juanjuan Jiang Feng Zhan Wei Yong Jiahui Liu YiYang Dong Rapid screening and quantification of residual pesticides and illegal adulterants in red wine by direct analysis in real time mass spectrometry Journal of Chromatography A 2016 vol 1471 p 27-3 [50] GONZAacuteLEZ-RODRIacuteGUEZ R M CANCHO-GRANDE B SIMAL-GAacuteNDARA J Decay of fungicide residues during vinification of white grapes harvested after the application of some new active substances against downy mildew Food chemistry 2011 vol 125 no 2 p 549-560 [51] CARPINTEIRO I Ramil M Rodriacuteguez I Cela R Determination of fungicides in wine by mixed-mode solid phase extraction and liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry Journal of Chromatography A 2010 vol 1217 no 48 p 7484-7492
53
ResumenResumoAbstract
bull RESUMEN
Los pesticidas son compuestos que se emplean en vintildeedos de todo el mundo para garantizar una proteccioacuten en la
cosecha con escasas peacuterdidas producidas por diferentes organismos en uvas empleadas para la elaboracioacuten del
vino El modo de accioacuten de estos compuestos se basa en la interferencia sobre el metabolismo de diferentes
organismos sin afectar a la vid Un incremento en el empleo de estos compuestos puede determinar la existencia
de residuos en las uvas en el momento de la cosecha desde donde pueden alcanzar el vino que se elabora con las
mismas Por ese motivo se ha establecido una legislacioacuten que regule la cantidad maacutexima de residuos de pesticidas
en uvas y aunque a diacutea de hoy no hay valores regulados en el vino se recomienda que no excedan al 10 de los
liacutemites en uvas En este estudio se ha trabajado con distintos tipos de fitosanitarios fungicidas principalmente
aunque tambieacuten alguacuten insecticida con el objetivo de poder detectar la mayor cantidad de estas sustancias en vinos
comerciales optimizando la extraccioacuten mediante extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) y deteccioacuten mediante
cromatografiacutea de liacutequidos acoplada a espectrometriacutea de masas en taacutendem (LC-ESI-MSMS) Se presenta una
metodologiacutea analiacutetica sencilla raacutepida y robusta que puede ser implementada en laboratorios de control de
alimentos
bull RESUMO
Os pesticidas son compostos empregados en vintildeas arredor do mundo para garantir unha proteccioacuten na colleita
con poucas perdas producidas por distintos organismos en uvas utilizadas para a fabricacioacuten do vintildeo O modo de
accioacuten destes compostos baseacutease na intromisioacuten sobre o metabolismo de diferentes organismos sen afectar aacute vide
Un acrecentamento no uso destos compostos pode fixar a existencia de residuos nas uvas no momento da colleita
onde poden chegar ao vintildeo que se produce coas mesmas Por ese motivo estipulouse unha lexislacioacuten que regula a
cantidade maacutexima de residuos de pesticidas en uvas e aiacutenda que a diacutea de hoxe non hay valores regulamentados no
vintildeo recomeacutendase que non superen ao 10 dos liacutemites en uvas Neste estudo traballouse con diferentes tipos de
pesticidas funxicidas principalmente aiacutenda que tameacuten alguacuten insecticida co obxecto de poder detectar a maior
cantidade destas sustancias en vintildeos comerciais optimizando a extraccioacuten por medio da extraccioacuten en fase soacutelida
(SPE) e deteccioacuten por medio de cromatografiacutea de liacutequidos acoplada a espectrometriacutea de masas en taacutendem (LC-
MSMS) Preseacutentase unha metodoloxiacutea analiacutetica simple raacutepida e robusta que pode ser aplicada en laboratorios de
control de alimentos
1
ResumenResumoAbstract
bull ABSTRACT
Pesticides are compounds that are used in vineyards around the world to ensure protection at harvest with a few
loss produced by different organisms in grapes used to make wine The mode of action of these compounds is
based on the interference on the metabolism of different organisms without affecting the vine An increase in the
use of these compounds can determine the existence of residues in grapes at the time of harvest from where
they can reach the wine that is elaborated with the same ones For this reason legislation has been established to
regulate the maximum amount of pesticide residues in grapes and although there are currently no regulated
values in wine it is recommended that they do not exceed 10 of the limits on grapes In this study we have
worked with different types of pesticides mainly fungicides but also some insecticide with the purpose of being
able to detect the greatest amount of these substances in commercial wines extraction has been optimized by
solid phase extraction (SPE) and detection has been optimized by liquid chromatography coupled to tandem mass
spectrometry (LC-ESI-MSMS) It is presented a simple fast and robust analytical methodology that can be
implemented in food control laboratories
2
Capitulo I Introduccioacuten
CAPIacuteTULO I INTRODUCCIOacuteN
1 FITOSANITARIOS
11 Tipos de fitosanitarios empleados en viticultura
De acuerdo con el Ministerio de Agricultura y Pesca Alimentacioacuten y Medio Ambiente los fitosanitarios se definen
como una o varias sustancias activas u otros ingredientes conformando una mezcla con el fin de proteger los
productos de origen vegetal de organismos nocivos tanto de tipo vegetal como animal que conforman plagas
Dentro de estos fitosanitarios tambieacuten se encuentran las sustancias que destruyen regulan o inhiben la
germinacioacuten de las plantas pero no se contemplan dentro de este grupo vacunas medicamentos y antibioacuteticos
para uso humano o veterinario o agentes utilizados en el control bioloacutegico Los productos fitosanitarios ayudan a
asegurar una buena calidad en los alimentos asiacute como contribuyen al aumento de los rendimientos en la
agricultura [1]
Seguacuten la OMS (Organizacioacuten Mundial de la Salud) los fitosanitarios se pueden clasificar atendiendo a los
organismos a los que esteacuten destinados siendo estos insectos (insecticidas) aacutecaros (acaricidas) moluscos
(molusquicidas) roedores (rodenticidas o raticidas) hongos (fungicidas) gusanos y larvas (nematicidas) malas
hierbas (herbicidas) bacterias (antibioacuteticos pero sin comprender los de uso humano y bactericidas) y otras formas
de vida perjudiciales para la salud puacuteblica y tambieacuten para la agricultura consideradas como plagas animales o
vegetales que puedan ser generadas durante la produccioacuten almacenamiento transporte distribucioacuten y elaboracioacuten
de productos agriacutecolas y sus derivados Actualmente no se puede pensar en un cultivo racional sin el uso de alguacuten
tipo de pesticida ya que la peacuterdida de cosechas en todo el mundo debido a causa de insectos enfermedades de las
plantas y malas hierbas es equivalente a un tercio de la produccioacuten total [2] [3]
Para el estudio de los productos de fitosanitarios en vino nos centraremos solamente en los tres tipos maacutes
importantes en eacuteste aacuterea herbicidas insecticidas y sobre todo fungicidas
Los herbicidas son sustancias destinadas a destruir las malas hierbas cuyo meacutetodo de accioacuten es la interferencia
en los procesos bioquiacutemicos como la fotosiacutentesis que tienen lugar en el sistema vivo de eacutestas Generalmente se
aplican en solucioacuten o suspensioacuten acuosa en forma de nube de pequentildeas gotas dirigidas hacia el objetivo de la
aplicacioacuten Los herbicidas ofrecen los medios maacutes efectivos para el control de las plagas siendo en los paiacuteses
industrializados aplicados sobre el 85-100 de todos los cultivos principales Este tipo de sustancias son
propensas a la descomposicioacuten por microbios plantas y animales y no son comunes los problemas de residuos de
herbicidas si se utilizan de acuerdo a las instrucciones de las etiquetas [4] A pesar de todos los beneficios que nos
aportan un mal uso de estos puede convertirse en un serio problema ya que toda sustancia quiacutemica usada en
3
Capiacutetulo I Introduccioacuten
agricultura puede provocar un efecto negativo en el ambiente si es utilizada en altas dosis El uso prolongado de
un mismo herbicida puede causar problemas de resistencia de malezas fenoacutemeno que consiste en la aparicioacuten de
biotipos tolerantes de una especie la cual anteriormente era controlada por el herbicida [5]
Por otro lado los insecticidas son fitosanitarios destinados a controlar el ataque de insectos y para eso existen
distintos caminos a traveacutes de los que pueden actuar siendo envenenamiento por contacto en doacutende el insecticida
penetra a traveacutes de la cutiacutecula del insecto hasta alcanzar el sitio activo envenenamiento oral en doacutende el
insecticida es ingerido y absorbido a traveacutes del intestino o tambieacuten por fumigaciones en doacutende el insecticida
penetra en el cuerpo del insecto a traveacutes de los espiraacuteculos del sistema respiratorio Pero al igual que pasa con los
herbicidas los insectos tambieacuten desarrollan resistencia a los insecticidas debido al contacto continuo con estos
Esta resistencia puede ser expresada por varios caminos que el insecto no entre en contacto con la deposicioacuten del
insecticida que se modifique la composicioacuten del exoesqueleto inhibiendo asiacute la penetracioacuten del insecticida la
modificacioacuten del sitio activo para el fitosanitario reduciendo la sensibilidad a la forma activa del insecticida o que
la viacutea metaboacutelica del insecto se modifique negando el metabolismo del compuesto aplicado en su forma toacutexica
[6] Aunque por lo general otros aspectos de la agricultura moderna tienen un mayor impacto en el medio
ambiente los insecticidas se encuentran entre las herramientas agriacutecolas que estaacuten maacutes asociadas con el dantildeo
ambiental Su objetivo especiacutefico es matar a plagas de insectos por lo que puede que tenga un impacto letal en
organismos que no son su objetivo [7]
Por uacuteltimo los fungicidas estaacuten destinados tanto a combatir las plagas de hongos como a combatir las
enfermedades fungosas de las plantas ya sea matando retrasando el desarrollo o inhibiendo la reproduccioacuten de
los hongos Los fungicidas en general se dividen atendiendo al modo de accioacuten de eacutestos en fungicidas de
contacto fungicidas penetrantes o fungicidas sistemaacuteticos
Los fungicidas de contacto protegen uacutenicamente el sitio de aplicacioacuten contra las plagas quedando en el exterior de
la planta de eacutesta manera sin penetrar en el tejido vegetal forman una peliacutecula protectora Cuando alguna espora
de un hongo llega a su superficie se encuentra con esa peliacutecula que le impide penetrar o en su defecto germinar
En el caso de que atraviesen el tejido vegetal bien sea por una alta dosis o por una rotura en las paredes de la
planta se convierten en un producto toacutexico para ella llegando a quemarla
Otro tipo de fungicidas los fungicidas penetrantes como su nombre indica se introducen en el tejido vegetal y
una vez dentro cuentan con muy poca movilidad es decir no circulan por los vasos conductores Al tener la
capacidad de entrar en la planta pueden combatir a los hongos que ya se encuentren dentro de eacutesta pero no
pueden ser toacutexicos para ella porque de lo contrario la dantildeariacutean
Por uacuteltimo nos encontramos con los fungicidas sistemaacuteticos Este tipo de fungicidas actuacutean protegiendo a la
planta contra las plagas en distintas zonas por transfusioacuten del fitosanitario dentro de la misma Esto sucede porque
penetran en el tejido vegetal y circulan por ella a traveacutes de la corriente de los vasos conductores
El meacutetodo de accioacuten de los fungicidas se basa en interferir en el metabolismo de los hongos ya sea por un
4
Capiacutetulo I Introduccioacuten
ataque en la produccioacuten de energiacutea la inhibicioacuten de la mitosis o inhibiendo la formacioacuten de quitina que se trata
del compuesto principal de la pared celular de los hongos y que por ende influye en la permeabilidad de la
membrana [8] [9]
Las enfermedades fuacutengicas fundamentales que nos podemos encontrar en las uvas de la vid son la botritis el oiacutedio
y el mildium las cuales pueden llegar a causar peacuterdidas importantes en viticultura
La enfermedad de la botritis tambieacuten llamada moho gris estaacute causada
por el hongo Botrytis cineacuterea y se puede encontrar en todo el mundo
infectando a un amplio nuacutemero de plantas Se trata de uno de los
patoacutegenos fuacutengicos maacutes interesantes debido a que puede vivir tanto
de forma patoloacutegica produciendo la enfermedad como
alimentaacutendose de materia orgaacutenica en descomposicioacuten La accioacuten
fuacutengica del hongo se lleva a cabo cuando las uvas empiezan a
acumular azuacutecar pudiendo ser muy devastador en algunas
condiciones sobre todo en cultivos empapados por la lluvia o
localizados en un ambiente huacutemedo y con viento produciendo la peacuterdida de los racimos de uvas que son
infectados O por el contrario en otro tipo de condiciones ambientales de sequedad despueacutes de unas
condiciones de humedad dicho hongo le confiere beneficios a ciertos tipos de vino blanco [10]
El oiacutedio es una enfermedad causada por la especie Uncinula necator la cual afecta tanto al rendimiento como a la
calidad de las uvas y altera las cualidades de sus derivados vino mosto etc El proceso de infeccioacuten del oiacutedio
tiene lugar siguiendo un ciclo de reproduccioacuten en las distintas estaciones del antildeo El riesgo de infeccioacuten viene
dado en funcioacuten de la temperatura oacuteptima entre 25-30ordmC humedad del ambiente en el que se encuentre y
tambieacuten en funcioacuten de la temporada siendo maacutes resistentes los racimos de uvas a medida que van madurando El
hongo afecta a todas las parte de la vid hojas tallo y racimos las cuales presentan siacutentomas distintos Las hojas se
vuelven de un color amarillento y se cubren de un polvo fino blanco grisaacuteceo En el tallo el oiacutedio se manifiesta a
traveacutes de manchas difuminadas con coloracioacuten inicial verde oscuro volvieacutendose cada vez maacutes oscuras al final y si
ocurre un ataque fuerte puede desembocar en que el tallo se acabe secando y por consiguiente disminuye la
produccioacuten Pero el ataque maacutes fuerte se produce en los racimos empezando por cubrirse del polvillo blanco
grisaacuteceo y continuando con que el oiacutedio detiene el crecimiento de la piel de la uva con la consecuencia que la uva
se agrieta Esta enfermedad produce unos dantildeos directos en la cantidad y calidad de la cosecha y si no se toman
medidas de prevencioacuten las peacuterdidas pueden llegar a ser totales [12] [13]
Figura I1Enfermedad de botritis en un racimo de uvas [11]
Figura I2 Enfermedad del oiacutedio en hoja tallo y racimo de izquierda a derecha [14] 5
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Por uacuteltimo el mildium o mildiu es una enfermedad producida por el hongo Plasmopara vitiacutecola considerada como
una de las peores enfermedades del cultivo siempre y cuando esteacuten en las condiciones ambientales favorables para
su desarrollo Dichas condiciones oacuteptimas para la propagacioacuten de la enfermedad son las lluvias al amanecer o al
anochecer con una temperatura en un rango de 20-25 ordmC El periacuteodo sensible de la vegetacioacuten de la vintildea es a
partir de una longitud de 10 cm en adelante siendo maacutexima en el periacuteodo de mayor crecimiento de la planta Por
otro lado la sensibilidad del racimo empieza desde su formacioacuten hasta que las uvas al florecer alcanzan el tamantildeo
similar al de un guisante pero de ahiacute en adelante la sensibilidad se ve disminuida Dicho hongo cuenta con un
ciclo reproductivo abarcando varias fases desde la fase de contaminacioacuten siendo el principio hasta la fase de pro-
pagacioacuten Afecta a todos los oacuterganos verdes de la vid y sus siacutentomas son variados en las distintas zonas de eacutesta
En las caras de las hojas aparecen unas manchas amarillentas en los racimos cuando se aproxima la floracioacuten los
que se encuentran infectados se curvan secaacutendose y cubrieacutendose de una pelusa blanquecina y cuando alcanzan el
tamantildeo de un guisante en adelante las uvas de los racimos afectados se van oscureciendo y secando sin que apa-
rezca la fructificacioacuten del hongo ademaacutes de oscurecerse el tallo [15]
12 Estructura propiedades fiacutesico-quiacutemicas y clasificacioacuten
En este trabajo nos centramos en estudiar los residuos de veintitreacutes fitosanitarios tipo fungicida principalmente
aunque tambieacuten alguacuten residuo tipo insecticida Las caracteriacutesticas maacutes importantes de dichos compuestos seraacuten
recogidas en la Tabla I1 que incluye estructuras clasificacioacuten (se ha usado el acroacutenimo ldquoFrdquo en caso de ser
fungicidas e ldquoIrdquo en caso de ser insecticidas) y propiedades fiacutesico-quiacutemicas Las propiedades fiacutesico-quiacutemicas que
pueden resultar maacutes relevantes para este estudio son el pKa ya que la mayoriacutea se trata de compuestos baacutesicos
aunque se encuentre alguacuten aacutecido deacutebil como es por ejemplo el Fenhexamid y Kow describiendo el coeficiente de
reparto entre octanolagua empleado para medir el grado de hidrofobidad que proporciona una estimacioacuten de
la posible distribucioacuten del analito entre materia orgaacutenica y agua
Figura I3 Enfermedad del mildium en la imagen de la izquierda coacutemo afecta a las hojas imagen central coacutemo
afecta a los racimos cuaacutendo estaacuten infectados al comenzar la floracioacuten y en la imagen de la derecha coacutemo afecta a
los racimos en doacutende las uvas tienen tamantildeo mayor al de un guisante [16]
6
Compuesto Estructura Nombre sistemaacutetico Foacutermula CAS Uso ordflog (kow) pKa
Ametoctradin
(AME)
5-ethyl-6-
octyl[124]triazolo[15-
a]pyrimidin-7-amine
C15H25N5 865318-97-4 F 440 278
Benalaxyl
(BEN)
Methyl-N-(phenylacetyl)-N-
(26-xylyl)-D-alaninate C20H23NO3 98243-83-5 F 368 -
Boscalid
(BOS)
2-Chloro-N-(4rsquo-
chlorobiphenyl-2-yl)-
nicotinamide
C18H12Cl2N2O 188425-85-6 F 296 -
Carbendazim
(CAR)
Methyl 2-benzimidazole
carbamate C9H9N3O2 10605-21-7 F 148 420
Cyprodinil
(CYP)
4-Cyclopropyl-6-methyl-N-
phenilpyrimidin-2-amine C14H15N3 121552-61-2 F 400 309
Dimethomorph
(DIM)
(2E)-3-(4-chlorophenyl)-3-(34-
dimethoxyphenyl)-1-
(morpholin-4-yl)prop-2-en-1-
one
C21H22ClNO4 110488-70-5 F 268 -13
Fenhexamid
(FEH)
N-(23-dichloro-4-
hydroxyphenyl)-1-methyl-
cyclohexanecarboxamide
C14H17Cl2NO2 126833-17-8 F 351 73
Fenpropidin
(FEP)
1-[(RS)-3-(4-tert-butylphenyl)-
2-methylpropyl]piperidine C19H31N 67306-00-7 F 26 1013
Fluopicolid
(FLU)
26-dichloro-N-[3-chloro-5-
(trifluoromethyl)-2-
pyridylmethyl]benzamide
C14H8Cl3F3N2O 239110-15-7 F 29 -
Imidacloprid
(IMI)
(E)-1-(6-chloro-3-
pyridylmethyl)-N-
nitroimidazolidin-2-
ylideneamine
C9H10ClN5O2 138261-41-3 I 057 -
Iprovalicarb
(IPR)
Isopropyl (S)-2-methyl-1-[1-(p-
tolyl)ethylcarbamoyl]propyl-
carbamate
C18H28N2O3 140923-17-7 F 32 -
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Tabla I1 Estructura clasificacioacuten y propiedades fiacutesico-quiacutemicas de intereacutes para los analitos de estudio
7
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Compuesto Estructura Nombre sistemaacutetico Foacutermula CAS Uso ordflog (kow) pKa
Mandipropamid
(MAN)
2-(4-chlorophenyl)-N-[3-
methoxy-4-(2-
propynyloxy)phenethyl]-2-(2-
propynyloxy)acetamide
C23H22ClNO4 374726-62-2 F 32 -
Metalaxyl
(MET)
N-(26-dimethylphenyl)-N-
(methoxyacetyl)-DL-alanine
methyl ester
C15H21NO4 57837-19-1 F 175 000
Myclobutanil
(MYC)
2-(4-chlorophenyl)-2-(1H-
124-triazol-1-
ylmethyl)hexanentrile
C15H17ClN4 88671-89-0 F 289 230
Penconazol
(PEN)
1-[2-(24-
dichlorophenyl)pentyl]-1H-
124-triazole
C13H15Cl2N3 66246-88-6 F 372 151
Pyraclostrobin
(PYC)
Methyl2-[1-(4-chlorophenyl)-
1H-pyrazol-3-
yloxymethyl]phenylmetoxy-
carbamate
C19H18ClN3O4 175013-18-0 F 399 -
Pyrimethanil
(PYM)
4-6-dimethyl-N-phenyl-2-
pyrimidinamine C12H13N3 53112-28-0 F 284 352
Tebuconazol
(TEC)
1-(4-chlorophenyl)-44-
dimethyl-3-(1H-124-triazol-1-
ylmethyl)-3-pentanol
C16H22ClN3O 107534-96-3 F 370 500
Tebufenozid
(TEF)
35-dimethylbenzoic acid 1-
(11-dimethylethyl)-2-(4-
ethylbenzoyl)hidrazide
C22H28N2O2 112410-23-8 I 425 -
Thiabendazol
(TBZ)
2-(13-thiazol-4-yl)-1H-
benzimidazole C10H7N3S 148-79-8 F 239 473
Thiamethoxam
(TME)
3-[(2-chloro-5-
thiazolyl)methyl]tetrahydro-5-
methyl-N-nitro-4H-135-
oxadiazin-4-imine
C8H10ClN5O3S 153719-23-4 I -013 -
Thiophanate-
methyl
(THI-M)
DimethylNNrsquo-[12-
phenylenebis(azanediylcarbono
thioyl)] dicarbamate
C12H14N4O4S2 23564-05-8 F 145 728
Triadimenol
(TRI)
1-(4-chlorophenoxy)-33-
dimethyl-1-(1H-124-triazol-1-
yl)-2-butanol
C14H18ClN3O2 55219-65-3 F 318
-
ordf Valores para la forma neutra 8
Capiacutetulo I Introduccioacuten
13 Toxicidad de los pesticidas
En los uacuteltimos antildeos el uso indiscriminado de pesticidas de siacutentesis en agricultura ha creado graves problemas de
salud y medioambientales ya que su uso debido al aumento de la poblacioacuten y por consiguiente de la actividad
agraria se ha incrementado considerablemente Durante las tres uacuteltimas deacutecadas una estimacioacuten dada por la
Organizacioacuten Mundial de la Salud y el Programa de las Naciones Unidas para el Medio Ambiente revela que
aproximadamente cerca de 20000 personas al antildeo mueren generalmente agricultores por exposicioacuten continuada
a alguno de estos toacutexicos En la mayoriacutea de los casos los agricultores utilizan los pesticidas de forma que las
cantidades se desviacutean significativamente de las recomendadas ya que asocian cantidades maacutes altas con mayor
efectividad y velocidad de accioacuten El mal uso de dichos toacutexicos se ve en los signos presentes en los ecosistemas
afectados pudiendo llegar a ser perjudiciales para la salud humana Estos riesgos que causan tanto en la salud
como en el medioambiente pueden ser reducidos o en su defecto evitados mediante la educacioacuten sobre este tipo
de toacutexicos con el fin de frenar su uso excesivo y descontrolado [17]
Desde el punto de vista medioambiental los fitosanitarios empleados en un cultivo pueden persistir en los
distintos medios tierra aire o agua y afectar tanto a ecosistemas terrestres como acuaacuteticos En los sistemas
terrestres los suelos son contaminados mediante la aplicacioacuten del toacutexico de forma directa o como deposicioacuten del
resultado de una suspensioacuten aeacuterea Eacutestos pueden persistir desde varios diacuteas hasta varios antildeos ya que el suelo
retiene y moviliza el toacutexico despueacutes de su emisioacuten Los que persisten maacutes tiempo en el medioambiente tienen una
mayor probabilidad de interaccionar con otros elementos del sistema y si su vida media es mayor a la frecuencia
con la que se aplica el pesticida tienden a acumularse tanto en el suelo como en las especies que habitan en eacutel Por
otro lado el agua es contaminada por pesticidas bien por aplicacioacuten directa por estar presentes en las
precipitaciones de la atmoacutesfera o bien por la movilidad que tienen desde el suelo Tanto los pesticidas solubles
como los insolubles interaccionan con los ecosistemas acuaacuteticos los hidrosolubles persisten maacutes tiempo
solubilizados en agua mientras que los otros se asocian a los sedimentos y se concentran en las especies que
habitan el medio acuaacutetico [18]
Como consecuencia de la amplia distribucioacuten de los toacutexicos en aire suelo y agua se produce una acumulacioacuten de
ellos en los elementos que contribuyen a la alimentacioacuten humana ya que su amplio uso hace que el contacto con
los plaguicidas por parte de personas y animales sea inevitable La contaminacioacuten de los alimentos se puede
presentar por aplicacioacuten directa de los pesticidas el uso de eacutestos durante el manejo transporte y almacenamiento
de los productos comestibles o por su acumulacioacuten en la cadena troacutefica Son bioacumulables en el organismo
debido a su caraacutecter lipofiacutelico lo que les confiere una vida media en los tejidos larga La exposicioacuten a pesticidas
persistentes no tiene la misma repercusioacuten en cada uno de los individuos expuestos sino que se considera criacutetica la
exposicioacuten durante la etapas embrionaria fetal y primeros antildeos de vida en doacutende se transmite de madres a hijos
mediante la gestacioacuten y la lactancia como resultado de la acumulacioacuten en el tejido graso de la madre [19]
9
Capiacutetulo I Introduccioacuten
14 Legislacioacuten
El aumento del uso de fitosanitarios en actividades relacionadas con la produccioacuten de alimentos para consumo
humano o animal tambieacuten desembocoacute en una preocupacioacuten social debido a su toxicidad y bioacumulacioacuten En
respuesta la Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura (FAO) en colaboracioacuten
con la Organizacioacuten Mundial de la Salud (OMS) pusieron en marcha un programa Codex Alimentarius cuyo
objetivo a traveacutes de sus normas y coacutedigos de praacutecticas alimentarias internacionales es garantizar la calidad e
inocuidad de los alimentos que estaacuten al alcance de cualquier persona Con estas normas internacionales los
consumidores pueden confiar en la calidad de los alimentos independientemente de su origen geograacutefico [20]
Todos los alimentos destinados al consumo humano o animal en la Unioacuten Europea estaacuten sujetos a un liacutemite
maacuteximo de residuos de plaguicidas para la proteccioacuten de la salud humana y animal Actualmente en lo referente a
legislacioacuten para el control de la cantidad del toacutexico en la uva estaacute vigente el Reglamento 3962005 del Parlamento
Europeo y del Consejo de 23 de febrero de 2005 referido a la regulacioacuten de los liacutemites maacuteximos de residuos de
plaguicidas en alimentos y piensos de origen vegetal y animal El liacutemite maacuteximo de residuos (LMR) se define co-
mo el nivel maacutes alto de un residuo de un pesticida que se tolera de manera legal sobre los alimentos o piensos
cuando se aplican correctamente Las cantidades de residuos que se encuentren deben ser lo maacutes bajas posible
para garantizar la seguridad en la alimentacioacuten de los consumidores Dichos liacutemites maacuteximos de residuos estaacuten
fijados por la Comisioacuten Europea pudieacutendose encontrar en su base de datos LMR [21]
A continuacioacuten en la Tabla I2 se resumen los LMRs de los compuestos de este estudio en uvas de vinificacioacuten
en unidades de mgkg de uva En el caso del vino no hay legislacioacuten en lo referente a estos pesticidas solamente
la recomendacioacuten de no superar el 10 del valor del LMR en uva
Compuesto LMRs (mgkg uva) Compuesto LMRs (mgkg uva)
AME 6 MET 1
BEN 03 MYC 1
BOS 5 PEN 02
CAR 05 PYC 2
CYP 3 PYM 5
DIM 3 TEC 1
FEH 15 TEF 3
FEP 001 TBZ 005
FLU 2 TME 04
IMI 1 THI-M 3
IPR 2 TRI 2
MAN 2
Tabla I2 Liacutemites maacuteximos de residuos permitidos para los compuestos estudiados en uvas
10
Capiacutetulo I Introduccioacuten
2 MEacuteTODOS DE PREPARACIOacuteN DE MUESTRA APLICADOS A MUESTRAS DE VINO
21 Extraccioacuten liacutequido-liacutequido (LLE)
Se entiende por extraccioacuten liacutequido-liacutequido al meacutetodo mediante el cual un analito de intereacutes se separa por el
contacto con otra fase en la cual tiene mayor afinidad de la matriz en la que se halle Los procesos de extraccioacuten
implican dos fases y requieren tres pasos sucesivos mezcla de materia prima y disolvente separacioacuten de las dos
fases despueacutes del contacto y eliminacioacuten del disolvente que contiene el analito [22]
La extraccioacuten liacutequido-liacutequido (LLE) se basa en la distribucioacuten
de un analito entre dos fases liacutequidas inmiscibles en las
cuales analito y matriz tienen solubilidades diferentes
Principalmente una de las fases es un medio acuoso en
general se trata de la muestra y la otra un disolvente
orgaacutenico La selectividad y eficacia de este meacutetodo vienen
determinadas por la eleccioacuten del disolvente y por los factores
que pueden afectar al proceso de equilibrio (pH adiccioacuten de
sales neutras en la fase acuosa para reducir la solubilidad del
analito etc) [23] Esta teacutecnica permite llevar a cabo extracciones para un rango muy amplio de analitos siendo
una de las maacutes antiguas para la preparacioacuten de muestras en el anaacutelisis cualitativo y cuantitativo Ofrece grandes
capacidades de muestreo lineal y cuenta con la ventaja de la cantidad de informacioacuten existente sobre este meacutetodo
[24]
22 Extraccioacuten en fase soacutelida (SPE)
En 1978 aparecieron los primeros cartuchos desechables para la extraccioacuten en fase soacutelida y actualmente casi 40
antildeos despueacutes la extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) es la teacutecnica de preparacioacuten de muestras maacutes empleada en los
laboratorios Es una teacutecnica de preparacioacuten y tratamiento de muestras que se basa en la retencioacuten en una fase
adsorbente del analito de intereacutes presente en una muestra liacutequida que pasa a traveacutes de ella Debido a la variedad de
formatos (discos cartuchos y jeringas) y tipos de adsorbentes (los maacutes comunes carboacuten activo aluacutemina siacutelica gel
silicato de magnesio siacutelices enlazadas y poliacutemeros como por ejemplo estinero-divinilbenceno) o la facilidad de
automatizacioacuten y acoplamiento con otras teacutecnicas como por ejemplo una conexioacuten directa con un sistema de
Figura I4 Fundamentos teoacutericos de la LLE [25]
11
Capiacutetulo I Introduccioacuten
cromatografiacutea este meacutetodo le fue ganando terreno a la LLE Otra ventaja muy importante de la SPE frente a la
LLE es la disminucioacuten en la cantidad de disolvente orgaacutenico empleada Cada vez se va innovando maacutes sobre esta
teacutecnica llegando a encontrarse fases adsorbentes formadas por poliacutemeros capaces de retener en un uacutenico
cartucho un amplio abanico de analitos lipofiacutelicos o hidrofoacutebicos aacutecidos baacutesicos o neutros [26]
El fundamento de esta extraccioacuten como se puede en la Figura I6
consiste en cuatro etapas acondicionamiento adiccioacuten de muestra
retencioacuten y elucioacuten de los analitos de intereacutes En primer lugar antes
de empezar la extraccioacuten se requiere una etapa de acondicionamiento
para preparar el adsorbente haciendo pasar un poco de disolvente
para asiacute interaccionar mejor con la muestra Luego se hace pasar la
muestra liacutequida por la fase soacutelida Idealmente el adsorbente retiene
los analitos selectivamente a medida que va pasando la muestra y la
matriz pasa sin ser retenida Por uacuteltimo los analitos se eluyen del
adsorbente con un disolvente con el que tenga mayor afinidad [27]
23 Teacutecnicas de microextraccioacuten
231 Microextraccioacuten en fase soacutelida (SPME)
En la microextraccioacuten en fase soacutelida (SPME) se utilizan fibras de siacutelice fundida revestidas con un poliacutemero en un
disentildeo en forma de jeringa para la extraccioacuten de los analitos de intereacutes El principio por el que se rige esta
extraccioacuten es el reparto del analito entre la matriz de la muestra y el revestimiento de la fibra mediante un proceso
no competitivo Se trata de un meacutetodo que cuenta con muchas ventajas ya que se elimina completamente el uso de
disolventes y aparte no son necesarios voluacutemenes de muestra grandes pero tambieacuten cuenta con algunas
desventajas ya que tanto la capacidad como la sensibilidad se ven limitadas [29]
En la figura I7 podemos ver las etapas de la extraccioacuten En un
vial cerrado con una caacutepsula y un seacuteptum tenemos la muestra
liacutequida o bien soacutelida que contenga los analitos de intereacutes
volaacutetiles Con la jeringa se perfora el seacuteptum y una vez dentro
se acciona el eacutembolo para la exposicioacuten de la fibra con los
analitos introducieacutendola en la muestra liacutequida o en su defecto
en el espacio de cabeza para la extraccioacuten de analitos volaacutetiles
de una muestra soacutelida Despueacutes de la extraccioacuten dentro del vial
Figura I6 Etapas de una SPE [28]
Figura I7 Etapas de una SPME [30]
12
Capiacutetulo I Introduccioacuten
la fibra se introduce de nuevo en la jeringa y se retira del vial [27]
232 Microextraccioacuten en fase liacutequida (LPME)
La microextraccioacuten en fase liacutequida se desarrolloacute como una alternativa a la LLE para la reduccioacuten en la cantidad de
disolventes orgaacutenicos siendo rentable tanto para el medioambiente como econoacutemicamente Entre las modalidades
maacutes populares de esta teacutecnica se encuentran microextraccioacuten con gota suspendida (SDME) y microextraccioacuten
liacutequido-liacutequido dispersiva (DLLME) En la SDME una gota de disolvente orgaacutenico es expuesta al espacio de
cabeza situado sobre una muestra en un vial dicha gota es suspendida del extremo de una microjeringa Por otro
lado la DLLME sobre una muestra acuosa se inyecta un pequentildeo volumen de una mezcla de disolventes en la
cual es dispersada formando una solucioacuten en la que se establece el equilibrio El disolvente de extraccioacuten debe
presentar una densidad inferior a la de la muestra para facilitar su recuperacioacuten normalmente despueacutes de
centrifugar el vial doacutende se realiza la extraccioacuten [31]
24 QuEChERS
La extraccioacuten QuEChERS de las palabras en ingleacutes Quick Easy Cheap Effective Rugged and Safe es un meacutetodo
de extraccioacuten que se desarrolloacute entre 2000 y 2002 para el anaacutelisis de pesticidas Como su nombre indica raacutepido
faacutecil barato eficaz robusto y seguro son las principales
caracteriacutesticas de esta preparacioacuten de muestra Se realiza en dos
etapas en primer lugar una extraccioacuten simple y una segunda fase
de purificacioacuten En la primera etapa tenemos el vial con la
muestra en el cual se antildeade un disolvente generalmente
acetonitrilo para la extraccioacuten de los analitos de intereacutes en
presencia de diferentes sales (en el meacutetodo original se utiliza
sulfato de magnesio y cloruro de sodio) para facilitar la separacioacuten
de las fases En la segunda parte se realiza la purificacioacuten de la
fraccioacuten del extracto orgaacutenico Para eso se lleva a cabo una
limpieza de los analitos eliminando el agua y los compuestos
presentes en la matriz de la muestra empleando un adsorbente PSA (amina primaria y secundaria) C18 carboacuten
negro grafitizado (GCB) o una combinacioacuten de eacutestas [32]
Figura I8 Etapas de QuEChERS [33]
13
Capiacutetulo I Introduccioacuten
3 METODOLOGIacuteA ANALIacuteTICA PARA LA DETERMINACIOacuteN DE PESTICIDAS
31 Meacutetodos de GC-MS (MSMS)
La combinacioacuten de cromatografiacutea de gases (GC) teacutecnica de separacioacuten con espectrometriacutea de masas (MS) como
sistema de deteccioacuten representa un potente meacutetodo para la identificacioacuten determinacioacuten y cuantificacioacuten de
analitos orgaacutenicos en concentraciones traza presentes en muestras complejas Esta teacutecnica de anaacutelisis cuenta con
muchas ventajas en sensibilidad multifuncionalidad buena reproducibilidad robustez asiacute como facilidad en el
manejo pero con una gran desventaja este meacutetodo no es apto para ser utilizado con todos los analitos sino que
se ve limitado a aquellos que sean termoestables y no se descompongan a temperaturas elevadas antes de ser
volatilizados La muestra es introducida a traveacutes del inyector en el cromatoacutegrafo de gases doacutende impulsada por
una corriente de gas inerte como fase moacutevil pasa a traveacutes de la columna que contiene la fase estacionaria en la
cual se separan los compuestos debido a una distribucioacuten de estos entre fase moacutevil-fase estacionaria Mediante
una interfase son introducidos para su deteccioacuten en el espectroacutemetro de masas que cuenta con una fuente de
iones analizador de masas y un detector [34]
La combinacioacuten de analizadores de masas en taacutendem (MSMS) como sistema de deteccioacuten en GC es una teacutecnica
altamente selectiva mejorando la sensibilidad y la relacioacuten sentildeal-ruido en los espectros experimentando una
mejora por lo que se logran unos liacutemites de deteccioacuten inferiores Esta teacutecnica GC-MSMS comprende maacutes
pasos despueacutes de la separacioacuten por cromatografiacutea se lleva a cabo la deteccioacuten con MSMS que consta de varias
etapas generacioacuten de iones en la fuente de ionizacioacuten seleccioacuten de los iones precursores de una determinada
masa disociacioacuten causada por colisioacuten con moleacuteculas de gas inerte de los iones precursores y por uacuteltimo el
anaacutelisis de los fragmentos en relacioacuten a su masacarga (mz) En el caso de que un espectro de MS no permita
confirmar la identidad de un determinado compuesto quiacutemico la obtencioacuten de su espectro de MSMS permite
mejorar la confianza en su identificacioacuten [36]
Figura I9 Acoplamiento GC-MS [35]
14
Capiacutetulo I Introduccioacuten
32 Meacutetodos LC-MS (MSMS)
La teacutecnica de LC-MS se desarrolloacute para minimizar las desventajas del acoplamiento GC-MS y asiacute resolver los
problemas que este uacuteltimo acarreaba con los analitos termolaacutebiles permitiendo el anaacutelisis de eacutestos sin tener que
realizar una etapa previa de derivatizacioacuten La interfase de unioacuten de cromatografiacutea liacutequida (LC) con espectrometriacutea
de masas (MS) acarrea una dificultad significativa siendo responsable de transformar los analitos que se
encontraban en la fase moacutevil liacutequida en iones en fase gas sin que se produzca su degradacioacuten teacutermica La
sensibilidad de las determinaciones por LC-MS va a depender de la interfase empleada Las principales interfases
empleadas actualmente son las ionizaciones a presioacuten atmosfeacuterica electrospray (ES) e ionizacioacuten quiacutemica a
presioacuten atmosfeacuterica (APCI) [37]
Con los antildeos la cromatografiacutea liacutequida se ha ido innovando y mediante la disminucioacuten del tamantildeo de partiacutecula en
la columna se fue mejorando la eficiencia asiacute como aumentando la selectividad y resolucioacuten del pico en el
cromatograma Para este nuevo sistema llamado UPLC Ultra-Performance Liquid Chromatography se desarrolloacute
una nueva instrumentacioacuten capaz de trabajar a altas presiones generando flujos mayores sin peacuterdidas de
resolucioacuten utilizando inyectores automaacuteticos maacutes raacutepidos y detectores con mayor velocidad de adquisicioacuten de
datos disminuyendo asiacute el tiempo de anaacutelisis [39]
33 Espectrometriacutea de masas
La espectrometriacutea de masas es el meacutetodo de deteccioacuten y cuantificacioacuten maacutes fiable a la hora de la determinacioacuten de
compuestos en matrices complejas (tales como alimentos) ya que otros detectores maacutes tradicionales como UV-
visible o fluorescencia cuentan con una gran incertidumbre en los resultados llegando incluso a ofrecer falsos
Figura I10 Acoplamiento LC-MS [38]
15
Capiacutetulo I Introduccioacuten
positivos o negativos Un espectrometro de masas cuenta con un dispositivo de introduccioacuten de muestra una
caacutemara de ionizacioacuten un sistema para la aceleracioacuten de los iones uno o varios analizadores de masas y un detector
[40]
El fundamento de la espectrometriacutea de masas se basa en la separacioacuten de iones en base a la relacioacuten masacarga
(mz) El proceso consta fundamentalmente de cuatro etapas La
primera es la ionizacioacuten de la muestra los iones formados se aceleran
debido a la accioacuten de un campo eleacutectrico variable separacioacuten de los
iones seguacuten su masacarga deteccioacuten de los iones y produccioacuten de la
sentildeal eleacutectrica El analizador de masas es el encargado de la separacioacuten
de los iones en funcioacuten a su mz entre los que maacutes destacan
analizador de masas cuadrupolar que dispersa simultaacuteneamente todos
los iones en funcioacuten de la relacioacuten mz analizador de masas de
tiempo de vuelo (TOF) consta de un tubo a alto vaciacuteo sobre el que no
actuacutea ninguacuten campo eleacutectrico al cual llegan todos los iones acelerados con la misma energiacutea cineacutetica y en el tubo
las velocidades variacutean seguacuten mz y analizador de trampa de iones en doacutende los iones gaseosos quedan aislados
durante largos periacuteodos de tiempo por la accioacuten del campo eleacutectrico [41]
4RESUMEN BIBLIOGRAacuteFICO DE LAS TEacuteCNICAS DE EXTRACCIOacuteN Y
DETERMINACIOacuteN DE PESTICIDAS EN VINO
En la bibliografiacutea se han descrito diversas teacutecnicas y diferentes combinaciones entre teacutecnicas de extraccioacuten y
distintas teacutecnicas de cuantificacioacuten e identificacioacuten para esos analitos Entre estas teacutecnicas los valores de los liacutemites
de cuantificacioacuten (LOQs) y las recuperaciones relativas pueden diferir en el resultado en un rango de valores asiacute
como el tiempo total empleado para el anaacutelisis y para la preparacioacuten de la muestra
Por lo general el meacutetodo de extraccioacuten de los analitos de intereacutes maacutes empleado es la extraccioacuten en fase soacutelida
(SPE) la cuaacutel le ha estado ganando terreno a la extraccioacuten liacutequido-liacutequido aunque tambieacuten se estaacute viendo cada vez
maacutes desplazada debido al creciente uso de la teacutecnica QuEChERS
Figura I11 Etapas de la espectrometriacutea de masas [42]
16
Capiacutetulo I Introduccioacuten
En el estudio de ECONOMOU et al [43] realizado en el antildeo 2009 en Grecia se empleoacute la extraccioacuten en fase
soacutelida con deteccioacuten en cromatografiacutea de liacutequidos acoplada a espectrometriacutea de masas en taacutendem (SPE-LC-ESI-
MSMS) Para la preparacioacuten de la muestra diluyeron 10 mL de vino (tanto blanco como tinto) a un volumen
final de 100 mL con agua ultrapura antes de la SPE Determinaron las recuperaciones de la extraccioacuten para dos
niveles de concentracioacuten 0010 y 0050 mgL realizando 8 medidas diarias durante 3 diacuteas consecutivos
encontraacutendose unos valores que variacutean dentro del rango 70-110 para todos los pesticidas en los dos niveles Para
la determinacioacuten y cuantificacioacuten de 46 pesticidas emplearon la teacutecnica de cromatografiacutea de liacutequidos con
espectrometriacutea de masas con un volumen de inyeccioacuten de 20 microL y un flujo de fase moacutevil de 02 mLmin
aclopada a espectrometriacutea de masas en taacutendem
Con la misma teacutecnica de extraccioacuten PELAJIĆ et al [45] durante el antildeo 2015 en Croacia llevaron a cabo la
determinacioacuten de 25 residuos de plaguicidas en vino tinto El meacutetodo que desarrollaron para dicha finalidad fue el
acoplamiento SPE-GC-MS Para la preparacioacuten de la muestra emplearon 10 mL de vino diluidos 11 con agua
ultrapura hasta un volumen final de 20 mL Calcularon las recuperaciones de la extraccioacuten y se encontroacute un rango
para todos los pesticidas en las muestras de 70-120 Para la determinacioacuten en cromatografiacutea de gases-
espectrometriacutea de masas se empleoacute un volumen de inyeccioacuten de 5 μL y un flujo de fase moacutevil de 10 mLmin
Mediante el acoplamiento de teacutecnicas SPE dispersiva-GC-MS WALORCZYK et al [48] en el antildeo 2011 en
Polonia llevaron a cabo la cuantificacioacuten de 160 pesticidas en diferentes clases de vino tinto rosado y blanco Con
10 g de vino y 10 mL de acetonitrilo se realizaron pruebas de recuperacioacuten en la fase de extraccioacuten para vino
tinto con los niveles de concentracioacuten 001 005 y 02 mgkg y para los vinos rosado y blanco con el nivel de
concentracioacuten 005mgkg y encontraron que a todos los niveles de concentracioacuten los valores de recuperacioacuten
rondan el rango 80-110 Para la teacutecnica cromatograacutefica se utilizoacute un volumen de inyeccioacuten de 5 microL
El acoplamiento LLE-SPE-LCDAD fue desarrollado por GONZAacuteLEZ-RODRIacuteGUEZ et al [50] en el antildeo
2010 en la provincia de Orense para la determinacioacuten de nuevos fungicidas propuestos para combatir el hongo
que provoca la enfermedad del mildium En la preparacioacuten de la muestra emplearon 15 mL de vino blanco para la
extraccioacuten en la cual fueron calculadas las recuperaciones relativas para dos niveles de concentracioacuten 005 y 05
mgkg en donde se establece un rango de entre 70-110 para todos los analitos Para la determinacioacuten mediante
cromatografiacutea de liacutequidos se empleoacute un volumen de inyeccioacuten de 2 μL y como meacutetodo de deteccioacuten utilizaron un
detector de diodos array
La microextraccioacuten sorptiva en fase soacutelida fue empleada en la publicacioacuten de FONTANA et al [44] junto con un
acoplamiento entre cromatografiacutea de liacutequidos y espectrometriacutea de masas para la determinacioacuten de 15 fungicidas
en vino realizada durante el 2010 en el noroeste de Espantildea Para la preparacioacuten de la muestra emplearon 10 mL
17
Capiacutetulo I Introduccioacuten
de vino diluiacutedos con el mismo volumen de agua ultrapura y un sorbente en forma de disco de silicona con un
volumen de 12 microL La recuperacioacuten de la extraccioacuten se calculoacute para vino tinto (Menciacutea) y vino blanco (Godello)
realizando tres replicas dentro de un mismo diacutea para los niveles de concentracioacuten 10 y 50 ngmL y nueve reacuteplicas
realizando el anaacutelisis en tres diacuteas consecutivos para el nivel de concentracioacuten de 25 ngmL y los resultados
obtenidos dan unos valores de recuperacioacuten dentro del rango 75-117 En el sistema LC-QTOF-MS el volumen
de inyeccioacuten fue de 15 microL
El otro meacutetodo de extraccioacuten mencionado anteriormente es QuEChERS estaacute en auge como meacutetodo de extracioacuten
de residuos de pesticidas en matrices como la del vino o la uva ya que incrementa la velocidad del anaacutelisis y reduce
el efecto de matriz BUERGE et al [46] seguido de una deteccioacuten mediante GC-MSMS realizaron una estapa
de extraccioacuten QuEChERS con alguna modificacioacuten acetato de sodio en lugar de cloruro soacutedico y acetato de etilo
en lugar de acetonitrilo utilizando 5 g de uva para la determinacioacuten de residuos de 4 pesticidas durante el antildeo
2016 Las recuperaciones de extraccioacuten resultaron ser valores entre 91-149 en uva a distintos niveles de
concentracioacuten 005 05 y 5 mgkg
Para la determinacioacuten de Ametoctradin HU et al [47] llevaron a cabo una extraccioacuten QuEChERS empleando 10
g de uva con deteccioacuten mediante el acoplamiento UPLC-MSMS utilizando un volumen de inyeccioacuten de 5 μL y
un flujo de fase moacutevil de 03 mLmin Las recuperaciones de la extraccioacuten se calcularon para tres niveles de
concentracioacuten 1 10 100 μgL de dos formas distintas en tres diacuteas consecutivos realizando 5 reacuteplicas al diacutea o en
dentro de un mismo diacutea realizando 15 reacuteplicas los resultados de todos los caacutelculos se encuentran dentro del rango
818-1001
Siguiendo con el mismo modo de extraccioacuten GUO et al [49] publicaron sus estudios para la determinacioacuten de
50 pesticidas y 12 adulterantes en vino tinto Para la extraccioacuten QuEChERS se utilizaron 10 mL de vino tinto con
10 mL de acetonitrilo y calcularon las recuperaciones para tres niveles de concentracioacuten 50 100 y 250 ngmL
encontraacutendose un rango de valores entre 75-120 El meacutetodo de deteccioacuten se llevoacute a cabo mediante un anaacutelisis
directo en tiempo real junto con espectrometriacutea de masas en tandem con un cuadrupolo (DART-MSMS) la
teacutecnica DART es un meacutetodo raacutepido para cribar y cuantificar los analitos de estudio que prescinde de la etapa de
separacioacuten cromatograacutefica
A continuacioacuten se recogen en la Tabla I3 los liacutemites de cuantificacioacuten (LOQs) de los analitos de intereacutes en este
trabajo caacutelculados por los diferentes meacutetodos encontrados en bibliografiacutea citados anteriormente en este apartado
18
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Tabla I3 LOQs de los analitos de intereacutes descritos para los distintos meacutetodos encontrados en la bibliografiacutea
Compuesto LOQs
Compuesto LOQs
V Blanco V Tinto Uva V Blanco V Tinto Uva
AME - - 0032μgkg[47] MET 86 μgL[43]
22 μgL[44]
89 μgL[43]
22 μgL[44]
5 μgL[45]
259 ngmL[49]
001mgkg[48]
BEN 02 μgL[44]
0001 mgL[50]
02 μgL[44]
001 μgL[45]
280ngmL[49]
005 mgkg[48] MYC 30 μgL[43]
08 μgL[44]
36 μgL[43]
10 μgL[44]
025 μgL[45]
331ngmL[49]
001 mgkg[48]
BOS 0065 mgL[50] 05 μgL[45]
1076 ngmL[49] 001 mgkg[48] PEN
56 μgL[43]
05 μgL[44]
49 μgL[43]
04 μgL[44]
220ngmL[49]
001 mgkg[48]
CAR - 386 ngmL[49] - PYC 0003mgL[50] 07 μgL[45] 001 mgkg[48]
CYP 15 μgL[43]
04 μgL[44]
0001 mgL[50]
22 μgL[43]
06 μgL[44]
312 ngmL[49]
001 mgkg[48] PYM 17 μgL[43] 22 μgL[43]
10 μgL[45] 001 mgkg[48]
DIM 18 μgL[43] 20 μgL[43] 001 mgkg[48] TEC 03 μgL[44]
03 μgL[44]
10 μgL[45]
160ngmL[49]
001 mgkg[48]
FEH 17 μgL[43] 22 μgL[43]
938 ngmL[49] 001 mgkg[48] TEF - 876ngmL[49] -
FEP - - 002mgkg[46] TBZ 15μgL [43] 29μgL[43] 001 mgkg[48]
FLU 005 μgL[45] TME - 25 μgL[45] 001 mgkg[48]
IMI 21 μgL[43] 22 μgL[43]
225 ngmL[49] - THI-M 92 μgL[43] 89 μgL[43] -
IPR 07 μgL[44] 07 μgL[44] 001 mgkg[48] TRI 10 μgL[44] 12 μgL[44] 001 mgkg[48]
MAN 0011 mgL[50] - -
5 DISTRIBUCIOacuteN DE PESTICIDAS EN VINOS COMERCIALES
En algunos de los meacutetodos descritos en el apartado anterior se procesaron vinos comerciales encontraacutendose
resultados positivos para muchos residuos de pesticidas y algunos hasta en gran concentracioacuten
ECONOMOU et al [43] mediante el meacutetodo LC-ESI-MSMS realizaron el anaacutelisis de 60 muestras de vino tinto
y blanco recogidos en supermercados locales en Grecia a lo largo de un antildeo El meacutetodo se habiacutea desarrollado
19
Capiacutetulo I Introduccioacuten
para la determinacioacuten de 46 pesticidas pero la mayoriacutea se encuentran con una concentracioacuten por debajo de
001mgL solo ocho plaguicidas se obtuvieron con resultados de concentracioacuten mayores Se muestran los
resultados en la Tabla I4 de los analitos de intereacutes en este estudio
Tabla I4 Nuacutemero de muestras positivas de distintos pesticidas en el anaacutelisis de 60 muestras de vino [43]
Compuesto Positivos con concentracioacuten entre 001-01
mgL
Positivos con concentracioacuten entre 01-1
mgL
PYM 2 (3) 2 (3)
MYC 2 (3) 0 (0)
CAR 11 (18) 7 (12)
THI-M 7 (12) 5 (8)
FEH 5 (8) 0 (0)
MET 1 (2) 0 (0)
Mediante el meacutetodo de microextraccioacuten en fase soacutelida-LC-TOF-MS FONTANA et al [44] aplicaron el
desarrollo del procedimiento a un total de 12 vinos joacutevenes elaborados en el 2010 y correspondientes a diferentes
denominaciones geograacuteficas del noroeste de Espantildea En la Tabla I5 se muestran los datos que han obtenido
Tabla I5 Determinacioacuten de fitosanitarios en vinos comerciales mediante Microextraccioacuten en fase soacutelida-LC-TOF-MS
Valores de concentracioacuten en ngmL [44]
Pesticidas
W 1
Albarintildeo
W5
Ribeiro
W6
Valdeorras
R1
Ribeira Sacra
R3
Ribeiro
R4
Valdeorras
MET 404plusmn06 223plusmn05 311plusmn007 25plusmn03 31plusmn03 74plusmn10
TRI nd nd 36plusmn06 nd nd ltLOQ
IPR 394plusmn03 324plusmn02 324plusmn02 071plusmn007 31plusmn02 28plusmn05
MYC nd nd nd ltLOQ 39plusmn02 nd
TEC 25plusmn01 nd nd nd nd nd
CYP 179plusmn08 ltLOQ ltLOQ 562plusmn002 083plusmn001 nd
BEN 042plusmn001 nd ltLOQ nd 032plusmn001 ltLOQ
ndNo detectados ltLOQ por debajo del liacutemite de cuantificacioacuten del meacutetodo los coacutedigos W y R corresponden respecti-vamente a los vinos blanco y tinto
20
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Por uacuteltimo PELAJIĆ et al [45] aplicaron su meacutetodo SPE dispersiva-GC-MS mediante el cual determinaron 25
residuos de plaguicidas en vino tinto a un total de 32 muestras de vino adquiridos en supermercados locales de
Croacia pero de diversos oriacutegenes de procedencia Los resultados que han obtenido se muestran en la Tabla I6
en doacutende un total de 15 plaguicidas han sido detectados y 7 de los cuales se encontraban en una alta
concentracioacuten
Tabla I6 Resultados de los vinos con positivos en pesticidas y sus concentraciones [45]
Vino Paiacutes Residuos de pesticidas (mgKg)
Tinto Francia DIM (0013) MET (0009) IPR (001)
Tinto Alemania BOS (0011)
Tinto Alemania IPR (0009)
Tinto Macedonia MET (0015)
Tinto Moldavia IPR (0008)
Tinto Polonia MET (004)
Tinto Rumania PYM (0058)
Tinto Espantildea TRI (0005) MET (0011)
Tinto Estados Unidos BOS (001)
Rosado Francia BOS (0005)
Blanco Chile TEC (0008)
Blanco Georgia MET (0057)
Blanco Alemania DIM (001) IPR (0054) PYM (0056)
Blanco Sudaacutefrica DIM (0011) IPR (0011)
21
Capiacutetulo II Objetivos y discusioacuten
CAPIacuteTULO II OBJETIVOS Y DISCUSIOacuteN
El objetivo principal que se persigue en este trabajo es el desarrollo de un meacutetodo analiacutetico raacutepido basado en la
extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) y deteccioacuten mediante cromatografiacutea de liacutequidos en la modalidad de UPLC
acoplada a la espectrometriacutea de masas en taacutendem (UPLC-MSMS) para la determinacioacuten multianalito de residuos
de fitosanitarios principalmente fungicidas aunque tambieacuten alguacuten insecticida en muestras de vino blanco y tinto
Para llevar a cabo la finalidad de lo dicho se consideran unos objetivos maacutes especiacuteficos
Minimizar la manipulacioacuten de la muestra para asiacute reducir la cantidad de disolventes y tiempo empleado
Optimizacioacuten de los factores que afectan en la extraccioacuten en la SPE tales como tipo y cantidad de
adsorbente volumen de eluyente etc
Estudio de las condiciones en UPLC-MSMS para una separacioacuten y cuantificacioacuten oacuteptimas
Caracterizacioacuten y validacioacuten del meacutetodo propuesto
Por uacuteltimo una vez cumplidos todos los objetivos anteriores y fijadas las condiciones oacuteptimas el meacutetodo
estudiado se aplica en el anaacutelisis de muestras de vino comercial (blanco y tinto) para determinar si se encuentran
residuos presentes asiacute como conocer en queacute concentracioacuten se encuentran los pesticidas objeto de este estudio
22
Capiacutetulo III Parte experimental
CAPIacuteTULO III PARTE EXPERIMENTAL
1 MATERIAL Y REACTIVOS
11 Material
Material de vidrio de uso comuacuten en el laboratorio vasos de precipitados matraces aforados etc
Micropipetas automaacuteticas de 20-200 microL 20-200 microL 100-1000 microL 1000-5000 microL Eppendorf
Puntas de plaacutestico para micropipetas
Encapsulador y desencapsulador
Soportes y pinzas
Viales de 15 mL transparentes para muestreador automaacutetico de cromatografiacutea (Sugelabor)
Caacutepsulas de aluminio con seacuteptum de Tefloacuten (Sugelabor) y tapones pre-slit para viales
Tubos y conectores de tefloacuten
Cartuchos de divinilbenceno-N-vinilpirrolidona 200 mg Oasis HLB Waters
Cartuchos de divinilbenceno-N-vinilpirrolidona funcionalizados con grupos amina cuaternaria 150 mg
Oasis MAX Waters
Cartuchos de divinilbenceno-N-vinilpirrolidona 60 mg Oasis HLB Waters
12 Reactivos y disolventes
Agua ultrapura Milli-Q
Aacutecido foacutermico (Sigma Aldrich) 95
Acetonitrilo (LichrosolvregMerck) Gradient grade for liquid chromatography
Metanol (LichrosolvregMerck) Gradient grade for liquid chromatography
Etanol (LichrosolvregMerck) Gradient grade for liquid chromatography
13 Patrones
Ametoctradin (AME) Dr Ehrenstrorfer 990
Benalaxyl (BEN) Pestanal Sigma- Aldrich 999
23
Capiacutetulo III Parte experimental
Boscalid (BOS) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Carbendazim (CAR) Pestanal Sigma- Aldrich 992
Cyprodinil (CYP) Pestanal Sigma- Aldrich 998
Dimethomorph (DIM) mezcla de isoacutemeros E + Z Pestanal Sigma- Aldrich 989
Fenhexamid (FEH) Pestanal Sigma- Aldrich 997
Fenpropidin (FEP) Dr Ehrenstrorfer 980
Fluopicolide (FLU) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Imidacloprid (IMI) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Iprovalicarb (IPR) mezcla de isoacutemeros Pestanal Sigma- Aldrich 985
Mandipropamid (MAN) Pestanal Sigma- Aldrich 991
Metalaxyl (MET) Pestanal Sigma- Aldrich 990
Myclobutanil (MYC) Pestanal Sigma- Aldrich 994
Penconazole (PEN) Pestanal Sigma- Aldrich 991
Pyraclostrobin (PYC) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Pyrimethanil (PYM) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Tebuconazol (TEC) Pestanal Sigma- Aldrich 996
Tebufenozide (TEF) Dr Ehrenstrorfer 988
Thiabendazole (TBZ) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Thiamethoxam (TME) Pestanal Sigma- Aldrich 996
Thiophanate-methyl (THI-M) Dr Ehrenstrofer 990
Triadimenol (TRI) Mezcla de diastereoisoacutemeros Pestanal Sigma- Aldrich 994
14 Patrones internos
Carbendazim-d3 (CAR-d3) Pestanal Sigma- Aldrich 998
Cyprodinil-d5 (CYP-d5) Pestanal Sigma- Aldrich
Imidacloprid-d4 (IMID-d4) Pestanal Sigma- Aldrich
Metalaxyl 13C6 (MET13C6) Pestanal Sigma-Aldrich 99
24
Capiacutetulo III Parte experimental
15 Gases
Nitroacutegeno 99999 como gas de colisioacuten en el espectroacutemetro de masas
Nitroacutegeno en los sistemas de concentracioacuten y secado por corriente de nitroacutegeno de los cartuchos SPE
2 INSTRUMENTACIOacuteN
Balanza analiacutetica de precisioacuten Sartorius
Granatario Sartorius
Bantildeo de ultrasonidos P-Selecta
Equipo de purificacioacuten de agua Millipore modelo Milli-Q gradient A-10ZMQSSVOT4
Estacioacuten de concentracioacuten por corriente de nitroacutegeno Mini-Vap Supelco
Sistema de secado de cartuchos de SPE por corriente de nitroacutegeno VisiDry Supelco
Sistema distribuidor de vaciacuteo Visiprep reg Supelco
Cromatoacutegrafo de liacutequidos de ultra-alta resolucioacuten Waters AcquityUPLC reg y espectroacutemetro de masas
Acquity TQD con analizador de triple quadrupolo (QqQ) equipado con una fuente de ionizacioacuten a
presioacuten atmosfeacuterica del tipo Z-spray (ESI)
3 PREPARACIOacuteN DE LAS DISOLUCIONES
Los patrones de pesticidas se prepararon individualmente a partir de los compuestos soacutelidos comerciales por
pesada excepto en el caso del fenpropidin (FEP) que se preparoacute a partir del compuesto liacutequido comercial Estos
compuestos soacutelidos se disolvieron en metanol y se obtuvieron unas disoluciones iniciales con concentraciones
recogidas en la Tabla III1
25
Capiacutetulo III Parte experimental
Tabla III1 Concentracioacuten de las disoluciones patroacuten stock
Compuesto Concentracioacuten (microgmL) Compuesto Concentracioacuten (microgmL)
AME 102201 MET 118912
BEN 138330 MYC 102017
BOS 99474 PEN 129791
CAR 17105 PYC 104581
CYP 131075 PYM 141386
DIM 103009 TEC 134729
FEH 99584 TEF 137769
FEP 100000 TBZ 105928
FLU 126859 TME 112283
IMI 101123 THI-M 124202
IPR 106739 TRI 118933
MAN 101021
4 LAVADO DEL MATERIAL
La limpieza del material de vidrio utilizado en el laboratorio se realizoacute utilizando jaboacuten y aclarando con agua de
grifo Luego en primer lugar se realiza un enjuague con agua Milli-Q finalmente un segundo enjuague con
acetona para eliminar posibles restos de compuestos orgaacutenicos y se deja secar sobre papel
Para la limpieza de los conectores de tefloacuten empleados en el proceso de SPE se introducen en un vaso de
precipitados con metanol y este en un bantildeo de ultrasonidos durante 10 minutos Al finalizar con el bantildeo de
ultrasonidos se realiza un enjuague con acetona y se pone a secar
5 EXTRACCIOacuteN DE MUESTRAS MEDIANTE SPE
El meacutetodo de extraccioacuten utilizado para la determinacioacuten de pesticidas fue la extraccioacuten en fase soacutelida (SPE)
mediante cartuchos Oasis HLB de 200 mg A continuacioacuten se describe el protocolo de extraccioacuten en las
condiciones oacuteptimas
26
Capiacutetulo III Parte experimental
1 Acondicionamiento del cartucho Oasis HLB de 200 mg con 2 mL de acetonitrilo seguidos de otros 2 mL de
vino sinteacutetico formado por la mezcla etanolagua MilliQ (1288)
2 Paso de la muestra 2 mL de vino diluiacutedos con 2 mL de agua MilliQ a traveacutes del cartucho por gravedad
3 Lavado del cartucho con 2 mL de agua MilliQ
4 Secado del cartucho durante 45 minutos en el VisiDry mediante el paso de una corriente de nitroacutegeno
5 Elucioacuten del cartucho con la mezcla metanolacetonitrilo en proporcioacuten 2080 hasta un volumen final de 2
mL
6 Anaacutelisis mediante cromatografiacutea liacutequida acoplada a espectrometriacutea de masas en taacutendem UPLC-MSMS
(volumen de inyeccioacuten 15 microL)
Representacioacuten esquematizada en la Figura III1
Figura III1 Extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) de las muestras de vino
27
Capiacutetulo III Parte experimental
6 CONDICIONES DE DETERMINACIOacuteN MEDIANTE UPLC-MSMS
En la Tabla III2 se indican las condiciones utlizadas en la determinacioacuten de los pesticidas de intereacutes mediante
LC-MSMS y en la Tabla III3 se muestra el gradiente de la fase moacutevil utilizado para la separacioacuten
cromatograacutefica
Tabla III2 Condiciones experimentales de determinacioacuten en LC-MSMS
UPLC Acquity UPLC-I-Class IVD System
bull Columna cromatograacutefica Zorbax Eclipse Plus C18 Rapid Resolution HD
Fase estacionaria C18
Dimensiones 21 x 50 mm
Tamantildeo de partiacutecula 18 microm
Temperatura del horno 40ordmC
bull Inyector
Volumen de inyeccioacuten 15 microL
bull Fase moacutevil
Flujo 04 mLmin
Fase acuosa (A) Agua MilliQ con 01 aacutecido foacutermico
Fase orgaacutenica (B) Acetonitrilo con 01 aacutecido foacutermico
MSMS WatersXevo TQD
Modo de ionizacioacuten ESI positivo
Voltaje del capilar 15 kV
Voltaje de cono 50 V
Temperatura de gas de secado (N2) 450ordmC
Flujo de gas de secado (N2) 1000 Lh
Modo de adquisicioacuten Centroide
Tabla III3 Gradiente de fase moacutevil utilizado en la separacioacuten cromatograacutefica (LC)
Tiempo min 0 13 28 64 75 76 10
A 98 50 50 0 0 98 98
B 2 50 50 100 100 2 2
28
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
CAPIacuteTULO IV RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
1 IDENTIFICACIOacuteN DE LOS COMPUESTOS
Para empezar el estudio en primer lugar se realizoacute la caracterizacioacuten de las condiciones de determinacioacuten de los
analitos en el modo Multiple Reaction Monitoring (MRM) mediante UPLC-ESI-MSMS Para llevarla a cabo se
tomaron patrones individuales de cada fitosanitario y mediante infusioacuten se estudiaron las posibles transiciones y
voltajes oacuteptimos para su determinacioacuten (Tabla IV1)
La ionizacioacuten por electrospray (ESI) se estudioacute tanto en modo positivo como en modo negativo encontraacutendose
que para todos los pesticidas de nuestro intereacutes se obteniacutea sentildeal en el modo positivo mientras el modo negativo
no presentaba respuesta significativa
A continuacioacuten se estudia el efecto del voltaje de cono en la respuesta del ioacuten molecular [M+H]+ aumentaacutendolo
hasta alcanzar el valor maacuteximo de la sentildeal correspondiente a dicho ioacuten y luego se optimiza la energiacutea de colisioacuten
variaacutendola para cada analito hasta obtener la sentildeal de mayor intensidad para cada uno de los iones producto Por
uacuteltimo una vez optimizado el voltaje de cono y la energiacutea de colisioacuten se seleccionan las dos transiciones maacutes
intensas para llevar a cabo la cuantificacioacuten y cualificacioacuten de cada analito en modo MRM Este procedimiento se
realizoacute para la totalidad de los compuestos confirmando los datos obtenidos con los facilitados por la base de
datos Quanpedia que estaacute disponible en el software del equipo utilizado para algunos de los compuestos
considerados
Compuesto Tr (min) Ion precursor (mz Da)
Voltaje de cono (V)
Ion producto 1 (CEv)
cuantificacioacuten
Ion producto 2 (CEv)
cualificacioacuten
Relacioacuten IP2IP1
AME 325 2760 60 176 (35) 70 (50) 016
BEN 485 3261 26 148 (20) 91 (34) 067
BOS 387 3429 41 140 (20) 307 (20) 011
CAR 167 1921 33 160 (18) 132 (28) 014
CYP 311 2260 56 93 (33) 108 (25) 061
DIM 322 3881 40 301 (20) 165 (30) 057
FEH 386 3021 41 97 (22) 55 (38) 044
FEP 257 2742 55 147 (28) 86 (28) 093
FLU 401 3830 40 173 (20) 365 (15) 010
IMI 218 2561 34 209 (15) 175 (20) 091
IPR 358 3211 28 119 (16) 203 (10) 042
Tabla IV1 Tiempos de retencioacuten (Tr) relacioacuten de iones precursores (mz) voltaje de cono (V) energiacuteas de colisioacuten (CE) y relacioacuten de intensidades entre transiciones (IP2IP1)
29
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Compuesto Tr (min) Ion precursor (mz Da)
Voltaje de cono (V)
Ion producto 1 (CEv)
cuantificacioacuten
Ion producto 2 (CEv)
cualificacioacuten
Relacioacuten IP2IP1
MAN 392 4120 25 328 (16) 125 (35) 063
MET 283 2801 26 220 (13) 192 (17) 057
MYC 365 2891 34 70 (18) 125 (32) 029
PEN 417 2840 34 70 (16) 159 (34) 031
PYC 523 3881 31 194 (12) 163 (25) 066
PYM 266 2000 51 107 (24) 82 (24) 071
TEC 397 3080 40 70 (22) 125 (40) 007
TEF 473 3531 19 133 (20) 297 (8) 072
TBZ 182 2020 51 175 (25) 131 (30) 062
TME 203 2920 28 211 (12) 132 (22) 047
THI-M 257 3430 28 151 (46) 93 (19) 0001
TRI 319 2961 21 70 (10) 99 (15) 013
El dwell time para cada una de las transiciones se ajustoacute de manera automaacutetica por el software (MassLinx) con
objeto de obtener doce puntos espectrales por compuesto tomando un valor promedio de cuatro segundos como
ancho de pico a liacutenea de base
2 CARACTERIZACIOacuteN DEL PROCEDIMIENTO DE DETERMINACIOacuteN (UPLC-ESI-
MSMS)
Una vez optimizados los paraacutemetros que afectan a la separacioacuten cromatograacutefica (UPLC) y a la determinacioacuten por
espectrometriacutea de masas en taacutendem (MSMS) se lleva a cabo la evaluacioacuten de la repetibilidad de inyeccioacuten y
determinacioacuten en esas condiciones Se expresa por medio de la desviacioacuten estaacutendar relativa (RSD) paraacutemetro que
nos indica el grado de correlacioacuten que existe entre varias medidas del mismo patroacuten realizadas por el mismo
operador en el laboratorio y en el mismo equipo de medida a lo largo de un diacutea Para el estudio se realizan diez
inyecciones con volumen de 15 microL de dos patrones con distintos niveles de concentracioacuten 5 y 20 ngmL Los
datos de RSD (Tabla IV2) para las aacutereas de pico de los analitos se situacutean para el nivel de concentracioacuten 5 ngmL
en el rango 2-13 y en el nivel de concentracioacuten 20 ngmL en el rango 1-7
30
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten Tabla IV2 Desviacioacuten estaacutendar relativa (RSD) del aacuterea de pico (transicioacuten de cuantificacioacuten) para evaluar la repetivilidad del proceso de LC-MSMS
Compuesto RSD
5 ngmL
RSD
20 ngmL Compuesto
RSD
5 ngmL
RSD
20 ngmL
AME 5 2 MET 3 2
BEN 2 2 MYC 9 2
BOS 4 5 PEN 4 4
CAR 4 2 PYC 3 1
CYP 5 7 PYM 7 3
DIM 6 5 TEC 3 2
FEH 7 4 TEF 4 2
FEP 4 2 TBZ 2 1
FLU 5 3 TME 6 6
IMI 13 7 THI-M a 6
IPR 8 2 TRI 8 6
MAN 3 2
A continuacioacuten tambieacuten se evaluoacute la repetibilidad de los tiempos de retencioacuten (Tr) para diez inyecciones de
patrones a los dos niveles de concentracioacuten 5 y 20 ngmL situaacutendose las RSD para todos los compuestos en el
rango 01-03 En base a este dato la ventana de tiempo en la que se registran las transiciones de MRM de cada
compuesto se fijoacute en 05 min lo que es lo mismo 025 min alrededor del valor medio de su tiempo de retencioacuten
Por otro lado la linealidad del meacutetodo se estudioacute a nueve niveles de concentracioacuten diferentes comprendidos ente
los niveles 05 ngmL y 200 ngmL mediante la inyeccioacuten de disoluciones patroacuten de los distintos compuestos de
estudio Se realizoacute una evaluacioacuten sin y otra con patroacuten interno (IS) antildeadiendo una concentracioacuten fija de patrones
internos a nivel de 25 ngmL y pudimos observar que los resultados mejoran notablemente al realizar una
correccioacuten con el IS En la Tabla IV3 se muestran los coeficientes de determinacioacuten (R2) obtenidos al realizar la
correccioacuten mediante IS observando que para todos los compuestos excepto para THI-M y para TRI los
coeficientes de correlacioacuten son superiores a 0990 por lo que existe una respuesta lineal en el rango de
concentraciones que hemos estudiado
Aparte del estudio de la linealidad tambieacuten se han estudiado los liacutemites de cuantificacioacuten instrumentales del
meacutetodo (LOQs) Para ello los LOQs se evaluacutean como la miacutenima cantidad de analito que origina una sentildeal 10
veces superior a la desviacioacuten estaacutendar del ruido Los valores anteriores se estimaron a partir del patroacuten de
a no evaluado ya que se encuentra por debajo del liacutemite de cuantificacioacuten del meacutetodo
31
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
concentracioacuten maacutes baja que presenta un pico con una relacioacuten SN superior a 10 En la Tabla IV3 tambieacuten se
recogen estos LOQs en doacutende podemos ver que variacutean en el rango 01-1 ngmL excepto para THI-M que se
desviacutea a valores de 10 ngmL
Tabla IV3 Coeficientes de determinacioacuten (R2) y liacutemites de cuantificacioacuten instrumentales (LOQs) de los analitos para nueve
niveles de concentracioacuten de 05 a 200 ngmL
Compuesto Coeficiente de
correlacioacuten (R2)
LOQs (ngmL) Compuesto
Coeficiente de correlacioacuten
(R2)
LOQs (ngmL)
AME 09951 04 MET 09933 01
BEN 09949 01 MYC 09950 04
BOS 09979 02 PEN 09945 02
CAR 09923 02 PYC 09955 02
CYP 09878 02 PYM 09931 01
DIM 09938 07 TEC 09958 05
FEH 09959 05 TEF 09957 01
FEP 09931 01 TBZ 09942 02
FLU 09965 02 TME 09903 01
IMI 09979 05 THI-M 09580 100
IPR 09938 01 TRI 09867 07
MAN 09979 01
En la Figura IV1 y Figura IV2 se muestran dos ejemplo de curvas de calibrado para dos compuestos IMI y
MAN respectivamente
Figura IV1 Curva de calibrado y coeficiente de determinacioacuten de IMI para UPLC-ESI-MSMS
32
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Figura IV2 Curva de calibrado y coeficiente de determinacioacuten de MAN para UPLC-ESI-MSMS
3 ESTUDIO DEL MEacuteTODO SPE
La extraccioacuten de pesticidas se llevoacute a cabo mediante extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) en doacutende se realizaron
diversos estudios con diferentes condiciones para dar con las oacuteptimas En primer lugar se llevaron a cabo los
experimentos de retencioacuten y elucioacuten sobre dos tipos distintos de adsorbentes cartuchos OASIS HLB (200mg) y
cartuchos OASIS MAX (150 mg) como fases potenciales en las que llevar a cabo la extraccioacuten de manera
selectiva Los dos tipos de cartuchos son de fase reversa pero difieren entre siacute en el fundamento de retencioacuten de
los analitos En los cartuchos OASIS HLB (200 mg) formados por divinilbenceno-N-vinilpirrolidona (DVB-VP)
la retencioacuten de los diferentes analitos tiene lugar por interacciones π-π o de Van der Waals mientras que los
cartuchos OASIS MAX (150 mg) que se probaron como alternativa para mejorar la selectividad en la extraccioacuten
cuentan con un adsorbente polimeacuterico de modo mixto formado por divinilbenceno-N-vinilpirrolidona (DVB-VP)
funcionalizado con grupos amina cuaternaria siendo el fundamento de la extraccioacuten la combinacioacuten de las
propiedades adsorbentes del cartucho HLB con un mecanismo adicional de intercambio ioacutenico (anioacutenico) [27]
Algunos autores han empleado este mecanismo para mejorar la selectividad de la extraccioacuten de forma que en la
etapa de elucioacuten ciertos pigmentos del vino quedan fuertemente retenidos en el adsorbente a diferencia de lo que
ocurre con los adsorbentes de fase reversa [51]
Para llevar a cabo la eleccioacuten del tipo de adsorbente se realizaron pruebas con 10 mL de vino blanco y tinto
conectando en serie los dos tipos de cartuchos HLB (200 mg) y MAX (150 mg) a un segundo cartucho OASIS
HLB (60 mg) La elucioacuten de los analitos se hace de forma independiente para cada cartucho y se evaluacutea si los
analitos pasan del primer cartucho hacia el segundo cartucho es decir si se supera el volumen de corte o si por
33
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
otro lado se quedan retenidos en el primero y no eluyen hacia el segundo En estas pruebas de estudio
preliminares de preparacioacuten de la muestra no se ha incluido el CYP
En la Figura IV3 podemos ver la eficacia de la extraccioacuten para vino blanco y tinto que obtenemos empleando
cartuchos OASIS MAX (150 mg) conectados en serie con cartuchos OASIS HLB (60 mg) realizando la
extraccioacuten de tres fracciones de 2 mL cada una del cartucho OASIS MAX (150 mg) y una cuarta fraccioacuten de 2
mL del cartucho OASIS HLB (60 mg)
Por otro lado en la Figura IV4 podemos ver un graacutefico de columnas en el cual comparamos la eficacia de
extraccioacuten de los cartuchos OASIS HLB (200 mg) con dos disolventes de elucioacuten distintos En dicho graacutefica el
acroacutenimo de cada compuesto consta de dos barras cuyo significado es el siguiente la barra de la izquierda indica
la eficacia de la extraccioacuten empleando acetonitrilo (ACN) como disolvente de elucioacuten y la barra de la derecha
indica la eficacia de la extraccioacuten empleando la combinacioacuten MetanolAcetonitrilo (2080) (MeOHACN) como
disolvente de elucioacuten Para este adsorbente no se detectoacute ninguacuten compuesto en la extraccioacuten del segundo
cartuchos OASIS HLB (60 mg) empleando 2 mL de metanol
Figura IV3 Distribucioacuten de los compuestos en cada fraccioacuten obtenidas con cartuchos OASIS MAX (150 mg)
utilizando 10 mL de vino tinto y blanco sacando cuatro fracciones de 2 mL cada una con metanol como
disolvente de elucioacuten
34
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Figura IV4 Distribucioacuten de los compuestos en cada fraccioacuten obtenidas con cartuchos OASIS HLB (200 mg) utilizando 10
mL de vino tinto y blanco sacando 3 fracciones de 2 mL cada una con acetonitrilo (ACN) (columna de la izquierda) y una
combinacioacuten MetanolAcetonitrilo (2080) (MeOHACN) (columna de la derecha) como disolventes de elucioacuten
A la vista de los resultados reflejados en las graacuteficas podemos afirmar que cuando se utiliza el cartucho OASIS
HLB (200 mg) eluyendo con acetonitrilo o la combinacioacuten metanolacetonitrilo (2080) los extractos son limpios
y se eluyen la mayoriacutea de los compuestos en la primera fraccioacuten Pero utilizando acetonitrilo como disolvente de
elucioacuten se encuentran problemas en la extraccioacuten de CAR FEH y TBZ para los que es necesario emplear un
volumen mayor de elucioacuten o bien seleccionar otro disolvente de elucioacuten como es la combinacioacuten
metanolacetonitrilo
35
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Por otro lado los extractos en los cartuchos OASIS MAX (150 mg) son maacutes limpios incluso utilizando metanol en
la elucioacuten pero se detecta la presencia de CAR FEP TBZ y TME en el segundo cartucho OASIS HLB (60 mg)
significando la rotura del primer cartucho para dichos analitos considerando un volumen de 10 mL de vino Los
demaacutes compuestos se podriacutean recuperar cuantitativamente en la primera fraccioacuten sacada pero la peacuterdida de estos
compuestos inclina la eleccioacuten hacia los cartuchos OASIS HLB (200 mg) con metanolacetonitrilo (2080) como
disolvente de elucioacuten para continuar con el estudio
Una vez fijado el adsorbente y el volumen de elucioacuten se prueba la eficacia de la SPE independiente de los efectos
de matriz En la Tabla IV4 se muestran las recuperaciones de la SPE tomando 10 mL de vino blanco y tinto
con un nivel de adicioacuten de 15 ngmL sacando una sola fraccioacuten de 2 mL con la combinacioacuten
metanolacetonitrilo (2080) y n=3 reacuteplicas
Tabla IV4 Recuperaciones (R plusmn SD) de SPE para 10 mL de vino (blanco y tinto) con un nivel de adicioacuten de 15 ngmL y
n=3 reacuteplicas
Compuesto Vino Tinto
R plusmn SD
Vino Blanco
R plusmnSD Compuesto
Vino Tinto
R plusmn SD
Vino Blanco
R plusmn SD
AME 82 plusmn 7 100 plusmn 1 MET 92 plusmn 6 94 plusmn 3
BEN 89 plusmn 6 97 plusmn 3 MYC 90 plusmn 9 86 plusmn 4
BOS 95 plusmn 1 100 plusmn 2 PEN 84 plusmn 10 103 plusmn 3
CAR 91 plusmn 6 104 plusmn 6 PYC 86 plusmn 5 106 plusmn 1
CYP 81 plusmn 7 102 plusmn 3 PYM 87 plusmn 12 94 plusmn 3
DIM 97 plusmn 3 86 plusmn 4 TEC 83 plusmn 10 103 plusmn 1
FEH 89 plusmn 3 88 plusmn 3 TEF 84 plusmn 5 108 plusmn 4
FEP 91 plusmn 7 104 plusmn 3 TBZ 88 plusmn 7 92 plusmn 5
FLU 91 plusmn 2 97 plusmn 4 TME 101 plusmn 1 110 plusmn 13
IMI 117 plusmn 8 101 plusmn 11 THI-M 85 plusmn 9 110 plusmn 4
IPR 89 plusmn 7 112 plusmn 4 TRI 85 plusmn 10 110 plusmn 4
MAN 88 plusmn 2 87 plusmn 2
Algunos compuestos de la matriz en el vino pueden competir con los analitos durante el proceso de ionizacioacuten
que tiene lugar en la interfase entre UPLC-MSMS por lo que para la cuantificacioacuten del rendimiento de la
ionizacioacuten por electrospray (ESI) se estudian los efectos de matriz (EM) para vino blanco y tinto considerando
dos voluacutemenes de muestra distintos 2 y 10 mL y un volumen final del extracto de 2 mL En la Tabla IV5 se
36
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
exponen los valores para cada compuesto notando que al aumentar el volumen de muestra tambieacuten se aumentan
los efectos de matriz y eacutestos siempre son mayores en vino tinto Para el caacutelculo de estos efectos de matriz (EM)
se emplea la siguiente ecuacioacuten
Donde Am Ab y Ap representan el aacuterea de pico en la sentildeal medida del analito en el extracto de la muestra con
adicioacuten en el extracto de la muestra sin adicioacuten (o blanco) y en el patroacuten antildeadido respectivamente El nivel de
adicioacuten en extracto fue de 50 ngmL por compuesto
Tabla IV5 Efectos de matriz para vino blanco y tinto con un volumen inicial de 2 y 10 mL evaluados para un nivel de adicioacuten de 50 ngmL en extracto
Compuesto
Vino blanco Vino tinto
2 mL 10 mL 2mL 10 mL
EM () CV () EM () CV () EM () CV () EM () CV()
AME 93 3 95 2 99 3 101 7
BEN 99 1 93 2 101 3 100 6
BOS 97 5 98 1 108 2 96 0
CAR 62 2 50 3 58 2 55 6
CYP 94 3 91 1 97 2 95 7
DIM 105 2 95 3 100 3 108 3
FEH 100 4 102 4 105 4 94 3
FEP 95 3 88 2 96 2 92 7
FLU 98 2 93 2 106 1 101 2
IMI 84 4 46 3 48 10 18 8
IPR 99 3 92 3 105 1 100 7
MAN 100 1 94 3 109 4 107 2
MET 98 1 89 1 99 2 99 6
MYC 105 1 100 1 103 2 96 9
PEN 98 3 97 1 101 3 99 10
PYC 98 2 92 3 102 2 98 5
PYM 95 2 87 1 94 3 85 12
TEC 95 3 99 1 101 1 102 10
TEF 99 1 92 3 101 2 104 5
TBZ 45 0 40 5 43 2 30 7
TME 60 6 19 16 36 4 16 1
THI-M 107 2 109 2 103 1 96 9
TRI 97 3 118 4 104 5 117 10
37
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Al observar los resultados podemos ver que la mayoriacutea de los compuestos dan resultados de EM en torno al
100 lo que significa que no sufren una modificacioacuten importante en la eficacia de ionizacioacuten para las muestras
con respecto a los patrones Pero tambieacuten por el contrario podemos observar que algunos compuestos como
por ejemplo en el caso de CAR TBZ IMI y TME experimentan una gran supresioacuten de sentildeal es decir EM bajos
que se acentuacutean al aumentar el volumen de muestra La atenuacioacuten en la eficacia de variacioacuten para estos cuatro
compuestos no solo se ve incrementada con el volumen de muestra si no que ademaacutes es maacutes significativa para
vino tinto que para vino blanco En base a estos resultados aunque la eficacia de la SPE fue cuantitativa para
muestras de 10 mL se limitoacute el volumen de muestra a extraer a 2 mL
Las condiciones oacuteptimas de extraccioacuten se esquematizan en un resumen en la Figura IV5
Figura IV5 Condiciones optimizadas para la extraccioacuten de pesticidas en vino
38
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
4 CARACTERIZACIOacuteN DEL MEacuteTODO DE DETERMINACIOacuteN
Con las condiciones de extraccioacuten y determinacioacuten citadas anteriormente se llevaron a cabo pruebas de
recuperaciones absolutas de los compuestos a nivel de adicioacuten de 5 y 20 ngmL sobre las muestras Para cada
muestra y nivel de adicioacuten se realizaron tres reacuteplicas de las muestras con adicioacuten y los blancos aliacutecuotas de las
mismas muestras sin adicioacuten se procesaron en duplicado Los IS se antildeadieron a nivel de 25 ngmL y cada uno se
utiliza para corregir unos determinados compuestos CAR-d3 se emplea para CAR y TBZ el CYP-d5 para CYP y
PYM el IMID-d4 para IMI y TME y el MET13C6 para el resto de compuestos Los resultados para vino blanco
comprenden en el nivel de concentracioacuten 5 ngmL el rango entre 79-122 y en el nivel de concentracioacuten 20
ngmL el rango entre 84-109 Por otro lado en el caso del vino tinto las recuperaciones se encuentran para el
nivel de concentracioacuten 5 ngmL en el rango 67-112 y para el nivel de concentracioacuten 20 ngmL entre el rango
73-132 Los resultados obtenidos en las pruebas con vino blanco y vino tinto se muestran en la Tabla IV6
Los resultados son satisfactorios ya que la mayoriacutea de los compuestos se ajustan en todos los casos al rango de
recuperacioacuten entre 70-120 Para la realizacioacuten de estas pruebas se ha eliminado de los resultados el compuesto
THI-M debido a que las concentraciones utilizadas se encuentran en el liacutemite o por debajo del LOQ en los
experimentos con muestras adicionadas a 5 ngmL
Para calcular las recuperaciones (R) se recurrioacute a la siguiente ecuacioacuten
Donde Cm Cb y Cp son la concentracioacuten medida de analito en el extracto de la muestra con adicioacuten en el extracto
de la muestra sin adicioacuten (o blanco) y en el patroacuten antildeadido respectivamente
Tabla IV6 Recuperaciones (R) para vino tinto y vino blanco evaluadas para dos niveles de concentracioacuten 5 y 20 ngmL
Compuesto
Vino tinto Vino Blanco
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
AME 97 3 105 6 104 9 96 5
BEN 88 11 105 3 101 1 98 4
BOS 91 13 110 2 88 13 97 3
39
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Compuesto
Vino tinto Vino blanco
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
CAR 99 6 99 3 122 3 109 1
CYP 91 2 111 1 101 4 100 6
DIM 112 3 110 9 102 24 99 11
FEH 91 4 108 0 102 20 95 2
FEP 89 8 102 7 94 5 84 1
FLU 95 10 104 4 109 5 100 8
IMI 73 11 115 9 80 13 100 2
IPR 84 13 99 3 111 3 99 4
MAN 88 22 112 8 112 3 99 4
MET 99 3 106 5 106 3 98 2
MYC 84 9 106 13 88 17 86 3
PEN 84 9 102 5 84 8 90 5
PYC 96 6 105 4 100 2 95 4
PYM 90 12 112 14 106 4 97 1
TEC 89 8 101 6 98 12 94 1
TEF 93 10 102 5 107 2 97 3
TBZ 94 17 115 8 79 5 106 2
TME 67 2 101 7 84 18 90 11
THI-M ne - 74 7 ne - 89 24
TRI 88 12 97 6 102 6 92 2
ne No evaluado El nivel de adicioacuten es inferior al LOQ del meacutetodo para este compuesto
Para estudiar la reproducibilidad del meacutetodo analiacutetico global (correspondientes a los datos de preparacioacuten de
muestra y determinacioacuten) es decir la concordancia de varias medidas realizadas en diacuteas diferentes se procedioacute a la
extraccioacuten en las condiciones oacuteptimas tanto de vino blanco como tinto Las extracciones y determinaciones se
realizaron durante tres diacuteas consecutivos realizando tres reacuteplicas por vino y por diacutea con un nivel de adicioacuten en
muestra de 10 ngmL un blanco de muestra cada diacutea En la Tabla IV7 se muestran los resultados como
recuperaciones (R) en condiciones de reproducibilidad obtenidos para ambos tipos de vino dando valores entre
64-116 para muestras de vino blanco y valores situados entre 68-108 para muestras de vino tinto con la
excepcioacuten del TME para el que se ha obtenido un valor no aceptable en cuanto a la exactitud medida en
condiciones de reproducibilidad A la vista de los resultados obtenidos con estas pruebas se considera necesario el
empleo de IS adicionales para la mejora en la exactitud del meacutetodo para algunos compuestos por ejemplo el
TME
40
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Tabla IV7 Recuperaciones en condiciones de reproducibilidad (R plusmn SD) para vino blanco y tinto
Compuesto
Vino tinto Vino blanco
R
10 ngmL CV ()
R
10 ngmL CV ()
AME 90 5 101 13
BEN 96 5 102 7
BOS 97 6 100 8
CAR 97 3 94 5
CYP 103 3 105 12
DIM 104 7 106 8
FEH 90 16 83 15
FEP 91 5 90 4
FLU 103 7 102 6
IMI 99 14 101 14
IPR 91 5 100 13
MAN 108 5 108 13
MET 101 5 101 5
MYC 105 16 102 14
PEN 96 11 92 10
PYC 99 12 97 12
PYM 102 4 116 8
TEC 99 9 97 16
TEF 99 8 105 11
TBZ 68 4 84 5
TME 47 13 64 10
THI-M 107 11 104 16
TRI 95 14 103 4
En la Tabla IV8 se muestran los liacutemites de cuantificacioacuten (LOQs) del meacutetodo del meacutetodo de SPE-UPLC-ESI-
MSMS obtenidos para los diferentes pesticidas Los valores obtenidos son ideacutenticos a los LOQs instrumentales
excepto en el caso de aquellos compuestos para los que se observaronfuertes efectos de matriz (Tabla IV5) En
estos casos (CAR TBZ IMI y TME) los LOQs del meacutetodo se incrementan seguacuten la atenuacioacuten de sentildeal
observada
41
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Tabla IV8 Liacutemites de cuantificacioacuten LOQs (ngmL) del meacutetodo obtendos para cada compuesto
Compuesto LOQ (ngmL) Compuesto LOQ (ngmL)
AME 04 MET 01
BEN 01 MYC 04
BOS 02 PEN 02
CAR 03 PYC 02
CYP 02 PYM 01
DIM 07 TEC 05
FEH 05 TEF 01
FEP 01 TBZ 04
FLU 02 TME 02
IMI 06 THI-M 10
IPR 01 TRI 07
MAN 01
5 APLICACIOacuteN A MUESTRAS DE VINO COMERCIALES
Una vez optimizadas las condiciones del meacutetodo y estudiadas las caracteriacutesticas del meacutetodo desarrollado se aplicoacute
a la determinacioacuten de los compuestos de intereacutes estudiados en muestras de vino blanco y vino tinto comerciales
producidos en diferentes paiacuteses En la Tabla IV9 se muestra el paiacutes de origen de cada muestra comercial
identificadas con un coacutedigo alfanumeacuterico y antildeo de produccioacuten
42
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Tabla IV9 Coacutedigo asignado para los diferentes vinos comerciales blancos y tintos analizados Indicando el paiacutes de origen y
antildeo de produccioacuten
Coacutedigo Denominacioacuten de origen Antildeo de produccioacuten
bull Vinos Blancos
W1 Alemania 2014
W2 Espantildea 2012
W3 Espantildea 2016
W4 Portugal Desconocido
W5 Francia 2015
W6 Francia 2015
W7 Espantildea 2016
bull Vinos Tintos
R1 Espantildea 2015
R2 Sudaacutefrica 2015
R3 Chile 2015
R4 Francia 2015
R5 China Desconocido
R6 Espantildea 2016
R7 Australia 2014
R8 Francia 2013
R9 Francia 2015
A continuacioacuten en la Tabla IV10 y la Tabla IV11 se recogen los resultados obtenidos en el anaacutelisis de las
muestras comerciales Los datos obtenidos corresponden en todos los casos al uso de patrones de calibracioacuten
como teacutecnica de cuantificacioacuten
Tabla IV10 Concentracioacuten (ngmL) encontradas en las diferentes muestras de vino blanco comercial analizadas mediante
SPE-UPLC-MSMS n=2 reacuteplicas y al final el sumatorio de las concentraciones encontradas
Compuesto W1 W2 W3 W4 W5 W6 W7
AME 04 nd nd nd 41 nd nd
BEN nd nd 14 nd nd nd nd
BOS 84 102 520 54 197 nd nd
CAR nd 115 56 nd nd nd nd
CYP 08 59 112 nd nd 26 nd
43
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Compuesto W1 W2 W3 W4 W5 W6 W7
DIM 14 84 400 09 32 50 nd
FEH 85 809 639 15 187 nd nd
FLU 11 05 92 nd 77 32 nd
IMI nd 136 88 29 nd nd 69
IPR 30 749 1144 14 nd nd nd
MAN nd nd nd nd nd 30 nd
MET 04 273 494 63 nd nd 172
MYC 09 nd 35 nd nd nd nd
PYM 15 469 584 08 24 35 nd
TEC 11 nd 58 nd nd nd nd
TRI nd 67 61 nd nd nd nd
sumconcentracioacuten
(ngmL) 274 2868 4358 192 558 173 862
nd no detectado
Tabla IV11 Concentracioacuten (ngmL) encontradas en las diferentes muestras de vino tinto comercial analizadas mediante
SPE-UPLC-MSMS n= 2 reacuteplicas y al final el sumatorio de las concentraciones encontradas
Compuesto R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9
AME nd nd nd 30 nd nd nd nd 16
BEN nd nd nd 07 nd nd nd nd nd
BOS nd 55 21 196 nd nd nd 73 21
CAR nd nd 04 17 249 20 nd nd nd
CYP 34 08 02 22 nd 136 nd 85 nd
DIM nd 33 nd 52 233 46 nd 61 23
FEH nd nd nd 1070 nd 10 nd 1307 14
FLU nd nd nd 20 nd nd nd nd nd
IPR 16 nd nd 17 nd 22 nd nd nd
MAN nd nd nd 17 nd nd nd 20 nd
MET 126 nd nd 14 55 313 30 44 39
MYC nd nd nd 05 nd 32 nd nd nd
PYM 19 nd 03 185 49 281 nd 24 nd
TEC 25 06 39 29 nd nd nd 21 20
TEF nd 01 12 nd nd nd nd nd nd
sumconcentracioacuten
(ngmL) 220 48 81 1681 586 860 30 1635 133
nd no detectado 44
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
En los resultados de los anaacutelisis podemos observar que en ninguna de las muestras comerciales de vino blanco
aparecieron los siguientes compuestos FEP PEN PYC TEF TBZ THI-M y TME y en los vinos tintos
comerciales no aparece a ninguna concentracioacuten FEP IMI PEN PYC TBZ TME THI-M y TRI No se
detectaron para dichas muestras de vino a niveles superiores a los LOQs del meacutetodo propuesto
Cuando se detecta un compuesto positivo se compara el pico cromatograacutefico del compuesto con el de un patroacuten
verificando la coincidencia del tiempo de retencioacuten (maacutexima diferencia 01 min) y la relacioacuten entre transiciones
(maacutexima diferencia 30 ) En la Figura IV6 y la Figura IV7 se muestran los cromatogramas para el compuesto
CYP obtenido en condiciones oacuteptimas para la muestra de vino blanco W6 y en un patroacuten de 5 ngmL
respectivamente En este caso el intervalo de tolerancia para la relacioacuten de intensidad entre transiciones es
IP2IP1=061plusmn018
Figura IV6 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el CYP en la muestra W6 (26 ngmL) Transicioacuten
superior 226gt93 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 226gt108 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades IP2IP1= 066
Figura IV7 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el CYP en un patroacuten de 5 ngmL Transicioacuten
superior 226gt93 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 226gt108 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades IP2IP1=061plusmn018
45
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Otro ejemplo de compuesto positivo en abundantes muestras comerciales de estudio es el Metalaxyl positivo con
una concentracioacuten de 04 ngmL en el vino con referencia W1 (Figura IV8) y positivo con una concentracioacuten de
313 ngmL en el vino con referencia R6 (Figura IV9) Ambas se comparan con el cromatograma de un patroacuten
de Metalaxyl de 1 ngmL (Figura IV10) El grado de concordancia en los tiempos de retencioacuten y la relacioacuten de
intensidades entre transiciones es satisfactorio
Figura IV8 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el MET en la muestra W1 (04 ngmL) Transicioacuten
superior 2801gt2201 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 2801gt1921 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades
IP2IP1=056
Figura IV9 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el MET en la muestra R6 (313 ngmL) Transicioacuten
superior 2801gt2201 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 2801gt1921 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades IP2IP1=
056
46
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Figura IV10 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el MET en un patroacuten de 1 ngmL Transicioacuten
superior 2801gt2201 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 2801gt1921 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades
IP2IP1=057plusmn017
Es de destacar que aunque se detectaron bastantes pesticidas en las diferentes muestras de vino comerciales pero
en ninguacuten caso superaron el 10 de los LMRs permitidos en uvas tal y como se recomienda ya que todaviacutea no
existen LMRs para vino en la legislacioacuten vigente No obstante el nivel total de concentracioacuten (sumatorio de
concentraciones Tabla IV10 y Tabla VI11) es significativo para varias muestras tanto de vinos blancos (W2 y
W3) como tintos (R4 y R8)
47
Capiacutetulo V Conclusiones
CAPIacuteTULO V CONCLUSIONES
En este trabajo se ha estudiado un meacutetodo para la cuantificacioacuten de pesticidas concretamente veinte fungicidas y
tres insecticidas en vino blanco y tinto En la etapa de preparacioacuten de muestra se optimizoacute la extraccioacuten en fase
soacutelida (SPE) utilizando cartuchos OASIS HLB (200 mg) compuestos por divinilbenceno-N-vinilpirrolidona
(DVB-VP) como adsorbente Como teacutecnica de determinacioacuten se utilizoacute cromatografiacutea de liacutequidos con una
interfase de electroespray acoplada a espectrometriacutea de masas (UPLC-ESI-MSMS)
Las conclusiones generales obtenidas a partir de los resultados de este proyecto relativo a la determinacioacuten de
fitosanitarios en vino son
Ante los problemas de retencioacuten que presentan los cartuchos OASIS MAX (150 mg) para algunos
compuestos los cartuchos OASIS HLB (200 mg) junto con la combinacioacuten metanolacetonitrilo (2080)
como disolvente de elucioacuten son elegidos como mejor opcioacuten en la extraccioacuten en fase soacutelida de pesticidas
en muestras con matrices complejas como es el caso del vino Asiacute se consigue la retencioacuten selectiva de
componentes de la matriz y proporciona extractos con menor porcentaje de interferencias
El meacutetodo estudiado y optimizado se puede aplicar tanto a vinos blancos como a vinos tintos procesados
a partir de distintas variedades de uvas
Los liacutemites de cuantificacioacuten (LOQs) del estudio se situacutean la mayoriacutea por debajo de 10 ngmL excepto
en el caso de THI-M que asciende al valor de 20 ngmL El rango de respuesta lineal abarca hasta 200
ngmL y el tiempo de anaacutelisis ha sido de solo 10 minutos por muestra
En todas las muestras de vino (blancos y tintos) comerciales analizadas se han detectado la presencia de
varios pesticidas sin embargo todas las concentraciones encontradas se encuentran por debajo del 10
de los LMRs fijados en uvas tal y como recomienda la legislacioacuten por lo que no se considera
preocupante
48
Capiacutetulo V Conclusioacutens
CAPIacuteTULO V CONCLUSIOacuteNS
Neste traballo estudouse un meacutetodo para a cuantificacioacuten de pesticidas en particular vinte funxicidas e tres
insecticidas en vintildeo branco e maacuteis tinto No paso da preparacioacuten da mostra optimizouse a extraccioacuten en fase
soacutelida (SPE) empregando cartuchos OASIS HLB (200 mg) compostos por divinilbenceno-N-pirrolidona (DVB-
VP) como adsorbente Para a teacutecnica de determinacioacuten utilizouse cromatografiacutea de liacutequidos con unha interfase de
electroespray acoplada a espectrometriacutea de masas (UPLC-ESI-MSMS)
As conclusioacutens xerais a obtidas a partir dos resultados deste proxecto relativo aacute determinacioacuten de pesticidas en
vintildeo son
Ante os problemas de retencioacuten que mostraban os cartuchos OASIS MAX (150 mg) para alguacuten
compostos os cartuchos OASIS HLB (200 mg) en conxunto coa mistura metanolacetonitrilo (2080)
como disolvente de elucioacuten son elexidos como mellor opcioacuten na extraccioacuten en fase soacutelida de pesticidas
en mostras con matrices complexas como eacute o caso do vintildeo Asiacute eacute conseguida a retencioacuten selectiva de
componentes da matriz e proporciona extractos con menos porcentaxe de interferencias
O meacutetodo estudado e optimizado poacutedese aplicar tanto a vintildeos brancos coma tintos procesados a partir de
diferentes variedades de uvas
Os liacutemites de cuantificacioacuten do estudo (LOQs) son maacuteis baixos de 10 ngmL agaacutes no caso do THI-M
que ascende ao valor de 20 ngmL O rango de resposta lineal cobre ata 200 ngmL e o tempo de anaacutelise
foi de soacute 10 minuacutetos por mostra
En todas as mostras de vintildeo (brancos e tintos) comercial analizadas detectouse a presenza de varios
pesticidas maacuteis poreacuten todas as concentracioacutens atopadas son inferiores ao 10 dos LMR fixados en uvas
tal e como recomenda a lexislacioacuten polo que non se considera preocupante
49
Chapter V Conclusions
CHAPTER V CONCLUSIONS
In this work we have studied a method for the quantification of pesticides specifically twenty fungicides and
three insecticides in white and red wine In the sample preparation step the solid phase extraction was optimized
using cartridges OASIS HLB (200 mg) containing divinylbenzene-N-vinylpyrrolidone (DVB-VP) as adsorbent
As determination technique ultraperformance liquid chromatography was used with an electrospray interface
coupled to mass spectrometry (UPLC-ESI-MS7MS)
The general conclusions drawn from the results of this project concerning the determination of pesticides in wine
are
Due to the retention problems presented by the OASIS MAX sorbent (150 mg) for some compounds of
this project the cartridges OASIS HLB (200 mg) together with the methanolacetonitrile (2080) mixture
are chosen as the best option in the solid phase extraction of pesticides in samples with complex
matrices as is the case with the wine
The method studied and optimized can be applied to both white and red wines obtained from different
varieties of grapes
The limits of quantification (LOQs) were below 10 ngmL for most of the compounds except in the
case of THI-M with a LOQ of to 10 ngmL The linear response range covers up to 200 ngmL and the
analysis time was only 10 minutes per sample
In all commercial wine samples (white and red) analyzed the presence of several pesticides was
conformed however all the concentrations obtained are below 10 of the Maximum residue
levels(MRLs) fixed in grapes as recommended by legislation
50
VI Bibliografiacutea VI BIBLIOGRAFIacuteA [1] Ministerio de agricultura y pesca alimentacioacuten y medio ambiente mhttpwwwmapamagobesescalidad-y-evaluacion-ambientaltemasproductos-quimicosfitosanitarios (Acceso el diacutea 11052017) [2] httpwwwcricyteduarenciclopediaterminosProducFitohtm (Acceso el diacutea 11052017) [3] WERNER BALTES ldquoQuiacutemica de los alimentosrdquo Editorial Acribia SA 2007 Capiacutetulo 11 ldquoResiduos en los alimentosrdquo paacuteginas 206-217
[4] RLabrada JCCaseley CParker ldquoESTUDIO FAO PRODUCCIOacuteN Y PROTECCIOacuteN VEGETAL 120rdquo Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentacioacuten Roma 1996 ISSN 1014- Capiacutetulo 10 Herbicidas httpwwwfaoorgdocrepT1147St1147s00htmContents (Acceso el diacutea 12052017)
[5] Taberner Palou Andreu Cirujeda Ranzenberger Alicia Zaragoza Larios Carlos ldquoManejo de poblaciones de malezas resistentes a herbicidasrdquo (FAO Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura) 100 preguntas sobre resistencia PDF sacado de httpwwwfaoorg3a-a1422spdf (Acceso el diacutea 12052017) [6] BISSET Juan A Uso correcto de insecticidas control de la resistencia Revista Cubana de Medicina Tropical 2002 vol 54 no 3 p 202-219 [7] DEVINE Gregor J EZA Dominique Ogusuku Elena FURLONGMichael J Uso de insecticidas contexto y consecuencias ecoloacutegicas Revista peruana de medicina experimental y Salud Puacuteblica 2008 vol 25 no 1 p 74-100 [8] Ministerio de agricultura y ganaderiacutea (proteccioacuten agropecuaria servicio de diagnoacutestico fitosanitario) de costa Rica httpwwwmaggocrbibliotecavirtualH20-5054pdf (Acceso el diacutea 11052017) [9] GEPP V MONDINO P Control quiacutemico 2011 PDF obtenido de httpwwwpvfagroeduuyfitopatodocscursosfitopatoMaterialesGuiasC-QUIMICOpdf (Acceso el diacutea 772017) [10] ROSSLENBROICH Hans-Juergen STUEBLER Dietrich Botrytis cinereamdashhistory of chemical control and novel fungicides for its management Crop Protection 2000 vol 19 no 8 p 557-561 [11] Figura 11 httpwwwvitiviniculturanetbotritis-o-podredumbre-gris-botrytis-cinerea-pershtml (Acceso el diacutea 12052017) [12] CAMPBELL Paul BENDEK Carlos LATORRE Bernardo A Riesgo de oiacutedio (Erysiphe necator) de la vid en relacioacuten con el desarrollo de los racimos Ciencia e investigacioacuten agraria 2007 vol 34 no 1 p 5-11 [13] ldquoCoacutemo combatir el oiacutedio de la vidrdquo Jose Javier Peacuterez de Obanos Castillo PDF sacado de httpswwwnavarraesNRrdonlyres05E65D9B-D1A2-4EAD-9A63-AFF1D3215552135109Comocombatireloidiodelavidpdf (Acceso el diacutea 12052017) [14] Imagen 12 sacadas las 3 de httpwwwvitiviniculturanetoidio-de-la-vidhtml (Acceso el diacutea 12052017) [15] BARRIOS Gonccedilal REYES Joan Modelizacioacuten del Mildiu de la Vid 2004 httpwwwruralcatnetmigracio_resources617683_mildiusPDF (Acceso el diacutea 12052017) [16] Imaacutegenes sacadas de httpwwwvitiviniculturanetmildiu-de-la-vid-enfermedades-vinahtml (Acceso el diacutea 13052017) [17] HUQ Mainul MEISNER Craig DASGUPTA Susmita Health effects and pesticide perception as determinants of pesticide use evidence from Bangladesh httpagrisfaoorgagris-searchsearchdorecordID=US2012411738 (Acceso el diacutea 13052017)
51
IV Bibliografiacutea [18] BADII Mohammad H LANDEROS Jeroacutenimo Plaguicidas que afectan a la salud humana y la sustentabilidad CULCyT 2015 no 19 Revista vista en httpopenjournaluacjmxojsindexphpculcytarticleview454 (Acceso el diacutea 772017) [19] OLEA Nicolaacutes FERNAacuteNDEZ Mariana F Plaguicidas persistentes En Congreso Implementacioacuten del Convenio de Contaminantes Orgaacutenicos Persistentes Madrid 2001 p 26-27 [20] httpwwwfaoorgfao-who-codexalimentariusabout-codexes (Acceso el diacutea 14052017) [21] httpeceuropaeufoodplantpesticidesmax_residue_levels_en (Acceso el diacutea 14052017 [22] ORDONtildeEZ Juan A Cambero Rodriacuteguez MI Fernaacutendez Aacutelvarez L Garciacutea Sanz ML Garciacutea de Fernando Minguilloacuten GD de la Hoz Perales L Selgas Cortecero MD Tecnologiacutea de los alimentos Volumen 1 Componentes de los Alimentos y Procesos Siacutentesis Madrid 1998paacutegs 349-351 [23] CELA Rafael Casais Maria del Carmen Lorenzo Rosa Antonia Teacutecnicas de separacioacuten en quiacutemica analiacutetica Siacutentesis 2002 Capiacutetulo 11 Extraccioacuten y lixiviacioacuten por disolvente (paacutegs206-260) [24] CANTWELL Frederick F LOSIER Manon Liquidmdashliquid extraction Comprehensive Analytical Chemistry 2002 vol 37 p 297-340 [25] Imagen de LLE sacada de httpprocesosbiowikispacescomExtracciC3B3n+liquido-liquido (Acceso el diacutea 15052017) [26] HENNION Marie-Claire Solid-phase extraction method development sorbents and coupling with liquid chromatography Journal of Chromatography A 1999 vol 856 no 1 p 3-54 [27] CELA Rafael Casais Maria del Carmen Lorenzo Rosa Antonia Teacutecnicas de separacioacuten en quiacutemica analiacutetica Siacutentesis 2002 Capiacutetulo 16 Teacutecnicas de adsorcioacuten y absorcioacuten en la preparacioacuten de muestras Extraccioacuten y microextraccioacuten en fase soacutelida (paacutegs520-555) [28] Imagen spe sacada httptoxicocbblogspotcomes201310las-intoxicaciones-con-farmacoshtml (Acceso el diacutea 15052017) [29] Chaacutefer Pericaacutes Consuelo Acoplamiento microextraccioacuten en fase soacutelida-cromatografiacutea (2006) httprodericuveshandle1055014940 (Acceso el diacutea 16052017) [30] Imagen SPME httpwwwscieloorgcoscielophpscript=sci_arttextamppid=S0122-53832002000100005 (Acceso el diacutea 16052017) [31] MONTES GOYANES Rosa Mariacutea Avances en teacutecnicas de microextraccioacuten para la determinacioacuten de compuestos traza en muestras medioambientales y alimentarias Teacutesis doctoral Noviembre 2009 (Paacutegs 34-55) [32] LEHOTAY Steven J Ae Son Kyung KwonHyeyoung Koesukwiwat Urairat Fu Wusheng Mastovska Katerina Hoh Eunha Leepipatpiboon Natchanun Comparison of QuEChERS sample preparation methods for the analysis of pesticide residues in fruits and vegetables Journal of Chromatography A 2010 vol 1217 no 16 p 2548-2560 [33] Imagen QueChERS httpswwwresearchgatenetpublication279221361_QuEChERS_A_Sample_Preparation_for_Extraction_of_Carbaryl_from_Rat_Feces (Acceso el diacutea 16052017) [34] STASHENKO Elena E MARTIacuteNEZ Jairo Reneacute Preparacioacuten de la muestra un paso crucial para el anaacutelisis por GC-MS Uma publicaccedilatildeo trimestral do Instituto Internacional de Cromatografia (IIC) Ciecircncia Cromatograacutefica 2011 vol 3 no 1 [35] Imagen GC-MS httpsorgspectroscopyintblogspotcomes201411gas-chromatography-mass-spectrometry-gchtml (Acceso el diacutea 17052017) [36] httpwwwactlabscompageaspxmenu=65ampapp=221ampcat1=534amptp=2amplk=no (Acceso el diacutea 17052017)
52
IV Bibliografiacutea [37] Quintela O Cruz A Concheiro M De Castro A amp Loacutepez-Rivadulla M (2005) Metodologiacutea LC-MS Aspectos generales de la teacutecnica y sus aplicaciones en el campo de la toxicologiacutea Rev Toxicol 22 paacutegs7-14 [38] Imagen LC-MS httpsuploadwikimediaorgwikipediaenff9Liquid_chromatography_tandem_Mass_spectrometry_diagrampng (visto 18052017) [39] Vargas de la Cruz Celia Bertha Adaptacioacuten de la Metodologiacutea Analiacutetica para la determinacioacuten de residuos de plaguicidas en frutas nativas de exportacioacuten mediante Uplc-MsMs (2012) Tesis obtenida en http20062146130handlecybertesis2331 (Acceso el diacutea 772017) [40] ROMERO GONZAacuteLEZ Roberto Fernaacutendez Moreno Joseacute Luis Plaza Bolantildeos Patricia Garrido Frenich Antonia Martiacutenez Vidal Joseacute Luis Empleo de la espectrometriacutea de masas como herramienta para la determinacioacuten de toacutexicos en alimentos hacia la seguridad alimentaria Revista Espantildeola de salud puacuteblica 2007 vol 81 no 5 p 461-474 [41] PAYAacute Andrus Fundamento y Funciones de la Espectrometriacutea de Masas Universidad de Valencia Espantildea 2006 httpmuraluvescaloan (Acceso el diacutea 19052017) [42] Imagen MS sacada de httpsesslidesharenetMaYaTorrezespectrometria-demasas (Acceso el diacutea 21052017) [43] ECONOMOU Anastasios Botitsi Helen Antoniou Spyros Tsipi Despina Determination of multi-class pesticides in wines by solid-phase extraction and liquid chromatography-tandem mass spectrometry Journal of Chromatography A 2009 vol 1216 no 31 p 5856-5867 [44] FONTANA A R Rodriacuteguez I Ramil M Altamirano JC Cela R Liquid chromatography time-of-flight mass spectrometry following sorptive microextraction for the determination of fungicide residues in wine Analytical and bioanalytical chemistry 2011 vol 401 no 2 p 767-775 [45] PELAJIĆ Maja G Peček DM Pavlović DV Čepo Novel multiresidue method for determination of pesticides in red wine using gas chromatographyndashmass spectrometry and solid phase extraction Food chemistry 2016 vol 200 p 98-106 [46] Ignaz J Buerge Juumlrgen Krauss Rociacuteo Loacutepez-Cabeza Werner Siegfried Michael Stuumlssi Felix E Wettstein Thomas Poiger Stereoselective Metabolism of the Sterol Biosynthesis Inhibitor Fungicides Fenpropidin Fenpropimorph and Spiroxamine in Grapes Sugar Beets and Wheat Journal of Agricultural and Food Chemistry 2016 vol 64 no 26 p 5301-5309 [47] M Hu X Liu F Dong J Xu S Li H Xu Y Zheng Determination of ametoctradin residue in fruits and vegetables by modified quick easy cheap effective rugged and safe method using ultra-performance liquid chromatographytandem mass spectrometry Food chemistry 2015 vol 175 p 395-400 [48] WALORCZYK Stanisław DROŻDŻYŃSKI Dariusz GNUSOWSKI Bogusław Multiresidue determination of 160 pesticides in wines employing mixed-mode dispersive-solid phase extraction and gas chromatographyndashtandem mass spectrometry Talanta 2011 vol 85 no 4 p 1856-1870 [49] Tianyang Guo Pingping Fang Juanjuan Jiang Feng Zhan Wei Yong Jiahui Liu YiYang Dong Rapid screening and quantification of residual pesticides and illegal adulterants in red wine by direct analysis in real time mass spectrometry Journal of Chromatography A 2016 vol 1471 p 27-3 [50] GONZAacuteLEZ-RODRIacuteGUEZ R M CANCHO-GRANDE B SIMAL-GAacuteNDARA J Decay of fungicide residues during vinification of white grapes harvested after the application of some new active substances against downy mildew Food chemistry 2011 vol 125 no 2 p 549-560 [51] CARPINTEIRO I Ramil M Rodriacuteguez I Cela R Determination of fungicides in wine by mixed-mode solid phase extraction and liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry Journal of Chromatography A 2010 vol 1217 no 48 p 7484-7492
53
ResumenResumoAbstract
bull ABSTRACT
Pesticides are compounds that are used in vineyards around the world to ensure protection at harvest with a few
loss produced by different organisms in grapes used to make wine The mode of action of these compounds is
based on the interference on the metabolism of different organisms without affecting the vine An increase in the
use of these compounds can determine the existence of residues in grapes at the time of harvest from where
they can reach the wine that is elaborated with the same ones For this reason legislation has been established to
regulate the maximum amount of pesticide residues in grapes and although there are currently no regulated
values in wine it is recommended that they do not exceed 10 of the limits on grapes In this study we have
worked with different types of pesticides mainly fungicides but also some insecticide with the purpose of being
able to detect the greatest amount of these substances in commercial wines extraction has been optimized by
solid phase extraction (SPE) and detection has been optimized by liquid chromatography coupled to tandem mass
spectrometry (LC-ESI-MSMS) It is presented a simple fast and robust analytical methodology that can be
implemented in food control laboratories
2
Capitulo I Introduccioacuten
CAPIacuteTULO I INTRODUCCIOacuteN
1 FITOSANITARIOS
11 Tipos de fitosanitarios empleados en viticultura
De acuerdo con el Ministerio de Agricultura y Pesca Alimentacioacuten y Medio Ambiente los fitosanitarios se definen
como una o varias sustancias activas u otros ingredientes conformando una mezcla con el fin de proteger los
productos de origen vegetal de organismos nocivos tanto de tipo vegetal como animal que conforman plagas
Dentro de estos fitosanitarios tambieacuten se encuentran las sustancias que destruyen regulan o inhiben la
germinacioacuten de las plantas pero no se contemplan dentro de este grupo vacunas medicamentos y antibioacuteticos
para uso humano o veterinario o agentes utilizados en el control bioloacutegico Los productos fitosanitarios ayudan a
asegurar una buena calidad en los alimentos asiacute como contribuyen al aumento de los rendimientos en la
agricultura [1]
Seguacuten la OMS (Organizacioacuten Mundial de la Salud) los fitosanitarios se pueden clasificar atendiendo a los
organismos a los que esteacuten destinados siendo estos insectos (insecticidas) aacutecaros (acaricidas) moluscos
(molusquicidas) roedores (rodenticidas o raticidas) hongos (fungicidas) gusanos y larvas (nematicidas) malas
hierbas (herbicidas) bacterias (antibioacuteticos pero sin comprender los de uso humano y bactericidas) y otras formas
de vida perjudiciales para la salud puacuteblica y tambieacuten para la agricultura consideradas como plagas animales o
vegetales que puedan ser generadas durante la produccioacuten almacenamiento transporte distribucioacuten y elaboracioacuten
de productos agriacutecolas y sus derivados Actualmente no se puede pensar en un cultivo racional sin el uso de alguacuten
tipo de pesticida ya que la peacuterdida de cosechas en todo el mundo debido a causa de insectos enfermedades de las
plantas y malas hierbas es equivalente a un tercio de la produccioacuten total [2] [3]
Para el estudio de los productos de fitosanitarios en vino nos centraremos solamente en los tres tipos maacutes
importantes en eacuteste aacuterea herbicidas insecticidas y sobre todo fungicidas
Los herbicidas son sustancias destinadas a destruir las malas hierbas cuyo meacutetodo de accioacuten es la interferencia
en los procesos bioquiacutemicos como la fotosiacutentesis que tienen lugar en el sistema vivo de eacutestas Generalmente se
aplican en solucioacuten o suspensioacuten acuosa en forma de nube de pequentildeas gotas dirigidas hacia el objetivo de la
aplicacioacuten Los herbicidas ofrecen los medios maacutes efectivos para el control de las plagas siendo en los paiacuteses
industrializados aplicados sobre el 85-100 de todos los cultivos principales Este tipo de sustancias son
propensas a la descomposicioacuten por microbios plantas y animales y no son comunes los problemas de residuos de
herbicidas si se utilizan de acuerdo a las instrucciones de las etiquetas [4] A pesar de todos los beneficios que nos
aportan un mal uso de estos puede convertirse en un serio problema ya que toda sustancia quiacutemica usada en
3
Capiacutetulo I Introduccioacuten
agricultura puede provocar un efecto negativo en el ambiente si es utilizada en altas dosis El uso prolongado de
un mismo herbicida puede causar problemas de resistencia de malezas fenoacutemeno que consiste en la aparicioacuten de
biotipos tolerantes de una especie la cual anteriormente era controlada por el herbicida [5]
Por otro lado los insecticidas son fitosanitarios destinados a controlar el ataque de insectos y para eso existen
distintos caminos a traveacutes de los que pueden actuar siendo envenenamiento por contacto en doacutende el insecticida
penetra a traveacutes de la cutiacutecula del insecto hasta alcanzar el sitio activo envenenamiento oral en doacutende el
insecticida es ingerido y absorbido a traveacutes del intestino o tambieacuten por fumigaciones en doacutende el insecticida
penetra en el cuerpo del insecto a traveacutes de los espiraacuteculos del sistema respiratorio Pero al igual que pasa con los
herbicidas los insectos tambieacuten desarrollan resistencia a los insecticidas debido al contacto continuo con estos
Esta resistencia puede ser expresada por varios caminos que el insecto no entre en contacto con la deposicioacuten del
insecticida que se modifique la composicioacuten del exoesqueleto inhibiendo asiacute la penetracioacuten del insecticida la
modificacioacuten del sitio activo para el fitosanitario reduciendo la sensibilidad a la forma activa del insecticida o que
la viacutea metaboacutelica del insecto se modifique negando el metabolismo del compuesto aplicado en su forma toacutexica
[6] Aunque por lo general otros aspectos de la agricultura moderna tienen un mayor impacto en el medio
ambiente los insecticidas se encuentran entre las herramientas agriacutecolas que estaacuten maacutes asociadas con el dantildeo
ambiental Su objetivo especiacutefico es matar a plagas de insectos por lo que puede que tenga un impacto letal en
organismos que no son su objetivo [7]
Por uacuteltimo los fungicidas estaacuten destinados tanto a combatir las plagas de hongos como a combatir las
enfermedades fungosas de las plantas ya sea matando retrasando el desarrollo o inhibiendo la reproduccioacuten de
los hongos Los fungicidas en general se dividen atendiendo al modo de accioacuten de eacutestos en fungicidas de
contacto fungicidas penetrantes o fungicidas sistemaacuteticos
Los fungicidas de contacto protegen uacutenicamente el sitio de aplicacioacuten contra las plagas quedando en el exterior de
la planta de eacutesta manera sin penetrar en el tejido vegetal forman una peliacutecula protectora Cuando alguna espora
de un hongo llega a su superficie se encuentra con esa peliacutecula que le impide penetrar o en su defecto germinar
En el caso de que atraviesen el tejido vegetal bien sea por una alta dosis o por una rotura en las paredes de la
planta se convierten en un producto toacutexico para ella llegando a quemarla
Otro tipo de fungicidas los fungicidas penetrantes como su nombre indica se introducen en el tejido vegetal y
una vez dentro cuentan con muy poca movilidad es decir no circulan por los vasos conductores Al tener la
capacidad de entrar en la planta pueden combatir a los hongos que ya se encuentren dentro de eacutesta pero no
pueden ser toacutexicos para ella porque de lo contrario la dantildeariacutean
Por uacuteltimo nos encontramos con los fungicidas sistemaacuteticos Este tipo de fungicidas actuacutean protegiendo a la
planta contra las plagas en distintas zonas por transfusioacuten del fitosanitario dentro de la misma Esto sucede porque
penetran en el tejido vegetal y circulan por ella a traveacutes de la corriente de los vasos conductores
El meacutetodo de accioacuten de los fungicidas se basa en interferir en el metabolismo de los hongos ya sea por un
4
Capiacutetulo I Introduccioacuten
ataque en la produccioacuten de energiacutea la inhibicioacuten de la mitosis o inhibiendo la formacioacuten de quitina que se trata
del compuesto principal de la pared celular de los hongos y que por ende influye en la permeabilidad de la
membrana [8] [9]
Las enfermedades fuacutengicas fundamentales que nos podemos encontrar en las uvas de la vid son la botritis el oiacutedio
y el mildium las cuales pueden llegar a causar peacuterdidas importantes en viticultura
La enfermedad de la botritis tambieacuten llamada moho gris estaacute causada
por el hongo Botrytis cineacuterea y se puede encontrar en todo el mundo
infectando a un amplio nuacutemero de plantas Se trata de uno de los
patoacutegenos fuacutengicos maacutes interesantes debido a que puede vivir tanto
de forma patoloacutegica produciendo la enfermedad como
alimentaacutendose de materia orgaacutenica en descomposicioacuten La accioacuten
fuacutengica del hongo se lleva a cabo cuando las uvas empiezan a
acumular azuacutecar pudiendo ser muy devastador en algunas
condiciones sobre todo en cultivos empapados por la lluvia o
localizados en un ambiente huacutemedo y con viento produciendo la peacuterdida de los racimos de uvas que son
infectados O por el contrario en otro tipo de condiciones ambientales de sequedad despueacutes de unas
condiciones de humedad dicho hongo le confiere beneficios a ciertos tipos de vino blanco [10]
El oiacutedio es una enfermedad causada por la especie Uncinula necator la cual afecta tanto al rendimiento como a la
calidad de las uvas y altera las cualidades de sus derivados vino mosto etc El proceso de infeccioacuten del oiacutedio
tiene lugar siguiendo un ciclo de reproduccioacuten en las distintas estaciones del antildeo El riesgo de infeccioacuten viene
dado en funcioacuten de la temperatura oacuteptima entre 25-30ordmC humedad del ambiente en el que se encuentre y
tambieacuten en funcioacuten de la temporada siendo maacutes resistentes los racimos de uvas a medida que van madurando El
hongo afecta a todas las parte de la vid hojas tallo y racimos las cuales presentan siacutentomas distintos Las hojas se
vuelven de un color amarillento y se cubren de un polvo fino blanco grisaacuteceo En el tallo el oiacutedio se manifiesta a
traveacutes de manchas difuminadas con coloracioacuten inicial verde oscuro volvieacutendose cada vez maacutes oscuras al final y si
ocurre un ataque fuerte puede desembocar en que el tallo se acabe secando y por consiguiente disminuye la
produccioacuten Pero el ataque maacutes fuerte se produce en los racimos empezando por cubrirse del polvillo blanco
grisaacuteceo y continuando con que el oiacutedio detiene el crecimiento de la piel de la uva con la consecuencia que la uva
se agrieta Esta enfermedad produce unos dantildeos directos en la cantidad y calidad de la cosecha y si no se toman
medidas de prevencioacuten las peacuterdidas pueden llegar a ser totales [12] [13]
Figura I1Enfermedad de botritis en un racimo de uvas [11]
Figura I2 Enfermedad del oiacutedio en hoja tallo y racimo de izquierda a derecha [14] 5
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Por uacuteltimo el mildium o mildiu es una enfermedad producida por el hongo Plasmopara vitiacutecola considerada como
una de las peores enfermedades del cultivo siempre y cuando esteacuten en las condiciones ambientales favorables para
su desarrollo Dichas condiciones oacuteptimas para la propagacioacuten de la enfermedad son las lluvias al amanecer o al
anochecer con una temperatura en un rango de 20-25 ordmC El periacuteodo sensible de la vegetacioacuten de la vintildea es a
partir de una longitud de 10 cm en adelante siendo maacutexima en el periacuteodo de mayor crecimiento de la planta Por
otro lado la sensibilidad del racimo empieza desde su formacioacuten hasta que las uvas al florecer alcanzan el tamantildeo
similar al de un guisante pero de ahiacute en adelante la sensibilidad se ve disminuida Dicho hongo cuenta con un
ciclo reproductivo abarcando varias fases desde la fase de contaminacioacuten siendo el principio hasta la fase de pro-
pagacioacuten Afecta a todos los oacuterganos verdes de la vid y sus siacutentomas son variados en las distintas zonas de eacutesta
En las caras de las hojas aparecen unas manchas amarillentas en los racimos cuando se aproxima la floracioacuten los
que se encuentran infectados se curvan secaacutendose y cubrieacutendose de una pelusa blanquecina y cuando alcanzan el
tamantildeo de un guisante en adelante las uvas de los racimos afectados se van oscureciendo y secando sin que apa-
rezca la fructificacioacuten del hongo ademaacutes de oscurecerse el tallo [15]
12 Estructura propiedades fiacutesico-quiacutemicas y clasificacioacuten
En este trabajo nos centramos en estudiar los residuos de veintitreacutes fitosanitarios tipo fungicida principalmente
aunque tambieacuten alguacuten residuo tipo insecticida Las caracteriacutesticas maacutes importantes de dichos compuestos seraacuten
recogidas en la Tabla I1 que incluye estructuras clasificacioacuten (se ha usado el acroacutenimo ldquoFrdquo en caso de ser
fungicidas e ldquoIrdquo en caso de ser insecticidas) y propiedades fiacutesico-quiacutemicas Las propiedades fiacutesico-quiacutemicas que
pueden resultar maacutes relevantes para este estudio son el pKa ya que la mayoriacutea se trata de compuestos baacutesicos
aunque se encuentre alguacuten aacutecido deacutebil como es por ejemplo el Fenhexamid y Kow describiendo el coeficiente de
reparto entre octanolagua empleado para medir el grado de hidrofobidad que proporciona una estimacioacuten de
la posible distribucioacuten del analito entre materia orgaacutenica y agua
Figura I3 Enfermedad del mildium en la imagen de la izquierda coacutemo afecta a las hojas imagen central coacutemo
afecta a los racimos cuaacutendo estaacuten infectados al comenzar la floracioacuten y en la imagen de la derecha coacutemo afecta a
los racimos en doacutende las uvas tienen tamantildeo mayor al de un guisante [16]
6
Compuesto Estructura Nombre sistemaacutetico Foacutermula CAS Uso ordflog (kow) pKa
Ametoctradin
(AME)
5-ethyl-6-
octyl[124]triazolo[15-
a]pyrimidin-7-amine
C15H25N5 865318-97-4 F 440 278
Benalaxyl
(BEN)
Methyl-N-(phenylacetyl)-N-
(26-xylyl)-D-alaninate C20H23NO3 98243-83-5 F 368 -
Boscalid
(BOS)
2-Chloro-N-(4rsquo-
chlorobiphenyl-2-yl)-
nicotinamide
C18H12Cl2N2O 188425-85-6 F 296 -
Carbendazim
(CAR)
Methyl 2-benzimidazole
carbamate C9H9N3O2 10605-21-7 F 148 420
Cyprodinil
(CYP)
4-Cyclopropyl-6-methyl-N-
phenilpyrimidin-2-amine C14H15N3 121552-61-2 F 400 309
Dimethomorph
(DIM)
(2E)-3-(4-chlorophenyl)-3-(34-
dimethoxyphenyl)-1-
(morpholin-4-yl)prop-2-en-1-
one
C21H22ClNO4 110488-70-5 F 268 -13
Fenhexamid
(FEH)
N-(23-dichloro-4-
hydroxyphenyl)-1-methyl-
cyclohexanecarboxamide
C14H17Cl2NO2 126833-17-8 F 351 73
Fenpropidin
(FEP)
1-[(RS)-3-(4-tert-butylphenyl)-
2-methylpropyl]piperidine C19H31N 67306-00-7 F 26 1013
Fluopicolid
(FLU)
26-dichloro-N-[3-chloro-5-
(trifluoromethyl)-2-
pyridylmethyl]benzamide
C14H8Cl3F3N2O 239110-15-7 F 29 -
Imidacloprid
(IMI)
(E)-1-(6-chloro-3-
pyridylmethyl)-N-
nitroimidazolidin-2-
ylideneamine
C9H10ClN5O2 138261-41-3 I 057 -
Iprovalicarb
(IPR)
Isopropyl (S)-2-methyl-1-[1-(p-
tolyl)ethylcarbamoyl]propyl-
carbamate
C18H28N2O3 140923-17-7 F 32 -
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Tabla I1 Estructura clasificacioacuten y propiedades fiacutesico-quiacutemicas de intereacutes para los analitos de estudio
7
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Compuesto Estructura Nombre sistemaacutetico Foacutermula CAS Uso ordflog (kow) pKa
Mandipropamid
(MAN)
2-(4-chlorophenyl)-N-[3-
methoxy-4-(2-
propynyloxy)phenethyl]-2-(2-
propynyloxy)acetamide
C23H22ClNO4 374726-62-2 F 32 -
Metalaxyl
(MET)
N-(26-dimethylphenyl)-N-
(methoxyacetyl)-DL-alanine
methyl ester
C15H21NO4 57837-19-1 F 175 000
Myclobutanil
(MYC)
2-(4-chlorophenyl)-2-(1H-
124-triazol-1-
ylmethyl)hexanentrile
C15H17ClN4 88671-89-0 F 289 230
Penconazol
(PEN)
1-[2-(24-
dichlorophenyl)pentyl]-1H-
124-triazole
C13H15Cl2N3 66246-88-6 F 372 151
Pyraclostrobin
(PYC)
Methyl2-[1-(4-chlorophenyl)-
1H-pyrazol-3-
yloxymethyl]phenylmetoxy-
carbamate
C19H18ClN3O4 175013-18-0 F 399 -
Pyrimethanil
(PYM)
4-6-dimethyl-N-phenyl-2-
pyrimidinamine C12H13N3 53112-28-0 F 284 352
Tebuconazol
(TEC)
1-(4-chlorophenyl)-44-
dimethyl-3-(1H-124-triazol-1-
ylmethyl)-3-pentanol
C16H22ClN3O 107534-96-3 F 370 500
Tebufenozid
(TEF)
35-dimethylbenzoic acid 1-
(11-dimethylethyl)-2-(4-
ethylbenzoyl)hidrazide
C22H28N2O2 112410-23-8 I 425 -
Thiabendazol
(TBZ)
2-(13-thiazol-4-yl)-1H-
benzimidazole C10H7N3S 148-79-8 F 239 473
Thiamethoxam
(TME)
3-[(2-chloro-5-
thiazolyl)methyl]tetrahydro-5-
methyl-N-nitro-4H-135-
oxadiazin-4-imine
C8H10ClN5O3S 153719-23-4 I -013 -
Thiophanate-
methyl
(THI-M)
DimethylNNrsquo-[12-
phenylenebis(azanediylcarbono
thioyl)] dicarbamate
C12H14N4O4S2 23564-05-8 F 145 728
Triadimenol
(TRI)
1-(4-chlorophenoxy)-33-
dimethyl-1-(1H-124-triazol-1-
yl)-2-butanol
C14H18ClN3O2 55219-65-3 F 318
-
ordf Valores para la forma neutra 8
Capiacutetulo I Introduccioacuten
13 Toxicidad de los pesticidas
En los uacuteltimos antildeos el uso indiscriminado de pesticidas de siacutentesis en agricultura ha creado graves problemas de
salud y medioambientales ya que su uso debido al aumento de la poblacioacuten y por consiguiente de la actividad
agraria se ha incrementado considerablemente Durante las tres uacuteltimas deacutecadas una estimacioacuten dada por la
Organizacioacuten Mundial de la Salud y el Programa de las Naciones Unidas para el Medio Ambiente revela que
aproximadamente cerca de 20000 personas al antildeo mueren generalmente agricultores por exposicioacuten continuada
a alguno de estos toacutexicos En la mayoriacutea de los casos los agricultores utilizan los pesticidas de forma que las
cantidades se desviacutean significativamente de las recomendadas ya que asocian cantidades maacutes altas con mayor
efectividad y velocidad de accioacuten El mal uso de dichos toacutexicos se ve en los signos presentes en los ecosistemas
afectados pudiendo llegar a ser perjudiciales para la salud humana Estos riesgos que causan tanto en la salud
como en el medioambiente pueden ser reducidos o en su defecto evitados mediante la educacioacuten sobre este tipo
de toacutexicos con el fin de frenar su uso excesivo y descontrolado [17]
Desde el punto de vista medioambiental los fitosanitarios empleados en un cultivo pueden persistir en los
distintos medios tierra aire o agua y afectar tanto a ecosistemas terrestres como acuaacuteticos En los sistemas
terrestres los suelos son contaminados mediante la aplicacioacuten del toacutexico de forma directa o como deposicioacuten del
resultado de una suspensioacuten aeacuterea Eacutestos pueden persistir desde varios diacuteas hasta varios antildeos ya que el suelo
retiene y moviliza el toacutexico despueacutes de su emisioacuten Los que persisten maacutes tiempo en el medioambiente tienen una
mayor probabilidad de interaccionar con otros elementos del sistema y si su vida media es mayor a la frecuencia
con la que se aplica el pesticida tienden a acumularse tanto en el suelo como en las especies que habitan en eacutel Por
otro lado el agua es contaminada por pesticidas bien por aplicacioacuten directa por estar presentes en las
precipitaciones de la atmoacutesfera o bien por la movilidad que tienen desde el suelo Tanto los pesticidas solubles
como los insolubles interaccionan con los ecosistemas acuaacuteticos los hidrosolubles persisten maacutes tiempo
solubilizados en agua mientras que los otros se asocian a los sedimentos y se concentran en las especies que
habitan el medio acuaacutetico [18]
Como consecuencia de la amplia distribucioacuten de los toacutexicos en aire suelo y agua se produce una acumulacioacuten de
ellos en los elementos que contribuyen a la alimentacioacuten humana ya que su amplio uso hace que el contacto con
los plaguicidas por parte de personas y animales sea inevitable La contaminacioacuten de los alimentos se puede
presentar por aplicacioacuten directa de los pesticidas el uso de eacutestos durante el manejo transporte y almacenamiento
de los productos comestibles o por su acumulacioacuten en la cadena troacutefica Son bioacumulables en el organismo
debido a su caraacutecter lipofiacutelico lo que les confiere una vida media en los tejidos larga La exposicioacuten a pesticidas
persistentes no tiene la misma repercusioacuten en cada uno de los individuos expuestos sino que se considera criacutetica la
exposicioacuten durante la etapas embrionaria fetal y primeros antildeos de vida en doacutende se transmite de madres a hijos
mediante la gestacioacuten y la lactancia como resultado de la acumulacioacuten en el tejido graso de la madre [19]
9
Capiacutetulo I Introduccioacuten
14 Legislacioacuten
El aumento del uso de fitosanitarios en actividades relacionadas con la produccioacuten de alimentos para consumo
humano o animal tambieacuten desembocoacute en una preocupacioacuten social debido a su toxicidad y bioacumulacioacuten En
respuesta la Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura (FAO) en colaboracioacuten
con la Organizacioacuten Mundial de la Salud (OMS) pusieron en marcha un programa Codex Alimentarius cuyo
objetivo a traveacutes de sus normas y coacutedigos de praacutecticas alimentarias internacionales es garantizar la calidad e
inocuidad de los alimentos que estaacuten al alcance de cualquier persona Con estas normas internacionales los
consumidores pueden confiar en la calidad de los alimentos independientemente de su origen geograacutefico [20]
Todos los alimentos destinados al consumo humano o animal en la Unioacuten Europea estaacuten sujetos a un liacutemite
maacuteximo de residuos de plaguicidas para la proteccioacuten de la salud humana y animal Actualmente en lo referente a
legislacioacuten para el control de la cantidad del toacutexico en la uva estaacute vigente el Reglamento 3962005 del Parlamento
Europeo y del Consejo de 23 de febrero de 2005 referido a la regulacioacuten de los liacutemites maacuteximos de residuos de
plaguicidas en alimentos y piensos de origen vegetal y animal El liacutemite maacuteximo de residuos (LMR) se define co-
mo el nivel maacutes alto de un residuo de un pesticida que se tolera de manera legal sobre los alimentos o piensos
cuando se aplican correctamente Las cantidades de residuos que se encuentren deben ser lo maacutes bajas posible
para garantizar la seguridad en la alimentacioacuten de los consumidores Dichos liacutemites maacuteximos de residuos estaacuten
fijados por la Comisioacuten Europea pudieacutendose encontrar en su base de datos LMR [21]
A continuacioacuten en la Tabla I2 se resumen los LMRs de los compuestos de este estudio en uvas de vinificacioacuten
en unidades de mgkg de uva En el caso del vino no hay legislacioacuten en lo referente a estos pesticidas solamente
la recomendacioacuten de no superar el 10 del valor del LMR en uva
Compuesto LMRs (mgkg uva) Compuesto LMRs (mgkg uva)
AME 6 MET 1
BEN 03 MYC 1
BOS 5 PEN 02
CAR 05 PYC 2
CYP 3 PYM 5
DIM 3 TEC 1
FEH 15 TEF 3
FEP 001 TBZ 005
FLU 2 TME 04
IMI 1 THI-M 3
IPR 2 TRI 2
MAN 2
Tabla I2 Liacutemites maacuteximos de residuos permitidos para los compuestos estudiados en uvas
10
Capiacutetulo I Introduccioacuten
2 MEacuteTODOS DE PREPARACIOacuteN DE MUESTRA APLICADOS A MUESTRAS DE VINO
21 Extraccioacuten liacutequido-liacutequido (LLE)
Se entiende por extraccioacuten liacutequido-liacutequido al meacutetodo mediante el cual un analito de intereacutes se separa por el
contacto con otra fase en la cual tiene mayor afinidad de la matriz en la que se halle Los procesos de extraccioacuten
implican dos fases y requieren tres pasos sucesivos mezcla de materia prima y disolvente separacioacuten de las dos
fases despueacutes del contacto y eliminacioacuten del disolvente que contiene el analito [22]
La extraccioacuten liacutequido-liacutequido (LLE) se basa en la distribucioacuten
de un analito entre dos fases liacutequidas inmiscibles en las
cuales analito y matriz tienen solubilidades diferentes
Principalmente una de las fases es un medio acuoso en
general se trata de la muestra y la otra un disolvente
orgaacutenico La selectividad y eficacia de este meacutetodo vienen
determinadas por la eleccioacuten del disolvente y por los factores
que pueden afectar al proceso de equilibrio (pH adiccioacuten de
sales neutras en la fase acuosa para reducir la solubilidad del
analito etc) [23] Esta teacutecnica permite llevar a cabo extracciones para un rango muy amplio de analitos siendo
una de las maacutes antiguas para la preparacioacuten de muestras en el anaacutelisis cualitativo y cuantitativo Ofrece grandes
capacidades de muestreo lineal y cuenta con la ventaja de la cantidad de informacioacuten existente sobre este meacutetodo
[24]
22 Extraccioacuten en fase soacutelida (SPE)
En 1978 aparecieron los primeros cartuchos desechables para la extraccioacuten en fase soacutelida y actualmente casi 40
antildeos despueacutes la extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) es la teacutecnica de preparacioacuten de muestras maacutes empleada en los
laboratorios Es una teacutecnica de preparacioacuten y tratamiento de muestras que se basa en la retencioacuten en una fase
adsorbente del analito de intereacutes presente en una muestra liacutequida que pasa a traveacutes de ella Debido a la variedad de
formatos (discos cartuchos y jeringas) y tipos de adsorbentes (los maacutes comunes carboacuten activo aluacutemina siacutelica gel
silicato de magnesio siacutelices enlazadas y poliacutemeros como por ejemplo estinero-divinilbenceno) o la facilidad de
automatizacioacuten y acoplamiento con otras teacutecnicas como por ejemplo una conexioacuten directa con un sistema de
Figura I4 Fundamentos teoacutericos de la LLE [25]
11
Capiacutetulo I Introduccioacuten
cromatografiacutea este meacutetodo le fue ganando terreno a la LLE Otra ventaja muy importante de la SPE frente a la
LLE es la disminucioacuten en la cantidad de disolvente orgaacutenico empleada Cada vez se va innovando maacutes sobre esta
teacutecnica llegando a encontrarse fases adsorbentes formadas por poliacutemeros capaces de retener en un uacutenico
cartucho un amplio abanico de analitos lipofiacutelicos o hidrofoacutebicos aacutecidos baacutesicos o neutros [26]
El fundamento de esta extraccioacuten como se puede en la Figura I6
consiste en cuatro etapas acondicionamiento adiccioacuten de muestra
retencioacuten y elucioacuten de los analitos de intereacutes En primer lugar antes
de empezar la extraccioacuten se requiere una etapa de acondicionamiento
para preparar el adsorbente haciendo pasar un poco de disolvente
para asiacute interaccionar mejor con la muestra Luego se hace pasar la
muestra liacutequida por la fase soacutelida Idealmente el adsorbente retiene
los analitos selectivamente a medida que va pasando la muestra y la
matriz pasa sin ser retenida Por uacuteltimo los analitos se eluyen del
adsorbente con un disolvente con el que tenga mayor afinidad [27]
23 Teacutecnicas de microextraccioacuten
231 Microextraccioacuten en fase soacutelida (SPME)
En la microextraccioacuten en fase soacutelida (SPME) se utilizan fibras de siacutelice fundida revestidas con un poliacutemero en un
disentildeo en forma de jeringa para la extraccioacuten de los analitos de intereacutes El principio por el que se rige esta
extraccioacuten es el reparto del analito entre la matriz de la muestra y el revestimiento de la fibra mediante un proceso
no competitivo Se trata de un meacutetodo que cuenta con muchas ventajas ya que se elimina completamente el uso de
disolventes y aparte no son necesarios voluacutemenes de muestra grandes pero tambieacuten cuenta con algunas
desventajas ya que tanto la capacidad como la sensibilidad se ven limitadas [29]
En la figura I7 podemos ver las etapas de la extraccioacuten En un
vial cerrado con una caacutepsula y un seacuteptum tenemos la muestra
liacutequida o bien soacutelida que contenga los analitos de intereacutes
volaacutetiles Con la jeringa se perfora el seacuteptum y una vez dentro
se acciona el eacutembolo para la exposicioacuten de la fibra con los
analitos introducieacutendola en la muestra liacutequida o en su defecto
en el espacio de cabeza para la extraccioacuten de analitos volaacutetiles
de una muestra soacutelida Despueacutes de la extraccioacuten dentro del vial
Figura I6 Etapas de una SPE [28]
Figura I7 Etapas de una SPME [30]
12
Capiacutetulo I Introduccioacuten
la fibra se introduce de nuevo en la jeringa y se retira del vial [27]
232 Microextraccioacuten en fase liacutequida (LPME)
La microextraccioacuten en fase liacutequida se desarrolloacute como una alternativa a la LLE para la reduccioacuten en la cantidad de
disolventes orgaacutenicos siendo rentable tanto para el medioambiente como econoacutemicamente Entre las modalidades
maacutes populares de esta teacutecnica se encuentran microextraccioacuten con gota suspendida (SDME) y microextraccioacuten
liacutequido-liacutequido dispersiva (DLLME) En la SDME una gota de disolvente orgaacutenico es expuesta al espacio de
cabeza situado sobre una muestra en un vial dicha gota es suspendida del extremo de una microjeringa Por otro
lado la DLLME sobre una muestra acuosa se inyecta un pequentildeo volumen de una mezcla de disolventes en la
cual es dispersada formando una solucioacuten en la que se establece el equilibrio El disolvente de extraccioacuten debe
presentar una densidad inferior a la de la muestra para facilitar su recuperacioacuten normalmente despueacutes de
centrifugar el vial doacutende se realiza la extraccioacuten [31]
24 QuEChERS
La extraccioacuten QuEChERS de las palabras en ingleacutes Quick Easy Cheap Effective Rugged and Safe es un meacutetodo
de extraccioacuten que se desarrolloacute entre 2000 y 2002 para el anaacutelisis de pesticidas Como su nombre indica raacutepido
faacutecil barato eficaz robusto y seguro son las principales
caracteriacutesticas de esta preparacioacuten de muestra Se realiza en dos
etapas en primer lugar una extraccioacuten simple y una segunda fase
de purificacioacuten En la primera etapa tenemos el vial con la
muestra en el cual se antildeade un disolvente generalmente
acetonitrilo para la extraccioacuten de los analitos de intereacutes en
presencia de diferentes sales (en el meacutetodo original se utiliza
sulfato de magnesio y cloruro de sodio) para facilitar la separacioacuten
de las fases En la segunda parte se realiza la purificacioacuten de la
fraccioacuten del extracto orgaacutenico Para eso se lleva a cabo una
limpieza de los analitos eliminando el agua y los compuestos
presentes en la matriz de la muestra empleando un adsorbente PSA (amina primaria y secundaria) C18 carboacuten
negro grafitizado (GCB) o una combinacioacuten de eacutestas [32]
Figura I8 Etapas de QuEChERS [33]
13
Capiacutetulo I Introduccioacuten
3 METODOLOGIacuteA ANALIacuteTICA PARA LA DETERMINACIOacuteN DE PESTICIDAS
31 Meacutetodos de GC-MS (MSMS)
La combinacioacuten de cromatografiacutea de gases (GC) teacutecnica de separacioacuten con espectrometriacutea de masas (MS) como
sistema de deteccioacuten representa un potente meacutetodo para la identificacioacuten determinacioacuten y cuantificacioacuten de
analitos orgaacutenicos en concentraciones traza presentes en muestras complejas Esta teacutecnica de anaacutelisis cuenta con
muchas ventajas en sensibilidad multifuncionalidad buena reproducibilidad robustez asiacute como facilidad en el
manejo pero con una gran desventaja este meacutetodo no es apto para ser utilizado con todos los analitos sino que
se ve limitado a aquellos que sean termoestables y no se descompongan a temperaturas elevadas antes de ser
volatilizados La muestra es introducida a traveacutes del inyector en el cromatoacutegrafo de gases doacutende impulsada por
una corriente de gas inerte como fase moacutevil pasa a traveacutes de la columna que contiene la fase estacionaria en la
cual se separan los compuestos debido a una distribucioacuten de estos entre fase moacutevil-fase estacionaria Mediante
una interfase son introducidos para su deteccioacuten en el espectroacutemetro de masas que cuenta con una fuente de
iones analizador de masas y un detector [34]
La combinacioacuten de analizadores de masas en taacutendem (MSMS) como sistema de deteccioacuten en GC es una teacutecnica
altamente selectiva mejorando la sensibilidad y la relacioacuten sentildeal-ruido en los espectros experimentando una
mejora por lo que se logran unos liacutemites de deteccioacuten inferiores Esta teacutecnica GC-MSMS comprende maacutes
pasos despueacutes de la separacioacuten por cromatografiacutea se lleva a cabo la deteccioacuten con MSMS que consta de varias
etapas generacioacuten de iones en la fuente de ionizacioacuten seleccioacuten de los iones precursores de una determinada
masa disociacioacuten causada por colisioacuten con moleacuteculas de gas inerte de los iones precursores y por uacuteltimo el
anaacutelisis de los fragmentos en relacioacuten a su masacarga (mz) En el caso de que un espectro de MS no permita
confirmar la identidad de un determinado compuesto quiacutemico la obtencioacuten de su espectro de MSMS permite
mejorar la confianza en su identificacioacuten [36]
Figura I9 Acoplamiento GC-MS [35]
14
Capiacutetulo I Introduccioacuten
32 Meacutetodos LC-MS (MSMS)
La teacutecnica de LC-MS se desarrolloacute para minimizar las desventajas del acoplamiento GC-MS y asiacute resolver los
problemas que este uacuteltimo acarreaba con los analitos termolaacutebiles permitiendo el anaacutelisis de eacutestos sin tener que
realizar una etapa previa de derivatizacioacuten La interfase de unioacuten de cromatografiacutea liacutequida (LC) con espectrometriacutea
de masas (MS) acarrea una dificultad significativa siendo responsable de transformar los analitos que se
encontraban en la fase moacutevil liacutequida en iones en fase gas sin que se produzca su degradacioacuten teacutermica La
sensibilidad de las determinaciones por LC-MS va a depender de la interfase empleada Las principales interfases
empleadas actualmente son las ionizaciones a presioacuten atmosfeacuterica electrospray (ES) e ionizacioacuten quiacutemica a
presioacuten atmosfeacuterica (APCI) [37]
Con los antildeos la cromatografiacutea liacutequida se ha ido innovando y mediante la disminucioacuten del tamantildeo de partiacutecula en
la columna se fue mejorando la eficiencia asiacute como aumentando la selectividad y resolucioacuten del pico en el
cromatograma Para este nuevo sistema llamado UPLC Ultra-Performance Liquid Chromatography se desarrolloacute
una nueva instrumentacioacuten capaz de trabajar a altas presiones generando flujos mayores sin peacuterdidas de
resolucioacuten utilizando inyectores automaacuteticos maacutes raacutepidos y detectores con mayor velocidad de adquisicioacuten de
datos disminuyendo asiacute el tiempo de anaacutelisis [39]
33 Espectrometriacutea de masas
La espectrometriacutea de masas es el meacutetodo de deteccioacuten y cuantificacioacuten maacutes fiable a la hora de la determinacioacuten de
compuestos en matrices complejas (tales como alimentos) ya que otros detectores maacutes tradicionales como UV-
visible o fluorescencia cuentan con una gran incertidumbre en los resultados llegando incluso a ofrecer falsos
Figura I10 Acoplamiento LC-MS [38]
15
Capiacutetulo I Introduccioacuten
positivos o negativos Un espectrometro de masas cuenta con un dispositivo de introduccioacuten de muestra una
caacutemara de ionizacioacuten un sistema para la aceleracioacuten de los iones uno o varios analizadores de masas y un detector
[40]
El fundamento de la espectrometriacutea de masas se basa en la separacioacuten de iones en base a la relacioacuten masacarga
(mz) El proceso consta fundamentalmente de cuatro etapas La
primera es la ionizacioacuten de la muestra los iones formados se aceleran
debido a la accioacuten de un campo eleacutectrico variable separacioacuten de los
iones seguacuten su masacarga deteccioacuten de los iones y produccioacuten de la
sentildeal eleacutectrica El analizador de masas es el encargado de la separacioacuten
de los iones en funcioacuten a su mz entre los que maacutes destacan
analizador de masas cuadrupolar que dispersa simultaacuteneamente todos
los iones en funcioacuten de la relacioacuten mz analizador de masas de
tiempo de vuelo (TOF) consta de un tubo a alto vaciacuteo sobre el que no
actuacutea ninguacuten campo eleacutectrico al cual llegan todos los iones acelerados con la misma energiacutea cineacutetica y en el tubo
las velocidades variacutean seguacuten mz y analizador de trampa de iones en doacutende los iones gaseosos quedan aislados
durante largos periacuteodos de tiempo por la accioacuten del campo eleacutectrico [41]
4RESUMEN BIBLIOGRAacuteFICO DE LAS TEacuteCNICAS DE EXTRACCIOacuteN Y
DETERMINACIOacuteN DE PESTICIDAS EN VINO
En la bibliografiacutea se han descrito diversas teacutecnicas y diferentes combinaciones entre teacutecnicas de extraccioacuten y
distintas teacutecnicas de cuantificacioacuten e identificacioacuten para esos analitos Entre estas teacutecnicas los valores de los liacutemites
de cuantificacioacuten (LOQs) y las recuperaciones relativas pueden diferir en el resultado en un rango de valores asiacute
como el tiempo total empleado para el anaacutelisis y para la preparacioacuten de la muestra
Por lo general el meacutetodo de extraccioacuten de los analitos de intereacutes maacutes empleado es la extraccioacuten en fase soacutelida
(SPE) la cuaacutel le ha estado ganando terreno a la extraccioacuten liacutequido-liacutequido aunque tambieacuten se estaacute viendo cada vez
maacutes desplazada debido al creciente uso de la teacutecnica QuEChERS
Figura I11 Etapas de la espectrometriacutea de masas [42]
16
Capiacutetulo I Introduccioacuten
En el estudio de ECONOMOU et al [43] realizado en el antildeo 2009 en Grecia se empleoacute la extraccioacuten en fase
soacutelida con deteccioacuten en cromatografiacutea de liacutequidos acoplada a espectrometriacutea de masas en taacutendem (SPE-LC-ESI-
MSMS) Para la preparacioacuten de la muestra diluyeron 10 mL de vino (tanto blanco como tinto) a un volumen
final de 100 mL con agua ultrapura antes de la SPE Determinaron las recuperaciones de la extraccioacuten para dos
niveles de concentracioacuten 0010 y 0050 mgL realizando 8 medidas diarias durante 3 diacuteas consecutivos
encontraacutendose unos valores que variacutean dentro del rango 70-110 para todos los pesticidas en los dos niveles Para
la determinacioacuten y cuantificacioacuten de 46 pesticidas emplearon la teacutecnica de cromatografiacutea de liacutequidos con
espectrometriacutea de masas con un volumen de inyeccioacuten de 20 microL y un flujo de fase moacutevil de 02 mLmin
aclopada a espectrometriacutea de masas en taacutendem
Con la misma teacutecnica de extraccioacuten PELAJIĆ et al [45] durante el antildeo 2015 en Croacia llevaron a cabo la
determinacioacuten de 25 residuos de plaguicidas en vino tinto El meacutetodo que desarrollaron para dicha finalidad fue el
acoplamiento SPE-GC-MS Para la preparacioacuten de la muestra emplearon 10 mL de vino diluidos 11 con agua
ultrapura hasta un volumen final de 20 mL Calcularon las recuperaciones de la extraccioacuten y se encontroacute un rango
para todos los pesticidas en las muestras de 70-120 Para la determinacioacuten en cromatografiacutea de gases-
espectrometriacutea de masas se empleoacute un volumen de inyeccioacuten de 5 μL y un flujo de fase moacutevil de 10 mLmin
Mediante el acoplamiento de teacutecnicas SPE dispersiva-GC-MS WALORCZYK et al [48] en el antildeo 2011 en
Polonia llevaron a cabo la cuantificacioacuten de 160 pesticidas en diferentes clases de vino tinto rosado y blanco Con
10 g de vino y 10 mL de acetonitrilo se realizaron pruebas de recuperacioacuten en la fase de extraccioacuten para vino
tinto con los niveles de concentracioacuten 001 005 y 02 mgkg y para los vinos rosado y blanco con el nivel de
concentracioacuten 005mgkg y encontraron que a todos los niveles de concentracioacuten los valores de recuperacioacuten
rondan el rango 80-110 Para la teacutecnica cromatograacutefica se utilizoacute un volumen de inyeccioacuten de 5 microL
El acoplamiento LLE-SPE-LCDAD fue desarrollado por GONZAacuteLEZ-RODRIacuteGUEZ et al [50] en el antildeo
2010 en la provincia de Orense para la determinacioacuten de nuevos fungicidas propuestos para combatir el hongo
que provoca la enfermedad del mildium En la preparacioacuten de la muestra emplearon 15 mL de vino blanco para la
extraccioacuten en la cual fueron calculadas las recuperaciones relativas para dos niveles de concentracioacuten 005 y 05
mgkg en donde se establece un rango de entre 70-110 para todos los analitos Para la determinacioacuten mediante
cromatografiacutea de liacutequidos se empleoacute un volumen de inyeccioacuten de 2 μL y como meacutetodo de deteccioacuten utilizaron un
detector de diodos array
La microextraccioacuten sorptiva en fase soacutelida fue empleada en la publicacioacuten de FONTANA et al [44] junto con un
acoplamiento entre cromatografiacutea de liacutequidos y espectrometriacutea de masas para la determinacioacuten de 15 fungicidas
en vino realizada durante el 2010 en el noroeste de Espantildea Para la preparacioacuten de la muestra emplearon 10 mL
17
Capiacutetulo I Introduccioacuten
de vino diluiacutedos con el mismo volumen de agua ultrapura y un sorbente en forma de disco de silicona con un
volumen de 12 microL La recuperacioacuten de la extraccioacuten se calculoacute para vino tinto (Menciacutea) y vino blanco (Godello)
realizando tres replicas dentro de un mismo diacutea para los niveles de concentracioacuten 10 y 50 ngmL y nueve reacuteplicas
realizando el anaacutelisis en tres diacuteas consecutivos para el nivel de concentracioacuten de 25 ngmL y los resultados
obtenidos dan unos valores de recuperacioacuten dentro del rango 75-117 En el sistema LC-QTOF-MS el volumen
de inyeccioacuten fue de 15 microL
El otro meacutetodo de extraccioacuten mencionado anteriormente es QuEChERS estaacute en auge como meacutetodo de extracioacuten
de residuos de pesticidas en matrices como la del vino o la uva ya que incrementa la velocidad del anaacutelisis y reduce
el efecto de matriz BUERGE et al [46] seguido de una deteccioacuten mediante GC-MSMS realizaron una estapa
de extraccioacuten QuEChERS con alguna modificacioacuten acetato de sodio en lugar de cloruro soacutedico y acetato de etilo
en lugar de acetonitrilo utilizando 5 g de uva para la determinacioacuten de residuos de 4 pesticidas durante el antildeo
2016 Las recuperaciones de extraccioacuten resultaron ser valores entre 91-149 en uva a distintos niveles de
concentracioacuten 005 05 y 5 mgkg
Para la determinacioacuten de Ametoctradin HU et al [47] llevaron a cabo una extraccioacuten QuEChERS empleando 10
g de uva con deteccioacuten mediante el acoplamiento UPLC-MSMS utilizando un volumen de inyeccioacuten de 5 μL y
un flujo de fase moacutevil de 03 mLmin Las recuperaciones de la extraccioacuten se calcularon para tres niveles de
concentracioacuten 1 10 100 μgL de dos formas distintas en tres diacuteas consecutivos realizando 5 reacuteplicas al diacutea o en
dentro de un mismo diacutea realizando 15 reacuteplicas los resultados de todos los caacutelculos se encuentran dentro del rango
818-1001
Siguiendo con el mismo modo de extraccioacuten GUO et al [49] publicaron sus estudios para la determinacioacuten de
50 pesticidas y 12 adulterantes en vino tinto Para la extraccioacuten QuEChERS se utilizaron 10 mL de vino tinto con
10 mL de acetonitrilo y calcularon las recuperaciones para tres niveles de concentracioacuten 50 100 y 250 ngmL
encontraacutendose un rango de valores entre 75-120 El meacutetodo de deteccioacuten se llevoacute a cabo mediante un anaacutelisis
directo en tiempo real junto con espectrometriacutea de masas en tandem con un cuadrupolo (DART-MSMS) la
teacutecnica DART es un meacutetodo raacutepido para cribar y cuantificar los analitos de estudio que prescinde de la etapa de
separacioacuten cromatograacutefica
A continuacioacuten se recogen en la Tabla I3 los liacutemites de cuantificacioacuten (LOQs) de los analitos de intereacutes en este
trabajo caacutelculados por los diferentes meacutetodos encontrados en bibliografiacutea citados anteriormente en este apartado
18
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Tabla I3 LOQs de los analitos de intereacutes descritos para los distintos meacutetodos encontrados en la bibliografiacutea
Compuesto LOQs
Compuesto LOQs
V Blanco V Tinto Uva V Blanco V Tinto Uva
AME - - 0032μgkg[47] MET 86 μgL[43]
22 μgL[44]
89 μgL[43]
22 μgL[44]
5 μgL[45]
259 ngmL[49]
001mgkg[48]
BEN 02 μgL[44]
0001 mgL[50]
02 μgL[44]
001 μgL[45]
280ngmL[49]
005 mgkg[48] MYC 30 μgL[43]
08 μgL[44]
36 μgL[43]
10 μgL[44]
025 μgL[45]
331ngmL[49]
001 mgkg[48]
BOS 0065 mgL[50] 05 μgL[45]
1076 ngmL[49] 001 mgkg[48] PEN
56 μgL[43]
05 μgL[44]
49 μgL[43]
04 μgL[44]
220ngmL[49]
001 mgkg[48]
CAR - 386 ngmL[49] - PYC 0003mgL[50] 07 μgL[45] 001 mgkg[48]
CYP 15 μgL[43]
04 μgL[44]
0001 mgL[50]
22 μgL[43]
06 μgL[44]
312 ngmL[49]
001 mgkg[48] PYM 17 μgL[43] 22 μgL[43]
10 μgL[45] 001 mgkg[48]
DIM 18 μgL[43] 20 μgL[43] 001 mgkg[48] TEC 03 μgL[44]
03 μgL[44]
10 μgL[45]
160ngmL[49]
001 mgkg[48]
FEH 17 μgL[43] 22 μgL[43]
938 ngmL[49] 001 mgkg[48] TEF - 876ngmL[49] -
FEP - - 002mgkg[46] TBZ 15μgL [43] 29μgL[43] 001 mgkg[48]
FLU 005 μgL[45] TME - 25 μgL[45] 001 mgkg[48]
IMI 21 μgL[43] 22 μgL[43]
225 ngmL[49] - THI-M 92 μgL[43] 89 μgL[43] -
IPR 07 μgL[44] 07 μgL[44] 001 mgkg[48] TRI 10 μgL[44] 12 μgL[44] 001 mgkg[48]
MAN 0011 mgL[50] - -
5 DISTRIBUCIOacuteN DE PESTICIDAS EN VINOS COMERCIALES
En algunos de los meacutetodos descritos en el apartado anterior se procesaron vinos comerciales encontraacutendose
resultados positivos para muchos residuos de pesticidas y algunos hasta en gran concentracioacuten
ECONOMOU et al [43] mediante el meacutetodo LC-ESI-MSMS realizaron el anaacutelisis de 60 muestras de vino tinto
y blanco recogidos en supermercados locales en Grecia a lo largo de un antildeo El meacutetodo se habiacutea desarrollado
19
Capiacutetulo I Introduccioacuten
para la determinacioacuten de 46 pesticidas pero la mayoriacutea se encuentran con una concentracioacuten por debajo de
001mgL solo ocho plaguicidas se obtuvieron con resultados de concentracioacuten mayores Se muestran los
resultados en la Tabla I4 de los analitos de intereacutes en este estudio
Tabla I4 Nuacutemero de muestras positivas de distintos pesticidas en el anaacutelisis de 60 muestras de vino [43]
Compuesto Positivos con concentracioacuten entre 001-01
mgL
Positivos con concentracioacuten entre 01-1
mgL
PYM 2 (3) 2 (3)
MYC 2 (3) 0 (0)
CAR 11 (18) 7 (12)
THI-M 7 (12) 5 (8)
FEH 5 (8) 0 (0)
MET 1 (2) 0 (0)
Mediante el meacutetodo de microextraccioacuten en fase soacutelida-LC-TOF-MS FONTANA et al [44] aplicaron el
desarrollo del procedimiento a un total de 12 vinos joacutevenes elaborados en el 2010 y correspondientes a diferentes
denominaciones geograacuteficas del noroeste de Espantildea En la Tabla I5 se muestran los datos que han obtenido
Tabla I5 Determinacioacuten de fitosanitarios en vinos comerciales mediante Microextraccioacuten en fase soacutelida-LC-TOF-MS
Valores de concentracioacuten en ngmL [44]
Pesticidas
W 1
Albarintildeo
W5
Ribeiro
W6
Valdeorras
R1
Ribeira Sacra
R3
Ribeiro
R4
Valdeorras
MET 404plusmn06 223plusmn05 311plusmn007 25plusmn03 31plusmn03 74plusmn10
TRI nd nd 36plusmn06 nd nd ltLOQ
IPR 394plusmn03 324plusmn02 324plusmn02 071plusmn007 31plusmn02 28plusmn05
MYC nd nd nd ltLOQ 39plusmn02 nd
TEC 25plusmn01 nd nd nd nd nd
CYP 179plusmn08 ltLOQ ltLOQ 562plusmn002 083plusmn001 nd
BEN 042plusmn001 nd ltLOQ nd 032plusmn001 ltLOQ
ndNo detectados ltLOQ por debajo del liacutemite de cuantificacioacuten del meacutetodo los coacutedigos W y R corresponden respecti-vamente a los vinos blanco y tinto
20
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Por uacuteltimo PELAJIĆ et al [45] aplicaron su meacutetodo SPE dispersiva-GC-MS mediante el cual determinaron 25
residuos de plaguicidas en vino tinto a un total de 32 muestras de vino adquiridos en supermercados locales de
Croacia pero de diversos oriacutegenes de procedencia Los resultados que han obtenido se muestran en la Tabla I6
en doacutende un total de 15 plaguicidas han sido detectados y 7 de los cuales se encontraban en una alta
concentracioacuten
Tabla I6 Resultados de los vinos con positivos en pesticidas y sus concentraciones [45]
Vino Paiacutes Residuos de pesticidas (mgKg)
Tinto Francia DIM (0013) MET (0009) IPR (001)
Tinto Alemania BOS (0011)
Tinto Alemania IPR (0009)
Tinto Macedonia MET (0015)
Tinto Moldavia IPR (0008)
Tinto Polonia MET (004)
Tinto Rumania PYM (0058)
Tinto Espantildea TRI (0005) MET (0011)
Tinto Estados Unidos BOS (001)
Rosado Francia BOS (0005)
Blanco Chile TEC (0008)
Blanco Georgia MET (0057)
Blanco Alemania DIM (001) IPR (0054) PYM (0056)
Blanco Sudaacutefrica DIM (0011) IPR (0011)
21
Capiacutetulo II Objetivos y discusioacuten
CAPIacuteTULO II OBJETIVOS Y DISCUSIOacuteN
El objetivo principal que se persigue en este trabajo es el desarrollo de un meacutetodo analiacutetico raacutepido basado en la
extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) y deteccioacuten mediante cromatografiacutea de liacutequidos en la modalidad de UPLC
acoplada a la espectrometriacutea de masas en taacutendem (UPLC-MSMS) para la determinacioacuten multianalito de residuos
de fitosanitarios principalmente fungicidas aunque tambieacuten alguacuten insecticida en muestras de vino blanco y tinto
Para llevar a cabo la finalidad de lo dicho se consideran unos objetivos maacutes especiacuteficos
Minimizar la manipulacioacuten de la muestra para asiacute reducir la cantidad de disolventes y tiempo empleado
Optimizacioacuten de los factores que afectan en la extraccioacuten en la SPE tales como tipo y cantidad de
adsorbente volumen de eluyente etc
Estudio de las condiciones en UPLC-MSMS para una separacioacuten y cuantificacioacuten oacuteptimas
Caracterizacioacuten y validacioacuten del meacutetodo propuesto
Por uacuteltimo una vez cumplidos todos los objetivos anteriores y fijadas las condiciones oacuteptimas el meacutetodo
estudiado se aplica en el anaacutelisis de muestras de vino comercial (blanco y tinto) para determinar si se encuentran
residuos presentes asiacute como conocer en queacute concentracioacuten se encuentran los pesticidas objeto de este estudio
22
Capiacutetulo III Parte experimental
CAPIacuteTULO III PARTE EXPERIMENTAL
1 MATERIAL Y REACTIVOS
11 Material
Material de vidrio de uso comuacuten en el laboratorio vasos de precipitados matraces aforados etc
Micropipetas automaacuteticas de 20-200 microL 20-200 microL 100-1000 microL 1000-5000 microL Eppendorf
Puntas de plaacutestico para micropipetas
Encapsulador y desencapsulador
Soportes y pinzas
Viales de 15 mL transparentes para muestreador automaacutetico de cromatografiacutea (Sugelabor)
Caacutepsulas de aluminio con seacuteptum de Tefloacuten (Sugelabor) y tapones pre-slit para viales
Tubos y conectores de tefloacuten
Cartuchos de divinilbenceno-N-vinilpirrolidona 200 mg Oasis HLB Waters
Cartuchos de divinilbenceno-N-vinilpirrolidona funcionalizados con grupos amina cuaternaria 150 mg
Oasis MAX Waters
Cartuchos de divinilbenceno-N-vinilpirrolidona 60 mg Oasis HLB Waters
12 Reactivos y disolventes
Agua ultrapura Milli-Q
Aacutecido foacutermico (Sigma Aldrich) 95
Acetonitrilo (LichrosolvregMerck) Gradient grade for liquid chromatography
Metanol (LichrosolvregMerck) Gradient grade for liquid chromatography
Etanol (LichrosolvregMerck) Gradient grade for liquid chromatography
13 Patrones
Ametoctradin (AME) Dr Ehrenstrorfer 990
Benalaxyl (BEN) Pestanal Sigma- Aldrich 999
23
Capiacutetulo III Parte experimental
Boscalid (BOS) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Carbendazim (CAR) Pestanal Sigma- Aldrich 992
Cyprodinil (CYP) Pestanal Sigma- Aldrich 998
Dimethomorph (DIM) mezcla de isoacutemeros E + Z Pestanal Sigma- Aldrich 989
Fenhexamid (FEH) Pestanal Sigma- Aldrich 997
Fenpropidin (FEP) Dr Ehrenstrorfer 980
Fluopicolide (FLU) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Imidacloprid (IMI) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Iprovalicarb (IPR) mezcla de isoacutemeros Pestanal Sigma- Aldrich 985
Mandipropamid (MAN) Pestanal Sigma- Aldrich 991
Metalaxyl (MET) Pestanal Sigma- Aldrich 990
Myclobutanil (MYC) Pestanal Sigma- Aldrich 994
Penconazole (PEN) Pestanal Sigma- Aldrich 991
Pyraclostrobin (PYC) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Pyrimethanil (PYM) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Tebuconazol (TEC) Pestanal Sigma- Aldrich 996
Tebufenozide (TEF) Dr Ehrenstrorfer 988
Thiabendazole (TBZ) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Thiamethoxam (TME) Pestanal Sigma- Aldrich 996
Thiophanate-methyl (THI-M) Dr Ehrenstrofer 990
Triadimenol (TRI) Mezcla de diastereoisoacutemeros Pestanal Sigma- Aldrich 994
14 Patrones internos
Carbendazim-d3 (CAR-d3) Pestanal Sigma- Aldrich 998
Cyprodinil-d5 (CYP-d5) Pestanal Sigma- Aldrich
Imidacloprid-d4 (IMID-d4) Pestanal Sigma- Aldrich
Metalaxyl 13C6 (MET13C6) Pestanal Sigma-Aldrich 99
24
Capiacutetulo III Parte experimental
15 Gases
Nitroacutegeno 99999 como gas de colisioacuten en el espectroacutemetro de masas
Nitroacutegeno en los sistemas de concentracioacuten y secado por corriente de nitroacutegeno de los cartuchos SPE
2 INSTRUMENTACIOacuteN
Balanza analiacutetica de precisioacuten Sartorius
Granatario Sartorius
Bantildeo de ultrasonidos P-Selecta
Equipo de purificacioacuten de agua Millipore modelo Milli-Q gradient A-10ZMQSSVOT4
Estacioacuten de concentracioacuten por corriente de nitroacutegeno Mini-Vap Supelco
Sistema de secado de cartuchos de SPE por corriente de nitroacutegeno VisiDry Supelco
Sistema distribuidor de vaciacuteo Visiprep reg Supelco
Cromatoacutegrafo de liacutequidos de ultra-alta resolucioacuten Waters AcquityUPLC reg y espectroacutemetro de masas
Acquity TQD con analizador de triple quadrupolo (QqQ) equipado con una fuente de ionizacioacuten a
presioacuten atmosfeacuterica del tipo Z-spray (ESI)
3 PREPARACIOacuteN DE LAS DISOLUCIONES
Los patrones de pesticidas se prepararon individualmente a partir de los compuestos soacutelidos comerciales por
pesada excepto en el caso del fenpropidin (FEP) que se preparoacute a partir del compuesto liacutequido comercial Estos
compuestos soacutelidos se disolvieron en metanol y se obtuvieron unas disoluciones iniciales con concentraciones
recogidas en la Tabla III1
25
Capiacutetulo III Parte experimental
Tabla III1 Concentracioacuten de las disoluciones patroacuten stock
Compuesto Concentracioacuten (microgmL) Compuesto Concentracioacuten (microgmL)
AME 102201 MET 118912
BEN 138330 MYC 102017
BOS 99474 PEN 129791
CAR 17105 PYC 104581
CYP 131075 PYM 141386
DIM 103009 TEC 134729
FEH 99584 TEF 137769
FEP 100000 TBZ 105928
FLU 126859 TME 112283
IMI 101123 THI-M 124202
IPR 106739 TRI 118933
MAN 101021
4 LAVADO DEL MATERIAL
La limpieza del material de vidrio utilizado en el laboratorio se realizoacute utilizando jaboacuten y aclarando con agua de
grifo Luego en primer lugar se realiza un enjuague con agua Milli-Q finalmente un segundo enjuague con
acetona para eliminar posibles restos de compuestos orgaacutenicos y se deja secar sobre papel
Para la limpieza de los conectores de tefloacuten empleados en el proceso de SPE se introducen en un vaso de
precipitados con metanol y este en un bantildeo de ultrasonidos durante 10 minutos Al finalizar con el bantildeo de
ultrasonidos se realiza un enjuague con acetona y se pone a secar
5 EXTRACCIOacuteN DE MUESTRAS MEDIANTE SPE
El meacutetodo de extraccioacuten utilizado para la determinacioacuten de pesticidas fue la extraccioacuten en fase soacutelida (SPE)
mediante cartuchos Oasis HLB de 200 mg A continuacioacuten se describe el protocolo de extraccioacuten en las
condiciones oacuteptimas
26
Capiacutetulo III Parte experimental
1 Acondicionamiento del cartucho Oasis HLB de 200 mg con 2 mL de acetonitrilo seguidos de otros 2 mL de
vino sinteacutetico formado por la mezcla etanolagua MilliQ (1288)
2 Paso de la muestra 2 mL de vino diluiacutedos con 2 mL de agua MilliQ a traveacutes del cartucho por gravedad
3 Lavado del cartucho con 2 mL de agua MilliQ
4 Secado del cartucho durante 45 minutos en el VisiDry mediante el paso de una corriente de nitroacutegeno
5 Elucioacuten del cartucho con la mezcla metanolacetonitrilo en proporcioacuten 2080 hasta un volumen final de 2
mL
6 Anaacutelisis mediante cromatografiacutea liacutequida acoplada a espectrometriacutea de masas en taacutendem UPLC-MSMS
(volumen de inyeccioacuten 15 microL)
Representacioacuten esquematizada en la Figura III1
Figura III1 Extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) de las muestras de vino
27
Capiacutetulo III Parte experimental
6 CONDICIONES DE DETERMINACIOacuteN MEDIANTE UPLC-MSMS
En la Tabla III2 se indican las condiciones utlizadas en la determinacioacuten de los pesticidas de intereacutes mediante
LC-MSMS y en la Tabla III3 se muestra el gradiente de la fase moacutevil utilizado para la separacioacuten
cromatograacutefica
Tabla III2 Condiciones experimentales de determinacioacuten en LC-MSMS
UPLC Acquity UPLC-I-Class IVD System
bull Columna cromatograacutefica Zorbax Eclipse Plus C18 Rapid Resolution HD
Fase estacionaria C18
Dimensiones 21 x 50 mm
Tamantildeo de partiacutecula 18 microm
Temperatura del horno 40ordmC
bull Inyector
Volumen de inyeccioacuten 15 microL
bull Fase moacutevil
Flujo 04 mLmin
Fase acuosa (A) Agua MilliQ con 01 aacutecido foacutermico
Fase orgaacutenica (B) Acetonitrilo con 01 aacutecido foacutermico
MSMS WatersXevo TQD
Modo de ionizacioacuten ESI positivo
Voltaje del capilar 15 kV
Voltaje de cono 50 V
Temperatura de gas de secado (N2) 450ordmC
Flujo de gas de secado (N2) 1000 Lh
Modo de adquisicioacuten Centroide
Tabla III3 Gradiente de fase moacutevil utilizado en la separacioacuten cromatograacutefica (LC)
Tiempo min 0 13 28 64 75 76 10
A 98 50 50 0 0 98 98
B 2 50 50 100 100 2 2
28
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
CAPIacuteTULO IV RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
1 IDENTIFICACIOacuteN DE LOS COMPUESTOS
Para empezar el estudio en primer lugar se realizoacute la caracterizacioacuten de las condiciones de determinacioacuten de los
analitos en el modo Multiple Reaction Monitoring (MRM) mediante UPLC-ESI-MSMS Para llevarla a cabo se
tomaron patrones individuales de cada fitosanitario y mediante infusioacuten se estudiaron las posibles transiciones y
voltajes oacuteptimos para su determinacioacuten (Tabla IV1)
La ionizacioacuten por electrospray (ESI) se estudioacute tanto en modo positivo como en modo negativo encontraacutendose
que para todos los pesticidas de nuestro intereacutes se obteniacutea sentildeal en el modo positivo mientras el modo negativo
no presentaba respuesta significativa
A continuacioacuten se estudia el efecto del voltaje de cono en la respuesta del ioacuten molecular [M+H]+ aumentaacutendolo
hasta alcanzar el valor maacuteximo de la sentildeal correspondiente a dicho ioacuten y luego se optimiza la energiacutea de colisioacuten
variaacutendola para cada analito hasta obtener la sentildeal de mayor intensidad para cada uno de los iones producto Por
uacuteltimo una vez optimizado el voltaje de cono y la energiacutea de colisioacuten se seleccionan las dos transiciones maacutes
intensas para llevar a cabo la cuantificacioacuten y cualificacioacuten de cada analito en modo MRM Este procedimiento se
realizoacute para la totalidad de los compuestos confirmando los datos obtenidos con los facilitados por la base de
datos Quanpedia que estaacute disponible en el software del equipo utilizado para algunos de los compuestos
considerados
Compuesto Tr (min) Ion precursor (mz Da)
Voltaje de cono (V)
Ion producto 1 (CEv)
cuantificacioacuten
Ion producto 2 (CEv)
cualificacioacuten
Relacioacuten IP2IP1
AME 325 2760 60 176 (35) 70 (50) 016
BEN 485 3261 26 148 (20) 91 (34) 067
BOS 387 3429 41 140 (20) 307 (20) 011
CAR 167 1921 33 160 (18) 132 (28) 014
CYP 311 2260 56 93 (33) 108 (25) 061
DIM 322 3881 40 301 (20) 165 (30) 057
FEH 386 3021 41 97 (22) 55 (38) 044
FEP 257 2742 55 147 (28) 86 (28) 093
FLU 401 3830 40 173 (20) 365 (15) 010
IMI 218 2561 34 209 (15) 175 (20) 091
IPR 358 3211 28 119 (16) 203 (10) 042
Tabla IV1 Tiempos de retencioacuten (Tr) relacioacuten de iones precursores (mz) voltaje de cono (V) energiacuteas de colisioacuten (CE) y relacioacuten de intensidades entre transiciones (IP2IP1)
29
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Compuesto Tr (min) Ion precursor (mz Da)
Voltaje de cono (V)
Ion producto 1 (CEv)
cuantificacioacuten
Ion producto 2 (CEv)
cualificacioacuten
Relacioacuten IP2IP1
MAN 392 4120 25 328 (16) 125 (35) 063
MET 283 2801 26 220 (13) 192 (17) 057
MYC 365 2891 34 70 (18) 125 (32) 029
PEN 417 2840 34 70 (16) 159 (34) 031
PYC 523 3881 31 194 (12) 163 (25) 066
PYM 266 2000 51 107 (24) 82 (24) 071
TEC 397 3080 40 70 (22) 125 (40) 007
TEF 473 3531 19 133 (20) 297 (8) 072
TBZ 182 2020 51 175 (25) 131 (30) 062
TME 203 2920 28 211 (12) 132 (22) 047
THI-M 257 3430 28 151 (46) 93 (19) 0001
TRI 319 2961 21 70 (10) 99 (15) 013
El dwell time para cada una de las transiciones se ajustoacute de manera automaacutetica por el software (MassLinx) con
objeto de obtener doce puntos espectrales por compuesto tomando un valor promedio de cuatro segundos como
ancho de pico a liacutenea de base
2 CARACTERIZACIOacuteN DEL PROCEDIMIENTO DE DETERMINACIOacuteN (UPLC-ESI-
MSMS)
Una vez optimizados los paraacutemetros que afectan a la separacioacuten cromatograacutefica (UPLC) y a la determinacioacuten por
espectrometriacutea de masas en taacutendem (MSMS) se lleva a cabo la evaluacioacuten de la repetibilidad de inyeccioacuten y
determinacioacuten en esas condiciones Se expresa por medio de la desviacioacuten estaacutendar relativa (RSD) paraacutemetro que
nos indica el grado de correlacioacuten que existe entre varias medidas del mismo patroacuten realizadas por el mismo
operador en el laboratorio y en el mismo equipo de medida a lo largo de un diacutea Para el estudio se realizan diez
inyecciones con volumen de 15 microL de dos patrones con distintos niveles de concentracioacuten 5 y 20 ngmL Los
datos de RSD (Tabla IV2) para las aacutereas de pico de los analitos se situacutean para el nivel de concentracioacuten 5 ngmL
en el rango 2-13 y en el nivel de concentracioacuten 20 ngmL en el rango 1-7
30
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten Tabla IV2 Desviacioacuten estaacutendar relativa (RSD) del aacuterea de pico (transicioacuten de cuantificacioacuten) para evaluar la repetivilidad del proceso de LC-MSMS
Compuesto RSD
5 ngmL
RSD
20 ngmL Compuesto
RSD
5 ngmL
RSD
20 ngmL
AME 5 2 MET 3 2
BEN 2 2 MYC 9 2
BOS 4 5 PEN 4 4
CAR 4 2 PYC 3 1
CYP 5 7 PYM 7 3
DIM 6 5 TEC 3 2
FEH 7 4 TEF 4 2
FEP 4 2 TBZ 2 1
FLU 5 3 TME 6 6
IMI 13 7 THI-M a 6
IPR 8 2 TRI 8 6
MAN 3 2
A continuacioacuten tambieacuten se evaluoacute la repetibilidad de los tiempos de retencioacuten (Tr) para diez inyecciones de
patrones a los dos niveles de concentracioacuten 5 y 20 ngmL situaacutendose las RSD para todos los compuestos en el
rango 01-03 En base a este dato la ventana de tiempo en la que se registran las transiciones de MRM de cada
compuesto se fijoacute en 05 min lo que es lo mismo 025 min alrededor del valor medio de su tiempo de retencioacuten
Por otro lado la linealidad del meacutetodo se estudioacute a nueve niveles de concentracioacuten diferentes comprendidos ente
los niveles 05 ngmL y 200 ngmL mediante la inyeccioacuten de disoluciones patroacuten de los distintos compuestos de
estudio Se realizoacute una evaluacioacuten sin y otra con patroacuten interno (IS) antildeadiendo una concentracioacuten fija de patrones
internos a nivel de 25 ngmL y pudimos observar que los resultados mejoran notablemente al realizar una
correccioacuten con el IS En la Tabla IV3 se muestran los coeficientes de determinacioacuten (R2) obtenidos al realizar la
correccioacuten mediante IS observando que para todos los compuestos excepto para THI-M y para TRI los
coeficientes de correlacioacuten son superiores a 0990 por lo que existe una respuesta lineal en el rango de
concentraciones que hemos estudiado
Aparte del estudio de la linealidad tambieacuten se han estudiado los liacutemites de cuantificacioacuten instrumentales del
meacutetodo (LOQs) Para ello los LOQs se evaluacutean como la miacutenima cantidad de analito que origina una sentildeal 10
veces superior a la desviacioacuten estaacutendar del ruido Los valores anteriores se estimaron a partir del patroacuten de
a no evaluado ya que se encuentra por debajo del liacutemite de cuantificacioacuten del meacutetodo
31
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
concentracioacuten maacutes baja que presenta un pico con una relacioacuten SN superior a 10 En la Tabla IV3 tambieacuten se
recogen estos LOQs en doacutende podemos ver que variacutean en el rango 01-1 ngmL excepto para THI-M que se
desviacutea a valores de 10 ngmL
Tabla IV3 Coeficientes de determinacioacuten (R2) y liacutemites de cuantificacioacuten instrumentales (LOQs) de los analitos para nueve
niveles de concentracioacuten de 05 a 200 ngmL
Compuesto Coeficiente de
correlacioacuten (R2)
LOQs (ngmL) Compuesto
Coeficiente de correlacioacuten
(R2)
LOQs (ngmL)
AME 09951 04 MET 09933 01
BEN 09949 01 MYC 09950 04
BOS 09979 02 PEN 09945 02
CAR 09923 02 PYC 09955 02
CYP 09878 02 PYM 09931 01
DIM 09938 07 TEC 09958 05
FEH 09959 05 TEF 09957 01
FEP 09931 01 TBZ 09942 02
FLU 09965 02 TME 09903 01
IMI 09979 05 THI-M 09580 100
IPR 09938 01 TRI 09867 07
MAN 09979 01
En la Figura IV1 y Figura IV2 se muestran dos ejemplo de curvas de calibrado para dos compuestos IMI y
MAN respectivamente
Figura IV1 Curva de calibrado y coeficiente de determinacioacuten de IMI para UPLC-ESI-MSMS
32
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Figura IV2 Curva de calibrado y coeficiente de determinacioacuten de MAN para UPLC-ESI-MSMS
3 ESTUDIO DEL MEacuteTODO SPE
La extraccioacuten de pesticidas se llevoacute a cabo mediante extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) en doacutende se realizaron
diversos estudios con diferentes condiciones para dar con las oacuteptimas En primer lugar se llevaron a cabo los
experimentos de retencioacuten y elucioacuten sobre dos tipos distintos de adsorbentes cartuchos OASIS HLB (200mg) y
cartuchos OASIS MAX (150 mg) como fases potenciales en las que llevar a cabo la extraccioacuten de manera
selectiva Los dos tipos de cartuchos son de fase reversa pero difieren entre siacute en el fundamento de retencioacuten de
los analitos En los cartuchos OASIS HLB (200 mg) formados por divinilbenceno-N-vinilpirrolidona (DVB-VP)
la retencioacuten de los diferentes analitos tiene lugar por interacciones π-π o de Van der Waals mientras que los
cartuchos OASIS MAX (150 mg) que se probaron como alternativa para mejorar la selectividad en la extraccioacuten
cuentan con un adsorbente polimeacuterico de modo mixto formado por divinilbenceno-N-vinilpirrolidona (DVB-VP)
funcionalizado con grupos amina cuaternaria siendo el fundamento de la extraccioacuten la combinacioacuten de las
propiedades adsorbentes del cartucho HLB con un mecanismo adicional de intercambio ioacutenico (anioacutenico) [27]
Algunos autores han empleado este mecanismo para mejorar la selectividad de la extraccioacuten de forma que en la
etapa de elucioacuten ciertos pigmentos del vino quedan fuertemente retenidos en el adsorbente a diferencia de lo que
ocurre con los adsorbentes de fase reversa [51]
Para llevar a cabo la eleccioacuten del tipo de adsorbente se realizaron pruebas con 10 mL de vino blanco y tinto
conectando en serie los dos tipos de cartuchos HLB (200 mg) y MAX (150 mg) a un segundo cartucho OASIS
HLB (60 mg) La elucioacuten de los analitos se hace de forma independiente para cada cartucho y se evaluacutea si los
analitos pasan del primer cartucho hacia el segundo cartucho es decir si se supera el volumen de corte o si por
33
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
otro lado se quedan retenidos en el primero y no eluyen hacia el segundo En estas pruebas de estudio
preliminares de preparacioacuten de la muestra no se ha incluido el CYP
En la Figura IV3 podemos ver la eficacia de la extraccioacuten para vino blanco y tinto que obtenemos empleando
cartuchos OASIS MAX (150 mg) conectados en serie con cartuchos OASIS HLB (60 mg) realizando la
extraccioacuten de tres fracciones de 2 mL cada una del cartucho OASIS MAX (150 mg) y una cuarta fraccioacuten de 2
mL del cartucho OASIS HLB (60 mg)
Por otro lado en la Figura IV4 podemos ver un graacutefico de columnas en el cual comparamos la eficacia de
extraccioacuten de los cartuchos OASIS HLB (200 mg) con dos disolventes de elucioacuten distintos En dicho graacutefica el
acroacutenimo de cada compuesto consta de dos barras cuyo significado es el siguiente la barra de la izquierda indica
la eficacia de la extraccioacuten empleando acetonitrilo (ACN) como disolvente de elucioacuten y la barra de la derecha
indica la eficacia de la extraccioacuten empleando la combinacioacuten MetanolAcetonitrilo (2080) (MeOHACN) como
disolvente de elucioacuten Para este adsorbente no se detectoacute ninguacuten compuesto en la extraccioacuten del segundo
cartuchos OASIS HLB (60 mg) empleando 2 mL de metanol
Figura IV3 Distribucioacuten de los compuestos en cada fraccioacuten obtenidas con cartuchos OASIS MAX (150 mg)
utilizando 10 mL de vino tinto y blanco sacando cuatro fracciones de 2 mL cada una con metanol como
disolvente de elucioacuten
34
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Figura IV4 Distribucioacuten de los compuestos en cada fraccioacuten obtenidas con cartuchos OASIS HLB (200 mg) utilizando 10
mL de vino tinto y blanco sacando 3 fracciones de 2 mL cada una con acetonitrilo (ACN) (columna de la izquierda) y una
combinacioacuten MetanolAcetonitrilo (2080) (MeOHACN) (columna de la derecha) como disolventes de elucioacuten
A la vista de los resultados reflejados en las graacuteficas podemos afirmar que cuando se utiliza el cartucho OASIS
HLB (200 mg) eluyendo con acetonitrilo o la combinacioacuten metanolacetonitrilo (2080) los extractos son limpios
y se eluyen la mayoriacutea de los compuestos en la primera fraccioacuten Pero utilizando acetonitrilo como disolvente de
elucioacuten se encuentran problemas en la extraccioacuten de CAR FEH y TBZ para los que es necesario emplear un
volumen mayor de elucioacuten o bien seleccionar otro disolvente de elucioacuten como es la combinacioacuten
metanolacetonitrilo
35
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Por otro lado los extractos en los cartuchos OASIS MAX (150 mg) son maacutes limpios incluso utilizando metanol en
la elucioacuten pero se detecta la presencia de CAR FEP TBZ y TME en el segundo cartucho OASIS HLB (60 mg)
significando la rotura del primer cartucho para dichos analitos considerando un volumen de 10 mL de vino Los
demaacutes compuestos se podriacutean recuperar cuantitativamente en la primera fraccioacuten sacada pero la peacuterdida de estos
compuestos inclina la eleccioacuten hacia los cartuchos OASIS HLB (200 mg) con metanolacetonitrilo (2080) como
disolvente de elucioacuten para continuar con el estudio
Una vez fijado el adsorbente y el volumen de elucioacuten se prueba la eficacia de la SPE independiente de los efectos
de matriz En la Tabla IV4 se muestran las recuperaciones de la SPE tomando 10 mL de vino blanco y tinto
con un nivel de adicioacuten de 15 ngmL sacando una sola fraccioacuten de 2 mL con la combinacioacuten
metanolacetonitrilo (2080) y n=3 reacuteplicas
Tabla IV4 Recuperaciones (R plusmn SD) de SPE para 10 mL de vino (blanco y tinto) con un nivel de adicioacuten de 15 ngmL y
n=3 reacuteplicas
Compuesto Vino Tinto
R plusmn SD
Vino Blanco
R plusmnSD Compuesto
Vino Tinto
R plusmn SD
Vino Blanco
R plusmn SD
AME 82 plusmn 7 100 plusmn 1 MET 92 plusmn 6 94 plusmn 3
BEN 89 plusmn 6 97 plusmn 3 MYC 90 plusmn 9 86 plusmn 4
BOS 95 plusmn 1 100 plusmn 2 PEN 84 plusmn 10 103 plusmn 3
CAR 91 plusmn 6 104 plusmn 6 PYC 86 plusmn 5 106 plusmn 1
CYP 81 plusmn 7 102 plusmn 3 PYM 87 plusmn 12 94 plusmn 3
DIM 97 plusmn 3 86 plusmn 4 TEC 83 plusmn 10 103 plusmn 1
FEH 89 plusmn 3 88 plusmn 3 TEF 84 plusmn 5 108 plusmn 4
FEP 91 plusmn 7 104 plusmn 3 TBZ 88 plusmn 7 92 plusmn 5
FLU 91 plusmn 2 97 plusmn 4 TME 101 plusmn 1 110 plusmn 13
IMI 117 plusmn 8 101 plusmn 11 THI-M 85 plusmn 9 110 plusmn 4
IPR 89 plusmn 7 112 plusmn 4 TRI 85 plusmn 10 110 plusmn 4
MAN 88 plusmn 2 87 plusmn 2
Algunos compuestos de la matriz en el vino pueden competir con los analitos durante el proceso de ionizacioacuten
que tiene lugar en la interfase entre UPLC-MSMS por lo que para la cuantificacioacuten del rendimiento de la
ionizacioacuten por electrospray (ESI) se estudian los efectos de matriz (EM) para vino blanco y tinto considerando
dos voluacutemenes de muestra distintos 2 y 10 mL y un volumen final del extracto de 2 mL En la Tabla IV5 se
36
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
exponen los valores para cada compuesto notando que al aumentar el volumen de muestra tambieacuten se aumentan
los efectos de matriz y eacutestos siempre son mayores en vino tinto Para el caacutelculo de estos efectos de matriz (EM)
se emplea la siguiente ecuacioacuten
Donde Am Ab y Ap representan el aacuterea de pico en la sentildeal medida del analito en el extracto de la muestra con
adicioacuten en el extracto de la muestra sin adicioacuten (o blanco) y en el patroacuten antildeadido respectivamente El nivel de
adicioacuten en extracto fue de 50 ngmL por compuesto
Tabla IV5 Efectos de matriz para vino blanco y tinto con un volumen inicial de 2 y 10 mL evaluados para un nivel de adicioacuten de 50 ngmL en extracto
Compuesto
Vino blanco Vino tinto
2 mL 10 mL 2mL 10 mL
EM () CV () EM () CV () EM () CV () EM () CV()
AME 93 3 95 2 99 3 101 7
BEN 99 1 93 2 101 3 100 6
BOS 97 5 98 1 108 2 96 0
CAR 62 2 50 3 58 2 55 6
CYP 94 3 91 1 97 2 95 7
DIM 105 2 95 3 100 3 108 3
FEH 100 4 102 4 105 4 94 3
FEP 95 3 88 2 96 2 92 7
FLU 98 2 93 2 106 1 101 2
IMI 84 4 46 3 48 10 18 8
IPR 99 3 92 3 105 1 100 7
MAN 100 1 94 3 109 4 107 2
MET 98 1 89 1 99 2 99 6
MYC 105 1 100 1 103 2 96 9
PEN 98 3 97 1 101 3 99 10
PYC 98 2 92 3 102 2 98 5
PYM 95 2 87 1 94 3 85 12
TEC 95 3 99 1 101 1 102 10
TEF 99 1 92 3 101 2 104 5
TBZ 45 0 40 5 43 2 30 7
TME 60 6 19 16 36 4 16 1
THI-M 107 2 109 2 103 1 96 9
TRI 97 3 118 4 104 5 117 10
37
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Al observar los resultados podemos ver que la mayoriacutea de los compuestos dan resultados de EM en torno al
100 lo que significa que no sufren una modificacioacuten importante en la eficacia de ionizacioacuten para las muestras
con respecto a los patrones Pero tambieacuten por el contrario podemos observar que algunos compuestos como
por ejemplo en el caso de CAR TBZ IMI y TME experimentan una gran supresioacuten de sentildeal es decir EM bajos
que se acentuacutean al aumentar el volumen de muestra La atenuacioacuten en la eficacia de variacioacuten para estos cuatro
compuestos no solo se ve incrementada con el volumen de muestra si no que ademaacutes es maacutes significativa para
vino tinto que para vino blanco En base a estos resultados aunque la eficacia de la SPE fue cuantitativa para
muestras de 10 mL se limitoacute el volumen de muestra a extraer a 2 mL
Las condiciones oacuteptimas de extraccioacuten se esquematizan en un resumen en la Figura IV5
Figura IV5 Condiciones optimizadas para la extraccioacuten de pesticidas en vino
38
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
4 CARACTERIZACIOacuteN DEL MEacuteTODO DE DETERMINACIOacuteN
Con las condiciones de extraccioacuten y determinacioacuten citadas anteriormente se llevaron a cabo pruebas de
recuperaciones absolutas de los compuestos a nivel de adicioacuten de 5 y 20 ngmL sobre las muestras Para cada
muestra y nivel de adicioacuten se realizaron tres reacuteplicas de las muestras con adicioacuten y los blancos aliacutecuotas de las
mismas muestras sin adicioacuten se procesaron en duplicado Los IS se antildeadieron a nivel de 25 ngmL y cada uno se
utiliza para corregir unos determinados compuestos CAR-d3 se emplea para CAR y TBZ el CYP-d5 para CYP y
PYM el IMID-d4 para IMI y TME y el MET13C6 para el resto de compuestos Los resultados para vino blanco
comprenden en el nivel de concentracioacuten 5 ngmL el rango entre 79-122 y en el nivel de concentracioacuten 20
ngmL el rango entre 84-109 Por otro lado en el caso del vino tinto las recuperaciones se encuentran para el
nivel de concentracioacuten 5 ngmL en el rango 67-112 y para el nivel de concentracioacuten 20 ngmL entre el rango
73-132 Los resultados obtenidos en las pruebas con vino blanco y vino tinto se muestran en la Tabla IV6
Los resultados son satisfactorios ya que la mayoriacutea de los compuestos se ajustan en todos los casos al rango de
recuperacioacuten entre 70-120 Para la realizacioacuten de estas pruebas se ha eliminado de los resultados el compuesto
THI-M debido a que las concentraciones utilizadas se encuentran en el liacutemite o por debajo del LOQ en los
experimentos con muestras adicionadas a 5 ngmL
Para calcular las recuperaciones (R) se recurrioacute a la siguiente ecuacioacuten
Donde Cm Cb y Cp son la concentracioacuten medida de analito en el extracto de la muestra con adicioacuten en el extracto
de la muestra sin adicioacuten (o blanco) y en el patroacuten antildeadido respectivamente
Tabla IV6 Recuperaciones (R) para vino tinto y vino blanco evaluadas para dos niveles de concentracioacuten 5 y 20 ngmL
Compuesto
Vino tinto Vino Blanco
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
AME 97 3 105 6 104 9 96 5
BEN 88 11 105 3 101 1 98 4
BOS 91 13 110 2 88 13 97 3
39
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Compuesto
Vino tinto Vino blanco
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
CAR 99 6 99 3 122 3 109 1
CYP 91 2 111 1 101 4 100 6
DIM 112 3 110 9 102 24 99 11
FEH 91 4 108 0 102 20 95 2
FEP 89 8 102 7 94 5 84 1
FLU 95 10 104 4 109 5 100 8
IMI 73 11 115 9 80 13 100 2
IPR 84 13 99 3 111 3 99 4
MAN 88 22 112 8 112 3 99 4
MET 99 3 106 5 106 3 98 2
MYC 84 9 106 13 88 17 86 3
PEN 84 9 102 5 84 8 90 5
PYC 96 6 105 4 100 2 95 4
PYM 90 12 112 14 106 4 97 1
TEC 89 8 101 6 98 12 94 1
TEF 93 10 102 5 107 2 97 3
TBZ 94 17 115 8 79 5 106 2
TME 67 2 101 7 84 18 90 11
THI-M ne - 74 7 ne - 89 24
TRI 88 12 97 6 102 6 92 2
ne No evaluado El nivel de adicioacuten es inferior al LOQ del meacutetodo para este compuesto
Para estudiar la reproducibilidad del meacutetodo analiacutetico global (correspondientes a los datos de preparacioacuten de
muestra y determinacioacuten) es decir la concordancia de varias medidas realizadas en diacuteas diferentes se procedioacute a la
extraccioacuten en las condiciones oacuteptimas tanto de vino blanco como tinto Las extracciones y determinaciones se
realizaron durante tres diacuteas consecutivos realizando tres reacuteplicas por vino y por diacutea con un nivel de adicioacuten en
muestra de 10 ngmL un blanco de muestra cada diacutea En la Tabla IV7 se muestran los resultados como
recuperaciones (R) en condiciones de reproducibilidad obtenidos para ambos tipos de vino dando valores entre
64-116 para muestras de vino blanco y valores situados entre 68-108 para muestras de vino tinto con la
excepcioacuten del TME para el que se ha obtenido un valor no aceptable en cuanto a la exactitud medida en
condiciones de reproducibilidad A la vista de los resultados obtenidos con estas pruebas se considera necesario el
empleo de IS adicionales para la mejora en la exactitud del meacutetodo para algunos compuestos por ejemplo el
TME
40
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Tabla IV7 Recuperaciones en condiciones de reproducibilidad (R plusmn SD) para vino blanco y tinto
Compuesto
Vino tinto Vino blanco
R
10 ngmL CV ()
R
10 ngmL CV ()
AME 90 5 101 13
BEN 96 5 102 7
BOS 97 6 100 8
CAR 97 3 94 5
CYP 103 3 105 12
DIM 104 7 106 8
FEH 90 16 83 15
FEP 91 5 90 4
FLU 103 7 102 6
IMI 99 14 101 14
IPR 91 5 100 13
MAN 108 5 108 13
MET 101 5 101 5
MYC 105 16 102 14
PEN 96 11 92 10
PYC 99 12 97 12
PYM 102 4 116 8
TEC 99 9 97 16
TEF 99 8 105 11
TBZ 68 4 84 5
TME 47 13 64 10
THI-M 107 11 104 16
TRI 95 14 103 4
En la Tabla IV8 se muestran los liacutemites de cuantificacioacuten (LOQs) del meacutetodo del meacutetodo de SPE-UPLC-ESI-
MSMS obtenidos para los diferentes pesticidas Los valores obtenidos son ideacutenticos a los LOQs instrumentales
excepto en el caso de aquellos compuestos para los que se observaronfuertes efectos de matriz (Tabla IV5) En
estos casos (CAR TBZ IMI y TME) los LOQs del meacutetodo se incrementan seguacuten la atenuacioacuten de sentildeal
observada
41
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Tabla IV8 Liacutemites de cuantificacioacuten LOQs (ngmL) del meacutetodo obtendos para cada compuesto
Compuesto LOQ (ngmL) Compuesto LOQ (ngmL)
AME 04 MET 01
BEN 01 MYC 04
BOS 02 PEN 02
CAR 03 PYC 02
CYP 02 PYM 01
DIM 07 TEC 05
FEH 05 TEF 01
FEP 01 TBZ 04
FLU 02 TME 02
IMI 06 THI-M 10
IPR 01 TRI 07
MAN 01
5 APLICACIOacuteN A MUESTRAS DE VINO COMERCIALES
Una vez optimizadas las condiciones del meacutetodo y estudiadas las caracteriacutesticas del meacutetodo desarrollado se aplicoacute
a la determinacioacuten de los compuestos de intereacutes estudiados en muestras de vino blanco y vino tinto comerciales
producidos en diferentes paiacuteses En la Tabla IV9 se muestra el paiacutes de origen de cada muestra comercial
identificadas con un coacutedigo alfanumeacuterico y antildeo de produccioacuten
42
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Tabla IV9 Coacutedigo asignado para los diferentes vinos comerciales blancos y tintos analizados Indicando el paiacutes de origen y
antildeo de produccioacuten
Coacutedigo Denominacioacuten de origen Antildeo de produccioacuten
bull Vinos Blancos
W1 Alemania 2014
W2 Espantildea 2012
W3 Espantildea 2016
W4 Portugal Desconocido
W5 Francia 2015
W6 Francia 2015
W7 Espantildea 2016
bull Vinos Tintos
R1 Espantildea 2015
R2 Sudaacutefrica 2015
R3 Chile 2015
R4 Francia 2015
R5 China Desconocido
R6 Espantildea 2016
R7 Australia 2014
R8 Francia 2013
R9 Francia 2015
A continuacioacuten en la Tabla IV10 y la Tabla IV11 se recogen los resultados obtenidos en el anaacutelisis de las
muestras comerciales Los datos obtenidos corresponden en todos los casos al uso de patrones de calibracioacuten
como teacutecnica de cuantificacioacuten
Tabla IV10 Concentracioacuten (ngmL) encontradas en las diferentes muestras de vino blanco comercial analizadas mediante
SPE-UPLC-MSMS n=2 reacuteplicas y al final el sumatorio de las concentraciones encontradas
Compuesto W1 W2 W3 W4 W5 W6 W7
AME 04 nd nd nd 41 nd nd
BEN nd nd 14 nd nd nd nd
BOS 84 102 520 54 197 nd nd
CAR nd 115 56 nd nd nd nd
CYP 08 59 112 nd nd 26 nd
43
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Compuesto W1 W2 W3 W4 W5 W6 W7
DIM 14 84 400 09 32 50 nd
FEH 85 809 639 15 187 nd nd
FLU 11 05 92 nd 77 32 nd
IMI nd 136 88 29 nd nd 69
IPR 30 749 1144 14 nd nd nd
MAN nd nd nd nd nd 30 nd
MET 04 273 494 63 nd nd 172
MYC 09 nd 35 nd nd nd nd
PYM 15 469 584 08 24 35 nd
TEC 11 nd 58 nd nd nd nd
TRI nd 67 61 nd nd nd nd
sumconcentracioacuten
(ngmL) 274 2868 4358 192 558 173 862
nd no detectado
Tabla IV11 Concentracioacuten (ngmL) encontradas en las diferentes muestras de vino tinto comercial analizadas mediante
SPE-UPLC-MSMS n= 2 reacuteplicas y al final el sumatorio de las concentraciones encontradas
Compuesto R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9
AME nd nd nd 30 nd nd nd nd 16
BEN nd nd nd 07 nd nd nd nd nd
BOS nd 55 21 196 nd nd nd 73 21
CAR nd nd 04 17 249 20 nd nd nd
CYP 34 08 02 22 nd 136 nd 85 nd
DIM nd 33 nd 52 233 46 nd 61 23
FEH nd nd nd 1070 nd 10 nd 1307 14
FLU nd nd nd 20 nd nd nd nd nd
IPR 16 nd nd 17 nd 22 nd nd nd
MAN nd nd nd 17 nd nd nd 20 nd
MET 126 nd nd 14 55 313 30 44 39
MYC nd nd nd 05 nd 32 nd nd nd
PYM 19 nd 03 185 49 281 nd 24 nd
TEC 25 06 39 29 nd nd nd 21 20
TEF nd 01 12 nd nd nd nd nd nd
sumconcentracioacuten
(ngmL) 220 48 81 1681 586 860 30 1635 133
nd no detectado 44
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
En los resultados de los anaacutelisis podemos observar que en ninguna de las muestras comerciales de vino blanco
aparecieron los siguientes compuestos FEP PEN PYC TEF TBZ THI-M y TME y en los vinos tintos
comerciales no aparece a ninguna concentracioacuten FEP IMI PEN PYC TBZ TME THI-M y TRI No se
detectaron para dichas muestras de vino a niveles superiores a los LOQs del meacutetodo propuesto
Cuando se detecta un compuesto positivo se compara el pico cromatograacutefico del compuesto con el de un patroacuten
verificando la coincidencia del tiempo de retencioacuten (maacutexima diferencia 01 min) y la relacioacuten entre transiciones
(maacutexima diferencia 30 ) En la Figura IV6 y la Figura IV7 se muestran los cromatogramas para el compuesto
CYP obtenido en condiciones oacuteptimas para la muestra de vino blanco W6 y en un patroacuten de 5 ngmL
respectivamente En este caso el intervalo de tolerancia para la relacioacuten de intensidad entre transiciones es
IP2IP1=061plusmn018
Figura IV6 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el CYP en la muestra W6 (26 ngmL) Transicioacuten
superior 226gt93 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 226gt108 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades IP2IP1= 066
Figura IV7 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el CYP en un patroacuten de 5 ngmL Transicioacuten
superior 226gt93 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 226gt108 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades IP2IP1=061plusmn018
45
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Otro ejemplo de compuesto positivo en abundantes muestras comerciales de estudio es el Metalaxyl positivo con
una concentracioacuten de 04 ngmL en el vino con referencia W1 (Figura IV8) y positivo con una concentracioacuten de
313 ngmL en el vino con referencia R6 (Figura IV9) Ambas se comparan con el cromatograma de un patroacuten
de Metalaxyl de 1 ngmL (Figura IV10) El grado de concordancia en los tiempos de retencioacuten y la relacioacuten de
intensidades entre transiciones es satisfactorio
Figura IV8 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el MET en la muestra W1 (04 ngmL) Transicioacuten
superior 2801gt2201 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 2801gt1921 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades
IP2IP1=056
Figura IV9 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el MET en la muestra R6 (313 ngmL) Transicioacuten
superior 2801gt2201 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 2801gt1921 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades IP2IP1=
056
46
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Figura IV10 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el MET en un patroacuten de 1 ngmL Transicioacuten
superior 2801gt2201 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 2801gt1921 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades
IP2IP1=057plusmn017
Es de destacar que aunque se detectaron bastantes pesticidas en las diferentes muestras de vino comerciales pero
en ninguacuten caso superaron el 10 de los LMRs permitidos en uvas tal y como se recomienda ya que todaviacutea no
existen LMRs para vino en la legislacioacuten vigente No obstante el nivel total de concentracioacuten (sumatorio de
concentraciones Tabla IV10 y Tabla VI11) es significativo para varias muestras tanto de vinos blancos (W2 y
W3) como tintos (R4 y R8)
47
Capiacutetulo V Conclusiones
CAPIacuteTULO V CONCLUSIONES
En este trabajo se ha estudiado un meacutetodo para la cuantificacioacuten de pesticidas concretamente veinte fungicidas y
tres insecticidas en vino blanco y tinto En la etapa de preparacioacuten de muestra se optimizoacute la extraccioacuten en fase
soacutelida (SPE) utilizando cartuchos OASIS HLB (200 mg) compuestos por divinilbenceno-N-vinilpirrolidona
(DVB-VP) como adsorbente Como teacutecnica de determinacioacuten se utilizoacute cromatografiacutea de liacutequidos con una
interfase de electroespray acoplada a espectrometriacutea de masas (UPLC-ESI-MSMS)
Las conclusiones generales obtenidas a partir de los resultados de este proyecto relativo a la determinacioacuten de
fitosanitarios en vino son
Ante los problemas de retencioacuten que presentan los cartuchos OASIS MAX (150 mg) para algunos
compuestos los cartuchos OASIS HLB (200 mg) junto con la combinacioacuten metanolacetonitrilo (2080)
como disolvente de elucioacuten son elegidos como mejor opcioacuten en la extraccioacuten en fase soacutelida de pesticidas
en muestras con matrices complejas como es el caso del vino Asiacute se consigue la retencioacuten selectiva de
componentes de la matriz y proporciona extractos con menor porcentaje de interferencias
El meacutetodo estudiado y optimizado se puede aplicar tanto a vinos blancos como a vinos tintos procesados
a partir de distintas variedades de uvas
Los liacutemites de cuantificacioacuten (LOQs) del estudio se situacutean la mayoriacutea por debajo de 10 ngmL excepto
en el caso de THI-M que asciende al valor de 20 ngmL El rango de respuesta lineal abarca hasta 200
ngmL y el tiempo de anaacutelisis ha sido de solo 10 minutos por muestra
En todas las muestras de vino (blancos y tintos) comerciales analizadas se han detectado la presencia de
varios pesticidas sin embargo todas las concentraciones encontradas se encuentran por debajo del 10
de los LMRs fijados en uvas tal y como recomienda la legislacioacuten por lo que no se considera
preocupante
48
Capiacutetulo V Conclusioacutens
CAPIacuteTULO V CONCLUSIOacuteNS
Neste traballo estudouse un meacutetodo para a cuantificacioacuten de pesticidas en particular vinte funxicidas e tres
insecticidas en vintildeo branco e maacuteis tinto No paso da preparacioacuten da mostra optimizouse a extraccioacuten en fase
soacutelida (SPE) empregando cartuchos OASIS HLB (200 mg) compostos por divinilbenceno-N-pirrolidona (DVB-
VP) como adsorbente Para a teacutecnica de determinacioacuten utilizouse cromatografiacutea de liacutequidos con unha interfase de
electroespray acoplada a espectrometriacutea de masas (UPLC-ESI-MSMS)
As conclusioacutens xerais a obtidas a partir dos resultados deste proxecto relativo aacute determinacioacuten de pesticidas en
vintildeo son
Ante os problemas de retencioacuten que mostraban os cartuchos OASIS MAX (150 mg) para alguacuten
compostos os cartuchos OASIS HLB (200 mg) en conxunto coa mistura metanolacetonitrilo (2080)
como disolvente de elucioacuten son elexidos como mellor opcioacuten na extraccioacuten en fase soacutelida de pesticidas
en mostras con matrices complexas como eacute o caso do vintildeo Asiacute eacute conseguida a retencioacuten selectiva de
componentes da matriz e proporciona extractos con menos porcentaxe de interferencias
O meacutetodo estudado e optimizado poacutedese aplicar tanto a vintildeos brancos coma tintos procesados a partir de
diferentes variedades de uvas
Os liacutemites de cuantificacioacuten do estudo (LOQs) son maacuteis baixos de 10 ngmL agaacutes no caso do THI-M
que ascende ao valor de 20 ngmL O rango de resposta lineal cobre ata 200 ngmL e o tempo de anaacutelise
foi de soacute 10 minuacutetos por mostra
En todas as mostras de vintildeo (brancos e tintos) comercial analizadas detectouse a presenza de varios
pesticidas maacuteis poreacuten todas as concentracioacutens atopadas son inferiores ao 10 dos LMR fixados en uvas
tal e como recomenda a lexislacioacuten polo que non se considera preocupante
49
Chapter V Conclusions
CHAPTER V CONCLUSIONS
In this work we have studied a method for the quantification of pesticides specifically twenty fungicides and
three insecticides in white and red wine In the sample preparation step the solid phase extraction was optimized
using cartridges OASIS HLB (200 mg) containing divinylbenzene-N-vinylpyrrolidone (DVB-VP) as adsorbent
As determination technique ultraperformance liquid chromatography was used with an electrospray interface
coupled to mass spectrometry (UPLC-ESI-MS7MS)
The general conclusions drawn from the results of this project concerning the determination of pesticides in wine
are
Due to the retention problems presented by the OASIS MAX sorbent (150 mg) for some compounds of
this project the cartridges OASIS HLB (200 mg) together with the methanolacetonitrile (2080) mixture
are chosen as the best option in the solid phase extraction of pesticides in samples with complex
matrices as is the case with the wine
The method studied and optimized can be applied to both white and red wines obtained from different
varieties of grapes
The limits of quantification (LOQs) were below 10 ngmL for most of the compounds except in the
case of THI-M with a LOQ of to 10 ngmL The linear response range covers up to 200 ngmL and the
analysis time was only 10 minutes per sample
In all commercial wine samples (white and red) analyzed the presence of several pesticides was
conformed however all the concentrations obtained are below 10 of the Maximum residue
levels(MRLs) fixed in grapes as recommended by legislation
50
VI Bibliografiacutea VI BIBLIOGRAFIacuteA [1] Ministerio de agricultura y pesca alimentacioacuten y medio ambiente mhttpwwwmapamagobesescalidad-y-evaluacion-ambientaltemasproductos-quimicosfitosanitarios (Acceso el diacutea 11052017) [2] httpwwwcricyteduarenciclopediaterminosProducFitohtm (Acceso el diacutea 11052017) [3] WERNER BALTES ldquoQuiacutemica de los alimentosrdquo Editorial Acribia SA 2007 Capiacutetulo 11 ldquoResiduos en los alimentosrdquo paacuteginas 206-217
[4] RLabrada JCCaseley CParker ldquoESTUDIO FAO PRODUCCIOacuteN Y PROTECCIOacuteN VEGETAL 120rdquo Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentacioacuten Roma 1996 ISSN 1014- Capiacutetulo 10 Herbicidas httpwwwfaoorgdocrepT1147St1147s00htmContents (Acceso el diacutea 12052017)
[5] Taberner Palou Andreu Cirujeda Ranzenberger Alicia Zaragoza Larios Carlos ldquoManejo de poblaciones de malezas resistentes a herbicidasrdquo (FAO Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura) 100 preguntas sobre resistencia PDF sacado de httpwwwfaoorg3a-a1422spdf (Acceso el diacutea 12052017) [6] BISSET Juan A Uso correcto de insecticidas control de la resistencia Revista Cubana de Medicina Tropical 2002 vol 54 no 3 p 202-219 [7] DEVINE Gregor J EZA Dominique Ogusuku Elena FURLONGMichael J Uso de insecticidas contexto y consecuencias ecoloacutegicas Revista peruana de medicina experimental y Salud Puacuteblica 2008 vol 25 no 1 p 74-100 [8] Ministerio de agricultura y ganaderiacutea (proteccioacuten agropecuaria servicio de diagnoacutestico fitosanitario) de costa Rica httpwwwmaggocrbibliotecavirtualH20-5054pdf (Acceso el diacutea 11052017) [9] GEPP V MONDINO P Control quiacutemico 2011 PDF obtenido de httpwwwpvfagroeduuyfitopatodocscursosfitopatoMaterialesGuiasC-QUIMICOpdf (Acceso el diacutea 772017) [10] ROSSLENBROICH Hans-Juergen STUEBLER Dietrich Botrytis cinereamdashhistory of chemical control and novel fungicides for its management Crop Protection 2000 vol 19 no 8 p 557-561 [11] Figura 11 httpwwwvitiviniculturanetbotritis-o-podredumbre-gris-botrytis-cinerea-pershtml (Acceso el diacutea 12052017) [12] CAMPBELL Paul BENDEK Carlos LATORRE Bernardo A Riesgo de oiacutedio (Erysiphe necator) de la vid en relacioacuten con el desarrollo de los racimos Ciencia e investigacioacuten agraria 2007 vol 34 no 1 p 5-11 [13] ldquoCoacutemo combatir el oiacutedio de la vidrdquo Jose Javier Peacuterez de Obanos Castillo PDF sacado de httpswwwnavarraesNRrdonlyres05E65D9B-D1A2-4EAD-9A63-AFF1D3215552135109Comocombatireloidiodelavidpdf (Acceso el diacutea 12052017) [14] Imagen 12 sacadas las 3 de httpwwwvitiviniculturanetoidio-de-la-vidhtml (Acceso el diacutea 12052017) [15] BARRIOS Gonccedilal REYES Joan Modelizacioacuten del Mildiu de la Vid 2004 httpwwwruralcatnetmigracio_resources617683_mildiusPDF (Acceso el diacutea 12052017) [16] Imaacutegenes sacadas de httpwwwvitiviniculturanetmildiu-de-la-vid-enfermedades-vinahtml (Acceso el diacutea 13052017) [17] HUQ Mainul MEISNER Craig DASGUPTA Susmita Health effects and pesticide perception as determinants of pesticide use evidence from Bangladesh httpagrisfaoorgagris-searchsearchdorecordID=US2012411738 (Acceso el diacutea 13052017)
51
IV Bibliografiacutea [18] BADII Mohammad H LANDEROS Jeroacutenimo Plaguicidas que afectan a la salud humana y la sustentabilidad CULCyT 2015 no 19 Revista vista en httpopenjournaluacjmxojsindexphpculcytarticleview454 (Acceso el diacutea 772017) [19] OLEA Nicolaacutes FERNAacuteNDEZ Mariana F Plaguicidas persistentes En Congreso Implementacioacuten del Convenio de Contaminantes Orgaacutenicos Persistentes Madrid 2001 p 26-27 [20] httpwwwfaoorgfao-who-codexalimentariusabout-codexes (Acceso el diacutea 14052017) [21] httpeceuropaeufoodplantpesticidesmax_residue_levels_en (Acceso el diacutea 14052017 [22] ORDONtildeEZ Juan A Cambero Rodriacuteguez MI Fernaacutendez Aacutelvarez L Garciacutea Sanz ML Garciacutea de Fernando Minguilloacuten GD de la Hoz Perales L Selgas Cortecero MD Tecnologiacutea de los alimentos Volumen 1 Componentes de los Alimentos y Procesos Siacutentesis Madrid 1998paacutegs 349-351 [23] CELA Rafael Casais Maria del Carmen Lorenzo Rosa Antonia Teacutecnicas de separacioacuten en quiacutemica analiacutetica Siacutentesis 2002 Capiacutetulo 11 Extraccioacuten y lixiviacioacuten por disolvente (paacutegs206-260) [24] CANTWELL Frederick F LOSIER Manon Liquidmdashliquid extraction Comprehensive Analytical Chemistry 2002 vol 37 p 297-340 [25] Imagen de LLE sacada de httpprocesosbiowikispacescomExtracciC3B3n+liquido-liquido (Acceso el diacutea 15052017) [26] HENNION Marie-Claire Solid-phase extraction method development sorbents and coupling with liquid chromatography Journal of Chromatography A 1999 vol 856 no 1 p 3-54 [27] CELA Rafael Casais Maria del Carmen Lorenzo Rosa Antonia Teacutecnicas de separacioacuten en quiacutemica analiacutetica Siacutentesis 2002 Capiacutetulo 16 Teacutecnicas de adsorcioacuten y absorcioacuten en la preparacioacuten de muestras Extraccioacuten y microextraccioacuten en fase soacutelida (paacutegs520-555) [28] Imagen spe sacada httptoxicocbblogspotcomes201310las-intoxicaciones-con-farmacoshtml (Acceso el diacutea 15052017) [29] Chaacutefer Pericaacutes Consuelo Acoplamiento microextraccioacuten en fase soacutelida-cromatografiacutea (2006) httprodericuveshandle1055014940 (Acceso el diacutea 16052017) [30] Imagen SPME httpwwwscieloorgcoscielophpscript=sci_arttextamppid=S0122-53832002000100005 (Acceso el diacutea 16052017) [31] MONTES GOYANES Rosa Mariacutea Avances en teacutecnicas de microextraccioacuten para la determinacioacuten de compuestos traza en muestras medioambientales y alimentarias Teacutesis doctoral Noviembre 2009 (Paacutegs 34-55) [32] LEHOTAY Steven J Ae Son Kyung KwonHyeyoung Koesukwiwat Urairat Fu Wusheng Mastovska Katerina Hoh Eunha Leepipatpiboon Natchanun Comparison of QuEChERS sample preparation methods for the analysis of pesticide residues in fruits and vegetables Journal of Chromatography A 2010 vol 1217 no 16 p 2548-2560 [33] Imagen QueChERS httpswwwresearchgatenetpublication279221361_QuEChERS_A_Sample_Preparation_for_Extraction_of_Carbaryl_from_Rat_Feces (Acceso el diacutea 16052017) [34] STASHENKO Elena E MARTIacuteNEZ Jairo Reneacute Preparacioacuten de la muestra un paso crucial para el anaacutelisis por GC-MS Uma publicaccedilatildeo trimestral do Instituto Internacional de Cromatografia (IIC) Ciecircncia Cromatograacutefica 2011 vol 3 no 1 [35] Imagen GC-MS httpsorgspectroscopyintblogspotcomes201411gas-chromatography-mass-spectrometry-gchtml (Acceso el diacutea 17052017) [36] httpwwwactlabscompageaspxmenu=65ampapp=221ampcat1=534amptp=2amplk=no (Acceso el diacutea 17052017)
52
IV Bibliografiacutea [37] Quintela O Cruz A Concheiro M De Castro A amp Loacutepez-Rivadulla M (2005) Metodologiacutea LC-MS Aspectos generales de la teacutecnica y sus aplicaciones en el campo de la toxicologiacutea Rev Toxicol 22 paacutegs7-14 [38] Imagen LC-MS httpsuploadwikimediaorgwikipediaenff9Liquid_chromatography_tandem_Mass_spectrometry_diagrampng (visto 18052017) [39] Vargas de la Cruz Celia Bertha Adaptacioacuten de la Metodologiacutea Analiacutetica para la determinacioacuten de residuos de plaguicidas en frutas nativas de exportacioacuten mediante Uplc-MsMs (2012) Tesis obtenida en http20062146130handlecybertesis2331 (Acceso el diacutea 772017) [40] ROMERO GONZAacuteLEZ Roberto Fernaacutendez Moreno Joseacute Luis Plaza Bolantildeos Patricia Garrido Frenich Antonia Martiacutenez Vidal Joseacute Luis Empleo de la espectrometriacutea de masas como herramienta para la determinacioacuten de toacutexicos en alimentos hacia la seguridad alimentaria Revista Espantildeola de salud puacuteblica 2007 vol 81 no 5 p 461-474 [41] PAYAacute Andrus Fundamento y Funciones de la Espectrometriacutea de Masas Universidad de Valencia Espantildea 2006 httpmuraluvescaloan (Acceso el diacutea 19052017) [42] Imagen MS sacada de httpsesslidesharenetMaYaTorrezespectrometria-demasas (Acceso el diacutea 21052017) [43] ECONOMOU Anastasios Botitsi Helen Antoniou Spyros Tsipi Despina Determination of multi-class pesticides in wines by solid-phase extraction and liquid chromatography-tandem mass spectrometry Journal of Chromatography A 2009 vol 1216 no 31 p 5856-5867 [44] FONTANA A R Rodriacuteguez I Ramil M Altamirano JC Cela R Liquid chromatography time-of-flight mass spectrometry following sorptive microextraction for the determination of fungicide residues in wine Analytical and bioanalytical chemistry 2011 vol 401 no 2 p 767-775 [45] PELAJIĆ Maja G Peček DM Pavlović DV Čepo Novel multiresidue method for determination of pesticides in red wine using gas chromatographyndashmass spectrometry and solid phase extraction Food chemistry 2016 vol 200 p 98-106 [46] Ignaz J Buerge Juumlrgen Krauss Rociacuteo Loacutepez-Cabeza Werner Siegfried Michael Stuumlssi Felix E Wettstein Thomas Poiger Stereoselective Metabolism of the Sterol Biosynthesis Inhibitor Fungicides Fenpropidin Fenpropimorph and Spiroxamine in Grapes Sugar Beets and Wheat Journal of Agricultural and Food Chemistry 2016 vol 64 no 26 p 5301-5309 [47] M Hu X Liu F Dong J Xu S Li H Xu Y Zheng Determination of ametoctradin residue in fruits and vegetables by modified quick easy cheap effective rugged and safe method using ultra-performance liquid chromatographytandem mass spectrometry Food chemistry 2015 vol 175 p 395-400 [48] WALORCZYK Stanisław DROŻDŻYŃSKI Dariusz GNUSOWSKI Bogusław Multiresidue determination of 160 pesticides in wines employing mixed-mode dispersive-solid phase extraction and gas chromatographyndashtandem mass spectrometry Talanta 2011 vol 85 no 4 p 1856-1870 [49] Tianyang Guo Pingping Fang Juanjuan Jiang Feng Zhan Wei Yong Jiahui Liu YiYang Dong Rapid screening and quantification of residual pesticides and illegal adulterants in red wine by direct analysis in real time mass spectrometry Journal of Chromatography A 2016 vol 1471 p 27-3 [50] GONZAacuteLEZ-RODRIacuteGUEZ R M CANCHO-GRANDE B SIMAL-GAacuteNDARA J Decay of fungicide residues during vinification of white grapes harvested after the application of some new active substances against downy mildew Food chemistry 2011 vol 125 no 2 p 549-560 [51] CARPINTEIRO I Ramil M Rodriacuteguez I Cela R Determination of fungicides in wine by mixed-mode solid phase extraction and liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry Journal of Chromatography A 2010 vol 1217 no 48 p 7484-7492
53
Capitulo I Introduccioacuten
CAPIacuteTULO I INTRODUCCIOacuteN
1 FITOSANITARIOS
11 Tipos de fitosanitarios empleados en viticultura
De acuerdo con el Ministerio de Agricultura y Pesca Alimentacioacuten y Medio Ambiente los fitosanitarios se definen
como una o varias sustancias activas u otros ingredientes conformando una mezcla con el fin de proteger los
productos de origen vegetal de organismos nocivos tanto de tipo vegetal como animal que conforman plagas
Dentro de estos fitosanitarios tambieacuten se encuentran las sustancias que destruyen regulan o inhiben la
germinacioacuten de las plantas pero no se contemplan dentro de este grupo vacunas medicamentos y antibioacuteticos
para uso humano o veterinario o agentes utilizados en el control bioloacutegico Los productos fitosanitarios ayudan a
asegurar una buena calidad en los alimentos asiacute como contribuyen al aumento de los rendimientos en la
agricultura [1]
Seguacuten la OMS (Organizacioacuten Mundial de la Salud) los fitosanitarios se pueden clasificar atendiendo a los
organismos a los que esteacuten destinados siendo estos insectos (insecticidas) aacutecaros (acaricidas) moluscos
(molusquicidas) roedores (rodenticidas o raticidas) hongos (fungicidas) gusanos y larvas (nematicidas) malas
hierbas (herbicidas) bacterias (antibioacuteticos pero sin comprender los de uso humano y bactericidas) y otras formas
de vida perjudiciales para la salud puacuteblica y tambieacuten para la agricultura consideradas como plagas animales o
vegetales que puedan ser generadas durante la produccioacuten almacenamiento transporte distribucioacuten y elaboracioacuten
de productos agriacutecolas y sus derivados Actualmente no se puede pensar en un cultivo racional sin el uso de alguacuten
tipo de pesticida ya que la peacuterdida de cosechas en todo el mundo debido a causa de insectos enfermedades de las
plantas y malas hierbas es equivalente a un tercio de la produccioacuten total [2] [3]
Para el estudio de los productos de fitosanitarios en vino nos centraremos solamente en los tres tipos maacutes
importantes en eacuteste aacuterea herbicidas insecticidas y sobre todo fungicidas
Los herbicidas son sustancias destinadas a destruir las malas hierbas cuyo meacutetodo de accioacuten es la interferencia
en los procesos bioquiacutemicos como la fotosiacutentesis que tienen lugar en el sistema vivo de eacutestas Generalmente se
aplican en solucioacuten o suspensioacuten acuosa en forma de nube de pequentildeas gotas dirigidas hacia el objetivo de la
aplicacioacuten Los herbicidas ofrecen los medios maacutes efectivos para el control de las plagas siendo en los paiacuteses
industrializados aplicados sobre el 85-100 de todos los cultivos principales Este tipo de sustancias son
propensas a la descomposicioacuten por microbios plantas y animales y no son comunes los problemas de residuos de
herbicidas si se utilizan de acuerdo a las instrucciones de las etiquetas [4] A pesar de todos los beneficios que nos
aportan un mal uso de estos puede convertirse en un serio problema ya que toda sustancia quiacutemica usada en
3
Capiacutetulo I Introduccioacuten
agricultura puede provocar un efecto negativo en el ambiente si es utilizada en altas dosis El uso prolongado de
un mismo herbicida puede causar problemas de resistencia de malezas fenoacutemeno que consiste en la aparicioacuten de
biotipos tolerantes de una especie la cual anteriormente era controlada por el herbicida [5]
Por otro lado los insecticidas son fitosanitarios destinados a controlar el ataque de insectos y para eso existen
distintos caminos a traveacutes de los que pueden actuar siendo envenenamiento por contacto en doacutende el insecticida
penetra a traveacutes de la cutiacutecula del insecto hasta alcanzar el sitio activo envenenamiento oral en doacutende el
insecticida es ingerido y absorbido a traveacutes del intestino o tambieacuten por fumigaciones en doacutende el insecticida
penetra en el cuerpo del insecto a traveacutes de los espiraacuteculos del sistema respiratorio Pero al igual que pasa con los
herbicidas los insectos tambieacuten desarrollan resistencia a los insecticidas debido al contacto continuo con estos
Esta resistencia puede ser expresada por varios caminos que el insecto no entre en contacto con la deposicioacuten del
insecticida que se modifique la composicioacuten del exoesqueleto inhibiendo asiacute la penetracioacuten del insecticida la
modificacioacuten del sitio activo para el fitosanitario reduciendo la sensibilidad a la forma activa del insecticida o que
la viacutea metaboacutelica del insecto se modifique negando el metabolismo del compuesto aplicado en su forma toacutexica
[6] Aunque por lo general otros aspectos de la agricultura moderna tienen un mayor impacto en el medio
ambiente los insecticidas se encuentran entre las herramientas agriacutecolas que estaacuten maacutes asociadas con el dantildeo
ambiental Su objetivo especiacutefico es matar a plagas de insectos por lo que puede que tenga un impacto letal en
organismos que no son su objetivo [7]
Por uacuteltimo los fungicidas estaacuten destinados tanto a combatir las plagas de hongos como a combatir las
enfermedades fungosas de las plantas ya sea matando retrasando el desarrollo o inhibiendo la reproduccioacuten de
los hongos Los fungicidas en general se dividen atendiendo al modo de accioacuten de eacutestos en fungicidas de
contacto fungicidas penetrantes o fungicidas sistemaacuteticos
Los fungicidas de contacto protegen uacutenicamente el sitio de aplicacioacuten contra las plagas quedando en el exterior de
la planta de eacutesta manera sin penetrar en el tejido vegetal forman una peliacutecula protectora Cuando alguna espora
de un hongo llega a su superficie se encuentra con esa peliacutecula que le impide penetrar o en su defecto germinar
En el caso de que atraviesen el tejido vegetal bien sea por una alta dosis o por una rotura en las paredes de la
planta se convierten en un producto toacutexico para ella llegando a quemarla
Otro tipo de fungicidas los fungicidas penetrantes como su nombre indica se introducen en el tejido vegetal y
una vez dentro cuentan con muy poca movilidad es decir no circulan por los vasos conductores Al tener la
capacidad de entrar en la planta pueden combatir a los hongos que ya se encuentren dentro de eacutesta pero no
pueden ser toacutexicos para ella porque de lo contrario la dantildeariacutean
Por uacuteltimo nos encontramos con los fungicidas sistemaacuteticos Este tipo de fungicidas actuacutean protegiendo a la
planta contra las plagas en distintas zonas por transfusioacuten del fitosanitario dentro de la misma Esto sucede porque
penetran en el tejido vegetal y circulan por ella a traveacutes de la corriente de los vasos conductores
El meacutetodo de accioacuten de los fungicidas se basa en interferir en el metabolismo de los hongos ya sea por un
4
Capiacutetulo I Introduccioacuten
ataque en la produccioacuten de energiacutea la inhibicioacuten de la mitosis o inhibiendo la formacioacuten de quitina que se trata
del compuesto principal de la pared celular de los hongos y que por ende influye en la permeabilidad de la
membrana [8] [9]
Las enfermedades fuacutengicas fundamentales que nos podemos encontrar en las uvas de la vid son la botritis el oiacutedio
y el mildium las cuales pueden llegar a causar peacuterdidas importantes en viticultura
La enfermedad de la botritis tambieacuten llamada moho gris estaacute causada
por el hongo Botrytis cineacuterea y se puede encontrar en todo el mundo
infectando a un amplio nuacutemero de plantas Se trata de uno de los
patoacutegenos fuacutengicos maacutes interesantes debido a que puede vivir tanto
de forma patoloacutegica produciendo la enfermedad como
alimentaacutendose de materia orgaacutenica en descomposicioacuten La accioacuten
fuacutengica del hongo se lleva a cabo cuando las uvas empiezan a
acumular azuacutecar pudiendo ser muy devastador en algunas
condiciones sobre todo en cultivos empapados por la lluvia o
localizados en un ambiente huacutemedo y con viento produciendo la peacuterdida de los racimos de uvas que son
infectados O por el contrario en otro tipo de condiciones ambientales de sequedad despueacutes de unas
condiciones de humedad dicho hongo le confiere beneficios a ciertos tipos de vino blanco [10]
El oiacutedio es una enfermedad causada por la especie Uncinula necator la cual afecta tanto al rendimiento como a la
calidad de las uvas y altera las cualidades de sus derivados vino mosto etc El proceso de infeccioacuten del oiacutedio
tiene lugar siguiendo un ciclo de reproduccioacuten en las distintas estaciones del antildeo El riesgo de infeccioacuten viene
dado en funcioacuten de la temperatura oacuteptima entre 25-30ordmC humedad del ambiente en el que se encuentre y
tambieacuten en funcioacuten de la temporada siendo maacutes resistentes los racimos de uvas a medida que van madurando El
hongo afecta a todas las parte de la vid hojas tallo y racimos las cuales presentan siacutentomas distintos Las hojas se
vuelven de un color amarillento y se cubren de un polvo fino blanco grisaacuteceo En el tallo el oiacutedio se manifiesta a
traveacutes de manchas difuminadas con coloracioacuten inicial verde oscuro volvieacutendose cada vez maacutes oscuras al final y si
ocurre un ataque fuerte puede desembocar en que el tallo se acabe secando y por consiguiente disminuye la
produccioacuten Pero el ataque maacutes fuerte se produce en los racimos empezando por cubrirse del polvillo blanco
grisaacuteceo y continuando con que el oiacutedio detiene el crecimiento de la piel de la uva con la consecuencia que la uva
se agrieta Esta enfermedad produce unos dantildeos directos en la cantidad y calidad de la cosecha y si no se toman
medidas de prevencioacuten las peacuterdidas pueden llegar a ser totales [12] [13]
Figura I1Enfermedad de botritis en un racimo de uvas [11]
Figura I2 Enfermedad del oiacutedio en hoja tallo y racimo de izquierda a derecha [14] 5
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Por uacuteltimo el mildium o mildiu es una enfermedad producida por el hongo Plasmopara vitiacutecola considerada como
una de las peores enfermedades del cultivo siempre y cuando esteacuten en las condiciones ambientales favorables para
su desarrollo Dichas condiciones oacuteptimas para la propagacioacuten de la enfermedad son las lluvias al amanecer o al
anochecer con una temperatura en un rango de 20-25 ordmC El periacuteodo sensible de la vegetacioacuten de la vintildea es a
partir de una longitud de 10 cm en adelante siendo maacutexima en el periacuteodo de mayor crecimiento de la planta Por
otro lado la sensibilidad del racimo empieza desde su formacioacuten hasta que las uvas al florecer alcanzan el tamantildeo
similar al de un guisante pero de ahiacute en adelante la sensibilidad se ve disminuida Dicho hongo cuenta con un
ciclo reproductivo abarcando varias fases desde la fase de contaminacioacuten siendo el principio hasta la fase de pro-
pagacioacuten Afecta a todos los oacuterganos verdes de la vid y sus siacutentomas son variados en las distintas zonas de eacutesta
En las caras de las hojas aparecen unas manchas amarillentas en los racimos cuando se aproxima la floracioacuten los
que se encuentran infectados se curvan secaacutendose y cubrieacutendose de una pelusa blanquecina y cuando alcanzan el
tamantildeo de un guisante en adelante las uvas de los racimos afectados se van oscureciendo y secando sin que apa-
rezca la fructificacioacuten del hongo ademaacutes de oscurecerse el tallo [15]
12 Estructura propiedades fiacutesico-quiacutemicas y clasificacioacuten
En este trabajo nos centramos en estudiar los residuos de veintitreacutes fitosanitarios tipo fungicida principalmente
aunque tambieacuten alguacuten residuo tipo insecticida Las caracteriacutesticas maacutes importantes de dichos compuestos seraacuten
recogidas en la Tabla I1 que incluye estructuras clasificacioacuten (se ha usado el acroacutenimo ldquoFrdquo en caso de ser
fungicidas e ldquoIrdquo en caso de ser insecticidas) y propiedades fiacutesico-quiacutemicas Las propiedades fiacutesico-quiacutemicas que
pueden resultar maacutes relevantes para este estudio son el pKa ya que la mayoriacutea se trata de compuestos baacutesicos
aunque se encuentre alguacuten aacutecido deacutebil como es por ejemplo el Fenhexamid y Kow describiendo el coeficiente de
reparto entre octanolagua empleado para medir el grado de hidrofobidad que proporciona una estimacioacuten de
la posible distribucioacuten del analito entre materia orgaacutenica y agua
Figura I3 Enfermedad del mildium en la imagen de la izquierda coacutemo afecta a las hojas imagen central coacutemo
afecta a los racimos cuaacutendo estaacuten infectados al comenzar la floracioacuten y en la imagen de la derecha coacutemo afecta a
los racimos en doacutende las uvas tienen tamantildeo mayor al de un guisante [16]
6
Compuesto Estructura Nombre sistemaacutetico Foacutermula CAS Uso ordflog (kow) pKa
Ametoctradin
(AME)
5-ethyl-6-
octyl[124]triazolo[15-
a]pyrimidin-7-amine
C15H25N5 865318-97-4 F 440 278
Benalaxyl
(BEN)
Methyl-N-(phenylacetyl)-N-
(26-xylyl)-D-alaninate C20H23NO3 98243-83-5 F 368 -
Boscalid
(BOS)
2-Chloro-N-(4rsquo-
chlorobiphenyl-2-yl)-
nicotinamide
C18H12Cl2N2O 188425-85-6 F 296 -
Carbendazim
(CAR)
Methyl 2-benzimidazole
carbamate C9H9N3O2 10605-21-7 F 148 420
Cyprodinil
(CYP)
4-Cyclopropyl-6-methyl-N-
phenilpyrimidin-2-amine C14H15N3 121552-61-2 F 400 309
Dimethomorph
(DIM)
(2E)-3-(4-chlorophenyl)-3-(34-
dimethoxyphenyl)-1-
(morpholin-4-yl)prop-2-en-1-
one
C21H22ClNO4 110488-70-5 F 268 -13
Fenhexamid
(FEH)
N-(23-dichloro-4-
hydroxyphenyl)-1-methyl-
cyclohexanecarboxamide
C14H17Cl2NO2 126833-17-8 F 351 73
Fenpropidin
(FEP)
1-[(RS)-3-(4-tert-butylphenyl)-
2-methylpropyl]piperidine C19H31N 67306-00-7 F 26 1013
Fluopicolid
(FLU)
26-dichloro-N-[3-chloro-5-
(trifluoromethyl)-2-
pyridylmethyl]benzamide
C14H8Cl3F3N2O 239110-15-7 F 29 -
Imidacloprid
(IMI)
(E)-1-(6-chloro-3-
pyridylmethyl)-N-
nitroimidazolidin-2-
ylideneamine
C9H10ClN5O2 138261-41-3 I 057 -
Iprovalicarb
(IPR)
Isopropyl (S)-2-methyl-1-[1-(p-
tolyl)ethylcarbamoyl]propyl-
carbamate
C18H28N2O3 140923-17-7 F 32 -
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Tabla I1 Estructura clasificacioacuten y propiedades fiacutesico-quiacutemicas de intereacutes para los analitos de estudio
7
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Compuesto Estructura Nombre sistemaacutetico Foacutermula CAS Uso ordflog (kow) pKa
Mandipropamid
(MAN)
2-(4-chlorophenyl)-N-[3-
methoxy-4-(2-
propynyloxy)phenethyl]-2-(2-
propynyloxy)acetamide
C23H22ClNO4 374726-62-2 F 32 -
Metalaxyl
(MET)
N-(26-dimethylphenyl)-N-
(methoxyacetyl)-DL-alanine
methyl ester
C15H21NO4 57837-19-1 F 175 000
Myclobutanil
(MYC)
2-(4-chlorophenyl)-2-(1H-
124-triazol-1-
ylmethyl)hexanentrile
C15H17ClN4 88671-89-0 F 289 230
Penconazol
(PEN)
1-[2-(24-
dichlorophenyl)pentyl]-1H-
124-triazole
C13H15Cl2N3 66246-88-6 F 372 151
Pyraclostrobin
(PYC)
Methyl2-[1-(4-chlorophenyl)-
1H-pyrazol-3-
yloxymethyl]phenylmetoxy-
carbamate
C19H18ClN3O4 175013-18-0 F 399 -
Pyrimethanil
(PYM)
4-6-dimethyl-N-phenyl-2-
pyrimidinamine C12H13N3 53112-28-0 F 284 352
Tebuconazol
(TEC)
1-(4-chlorophenyl)-44-
dimethyl-3-(1H-124-triazol-1-
ylmethyl)-3-pentanol
C16H22ClN3O 107534-96-3 F 370 500
Tebufenozid
(TEF)
35-dimethylbenzoic acid 1-
(11-dimethylethyl)-2-(4-
ethylbenzoyl)hidrazide
C22H28N2O2 112410-23-8 I 425 -
Thiabendazol
(TBZ)
2-(13-thiazol-4-yl)-1H-
benzimidazole C10H7N3S 148-79-8 F 239 473
Thiamethoxam
(TME)
3-[(2-chloro-5-
thiazolyl)methyl]tetrahydro-5-
methyl-N-nitro-4H-135-
oxadiazin-4-imine
C8H10ClN5O3S 153719-23-4 I -013 -
Thiophanate-
methyl
(THI-M)
DimethylNNrsquo-[12-
phenylenebis(azanediylcarbono
thioyl)] dicarbamate
C12H14N4O4S2 23564-05-8 F 145 728
Triadimenol
(TRI)
1-(4-chlorophenoxy)-33-
dimethyl-1-(1H-124-triazol-1-
yl)-2-butanol
C14H18ClN3O2 55219-65-3 F 318
-
ordf Valores para la forma neutra 8
Capiacutetulo I Introduccioacuten
13 Toxicidad de los pesticidas
En los uacuteltimos antildeos el uso indiscriminado de pesticidas de siacutentesis en agricultura ha creado graves problemas de
salud y medioambientales ya que su uso debido al aumento de la poblacioacuten y por consiguiente de la actividad
agraria se ha incrementado considerablemente Durante las tres uacuteltimas deacutecadas una estimacioacuten dada por la
Organizacioacuten Mundial de la Salud y el Programa de las Naciones Unidas para el Medio Ambiente revela que
aproximadamente cerca de 20000 personas al antildeo mueren generalmente agricultores por exposicioacuten continuada
a alguno de estos toacutexicos En la mayoriacutea de los casos los agricultores utilizan los pesticidas de forma que las
cantidades se desviacutean significativamente de las recomendadas ya que asocian cantidades maacutes altas con mayor
efectividad y velocidad de accioacuten El mal uso de dichos toacutexicos se ve en los signos presentes en los ecosistemas
afectados pudiendo llegar a ser perjudiciales para la salud humana Estos riesgos que causan tanto en la salud
como en el medioambiente pueden ser reducidos o en su defecto evitados mediante la educacioacuten sobre este tipo
de toacutexicos con el fin de frenar su uso excesivo y descontrolado [17]
Desde el punto de vista medioambiental los fitosanitarios empleados en un cultivo pueden persistir en los
distintos medios tierra aire o agua y afectar tanto a ecosistemas terrestres como acuaacuteticos En los sistemas
terrestres los suelos son contaminados mediante la aplicacioacuten del toacutexico de forma directa o como deposicioacuten del
resultado de una suspensioacuten aeacuterea Eacutestos pueden persistir desde varios diacuteas hasta varios antildeos ya que el suelo
retiene y moviliza el toacutexico despueacutes de su emisioacuten Los que persisten maacutes tiempo en el medioambiente tienen una
mayor probabilidad de interaccionar con otros elementos del sistema y si su vida media es mayor a la frecuencia
con la que se aplica el pesticida tienden a acumularse tanto en el suelo como en las especies que habitan en eacutel Por
otro lado el agua es contaminada por pesticidas bien por aplicacioacuten directa por estar presentes en las
precipitaciones de la atmoacutesfera o bien por la movilidad que tienen desde el suelo Tanto los pesticidas solubles
como los insolubles interaccionan con los ecosistemas acuaacuteticos los hidrosolubles persisten maacutes tiempo
solubilizados en agua mientras que los otros se asocian a los sedimentos y se concentran en las especies que
habitan el medio acuaacutetico [18]
Como consecuencia de la amplia distribucioacuten de los toacutexicos en aire suelo y agua se produce una acumulacioacuten de
ellos en los elementos que contribuyen a la alimentacioacuten humana ya que su amplio uso hace que el contacto con
los plaguicidas por parte de personas y animales sea inevitable La contaminacioacuten de los alimentos se puede
presentar por aplicacioacuten directa de los pesticidas el uso de eacutestos durante el manejo transporte y almacenamiento
de los productos comestibles o por su acumulacioacuten en la cadena troacutefica Son bioacumulables en el organismo
debido a su caraacutecter lipofiacutelico lo que les confiere una vida media en los tejidos larga La exposicioacuten a pesticidas
persistentes no tiene la misma repercusioacuten en cada uno de los individuos expuestos sino que se considera criacutetica la
exposicioacuten durante la etapas embrionaria fetal y primeros antildeos de vida en doacutende se transmite de madres a hijos
mediante la gestacioacuten y la lactancia como resultado de la acumulacioacuten en el tejido graso de la madre [19]
9
Capiacutetulo I Introduccioacuten
14 Legislacioacuten
El aumento del uso de fitosanitarios en actividades relacionadas con la produccioacuten de alimentos para consumo
humano o animal tambieacuten desembocoacute en una preocupacioacuten social debido a su toxicidad y bioacumulacioacuten En
respuesta la Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura (FAO) en colaboracioacuten
con la Organizacioacuten Mundial de la Salud (OMS) pusieron en marcha un programa Codex Alimentarius cuyo
objetivo a traveacutes de sus normas y coacutedigos de praacutecticas alimentarias internacionales es garantizar la calidad e
inocuidad de los alimentos que estaacuten al alcance de cualquier persona Con estas normas internacionales los
consumidores pueden confiar en la calidad de los alimentos independientemente de su origen geograacutefico [20]
Todos los alimentos destinados al consumo humano o animal en la Unioacuten Europea estaacuten sujetos a un liacutemite
maacuteximo de residuos de plaguicidas para la proteccioacuten de la salud humana y animal Actualmente en lo referente a
legislacioacuten para el control de la cantidad del toacutexico en la uva estaacute vigente el Reglamento 3962005 del Parlamento
Europeo y del Consejo de 23 de febrero de 2005 referido a la regulacioacuten de los liacutemites maacuteximos de residuos de
plaguicidas en alimentos y piensos de origen vegetal y animal El liacutemite maacuteximo de residuos (LMR) se define co-
mo el nivel maacutes alto de un residuo de un pesticida que se tolera de manera legal sobre los alimentos o piensos
cuando se aplican correctamente Las cantidades de residuos que se encuentren deben ser lo maacutes bajas posible
para garantizar la seguridad en la alimentacioacuten de los consumidores Dichos liacutemites maacuteximos de residuos estaacuten
fijados por la Comisioacuten Europea pudieacutendose encontrar en su base de datos LMR [21]
A continuacioacuten en la Tabla I2 se resumen los LMRs de los compuestos de este estudio en uvas de vinificacioacuten
en unidades de mgkg de uva En el caso del vino no hay legislacioacuten en lo referente a estos pesticidas solamente
la recomendacioacuten de no superar el 10 del valor del LMR en uva
Compuesto LMRs (mgkg uva) Compuesto LMRs (mgkg uva)
AME 6 MET 1
BEN 03 MYC 1
BOS 5 PEN 02
CAR 05 PYC 2
CYP 3 PYM 5
DIM 3 TEC 1
FEH 15 TEF 3
FEP 001 TBZ 005
FLU 2 TME 04
IMI 1 THI-M 3
IPR 2 TRI 2
MAN 2
Tabla I2 Liacutemites maacuteximos de residuos permitidos para los compuestos estudiados en uvas
10
Capiacutetulo I Introduccioacuten
2 MEacuteTODOS DE PREPARACIOacuteN DE MUESTRA APLICADOS A MUESTRAS DE VINO
21 Extraccioacuten liacutequido-liacutequido (LLE)
Se entiende por extraccioacuten liacutequido-liacutequido al meacutetodo mediante el cual un analito de intereacutes se separa por el
contacto con otra fase en la cual tiene mayor afinidad de la matriz en la que se halle Los procesos de extraccioacuten
implican dos fases y requieren tres pasos sucesivos mezcla de materia prima y disolvente separacioacuten de las dos
fases despueacutes del contacto y eliminacioacuten del disolvente que contiene el analito [22]
La extraccioacuten liacutequido-liacutequido (LLE) se basa en la distribucioacuten
de un analito entre dos fases liacutequidas inmiscibles en las
cuales analito y matriz tienen solubilidades diferentes
Principalmente una de las fases es un medio acuoso en
general se trata de la muestra y la otra un disolvente
orgaacutenico La selectividad y eficacia de este meacutetodo vienen
determinadas por la eleccioacuten del disolvente y por los factores
que pueden afectar al proceso de equilibrio (pH adiccioacuten de
sales neutras en la fase acuosa para reducir la solubilidad del
analito etc) [23] Esta teacutecnica permite llevar a cabo extracciones para un rango muy amplio de analitos siendo
una de las maacutes antiguas para la preparacioacuten de muestras en el anaacutelisis cualitativo y cuantitativo Ofrece grandes
capacidades de muestreo lineal y cuenta con la ventaja de la cantidad de informacioacuten existente sobre este meacutetodo
[24]
22 Extraccioacuten en fase soacutelida (SPE)
En 1978 aparecieron los primeros cartuchos desechables para la extraccioacuten en fase soacutelida y actualmente casi 40
antildeos despueacutes la extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) es la teacutecnica de preparacioacuten de muestras maacutes empleada en los
laboratorios Es una teacutecnica de preparacioacuten y tratamiento de muestras que se basa en la retencioacuten en una fase
adsorbente del analito de intereacutes presente en una muestra liacutequida que pasa a traveacutes de ella Debido a la variedad de
formatos (discos cartuchos y jeringas) y tipos de adsorbentes (los maacutes comunes carboacuten activo aluacutemina siacutelica gel
silicato de magnesio siacutelices enlazadas y poliacutemeros como por ejemplo estinero-divinilbenceno) o la facilidad de
automatizacioacuten y acoplamiento con otras teacutecnicas como por ejemplo una conexioacuten directa con un sistema de
Figura I4 Fundamentos teoacutericos de la LLE [25]
11
Capiacutetulo I Introduccioacuten
cromatografiacutea este meacutetodo le fue ganando terreno a la LLE Otra ventaja muy importante de la SPE frente a la
LLE es la disminucioacuten en la cantidad de disolvente orgaacutenico empleada Cada vez se va innovando maacutes sobre esta
teacutecnica llegando a encontrarse fases adsorbentes formadas por poliacutemeros capaces de retener en un uacutenico
cartucho un amplio abanico de analitos lipofiacutelicos o hidrofoacutebicos aacutecidos baacutesicos o neutros [26]
El fundamento de esta extraccioacuten como se puede en la Figura I6
consiste en cuatro etapas acondicionamiento adiccioacuten de muestra
retencioacuten y elucioacuten de los analitos de intereacutes En primer lugar antes
de empezar la extraccioacuten se requiere una etapa de acondicionamiento
para preparar el adsorbente haciendo pasar un poco de disolvente
para asiacute interaccionar mejor con la muestra Luego se hace pasar la
muestra liacutequida por la fase soacutelida Idealmente el adsorbente retiene
los analitos selectivamente a medida que va pasando la muestra y la
matriz pasa sin ser retenida Por uacuteltimo los analitos se eluyen del
adsorbente con un disolvente con el que tenga mayor afinidad [27]
23 Teacutecnicas de microextraccioacuten
231 Microextraccioacuten en fase soacutelida (SPME)
En la microextraccioacuten en fase soacutelida (SPME) se utilizan fibras de siacutelice fundida revestidas con un poliacutemero en un
disentildeo en forma de jeringa para la extraccioacuten de los analitos de intereacutes El principio por el que se rige esta
extraccioacuten es el reparto del analito entre la matriz de la muestra y el revestimiento de la fibra mediante un proceso
no competitivo Se trata de un meacutetodo que cuenta con muchas ventajas ya que se elimina completamente el uso de
disolventes y aparte no son necesarios voluacutemenes de muestra grandes pero tambieacuten cuenta con algunas
desventajas ya que tanto la capacidad como la sensibilidad se ven limitadas [29]
En la figura I7 podemos ver las etapas de la extraccioacuten En un
vial cerrado con una caacutepsula y un seacuteptum tenemos la muestra
liacutequida o bien soacutelida que contenga los analitos de intereacutes
volaacutetiles Con la jeringa se perfora el seacuteptum y una vez dentro
se acciona el eacutembolo para la exposicioacuten de la fibra con los
analitos introducieacutendola en la muestra liacutequida o en su defecto
en el espacio de cabeza para la extraccioacuten de analitos volaacutetiles
de una muestra soacutelida Despueacutes de la extraccioacuten dentro del vial
Figura I6 Etapas de una SPE [28]
Figura I7 Etapas de una SPME [30]
12
Capiacutetulo I Introduccioacuten
la fibra se introduce de nuevo en la jeringa y se retira del vial [27]
232 Microextraccioacuten en fase liacutequida (LPME)
La microextraccioacuten en fase liacutequida se desarrolloacute como una alternativa a la LLE para la reduccioacuten en la cantidad de
disolventes orgaacutenicos siendo rentable tanto para el medioambiente como econoacutemicamente Entre las modalidades
maacutes populares de esta teacutecnica se encuentran microextraccioacuten con gota suspendida (SDME) y microextraccioacuten
liacutequido-liacutequido dispersiva (DLLME) En la SDME una gota de disolvente orgaacutenico es expuesta al espacio de
cabeza situado sobre una muestra en un vial dicha gota es suspendida del extremo de una microjeringa Por otro
lado la DLLME sobre una muestra acuosa se inyecta un pequentildeo volumen de una mezcla de disolventes en la
cual es dispersada formando una solucioacuten en la que se establece el equilibrio El disolvente de extraccioacuten debe
presentar una densidad inferior a la de la muestra para facilitar su recuperacioacuten normalmente despueacutes de
centrifugar el vial doacutende se realiza la extraccioacuten [31]
24 QuEChERS
La extraccioacuten QuEChERS de las palabras en ingleacutes Quick Easy Cheap Effective Rugged and Safe es un meacutetodo
de extraccioacuten que se desarrolloacute entre 2000 y 2002 para el anaacutelisis de pesticidas Como su nombre indica raacutepido
faacutecil barato eficaz robusto y seguro son las principales
caracteriacutesticas de esta preparacioacuten de muestra Se realiza en dos
etapas en primer lugar una extraccioacuten simple y una segunda fase
de purificacioacuten En la primera etapa tenemos el vial con la
muestra en el cual se antildeade un disolvente generalmente
acetonitrilo para la extraccioacuten de los analitos de intereacutes en
presencia de diferentes sales (en el meacutetodo original se utiliza
sulfato de magnesio y cloruro de sodio) para facilitar la separacioacuten
de las fases En la segunda parte se realiza la purificacioacuten de la
fraccioacuten del extracto orgaacutenico Para eso se lleva a cabo una
limpieza de los analitos eliminando el agua y los compuestos
presentes en la matriz de la muestra empleando un adsorbente PSA (amina primaria y secundaria) C18 carboacuten
negro grafitizado (GCB) o una combinacioacuten de eacutestas [32]
Figura I8 Etapas de QuEChERS [33]
13
Capiacutetulo I Introduccioacuten
3 METODOLOGIacuteA ANALIacuteTICA PARA LA DETERMINACIOacuteN DE PESTICIDAS
31 Meacutetodos de GC-MS (MSMS)
La combinacioacuten de cromatografiacutea de gases (GC) teacutecnica de separacioacuten con espectrometriacutea de masas (MS) como
sistema de deteccioacuten representa un potente meacutetodo para la identificacioacuten determinacioacuten y cuantificacioacuten de
analitos orgaacutenicos en concentraciones traza presentes en muestras complejas Esta teacutecnica de anaacutelisis cuenta con
muchas ventajas en sensibilidad multifuncionalidad buena reproducibilidad robustez asiacute como facilidad en el
manejo pero con una gran desventaja este meacutetodo no es apto para ser utilizado con todos los analitos sino que
se ve limitado a aquellos que sean termoestables y no se descompongan a temperaturas elevadas antes de ser
volatilizados La muestra es introducida a traveacutes del inyector en el cromatoacutegrafo de gases doacutende impulsada por
una corriente de gas inerte como fase moacutevil pasa a traveacutes de la columna que contiene la fase estacionaria en la
cual se separan los compuestos debido a una distribucioacuten de estos entre fase moacutevil-fase estacionaria Mediante
una interfase son introducidos para su deteccioacuten en el espectroacutemetro de masas que cuenta con una fuente de
iones analizador de masas y un detector [34]
La combinacioacuten de analizadores de masas en taacutendem (MSMS) como sistema de deteccioacuten en GC es una teacutecnica
altamente selectiva mejorando la sensibilidad y la relacioacuten sentildeal-ruido en los espectros experimentando una
mejora por lo que se logran unos liacutemites de deteccioacuten inferiores Esta teacutecnica GC-MSMS comprende maacutes
pasos despueacutes de la separacioacuten por cromatografiacutea se lleva a cabo la deteccioacuten con MSMS que consta de varias
etapas generacioacuten de iones en la fuente de ionizacioacuten seleccioacuten de los iones precursores de una determinada
masa disociacioacuten causada por colisioacuten con moleacuteculas de gas inerte de los iones precursores y por uacuteltimo el
anaacutelisis de los fragmentos en relacioacuten a su masacarga (mz) En el caso de que un espectro de MS no permita
confirmar la identidad de un determinado compuesto quiacutemico la obtencioacuten de su espectro de MSMS permite
mejorar la confianza en su identificacioacuten [36]
Figura I9 Acoplamiento GC-MS [35]
14
Capiacutetulo I Introduccioacuten
32 Meacutetodos LC-MS (MSMS)
La teacutecnica de LC-MS se desarrolloacute para minimizar las desventajas del acoplamiento GC-MS y asiacute resolver los
problemas que este uacuteltimo acarreaba con los analitos termolaacutebiles permitiendo el anaacutelisis de eacutestos sin tener que
realizar una etapa previa de derivatizacioacuten La interfase de unioacuten de cromatografiacutea liacutequida (LC) con espectrometriacutea
de masas (MS) acarrea una dificultad significativa siendo responsable de transformar los analitos que se
encontraban en la fase moacutevil liacutequida en iones en fase gas sin que se produzca su degradacioacuten teacutermica La
sensibilidad de las determinaciones por LC-MS va a depender de la interfase empleada Las principales interfases
empleadas actualmente son las ionizaciones a presioacuten atmosfeacuterica electrospray (ES) e ionizacioacuten quiacutemica a
presioacuten atmosfeacuterica (APCI) [37]
Con los antildeos la cromatografiacutea liacutequida se ha ido innovando y mediante la disminucioacuten del tamantildeo de partiacutecula en
la columna se fue mejorando la eficiencia asiacute como aumentando la selectividad y resolucioacuten del pico en el
cromatograma Para este nuevo sistema llamado UPLC Ultra-Performance Liquid Chromatography se desarrolloacute
una nueva instrumentacioacuten capaz de trabajar a altas presiones generando flujos mayores sin peacuterdidas de
resolucioacuten utilizando inyectores automaacuteticos maacutes raacutepidos y detectores con mayor velocidad de adquisicioacuten de
datos disminuyendo asiacute el tiempo de anaacutelisis [39]
33 Espectrometriacutea de masas
La espectrometriacutea de masas es el meacutetodo de deteccioacuten y cuantificacioacuten maacutes fiable a la hora de la determinacioacuten de
compuestos en matrices complejas (tales como alimentos) ya que otros detectores maacutes tradicionales como UV-
visible o fluorescencia cuentan con una gran incertidumbre en los resultados llegando incluso a ofrecer falsos
Figura I10 Acoplamiento LC-MS [38]
15
Capiacutetulo I Introduccioacuten
positivos o negativos Un espectrometro de masas cuenta con un dispositivo de introduccioacuten de muestra una
caacutemara de ionizacioacuten un sistema para la aceleracioacuten de los iones uno o varios analizadores de masas y un detector
[40]
El fundamento de la espectrometriacutea de masas se basa en la separacioacuten de iones en base a la relacioacuten masacarga
(mz) El proceso consta fundamentalmente de cuatro etapas La
primera es la ionizacioacuten de la muestra los iones formados se aceleran
debido a la accioacuten de un campo eleacutectrico variable separacioacuten de los
iones seguacuten su masacarga deteccioacuten de los iones y produccioacuten de la
sentildeal eleacutectrica El analizador de masas es el encargado de la separacioacuten
de los iones en funcioacuten a su mz entre los que maacutes destacan
analizador de masas cuadrupolar que dispersa simultaacuteneamente todos
los iones en funcioacuten de la relacioacuten mz analizador de masas de
tiempo de vuelo (TOF) consta de un tubo a alto vaciacuteo sobre el que no
actuacutea ninguacuten campo eleacutectrico al cual llegan todos los iones acelerados con la misma energiacutea cineacutetica y en el tubo
las velocidades variacutean seguacuten mz y analizador de trampa de iones en doacutende los iones gaseosos quedan aislados
durante largos periacuteodos de tiempo por la accioacuten del campo eleacutectrico [41]
4RESUMEN BIBLIOGRAacuteFICO DE LAS TEacuteCNICAS DE EXTRACCIOacuteN Y
DETERMINACIOacuteN DE PESTICIDAS EN VINO
En la bibliografiacutea se han descrito diversas teacutecnicas y diferentes combinaciones entre teacutecnicas de extraccioacuten y
distintas teacutecnicas de cuantificacioacuten e identificacioacuten para esos analitos Entre estas teacutecnicas los valores de los liacutemites
de cuantificacioacuten (LOQs) y las recuperaciones relativas pueden diferir en el resultado en un rango de valores asiacute
como el tiempo total empleado para el anaacutelisis y para la preparacioacuten de la muestra
Por lo general el meacutetodo de extraccioacuten de los analitos de intereacutes maacutes empleado es la extraccioacuten en fase soacutelida
(SPE) la cuaacutel le ha estado ganando terreno a la extraccioacuten liacutequido-liacutequido aunque tambieacuten se estaacute viendo cada vez
maacutes desplazada debido al creciente uso de la teacutecnica QuEChERS
Figura I11 Etapas de la espectrometriacutea de masas [42]
16
Capiacutetulo I Introduccioacuten
En el estudio de ECONOMOU et al [43] realizado en el antildeo 2009 en Grecia se empleoacute la extraccioacuten en fase
soacutelida con deteccioacuten en cromatografiacutea de liacutequidos acoplada a espectrometriacutea de masas en taacutendem (SPE-LC-ESI-
MSMS) Para la preparacioacuten de la muestra diluyeron 10 mL de vino (tanto blanco como tinto) a un volumen
final de 100 mL con agua ultrapura antes de la SPE Determinaron las recuperaciones de la extraccioacuten para dos
niveles de concentracioacuten 0010 y 0050 mgL realizando 8 medidas diarias durante 3 diacuteas consecutivos
encontraacutendose unos valores que variacutean dentro del rango 70-110 para todos los pesticidas en los dos niveles Para
la determinacioacuten y cuantificacioacuten de 46 pesticidas emplearon la teacutecnica de cromatografiacutea de liacutequidos con
espectrometriacutea de masas con un volumen de inyeccioacuten de 20 microL y un flujo de fase moacutevil de 02 mLmin
aclopada a espectrometriacutea de masas en taacutendem
Con la misma teacutecnica de extraccioacuten PELAJIĆ et al [45] durante el antildeo 2015 en Croacia llevaron a cabo la
determinacioacuten de 25 residuos de plaguicidas en vino tinto El meacutetodo que desarrollaron para dicha finalidad fue el
acoplamiento SPE-GC-MS Para la preparacioacuten de la muestra emplearon 10 mL de vino diluidos 11 con agua
ultrapura hasta un volumen final de 20 mL Calcularon las recuperaciones de la extraccioacuten y se encontroacute un rango
para todos los pesticidas en las muestras de 70-120 Para la determinacioacuten en cromatografiacutea de gases-
espectrometriacutea de masas se empleoacute un volumen de inyeccioacuten de 5 μL y un flujo de fase moacutevil de 10 mLmin
Mediante el acoplamiento de teacutecnicas SPE dispersiva-GC-MS WALORCZYK et al [48] en el antildeo 2011 en
Polonia llevaron a cabo la cuantificacioacuten de 160 pesticidas en diferentes clases de vino tinto rosado y blanco Con
10 g de vino y 10 mL de acetonitrilo se realizaron pruebas de recuperacioacuten en la fase de extraccioacuten para vino
tinto con los niveles de concentracioacuten 001 005 y 02 mgkg y para los vinos rosado y blanco con el nivel de
concentracioacuten 005mgkg y encontraron que a todos los niveles de concentracioacuten los valores de recuperacioacuten
rondan el rango 80-110 Para la teacutecnica cromatograacutefica se utilizoacute un volumen de inyeccioacuten de 5 microL
El acoplamiento LLE-SPE-LCDAD fue desarrollado por GONZAacuteLEZ-RODRIacuteGUEZ et al [50] en el antildeo
2010 en la provincia de Orense para la determinacioacuten de nuevos fungicidas propuestos para combatir el hongo
que provoca la enfermedad del mildium En la preparacioacuten de la muestra emplearon 15 mL de vino blanco para la
extraccioacuten en la cual fueron calculadas las recuperaciones relativas para dos niveles de concentracioacuten 005 y 05
mgkg en donde se establece un rango de entre 70-110 para todos los analitos Para la determinacioacuten mediante
cromatografiacutea de liacutequidos se empleoacute un volumen de inyeccioacuten de 2 μL y como meacutetodo de deteccioacuten utilizaron un
detector de diodos array
La microextraccioacuten sorptiva en fase soacutelida fue empleada en la publicacioacuten de FONTANA et al [44] junto con un
acoplamiento entre cromatografiacutea de liacutequidos y espectrometriacutea de masas para la determinacioacuten de 15 fungicidas
en vino realizada durante el 2010 en el noroeste de Espantildea Para la preparacioacuten de la muestra emplearon 10 mL
17
Capiacutetulo I Introduccioacuten
de vino diluiacutedos con el mismo volumen de agua ultrapura y un sorbente en forma de disco de silicona con un
volumen de 12 microL La recuperacioacuten de la extraccioacuten se calculoacute para vino tinto (Menciacutea) y vino blanco (Godello)
realizando tres replicas dentro de un mismo diacutea para los niveles de concentracioacuten 10 y 50 ngmL y nueve reacuteplicas
realizando el anaacutelisis en tres diacuteas consecutivos para el nivel de concentracioacuten de 25 ngmL y los resultados
obtenidos dan unos valores de recuperacioacuten dentro del rango 75-117 En el sistema LC-QTOF-MS el volumen
de inyeccioacuten fue de 15 microL
El otro meacutetodo de extraccioacuten mencionado anteriormente es QuEChERS estaacute en auge como meacutetodo de extracioacuten
de residuos de pesticidas en matrices como la del vino o la uva ya que incrementa la velocidad del anaacutelisis y reduce
el efecto de matriz BUERGE et al [46] seguido de una deteccioacuten mediante GC-MSMS realizaron una estapa
de extraccioacuten QuEChERS con alguna modificacioacuten acetato de sodio en lugar de cloruro soacutedico y acetato de etilo
en lugar de acetonitrilo utilizando 5 g de uva para la determinacioacuten de residuos de 4 pesticidas durante el antildeo
2016 Las recuperaciones de extraccioacuten resultaron ser valores entre 91-149 en uva a distintos niveles de
concentracioacuten 005 05 y 5 mgkg
Para la determinacioacuten de Ametoctradin HU et al [47] llevaron a cabo una extraccioacuten QuEChERS empleando 10
g de uva con deteccioacuten mediante el acoplamiento UPLC-MSMS utilizando un volumen de inyeccioacuten de 5 μL y
un flujo de fase moacutevil de 03 mLmin Las recuperaciones de la extraccioacuten se calcularon para tres niveles de
concentracioacuten 1 10 100 μgL de dos formas distintas en tres diacuteas consecutivos realizando 5 reacuteplicas al diacutea o en
dentro de un mismo diacutea realizando 15 reacuteplicas los resultados de todos los caacutelculos se encuentran dentro del rango
818-1001
Siguiendo con el mismo modo de extraccioacuten GUO et al [49] publicaron sus estudios para la determinacioacuten de
50 pesticidas y 12 adulterantes en vino tinto Para la extraccioacuten QuEChERS se utilizaron 10 mL de vino tinto con
10 mL de acetonitrilo y calcularon las recuperaciones para tres niveles de concentracioacuten 50 100 y 250 ngmL
encontraacutendose un rango de valores entre 75-120 El meacutetodo de deteccioacuten se llevoacute a cabo mediante un anaacutelisis
directo en tiempo real junto con espectrometriacutea de masas en tandem con un cuadrupolo (DART-MSMS) la
teacutecnica DART es un meacutetodo raacutepido para cribar y cuantificar los analitos de estudio que prescinde de la etapa de
separacioacuten cromatograacutefica
A continuacioacuten se recogen en la Tabla I3 los liacutemites de cuantificacioacuten (LOQs) de los analitos de intereacutes en este
trabajo caacutelculados por los diferentes meacutetodos encontrados en bibliografiacutea citados anteriormente en este apartado
18
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Tabla I3 LOQs de los analitos de intereacutes descritos para los distintos meacutetodos encontrados en la bibliografiacutea
Compuesto LOQs
Compuesto LOQs
V Blanco V Tinto Uva V Blanco V Tinto Uva
AME - - 0032μgkg[47] MET 86 μgL[43]
22 μgL[44]
89 μgL[43]
22 μgL[44]
5 μgL[45]
259 ngmL[49]
001mgkg[48]
BEN 02 μgL[44]
0001 mgL[50]
02 μgL[44]
001 μgL[45]
280ngmL[49]
005 mgkg[48] MYC 30 μgL[43]
08 μgL[44]
36 μgL[43]
10 μgL[44]
025 μgL[45]
331ngmL[49]
001 mgkg[48]
BOS 0065 mgL[50] 05 μgL[45]
1076 ngmL[49] 001 mgkg[48] PEN
56 μgL[43]
05 μgL[44]
49 μgL[43]
04 μgL[44]
220ngmL[49]
001 mgkg[48]
CAR - 386 ngmL[49] - PYC 0003mgL[50] 07 μgL[45] 001 mgkg[48]
CYP 15 μgL[43]
04 μgL[44]
0001 mgL[50]
22 μgL[43]
06 μgL[44]
312 ngmL[49]
001 mgkg[48] PYM 17 μgL[43] 22 μgL[43]
10 μgL[45] 001 mgkg[48]
DIM 18 μgL[43] 20 μgL[43] 001 mgkg[48] TEC 03 μgL[44]
03 μgL[44]
10 μgL[45]
160ngmL[49]
001 mgkg[48]
FEH 17 μgL[43] 22 μgL[43]
938 ngmL[49] 001 mgkg[48] TEF - 876ngmL[49] -
FEP - - 002mgkg[46] TBZ 15μgL [43] 29μgL[43] 001 mgkg[48]
FLU 005 μgL[45] TME - 25 μgL[45] 001 mgkg[48]
IMI 21 μgL[43] 22 μgL[43]
225 ngmL[49] - THI-M 92 μgL[43] 89 μgL[43] -
IPR 07 μgL[44] 07 μgL[44] 001 mgkg[48] TRI 10 μgL[44] 12 μgL[44] 001 mgkg[48]
MAN 0011 mgL[50] - -
5 DISTRIBUCIOacuteN DE PESTICIDAS EN VINOS COMERCIALES
En algunos de los meacutetodos descritos en el apartado anterior se procesaron vinos comerciales encontraacutendose
resultados positivos para muchos residuos de pesticidas y algunos hasta en gran concentracioacuten
ECONOMOU et al [43] mediante el meacutetodo LC-ESI-MSMS realizaron el anaacutelisis de 60 muestras de vino tinto
y blanco recogidos en supermercados locales en Grecia a lo largo de un antildeo El meacutetodo se habiacutea desarrollado
19
Capiacutetulo I Introduccioacuten
para la determinacioacuten de 46 pesticidas pero la mayoriacutea se encuentran con una concentracioacuten por debajo de
001mgL solo ocho plaguicidas se obtuvieron con resultados de concentracioacuten mayores Se muestran los
resultados en la Tabla I4 de los analitos de intereacutes en este estudio
Tabla I4 Nuacutemero de muestras positivas de distintos pesticidas en el anaacutelisis de 60 muestras de vino [43]
Compuesto Positivos con concentracioacuten entre 001-01
mgL
Positivos con concentracioacuten entre 01-1
mgL
PYM 2 (3) 2 (3)
MYC 2 (3) 0 (0)
CAR 11 (18) 7 (12)
THI-M 7 (12) 5 (8)
FEH 5 (8) 0 (0)
MET 1 (2) 0 (0)
Mediante el meacutetodo de microextraccioacuten en fase soacutelida-LC-TOF-MS FONTANA et al [44] aplicaron el
desarrollo del procedimiento a un total de 12 vinos joacutevenes elaborados en el 2010 y correspondientes a diferentes
denominaciones geograacuteficas del noroeste de Espantildea En la Tabla I5 se muestran los datos que han obtenido
Tabla I5 Determinacioacuten de fitosanitarios en vinos comerciales mediante Microextraccioacuten en fase soacutelida-LC-TOF-MS
Valores de concentracioacuten en ngmL [44]
Pesticidas
W 1
Albarintildeo
W5
Ribeiro
W6
Valdeorras
R1
Ribeira Sacra
R3
Ribeiro
R4
Valdeorras
MET 404plusmn06 223plusmn05 311plusmn007 25plusmn03 31plusmn03 74plusmn10
TRI nd nd 36plusmn06 nd nd ltLOQ
IPR 394plusmn03 324plusmn02 324plusmn02 071plusmn007 31plusmn02 28plusmn05
MYC nd nd nd ltLOQ 39plusmn02 nd
TEC 25plusmn01 nd nd nd nd nd
CYP 179plusmn08 ltLOQ ltLOQ 562plusmn002 083plusmn001 nd
BEN 042plusmn001 nd ltLOQ nd 032plusmn001 ltLOQ
ndNo detectados ltLOQ por debajo del liacutemite de cuantificacioacuten del meacutetodo los coacutedigos W y R corresponden respecti-vamente a los vinos blanco y tinto
20
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Por uacuteltimo PELAJIĆ et al [45] aplicaron su meacutetodo SPE dispersiva-GC-MS mediante el cual determinaron 25
residuos de plaguicidas en vino tinto a un total de 32 muestras de vino adquiridos en supermercados locales de
Croacia pero de diversos oriacutegenes de procedencia Los resultados que han obtenido se muestran en la Tabla I6
en doacutende un total de 15 plaguicidas han sido detectados y 7 de los cuales se encontraban en una alta
concentracioacuten
Tabla I6 Resultados de los vinos con positivos en pesticidas y sus concentraciones [45]
Vino Paiacutes Residuos de pesticidas (mgKg)
Tinto Francia DIM (0013) MET (0009) IPR (001)
Tinto Alemania BOS (0011)
Tinto Alemania IPR (0009)
Tinto Macedonia MET (0015)
Tinto Moldavia IPR (0008)
Tinto Polonia MET (004)
Tinto Rumania PYM (0058)
Tinto Espantildea TRI (0005) MET (0011)
Tinto Estados Unidos BOS (001)
Rosado Francia BOS (0005)
Blanco Chile TEC (0008)
Blanco Georgia MET (0057)
Blanco Alemania DIM (001) IPR (0054) PYM (0056)
Blanco Sudaacutefrica DIM (0011) IPR (0011)
21
Capiacutetulo II Objetivos y discusioacuten
CAPIacuteTULO II OBJETIVOS Y DISCUSIOacuteN
El objetivo principal que se persigue en este trabajo es el desarrollo de un meacutetodo analiacutetico raacutepido basado en la
extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) y deteccioacuten mediante cromatografiacutea de liacutequidos en la modalidad de UPLC
acoplada a la espectrometriacutea de masas en taacutendem (UPLC-MSMS) para la determinacioacuten multianalito de residuos
de fitosanitarios principalmente fungicidas aunque tambieacuten alguacuten insecticida en muestras de vino blanco y tinto
Para llevar a cabo la finalidad de lo dicho se consideran unos objetivos maacutes especiacuteficos
Minimizar la manipulacioacuten de la muestra para asiacute reducir la cantidad de disolventes y tiempo empleado
Optimizacioacuten de los factores que afectan en la extraccioacuten en la SPE tales como tipo y cantidad de
adsorbente volumen de eluyente etc
Estudio de las condiciones en UPLC-MSMS para una separacioacuten y cuantificacioacuten oacuteptimas
Caracterizacioacuten y validacioacuten del meacutetodo propuesto
Por uacuteltimo una vez cumplidos todos los objetivos anteriores y fijadas las condiciones oacuteptimas el meacutetodo
estudiado se aplica en el anaacutelisis de muestras de vino comercial (blanco y tinto) para determinar si se encuentran
residuos presentes asiacute como conocer en queacute concentracioacuten se encuentran los pesticidas objeto de este estudio
22
Capiacutetulo III Parte experimental
CAPIacuteTULO III PARTE EXPERIMENTAL
1 MATERIAL Y REACTIVOS
11 Material
Material de vidrio de uso comuacuten en el laboratorio vasos de precipitados matraces aforados etc
Micropipetas automaacuteticas de 20-200 microL 20-200 microL 100-1000 microL 1000-5000 microL Eppendorf
Puntas de plaacutestico para micropipetas
Encapsulador y desencapsulador
Soportes y pinzas
Viales de 15 mL transparentes para muestreador automaacutetico de cromatografiacutea (Sugelabor)
Caacutepsulas de aluminio con seacuteptum de Tefloacuten (Sugelabor) y tapones pre-slit para viales
Tubos y conectores de tefloacuten
Cartuchos de divinilbenceno-N-vinilpirrolidona 200 mg Oasis HLB Waters
Cartuchos de divinilbenceno-N-vinilpirrolidona funcionalizados con grupos amina cuaternaria 150 mg
Oasis MAX Waters
Cartuchos de divinilbenceno-N-vinilpirrolidona 60 mg Oasis HLB Waters
12 Reactivos y disolventes
Agua ultrapura Milli-Q
Aacutecido foacutermico (Sigma Aldrich) 95
Acetonitrilo (LichrosolvregMerck) Gradient grade for liquid chromatography
Metanol (LichrosolvregMerck) Gradient grade for liquid chromatography
Etanol (LichrosolvregMerck) Gradient grade for liquid chromatography
13 Patrones
Ametoctradin (AME) Dr Ehrenstrorfer 990
Benalaxyl (BEN) Pestanal Sigma- Aldrich 999
23
Capiacutetulo III Parte experimental
Boscalid (BOS) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Carbendazim (CAR) Pestanal Sigma- Aldrich 992
Cyprodinil (CYP) Pestanal Sigma- Aldrich 998
Dimethomorph (DIM) mezcla de isoacutemeros E + Z Pestanal Sigma- Aldrich 989
Fenhexamid (FEH) Pestanal Sigma- Aldrich 997
Fenpropidin (FEP) Dr Ehrenstrorfer 980
Fluopicolide (FLU) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Imidacloprid (IMI) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Iprovalicarb (IPR) mezcla de isoacutemeros Pestanal Sigma- Aldrich 985
Mandipropamid (MAN) Pestanal Sigma- Aldrich 991
Metalaxyl (MET) Pestanal Sigma- Aldrich 990
Myclobutanil (MYC) Pestanal Sigma- Aldrich 994
Penconazole (PEN) Pestanal Sigma- Aldrich 991
Pyraclostrobin (PYC) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Pyrimethanil (PYM) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Tebuconazol (TEC) Pestanal Sigma- Aldrich 996
Tebufenozide (TEF) Dr Ehrenstrorfer 988
Thiabendazole (TBZ) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Thiamethoxam (TME) Pestanal Sigma- Aldrich 996
Thiophanate-methyl (THI-M) Dr Ehrenstrofer 990
Triadimenol (TRI) Mezcla de diastereoisoacutemeros Pestanal Sigma- Aldrich 994
14 Patrones internos
Carbendazim-d3 (CAR-d3) Pestanal Sigma- Aldrich 998
Cyprodinil-d5 (CYP-d5) Pestanal Sigma- Aldrich
Imidacloprid-d4 (IMID-d4) Pestanal Sigma- Aldrich
Metalaxyl 13C6 (MET13C6) Pestanal Sigma-Aldrich 99
24
Capiacutetulo III Parte experimental
15 Gases
Nitroacutegeno 99999 como gas de colisioacuten en el espectroacutemetro de masas
Nitroacutegeno en los sistemas de concentracioacuten y secado por corriente de nitroacutegeno de los cartuchos SPE
2 INSTRUMENTACIOacuteN
Balanza analiacutetica de precisioacuten Sartorius
Granatario Sartorius
Bantildeo de ultrasonidos P-Selecta
Equipo de purificacioacuten de agua Millipore modelo Milli-Q gradient A-10ZMQSSVOT4
Estacioacuten de concentracioacuten por corriente de nitroacutegeno Mini-Vap Supelco
Sistema de secado de cartuchos de SPE por corriente de nitroacutegeno VisiDry Supelco
Sistema distribuidor de vaciacuteo Visiprep reg Supelco
Cromatoacutegrafo de liacutequidos de ultra-alta resolucioacuten Waters AcquityUPLC reg y espectroacutemetro de masas
Acquity TQD con analizador de triple quadrupolo (QqQ) equipado con una fuente de ionizacioacuten a
presioacuten atmosfeacuterica del tipo Z-spray (ESI)
3 PREPARACIOacuteN DE LAS DISOLUCIONES
Los patrones de pesticidas se prepararon individualmente a partir de los compuestos soacutelidos comerciales por
pesada excepto en el caso del fenpropidin (FEP) que se preparoacute a partir del compuesto liacutequido comercial Estos
compuestos soacutelidos se disolvieron en metanol y se obtuvieron unas disoluciones iniciales con concentraciones
recogidas en la Tabla III1
25
Capiacutetulo III Parte experimental
Tabla III1 Concentracioacuten de las disoluciones patroacuten stock
Compuesto Concentracioacuten (microgmL) Compuesto Concentracioacuten (microgmL)
AME 102201 MET 118912
BEN 138330 MYC 102017
BOS 99474 PEN 129791
CAR 17105 PYC 104581
CYP 131075 PYM 141386
DIM 103009 TEC 134729
FEH 99584 TEF 137769
FEP 100000 TBZ 105928
FLU 126859 TME 112283
IMI 101123 THI-M 124202
IPR 106739 TRI 118933
MAN 101021
4 LAVADO DEL MATERIAL
La limpieza del material de vidrio utilizado en el laboratorio se realizoacute utilizando jaboacuten y aclarando con agua de
grifo Luego en primer lugar se realiza un enjuague con agua Milli-Q finalmente un segundo enjuague con
acetona para eliminar posibles restos de compuestos orgaacutenicos y se deja secar sobre papel
Para la limpieza de los conectores de tefloacuten empleados en el proceso de SPE se introducen en un vaso de
precipitados con metanol y este en un bantildeo de ultrasonidos durante 10 minutos Al finalizar con el bantildeo de
ultrasonidos se realiza un enjuague con acetona y se pone a secar
5 EXTRACCIOacuteN DE MUESTRAS MEDIANTE SPE
El meacutetodo de extraccioacuten utilizado para la determinacioacuten de pesticidas fue la extraccioacuten en fase soacutelida (SPE)
mediante cartuchos Oasis HLB de 200 mg A continuacioacuten se describe el protocolo de extraccioacuten en las
condiciones oacuteptimas
26
Capiacutetulo III Parte experimental
1 Acondicionamiento del cartucho Oasis HLB de 200 mg con 2 mL de acetonitrilo seguidos de otros 2 mL de
vino sinteacutetico formado por la mezcla etanolagua MilliQ (1288)
2 Paso de la muestra 2 mL de vino diluiacutedos con 2 mL de agua MilliQ a traveacutes del cartucho por gravedad
3 Lavado del cartucho con 2 mL de agua MilliQ
4 Secado del cartucho durante 45 minutos en el VisiDry mediante el paso de una corriente de nitroacutegeno
5 Elucioacuten del cartucho con la mezcla metanolacetonitrilo en proporcioacuten 2080 hasta un volumen final de 2
mL
6 Anaacutelisis mediante cromatografiacutea liacutequida acoplada a espectrometriacutea de masas en taacutendem UPLC-MSMS
(volumen de inyeccioacuten 15 microL)
Representacioacuten esquematizada en la Figura III1
Figura III1 Extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) de las muestras de vino
27
Capiacutetulo III Parte experimental
6 CONDICIONES DE DETERMINACIOacuteN MEDIANTE UPLC-MSMS
En la Tabla III2 se indican las condiciones utlizadas en la determinacioacuten de los pesticidas de intereacutes mediante
LC-MSMS y en la Tabla III3 se muestra el gradiente de la fase moacutevil utilizado para la separacioacuten
cromatograacutefica
Tabla III2 Condiciones experimentales de determinacioacuten en LC-MSMS
UPLC Acquity UPLC-I-Class IVD System
bull Columna cromatograacutefica Zorbax Eclipse Plus C18 Rapid Resolution HD
Fase estacionaria C18
Dimensiones 21 x 50 mm
Tamantildeo de partiacutecula 18 microm
Temperatura del horno 40ordmC
bull Inyector
Volumen de inyeccioacuten 15 microL
bull Fase moacutevil
Flujo 04 mLmin
Fase acuosa (A) Agua MilliQ con 01 aacutecido foacutermico
Fase orgaacutenica (B) Acetonitrilo con 01 aacutecido foacutermico
MSMS WatersXevo TQD
Modo de ionizacioacuten ESI positivo
Voltaje del capilar 15 kV
Voltaje de cono 50 V
Temperatura de gas de secado (N2) 450ordmC
Flujo de gas de secado (N2) 1000 Lh
Modo de adquisicioacuten Centroide
Tabla III3 Gradiente de fase moacutevil utilizado en la separacioacuten cromatograacutefica (LC)
Tiempo min 0 13 28 64 75 76 10
A 98 50 50 0 0 98 98
B 2 50 50 100 100 2 2
28
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
CAPIacuteTULO IV RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
1 IDENTIFICACIOacuteN DE LOS COMPUESTOS
Para empezar el estudio en primer lugar se realizoacute la caracterizacioacuten de las condiciones de determinacioacuten de los
analitos en el modo Multiple Reaction Monitoring (MRM) mediante UPLC-ESI-MSMS Para llevarla a cabo se
tomaron patrones individuales de cada fitosanitario y mediante infusioacuten se estudiaron las posibles transiciones y
voltajes oacuteptimos para su determinacioacuten (Tabla IV1)
La ionizacioacuten por electrospray (ESI) se estudioacute tanto en modo positivo como en modo negativo encontraacutendose
que para todos los pesticidas de nuestro intereacutes se obteniacutea sentildeal en el modo positivo mientras el modo negativo
no presentaba respuesta significativa
A continuacioacuten se estudia el efecto del voltaje de cono en la respuesta del ioacuten molecular [M+H]+ aumentaacutendolo
hasta alcanzar el valor maacuteximo de la sentildeal correspondiente a dicho ioacuten y luego se optimiza la energiacutea de colisioacuten
variaacutendola para cada analito hasta obtener la sentildeal de mayor intensidad para cada uno de los iones producto Por
uacuteltimo una vez optimizado el voltaje de cono y la energiacutea de colisioacuten se seleccionan las dos transiciones maacutes
intensas para llevar a cabo la cuantificacioacuten y cualificacioacuten de cada analito en modo MRM Este procedimiento se
realizoacute para la totalidad de los compuestos confirmando los datos obtenidos con los facilitados por la base de
datos Quanpedia que estaacute disponible en el software del equipo utilizado para algunos de los compuestos
considerados
Compuesto Tr (min) Ion precursor (mz Da)
Voltaje de cono (V)
Ion producto 1 (CEv)
cuantificacioacuten
Ion producto 2 (CEv)
cualificacioacuten
Relacioacuten IP2IP1
AME 325 2760 60 176 (35) 70 (50) 016
BEN 485 3261 26 148 (20) 91 (34) 067
BOS 387 3429 41 140 (20) 307 (20) 011
CAR 167 1921 33 160 (18) 132 (28) 014
CYP 311 2260 56 93 (33) 108 (25) 061
DIM 322 3881 40 301 (20) 165 (30) 057
FEH 386 3021 41 97 (22) 55 (38) 044
FEP 257 2742 55 147 (28) 86 (28) 093
FLU 401 3830 40 173 (20) 365 (15) 010
IMI 218 2561 34 209 (15) 175 (20) 091
IPR 358 3211 28 119 (16) 203 (10) 042
Tabla IV1 Tiempos de retencioacuten (Tr) relacioacuten de iones precursores (mz) voltaje de cono (V) energiacuteas de colisioacuten (CE) y relacioacuten de intensidades entre transiciones (IP2IP1)
29
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Compuesto Tr (min) Ion precursor (mz Da)
Voltaje de cono (V)
Ion producto 1 (CEv)
cuantificacioacuten
Ion producto 2 (CEv)
cualificacioacuten
Relacioacuten IP2IP1
MAN 392 4120 25 328 (16) 125 (35) 063
MET 283 2801 26 220 (13) 192 (17) 057
MYC 365 2891 34 70 (18) 125 (32) 029
PEN 417 2840 34 70 (16) 159 (34) 031
PYC 523 3881 31 194 (12) 163 (25) 066
PYM 266 2000 51 107 (24) 82 (24) 071
TEC 397 3080 40 70 (22) 125 (40) 007
TEF 473 3531 19 133 (20) 297 (8) 072
TBZ 182 2020 51 175 (25) 131 (30) 062
TME 203 2920 28 211 (12) 132 (22) 047
THI-M 257 3430 28 151 (46) 93 (19) 0001
TRI 319 2961 21 70 (10) 99 (15) 013
El dwell time para cada una de las transiciones se ajustoacute de manera automaacutetica por el software (MassLinx) con
objeto de obtener doce puntos espectrales por compuesto tomando un valor promedio de cuatro segundos como
ancho de pico a liacutenea de base
2 CARACTERIZACIOacuteN DEL PROCEDIMIENTO DE DETERMINACIOacuteN (UPLC-ESI-
MSMS)
Una vez optimizados los paraacutemetros que afectan a la separacioacuten cromatograacutefica (UPLC) y a la determinacioacuten por
espectrometriacutea de masas en taacutendem (MSMS) se lleva a cabo la evaluacioacuten de la repetibilidad de inyeccioacuten y
determinacioacuten en esas condiciones Se expresa por medio de la desviacioacuten estaacutendar relativa (RSD) paraacutemetro que
nos indica el grado de correlacioacuten que existe entre varias medidas del mismo patroacuten realizadas por el mismo
operador en el laboratorio y en el mismo equipo de medida a lo largo de un diacutea Para el estudio se realizan diez
inyecciones con volumen de 15 microL de dos patrones con distintos niveles de concentracioacuten 5 y 20 ngmL Los
datos de RSD (Tabla IV2) para las aacutereas de pico de los analitos se situacutean para el nivel de concentracioacuten 5 ngmL
en el rango 2-13 y en el nivel de concentracioacuten 20 ngmL en el rango 1-7
30
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten Tabla IV2 Desviacioacuten estaacutendar relativa (RSD) del aacuterea de pico (transicioacuten de cuantificacioacuten) para evaluar la repetivilidad del proceso de LC-MSMS
Compuesto RSD
5 ngmL
RSD
20 ngmL Compuesto
RSD
5 ngmL
RSD
20 ngmL
AME 5 2 MET 3 2
BEN 2 2 MYC 9 2
BOS 4 5 PEN 4 4
CAR 4 2 PYC 3 1
CYP 5 7 PYM 7 3
DIM 6 5 TEC 3 2
FEH 7 4 TEF 4 2
FEP 4 2 TBZ 2 1
FLU 5 3 TME 6 6
IMI 13 7 THI-M a 6
IPR 8 2 TRI 8 6
MAN 3 2
A continuacioacuten tambieacuten se evaluoacute la repetibilidad de los tiempos de retencioacuten (Tr) para diez inyecciones de
patrones a los dos niveles de concentracioacuten 5 y 20 ngmL situaacutendose las RSD para todos los compuestos en el
rango 01-03 En base a este dato la ventana de tiempo en la que se registran las transiciones de MRM de cada
compuesto se fijoacute en 05 min lo que es lo mismo 025 min alrededor del valor medio de su tiempo de retencioacuten
Por otro lado la linealidad del meacutetodo se estudioacute a nueve niveles de concentracioacuten diferentes comprendidos ente
los niveles 05 ngmL y 200 ngmL mediante la inyeccioacuten de disoluciones patroacuten de los distintos compuestos de
estudio Se realizoacute una evaluacioacuten sin y otra con patroacuten interno (IS) antildeadiendo una concentracioacuten fija de patrones
internos a nivel de 25 ngmL y pudimos observar que los resultados mejoran notablemente al realizar una
correccioacuten con el IS En la Tabla IV3 se muestran los coeficientes de determinacioacuten (R2) obtenidos al realizar la
correccioacuten mediante IS observando que para todos los compuestos excepto para THI-M y para TRI los
coeficientes de correlacioacuten son superiores a 0990 por lo que existe una respuesta lineal en el rango de
concentraciones que hemos estudiado
Aparte del estudio de la linealidad tambieacuten se han estudiado los liacutemites de cuantificacioacuten instrumentales del
meacutetodo (LOQs) Para ello los LOQs se evaluacutean como la miacutenima cantidad de analito que origina una sentildeal 10
veces superior a la desviacioacuten estaacutendar del ruido Los valores anteriores se estimaron a partir del patroacuten de
a no evaluado ya que se encuentra por debajo del liacutemite de cuantificacioacuten del meacutetodo
31
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
concentracioacuten maacutes baja que presenta un pico con una relacioacuten SN superior a 10 En la Tabla IV3 tambieacuten se
recogen estos LOQs en doacutende podemos ver que variacutean en el rango 01-1 ngmL excepto para THI-M que se
desviacutea a valores de 10 ngmL
Tabla IV3 Coeficientes de determinacioacuten (R2) y liacutemites de cuantificacioacuten instrumentales (LOQs) de los analitos para nueve
niveles de concentracioacuten de 05 a 200 ngmL
Compuesto Coeficiente de
correlacioacuten (R2)
LOQs (ngmL) Compuesto
Coeficiente de correlacioacuten
(R2)
LOQs (ngmL)
AME 09951 04 MET 09933 01
BEN 09949 01 MYC 09950 04
BOS 09979 02 PEN 09945 02
CAR 09923 02 PYC 09955 02
CYP 09878 02 PYM 09931 01
DIM 09938 07 TEC 09958 05
FEH 09959 05 TEF 09957 01
FEP 09931 01 TBZ 09942 02
FLU 09965 02 TME 09903 01
IMI 09979 05 THI-M 09580 100
IPR 09938 01 TRI 09867 07
MAN 09979 01
En la Figura IV1 y Figura IV2 se muestran dos ejemplo de curvas de calibrado para dos compuestos IMI y
MAN respectivamente
Figura IV1 Curva de calibrado y coeficiente de determinacioacuten de IMI para UPLC-ESI-MSMS
32
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Figura IV2 Curva de calibrado y coeficiente de determinacioacuten de MAN para UPLC-ESI-MSMS
3 ESTUDIO DEL MEacuteTODO SPE
La extraccioacuten de pesticidas se llevoacute a cabo mediante extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) en doacutende se realizaron
diversos estudios con diferentes condiciones para dar con las oacuteptimas En primer lugar se llevaron a cabo los
experimentos de retencioacuten y elucioacuten sobre dos tipos distintos de adsorbentes cartuchos OASIS HLB (200mg) y
cartuchos OASIS MAX (150 mg) como fases potenciales en las que llevar a cabo la extraccioacuten de manera
selectiva Los dos tipos de cartuchos son de fase reversa pero difieren entre siacute en el fundamento de retencioacuten de
los analitos En los cartuchos OASIS HLB (200 mg) formados por divinilbenceno-N-vinilpirrolidona (DVB-VP)
la retencioacuten de los diferentes analitos tiene lugar por interacciones π-π o de Van der Waals mientras que los
cartuchos OASIS MAX (150 mg) que se probaron como alternativa para mejorar la selectividad en la extraccioacuten
cuentan con un adsorbente polimeacuterico de modo mixto formado por divinilbenceno-N-vinilpirrolidona (DVB-VP)
funcionalizado con grupos amina cuaternaria siendo el fundamento de la extraccioacuten la combinacioacuten de las
propiedades adsorbentes del cartucho HLB con un mecanismo adicional de intercambio ioacutenico (anioacutenico) [27]
Algunos autores han empleado este mecanismo para mejorar la selectividad de la extraccioacuten de forma que en la
etapa de elucioacuten ciertos pigmentos del vino quedan fuertemente retenidos en el adsorbente a diferencia de lo que
ocurre con los adsorbentes de fase reversa [51]
Para llevar a cabo la eleccioacuten del tipo de adsorbente se realizaron pruebas con 10 mL de vino blanco y tinto
conectando en serie los dos tipos de cartuchos HLB (200 mg) y MAX (150 mg) a un segundo cartucho OASIS
HLB (60 mg) La elucioacuten de los analitos se hace de forma independiente para cada cartucho y se evaluacutea si los
analitos pasan del primer cartucho hacia el segundo cartucho es decir si se supera el volumen de corte o si por
33
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
otro lado se quedan retenidos en el primero y no eluyen hacia el segundo En estas pruebas de estudio
preliminares de preparacioacuten de la muestra no se ha incluido el CYP
En la Figura IV3 podemos ver la eficacia de la extraccioacuten para vino blanco y tinto que obtenemos empleando
cartuchos OASIS MAX (150 mg) conectados en serie con cartuchos OASIS HLB (60 mg) realizando la
extraccioacuten de tres fracciones de 2 mL cada una del cartucho OASIS MAX (150 mg) y una cuarta fraccioacuten de 2
mL del cartucho OASIS HLB (60 mg)
Por otro lado en la Figura IV4 podemos ver un graacutefico de columnas en el cual comparamos la eficacia de
extraccioacuten de los cartuchos OASIS HLB (200 mg) con dos disolventes de elucioacuten distintos En dicho graacutefica el
acroacutenimo de cada compuesto consta de dos barras cuyo significado es el siguiente la barra de la izquierda indica
la eficacia de la extraccioacuten empleando acetonitrilo (ACN) como disolvente de elucioacuten y la barra de la derecha
indica la eficacia de la extraccioacuten empleando la combinacioacuten MetanolAcetonitrilo (2080) (MeOHACN) como
disolvente de elucioacuten Para este adsorbente no se detectoacute ninguacuten compuesto en la extraccioacuten del segundo
cartuchos OASIS HLB (60 mg) empleando 2 mL de metanol
Figura IV3 Distribucioacuten de los compuestos en cada fraccioacuten obtenidas con cartuchos OASIS MAX (150 mg)
utilizando 10 mL de vino tinto y blanco sacando cuatro fracciones de 2 mL cada una con metanol como
disolvente de elucioacuten
34
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Figura IV4 Distribucioacuten de los compuestos en cada fraccioacuten obtenidas con cartuchos OASIS HLB (200 mg) utilizando 10
mL de vino tinto y blanco sacando 3 fracciones de 2 mL cada una con acetonitrilo (ACN) (columna de la izquierda) y una
combinacioacuten MetanolAcetonitrilo (2080) (MeOHACN) (columna de la derecha) como disolventes de elucioacuten
A la vista de los resultados reflejados en las graacuteficas podemos afirmar que cuando se utiliza el cartucho OASIS
HLB (200 mg) eluyendo con acetonitrilo o la combinacioacuten metanolacetonitrilo (2080) los extractos son limpios
y se eluyen la mayoriacutea de los compuestos en la primera fraccioacuten Pero utilizando acetonitrilo como disolvente de
elucioacuten se encuentran problemas en la extraccioacuten de CAR FEH y TBZ para los que es necesario emplear un
volumen mayor de elucioacuten o bien seleccionar otro disolvente de elucioacuten como es la combinacioacuten
metanolacetonitrilo
35
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Por otro lado los extractos en los cartuchos OASIS MAX (150 mg) son maacutes limpios incluso utilizando metanol en
la elucioacuten pero se detecta la presencia de CAR FEP TBZ y TME en el segundo cartucho OASIS HLB (60 mg)
significando la rotura del primer cartucho para dichos analitos considerando un volumen de 10 mL de vino Los
demaacutes compuestos se podriacutean recuperar cuantitativamente en la primera fraccioacuten sacada pero la peacuterdida de estos
compuestos inclina la eleccioacuten hacia los cartuchos OASIS HLB (200 mg) con metanolacetonitrilo (2080) como
disolvente de elucioacuten para continuar con el estudio
Una vez fijado el adsorbente y el volumen de elucioacuten se prueba la eficacia de la SPE independiente de los efectos
de matriz En la Tabla IV4 se muestran las recuperaciones de la SPE tomando 10 mL de vino blanco y tinto
con un nivel de adicioacuten de 15 ngmL sacando una sola fraccioacuten de 2 mL con la combinacioacuten
metanolacetonitrilo (2080) y n=3 reacuteplicas
Tabla IV4 Recuperaciones (R plusmn SD) de SPE para 10 mL de vino (blanco y tinto) con un nivel de adicioacuten de 15 ngmL y
n=3 reacuteplicas
Compuesto Vino Tinto
R plusmn SD
Vino Blanco
R plusmnSD Compuesto
Vino Tinto
R plusmn SD
Vino Blanco
R plusmn SD
AME 82 plusmn 7 100 plusmn 1 MET 92 plusmn 6 94 plusmn 3
BEN 89 plusmn 6 97 plusmn 3 MYC 90 plusmn 9 86 plusmn 4
BOS 95 plusmn 1 100 plusmn 2 PEN 84 plusmn 10 103 plusmn 3
CAR 91 plusmn 6 104 plusmn 6 PYC 86 plusmn 5 106 plusmn 1
CYP 81 plusmn 7 102 plusmn 3 PYM 87 plusmn 12 94 plusmn 3
DIM 97 plusmn 3 86 plusmn 4 TEC 83 plusmn 10 103 plusmn 1
FEH 89 plusmn 3 88 plusmn 3 TEF 84 plusmn 5 108 plusmn 4
FEP 91 plusmn 7 104 plusmn 3 TBZ 88 plusmn 7 92 plusmn 5
FLU 91 plusmn 2 97 plusmn 4 TME 101 plusmn 1 110 plusmn 13
IMI 117 plusmn 8 101 plusmn 11 THI-M 85 plusmn 9 110 plusmn 4
IPR 89 plusmn 7 112 plusmn 4 TRI 85 plusmn 10 110 plusmn 4
MAN 88 plusmn 2 87 plusmn 2
Algunos compuestos de la matriz en el vino pueden competir con los analitos durante el proceso de ionizacioacuten
que tiene lugar en la interfase entre UPLC-MSMS por lo que para la cuantificacioacuten del rendimiento de la
ionizacioacuten por electrospray (ESI) se estudian los efectos de matriz (EM) para vino blanco y tinto considerando
dos voluacutemenes de muestra distintos 2 y 10 mL y un volumen final del extracto de 2 mL En la Tabla IV5 se
36
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
exponen los valores para cada compuesto notando que al aumentar el volumen de muestra tambieacuten se aumentan
los efectos de matriz y eacutestos siempre son mayores en vino tinto Para el caacutelculo de estos efectos de matriz (EM)
se emplea la siguiente ecuacioacuten
Donde Am Ab y Ap representan el aacuterea de pico en la sentildeal medida del analito en el extracto de la muestra con
adicioacuten en el extracto de la muestra sin adicioacuten (o blanco) y en el patroacuten antildeadido respectivamente El nivel de
adicioacuten en extracto fue de 50 ngmL por compuesto
Tabla IV5 Efectos de matriz para vino blanco y tinto con un volumen inicial de 2 y 10 mL evaluados para un nivel de adicioacuten de 50 ngmL en extracto
Compuesto
Vino blanco Vino tinto
2 mL 10 mL 2mL 10 mL
EM () CV () EM () CV () EM () CV () EM () CV()
AME 93 3 95 2 99 3 101 7
BEN 99 1 93 2 101 3 100 6
BOS 97 5 98 1 108 2 96 0
CAR 62 2 50 3 58 2 55 6
CYP 94 3 91 1 97 2 95 7
DIM 105 2 95 3 100 3 108 3
FEH 100 4 102 4 105 4 94 3
FEP 95 3 88 2 96 2 92 7
FLU 98 2 93 2 106 1 101 2
IMI 84 4 46 3 48 10 18 8
IPR 99 3 92 3 105 1 100 7
MAN 100 1 94 3 109 4 107 2
MET 98 1 89 1 99 2 99 6
MYC 105 1 100 1 103 2 96 9
PEN 98 3 97 1 101 3 99 10
PYC 98 2 92 3 102 2 98 5
PYM 95 2 87 1 94 3 85 12
TEC 95 3 99 1 101 1 102 10
TEF 99 1 92 3 101 2 104 5
TBZ 45 0 40 5 43 2 30 7
TME 60 6 19 16 36 4 16 1
THI-M 107 2 109 2 103 1 96 9
TRI 97 3 118 4 104 5 117 10
37
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Al observar los resultados podemos ver que la mayoriacutea de los compuestos dan resultados de EM en torno al
100 lo que significa que no sufren una modificacioacuten importante en la eficacia de ionizacioacuten para las muestras
con respecto a los patrones Pero tambieacuten por el contrario podemos observar que algunos compuestos como
por ejemplo en el caso de CAR TBZ IMI y TME experimentan una gran supresioacuten de sentildeal es decir EM bajos
que se acentuacutean al aumentar el volumen de muestra La atenuacioacuten en la eficacia de variacioacuten para estos cuatro
compuestos no solo se ve incrementada con el volumen de muestra si no que ademaacutes es maacutes significativa para
vino tinto que para vino blanco En base a estos resultados aunque la eficacia de la SPE fue cuantitativa para
muestras de 10 mL se limitoacute el volumen de muestra a extraer a 2 mL
Las condiciones oacuteptimas de extraccioacuten se esquematizan en un resumen en la Figura IV5
Figura IV5 Condiciones optimizadas para la extraccioacuten de pesticidas en vino
38
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
4 CARACTERIZACIOacuteN DEL MEacuteTODO DE DETERMINACIOacuteN
Con las condiciones de extraccioacuten y determinacioacuten citadas anteriormente se llevaron a cabo pruebas de
recuperaciones absolutas de los compuestos a nivel de adicioacuten de 5 y 20 ngmL sobre las muestras Para cada
muestra y nivel de adicioacuten se realizaron tres reacuteplicas de las muestras con adicioacuten y los blancos aliacutecuotas de las
mismas muestras sin adicioacuten se procesaron en duplicado Los IS se antildeadieron a nivel de 25 ngmL y cada uno se
utiliza para corregir unos determinados compuestos CAR-d3 se emplea para CAR y TBZ el CYP-d5 para CYP y
PYM el IMID-d4 para IMI y TME y el MET13C6 para el resto de compuestos Los resultados para vino blanco
comprenden en el nivel de concentracioacuten 5 ngmL el rango entre 79-122 y en el nivel de concentracioacuten 20
ngmL el rango entre 84-109 Por otro lado en el caso del vino tinto las recuperaciones se encuentran para el
nivel de concentracioacuten 5 ngmL en el rango 67-112 y para el nivel de concentracioacuten 20 ngmL entre el rango
73-132 Los resultados obtenidos en las pruebas con vino blanco y vino tinto se muestran en la Tabla IV6
Los resultados son satisfactorios ya que la mayoriacutea de los compuestos se ajustan en todos los casos al rango de
recuperacioacuten entre 70-120 Para la realizacioacuten de estas pruebas se ha eliminado de los resultados el compuesto
THI-M debido a que las concentraciones utilizadas se encuentran en el liacutemite o por debajo del LOQ en los
experimentos con muestras adicionadas a 5 ngmL
Para calcular las recuperaciones (R) se recurrioacute a la siguiente ecuacioacuten
Donde Cm Cb y Cp son la concentracioacuten medida de analito en el extracto de la muestra con adicioacuten en el extracto
de la muestra sin adicioacuten (o blanco) y en el patroacuten antildeadido respectivamente
Tabla IV6 Recuperaciones (R) para vino tinto y vino blanco evaluadas para dos niveles de concentracioacuten 5 y 20 ngmL
Compuesto
Vino tinto Vino Blanco
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
AME 97 3 105 6 104 9 96 5
BEN 88 11 105 3 101 1 98 4
BOS 91 13 110 2 88 13 97 3
39
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Compuesto
Vino tinto Vino blanco
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
CAR 99 6 99 3 122 3 109 1
CYP 91 2 111 1 101 4 100 6
DIM 112 3 110 9 102 24 99 11
FEH 91 4 108 0 102 20 95 2
FEP 89 8 102 7 94 5 84 1
FLU 95 10 104 4 109 5 100 8
IMI 73 11 115 9 80 13 100 2
IPR 84 13 99 3 111 3 99 4
MAN 88 22 112 8 112 3 99 4
MET 99 3 106 5 106 3 98 2
MYC 84 9 106 13 88 17 86 3
PEN 84 9 102 5 84 8 90 5
PYC 96 6 105 4 100 2 95 4
PYM 90 12 112 14 106 4 97 1
TEC 89 8 101 6 98 12 94 1
TEF 93 10 102 5 107 2 97 3
TBZ 94 17 115 8 79 5 106 2
TME 67 2 101 7 84 18 90 11
THI-M ne - 74 7 ne - 89 24
TRI 88 12 97 6 102 6 92 2
ne No evaluado El nivel de adicioacuten es inferior al LOQ del meacutetodo para este compuesto
Para estudiar la reproducibilidad del meacutetodo analiacutetico global (correspondientes a los datos de preparacioacuten de
muestra y determinacioacuten) es decir la concordancia de varias medidas realizadas en diacuteas diferentes se procedioacute a la
extraccioacuten en las condiciones oacuteptimas tanto de vino blanco como tinto Las extracciones y determinaciones se
realizaron durante tres diacuteas consecutivos realizando tres reacuteplicas por vino y por diacutea con un nivel de adicioacuten en
muestra de 10 ngmL un blanco de muestra cada diacutea En la Tabla IV7 se muestran los resultados como
recuperaciones (R) en condiciones de reproducibilidad obtenidos para ambos tipos de vino dando valores entre
64-116 para muestras de vino blanco y valores situados entre 68-108 para muestras de vino tinto con la
excepcioacuten del TME para el que se ha obtenido un valor no aceptable en cuanto a la exactitud medida en
condiciones de reproducibilidad A la vista de los resultados obtenidos con estas pruebas se considera necesario el
empleo de IS adicionales para la mejora en la exactitud del meacutetodo para algunos compuestos por ejemplo el
TME
40
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Tabla IV7 Recuperaciones en condiciones de reproducibilidad (R plusmn SD) para vino blanco y tinto
Compuesto
Vino tinto Vino blanco
R
10 ngmL CV ()
R
10 ngmL CV ()
AME 90 5 101 13
BEN 96 5 102 7
BOS 97 6 100 8
CAR 97 3 94 5
CYP 103 3 105 12
DIM 104 7 106 8
FEH 90 16 83 15
FEP 91 5 90 4
FLU 103 7 102 6
IMI 99 14 101 14
IPR 91 5 100 13
MAN 108 5 108 13
MET 101 5 101 5
MYC 105 16 102 14
PEN 96 11 92 10
PYC 99 12 97 12
PYM 102 4 116 8
TEC 99 9 97 16
TEF 99 8 105 11
TBZ 68 4 84 5
TME 47 13 64 10
THI-M 107 11 104 16
TRI 95 14 103 4
En la Tabla IV8 se muestran los liacutemites de cuantificacioacuten (LOQs) del meacutetodo del meacutetodo de SPE-UPLC-ESI-
MSMS obtenidos para los diferentes pesticidas Los valores obtenidos son ideacutenticos a los LOQs instrumentales
excepto en el caso de aquellos compuestos para los que se observaronfuertes efectos de matriz (Tabla IV5) En
estos casos (CAR TBZ IMI y TME) los LOQs del meacutetodo se incrementan seguacuten la atenuacioacuten de sentildeal
observada
41
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Tabla IV8 Liacutemites de cuantificacioacuten LOQs (ngmL) del meacutetodo obtendos para cada compuesto
Compuesto LOQ (ngmL) Compuesto LOQ (ngmL)
AME 04 MET 01
BEN 01 MYC 04
BOS 02 PEN 02
CAR 03 PYC 02
CYP 02 PYM 01
DIM 07 TEC 05
FEH 05 TEF 01
FEP 01 TBZ 04
FLU 02 TME 02
IMI 06 THI-M 10
IPR 01 TRI 07
MAN 01
5 APLICACIOacuteN A MUESTRAS DE VINO COMERCIALES
Una vez optimizadas las condiciones del meacutetodo y estudiadas las caracteriacutesticas del meacutetodo desarrollado se aplicoacute
a la determinacioacuten de los compuestos de intereacutes estudiados en muestras de vino blanco y vino tinto comerciales
producidos en diferentes paiacuteses En la Tabla IV9 se muestra el paiacutes de origen de cada muestra comercial
identificadas con un coacutedigo alfanumeacuterico y antildeo de produccioacuten
42
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Tabla IV9 Coacutedigo asignado para los diferentes vinos comerciales blancos y tintos analizados Indicando el paiacutes de origen y
antildeo de produccioacuten
Coacutedigo Denominacioacuten de origen Antildeo de produccioacuten
bull Vinos Blancos
W1 Alemania 2014
W2 Espantildea 2012
W3 Espantildea 2016
W4 Portugal Desconocido
W5 Francia 2015
W6 Francia 2015
W7 Espantildea 2016
bull Vinos Tintos
R1 Espantildea 2015
R2 Sudaacutefrica 2015
R3 Chile 2015
R4 Francia 2015
R5 China Desconocido
R6 Espantildea 2016
R7 Australia 2014
R8 Francia 2013
R9 Francia 2015
A continuacioacuten en la Tabla IV10 y la Tabla IV11 se recogen los resultados obtenidos en el anaacutelisis de las
muestras comerciales Los datos obtenidos corresponden en todos los casos al uso de patrones de calibracioacuten
como teacutecnica de cuantificacioacuten
Tabla IV10 Concentracioacuten (ngmL) encontradas en las diferentes muestras de vino blanco comercial analizadas mediante
SPE-UPLC-MSMS n=2 reacuteplicas y al final el sumatorio de las concentraciones encontradas
Compuesto W1 W2 W3 W4 W5 W6 W7
AME 04 nd nd nd 41 nd nd
BEN nd nd 14 nd nd nd nd
BOS 84 102 520 54 197 nd nd
CAR nd 115 56 nd nd nd nd
CYP 08 59 112 nd nd 26 nd
43
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Compuesto W1 W2 W3 W4 W5 W6 W7
DIM 14 84 400 09 32 50 nd
FEH 85 809 639 15 187 nd nd
FLU 11 05 92 nd 77 32 nd
IMI nd 136 88 29 nd nd 69
IPR 30 749 1144 14 nd nd nd
MAN nd nd nd nd nd 30 nd
MET 04 273 494 63 nd nd 172
MYC 09 nd 35 nd nd nd nd
PYM 15 469 584 08 24 35 nd
TEC 11 nd 58 nd nd nd nd
TRI nd 67 61 nd nd nd nd
sumconcentracioacuten
(ngmL) 274 2868 4358 192 558 173 862
nd no detectado
Tabla IV11 Concentracioacuten (ngmL) encontradas en las diferentes muestras de vino tinto comercial analizadas mediante
SPE-UPLC-MSMS n= 2 reacuteplicas y al final el sumatorio de las concentraciones encontradas
Compuesto R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9
AME nd nd nd 30 nd nd nd nd 16
BEN nd nd nd 07 nd nd nd nd nd
BOS nd 55 21 196 nd nd nd 73 21
CAR nd nd 04 17 249 20 nd nd nd
CYP 34 08 02 22 nd 136 nd 85 nd
DIM nd 33 nd 52 233 46 nd 61 23
FEH nd nd nd 1070 nd 10 nd 1307 14
FLU nd nd nd 20 nd nd nd nd nd
IPR 16 nd nd 17 nd 22 nd nd nd
MAN nd nd nd 17 nd nd nd 20 nd
MET 126 nd nd 14 55 313 30 44 39
MYC nd nd nd 05 nd 32 nd nd nd
PYM 19 nd 03 185 49 281 nd 24 nd
TEC 25 06 39 29 nd nd nd 21 20
TEF nd 01 12 nd nd nd nd nd nd
sumconcentracioacuten
(ngmL) 220 48 81 1681 586 860 30 1635 133
nd no detectado 44
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
En los resultados de los anaacutelisis podemos observar que en ninguna de las muestras comerciales de vino blanco
aparecieron los siguientes compuestos FEP PEN PYC TEF TBZ THI-M y TME y en los vinos tintos
comerciales no aparece a ninguna concentracioacuten FEP IMI PEN PYC TBZ TME THI-M y TRI No se
detectaron para dichas muestras de vino a niveles superiores a los LOQs del meacutetodo propuesto
Cuando se detecta un compuesto positivo se compara el pico cromatograacutefico del compuesto con el de un patroacuten
verificando la coincidencia del tiempo de retencioacuten (maacutexima diferencia 01 min) y la relacioacuten entre transiciones
(maacutexima diferencia 30 ) En la Figura IV6 y la Figura IV7 se muestran los cromatogramas para el compuesto
CYP obtenido en condiciones oacuteptimas para la muestra de vino blanco W6 y en un patroacuten de 5 ngmL
respectivamente En este caso el intervalo de tolerancia para la relacioacuten de intensidad entre transiciones es
IP2IP1=061plusmn018
Figura IV6 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el CYP en la muestra W6 (26 ngmL) Transicioacuten
superior 226gt93 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 226gt108 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades IP2IP1= 066
Figura IV7 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el CYP en un patroacuten de 5 ngmL Transicioacuten
superior 226gt93 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 226gt108 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades IP2IP1=061plusmn018
45
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Otro ejemplo de compuesto positivo en abundantes muestras comerciales de estudio es el Metalaxyl positivo con
una concentracioacuten de 04 ngmL en el vino con referencia W1 (Figura IV8) y positivo con una concentracioacuten de
313 ngmL en el vino con referencia R6 (Figura IV9) Ambas se comparan con el cromatograma de un patroacuten
de Metalaxyl de 1 ngmL (Figura IV10) El grado de concordancia en los tiempos de retencioacuten y la relacioacuten de
intensidades entre transiciones es satisfactorio
Figura IV8 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el MET en la muestra W1 (04 ngmL) Transicioacuten
superior 2801gt2201 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 2801gt1921 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades
IP2IP1=056
Figura IV9 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el MET en la muestra R6 (313 ngmL) Transicioacuten
superior 2801gt2201 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 2801gt1921 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades IP2IP1=
056
46
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Figura IV10 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el MET en un patroacuten de 1 ngmL Transicioacuten
superior 2801gt2201 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 2801gt1921 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades
IP2IP1=057plusmn017
Es de destacar que aunque se detectaron bastantes pesticidas en las diferentes muestras de vino comerciales pero
en ninguacuten caso superaron el 10 de los LMRs permitidos en uvas tal y como se recomienda ya que todaviacutea no
existen LMRs para vino en la legislacioacuten vigente No obstante el nivel total de concentracioacuten (sumatorio de
concentraciones Tabla IV10 y Tabla VI11) es significativo para varias muestras tanto de vinos blancos (W2 y
W3) como tintos (R4 y R8)
47
Capiacutetulo V Conclusiones
CAPIacuteTULO V CONCLUSIONES
En este trabajo se ha estudiado un meacutetodo para la cuantificacioacuten de pesticidas concretamente veinte fungicidas y
tres insecticidas en vino blanco y tinto En la etapa de preparacioacuten de muestra se optimizoacute la extraccioacuten en fase
soacutelida (SPE) utilizando cartuchos OASIS HLB (200 mg) compuestos por divinilbenceno-N-vinilpirrolidona
(DVB-VP) como adsorbente Como teacutecnica de determinacioacuten se utilizoacute cromatografiacutea de liacutequidos con una
interfase de electroespray acoplada a espectrometriacutea de masas (UPLC-ESI-MSMS)
Las conclusiones generales obtenidas a partir de los resultados de este proyecto relativo a la determinacioacuten de
fitosanitarios en vino son
Ante los problemas de retencioacuten que presentan los cartuchos OASIS MAX (150 mg) para algunos
compuestos los cartuchos OASIS HLB (200 mg) junto con la combinacioacuten metanolacetonitrilo (2080)
como disolvente de elucioacuten son elegidos como mejor opcioacuten en la extraccioacuten en fase soacutelida de pesticidas
en muestras con matrices complejas como es el caso del vino Asiacute se consigue la retencioacuten selectiva de
componentes de la matriz y proporciona extractos con menor porcentaje de interferencias
El meacutetodo estudiado y optimizado se puede aplicar tanto a vinos blancos como a vinos tintos procesados
a partir de distintas variedades de uvas
Los liacutemites de cuantificacioacuten (LOQs) del estudio se situacutean la mayoriacutea por debajo de 10 ngmL excepto
en el caso de THI-M que asciende al valor de 20 ngmL El rango de respuesta lineal abarca hasta 200
ngmL y el tiempo de anaacutelisis ha sido de solo 10 minutos por muestra
En todas las muestras de vino (blancos y tintos) comerciales analizadas se han detectado la presencia de
varios pesticidas sin embargo todas las concentraciones encontradas se encuentran por debajo del 10
de los LMRs fijados en uvas tal y como recomienda la legislacioacuten por lo que no se considera
preocupante
48
Capiacutetulo V Conclusioacutens
CAPIacuteTULO V CONCLUSIOacuteNS
Neste traballo estudouse un meacutetodo para a cuantificacioacuten de pesticidas en particular vinte funxicidas e tres
insecticidas en vintildeo branco e maacuteis tinto No paso da preparacioacuten da mostra optimizouse a extraccioacuten en fase
soacutelida (SPE) empregando cartuchos OASIS HLB (200 mg) compostos por divinilbenceno-N-pirrolidona (DVB-
VP) como adsorbente Para a teacutecnica de determinacioacuten utilizouse cromatografiacutea de liacutequidos con unha interfase de
electroespray acoplada a espectrometriacutea de masas (UPLC-ESI-MSMS)
As conclusioacutens xerais a obtidas a partir dos resultados deste proxecto relativo aacute determinacioacuten de pesticidas en
vintildeo son
Ante os problemas de retencioacuten que mostraban os cartuchos OASIS MAX (150 mg) para alguacuten
compostos os cartuchos OASIS HLB (200 mg) en conxunto coa mistura metanolacetonitrilo (2080)
como disolvente de elucioacuten son elexidos como mellor opcioacuten na extraccioacuten en fase soacutelida de pesticidas
en mostras con matrices complexas como eacute o caso do vintildeo Asiacute eacute conseguida a retencioacuten selectiva de
componentes da matriz e proporciona extractos con menos porcentaxe de interferencias
O meacutetodo estudado e optimizado poacutedese aplicar tanto a vintildeos brancos coma tintos procesados a partir de
diferentes variedades de uvas
Os liacutemites de cuantificacioacuten do estudo (LOQs) son maacuteis baixos de 10 ngmL agaacutes no caso do THI-M
que ascende ao valor de 20 ngmL O rango de resposta lineal cobre ata 200 ngmL e o tempo de anaacutelise
foi de soacute 10 minuacutetos por mostra
En todas as mostras de vintildeo (brancos e tintos) comercial analizadas detectouse a presenza de varios
pesticidas maacuteis poreacuten todas as concentracioacutens atopadas son inferiores ao 10 dos LMR fixados en uvas
tal e como recomenda a lexislacioacuten polo que non se considera preocupante
49
Chapter V Conclusions
CHAPTER V CONCLUSIONS
In this work we have studied a method for the quantification of pesticides specifically twenty fungicides and
three insecticides in white and red wine In the sample preparation step the solid phase extraction was optimized
using cartridges OASIS HLB (200 mg) containing divinylbenzene-N-vinylpyrrolidone (DVB-VP) as adsorbent
As determination technique ultraperformance liquid chromatography was used with an electrospray interface
coupled to mass spectrometry (UPLC-ESI-MS7MS)
The general conclusions drawn from the results of this project concerning the determination of pesticides in wine
are
Due to the retention problems presented by the OASIS MAX sorbent (150 mg) for some compounds of
this project the cartridges OASIS HLB (200 mg) together with the methanolacetonitrile (2080) mixture
are chosen as the best option in the solid phase extraction of pesticides in samples with complex
matrices as is the case with the wine
The method studied and optimized can be applied to both white and red wines obtained from different
varieties of grapes
The limits of quantification (LOQs) were below 10 ngmL for most of the compounds except in the
case of THI-M with a LOQ of to 10 ngmL The linear response range covers up to 200 ngmL and the
analysis time was only 10 minutes per sample
In all commercial wine samples (white and red) analyzed the presence of several pesticides was
conformed however all the concentrations obtained are below 10 of the Maximum residue
levels(MRLs) fixed in grapes as recommended by legislation
50
VI Bibliografiacutea VI BIBLIOGRAFIacuteA [1] Ministerio de agricultura y pesca alimentacioacuten y medio ambiente mhttpwwwmapamagobesescalidad-y-evaluacion-ambientaltemasproductos-quimicosfitosanitarios (Acceso el diacutea 11052017) [2] httpwwwcricyteduarenciclopediaterminosProducFitohtm (Acceso el diacutea 11052017) [3] WERNER BALTES ldquoQuiacutemica de los alimentosrdquo Editorial Acribia SA 2007 Capiacutetulo 11 ldquoResiduos en los alimentosrdquo paacuteginas 206-217
[4] RLabrada JCCaseley CParker ldquoESTUDIO FAO PRODUCCIOacuteN Y PROTECCIOacuteN VEGETAL 120rdquo Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentacioacuten Roma 1996 ISSN 1014- Capiacutetulo 10 Herbicidas httpwwwfaoorgdocrepT1147St1147s00htmContents (Acceso el diacutea 12052017)
[5] Taberner Palou Andreu Cirujeda Ranzenberger Alicia Zaragoza Larios Carlos ldquoManejo de poblaciones de malezas resistentes a herbicidasrdquo (FAO Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura) 100 preguntas sobre resistencia PDF sacado de httpwwwfaoorg3a-a1422spdf (Acceso el diacutea 12052017) [6] BISSET Juan A Uso correcto de insecticidas control de la resistencia Revista Cubana de Medicina Tropical 2002 vol 54 no 3 p 202-219 [7] DEVINE Gregor J EZA Dominique Ogusuku Elena FURLONGMichael J Uso de insecticidas contexto y consecuencias ecoloacutegicas Revista peruana de medicina experimental y Salud Puacuteblica 2008 vol 25 no 1 p 74-100 [8] Ministerio de agricultura y ganaderiacutea (proteccioacuten agropecuaria servicio de diagnoacutestico fitosanitario) de costa Rica httpwwwmaggocrbibliotecavirtualH20-5054pdf (Acceso el diacutea 11052017) [9] GEPP V MONDINO P Control quiacutemico 2011 PDF obtenido de httpwwwpvfagroeduuyfitopatodocscursosfitopatoMaterialesGuiasC-QUIMICOpdf (Acceso el diacutea 772017) [10] ROSSLENBROICH Hans-Juergen STUEBLER Dietrich Botrytis cinereamdashhistory of chemical control and novel fungicides for its management Crop Protection 2000 vol 19 no 8 p 557-561 [11] Figura 11 httpwwwvitiviniculturanetbotritis-o-podredumbre-gris-botrytis-cinerea-pershtml (Acceso el diacutea 12052017) [12] CAMPBELL Paul BENDEK Carlos LATORRE Bernardo A Riesgo de oiacutedio (Erysiphe necator) de la vid en relacioacuten con el desarrollo de los racimos Ciencia e investigacioacuten agraria 2007 vol 34 no 1 p 5-11 [13] ldquoCoacutemo combatir el oiacutedio de la vidrdquo Jose Javier Peacuterez de Obanos Castillo PDF sacado de httpswwwnavarraesNRrdonlyres05E65D9B-D1A2-4EAD-9A63-AFF1D3215552135109Comocombatireloidiodelavidpdf (Acceso el diacutea 12052017) [14] Imagen 12 sacadas las 3 de httpwwwvitiviniculturanetoidio-de-la-vidhtml (Acceso el diacutea 12052017) [15] BARRIOS Gonccedilal REYES Joan Modelizacioacuten del Mildiu de la Vid 2004 httpwwwruralcatnetmigracio_resources617683_mildiusPDF (Acceso el diacutea 12052017) [16] Imaacutegenes sacadas de httpwwwvitiviniculturanetmildiu-de-la-vid-enfermedades-vinahtml (Acceso el diacutea 13052017) [17] HUQ Mainul MEISNER Craig DASGUPTA Susmita Health effects and pesticide perception as determinants of pesticide use evidence from Bangladesh httpagrisfaoorgagris-searchsearchdorecordID=US2012411738 (Acceso el diacutea 13052017)
51
IV Bibliografiacutea [18] BADII Mohammad H LANDEROS Jeroacutenimo Plaguicidas que afectan a la salud humana y la sustentabilidad CULCyT 2015 no 19 Revista vista en httpopenjournaluacjmxojsindexphpculcytarticleview454 (Acceso el diacutea 772017) [19] OLEA Nicolaacutes FERNAacuteNDEZ Mariana F Plaguicidas persistentes En Congreso Implementacioacuten del Convenio de Contaminantes Orgaacutenicos Persistentes Madrid 2001 p 26-27 [20] httpwwwfaoorgfao-who-codexalimentariusabout-codexes (Acceso el diacutea 14052017) [21] httpeceuropaeufoodplantpesticidesmax_residue_levels_en (Acceso el diacutea 14052017 [22] ORDONtildeEZ Juan A Cambero Rodriacuteguez MI Fernaacutendez Aacutelvarez L Garciacutea Sanz ML Garciacutea de Fernando Minguilloacuten GD de la Hoz Perales L Selgas Cortecero MD Tecnologiacutea de los alimentos Volumen 1 Componentes de los Alimentos y Procesos Siacutentesis Madrid 1998paacutegs 349-351 [23] CELA Rafael Casais Maria del Carmen Lorenzo Rosa Antonia Teacutecnicas de separacioacuten en quiacutemica analiacutetica Siacutentesis 2002 Capiacutetulo 11 Extraccioacuten y lixiviacioacuten por disolvente (paacutegs206-260) [24] CANTWELL Frederick F LOSIER Manon Liquidmdashliquid extraction Comprehensive Analytical Chemistry 2002 vol 37 p 297-340 [25] Imagen de LLE sacada de httpprocesosbiowikispacescomExtracciC3B3n+liquido-liquido (Acceso el diacutea 15052017) [26] HENNION Marie-Claire Solid-phase extraction method development sorbents and coupling with liquid chromatography Journal of Chromatography A 1999 vol 856 no 1 p 3-54 [27] CELA Rafael Casais Maria del Carmen Lorenzo Rosa Antonia Teacutecnicas de separacioacuten en quiacutemica analiacutetica Siacutentesis 2002 Capiacutetulo 16 Teacutecnicas de adsorcioacuten y absorcioacuten en la preparacioacuten de muestras Extraccioacuten y microextraccioacuten en fase soacutelida (paacutegs520-555) [28] Imagen spe sacada httptoxicocbblogspotcomes201310las-intoxicaciones-con-farmacoshtml (Acceso el diacutea 15052017) [29] Chaacutefer Pericaacutes Consuelo Acoplamiento microextraccioacuten en fase soacutelida-cromatografiacutea (2006) httprodericuveshandle1055014940 (Acceso el diacutea 16052017) [30] Imagen SPME httpwwwscieloorgcoscielophpscript=sci_arttextamppid=S0122-53832002000100005 (Acceso el diacutea 16052017) [31] MONTES GOYANES Rosa Mariacutea Avances en teacutecnicas de microextraccioacuten para la determinacioacuten de compuestos traza en muestras medioambientales y alimentarias Teacutesis doctoral Noviembre 2009 (Paacutegs 34-55) [32] LEHOTAY Steven J Ae Son Kyung KwonHyeyoung Koesukwiwat Urairat Fu Wusheng Mastovska Katerina Hoh Eunha Leepipatpiboon Natchanun Comparison of QuEChERS sample preparation methods for the analysis of pesticide residues in fruits and vegetables Journal of Chromatography A 2010 vol 1217 no 16 p 2548-2560 [33] Imagen QueChERS httpswwwresearchgatenetpublication279221361_QuEChERS_A_Sample_Preparation_for_Extraction_of_Carbaryl_from_Rat_Feces (Acceso el diacutea 16052017) [34] STASHENKO Elena E MARTIacuteNEZ Jairo Reneacute Preparacioacuten de la muestra un paso crucial para el anaacutelisis por GC-MS Uma publicaccedilatildeo trimestral do Instituto Internacional de Cromatografia (IIC) Ciecircncia Cromatograacutefica 2011 vol 3 no 1 [35] Imagen GC-MS httpsorgspectroscopyintblogspotcomes201411gas-chromatography-mass-spectrometry-gchtml (Acceso el diacutea 17052017) [36] httpwwwactlabscompageaspxmenu=65ampapp=221ampcat1=534amptp=2amplk=no (Acceso el diacutea 17052017)
52
IV Bibliografiacutea [37] Quintela O Cruz A Concheiro M De Castro A amp Loacutepez-Rivadulla M (2005) Metodologiacutea LC-MS Aspectos generales de la teacutecnica y sus aplicaciones en el campo de la toxicologiacutea Rev Toxicol 22 paacutegs7-14 [38] Imagen LC-MS httpsuploadwikimediaorgwikipediaenff9Liquid_chromatography_tandem_Mass_spectrometry_diagrampng (visto 18052017) [39] Vargas de la Cruz Celia Bertha Adaptacioacuten de la Metodologiacutea Analiacutetica para la determinacioacuten de residuos de plaguicidas en frutas nativas de exportacioacuten mediante Uplc-MsMs (2012) Tesis obtenida en http20062146130handlecybertesis2331 (Acceso el diacutea 772017) [40] ROMERO GONZAacuteLEZ Roberto Fernaacutendez Moreno Joseacute Luis Plaza Bolantildeos Patricia Garrido Frenich Antonia Martiacutenez Vidal Joseacute Luis Empleo de la espectrometriacutea de masas como herramienta para la determinacioacuten de toacutexicos en alimentos hacia la seguridad alimentaria Revista Espantildeola de salud puacuteblica 2007 vol 81 no 5 p 461-474 [41] PAYAacute Andrus Fundamento y Funciones de la Espectrometriacutea de Masas Universidad de Valencia Espantildea 2006 httpmuraluvescaloan (Acceso el diacutea 19052017) [42] Imagen MS sacada de httpsesslidesharenetMaYaTorrezespectrometria-demasas (Acceso el diacutea 21052017) [43] ECONOMOU Anastasios Botitsi Helen Antoniou Spyros Tsipi Despina Determination of multi-class pesticides in wines by solid-phase extraction and liquid chromatography-tandem mass spectrometry Journal of Chromatography A 2009 vol 1216 no 31 p 5856-5867 [44] FONTANA A R Rodriacuteguez I Ramil M Altamirano JC Cela R Liquid chromatography time-of-flight mass spectrometry following sorptive microextraction for the determination of fungicide residues in wine Analytical and bioanalytical chemistry 2011 vol 401 no 2 p 767-775 [45] PELAJIĆ Maja G Peček DM Pavlović DV Čepo Novel multiresidue method for determination of pesticides in red wine using gas chromatographyndashmass spectrometry and solid phase extraction Food chemistry 2016 vol 200 p 98-106 [46] Ignaz J Buerge Juumlrgen Krauss Rociacuteo Loacutepez-Cabeza Werner Siegfried Michael Stuumlssi Felix E Wettstein Thomas Poiger Stereoselective Metabolism of the Sterol Biosynthesis Inhibitor Fungicides Fenpropidin Fenpropimorph and Spiroxamine in Grapes Sugar Beets and Wheat Journal of Agricultural and Food Chemistry 2016 vol 64 no 26 p 5301-5309 [47] M Hu X Liu F Dong J Xu S Li H Xu Y Zheng Determination of ametoctradin residue in fruits and vegetables by modified quick easy cheap effective rugged and safe method using ultra-performance liquid chromatographytandem mass spectrometry Food chemistry 2015 vol 175 p 395-400 [48] WALORCZYK Stanisław DROŻDŻYŃSKI Dariusz GNUSOWSKI Bogusław Multiresidue determination of 160 pesticides in wines employing mixed-mode dispersive-solid phase extraction and gas chromatographyndashtandem mass spectrometry Talanta 2011 vol 85 no 4 p 1856-1870 [49] Tianyang Guo Pingping Fang Juanjuan Jiang Feng Zhan Wei Yong Jiahui Liu YiYang Dong Rapid screening and quantification of residual pesticides and illegal adulterants in red wine by direct analysis in real time mass spectrometry Journal of Chromatography A 2016 vol 1471 p 27-3 [50] GONZAacuteLEZ-RODRIacuteGUEZ R M CANCHO-GRANDE B SIMAL-GAacuteNDARA J Decay of fungicide residues during vinification of white grapes harvested after the application of some new active substances against downy mildew Food chemistry 2011 vol 125 no 2 p 549-560 [51] CARPINTEIRO I Ramil M Rodriacuteguez I Cela R Determination of fungicides in wine by mixed-mode solid phase extraction and liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry Journal of Chromatography A 2010 vol 1217 no 48 p 7484-7492
53
Capiacutetulo I Introduccioacuten
agricultura puede provocar un efecto negativo en el ambiente si es utilizada en altas dosis El uso prolongado de
un mismo herbicida puede causar problemas de resistencia de malezas fenoacutemeno que consiste en la aparicioacuten de
biotipos tolerantes de una especie la cual anteriormente era controlada por el herbicida [5]
Por otro lado los insecticidas son fitosanitarios destinados a controlar el ataque de insectos y para eso existen
distintos caminos a traveacutes de los que pueden actuar siendo envenenamiento por contacto en doacutende el insecticida
penetra a traveacutes de la cutiacutecula del insecto hasta alcanzar el sitio activo envenenamiento oral en doacutende el
insecticida es ingerido y absorbido a traveacutes del intestino o tambieacuten por fumigaciones en doacutende el insecticida
penetra en el cuerpo del insecto a traveacutes de los espiraacuteculos del sistema respiratorio Pero al igual que pasa con los
herbicidas los insectos tambieacuten desarrollan resistencia a los insecticidas debido al contacto continuo con estos
Esta resistencia puede ser expresada por varios caminos que el insecto no entre en contacto con la deposicioacuten del
insecticida que se modifique la composicioacuten del exoesqueleto inhibiendo asiacute la penetracioacuten del insecticida la
modificacioacuten del sitio activo para el fitosanitario reduciendo la sensibilidad a la forma activa del insecticida o que
la viacutea metaboacutelica del insecto se modifique negando el metabolismo del compuesto aplicado en su forma toacutexica
[6] Aunque por lo general otros aspectos de la agricultura moderna tienen un mayor impacto en el medio
ambiente los insecticidas se encuentran entre las herramientas agriacutecolas que estaacuten maacutes asociadas con el dantildeo
ambiental Su objetivo especiacutefico es matar a plagas de insectos por lo que puede que tenga un impacto letal en
organismos que no son su objetivo [7]
Por uacuteltimo los fungicidas estaacuten destinados tanto a combatir las plagas de hongos como a combatir las
enfermedades fungosas de las plantas ya sea matando retrasando el desarrollo o inhibiendo la reproduccioacuten de
los hongos Los fungicidas en general se dividen atendiendo al modo de accioacuten de eacutestos en fungicidas de
contacto fungicidas penetrantes o fungicidas sistemaacuteticos
Los fungicidas de contacto protegen uacutenicamente el sitio de aplicacioacuten contra las plagas quedando en el exterior de
la planta de eacutesta manera sin penetrar en el tejido vegetal forman una peliacutecula protectora Cuando alguna espora
de un hongo llega a su superficie se encuentra con esa peliacutecula que le impide penetrar o en su defecto germinar
En el caso de que atraviesen el tejido vegetal bien sea por una alta dosis o por una rotura en las paredes de la
planta se convierten en un producto toacutexico para ella llegando a quemarla
Otro tipo de fungicidas los fungicidas penetrantes como su nombre indica se introducen en el tejido vegetal y
una vez dentro cuentan con muy poca movilidad es decir no circulan por los vasos conductores Al tener la
capacidad de entrar en la planta pueden combatir a los hongos que ya se encuentren dentro de eacutesta pero no
pueden ser toacutexicos para ella porque de lo contrario la dantildeariacutean
Por uacuteltimo nos encontramos con los fungicidas sistemaacuteticos Este tipo de fungicidas actuacutean protegiendo a la
planta contra las plagas en distintas zonas por transfusioacuten del fitosanitario dentro de la misma Esto sucede porque
penetran en el tejido vegetal y circulan por ella a traveacutes de la corriente de los vasos conductores
El meacutetodo de accioacuten de los fungicidas se basa en interferir en el metabolismo de los hongos ya sea por un
4
Capiacutetulo I Introduccioacuten
ataque en la produccioacuten de energiacutea la inhibicioacuten de la mitosis o inhibiendo la formacioacuten de quitina que se trata
del compuesto principal de la pared celular de los hongos y que por ende influye en la permeabilidad de la
membrana [8] [9]
Las enfermedades fuacutengicas fundamentales que nos podemos encontrar en las uvas de la vid son la botritis el oiacutedio
y el mildium las cuales pueden llegar a causar peacuterdidas importantes en viticultura
La enfermedad de la botritis tambieacuten llamada moho gris estaacute causada
por el hongo Botrytis cineacuterea y se puede encontrar en todo el mundo
infectando a un amplio nuacutemero de plantas Se trata de uno de los
patoacutegenos fuacutengicos maacutes interesantes debido a que puede vivir tanto
de forma patoloacutegica produciendo la enfermedad como
alimentaacutendose de materia orgaacutenica en descomposicioacuten La accioacuten
fuacutengica del hongo se lleva a cabo cuando las uvas empiezan a
acumular azuacutecar pudiendo ser muy devastador en algunas
condiciones sobre todo en cultivos empapados por la lluvia o
localizados en un ambiente huacutemedo y con viento produciendo la peacuterdida de los racimos de uvas que son
infectados O por el contrario en otro tipo de condiciones ambientales de sequedad despueacutes de unas
condiciones de humedad dicho hongo le confiere beneficios a ciertos tipos de vino blanco [10]
El oiacutedio es una enfermedad causada por la especie Uncinula necator la cual afecta tanto al rendimiento como a la
calidad de las uvas y altera las cualidades de sus derivados vino mosto etc El proceso de infeccioacuten del oiacutedio
tiene lugar siguiendo un ciclo de reproduccioacuten en las distintas estaciones del antildeo El riesgo de infeccioacuten viene
dado en funcioacuten de la temperatura oacuteptima entre 25-30ordmC humedad del ambiente en el que se encuentre y
tambieacuten en funcioacuten de la temporada siendo maacutes resistentes los racimos de uvas a medida que van madurando El
hongo afecta a todas las parte de la vid hojas tallo y racimos las cuales presentan siacutentomas distintos Las hojas se
vuelven de un color amarillento y se cubren de un polvo fino blanco grisaacuteceo En el tallo el oiacutedio se manifiesta a
traveacutes de manchas difuminadas con coloracioacuten inicial verde oscuro volvieacutendose cada vez maacutes oscuras al final y si
ocurre un ataque fuerte puede desembocar en que el tallo se acabe secando y por consiguiente disminuye la
produccioacuten Pero el ataque maacutes fuerte se produce en los racimos empezando por cubrirse del polvillo blanco
grisaacuteceo y continuando con que el oiacutedio detiene el crecimiento de la piel de la uva con la consecuencia que la uva
se agrieta Esta enfermedad produce unos dantildeos directos en la cantidad y calidad de la cosecha y si no se toman
medidas de prevencioacuten las peacuterdidas pueden llegar a ser totales [12] [13]
Figura I1Enfermedad de botritis en un racimo de uvas [11]
Figura I2 Enfermedad del oiacutedio en hoja tallo y racimo de izquierda a derecha [14] 5
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Por uacuteltimo el mildium o mildiu es una enfermedad producida por el hongo Plasmopara vitiacutecola considerada como
una de las peores enfermedades del cultivo siempre y cuando esteacuten en las condiciones ambientales favorables para
su desarrollo Dichas condiciones oacuteptimas para la propagacioacuten de la enfermedad son las lluvias al amanecer o al
anochecer con una temperatura en un rango de 20-25 ordmC El periacuteodo sensible de la vegetacioacuten de la vintildea es a
partir de una longitud de 10 cm en adelante siendo maacutexima en el periacuteodo de mayor crecimiento de la planta Por
otro lado la sensibilidad del racimo empieza desde su formacioacuten hasta que las uvas al florecer alcanzan el tamantildeo
similar al de un guisante pero de ahiacute en adelante la sensibilidad se ve disminuida Dicho hongo cuenta con un
ciclo reproductivo abarcando varias fases desde la fase de contaminacioacuten siendo el principio hasta la fase de pro-
pagacioacuten Afecta a todos los oacuterganos verdes de la vid y sus siacutentomas son variados en las distintas zonas de eacutesta
En las caras de las hojas aparecen unas manchas amarillentas en los racimos cuando se aproxima la floracioacuten los
que se encuentran infectados se curvan secaacutendose y cubrieacutendose de una pelusa blanquecina y cuando alcanzan el
tamantildeo de un guisante en adelante las uvas de los racimos afectados se van oscureciendo y secando sin que apa-
rezca la fructificacioacuten del hongo ademaacutes de oscurecerse el tallo [15]
12 Estructura propiedades fiacutesico-quiacutemicas y clasificacioacuten
En este trabajo nos centramos en estudiar los residuos de veintitreacutes fitosanitarios tipo fungicida principalmente
aunque tambieacuten alguacuten residuo tipo insecticida Las caracteriacutesticas maacutes importantes de dichos compuestos seraacuten
recogidas en la Tabla I1 que incluye estructuras clasificacioacuten (se ha usado el acroacutenimo ldquoFrdquo en caso de ser
fungicidas e ldquoIrdquo en caso de ser insecticidas) y propiedades fiacutesico-quiacutemicas Las propiedades fiacutesico-quiacutemicas que
pueden resultar maacutes relevantes para este estudio son el pKa ya que la mayoriacutea se trata de compuestos baacutesicos
aunque se encuentre alguacuten aacutecido deacutebil como es por ejemplo el Fenhexamid y Kow describiendo el coeficiente de
reparto entre octanolagua empleado para medir el grado de hidrofobidad que proporciona una estimacioacuten de
la posible distribucioacuten del analito entre materia orgaacutenica y agua
Figura I3 Enfermedad del mildium en la imagen de la izquierda coacutemo afecta a las hojas imagen central coacutemo
afecta a los racimos cuaacutendo estaacuten infectados al comenzar la floracioacuten y en la imagen de la derecha coacutemo afecta a
los racimos en doacutende las uvas tienen tamantildeo mayor al de un guisante [16]
6
Compuesto Estructura Nombre sistemaacutetico Foacutermula CAS Uso ordflog (kow) pKa
Ametoctradin
(AME)
5-ethyl-6-
octyl[124]triazolo[15-
a]pyrimidin-7-amine
C15H25N5 865318-97-4 F 440 278
Benalaxyl
(BEN)
Methyl-N-(phenylacetyl)-N-
(26-xylyl)-D-alaninate C20H23NO3 98243-83-5 F 368 -
Boscalid
(BOS)
2-Chloro-N-(4rsquo-
chlorobiphenyl-2-yl)-
nicotinamide
C18H12Cl2N2O 188425-85-6 F 296 -
Carbendazim
(CAR)
Methyl 2-benzimidazole
carbamate C9H9N3O2 10605-21-7 F 148 420
Cyprodinil
(CYP)
4-Cyclopropyl-6-methyl-N-
phenilpyrimidin-2-amine C14H15N3 121552-61-2 F 400 309
Dimethomorph
(DIM)
(2E)-3-(4-chlorophenyl)-3-(34-
dimethoxyphenyl)-1-
(morpholin-4-yl)prop-2-en-1-
one
C21H22ClNO4 110488-70-5 F 268 -13
Fenhexamid
(FEH)
N-(23-dichloro-4-
hydroxyphenyl)-1-methyl-
cyclohexanecarboxamide
C14H17Cl2NO2 126833-17-8 F 351 73
Fenpropidin
(FEP)
1-[(RS)-3-(4-tert-butylphenyl)-
2-methylpropyl]piperidine C19H31N 67306-00-7 F 26 1013
Fluopicolid
(FLU)
26-dichloro-N-[3-chloro-5-
(trifluoromethyl)-2-
pyridylmethyl]benzamide
C14H8Cl3F3N2O 239110-15-7 F 29 -
Imidacloprid
(IMI)
(E)-1-(6-chloro-3-
pyridylmethyl)-N-
nitroimidazolidin-2-
ylideneamine
C9H10ClN5O2 138261-41-3 I 057 -
Iprovalicarb
(IPR)
Isopropyl (S)-2-methyl-1-[1-(p-
tolyl)ethylcarbamoyl]propyl-
carbamate
C18H28N2O3 140923-17-7 F 32 -
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Tabla I1 Estructura clasificacioacuten y propiedades fiacutesico-quiacutemicas de intereacutes para los analitos de estudio
7
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Compuesto Estructura Nombre sistemaacutetico Foacutermula CAS Uso ordflog (kow) pKa
Mandipropamid
(MAN)
2-(4-chlorophenyl)-N-[3-
methoxy-4-(2-
propynyloxy)phenethyl]-2-(2-
propynyloxy)acetamide
C23H22ClNO4 374726-62-2 F 32 -
Metalaxyl
(MET)
N-(26-dimethylphenyl)-N-
(methoxyacetyl)-DL-alanine
methyl ester
C15H21NO4 57837-19-1 F 175 000
Myclobutanil
(MYC)
2-(4-chlorophenyl)-2-(1H-
124-triazol-1-
ylmethyl)hexanentrile
C15H17ClN4 88671-89-0 F 289 230
Penconazol
(PEN)
1-[2-(24-
dichlorophenyl)pentyl]-1H-
124-triazole
C13H15Cl2N3 66246-88-6 F 372 151
Pyraclostrobin
(PYC)
Methyl2-[1-(4-chlorophenyl)-
1H-pyrazol-3-
yloxymethyl]phenylmetoxy-
carbamate
C19H18ClN3O4 175013-18-0 F 399 -
Pyrimethanil
(PYM)
4-6-dimethyl-N-phenyl-2-
pyrimidinamine C12H13N3 53112-28-0 F 284 352
Tebuconazol
(TEC)
1-(4-chlorophenyl)-44-
dimethyl-3-(1H-124-triazol-1-
ylmethyl)-3-pentanol
C16H22ClN3O 107534-96-3 F 370 500
Tebufenozid
(TEF)
35-dimethylbenzoic acid 1-
(11-dimethylethyl)-2-(4-
ethylbenzoyl)hidrazide
C22H28N2O2 112410-23-8 I 425 -
Thiabendazol
(TBZ)
2-(13-thiazol-4-yl)-1H-
benzimidazole C10H7N3S 148-79-8 F 239 473
Thiamethoxam
(TME)
3-[(2-chloro-5-
thiazolyl)methyl]tetrahydro-5-
methyl-N-nitro-4H-135-
oxadiazin-4-imine
C8H10ClN5O3S 153719-23-4 I -013 -
Thiophanate-
methyl
(THI-M)
DimethylNNrsquo-[12-
phenylenebis(azanediylcarbono
thioyl)] dicarbamate
C12H14N4O4S2 23564-05-8 F 145 728
Triadimenol
(TRI)
1-(4-chlorophenoxy)-33-
dimethyl-1-(1H-124-triazol-1-
yl)-2-butanol
C14H18ClN3O2 55219-65-3 F 318
-
ordf Valores para la forma neutra 8
Capiacutetulo I Introduccioacuten
13 Toxicidad de los pesticidas
En los uacuteltimos antildeos el uso indiscriminado de pesticidas de siacutentesis en agricultura ha creado graves problemas de
salud y medioambientales ya que su uso debido al aumento de la poblacioacuten y por consiguiente de la actividad
agraria se ha incrementado considerablemente Durante las tres uacuteltimas deacutecadas una estimacioacuten dada por la
Organizacioacuten Mundial de la Salud y el Programa de las Naciones Unidas para el Medio Ambiente revela que
aproximadamente cerca de 20000 personas al antildeo mueren generalmente agricultores por exposicioacuten continuada
a alguno de estos toacutexicos En la mayoriacutea de los casos los agricultores utilizan los pesticidas de forma que las
cantidades se desviacutean significativamente de las recomendadas ya que asocian cantidades maacutes altas con mayor
efectividad y velocidad de accioacuten El mal uso de dichos toacutexicos se ve en los signos presentes en los ecosistemas
afectados pudiendo llegar a ser perjudiciales para la salud humana Estos riesgos que causan tanto en la salud
como en el medioambiente pueden ser reducidos o en su defecto evitados mediante la educacioacuten sobre este tipo
de toacutexicos con el fin de frenar su uso excesivo y descontrolado [17]
Desde el punto de vista medioambiental los fitosanitarios empleados en un cultivo pueden persistir en los
distintos medios tierra aire o agua y afectar tanto a ecosistemas terrestres como acuaacuteticos En los sistemas
terrestres los suelos son contaminados mediante la aplicacioacuten del toacutexico de forma directa o como deposicioacuten del
resultado de una suspensioacuten aeacuterea Eacutestos pueden persistir desde varios diacuteas hasta varios antildeos ya que el suelo
retiene y moviliza el toacutexico despueacutes de su emisioacuten Los que persisten maacutes tiempo en el medioambiente tienen una
mayor probabilidad de interaccionar con otros elementos del sistema y si su vida media es mayor a la frecuencia
con la que se aplica el pesticida tienden a acumularse tanto en el suelo como en las especies que habitan en eacutel Por
otro lado el agua es contaminada por pesticidas bien por aplicacioacuten directa por estar presentes en las
precipitaciones de la atmoacutesfera o bien por la movilidad que tienen desde el suelo Tanto los pesticidas solubles
como los insolubles interaccionan con los ecosistemas acuaacuteticos los hidrosolubles persisten maacutes tiempo
solubilizados en agua mientras que los otros se asocian a los sedimentos y se concentran en las especies que
habitan el medio acuaacutetico [18]
Como consecuencia de la amplia distribucioacuten de los toacutexicos en aire suelo y agua se produce una acumulacioacuten de
ellos en los elementos que contribuyen a la alimentacioacuten humana ya que su amplio uso hace que el contacto con
los plaguicidas por parte de personas y animales sea inevitable La contaminacioacuten de los alimentos se puede
presentar por aplicacioacuten directa de los pesticidas el uso de eacutestos durante el manejo transporte y almacenamiento
de los productos comestibles o por su acumulacioacuten en la cadena troacutefica Son bioacumulables en el organismo
debido a su caraacutecter lipofiacutelico lo que les confiere una vida media en los tejidos larga La exposicioacuten a pesticidas
persistentes no tiene la misma repercusioacuten en cada uno de los individuos expuestos sino que se considera criacutetica la
exposicioacuten durante la etapas embrionaria fetal y primeros antildeos de vida en doacutende se transmite de madres a hijos
mediante la gestacioacuten y la lactancia como resultado de la acumulacioacuten en el tejido graso de la madre [19]
9
Capiacutetulo I Introduccioacuten
14 Legislacioacuten
El aumento del uso de fitosanitarios en actividades relacionadas con la produccioacuten de alimentos para consumo
humano o animal tambieacuten desembocoacute en una preocupacioacuten social debido a su toxicidad y bioacumulacioacuten En
respuesta la Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura (FAO) en colaboracioacuten
con la Organizacioacuten Mundial de la Salud (OMS) pusieron en marcha un programa Codex Alimentarius cuyo
objetivo a traveacutes de sus normas y coacutedigos de praacutecticas alimentarias internacionales es garantizar la calidad e
inocuidad de los alimentos que estaacuten al alcance de cualquier persona Con estas normas internacionales los
consumidores pueden confiar en la calidad de los alimentos independientemente de su origen geograacutefico [20]
Todos los alimentos destinados al consumo humano o animal en la Unioacuten Europea estaacuten sujetos a un liacutemite
maacuteximo de residuos de plaguicidas para la proteccioacuten de la salud humana y animal Actualmente en lo referente a
legislacioacuten para el control de la cantidad del toacutexico en la uva estaacute vigente el Reglamento 3962005 del Parlamento
Europeo y del Consejo de 23 de febrero de 2005 referido a la regulacioacuten de los liacutemites maacuteximos de residuos de
plaguicidas en alimentos y piensos de origen vegetal y animal El liacutemite maacuteximo de residuos (LMR) se define co-
mo el nivel maacutes alto de un residuo de un pesticida que se tolera de manera legal sobre los alimentos o piensos
cuando se aplican correctamente Las cantidades de residuos que se encuentren deben ser lo maacutes bajas posible
para garantizar la seguridad en la alimentacioacuten de los consumidores Dichos liacutemites maacuteximos de residuos estaacuten
fijados por la Comisioacuten Europea pudieacutendose encontrar en su base de datos LMR [21]
A continuacioacuten en la Tabla I2 se resumen los LMRs de los compuestos de este estudio en uvas de vinificacioacuten
en unidades de mgkg de uva En el caso del vino no hay legislacioacuten en lo referente a estos pesticidas solamente
la recomendacioacuten de no superar el 10 del valor del LMR en uva
Compuesto LMRs (mgkg uva) Compuesto LMRs (mgkg uva)
AME 6 MET 1
BEN 03 MYC 1
BOS 5 PEN 02
CAR 05 PYC 2
CYP 3 PYM 5
DIM 3 TEC 1
FEH 15 TEF 3
FEP 001 TBZ 005
FLU 2 TME 04
IMI 1 THI-M 3
IPR 2 TRI 2
MAN 2
Tabla I2 Liacutemites maacuteximos de residuos permitidos para los compuestos estudiados en uvas
10
Capiacutetulo I Introduccioacuten
2 MEacuteTODOS DE PREPARACIOacuteN DE MUESTRA APLICADOS A MUESTRAS DE VINO
21 Extraccioacuten liacutequido-liacutequido (LLE)
Se entiende por extraccioacuten liacutequido-liacutequido al meacutetodo mediante el cual un analito de intereacutes se separa por el
contacto con otra fase en la cual tiene mayor afinidad de la matriz en la que se halle Los procesos de extraccioacuten
implican dos fases y requieren tres pasos sucesivos mezcla de materia prima y disolvente separacioacuten de las dos
fases despueacutes del contacto y eliminacioacuten del disolvente que contiene el analito [22]
La extraccioacuten liacutequido-liacutequido (LLE) se basa en la distribucioacuten
de un analito entre dos fases liacutequidas inmiscibles en las
cuales analito y matriz tienen solubilidades diferentes
Principalmente una de las fases es un medio acuoso en
general se trata de la muestra y la otra un disolvente
orgaacutenico La selectividad y eficacia de este meacutetodo vienen
determinadas por la eleccioacuten del disolvente y por los factores
que pueden afectar al proceso de equilibrio (pH adiccioacuten de
sales neutras en la fase acuosa para reducir la solubilidad del
analito etc) [23] Esta teacutecnica permite llevar a cabo extracciones para un rango muy amplio de analitos siendo
una de las maacutes antiguas para la preparacioacuten de muestras en el anaacutelisis cualitativo y cuantitativo Ofrece grandes
capacidades de muestreo lineal y cuenta con la ventaja de la cantidad de informacioacuten existente sobre este meacutetodo
[24]
22 Extraccioacuten en fase soacutelida (SPE)
En 1978 aparecieron los primeros cartuchos desechables para la extraccioacuten en fase soacutelida y actualmente casi 40
antildeos despueacutes la extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) es la teacutecnica de preparacioacuten de muestras maacutes empleada en los
laboratorios Es una teacutecnica de preparacioacuten y tratamiento de muestras que se basa en la retencioacuten en una fase
adsorbente del analito de intereacutes presente en una muestra liacutequida que pasa a traveacutes de ella Debido a la variedad de
formatos (discos cartuchos y jeringas) y tipos de adsorbentes (los maacutes comunes carboacuten activo aluacutemina siacutelica gel
silicato de magnesio siacutelices enlazadas y poliacutemeros como por ejemplo estinero-divinilbenceno) o la facilidad de
automatizacioacuten y acoplamiento con otras teacutecnicas como por ejemplo una conexioacuten directa con un sistema de
Figura I4 Fundamentos teoacutericos de la LLE [25]
11
Capiacutetulo I Introduccioacuten
cromatografiacutea este meacutetodo le fue ganando terreno a la LLE Otra ventaja muy importante de la SPE frente a la
LLE es la disminucioacuten en la cantidad de disolvente orgaacutenico empleada Cada vez se va innovando maacutes sobre esta
teacutecnica llegando a encontrarse fases adsorbentes formadas por poliacutemeros capaces de retener en un uacutenico
cartucho un amplio abanico de analitos lipofiacutelicos o hidrofoacutebicos aacutecidos baacutesicos o neutros [26]
El fundamento de esta extraccioacuten como se puede en la Figura I6
consiste en cuatro etapas acondicionamiento adiccioacuten de muestra
retencioacuten y elucioacuten de los analitos de intereacutes En primer lugar antes
de empezar la extraccioacuten se requiere una etapa de acondicionamiento
para preparar el adsorbente haciendo pasar un poco de disolvente
para asiacute interaccionar mejor con la muestra Luego se hace pasar la
muestra liacutequida por la fase soacutelida Idealmente el adsorbente retiene
los analitos selectivamente a medida que va pasando la muestra y la
matriz pasa sin ser retenida Por uacuteltimo los analitos se eluyen del
adsorbente con un disolvente con el que tenga mayor afinidad [27]
23 Teacutecnicas de microextraccioacuten
231 Microextraccioacuten en fase soacutelida (SPME)
En la microextraccioacuten en fase soacutelida (SPME) se utilizan fibras de siacutelice fundida revestidas con un poliacutemero en un
disentildeo en forma de jeringa para la extraccioacuten de los analitos de intereacutes El principio por el que se rige esta
extraccioacuten es el reparto del analito entre la matriz de la muestra y el revestimiento de la fibra mediante un proceso
no competitivo Se trata de un meacutetodo que cuenta con muchas ventajas ya que se elimina completamente el uso de
disolventes y aparte no son necesarios voluacutemenes de muestra grandes pero tambieacuten cuenta con algunas
desventajas ya que tanto la capacidad como la sensibilidad se ven limitadas [29]
En la figura I7 podemos ver las etapas de la extraccioacuten En un
vial cerrado con una caacutepsula y un seacuteptum tenemos la muestra
liacutequida o bien soacutelida que contenga los analitos de intereacutes
volaacutetiles Con la jeringa se perfora el seacuteptum y una vez dentro
se acciona el eacutembolo para la exposicioacuten de la fibra con los
analitos introducieacutendola en la muestra liacutequida o en su defecto
en el espacio de cabeza para la extraccioacuten de analitos volaacutetiles
de una muestra soacutelida Despueacutes de la extraccioacuten dentro del vial
Figura I6 Etapas de una SPE [28]
Figura I7 Etapas de una SPME [30]
12
Capiacutetulo I Introduccioacuten
la fibra se introduce de nuevo en la jeringa y se retira del vial [27]
232 Microextraccioacuten en fase liacutequida (LPME)
La microextraccioacuten en fase liacutequida se desarrolloacute como una alternativa a la LLE para la reduccioacuten en la cantidad de
disolventes orgaacutenicos siendo rentable tanto para el medioambiente como econoacutemicamente Entre las modalidades
maacutes populares de esta teacutecnica se encuentran microextraccioacuten con gota suspendida (SDME) y microextraccioacuten
liacutequido-liacutequido dispersiva (DLLME) En la SDME una gota de disolvente orgaacutenico es expuesta al espacio de
cabeza situado sobre una muestra en un vial dicha gota es suspendida del extremo de una microjeringa Por otro
lado la DLLME sobre una muestra acuosa se inyecta un pequentildeo volumen de una mezcla de disolventes en la
cual es dispersada formando una solucioacuten en la que se establece el equilibrio El disolvente de extraccioacuten debe
presentar una densidad inferior a la de la muestra para facilitar su recuperacioacuten normalmente despueacutes de
centrifugar el vial doacutende se realiza la extraccioacuten [31]
24 QuEChERS
La extraccioacuten QuEChERS de las palabras en ingleacutes Quick Easy Cheap Effective Rugged and Safe es un meacutetodo
de extraccioacuten que se desarrolloacute entre 2000 y 2002 para el anaacutelisis de pesticidas Como su nombre indica raacutepido
faacutecil barato eficaz robusto y seguro son las principales
caracteriacutesticas de esta preparacioacuten de muestra Se realiza en dos
etapas en primer lugar una extraccioacuten simple y una segunda fase
de purificacioacuten En la primera etapa tenemos el vial con la
muestra en el cual se antildeade un disolvente generalmente
acetonitrilo para la extraccioacuten de los analitos de intereacutes en
presencia de diferentes sales (en el meacutetodo original se utiliza
sulfato de magnesio y cloruro de sodio) para facilitar la separacioacuten
de las fases En la segunda parte se realiza la purificacioacuten de la
fraccioacuten del extracto orgaacutenico Para eso se lleva a cabo una
limpieza de los analitos eliminando el agua y los compuestos
presentes en la matriz de la muestra empleando un adsorbente PSA (amina primaria y secundaria) C18 carboacuten
negro grafitizado (GCB) o una combinacioacuten de eacutestas [32]
Figura I8 Etapas de QuEChERS [33]
13
Capiacutetulo I Introduccioacuten
3 METODOLOGIacuteA ANALIacuteTICA PARA LA DETERMINACIOacuteN DE PESTICIDAS
31 Meacutetodos de GC-MS (MSMS)
La combinacioacuten de cromatografiacutea de gases (GC) teacutecnica de separacioacuten con espectrometriacutea de masas (MS) como
sistema de deteccioacuten representa un potente meacutetodo para la identificacioacuten determinacioacuten y cuantificacioacuten de
analitos orgaacutenicos en concentraciones traza presentes en muestras complejas Esta teacutecnica de anaacutelisis cuenta con
muchas ventajas en sensibilidad multifuncionalidad buena reproducibilidad robustez asiacute como facilidad en el
manejo pero con una gran desventaja este meacutetodo no es apto para ser utilizado con todos los analitos sino que
se ve limitado a aquellos que sean termoestables y no se descompongan a temperaturas elevadas antes de ser
volatilizados La muestra es introducida a traveacutes del inyector en el cromatoacutegrafo de gases doacutende impulsada por
una corriente de gas inerte como fase moacutevil pasa a traveacutes de la columna que contiene la fase estacionaria en la
cual se separan los compuestos debido a una distribucioacuten de estos entre fase moacutevil-fase estacionaria Mediante
una interfase son introducidos para su deteccioacuten en el espectroacutemetro de masas que cuenta con una fuente de
iones analizador de masas y un detector [34]
La combinacioacuten de analizadores de masas en taacutendem (MSMS) como sistema de deteccioacuten en GC es una teacutecnica
altamente selectiva mejorando la sensibilidad y la relacioacuten sentildeal-ruido en los espectros experimentando una
mejora por lo que se logran unos liacutemites de deteccioacuten inferiores Esta teacutecnica GC-MSMS comprende maacutes
pasos despueacutes de la separacioacuten por cromatografiacutea se lleva a cabo la deteccioacuten con MSMS que consta de varias
etapas generacioacuten de iones en la fuente de ionizacioacuten seleccioacuten de los iones precursores de una determinada
masa disociacioacuten causada por colisioacuten con moleacuteculas de gas inerte de los iones precursores y por uacuteltimo el
anaacutelisis de los fragmentos en relacioacuten a su masacarga (mz) En el caso de que un espectro de MS no permita
confirmar la identidad de un determinado compuesto quiacutemico la obtencioacuten de su espectro de MSMS permite
mejorar la confianza en su identificacioacuten [36]
Figura I9 Acoplamiento GC-MS [35]
14
Capiacutetulo I Introduccioacuten
32 Meacutetodos LC-MS (MSMS)
La teacutecnica de LC-MS se desarrolloacute para minimizar las desventajas del acoplamiento GC-MS y asiacute resolver los
problemas que este uacuteltimo acarreaba con los analitos termolaacutebiles permitiendo el anaacutelisis de eacutestos sin tener que
realizar una etapa previa de derivatizacioacuten La interfase de unioacuten de cromatografiacutea liacutequida (LC) con espectrometriacutea
de masas (MS) acarrea una dificultad significativa siendo responsable de transformar los analitos que se
encontraban en la fase moacutevil liacutequida en iones en fase gas sin que se produzca su degradacioacuten teacutermica La
sensibilidad de las determinaciones por LC-MS va a depender de la interfase empleada Las principales interfases
empleadas actualmente son las ionizaciones a presioacuten atmosfeacuterica electrospray (ES) e ionizacioacuten quiacutemica a
presioacuten atmosfeacuterica (APCI) [37]
Con los antildeos la cromatografiacutea liacutequida se ha ido innovando y mediante la disminucioacuten del tamantildeo de partiacutecula en
la columna se fue mejorando la eficiencia asiacute como aumentando la selectividad y resolucioacuten del pico en el
cromatograma Para este nuevo sistema llamado UPLC Ultra-Performance Liquid Chromatography se desarrolloacute
una nueva instrumentacioacuten capaz de trabajar a altas presiones generando flujos mayores sin peacuterdidas de
resolucioacuten utilizando inyectores automaacuteticos maacutes raacutepidos y detectores con mayor velocidad de adquisicioacuten de
datos disminuyendo asiacute el tiempo de anaacutelisis [39]
33 Espectrometriacutea de masas
La espectrometriacutea de masas es el meacutetodo de deteccioacuten y cuantificacioacuten maacutes fiable a la hora de la determinacioacuten de
compuestos en matrices complejas (tales como alimentos) ya que otros detectores maacutes tradicionales como UV-
visible o fluorescencia cuentan con una gran incertidumbre en los resultados llegando incluso a ofrecer falsos
Figura I10 Acoplamiento LC-MS [38]
15
Capiacutetulo I Introduccioacuten
positivos o negativos Un espectrometro de masas cuenta con un dispositivo de introduccioacuten de muestra una
caacutemara de ionizacioacuten un sistema para la aceleracioacuten de los iones uno o varios analizadores de masas y un detector
[40]
El fundamento de la espectrometriacutea de masas se basa en la separacioacuten de iones en base a la relacioacuten masacarga
(mz) El proceso consta fundamentalmente de cuatro etapas La
primera es la ionizacioacuten de la muestra los iones formados se aceleran
debido a la accioacuten de un campo eleacutectrico variable separacioacuten de los
iones seguacuten su masacarga deteccioacuten de los iones y produccioacuten de la
sentildeal eleacutectrica El analizador de masas es el encargado de la separacioacuten
de los iones en funcioacuten a su mz entre los que maacutes destacan
analizador de masas cuadrupolar que dispersa simultaacuteneamente todos
los iones en funcioacuten de la relacioacuten mz analizador de masas de
tiempo de vuelo (TOF) consta de un tubo a alto vaciacuteo sobre el que no
actuacutea ninguacuten campo eleacutectrico al cual llegan todos los iones acelerados con la misma energiacutea cineacutetica y en el tubo
las velocidades variacutean seguacuten mz y analizador de trampa de iones en doacutende los iones gaseosos quedan aislados
durante largos periacuteodos de tiempo por la accioacuten del campo eleacutectrico [41]
4RESUMEN BIBLIOGRAacuteFICO DE LAS TEacuteCNICAS DE EXTRACCIOacuteN Y
DETERMINACIOacuteN DE PESTICIDAS EN VINO
En la bibliografiacutea se han descrito diversas teacutecnicas y diferentes combinaciones entre teacutecnicas de extraccioacuten y
distintas teacutecnicas de cuantificacioacuten e identificacioacuten para esos analitos Entre estas teacutecnicas los valores de los liacutemites
de cuantificacioacuten (LOQs) y las recuperaciones relativas pueden diferir en el resultado en un rango de valores asiacute
como el tiempo total empleado para el anaacutelisis y para la preparacioacuten de la muestra
Por lo general el meacutetodo de extraccioacuten de los analitos de intereacutes maacutes empleado es la extraccioacuten en fase soacutelida
(SPE) la cuaacutel le ha estado ganando terreno a la extraccioacuten liacutequido-liacutequido aunque tambieacuten se estaacute viendo cada vez
maacutes desplazada debido al creciente uso de la teacutecnica QuEChERS
Figura I11 Etapas de la espectrometriacutea de masas [42]
16
Capiacutetulo I Introduccioacuten
En el estudio de ECONOMOU et al [43] realizado en el antildeo 2009 en Grecia se empleoacute la extraccioacuten en fase
soacutelida con deteccioacuten en cromatografiacutea de liacutequidos acoplada a espectrometriacutea de masas en taacutendem (SPE-LC-ESI-
MSMS) Para la preparacioacuten de la muestra diluyeron 10 mL de vino (tanto blanco como tinto) a un volumen
final de 100 mL con agua ultrapura antes de la SPE Determinaron las recuperaciones de la extraccioacuten para dos
niveles de concentracioacuten 0010 y 0050 mgL realizando 8 medidas diarias durante 3 diacuteas consecutivos
encontraacutendose unos valores que variacutean dentro del rango 70-110 para todos los pesticidas en los dos niveles Para
la determinacioacuten y cuantificacioacuten de 46 pesticidas emplearon la teacutecnica de cromatografiacutea de liacutequidos con
espectrometriacutea de masas con un volumen de inyeccioacuten de 20 microL y un flujo de fase moacutevil de 02 mLmin
aclopada a espectrometriacutea de masas en taacutendem
Con la misma teacutecnica de extraccioacuten PELAJIĆ et al [45] durante el antildeo 2015 en Croacia llevaron a cabo la
determinacioacuten de 25 residuos de plaguicidas en vino tinto El meacutetodo que desarrollaron para dicha finalidad fue el
acoplamiento SPE-GC-MS Para la preparacioacuten de la muestra emplearon 10 mL de vino diluidos 11 con agua
ultrapura hasta un volumen final de 20 mL Calcularon las recuperaciones de la extraccioacuten y se encontroacute un rango
para todos los pesticidas en las muestras de 70-120 Para la determinacioacuten en cromatografiacutea de gases-
espectrometriacutea de masas se empleoacute un volumen de inyeccioacuten de 5 μL y un flujo de fase moacutevil de 10 mLmin
Mediante el acoplamiento de teacutecnicas SPE dispersiva-GC-MS WALORCZYK et al [48] en el antildeo 2011 en
Polonia llevaron a cabo la cuantificacioacuten de 160 pesticidas en diferentes clases de vino tinto rosado y blanco Con
10 g de vino y 10 mL de acetonitrilo se realizaron pruebas de recuperacioacuten en la fase de extraccioacuten para vino
tinto con los niveles de concentracioacuten 001 005 y 02 mgkg y para los vinos rosado y blanco con el nivel de
concentracioacuten 005mgkg y encontraron que a todos los niveles de concentracioacuten los valores de recuperacioacuten
rondan el rango 80-110 Para la teacutecnica cromatograacutefica se utilizoacute un volumen de inyeccioacuten de 5 microL
El acoplamiento LLE-SPE-LCDAD fue desarrollado por GONZAacuteLEZ-RODRIacuteGUEZ et al [50] en el antildeo
2010 en la provincia de Orense para la determinacioacuten de nuevos fungicidas propuestos para combatir el hongo
que provoca la enfermedad del mildium En la preparacioacuten de la muestra emplearon 15 mL de vino blanco para la
extraccioacuten en la cual fueron calculadas las recuperaciones relativas para dos niveles de concentracioacuten 005 y 05
mgkg en donde se establece un rango de entre 70-110 para todos los analitos Para la determinacioacuten mediante
cromatografiacutea de liacutequidos se empleoacute un volumen de inyeccioacuten de 2 μL y como meacutetodo de deteccioacuten utilizaron un
detector de diodos array
La microextraccioacuten sorptiva en fase soacutelida fue empleada en la publicacioacuten de FONTANA et al [44] junto con un
acoplamiento entre cromatografiacutea de liacutequidos y espectrometriacutea de masas para la determinacioacuten de 15 fungicidas
en vino realizada durante el 2010 en el noroeste de Espantildea Para la preparacioacuten de la muestra emplearon 10 mL
17
Capiacutetulo I Introduccioacuten
de vino diluiacutedos con el mismo volumen de agua ultrapura y un sorbente en forma de disco de silicona con un
volumen de 12 microL La recuperacioacuten de la extraccioacuten se calculoacute para vino tinto (Menciacutea) y vino blanco (Godello)
realizando tres replicas dentro de un mismo diacutea para los niveles de concentracioacuten 10 y 50 ngmL y nueve reacuteplicas
realizando el anaacutelisis en tres diacuteas consecutivos para el nivel de concentracioacuten de 25 ngmL y los resultados
obtenidos dan unos valores de recuperacioacuten dentro del rango 75-117 En el sistema LC-QTOF-MS el volumen
de inyeccioacuten fue de 15 microL
El otro meacutetodo de extraccioacuten mencionado anteriormente es QuEChERS estaacute en auge como meacutetodo de extracioacuten
de residuos de pesticidas en matrices como la del vino o la uva ya que incrementa la velocidad del anaacutelisis y reduce
el efecto de matriz BUERGE et al [46] seguido de una deteccioacuten mediante GC-MSMS realizaron una estapa
de extraccioacuten QuEChERS con alguna modificacioacuten acetato de sodio en lugar de cloruro soacutedico y acetato de etilo
en lugar de acetonitrilo utilizando 5 g de uva para la determinacioacuten de residuos de 4 pesticidas durante el antildeo
2016 Las recuperaciones de extraccioacuten resultaron ser valores entre 91-149 en uva a distintos niveles de
concentracioacuten 005 05 y 5 mgkg
Para la determinacioacuten de Ametoctradin HU et al [47] llevaron a cabo una extraccioacuten QuEChERS empleando 10
g de uva con deteccioacuten mediante el acoplamiento UPLC-MSMS utilizando un volumen de inyeccioacuten de 5 μL y
un flujo de fase moacutevil de 03 mLmin Las recuperaciones de la extraccioacuten se calcularon para tres niveles de
concentracioacuten 1 10 100 μgL de dos formas distintas en tres diacuteas consecutivos realizando 5 reacuteplicas al diacutea o en
dentro de un mismo diacutea realizando 15 reacuteplicas los resultados de todos los caacutelculos se encuentran dentro del rango
818-1001
Siguiendo con el mismo modo de extraccioacuten GUO et al [49] publicaron sus estudios para la determinacioacuten de
50 pesticidas y 12 adulterantes en vino tinto Para la extraccioacuten QuEChERS se utilizaron 10 mL de vino tinto con
10 mL de acetonitrilo y calcularon las recuperaciones para tres niveles de concentracioacuten 50 100 y 250 ngmL
encontraacutendose un rango de valores entre 75-120 El meacutetodo de deteccioacuten se llevoacute a cabo mediante un anaacutelisis
directo en tiempo real junto con espectrometriacutea de masas en tandem con un cuadrupolo (DART-MSMS) la
teacutecnica DART es un meacutetodo raacutepido para cribar y cuantificar los analitos de estudio que prescinde de la etapa de
separacioacuten cromatograacutefica
A continuacioacuten se recogen en la Tabla I3 los liacutemites de cuantificacioacuten (LOQs) de los analitos de intereacutes en este
trabajo caacutelculados por los diferentes meacutetodos encontrados en bibliografiacutea citados anteriormente en este apartado
18
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Tabla I3 LOQs de los analitos de intereacutes descritos para los distintos meacutetodos encontrados en la bibliografiacutea
Compuesto LOQs
Compuesto LOQs
V Blanco V Tinto Uva V Blanco V Tinto Uva
AME - - 0032μgkg[47] MET 86 μgL[43]
22 μgL[44]
89 μgL[43]
22 μgL[44]
5 μgL[45]
259 ngmL[49]
001mgkg[48]
BEN 02 μgL[44]
0001 mgL[50]
02 μgL[44]
001 μgL[45]
280ngmL[49]
005 mgkg[48] MYC 30 μgL[43]
08 μgL[44]
36 μgL[43]
10 μgL[44]
025 μgL[45]
331ngmL[49]
001 mgkg[48]
BOS 0065 mgL[50] 05 μgL[45]
1076 ngmL[49] 001 mgkg[48] PEN
56 μgL[43]
05 μgL[44]
49 μgL[43]
04 μgL[44]
220ngmL[49]
001 mgkg[48]
CAR - 386 ngmL[49] - PYC 0003mgL[50] 07 μgL[45] 001 mgkg[48]
CYP 15 μgL[43]
04 μgL[44]
0001 mgL[50]
22 μgL[43]
06 μgL[44]
312 ngmL[49]
001 mgkg[48] PYM 17 μgL[43] 22 μgL[43]
10 μgL[45] 001 mgkg[48]
DIM 18 μgL[43] 20 μgL[43] 001 mgkg[48] TEC 03 μgL[44]
03 μgL[44]
10 μgL[45]
160ngmL[49]
001 mgkg[48]
FEH 17 μgL[43] 22 μgL[43]
938 ngmL[49] 001 mgkg[48] TEF - 876ngmL[49] -
FEP - - 002mgkg[46] TBZ 15μgL [43] 29μgL[43] 001 mgkg[48]
FLU 005 μgL[45] TME - 25 μgL[45] 001 mgkg[48]
IMI 21 μgL[43] 22 μgL[43]
225 ngmL[49] - THI-M 92 μgL[43] 89 μgL[43] -
IPR 07 μgL[44] 07 μgL[44] 001 mgkg[48] TRI 10 μgL[44] 12 μgL[44] 001 mgkg[48]
MAN 0011 mgL[50] - -
5 DISTRIBUCIOacuteN DE PESTICIDAS EN VINOS COMERCIALES
En algunos de los meacutetodos descritos en el apartado anterior se procesaron vinos comerciales encontraacutendose
resultados positivos para muchos residuos de pesticidas y algunos hasta en gran concentracioacuten
ECONOMOU et al [43] mediante el meacutetodo LC-ESI-MSMS realizaron el anaacutelisis de 60 muestras de vino tinto
y blanco recogidos en supermercados locales en Grecia a lo largo de un antildeo El meacutetodo se habiacutea desarrollado
19
Capiacutetulo I Introduccioacuten
para la determinacioacuten de 46 pesticidas pero la mayoriacutea se encuentran con una concentracioacuten por debajo de
001mgL solo ocho plaguicidas se obtuvieron con resultados de concentracioacuten mayores Se muestran los
resultados en la Tabla I4 de los analitos de intereacutes en este estudio
Tabla I4 Nuacutemero de muestras positivas de distintos pesticidas en el anaacutelisis de 60 muestras de vino [43]
Compuesto Positivos con concentracioacuten entre 001-01
mgL
Positivos con concentracioacuten entre 01-1
mgL
PYM 2 (3) 2 (3)
MYC 2 (3) 0 (0)
CAR 11 (18) 7 (12)
THI-M 7 (12) 5 (8)
FEH 5 (8) 0 (0)
MET 1 (2) 0 (0)
Mediante el meacutetodo de microextraccioacuten en fase soacutelida-LC-TOF-MS FONTANA et al [44] aplicaron el
desarrollo del procedimiento a un total de 12 vinos joacutevenes elaborados en el 2010 y correspondientes a diferentes
denominaciones geograacuteficas del noroeste de Espantildea En la Tabla I5 se muestran los datos que han obtenido
Tabla I5 Determinacioacuten de fitosanitarios en vinos comerciales mediante Microextraccioacuten en fase soacutelida-LC-TOF-MS
Valores de concentracioacuten en ngmL [44]
Pesticidas
W 1
Albarintildeo
W5
Ribeiro
W6
Valdeorras
R1
Ribeira Sacra
R3
Ribeiro
R4
Valdeorras
MET 404plusmn06 223plusmn05 311plusmn007 25plusmn03 31plusmn03 74plusmn10
TRI nd nd 36plusmn06 nd nd ltLOQ
IPR 394plusmn03 324plusmn02 324plusmn02 071plusmn007 31plusmn02 28plusmn05
MYC nd nd nd ltLOQ 39plusmn02 nd
TEC 25plusmn01 nd nd nd nd nd
CYP 179plusmn08 ltLOQ ltLOQ 562plusmn002 083plusmn001 nd
BEN 042plusmn001 nd ltLOQ nd 032plusmn001 ltLOQ
ndNo detectados ltLOQ por debajo del liacutemite de cuantificacioacuten del meacutetodo los coacutedigos W y R corresponden respecti-vamente a los vinos blanco y tinto
20
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Por uacuteltimo PELAJIĆ et al [45] aplicaron su meacutetodo SPE dispersiva-GC-MS mediante el cual determinaron 25
residuos de plaguicidas en vino tinto a un total de 32 muestras de vino adquiridos en supermercados locales de
Croacia pero de diversos oriacutegenes de procedencia Los resultados que han obtenido se muestran en la Tabla I6
en doacutende un total de 15 plaguicidas han sido detectados y 7 de los cuales se encontraban en una alta
concentracioacuten
Tabla I6 Resultados de los vinos con positivos en pesticidas y sus concentraciones [45]
Vino Paiacutes Residuos de pesticidas (mgKg)
Tinto Francia DIM (0013) MET (0009) IPR (001)
Tinto Alemania BOS (0011)
Tinto Alemania IPR (0009)
Tinto Macedonia MET (0015)
Tinto Moldavia IPR (0008)
Tinto Polonia MET (004)
Tinto Rumania PYM (0058)
Tinto Espantildea TRI (0005) MET (0011)
Tinto Estados Unidos BOS (001)
Rosado Francia BOS (0005)
Blanco Chile TEC (0008)
Blanco Georgia MET (0057)
Blanco Alemania DIM (001) IPR (0054) PYM (0056)
Blanco Sudaacutefrica DIM (0011) IPR (0011)
21
Capiacutetulo II Objetivos y discusioacuten
CAPIacuteTULO II OBJETIVOS Y DISCUSIOacuteN
El objetivo principal que se persigue en este trabajo es el desarrollo de un meacutetodo analiacutetico raacutepido basado en la
extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) y deteccioacuten mediante cromatografiacutea de liacutequidos en la modalidad de UPLC
acoplada a la espectrometriacutea de masas en taacutendem (UPLC-MSMS) para la determinacioacuten multianalito de residuos
de fitosanitarios principalmente fungicidas aunque tambieacuten alguacuten insecticida en muestras de vino blanco y tinto
Para llevar a cabo la finalidad de lo dicho se consideran unos objetivos maacutes especiacuteficos
Minimizar la manipulacioacuten de la muestra para asiacute reducir la cantidad de disolventes y tiempo empleado
Optimizacioacuten de los factores que afectan en la extraccioacuten en la SPE tales como tipo y cantidad de
adsorbente volumen de eluyente etc
Estudio de las condiciones en UPLC-MSMS para una separacioacuten y cuantificacioacuten oacuteptimas
Caracterizacioacuten y validacioacuten del meacutetodo propuesto
Por uacuteltimo una vez cumplidos todos los objetivos anteriores y fijadas las condiciones oacuteptimas el meacutetodo
estudiado se aplica en el anaacutelisis de muestras de vino comercial (blanco y tinto) para determinar si se encuentran
residuos presentes asiacute como conocer en queacute concentracioacuten se encuentran los pesticidas objeto de este estudio
22
Capiacutetulo III Parte experimental
CAPIacuteTULO III PARTE EXPERIMENTAL
1 MATERIAL Y REACTIVOS
11 Material
Material de vidrio de uso comuacuten en el laboratorio vasos de precipitados matraces aforados etc
Micropipetas automaacuteticas de 20-200 microL 20-200 microL 100-1000 microL 1000-5000 microL Eppendorf
Puntas de plaacutestico para micropipetas
Encapsulador y desencapsulador
Soportes y pinzas
Viales de 15 mL transparentes para muestreador automaacutetico de cromatografiacutea (Sugelabor)
Caacutepsulas de aluminio con seacuteptum de Tefloacuten (Sugelabor) y tapones pre-slit para viales
Tubos y conectores de tefloacuten
Cartuchos de divinilbenceno-N-vinilpirrolidona 200 mg Oasis HLB Waters
Cartuchos de divinilbenceno-N-vinilpirrolidona funcionalizados con grupos amina cuaternaria 150 mg
Oasis MAX Waters
Cartuchos de divinilbenceno-N-vinilpirrolidona 60 mg Oasis HLB Waters
12 Reactivos y disolventes
Agua ultrapura Milli-Q
Aacutecido foacutermico (Sigma Aldrich) 95
Acetonitrilo (LichrosolvregMerck) Gradient grade for liquid chromatography
Metanol (LichrosolvregMerck) Gradient grade for liquid chromatography
Etanol (LichrosolvregMerck) Gradient grade for liquid chromatography
13 Patrones
Ametoctradin (AME) Dr Ehrenstrorfer 990
Benalaxyl (BEN) Pestanal Sigma- Aldrich 999
23
Capiacutetulo III Parte experimental
Boscalid (BOS) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Carbendazim (CAR) Pestanal Sigma- Aldrich 992
Cyprodinil (CYP) Pestanal Sigma- Aldrich 998
Dimethomorph (DIM) mezcla de isoacutemeros E + Z Pestanal Sigma- Aldrich 989
Fenhexamid (FEH) Pestanal Sigma- Aldrich 997
Fenpropidin (FEP) Dr Ehrenstrorfer 980
Fluopicolide (FLU) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Imidacloprid (IMI) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Iprovalicarb (IPR) mezcla de isoacutemeros Pestanal Sigma- Aldrich 985
Mandipropamid (MAN) Pestanal Sigma- Aldrich 991
Metalaxyl (MET) Pestanal Sigma- Aldrich 990
Myclobutanil (MYC) Pestanal Sigma- Aldrich 994
Penconazole (PEN) Pestanal Sigma- Aldrich 991
Pyraclostrobin (PYC) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Pyrimethanil (PYM) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Tebuconazol (TEC) Pestanal Sigma- Aldrich 996
Tebufenozide (TEF) Dr Ehrenstrorfer 988
Thiabendazole (TBZ) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Thiamethoxam (TME) Pestanal Sigma- Aldrich 996
Thiophanate-methyl (THI-M) Dr Ehrenstrofer 990
Triadimenol (TRI) Mezcla de diastereoisoacutemeros Pestanal Sigma- Aldrich 994
14 Patrones internos
Carbendazim-d3 (CAR-d3) Pestanal Sigma- Aldrich 998
Cyprodinil-d5 (CYP-d5) Pestanal Sigma- Aldrich
Imidacloprid-d4 (IMID-d4) Pestanal Sigma- Aldrich
Metalaxyl 13C6 (MET13C6) Pestanal Sigma-Aldrich 99
24
Capiacutetulo III Parte experimental
15 Gases
Nitroacutegeno 99999 como gas de colisioacuten en el espectroacutemetro de masas
Nitroacutegeno en los sistemas de concentracioacuten y secado por corriente de nitroacutegeno de los cartuchos SPE
2 INSTRUMENTACIOacuteN
Balanza analiacutetica de precisioacuten Sartorius
Granatario Sartorius
Bantildeo de ultrasonidos P-Selecta
Equipo de purificacioacuten de agua Millipore modelo Milli-Q gradient A-10ZMQSSVOT4
Estacioacuten de concentracioacuten por corriente de nitroacutegeno Mini-Vap Supelco
Sistema de secado de cartuchos de SPE por corriente de nitroacutegeno VisiDry Supelco
Sistema distribuidor de vaciacuteo Visiprep reg Supelco
Cromatoacutegrafo de liacutequidos de ultra-alta resolucioacuten Waters AcquityUPLC reg y espectroacutemetro de masas
Acquity TQD con analizador de triple quadrupolo (QqQ) equipado con una fuente de ionizacioacuten a
presioacuten atmosfeacuterica del tipo Z-spray (ESI)
3 PREPARACIOacuteN DE LAS DISOLUCIONES
Los patrones de pesticidas se prepararon individualmente a partir de los compuestos soacutelidos comerciales por
pesada excepto en el caso del fenpropidin (FEP) que se preparoacute a partir del compuesto liacutequido comercial Estos
compuestos soacutelidos se disolvieron en metanol y se obtuvieron unas disoluciones iniciales con concentraciones
recogidas en la Tabla III1
25
Capiacutetulo III Parte experimental
Tabla III1 Concentracioacuten de las disoluciones patroacuten stock
Compuesto Concentracioacuten (microgmL) Compuesto Concentracioacuten (microgmL)
AME 102201 MET 118912
BEN 138330 MYC 102017
BOS 99474 PEN 129791
CAR 17105 PYC 104581
CYP 131075 PYM 141386
DIM 103009 TEC 134729
FEH 99584 TEF 137769
FEP 100000 TBZ 105928
FLU 126859 TME 112283
IMI 101123 THI-M 124202
IPR 106739 TRI 118933
MAN 101021
4 LAVADO DEL MATERIAL
La limpieza del material de vidrio utilizado en el laboratorio se realizoacute utilizando jaboacuten y aclarando con agua de
grifo Luego en primer lugar se realiza un enjuague con agua Milli-Q finalmente un segundo enjuague con
acetona para eliminar posibles restos de compuestos orgaacutenicos y se deja secar sobre papel
Para la limpieza de los conectores de tefloacuten empleados en el proceso de SPE se introducen en un vaso de
precipitados con metanol y este en un bantildeo de ultrasonidos durante 10 minutos Al finalizar con el bantildeo de
ultrasonidos se realiza un enjuague con acetona y se pone a secar
5 EXTRACCIOacuteN DE MUESTRAS MEDIANTE SPE
El meacutetodo de extraccioacuten utilizado para la determinacioacuten de pesticidas fue la extraccioacuten en fase soacutelida (SPE)
mediante cartuchos Oasis HLB de 200 mg A continuacioacuten se describe el protocolo de extraccioacuten en las
condiciones oacuteptimas
26
Capiacutetulo III Parte experimental
1 Acondicionamiento del cartucho Oasis HLB de 200 mg con 2 mL de acetonitrilo seguidos de otros 2 mL de
vino sinteacutetico formado por la mezcla etanolagua MilliQ (1288)
2 Paso de la muestra 2 mL de vino diluiacutedos con 2 mL de agua MilliQ a traveacutes del cartucho por gravedad
3 Lavado del cartucho con 2 mL de agua MilliQ
4 Secado del cartucho durante 45 minutos en el VisiDry mediante el paso de una corriente de nitroacutegeno
5 Elucioacuten del cartucho con la mezcla metanolacetonitrilo en proporcioacuten 2080 hasta un volumen final de 2
mL
6 Anaacutelisis mediante cromatografiacutea liacutequida acoplada a espectrometriacutea de masas en taacutendem UPLC-MSMS
(volumen de inyeccioacuten 15 microL)
Representacioacuten esquematizada en la Figura III1
Figura III1 Extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) de las muestras de vino
27
Capiacutetulo III Parte experimental
6 CONDICIONES DE DETERMINACIOacuteN MEDIANTE UPLC-MSMS
En la Tabla III2 se indican las condiciones utlizadas en la determinacioacuten de los pesticidas de intereacutes mediante
LC-MSMS y en la Tabla III3 se muestra el gradiente de la fase moacutevil utilizado para la separacioacuten
cromatograacutefica
Tabla III2 Condiciones experimentales de determinacioacuten en LC-MSMS
UPLC Acquity UPLC-I-Class IVD System
bull Columna cromatograacutefica Zorbax Eclipse Plus C18 Rapid Resolution HD
Fase estacionaria C18
Dimensiones 21 x 50 mm
Tamantildeo de partiacutecula 18 microm
Temperatura del horno 40ordmC
bull Inyector
Volumen de inyeccioacuten 15 microL
bull Fase moacutevil
Flujo 04 mLmin
Fase acuosa (A) Agua MilliQ con 01 aacutecido foacutermico
Fase orgaacutenica (B) Acetonitrilo con 01 aacutecido foacutermico
MSMS WatersXevo TQD
Modo de ionizacioacuten ESI positivo
Voltaje del capilar 15 kV
Voltaje de cono 50 V
Temperatura de gas de secado (N2) 450ordmC
Flujo de gas de secado (N2) 1000 Lh
Modo de adquisicioacuten Centroide
Tabla III3 Gradiente de fase moacutevil utilizado en la separacioacuten cromatograacutefica (LC)
Tiempo min 0 13 28 64 75 76 10
A 98 50 50 0 0 98 98
B 2 50 50 100 100 2 2
28
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
CAPIacuteTULO IV RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
1 IDENTIFICACIOacuteN DE LOS COMPUESTOS
Para empezar el estudio en primer lugar se realizoacute la caracterizacioacuten de las condiciones de determinacioacuten de los
analitos en el modo Multiple Reaction Monitoring (MRM) mediante UPLC-ESI-MSMS Para llevarla a cabo se
tomaron patrones individuales de cada fitosanitario y mediante infusioacuten se estudiaron las posibles transiciones y
voltajes oacuteptimos para su determinacioacuten (Tabla IV1)
La ionizacioacuten por electrospray (ESI) se estudioacute tanto en modo positivo como en modo negativo encontraacutendose
que para todos los pesticidas de nuestro intereacutes se obteniacutea sentildeal en el modo positivo mientras el modo negativo
no presentaba respuesta significativa
A continuacioacuten se estudia el efecto del voltaje de cono en la respuesta del ioacuten molecular [M+H]+ aumentaacutendolo
hasta alcanzar el valor maacuteximo de la sentildeal correspondiente a dicho ioacuten y luego se optimiza la energiacutea de colisioacuten
variaacutendola para cada analito hasta obtener la sentildeal de mayor intensidad para cada uno de los iones producto Por
uacuteltimo una vez optimizado el voltaje de cono y la energiacutea de colisioacuten se seleccionan las dos transiciones maacutes
intensas para llevar a cabo la cuantificacioacuten y cualificacioacuten de cada analito en modo MRM Este procedimiento se
realizoacute para la totalidad de los compuestos confirmando los datos obtenidos con los facilitados por la base de
datos Quanpedia que estaacute disponible en el software del equipo utilizado para algunos de los compuestos
considerados
Compuesto Tr (min) Ion precursor (mz Da)
Voltaje de cono (V)
Ion producto 1 (CEv)
cuantificacioacuten
Ion producto 2 (CEv)
cualificacioacuten
Relacioacuten IP2IP1
AME 325 2760 60 176 (35) 70 (50) 016
BEN 485 3261 26 148 (20) 91 (34) 067
BOS 387 3429 41 140 (20) 307 (20) 011
CAR 167 1921 33 160 (18) 132 (28) 014
CYP 311 2260 56 93 (33) 108 (25) 061
DIM 322 3881 40 301 (20) 165 (30) 057
FEH 386 3021 41 97 (22) 55 (38) 044
FEP 257 2742 55 147 (28) 86 (28) 093
FLU 401 3830 40 173 (20) 365 (15) 010
IMI 218 2561 34 209 (15) 175 (20) 091
IPR 358 3211 28 119 (16) 203 (10) 042
Tabla IV1 Tiempos de retencioacuten (Tr) relacioacuten de iones precursores (mz) voltaje de cono (V) energiacuteas de colisioacuten (CE) y relacioacuten de intensidades entre transiciones (IP2IP1)
29
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Compuesto Tr (min) Ion precursor (mz Da)
Voltaje de cono (V)
Ion producto 1 (CEv)
cuantificacioacuten
Ion producto 2 (CEv)
cualificacioacuten
Relacioacuten IP2IP1
MAN 392 4120 25 328 (16) 125 (35) 063
MET 283 2801 26 220 (13) 192 (17) 057
MYC 365 2891 34 70 (18) 125 (32) 029
PEN 417 2840 34 70 (16) 159 (34) 031
PYC 523 3881 31 194 (12) 163 (25) 066
PYM 266 2000 51 107 (24) 82 (24) 071
TEC 397 3080 40 70 (22) 125 (40) 007
TEF 473 3531 19 133 (20) 297 (8) 072
TBZ 182 2020 51 175 (25) 131 (30) 062
TME 203 2920 28 211 (12) 132 (22) 047
THI-M 257 3430 28 151 (46) 93 (19) 0001
TRI 319 2961 21 70 (10) 99 (15) 013
El dwell time para cada una de las transiciones se ajustoacute de manera automaacutetica por el software (MassLinx) con
objeto de obtener doce puntos espectrales por compuesto tomando un valor promedio de cuatro segundos como
ancho de pico a liacutenea de base
2 CARACTERIZACIOacuteN DEL PROCEDIMIENTO DE DETERMINACIOacuteN (UPLC-ESI-
MSMS)
Una vez optimizados los paraacutemetros que afectan a la separacioacuten cromatograacutefica (UPLC) y a la determinacioacuten por
espectrometriacutea de masas en taacutendem (MSMS) se lleva a cabo la evaluacioacuten de la repetibilidad de inyeccioacuten y
determinacioacuten en esas condiciones Se expresa por medio de la desviacioacuten estaacutendar relativa (RSD) paraacutemetro que
nos indica el grado de correlacioacuten que existe entre varias medidas del mismo patroacuten realizadas por el mismo
operador en el laboratorio y en el mismo equipo de medida a lo largo de un diacutea Para el estudio se realizan diez
inyecciones con volumen de 15 microL de dos patrones con distintos niveles de concentracioacuten 5 y 20 ngmL Los
datos de RSD (Tabla IV2) para las aacutereas de pico de los analitos se situacutean para el nivel de concentracioacuten 5 ngmL
en el rango 2-13 y en el nivel de concentracioacuten 20 ngmL en el rango 1-7
30
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten Tabla IV2 Desviacioacuten estaacutendar relativa (RSD) del aacuterea de pico (transicioacuten de cuantificacioacuten) para evaluar la repetivilidad del proceso de LC-MSMS
Compuesto RSD
5 ngmL
RSD
20 ngmL Compuesto
RSD
5 ngmL
RSD
20 ngmL
AME 5 2 MET 3 2
BEN 2 2 MYC 9 2
BOS 4 5 PEN 4 4
CAR 4 2 PYC 3 1
CYP 5 7 PYM 7 3
DIM 6 5 TEC 3 2
FEH 7 4 TEF 4 2
FEP 4 2 TBZ 2 1
FLU 5 3 TME 6 6
IMI 13 7 THI-M a 6
IPR 8 2 TRI 8 6
MAN 3 2
A continuacioacuten tambieacuten se evaluoacute la repetibilidad de los tiempos de retencioacuten (Tr) para diez inyecciones de
patrones a los dos niveles de concentracioacuten 5 y 20 ngmL situaacutendose las RSD para todos los compuestos en el
rango 01-03 En base a este dato la ventana de tiempo en la que se registran las transiciones de MRM de cada
compuesto se fijoacute en 05 min lo que es lo mismo 025 min alrededor del valor medio de su tiempo de retencioacuten
Por otro lado la linealidad del meacutetodo se estudioacute a nueve niveles de concentracioacuten diferentes comprendidos ente
los niveles 05 ngmL y 200 ngmL mediante la inyeccioacuten de disoluciones patroacuten de los distintos compuestos de
estudio Se realizoacute una evaluacioacuten sin y otra con patroacuten interno (IS) antildeadiendo una concentracioacuten fija de patrones
internos a nivel de 25 ngmL y pudimos observar que los resultados mejoran notablemente al realizar una
correccioacuten con el IS En la Tabla IV3 se muestran los coeficientes de determinacioacuten (R2) obtenidos al realizar la
correccioacuten mediante IS observando que para todos los compuestos excepto para THI-M y para TRI los
coeficientes de correlacioacuten son superiores a 0990 por lo que existe una respuesta lineal en el rango de
concentraciones que hemos estudiado
Aparte del estudio de la linealidad tambieacuten se han estudiado los liacutemites de cuantificacioacuten instrumentales del
meacutetodo (LOQs) Para ello los LOQs se evaluacutean como la miacutenima cantidad de analito que origina una sentildeal 10
veces superior a la desviacioacuten estaacutendar del ruido Los valores anteriores se estimaron a partir del patroacuten de
a no evaluado ya que se encuentra por debajo del liacutemite de cuantificacioacuten del meacutetodo
31
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
concentracioacuten maacutes baja que presenta un pico con una relacioacuten SN superior a 10 En la Tabla IV3 tambieacuten se
recogen estos LOQs en doacutende podemos ver que variacutean en el rango 01-1 ngmL excepto para THI-M que se
desviacutea a valores de 10 ngmL
Tabla IV3 Coeficientes de determinacioacuten (R2) y liacutemites de cuantificacioacuten instrumentales (LOQs) de los analitos para nueve
niveles de concentracioacuten de 05 a 200 ngmL
Compuesto Coeficiente de
correlacioacuten (R2)
LOQs (ngmL) Compuesto
Coeficiente de correlacioacuten
(R2)
LOQs (ngmL)
AME 09951 04 MET 09933 01
BEN 09949 01 MYC 09950 04
BOS 09979 02 PEN 09945 02
CAR 09923 02 PYC 09955 02
CYP 09878 02 PYM 09931 01
DIM 09938 07 TEC 09958 05
FEH 09959 05 TEF 09957 01
FEP 09931 01 TBZ 09942 02
FLU 09965 02 TME 09903 01
IMI 09979 05 THI-M 09580 100
IPR 09938 01 TRI 09867 07
MAN 09979 01
En la Figura IV1 y Figura IV2 se muestran dos ejemplo de curvas de calibrado para dos compuestos IMI y
MAN respectivamente
Figura IV1 Curva de calibrado y coeficiente de determinacioacuten de IMI para UPLC-ESI-MSMS
32
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Figura IV2 Curva de calibrado y coeficiente de determinacioacuten de MAN para UPLC-ESI-MSMS
3 ESTUDIO DEL MEacuteTODO SPE
La extraccioacuten de pesticidas se llevoacute a cabo mediante extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) en doacutende se realizaron
diversos estudios con diferentes condiciones para dar con las oacuteptimas En primer lugar se llevaron a cabo los
experimentos de retencioacuten y elucioacuten sobre dos tipos distintos de adsorbentes cartuchos OASIS HLB (200mg) y
cartuchos OASIS MAX (150 mg) como fases potenciales en las que llevar a cabo la extraccioacuten de manera
selectiva Los dos tipos de cartuchos son de fase reversa pero difieren entre siacute en el fundamento de retencioacuten de
los analitos En los cartuchos OASIS HLB (200 mg) formados por divinilbenceno-N-vinilpirrolidona (DVB-VP)
la retencioacuten de los diferentes analitos tiene lugar por interacciones π-π o de Van der Waals mientras que los
cartuchos OASIS MAX (150 mg) que se probaron como alternativa para mejorar la selectividad en la extraccioacuten
cuentan con un adsorbente polimeacuterico de modo mixto formado por divinilbenceno-N-vinilpirrolidona (DVB-VP)
funcionalizado con grupos amina cuaternaria siendo el fundamento de la extraccioacuten la combinacioacuten de las
propiedades adsorbentes del cartucho HLB con un mecanismo adicional de intercambio ioacutenico (anioacutenico) [27]
Algunos autores han empleado este mecanismo para mejorar la selectividad de la extraccioacuten de forma que en la
etapa de elucioacuten ciertos pigmentos del vino quedan fuertemente retenidos en el adsorbente a diferencia de lo que
ocurre con los adsorbentes de fase reversa [51]
Para llevar a cabo la eleccioacuten del tipo de adsorbente se realizaron pruebas con 10 mL de vino blanco y tinto
conectando en serie los dos tipos de cartuchos HLB (200 mg) y MAX (150 mg) a un segundo cartucho OASIS
HLB (60 mg) La elucioacuten de los analitos se hace de forma independiente para cada cartucho y se evaluacutea si los
analitos pasan del primer cartucho hacia el segundo cartucho es decir si se supera el volumen de corte o si por
33
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
otro lado se quedan retenidos en el primero y no eluyen hacia el segundo En estas pruebas de estudio
preliminares de preparacioacuten de la muestra no se ha incluido el CYP
En la Figura IV3 podemos ver la eficacia de la extraccioacuten para vino blanco y tinto que obtenemos empleando
cartuchos OASIS MAX (150 mg) conectados en serie con cartuchos OASIS HLB (60 mg) realizando la
extraccioacuten de tres fracciones de 2 mL cada una del cartucho OASIS MAX (150 mg) y una cuarta fraccioacuten de 2
mL del cartucho OASIS HLB (60 mg)
Por otro lado en la Figura IV4 podemos ver un graacutefico de columnas en el cual comparamos la eficacia de
extraccioacuten de los cartuchos OASIS HLB (200 mg) con dos disolventes de elucioacuten distintos En dicho graacutefica el
acroacutenimo de cada compuesto consta de dos barras cuyo significado es el siguiente la barra de la izquierda indica
la eficacia de la extraccioacuten empleando acetonitrilo (ACN) como disolvente de elucioacuten y la barra de la derecha
indica la eficacia de la extraccioacuten empleando la combinacioacuten MetanolAcetonitrilo (2080) (MeOHACN) como
disolvente de elucioacuten Para este adsorbente no se detectoacute ninguacuten compuesto en la extraccioacuten del segundo
cartuchos OASIS HLB (60 mg) empleando 2 mL de metanol
Figura IV3 Distribucioacuten de los compuestos en cada fraccioacuten obtenidas con cartuchos OASIS MAX (150 mg)
utilizando 10 mL de vino tinto y blanco sacando cuatro fracciones de 2 mL cada una con metanol como
disolvente de elucioacuten
34
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Figura IV4 Distribucioacuten de los compuestos en cada fraccioacuten obtenidas con cartuchos OASIS HLB (200 mg) utilizando 10
mL de vino tinto y blanco sacando 3 fracciones de 2 mL cada una con acetonitrilo (ACN) (columna de la izquierda) y una
combinacioacuten MetanolAcetonitrilo (2080) (MeOHACN) (columna de la derecha) como disolventes de elucioacuten
A la vista de los resultados reflejados en las graacuteficas podemos afirmar que cuando se utiliza el cartucho OASIS
HLB (200 mg) eluyendo con acetonitrilo o la combinacioacuten metanolacetonitrilo (2080) los extractos son limpios
y se eluyen la mayoriacutea de los compuestos en la primera fraccioacuten Pero utilizando acetonitrilo como disolvente de
elucioacuten se encuentran problemas en la extraccioacuten de CAR FEH y TBZ para los que es necesario emplear un
volumen mayor de elucioacuten o bien seleccionar otro disolvente de elucioacuten como es la combinacioacuten
metanolacetonitrilo
35
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Por otro lado los extractos en los cartuchos OASIS MAX (150 mg) son maacutes limpios incluso utilizando metanol en
la elucioacuten pero se detecta la presencia de CAR FEP TBZ y TME en el segundo cartucho OASIS HLB (60 mg)
significando la rotura del primer cartucho para dichos analitos considerando un volumen de 10 mL de vino Los
demaacutes compuestos se podriacutean recuperar cuantitativamente en la primera fraccioacuten sacada pero la peacuterdida de estos
compuestos inclina la eleccioacuten hacia los cartuchos OASIS HLB (200 mg) con metanolacetonitrilo (2080) como
disolvente de elucioacuten para continuar con el estudio
Una vez fijado el adsorbente y el volumen de elucioacuten se prueba la eficacia de la SPE independiente de los efectos
de matriz En la Tabla IV4 se muestran las recuperaciones de la SPE tomando 10 mL de vino blanco y tinto
con un nivel de adicioacuten de 15 ngmL sacando una sola fraccioacuten de 2 mL con la combinacioacuten
metanolacetonitrilo (2080) y n=3 reacuteplicas
Tabla IV4 Recuperaciones (R plusmn SD) de SPE para 10 mL de vino (blanco y tinto) con un nivel de adicioacuten de 15 ngmL y
n=3 reacuteplicas
Compuesto Vino Tinto
R plusmn SD
Vino Blanco
R plusmnSD Compuesto
Vino Tinto
R plusmn SD
Vino Blanco
R plusmn SD
AME 82 plusmn 7 100 plusmn 1 MET 92 plusmn 6 94 plusmn 3
BEN 89 plusmn 6 97 plusmn 3 MYC 90 plusmn 9 86 plusmn 4
BOS 95 plusmn 1 100 plusmn 2 PEN 84 plusmn 10 103 plusmn 3
CAR 91 plusmn 6 104 plusmn 6 PYC 86 plusmn 5 106 plusmn 1
CYP 81 plusmn 7 102 plusmn 3 PYM 87 plusmn 12 94 plusmn 3
DIM 97 plusmn 3 86 plusmn 4 TEC 83 plusmn 10 103 plusmn 1
FEH 89 plusmn 3 88 plusmn 3 TEF 84 plusmn 5 108 plusmn 4
FEP 91 plusmn 7 104 plusmn 3 TBZ 88 plusmn 7 92 plusmn 5
FLU 91 plusmn 2 97 plusmn 4 TME 101 plusmn 1 110 plusmn 13
IMI 117 plusmn 8 101 plusmn 11 THI-M 85 plusmn 9 110 plusmn 4
IPR 89 plusmn 7 112 plusmn 4 TRI 85 plusmn 10 110 plusmn 4
MAN 88 plusmn 2 87 plusmn 2
Algunos compuestos de la matriz en el vino pueden competir con los analitos durante el proceso de ionizacioacuten
que tiene lugar en la interfase entre UPLC-MSMS por lo que para la cuantificacioacuten del rendimiento de la
ionizacioacuten por electrospray (ESI) se estudian los efectos de matriz (EM) para vino blanco y tinto considerando
dos voluacutemenes de muestra distintos 2 y 10 mL y un volumen final del extracto de 2 mL En la Tabla IV5 se
36
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
exponen los valores para cada compuesto notando que al aumentar el volumen de muestra tambieacuten se aumentan
los efectos de matriz y eacutestos siempre son mayores en vino tinto Para el caacutelculo de estos efectos de matriz (EM)
se emplea la siguiente ecuacioacuten
Donde Am Ab y Ap representan el aacuterea de pico en la sentildeal medida del analito en el extracto de la muestra con
adicioacuten en el extracto de la muestra sin adicioacuten (o blanco) y en el patroacuten antildeadido respectivamente El nivel de
adicioacuten en extracto fue de 50 ngmL por compuesto
Tabla IV5 Efectos de matriz para vino blanco y tinto con un volumen inicial de 2 y 10 mL evaluados para un nivel de adicioacuten de 50 ngmL en extracto
Compuesto
Vino blanco Vino tinto
2 mL 10 mL 2mL 10 mL
EM () CV () EM () CV () EM () CV () EM () CV()
AME 93 3 95 2 99 3 101 7
BEN 99 1 93 2 101 3 100 6
BOS 97 5 98 1 108 2 96 0
CAR 62 2 50 3 58 2 55 6
CYP 94 3 91 1 97 2 95 7
DIM 105 2 95 3 100 3 108 3
FEH 100 4 102 4 105 4 94 3
FEP 95 3 88 2 96 2 92 7
FLU 98 2 93 2 106 1 101 2
IMI 84 4 46 3 48 10 18 8
IPR 99 3 92 3 105 1 100 7
MAN 100 1 94 3 109 4 107 2
MET 98 1 89 1 99 2 99 6
MYC 105 1 100 1 103 2 96 9
PEN 98 3 97 1 101 3 99 10
PYC 98 2 92 3 102 2 98 5
PYM 95 2 87 1 94 3 85 12
TEC 95 3 99 1 101 1 102 10
TEF 99 1 92 3 101 2 104 5
TBZ 45 0 40 5 43 2 30 7
TME 60 6 19 16 36 4 16 1
THI-M 107 2 109 2 103 1 96 9
TRI 97 3 118 4 104 5 117 10
37
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Al observar los resultados podemos ver que la mayoriacutea de los compuestos dan resultados de EM en torno al
100 lo que significa que no sufren una modificacioacuten importante en la eficacia de ionizacioacuten para las muestras
con respecto a los patrones Pero tambieacuten por el contrario podemos observar que algunos compuestos como
por ejemplo en el caso de CAR TBZ IMI y TME experimentan una gran supresioacuten de sentildeal es decir EM bajos
que se acentuacutean al aumentar el volumen de muestra La atenuacioacuten en la eficacia de variacioacuten para estos cuatro
compuestos no solo se ve incrementada con el volumen de muestra si no que ademaacutes es maacutes significativa para
vino tinto que para vino blanco En base a estos resultados aunque la eficacia de la SPE fue cuantitativa para
muestras de 10 mL se limitoacute el volumen de muestra a extraer a 2 mL
Las condiciones oacuteptimas de extraccioacuten se esquematizan en un resumen en la Figura IV5
Figura IV5 Condiciones optimizadas para la extraccioacuten de pesticidas en vino
38
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
4 CARACTERIZACIOacuteN DEL MEacuteTODO DE DETERMINACIOacuteN
Con las condiciones de extraccioacuten y determinacioacuten citadas anteriormente se llevaron a cabo pruebas de
recuperaciones absolutas de los compuestos a nivel de adicioacuten de 5 y 20 ngmL sobre las muestras Para cada
muestra y nivel de adicioacuten se realizaron tres reacuteplicas de las muestras con adicioacuten y los blancos aliacutecuotas de las
mismas muestras sin adicioacuten se procesaron en duplicado Los IS se antildeadieron a nivel de 25 ngmL y cada uno se
utiliza para corregir unos determinados compuestos CAR-d3 se emplea para CAR y TBZ el CYP-d5 para CYP y
PYM el IMID-d4 para IMI y TME y el MET13C6 para el resto de compuestos Los resultados para vino blanco
comprenden en el nivel de concentracioacuten 5 ngmL el rango entre 79-122 y en el nivel de concentracioacuten 20
ngmL el rango entre 84-109 Por otro lado en el caso del vino tinto las recuperaciones se encuentran para el
nivel de concentracioacuten 5 ngmL en el rango 67-112 y para el nivel de concentracioacuten 20 ngmL entre el rango
73-132 Los resultados obtenidos en las pruebas con vino blanco y vino tinto se muestran en la Tabla IV6
Los resultados son satisfactorios ya que la mayoriacutea de los compuestos se ajustan en todos los casos al rango de
recuperacioacuten entre 70-120 Para la realizacioacuten de estas pruebas se ha eliminado de los resultados el compuesto
THI-M debido a que las concentraciones utilizadas se encuentran en el liacutemite o por debajo del LOQ en los
experimentos con muestras adicionadas a 5 ngmL
Para calcular las recuperaciones (R) se recurrioacute a la siguiente ecuacioacuten
Donde Cm Cb y Cp son la concentracioacuten medida de analito en el extracto de la muestra con adicioacuten en el extracto
de la muestra sin adicioacuten (o blanco) y en el patroacuten antildeadido respectivamente
Tabla IV6 Recuperaciones (R) para vino tinto y vino blanco evaluadas para dos niveles de concentracioacuten 5 y 20 ngmL
Compuesto
Vino tinto Vino Blanco
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
AME 97 3 105 6 104 9 96 5
BEN 88 11 105 3 101 1 98 4
BOS 91 13 110 2 88 13 97 3
39
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Compuesto
Vino tinto Vino blanco
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
CAR 99 6 99 3 122 3 109 1
CYP 91 2 111 1 101 4 100 6
DIM 112 3 110 9 102 24 99 11
FEH 91 4 108 0 102 20 95 2
FEP 89 8 102 7 94 5 84 1
FLU 95 10 104 4 109 5 100 8
IMI 73 11 115 9 80 13 100 2
IPR 84 13 99 3 111 3 99 4
MAN 88 22 112 8 112 3 99 4
MET 99 3 106 5 106 3 98 2
MYC 84 9 106 13 88 17 86 3
PEN 84 9 102 5 84 8 90 5
PYC 96 6 105 4 100 2 95 4
PYM 90 12 112 14 106 4 97 1
TEC 89 8 101 6 98 12 94 1
TEF 93 10 102 5 107 2 97 3
TBZ 94 17 115 8 79 5 106 2
TME 67 2 101 7 84 18 90 11
THI-M ne - 74 7 ne - 89 24
TRI 88 12 97 6 102 6 92 2
ne No evaluado El nivel de adicioacuten es inferior al LOQ del meacutetodo para este compuesto
Para estudiar la reproducibilidad del meacutetodo analiacutetico global (correspondientes a los datos de preparacioacuten de
muestra y determinacioacuten) es decir la concordancia de varias medidas realizadas en diacuteas diferentes se procedioacute a la
extraccioacuten en las condiciones oacuteptimas tanto de vino blanco como tinto Las extracciones y determinaciones se
realizaron durante tres diacuteas consecutivos realizando tres reacuteplicas por vino y por diacutea con un nivel de adicioacuten en
muestra de 10 ngmL un blanco de muestra cada diacutea En la Tabla IV7 se muestran los resultados como
recuperaciones (R) en condiciones de reproducibilidad obtenidos para ambos tipos de vino dando valores entre
64-116 para muestras de vino blanco y valores situados entre 68-108 para muestras de vino tinto con la
excepcioacuten del TME para el que se ha obtenido un valor no aceptable en cuanto a la exactitud medida en
condiciones de reproducibilidad A la vista de los resultados obtenidos con estas pruebas se considera necesario el
empleo de IS adicionales para la mejora en la exactitud del meacutetodo para algunos compuestos por ejemplo el
TME
40
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Tabla IV7 Recuperaciones en condiciones de reproducibilidad (R plusmn SD) para vino blanco y tinto
Compuesto
Vino tinto Vino blanco
R
10 ngmL CV ()
R
10 ngmL CV ()
AME 90 5 101 13
BEN 96 5 102 7
BOS 97 6 100 8
CAR 97 3 94 5
CYP 103 3 105 12
DIM 104 7 106 8
FEH 90 16 83 15
FEP 91 5 90 4
FLU 103 7 102 6
IMI 99 14 101 14
IPR 91 5 100 13
MAN 108 5 108 13
MET 101 5 101 5
MYC 105 16 102 14
PEN 96 11 92 10
PYC 99 12 97 12
PYM 102 4 116 8
TEC 99 9 97 16
TEF 99 8 105 11
TBZ 68 4 84 5
TME 47 13 64 10
THI-M 107 11 104 16
TRI 95 14 103 4
En la Tabla IV8 se muestran los liacutemites de cuantificacioacuten (LOQs) del meacutetodo del meacutetodo de SPE-UPLC-ESI-
MSMS obtenidos para los diferentes pesticidas Los valores obtenidos son ideacutenticos a los LOQs instrumentales
excepto en el caso de aquellos compuestos para los que se observaronfuertes efectos de matriz (Tabla IV5) En
estos casos (CAR TBZ IMI y TME) los LOQs del meacutetodo se incrementan seguacuten la atenuacioacuten de sentildeal
observada
41
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Tabla IV8 Liacutemites de cuantificacioacuten LOQs (ngmL) del meacutetodo obtendos para cada compuesto
Compuesto LOQ (ngmL) Compuesto LOQ (ngmL)
AME 04 MET 01
BEN 01 MYC 04
BOS 02 PEN 02
CAR 03 PYC 02
CYP 02 PYM 01
DIM 07 TEC 05
FEH 05 TEF 01
FEP 01 TBZ 04
FLU 02 TME 02
IMI 06 THI-M 10
IPR 01 TRI 07
MAN 01
5 APLICACIOacuteN A MUESTRAS DE VINO COMERCIALES
Una vez optimizadas las condiciones del meacutetodo y estudiadas las caracteriacutesticas del meacutetodo desarrollado se aplicoacute
a la determinacioacuten de los compuestos de intereacutes estudiados en muestras de vino blanco y vino tinto comerciales
producidos en diferentes paiacuteses En la Tabla IV9 se muestra el paiacutes de origen de cada muestra comercial
identificadas con un coacutedigo alfanumeacuterico y antildeo de produccioacuten
42
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Tabla IV9 Coacutedigo asignado para los diferentes vinos comerciales blancos y tintos analizados Indicando el paiacutes de origen y
antildeo de produccioacuten
Coacutedigo Denominacioacuten de origen Antildeo de produccioacuten
bull Vinos Blancos
W1 Alemania 2014
W2 Espantildea 2012
W3 Espantildea 2016
W4 Portugal Desconocido
W5 Francia 2015
W6 Francia 2015
W7 Espantildea 2016
bull Vinos Tintos
R1 Espantildea 2015
R2 Sudaacutefrica 2015
R3 Chile 2015
R4 Francia 2015
R5 China Desconocido
R6 Espantildea 2016
R7 Australia 2014
R8 Francia 2013
R9 Francia 2015
A continuacioacuten en la Tabla IV10 y la Tabla IV11 se recogen los resultados obtenidos en el anaacutelisis de las
muestras comerciales Los datos obtenidos corresponden en todos los casos al uso de patrones de calibracioacuten
como teacutecnica de cuantificacioacuten
Tabla IV10 Concentracioacuten (ngmL) encontradas en las diferentes muestras de vino blanco comercial analizadas mediante
SPE-UPLC-MSMS n=2 reacuteplicas y al final el sumatorio de las concentraciones encontradas
Compuesto W1 W2 W3 W4 W5 W6 W7
AME 04 nd nd nd 41 nd nd
BEN nd nd 14 nd nd nd nd
BOS 84 102 520 54 197 nd nd
CAR nd 115 56 nd nd nd nd
CYP 08 59 112 nd nd 26 nd
43
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Compuesto W1 W2 W3 W4 W5 W6 W7
DIM 14 84 400 09 32 50 nd
FEH 85 809 639 15 187 nd nd
FLU 11 05 92 nd 77 32 nd
IMI nd 136 88 29 nd nd 69
IPR 30 749 1144 14 nd nd nd
MAN nd nd nd nd nd 30 nd
MET 04 273 494 63 nd nd 172
MYC 09 nd 35 nd nd nd nd
PYM 15 469 584 08 24 35 nd
TEC 11 nd 58 nd nd nd nd
TRI nd 67 61 nd nd nd nd
sumconcentracioacuten
(ngmL) 274 2868 4358 192 558 173 862
nd no detectado
Tabla IV11 Concentracioacuten (ngmL) encontradas en las diferentes muestras de vino tinto comercial analizadas mediante
SPE-UPLC-MSMS n= 2 reacuteplicas y al final el sumatorio de las concentraciones encontradas
Compuesto R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9
AME nd nd nd 30 nd nd nd nd 16
BEN nd nd nd 07 nd nd nd nd nd
BOS nd 55 21 196 nd nd nd 73 21
CAR nd nd 04 17 249 20 nd nd nd
CYP 34 08 02 22 nd 136 nd 85 nd
DIM nd 33 nd 52 233 46 nd 61 23
FEH nd nd nd 1070 nd 10 nd 1307 14
FLU nd nd nd 20 nd nd nd nd nd
IPR 16 nd nd 17 nd 22 nd nd nd
MAN nd nd nd 17 nd nd nd 20 nd
MET 126 nd nd 14 55 313 30 44 39
MYC nd nd nd 05 nd 32 nd nd nd
PYM 19 nd 03 185 49 281 nd 24 nd
TEC 25 06 39 29 nd nd nd 21 20
TEF nd 01 12 nd nd nd nd nd nd
sumconcentracioacuten
(ngmL) 220 48 81 1681 586 860 30 1635 133
nd no detectado 44
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
En los resultados de los anaacutelisis podemos observar que en ninguna de las muestras comerciales de vino blanco
aparecieron los siguientes compuestos FEP PEN PYC TEF TBZ THI-M y TME y en los vinos tintos
comerciales no aparece a ninguna concentracioacuten FEP IMI PEN PYC TBZ TME THI-M y TRI No se
detectaron para dichas muestras de vino a niveles superiores a los LOQs del meacutetodo propuesto
Cuando se detecta un compuesto positivo se compara el pico cromatograacutefico del compuesto con el de un patroacuten
verificando la coincidencia del tiempo de retencioacuten (maacutexima diferencia 01 min) y la relacioacuten entre transiciones
(maacutexima diferencia 30 ) En la Figura IV6 y la Figura IV7 se muestran los cromatogramas para el compuesto
CYP obtenido en condiciones oacuteptimas para la muestra de vino blanco W6 y en un patroacuten de 5 ngmL
respectivamente En este caso el intervalo de tolerancia para la relacioacuten de intensidad entre transiciones es
IP2IP1=061plusmn018
Figura IV6 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el CYP en la muestra W6 (26 ngmL) Transicioacuten
superior 226gt93 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 226gt108 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades IP2IP1= 066
Figura IV7 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el CYP en un patroacuten de 5 ngmL Transicioacuten
superior 226gt93 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 226gt108 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades IP2IP1=061plusmn018
45
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Otro ejemplo de compuesto positivo en abundantes muestras comerciales de estudio es el Metalaxyl positivo con
una concentracioacuten de 04 ngmL en el vino con referencia W1 (Figura IV8) y positivo con una concentracioacuten de
313 ngmL en el vino con referencia R6 (Figura IV9) Ambas se comparan con el cromatograma de un patroacuten
de Metalaxyl de 1 ngmL (Figura IV10) El grado de concordancia en los tiempos de retencioacuten y la relacioacuten de
intensidades entre transiciones es satisfactorio
Figura IV8 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el MET en la muestra W1 (04 ngmL) Transicioacuten
superior 2801gt2201 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 2801gt1921 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades
IP2IP1=056
Figura IV9 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el MET en la muestra R6 (313 ngmL) Transicioacuten
superior 2801gt2201 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 2801gt1921 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades IP2IP1=
056
46
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Figura IV10 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el MET en un patroacuten de 1 ngmL Transicioacuten
superior 2801gt2201 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 2801gt1921 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades
IP2IP1=057plusmn017
Es de destacar que aunque se detectaron bastantes pesticidas en las diferentes muestras de vino comerciales pero
en ninguacuten caso superaron el 10 de los LMRs permitidos en uvas tal y como se recomienda ya que todaviacutea no
existen LMRs para vino en la legislacioacuten vigente No obstante el nivel total de concentracioacuten (sumatorio de
concentraciones Tabla IV10 y Tabla VI11) es significativo para varias muestras tanto de vinos blancos (W2 y
W3) como tintos (R4 y R8)
47
Capiacutetulo V Conclusiones
CAPIacuteTULO V CONCLUSIONES
En este trabajo se ha estudiado un meacutetodo para la cuantificacioacuten de pesticidas concretamente veinte fungicidas y
tres insecticidas en vino blanco y tinto En la etapa de preparacioacuten de muestra se optimizoacute la extraccioacuten en fase
soacutelida (SPE) utilizando cartuchos OASIS HLB (200 mg) compuestos por divinilbenceno-N-vinilpirrolidona
(DVB-VP) como adsorbente Como teacutecnica de determinacioacuten se utilizoacute cromatografiacutea de liacutequidos con una
interfase de electroespray acoplada a espectrometriacutea de masas (UPLC-ESI-MSMS)
Las conclusiones generales obtenidas a partir de los resultados de este proyecto relativo a la determinacioacuten de
fitosanitarios en vino son
Ante los problemas de retencioacuten que presentan los cartuchos OASIS MAX (150 mg) para algunos
compuestos los cartuchos OASIS HLB (200 mg) junto con la combinacioacuten metanolacetonitrilo (2080)
como disolvente de elucioacuten son elegidos como mejor opcioacuten en la extraccioacuten en fase soacutelida de pesticidas
en muestras con matrices complejas como es el caso del vino Asiacute se consigue la retencioacuten selectiva de
componentes de la matriz y proporciona extractos con menor porcentaje de interferencias
El meacutetodo estudiado y optimizado se puede aplicar tanto a vinos blancos como a vinos tintos procesados
a partir de distintas variedades de uvas
Los liacutemites de cuantificacioacuten (LOQs) del estudio se situacutean la mayoriacutea por debajo de 10 ngmL excepto
en el caso de THI-M que asciende al valor de 20 ngmL El rango de respuesta lineal abarca hasta 200
ngmL y el tiempo de anaacutelisis ha sido de solo 10 minutos por muestra
En todas las muestras de vino (blancos y tintos) comerciales analizadas se han detectado la presencia de
varios pesticidas sin embargo todas las concentraciones encontradas se encuentran por debajo del 10
de los LMRs fijados en uvas tal y como recomienda la legislacioacuten por lo que no se considera
preocupante
48
Capiacutetulo V Conclusioacutens
CAPIacuteTULO V CONCLUSIOacuteNS
Neste traballo estudouse un meacutetodo para a cuantificacioacuten de pesticidas en particular vinte funxicidas e tres
insecticidas en vintildeo branco e maacuteis tinto No paso da preparacioacuten da mostra optimizouse a extraccioacuten en fase
soacutelida (SPE) empregando cartuchos OASIS HLB (200 mg) compostos por divinilbenceno-N-pirrolidona (DVB-
VP) como adsorbente Para a teacutecnica de determinacioacuten utilizouse cromatografiacutea de liacutequidos con unha interfase de
electroespray acoplada a espectrometriacutea de masas (UPLC-ESI-MSMS)
As conclusioacutens xerais a obtidas a partir dos resultados deste proxecto relativo aacute determinacioacuten de pesticidas en
vintildeo son
Ante os problemas de retencioacuten que mostraban os cartuchos OASIS MAX (150 mg) para alguacuten
compostos os cartuchos OASIS HLB (200 mg) en conxunto coa mistura metanolacetonitrilo (2080)
como disolvente de elucioacuten son elexidos como mellor opcioacuten na extraccioacuten en fase soacutelida de pesticidas
en mostras con matrices complexas como eacute o caso do vintildeo Asiacute eacute conseguida a retencioacuten selectiva de
componentes da matriz e proporciona extractos con menos porcentaxe de interferencias
O meacutetodo estudado e optimizado poacutedese aplicar tanto a vintildeos brancos coma tintos procesados a partir de
diferentes variedades de uvas
Os liacutemites de cuantificacioacuten do estudo (LOQs) son maacuteis baixos de 10 ngmL agaacutes no caso do THI-M
que ascende ao valor de 20 ngmL O rango de resposta lineal cobre ata 200 ngmL e o tempo de anaacutelise
foi de soacute 10 minuacutetos por mostra
En todas as mostras de vintildeo (brancos e tintos) comercial analizadas detectouse a presenza de varios
pesticidas maacuteis poreacuten todas as concentracioacutens atopadas son inferiores ao 10 dos LMR fixados en uvas
tal e como recomenda a lexislacioacuten polo que non se considera preocupante
49
Chapter V Conclusions
CHAPTER V CONCLUSIONS
In this work we have studied a method for the quantification of pesticides specifically twenty fungicides and
three insecticides in white and red wine In the sample preparation step the solid phase extraction was optimized
using cartridges OASIS HLB (200 mg) containing divinylbenzene-N-vinylpyrrolidone (DVB-VP) as adsorbent
As determination technique ultraperformance liquid chromatography was used with an electrospray interface
coupled to mass spectrometry (UPLC-ESI-MS7MS)
The general conclusions drawn from the results of this project concerning the determination of pesticides in wine
are
Due to the retention problems presented by the OASIS MAX sorbent (150 mg) for some compounds of
this project the cartridges OASIS HLB (200 mg) together with the methanolacetonitrile (2080) mixture
are chosen as the best option in the solid phase extraction of pesticides in samples with complex
matrices as is the case with the wine
The method studied and optimized can be applied to both white and red wines obtained from different
varieties of grapes
The limits of quantification (LOQs) were below 10 ngmL for most of the compounds except in the
case of THI-M with a LOQ of to 10 ngmL The linear response range covers up to 200 ngmL and the
analysis time was only 10 minutes per sample
In all commercial wine samples (white and red) analyzed the presence of several pesticides was
conformed however all the concentrations obtained are below 10 of the Maximum residue
levels(MRLs) fixed in grapes as recommended by legislation
50
VI Bibliografiacutea VI BIBLIOGRAFIacuteA [1] Ministerio de agricultura y pesca alimentacioacuten y medio ambiente mhttpwwwmapamagobesescalidad-y-evaluacion-ambientaltemasproductos-quimicosfitosanitarios (Acceso el diacutea 11052017) [2] httpwwwcricyteduarenciclopediaterminosProducFitohtm (Acceso el diacutea 11052017) [3] WERNER BALTES ldquoQuiacutemica de los alimentosrdquo Editorial Acribia SA 2007 Capiacutetulo 11 ldquoResiduos en los alimentosrdquo paacuteginas 206-217
[4] RLabrada JCCaseley CParker ldquoESTUDIO FAO PRODUCCIOacuteN Y PROTECCIOacuteN VEGETAL 120rdquo Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentacioacuten Roma 1996 ISSN 1014- Capiacutetulo 10 Herbicidas httpwwwfaoorgdocrepT1147St1147s00htmContents (Acceso el diacutea 12052017)
[5] Taberner Palou Andreu Cirujeda Ranzenberger Alicia Zaragoza Larios Carlos ldquoManejo de poblaciones de malezas resistentes a herbicidasrdquo (FAO Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura) 100 preguntas sobre resistencia PDF sacado de httpwwwfaoorg3a-a1422spdf (Acceso el diacutea 12052017) [6] BISSET Juan A Uso correcto de insecticidas control de la resistencia Revista Cubana de Medicina Tropical 2002 vol 54 no 3 p 202-219 [7] DEVINE Gregor J EZA Dominique Ogusuku Elena FURLONGMichael J Uso de insecticidas contexto y consecuencias ecoloacutegicas Revista peruana de medicina experimental y Salud Puacuteblica 2008 vol 25 no 1 p 74-100 [8] Ministerio de agricultura y ganaderiacutea (proteccioacuten agropecuaria servicio de diagnoacutestico fitosanitario) de costa Rica httpwwwmaggocrbibliotecavirtualH20-5054pdf (Acceso el diacutea 11052017) [9] GEPP V MONDINO P Control quiacutemico 2011 PDF obtenido de httpwwwpvfagroeduuyfitopatodocscursosfitopatoMaterialesGuiasC-QUIMICOpdf (Acceso el diacutea 772017) [10] ROSSLENBROICH Hans-Juergen STUEBLER Dietrich Botrytis cinereamdashhistory of chemical control and novel fungicides for its management Crop Protection 2000 vol 19 no 8 p 557-561 [11] Figura 11 httpwwwvitiviniculturanetbotritis-o-podredumbre-gris-botrytis-cinerea-pershtml (Acceso el diacutea 12052017) [12] CAMPBELL Paul BENDEK Carlos LATORRE Bernardo A Riesgo de oiacutedio (Erysiphe necator) de la vid en relacioacuten con el desarrollo de los racimos Ciencia e investigacioacuten agraria 2007 vol 34 no 1 p 5-11 [13] ldquoCoacutemo combatir el oiacutedio de la vidrdquo Jose Javier Peacuterez de Obanos Castillo PDF sacado de httpswwwnavarraesNRrdonlyres05E65D9B-D1A2-4EAD-9A63-AFF1D3215552135109Comocombatireloidiodelavidpdf (Acceso el diacutea 12052017) [14] Imagen 12 sacadas las 3 de httpwwwvitiviniculturanetoidio-de-la-vidhtml (Acceso el diacutea 12052017) [15] BARRIOS Gonccedilal REYES Joan Modelizacioacuten del Mildiu de la Vid 2004 httpwwwruralcatnetmigracio_resources617683_mildiusPDF (Acceso el diacutea 12052017) [16] Imaacutegenes sacadas de httpwwwvitiviniculturanetmildiu-de-la-vid-enfermedades-vinahtml (Acceso el diacutea 13052017) [17] HUQ Mainul MEISNER Craig DASGUPTA Susmita Health effects and pesticide perception as determinants of pesticide use evidence from Bangladesh httpagrisfaoorgagris-searchsearchdorecordID=US2012411738 (Acceso el diacutea 13052017)
51
IV Bibliografiacutea [18] BADII Mohammad H LANDEROS Jeroacutenimo Plaguicidas que afectan a la salud humana y la sustentabilidad CULCyT 2015 no 19 Revista vista en httpopenjournaluacjmxojsindexphpculcytarticleview454 (Acceso el diacutea 772017) [19] OLEA Nicolaacutes FERNAacuteNDEZ Mariana F Plaguicidas persistentes En Congreso Implementacioacuten del Convenio de Contaminantes Orgaacutenicos Persistentes Madrid 2001 p 26-27 [20] httpwwwfaoorgfao-who-codexalimentariusabout-codexes (Acceso el diacutea 14052017) [21] httpeceuropaeufoodplantpesticidesmax_residue_levels_en (Acceso el diacutea 14052017 [22] ORDONtildeEZ Juan A Cambero Rodriacuteguez MI Fernaacutendez Aacutelvarez L Garciacutea Sanz ML Garciacutea de Fernando Minguilloacuten GD de la Hoz Perales L Selgas Cortecero MD Tecnologiacutea de los alimentos Volumen 1 Componentes de los Alimentos y Procesos Siacutentesis Madrid 1998paacutegs 349-351 [23] CELA Rafael Casais Maria del Carmen Lorenzo Rosa Antonia Teacutecnicas de separacioacuten en quiacutemica analiacutetica Siacutentesis 2002 Capiacutetulo 11 Extraccioacuten y lixiviacioacuten por disolvente (paacutegs206-260) [24] CANTWELL Frederick F LOSIER Manon Liquidmdashliquid extraction Comprehensive Analytical Chemistry 2002 vol 37 p 297-340 [25] Imagen de LLE sacada de httpprocesosbiowikispacescomExtracciC3B3n+liquido-liquido (Acceso el diacutea 15052017) [26] HENNION Marie-Claire Solid-phase extraction method development sorbents and coupling with liquid chromatography Journal of Chromatography A 1999 vol 856 no 1 p 3-54 [27] CELA Rafael Casais Maria del Carmen Lorenzo Rosa Antonia Teacutecnicas de separacioacuten en quiacutemica analiacutetica Siacutentesis 2002 Capiacutetulo 16 Teacutecnicas de adsorcioacuten y absorcioacuten en la preparacioacuten de muestras Extraccioacuten y microextraccioacuten en fase soacutelida (paacutegs520-555) [28] Imagen spe sacada httptoxicocbblogspotcomes201310las-intoxicaciones-con-farmacoshtml (Acceso el diacutea 15052017) [29] Chaacutefer Pericaacutes Consuelo Acoplamiento microextraccioacuten en fase soacutelida-cromatografiacutea (2006) httprodericuveshandle1055014940 (Acceso el diacutea 16052017) [30] Imagen SPME httpwwwscieloorgcoscielophpscript=sci_arttextamppid=S0122-53832002000100005 (Acceso el diacutea 16052017) [31] MONTES GOYANES Rosa Mariacutea Avances en teacutecnicas de microextraccioacuten para la determinacioacuten de compuestos traza en muestras medioambientales y alimentarias Teacutesis doctoral Noviembre 2009 (Paacutegs 34-55) [32] LEHOTAY Steven J Ae Son Kyung KwonHyeyoung Koesukwiwat Urairat Fu Wusheng Mastovska Katerina Hoh Eunha Leepipatpiboon Natchanun Comparison of QuEChERS sample preparation methods for the analysis of pesticide residues in fruits and vegetables Journal of Chromatography A 2010 vol 1217 no 16 p 2548-2560 [33] Imagen QueChERS httpswwwresearchgatenetpublication279221361_QuEChERS_A_Sample_Preparation_for_Extraction_of_Carbaryl_from_Rat_Feces (Acceso el diacutea 16052017) [34] STASHENKO Elena E MARTIacuteNEZ Jairo Reneacute Preparacioacuten de la muestra un paso crucial para el anaacutelisis por GC-MS Uma publicaccedilatildeo trimestral do Instituto Internacional de Cromatografia (IIC) Ciecircncia Cromatograacutefica 2011 vol 3 no 1 [35] Imagen GC-MS httpsorgspectroscopyintblogspotcomes201411gas-chromatography-mass-spectrometry-gchtml (Acceso el diacutea 17052017) [36] httpwwwactlabscompageaspxmenu=65ampapp=221ampcat1=534amptp=2amplk=no (Acceso el diacutea 17052017)
52
IV Bibliografiacutea [37] Quintela O Cruz A Concheiro M De Castro A amp Loacutepez-Rivadulla M (2005) Metodologiacutea LC-MS Aspectos generales de la teacutecnica y sus aplicaciones en el campo de la toxicologiacutea Rev Toxicol 22 paacutegs7-14 [38] Imagen LC-MS httpsuploadwikimediaorgwikipediaenff9Liquid_chromatography_tandem_Mass_spectrometry_diagrampng (visto 18052017) [39] Vargas de la Cruz Celia Bertha Adaptacioacuten de la Metodologiacutea Analiacutetica para la determinacioacuten de residuos de plaguicidas en frutas nativas de exportacioacuten mediante Uplc-MsMs (2012) Tesis obtenida en http20062146130handlecybertesis2331 (Acceso el diacutea 772017) [40] ROMERO GONZAacuteLEZ Roberto Fernaacutendez Moreno Joseacute Luis Plaza Bolantildeos Patricia Garrido Frenich Antonia Martiacutenez Vidal Joseacute Luis Empleo de la espectrometriacutea de masas como herramienta para la determinacioacuten de toacutexicos en alimentos hacia la seguridad alimentaria Revista Espantildeola de salud puacuteblica 2007 vol 81 no 5 p 461-474 [41] PAYAacute Andrus Fundamento y Funciones de la Espectrometriacutea de Masas Universidad de Valencia Espantildea 2006 httpmuraluvescaloan (Acceso el diacutea 19052017) [42] Imagen MS sacada de httpsesslidesharenetMaYaTorrezespectrometria-demasas (Acceso el diacutea 21052017) [43] ECONOMOU Anastasios Botitsi Helen Antoniou Spyros Tsipi Despina Determination of multi-class pesticides in wines by solid-phase extraction and liquid chromatography-tandem mass spectrometry Journal of Chromatography A 2009 vol 1216 no 31 p 5856-5867 [44] FONTANA A R Rodriacuteguez I Ramil M Altamirano JC Cela R Liquid chromatography time-of-flight mass spectrometry following sorptive microextraction for the determination of fungicide residues in wine Analytical and bioanalytical chemistry 2011 vol 401 no 2 p 767-775 [45] PELAJIĆ Maja G Peček DM Pavlović DV Čepo Novel multiresidue method for determination of pesticides in red wine using gas chromatographyndashmass spectrometry and solid phase extraction Food chemistry 2016 vol 200 p 98-106 [46] Ignaz J Buerge Juumlrgen Krauss Rociacuteo Loacutepez-Cabeza Werner Siegfried Michael Stuumlssi Felix E Wettstein Thomas Poiger Stereoselective Metabolism of the Sterol Biosynthesis Inhibitor Fungicides Fenpropidin Fenpropimorph and Spiroxamine in Grapes Sugar Beets and Wheat Journal of Agricultural and Food Chemistry 2016 vol 64 no 26 p 5301-5309 [47] M Hu X Liu F Dong J Xu S Li H Xu Y Zheng Determination of ametoctradin residue in fruits and vegetables by modified quick easy cheap effective rugged and safe method using ultra-performance liquid chromatographytandem mass spectrometry Food chemistry 2015 vol 175 p 395-400 [48] WALORCZYK Stanisław DROŻDŻYŃSKI Dariusz GNUSOWSKI Bogusław Multiresidue determination of 160 pesticides in wines employing mixed-mode dispersive-solid phase extraction and gas chromatographyndashtandem mass spectrometry Talanta 2011 vol 85 no 4 p 1856-1870 [49] Tianyang Guo Pingping Fang Juanjuan Jiang Feng Zhan Wei Yong Jiahui Liu YiYang Dong Rapid screening and quantification of residual pesticides and illegal adulterants in red wine by direct analysis in real time mass spectrometry Journal of Chromatography A 2016 vol 1471 p 27-3 [50] GONZAacuteLEZ-RODRIacuteGUEZ R M CANCHO-GRANDE B SIMAL-GAacuteNDARA J Decay of fungicide residues during vinification of white grapes harvested after the application of some new active substances against downy mildew Food chemistry 2011 vol 125 no 2 p 549-560 [51] CARPINTEIRO I Ramil M Rodriacuteguez I Cela R Determination of fungicides in wine by mixed-mode solid phase extraction and liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry Journal of Chromatography A 2010 vol 1217 no 48 p 7484-7492
53
Capiacutetulo I Introduccioacuten
ataque en la produccioacuten de energiacutea la inhibicioacuten de la mitosis o inhibiendo la formacioacuten de quitina que se trata
del compuesto principal de la pared celular de los hongos y que por ende influye en la permeabilidad de la
membrana [8] [9]
Las enfermedades fuacutengicas fundamentales que nos podemos encontrar en las uvas de la vid son la botritis el oiacutedio
y el mildium las cuales pueden llegar a causar peacuterdidas importantes en viticultura
La enfermedad de la botritis tambieacuten llamada moho gris estaacute causada
por el hongo Botrytis cineacuterea y se puede encontrar en todo el mundo
infectando a un amplio nuacutemero de plantas Se trata de uno de los
patoacutegenos fuacutengicos maacutes interesantes debido a que puede vivir tanto
de forma patoloacutegica produciendo la enfermedad como
alimentaacutendose de materia orgaacutenica en descomposicioacuten La accioacuten
fuacutengica del hongo se lleva a cabo cuando las uvas empiezan a
acumular azuacutecar pudiendo ser muy devastador en algunas
condiciones sobre todo en cultivos empapados por la lluvia o
localizados en un ambiente huacutemedo y con viento produciendo la peacuterdida de los racimos de uvas que son
infectados O por el contrario en otro tipo de condiciones ambientales de sequedad despueacutes de unas
condiciones de humedad dicho hongo le confiere beneficios a ciertos tipos de vino blanco [10]
El oiacutedio es una enfermedad causada por la especie Uncinula necator la cual afecta tanto al rendimiento como a la
calidad de las uvas y altera las cualidades de sus derivados vino mosto etc El proceso de infeccioacuten del oiacutedio
tiene lugar siguiendo un ciclo de reproduccioacuten en las distintas estaciones del antildeo El riesgo de infeccioacuten viene
dado en funcioacuten de la temperatura oacuteptima entre 25-30ordmC humedad del ambiente en el que se encuentre y
tambieacuten en funcioacuten de la temporada siendo maacutes resistentes los racimos de uvas a medida que van madurando El
hongo afecta a todas las parte de la vid hojas tallo y racimos las cuales presentan siacutentomas distintos Las hojas se
vuelven de un color amarillento y se cubren de un polvo fino blanco grisaacuteceo En el tallo el oiacutedio se manifiesta a
traveacutes de manchas difuminadas con coloracioacuten inicial verde oscuro volvieacutendose cada vez maacutes oscuras al final y si
ocurre un ataque fuerte puede desembocar en que el tallo se acabe secando y por consiguiente disminuye la
produccioacuten Pero el ataque maacutes fuerte se produce en los racimos empezando por cubrirse del polvillo blanco
grisaacuteceo y continuando con que el oiacutedio detiene el crecimiento de la piel de la uva con la consecuencia que la uva
se agrieta Esta enfermedad produce unos dantildeos directos en la cantidad y calidad de la cosecha y si no se toman
medidas de prevencioacuten las peacuterdidas pueden llegar a ser totales [12] [13]
Figura I1Enfermedad de botritis en un racimo de uvas [11]
Figura I2 Enfermedad del oiacutedio en hoja tallo y racimo de izquierda a derecha [14] 5
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Por uacuteltimo el mildium o mildiu es una enfermedad producida por el hongo Plasmopara vitiacutecola considerada como
una de las peores enfermedades del cultivo siempre y cuando esteacuten en las condiciones ambientales favorables para
su desarrollo Dichas condiciones oacuteptimas para la propagacioacuten de la enfermedad son las lluvias al amanecer o al
anochecer con una temperatura en un rango de 20-25 ordmC El periacuteodo sensible de la vegetacioacuten de la vintildea es a
partir de una longitud de 10 cm en adelante siendo maacutexima en el periacuteodo de mayor crecimiento de la planta Por
otro lado la sensibilidad del racimo empieza desde su formacioacuten hasta que las uvas al florecer alcanzan el tamantildeo
similar al de un guisante pero de ahiacute en adelante la sensibilidad se ve disminuida Dicho hongo cuenta con un
ciclo reproductivo abarcando varias fases desde la fase de contaminacioacuten siendo el principio hasta la fase de pro-
pagacioacuten Afecta a todos los oacuterganos verdes de la vid y sus siacutentomas son variados en las distintas zonas de eacutesta
En las caras de las hojas aparecen unas manchas amarillentas en los racimos cuando se aproxima la floracioacuten los
que se encuentran infectados se curvan secaacutendose y cubrieacutendose de una pelusa blanquecina y cuando alcanzan el
tamantildeo de un guisante en adelante las uvas de los racimos afectados se van oscureciendo y secando sin que apa-
rezca la fructificacioacuten del hongo ademaacutes de oscurecerse el tallo [15]
12 Estructura propiedades fiacutesico-quiacutemicas y clasificacioacuten
En este trabajo nos centramos en estudiar los residuos de veintitreacutes fitosanitarios tipo fungicida principalmente
aunque tambieacuten alguacuten residuo tipo insecticida Las caracteriacutesticas maacutes importantes de dichos compuestos seraacuten
recogidas en la Tabla I1 que incluye estructuras clasificacioacuten (se ha usado el acroacutenimo ldquoFrdquo en caso de ser
fungicidas e ldquoIrdquo en caso de ser insecticidas) y propiedades fiacutesico-quiacutemicas Las propiedades fiacutesico-quiacutemicas que
pueden resultar maacutes relevantes para este estudio son el pKa ya que la mayoriacutea se trata de compuestos baacutesicos
aunque se encuentre alguacuten aacutecido deacutebil como es por ejemplo el Fenhexamid y Kow describiendo el coeficiente de
reparto entre octanolagua empleado para medir el grado de hidrofobidad que proporciona una estimacioacuten de
la posible distribucioacuten del analito entre materia orgaacutenica y agua
Figura I3 Enfermedad del mildium en la imagen de la izquierda coacutemo afecta a las hojas imagen central coacutemo
afecta a los racimos cuaacutendo estaacuten infectados al comenzar la floracioacuten y en la imagen de la derecha coacutemo afecta a
los racimos en doacutende las uvas tienen tamantildeo mayor al de un guisante [16]
6
Compuesto Estructura Nombre sistemaacutetico Foacutermula CAS Uso ordflog (kow) pKa
Ametoctradin
(AME)
5-ethyl-6-
octyl[124]triazolo[15-
a]pyrimidin-7-amine
C15H25N5 865318-97-4 F 440 278
Benalaxyl
(BEN)
Methyl-N-(phenylacetyl)-N-
(26-xylyl)-D-alaninate C20H23NO3 98243-83-5 F 368 -
Boscalid
(BOS)
2-Chloro-N-(4rsquo-
chlorobiphenyl-2-yl)-
nicotinamide
C18H12Cl2N2O 188425-85-6 F 296 -
Carbendazim
(CAR)
Methyl 2-benzimidazole
carbamate C9H9N3O2 10605-21-7 F 148 420
Cyprodinil
(CYP)
4-Cyclopropyl-6-methyl-N-
phenilpyrimidin-2-amine C14H15N3 121552-61-2 F 400 309
Dimethomorph
(DIM)
(2E)-3-(4-chlorophenyl)-3-(34-
dimethoxyphenyl)-1-
(morpholin-4-yl)prop-2-en-1-
one
C21H22ClNO4 110488-70-5 F 268 -13
Fenhexamid
(FEH)
N-(23-dichloro-4-
hydroxyphenyl)-1-methyl-
cyclohexanecarboxamide
C14H17Cl2NO2 126833-17-8 F 351 73
Fenpropidin
(FEP)
1-[(RS)-3-(4-tert-butylphenyl)-
2-methylpropyl]piperidine C19H31N 67306-00-7 F 26 1013
Fluopicolid
(FLU)
26-dichloro-N-[3-chloro-5-
(trifluoromethyl)-2-
pyridylmethyl]benzamide
C14H8Cl3F3N2O 239110-15-7 F 29 -
Imidacloprid
(IMI)
(E)-1-(6-chloro-3-
pyridylmethyl)-N-
nitroimidazolidin-2-
ylideneamine
C9H10ClN5O2 138261-41-3 I 057 -
Iprovalicarb
(IPR)
Isopropyl (S)-2-methyl-1-[1-(p-
tolyl)ethylcarbamoyl]propyl-
carbamate
C18H28N2O3 140923-17-7 F 32 -
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Tabla I1 Estructura clasificacioacuten y propiedades fiacutesico-quiacutemicas de intereacutes para los analitos de estudio
7
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Compuesto Estructura Nombre sistemaacutetico Foacutermula CAS Uso ordflog (kow) pKa
Mandipropamid
(MAN)
2-(4-chlorophenyl)-N-[3-
methoxy-4-(2-
propynyloxy)phenethyl]-2-(2-
propynyloxy)acetamide
C23H22ClNO4 374726-62-2 F 32 -
Metalaxyl
(MET)
N-(26-dimethylphenyl)-N-
(methoxyacetyl)-DL-alanine
methyl ester
C15H21NO4 57837-19-1 F 175 000
Myclobutanil
(MYC)
2-(4-chlorophenyl)-2-(1H-
124-triazol-1-
ylmethyl)hexanentrile
C15H17ClN4 88671-89-0 F 289 230
Penconazol
(PEN)
1-[2-(24-
dichlorophenyl)pentyl]-1H-
124-triazole
C13H15Cl2N3 66246-88-6 F 372 151
Pyraclostrobin
(PYC)
Methyl2-[1-(4-chlorophenyl)-
1H-pyrazol-3-
yloxymethyl]phenylmetoxy-
carbamate
C19H18ClN3O4 175013-18-0 F 399 -
Pyrimethanil
(PYM)
4-6-dimethyl-N-phenyl-2-
pyrimidinamine C12H13N3 53112-28-0 F 284 352
Tebuconazol
(TEC)
1-(4-chlorophenyl)-44-
dimethyl-3-(1H-124-triazol-1-
ylmethyl)-3-pentanol
C16H22ClN3O 107534-96-3 F 370 500
Tebufenozid
(TEF)
35-dimethylbenzoic acid 1-
(11-dimethylethyl)-2-(4-
ethylbenzoyl)hidrazide
C22H28N2O2 112410-23-8 I 425 -
Thiabendazol
(TBZ)
2-(13-thiazol-4-yl)-1H-
benzimidazole C10H7N3S 148-79-8 F 239 473
Thiamethoxam
(TME)
3-[(2-chloro-5-
thiazolyl)methyl]tetrahydro-5-
methyl-N-nitro-4H-135-
oxadiazin-4-imine
C8H10ClN5O3S 153719-23-4 I -013 -
Thiophanate-
methyl
(THI-M)
DimethylNNrsquo-[12-
phenylenebis(azanediylcarbono
thioyl)] dicarbamate
C12H14N4O4S2 23564-05-8 F 145 728
Triadimenol
(TRI)
1-(4-chlorophenoxy)-33-
dimethyl-1-(1H-124-triazol-1-
yl)-2-butanol
C14H18ClN3O2 55219-65-3 F 318
-
ordf Valores para la forma neutra 8
Capiacutetulo I Introduccioacuten
13 Toxicidad de los pesticidas
En los uacuteltimos antildeos el uso indiscriminado de pesticidas de siacutentesis en agricultura ha creado graves problemas de
salud y medioambientales ya que su uso debido al aumento de la poblacioacuten y por consiguiente de la actividad
agraria se ha incrementado considerablemente Durante las tres uacuteltimas deacutecadas una estimacioacuten dada por la
Organizacioacuten Mundial de la Salud y el Programa de las Naciones Unidas para el Medio Ambiente revela que
aproximadamente cerca de 20000 personas al antildeo mueren generalmente agricultores por exposicioacuten continuada
a alguno de estos toacutexicos En la mayoriacutea de los casos los agricultores utilizan los pesticidas de forma que las
cantidades se desviacutean significativamente de las recomendadas ya que asocian cantidades maacutes altas con mayor
efectividad y velocidad de accioacuten El mal uso de dichos toacutexicos se ve en los signos presentes en los ecosistemas
afectados pudiendo llegar a ser perjudiciales para la salud humana Estos riesgos que causan tanto en la salud
como en el medioambiente pueden ser reducidos o en su defecto evitados mediante la educacioacuten sobre este tipo
de toacutexicos con el fin de frenar su uso excesivo y descontrolado [17]
Desde el punto de vista medioambiental los fitosanitarios empleados en un cultivo pueden persistir en los
distintos medios tierra aire o agua y afectar tanto a ecosistemas terrestres como acuaacuteticos En los sistemas
terrestres los suelos son contaminados mediante la aplicacioacuten del toacutexico de forma directa o como deposicioacuten del
resultado de una suspensioacuten aeacuterea Eacutestos pueden persistir desde varios diacuteas hasta varios antildeos ya que el suelo
retiene y moviliza el toacutexico despueacutes de su emisioacuten Los que persisten maacutes tiempo en el medioambiente tienen una
mayor probabilidad de interaccionar con otros elementos del sistema y si su vida media es mayor a la frecuencia
con la que se aplica el pesticida tienden a acumularse tanto en el suelo como en las especies que habitan en eacutel Por
otro lado el agua es contaminada por pesticidas bien por aplicacioacuten directa por estar presentes en las
precipitaciones de la atmoacutesfera o bien por la movilidad que tienen desde el suelo Tanto los pesticidas solubles
como los insolubles interaccionan con los ecosistemas acuaacuteticos los hidrosolubles persisten maacutes tiempo
solubilizados en agua mientras que los otros se asocian a los sedimentos y se concentran en las especies que
habitan el medio acuaacutetico [18]
Como consecuencia de la amplia distribucioacuten de los toacutexicos en aire suelo y agua se produce una acumulacioacuten de
ellos en los elementos que contribuyen a la alimentacioacuten humana ya que su amplio uso hace que el contacto con
los plaguicidas por parte de personas y animales sea inevitable La contaminacioacuten de los alimentos se puede
presentar por aplicacioacuten directa de los pesticidas el uso de eacutestos durante el manejo transporte y almacenamiento
de los productos comestibles o por su acumulacioacuten en la cadena troacutefica Son bioacumulables en el organismo
debido a su caraacutecter lipofiacutelico lo que les confiere una vida media en los tejidos larga La exposicioacuten a pesticidas
persistentes no tiene la misma repercusioacuten en cada uno de los individuos expuestos sino que se considera criacutetica la
exposicioacuten durante la etapas embrionaria fetal y primeros antildeos de vida en doacutende se transmite de madres a hijos
mediante la gestacioacuten y la lactancia como resultado de la acumulacioacuten en el tejido graso de la madre [19]
9
Capiacutetulo I Introduccioacuten
14 Legislacioacuten
El aumento del uso de fitosanitarios en actividades relacionadas con la produccioacuten de alimentos para consumo
humano o animal tambieacuten desembocoacute en una preocupacioacuten social debido a su toxicidad y bioacumulacioacuten En
respuesta la Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura (FAO) en colaboracioacuten
con la Organizacioacuten Mundial de la Salud (OMS) pusieron en marcha un programa Codex Alimentarius cuyo
objetivo a traveacutes de sus normas y coacutedigos de praacutecticas alimentarias internacionales es garantizar la calidad e
inocuidad de los alimentos que estaacuten al alcance de cualquier persona Con estas normas internacionales los
consumidores pueden confiar en la calidad de los alimentos independientemente de su origen geograacutefico [20]
Todos los alimentos destinados al consumo humano o animal en la Unioacuten Europea estaacuten sujetos a un liacutemite
maacuteximo de residuos de plaguicidas para la proteccioacuten de la salud humana y animal Actualmente en lo referente a
legislacioacuten para el control de la cantidad del toacutexico en la uva estaacute vigente el Reglamento 3962005 del Parlamento
Europeo y del Consejo de 23 de febrero de 2005 referido a la regulacioacuten de los liacutemites maacuteximos de residuos de
plaguicidas en alimentos y piensos de origen vegetal y animal El liacutemite maacuteximo de residuos (LMR) se define co-
mo el nivel maacutes alto de un residuo de un pesticida que se tolera de manera legal sobre los alimentos o piensos
cuando se aplican correctamente Las cantidades de residuos que se encuentren deben ser lo maacutes bajas posible
para garantizar la seguridad en la alimentacioacuten de los consumidores Dichos liacutemites maacuteximos de residuos estaacuten
fijados por la Comisioacuten Europea pudieacutendose encontrar en su base de datos LMR [21]
A continuacioacuten en la Tabla I2 se resumen los LMRs de los compuestos de este estudio en uvas de vinificacioacuten
en unidades de mgkg de uva En el caso del vino no hay legislacioacuten en lo referente a estos pesticidas solamente
la recomendacioacuten de no superar el 10 del valor del LMR en uva
Compuesto LMRs (mgkg uva) Compuesto LMRs (mgkg uva)
AME 6 MET 1
BEN 03 MYC 1
BOS 5 PEN 02
CAR 05 PYC 2
CYP 3 PYM 5
DIM 3 TEC 1
FEH 15 TEF 3
FEP 001 TBZ 005
FLU 2 TME 04
IMI 1 THI-M 3
IPR 2 TRI 2
MAN 2
Tabla I2 Liacutemites maacuteximos de residuos permitidos para los compuestos estudiados en uvas
10
Capiacutetulo I Introduccioacuten
2 MEacuteTODOS DE PREPARACIOacuteN DE MUESTRA APLICADOS A MUESTRAS DE VINO
21 Extraccioacuten liacutequido-liacutequido (LLE)
Se entiende por extraccioacuten liacutequido-liacutequido al meacutetodo mediante el cual un analito de intereacutes se separa por el
contacto con otra fase en la cual tiene mayor afinidad de la matriz en la que se halle Los procesos de extraccioacuten
implican dos fases y requieren tres pasos sucesivos mezcla de materia prima y disolvente separacioacuten de las dos
fases despueacutes del contacto y eliminacioacuten del disolvente que contiene el analito [22]
La extraccioacuten liacutequido-liacutequido (LLE) se basa en la distribucioacuten
de un analito entre dos fases liacutequidas inmiscibles en las
cuales analito y matriz tienen solubilidades diferentes
Principalmente una de las fases es un medio acuoso en
general se trata de la muestra y la otra un disolvente
orgaacutenico La selectividad y eficacia de este meacutetodo vienen
determinadas por la eleccioacuten del disolvente y por los factores
que pueden afectar al proceso de equilibrio (pH adiccioacuten de
sales neutras en la fase acuosa para reducir la solubilidad del
analito etc) [23] Esta teacutecnica permite llevar a cabo extracciones para un rango muy amplio de analitos siendo
una de las maacutes antiguas para la preparacioacuten de muestras en el anaacutelisis cualitativo y cuantitativo Ofrece grandes
capacidades de muestreo lineal y cuenta con la ventaja de la cantidad de informacioacuten existente sobre este meacutetodo
[24]
22 Extraccioacuten en fase soacutelida (SPE)
En 1978 aparecieron los primeros cartuchos desechables para la extraccioacuten en fase soacutelida y actualmente casi 40
antildeos despueacutes la extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) es la teacutecnica de preparacioacuten de muestras maacutes empleada en los
laboratorios Es una teacutecnica de preparacioacuten y tratamiento de muestras que se basa en la retencioacuten en una fase
adsorbente del analito de intereacutes presente en una muestra liacutequida que pasa a traveacutes de ella Debido a la variedad de
formatos (discos cartuchos y jeringas) y tipos de adsorbentes (los maacutes comunes carboacuten activo aluacutemina siacutelica gel
silicato de magnesio siacutelices enlazadas y poliacutemeros como por ejemplo estinero-divinilbenceno) o la facilidad de
automatizacioacuten y acoplamiento con otras teacutecnicas como por ejemplo una conexioacuten directa con un sistema de
Figura I4 Fundamentos teoacutericos de la LLE [25]
11
Capiacutetulo I Introduccioacuten
cromatografiacutea este meacutetodo le fue ganando terreno a la LLE Otra ventaja muy importante de la SPE frente a la
LLE es la disminucioacuten en la cantidad de disolvente orgaacutenico empleada Cada vez se va innovando maacutes sobre esta
teacutecnica llegando a encontrarse fases adsorbentes formadas por poliacutemeros capaces de retener en un uacutenico
cartucho un amplio abanico de analitos lipofiacutelicos o hidrofoacutebicos aacutecidos baacutesicos o neutros [26]
El fundamento de esta extraccioacuten como se puede en la Figura I6
consiste en cuatro etapas acondicionamiento adiccioacuten de muestra
retencioacuten y elucioacuten de los analitos de intereacutes En primer lugar antes
de empezar la extraccioacuten se requiere una etapa de acondicionamiento
para preparar el adsorbente haciendo pasar un poco de disolvente
para asiacute interaccionar mejor con la muestra Luego se hace pasar la
muestra liacutequida por la fase soacutelida Idealmente el adsorbente retiene
los analitos selectivamente a medida que va pasando la muestra y la
matriz pasa sin ser retenida Por uacuteltimo los analitos se eluyen del
adsorbente con un disolvente con el que tenga mayor afinidad [27]
23 Teacutecnicas de microextraccioacuten
231 Microextraccioacuten en fase soacutelida (SPME)
En la microextraccioacuten en fase soacutelida (SPME) se utilizan fibras de siacutelice fundida revestidas con un poliacutemero en un
disentildeo en forma de jeringa para la extraccioacuten de los analitos de intereacutes El principio por el que se rige esta
extraccioacuten es el reparto del analito entre la matriz de la muestra y el revestimiento de la fibra mediante un proceso
no competitivo Se trata de un meacutetodo que cuenta con muchas ventajas ya que se elimina completamente el uso de
disolventes y aparte no son necesarios voluacutemenes de muestra grandes pero tambieacuten cuenta con algunas
desventajas ya que tanto la capacidad como la sensibilidad se ven limitadas [29]
En la figura I7 podemos ver las etapas de la extraccioacuten En un
vial cerrado con una caacutepsula y un seacuteptum tenemos la muestra
liacutequida o bien soacutelida que contenga los analitos de intereacutes
volaacutetiles Con la jeringa se perfora el seacuteptum y una vez dentro
se acciona el eacutembolo para la exposicioacuten de la fibra con los
analitos introducieacutendola en la muestra liacutequida o en su defecto
en el espacio de cabeza para la extraccioacuten de analitos volaacutetiles
de una muestra soacutelida Despueacutes de la extraccioacuten dentro del vial
Figura I6 Etapas de una SPE [28]
Figura I7 Etapas de una SPME [30]
12
Capiacutetulo I Introduccioacuten
la fibra se introduce de nuevo en la jeringa y se retira del vial [27]
232 Microextraccioacuten en fase liacutequida (LPME)
La microextraccioacuten en fase liacutequida se desarrolloacute como una alternativa a la LLE para la reduccioacuten en la cantidad de
disolventes orgaacutenicos siendo rentable tanto para el medioambiente como econoacutemicamente Entre las modalidades
maacutes populares de esta teacutecnica se encuentran microextraccioacuten con gota suspendida (SDME) y microextraccioacuten
liacutequido-liacutequido dispersiva (DLLME) En la SDME una gota de disolvente orgaacutenico es expuesta al espacio de
cabeza situado sobre una muestra en un vial dicha gota es suspendida del extremo de una microjeringa Por otro
lado la DLLME sobre una muestra acuosa se inyecta un pequentildeo volumen de una mezcla de disolventes en la
cual es dispersada formando una solucioacuten en la que se establece el equilibrio El disolvente de extraccioacuten debe
presentar una densidad inferior a la de la muestra para facilitar su recuperacioacuten normalmente despueacutes de
centrifugar el vial doacutende se realiza la extraccioacuten [31]
24 QuEChERS
La extraccioacuten QuEChERS de las palabras en ingleacutes Quick Easy Cheap Effective Rugged and Safe es un meacutetodo
de extraccioacuten que se desarrolloacute entre 2000 y 2002 para el anaacutelisis de pesticidas Como su nombre indica raacutepido
faacutecil barato eficaz robusto y seguro son las principales
caracteriacutesticas de esta preparacioacuten de muestra Se realiza en dos
etapas en primer lugar una extraccioacuten simple y una segunda fase
de purificacioacuten En la primera etapa tenemos el vial con la
muestra en el cual se antildeade un disolvente generalmente
acetonitrilo para la extraccioacuten de los analitos de intereacutes en
presencia de diferentes sales (en el meacutetodo original se utiliza
sulfato de magnesio y cloruro de sodio) para facilitar la separacioacuten
de las fases En la segunda parte se realiza la purificacioacuten de la
fraccioacuten del extracto orgaacutenico Para eso se lleva a cabo una
limpieza de los analitos eliminando el agua y los compuestos
presentes en la matriz de la muestra empleando un adsorbente PSA (amina primaria y secundaria) C18 carboacuten
negro grafitizado (GCB) o una combinacioacuten de eacutestas [32]
Figura I8 Etapas de QuEChERS [33]
13
Capiacutetulo I Introduccioacuten
3 METODOLOGIacuteA ANALIacuteTICA PARA LA DETERMINACIOacuteN DE PESTICIDAS
31 Meacutetodos de GC-MS (MSMS)
La combinacioacuten de cromatografiacutea de gases (GC) teacutecnica de separacioacuten con espectrometriacutea de masas (MS) como
sistema de deteccioacuten representa un potente meacutetodo para la identificacioacuten determinacioacuten y cuantificacioacuten de
analitos orgaacutenicos en concentraciones traza presentes en muestras complejas Esta teacutecnica de anaacutelisis cuenta con
muchas ventajas en sensibilidad multifuncionalidad buena reproducibilidad robustez asiacute como facilidad en el
manejo pero con una gran desventaja este meacutetodo no es apto para ser utilizado con todos los analitos sino que
se ve limitado a aquellos que sean termoestables y no se descompongan a temperaturas elevadas antes de ser
volatilizados La muestra es introducida a traveacutes del inyector en el cromatoacutegrafo de gases doacutende impulsada por
una corriente de gas inerte como fase moacutevil pasa a traveacutes de la columna que contiene la fase estacionaria en la
cual se separan los compuestos debido a una distribucioacuten de estos entre fase moacutevil-fase estacionaria Mediante
una interfase son introducidos para su deteccioacuten en el espectroacutemetro de masas que cuenta con una fuente de
iones analizador de masas y un detector [34]
La combinacioacuten de analizadores de masas en taacutendem (MSMS) como sistema de deteccioacuten en GC es una teacutecnica
altamente selectiva mejorando la sensibilidad y la relacioacuten sentildeal-ruido en los espectros experimentando una
mejora por lo que se logran unos liacutemites de deteccioacuten inferiores Esta teacutecnica GC-MSMS comprende maacutes
pasos despueacutes de la separacioacuten por cromatografiacutea se lleva a cabo la deteccioacuten con MSMS que consta de varias
etapas generacioacuten de iones en la fuente de ionizacioacuten seleccioacuten de los iones precursores de una determinada
masa disociacioacuten causada por colisioacuten con moleacuteculas de gas inerte de los iones precursores y por uacuteltimo el
anaacutelisis de los fragmentos en relacioacuten a su masacarga (mz) En el caso de que un espectro de MS no permita
confirmar la identidad de un determinado compuesto quiacutemico la obtencioacuten de su espectro de MSMS permite
mejorar la confianza en su identificacioacuten [36]
Figura I9 Acoplamiento GC-MS [35]
14
Capiacutetulo I Introduccioacuten
32 Meacutetodos LC-MS (MSMS)
La teacutecnica de LC-MS se desarrolloacute para minimizar las desventajas del acoplamiento GC-MS y asiacute resolver los
problemas que este uacuteltimo acarreaba con los analitos termolaacutebiles permitiendo el anaacutelisis de eacutestos sin tener que
realizar una etapa previa de derivatizacioacuten La interfase de unioacuten de cromatografiacutea liacutequida (LC) con espectrometriacutea
de masas (MS) acarrea una dificultad significativa siendo responsable de transformar los analitos que se
encontraban en la fase moacutevil liacutequida en iones en fase gas sin que se produzca su degradacioacuten teacutermica La
sensibilidad de las determinaciones por LC-MS va a depender de la interfase empleada Las principales interfases
empleadas actualmente son las ionizaciones a presioacuten atmosfeacuterica electrospray (ES) e ionizacioacuten quiacutemica a
presioacuten atmosfeacuterica (APCI) [37]
Con los antildeos la cromatografiacutea liacutequida se ha ido innovando y mediante la disminucioacuten del tamantildeo de partiacutecula en
la columna se fue mejorando la eficiencia asiacute como aumentando la selectividad y resolucioacuten del pico en el
cromatograma Para este nuevo sistema llamado UPLC Ultra-Performance Liquid Chromatography se desarrolloacute
una nueva instrumentacioacuten capaz de trabajar a altas presiones generando flujos mayores sin peacuterdidas de
resolucioacuten utilizando inyectores automaacuteticos maacutes raacutepidos y detectores con mayor velocidad de adquisicioacuten de
datos disminuyendo asiacute el tiempo de anaacutelisis [39]
33 Espectrometriacutea de masas
La espectrometriacutea de masas es el meacutetodo de deteccioacuten y cuantificacioacuten maacutes fiable a la hora de la determinacioacuten de
compuestos en matrices complejas (tales como alimentos) ya que otros detectores maacutes tradicionales como UV-
visible o fluorescencia cuentan con una gran incertidumbre en los resultados llegando incluso a ofrecer falsos
Figura I10 Acoplamiento LC-MS [38]
15
Capiacutetulo I Introduccioacuten
positivos o negativos Un espectrometro de masas cuenta con un dispositivo de introduccioacuten de muestra una
caacutemara de ionizacioacuten un sistema para la aceleracioacuten de los iones uno o varios analizadores de masas y un detector
[40]
El fundamento de la espectrometriacutea de masas se basa en la separacioacuten de iones en base a la relacioacuten masacarga
(mz) El proceso consta fundamentalmente de cuatro etapas La
primera es la ionizacioacuten de la muestra los iones formados se aceleran
debido a la accioacuten de un campo eleacutectrico variable separacioacuten de los
iones seguacuten su masacarga deteccioacuten de los iones y produccioacuten de la
sentildeal eleacutectrica El analizador de masas es el encargado de la separacioacuten
de los iones en funcioacuten a su mz entre los que maacutes destacan
analizador de masas cuadrupolar que dispersa simultaacuteneamente todos
los iones en funcioacuten de la relacioacuten mz analizador de masas de
tiempo de vuelo (TOF) consta de un tubo a alto vaciacuteo sobre el que no
actuacutea ninguacuten campo eleacutectrico al cual llegan todos los iones acelerados con la misma energiacutea cineacutetica y en el tubo
las velocidades variacutean seguacuten mz y analizador de trampa de iones en doacutende los iones gaseosos quedan aislados
durante largos periacuteodos de tiempo por la accioacuten del campo eleacutectrico [41]
4RESUMEN BIBLIOGRAacuteFICO DE LAS TEacuteCNICAS DE EXTRACCIOacuteN Y
DETERMINACIOacuteN DE PESTICIDAS EN VINO
En la bibliografiacutea se han descrito diversas teacutecnicas y diferentes combinaciones entre teacutecnicas de extraccioacuten y
distintas teacutecnicas de cuantificacioacuten e identificacioacuten para esos analitos Entre estas teacutecnicas los valores de los liacutemites
de cuantificacioacuten (LOQs) y las recuperaciones relativas pueden diferir en el resultado en un rango de valores asiacute
como el tiempo total empleado para el anaacutelisis y para la preparacioacuten de la muestra
Por lo general el meacutetodo de extraccioacuten de los analitos de intereacutes maacutes empleado es la extraccioacuten en fase soacutelida
(SPE) la cuaacutel le ha estado ganando terreno a la extraccioacuten liacutequido-liacutequido aunque tambieacuten se estaacute viendo cada vez
maacutes desplazada debido al creciente uso de la teacutecnica QuEChERS
Figura I11 Etapas de la espectrometriacutea de masas [42]
16
Capiacutetulo I Introduccioacuten
En el estudio de ECONOMOU et al [43] realizado en el antildeo 2009 en Grecia se empleoacute la extraccioacuten en fase
soacutelida con deteccioacuten en cromatografiacutea de liacutequidos acoplada a espectrometriacutea de masas en taacutendem (SPE-LC-ESI-
MSMS) Para la preparacioacuten de la muestra diluyeron 10 mL de vino (tanto blanco como tinto) a un volumen
final de 100 mL con agua ultrapura antes de la SPE Determinaron las recuperaciones de la extraccioacuten para dos
niveles de concentracioacuten 0010 y 0050 mgL realizando 8 medidas diarias durante 3 diacuteas consecutivos
encontraacutendose unos valores que variacutean dentro del rango 70-110 para todos los pesticidas en los dos niveles Para
la determinacioacuten y cuantificacioacuten de 46 pesticidas emplearon la teacutecnica de cromatografiacutea de liacutequidos con
espectrometriacutea de masas con un volumen de inyeccioacuten de 20 microL y un flujo de fase moacutevil de 02 mLmin
aclopada a espectrometriacutea de masas en taacutendem
Con la misma teacutecnica de extraccioacuten PELAJIĆ et al [45] durante el antildeo 2015 en Croacia llevaron a cabo la
determinacioacuten de 25 residuos de plaguicidas en vino tinto El meacutetodo que desarrollaron para dicha finalidad fue el
acoplamiento SPE-GC-MS Para la preparacioacuten de la muestra emplearon 10 mL de vino diluidos 11 con agua
ultrapura hasta un volumen final de 20 mL Calcularon las recuperaciones de la extraccioacuten y se encontroacute un rango
para todos los pesticidas en las muestras de 70-120 Para la determinacioacuten en cromatografiacutea de gases-
espectrometriacutea de masas se empleoacute un volumen de inyeccioacuten de 5 μL y un flujo de fase moacutevil de 10 mLmin
Mediante el acoplamiento de teacutecnicas SPE dispersiva-GC-MS WALORCZYK et al [48] en el antildeo 2011 en
Polonia llevaron a cabo la cuantificacioacuten de 160 pesticidas en diferentes clases de vino tinto rosado y blanco Con
10 g de vino y 10 mL de acetonitrilo se realizaron pruebas de recuperacioacuten en la fase de extraccioacuten para vino
tinto con los niveles de concentracioacuten 001 005 y 02 mgkg y para los vinos rosado y blanco con el nivel de
concentracioacuten 005mgkg y encontraron que a todos los niveles de concentracioacuten los valores de recuperacioacuten
rondan el rango 80-110 Para la teacutecnica cromatograacutefica se utilizoacute un volumen de inyeccioacuten de 5 microL
El acoplamiento LLE-SPE-LCDAD fue desarrollado por GONZAacuteLEZ-RODRIacuteGUEZ et al [50] en el antildeo
2010 en la provincia de Orense para la determinacioacuten de nuevos fungicidas propuestos para combatir el hongo
que provoca la enfermedad del mildium En la preparacioacuten de la muestra emplearon 15 mL de vino blanco para la
extraccioacuten en la cual fueron calculadas las recuperaciones relativas para dos niveles de concentracioacuten 005 y 05
mgkg en donde se establece un rango de entre 70-110 para todos los analitos Para la determinacioacuten mediante
cromatografiacutea de liacutequidos se empleoacute un volumen de inyeccioacuten de 2 μL y como meacutetodo de deteccioacuten utilizaron un
detector de diodos array
La microextraccioacuten sorptiva en fase soacutelida fue empleada en la publicacioacuten de FONTANA et al [44] junto con un
acoplamiento entre cromatografiacutea de liacutequidos y espectrometriacutea de masas para la determinacioacuten de 15 fungicidas
en vino realizada durante el 2010 en el noroeste de Espantildea Para la preparacioacuten de la muestra emplearon 10 mL
17
Capiacutetulo I Introduccioacuten
de vino diluiacutedos con el mismo volumen de agua ultrapura y un sorbente en forma de disco de silicona con un
volumen de 12 microL La recuperacioacuten de la extraccioacuten se calculoacute para vino tinto (Menciacutea) y vino blanco (Godello)
realizando tres replicas dentro de un mismo diacutea para los niveles de concentracioacuten 10 y 50 ngmL y nueve reacuteplicas
realizando el anaacutelisis en tres diacuteas consecutivos para el nivel de concentracioacuten de 25 ngmL y los resultados
obtenidos dan unos valores de recuperacioacuten dentro del rango 75-117 En el sistema LC-QTOF-MS el volumen
de inyeccioacuten fue de 15 microL
El otro meacutetodo de extraccioacuten mencionado anteriormente es QuEChERS estaacute en auge como meacutetodo de extracioacuten
de residuos de pesticidas en matrices como la del vino o la uva ya que incrementa la velocidad del anaacutelisis y reduce
el efecto de matriz BUERGE et al [46] seguido de una deteccioacuten mediante GC-MSMS realizaron una estapa
de extraccioacuten QuEChERS con alguna modificacioacuten acetato de sodio en lugar de cloruro soacutedico y acetato de etilo
en lugar de acetonitrilo utilizando 5 g de uva para la determinacioacuten de residuos de 4 pesticidas durante el antildeo
2016 Las recuperaciones de extraccioacuten resultaron ser valores entre 91-149 en uva a distintos niveles de
concentracioacuten 005 05 y 5 mgkg
Para la determinacioacuten de Ametoctradin HU et al [47] llevaron a cabo una extraccioacuten QuEChERS empleando 10
g de uva con deteccioacuten mediante el acoplamiento UPLC-MSMS utilizando un volumen de inyeccioacuten de 5 μL y
un flujo de fase moacutevil de 03 mLmin Las recuperaciones de la extraccioacuten se calcularon para tres niveles de
concentracioacuten 1 10 100 μgL de dos formas distintas en tres diacuteas consecutivos realizando 5 reacuteplicas al diacutea o en
dentro de un mismo diacutea realizando 15 reacuteplicas los resultados de todos los caacutelculos se encuentran dentro del rango
818-1001
Siguiendo con el mismo modo de extraccioacuten GUO et al [49] publicaron sus estudios para la determinacioacuten de
50 pesticidas y 12 adulterantes en vino tinto Para la extraccioacuten QuEChERS se utilizaron 10 mL de vino tinto con
10 mL de acetonitrilo y calcularon las recuperaciones para tres niveles de concentracioacuten 50 100 y 250 ngmL
encontraacutendose un rango de valores entre 75-120 El meacutetodo de deteccioacuten se llevoacute a cabo mediante un anaacutelisis
directo en tiempo real junto con espectrometriacutea de masas en tandem con un cuadrupolo (DART-MSMS) la
teacutecnica DART es un meacutetodo raacutepido para cribar y cuantificar los analitos de estudio que prescinde de la etapa de
separacioacuten cromatograacutefica
A continuacioacuten se recogen en la Tabla I3 los liacutemites de cuantificacioacuten (LOQs) de los analitos de intereacutes en este
trabajo caacutelculados por los diferentes meacutetodos encontrados en bibliografiacutea citados anteriormente en este apartado
18
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Tabla I3 LOQs de los analitos de intereacutes descritos para los distintos meacutetodos encontrados en la bibliografiacutea
Compuesto LOQs
Compuesto LOQs
V Blanco V Tinto Uva V Blanco V Tinto Uva
AME - - 0032μgkg[47] MET 86 μgL[43]
22 μgL[44]
89 μgL[43]
22 μgL[44]
5 μgL[45]
259 ngmL[49]
001mgkg[48]
BEN 02 μgL[44]
0001 mgL[50]
02 μgL[44]
001 μgL[45]
280ngmL[49]
005 mgkg[48] MYC 30 μgL[43]
08 μgL[44]
36 μgL[43]
10 μgL[44]
025 μgL[45]
331ngmL[49]
001 mgkg[48]
BOS 0065 mgL[50] 05 μgL[45]
1076 ngmL[49] 001 mgkg[48] PEN
56 μgL[43]
05 μgL[44]
49 μgL[43]
04 μgL[44]
220ngmL[49]
001 mgkg[48]
CAR - 386 ngmL[49] - PYC 0003mgL[50] 07 μgL[45] 001 mgkg[48]
CYP 15 μgL[43]
04 μgL[44]
0001 mgL[50]
22 μgL[43]
06 μgL[44]
312 ngmL[49]
001 mgkg[48] PYM 17 μgL[43] 22 μgL[43]
10 μgL[45] 001 mgkg[48]
DIM 18 μgL[43] 20 μgL[43] 001 mgkg[48] TEC 03 μgL[44]
03 μgL[44]
10 μgL[45]
160ngmL[49]
001 mgkg[48]
FEH 17 μgL[43] 22 μgL[43]
938 ngmL[49] 001 mgkg[48] TEF - 876ngmL[49] -
FEP - - 002mgkg[46] TBZ 15μgL [43] 29μgL[43] 001 mgkg[48]
FLU 005 μgL[45] TME - 25 μgL[45] 001 mgkg[48]
IMI 21 μgL[43] 22 μgL[43]
225 ngmL[49] - THI-M 92 μgL[43] 89 μgL[43] -
IPR 07 μgL[44] 07 μgL[44] 001 mgkg[48] TRI 10 μgL[44] 12 μgL[44] 001 mgkg[48]
MAN 0011 mgL[50] - -
5 DISTRIBUCIOacuteN DE PESTICIDAS EN VINOS COMERCIALES
En algunos de los meacutetodos descritos en el apartado anterior se procesaron vinos comerciales encontraacutendose
resultados positivos para muchos residuos de pesticidas y algunos hasta en gran concentracioacuten
ECONOMOU et al [43] mediante el meacutetodo LC-ESI-MSMS realizaron el anaacutelisis de 60 muestras de vino tinto
y blanco recogidos en supermercados locales en Grecia a lo largo de un antildeo El meacutetodo se habiacutea desarrollado
19
Capiacutetulo I Introduccioacuten
para la determinacioacuten de 46 pesticidas pero la mayoriacutea se encuentran con una concentracioacuten por debajo de
001mgL solo ocho plaguicidas se obtuvieron con resultados de concentracioacuten mayores Se muestran los
resultados en la Tabla I4 de los analitos de intereacutes en este estudio
Tabla I4 Nuacutemero de muestras positivas de distintos pesticidas en el anaacutelisis de 60 muestras de vino [43]
Compuesto Positivos con concentracioacuten entre 001-01
mgL
Positivos con concentracioacuten entre 01-1
mgL
PYM 2 (3) 2 (3)
MYC 2 (3) 0 (0)
CAR 11 (18) 7 (12)
THI-M 7 (12) 5 (8)
FEH 5 (8) 0 (0)
MET 1 (2) 0 (0)
Mediante el meacutetodo de microextraccioacuten en fase soacutelida-LC-TOF-MS FONTANA et al [44] aplicaron el
desarrollo del procedimiento a un total de 12 vinos joacutevenes elaborados en el 2010 y correspondientes a diferentes
denominaciones geograacuteficas del noroeste de Espantildea En la Tabla I5 se muestran los datos que han obtenido
Tabla I5 Determinacioacuten de fitosanitarios en vinos comerciales mediante Microextraccioacuten en fase soacutelida-LC-TOF-MS
Valores de concentracioacuten en ngmL [44]
Pesticidas
W 1
Albarintildeo
W5
Ribeiro
W6
Valdeorras
R1
Ribeira Sacra
R3
Ribeiro
R4
Valdeorras
MET 404plusmn06 223plusmn05 311plusmn007 25plusmn03 31plusmn03 74plusmn10
TRI nd nd 36plusmn06 nd nd ltLOQ
IPR 394plusmn03 324plusmn02 324plusmn02 071plusmn007 31plusmn02 28plusmn05
MYC nd nd nd ltLOQ 39plusmn02 nd
TEC 25plusmn01 nd nd nd nd nd
CYP 179plusmn08 ltLOQ ltLOQ 562plusmn002 083plusmn001 nd
BEN 042plusmn001 nd ltLOQ nd 032plusmn001 ltLOQ
ndNo detectados ltLOQ por debajo del liacutemite de cuantificacioacuten del meacutetodo los coacutedigos W y R corresponden respecti-vamente a los vinos blanco y tinto
20
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Por uacuteltimo PELAJIĆ et al [45] aplicaron su meacutetodo SPE dispersiva-GC-MS mediante el cual determinaron 25
residuos de plaguicidas en vino tinto a un total de 32 muestras de vino adquiridos en supermercados locales de
Croacia pero de diversos oriacutegenes de procedencia Los resultados que han obtenido se muestran en la Tabla I6
en doacutende un total de 15 plaguicidas han sido detectados y 7 de los cuales se encontraban en una alta
concentracioacuten
Tabla I6 Resultados de los vinos con positivos en pesticidas y sus concentraciones [45]
Vino Paiacutes Residuos de pesticidas (mgKg)
Tinto Francia DIM (0013) MET (0009) IPR (001)
Tinto Alemania BOS (0011)
Tinto Alemania IPR (0009)
Tinto Macedonia MET (0015)
Tinto Moldavia IPR (0008)
Tinto Polonia MET (004)
Tinto Rumania PYM (0058)
Tinto Espantildea TRI (0005) MET (0011)
Tinto Estados Unidos BOS (001)
Rosado Francia BOS (0005)
Blanco Chile TEC (0008)
Blanco Georgia MET (0057)
Blanco Alemania DIM (001) IPR (0054) PYM (0056)
Blanco Sudaacutefrica DIM (0011) IPR (0011)
21
Capiacutetulo II Objetivos y discusioacuten
CAPIacuteTULO II OBJETIVOS Y DISCUSIOacuteN
El objetivo principal que se persigue en este trabajo es el desarrollo de un meacutetodo analiacutetico raacutepido basado en la
extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) y deteccioacuten mediante cromatografiacutea de liacutequidos en la modalidad de UPLC
acoplada a la espectrometriacutea de masas en taacutendem (UPLC-MSMS) para la determinacioacuten multianalito de residuos
de fitosanitarios principalmente fungicidas aunque tambieacuten alguacuten insecticida en muestras de vino blanco y tinto
Para llevar a cabo la finalidad de lo dicho se consideran unos objetivos maacutes especiacuteficos
Minimizar la manipulacioacuten de la muestra para asiacute reducir la cantidad de disolventes y tiempo empleado
Optimizacioacuten de los factores que afectan en la extraccioacuten en la SPE tales como tipo y cantidad de
adsorbente volumen de eluyente etc
Estudio de las condiciones en UPLC-MSMS para una separacioacuten y cuantificacioacuten oacuteptimas
Caracterizacioacuten y validacioacuten del meacutetodo propuesto
Por uacuteltimo una vez cumplidos todos los objetivos anteriores y fijadas las condiciones oacuteptimas el meacutetodo
estudiado se aplica en el anaacutelisis de muestras de vino comercial (blanco y tinto) para determinar si se encuentran
residuos presentes asiacute como conocer en queacute concentracioacuten se encuentran los pesticidas objeto de este estudio
22
Capiacutetulo III Parte experimental
CAPIacuteTULO III PARTE EXPERIMENTAL
1 MATERIAL Y REACTIVOS
11 Material
Material de vidrio de uso comuacuten en el laboratorio vasos de precipitados matraces aforados etc
Micropipetas automaacuteticas de 20-200 microL 20-200 microL 100-1000 microL 1000-5000 microL Eppendorf
Puntas de plaacutestico para micropipetas
Encapsulador y desencapsulador
Soportes y pinzas
Viales de 15 mL transparentes para muestreador automaacutetico de cromatografiacutea (Sugelabor)
Caacutepsulas de aluminio con seacuteptum de Tefloacuten (Sugelabor) y tapones pre-slit para viales
Tubos y conectores de tefloacuten
Cartuchos de divinilbenceno-N-vinilpirrolidona 200 mg Oasis HLB Waters
Cartuchos de divinilbenceno-N-vinilpirrolidona funcionalizados con grupos amina cuaternaria 150 mg
Oasis MAX Waters
Cartuchos de divinilbenceno-N-vinilpirrolidona 60 mg Oasis HLB Waters
12 Reactivos y disolventes
Agua ultrapura Milli-Q
Aacutecido foacutermico (Sigma Aldrich) 95
Acetonitrilo (LichrosolvregMerck) Gradient grade for liquid chromatography
Metanol (LichrosolvregMerck) Gradient grade for liquid chromatography
Etanol (LichrosolvregMerck) Gradient grade for liquid chromatography
13 Patrones
Ametoctradin (AME) Dr Ehrenstrorfer 990
Benalaxyl (BEN) Pestanal Sigma- Aldrich 999
23
Capiacutetulo III Parte experimental
Boscalid (BOS) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Carbendazim (CAR) Pestanal Sigma- Aldrich 992
Cyprodinil (CYP) Pestanal Sigma- Aldrich 998
Dimethomorph (DIM) mezcla de isoacutemeros E + Z Pestanal Sigma- Aldrich 989
Fenhexamid (FEH) Pestanal Sigma- Aldrich 997
Fenpropidin (FEP) Dr Ehrenstrorfer 980
Fluopicolide (FLU) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Imidacloprid (IMI) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Iprovalicarb (IPR) mezcla de isoacutemeros Pestanal Sigma- Aldrich 985
Mandipropamid (MAN) Pestanal Sigma- Aldrich 991
Metalaxyl (MET) Pestanal Sigma- Aldrich 990
Myclobutanil (MYC) Pestanal Sigma- Aldrich 994
Penconazole (PEN) Pestanal Sigma- Aldrich 991
Pyraclostrobin (PYC) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Pyrimethanil (PYM) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Tebuconazol (TEC) Pestanal Sigma- Aldrich 996
Tebufenozide (TEF) Dr Ehrenstrorfer 988
Thiabendazole (TBZ) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Thiamethoxam (TME) Pestanal Sigma- Aldrich 996
Thiophanate-methyl (THI-M) Dr Ehrenstrofer 990
Triadimenol (TRI) Mezcla de diastereoisoacutemeros Pestanal Sigma- Aldrich 994
14 Patrones internos
Carbendazim-d3 (CAR-d3) Pestanal Sigma- Aldrich 998
Cyprodinil-d5 (CYP-d5) Pestanal Sigma- Aldrich
Imidacloprid-d4 (IMID-d4) Pestanal Sigma- Aldrich
Metalaxyl 13C6 (MET13C6) Pestanal Sigma-Aldrich 99
24
Capiacutetulo III Parte experimental
15 Gases
Nitroacutegeno 99999 como gas de colisioacuten en el espectroacutemetro de masas
Nitroacutegeno en los sistemas de concentracioacuten y secado por corriente de nitroacutegeno de los cartuchos SPE
2 INSTRUMENTACIOacuteN
Balanza analiacutetica de precisioacuten Sartorius
Granatario Sartorius
Bantildeo de ultrasonidos P-Selecta
Equipo de purificacioacuten de agua Millipore modelo Milli-Q gradient A-10ZMQSSVOT4
Estacioacuten de concentracioacuten por corriente de nitroacutegeno Mini-Vap Supelco
Sistema de secado de cartuchos de SPE por corriente de nitroacutegeno VisiDry Supelco
Sistema distribuidor de vaciacuteo Visiprep reg Supelco
Cromatoacutegrafo de liacutequidos de ultra-alta resolucioacuten Waters AcquityUPLC reg y espectroacutemetro de masas
Acquity TQD con analizador de triple quadrupolo (QqQ) equipado con una fuente de ionizacioacuten a
presioacuten atmosfeacuterica del tipo Z-spray (ESI)
3 PREPARACIOacuteN DE LAS DISOLUCIONES
Los patrones de pesticidas se prepararon individualmente a partir de los compuestos soacutelidos comerciales por
pesada excepto en el caso del fenpropidin (FEP) que se preparoacute a partir del compuesto liacutequido comercial Estos
compuestos soacutelidos se disolvieron en metanol y se obtuvieron unas disoluciones iniciales con concentraciones
recogidas en la Tabla III1
25
Capiacutetulo III Parte experimental
Tabla III1 Concentracioacuten de las disoluciones patroacuten stock
Compuesto Concentracioacuten (microgmL) Compuesto Concentracioacuten (microgmL)
AME 102201 MET 118912
BEN 138330 MYC 102017
BOS 99474 PEN 129791
CAR 17105 PYC 104581
CYP 131075 PYM 141386
DIM 103009 TEC 134729
FEH 99584 TEF 137769
FEP 100000 TBZ 105928
FLU 126859 TME 112283
IMI 101123 THI-M 124202
IPR 106739 TRI 118933
MAN 101021
4 LAVADO DEL MATERIAL
La limpieza del material de vidrio utilizado en el laboratorio se realizoacute utilizando jaboacuten y aclarando con agua de
grifo Luego en primer lugar se realiza un enjuague con agua Milli-Q finalmente un segundo enjuague con
acetona para eliminar posibles restos de compuestos orgaacutenicos y se deja secar sobre papel
Para la limpieza de los conectores de tefloacuten empleados en el proceso de SPE se introducen en un vaso de
precipitados con metanol y este en un bantildeo de ultrasonidos durante 10 minutos Al finalizar con el bantildeo de
ultrasonidos se realiza un enjuague con acetona y se pone a secar
5 EXTRACCIOacuteN DE MUESTRAS MEDIANTE SPE
El meacutetodo de extraccioacuten utilizado para la determinacioacuten de pesticidas fue la extraccioacuten en fase soacutelida (SPE)
mediante cartuchos Oasis HLB de 200 mg A continuacioacuten se describe el protocolo de extraccioacuten en las
condiciones oacuteptimas
26
Capiacutetulo III Parte experimental
1 Acondicionamiento del cartucho Oasis HLB de 200 mg con 2 mL de acetonitrilo seguidos de otros 2 mL de
vino sinteacutetico formado por la mezcla etanolagua MilliQ (1288)
2 Paso de la muestra 2 mL de vino diluiacutedos con 2 mL de agua MilliQ a traveacutes del cartucho por gravedad
3 Lavado del cartucho con 2 mL de agua MilliQ
4 Secado del cartucho durante 45 minutos en el VisiDry mediante el paso de una corriente de nitroacutegeno
5 Elucioacuten del cartucho con la mezcla metanolacetonitrilo en proporcioacuten 2080 hasta un volumen final de 2
mL
6 Anaacutelisis mediante cromatografiacutea liacutequida acoplada a espectrometriacutea de masas en taacutendem UPLC-MSMS
(volumen de inyeccioacuten 15 microL)
Representacioacuten esquematizada en la Figura III1
Figura III1 Extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) de las muestras de vino
27
Capiacutetulo III Parte experimental
6 CONDICIONES DE DETERMINACIOacuteN MEDIANTE UPLC-MSMS
En la Tabla III2 se indican las condiciones utlizadas en la determinacioacuten de los pesticidas de intereacutes mediante
LC-MSMS y en la Tabla III3 se muestra el gradiente de la fase moacutevil utilizado para la separacioacuten
cromatograacutefica
Tabla III2 Condiciones experimentales de determinacioacuten en LC-MSMS
UPLC Acquity UPLC-I-Class IVD System
bull Columna cromatograacutefica Zorbax Eclipse Plus C18 Rapid Resolution HD
Fase estacionaria C18
Dimensiones 21 x 50 mm
Tamantildeo de partiacutecula 18 microm
Temperatura del horno 40ordmC
bull Inyector
Volumen de inyeccioacuten 15 microL
bull Fase moacutevil
Flujo 04 mLmin
Fase acuosa (A) Agua MilliQ con 01 aacutecido foacutermico
Fase orgaacutenica (B) Acetonitrilo con 01 aacutecido foacutermico
MSMS WatersXevo TQD
Modo de ionizacioacuten ESI positivo
Voltaje del capilar 15 kV
Voltaje de cono 50 V
Temperatura de gas de secado (N2) 450ordmC
Flujo de gas de secado (N2) 1000 Lh
Modo de adquisicioacuten Centroide
Tabla III3 Gradiente de fase moacutevil utilizado en la separacioacuten cromatograacutefica (LC)
Tiempo min 0 13 28 64 75 76 10
A 98 50 50 0 0 98 98
B 2 50 50 100 100 2 2
28
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
CAPIacuteTULO IV RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
1 IDENTIFICACIOacuteN DE LOS COMPUESTOS
Para empezar el estudio en primer lugar se realizoacute la caracterizacioacuten de las condiciones de determinacioacuten de los
analitos en el modo Multiple Reaction Monitoring (MRM) mediante UPLC-ESI-MSMS Para llevarla a cabo se
tomaron patrones individuales de cada fitosanitario y mediante infusioacuten se estudiaron las posibles transiciones y
voltajes oacuteptimos para su determinacioacuten (Tabla IV1)
La ionizacioacuten por electrospray (ESI) se estudioacute tanto en modo positivo como en modo negativo encontraacutendose
que para todos los pesticidas de nuestro intereacutes se obteniacutea sentildeal en el modo positivo mientras el modo negativo
no presentaba respuesta significativa
A continuacioacuten se estudia el efecto del voltaje de cono en la respuesta del ioacuten molecular [M+H]+ aumentaacutendolo
hasta alcanzar el valor maacuteximo de la sentildeal correspondiente a dicho ioacuten y luego se optimiza la energiacutea de colisioacuten
variaacutendola para cada analito hasta obtener la sentildeal de mayor intensidad para cada uno de los iones producto Por
uacuteltimo una vez optimizado el voltaje de cono y la energiacutea de colisioacuten se seleccionan las dos transiciones maacutes
intensas para llevar a cabo la cuantificacioacuten y cualificacioacuten de cada analito en modo MRM Este procedimiento se
realizoacute para la totalidad de los compuestos confirmando los datos obtenidos con los facilitados por la base de
datos Quanpedia que estaacute disponible en el software del equipo utilizado para algunos de los compuestos
considerados
Compuesto Tr (min) Ion precursor (mz Da)
Voltaje de cono (V)
Ion producto 1 (CEv)
cuantificacioacuten
Ion producto 2 (CEv)
cualificacioacuten
Relacioacuten IP2IP1
AME 325 2760 60 176 (35) 70 (50) 016
BEN 485 3261 26 148 (20) 91 (34) 067
BOS 387 3429 41 140 (20) 307 (20) 011
CAR 167 1921 33 160 (18) 132 (28) 014
CYP 311 2260 56 93 (33) 108 (25) 061
DIM 322 3881 40 301 (20) 165 (30) 057
FEH 386 3021 41 97 (22) 55 (38) 044
FEP 257 2742 55 147 (28) 86 (28) 093
FLU 401 3830 40 173 (20) 365 (15) 010
IMI 218 2561 34 209 (15) 175 (20) 091
IPR 358 3211 28 119 (16) 203 (10) 042
Tabla IV1 Tiempos de retencioacuten (Tr) relacioacuten de iones precursores (mz) voltaje de cono (V) energiacuteas de colisioacuten (CE) y relacioacuten de intensidades entre transiciones (IP2IP1)
29
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Compuesto Tr (min) Ion precursor (mz Da)
Voltaje de cono (V)
Ion producto 1 (CEv)
cuantificacioacuten
Ion producto 2 (CEv)
cualificacioacuten
Relacioacuten IP2IP1
MAN 392 4120 25 328 (16) 125 (35) 063
MET 283 2801 26 220 (13) 192 (17) 057
MYC 365 2891 34 70 (18) 125 (32) 029
PEN 417 2840 34 70 (16) 159 (34) 031
PYC 523 3881 31 194 (12) 163 (25) 066
PYM 266 2000 51 107 (24) 82 (24) 071
TEC 397 3080 40 70 (22) 125 (40) 007
TEF 473 3531 19 133 (20) 297 (8) 072
TBZ 182 2020 51 175 (25) 131 (30) 062
TME 203 2920 28 211 (12) 132 (22) 047
THI-M 257 3430 28 151 (46) 93 (19) 0001
TRI 319 2961 21 70 (10) 99 (15) 013
El dwell time para cada una de las transiciones se ajustoacute de manera automaacutetica por el software (MassLinx) con
objeto de obtener doce puntos espectrales por compuesto tomando un valor promedio de cuatro segundos como
ancho de pico a liacutenea de base
2 CARACTERIZACIOacuteN DEL PROCEDIMIENTO DE DETERMINACIOacuteN (UPLC-ESI-
MSMS)
Una vez optimizados los paraacutemetros que afectan a la separacioacuten cromatograacutefica (UPLC) y a la determinacioacuten por
espectrometriacutea de masas en taacutendem (MSMS) se lleva a cabo la evaluacioacuten de la repetibilidad de inyeccioacuten y
determinacioacuten en esas condiciones Se expresa por medio de la desviacioacuten estaacutendar relativa (RSD) paraacutemetro que
nos indica el grado de correlacioacuten que existe entre varias medidas del mismo patroacuten realizadas por el mismo
operador en el laboratorio y en el mismo equipo de medida a lo largo de un diacutea Para el estudio se realizan diez
inyecciones con volumen de 15 microL de dos patrones con distintos niveles de concentracioacuten 5 y 20 ngmL Los
datos de RSD (Tabla IV2) para las aacutereas de pico de los analitos se situacutean para el nivel de concentracioacuten 5 ngmL
en el rango 2-13 y en el nivel de concentracioacuten 20 ngmL en el rango 1-7
30
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten Tabla IV2 Desviacioacuten estaacutendar relativa (RSD) del aacuterea de pico (transicioacuten de cuantificacioacuten) para evaluar la repetivilidad del proceso de LC-MSMS
Compuesto RSD
5 ngmL
RSD
20 ngmL Compuesto
RSD
5 ngmL
RSD
20 ngmL
AME 5 2 MET 3 2
BEN 2 2 MYC 9 2
BOS 4 5 PEN 4 4
CAR 4 2 PYC 3 1
CYP 5 7 PYM 7 3
DIM 6 5 TEC 3 2
FEH 7 4 TEF 4 2
FEP 4 2 TBZ 2 1
FLU 5 3 TME 6 6
IMI 13 7 THI-M a 6
IPR 8 2 TRI 8 6
MAN 3 2
A continuacioacuten tambieacuten se evaluoacute la repetibilidad de los tiempos de retencioacuten (Tr) para diez inyecciones de
patrones a los dos niveles de concentracioacuten 5 y 20 ngmL situaacutendose las RSD para todos los compuestos en el
rango 01-03 En base a este dato la ventana de tiempo en la que se registran las transiciones de MRM de cada
compuesto se fijoacute en 05 min lo que es lo mismo 025 min alrededor del valor medio de su tiempo de retencioacuten
Por otro lado la linealidad del meacutetodo se estudioacute a nueve niveles de concentracioacuten diferentes comprendidos ente
los niveles 05 ngmL y 200 ngmL mediante la inyeccioacuten de disoluciones patroacuten de los distintos compuestos de
estudio Se realizoacute una evaluacioacuten sin y otra con patroacuten interno (IS) antildeadiendo una concentracioacuten fija de patrones
internos a nivel de 25 ngmL y pudimos observar que los resultados mejoran notablemente al realizar una
correccioacuten con el IS En la Tabla IV3 se muestran los coeficientes de determinacioacuten (R2) obtenidos al realizar la
correccioacuten mediante IS observando que para todos los compuestos excepto para THI-M y para TRI los
coeficientes de correlacioacuten son superiores a 0990 por lo que existe una respuesta lineal en el rango de
concentraciones que hemos estudiado
Aparte del estudio de la linealidad tambieacuten se han estudiado los liacutemites de cuantificacioacuten instrumentales del
meacutetodo (LOQs) Para ello los LOQs se evaluacutean como la miacutenima cantidad de analito que origina una sentildeal 10
veces superior a la desviacioacuten estaacutendar del ruido Los valores anteriores se estimaron a partir del patroacuten de
a no evaluado ya que se encuentra por debajo del liacutemite de cuantificacioacuten del meacutetodo
31
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
concentracioacuten maacutes baja que presenta un pico con una relacioacuten SN superior a 10 En la Tabla IV3 tambieacuten se
recogen estos LOQs en doacutende podemos ver que variacutean en el rango 01-1 ngmL excepto para THI-M que se
desviacutea a valores de 10 ngmL
Tabla IV3 Coeficientes de determinacioacuten (R2) y liacutemites de cuantificacioacuten instrumentales (LOQs) de los analitos para nueve
niveles de concentracioacuten de 05 a 200 ngmL
Compuesto Coeficiente de
correlacioacuten (R2)
LOQs (ngmL) Compuesto
Coeficiente de correlacioacuten
(R2)
LOQs (ngmL)
AME 09951 04 MET 09933 01
BEN 09949 01 MYC 09950 04
BOS 09979 02 PEN 09945 02
CAR 09923 02 PYC 09955 02
CYP 09878 02 PYM 09931 01
DIM 09938 07 TEC 09958 05
FEH 09959 05 TEF 09957 01
FEP 09931 01 TBZ 09942 02
FLU 09965 02 TME 09903 01
IMI 09979 05 THI-M 09580 100
IPR 09938 01 TRI 09867 07
MAN 09979 01
En la Figura IV1 y Figura IV2 se muestran dos ejemplo de curvas de calibrado para dos compuestos IMI y
MAN respectivamente
Figura IV1 Curva de calibrado y coeficiente de determinacioacuten de IMI para UPLC-ESI-MSMS
32
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Figura IV2 Curva de calibrado y coeficiente de determinacioacuten de MAN para UPLC-ESI-MSMS
3 ESTUDIO DEL MEacuteTODO SPE
La extraccioacuten de pesticidas se llevoacute a cabo mediante extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) en doacutende se realizaron
diversos estudios con diferentes condiciones para dar con las oacuteptimas En primer lugar se llevaron a cabo los
experimentos de retencioacuten y elucioacuten sobre dos tipos distintos de adsorbentes cartuchos OASIS HLB (200mg) y
cartuchos OASIS MAX (150 mg) como fases potenciales en las que llevar a cabo la extraccioacuten de manera
selectiva Los dos tipos de cartuchos son de fase reversa pero difieren entre siacute en el fundamento de retencioacuten de
los analitos En los cartuchos OASIS HLB (200 mg) formados por divinilbenceno-N-vinilpirrolidona (DVB-VP)
la retencioacuten de los diferentes analitos tiene lugar por interacciones π-π o de Van der Waals mientras que los
cartuchos OASIS MAX (150 mg) que se probaron como alternativa para mejorar la selectividad en la extraccioacuten
cuentan con un adsorbente polimeacuterico de modo mixto formado por divinilbenceno-N-vinilpirrolidona (DVB-VP)
funcionalizado con grupos amina cuaternaria siendo el fundamento de la extraccioacuten la combinacioacuten de las
propiedades adsorbentes del cartucho HLB con un mecanismo adicional de intercambio ioacutenico (anioacutenico) [27]
Algunos autores han empleado este mecanismo para mejorar la selectividad de la extraccioacuten de forma que en la
etapa de elucioacuten ciertos pigmentos del vino quedan fuertemente retenidos en el adsorbente a diferencia de lo que
ocurre con los adsorbentes de fase reversa [51]
Para llevar a cabo la eleccioacuten del tipo de adsorbente se realizaron pruebas con 10 mL de vino blanco y tinto
conectando en serie los dos tipos de cartuchos HLB (200 mg) y MAX (150 mg) a un segundo cartucho OASIS
HLB (60 mg) La elucioacuten de los analitos se hace de forma independiente para cada cartucho y se evaluacutea si los
analitos pasan del primer cartucho hacia el segundo cartucho es decir si se supera el volumen de corte o si por
33
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
otro lado se quedan retenidos en el primero y no eluyen hacia el segundo En estas pruebas de estudio
preliminares de preparacioacuten de la muestra no se ha incluido el CYP
En la Figura IV3 podemos ver la eficacia de la extraccioacuten para vino blanco y tinto que obtenemos empleando
cartuchos OASIS MAX (150 mg) conectados en serie con cartuchos OASIS HLB (60 mg) realizando la
extraccioacuten de tres fracciones de 2 mL cada una del cartucho OASIS MAX (150 mg) y una cuarta fraccioacuten de 2
mL del cartucho OASIS HLB (60 mg)
Por otro lado en la Figura IV4 podemos ver un graacutefico de columnas en el cual comparamos la eficacia de
extraccioacuten de los cartuchos OASIS HLB (200 mg) con dos disolventes de elucioacuten distintos En dicho graacutefica el
acroacutenimo de cada compuesto consta de dos barras cuyo significado es el siguiente la barra de la izquierda indica
la eficacia de la extraccioacuten empleando acetonitrilo (ACN) como disolvente de elucioacuten y la barra de la derecha
indica la eficacia de la extraccioacuten empleando la combinacioacuten MetanolAcetonitrilo (2080) (MeOHACN) como
disolvente de elucioacuten Para este adsorbente no se detectoacute ninguacuten compuesto en la extraccioacuten del segundo
cartuchos OASIS HLB (60 mg) empleando 2 mL de metanol
Figura IV3 Distribucioacuten de los compuestos en cada fraccioacuten obtenidas con cartuchos OASIS MAX (150 mg)
utilizando 10 mL de vino tinto y blanco sacando cuatro fracciones de 2 mL cada una con metanol como
disolvente de elucioacuten
34
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Figura IV4 Distribucioacuten de los compuestos en cada fraccioacuten obtenidas con cartuchos OASIS HLB (200 mg) utilizando 10
mL de vino tinto y blanco sacando 3 fracciones de 2 mL cada una con acetonitrilo (ACN) (columna de la izquierda) y una
combinacioacuten MetanolAcetonitrilo (2080) (MeOHACN) (columna de la derecha) como disolventes de elucioacuten
A la vista de los resultados reflejados en las graacuteficas podemos afirmar que cuando se utiliza el cartucho OASIS
HLB (200 mg) eluyendo con acetonitrilo o la combinacioacuten metanolacetonitrilo (2080) los extractos son limpios
y se eluyen la mayoriacutea de los compuestos en la primera fraccioacuten Pero utilizando acetonitrilo como disolvente de
elucioacuten se encuentran problemas en la extraccioacuten de CAR FEH y TBZ para los que es necesario emplear un
volumen mayor de elucioacuten o bien seleccionar otro disolvente de elucioacuten como es la combinacioacuten
metanolacetonitrilo
35
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Por otro lado los extractos en los cartuchos OASIS MAX (150 mg) son maacutes limpios incluso utilizando metanol en
la elucioacuten pero se detecta la presencia de CAR FEP TBZ y TME en el segundo cartucho OASIS HLB (60 mg)
significando la rotura del primer cartucho para dichos analitos considerando un volumen de 10 mL de vino Los
demaacutes compuestos se podriacutean recuperar cuantitativamente en la primera fraccioacuten sacada pero la peacuterdida de estos
compuestos inclina la eleccioacuten hacia los cartuchos OASIS HLB (200 mg) con metanolacetonitrilo (2080) como
disolvente de elucioacuten para continuar con el estudio
Una vez fijado el adsorbente y el volumen de elucioacuten se prueba la eficacia de la SPE independiente de los efectos
de matriz En la Tabla IV4 se muestran las recuperaciones de la SPE tomando 10 mL de vino blanco y tinto
con un nivel de adicioacuten de 15 ngmL sacando una sola fraccioacuten de 2 mL con la combinacioacuten
metanolacetonitrilo (2080) y n=3 reacuteplicas
Tabla IV4 Recuperaciones (R plusmn SD) de SPE para 10 mL de vino (blanco y tinto) con un nivel de adicioacuten de 15 ngmL y
n=3 reacuteplicas
Compuesto Vino Tinto
R plusmn SD
Vino Blanco
R plusmnSD Compuesto
Vino Tinto
R plusmn SD
Vino Blanco
R plusmn SD
AME 82 plusmn 7 100 plusmn 1 MET 92 plusmn 6 94 plusmn 3
BEN 89 plusmn 6 97 plusmn 3 MYC 90 plusmn 9 86 plusmn 4
BOS 95 plusmn 1 100 plusmn 2 PEN 84 plusmn 10 103 plusmn 3
CAR 91 plusmn 6 104 plusmn 6 PYC 86 plusmn 5 106 plusmn 1
CYP 81 plusmn 7 102 plusmn 3 PYM 87 plusmn 12 94 plusmn 3
DIM 97 plusmn 3 86 plusmn 4 TEC 83 plusmn 10 103 plusmn 1
FEH 89 plusmn 3 88 plusmn 3 TEF 84 plusmn 5 108 plusmn 4
FEP 91 plusmn 7 104 plusmn 3 TBZ 88 plusmn 7 92 plusmn 5
FLU 91 plusmn 2 97 plusmn 4 TME 101 plusmn 1 110 plusmn 13
IMI 117 plusmn 8 101 plusmn 11 THI-M 85 plusmn 9 110 plusmn 4
IPR 89 plusmn 7 112 plusmn 4 TRI 85 plusmn 10 110 plusmn 4
MAN 88 plusmn 2 87 plusmn 2
Algunos compuestos de la matriz en el vino pueden competir con los analitos durante el proceso de ionizacioacuten
que tiene lugar en la interfase entre UPLC-MSMS por lo que para la cuantificacioacuten del rendimiento de la
ionizacioacuten por electrospray (ESI) se estudian los efectos de matriz (EM) para vino blanco y tinto considerando
dos voluacutemenes de muestra distintos 2 y 10 mL y un volumen final del extracto de 2 mL En la Tabla IV5 se
36
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
exponen los valores para cada compuesto notando que al aumentar el volumen de muestra tambieacuten se aumentan
los efectos de matriz y eacutestos siempre son mayores en vino tinto Para el caacutelculo de estos efectos de matriz (EM)
se emplea la siguiente ecuacioacuten
Donde Am Ab y Ap representan el aacuterea de pico en la sentildeal medida del analito en el extracto de la muestra con
adicioacuten en el extracto de la muestra sin adicioacuten (o blanco) y en el patroacuten antildeadido respectivamente El nivel de
adicioacuten en extracto fue de 50 ngmL por compuesto
Tabla IV5 Efectos de matriz para vino blanco y tinto con un volumen inicial de 2 y 10 mL evaluados para un nivel de adicioacuten de 50 ngmL en extracto
Compuesto
Vino blanco Vino tinto
2 mL 10 mL 2mL 10 mL
EM () CV () EM () CV () EM () CV () EM () CV()
AME 93 3 95 2 99 3 101 7
BEN 99 1 93 2 101 3 100 6
BOS 97 5 98 1 108 2 96 0
CAR 62 2 50 3 58 2 55 6
CYP 94 3 91 1 97 2 95 7
DIM 105 2 95 3 100 3 108 3
FEH 100 4 102 4 105 4 94 3
FEP 95 3 88 2 96 2 92 7
FLU 98 2 93 2 106 1 101 2
IMI 84 4 46 3 48 10 18 8
IPR 99 3 92 3 105 1 100 7
MAN 100 1 94 3 109 4 107 2
MET 98 1 89 1 99 2 99 6
MYC 105 1 100 1 103 2 96 9
PEN 98 3 97 1 101 3 99 10
PYC 98 2 92 3 102 2 98 5
PYM 95 2 87 1 94 3 85 12
TEC 95 3 99 1 101 1 102 10
TEF 99 1 92 3 101 2 104 5
TBZ 45 0 40 5 43 2 30 7
TME 60 6 19 16 36 4 16 1
THI-M 107 2 109 2 103 1 96 9
TRI 97 3 118 4 104 5 117 10
37
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Al observar los resultados podemos ver que la mayoriacutea de los compuestos dan resultados de EM en torno al
100 lo que significa que no sufren una modificacioacuten importante en la eficacia de ionizacioacuten para las muestras
con respecto a los patrones Pero tambieacuten por el contrario podemos observar que algunos compuestos como
por ejemplo en el caso de CAR TBZ IMI y TME experimentan una gran supresioacuten de sentildeal es decir EM bajos
que se acentuacutean al aumentar el volumen de muestra La atenuacioacuten en la eficacia de variacioacuten para estos cuatro
compuestos no solo se ve incrementada con el volumen de muestra si no que ademaacutes es maacutes significativa para
vino tinto que para vino blanco En base a estos resultados aunque la eficacia de la SPE fue cuantitativa para
muestras de 10 mL se limitoacute el volumen de muestra a extraer a 2 mL
Las condiciones oacuteptimas de extraccioacuten se esquematizan en un resumen en la Figura IV5
Figura IV5 Condiciones optimizadas para la extraccioacuten de pesticidas en vino
38
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
4 CARACTERIZACIOacuteN DEL MEacuteTODO DE DETERMINACIOacuteN
Con las condiciones de extraccioacuten y determinacioacuten citadas anteriormente se llevaron a cabo pruebas de
recuperaciones absolutas de los compuestos a nivel de adicioacuten de 5 y 20 ngmL sobre las muestras Para cada
muestra y nivel de adicioacuten se realizaron tres reacuteplicas de las muestras con adicioacuten y los blancos aliacutecuotas de las
mismas muestras sin adicioacuten se procesaron en duplicado Los IS se antildeadieron a nivel de 25 ngmL y cada uno se
utiliza para corregir unos determinados compuestos CAR-d3 se emplea para CAR y TBZ el CYP-d5 para CYP y
PYM el IMID-d4 para IMI y TME y el MET13C6 para el resto de compuestos Los resultados para vino blanco
comprenden en el nivel de concentracioacuten 5 ngmL el rango entre 79-122 y en el nivel de concentracioacuten 20
ngmL el rango entre 84-109 Por otro lado en el caso del vino tinto las recuperaciones se encuentran para el
nivel de concentracioacuten 5 ngmL en el rango 67-112 y para el nivel de concentracioacuten 20 ngmL entre el rango
73-132 Los resultados obtenidos en las pruebas con vino blanco y vino tinto se muestran en la Tabla IV6
Los resultados son satisfactorios ya que la mayoriacutea de los compuestos se ajustan en todos los casos al rango de
recuperacioacuten entre 70-120 Para la realizacioacuten de estas pruebas se ha eliminado de los resultados el compuesto
THI-M debido a que las concentraciones utilizadas se encuentran en el liacutemite o por debajo del LOQ en los
experimentos con muestras adicionadas a 5 ngmL
Para calcular las recuperaciones (R) se recurrioacute a la siguiente ecuacioacuten
Donde Cm Cb y Cp son la concentracioacuten medida de analito en el extracto de la muestra con adicioacuten en el extracto
de la muestra sin adicioacuten (o blanco) y en el patroacuten antildeadido respectivamente
Tabla IV6 Recuperaciones (R) para vino tinto y vino blanco evaluadas para dos niveles de concentracioacuten 5 y 20 ngmL
Compuesto
Vino tinto Vino Blanco
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
AME 97 3 105 6 104 9 96 5
BEN 88 11 105 3 101 1 98 4
BOS 91 13 110 2 88 13 97 3
39
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Compuesto
Vino tinto Vino blanco
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
CAR 99 6 99 3 122 3 109 1
CYP 91 2 111 1 101 4 100 6
DIM 112 3 110 9 102 24 99 11
FEH 91 4 108 0 102 20 95 2
FEP 89 8 102 7 94 5 84 1
FLU 95 10 104 4 109 5 100 8
IMI 73 11 115 9 80 13 100 2
IPR 84 13 99 3 111 3 99 4
MAN 88 22 112 8 112 3 99 4
MET 99 3 106 5 106 3 98 2
MYC 84 9 106 13 88 17 86 3
PEN 84 9 102 5 84 8 90 5
PYC 96 6 105 4 100 2 95 4
PYM 90 12 112 14 106 4 97 1
TEC 89 8 101 6 98 12 94 1
TEF 93 10 102 5 107 2 97 3
TBZ 94 17 115 8 79 5 106 2
TME 67 2 101 7 84 18 90 11
THI-M ne - 74 7 ne - 89 24
TRI 88 12 97 6 102 6 92 2
ne No evaluado El nivel de adicioacuten es inferior al LOQ del meacutetodo para este compuesto
Para estudiar la reproducibilidad del meacutetodo analiacutetico global (correspondientes a los datos de preparacioacuten de
muestra y determinacioacuten) es decir la concordancia de varias medidas realizadas en diacuteas diferentes se procedioacute a la
extraccioacuten en las condiciones oacuteptimas tanto de vino blanco como tinto Las extracciones y determinaciones se
realizaron durante tres diacuteas consecutivos realizando tres reacuteplicas por vino y por diacutea con un nivel de adicioacuten en
muestra de 10 ngmL un blanco de muestra cada diacutea En la Tabla IV7 se muestran los resultados como
recuperaciones (R) en condiciones de reproducibilidad obtenidos para ambos tipos de vino dando valores entre
64-116 para muestras de vino blanco y valores situados entre 68-108 para muestras de vino tinto con la
excepcioacuten del TME para el que se ha obtenido un valor no aceptable en cuanto a la exactitud medida en
condiciones de reproducibilidad A la vista de los resultados obtenidos con estas pruebas se considera necesario el
empleo de IS adicionales para la mejora en la exactitud del meacutetodo para algunos compuestos por ejemplo el
TME
40
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Tabla IV7 Recuperaciones en condiciones de reproducibilidad (R plusmn SD) para vino blanco y tinto
Compuesto
Vino tinto Vino blanco
R
10 ngmL CV ()
R
10 ngmL CV ()
AME 90 5 101 13
BEN 96 5 102 7
BOS 97 6 100 8
CAR 97 3 94 5
CYP 103 3 105 12
DIM 104 7 106 8
FEH 90 16 83 15
FEP 91 5 90 4
FLU 103 7 102 6
IMI 99 14 101 14
IPR 91 5 100 13
MAN 108 5 108 13
MET 101 5 101 5
MYC 105 16 102 14
PEN 96 11 92 10
PYC 99 12 97 12
PYM 102 4 116 8
TEC 99 9 97 16
TEF 99 8 105 11
TBZ 68 4 84 5
TME 47 13 64 10
THI-M 107 11 104 16
TRI 95 14 103 4
En la Tabla IV8 se muestran los liacutemites de cuantificacioacuten (LOQs) del meacutetodo del meacutetodo de SPE-UPLC-ESI-
MSMS obtenidos para los diferentes pesticidas Los valores obtenidos son ideacutenticos a los LOQs instrumentales
excepto en el caso de aquellos compuestos para los que se observaronfuertes efectos de matriz (Tabla IV5) En
estos casos (CAR TBZ IMI y TME) los LOQs del meacutetodo se incrementan seguacuten la atenuacioacuten de sentildeal
observada
41
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Tabla IV8 Liacutemites de cuantificacioacuten LOQs (ngmL) del meacutetodo obtendos para cada compuesto
Compuesto LOQ (ngmL) Compuesto LOQ (ngmL)
AME 04 MET 01
BEN 01 MYC 04
BOS 02 PEN 02
CAR 03 PYC 02
CYP 02 PYM 01
DIM 07 TEC 05
FEH 05 TEF 01
FEP 01 TBZ 04
FLU 02 TME 02
IMI 06 THI-M 10
IPR 01 TRI 07
MAN 01
5 APLICACIOacuteN A MUESTRAS DE VINO COMERCIALES
Una vez optimizadas las condiciones del meacutetodo y estudiadas las caracteriacutesticas del meacutetodo desarrollado se aplicoacute
a la determinacioacuten de los compuestos de intereacutes estudiados en muestras de vino blanco y vino tinto comerciales
producidos en diferentes paiacuteses En la Tabla IV9 se muestra el paiacutes de origen de cada muestra comercial
identificadas con un coacutedigo alfanumeacuterico y antildeo de produccioacuten
42
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Tabla IV9 Coacutedigo asignado para los diferentes vinos comerciales blancos y tintos analizados Indicando el paiacutes de origen y
antildeo de produccioacuten
Coacutedigo Denominacioacuten de origen Antildeo de produccioacuten
bull Vinos Blancos
W1 Alemania 2014
W2 Espantildea 2012
W3 Espantildea 2016
W4 Portugal Desconocido
W5 Francia 2015
W6 Francia 2015
W7 Espantildea 2016
bull Vinos Tintos
R1 Espantildea 2015
R2 Sudaacutefrica 2015
R3 Chile 2015
R4 Francia 2015
R5 China Desconocido
R6 Espantildea 2016
R7 Australia 2014
R8 Francia 2013
R9 Francia 2015
A continuacioacuten en la Tabla IV10 y la Tabla IV11 se recogen los resultados obtenidos en el anaacutelisis de las
muestras comerciales Los datos obtenidos corresponden en todos los casos al uso de patrones de calibracioacuten
como teacutecnica de cuantificacioacuten
Tabla IV10 Concentracioacuten (ngmL) encontradas en las diferentes muestras de vino blanco comercial analizadas mediante
SPE-UPLC-MSMS n=2 reacuteplicas y al final el sumatorio de las concentraciones encontradas
Compuesto W1 W2 W3 W4 W5 W6 W7
AME 04 nd nd nd 41 nd nd
BEN nd nd 14 nd nd nd nd
BOS 84 102 520 54 197 nd nd
CAR nd 115 56 nd nd nd nd
CYP 08 59 112 nd nd 26 nd
43
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Compuesto W1 W2 W3 W4 W5 W6 W7
DIM 14 84 400 09 32 50 nd
FEH 85 809 639 15 187 nd nd
FLU 11 05 92 nd 77 32 nd
IMI nd 136 88 29 nd nd 69
IPR 30 749 1144 14 nd nd nd
MAN nd nd nd nd nd 30 nd
MET 04 273 494 63 nd nd 172
MYC 09 nd 35 nd nd nd nd
PYM 15 469 584 08 24 35 nd
TEC 11 nd 58 nd nd nd nd
TRI nd 67 61 nd nd nd nd
sumconcentracioacuten
(ngmL) 274 2868 4358 192 558 173 862
nd no detectado
Tabla IV11 Concentracioacuten (ngmL) encontradas en las diferentes muestras de vino tinto comercial analizadas mediante
SPE-UPLC-MSMS n= 2 reacuteplicas y al final el sumatorio de las concentraciones encontradas
Compuesto R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9
AME nd nd nd 30 nd nd nd nd 16
BEN nd nd nd 07 nd nd nd nd nd
BOS nd 55 21 196 nd nd nd 73 21
CAR nd nd 04 17 249 20 nd nd nd
CYP 34 08 02 22 nd 136 nd 85 nd
DIM nd 33 nd 52 233 46 nd 61 23
FEH nd nd nd 1070 nd 10 nd 1307 14
FLU nd nd nd 20 nd nd nd nd nd
IPR 16 nd nd 17 nd 22 nd nd nd
MAN nd nd nd 17 nd nd nd 20 nd
MET 126 nd nd 14 55 313 30 44 39
MYC nd nd nd 05 nd 32 nd nd nd
PYM 19 nd 03 185 49 281 nd 24 nd
TEC 25 06 39 29 nd nd nd 21 20
TEF nd 01 12 nd nd nd nd nd nd
sumconcentracioacuten
(ngmL) 220 48 81 1681 586 860 30 1635 133
nd no detectado 44
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
En los resultados de los anaacutelisis podemos observar que en ninguna de las muestras comerciales de vino blanco
aparecieron los siguientes compuestos FEP PEN PYC TEF TBZ THI-M y TME y en los vinos tintos
comerciales no aparece a ninguna concentracioacuten FEP IMI PEN PYC TBZ TME THI-M y TRI No se
detectaron para dichas muestras de vino a niveles superiores a los LOQs del meacutetodo propuesto
Cuando se detecta un compuesto positivo se compara el pico cromatograacutefico del compuesto con el de un patroacuten
verificando la coincidencia del tiempo de retencioacuten (maacutexima diferencia 01 min) y la relacioacuten entre transiciones
(maacutexima diferencia 30 ) En la Figura IV6 y la Figura IV7 se muestran los cromatogramas para el compuesto
CYP obtenido en condiciones oacuteptimas para la muestra de vino blanco W6 y en un patroacuten de 5 ngmL
respectivamente En este caso el intervalo de tolerancia para la relacioacuten de intensidad entre transiciones es
IP2IP1=061plusmn018
Figura IV6 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el CYP en la muestra W6 (26 ngmL) Transicioacuten
superior 226gt93 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 226gt108 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades IP2IP1= 066
Figura IV7 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el CYP en un patroacuten de 5 ngmL Transicioacuten
superior 226gt93 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 226gt108 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades IP2IP1=061plusmn018
45
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Otro ejemplo de compuesto positivo en abundantes muestras comerciales de estudio es el Metalaxyl positivo con
una concentracioacuten de 04 ngmL en el vino con referencia W1 (Figura IV8) y positivo con una concentracioacuten de
313 ngmL en el vino con referencia R6 (Figura IV9) Ambas se comparan con el cromatograma de un patroacuten
de Metalaxyl de 1 ngmL (Figura IV10) El grado de concordancia en los tiempos de retencioacuten y la relacioacuten de
intensidades entre transiciones es satisfactorio
Figura IV8 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el MET en la muestra W1 (04 ngmL) Transicioacuten
superior 2801gt2201 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 2801gt1921 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades
IP2IP1=056
Figura IV9 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el MET en la muestra R6 (313 ngmL) Transicioacuten
superior 2801gt2201 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 2801gt1921 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades IP2IP1=
056
46
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Figura IV10 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el MET en un patroacuten de 1 ngmL Transicioacuten
superior 2801gt2201 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 2801gt1921 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades
IP2IP1=057plusmn017
Es de destacar que aunque se detectaron bastantes pesticidas en las diferentes muestras de vino comerciales pero
en ninguacuten caso superaron el 10 de los LMRs permitidos en uvas tal y como se recomienda ya que todaviacutea no
existen LMRs para vino en la legislacioacuten vigente No obstante el nivel total de concentracioacuten (sumatorio de
concentraciones Tabla IV10 y Tabla VI11) es significativo para varias muestras tanto de vinos blancos (W2 y
W3) como tintos (R4 y R8)
47
Capiacutetulo V Conclusiones
CAPIacuteTULO V CONCLUSIONES
En este trabajo se ha estudiado un meacutetodo para la cuantificacioacuten de pesticidas concretamente veinte fungicidas y
tres insecticidas en vino blanco y tinto En la etapa de preparacioacuten de muestra se optimizoacute la extraccioacuten en fase
soacutelida (SPE) utilizando cartuchos OASIS HLB (200 mg) compuestos por divinilbenceno-N-vinilpirrolidona
(DVB-VP) como adsorbente Como teacutecnica de determinacioacuten se utilizoacute cromatografiacutea de liacutequidos con una
interfase de electroespray acoplada a espectrometriacutea de masas (UPLC-ESI-MSMS)
Las conclusiones generales obtenidas a partir de los resultados de este proyecto relativo a la determinacioacuten de
fitosanitarios en vino son
Ante los problemas de retencioacuten que presentan los cartuchos OASIS MAX (150 mg) para algunos
compuestos los cartuchos OASIS HLB (200 mg) junto con la combinacioacuten metanolacetonitrilo (2080)
como disolvente de elucioacuten son elegidos como mejor opcioacuten en la extraccioacuten en fase soacutelida de pesticidas
en muestras con matrices complejas como es el caso del vino Asiacute se consigue la retencioacuten selectiva de
componentes de la matriz y proporciona extractos con menor porcentaje de interferencias
El meacutetodo estudiado y optimizado se puede aplicar tanto a vinos blancos como a vinos tintos procesados
a partir de distintas variedades de uvas
Los liacutemites de cuantificacioacuten (LOQs) del estudio se situacutean la mayoriacutea por debajo de 10 ngmL excepto
en el caso de THI-M que asciende al valor de 20 ngmL El rango de respuesta lineal abarca hasta 200
ngmL y el tiempo de anaacutelisis ha sido de solo 10 minutos por muestra
En todas las muestras de vino (blancos y tintos) comerciales analizadas se han detectado la presencia de
varios pesticidas sin embargo todas las concentraciones encontradas se encuentran por debajo del 10
de los LMRs fijados en uvas tal y como recomienda la legislacioacuten por lo que no se considera
preocupante
48
Capiacutetulo V Conclusioacutens
CAPIacuteTULO V CONCLUSIOacuteNS
Neste traballo estudouse un meacutetodo para a cuantificacioacuten de pesticidas en particular vinte funxicidas e tres
insecticidas en vintildeo branco e maacuteis tinto No paso da preparacioacuten da mostra optimizouse a extraccioacuten en fase
soacutelida (SPE) empregando cartuchos OASIS HLB (200 mg) compostos por divinilbenceno-N-pirrolidona (DVB-
VP) como adsorbente Para a teacutecnica de determinacioacuten utilizouse cromatografiacutea de liacutequidos con unha interfase de
electroespray acoplada a espectrometriacutea de masas (UPLC-ESI-MSMS)
As conclusioacutens xerais a obtidas a partir dos resultados deste proxecto relativo aacute determinacioacuten de pesticidas en
vintildeo son
Ante os problemas de retencioacuten que mostraban os cartuchos OASIS MAX (150 mg) para alguacuten
compostos os cartuchos OASIS HLB (200 mg) en conxunto coa mistura metanolacetonitrilo (2080)
como disolvente de elucioacuten son elexidos como mellor opcioacuten na extraccioacuten en fase soacutelida de pesticidas
en mostras con matrices complexas como eacute o caso do vintildeo Asiacute eacute conseguida a retencioacuten selectiva de
componentes da matriz e proporciona extractos con menos porcentaxe de interferencias
O meacutetodo estudado e optimizado poacutedese aplicar tanto a vintildeos brancos coma tintos procesados a partir de
diferentes variedades de uvas
Os liacutemites de cuantificacioacuten do estudo (LOQs) son maacuteis baixos de 10 ngmL agaacutes no caso do THI-M
que ascende ao valor de 20 ngmL O rango de resposta lineal cobre ata 200 ngmL e o tempo de anaacutelise
foi de soacute 10 minuacutetos por mostra
En todas as mostras de vintildeo (brancos e tintos) comercial analizadas detectouse a presenza de varios
pesticidas maacuteis poreacuten todas as concentracioacutens atopadas son inferiores ao 10 dos LMR fixados en uvas
tal e como recomenda a lexislacioacuten polo que non se considera preocupante
49
Chapter V Conclusions
CHAPTER V CONCLUSIONS
In this work we have studied a method for the quantification of pesticides specifically twenty fungicides and
three insecticides in white and red wine In the sample preparation step the solid phase extraction was optimized
using cartridges OASIS HLB (200 mg) containing divinylbenzene-N-vinylpyrrolidone (DVB-VP) as adsorbent
As determination technique ultraperformance liquid chromatography was used with an electrospray interface
coupled to mass spectrometry (UPLC-ESI-MS7MS)
The general conclusions drawn from the results of this project concerning the determination of pesticides in wine
are
Due to the retention problems presented by the OASIS MAX sorbent (150 mg) for some compounds of
this project the cartridges OASIS HLB (200 mg) together with the methanolacetonitrile (2080) mixture
are chosen as the best option in the solid phase extraction of pesticides in samples with complex
matrices as is the case with the wine
The method studied and optimized can be applied to both white and red wines obtained from different
varieties of grapes
The limits of quantification (LOQs) were below 10 ngmL for most of the compounds except in the
case of THI-M with a LOQ of to 10 ngmL The linear response range covers up to 200 ngmL and the
analysis time was only 10 minutes per sample
In all commercial wine samples (white and red) analyzed the presence of several pesticides was
conformed however all the concentrations obtained are below 10 of the Maximum residue
levels(MRLs) fixed in grapes as recommended by legislation
50
VI Bibliografiacutea VI BIBLIOGRAFIacuteA [1] Ministerio de agricultura y pesca alimentacioacuten y medio ambiente mhttpwwwmapamagobesescalidad-y-evaluacion-ambientaltemasproductos-quimicosfitosanitarios (Acceso el diacutea 11052017) [2] httpwwwcricyteduarenciclopediaterminosProducFitohtm (Acceso el diacutea 11052017) [3] WERNER BALTES ldquoQuiacutemica de los alimentosrdquo Editorial Acribia SA 2007 Capiacutetulo 11 ldquoResiduos en los alimentosrdquo paacuteginas 206-217
[4] RLabrada JCCaseley CParker ldquoESTUDIO FAO PRODUCCIOacuteN Y PROTECCIOacuteN VEGETAL 120rdquo Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentacioacuten Roma 1996 ISSN 1014- Capiacutetulo 10 Herbicidas httpwwwfaoorgdocrepT1147St1147s00htmContents (Acceso el diacutea 12052017)
[5] Taberner Palou Andreu Cirujeda Ranzenberger Alicia Zaragoza Larios Carlos ldquoManejo de poblaciones de malezas resistentes a herbicidasrdquo (FAO Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura) 100 preguntas sobre resistencia PDF sacado de httpwwwfaoorg3a-a1422spdf (Acceso el diacutea 12052017) [6] BISSET Juan A Uso correcto de insecticidas control de la resistencia Revista Cubana de Medicina Tropical 2002 vol 54 no 3 p 202-219 [7] DEVINE Gregor J EZA Dominique Ogusuku Elena FURLONGMichael J Uso de insecticidas contexto y consecuencias ecoloacutegicas Revista peruana de medicina experimental y Salud Puacuteblica 2008 vol 25 no 1 p 74-100 [8] Ministerio de agricultura y ganaderiacutea (proteccioacuten agropecuaria servicio de diagnoacutestico fitosanitario) de costa Rica httpwwwmaggocrbibliotecavirtualH20-5054pdf (Acceso el diacutea 11052017) [9] GEPP V MONDINO P Control quiacutemico 2011 PDF obtenido de httpwwwpvfagroeduuyfitopatodocscursosfitopatoMaterialesGuiasC-QUIMICOpdf (Acceso el diacutea 772017) [10] ROSSLENBROICH Hans-Juergen STUEBLER Dietrich Botrytis cinereamdashhistory of chemical control and novel fungicides for its management Crop Protection 2000 vol 19 no 8 p 557-561 [11] Figura 11 httpwwwvitiviniculturanetbotritis-o-podredumbre-gris-botrytis-cinerea-pershtml (Acceso el diacutea 12052017) [12] CAMPBELL Paul BENDEK Carlos LATORRE Bernardo A Riesgo de oiacutedio (Erysiphe necator) de la vid en relacioacuten con el desarrollo de los racimos Ciencia e investigacioacuten agraria 2007 vol 34 no 1 p 5-11 [13] ldquoCoacutemo combatir el oiacutedio de la vidrdquo Jose Javier Peacuterez de Obanos Castillo PDF sacado de httpswwwnavarraesNRrdonlyres05E65D9B-D1A2-4EAD-9A63-AFF1D3215552135109Comocombatireloidiodelavidpdf (Acceso el diacutea 12052017) [14] Imagen 12 sacadas las 3 de httpwwwvitiviniculturanetoidio-de-la-vidhtml (Acceso el diacutea 12052017) [15] BARRIOS Gonccedilal REYES Joan Modelizacioacuten del Mildiu de la Vid 2004 httpwwwruralcatnetmigracio_resources617683_mildiusPDF (Acceso el diacutea 12052017) [16] Imaacutegenes sacadas de httpwwwvitiviniculturanetmildiu-de-la-vid-enfermedades-vinahtml (Acceso el diacutea 13052017) [17] HUQ Mainul MEISNER Craig DASGUPTA Susmita Health effects and pesticide perception as determinants of pesticide use evidence from Bangladesh httpagrisfaoorgagris-searchsearchdorecordID=US2012411738 (Acceso el diacutea 13052017)
51
IV Bibliografiacutea [18] BADII Mohammad H LANDEROS Jeroacutenimo Plaguicidas que afectan a la salud humana y la sustentabilidad CULCyT 2015 no 19 Revista vista en httpopenjournaluacjmxojsindexphpculcytarticleview454 (Acceso el diacutea 772017) [19] OLEA Nicolaacutes FERNAacuteNDEZ Mariana F Plaguicidas persistentes En Congreso Implementacioacuten del Convenio de Contaminantes Orgaacutenicos Persistentes Madrid 2001 p 26-27 [20] httpwwwfaoorgfao-who-codexalimentariusabout-codexes (Acceso el diacutea 14052017) [21] httpeceuropaeufoodplantpesticidesmax_residue_levels_en (Acceso el diacutea 14052017 [22] ORDONtildeEZ Juan A Cambero Rodriacuteguez MI Fernaacutendez Aacutelvarez L Garciacutea Sanz ML Garciacutea de Fernando Minguilloacuten GD de la Hoz Perales L Selgas Cortecero MD Tecnologiacutea de los alimentos Volumen 1 Componentes de los Alimentos y Procesos Siacutentesis Madrid 1998paacutegs 349-351 [23] CELA Rafael Casais Maria del Carmen Lorenzo Rosa Antonia Teacutecnicas de separacioacuten en quiacutemica analiacutetica Siacutentesis 2002 Capiacutetulo 11 Extraccioacuten y lixiviacioacuten por disolvente (paacutegs206-260) [24] CANTWELL Frederick F LOSIER Manon Liquidmdashliquid extraction Comprehensive Analytical Chemistry 2002 vol 37 p 297-340 [25] Imagen de LLE sacada de httpprocesosbiowikispacescomExtracciC3B3n+liquido-liquido (Acceso el diacutea 15052017) [26] HENNION Marie-Claire Solid-phase extraction method development sorbents and coupling with liquid chromatography Journal of Chromatography A 1999 vol 856 no 1 p 3-54 [27] CELA Rafael Casais Maria del Carmen Lorenzo Rosa Antonia Teacutecnicas de separacioacuten en quiacutemica analiacutetica Siacutentesis 2002 Capiacutetulo 16 Teacutecnicas de adsorcioacuten y absorcioacuten en la preparacioacuten de muestras Extraccioacuten y microextraccioacuten en fase soacutelida (paacutegs520-555) [28] Imagen spe sacada httptoxicocbblogspotcomes201310las-intoxicaciones-con-farmacoshtml (Acceso el diacutea 15052017) [29] Chaacutefer Pericaacutes Consuelo Acoplamiento microextraccioacuten en fase soacutelida-cromatografiacutea (2006) httprodericuveshandle1055014940 (Acceso el diacutea 16052017) [30] Imagen SPME httpwwwscieloorgcoscielophpscript=sci_arttextamppid=S0122-53832002000100005 (Acceso el diacutea 16052017) [31] MONTES GOYANES Rosa Mariacutea Avances en teacutecnicas de microextraccioacuten para la determinacioacuten de compuestos traza en muestras medioambientales y alimentarias Teacutesis doctoral Noviembre 2009 (Paacutegs 34-55) [32] LEHOTAY Steven J Ae Son Kyung KwonHyeyoung Koesukwiwat Urairat Fu Wusheng Mastovska Katerina Hoh Eunha Leepipatpiboon Natchanun Comparison of QuEChERS sample preparation methods for the analysis of pesticide residues in fruits and vegetables Journal of Chromatography A 2010 vol 1217 no 16 p 2548-2560 [33] Imagen QueChERS httpswwwresearchgatenetpublication279221361_QuEChERS_A_Sample_Preparation_for_Extraction_of_Carbaryl_from_Rat_Feces (Acceso el diacutea 16052017) [34] STASHENKO Elena E MARTIacuteNEZ Jairo Reneacute Preparacioacuten de la muestra un paso crucial para el anaacutelisis por GC-MS Uma publicaccedilatildeo trimestral do Instituto Internacional de Cromatografia (IIC) Ciecircncia Cromatograacutefica 2011 vol 3 no 1 [35] Imagen GC-MS httpsorgspectroscopyintblogspotcomes201411gas-chromatography-mass-spectrometry-gchtml (Acceso el diacutea 17052017) [36] httpwwwactlabscompageaspxmenu=65ampapp=221ampcat1=534amptp=2amplk=no (Acceso el diacutea 17052017)
52
IV Bibliografiacutea [37] Quintela O Cruz A Concheiro M De Castro A amp Loacutepez-Rivadulla M (2005) Metodologiacutea LC-MS Aspectos generales de la teacutecnica y sus aplicaciones en el campo de la toxicologiacutea Rev Toxicol 22 paacutegs7-14 [38] Imagen LC-MS httpsuploadwikimediaorgwikipediaenff9Liquid_chromatography_tandem_Mass_spectrometry_diagrampng (visto 18052017) [39] Vargas de la Cruz Celia Bertha Adaptacioacuten de la Metodologiacutea Analiacutetica para la determinacioacuten de residuos de plaguicidas en frutas nativas de exportacioacuten mediante Uplc-MsMs (2012) Tesis obtenida en http20062146130handlecybertesis2331 (Acceso el diacutea 772017) [40] ROMERO GONZAacuteLEZ Roberto Fernaacutendez Moreno Joseacute Luis Plaza Bolantildeos Patricia Garrido Frenich Antonia Martiacutenez Vidal Joseacute Luis Empleo de la espectrometriacutea de masas como herramienta para la determinacioacuten de toacutexicos en alimentos hacia la seguridad alimentaria Revista Espantildeola de salud puacuteblica 2007 vol 81 no 5 p 461-474 [41] PAYAacute Andrus Fundamento y Funciones de la Espectrometriacutea de Masas Universidad de Valencia Espantildea 2006 httpmuraluvescaloan (Acceso el diacutea 19052017) [42] Imagen MS sacada de httpsesslidesharenetMaYaTorrezespectrometria-demasas (Acceso el diacutea 21052017) [43] ECONOMOU Anastasios Botitsi Helen Antoniou Spyros Tsipi Despina Determination of multi-class pesticides in wines by solid-phase extraction and liquid chromatography-tandem mass spectrometry Journal of Chromatography A 2009 vol 1216 no 31 p 5856-5867 [44] FONTANA A R Rodriacuteguez I Ramil M Altamirano JC Cela R Liquid chromatography time-of-flight mass spectrometry following sorptive microextraction for the determination of fungicide residues in wine Analytical and bioanalytical chemistry 2011 vol 401 no 2 p 767-775 [45] PELAJIĆ Maja G Peček DM Pavlović DV Čepo Novel multiresidue method for determination of pesticides in red wine using gas chromatographyndashmass spectrometry and solid phase extraction Food chemistry 2016 vol 200 p 98-106 [46] Ignaz J Buerge Juumlrgen Krauss Rociacuteo Loacutepez-Cabeza Werner Siegfried Michael Stuumlssi Felix E Wettstein Thomas Poiger Stereoselective Metabolism of the Sterol Biosynthesis Inhibitor Fungicides Fenpropidin Fenpropimorph and Spiroxamine in Grapes Sugar Beets and Wheat Journal of Agricultural and Food Chemistry 2016 vol 64 no 26 p 5301-5309 [47] M Hu X Liu F Dong J Xu S Li H Xu Y Zheng Determination of ametoctradin residue in fruits and vegetables by modified quick easy cheap effective rugged and safe method using ultra-performance liquid chromatographytandem mass spectrometry Food chemistry 2015 vol 175 p 395-400 [48] WALORCZYK Stanisław DROŻDŻYŃSKI Dariusz GNUSOWSKI Bogusław Multiresidue determination of 160 pesticides in wines employing mixed-mode dispersive-solid phase extraction and gas chromatographyndashtandem mass spectrometry Talanta 2011 vol 85 no 4 p 1856-1870 [49] Tianyang Guo Pingping Fang Juanjuan Jiang Feng Zhan Wei Yong Jiahui Liu YiYang Dong Rapid screening and quantification of residual pesticides and illegal adulterants in red wine by direct analysis in real time mass spectrometry Journal of Chromatography A 2016 vol 1471 p 27-3 [50] GONZAacuteLEZ-RODRIacuteGUEZ R M CANCHO-GRANDE B SIMAL-GAacuteNDARA J Decay of fungicide residues during vinification of white grapes harvested after the application of some new active substances against downy mildew Food chemistry 2011 vol 125 no 2 p 549-560 [51] CARPINTEIRO I Ramil M Rodriacuteguez I Cela R Determination of fungicides in wine by mixed-mode solid phase extraction and liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry Journal of Chromatography A 2010 vol 1217 no 48 p 7484-7492
53
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Por uacuteltimo el mildium o mildiu es una enfermedad producida por el hongo Plasmopara vitiacutecola considerada como
una de las peores enfermedades del cultivo siempre y cuando esteacuten en las condiciones ambientales favorables para
su desarrollo Dichas condiciones oacuteptimas para la propagacioacuten de la enfermedad son las lluvias al amanecer o al
anochecer con una temperatura en un rango de 20-25 ordmC El periacuteodo sensible de la vegetacioacuten de la vintildea es a
partir de una longitud de 10 cm en adelante siendo maacutexima en el periacuteodo de mayor crecimiento de la planta Por
otro lado la sensibilidad del racimo empieza desde su formacioacuten hasta que las uvas al florecer alcanzan el tamantildeo
similar al de un guisante pero de ahiacute en adelante la sensibilidad se ve disminuida Dicho hongo cuenta con un
ciclo reproductivo abarcando varias fases desde la fase de contaminacioacuten siendo el principio hasta la fase de pro-
pagacioacuten Afecta a todos los oacuterganos verdes de la vid y sus siacutentomas son variados en las distintas zonas de eacutesta
En las caras de las hojas aparecen unas manchas amarillentas en los racimos cuando se aproxima la floracioacuten los
que se encuentran infectados se curvan secaacutendose y cubrieacutendose de una pelusa blanquecina y cuando alcanzan el
tamantildeo de un guisante en adelante las uvas de los racimos afectados se van oscureciendo y secando sin que apa-
rezca la fructificacioacuten del hongo ademaacutes de oscurecerse el tallo [15]
12 Estructura propiedades fiacutesico-quiacutemicas y clasificacioacuten
En este trabajo nos centramos en estudiar los residuos de veintitreacutes fitosanitarios tipo fungicida principalmente
aunque tambieacuten alguacuten residuo tipo insecticida Las caracteriacutesticas maacutes importantes de dichos compuestos seraacuten
recogidas en la Tabla I1 que incluye estructuras clasificacioacuten (se ha usado el acroacutenimo ldquoFrdquo en caso de ser
fungicidas e ldquoIrdquo en caso de ser insecticidas) y propiedades fiacutesico-quiacutemicas Las propiedades fiacutesico-quiacutemicas que
pueden resultar maacutes relevantes para este estudio son el pKa ya que la mayoriacutea se trata de compuestos baacutesicos
aunque se encuentre alguacuten aacutecido deacutebil como es por ejemplo el Fenhexamid y Kow describiendo el coeficiente de
reparto entre octanolagua empleado para medir el grado de hidrofobidad que proporciona una estimacioacuten de
la posible distribucioacuten del analito entre materia orgaacutenica y agua
Figura I3 Enfermedad del mildium en la imagen de la izquierda coacutemo afecta a las hojas imagen central coacutemo
afecta a los racimos cuaacutendo estaacuten infectados al comenzar la floracioacuten y en la imagen de la derecha coacutemo afecta a
los racimos en doacutende las uvas tienen tamantildeo mayor al de un guisante [16]
6
Compuesto Estructura Nombre sistemaacutetico Foacutermula CAS Uso ordflog (kow) pKa
Ametoctradin
(AME)
5-ethyl-6-
octyl[124]triazolo[15-
a]pyrimidin-7-amine
C15H25N5 865318-97-4 F 440 278
Benalaxyl
(BEN)
Methyl-N-(phenylacetyl)-N-
(26-xylyl)-D-alaninate C20H23NO3 98243-83-5 F 368 -
Boscalid
(BOS)
2-Chloro-N-(4rsquo-
chlorobiphenyl-2-yl)-
nicotinamide
C18H12Cl2N2O 188425-85-6 F 296 -
Carbendazim
(CAR)
Methyl 2-benzimidazole
carbamate C9H9N3O2 10605-21-7 F 148 420
Cyprodinil
(CYP)
4-Cyclopropyl-6-methyl-N-
phenilpyrimidin-2-amine C14H15N3 121552-61-2 F 400 309
Dimethomorph
(DIM)
(2E)-3-(4-chlorophenyl)-3-(34-
dimethoxyphenyl)-1-
(morpholin-4-yl)prop-2-en-1-
one
C21H22ClNO4 110488-70-5 F 268 -13
Fenhexamid
(FEH)
N-(23-dichloro-4-
hydroxyphenyl)-1-methyl-
cyclohexanecarboxamide
C14H17Cl2NO2 126833-17-8 F 351 73
Fenpropidin
(FEP)
1-[(RS)-3-(4-tert-butylphenyl)-
2-methylpropyl]piperidine C19H31N 67306-00-7 F 26 1013
Fluopicolid
(FLU)
26-dichloro-N-[3-chloro-5-
(trifluoromethyl)-2-
pyridylmethyl]benzamide
C14H8Cl3F3N2O 239110-15-7 F 29 -
Imidacloprid
(IMI)
(E)-1-(6-chloro-3-
pyridylmethyl)-N-
nitroimidazolidin-2-
ylideneamine
C9H10ClN5O2 138261-41-3 I 057 -
Iprovalicarb
(IPR)
Isopropyl (S)-2-methyl-1-[1-(p-
tolyl)ethylcarbamoyl]propyl-
carbamate
C18H28N2O3 140923-17-7 F 32 -
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Tabla I1 Estructura clasificacioacuten y propiedades fiacutesico-quiacutemicas de intereacutes para los analitos de estudio
7
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Compuesto Estructura Nombre sistemaacutetico Foacutermula CAS Uso ordflog (kow) pKa
Mandipropamid
(MAN)
2-(4-chlorophenyl)-N-[3-
methoxy-4-(2-
propynyloxy)phenethyl]-2-(2-
propynyloxy)acetamide
C23H22ClNO4 374726-62-2 F 32 -
Metalaxyl
(MET)
N-(26-dimethylphenyl)-N-
(methoxyacetyl)-DL-alanine
methyl ester
C15H21NO4 57837-19-1 F 175 000
Myclobutanil
(MYC)
2-(4-chlorophenyl)-2-(1H-
124-triazol-1-
ylmethyl)hexanentrile
C15H17ClN4 88671-89-0 F 289 230
Penconazol
(PEN)
1-[2-(24-
dichlorophenyl)pentyl]-1H-
124-triazole
C13H15Cl2N3 66246-88-6 F 372 151
Pyraclostrobin
(PYC)
Methyl2-[1-(4-chlorophenyl)-
1H-pyrazol-3-
yloxymethyl]phenylmetoxy-
carbamate
C19H18ClN3O4 175013-18-0 F 399 -
Pyrimethanil
(PYM)
4-6-dimethyl-N-phenyl-2-
pyrimidinamine C12H13N3 53112-28-0 F 284 352
Tebuconazol
(TEC)
1-(4-chlorophenyl)-44-
dimethyl-3-(1H-124-triazol-1-
ylmethyl)-3-pentanol
C16H22ClN3O 107534-96-3 F 370 500
Tebufenozid
(TEF)
35-dimethylbenzoic acid 1-
(11-dimethylethyl)-2-(4-
ethylbenzoyl)hidrazide
C22H28N2O2 112410-23-8 I 425 -
Thiabendazol
(TBZ)
2-(13-thiazol-4-yl)-1H-
benzimidazole C10H7N3S 148-79-8 F 239 473
Thiamethoxam
(TME)
3-[(2-chloro-5-
thiazolyl)methyl]tetrahydro-5-
methyl-N-nitro-4H-135-
oxadiazin-4-imine
C8H10ClN5O3S 153719-23-4 I -013 -
Thiophanate-
methyl
(THI-M)
DimethylNNrsquo-[12-
phenylenebis(azanediylcarbono
thioyl)] dicarbamate
C12H14N4O4S2 23564-05-8 F 145 728
Triadimenol
(TRI)
1-(4-chlorophenoxy)-33-
dimethyl-1-(1H-124-triazol-1-
yl)-2-butanol
C14H18ClN3O2 55219-65-3 F 318
-
ordf Valores para la forma neutra 8
Capiacutetulo I Introduccioacuten
13 Toxicidad de los pesticidas
En los uacuteltimos antildeos el uso indiscriminado de pesticidas de siacutentesis en agricultura ha creado graves problemas de
salud y medioambientales ya que su uso debido al aumento de la poblacioacuten y por consiguiente de la actividad
agraria se ha incrementado considerablemente Durante las tres uacuteltimas deacutecadas una estimacioacuten dada por la
Organizacioacuten Mundial de la Salud y el Programa de las Naciones Unidas para el Medio Ambiente revela que
aproximadamente cerca de 20000 personas al antildeo mueren generalmente agricultores por exposicioacuten continuada
a alguno de estos toacutexicos En la mayoriacutea de los casos los agricultores utilizan los pesticidas de forma que las
cantidades se desviacutean significativamente de las recomendadas ya que asocian cantidades maacutes altas con mayor
efectividad y velocidad de accioacuten El mal uso de dichos toacutexicos se ve en los signos presentes en los ecosistemas
afectados pudiendo llegar a ser perjudiciales para la salud humana Estos riesgos que causan tanto en la salud
como en el medioambiente pueden ser reducidos o en su defecto evitados mediante la educacioacuten sobre este tipo
de toacutexicos con el fin de frenar su uso excesivo y descontrolado [17]
Desde el punto de vista medioambiental los fitosanitarios empleados en un cultivo pueden persistir en los
distintos medios tierra aire o agua y afectar tanto a ecosistemas terrestres como acuaacuteticos En los sistemas
terrestres los suelos son contaminados mediante la aplicacioacuten del toacutexico de forma directa o como deposicioacuten del
resultado de una suspensioacuten aeacuterea Eacutestos pueden persistir desde varios diacuteas hasta varios antildeos ya que el suelo
retiene y moviliza el toacutexico despueacutes de su emisioacuten Los que persisten maacutes tiempo en el medioambiente tienen una
mayor probabilidad de interaccionar con otros elementos del sistema y si su vida media es mayor a la frecuencia
con la que se aplica el pesticida tienden a acumularse tanto en el suelo como en las especies que habitan en eacutel Por
otro lado el agua es contaminada por pesticidas bien por aplicacioacuten directa por estar presentes en las
precipitaciones de la atmoacutesfera o bien por la movilidad que tienen desde el suelo Tanto los pesticidas solubles
como los insolubles interaccionan con los ecosistemas acuaacuteticos los hidrosolubles persisten maacutes tiempo
solubilizados en agua mientras que los otros se asocian a los sedimentos y se concentran en las especies que
habitan el medio acuaacutetico [18]
Como consecuencia de la amplia distribucioacuten de los toacutexicos en aire suelo y agua se produce una acumulacioacuten de
ellos en los elementos que contribuyen a la alimentacioacuten humana ya que su amplio uso hace que el contacto con
los plaguicidas por parte de personas y animales sea inevitable La contaminacioacuten de los alimentos se puede
presentar por aplicacioacuten directa de los pesticidas el uso de eacutestos durante el manejo transporte y almacenamiento
de los productos comestibles o por su acumulacioacuten en la cadena troacutefica Son bioacumulables en el organismo
debido a su caraacutecter lipofiacutelico lo que les confiere una vida media en los tejidos larga La exposicioacuten a pesticidas
persistentes no tiene la misma repercusioacuten en cada uno de los individuos expuestos sino que se considera criacutetica la
exposicioacuten durante la etapas embrionaria fetal y primeros antildeos de vida en doacutende se transmite de madres a hijos
mediante la gestacioacuten y la lactancia como resultado de la acumulacioacuten en el tejido graso de la madre [19]
9
Capiacutetulo I Introduccioacuten
14 Legislacioacuten
El aumento del uso de fitosanitarios en actividades relacionadas con la produccioacuten de alimentos para consumo
humano o animal tambieacuten desembocoacute en una preocupacioacuten social debido a su toxicidad y bioacumulacioacuten En
respuesta la Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura (FAO) en colaboracioacuten
con la Organizacioacuten Mundial de la Salud (OMS) pusieron en marcha un programa Codex Alimentarius cuyo
objetivo a traveacutes de sus normas y coacutedigos de praacutecticas alimentarias internacionales es garantizar la calidad e
inocuidad de los alimentos que estaacuten al alcance de cualquier persona Con estas normas internacionales los
consumidores pueden confiar en la calidad de los alimentos independientemente de su origen geograacutefico [20]
Todos los alimentos destinados al consumo humano o animal en la Unioacuten Europea estaacuten sujetos a un liacutemite
maacuteximo de residuos de plaguicidas para la proteccioacuten de la salud humana y animal Actualmente en lo referente a
legislacioacuten para el control de la cantidad del toacutexico en la uva estaacute vigente el Reglamento 3962005 del Parlamento
Europeo y del Consejo de 23 de febrero de 2005 referido a la regulacioacuten de los liacutemites maacuteximos de residuos de
plaguicidas en alimentos y piensos de origen vegetal y animal El liacutemite maacuteximo de residuos (LMR) se define co-
mo el nivel maacutes alto de un residuo de un pesticida que se tolera de manera legal sobre los alimentos o piensos
cuando se aplican correctamente Las cantidades de residuos que se encuentren deben ser lo maacutes bajas posible
para garantizar la seguridad en la alimentacioacuten de los consumidores Dichos liacutemites maacuteximos de residuos estaacuten
fijados por la Comisioacuten Europea pudieacutendose encontrar en su base de datos LMR [21]
A continuacioacuten en la Tabla I2 se resumen los LMRs de los compuestos de este estudio en uvas de vinificacioacuten
en unidades de mgkg de uva En el caso del vino no hay legislacioacuten en lo referente a estos pesticidas solamente
la recomendacioacuten de no superar el 10 del valor del LMR en uva
Compuesto LMRs (mgkg uva) Compuesto LMRs (mgkg uva)
AME 6 MET 1
BEN 03 MYC 1
BOS 5 PEN 02
CAR 05 PYC 2
CYP 3 PYM 5
DIM 3 TEC 1
FEH 15 TEF 3
FEP 001 TBZ 005
FLU 2 TME 04
IMI 1 THI-M 3
IPR 2 TRI 2
MAN 2
Tabla I2 Liacutemites maacuteximos de residuos permitidos para los compuestos estudiados en uvas
10
Capiacutetulo I Introduccioacuten
2 MEacuteTODOS DE PREPARACIOacuteN DE MUESTRA APLICADOS A MUESTRAS DE VINO
21 Extraccioacuten liacutequido-liacutequido (LLE)
Se entiende por extraccioacuten liacutequido-liacutequido al meacutetodo mediante el cual un analito de intereacutes se separa por el
contacto con otra fase en la cual tiene mayor afinidad de la matriz en la que se halle Los procesos de extraccioacuten
implican dos fases y requieren tres pasos sucesivos mezcla de materia prima y disolvente separacioacuten de las dos
fases despueacutes del contacto y eliminacioacuten del disolvente que contiene el analito [22]
La extraccioacuten liacutequido-liacutequido (LLE) se basa en la distribucioacuten
de un analito entre dos fases liacutequidas inmiscibles en las
cuales analito y matriz tienen solubilidades diferentes
Principalmente una de las fases es un medio acuoso en
general se trata de la muestra y la otra un disolvente
orgaacutenico La selectividad y eficacia de este meacutetodo vienen
determinadas por la eleccioacuten del disolvente y por los factores
que pueden afectar al proceso de equilibrio (pH adiccioacuten de
sales neutras en la fase acuosa para reducir la solubilidad del
analito etc) [23] Esta teacutecnica permite llevar a cabo extracciones para un rango muy amplio de analitos siendo
una de las maacutes antiguas para la preparacioacuten de muestras en el anaacutelisis cualitativo y cuantitativo Ofrece grandes
capacidades de muestreo lineal y cuenta con la ventaja de la cantidad de informacioacuten existente sobre este meacutetodo
[24]
22 Extraccioacuten en fase soacutelida (SPE)
En 1978 aparecieron los primeros cartuchos desechables para la extraccioacuten en fase soacutelida y actualmente casi 40
antildeos despueacutes la extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) es la teacutecnica de preparacioacuten de muestras maacutes empleada en los
laboratorios Es una teacutecnica de preparacioacuten y tratamiento de muestras que se basa en la retencioacuten en una fase
adsorbente del analito de intereacutes presente en una muestra liacutequida que pasa a traveacutes de ella Debido a la variedad de
formatos (discos cartuchos y jeringas) y tipos de adsorbentes (los maacutes comunes carboacuten activo aluacutemina siacutelica gel
silicato de magnesio siacutelices enlazadas y poliacutemeros como por ejemplo estinero-divinilbenceno) o la facilidad de
automatizacioacuten y acoplamiento con otras teacutecnicas como por ejemplo una conexioacuten directa con un sistema de
Figura I4 Fundamentos teoacutericos de la LLE [25]
11
Capiacutetulo I Introduccioacuten
cromatografiacutea este meacutetodo le fue ganando terreno a la LLE Otra ventaja muy importante de la SPE frente a la
LLE es la disminucioacuten en la cantidad de disolvente orgaacutenico empleada Cada vez se va innovando maacutes sobre esta
teacutecnica llegando a encontrarse fases adsorbentes formadas por poliacutemeros capaces de retener en un uacutenico
cartucho un amplio abanico de analitos lipofiacutelicos o hidrofoacutebicos aacutecidos baacutesicos o neutros [26]
El fundamento de esta extraccioacuten como se puede en la Figura I6
consiste en cuatro etapas acondicionamiento adiccioacuten de muestra
retencioacuten y elucioacuten de los analitos de intereacutes En primer lugar antes
de empezar la extraccioacuten se requiere una etapa de acondicionamiento
para preparar el adsorbente haciendo pasar un poco de disolvente
para asiacute interaccionar mejor con la muestra Luego se hace pasar la
muestra liacutequida por la fase soacutelida Idealmente el adsorbente retiene
los analitos selectivamente a medida que va pasando la muestra y la
matriz pasa sin ser retenida Por uacuteltimo los analitos se eluyen del
adsorbente con un disolvente con el que tenga mayor afinidad [27]
23 Teacutecnicas de microextraccioacuten
231 Microextraccioacuten en fase soacutelida (SPME)
En la microextraccioacuten en fase soacutelida (SPME) se utilizan fibras de siacutelice fundida revestidas con un poliacutemero en un
disentildeo en forma de jeringa para la extraccioacuten de los analitos de intereacutes El principio por el que se rige esta
extraccioacuten es el reparto del analito entre la matriz de la muestra y el revestimiento de la fibra mediante un proceso
no competitivo Se trata de un meacutetodo que cuenta con muchas ventajas ya que se elimina completamente el uso de
disolventes y aparte no son necesarios voluacutemenes de muestra grandes pero tambieacuten cuenta con algunas
desventajas ya que tanto la capacidad como la sensibilidad se ven limitadas [29]
En la figura I7 podemos ver las etapas de la extraccioacuten En un
vial cerrado con una caacutepsula y un seacuteptum tenemos la muestra
liacutequida o bien soacutelida que contenga los analitos de intereacutes
volaacutetiles Con la jeringa se perfora el seacuteptum y una vez dentro
se acciona el eacutembolo para la exposicioacuten de la fibra con los
analitos introducieacutendola en la muestra liacutequida o en su defecto
en el espacio de cabeza para la extraccioacuten de analitos volaacutetiles
de una muestra soacutelida Despueacutes de la extraccioacuten dentro del vial
Figura I6 Etapas de una SPE [28]
Figura I7 Etapas de una SPME [30]
12
Capiacutetulo I Introduccioacuten
la fibra se introduce de nuevo en la jeringa y se retira del vial [27]
232 Microextraccioacuten en fase liacutequida (LPME)
La microextraccioacuten en fase liacutequida se desarrolloacute como una alternativa a la LLE para la reduccioacuten en la cantidad de
disolventes orgaacutenicos siendo rentable tanto para el medioambiente como econoacutemicamente Entre las modalidades
maacutes populares de esta teacutecnica se encuentran microextraccioacuten con gota suspendida (SDME) y microextraccioacuten
liacutequido-liacutequido dispersiva (DLLME) En la SDME una gota de disolvente orgaacutenico es expuesta al espacio de
cabeza situado sobre una muestra en un vial dicha gota es suspendida del extremo de una microjeringa Por otro
lado la DLLME sobre una muestra acuosa se inyecta un pequentildeo volumen de una mezcla de disolventes en la
cual es dispersada formando una solucioacuten en la que se establece el equilibrio El disolvente de extraccioacuten debe
presentar una densidad inferior a la de la muestra para facilitar su recuperacioacuten normalmente despueacutes de
centrifugar el vial doacutende se realiza la extraccioacuten [31]
24 QuEChERS
La extraccioacuten QuEChERS de las palabras en ingleacutes Quick Easy Cheap Effective Rugged and Safe es un meacutetodo
de extraccioacuten que se desarrolloacute entre 2000 y 2002 para el anaacutelisis de pesticidas Como su nombre indica raacutepido
faacutecil barato eficaz robusto y seguro son las principales
caracteriacutesticas de esta preparacioacuten de muestra Se realiza en dos
etapas en primer lugar una extraccioacuten simple y una segunda fase
de purificacioacuten En la primera etapa tenemos el vial con la
muestra en el cual se antildeade un disolvente generalmente
acetonitrilo para la extraccioacuten de los analitos de intereacutes en
presencia de diferentes sales (en el meacutetodo original se utiliza
sulfato de magnesio y cloruro de sodio) para facilitar la separacioacuten
de las fases En la segunda parte se realiza la purificacioacuten de la
fraccioacuten del extracto orgaacutenico Para eso se lleva a cabo una
limpieza de los analitos eliminando el agua y los compuestos
presentes en la matriz de la muestra empleando un adsorbente PSA (amina primaria y secundaria) C18 carboacuten
negro grafitizado (GCB) o una combinacioacuten de eacutestas [32]
Figura I8 Etapas de QuEChERS [33]
13
Capiacutetulo I Introduccioacuten
3 METODOLOGIacuteA ANALIacuteTICA PARA LA DETERMINACIOacuteN DE PESTICIDAS
31 Meacutetodos de GC-MS (MSMS)
La combinacioacuten de cromatografiacutea de gases (GC) teacutecnica de separacioacuten con espectrometriacutea de masas (MS) como
sistema de deteccioacuten representa un potente meacutetodo para la identificacioacuten determinacioacuten y cuantificacioacuten de
analitos orgaacutenicos en concentraciones traza presentes en muestras complejas Esta teacutecnica de anaacutelisis cuenta con
muchas ventajas en sensibilidad multifuncionalidad buena reproducibilidad robustez asiacute como facilidad en el
manejo pero con una gran desventaja este meacutetodo no es apto para ser utilizado con todos los analitos sino que
se ve limitado a aquellos que sean termoestables y no se descompongan a temperaturas elevadas antes de ser
volatilizados La muestra es introducida a traveacutes del inyector en el cromatoacutegrafo de gases doacutende impulsada por
una corriente de gas inerte como fase moacutevil pasa a traveacutes de la columna que contiene la fase estacionaria en la
cual se separan los compuestos debido a una distribucioacuten de estos entre fase moacutevil-fase estacionaria Mediante
una interfase son introducidos para su deteccioacuten en el espectroacutemetro de masas que cuenta con una fuente de
iones analizador de masas y un detector [34]
La combinacioacuten de analizadores de masas en taacutendem (MSMS) como sistema de deteccioacuten en GC es una teacutecnica
altamente selectiva mejorando la sensibilidad y la relacioacuten sentildeal-ruido en los espectros experimentando una
mejora por lo que se logran unos liacutemites de deteccioacuten inferiores Esta teacutecnica GC-MSMS comprende maacutes
pasos despueacutes de la separacioacuten por cromatografiacutea se lleva a cabo la deteccioacuten con MSMS que consta de varias
etapas generacioacuten de iones en la fuente de ionizacioacuten seleccioacuten de los iones precursores de una determinada
masa disociacioacuten causada por colisioacuten con moleacuteculas de gas inerte de los iones precursores y por uacuteltimo el
anaacutelisis de los fragmentos en relacioacuten a su masacarga (mz) En el caso de que un espectro de MS no permita
confirmar la identidad de un determinado compuesto quiacutemico la obtencioacuten de su espectro de MSMS permite
mejorar la confianza en su identificacioacuten [36]
Figura I9 Acoplamiento GC-MS [35]
14
Capiacutetulo I Introduccioacuten
32 Meacutetodos LC-MS (MSMS)
La teacutecnica de LC-MS se desarrolloacute para minimizar las desventajas del acoplamiento GC-MS y asiacute resolver los
problemas que este uacuteltimo acarreaba con los analitos termolaacutebiles permitiendo el anaacutelisis de eacutestos sin tener que
realizar una etapa previa de derivatizacioacuten La interfase de unioacuten de cromatografiacutea liacutequida (LC) con espectrometriacutea
de masas (MS) acarrea una dificultad significativa siendo responsable de transformar los analitos que se
encontraban en la fase moacutevil liacutequida en iones en fase gas sin que se produzca su degradacioacuten teacutermica La
sensibilidad de las determinaciones por LC-MS va a depender de la interfase empleada Las principales interfases
empleadas actualmente son las ionizaciones a presioacuten atmosfeacuterica electrospray (ES) e ionizacioacuten quiacutemica a
presioacuten atmosfeacuterica (APCI) [37]
Con los antildeos la cromatografiacutea liacutequida se ha ido innovando y mediante la disminucioacuten del tamantildeo de partiacutecula en
la columna se fue mejorando la eficiencia asiacute como aumentando la selectividad y resolucioacuten del pico en el
cromatograma Para este nuevo sistema llamado UPLC Ultra-Performance Liquid Chromatography se desarrolloacute
una nueva instrumentacioacuten capaz de trabajar a altas presiones generando flujos mayores sin peacuterdidas de
resolucioacuten utilizando inyectores automaacuteticos maacutes raacutepidos y detectores con mayor velocidad de adquisicioacuten de
datos disminuyendo asiacute el tiempo de anaacutelisis [39]
33 Espectrometriacutea de masas
La espectrometriacutea de masas es el meacutetodo de deteccioacuten y cuantificacioacuten maacutes fiable a la hora de la determinacioacuten de
compuestos en matrices complejas (tales como alimentos) ya que otros detectores maacutes tradicionales como UV-
visible o fluorescencia cuentan con una gran incertidumbre en los resultados llegando incluso a ofrecer falsos
Figura I10 Acoplamiento LC-MS [38]
15
Capiacutetulo I Introduccioacuten
positivos o negativos Un espectrometro de masas cuenta con un dispositivo de introduccioacuten de muestra una
caacutemara de ionizacioacuten un sistema para la aceleracioacuten de los iones uno o varios analizadores de masas y un detector
[40]
El fundamento de la espectrometriacutea de masas se basa en la separacioacuten de iones en base a la relacioacuten masacarga
(mz) El proceso consta fundamentalmente de cuatro etapas La
primera es la ionizacioacuten de la muestra los iones formados se aceleran
debido a la accioacuten de un campo eleacutectrico variable separacioacuten de los
iones seguacuten su masacarga deteccioacuten de los iones y produccioacuten de la
sentildeal eleacutectrica El analizador de masas es el encargado de la separacioacuten
de los iones en funcioacuten a su mz entre los que maacutes destacan
analizador de masas cuadrupolar que dispersa simultaacuteneamente todos
los iones en funcioacuten de la relacioacuten mz analizador de masas de
tiempo de vuelo (TOF) consta de un tubo a alto vaciacuteo sobre el que no
actuacutea ninguacuten campo eleacutectrico al cual llegan todos los iones acelerados con la misma energiacutea cineacutetica y en el tubo
las velocidades variacutean seguacuten mz y analizador de trampa de iones en doacutende los iones gaseosos quedan aislados
durante largos periacuteodos de tiempo por la accioacuten del campo eleacutectrico [41]
4RESUMEN BIBLIOGRAacuteFICO DE LAS TEacuteCNICAS DE EXTRACCIOacuteN Y
DETERMINACIOacuteN DE PESTICIDAS EN VINO
En la bibliografiacutea se han descrito diversas teacutecnicas y diferentes combinaciones entre teacutecnicas de extraccioacuten y
distintas teacutecnicas de cuantificacioacuten e identificacioacuten para esos analitos Entre estas teacutecnicas los valores de los liacutemites
de cuantificacioacuten (LOQs) y las recuperaciones relativas pueden diferir en el resultado en un rango de valores asiacute
como el tiempo total empleado para el anaacutelisis y para la preparacioacuten de la muestra
Por lo general el meacutetodo de extraccioacuten de los analitos de intereacutes maacutes empleado es la extraccioacuten en fase soacutelida
(SPE) la cuaacutel le ha estado ganando terreno a la extraccioacuten liacutequido-liacutequido aunque tambieacuten se estaacute viendo cada vez
maacutes desplazada debido al creciente uso de la teacutecnica QuEChERS
Figura I11 Etapas de la espectrometriacutea de masas [42]
16
Capiacutetulo I Introduccioacuten
En el estudio de ECONOMOU et al [43] realizado en el antildeo 2009 en Grecia se empleoacute la extraccioacuten en fase
soacutelida con deteccioacuten en cromatografiacutea de liacutequidos acoplada a espectrometriacutea de masas en taacutendem (SPE-LC-ESI-
MSMS) Para la preparacioacuten de la muestra diluyeron 10 mL de vino (tanto blanco como tinto) a un volumen
final de 100 mL con agua ultrapura antes de la SPE Determinaron las recuperaciones de la extraccioacuten para dos
niveles de concentracioacuten 0010 y 0050 mgL realizando 8 medidas diarias durante 3 diacuteas consecutivos
encontraacutendose unos valores que variacutean dentro del rango 70-110 para todos los pesticidas en los dos niveles Para
la determinacioacuten y cuantificacioacuten de 46 pesticidas emplearon la teacutecnica de cromatografiacutea de liacutequidos con
espectrometriacutea de masas con un volumen de inyeccioacuten de 20 microL y un flujo de fase moacutevil de 02 mLmin
aclopada a espectrometriacutea de masas en taacutendem
Con la misma teacutecnica de extraccioacuten PELAJIĆ et al [45] durante el antildeo 2015 en Croacia llevaron a cabo la
determinacioacuten de 25 residuos de plaguicidas en vino tinto El meacutetodo que desarrollaron para dicha finalidad fue el
acoplamiento SPE-GC-MS Para la preparacioacuten de la muestra emplearon 10 mL de vino diluidos 11 con agua
ultrapura hasta un volumen final de 20 mL Calcularon las recuperaciones de la extraccioacuten y se encontroacute un rango
para todos los pesticidas en las muestras de 70-120 Para la determinacioacuten en cromatografiacutea de gases-
espectrometriacutea de masas se empleoacute un volumen de inyeccioacuten de 5 μL y un flujo de fase moacutevil de 10 mLmin
Mediante el acoplamiento de teacutecnicas SPE dispersiva-GC-MS WALORCZYK et al [48] en el antildeo 2011 en
Polonia llevaron a cabo la cuantificacioacuten de 160 pesticidas en diferentes clases de vino tinto rosado y blanco Con
10 g de vino y 10 mL de acetonitrilo se realizaron pruebas de recuperacioacuten en la fase de extraccioacuten para vino
tinto con los niveles de concentracioacuten 001 005 y 02 mgkg y para los vinos rosado y blanco con el nivel de
concentracioacuten 005mgkg y encontraron que a todos los niveles de concentracioacuten los valores de recuperacioacuten
rondan el rango 80-110 Para la teacutecnica cromatograacutefica se utilizoacute un volumen de inyeccioacuten de 5 microL
El acoplamiento LLE-SPE-LCDAD fue desarrollado por GONZAacuteLEZ-RODRIacuteGUEZ et al [50] en el antildeo
2010 en la provincia de Orense para la determinacioacuten de nuevos fungicidas propuestos para combatir el hongo
que provoca la enfermedad del mildium En la preparacioacuten de la muestra emplearon 15 mL de vino blanco para la
extraccioacuten en la cual fueron calculadas las recuperaciones relativas para dos niveles de concentracioacuten 005 y 05
mgkg en donde se establece un rango de entre 70-110 para todos los analitos Para la determinacioacuten mediante
cromatografiacutea de liacutequidos se empleoacute un volumen de inyeccioacuten de 2 μL y como meacutetodo de deteccioacuten utilizaron un
detector de diodos array
La microextraccioacuten sorptiva en fase soacutelida fue empleada en la publicacioacuten de FONTANA et al [44] junto con un
acoplamiento entre cromatografiacutea de liacutequidos y espectrometriacutea de masas para la determinacioacuten de 15 fungicidas
en vino realizada durante el 2010 en el noroeste de Espantildea Para la preparacioacuten de la muestra emplearon 10 mL
17
Capiacutetulo I Introduccioacuten
de vino diluiacutedos con el mismo volumen de agua ultrapura y un sorbente en forma de disco de silicona con un
volumen de 12 microL La recuperacioacuten de la extraccioacuten se calculoacute para vino tinto (Menciacutea) y vino blanco (Godello)
realizando tres replicas dentro de un mismo diacutea para los niveles de concentracioacuten 10 y 50 ngmL y nueve reacuteplicas
realizando el anaacutelisis en tres diacuteas consecutivos para el nivel de concentracioacuten de 25 ngmL y los resultados
obtenidos dan unos valores de recuperacioacuten dentro del rango 75-117 En el sistema LC-QTOF-MS el volumen
de inyeccioacuten fue de 15 microL
El otro meacutetodo de extraccioacuten mencionado anteriormente es QuEChERS estaacute en auge como meacutetodo de extracioacuten
de residuos de pesticidas en matrices como la del vino o la uva ya que incrementa la velocidad del anaacutelisis y reduce
el efecto de matriz BUERGE et al [46] seguido de una deteccioacuten mediante GC-MSMS realizaron una estapa
de extraccioacuten QuEChERS con alguna modificacioacuten acetato de sodio en lugar de cloruro soacutedico y acetato de etilo
en lugar de acetonitrilo utilizando 5 g de uva para la determinacioacuten de residuos de 4 pesticidas durante el antildeo
2016 Las recuperaciones de extraccioacuten resultaron ser valores entre 91-149 en uva a distintos niveles de
concentracioacuten 005 05 y 5 mgkg
Para la determinacioacuten de Ametoctradin HU et al [47] llevaron a cabo una extraccioacuten QuEChERS empleando 10
g de uva con deteccioacuten mediante el acoplamiento UPLC-MSMS utilizando un volumen de inyeccioacuten de 5 μL y
un flujo de fase moacutevil de 03 mLmin Las recuperaciones de la extraccioacuten se calcularon para tres niveles de
concentracioacuten 1 10 100 μgL de dos formas distintas en tres diacuteas consecutivos realizando 5 reacuteplicas al diacutea o en
dentro de un mismo diacutea realizando 15 reacuteplicas los resultados de todos los caacutelculos se encuentran dentro del rango
818-1001
Siguiendo con el mismo modo de extraccioacuten GUO et al [49] publicaron sus estudios para la determinacioacuten de
50 pesticidas y 12 adulterantes en vino tinto Para la extraccioacuten QuEChERS se utilizaron 10 mL de vino tinto con
10 mL de acetonitrilo y calcularon las recuperaciones para tres niveles de concentracioacuten 50 100 y 250 ngmL
encontraacutendose un rango de valores entre 75-120 El meacutetodo de deteccioacuten se llevoacute a cabo mediante un anaacutelisis
directo en tiempo real junto con espectrometriacutea de masas en tandem con un cuadrupolo (DART-MSMS) la
teacutecnica DART es un meacutetodo raacutepido para cribar y cuantificar los analitos de estudio que prescinde de la etapa de
separacioacuten cromatograacutefica
A continuacioacuten se recogen en la Tabla I3 los liacutemites de cuantificacioacuten (LOQs) de los analitos de intereacutes en este
trabajo caacutelculados por los diferentes meacutetodos encontrados en bibliografiacutea citados anteriormente en este apartado
18
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Tabla I3 LOQs de los analitos de intereacutes descritos para los distintos meacutetodos encontrados en la bibliografiacutea
Compuesto LOQs
Compuesto LOQs
V Blanco V Tinto Uva V Blanco V Tinto Uva
AME - - 0032μgkg[47] MET 86 μgL[43]
22 μgL[44]
89 μgL[43]
22 μgL[44]
5 μgL[45]
259 ngmL[49]
001mgkg[48]
BEN 02 μgL[44]
0001 mgL[50]
02 μgL[44]
001 μgL[45]
280ngmL[49]
005 mgkg[48] MYC 30 μgL[43]
08 μgL[44]
36 μgL[43]
10 μgL[44]
025 μgL[45]
331ngmL[49]
001 mgkg[48]
BOS 0065 mgL[50] 05 μgL[45]
1076 ngmL[49] 001 mgkg[48] PEN
56 μgL[43]
05 μgL[44]
49 μgL[43]
04 μgL[44]
220ngmL[49]
001 mgkg[48]
CAR - 386 ngmL[49] - PYC 0003mgL[50] 07 μgL[45] 001 mgkg[48]
CYP 15 μgL[43]
04 μgL[44]
0001 mgL[50]
22 μgL[43]
06 μgL[44]
312 ngmL[49]
001 mgkg[48] PYM 17 μgL[43] 22 μgL[43]
10 μgL[45] 001 mgkg[48]
DIM 18 μgL[43] 20 μgL[43] 001 mgkg[48] TEC 03 μgL[44]
03 μgL[44]
10 μgL[45]
160ngmL[49]
001 mgkg[48]
FEH 17 μgL[43] 22 μgL[43]
938 ngmL[49] 001 mgkg[48] TEF - 876ngmL[49] -
FEP - - 002mgkg[46] TBZ 15μgL [43] 29μgL[43] 001 mgkg[48]
FLU 005 μgL[45] TME - 25 μgL[45] 001 mgkg[48]
IMI 21 μgL[43] 22 μgL[43]
225 ngmL[49] - THI-M 92 μgL[43] 89 μgL[43] -
IPR 07 μgL[44] 07 μgL[44] 001 mgkg[48] TRI 10 μgL[44] 12 μgL[44] 001 mgkg[48]
MAN 0011 mgL[50] - -
5 DISTRIBUCIOacuteN DE PESTICIDAS EN VINOS COMERCIALES
En algunos de los meacutetodos descritos en el apartado anterior se procesaron vinos comerciales encontraacutendose
resultados positivos para muchos residuos de pesticidas y algunos hasta en gran concentracioacuten
ECONOMOU et al [43] mediante el meacutetodo LC-ESI-MSMS realizaron el anaacutelisis de 60 muestras de vino tinto
y blanco recogidos en supermercados locales en Grecia a lo largo de un antildeo El meacutetodo se habiacutea desarrollado
19
Capiacutetulo I Introduccioacuten
para la determinacioacuten de 46 pesticidas pero la mayoriacutea se encuentran con una concentracioacuten por debajo de
001mgL solo ocho plaguicidas se obtuvieron con resultados de concentracioacuten mayores Se muestran los
resultados en la Tabla I4 de los analitos de intereacutes en este estudio
Tabla I4 Nuacutemero de muestras positivas de distintos pesticidas en el anaacutelisis de 60 muestras de vino [43]
Compuesto Positivos con concentracioacuten entre 001-01
mgL
Positivos con concentracioacuten entre 01-1
mgL
PYM 2 (3) 2 (3)
MYC 2 (3) 0 (0)
CAR 11 (18) 7 (12)
THI-M 7 (12) 5 (8)
FEH 5 (8) 0 (0)
MET 1 (2) 0 (0)
Mediante el meacutetodo de microextraccioacuten en fase soacutelida-LC-TOF-MS FONTANA et al [44] aplicaron el
desarrollo del procedimiento a un total de 12 vinos joacutevenes elaborados en el 2010 y correspondientes a diferentes
denominaciones geograacuteficas del noroeste de Espantildea En la Tabla I5 se muestran los datos que han obtenido
Tabla I5 Determinacioacuten de fitosanitarios en vinos comerciales mediante Microextraccioacuten en fase soacutelida-LC-TOF-MS
Valores de concentracioacuten en ngmL [44]
Pesticidas
W 1
Albarintildeo
W5
Ribeiro
W6
Valdeorras
R1
Ribeira Sacra
R3
Ribeiro
R4
Valdeorras
MET 404plusmn06 223plusmn05 311plusmn007 25plusmn03 31plusmn03 74plusmn10
TRI nd nd 36plusmn06 nd nd ltLOQ
IPR 394plusmn03 324plusmn02 324plusmn02 071plusmn007 31plusmn02 28plusmn05
MYC nd nd nd ltLOQ 39plusmn02 nd
TEC 25plusmn01 nd nd nd nd nd
CYP 179plusmn08 ltLOQ ltLOQ 562plusmn002 083plusmn001 nd
BEN 042plusmn001 nd ltLOQ nd 032plusmn001 ltLOQ
ndNo detectados ltLOQ por debajo del liacutemite de cuantificacioacuten del meacutetodo los coacutedigos W y R corresponden respecti-vamente a los vinos blanco y tinto
20
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Por uacuteltimo PELAJIĆ et al [45] aplicaron su meacutetodo SPE dispersiva-GC-MS mediante el cual determinaron 25
residuos de plaguicidas en vino tinto a un total de 32 muestras de vino adquiridos en supermercados locales de
Croacia pero de diversos oriacutegenes de procedencia Los resultados que han obtenido se muestran en la Tabla I6
en doacutende un total de 15 plaguicidas han sido detectados y 7 de los cuales se encontraban en una alta
concentracioacuten
Tabla I6 Resultados de los vinos con positivos en pesticidas y sus concentraciones [45]
Vino Paiacutes Residuos de pesticidas (mgKg)
Tinto Francia DIM (0013) MET (0009) IPR (001)
Tinto Alemania BOS (0011)
Tinto Alemania IPR (0009)
Tinto Macedonia MET (0015)
Tinto Moldavia IPR (0008)
Tinto Polonia MET (004)
Tinto Rumania PYM (0058)
Tinto Espantildea TRI (0005) MET (0011)
Tinto Estados Unidos BOS (001)
Rosado Francia BOS (0005)
Blanco Chile TEC (0008)
Blanco Georgia MET (0057)
Blanco Alemania DIM (001) IPR (0054) PYM (0056)
Blanco Sudaacutefrica DIM (0011) IPR (0011)
21
Capiacutetulo II Objetivos y discusioacuten
CAPIacuteTULO II OBJETIVOS Y DISCUSIOacuteN
El objetivo principal que se persigue en este trabajo es el desarrollo de un meacutetodo analiacutetico raacutepido basado en la
extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) y deteccioacuten mediante cromatografiacutea de liacutequidos en la modalidad de UPLC
acoplada a la espectrometriacutea de masas en taacutendem (UPLC-MSMS) para la determinacioacuten multianalito de residuos
de fitosanitarios principalmente fungicidas aunque tambieacuten alguacuten insecticida en muestras de vino blanco y tinto
Para llevar a cabo la finalidad de lo dicho se consideran unos objetivos maacutes especiacuteficos
Minimizar la manipulacioacuten de la muestra para asiacute reducir la cantidad de disolventes y tiempo empleado
Optimizacioacuten de los factores que afectan en la extraccioacuten en la SPE tales como tipo y cantidad de
adsorbente volumen de eluyente etc
Estudio de las condiciones en UPLC-MSMS para una separacioacuten y cuantificacioacuten oacuteptimas
Caracterizacioacuten y validacioacuten del meacutetodo propuesto
Por uacuteltimo una vez cumplidos todos los objetivos anteriores y fijadas las condiciones oacuteptimas el meacutetodo
estudiado se aplica en el anaacutelisis de muestras de vino comercial (blanco y tinto) para determinar si se encuentran
residuos presentes asiacute como conocer en queacute concentracioacuten se encuentran los pesticidas objeto de este estudio
22
Capiacutetulo III Parte experimental
CAPIacuteTULO III PARTE EXPERIMENTAL
1 MATERIAL Y REACTIVOS
11 Material
Material de vidrio de uso comuacuten en el laboratorio vasos de precipitados matraces aforados etc
Micropipetas automaacuteticas de 20-200 microL 20-200 microL 100-1000 microL 1000-5000 microL Eppendorf
Puntas de plaacutestico para micropipetas
Encapsulador y desencapsulador
Soportes y pinzas
Viales de 15 mL transparentes para muestreador automaacutetico de cromatografiacutea (Sugelabor)
Caacutepsulas de aluminio con seacuteptum de Tefloacuten (Sugelabor) y tapones pre-slit para viales
Tubos y conectores de tefloacuten
Cartuchos de divinilbenceno-N-vinilpirrolidona 200 mg Oasis HLB Waters
Cartuchos de divinilbenceno-N-vinilpirrolidona funcionalizados con grupos amina cuaternaria 150 mg
Oasis MAX Waters
Cartuchos de divinilbenceno-N-vinilpirrolidona 60 mg Oasis HLB Waters
12 Reactivos y disolventes
Agua ultrapura Milli-Q
Aacutecido foacutermico (Sigma Aldrich) 95
Acetonitrilo (LichrosolvregMerck) Gradient grade for liquid chromatography
Metanol (LichrosolvregMerck) Gradient grade for liquid chromatography
Etanol (LichrosolvregMerck) Gradient grade for liquid chromatography
13 Patrones
Ametoctradin (AME) Dr Ehrenstrorfer 990
Benalaxyl (BEN) Pestanal Sigma- Aldrich 999
23
Capiacutetulo III Parte experimental
Boscalid (BOS) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Carbendazim (CAR) Pestanal Sigma- Aldrich 992
Cyprodinil (CYP) Pestanal Sigma- Aldrich 998
Dimethomorph (DIM) mezcla de isoacutemeros E + Z Pestanal Sigma- Aldrich 989
Fenhexamid (FEH) Pestanal Sigma- Aldrich 997
Fenpropidin (FEP) Dr Ehrenstrorfer 980
Fluopicolide (FLU) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Imidacloprid (IMI) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Iprovalicarb (IPR) mezcla de isoacutemeros Pestanal Sigma- Aldrich 985
Mandipropamid (MAN) Pestanal Sigma- Aldrich 991
Metalaxyl (MET) Pestanal Sigma- Aldrich 990
Myclobutanil (MYC) Pestanal Sigma- Aldrich 994
Penconazole (PEN) Pestanal Sigma- Aldrich 991
Pyraclostrobin (PYC) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Pyrimethanil (PYM) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Tebuconazol (TEC) Pestanal Sigma- Aldrich 996
Tebufenozide (TEF) Dr Ehrenstrorfer 988
Thiabendazole (TBZ) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Thiamethoxam (TME) Pestanal Sigma- Aldrich 996
Thiophanate-methyl (THI-M) Dr Ehrenstrofer 990
Triadimenol (TRI) Mezcla de diastereoisoacutemeros Pestanal Sigma- Aldrich 994
14 Patrones internos
Carbendazim-d3 (CAR-d3) Pestanal Sigma- Aldrich 998
Cyprodinil-d5 (CYP-d5) Pestanal Sigma- Aldrich
Imidacloprid-d4 (IMID-d4) Pestanal Sigma- Aldrich
Metalaxyl 13C6 (MET13C6) Pestanal Sigma-Aldrich 99
24
Capiacutetulo III Parte experimental
15 Gases
Nitroacutegeno 99999 como gas de colisioacuten en el espectroacutemetro de masas
Nitroacutegeno en los sistemas de concentracioacuten y secado por corriente de nitroacutegeno de los cartuchos SPE
2 INSTRUMENTACIOacuteN
Balanza analiacutetica de precisioacuten Sartorius
Granatario Sartorius
Bantildeo de ultrasonidos P-Selecta
Equipo de purificacioacuten de agua Millipore modelo Milli-Q gradient A-10ZMQSSVOT4
Estacioacuten de concentracioacuten por corriente de nitroacutegeno Mini-Vap Supelco
Sistema de secado de cartuchos de SPE por corriente de nitroacutegeno VisiDry Supelco
Sistema distribuidor de vaciacuteo Visiprep reg Supelco
Cromatoacutegrafo de liacutequidos de ultra-alta resolucioacuten Waters AcquityUPLC reg y espectroacutemetro de masas
Acquity TQD con analizador de triple quadrupolo (QqQ) equipado con una fuente de ionizacioacuten a
presioacuten atmosfeacuterica del tipo Z-spray (ESI)
3 PREPARACIOacuteN DE LAS DISOLUCIONES
Los patrones de pesticidas se prepararon individualmente a partir de los compuestos soacutelidos comerciales por
pesada excepto en el caso del fenpropidin (FEP) que se preparoacute a partir del compuesto liacutequido comercial Estos
compuestos soacutelidos se disolvieron en metanol y se obtuvieron unas disoluciones iniciales con concentraciones
recogidas en la Tabla III1
25
Capiacutetulo III Parte experimental
Tabla III1 Concentracioacuten de las disoluciones patroacuten stock
Compuesto Concentracioacuten (microgmL) Compuesto Concentracioacuten (microgmL)
AME 102201 MET 118912
BEN 138330 MYC 102017
BOS 99474 PEN 129791
CAR 17105 PYC 104581
CYP 131075 PYM 141386
DIM 103009 TEC 134729
FEH 99584 TEF 137769
FEP 100000 TBZ 105928
FLU 126859 TME 112283
IMI 101123 THI-M 124202
IPR 106739 TRI 118933
MAN 101021
4 LAVADO DEL MATERIAL
La limpieza del material de vidrio utilizado en el laboratorio se realizoacute utilizando jaboacuten y aclarando con agua de
grifo Luego en primer lugar se realiza un enjuague con agua Milli-Q finalmente un segundo enjuague con
acetona para eliminar posibles restos de compuestos orgaacutenicos y se deja secar sobre papel
Para la limpieza de los conectores de tefloacuten empleados en el proceso de SPE se introducen en un vaso de
precipitados con metanol y este en un bantildeo de ultrasonidos durante 10 minutos Al finalizar con el bantildeo de
ultrasonidos se realiza un enjuague con acetona y se pone a secar
5 EXTRACCIOacuteN DE MUESTRAS MEDIANTE SPE
El meacutetodo de extraccioacuten utilizado para la determinacioacuten de pesticidas fue la extraccioacuten en fase soacutelida (SPE)
mediante cartuchos Oasis HLB de 200 mg A continuacioacuten se describe el protocolo de extraccioacuten en las
condiciones oacuteptimas
26
Capiacutetulo III Parte experimental
1 Acondicionamiento del cartucho Oasis HLB de 200 mg con 2 mL de acetonitrilo seguidos de otros 2 mL de
vino sinteacutetico formado por la mezcla etanolagua MilliQ (1288)
2 Paso de la muestra 2 mL de vino diluiacutedos con 2 mL de agua MilliQ a traveacutes del cartucho por gravedad
3 Lavado del cartucho con 2 mL de agua MilliQ
4 Secado del cartucho durante 45 minutos en el VisiDry mediante el paso de una corriente de nitroacutegeno
5 Elucioacuten del cartucho con la mezcla metanolacetonitrilo en proporcioacuten 2080 hasta un volumen final de 2
mL
6 Anaacutelisis mediante cromatografiacutea liacutequida acoplada a espectrometriacutea de masas en taacutendem UPLC-MSMS
(volumen de inyeccioacuten 15 microL)
Representacioacuten esquematizada en la Figura III1
Figura III1 Extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) de las muestras de vino
27
Capiacutetulo III Parte experimental
6 CONDICIONES DE DETERMINACIOacuteN MEDIANTE UPLC-MSMS
En la Tabla III2 se indican las condiciones utlizadas en la determinacioacuten de los pesticidas de intereacutes mediante
LC-MSMS y en la Tabla III3 se muestra el gradiente de la fase moacutevil utilizado para la separacioacuten
cromatograacutefica
Tabla III2 Condiciones experimentales de determinacioacuten en LC-MSMS
UPLC Acquity UPLC-I-Class IVD System
bull Columna cromatograacutefica Zorbax Eclipse Plus C18 Rapid Resolution HD
Fase estacionaria C18
Dimensiones 21 x 50 mm
Tamantildeo de partiacutecula 18 microm
Temperatura del horno 40ordmC
bull Inyector
Volumen de inyeccioacuten 15 microL
bull Fase moacutevil
Flujo 04 mLmin
Fase acuosa (A) Agua MilliQ con 01 aacutecido foacutermico
Fase orgaacutenica (B) Acetonitrilo con 01 aacutecido foacutermico
MSMS WatersXevo TQD
Modo de ionizacioacuten ESI positivo
Voltaje del capilar 15 kV
Voltaje de cono 50 V
Temperatura de gas de secado (N2) 450ordmC
Flujo de gas de secado (N2) 1000 Lh
Modo de adquisicioacuten Centroide
Tabla III3 Gradiente de fase moacutevil utilizado en la separacioacuten cromatograacutefica (LC)
Tiempo min 0 13 28 64 75 76 10
A 98 50 50 0 0 98 98
B 2 50 50 100 100 2 2
28
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
CAPIacuteTULO IV RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
1 IDENTIFICACIOacuteN DE LOS COMPUESTOS
Para empezar el estudio en primer lugar se realizoacute la caracterizacioacuten de las condiciones de determinacioacuten de los
analitos en el modo Multiple Reaction Monitoring (MRM) mediante UPLC-ESI-MSMS Para llevarla a cabo se
tomaron patrones individuales de cada fitosanitario y mediante infusioacuten se estudiaron las posibles transiciones y
voltajes oacuteptimos para su determinacioacuten (Tabla IV1)
La ionizacioacuten por electrospray (ESI) se estudioacute tanto en modo positivo como en modo negativo encontraacutendose
que para todos los pesticidas de nuestro intereacutes se obteniacutea sentildeal en el modo positivo mientras el modo negativo
no presentaba respuesta significativa
A continuacioacuten se estudia el efecto del voltaje de cono en la respuesta del ioacuten molecular [M+H]+ aumentaacutendolo
hasta alcanzar el valor maacuteximo de la sentildeal correspondiente a dicho ioacuten y luego se optimiza la energiacutea de colisioacuten
variaacutendola para cada analito hasta obtener la sentildeal de mayor intensidad para cada uno de los iones producto Por
uacuteltimo una vez optimizado el voltaje de cono y la energiacutea de colisioacuten se seleccionan las dos transiciones maacutes
intensas para llevar a cabo la cuantificacioacuten y cualificacioacuten de cada analito en modo MRM Este procedimiento se
realizoacute para la totalidad de los compuestos confirmando los datos obtenidos con los facilitados por la base de
datos Quanpedia que estaacute disponible en el software del equipo utilizado para algunos de los compuestos
considerados
Compuesto Tr (min) Ion precursor (mz Da)
Voltaje de cono (V)
Ion producto 1 (CEv)
cuantificacioacuten
Ion producto 2 (CEv)
cualificacioacuten
Relacioacuten IP2IP1
AME 325 2760 60 176 (35) 70 (50) 016
BEN 485 3261 26 148 (20) 91 (34) 067
BOS 387 3429 41 140 (20) 307 (20) 011
CAR 167 1921 33 160 (18) 132 (28) 014
CYP 311 2260 56 93 (33) 108 (25) 061
DIM 322 3881 40 301 (20) 165 (30) 057
FEH 386 3021 41 97 (22) 55 (38) 044
FEP 257 2742 55 147 (28) 86 (28) 093
FLU 401 3830 40 173 (20) 365 (15) 010
IMI 218 2561 34 209 (15) 175 (20) 091
IPR 358 3211 28 119 (16) 203 (10) 042
Tabla IV1 Tiempos de retencioacuten (Tr) relacioacuten de iones precursores (mz) voltaje de cono (V) energiacuteas de colisioacuten (CE) y relacioacuten de intensidades entre transiciones (IP2IP1)
29
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Compuesto Tr (min) Ion precursor (mz Da)
Voltaje de cono (V)
Ion producto 1 (CEv)
cuantificacioacuten
Ion producto 2 (CEv)
cualificacioacuten
Relacioacuten IP2IP1
MAN 392 4120 25 328 (16) 125 (35) 063
MET 283 2801 26 220 (13) 192 (17) 057
MYC 365 2891 34 70 (18) 125 (32) 029
PEN 417 2840 34 70 (16) 159 (34) 031
PYC 523 3881 31 194 (12) 163 (25) 066
PYM 266 2000 51 107 (24) 82 (24) 071
TEC 397 3080 40 70 (22) 125 (40) 007
TEF 473 3531 19 133 (20) 297 (8) 072
TBZ 182 2020 51 175 (25) 131 (30) 062
TME 203 2920 28 211 (12) 132 (22) 047
THI-M 257 3430 28 151 (46) 93 (19) 0001
TRI 319 2961 21 70 (10) 99 (15) 013
El dwell time para cada una de las transiciones se ajustoacute de manera automaacutetica por el software (MassLinx) con
objeto de obtener doce puntos espectrales por compuesto tomando un valor promedio de cuatro segundos como
ancho de pico a liacutenea de base
2 CARACTERIZACIOacuteN DEL PROCEDIMIENTO DE DETERMINACIOacuteN (UPLC-ESI-
MSMS)
Una vez optimizados los paraacutemetros que afectan a la separacioacuten cromatograacutefica (UPLC) y a la determinacioacuten por
espectrometriacutea de masas en taacutendem (MSMS) se lleva a cabo la evaluacioacuten de la repetibilidad de inyeccioacuten y
determinacioacuten en esas condiciones Se expresa por medio de la desviacioacuten estaacutendar relativa (RSD) paraacutemetro que
nos indica el grado de correlacioacuten que existe entre varias medidas del mismo patroacuten realizadas por el mismo
operador en el laboratorio y en el mismo equipo de medida a lo largo de un diacutea Para el estudio se realizan diez
inyecciones con volumen de 15 microL de dos patrones con distintos niveles de concentracioacuten 5 y 20 ngmL Los
datos de RSD (Tabla IV2) para las aacutereas de pico de los analitos se situacutean para el nivel de concentracioacuten 5 ngmL
en el rango 2-13 y en el nivel de concentracioacuten 20 ngmL en el rango 1-7
30
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten Tabla IV2 Desviacioacuten estaacutendar relativa (RSD) del aacuterea de pico (transicioacuten de cuantificacioacuten) para evaluar la repetivilidad del proceso de LC-MSMS
Compuesto RSD
5 ngmL
RSD
20 ngmL Compuesto
RSD
5 ngmL
RSD
20 ngmL
AME 5 2 MET 3 2
BEN 2 2 MYC 9 2
BOS 4 5 PEN 4 4
CAR 4 2 PYC 3 1
CYP 5 7 PYM 7 3
DIM 6 5 TEC 3 2
FEH 7 4 TEF 4 2
FEP 4 2 TBZ 2 1
FLU 5 3 TME 6 6
IMI 13 7 THI-M a 6
IPR 8 2 TRI 8 6
MAN 3 2
A continuacioacuten tambieacuten se evaluoacute la repetibilidad de los tiempos de retencioacuten (Tr) para diez inyecciones de
patrones a los dos niveles de concentracioacuten 5 y 20 ngmL situaacutendose las RSD para todos los compuestos en el
rango 01-03 En base a este dato la ventana de tiempo en la que se registran las transiciones de MRM de cada
compuesto se fijoacute en 05 min lo que es lo mismo 025 min alrededor del valor medio de su tiempo de retencioacuten
Por otro lado la linealidad del meacutetodo se estudioacute a nueve niveles de concentracioacuten diferentes comprendidos ente
los niveles 05 ngmL y 200 ngmL mediante la inyeccioacuten de disoluciones patroacuten de los distintos compuestos de
estudio Se realizoacute una evaluacioacuten sin y otra con patroacuten interno (IS) antildeadiendo una concentracioacuten fija de patrones
internos a nivel de 25 ngmL y pudimos observar que los resultados mejoran notablemente al realizar una
correccioacuten con el IS En la Tabla IV3 se muestran los coeficientes de determinacioacuten (R2) obtenidos al realizar la
correccioacuten mediante IS observando que para todos los compuestos excepto para THI-M y para TRI los
coeficientes de correlacioacuten son superiores a 0990 por lo que existe una respuesta lineal en el rango de
concentraciones que hemos estudiado
Aparte del estudio de la linealidad tambieacuten se han estudiado los liacutemites de cuantificacioacuten instrumentales del
meacutetodo (LOQs) Para ello los LOQs se evaluacutean como la miacutenima cantidad de analito que origina una sentildeal 10
veces superior a la desviacioacuten estaacutendar del ruido Los valores anteriores se estimaron a partir del patroacuten de
a no evaluado ya que se encuentra por debajo del liacutemite de cuantificacioacuten del meacutetodo
31
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
concentracioacuten maacutes baja que presenta un pico con una relacioacuten SN superior a 10 En la Tabla IV3 tambieacuten se
recogen estos LOQs en doacutende podemos ver que variacutean en el rango 01-1 ngmL excepto para THI-M que se
desviacutea a valores de 10 ngmL
Tabla IV3 Coeficientes de determinacioacuten (R2) y liacutemites de cuantificacioacuten instrumentales (LOQs) de los analitos para nueve
niveles de concentracioacuten de 05 a 200 ngmL
Compuesto Coeficiente de
correlacioacuten (R2)
LOQs (ngmL) Compuesto
Coeficiente de correlacioacuten
(R2)
LOQs (ngmL)
AME 09951 04 MET 09933 01
BEN 09949 01 MYC 09950 04
BOS 09979 02 PEN 09945 02
CAR 09923 02 PYC 09955 02
CYP 09878 02 PYM 09931 01
DIM 09938 07 TEC 09958 05
FEH 09959 05 TEF 09957 01
FEP 09931 01 TBZ 09942 02
FLU 09965 02 TME 09903 01
IMI 09979 05 THI-M 09580 100
IPR 09938 01 TRI 09867 07
MAN 09979 01
En la Figura IV1 y Figura IV2 se muestran dos ejemplo de curvas de calibrado para dos compuestos IMI y
MAN respectivamente
Figura IV1 Curva de calibrado y coeficiente de determinacioacuten de IMI para UPLC-ESI-MSMS
32
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Figura IV2 Curva de calibrado y coeficiente de determinacioacuten de MAN para UPLC-ESI-MSMS
3 ESTUDIO DEL MEacuteTODO SPE
La extraccioacuten de pesticidas se llevoacute a cabo mediante extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) en doacutende se realizaron
diversos estudios con diferentes condiciones para dar con las oacuteptimas En primer lugar se llevaron a cabo los
experimentos de retencioacuten y elucioacuten sobre dos tipos distintos de adsorbentes cartuchos OASIS HLB (200mg) y
cartuchos OASIS MAX (150 mg) como fases potenciales en las que llevar a cabo la extraccioacuten de manera
selectiva Los dos tipos de cartuchos son de fase reversa pero difieren entre siacute en el fundamento de retencioacuten de
los analitos En los cartuchos OASIS HLB (200 mg) formados por divinilbenceno-N-vinilpirrolidona (DVB-VP)
la retencioacuten de los diferentes analitos tiene lugar por interacciones π-π o de Van der Waals mientras que los
cartuchos OASIS MAX (150 mg) que se probaron como alternativa para mejorar la selectividad en la extraccioacuten
cuentan con un adsorbente polimeacuterico de modo mixto formado por divinilbenceno-N-vinilpirrolidona (DVB-VP)
funcionalizado con grupos amina cuaternaria siendo el fundamento de la extraccioacuten la combinacioacuten de las
propiedades adsorbentes del cartucho HLB con un mecanismo adicional de intercambio ioacutenico (anioacutenico) [27]
Algunos autores han empleado este mecanismo para mejorar la selectividad de la extraccioacuten de forma que en la
etapa de elucioacuten ciertos pigmentos del vino quedan fuertemente retenidos en el adsorbente a diferencia de lo que
ocurre con los adsorbentes de fase reversa [51]
Para llevar a cabo la eleccioacuten del tipo de adsorbente se realizaron pruebas con 10 mL de vino blanco y tinto
conectando en serie los dos tipos de cartuchos HLB (200 mg) y MAX (150 mg) a un segundo cartucho OASIS
HLB (60 mg) La elucioacuten de los analitos se hace de forma independiente para cada cartucho y se evaluacutea si los
analitos pasan del primer cartucho hacia el segundo cartucho es decir si se supera el volumen de corte o si por
33
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
otro lado se quedan retenidos en el primero y no eluyen hacia el segundo En estas pruebas de estudio
preliminares de preparacioacuten de la muestra no se ha incluido el CYP
En la Figura IV3 podemos ver la eficacia de la extraccioacuten para vino blanco y tinto que obtenemos empleando
cartuchos OASIS MAX (150 mg) conectados en serie con cartuchos OASIS HLB (60 mg) realizando la
extraccioacuten de tres fracciones de 2 mL cada una del cartucho OASIS MAX (150 mg) y una cuarta fraccioacuten de 2
mL del cartucho OASIS HLB (60 mg)
Por otro lado en la Figura IV4 podemos ver un graacutefico de columnas en el cual comparamos la eficacia de
extraccioacuten de los cartuchos OASIS HLB (200 mg) con dos disolventes de elucioacuten distintos En dicho graacutefica el
acroacutenimo de cada compuesto consta de dos barras cuyo significado es el siguiente la barra de la izquierda indica
la eficacia de la extraccioacuten empleando acetonitrilo (ACN) como disolvente de elucioacuten y la barra de la derecha
indica la eficacia de la extraccioacuten empleando la combinacioacuten MetanolAcetonitrilo (2080) (MeOHACN) como
disolvente de elucioacuten Para este adsorbente no se detectoacute ninguacuten compuesto en la extraccioacuten del segundo
cartuchos OASIS HLB (60 mg) empleando 2 mL de metanol
Figura IV3 Distribucioacuten de los compuestos en cada fraccioacuten obtenidas con cartuchos OASIS MAX (150 mg)
utilizando 10 mL de vino tinto y blanco sacando cuatro fracciones de 2 mL cada una con metanol como
disolvente de elucioacuten
34
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Figura IV4 Distribucioacuten de los compuestos en cada fraccioacuten obtenidas con cartuchos OASIS HLB (200 mg) utilizando 10
mL de vino tinto y blanco sacando 3 fracciones de 2 mL cada una con acetonitrilo (ACN) (columna de la izquierda) y una
combinacioacuten MetanolAcetonitrilo (2080) (MeOHACN) (columna de la derecha) como disolventes de elucioacuten
A la vista de los resultados reflejados en las graacuteficas podemos afirmar que cuando se utiliza el cartucho OASIS
HLB (200 mg) eluyendo con acetonitrilo o la combinacioacuten metanolacetonitrilo (2080) los extractos son limpios
y se eluyen la mayoriacutea de los compuestos en la primera fraccioacuten Pero utilizando acetonitrilo como disolvente de
elucioacuten se encuentran problemas en la extraccioacuten de CAR FEH y TBZ para los que es necesario emplear un
volumen mayor de elucioacuten o bien seleccionar otro disolvente de elucioacuten como es la combinacioacuten
metanolacetonitrilo
35
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Por otro lado los extractos en los cartuchos OASIS MAX (150 mg) son maacutes limpios incluso utilizando metanol en
la elucioacuten pero se detecta la presencia de CAR FEP TBZ y TME en el segundo cartucho OASIS HLB (60 mg)
significando la rotura del primer cartucho para dichos analitos considerando un volumen de 10 mL de vino Los
demaacutes compuestos se podriacutean recuperar cuantitativamente en la primera fraccioacuten sacada pero la peacuterdida de estos
compuestos inclina la eleccioacuten hacia los cartuchos OASIS HLB (200 mg) con metanolacetonitrilo (2080) como
disolvente de elucioacuten para continuar con el estudio
Una vez fijado el adsorbente y el volumen de elucioacuten se prueba la eficacia de la SPE independiente de los efectos
de matriz En la Tabla IV4 se muestran las recuperaciones de la SPE tomando 10 mL de vino blanco y tinto
con un nivel de adicioacuten de 15 ngmL sacando una sola fraccioacuten de 2 mL con la combinacioacuten
metanolacetonitrilo (2080) y n=3 reacuteplicas
Tabla IV4 Recuperaciones (R plusmn SD) de SPE para 10 mL de vino (blanco y tinto) con un nivel de adicioacuten de 15 ngmL y
n=3 reacuteplicas
Compuesto Vino Tinto
R plusmn SD
Vino Blanco
R plusmnSD Compuesto
Vino Tinto
R plusmn SD
Vino Blanco
R plusmn SD
AME 82 plusmn 7 100 plusmn 1 MET 92 plusmn 6 94 plusmn 3
BEN 89 plusmn 6 97 plusmn 3 MYC 90 plusmn 9 86 plusmn 4
BOS 95 plusmn 1 100 plusmn 2 PEN 84 plusmn 10 103 plusmn 3
CAR 91 plusmn 6 104 plusmn 6 PYC 86 plusmn 5 106 plusmn 1
CYP 81 plusmn 7 102 plusmn 3 PYM 87 plusmn 12 94 plusmn 3
DIM 97 plusmn 3 86 plusmn 4 TEC 83 plusmn 10 103 plusmn 1
FEH 89 plusmn 3 88 plusmn 3 TEF 84 plusmn 5 108 plusmn 4
FEP 91 plusmn 7 104 plusmn 3 TBZ 88 plusmn 7 92 plusmn 5
FLU 91 plusmn 2 97 plusmn 4 TME 101 plusmn 1 110 plusmn 13
IMI 117 plusmn 8 101 plusmn 11 THI-M 85 plusmn 9 110 plusmn 4
IPR 89 plusmn 7 112 plusmn 4 TRI 85 plusmn 10 110 plusmn 4
MAN 88 plusmn 2 87 plusmn 2
Algunos compuestos de la matriz en el vino pueden competir con los analitos durante el proceso de ionizacioacuten
que tiene lugar en la interfase entre UPLC-MSMS por lo que para la cuantificacioacuten del rendimiento de la
ionizacioacuten por electrospray (ESI) se estudian los efectos de matriz (EM) para vino blanco y tinto considerando
dos voluacutemenes de muestra distintos 2 y 10 mL y un volumen final del extracto de 2 mL En la Tabla IV5 se
36
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
exponen los valores para cada compuesto notando que al aumentar el volumen de muestra tambieacuten se aumentan
los efectos de matriz y eacutestos siempre son mayores en vino tinto Para el caacutelculo de estos efectos de matriz (EM)
se emplea la siguiente ecuacioacuten
Donde Am Ab y Ap representan el aacuterea de pico en la sentildeal medida del analito en el extracto de la muestra con
adicioacuten en el extracto de la muestra sin adicioacuten (o blanco) y en el patroacuten antildeadido respectivamente El nivel de
adicioacuten en extracto fue de 50 ngmL por compuesto
Tabla IV5 Efectos de matriz para vino blanco y tinto con un volumen inicial de 2 y 10 mL evaluados para un nivel de adicioacuten de 50 ngmL en extracto
Compuesto
Vino blanco Vino tinto
2 mL 10 mL 2mL 10 mL
EM () CV () EM () CV () EM () CV () EM () CV()
AME 93 3 95 2 99 3 101 7
BEN 99 1 93 2 101 3 100 6
BOS 97 5 98 1 108 2 96 0
CAR 62 2 50 3 58 2 55 6
CYP 94 3 91 1 97 2 95 7
DIM 105 2 95 3 100 3 108 3
FEH 100 4 102 4 105 4 94 3
FEP 95 3 88 2 96 2 92 7
FLU 98 2 93 2 106 1 101 2
IMI 84 4 46 3 48 10 18 8
IPR 99 3 92 3 105 1 100 7
MAN 100 1 94 3 109 4 107 2
MET 98 1 89 1 99 2 99 6
MYC 105 1 100 1 103 2 96 9
PEN 98 3 97 1 101 3 99 10
PYC 98 2 92 3 102 2 98 5
PYM 95 2 87 1 94 3 85 12
TEC 95 3 99 1 101 1 102 10
TEF 99 1 92 3 101 2 104 5
TBZ 45 0 40 5 43 2 30 7
TME 60 6 19 16 36 4 16 1
THI-M 107 2 109 2 103 1 96 9
TRI 97 3 118 4 104 5 117 10
37
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Al observar los resultados podemos ver que la mayoriacutea de los compuestos dan resultados de EM en torno al
100 lo que significa que no sufren una modificacioacuten importante en la eficacia de ionizacioacuten para las muestras
con respecto a los patrones Pero tambieacuten por el contrario podemos observar que algunos compuestos como
por ejemplo en el caso de CAR TBZ IMI y TME experimentan una gran supresioacuten de sentildeal es decir EM bajos
que se acentuacutean al aumentar el volumen de muestra La atenuacioacuten en la eficacia de variacioacuten para estos cuatro
compuestos no solo se ve incrementada con el volumen de muestra si no que ademaacutes es maacutes significativa para
vino tinto que para vino blanco En base a estos resultados aunque la eficacia de la SPE fue cuantitativa para
muestras de 10 mL se limitoacute el volumen de muestra a extraer a 2 mL
Las condiciones oacuteptimas de extraccioacuten se esquematizan en un resumen en la Figura IV5
Figura IV5 Condiciones optimizadas para la extraccioacuten de pesticidas en vino
38
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
4 CARACTERIZACIOacuteN DEL MEacuteTODO DE DETERMINACIOacuteN
Con las condiciones de extraccioacuten y determinacioacuten citadas anteriormente se llevaron a cabo pruebas de
recuperaciones absolutas de los compuestos a nivel de adicioacuten de 5 y 20 ngmL sobre las muestras Para cada
muestra y nivel de adicioacuten se realizaron tres reacuteplicas de las muestras con adicioacuten y los blancos aliacutecuotas de las
mismas muestras sin adicioacuten se procesaron en duplicado Los IS se antildeadieron a nivel de 25 ngmL y cada uno se
utiliza para corregir unos determinados compuestos CAR-d3 se emplea para CAR y TBZ el CYP-d5 para CYP y
PYM el IMID-d4 para IMI y TME y el MET13C6 para el resto de compuestos Los resultados para vino blanco
comprenden en el nivel de concentracioacuten 5 ngmL el rango entre 79-122 y en el nivel de concentracioacuten 20
ngmL el rango entre 84-109 Por otro lado en el caso del vino tinto las recuperaciones se encuentran para el
nivel de concentracioacuten 5 ngmL en el rango 67-112 y para el nivel de concentracioacuten 20 ngmL entre el rango
73-132 Los resultados obtenidos en las pruebas con vino blanco y vino tinto se muestran en la Tabla IV6
Los resultados son satisfactorios ya que la mayoriacutea de los compuestos se ajustan en todos los casos al rango de
recuperacioacuten entre 70-120 Para la realizacioacuten de estas pruebas se ha eliminado de los resultados el compuesto
THI-M debido a que las concentraciones utilizadas se encuentran en el liacutemite o por debajo del LOQ en los
experimentos con muestras adicionadas a 5 ngmL
Para calcular las recuperaciones (R) se recurrioacute a la siguiente ecuacioacuten
Donde Cm Cb y Cp son la concentracioacuten medida de analito en el extracto de la muestra con adicioacuten en el extracto
de la muestra sin adicioacuten (o blanco) y en el patroacuten antildeadido respectivamente
Tabla IV6 Recuperaciones (R) para vino tinto y vino blanco evaluadas para dos niveles de concentracioacuten 5 y 20 ngmL
Compuesto
Vino tinto Vino Blanco
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
AME 97 3 105 6 104 9 96 5
BEN 88 11 105 3 101 1 98 4
BOS 91 13 110 2 88 13 97 3
39
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Compuesto
Vino tinto Vino blanco
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
CAR 99 6 99 3 122 3 109 1
CYP 91 2 111 1 101 4 100 6
DIM 112 3 110 9 102 24 99 11
FEH 91 4 108 0 102 20 95 2
FEP 89 8 102 7 94 5 84 1
FLU 95 10 104 4 109 5 100 8
IMI 73 11 115 9 80 13 100 2
IPR 84 13 99 3 111 3 99 4
MAN 88 22 112 8 112 3 99 4
MET 99 3 106 5 106 3 98 2
MYC 84 9 106 13 88 17 86 3
PEN 84 9 102 5 84 8 90 5
PYC 96 6 105 4 100 2 95 4
PYM 90 12 112 14 106 4 97 1
TEC 89 8 101 6 98 12 94 1
TEF 93 10 102 5 107 2 97 3
TBZ 94 17 115 8 79 5 106 2
TME 67 2 101 7 84 18 90 11
THI-M ne - 74 7 ne - 89 24
TRI 88 12 97 6 102 6 92 2
ne No evaluado El nivel de adicioacuten es inferior al LOQ del meacutetodo para este compuesto
Para estudiar la reproducibilidad del meacutetodo analiacutetico global (correspondientes a los datos de preparacioacuten de
muestra y determinacioacuten) es decir la concordancia de varias medidas realizadas en diacuteas diferentes se procedioacute a la
extraccioacuten en las condiciones oacuteptimas tanto de vino blanco como tinto Las extracciones y determinaciones se
realizaron durante tres diacuteas consecutivos realizando tres reacuteplicas por vino y por diacutea con un nivel de adicioacuten en
muestra de 10 ngmL un blanco de muestra cada diacutea En la Tabla IV7 se muestran los resultados como
recuperaciones (R) en condiciones de reproducibilidad obtenidos para ambos tipos de vino dando valores entre
64-116 para muestras de vino blanco y valores situados entre 68-108 para muestras de vino tinto con la
excepcioacuten del TME para el que se ha obtenido un valor no aceptable en cuanto a la exactitud medida en
condiciones de reproducibilidad A la vista de los resultados obtenidos con estas pruebas se considera necesario el
empleo de IS adicionales para la mejora en la exactitud del meacutetodo para algunos compuestos por ejemplo el
TME
40
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Tabla IV7 Recuperaciones en condiciones de reproducibilidad (R plusmn SD) para vino blanco y tinto
Compuesto
Vino tinto Vino blanco
R
10 ngmL CV ()
R
10 ngmL CV ()
AME 90 5 101 13
BEN 96 5 102 7
BOS 97 6 100 8
CAR 97 3 94 5
CYP 103 3 105 12
DIM 104 7 106 8
FEH 90 16 83 15
FEP 91 5 90 4
FLU 103 7 102 6
IMI 99 14 101 14
IPR 91 5 100 13
MAN 108 5 108 13
MET 101 5 101 5
MYC 105 16 102 14
PEN 96 11 92 10
PYC 99 12 97 12
PYM 102 4 116 8
TEC 99 9 97 16
TEF 99 8 105 11
TBZ 68 4 84 5
TME 47 13 64 10
THI-M 107 11 104 16
TRI 95 14 103 4
En la Tabla IV8 se muestran los liacutemites de cuantificacioacuten (LOQs) del meacutetodo del meacutetodo de SPE-UPLC-ESI-
MSMS obtenidos para los diferentes pesticidas Los valores obtenidos son ideacutenticos a los LOQs instrumentales
excepto en el caso de aquellos compuestos para los que se observaronfuertes efectos de matriz (Tabla IV5) En
estos casos (CAR TBZ IMI y TME) los LOQs del meacutetodo se incrementan seguacuten la atenuacioacuten de sentildeal
observada
41
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Tabla IV8 Liacutemites de cuantificacioacuten LOQs (ngmL) del meacutetodo obtendos para cada compuesto
Compuesto LOQ (ngmL) Compuesto LOQ (ngmL)
AME 04 MET 01
BEN 01 MYC 04
BOS 02 PEN 02
CAR 03 PYC 02
CYP 02 PYM 01
DIM 07 TEC 05
FEH 05 TEF 01
FEP 01 TBZ 04
FLU 02 TME 02
IMI 06 THI-M 10
IPR 01 TRI 07
MAN 01
5 APLICACIOacuteN A MUESTRAS DE VINO COMERCIALES
Una vez optimizadas las condiciones del meacutetodo y estudiadas las caracteriacutesticas del meacutetodo desarrollado se aplicoacute
a la determinacioacuten de los compuestos de intereacutes estudiados en muestras de vino blanco y vino tinto comerciales
producidos en diferentes paiacuteses En la Tabla IV9 se muestra el paiacutes de origen de cada muestra comercial
identificadas con un coacutedigo alfanumeacuterico y antildeo de produccioacuten
42
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Tabla IV9 Coacutedigo asignado para los diferentes vinos comerciales blancos y tintos analizados Indicando el paiacutes de origen y
antildeo de produccioacuten
Coacutedigo Denominacioacuten de origen Antildeo de produccioacuten
bull Vinos Blancos
W1 Alemania 2014
W2 Espantildea 2012
W3 Espantildea 2016
W4 Portugal Desconocido
W5 Francia 2015
W6 Francia 2015
W7 Espantildea 2016
bull Vinos Tintos
R1 Espantildea 2015
R2 Sudaacutefrica 2015
R3 Chile 2015
R4 Francia 2015
R5 China Desconocido
R6 Espantildea 2016
R7 Australia 2014
R8 Francia 2013
R9 Francia 2015
A continuacioacuten en la Tabla IV10 y la Tabla IV11 se recogen los resultados obtenidos en el anaacutelisis de las
muestras comerciales Los datos obtenidos corresponden en todos los casos al uso de patrones de calibracioacuten
como teacutecnica de cuantificacioacuten
Tabla IV10 Concentracioacuten (ngmL) encontradas en las diferentes muestras de vino blanco comercial analizadas mediante
SPE-UPLC-MSMS n=2 reacuteplicas y al final el sumatorio de las concentraciones encontradas
Compuesto W1 W2 W3 W4 W5 W6 W7
AME 04 nd nd nd 41 nd nd
BEN nd nd 14 nd nd nd nd
BOS 84 102 520 54 197 nd nd
CAR nd 115 56 nd nd nd nd
CYP 08 59 112 nd nd 26 nd
43
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Compuesto W1 W2 W3 W4 W5 W6 W7
DIM 14 84 400 09 32 50 nd
FEH 85 809 639 15 187 nd nd
FLU 11 05 92 nd 77 32 nd
IMI nd 136 88 29 nd nd 69
IPR 30 749 1144 14 nd nd nd
MAN nd nd nd nd nd 30 nd
MET 04 273 494 63 nd nd 172
MYC 09 nd 35 nd nd nd nd
PYM 15 469 584 08 24 35 nd
TEC 11 nd 58 nd nd nd nd
TRI nd 67 61 nd nd nd nd
sumconcentracioacuten
(ngmL) 274 2868 4358 192 558 173 862
nd no detectado
Tabla IV11 Concentracioacuten (ngmL) encontradas en las diferentes muestras de vino tinto comercial analizadas mediante
SPE-UPLC-MSMS n= 2 reacuteplicas y al final el sumatorio de las concentraciones encontradas
Compuesto R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9
AME nd nd nd 30 nd nd nd nd 16
BEN nd nd nd 07 nd nd nd nd nd
BOS nd 55 21 196 nd nd nd 73 21
CAR nd nd 04 17 249 20 nd nd nd
CYP 34 08 02 22 nd 136 nd 85 nd
DIM nd 33 nd 52 233 46 nd 61 23
FEH nd nd nd 1070 nd 10 nd 1307 14
FLU nd nd nd 20 nd nd nd nd nd
IPR 16 nd nd 17 nd 22 nd nd nd
MAN nd nd nd 17 nd nd nd 20 nd
MET 126 nd nd 14 55 313 30 44 39
MYC nd nd nd 05 nd 32 nd nd nd
PYM 19 nd 03 185 49 281 nd 24 nd
TEC 25 06 39 29 nd nd nd 21 20
TEF nd 01 12 nd nd nd nd nd nd
sumconcentracioacuten
(ngmL) 220 48 81 1681 586 860 30 1635 133
nd no detectado 44
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
En los resultados de los anaacutelisis podemos observar que en ninguna de las muestras comerciales de vino blanco
aparecieron los siguientes compuestos FEP PEN PYC TEF TBZ THI-M y TME y en los vinos tintos
comerciales no aparece a ninguna concentracioacuten FEP IMI PEN PYC TBZ TME THI-M y TRI No se
detectaron para dichas muestras de vino a niveles superiores a los LOQs del meacutetodo propuesto
Cuando se detecta un compuesto positivo se compara el pico cromatograacutefico del compuesto con el de un patroacuten
verificando la coincidencia del tiempo de retencioacuten (maacutexima diferencia 01 min) y la relacioacuten entre transiciones
(maacutexima diferencia 30 ) En la Figura IV6 y la Figura IV7 se muestran los cromatogramas para el compuesto
CYP obtenido en condiciones oacuteptimas para la muestra de vino blanco W6 y en un patroacuten de 5 ngmL
respectivamente En este caso el intervalo de tolerancia para la relacioacuten de intensidad entre transiciones es
IP2IP1=061plusmn018
Figura IV6 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el CYP en la muestra W6 (26 ngmL) Transicioacuten
superior 226gt93 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 226gt108 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades IP2IP1= 066
Figura IV7 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el CYP en un patroacuten de 5 ngmL Transicioacuten
superior 226gt93 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 226gt108 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades IP2IP1=061plusmn018
45
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Otro ejemplo de compuesto positivo en abundantes muestras comerciales de estudio es el Metalaxyl positivo con
una concentracioacuten de 04 ngmL en el vino con referencia W1 (Figura IV8) y positivo con una concentracioacuten de
313 ngmL en el vino con referencia R6 (Figura IV9) Ambas se comparan con el cromatograma de un patroacuten
de Metalaxyl de 1 ngmL (Figura IV10) El grado de concordancia en los tiempos de retencioacuten y la relacioacuten de
intensidades entre transiciones es satisfactorio
Figura IV8 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el MET en la muestra W1 (04 ngmL) Transicioacuten
superior 2801gt2201 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 2801gt1921 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades
IP2IP1=056
Figura IV9 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el MET en la muestra R6 (313 ngmL) Transicioacuten
superior 2801gt2201 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 2801gt1921 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades IP2IP1=
056
46
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Figura IV10 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el MET en un patroacuten de 1 ngmL Transicioacuten
superior 2801gt2201 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 2801gt1921 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades
IP2IP1=057plusmn017
Es de destacar que aunque se detectaron bastantes pesticidas en las diferentes muestras de vino comerciales pero
en ninguacuten caso superaron el 10 de los LMRs permitidos en uvas tal y como se recomienda ya que todaviacutea no
existen LMRs para vino en la legislacioacuten vigente No obstante el nivel total de concentracioacuten (sumatorio de
concentraciones Tabla IV10 y Tabla VI11) es significativo para varias muestras tanto de vinos blancos (W2 y
W3) como tintos (R4 y R8)
47
Capiacutetulo V Conclusiones
CAPIacuteTULO V CONCLUSIONES
En este trabajo se ha estudiado un meacutetodo para la cuantificacioacuten de pesticidas concretamente veinte fungicidas y
tres insecticidas en vino blanco y tinto En la etapa de preparacioacuten de muestra se optimizoacute la extraccioacuten en fase
soacutelida (SPE) utilizando cartuchos OASIS HLB (200 mg) compuestos por divinilbenceno-N-vinilpirrolidona
(DVB-VP) como adsorbente Como teacutecnica de determinacioacuten se utilizoacute cromatografiacutea de liacutequidos con una
interfase de electroespray acoplada a espectrometriacutea de masas (UPLC-ESI-MSMS)
Las conclusiones generales obtenidas a partir de los resultados de este proyecto relativo a la determinacioacuten de
fitosanitarios en vino son
Ante los problemas de retencioacuten que presentan los cartuchos OASIS MAX (150 mg) para algunos
compuestos los cartuchos OASIS HLB (200 mg) junto con la combinacioacuten metanolacetonitrilo (2080)
como disolvente de elucioacuten son elegidos como mejor opcioacuten en la extraccioacuten en fase soacutelida de pesticidas
en muestras con matrices complejas como es el caso del vino Asiacute se consigue la retencioacuten selectiva de
componentes de la matriz y proporciona extractos con menor porcentaje de interferencias
El meacutetodo estudiado y optimizado se puede aplicar tanto a vinos blancos como a vinos tintos procesados
a partir de distintas variedades de uvas
Los liacutemites de cuantificacioacuten (LOQs) del estudio se situacutean la mayoriacutea por debajo de 10 ngmL excepto
en el caso de THI-M que asciende al valor de 20 ngmL El rango de respuesta lineal abarca hasta 200
ngmL y el tiempo de anaacutelisis ha sido de solo 10 minutos por muestra
En todas las muestras de vino (blancos y tintos) comerciales analizadas se han detectado la presencia de
varios pesticidas sin embargo todas las concentraciones encontradas se encuentran por debajo del 10
de los LMRs fijados en uvas tal y como recomienda la legislacioacuten por lo que no se considera
preocupante
48
Capiacutetulo V Conclusioacutens
CAPIacuteTULO V CONCLUSIOacuteNS
Neste traballo estudouse un meacutetodo para a cuantificacioacuten de pesticidas en particular vinte funxicidas e tres
insecticidas en vintildeo branco e maacuteis tinto No paso da preparacioacuten da mostra optimizouse a extraccioacuten en fase
soacutelida (SPE) empregando cartuchos OASIS HLB (200 mg) compostos por divinilbenceno-N-pirrolidona (DVB-
VP) como adsorbente Para a teacutecnica de determinacioacuten utilizouse cromatografiacutea de liacutequidos con unha interfase de
electroespray acoplada a espectrometriacutea de masas (UPLC-ESI-MSMS)
As conclusioacutens xerais a obtidas a partir dos resultados deste proxecto relativo aacute determinacioacuten de pesticidas en
vintildeo son
Ante os problemas de retencioacuten que mostraban os cartuchos OASIS MAX (150 mg) para alguacuten
compostos os cartuchos OASIS HLB (200 mg) en conxunto coa mistura metanolacetonitrilo (2080)
como disolvente de elucioacuten son elexidos como mellor opcioacuten na extraccioacuten en fase soacutelida de pesticidas
en mostras con matrices complexas como eacute o caso do vintildeo Asiacute eacute conseguida a retencioacuten selectiva de
componentes da matriz e proporciona extractos con menos porcentaxe de interferencias
O meacutetodo estudado e optimizado poacutedese aplicar tanto a vintildeos brancos coma tintos procesados a partir de
diferentes variedades de uvas
Os liacutemites de cuantificacioacuten do estudo (LOQs) son maacuteis baixos de 10 ngmL agaacutes no caso do THI-M
que ascende ao valor de 20 ngmL O rango de resposta lineal cobre ata 200 ngmL e o tempo de anaacutelise
foi de soacute 10 minuacutetos por mostra
En todas as mostras de vintildeo (brancos e tintos) comercial analizadas detectouse a presenza de varios
pesticidas maacuteis poreacuten todas as concentracioacutens atopadas son inferiores ao 10 dos LMR fixados en uvas
tal e como recomenda a lexislacioacuten polo que non se considera preocupante
49
Chapter V Conclusions
CHAPTER V CONCLUSIONS
In this work we have studied a method for the quantification of pesticides specifically twenty fungicides and
three insecticides in white and red wine In the sample preparation step the solid phase extraction was optimized
using cartridges OASIS HLB (200 mg) containing divinylbenzene-N-vinylpyrrolidone (DVB-VP) as adsorbent
As determination technique ultraperformance liquid chromatography was used with an electrospray interface
coupled to mass spectrometry (UPLC-ESI-MS7MS)
The general conclusions drawn from the results of this project concerning the determination of pesticides in wine
are
Due to the retention problems presented by the OASIS MAX sorbent (150 mg) for some compounds of
this project the cartridges OASIS HLB (200 mg) together with the methanolacetonitrile (2080) mixture
are chosen as the best option in the solid phase extraction of pesticides in samples with complex
matrices as is the case with the wine
The method studied and optimized can be applied to both white and red wines obtained from different
varieties of grapes
The limits of quantification (LOQs) were below 10 ngmL for most of the compounds except in the
case of THI-M with a LOQ of to 10 ngmL The linear response range covers up to 200 ngmL and the
analysis time was only 10 minutes per sample
In all commercial wine samples (white and red) analyzed the presence of several pesticides was
conformed however all the concentrations obtained are below 10 of the Maximum residue
levels(MRLs) fixed in grapes as recommended by legislation
50
VI Bibliografiacutea VI BIBLIOGRAFIacuteA [1] Ministerio de agricultura y pesca alimentacioacuten y medio ambiente mhttpwwwmapamagobesescalidad-y-evaluacion-ambientaltemasproductos-quimicosfitosanitarios (Acceso el diacutea 11052017) [2] httpwwwcricyteduarenciclopediaterminosProducFitohtm (Acceso el diacutea 11052017) [3] WERNER BALTES ldquoQuiacutemica de los alimentosrdquo Editorial Acribia SA 2007 Capiacutetulo 11 ldquoResiduos en los alimentosrdquo paacuteginas 206-217
[4] RLabrada JCCaseley CParker ldquoESTUDIO FAO PRODUCCIOacuteN Y PROTECCIOacuteN VEGETAL 120rdquo Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentacioacuten Roma 1996 ISSN 1014- Capiacutetulo 10 Herbicidas httpwwwfaoorgdocrepT1147St1147s00htmContents (Acceso el diacutea 12052017)
[5] Taberner Palou Andreu Cirujeda Ranzenberger Alicia Zaragoza Larios Carlos ldquoManejo de poblaciones de malezas resistentes a herbicidasrdquo (FAO Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura) 100 preguntas sobre resistencia PDF sacado de httpwwwfaoorg3a-a1422spdf (Acceso el diacutea 12052017) [6] BISSET Juan A Uso correcto de insecticidas control de la resistencia Revista Cubana de Medicina Tropical 2002 vol 54 no 3 p 202-219 [7] DEVINE Gregor J EZA Dominique Ogusuku Elena FURLONGMichael J Uso de insecticidas contexto y consecuencias ecoloacutegicas Revista peruana de medicina experimental y Salud Puacuteblica 2008 vol 25 no 1 p 74-100 [8] Ministerio de agricultura y ganaderiacutea (proteccioacuten agropecuaria servicio de diagnoacutestico fitosanitario) de costa Rica httpwwwmaggocrbibliotecavirtualH20-5054pdf (Acceso el diacutea 11052017) [9] GEPP V MONDINO P Control quiacutemico 2011 PDF obtenido de httpwwwpvfagroeduuyfitopatodocscursosfitopatoMaterialesGuiasC-QUIMICOpdf (Acceso el diacutea 772017) [10] ROSSLENBROICH Hans-Juergen STUEBLER Dietrich Botrytis cinereamdashhistory of chemical control and novel fungicides for its management Crop Protection 2000 vol 19 no 8 p 557-561 [11] Figura 11 httpwwwvitiviniculturanetbotritis-o-podredumbre-gris-botrytis-cinerea-pershtml (Acceso el diacutea 12052017) [12] CAMPBELL Paul BENDEK Carlos LATORRE Bernardo A Riesgo de oiacutedio (Erysiphe necator) de la vid en relacioacuten con el desarrollo de los racimos Ciencia e investigacioacuten agraria 2007 vol 34 no 1 p 5-11 [13] ldquoCoacutemo combatir el oiacutedio de la vidrdquo Jose Javier Peacuterez de Obanos Castillo PDF sacado de httpswwwnavarraesNRrdonlyres05E65D9B-D1A2-4EAD-9A63-AFF1D3215552135109Comocombatireloidiodelavidpdf (Acceso el diacutea 12052017) [14] Imagen 12 sacadas las 3 de httpwwwvitiviniculturanetoidio-de-la-vidhtml (Acceso el diacutea 12052017) [15] BARRIOS Gonccedilal REYES Joan Modelizacioacuten del Mildiu de la Vid 2004 httpwwwruralcatnetmigracio_resources617683_mildiusPDF (Acceso el diacutea 12052017) [16] Imaacutegenes sacadas de httpwwwvitiviniculturanetmildiu-de-la-vid-enfermedades-vinahtml (Acceso el diacutea 13052017) [17] HUQ Mainul MEISNER Craig DASGUPTA Susmita Health effects and pesticide perception as determinants of pesticide use evidence from Bangladesh httpagrisfaoorgagris-searchsearchdorecordID=US2012411738 (Acceso el diacutea 13052017)
51
IV Bibliografiacutea [18] BADII Mohammad H LANDEROS Jeroacutenimo Plaguicidas que afectan a la salud humana y la sustentabilidad CULCyT 2015 no 19 Revista vista en httpopenjournaluacjmxojsindexphpculcytarticleview454 (Acceso el diacutea 772017) [19] OLEA Nicolaacutes FERNAacuteNDEZ Mariana F Plaguicidas persistentes En Congreso Implementacioacuten del Convenio de Contaminantes Orgaacutenicos Persistentes Madrid 2001 p 26-27 [20] httpwwwfaoorgfao-who-codexalimentariusabout-codexes (Acceso el diacutea 14052017) [21] httpeceuropaeufoodplantpesticidesmax_residue_levels_en (Acceso el diacutea 14052017 [22] ORDONtildeEZ Juan A Cambero Rodriacuteguez MI Fernaacutendez Aacutelvarez L Garciacutea Sanz ML Garciacutea de Fernando Minguilloacuten GD de la Hoz Perales L Selgas Cortecero MD Tecnologiacutea de los alimentos Volumen 1 Componentes de los Alimentos y Procesos Siacutentesis Madrid 1998paacutegs 349-351 [23] CELA Rafael Casais Maria del Carmen Lorenzo Rosa Antonia Teacutecnicas de separacioacuten en quiacutemica analiacutetica Siacutentesis 2002 Capiacutetulo 11 Extraccioacuten y lixiviacioacuten por disolvente (paacutegs206-260) [24] CANTWELL Frederick F LOSIER Manon Liquidmdashliquid extraction Comprehensive Analytical Chemistry 2002 vol 37 p 297-340 [25] Imagen de LLE sacada de httpprocesosbiowikispacescomExtracciC3B3n+liquido-liquido (Acceso el diacutea 15052017) [26] HENNION Marie-Claire Solid-phase extraction method development sorbents and coupling with liquid chromatography Journal of Chromatography A 1999 vol 856 no 1 p 3-54 [27] CELA Rafael Casais Maria del Carmen Lorenzo Rosa Antonia Teacutecnicas de separacioacuten en quiacutemica analiacutetica Siacutentesis 2002 Capiacutetulo 16 Teacutecnicas de adsorcioacuten y absorcioacuten en la preparacioacuten de muestras Extraccioacuten y microextraccioacuten en fase soacutelida (paacutegs520-555) [28] Imagen spe sacada httptoxicocbblogspotcomes201310las-intoxicaciones-con-farmacoshtml (Acceso el diacutea 15052017) [29] Chaacutefer Pericaacutes Consuelo Acoplamiento microextraccioacuten en fase soacutelida-cromatografiacutea (2006) httprodericuveshandle1055014940 (Acceso el diacutea 16052017) [30] Imagen SPME httpwwwscieloorgcoscielophpscript=sci_arttextamppid=S0122-53832002000100005 (Acceso el diacutea 16052017) [31] MONTES GOYANES Rosa Mariacutea Avances en teacutecnicas de microextraccioacuten para la determinacioacuten de compuestos traza en muestras medioambientales y alimentarias Teacutesis doctoral Noviembre 2009 (Paacutegs 34-55) [32] LEHOTAY Steven J Ae Son Kyung KwonHyeyoung Koesukwiwat Urairat Fu Wusheng Mastovska Katerina Hoh Eunha Leepipatpiboon Natchanun Comparison of QuEChERS sample preparation methods for the analysis of pesticide residues in fruits and vegetables Journal of Chromatography A 2010 vol 1217 no 16 p 2548-2560 [33] Imagen QueChERS httpswwwresearchgatenetpublication279221361_QuEChERS_A_Sample_Preparation_for_Extraction_of_Carbaryl_from_Rat_Feces (Acceso el diacutea 16052017) [34] STASHENKO Elena E MARTIacuteNEZ Jairo Reneacute Preparacioacuten de la muestra un paso crucial para el anaacutelisis por GC-MS Uma publicaccedilatildeo trimestral do Instituto Internacional de Cromatografia (IIC) Ciecircncia Cromatograacutefica 2011 vol 3 no 1 [35] Imagen GC-MS httpsorgspectroscopyintblogspotcomes201411gas-chromatography-mass-spectrometry-gchtml (Acceso el diacutea 17052017) [36] httpwwwactlabscompageaspxmenu=65ampapp=221ampcat1=534amptp=2amplk=no (Acceso el diacutea 17052017)
52
IV Bibliografiacutea [37] Quintela O Cruz A Concheiro M De Castro A amp Loacutepez-Rivadulla M (2005) Metodologiacutea LC-MS Aspectos generales de la teacutecnica y sus aplicaciones en el campo de la toxicologiacutea Rev Toxicol 22 paacutegs7-14 [38] Imagen LC-MS httpsuploadwikimediaorgwikipediaenff9Liquid_chromatography_tandem_Mass_spectrometry_diagrampng (visto 18052017) [39] Vargas de la Cruz Celia Bertha Adaptacioacuten de la Metodologiacutea Analiacutetica para la determinacioacuten de residuos de plaguicidas en frutas nativas de exportacioacuten mediante Uplc-MsMs (2012) Tesis obtenida en http20062146130handlecybertesis2331 (Acceso el diacutea 772017) [40] ROMERO GONZAacuteLEZ Roberto Fernaacutendez Moreno Joseacute Luis Plaza Bolantildeos Patricia Garrido Frenich Antonia Martiacutenez Vidal Joseacute Luis Empleo de la espectrometriacutea de masas como herramienta para la determinacioacuten de toacutexicos en alimentos hacia la seguridad alimentaria Revista Espantildeola de salud puacuteblica 2007 vol 81 no 5 p 461-474 [41] PAYAacute Andrus Fundamento y Funciones de la Espectrometriacutea de Masas Universidad de Valencia Espantildea 2006 httpmuraluvescaloan (Acceso el diacutea 19052017) [42] Imagen MS sacada de httpsesslidesharenetMaYaTorrezespectrometria-demasas (Acceso el diacutea 21052017) [43] ECONOMOU Anastasios Botitsi Helen Antoniou Spyros Tsipi Despina Determination of multi-class pesticides in wines by solid-phase extraction and liquid chromatography-tandem mass spectrometry Journal of Chromatography A 2009 vol 1216 no 31 p 5856-5867 [44] FONTANA A R Rodriacuteguez I Ramil M Altamirano JC Cela R Liquid chromatography time-of-flight mass spectrometry following sorptive microextraction for the determination of fungicide residues in wine Analytical and bioanalytical chemistry 2011 vol 401 no 2 p 767-775 [45] PELAJIĆ Maja G Peček DM Pavlović DV Čepo Novel multiresidue method for determination of pesticides in red wine using gas chromatographyndashmass spectrometry and solid phase extraction Food chemistry 2016 vol 200 p 98-106 [46] Ignaz J Buerge Juumlrgen Krauss Rociacuteo Loacutepez-Cabeza Werner Siegfried Michael Stuumlssi Felix E Wettstein Thomas Poiger Stereoselective Metabolism of the Sterol Biosynthesis Inhibitor Fungicides Fenpropidin Fenpropimorph and Spiroxamine in Grapes Sugar Beets and Wheat Journal of Agricultural and Food Chemistry 2016 vol 64 no 26 p 5301-5309 [47] M Hu X Liu F Dong J Xu S Li H Xu Y Zheng Determination of ametoctradin residue in fruits and vegetables by modified quick easy cheap effective rugged and safe method using ultra-performance liquid chromatographytandem mass spectrometry Food chemistry 2015 vol 175 p 395-400 [48] WALORCZYK Stanisław DROŻDŻYŃSKI Dariusz GNUSOWSKI Bogusław Multiresidue determination of 160 pesticides in wines employing mixed-mode dispersive-solid phase extraction and gas chromatographyndashtandem mass spectrometry Talanta 2011 vol 85 no 4 p 1856-1870 [49] Tianyang Guo Pingping Fang Juanjuan Jiang Feng Zhan Wei Yong Jiahui Liu YiYang Dong Rapid screening and quantification of residual pesticides and illegal adulterants in red wine by direct analysis in real time mass spectrometry Journal of Chromatography A 2016 vol 1471 p 27-3 [50] GONZAacuteLEZ-RODRIacuteGUEZ R M CANCHO-GRANDE B SIMAL-GAacuteNDARA J Decay of fungicide residues during vinification of white grapes harvested after the application of some new active substances against downy mildew Food chemistry 2011 vol 125 no 2 p 549-560 [51] CARPINTEIRO I Ramil M Rodriacuteguez I Cela R Determination of fungicides in wine by mixed-mode solid phase extraction and liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry Journal of Chromatography A 2010 vol 1217 no 48 p 7484-7492
53
Compuesto Estructura Nombre sistemaacutetico Foacutermula CAS Uso ordflog (kow) pKa
Ametoctradin
(AME)
5-ethyl-6-
octyl[124]triazolo[15-
a]pyrimidin-7-amine
C15H25N5 865318-97-4 F 440 278
Benalaxyl
(BEN)
Methyl-N-(phenylacetyl)-N-
(26-xylyl)-D-alaninate C20H23NO3 98243-83-5 F 368 -
Boscalid
(BOS)
2-Chloro-N-(4rsquo-
chlorobiphenyl-2-yl)-
nicotinamide
C18H12Cl2N2O 188425-85-6 F 296 -
Carbendazim
(CAR)
Methyl 2-benzimidazole
carbamate C9H9N3O2 10605-21-7 F 148 420
Cyprodinil
(CYP)
4-Cyclopropyl-6-methyl-N-
phenilpyrimidin-2-amine C14H15N3 121552-61-2 F 400 309
Dimethomorph
(DIM)
(2E)-3-(4-chlorophenyl)-3-(34-
dimethoxyphenyl)-1-
(morpholin-4-yl)prop-2-en-1-
one
C21H22ClNO4 110488-70-5 F 268 -13
Fenhexamid
(FEH)
N-(23-dichloro-4-
hydroxyphenyl)-1-methyl-
cyclohexanecarboxamide
C14H17Cl2NO2 126833-17-8 F 351 73
Fenpropidin
(FEP)
1-[(RS)-3-(4-tert-butylphenyl)-
2-methylpropyl]piperidine C19H31N 67306-00-7 F 26 1013
Fluopicolid
(FLU)
26-dichloro-N-[3-chloro-5-
(trifluoromethyl)-2-
pyridylmethyl]benzamide
C14H8Cl3F3N2O 239110-15-7 F 29 -
Imidacloprid
(IMI)
(E)-1-(6-chloro-3-
pyridylmethyl)-N-
nitroimidazolidin-2-
ylideneamine
C9H10ClN5O2 138261-41-3 I 057 -
Iprovalicarb
(IPR)
Isopropyl (S)-2-methyl-1-[1-(p-
tolyl)ethylcarbamoyl]propyl-
carbamate
C18H28N2O3 140923-17-7 F 32 -
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Tabla I1 Estructura clasificacioacuten y propiedades fiacutesico-quiacutemicas de intereacutes para los analitos de estudio
7
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Compuesto Estructura Nombre sistemaacutetico Foacutermula CAS Uso ordflog (kow) pKa
Mandipropamid
(MAN)
2-(4-chlorophenyl)-N-[3-
methoxy-4-(2-
propynyloxy)phenethyl]-2-(2-
propynyloxy)acetamide
C23H22ClNO4 374726-62-2 F 32 -
Metalaxyl
(MET)
N-(26-dimethylphenyl)-N-
(methoxyacetyl)-DL-alanine
methyl ester
C15H21NO4 57837-19-1 F 175 000
Myclobutanil
(MYC)
2-(4-chlorophenyl)-2-(1H-
124-triazol-1-
ylmethyl)hexanentrile
C15H17ClN4 88671-89-0 F 289 230
Penconazol
(PEN)
1-[2-(24-
dichlorophenyl)pentyl]-1H-
124-triazole
C13H15Cl2N3 66246-88-6 F 372 151
Pyraclostrobin
(PYC)
Methyl2-[1-(4-chlorophenyl)-
1H-pyrazol-3-
yloxymethyl]phenylmetoxy-
carbamate
C19H18ClN3O4 175013-18-0 F 399 -
Pyrimethanil
(PYM)
4-6-dimethyl-N-phenyl-2-
pyrimidinamine C12H13N3 53112-28-0 F 284 352
Tebuconazol
(TEC)
1-(4-chlorophenyl)-44-
dimethyl-3-(1H-124-triazol-1-
ylmethyl)-3-pentanol
C16H22ClN3O 107534-96-3 F 370 500
Tebufenozid
(TEF)
35-dimethylbenzoic acid 1-
(11-dimethylethyl)-2-(4-
ethylbenzoyl)hidrazide
C22H28N2O2 112410-23-8 I 425 -
Thiabendazol
(TBZ)
2-(13-thiazol-4-yl)-1H-
benzimidazole C10H7N3S 148-79-8 F 239 473
Thiamethoxam
(TME)
3-[(2-chloro-5-
thiazolyl)methyl]tetrahydro-5-
methyl-N-nitro-4H-135-
oxadiazin-4-imine
C8H10ClN5O3S 153719-23-4 I -013 -
Thiophanate-
methyl
(THI-M)
DimethylNNrsquo-[12-
phenylenebis(azanediylcarbono
thioyl)] dicarbamate
C12H14N4O4S2 23564-05-8 F 145 728
Triadimenol
(TRI)
1-(4-chlorophenoxy)-33-
dimethyl-1-(1H-124-triazol-1-
yl)-2-butanol
C14H18ClN3O2 55219-65-3 F 318
-
ordf Valores para la forma neutra 8
Capiacutetulo I Introduccioacuten
13 Toxicidad de los pesticidas
En los uacuteltimos antildeos el uso indiscriminado de pesticidas de siacutentesis en agricultura ha creado graves problemas de
salud y medioambientales ya que su uso debido al aumento de la poblacioacuten y por consiguiente de la actividad
agraria se ha incrementado considerablemente Durante las tres uacuteltimas deacutecadas una estimacioacuten dada por la
Organizacioacuten Mundial de la Salud y el Programa de las Naciones Unidas para el Medio Ambiente revela que
aproximadamente cerca de 20000 personas al antildeo mueren generalmente agricultores por exposicioacuten continuada
a alguno de estos toacutexicos En la mayoriacutea de los casos los agricultores utilizan los pesticidas de forma que las
cantidades se desviacutean significativamente de las recomendadas ya que asocian cantidades maacutes altas con mayor
efectividad y velocidad de accioacuten El mal uso de dichos toacutexicos se ve en los signos presentes en los ecosistemas
afectados pudiendo llegar a ser perjudiciales para la salud humana Estos riesgos que causan tanto en la salud
como en el medioambiente pueden ser reducidos o en su defecto evitados mediante la educacioacuten sobre este tipo
de toacutexicos con el fin de frenar su uso excesivo y descontrolado [17]
Desde el punto de vista medioambiental los fitosanitarios empleados en un cultivo pueden persistir en los
distintos medios tierra aire o agua y afectar tanto a ecosistemas terrestres como acuaacuteticos En los sistemas
terrestres los suelos son contaminados mediante la aplicacioacuten del toacutexico de forma directa o como deposicioacuten del
resultado de una suspensioacuten aeacuterea Eacutestos pueden persistir desde varios diacuteas hasta varios antildeos ya que el suelo
retiene y moviliza el toacutexico despueacutes de su emisioacuten Los que persisten maacutes tiempo en el medioambiente tienen una
mayor probabilidad de interaccionar con otros elementos del sistema y si su vida media es mayor a la frecuencia
con la que se aplica el pesticida tienden a acumularse tanto en el suelo como en las especies que habitan en eacutel Por
otro lado el agua es contaminada por pesticidas bien por aplicacioacuten directa por estar presentes en las
precipitaciones de la atmoacutesfera o bien por la movilidad que tienen desde el suelo Tanto los pesticidas solubles
como los insolubles interaccionan con los ecosistemas acuaacuteticos los hidrosolubles persisten maacutes tiempo
solubilizados en agua mientras que los otros se asocian a los sedimentos y se concentran en las especies que
habitan el medio acuaacutetico [18]
Como consecuencia de la amplia distribucioacuten de los toacutexicos en aire suelo y agua se produce una acumulacioacuten de
ellos en los elementos que contribuyen a la alimentacioacuten humana ya que su amplio uso hace que el contacto con
los plaguicidas por parte de personas y animales sea inevitable La contaminacioacuten de los alimentos se puede
presentar por aplicacioacuten directa de los pesticidas el uso de eacutestos durante el manejo transporte y almacenamiento
de los productos comestibles o por su acumulacioacuten en la cadena troacutefica Son bioacumulables en el organismo
debido a su caraacutecter lipofiacutelico lo que les confiere una vida media en los tejidos larga La exposicioacuten a pesticidas
persistentes no tiene la misma repercusioacuten en cada uno de los individuos expuestos sino que se considera criacutetica la
exposicioacuten durante la etapas embrionaria fetal y primeros antildeos de vida en doacutende se transmite de madres a hijos
mediante la gestacioacuten y la lactancia como resultado de la acumulacioacuten en el tejido graso de la madre [19]
9
Capiacutetulo I Introduccioacuten
14 Legislacioacuten
El aumento del uso de fitosanitarios en actividades relacionadas con la produccioacuten de alimentos para consumo
humano o animal tambieacuten desembocoacute en una preocupacioacuten social debido a su toxicidad y bioacumulacioacuten En
respuesta la Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura (FAO) en colaboracioacuten
con la Organizacioacuten Mundial de la Salud (OMS) pusieron en marcha un programa Codex Alimentarius cuyo
objetivo a traveacutes de sus normas y coacutedigos de praacutecticas alimentarias internacionales es garantizar la calidad e
inocuidad de los alimentos que estaacuten al alcance de cualquier persona Con estas normas internacionales los
consumidores pueden confiar en la calidad de los alimentos independientemente de su origen geograacutefico [20]
Todos los alimentos destinados al consumo humano o animal en la Unioacuten Europea estaacuten sujetos a un liacutemite
maacuteximo de residuos de plaguicidas para la proteccioacuten de la salud humana y animal Actualmente en lo referente a
legislacioacuten para el control de la cantidad del toacutexico en la uva estaacute vigente el Reglamento 3962005 del Parlamento
Europeo y del Consejo de 23 de febrero de 2005 referido a la regulacioacuten de los liacutemites maacuteximos de residuos de
plaguicidas en alimentos y piensos de origen vegetal y animal El liacutemite maacuteximo de residuos (LMR) se define co-
mo el nivel maacutes alto de un residuo de un pesticida que se tolera de manera legal sobre los alimentos o piensos
cuando se aplican correctamente Las cantidades de residuos que se encuentren deben ser lo maacutes bajas posible
para garantizar la seguridad en la alimentacioacuten de los consumidores Dichos liacutemites maacuteximos de residuos estaacuten
fijados por la Comisioacuten Europea pudieacutendose encontrar en su base de datos LMR [21]
A continuacioacuten en la Tabla I2 se resumen los LMRs de los compuestos de este estudio en uvas de vinificacioacuten
en unidades de mgkg de uva En el caso del vino no hay legislacioacuten en lo referente a estos pesticidas solamente
la recomendacioacuten de no superar el 10 del valor del LMR en uva
Compuesto LMRs (mgkg uva) Compuesto LMRs (mgkg uva)
AME 6 MET 1
BEN 03 MYC 1
BOS 5 PEN 02
CAR 05 PYC 2
CYP 3 PYM 5
DIM 3 TEC 1
FEH 15 TEF 3
FEP 001 TBZ 005
FLU 2 TME 04
IMI 1 THI-M 3
IPR 2 TRI 2
MAN 2
Tabla I2 Liacutemites maacuteximos de residuos permitidos para los compuestos estudiados en uvas
10
Capiacutetulo I Introduccioacuten
2 MEacuteTODOS DE PREPARACIOacuteN DE MUESTRA APLICADOS A MUESTRAS DE VINO
21 Extraccioacuten liacutequido-liacutequido (LLE)
Se entiende por extraccioacuten liacutequido-liacutequido al meacutetodo mediante el cual un analito de intereacutes se separa por el
contacto con otra fase en la cual tiene mayor afinidad de la matriz en la que se halle Los procesos de extraccioacuten
implican dos fases y requieren tres pasos sucesivos mezcla de materia prima y disolvente separacioacuten de las dos
fases despueacutes del contacto y eliminacioacuten del disolvente que contiene el analito [22]
La extraccioacuten liacutequido-liacutequido (LLE) se basa en la distribucioacuten
de un analito entre dos fases liacutequidas inmiscibles en las
cuales analito y matriz tienen solubilidades diferentes
Principalmente una de las fases es un medio acuoso en
general se trata de la muestra y la otra un disolvente
orgaacutenico La selectividad y eficacia de este meacutetodo vienen
determinadas por la eleccioacuten del disolvente y por los factores
que pueden afectar al proceso de equilibrio (pH adiccioacuten de
sales neutras en la fase acuosa para reducir la solubilidad del
analito etc) [23] Esta teacutecnica permite llevar a cabo extracciones para un rango muy amplio de analitos siendo
una de las maacutes antiguas para la preparacioacuten de muestras en el anaacutelisis cualitativo y cuantitativo Ofrece grandes
capacidades de muestreo lineal y cuenta con la ventaja de la cantidad de informacioacuten existente sobre este meacutetodo
[24]
22 Extraccioacuten en fase soacutelida (SPE)
En 1978 aparecieron los primeros cartuchos desechables para la extraccioacuten en fase soacutelida y actualmente casi 40
antildeos despueacutes la extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) es la teacutecnica de preparacioacuten de muestras maacutes empleada en los
laboratorios Es una teacutecnica de preparacioacuten y tratamiento de muestras que se basa en la retencioacuten en una fase
adsorbente del analito de intereacutes presente en una muestra liacutequida que pasa a traveacutes de ella Debido a la variedad de
formatos (discos cartuchos y jeringas) y tipos de adsorbentes (los maacutes comunes carboacuten activo aluacutemina siacutelica gel
silicato de magnesio siacutelices enlazadas y poliacutemeros como por ejemplo estinero-divinilbenceno) o la facilidad de
automatizacioacuten y acoplamiento con otras teacutecnicas como por ejemplo una conexioacuten directa con un sistema de
Figura I4 Fundamentos teoacutericos de la LLE [25]
11
Capiacutetulo I Introduccioacuten
cromatografiacutea este meacutetodo le fue ganando terreno a la LLE Otra ventaja muy importante de la SPE frente a la
LLE es la disminucioacuten en la cantidad de disolvente orgaacutenico empleada Cada vez se va innovando maacutes sobre esta
teacutecnica llegando a encontrarse fases adsorbentes formadas por poliacutemeros capaces de retener en un uacutenico
cartucho un amplio abanico de analitos lipofiacutelicos o hidrofoacutebicos aacutecidos baacutesicos o neutros [26]
El fundamento de esta extraccioacuten como se puede en la Figura I6
consiste en cuatro etapas acondicionamiento adiccioacuten de muestra
retencioacuten y elucioacuten de los analitos de intereacutes En primer lugar antes
de empezar la extraccioacuten se requiere una etapa de acondicionamiento
para preparar el adsorbente haciendo pasar un poco de disolvente
para asiacute interaccionar mejor con la muestra Luego se hace pasar la
muestra liacutequida por la fase soacutelida Idealmente el adsorbente retiene
los analitos selectivamente a medida que va pasando la muestra y la
matriz pasa sin ser retenida Por uacuteltimo los analitos se eluyen del
adsorbente con un disolvente con el que tenga mayor afinidad [27]
23 Teacutecnicas de microextraccioacuten
231 Microextraccioacuten en fase soacutelida (SPME)
En la microextraccioacuten en fase soacutelida (SPME) se utilizan fibras de siacutelice fundida revestidas con un poliacutemero en un
disentildeo en forma de jeringa para la extraccioacuten de los analitos de intereacutes El principio por el que se rige esta
extraccioacuten es el reparto del analito entre la matriz de la muestra y el revestimiento de la fibra mediante un proceso
no competitivo Se trata de un meacutetodo que cuenta con muchas ventajas ya que se elimina completamente el uso de
disolventes y aparte no son necesarios voluacutemenes de muestra grandes pero tambieacuten cuenta con algunas
desventajas ya que tanto la capacidad como la sensibilidad se ven limitadas [29]
En la figura I7 podemos ver las etapas de la extraccioacuten En un
vial cerrado con una caacutepsula y un seacuteptum tenemos la muestra
liacutequida o bien soacutelida que contenga los analitos de intereacutes
volaacutetiles Con la jeringa se perfora el seacuteptum y una vez dentro
se acciona el eacutembolo para la exposicioacuten de la fibra con los
analitos introducieacutendola en la muestra liacutequida o en su defecto
en el espacio de cabeza para la extraccioacuten de analitos volaacutetiles
de una muestra soacutelida Despueacutes de la extraccioacuten dentro del vial
Figura I6 Etapas de una SPE [28]
Figura I7 Etapas de una SPME [30]
12
Capiacutetulo I Introduccioacuten
la fibra se introduce de nuevo en la jeringa y se retira del vial [27]
232 Microextraccioacuten en fase liacutequida (LPME)
La microextraccioacuten en fase liacutequida se desarrolloacute como una alternativa a la LLE para la reduccioacuten en la cantidad de
disolventes orgaacutenicos siendo rentable tanto para el medioambiente como econoacutemicamente Entre las modalidades
maacutes populares de esta teacutecnica se encuentran microextraccioacuten con gota suspendida (SDME) y microextraccioacuten
liacutequido-liacutequido dispersiva (DLLME) En la SDME una gota de disolvente orgaacutenico es expuesta al espacio de
cabeza situado sobre una muestra en un vial dicha gota es suspendida del extremo de una microjeringa Por otro
lado la DLLME sobre una muestra acuosa se inyecta un pequentildeo volumen de una mezcla de disolventes en la
cual es dispersada formando una solucioacuten en la que se establece el equilibrio El disolvente de extraccioacuten debe
presentar una densidad inferior a la de la muestra para facilitar su recuperacioacuten normalmente despueacutes de
centrifugar el vial doacutende se realiza la extraccioacuten [31]
24 QuEChERS
La extraccioacuten QuEChERS de las palabras en ingleacutes Quick Easy Cheap Effective Rugged and Safe es un meacutetodo
de extraccioacuten que se desarrolloacute entre 2000 y 2002 para el anaacutelisis de pesticidas Como su nombre indica raacutepido
faacutecil barato eficaz robusto y seguro son las principales
caracteriacutesticas de esta preparacioacuten de muestra Se realiza en dos
etapas en primer lugar una extraccioacuten simple y una segunda fase
de purificacioacuten En la primera etapa tenemos el vial con la
muestra en el cual se antildeade un disolvente generalmente
acetonitrilo para la extraccioacuten de los analitos de intereacutes en
presencia de diferentes sales (en el meacutetodo original se utiliza
sulfato de magnesio y cloruro de sodio) para facilitar la separacioacuten
de las fases En la segunda parte se realiza la purificacioacuten de la
fraccioacuten del extracto orgaacutenico Para eso se lleva a cabo una
limpieza de los analitos eliminando el agua y los compuestos
presentes en la matriz de la muestra empleando un adsorbente PSA (amina primaria y secundaria) C18 carboacuten
negro grafitizado (GCB) o una combinacioacuten de eacutestas [32]
Figura I8 Etapas de QuEChERS [33]
13
Capiacutetulo I Introduccioacuten
3 METODOLOGIacuteA ANALIacuteTICA PARA LA DETERMINACIOacuteN DE PESTICIDAS
31 Meacutetodos de GC-MS (MSMS)
La combinacioacuten de cromatografiacutea de gases (GC) teacutecnica de separacioacuten con espectrometriacutea de masas (MS) como
sistema de deteccioacuten representa un potente meacutetodo para la identificacioacuten determinacioacuten y cuantificacioacuten de
analitos orgaacutenicos en concentraciones traza presentes en muestras complejas Esta teacutecnica de anaacutelisis cuenta con
muchas ventajas en sensibilidad multifuncionalidad buena reproducibilidad robustez asiacute como facilidad en el
manejo pero con una gran desventaja este meacutetodo no es apto para ser utilizado con todos los analitos sino que
se ve limitado a aquellos que sean termoestables y no se descompongan a temperaturas elevadas antes de ser
volatilizados La muestra es introducida a traveacutes del inyector en el cromatoacutegrafo de gases doacutende impulsada por
una corriente de gas inerte como fase moacutevil pasa a traveacutes de la columna que contiene la fase estacionaria en la
cual se separan los compuestos debido a una distribucioacuten de estos entre fase moacutevil-fase estacionaria Mediante
una interfase son introducidos para su deteccioacuten en el espectroacutemetro de masas que cuenta con una fuente de
iones analizador de masas y un detector [34]
La combinacioacuten de analizadores de masas en taacutendem (MSMS) como sistema de deteccioacuten en GC es una teacutecnica
altamente selectiva mejorando la sensibilidad y la relacioacuten sentildeal-ruido en los espectros experimentando una
mejora por lo que se logran unos liacutemites de deteccioacuten inferiores Esta teacutecnica GC-MSMS comprende maacutes
pasos despueacutes de la separacioacuten por cromatografiacutea se lleva a cabo la deteccioacuten con MSMS que consta de varias
etapas generacioacuten de iones en la fuente de ionizacioacuten seleccioacuten de los iones precursores de una determinada
masa disociacioacuten causada por colisioacuten con moleacuteculas de gas inerte de los iones precursores y por uacuteltimo el
anaacutelisis de los fragmentos en relacioacuten a su masacarga (mz) En el caso de que un espectro de MS no permita
confirmar la identidad de un determinado compuesto quiacutemico la obtencioacuten de su espectro de MSMS permite
mejorar la confianza en su identificacioacuten [36]
Figura I9 Acoplamiento GC-MS [35]
14
Capiacutetulo I Introduccioacuten
32 Meacutetodos LC-MS (MSMS)
La teacutecnica de LC-MS se desarrolloacute para minimizar las desventajas del acoplamiento GC-MS y asiacute resolver los
problemas que este uacuteltimo acarreaba con los analitos termolaacutebiles permitiendo el anaacutelisis de eacutestos sin tener que
realizar una etapa previa de derivatizacioacuten La interfase de unioacuten de cromatografiacutea liacutequida (LC) con espectrometriacutea
de masas (MS) acarrea una dificultad significativa siendo responsable de transformar los analitos que se
encontraban en la fase moacutevil liacutequida en iones en fase gas sin que se produzca su degradacioacuten teacutermica La
sensibilidad de las determinaciones por LC-MS va a depender de la interfase empleada Las principales interfases
empleadas actualmente son las ionizaciones a presioacuten atmosfeacuterica electrospray (ES) e ionizacioacuten quiacutemica a
presioacuten atmosfeacuterica (APCI) [37]
Con los antildeos la cromatografiacutea liacutequida se ha ido innovando y mediante la disminucioacuten del tamantildeo de partiacutecula en
la columna se fue mejorando la eficiencia asiacute como aumentando la selectividad y resolucioacuten del pico en el
cromatograma Para este nuevo sistema llamado UPLC Ultra-Performance Liquid Chromatography se desarrolloacute
una nueva instrumentacioacuten capaz de trabajar a altas presiones generando flujos mayores sin peacuterdidas de
resolucioacuten utilizando inyectores automaacuteticos maacutes raacutepidos y detectores con mayor velocidad de adquisicioacuten de
datos disminuyendo asiacute el tiempo de anaacutelisis [39]
33 Espectrometriacutea de masas
La espectrometriacutea de masas es el meacutetodo de deteccioacuten y cuantificacioacuten maacutes fiable a la hora de la determinacioacuten de
compuestos en matrices complejas (tales como alimentos) ya que otros detectores maacutes tradicionales como UV-
visible o fluorescencia cuentan con una gran incertidumbre en los resultados llegando incluso a ofrecer falsos
Figura I10 Acoplamiento LC-MS [38]
15
Capiacutetulo I Introduccioacuten
positivos o negativos Un espectrometro de masas cuenta con un dispositivo de introduccioacuten de muestra una
caacutemara de ionizacioacuten un sistema para la aceleracioacuten de los iones uno o varios analizadores de masas y un detector
[40]
El fundamento de la espectrometriacutea de masas se basa en la separacioacuten de iones en base a la relacioacuten masacarga
(mz) El proceso consta fundamentalmente de cuatro etapas La
primera es la ionizacioacuten de la muestra los iones formados se aceleran
debido a la accioacuten de un campo eleacutectrico variable separacioacuten de los
iones seguacuten su masacarga deteccioacuten de los iones y produccioacuten de la
sentildeal eleacutectrica El analizador de masas es el encargado de la separacioacuten
de los iones en funcioacuten a su mz entre los que maacutes destacan
analizador de masas cuadrupolar que dispersa simultaacuteneamente todos
los iones en funcioacuten de la relacioacuten mz analizador de masas de
tiempo de vuelo (TOF) consta de un tubo a alto vaciacuteo sobre el que no
actuacutea ninguacuten campo eleacutectrico al cual llegan todos los iones acelerados con la misma energiacutea cineacutetica y en el tubo
las velocidades variacutean seguacuten mz y analizador de trampa de iones en doacutende los iones gaseosos quedan aislados
durante largos periacuteodos de tiempo por la accioacuten del campo eleacutectrico [41]
4RESUMEN BIBLIOGRAacuteFICO DE LAS TEacuteCNICAS DE EXTRACCIOacuteN Y
DETERMINACIOacuteN DE PESTICIDAS EN VINO
En la bibliografiacutea se han descrito diversas teacutecnicas y diferentes combinaciones entre teacutecnicas de extraccioacuten y
distintas teacutecnicas de cuantificacioacuten e identificacioacuten para esos analitos Entre estas teacutecnicas los valores de los liacutemites
de cuantificacioacuten (LOQs) y las recuperaciones relativas pueden diferir en el resultado en un rango de valores asiacute
como el tiempo total empleado para el anaacutelisis y para la preparacioacuten de la muestra
Por lo general el meacutetodo de extraccioacuten de los analitos de intereacutes maacutes empleado es la extraccioacuten en fase soacutelida
(SPE) la cuaacutel le ha estado ganando terreno a la extraccioacuten liacutequido-liacutequido aunque tambieacuten se estaacute viendo cada vez
maacutes desplazada debido al creciente uso de la teacutecnica QuEChERS
Figura I11 Etapas de la espectrometriacutea de masas [42]
16
Capiacutetulo I Introduccioacuten
En el estudio de ECONOMOU et al [43] realizado en el antildeo 2009 en Grecia se empleoacute la extraccioacuten en fase
soacutelida con deteccioacuten en cromatografiacutea de liacutequidos acoplada a espectrometriacutea de masas en taacutendem (SPE-LC-ESI-
MSMS) Para la preparacioacuten de la muestra diluyeron 10 mL de vino (tanto blanco como tinto) a un volumen
final de 100 mL con agua ultrapura antes de la SPE Determinaron las recuperaciones de la extraccioacuten para dos
niveles de concentracioacuten 0010 y 0050 mgL realizando 8 medidas diarias durante 3 diacuteas consecutivos
encontraacutendose unos valores que variacutean dentro del rango 70-110 para todos los pesticidas en los dos niveles Para
la determinacioacuten y cuantificacioacuten de 46 pesticidas emplearon la teacutecnica de cromatografiacutea de liacutequidos con
espectrometriacutea de masas con un volumen de inyeccioacuten de 20 microL y un flujo de fase moacutevil de 02 mLmin
aclopada a espectrometriacutea de masas en taacutendem
Con la misma teacutecnica de extraccioacuten PELAJIĆ et al [45] durante el antildeo 2015 en Croacia llevaron a cabo la
determinacioacuten de 25 residuos de plaguicidas en vino tinto El meacutetodo que desarrollaron para dicha finalidad fue el
acoplamiento SPE-GC-MS Para la preparacioacuten de la muestra emplearon 10 mL de vino diluidos 11 con agua
ultrapura hasta un volumen final de 20 mL Calcularon las recuperaciones de la extraccioacuten y se encontroacute un rango
para todos los pesticidas en las muestras de 70-120 Para la determinacioacuten en cromatografiacutea de gases-
espectrometriacutea de masas se empleoacute un volumen de inyeccioacuten de 5 μL y un flujo de fase moacutevil de 10 mLmin
Mediante el acoplamiento de teacutecnicas SPE dispersiva-GC-MS WALORCZYK et al [48] en el antildeo 2011 en
Polonia llevaron a cabo la cuantificacioacuten de 160 pesticidas en diferentes clases de vino tinto rosado y blanco Con
10 g de vino y 10 mL de acetonitrilo se realizaron pruebas de recuperacioacuten en la fase de extraccioacuten para vino
tinto con los niveles de concentracioacuten 001 005 y 02 mgkg y para los vinos rosado y blanco con el nivel de
concentracioacuten 005mgkg y encontraron que a todos los niveles de concentracioacuten los valores de recuperacioacuten
rondan el rango 80-110 Para la teacutecnica cromatograacutefica se utilizoacute un volumen de inyeccioacuten de 5 microL
El acoplamiento LLE-SPE-LCDAD fue desarrollado por GONZAacuteLEZ-RODRIacuteGUEZ et al [50] en el antildeo
2010 en la provincia de Orense para la determinacioacuten de nuevos fungicidas propuestos para combatir el hongo
que provoca la enfermedad del mildium En la preparacioacuten de la muestra emplearon 15 mL de vino blanco para la
extraccioacuten en la cual fueron calculadas las recuperaciones relativas para dos niveles de concentracioacuten 005 y 05
mgkg en donde se establece un rango de entre 70-110 para todos los analitos Para la determinacioacuten mediante
cromatografiacutea de liacutequidos se empleoacute un volumen de inyeccioacuten de 2 μL y como meacutetodo de deteccioacuten utilizaron un
detector de diodos array
La microextraccioacuten sorptiva en fase soacutelida fue empleada en la publicacioacuten de FONTANA et al [44] junto con un
acoplamiento entre cromatografiacutea de liacutequidos y espectrometriacutea de masas para la determinacioacuten de 15 fungicidas
en vino realizada durante el 2010 en el noroeste de Espantildea Para la preparacioacuten de la muestra emplearon 10 mL
17
Capiacutetulo I Introduccioacuten
de vino diluiacutedos con el mismo volumen de agua ultrapura y un sorbente en forma de disco de silicona con un
volumen de 12 microL La recuperacioacuten de la extraccioacuten se calculoacute para vino tinto (Menciacutea) y vino blanco (Godello)
realizando tres replicas dentro de un mismo diacutea para los niveles de concentracioacuten 10 y 50 ngmL y nueve reacuteplicas
realizando el anaacutelisis en tres diacuteas consecutivos para el nivel de concentracioacuten de 25 ngmL y los resultados
obtenidos dan unos valores de recuperacioacuten dentro del rango 75-117 En el sistema LC-QTOF-MS el volumen
de inyeccioacuten fue de 15 microL
El otro meacutetodo de extraccioacuten mencionado anteriormente es QuEChERS estaacute en auge como meacutetodo de extracioacuten
de residuos de pesticidas en matrices como la del vino o la uva ya que incrementa la velocidad del anaacutelisis y reduce
el efecto de matriz BUERGE et al [46] seguido de una deteccioacuten mediante GC-MSMS realizaron una estapa
de extraccioacuten QuEChERS con alguna modificacioacuten acetato de sodio en lugar de cloruro soacutedico y acetato de etilo
en lugar de acetonitrilo utilizando 5 g de uva para la determinacioacuten de residuos de 4 pesticidas durante el antildeo
2016 Las recuperaciones de extraccioacuten resultaron ser valores entre 91-149 en uva a distintos niveles de
concentracioacuten 005 05 y 5 mgkg
Para la determinacioacuten de Ametoctradin HU et al [47] llevaron a cabo una extraccioacuten QuEChERS empleando 10
g de uva con deteccioacuten mediante el acoplamiento UPLC-MSMS utilizando un volumen de inyeccioacuten de 5 μL y
un flujo de fase moacutevil de 03 mLmin Las recuperaciones de la extraccioacuten se calcularon para tres niveles de
concentracioacuten 1 10 100 μgL de dos formas distintas en tres diacuteas consecutivos realizando 5 reacuteplicas al diacutea o en
dentro de un mismo diacutea realizando 15 reacuteplicas los resultados de todos los caacutelculos se encuentran dentro del rango
818-1001
Siguiendo con el mismo modo de extraccioacuten GUO et al [49] publicaron sus estudios para la determinacioacuten de
50 pesticidas y 12 adulterantes en vino tinto Para la extraccioacuten QuEChERS se utilizaron 10 mL de vino tinto con
10 mL de acetonitrilo y calcularon las recuperaciones para tres niveles de concentracioacuten 50 100 y 250 ngmL
encontraacutendose un rango de valores entre 75-120 El meacutetodo de deteccioacuten se llevoacute a cabo mediante un anaacutelisis
directo en tiempo real junto con espectrometriacutea de masas en tandem con un cuadrupolo (DART-MSMS) la
teacutecnica DART es un meacutetodo raacutepido para cribar y cuantificar los analitos de estudio que prescinde de la etapa de
separacioacuten cromatograacutefica
A continuacioacuten se recogen en la Tabla I3 los liacutemites de cuantificacioacuten (LOQs) de los analitos de intereacutes en este
trabajo caacutelculados por los diferentes meacutetodos encontrados en bibliografiacutea citados anteriormente en este apartado
18
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Tabla I3 LOQs de los analitos de intereacutes descritos para los distintos meacutetodos encontrados en la bibliografiacutea
Compuesto LOQs
Compuesto LOQs
V Blanco V Tinto Uva V Blanco V Tinto Uva
AME - - 0032μgkg[47] MET 86 μgL[43]
22 μgL[44]
89 μgL[43]
22 μgL[44]
5 μgL[45]
259 ngmL[49]
001mgkg[48]
BEN 02 μgL[44]
0001 mgL[50]
02 μgL[44]
001 μgL[45]
280ngmL[49]
005 mgkg[48] MYC 30 μgL[43]
08 μgL[44]
36 μgL[43]
10 μgL[44]
025 μgL[45]
331ngmL[49]
001 mgkg[48]
BOS 0065 mgL[50] 05 μgL[45]
1076 ngmL[49] 001 mgkg[48] PEN
56 μgL[43]
05 μgL[44]
49 μgL[43]
04 μgL[44]
220ngmL[49]
001 mgkg[48]
CAR - 386 ngmL[49] - PYC 0003mgL[50] 07 μgL[45] 001 mgkg[48]
CYP 15 μgL[43]
04 μgL[44]
0001 mgL[50]
22 μgL[43]
06 μgL[44]
312 ngmL[49]
001 mgkg[48] PYM 17 μgL[43] 22 μgL[43]
10 μgL[45] 001 mgkg[48]
DIM 18 μgL[43] 20 μgL[43] 001 mgkg[48] TEC 03 μgL[44]
03 μgL[44]
10 μgL[45]
160ngmL[49]
001 mgkg[48]
FEH 17 μgL[43] 22 μgL[43]
938 ngmL[49] 001 mgkg[48] TEF - 876ngmL[49] -
FEP - - 002mgkg[46] TBZ 15μgL [43] 29μgL[43] 001 mgkg[48]
FLU 005 μgL[45] TME - 25 μgL[45] 001 mgkg[48]
IMI 21 μgL[43] 22 μgL[43]
225 ngmL[49] - THI-M 92 μgL[43] 89 μgL[43] -
IPR 07 μgL[44] 07 μgL[44] 001 mgkg[48] TRI 10 μgL[44] 12 μgL[44] 001 mgkg[48]
MAN 0011 mgL[50] - -
5 DISTRIBUCIOacuteN DE PESTICIDAS EN VINOS COMERCIALES
En algunos de los meacutetodos descritos en el apartado anterior se procesaron vinos comerciales encontraacutendose
resultados positivos para muchos residuos de pesticidas y algunos hasta en gran concentracioacuten
ECONOMOU et al [43] mediante el meacutetodo LC-ESI-MSMS realizaron el anaacutelisis de 60 muestras de vino tinto
y blanco recogidos en supermercados locales en Grecia a lo largo de un antildeo El meacutetodo se habiacutea desarrollado
19
Capiacutetulo I Introduccioacuten
para la determinacioacuten de 46 pesticidas pero la mayoriacutea se encuentran con una concentracioacuten por debajo de
001mgL solo ocho plaguicidas se obtuvieron con resultados de concentracioacuten mayores Se muestran los
resultados en la Tabla I4 de los analitos de intereacutes en este estudio
Tabla I4 Nuacutemero de muestras positivas de distintos pesticidas en el anaacutelisis de 60 muestras de vino [43]
Compuesto Positivos con concentracioacuten entre 001-01
mgL
Positivos con concentracioacuten entre 01-1
mgL
PYM 2 (3) 2 (3)
MYC 2 (3) 0 (0)
CAR 11 (18) 7 (12)
THI-M 7 (12) 5 (8)
FEH 5 (8) 0 (0)
MET 1 (2) 0 (0)
Mediante el meacutetodo de microextraccioacuten en fase soacutelida-LC-TOF-MS FONTANA et al [44] aplicaron el
desarrollo del procedimiento a un total de 12 vinos joacutevenes elaborados en el 2010 y correspondientes a diferentes
denominaciones geograacuteficas del noroeste de Espantildea En la Tabla I5 se muestran los datos que han obtenido
Tabla I5 Determinacioacuten de fitosanitarios en vinos comerciales mediante Microextraccioacuten en fase soacutelida-LC-TOF-MS
Valores de concentracioacuten en ngmL [44]
Pesticidas
W 1
Albarintildeo
W5
Ribeiro
W6
Valdeorras
R1
Ribeira Sacra
R3
Ribeiro
R4
Valdeorras
MET 404plusmn06 223plusmn05 311plusmn007 25plusmn03 31plusmn03 74plusmn10
TRI nd nd 36plusmn06 nd nd ltLOQ
IPR 394plusmn03 324plusmn02 324plusmn02 071plusmn007 31plusmn02 28plusmn05
MYC nd nd nd ltLOQ 39plusmn02 nd
TEC 25plusmn01 nd nd nd nd nd
CYP 179plusmn08 ltLOQ ltLOQ 562plusmn002 083plusmn001 nd
BEN 042plusmn001 nd ltLOQ nd 032plusmn001 ltLOQ
ndNo detectados ltLOQ por debajo del liacutemite de cuantificacioacuten del meacutetodo los coacutedigos W y R corresponden respecti-vamente a los vinos blanco y tinto
20
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Por uacuteltimo PELAJIĆ et al [45] aplicaron su meacutetodo SPE dispersiva-GC-MS mediante el cual determinaron 25
residuos de plaguicidas en vino tinto a un total de 32 muestras de vino adquiridos en supermercados locales de
Croacia pero de diversos oriacutegenes de procedencia Los resultados que han obtenido se muestran en la Tabla I6
en doacutende un total de 15 plaguicidas han sido detectados y 7 de los cuales se encontraban en una alta
concentracioacuten
Tabla I6 Resultados de los vinos con positivos en pesticidas y sus concentraciones [45]
Vino Paiacutes Residuos de pesticidas (mgKg)
Tinto Francia DIM (0013) MET (0009) IPR (001)
Tinto Alemania BOS (0011)
Tinto Alemania IPR (0009)
Tinto Macedonia MET (0015)
Tinto Moldavia IPR (0008)
Tinto Polonia MET (004)
Tinto Rumania PYM (0058)
Tinto Espantildea TRI (0005) MET (0011)
Tinto Estados Unidos BOS (001)
Rosado Francia BOS (0005)
Blanco Chile TEC (0008)
Blanco Georgia MET (0057)
Blanco Alemania DIM (001) IPR (0054) PYM (0056)
Blanco Sudaacutefrica DIM (0011) IPR (0011)
21
Capiacutetulo II Objetivos y discusioacuten
CAPIacuteTULO II OBJETIVOS Y DISCUSIOacuteN
El objetivo principal que se persigue en este trabajo es el desarrollo de un meacutetodo analiacutetico raacutepido basado en la
extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) y deteccioacuten mediante cromatografiacutea de liacutequidos en la modalidad de UPLC
acoplada a la espectrometriacutea de masas en taacutendem (UPLC-MSMS) para la determinacioacuten multianalito de residuos
de fitosanitarios principalmente fungicidas aunque tambieacuten alguacuten insecticida en muestras de vino blanco y tinto
Para llevar a cabo la finalidad de lo dicho se consideran unos objetivos maacutes especiacuteficos
Minimizar la manipulacioacuten de la muestra para asiacute reducir la cantidad de disolventes y tiempo empleado
Optimizacioacuten de los factores que afectan en la extraccioacuten en la SPE tales como tipo y cantidad de
adsorbente volumen de eluyente etc
Estudio de las condiciones en UPLC-MSMS para una separacioacuten y cuantificacioacuten oacuteptimas
Caracterizacioacuten y validacioacuten del meacutetodo propuesto
Por uacuteltimo una vez cumplidos todos los objetivos anteriores y fijadas las condiciones oacuteptimas el meacutetodo
estudiado se aplica en el anaacutelisis de muestras de vino comercial (blanco y tinto) para determinar si se encuentran
residuos presentes asiacute como conocer en queacute concentracioacuten se encuentran los pesticidas objeto de este estudio
22
Capiacutetulo III Parte experimental
CAPIacuteTULO III PARTE EXPERIMENTAL
1 MATERIAL Y REACTIVOS
11 Material
Material de vidrio de uso comuacuten en el laboratorio vasos de precipitados matraces aforados etc
Micropipetas automaacuteticas de 20-200 microL 20-200 microL 100-1000 microL 1000-5000 microL Eppendorf
Puntas de plaacutestico para micropipetas
Encapsulador y desencapsulador
Soportes y pinzas
Viales de 15 mL transparentes para muestreador automaacutetico de cromatografiacutea (Sugelabor)
Caacutepsulas de aluminio con seacuteptum de Tefloacuten (Sugelabor) y tapones pre-slit para viales
Tubos y conectores de tefloacuten
Cartuchos de divinilbenceno-N-vinilpirrolidona 200 mg Oasis HLB Waters
Cartuchos de divinilbenceno-N-vinilpirrolidona funcionalizados con grupos amina cuaternaria 150 mg
Oasis MAX Waters
Cartuchos de divinilbenceno-N-vinilpirrolidona 60 mg Oasis HLB Waters
12 Reactivos y disolventes
Agua ultrapura Milli-Q
Aacutecido foacutermico (Sigma Aldrich) 95
Acetonitrilo (LichrosolvregMerck) Gradient grade for liquid chromatography
Metanol (LichrosolvregMerck) Gradient grade for liquid chromatography
Etanol (LichrosolvregMerck) Gradient grade for liquid chromatography
13 Patrones
Ametoctradin (AME) Dr Ehrenstrorfer 990
Benalaxyl (BEN) Pestanal Sigma- Aldrich 999
23
Capiacutetulo III Parte experimental
Boscalid (BOS) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Carbendazim (CAR) Pestanal Sigma- Aldrich 992
Cyprodinil (CYP) Pestanal Sigma- Aldrich 998
Dimethomorph (DIM) mezcla de isoacutemeros E + Z Pestanal Sigma- Aldrich 989
Fenhexamid (FEH) Pestanal Sigma- Aldrich 997
Fenpropidin (FEP) Dr Ehrenstrorfer 980
Fluopicolide (FLU) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Imidacloprid (IMI) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Iprovalicarb (IPR) mezcla de isoacutemeros Pestanal Sigma- Aldrich 985
Mandipropamid (MAN) Pestanal Sigma- Aldrich 991
Metalaxyl (MET) Pestanal Sigma- Aldrich 990
Myclobutanil (MYC) Pestanal Sigma- Aldrich 994
Penconazole (PEN) Pestanal Sigma- Aldrich 991
Pyraclostrobin (PYC) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Pyrimethanil (PYM) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Tebuconazol (TEC) Pestanal Sigma- Aldrich 996
Tebufenozide (TEF) Dr Ehrenstrorfer 988
Thiabendazole (TBZ) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Thiamethoxam (TME) Pestanal Sigma- Aldrich 996
Thiophanate-methyl (THI-M) Dr Ehrenstrofer 990
Triadimenol (TRI) Mezcla de diastereoisoacutemeros Pestanal Sigma- Aldrich 994
14 Patrones internos
Carbendazim-d3 (CAR-d3) Pestanal Sigma- Aldrich 998
Cyprodinil-d5 (CYP-d5) Pestanal Sigma- Aldrich
Imidacloprid-d4 (IMID-d4) Pestanal Sigma- Aldrich
Metalaxyl 13C6 (MET13C6) Pestanal Sigma-Aldrich 99
24
Capiacutetulo III Parte experimental
15 Gases
Nitroacutegeno 99999 como gas de colisioacuten en el espectroacutemetro de masas
Nitroacutegeno en los sistemas de concentracioacuten y secado por corriente de nitroacutegeno de los cartuchos SPE
2 INSTRUMENTACIOacuteN
Balanza analiacutetica de precisioacuten Sartorius
Granatario Sartorius
Bantildeo de ultrasonidos P-Selecta
Equipo de purificacioacuten de agua Millipore modelo Milli-Q gradient A-10ZMQSSVOT4
Estacioacuten de concentracioacuten por corriente de nitroacutegeno Mini-Vap Supelco
Sistema de secado de cartuchos de SPE por corriente de nitroacutegeno VisiDry Supelco
Sistema distribuidor de vaciacuteo Visiprep reg Supelco
Cromatoacutegrafo de liacutequidos de ultra-alta resolucioacuten Waters AcquityUPLC reg y espectroacutemetro de masas
Acquity TQD con analizador de triple quadrupolo (QqQ) equipado con una fuente de ionizacioacuten a
presioacuten atmosfeacuterica del tipo Z-spray (ESI)
3 PREPARACIOacuteN DE LAS DISOLUCIONES
Los patrones de pesticidas se prepararon individualmente a partir de los compuestos soacutelidos comerciales por
pesada excepto en el caso del fenpropidin (FEP) que se preparoacute a partir del compuesto liacutequido comercial Estos
compuestos soacutelidos se disolvieron en metanol y se obtuvieron unas disoluciones iniciales con concentraciones
recogidas en la Tabla III1
25
Capiacutetulo III Parte experimental
Tabla III1 Concentracioacuten de las disoluciones patroacuten stock
Compuesto Concentracioacuten (microgmL) Compuesto Concentracioacuten (microgmL)
AME 102201 MET 118912
BEN 138330 MYC 102017
BOS 99474 PEN 129791
CAR 17105 PYC 104581
CYP 131075 PYM 141386
DIM 103009 TEC 134729
FEH 99584 TEF 137769
FEP 100000 TBZ 105928
FLU 126859 TME 112283
IMI 101123 THI-M 124202
IPR 106739 TRI 118933
MAN 101021
4 LAVADO DEL MATERIAL
La limpieza del material de vidrio utilizado en el laboratorio se realizoacute utilizando jaboacuten y aclarando con agua de
grifo Luego en primer lugar se realiza un enjuague con agua Milli-Q finalmente un segundo enjuague con
acetona para eliminar posibles restos de compuestos orgaacutenicos y se deja secar sobre papel
Para la limpieza de los conectores de tefloacuten empleados en el proceso de SPE se introducen en un vaso de
precipitados con metanol y este en un bantildeo de ultrasonidos durante 10 minutos Al finalizar con el bantildeo de
ultrasonidos se realiza un enjuague con acetona y se pone a secar
5 EXTRACCIOacuteN DE MUESTRAS MEDIANTE SPE
El meacutetodo de extraccioacuten utilizado para la determinacioacuten de pesticidas fue la extraccioacuten en fase soacutelida (SPE)
mediante cartuchos Oasis HLB de 200 mg A continuacioacuten se describe el protocolo de extraccioacuten en las
condiciones oacuteptimas
26
Capiacutetulo III Parte experimental
1 Acondicionamiento del cartucho Oasis HLB de 200 mg con 2 mL de acetonitrilo seguidos de otros 2 mL de
vino sinteacutetico formado por la mezcla etanolagua MilliQ (1288)
2 Paso de la muestra 2 mL de vino diluiacutedos con 2 mL de agua MilliQ a traveacutes del cartucho por gravedad
3 Lavado del cartucho con 2 mL de agua MilliQ
4 Secado del cartucho durante 45 minutos en el VisiDry mediante el paso de una corriente de nitroacutegeno
5 Elucioacuten del cartucho con la mezcla metanolacetonitrilo en proporcioacuten 2080 hasta un volumen final de 2
mL
6 Anaacutelisis mediante cromatografiacutea liacutequida acoplada a espectrometriacutea de masas en taacutendem UPLC-MSMS
(volumen de inyeccioacuten 15 microL)
Representacioacuten esquematizada en la Figura III1
Figura III1 Extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) de las muestras de vino
27
Capiacutetulo III Parte experimental
6 CONDICIONES DE DETERMINACIOacuteN MEDIANTE UPLC-MSMS
En la Tabla III2 se indican las condiciones utlizadas en la determinacioacuten de los pesticidas de intereacutes mediante
LC-MSMS y en la Tabla III3 se muestra el gradiente de la fase moacutevil utilizado para la separacioacuten
cromatograacutefica
Tabla III2 Condiciones experimentales de determinacioacuten en LC-MSMS
UPLC Acquity UPLC-I-Class IVD System
bull Columna cromatograacutefica Zorbax Eclipse Plus C18 Rapid Resolution HD
Fase estacionaria C18
Dimensiones 21 x 50 mm
Tamantildeo de partiacutecula 18 microm
Temperatura del horno 40ordmC
bull Inyector
Volumen de inyeccioacuten 15 microL
bull Fase moacutevil
Flujo 04 mLmin
Fase acuosa (A) Agua MilliQ con 01 aacutecido foacutermico
Fase orgaacutenica (B) Acetonitrilo con 01 aacutecido foacutermico
MSMS WatersXevo TQD
Modo de ionizacioacuten ESI positivo
Voltaje del capilar 15 kV
Voltaje de cono 50 V
Temperatura de gas de secado (N2) 450ordmC
Flujo de gas de secado (N2) 1000 Lh
Modo de adquisicioacuten Centroide
Tabla III3 Gradiente de fase moacutevil utilizado en la separacioacuten cromatograacutefica (LC)
Tiempo min 0 13 28 64 75 76 10
A 98 50 50 0 0 98 98
B 2 50 50 100 100 2 2
28
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
CAPIacuteTULO IV RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
1 IDENTIFICACIOacuteN DE LOS COMPUESTOS
Para empezar el estudio en primer lugar se realizoacute la caracterizacioacuten de las condiciones de determinacioacuten de los
analitos en el modo Multiple Reaction Monitoring (MRM) mediante UPLC-ESI-MSMS Para llevarla a cabo se
tomaron patrones individuales de cada fitosanitario y mediante infusioacuten se estudiaron las posibles transiciones y
voltajes oacuteptimos para su determinacioacuten (Tabla IV1)
La ionizacioacuten por electrospray (ESI) se estudioacute tanto en modo positivo como en modo negativo encontraacutendose
que para todos los pesticidas de nuestro intereacutes se obteniacutea sentildeal en el modo positivo mientras el modo negativo
no presentaba respuesta significativa
A continuacioacuten se estudia el efecto del voltaje de cono en la respuesta del ioacuten molecular [M+H]+ aumentaacutendolo
hasta alcanzar el valor maacuteximo de la sentildeal correspondiente a dicho ioacuten y luego se optimiza la energiacutea de colisioacuten
variaacutendola para cada analito hasta obtener la sentildeal de mayor intensidad para cada uno de los iones producto Por
uacuteltimo una vez optimizado el voltaje de cono y la energiacutea de colisioacuten se seleccionan las dos transiciones maacutes
intensas para llevar a cabo la cuantificacioacuten y cualificacioacuten de cada analito en modo MRM Este procedimiento se
realizoacute para la totalidad de los compuestos confirmando los datos obtenidos con los facilitados por la base de
datos Quanpedia que estaacute disponible en el software del equipo utilizado para algunos de los compuestos
considerados
Compuesto Tr (min) Ion precursor (mz Da)
Voltaje de cono (V)
Ion producto 1 (CEv)
cuantificacioacuten
Ion producto 2 (CEv)
cualificacioacuten
Relacioacuten IP2IP1
AME 325 2760 60 176 (35) 70 (50) 016
BEN 485 3261 26 148 (20) 91 (34) 067
BOS 387 3429 41 140 (20) 307 (20) 011
CAR 167 1921 33 160 (18) 132 (28) 014
CYP 311 2260 56 93 (33) 108 (25) 061
DIM 322 3881 40 301 (20) 165 (30) 057
FEH 386 3021 41 97 (22) 55 (38) 044
FEP 257 2742 55 147 (28) 86 (28) 093
FLU 401 3830 40 173 (20) 365 (15) 010
IMI 218 2561 34 209 (15) 175 (20) 091
IPR 358 3211 28 119 (16) 203 (10) 042
Tabla IV1 Tiempos de retencioacuten (Tr) relacioacuten de iones precursores (mz) voltaje de cono (V) energiacuteas de colisioacuten (CE) y relacioacuten de intensidades entre transiciones (IP2IP1)
29
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Compuesto Tr (min) Ion precursor (mz Da)
Voltaje de cono (V)
Ion producto 1 (CEv)
cuantificacioacuten
Ion producto 2 (CEv)
cualificacioacuten
Relacioacuten IP2IP1
MAN 392 4120 25 328 (16) 125 (35) 063
MET 283 2801 26 220 (13) 192 (17) 057
MYC 365 2891 34 70 (18) 125 (32) 029
PEN 417 2840 34 70 (16) 159 (34) 031
PYC 523 3881 31 194 (12) 163 (25) 066
PYM 266 2000 51 107 (24) 82 (24) 071
TEC 397 3080 40 70 (22) 125 (40) 007
TEF 473 3531 19 133 (20) 297 (8) 072
TBZ 182 2020 51 175 (25) 131 (30) 062
TME 203 2920 28 211 (12) 132 (22) 047
THI-M 257 3430 28 151 (46) 93 (19) 0001
TRI 319 2961 21 70 (10) 99 (15) 013
El dwell time para cada una de las transiciones se ajustoacute de manera automaacutetica por el software (MassLinx) con
objeto de obtener doce puntos espectrales por compuesto tomando un valor promedio de cuatro segundos como
ancho de pico a liacutenea de base
2 CARACTERIZACIOacuteN DEL PROCEDIMIENTO DE DETERMINACIOacuteN (UPLC-ESI-
MSMS)
Una vez optimizados los paraacutemetros que afectan a la separacioacuten cromatograacutefica (UPLC) y a la determinacioacuten por
espectrometriacutea de masas en taacutendem (MSMS) se lleva a cabo la evaluacioacuten de la repetibilidad de inyeccioacuten y
determinacioacuten en esas condiciones Se expresa por medio de la desviacioacuten estaacutendar relativa (RSD) paraacutemetro que
nos indica el grado de correlacioacuten que existe entre varias medidas del mismo patroacuten realizadas por el mismo
operador en el laboratorio y en el mismo equipo de medida a lo largo de un diacutea Para el estudio se realizan diez
inyecciones con volumen de 15 microL de dos patrones con distintos niveles de concentracioacuten 5 y 20 ngmL Los
datos de RSD (Tabla IV2) para las aacutereas de pico de los analitos se situacutean para el nivel de concentracioacuten 5 ngmL
en el rango 2-13 y en el nivel de concentracioacuten 20 ngmL en el rango 1-7
30
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten Tabla IV2 Desviacioacuten estaacutendar relativa (RSD) del aacuterea de pico (transicioacuten de cuantificacioacuten) para evaluar la repetivilidad del proceso de LC-MSMS
Compuesto RSD
5 ngmL
RSD
20 ngmL Compuesto
RSD
5 ngmL
RSD
20 ngmL
AME 5 2 MET 3 2
BEN 2 2 MYC 9 2
BOS 4 5 PEN 4 4
CAR 4 2 PYC 3 1
CYP 5 7 PYM 7 3
DIM 6 5 TEC 3 2
FEH 7 4 TEF 4 2
FEP 4 2 TBZ 2 1
FLU 5 3 TME 6 6
IMI 13 7 THI-M a 6
IPR 8 2 TRI 8 6
MAN 3 2
A continuacioacuten tambieacuten se evaluoacute la repetibilidad de los tiempos de retencioacuten (Tr) para diez inyecciones de
patrones a los dos niveles de concentracioacuten 5 y 20 ngmL situaacutendose las RSD para todos los compuestos en el
rango 01-03 En base a este dato la ventana de tiempo en la que se registran las transiciones de MRM de cada
compuesto se fijoacute en 05 min lo que es lo mismo 025 min alrededor del valor medio de su tiempo de retencioacuten
Por otro lado la linealidad del meacutetodo se estudioacute a nueve niveles de concentracioacuten diferentes comprendidos ente
los niveles 05 ngmL y 200 ngmL mediante la inyeccioacuten de disoluciones patroacuten de los distintos compuestos de
estudio Se realizoacute una evaluacioacuten sin y otra con patroacuten interno (IS) antildeadiendo una concentracioacuten fija de patrones
internos a nivel de 25 ngmL y pudimos observar que los resultados mejoran notablemente al realizar una
correccioacuten con el IS En la Tabla IV3 se muestran los coeficientes de determinacioacuten (R2) obtenidos al realizar la
correccioacuten mediante IS observando que para todos los compuestos excepto para THI-M y para TRI los
coeficientes de correlacioacuten son superiores a 0990 por lo que existe una respuesta lineal en el rango de
concentraciones que hemos estudiado
Aparte del estudio de la linealidad tambieacuten se han estudiado los liacutemites de cuantificacioacuten instrumentales del
meacutetodo (LOQs) Para ello los LOQs se evaluacutean como la miacutenima cantidad de analito que origina una sentildeal 10
veces superior a la desviacioacuten estaacutendar del ruido Los valores anteriores se estimaron a partir del patroacuten de
a no evaluado ya que se encuentra por debajo del liacutemite de cuantificacioacuten del meacutetodo
31
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
concentracioacuten maacutes baja que presenta un pico con una relacioacuten SN superior a 10 En la Tabla IV3 tambieacuten se
recogen estos LOQs en doacutende podemos ver que variacutean en el rango 01-1 ngmL excepto para THI-M que se
desviacutea a valores de 10 ngmL
Tabla IV3 Coeficientes de determinacioacuten (R2) y liacutemites de cuantificacioacuten instrumentales (LOQs) de los analitos para nueve
niveles de concentracioacuten de 05 a 200 ngmL
Compuesto Coeficiente de
correlacioacuten (R2)
LOQs (ngmL) Compuesto
Coeficiente de correlacioacuten
(R2)
LOQs (ngmL)
AME 09951 04 MET 09933 01
BEN 09949 01 MYC 09950 04
BOS 09979 02 PEN 09945 02
CAR 09923 02 PYC 09955 02
CYP 09878 02 PYM 09931 01
DIM 09938 07 TEC 09958 05
FEH 09959 05 TEF 09957 01
FEP 09931 01 TBZ 09942 02
FLU 09965 02 TME 09903 01
IMI 09979 05 THI-M 09580 100
IPR 09938 01 TRI 09867 07
MAN 09979 01
En la Figura IV1 y Figura IV2 se muestran dos ejemplo de curvas de calibrado para dos compuestos IMI y
MAN respectivamente
Figura IV1 Curva de calibrado y coeficiente de determinacioacuten de IMI para UPLC-ESI-MSMS
32
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Figura IV2 Curva de calibrado y coeficiente de determinacioacuten de MAN para UPLC-ESI-MSMS
3 ESTUDIO DEL MEacuteTODO SPE
La extraccioacuten de pesticidas se llevoacute a cabo mediante extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) en doacutende se realizaron
diversos estudios con diferentes condiciones para dar con las oacuteptimas En primer lugar se llevaron a cabo los
experimentos de retencioacuten y elucioacuten sobre dos tipos distintos de adsorbentes cartuchos OASIS HLB (200mg) y
cartuchos OASIS MAX (150 mg) como fases potenciales en las que llevar a cabo la extraccioacuten de manera
selectiva Los dos tipos de cartuchos son de fase reversa pero difieren entre siacute en el fundamento de retencioacuten de
los analitos En los cartuchos OASIS HLB (200 mg) formados por divinilbenceno-N-vinilpirrolidona (DVB-VP)
la retencioacuten de los diferentes analitos tiene lugar por interacciones π-π o de Van der Waals mientras que los
cartuchos OASIS MAX (150 mg) que se probaron como alternativa para mejorar la selectividad en la extraccioacuten
cuentan con un adsorbente polimeacuterico de modo mixto formado por divinilbenceno-N-vinilpirrolidona (DVB-VP)
funcionalizado con grupos amina cuaternaria siendo el fundamento de la extraccioacuten la combinacioacuten de las
propiedades adsorbentes del cartucho HLB con un mecanismo adicional de intercambio ioacutenico (anioacutenico) [27]
Algunos autores han empleado este mecanismo para mejorar la selectividad de la extraccioacuten de forma que en la
etapa de elucioacuten ciertos pigmentos del vino quedan fuertemente retenidos en el adsorbente a diferencia de lo que
ocurre con los adsorbentes de fase reversa [51]
Para llevar a cabo la eleccioacuten del tipo de adsorbente se realizaron pruebas con 10 mL de vino blanco y tinto
conectando en serie los dos tipos de cartuchos HLB (200 mg) y MAX (150 mg) a un segundo cartucho OASIS
HLB (60 mg) La elucioacuten de los analitos se hace de forma independiente para cada cartucho y se evaluacutea si los
analitos pasan del primer cartucho hacia el segundo cartucho es decir si se supera el volumen de corte o si por
33
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
otro lado se quedan retenidos en el primero y no eluyen hacia el segundo En estas pruebas de estudio
preliminares de preparacioacuten de la muestra no se ha incluido el CYP
En la Figura IV3 podemos ver la eficacia de la extraccioacuten para vino blanco y tinto que obtenemos empleando
cartuchos OASIS MAX (150 mg) conectados en serie con cartuchos OASIS HLB (60 mg) realizando la
extraccioacuten de tres fracciones de 2 mL cada una del cartucho OASIS MAX (150 mg) y una cuarta fraccioacuten de 2
mL del cartucho OASIS HLB (60 mg)
Por otro lado en la Figura IV4 podemos ver un graacutefico de columnas en el cual comparamos la eficacia de
extraccioacuten de los cartuchos OASIS HLB (200 mg) con dos disolventes de elucioacuten distintos En dicho graacutefica el
acroacutenimo de cada compuesto consta de dos barras cuyo significado es el siguiente la barra de la izquierda indica
la eficacia de la extraccioacuten empleando acetonitrilo (ACN) como disolvente de elucioacuten y la barra de la derecha
indica la eficacia de la extraccioacuten empleando la combinacioacuten MetanolAcetonitrilo (2080) (MeOHACN) como
disolvente de elucioacuten Para este adsorbente no se detectoacute ninguacuten compuesto en la extraccioacuten del segundo
cartuchos OASIS HLB (60 mg) empleando 2 mL de metanol
Figura IV3 Distribucioacuten de los compuestos en cada fraccioacuten obtenidas con cartuchos OASIS MAX (150 mg)
utilizando 10 mL de vino tinto y blanco sacando cuatro fracciones de 2 mL cada una con metanol como
disolvente de elucioacuten
34
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Figura IV4 Distribucioacuten de los compuestos en cada fraccioacuten obtenidas con cartuchos OASIS HLB (200 mg) utilizando 10
mL de vino tinto y blanco sacando 3 fracciones de 2 mL cada una con acetonitrilo (ACN) (columna de la izquierda) y una
combinacioacuten MetanolAcetonitrilo (2080) (MeOHACN) (columna de la derecha) como disolventes de elucioacuten
A la vista de los resultados reflejados en las graacuteficas podemos afirmar que cuando se utiliza el cartucho OASIS
HLB (200 mg) eluyendo con acetonitrilo o la combinacioacuten metanolacetonitrilo (2080) los extractos son limpios
y se eluyen la mayoriacutea de los compuestos en la primera fraccioacuten Pero utilizando acetonitrilo como disolvente de
elucioacuten se encuentran problemas en la extraccioacuten de CAR FEH y TBZ para los que es necesario emplear un
volumen mayor de elucioacuten o bien seleccionar otro disolvente de elucioacuten como es la combinacioacuten
metanolacetonitrilo
35
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Por otro lado los extractos en los cartuchos OASIS MAX (150 mg) son maacutes limpios incluso utilizando metanol en
la elucioacuten pero se detecta la presencia de CAR FEP TBZ y TME en el segundo cartucho OASIS HLB (60 mg)
significando la rotura del primer cartucho para dichos analitos considerando un volumen de 10 mL de vino Los
demaacutes compuestos se podriacutean recuperar cuantitativamente en la primera fraccioacuten sacada pero la peacuterdida de estos
compuestos inclina la eleccioacuten hacia los cartuchos OASIS HLB (200 mg) con metanolacetonitrilo (2080) como
disolvente de elucioacuten para continuar con el estudio
Una vez fijado el adsorbente y el volumen de elucioacuten se prueba la eficacia de la SPE independiente de los efectos
de matriz En la Tabla IV4 se muestran las recuperaciones de la SPE tomando 10 mL de vino blanco y tinto
con un nivel de adicioacuten de 15 ngmL sacando una sola fraccioacuten de 2 mL con la combinacioacuten
metanolacetonitrilo (2080) y n=3 reacuteplicas
Tabla IV4 Recuperaciones (R plusmn SD) de SPE para 10 mL de vino (blanco y tinto) con un nivel de adicioacuten de 15 ngmL y
n=3 reacuteplicas
Compuesto Vino Tinto
R plusmn SD
Vino Blanco
R plusmnSD Compuesto
Vino Tinto
R plusmn SD
Vino Blanco
R plusmn SD
AME 82 plusmn 7 100 plusmn 1 MET 92 plusmn 6 94 plusmn 3
BEN 89 plusmn 6 97 plusmn 3 MYC 90 plusmn 9 86 plusmn 4
BOS 95 plusmn 1 100 plusmn 2 PEN 84 plusmn 10 103 plusmn 3
CAR 91 plusmn 6 104 plusmn 6 PYC 86 plusmn 5 106 plusmn 1
CYP 81 plusmn 7 102 plusmn 3 PYM 87 plusmn 12 94 plusmn 3
DIM 97 plusmn 3 86 plusmn 4 TEC 83 plusmn 10 103 plusmn 1
FEH 89 plusmn 3 88 plusmn 3 TEF 84 plusmn 5 108 plusmn 4
FEP 91 plusmn 7 104 plusmn 3 TBZ 88 plusmn 7 92 plusmn 5
FLU 91 plusmn 2 97 plusmn 4 TME 101 plusmn 1 110 plusmn 13
IMI 117 plusmn 8 101 plusmn 11 THI-M 85 plusmn 9 110 plusmn 4
IPR 89 plusmn 7 112 plusmn 4 TRI 85 plusmn 10 110 plusmn 4
MAN 88 plusmn 2 87 plusmn 2
Algunos compuestos de la matriz en el vino pueden competir con los analitos durante el proceso de ionizacioacuten
que tiene lugar en la interfase entre UPLC-MSMS por lo que para la cuantificacioacuten del rendimiento de la
ionizacioacuten por electrospray (ESI) se estudian los efectos de matriz (EM) para vino blanco y tinto considerando
dos voluacutemenes de muestra distintos 2 y 10 mL y un volumen final del extracto de 2 mL En la Tabla IV5 se
36
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
exponen los valores para cada compuesto notando que al aumentar el volumen de muestra tambieacuten se aumentan
los efectos de matriz y eacutestos siempre son mayores en vino tinto Para el caacutelculo de estos efectos de matriz (EM)
se emplea la siguiente ecuacioacuten
Donde Am Ab y Ap representan el aacuterea de pico en la sentildeal medida del analito en el extracto de la muestra con
adicioacuten en el extracto de la muestra sin adicioacuten (o blanco) y en el patroacuten antildeadido respectivamente El nivel de
adicioacuten en extracto fue de 50 ngmL por compuesto
Tabla IV5 Efectos de matriz para vino blanco y tinto con un volumen inicial de 2 y 10 mL evaluados para un nivel de adicioacuten de 50 ngmL en extracto
Compuesto
Vino blanco Vino tinto
2 mL 10 mL 2mL 10 mL
EM () CV () EM () CV () EM () CV () EM () CV()
AME 93 3 95 2 99 3 101 7
BEN 99 1 93 2 101 3 100 6
BOS 97 5 98 1 108 2 96 0
CAR 62 2 50 3 58 2 55 6
CYP 94 3 91 1 97 2 95 7
DIM 105 2 95 3 100 3 108 3
FEH 100 4 102 4 105 4 94 3
FEP 95 3 88 2 96 2 92 7
FLU 98 2 93 2 106 1 101 2
IMI 84 4 46 3 48 10 18 8
IPR 99 3 92 3 105 1 100 7
MAN 100 1 94 3 109 4 107 2
MET 98 1 89 1 99 2 99 6
MYC 105 1 100 1 103 2 96 9
PEN 98 3 97 1 101 3 99 10
PYC 98 2 92 3 102 2 98 5
PYM 95 2 87 1 94 3 85 12
TEC 95 3 99 1 101 1 102 10
TEF 99 1 92 3 101 2 104 5
TBZ 45 0 40 5 43 2 30 7
TME 60 6 19 16 36 4 16 1
THI-M 107 2 109 2 103 1 96 9
TRI 97 3 118 4 104 5 117 10
37
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Al observar los resultados podemos ver que la mayoriacutea de los compuestos dan resultados de EM en torno al
100 lo que significa que no sufren una modificacioacuten importante en la eficacia de ionizacioacuten para las muestras
con respecto a los patrones Pero tambieacuten por el contrario podemos observar que algunos compuestos como
por ejemplo en el caso de CAR TBZ IMI y TME experimentan una gran supresioacuten de sentildeal es decir EM bajos
que se acentuacutean al aumentar el volumen de muestra La atenuacioacuten en la eficacia de variacioacuten para estos cuatro
compuestos no solo se ve incrementada con el volumen de muestra si no que ademaacutes es maacutes significativa para
vino tinto que para vino blanco En base a estos resultados aunque la eficacia de la SPE fue cuantitativa para
muestras de 10 mL se limitoacute el volumen de muestra a extraer a 2 mL
Las condiciones oacuteptimas de extraccioacuten se esquematizan en un resumen en la Figura IV5
Figura IV5 Condiciones optimizadas para la extraccioacuten de pesticidas en vino
38
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
4 CARACTERIZACIOacuteN DEL MEacuteTODO DE DETERMINACIOacuteN
Con las condiciones de extraccioacuten y determinacioacuten citadas anteriormente se llevaron a cabo pruebas de
recuperaciones absolutas de los compuestos a nivel de adicioacuten de 5 y 20 ngmL sobre las muestras Para cada
muestra y nivel de adicioacuten se realizaron tres reacuteplicas de las muestras con adicioacuten y los blancos aliacutecuotas de las
mismas muestras sin adicioacuten se procesaron en duplicado Los IS se antildeadieron a nivel de 25 ngmL y cada uno se
utiliza para corregir unos determinados compuestos CAR-d3 se emplea para CAR y TBZ el CYP-d5 para CYP y
PYM el IMID-d4 para IMI y TME y el MET13C6 para el resto de compuestos Los resultados para vino blanco
comprenden en el nivel de concentracioacuten 5 ngmL el rango entre 79-122 y en el nivel de concentracioacuten 20
ngmL el rango entre 84-109 Por otro lado en el caso del vino tinto las recuperaciones se encuentran para el
nivel de concentracioacuten 5 ngmL en el rango 67-112 y para el nivel de concentracioacuten 20 ngmL entre el rango
73-132 Los resultados obtenidos en las pruebas con vino blanco y vino tinto se muestran en la Tabla IV6
Los resultados son satisfactorios ya que la mayoriacutea de los compuestos se ajustan en todos los casos al rango de
recuperacioacuten entre 70-120 Para la realizacioacuten de estas pruebas se ha eliminado de los resultados el compuesto
THI-M debido a que las concentraciones utilizadas se encuentran en el liacutemite o por debajo del LOQ en los
experimentos con muestras adicionadas a 5 ngmL
Para calcular las recuperaciones (R) se recurrioacute a la siguiente ecuacioacuten
Donde Cm Cb y Cp son la concentracioacuten medida de analito en el extracto de la muestra con adicioacuten en el extracto
de la muestra sin adicioacuten (o blanco) y en el patroacuten antildeadido respectivamente
Tabla IV6 Recuperaciones (R) para vino tinto y vino blanco evaluadas para dos niveles de concentracioacuten 5 y 20 ngmL
Compuesto
Vino tinto Vino Blanco
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
AME 97 3 105 6 104 9 96 5
BEN 88 11 105 3 101 1 98 4
BOS 91 13 110 2 88 13 97 3
39
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Compuesto
Vino tinto Vino blanco
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
CAR 99 6 99 3 122 3 109 1
CYP 91 2 111 1 101 4 100 6
DIM 112 3 110 9 102 24 99 11
FEH 91 4 108 0 102 20 95 2
FEP 89 8 102 7 94 5 84 1
FLU 95 10 104 4 109 5 100 8
IMI 73 11 115 9 80 13 100 2
IPR 84 13 99 3 111 3 99 4
MAN 88 22 112 8 112 3 99 4
MET 99 3 106 5 106 3 98 2
MYC 84 9 106 13 88 17 86 3
PEN 84 9 102 5 84 8 90 5
PYC 96 6 105 4 100 2 95 4
PYM 90 12 112 14 106 4 97 1
TEC 89 8 101 6 98 12 94 1
TEF 93 10 102 5 107 2 97 3
TBZ 94 17 115 8 79 5 106 2
TME 67 2 101 7 84 18 90 11
THI-M ne - 74 7 ne - 89 24
TRI 88 12 97 6 102 6 92 2
ne No evaluado El nivel de adicioacuten es inferior al LOQ del meacutetodo para este compuesto
Para estudiar la reproducibilidad del meacutetodo analiacutetico global (correspondientes a los datos de preparacioacuten de
muestra y determinacioacuten) es decir la concordancia de varias medidas realizadas en diacuteas diferentes se procedioacute a la
extraccioacuten en las condiciones oacuteptimas tanto de vino blanco como tinto Las extracciones y determinaciones se
realizaron durante tres diacuteas consecutivos realizando tres reacuteplicas por vino y por diacutea con un nivel de adicioacuten en
muestra de 10 ngmL un blanco de muestra cada diacutea En la Tabla IV7 se muestran los resultados como
recuperaciones (R) en condiciones de reproducibilidad obtenidos para ambos tipos de vino dando valores entre
64-116 para muestras de vino blanco y valores situados entre 68-108 para muestras de vino tinto con la
excepcioacuten del TME para el que se ha obtenido un valor no aceptable en cuanto a la exactitud medida en
condiciones de reproducibilidad A la vista de los resultados obtenidos con estas pruebas se considera necesario el
empleo de IS adicionales para la mejora en la exactitud del meacutetodo para algunos compuestos por ejemplo el
TME
40
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Tabla IV7 Recuperaciones en condiciones de reproducibilidad (R plusmn SD) para vino blanco y tinto
Compuesto
Vino tinto Vino blanco
R
10 ngmL CV ()
R
10 ngmL CV ()
AME 90 5 101 13
BEN 96 5 102 7
BOS 97 6 100 8
CAR 97 3 94 5
CYP 103 3 105 12
DIM 104 7 106 8
FEH 90 16 83 15
FEP 91 5 90 4
FLU 103 7 102 6
IMI 99 14 101 14
IPR 91 5 100 13
MAN 108 5 108 13
MET 101 5 101 5
MYC 105 16 102 14
PEN 96 11 92 10
PYC 99 12 97 12
PYM 102 4 116 8
TEC 99 9 97 16
TEF 99 8 105 11
TBZ 68 4 84 5
TME 47 13 64 10
THI-M 107 11 104 16
TRI 95 14 103 4
En la Tabla IV8 se muestran los liacutemites de cuantificacioacuten (LOQs) del meacutetodo del meacutetodo de SPE-UPLC-ESI-
MSMS obtenidos para los diferentes pesticidas Los valores obtenidos son ideacutenticos a los LOQs instrumentales
excepto en el caso de aquellos compuestos para los que se observaronfuertes efectos de matriz (Tabla IV5) En
estos casos (CAR TBZ IMI y TME) los LOQs del meacutetodo se incrementan seguacuten la atenuacioacuten de sentildeal
observada
41
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Tabla IV8 Liacutemites de cuantificacioacuten LOQs (ngmL) del meacutetodo obtendos para cada compuesto
Compuesto LOQ (ngmL) Compuesto LOQ (ngmL)
AME 04 MET 01
BEN 01 MYC 04
BOS 02 PEN 02
CAR 03 PYC 02
CYP 02 PYM 01
DIM 07 TEC 05
FEH 05 TEF 01
FEP 01 TBZ 04
FLU 02 TME 02
IMI 06 THI-M 10
IPR 01 TRI 07
MAN 01
5 APLICACIOacuteN A MUESTRAS DE VINO COMERCIALES
Una vez optimizadas las condiciones del meacutetodo y estudiadas las caracteriacutesticas del meacutetodo desarrollado se aplicoacute
a la determinacioacuten de los compuestos de intereacutes estudiados en muestras de vino blanco y vino tinto comerciales
producidos en diferentes paiacuteses En la Tabla IV9 se muestra el paiacutes de origen de cada muestra comercial
identificadas con un coacutedigo alfanumeacuterico y antildeo de produccioacuten
42
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Tabla IV9 Coacutedigo asignado para los diferentes vinos comerciales blancos y tintos analizados Indicando el paiacutes de origen y
antildeo de produccioacuten
Coacutedigo Denominacioacuten de origen Antildeo de produccioacuten
bull Vinos Blancos
W1 Alemania 2014
W2 Espantildea 2012
W3 Espantildea 2016
W4 Portugal Desconocido
W5 Francia 2015
W6 Francia 2015
W7 Espantildea 2016
bull Vinos Tintos
R1 Espantildea 2015
R2 Sudaacutefrica 2015
R3 Chile 2015
R4 Francia 2015
R5 China Desconocido
R6 Espantildea 2016
R7 Australia 2014
R8 Francia 2013
R9 Francia 2015
A continuacioacuten en la Tabla IV10 y la Tabla IV11 se recogen los resultados obtenidos en el anaacutelisis de las
muestras comerciales Los datos obtenidos corresponden en todos los casos al uso de patrones de calibracioacuten
como teacutecnica de cuantificacioacuten
Tabla IV10 Concentracioacuten (ngmL) encontradas en las diferentes muestras de vino blanco comercial analizadas mediante
SPE-UPLC-MSMS n=2 reacuteplicas y al final el sumatorio de las concentraciones encontradas
Compuesto W1 W2 W3 W4 W5 W6 W7
AME 04 nd nd nd 41 nd nd
BEN nd nd 14 nd nd nd nd
BOS 84 102 520 54 197 nd nd
CAR nd 115 56 nd nd nd nd
CYP 08 59 112 nd nd 26 nd
43
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Compuesto W1 W2 W3 W4 W5 W6 W7
DIM 14 84 400 09 32 50 nd
FEH 85 809 639 15 187 nd nd
FLU 11 05 92 nd 77 32 nd
IMI nd 136 88 29 nd nd 69
IPR 30 749 1144 14 nd nd nd
MAN nd nd nd nd nd 30 nd
MET 04 273 494 63 nd nd 172
MYC 09 nd 35 nd nd nd nd
PYM 15 469 584 08 24 35 nd
TEC 11 nd 58 nd nd nd nd
TRI nd 67 61 nd nd nd nd
sumconcentracioacuten
(ngmL) 274 2868 4358 192 558 173 862
nd no detectado
Tabla IV11 Concentracioacuten (ngmL) encontradas en las diferentes muestras de vino tinto comercial analizadas mediante
SPE-UPLC-MSMS n= 2 reacuteplicas y al final el sumatorio de las concentraciones encontradas
Compuesto R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9
AME nd nd nd 30 nd nd nd nd 16
BEN nd nd nd 07 nd nd nd nd nd
BOS nd 55 21 196 nd nd nd 73 21
CAR nd nd 04 17 249 20 nd nd nd
CYP 34 08 02 22 nd 136 nd 85 nd
DIM nd 33 nd 52 233 46 nd 61 23
FEH nd nd nd 1070 nd 10 nd 1307 14
FLU nd nd nd 20 nd nd nd nd nd
IPR 16 nd nd 17 nd 22 nd nd nd
MAN nd nd nd 17 nd nd nd 20 nd
MET 126 nd nd 14 55 313 30 44 39
MYC nd nd nd 05 nd 32 nd nd nd
PYM 19 nd 03 185 49 281 nd 24 nd
TEC 25 06 39 29 nd nd nd 21 20
TEF nd 01 12 nd nd nd nd nd nd
sumconcentracioacuten
(ngmL) 220 48 81 1681 586 860 30 1635 133
nd no detectado 44
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
En los resultados de los anaacutelisis podemos observar que en ninguna de las muestras comerciales de vino blanco
aparecieron los siguientes compuestos FEP PEN PYC TEF TBZ THI-M y TME y en los vinos tintos
comerciales no aparece a ninguna concentracioacuten FEP IMI PEN PYC TBZ TME THI-M y TRI No se
detectaron para dichas muestras de vino a niveles superiores a los LOQs del meacutetodo propuesto
Cuando se detecta un compuesto positivo se compara el pico cromatograacutefico del compuesto con el de un patroacuten
verificando la coincidencia del tiempo de retencioacuten (maacutexima diferencia 01 min) y la relacioacuten entre transiciones
(maacutexima diferencia 30 ) En la Figura IV6 y la Figura IV7 se muestran los cromatogramas para el compuesto
CYP obtenido en condiciones oacuteptimas para la muestra de vino blanco W6 y en un patroacuten de 5 ngmL
respectivamente En este caso el intervalo de tolerancia para la relacioacuten de intensidad entre transiciones es
IP2IP1=061plusmn018
Figura IV6 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el CYP en la muestra W6 (26 ngmL) Transicioacuten
superior 226gt93 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 226gt108 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades IP2IP1= 066
Figura IV7 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el CYP en un patroacuten de 5 ngmL Transicioacuten
superior 226gt93 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 226gt108 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades IP2IP1=061plusmn018
45
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Otro ejemplo de compuesto positivo en abundantes muestras comerciales de estudio es el Metalaxyl positivo con
una concentracioacuten de 04 ngmL en el vino con referencia W1 (Figura IV8) y positivo con una concentracioacuten de
313 ngmL en el vino con referencia R6 (Figura IV9) Ambas se comparan con el cromatograma de un patroacuten
de Metalaxyl de 1 ngmL (Figura IV10) El grado de concordancia en los tiempos de retencioacuten y la relacioacuten de
intensidades entre transiciones es satisfactorio
Figura IV8 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el MET en la muestra W1 (04 ngmL) Transicioacuten
superior 2801gt2201 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 2801gt1921 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades
IP2IP1=056
Figura IV9 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el MET en la muestra R6 (313 ngmL) Transicioacuten
superior 2801gt2201 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 2801gt1921 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades IP2IP1=
056
46
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Figura IV10 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el MET en un patroacuten de 1 ngmL Transicioacuten
superior 2801gt2201 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 2801gt1921 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades
IP2IP1=057plusmn017
Es de destacar que aunque se detectaron bastantes pesticidas en las diferentes muestras de vino comerciales pero
en ninguacuten caso superaron el 10 de los LMRs permitidos en uvas tal y como se recomienda ya que todaviacutea no
existen LMRs para vino en la legislacioacuten vigente No obstante el nivel total de concentracioacuten (sumatorio de
concentraciones Tabla IV10 y Tabla VI11) es significativo para varias muestras tanto de vinos blancos (W2 y
W3) como tintos (R4 y R8)
47
Capiacutetulo V Conclusiones
CAPIacuteTULO V CONCLUSIONES
En este trabajo se ha estudiado un meacutetodo para la cuantificacioacuten de pesticidas concretamente veinte fungicidas y
tres insecticidas en vino blanco y tinto En la etapa de preparacioacuten de muestra se optimizoacute la extraccioacuten en fase
soacutelida (SPE) utilizando cartuchos OASIS HLB (200 mg) compuestos por divinilbenceno-N-vinilpirrolidona
(DVB-VP) como adsorbente Como teacutecnica de determinacioacuten se utilizoacute cromatografiacutea de liacutequidos con una
interfase de electroespray acoplada a espectrometriacutea de masas (UPLC-ESI-MSMS)
Las conclusiones generales obtenidas a partir de los resultados de este proyecto relativo a la determinacioacuten de
fitosanitarios en vino son
Ante los problemas de retencioacuten que presentan los cartuchos OASIS MAX (150 mg) para algunos
compuestos los cartuchos OASIS HLB (200 mg) junto con la combinacioacuten metanolacetonitrilo (2080)
como disolvente de elucioacuten son elegidos como mejor opcioacuten en la extraccioacuten en fase soacutelida de pesticidas
en muestras con matrices complejas como es el caso del vino Asiacute se consigue la retencioacuten selectiva de
componentes de la matriz y proporciona extractos con menor porcentaje de interferencias
El meacutetodo estudiado y optimizado se puede aplicar tanto a vinos blancos como a vinos tintos procesados
a partir de distintas variedades de uvas
Los liacutemites de cuantificacioacuten (LOQs) del estudio se situacutean la mayoriacutea por debajo de 10 ngmL excepto
en el caso de THI-M que asciende al valor de 20 ngmL El rango de respuesta lineal abarca hasta 200
ngmL y el tiempo de anaacutelisis ha sido de solo 10 minutos por muestra
En todas las muestras de vino (blancos y tintos) comerciales analizadas se han detectado la presencia de
varios pesticidas sin embargo todas las concentraciones encontradas se encuentran por debajo del 10
de los LMRs fijados en uvas tal y como recomienda la legislacioacuten por lo que no se considera
preocupante
48
Capiacutetulo V Conclusioacutens
CAPIacuteTULO V CONCLUSIOacuteNS
Neste traballo estudouse un meacutetodo para a cuantificacioacuten de pesticidas en particular vinte funxicidas e tres
insecticidas en vintildeo branco e maacuteis tinto No paso da preparacioacuten da mostra optimizouse a extraccioacuten en fase
soacutelida (SPE) empregando cartuchos OASIS HLB (200 mg) compostos por divinilbenceno-N-pirrolidona (DVB-
VP) como adsorbente Para a teacutecnica de determinacioacuten utilizouse cromatografiacutea de liacutequidos con unha interfase de
electroespray acoplada a espectrometriacutea de masas (UPLC-ESI-MSMS)
As conclusioacutens xerais a obtidas a partir dos resultados deste proxecto relativo aacute determinacioacuten de pesticidas en
vintildeo son
Ante os problemas de retencioacuten que mostraban os cartuchos OASIS MAX (150 mg) para alguacuten
compostos os cartuchos OASIS HLB (200 mg) en conxunto coa mistura metanolacetonitrilo (2080)
como disolvente de elucioacuten son elexidos como mellor opcioacuten na extraccioacuten en fase soacutelida de pesticidas
en mostras con matrices complexas como eacute o caso do vintildeo Asiacute eacute conseguida a retencioacuten selectiva de
componentes da matriz e proporciona extractos con menos porcentaxe de interferencias
O meacutetodo estudado e optimizado poacutedese aplicar tanto a vintildeos brancos coma tintos procesados a partir de
diferentes variedades de uvas
Os liacutemites de cuantificacioacuten do estudo (LOQs) son maacuteis baixos de 10 ngmL agaacutes no caso do THI-M
que ascende ao valor de 20 ngmL O rango de resposta lineal cobre ata 200 ngmL e o tempo de anaacutelise
foi de soacute 10 minuacutetos por mostra
En todas as mostras de vintildeo (brancos e tintos) comercial analizadas detectouse a presenza de varios
pesticidas maacuteis poreacuten todas as concentracioacutens atopadas son inferiores ao 10 dos LMR fixados en uvas
tal e como recomenda a lexislacioacuten polo que non se considera preocupante
49
Chapter V Conclusions
CHAPTER V CONCLUSIONS
In this work we have studied a method for the quantification of pesticides specifically twenty fungicides and
three insecticides in white and red wine In the sample preparation step the solid phase extraction was optimized
using cartridges OASIS HLB (200 mg) containing divinylbenzene-N-vinylpyrrolidone (DVB-VP) as adsorbent
As determination technique ultraperformance liquid chromatography was used with an electrospray interface
coupled to mass spectrometry (UPLC-ESI-MS7MS)
The general conclusions drawn from the results of this project concerning the determination of pesticides in wine
are
Due to the retention problems presented by the OASIS MAX sorbent (150 mg) for some compounds of
this project the cartridges OASIS HLB (200 mg) together with the methanolacetonitrile (2080) mixture
are chosen as the best option in the solid phase extraction of pesticides in samples with complex
matrices as is the case with the wine
The method studied and optimized can be applied to both white and red wines obtained from different
varieties of grapes
The limits of quantification (LOQs) were below 10 ngmL for most of the compounds except in the
case of THI-M with a LOQ of to 10 ngmL The linear response range covers up to 200 ngmL and the
analysis time was only 10 minutes per sample
In all commercial wine samples (white and red) analyzed the presence of several pesticides was
conformed however all the concentrations obtained are below 10 of the Maximum residue
levels(MRLs) fixed in grapes as recommended by legislation
50
VI Bibliografiacutea VI BIBLIOGRAFIacuteA [1] Ministerio de agricultura y pesca alimentacioacuten y medio ambiente mhttpwwwmapamagobesescalidad-y-evaluacion-ambientaltemasproductos-quimicosfitosanitarios (Acceso el diacutea 11052017) [2] httpwwwcricyteduarenciclopediaterminosProducFitohtm (Acceso el diacutea 11052017) [3] WERNER BALTES ldquoQuiacutemica de los alimentosrdquo Editorial Acribia SA 2007 Capiacutetulo 11 ldquoResiduos en los alimentosrdquo paacuteginas 206-217
[4] RLabrada JCCaseley CParker ldquoESTUDIO FAO PRODUCCIOacuteN Y PROTECCIOacuteN VEGETAL 120rdquo Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentacioacuten Roma 1996 ISSN 1014- Capiacutetulo 10 Herbicidas httpwwwfaoorgdocrepT1147St1147s00htmContents (Acceso el diacutea 12052017)
[5] Taberner Palou Andreu Cirujeda Ranzenberger Alicia Zaragoza Larios Carlos ldquoManejo de poblaciones de malezas resistentes a herbicidasrdquo (FAO Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura) 100 preguntas sobre resistencia PDF sacado de httpwwwfaoorg3a-a1422spdf (Acceso el diacutea 12052017) [6] BISSET Juan A Uso correcto de insecticidas control de la resistencia Revista Cubana de Medicina Tropical 2002 vol 54 no 3 p 202-219 [7] DEVINE Gregor J EZA Dominique Ogusuku Elena FURLONGMichael J Uso de insecticidas contexto y consecuencias ecoloacutegicas Revista peruana de medicina experimental y Salud Puacuteblica 2008 vol 25 no 1 p 74-100 [8] Ministerio de agricultura y ganaderiacutea (proteccioacuten agropecuaria servicio de diagnoacutestico fitosanitario) de costa Rica httpwwwmaggocrbibliotecavirtualH20-5054pdf (Acceso el diacutea 11052017) [9] GEPP V MONDINO P Control quiacutemico 2011 PDF obtenido de httpwwwpvfagroeduuyfitopatodocscursosfitopatoMaterialesGuiasC-QUIMICOpdf (Acceso el diacutea 772017) [10] ROSSLENBROICH Hans-Juergen STUEBLER Dietrich Botrytis cinereamdashhistory of chemical control and novel fungicides for its management Crop Protection 2000 vol 19 no 8 p 557-561 [11] Figura 11 httpwwwvitiviniculturanetbotritis-o-podredumbre-gris-botrytis-cinerea-pershtml (Acceso el diacutea 12052017) [12] CAMPBELL Paul BENDEK Carlos LATORRE Bernardo A Riesgo de oiacutedio (Erysiphe necator) de la vid en relacioacuten con el desarrollo de los racimos Ciencia e investigacioacuten agraria 2007 vol 34 no 1 p 5-11 [13] ldquoCoacutemo combatir el oiacutedio de la vidrdquo Jose Javier Peacuterez de Obanos Castillo PDF sacado de httpswwwnavarraesNRrdonlyres05E65D9B-D1A2-4EAD-9A63-AFF1D3215552135109Comocombatireloidiodelavidpdf (Acceso el diacutea 12052017) [14] Imagen 12 sacadas las 3 de httpwwwvitiviniculturanetoidio-de-la-vidhtml (Acceso el diacutea 12052017) [15] BARRIOS Gonccedilal REYES Joan Modelizacioacuten del Mildiu de la Vid 2004 httpwwwruralcatnetmigracio_resources617683_mildiusPDF (Acceso el diacutea 12052017) [16] Imaacutegenes sacadas de httpwwwvitiviniculturanetmildiu-de-la-vid-enfermedades-vinahtml (Acceso el diacutea 13052017) [17] HUQ Mainul MEISNER Craig DASGUPTA Susmita Health effects and pesticide perception as determinants of pesticide use evidence from Bangladesh httpagrisfaoorgagris-searchsearchdorecordID=US2012411738 (Acceso el diacutea 13052017)
51
IV Bibliografiacutea [18] BADII Mohammad H LANDEROS Jeroacutenimo Plaguicidas que afectan a la salud humana y la sustentabilidad CULCyT 2015 no 19 Revista vista en httpopenjournaluacjmxojsindexphpculcytarticleview454 (Acceso el diacutea 772017) [19] OLEA Nicolaacutes FERNAacuteNDEZ Mariana F Plaguicidas persistentes En Congreso Implementacioacuten del Convenio de Contaminantes Orgaacutenicos Persistentes Madrid 2001 p 26-27 [20] httpwwwfaoorgfao-who-codexalimentariusabout-codexes (Acceso el diacutea 14052017) [21] httpeceuropaeufoodplantpesticidesmax_residue_levels_en (Acceso el diacutea 14052017 [22] ORDONtildeEZ Juan A Cambero Rodriacuteguez MI Fernaacutendez Aacutelvarez L Garciacutea Sanz ML Garciacutea de Fernando Minguilloacuten GD de la Hoz Perales L Selgas Cortecero MD Tecnologiacutea de los alimentos Volumen 1 Componentes de los Alimentos y Procesos Siacutentesis Madrid 1998paacutegs 349-351 [23] CELA Rafael Casais Maria del Carmen Lorenzo Rosa Antonia Teacutecnicas de separacioacuten en quiacutemica analiacutetica Siacutentesis 2002 Capiacutetulo 11 Extraccioacuten y lixiviacioacuten por disolvente (paacutegs206-260) [24] CANTWELL Frederick F LOSIER Manon Liquidmdashliquid extraction Comprehensive Analytical Chemistry 2002 vol 37 p 297-340 [25] Imagen de LLE sacada de httpprocesosbiowikispacescomExtracciC3B3n+liquido-liquido (Acceso el diacutea 15052017) [26] HENNION Marie-Claire Solid-phase extraction method development sorbents and coupling with liquid chromatography Journal of Chromatography A 1999 vol 856 no 1 p 3-54 [27] CELA Rafael Casais Maria del Carmen Lorenzo Rosa Antonia Teacutecnicas de separacioacuten en quiacutemica analiacutetica Siacutentesis 2002 Capiacutetulo 16 Teacutecnicas de adsorcioacuten y absorcioacuten en la preparacioacuten de muestras Extraccioacuten y microextraccioacuten en fase soacutelida (paacutegs520-555) [28] Imagen spe sacada httptoxicocbblogspotcomes201310las-intoxicaciones-con-farmacoshtml (Acceso el diacutea 15052017) [29] Chaacutefer Pericaacutes Consuelo Acoplamiento microextraccioacuten en fase soacutelida-cromatografiacutea (2006) httprodericuveshandle1055014940 (Acceso el diacutea 16052017) [30] Imagen SPME httpwwwscieloorgcoscielophpscript=sci_arttextamppid=S0122-53832002000100005 (Acceso el diacutea 16052017) [31] MONTES GOYANES Rosa Mariacutea Avances en teacutecnicas de microextraccioacuten para la determinacioacuten de compuestos traza en muestras medioambientales y alimentarias Teacutesis doctoral Noviembre 2009 (Paacutegs 34-55) [32] LEHOTAY Steven J Ae Son Kyung KwonHyeyoung Koesukwiwat Urairat Fu Wusheng Mastovska Katerina Hoh Eunha Leepipatpiboon Natchanun Comparison of QuEChERS sample preparation methods for the analysis of pesticide residues in fruits and vegetables Journal of Chromatography A 2010 vol 1217 no 16 p 2548-2560 [33] Imagen QueChERS httpswwwresearchgatenetpublication279221361_QuEChERS_A_Sample_Preparation_for_Extraction_of_Carbaryl_from_Rat_Feces (Acceso el diacutea 16052017) [34] STASHENKO Elena E MARTIacuteNEZ Jairo Reneacute Preparacioacuten de la muestra un paso crucial para el anaacutelisis por GC-MS Uma publicaccedilatildeo trimestral do Instituto Internacional de Cromatografia (IIC) Ciecircncia Cromatograacutefica 2011 vol 3 no 1 [35] Imagen GC-MS httpsorgspectroscopyintblogspotcomes201411gas-chromatography-mass-spectrometry-gchtml (Acceso el diacutea 17052017) [36] httpwwwactlabscompageaspxmenu=65ampapp=221ampcat1=534amptp=2amplk=no (Acceso el diacutea 17052017)
52
IV Bibliografiacutea [37] Quintela O Cruz A Concheiro M De Castro A amp Loacutepez-Rivadulla M (2005) Metodologiacutea LC-MS Aspectos generales de la teacutecnica y sus aplicaciones en el campo de la toxicologiacutea Rev Toxicol 22 paacutegs7-14 [38] Imagen LC-MS httpsuploadwikimediaorgwikipediaenff9Liquid_chromatography_tandem_Mass_spectrometry_diagrampng (visto 18052017) [39] Vargas de la Cruz Celia Bertha Adaptacioacuten de la Metodologiacutea Analiacutetica para la determinacioacuten de residuos de plaguicidas en frutas nativas de exportacioacuten mediante Uplc-MsMs (2012) Tesis obtenida en http20062146130handlecybertesis2331 (Acceso el diacutea 772017) [40] ROMERO GONZAacuteLEZ Roberto Fernaacutendez Moreno Joseacute Luis Plaza Bolantildeos Patricia Garrido Frenich Antonia Martiacutenez Vidal Joseacute Luis Empleo de la espectrometriacutea de masas como herramienta para la determinacioacuten de toacutexicos en alimentos hacia la seguridad alimentaria Revista Espantildeola de salud puacuteblica 2007 vol 81 no 5 p 461-474 [41] PAYAacute Andrus Fundamento y Funciones de la Espectrometriacutea de Masas Universidad de Valencia Espantildea 2006 httpmuraluvescaloan (Acceso el diacutea 19052017) [42] Imagen MS sacada de httpsesslidesharenetMaYaTorrezespectrometria-demasas (Acceso el diacutea 21052017) [43] ECONOMOU Anastasios Botitsi Helen Antoniou Spyros Tsipi Despina Determination of multi-class pesticides in wines by solid-phase extraction and liquid chromatography-tandem mass spectrometry Journal of Chromatography A 2009 vol 1216 no 31 p 5856-5867 [44] FONTANA A R Rodriacuteguez I Ramil M Altamirano JC Cela R Liquid chromatography time-of-flight mass spectrometry following sorptive microextraction for the determination of fungicide residues in wine Analytical and bioanalytical chemistry 2011 vol 401 no 2 p 767-775 [45] PELAJIĆ Maja G Peček DM Pavlović DV Čepo Novel multiresidue method for determination of pesticides in red wine using gas chromatographyndashmass spectrometry and solid phase extraction Food chemistry 2016 vol 200 p 98-106 [46] Ignaz J Buerge Juumlrgen Krauss Rociacuteo Loacutepez-Cabeza Werner Siegfried Michael Stuumlssi Felix E Wettstein Thomas Poiger Stereoselective Metabolism of the Sterol Biosynthesis Inhibitor Fungicides Fenpropidin Fenpropimorph and Spiroxamine in Grapes Sugar Beets and Wheat Journal of Agricultural and Food Chemistry 2016 vol 64 no 26 p 5301-5309 [47] M Hu X Liu F Dong J Xu S Li H Xu Y Zheng Determination of ametoctradin residue in fruits and vegetables by modified quick easy cheap effective rugged and safe method using ultra-performance liquid chromatographytandem mass spectrometry Food chemistry 2015 vol 175 p 395-400 [48] WALORCZYK Stanisław DROŻDŻYŃSKI Dariusz GNUSOWSKI Bogusław Multiresidue determination of 160 pesticides in wines employing mixed-mode dispersive-solid phase extraction and gas chromatographyndashtandem mass spectrometry Talanta 2011 vol 85 no 4 p 1856-1870 [49] Tianyang Guo Pingping Fang Juanjuan Jiang Feng Zhan Wei Yong Jiahui Liu YiYang Dong Rapid screening and quantification of residual pesticides and illegal adulterants in red wine by direct analysis in real time mass spectrometry Journal of Chromatography A 2016 vol 1471 p 27-3 [50] GONZAacuteLEZ-RODRIacuteGUEZ R M CANCHO-GRANDE B SIMAL-GAacuteNDARA J Decay of fungicide residues during vinification of white grapes harvested after the application of some new active substances against downy mildew Food chemistry 2011 vol 125 no 2 p 549-560 [51] CARPINTEIRO I Ramil M Rodriacuteguez I Cela R Determination of fungicides in wine by mixed-mode solid phase extraction and liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry Journal of Chromatography A 2010 vol 1217 no 48 p 7484-7492
53
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Compuesto Estructura Nombre sistemaacutetico Foacutermula CAS Uso ordflog (kow) pKa
Mandipropamid
(MAN)
2-(4-chlorophenyl)-N-[3-
methoxy-4-(2-
propynyloxy)phenethyl]-2-(2-
propynyloxy)acetamide
C23H22ClNO4 374726-62-2 F 32 -
Metalaxyl
(MET)
N-(26-dimethylphenyl)-N-
(methoxyacetyl)-DL-alanine
methyl ester
C15H21NO4 57837-19-1 F 175 000
Myclobutanil
(MYC)
2-(4-chlorophenyl)-2-(1H-
124-triazol-1-
ylmethyl)hexanentrile
C15H17ClN4 88671-89-0 F 289 230
Penconazol
(PEN)
1-[2-(24-
dichlorophenyl)pentyl]-1H-
124-triazole
C13H15Cl2N3 66246-88-6 F 372 151
Pyraclostrobin
(PYC)
Methyl2-[1-(4-chlorophenyl)-
1H-pyrazol-3-
yloxymethyl]phenylmetoxy-
carbamate
C19H18ClN3O4 175013-18-0 F 399 -
Pyrimethanil
(PYM)
4-6-dimethyl-N-phenyl-2-
pyrimidinamine C12H13N3 53112-28-0 F 284 352
Tebuconazol
(TEC)
1-(4-chlorophenyl)-44-
dimethyl-3-(1H-124-triazol-1-
ylmethyl)-3-pentanol
C16H22ClN3O 107534-96-3 F 370 500
Tebufenozid
(TEF)
35-dimethylbenzoic acid 1-
(11-dimethylethyl)-2-(4-
ethylbenzoyl)hidrazide
C22H28N2O2 112410-23-8 I 425 -
Thiabendazol
(TBZ)
2-(13-thiazol-4-yl)-1H-
benzimidazole C10H7N3S 148-79-8 F 239 473
Thiamethoxam
(TME)
3-[(2-chloro-5-
thiazolyl)methyl]tetrahydro-5-
methyl-N-nitro-4H-135-
oxadiazin-4-imine
C8H10ClN5O3S 153719-23-4 I -013 -
Thiophanate-
methyl
(THI-M)
DimethylNNrsquo-[12-
phenylenebis(azanediylcarbono
thioyl)] dicarbamate
C12H14N4O4S2 23564-05-8 F 145 728
Triadimenol
(TRI)
1-(4-chlorophenoxy)-33-
dimethyl-1-(1H-124-triazol-1-
yl)-2-butanol
C14H18ClN3O2 55219-65-3 F 318
-
ordf Valores para la forma neutra 8
Capiacutetulo I Introduccioacuten
13 Toxicidad de los pesticidas
En los uacuteltimos antildeos el uso indiscriminado de pesticidas de siacutentesis en agricultura ha creado graves problemas de
salud y medioambientales ya que su uso debido al aumento de la poblacioacuten y por consiguiente de la actividad
agraria se ha incrementado considerablemente Durante las tres uacuteltimas deacutecadas una estimacioacuten dada por la
Organizacioacuten Mundial de la Salud y el Programa de las Naciones Unidas para el Medio Ambiente revela que
aproximadamente cerca de 20000 personas al antildeo mueren generalmente agricultores por exposicioacuten continuada
a alguno de estos toacutexicos En la mayoriacutea de los casos los agricultores utilizan los pesticidas de forma que las
cantidades se desviacutean significativamente de las recomendadas ya que asocian cantidades maacutes altas con mayor
efectividad y velocidad de accioacuten El mal uso de dichos toacutexicos se ve en los signos presentes en los ecosistemas
afectados pudiendo llegar a ser perjudiciales para la salud humana Estos riesgos que causan tanto en la salud
como en el medioambiente pueden ser reducidos o en su defecto evitados mediante la educacioacuten sobre este tipo
de toacutexicos con el fin de frenar su uso excesivo y descontrolado [17]
Desde el punto de vista medioambiental los fitosanitarios empleados en un cultivo pueden persistir en los
distintos medios tierra aire o agua y afectar tanto a ecosistemas terrestres como acuaacuteticos En los sistemas
terrestres los suelos son contaminados mediante la aplicacioacuten del toacutexico de forma directa o como deposicioacuten del
resultado de una suspensioacuten aeacuterea Eacutestos pueden persistir desde varios diacuteas hasta varios antildeos ya que el suelo
retiene y moviliza el toacutexico despueacutes de su emisioacuten Los que persisten maacutes tiempo en el medioambiente tienen una
mayor probabilidad de interaccionar con otros elementos del sistema y si su vida media es mayor a la frecuencia
con la que se aplica el pesticida tienden a acumularse tanto en el suelo como en las especies que habitan en eacutel Por
otro lado el agua es contaminada por pesticidas bien por aplicacioacuten directa por estar presentes en las
precipitaciones de la atmoacutesfera o bien por la movilidad que tienen desde el suelo Tanto los pesticidas solubles
como los insolubles interaccionan con los ecosistemas acuaacuteticos los hidrosolubles persisten maacutes tiempo
solubilizados en agua mientras que los otros se asocian a los sedimentos y se concentran en las especies que
habitan el medio acuaacutetico [18]
Como consecuencia de la amplia distribucioacuten de los toacutexicos en aire suelo y agua se produce una acumulacioacuten de
ellos en los elementos que contribuyen a la alimentacioacuten humana ya que su amplio uso hace que el contacto con
los plaguicidas por parte de personas y animales sea inevitable La contaminacioacuten de los alimentos se puede
presentar por aplicacioacuten directa de los pesticidas el uso de eacutestos durante el manejo transporte y almacenamiento
de los productos comestibles o por su acumulacioacuten en la cadena troacutefica Son bioacumulables en el organismo
debido a su caraacutecter lipofiacutelico lo que les confiere una vida media en los tejidos larga La exposicioacuten a pesticidas
persistentes no tiene la misma repercusioacuten en cada uno de los individuos expuestos sino que se considera criacutetica la
exposicioacuten durante la etapas embrionaria fetal y primeros antildeos de vida en doacutende se transmite de madres a hijos
mediante la gestacioacuten y la lactancia como resultado de la acumulacioacuten en el tejido graso de la madre [19]
9
Capiacutetulo I Introduccioacuten
14 Legislacioacuten
El aumento del uso de fitosanitarios en actividades relacionadas con la produccioacuten de alimentos para consumo
humano o animal tambieacuten desembocoacute en una preocupacioacuten social debido a su toxicidad y bioacumulacioacuten En
respuesta la Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura (FAO) en colaboracioacuten
con la Organizacioacuten Mundial de la Salud (OMS) pusieron en marcha un programa Codex Alimentarius cuyo
objetivo a traveacutes de sus normas y coacutedigos de praacutecticas alimentarias internacionales es garantizar la calidad e
inocuidad de los alimentos que estaacuten al alcance de cualquier persona Con estas normas internacionales los
consumidores pueden confiar en la calidad de los alimentos independientemente de su origen geograacutefico [20]
Todos los alimentos destinados al consumo humano o animal en la Unioacuten Europea estaacuten sujetos a un liacutemite
maacuteximo de residuos de plaguicidas para la proteccioacuten de la salud humana y animal Actualmente en lo referente a
legislacioacuten para el control de la cantidad del toacutexico en la uva estaacute vigente el Reglamento 3962005 del Parlamento
Europeo y del Consejo de 23 de febrero de 2005 referido a la regulacioacuten de los liacutemites maacuteximos de residuos de
plaguicidas en alimentos y piensos de origen vegetal y animal El liacutemite maacuteximo de residuos (LMR) se define co-
mo el nivel maacutes alto de un residuo de un pesticida que se tolera de manera legal sobre los alimentos o piensos
cuando se aplican correctamente Las cantidades de residuos que se encuentren deben ser lo maacutes bajas posible
para garantizar la seguridad en la alimentacioacuten de los consumidores Dichos liacutemites maacuteximos de residuos estaacuten
fijados por la Comisioacuten Europea pudieacutendose encontrar en su base de datos LMR [21]
A continuacioacuten en la Tabla I2 se resumen los LMRs de los compuestos de este estudio en uvas de vinificacioacuten
en unidades de mgkg de uva En el caso del vino no hay legislacioacuten en lo referente a estos pesticidas solamente
la recomendacioacuten de no superar el 10 del valor del LMR en uva
Compuesto LMRs (mgkg uva) Compuesto LMRs (mgkg uva)
AME 6 MET 1
BEN 03 MYC 1
BOS 5 PEN 02
CAR 05 PYC 2
CYP 3 PYM 5
DIM 3 TEC 1
FEH 15 TEF 3
FEP 001 TBZ 005
FLU 2 TME 04
IMI 1 THI-M 3
IPR 2 TRI 2
MAN 2
Tabla I2 Liacutemites maacuteximos de residuos permitidos para los compuestos estudiados en uvas
10
Capiacutetulo I Introduccioacuten
2 MEacuteTODOS DE PREPARACIOacuteN DE MUESTRA APLICADOS A MUESTRAS DE VINO
21 Extraccioacuten liacutequido-liacutequido (LLE)
Se entiende por extraccioacuten liacutequido-liacutequido al meacutetodo mediante el cual un analito de intereacutes se separa por el
contacto con otra fase en la cual tiene mayor afinidad de la matriz en la que se halle Los procesos de extraccioacuten
implican dos fases y requieren tres pasos sucesivos mezcla de materia prima y disolvente separacioacuten de las dos
fases despueacutes del contacto y eliminacioacuten del disolvente que contiene el analito [22]
La extraccioacuten liacutequido-liacutequido (LLE) se basa en la distribucioacuten
de un analito entre dos fases liacutequidas inmiscibles en las
cuales analito y matriz tienen solubilidades diferentes
Principalmente una de las fases es un medio acuoso en
general se trata de la muestra y la otra un disolvente
orgaacutenico La selectividad y eficacia de este meacutetodo vienen
determinadas por la eleccioacuten del disolvente y por los factores
que pueden afectar al proceso de equilibrio (pH adiccioacuten de
sales neutras en la fase acuosa para reducir la solubilidad del
analito etc) [23] Esta teacutecnica permite llevar a cabo extracciones para un rango muy amplio de analitos siendo
una de las maacutes antiguas para la preparacioacuten de muestras en el anaacutelisis cualitativo y cuantitativo Ofrece grandes
capacidades de muestreo lineal y cuenta con la ventaja de la cantidad de informacioacuten existente sobre este meacutetodo
[24]
22 Extraccioacuten en fase soacutelida (SPE)
En 1978 aparecieron los primeros cartuchos desechables para la extraccioacuten en fase soacutelida y actualmente casi 40
antildeos despueacutes la extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) es la teacutecnica de preparacioacuten de muestras maacutes empleada en los
laboratorios Es una teacutecnica de preparacioacuten y tratamiento de muestras que se basa en la retencioacuten en una fase
adsorbente del analito de intereacutes presente en una muestra liacutequida que pasa a traveacutes de ella Debido a la variedad de
formatos (discos cartuchos y jeringas) y tipos de adsorbentes (los maacutes comunes carboacuten activo aluacutemina siacutelica gel
silicato de magnesio siacutelices enlazadas y poliacutemeros como por ejemplo estinero-divinilbenceno) o la facilidad de
automatizacioacuten y acoplamiento con otras teacutecnicas como por ejemplo una conexioacuten directa con un sistema de
Figura I4 Fundamentos teoacutericos de la LLE [25]
11
Capiacutetulo I Introduccioacuten
cromatografiacutea este meacutetodo le fue ganando terreno a la LLE Otra ventaja muy importante de la SPE frente a la
LLE es la disminucioacuten en la cantidad de disolvente orgaacutenico empleada Cada vez se va innovando maacutes sobre esta
teacutecnica llegando a encontrarse fases adsorbentes formadas por poliacutemeros capaces de retener en un uacutenico
cartucho un amplio abanico de analitos lipofiacutelicos o hidrofoacutebicos aacutecidos baacutesicos o neutros [26]
El fundamento de esta extraccioacuten como se puede en la Figura I6
consiste en cuatro etapas acondicionamiento adiccioacuten de muestra
retencioacuten y elucioacuten de los analitos de intereacutes En primer lugar antes
de empezar la extraccioacuten se requiere una etapa de acondicionamiento
para preparar el adsorbente haciendo pasar un poco de disolvente
para asiacute interaccionar mejor con la muestra Luego se hace pasar la
muestra liacutequida por la fase soacutelida Idealmente el adsorbente retiene
los analitos selectivamente a medida que va pasando la muestra y la
matriz pasa sin ser retenida Por uacuteltimo los analitos se eluyen del
adsorbente con un disolvente con el que tenga mayor afinidad [27]
23 Teacutecnicas de microextraccioacuten
231 Microextraccioacuten en fase soacutelida (SPME)
En la microextraccioacuten en fase soacutelida (SPME) se utilizan fibras de siacutelice fundida revestidas con un poliacutemero en un
disentildeo en forma de jeringa para la extraccioacuten de los analitos de intereacutes El principio por el que se rige esta
extraccioacuten es el reparto del analito entre la matriz de la muestra y el revestimiento de la fibra mediante un proceso
no competitivo Se trata de un meacutetodo que cuenta con muchas ventajas ya que se elimina completamente el uso de
disolventes y aparte no son necesarios voluacutemenes de muestra grandes pero tambieacuten cuenta con algunas
desventajas ya que tanto la capacidad como la sensibilidad se ven limitadas [29]
En la figura I7 podemos ver las etapas de la extraccioacuten En un
vial cerrado con una caacutepsula y un seacuteptum tenemos la muestra
liacutequida o bien soacutelida que contenga los analitos de intereacutes
volaacutetiles Con la jeringa se perfora el seacuteptum y una vez dentro
se acciona el eacutembolo para la exposicioacuten de la fibra con los
analitos introducieacutendola en la muestra liacutequida o en su defecto
en el espacio de cabeza para la extraccioacuten de analitos volaacutetiles
de una muestra soacutelida Despueacutes de la extraccioacuten dentro del vial
Figura I6 Etapas de una SPE [28]
Figura I7 Etapas de una SPME [30]
12
Capiacutetulo I Introduccioacuten
la fibra se introduce de nuevo en la jeringa y se retira del vial [27]
232 Microextraccioacuten en fase liacutequida (LPME)
La microextraccioacuten en fase liacutequida se desarrolloacute como una alternativa a la LLE para la reduccioacuten en la cantidad de
disolventes orgaacutenicos siendo rentable tanto para el medioambiente como econoacutemicamente Entre las modalidades
maacutes populares de esta teacutecnica se encuentran microextraccioacuten con gota suspendida (SDME) y microextraccioacuten
liacutequido-liacutequido dispersiva (DLLME) En la SDME una gota de disolvente orgaacutenico es expuesta al espacio de
cabeza situado sobre una muestra en un vial dicha gota es suspendida del extremo de una microjeringa Por otro
lado la DLLME sobre una muestra acuosa se inyecta un pequentildeo volumen de una mezcla de disolventes en la
cual es dispersada formando una solucioacuten en la que se establece el equilibrio El disolvente de extraccioacuten debe
presentar una densidad inferior a la de la muestra para facilitar su recuperacioacuten normalmente despueacutes de
centrifugar el vial doacutende se realiza la extraccioacuten [31]
24 QuEChERS
La extraccioacuten QuEChERS de las palabras en ingleacutes Quick Easy Cheap Effective Rugged and Safe es un meacutetodo
de extraccioacuten que se desarrolloacute entre 2000 y 2002 para el anaacutelisis de pesticidas Como su nombre indica raacutepido
faacutecil barato eficaz robusto y seguro son las principales
caracteriacutesticas de esta preparacioacuten de muestra Se realiza en dos
etapas en primer lugar una extraccioacuten simple y una segunda fase
de purificacioacuten En la primera etapa tenemos el vial con la
muestra en el cual se antildeade un disolvente generalmente
acetonitrilo para la extraccioacuten de los analitos de intereacutes en
presencia de diferentes sales (en el meacutetodo original se utiliza
sulfato de magnesio y cloruro de sodio) para facilitar la separacioacuten
de las fases En la segunda parte se realiza la purificacioacuten de la
fraccioacuten del extracto orgaacutenico Para eso se lleva a cabo una
limpieza de los analitos eliminando el agua y los compuestos
presentes en la matriz de la muestra empleando un adsorbente PSA (amina primaria y secundaria) C18 carboacuten
negro grafitizado (GCB) o una combinacioacuten de eacutestas [32]
Figura I8 Etapas de QuEChERS [33]
13
Capiacutetulo I Introduccioacuten
3 METODOLOGIacuteA ANALIacuteTICA PARA LA DETERMINACIOacuteN DE PESTICIDAS
31 Meacutetodos de GC-MS (MSMS)
La combinacioacuten de cromatografiacutea de gases (GC) teacutecnica de separacioacuten con espectrometriacutea de masas (MS) como
sistema de deteccioacuten representa un potente meacutetodo para la identificacioacuten determinacioacuten y cuantificacioacuten de
analitos orgaacutenicos en concentraciones traza presentes en muestras complejas Esta teacutecnica de anaacutelisis cuenta con
muchas ventajas en sensibilidad multifuncionalidad buena reproducibilidad robustez asiacute como facilidad en el
manejo pero con una gran desventaja este meacutetodo no es apto para ser utilizado con todos los analitos sino que
se ve limitado a aquellos que sean termoestables y no se descompongan a temperaturas elevadas antes de ser
volatilizados La muestra es introducida a traveacutes del inyector en el cromatoacutegrafo de gases doacutende impulsada por
una corriente de gas inerte como fase moacutevil pasa a traveacutes de la columna que contiene la fase estacionaria en la
cual se separan los compuestos debido a una distribucioacuten de estos entre fase moacutevil-fase estacionaria Mediante
una interfase son introducidos para su deteccioacuten en el espectroacutemetro de masas que cuenta con una fuente de
iones analizador de masas y un detector [34]
La combinacioacuten de analizadores de masas en taacutendem (MSMS) como sistema de deteccioacuten en GC es una teacutecnica
altamente selectiva mejorando la sensibilidad y la relacioacuten sentildeal-ruido en los espectros experimentando una
mejora por lo que se logran unos liacutemites de deteccioacuten inferiores Esta teacutecnica GC-MSMS comprende maacutes
pasos despueacutes de la separacioacuten por cromatografiacutea se lleva a cabo la deteccioacuten con MSMS que consta de varias
etapas generacioacuten de iones en la fuente de ionizacioacuten seleccioacuten de los iones precursores de una determinada
masa disociacioacuten causada por colisioacuten con moleacuteculas de gas inerte de los iones precursores y por uacuteltimo el
anaacutelisis de los fragmentos en relacioacuten a su masacarga (mz) En el caso de que un espectro de MS no permita
confirmar la identidad de un determinado compuesto quiacutemico la obtencioacuten de su espectro de MSMS permite
mejorar la confianza en su identificacioacuten [36]
Figura I9 Acoplamiento GC-MS [35]
14
Capiacutetulo I Introduccioacuten
32 Meacutetodos LC-MS (MSMS)
La teacutecnica de LC-MS se desarrolloacute para minimizar las desventajas del acoplamiento GC-MS y asiacute resolver los
problemas que este uacuteltimo acarreaba con los analitos termolaacutebiles permitiendo el anaacutelisis de eacutestos sin tener que
realizar una etapa previa de derivatizacioacuten La interfase de unioacuten de cromatografiacutea liacutequida (LC) con espectrometriacutea
de masas (MS) acarrea una dificultad significativa siendo responsable de transformar los analitos que se
encontraban en la fase moacutevil liacutequida en iones en fase gas sin que se produzca su degradacioacuten teacutermica La
sensibilidad de las determinaciones por LC-MS va a depender de la interfase empleada Las principales interfases
empleadas actualmente son las ionizaciones a presioacuten atmosfeacuterica electrospray (ES) e ionizacioacuten quiacutemica a
presioacuten atmosfeacuterica (APCI) [37]
Con los antildeos la cromatografiacutea liacutequida se ha ido innovando y mediante la disminucioacuten del tamantildeo de partiacutecula en
la columna se fue mejorando la eficiencia asiacute como aumentando la selectividad y resolucioacuten del pico en el
cromatograma Para este nuevo sistema llamado UPLC Ultra-Performance Liquid Chromatography se desarrolloacute
una nueva instrumentacioacuten capaz de trabajar a altas presiones generando flujos mayores sin peacuterdidas de
resolucioacuten utilizando inyectores automaacuteticos maacutes raacutepidos y detectores con mayor velocidad de adquisicioacuten de
datos disminuyendo asiacute el tiempo de anaacutelisis [39]
33 Espectrometriacutea de masas
La espectrometriacutea de masas es el meacutetodo de deteccioacuten y cuantificacioacuten maacutes fiable a la hora de la determinacioacuten de
compuestos en matrices complejas (tales como alimentos) ya que otros detectores maacutes tradicionales como UV-
visible o fluorescencia cuentan con una gran incertidumbre en los resultados llegando incluso a ofrecer falsos
Figura I10 Acoplamiento LC-MS [38]
15
Capiacutetulo I Introduccioacuten
positivos o negativos Un espectrometro de masas cuenta con un dispositivo de introduccioacuten de muestra una
caacutemara de ionizacioacuten un sistema para la aceleracioacuten de los iones uno o varios analizadores de masas y un detector
[40]
El fundamento de la espectrometriacutea de masas se basa en la separacioacuten de iones en base a la relacioacuten masacarga
(mz) El proceso consta fundamentalmente de cuatro etapas La
primera es la ionizacioacuten de la muestra los iones formados se aceleran
debido a la accioacuten de un campo eleacutectrico variable separacioacuten de los
iones seguacuten su masacarga deteccioacuten de los iones y produccioacuten de la
sentildeal eleacutectrica El analizador de masas es el encargado de la separacioacuten
de los iones en funcioacuten a su mz entre los que maacutes destacan
analizador de masas cuadrupolar que dispersa simultaacuteneamente todos
los iones en funcioacuten de la relacioacuten mz analizador de masas de
tiempo de vuelo (TOF) consta de un tubo a alto vaciacuteo sobre el que no
actuacutea ninguacuten campo eleacutectrico al cual llegan todos los iones acelerados con la misma energiacutea cineacutetica y en el tubo
las velocidades variacutean seguacuten mz y analizador de trampa de iones en doacutende los iones gaseosos quedan aislados
durante largos periacuteodos de tiempo por la accioacuten del campo eleacutectrico [41]
4RESUMEN BIBLIOGRAacuteFICO DE LAS TEacuteCNICAS DE EXTRACCIOacuteN Y
DETERMINACIOacuteN DE PESTICIDAS EN VINO
En la bibliografiacutea se han descrito diversas teacutecnicas y diferentes combinaciones entre teacutecnicas de extraccioacuten y
distintas teacutecnicas de cuantificacioacuten e identificacioacuten para esos analitos Entre estas teacutecnicas los valores de los liacutemites
de cuantificacioacuten (LOQs) y las recuperaciones relativas pueden diferir en el resultado en un rango de valores asiacute
como el tiempo total empleado para el anaacutelisis y para la preparacioacuten de la muestra
Por lo general el meacutetodo de extraccioacuten de los analitos de intereacutes maacutes empleado es la extraccioacuten en fase soacutelida
(SPE) la cuaacutel le ha estado ganando terreno a la extraccioacuten liacutequido-liacutequido aunque tambieacuten se estaacute viendo cada vez
maacutes desplazada debido al creciente uso de la teacutecnica QuEChERS
Figura I11 Etapas de la espectrometriacutea de masas [42]
16
Capiacutetulo I Introduccioacuten
En el estudio de ECONOMOU et al [43] realizado en el antildeo 2009 en Grecia se empleoacute la extraccioacuten en fase
soacutelida con deteccioacuten en cromatografiacutea de liacutequidos acoplada a espectrometriacutea de masas en taacutendem (SPE-LC-ESI-
MSMS) Para la preparacioacuten de la muestra diluyeron 10 mL de vino (tanto blanco como tinto) a un volumen
final de 100 mL con agua ultrapura antes de la SPE Determinaron las recuperaciones de la extraccioacuten para dos
niveles de concentracioacuten 0010 y 0050 mgL realizando 8 medidas diarias durante 3 diacuteas consecutivos
encontraacutendose unos valores que variacutean dentro del rango 70-110 para todos los pesticidas en los dos niveles Para
la determinacioacuten y cuantificacioacuten de 46 pesticidas emplearon la teacutecnica de cromatografiacutea de liacutequidos con
espectrometriacutea de masas con un volumen de inyeccioacuten de 20 microL y un flujo de fase moacutevil de 02 mLmin
aclopada a espectrometriacutea de masas en taacutendem
Con la misma teacutecnica de extraccioacuten PELAJIĆ et al [45] durante el antildeo 2015 en Croacia llevaron a cabo la
determinacioacuten de 25 residuos de plaguicidas en vino tinto El meacutetodo que desarrollaron para dicha finalidad fue el
acoplamiento SPE-GC-MS Para la preparacioacuten de la muestra emplearon 10 mL de vino diluidos 11 con agua
ultrapura hasta un volumen final de 20 mL Calcularon las recuperaciones de la extraccioacuten y se encontroacute un rango
para todos los pesticidas en las muestras de 70-120 Para la determinacioacuten en cromatografiacutea de gases-
espectrometriacutea de masas se empleoacute un volumen de inyeccioacuten de 5 μL y un flujo de fase moacutevil de 10 mLmin
Mediante el acoplamiento de teacutecnicas SPE dispersiva-GC-MS WALORCZYK et al [48] en el antildeo 2011 en
Polonia llevaron a cabo la cuantificacioacuten de 160 pesticidas en diferentes clases de vino tinto rosado y blanco Con
10 g de vino y 10 mL de acetonitrilo se realizaron pruebas de recuperacioacuten en la fase de extraccioacuten para vino
tinto con los niveles de concentracioacuten 001 005 y 02 mgkg y para los vinos rosado y blanco con el nivel de
concentracioacuten 005mgkg y encontraron que a todos los niveles de concentracioacuten los valores de recuperacioacuten
rondan el rango 80-110 Para la teacutecnica cromatograacutefica se utilizoacute un volumen de inyeccioacuten de 5 microL
El acoplamiento LLE-SPE-LCDAD fue desarrollado por GONZAacuteLEZ-RODRIacuteGUEZ et al [50] en el antildeo
2010 en la provincia de Orense para la determinacioacuten de nuevos fungicidas propuestos para combatir el hongo
que provoca la enfermedad del mildium En la preparacioacuten de la muestra emplearon 15 mL de vino blanco para la
extraccioacuten en la cual fueron calculadas las recuperaciones relativas para dos niveles de concentracioacuten 005 y 05
mgkg en donde se establece un rango de entre 70-110 para todos los analitos Para la determinacioacuten mediante
cromatografiacutea de liacutequidos se empleoacute un volumen de inyeccioacuten de 2 μL y como meacutetodo de deteccioacuten utilizaron un
detector de diodos array
La microextraccioacuten sorptiva en fase soacutelida fue empleada en la publicacioacuten de FONTANA et al [44] junto con un
acoplamiento entre cromatografiacutea de liacutequidos y espectrometriacutea de masas para la determinacioacuten de 15 fungicidas
en vino realizada durante el 2010 en el noroeste de Espantildea Para la preparacioacuten de la muestra emplearon 10 mL
17
Capiacutetulo I Introduccioacuten
de vino diluiacutedos con el mismo volumen de agua ultrapura y un sorbente en forma de disco de silicona con un
volumen de 12 microL La recuperacioacuten de la extraccioacuten se calculoacute para vino tinto (Menciacutea) y vino blanco (Godello)
realizando tres replicas dentro de un mismo diacutea para los niveles de concentracioacuten 10 y 50 ngmL y nueve reacuteplicas
realizando el anaacutelisis en tres diacuteas consecutivos para el nivel de concentracioacuten de 25 ngmL y los resultados
obtenidos dan unos valores de recuperacioacuten dentro del rango 75-117 En el sistema LC-QTOF-MS el volumen
de inyeccioacuten fue de 15 microL
El otro meacutetodo de extraccioacuten mencionado anteriormente es QuEChERS estaacute en auge como meacutetodo de extracioacuten
de residuos de pesticidas en matrices como la del vino o la uva ya que incrementa la velocidad del anaacutelisis y reduce
el efecto de matriz BUERGE et al [46] seguido de una deteccioacuten mediante GC-MSMS realizaron una estapa
de extraccioacuten QuEChERS con alguna modificacioacuten acetato de sodio en lugar de cloruro soacutedico y acetato de etilo
en lugar de acetonitrilo utilizando 5 g de uva para la determinacioacuten de residuos de 4 pesticidas durante el antildeo
2016 Las recuperaciones de extraccioacuten resultaron ser valores entre 91-149 en uva a distintos niveles de
concentracioacuten 005 05 y 5 mgkg
Para la determinacioacuten de Ametoctradin HU et al [47] llevaron a cabo una extraccioacuten QuEChERS empleando 10
g de uva con deteccioacuten mediante el acoplamiento UPLC-MSMS utilizando un volumen de inyeccioacuten de 5 μL y
un flujo de fase moacutevil de 03 mLmin Las recuperaciones de la extraccioacuten se calcularon para tres niveles de
concentracioacuten 1 10 100 μgL de dos formas distintas en tres diacuteas consecutivos realizando 5 reacuteplicas al diacutea o en
dentro de un mismo diacutea realizando 15 reacuteplicas los resultados de todos los caacutelculos se encuentran dentro del rango
818-1001
Siguiendo con el mismo modo de extraccioacuten GUO et al [49] publicaron sus estudios para la determinacioacuten de
50 pesticidas y 12 adulterantes en vino tinto Para la extraccioacuten QuEChERS se utilizaron 10 mL de vino tinto con
10 mL de acetonitrilo y calcularon las recuperaciones para tres niveles de concentracioacuten 50 100 y 250 ngmL
encontraacutendose un rango de valores entre 75-120 El meacutetodo de deteccioacuten se llevoacute a cabo mediante un anaacutelisis
directo en tiempo real junto con espectrometriacutea de masas en tandem con un cuadrupolo (DART-MSMS) la
teacutecnica DART es un meacutetodo raacutepido para cribar y cuantificar los analitos de estudio que prescinde de la etapa de
separacioacuten cromatograacutefica
A continuacioacuten se recogen en la Tabla I3 los liacutemites de cuantificacioacuten (LOQs) de los analitos de intereacutes en este
trabajo caacutelculados por los diferentes meacutetodos encontrados en bibliografiacutea citados anteriormente en este apartado
18
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Tabla I3 LOQs de los analitos de intereacutes descritos para los distintos meacutetodos encontrados en la bibliografiacutea
Compuesto LOQs
Compuesto LOQs
V Blanco V Tinto Uva V Blanco V Tinto Uva
AME - - 0032μgkg[47] MET 86 μgL[43]
22 μgL[44]
89 μgL[43]
22 μgL[44]
5 μgL[45]
259 ngmL[49]
001mgkg[48]
BEN 02 μgL[44]
0001 mgL[50]
02 μgL[44]
001 μgL[45]
280ngmL[49]
005 mgkg[48] MYC 30 μgL[43]
08 μgL[44]
36 μgL[43]
10 μgL[44]
025 μgL[45]
331ngmL[49]
001 mgkg[48]
BOS 0065 mgL[50] 05 μgL[45]
1076 ngmL[49] 001 mgkg[48] PEN
56 μgL[43]
05 μgL[44]
49 μgL[43]
04 μgL[44]
220ngmL[49]
001 mgkg[48]
CAR - 386 ngmL[49] - PYC 0003mgL[50] 07 μgL[45] 001 mgkg[48]
CYP 15 μgL[43]
04 μgL[44]
0001 mgL[50]
22 μgL[43]
06 μgL[44]
312 ngmL[49]
001 mgkg[48] PYM 17 μgL[43] 22 μgL[43]
10 μgL[45] 001 mgkg[48]
DIM 18 μgL[43] 20 μgL[43] 001 mgkg[48] TEC 03 μgL[44]
03 μgL[44]
10 μgL[45]
160ngmL[49]
001 mgkg[48]
FEH 17 μgL[43] 22 μgL[43]
938 ngmL[49] 001 mgkg[48] TEF - 876ngmL[49] -
FEP - - 002mgkg[46] TBZ 15μgL [43] 29μgL[43] 001 mgkg[48]
FLU 005 μgL[45] TME - 25 μgL[45] 001 mgkg[48]
IMI 21 μgL[43] 22 μgL[43]
225 ngmL[49] - THI-M 92 μgL[43] 89 μgL[43] -
IPR 07 μgL[44] 07 μgL[44] 001 mgkg[48] TRI 10 μgL[44] 12 μgL[44] 001 mgkg[48]
MAN 0011 mgL[50] - -
5 DISTRIBUCIOacuteN DE PESTICIDAS EN VINOS COMERCIALES
En algunos de los meacutetodos descritos en el apartado anterior se procesaron vinos comerciales encontraacutendose
resultados positivos para muchos residuos de pesticidas y algunos hasta en gran concentracioacuten
ECONOMOU et al [43] mediante el meacutetodo LC-ESI-MSMS realizaron el anaacutelisis de 60 muestras de vino tinto
y blanco recogidos en supermercados locales en Grecia a lo largo de un antildeo El meacutetodo se habiacutea desarrollado
19
Capiacutetulo I Introduccioacuten
para la determinacioacuten de 46 pesticidas pero la mayoriacutea se encuentran con una concentracioacuten por debajo de
001mgL solo ocho plaguicidas se obtuvieron con resultados de concentracioacuten mayores Se muestran los
resultados en la Tabla I4 de los analitos de intereacutes en este estudio
Tabla I4 Nuacutemero de muestras positivas de distintos pesticidas en el anaacutelisis de 60 muestras de vino [43]
Compuesto Positivos con concentracioacuten entre 001-01
mgL
Positivos con concentracioacuten entre 01-1
mgL
PYM 2 (3) 2 (3)
MYC 2 (3) 0 (0)
CAR 11 (18) 7 (12)
THI-M 7 (12) 5 (8)
FEH 5 (8) 0 (0)
MET 1 (2) 0 (0)
Mediante el meacutetodo de microextraccioacuten en fase soacutelida-LC-TOF-MS FONTANA et al [44] aplicaron el
desarrollo del procedimiento a un total de 12 vinos joacutevenes elaborados en el 2010 y correspondientes a diferentes
denominaciones geograacuteficas del noroeste de Espantildea En la Tabla I5 se muestran los datos que han obtenido
Tabla I5 Determinacioacuten de fitosanitarios en vinos comerciales mediante Microextraccioacuten en fase soacutelida-LC-TOF-MS
Valores de concentracioacuten en ngmL [44]
Pesticidas
W 1
Albarintildeo
W5
Ribeiro
W6
Valdeorras
R1
Ribeira Sacra
R3
Ribeiro
R4
Valdeorras
MET 404plusmn06 223plusmn05 311plusmn007 25plusmn03 31plusmn03 74plusmn10
TRI nd nd 36plusmn06 nd nd ltLOQ
IPR 394plusmn03 324plusmn02 324plusmn02 071plusmn007 31plusmn02 28plusmn05
MYC nd nd nd ltLOQ 39plusmn02 nd
TEC 25plusmn01 nd nd nd nd nd
CYP 179plusmn08 ltLOQ ltLOQ 562plusmn002 083plusmn001 nd
BEN 042plusmn001 nd ltLOQ nd 032plusmn001 ltLOQ
ndNo detectados ltLOQ por debajo del liacutemite de cuantificacioacuten del meacutetodo los coacutedigos W y R corresponden respecti-vamente a los vinos blanco y tinto
20
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Por uacuteltimo PELAJIĆ et al [45] aplicaron su meacutetodo SPE dispersiva-GC-MS mediante el cual determinaron 25
residuos de plaguicidas en vino tinto a un total de 32 muestras de vino adquiridos en supermercados locales de
Croacia pero de diversos oriacutegenes de procedencia Los resultados que han obtenido se muestran en la Tabla I6
en doacutende un total de 15 plaguicidas han sido detectados y 7 de los cuales se encontraban en una alta
concentracioacuten
Tabla I6 Resultados de los vinos con positivos en pesticidas y sus concentraciones [45]
Vino Paiacutes Residuos de pesticidas (mgKg)
Tinto Francia DIM (0013) MET (0009) IPR (001)
Tinto Alemania BOS (0011)
Tinto Alemania IPR (0009)
Tinto Macedonia MET (0015)
Tinto Moldavia IPR (0008)
Tinto Polonia MET (004)
Tinto Rumania PYM (0058)
Tinto Espantildea TRI (0005) MET (0011)
Tinto Estados Unidos BOS (001)
Rosado Francia BOS (0005)
Blanco Chile TEC (0008)
Blanco Georgia MET (0057)
Blanco Alemania DIM (001) IPR (0054) PYM (0056)
Blanco Sudaacutefrica DIM (0011) IPR (0011)
21
Capiacutetulo II Objetivos y discusioacuten
CAPIacuteTULO II OBJETIVOS Y DISCUSIOacuteN
El objetivo principal que se persigue en este trabajo es el desarrollo de un meacutetodo analiacutetico raacutepido basado en la
extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) y deteccioacuten mediante cromatografiacutea de liacutequidos en la modalidad de UPLC
acoplada a la espectrometriacutea de masas en taacutendem (UPLC-MSMS) para la determinacioacuten multianalito de residuos
de fitosanitarios principalmente fungicidas aunque tambieacuten alguacuten insecticida en muestras de vino blanco y tinto
Para llevar a cabo la finalidad de lo dicho se consideran unos objetivos maacutes especiacuteficos
Minimizar la manipulacioacuten de la muestra para asiacute reducir la cantidad de disolventes y tiempo empleado
Optimizacioacuten de los factores que afectan en la extraccioacuten en la SPE tales como tipo y cantidad de
adsorbente volumen de eluyente etc
Estudio de las condiciones en UPLC-MSMS para una separacioacuten y cuantificacioacuten oacuteptimas
Caracterizacioacuten y validacioacuten del meacutetodo propuesto
Por uacuteltimo una vez cumplidos todos los objetivos anteriores y fijadas las condiciones oacuteptimas el meacutetodo
estudiado se aplica en el anaacutelisis de muestras de vino comercial (blanco y tinto) para determinar si se encuentran
residuos presentes asiacute como conocer en queacute concentracioacuten se encuentran los pesticidas objeto de este estudio
22
Capiacutetulo III Parte experimental
CAPIacuteTULO III PARTE EXPERIMENTAL
1 MATERIAL Y REACTIVOS
11 Material
Material de vidrio de uso comuacuten en el laboratorio vasos de precipitados matraces aforados etc
Micropipetas automaacuteticas de 20-200 microL 20-200 microL 100-1000 microL 1000-5000 microL Eppendorf
Puntas de plaacutestico para micropipetas
Encapsulador y desencapsulador
Soportes y pinzas
Viales de 15 mL transparentes para muestreador automaacutetico de cromatografiacutea (Sugelabor)
Caacutepsulas de aluminio con seacuteptum de Tefloacuten (Sugelabor) y tapones pre-slit para viales
Tubos y conectores de tefloacuten
Cartuchos de divinilbenceno-N-vinilpirrolidona 200 mg Oasis HLB Waters
Cartuchos de divinilbenceno-N-vinilpirrolidona funcionalizados con grupos amina cuaternaria 150 mg
Oasis MAX Waters
Cartuchos de divinilbenceno-N-vinilpirrolidona 60 mg Oasis HLB Waters
12 Reactivos y disolventes
Agua ultrapura Milli-Q
Aacutecido foacutermico (Sigma Aldrich) 95
Acetonitrilo (LichrosolvregMerck) Gradient grade for liquid chromatography
Metanol (LichrosolvregMerck) Gradient grade for liquid chromatography
Etanol (LichrosolvregMerck) Gradient grade for liquid chromatography
13 Patrones
Ametoctradin (AME) Dr Ehrenstrorfer 990
Benalaxyl (BEN) Pestanal Sigma- Aldrich 999
23
Capiacutetulo III Parte experimental
Boscalid (BOS) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Carbendazim (CAR) Pestanal Sigma- Aldrich 992
Cyprodinil (CYP) Pestanal Sigma- Aldrich 998
Dimethomorph (DIM) mezcla de isoacutemeros E + Z Pestanal Sigma- Aldrich 989
Fenhexamid (FEH) Pestanal Sigma- Aldrich 997
Fenpropidin (FEP) Dr Ehrenstrorfer 980
Fluopicolide (FLU) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Imidacloprid (IMI) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Iprovalicarb (IPR) mezcla de isoacutemeros Pestanal Sigma- Aldrich 985
Mandipropamid (MAN) Pestanal Sigma- Aldrich 991
Metalaxyl (MET) Pestanal Sigma- Aldrich 990
Myclobutanil (MYC) Pestanal Sigma- Aldrich 994
Penconazole (PEN) Pestanal Sigma- Aldrich 991
Pyraclostrobin (PYC) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Pyrimethanil (PYM) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Tebuconazol (TEC) Pestanal Sigma- Aldrich 996
Tebufenozide (TEF) Dr Ehrenstrorfer 988
Thiabendazole (TBZ) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Thiamethoxam (TME) Pestanal Sigma- Aldrich 996
Thiophanate-methyl (THI-M) Dr Ehrenstrofer 990
Triadimenol (TRI) Mezcla de diastereoisoacutemeros Pestanal Sigma- Aldrich 994
14 Patrones internos
Carbendazim-d3 (CAR-d3) Pestanal Sigma- Aldrich 998
Cyprodinil-d5 (CYP-d5) Pestanal Sigma- Aldrich
Imidacloprid-d4 (IMID-d4) Pestanal Sigma- Aldrich
Metalaxyl 13C6 (MET13C6) Pestanal Sigma-Aldrich 99
24
Capiacutetulo III Parte experimental
15 Gases
Nitroacutegeno 99999 como gas de colisioacuten en el espectroacutemetro de masas
Nitroacutegeno en los sistemas de concentracioacuten y secado por corriente de nitroacutegeno de los cartuchos SPE
2 INSTRUMENTACIOacuteN
Balanza analiacutetica de precisioacuten Sartorius
Granatario Sartorius
Bantildeo de ultrasonidos P-Selecta
Equipo de purificacioacuten de agua Millipore modelo Milli-Q gradient A-10ZMQSSVOT4
Estacioacuten de concentracioacuten por corriente de nitroacutegeno Mini-Vap Supelco
Sistema de secado de cartuchos de SPE por corriente de nitroacutegeno VisiDry Supelco
Sistema distribuidor de vaciacuteo Visiprep reg Supelco
Cromatoacutegrafo de liacutequidos de ultra-alta resolucioacuten Waters AcquityUPLC reg y espectroacutemetro de masas
Acquity TQD con analizador de triple quadrupolo (QqQ) equipado con una fuente de ionizacioacuten a
presioacuten atmosfeacuterica del tipo Z-spray (ESI)
3 PREPARACIOacuteN DE LAS DISOLUCIONES
Los patrones de pesticidas se prepararon individualmente a partir de los compuestos soacutelidos comerciales por
pesada excepto en el caso del fenpropidin (FEP) que se preparoacute a partir del compuesto liacutequido comercial Estos
compuestos soacutelidos se disolvieron en metanol y se obtuvieron unas disoluciones iniciales con concentraciones
recogidas en la Tabla III1
25
Capiacutetulo III Parte experimental
Tabla III1 Concentracioacuten de las disoluciones patroacuten stock
Compuesto Concentracioacuten (microgmL) Compuesto Concentracioacuten (microgmL)
AME 102201 MET 118912
BEN 138330 MYC 102017
BOS 99474 PEN 129791
CAR 17105 PYC 104581
CYP 131075 PYM 141386
DIM 103009 TEC 134729
FEH 99584 TEF 137769
FEP 100000 TBZ 105928
FLU 126859 TME 112283
IMI 101123 THI-M 124202
IPR 106739 TRI 118933
MAN 101021
4 LAVADO DEL MATERIAL
La limpieza del material de vidrio utilizado en el laboratorio se realizoacute utilizando jaboacuten y aclarando con agua de
grifo Luego en primer lugar se realiza un enjuague con agua Milli-Q finalmente un segundo enjuague con
acetona para eliminar posibles restos de compuestos orgaacutenicos y se deja secar sobre papel
Para la limpieza de los conectores de tefloacuten empleados en el proceso de SPE se introducen en un vaso de
precipitados con metanol y este en un bantildeo de ultrasonidos durante 10 minutos Al finalizar con el bantildeo de
ultrasonidos se realiza un enjuague con acetona y se pone a secar
5 EXTRACCIOacuteN DE MUESTRAS MEDIANTE SPE
El meacutetodo de extraccioacuten utilizado para la determinacioacuten de pesticidas fue la extraccioacuten en fase soacutelida (SPE)
mediante cartuchos Oasis HLB de 200 mg A continuacioacuten se describe el protocolo de extraccioacuten en las
condiciones oacuteptimas
26
Capiacutetulo III Parte experimental
1 Acondicionamiento del cartucho Oasis HLB de 200 mg con 2 mL de acetonitrilo seguidos de otros 2 mL de
vino sinteacutetico formado por la mezcla etanolagua MilliQ (1288)
2 Paso de la muestra 2 mL de vino diluiacutedos con 2 mL de agua MilliQ a traveacutes del cartucho por gravedad
3 Lavado del cartucho con 2 mL de agua MilliQ
4 Secado del cartucho durante 45 minutos en el VisiDry mediante el paso de una corriente de nitroacutegeno
5 Elucioacuten del cartucho con la mezcla metanolacetonitrilo en proporcioacuten 2080 hasta un volumen final de 2
mL
6 Anaacutelisis mediante cromatografiacutea liacutequida acoplada a espectrometriacutea de masas en taacutendem UPLC-MSMS
(volumen de inyeccioacuten 15 microL)
Representacioacuten esquematizada en la Figura III1
Figura III1 Extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) de las muestras de vino
27
Capiacutetulo III Parte experimental
6 CONDICIONES DE DETERMINACIOacuteN MEDIANTE UPLC-MSMS
En la Tabla III2 se indican las condiciones utlizadas en la determinacioacuten de los pesticidas de intereacutes mediante
LC-MSMS y en la Tabla III3 se muestra el gradiente de la fase moacutevil utilizado para la separacioacuten
cromatograacutefica
Tabla III2 Condiciones experimentales de determinacioacuten en LC-MSMS
UPLC Acquity UPLC-I-Class IVD System
bull Columna cromatograacutefica Zorbax Eclipse Plus C18 Rapid Resolution HD
Fase estacionaria C18
Dimensiones 21 x 50 mm
Tamantildeo de partiacutecula 18 microm
Temperatura del horno 40ordmC
bull Inyector
Volumen de inyeccioacuten 15 microL
bull Fase moacutevil
Flujo 04 mLmin
Fase acuosa (A) Agua MilliQ con 01 aacutecido foacutermico
Fase orgaacutenica (B) Acetonitrilo con 01 aacutecido foacutermico
MSMS WatersXevo TQD
Modo de ionizacioacuten ESI positivo
Voltaje del capilar 15 kV
Voltaje de cono 50 V
Temperatura de gas de secado (N2) 450ordmC
Flujo de gas de secado (N2) 1000 Lh
Modo de adquisicioacuten Centroide
Tabla III3 Gradiente de fase moacutevil utilizado en la separacioacuten cromatograacutefica (LC)
Tiempo min 0 13 28 64 75 76 10
A 98 50 50 0 0 98 98
B 2 50 50 100 100 2 2
28
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
CAPIacuteTULO IV RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
1 IDENTIFICACIOacuteN DE LOS COMPUESTOS
Para empezar el estudio en primer lugar se realizoacute la caracterizacioacuten de las condiciones de determinacioacuten de los
analitos en el modo Multiple Reaction Monitoring (MRM) mediante UPLC-ESI-MSMS Para llevarla a cabo se
tomaron patrones individuales de cada fitosanitario y mediante infusioacuten se estudiaron las posibles transiciones y
voltajes oacuteptimos para su determinacioacuten (Tabla IV1)
La ionizacioacuten por electrospray (ESI) se estudioacute tanto en modo positivo como en modo negativo encontraacutendose
que para todos los pesticidas de nuestro intereacutes se obteniacutea sentildeal en el modo positivo mientras el modo negativo
no presentaba respuesta significativa
A continuacioacuten se estudia el efecto del voltaje de cono en la respuesta del ioacuten molecular [M+H]+ aumentaacutendolo
hasta alcanzar el valor maacuteximo de la sentildeal correspondiente a dicho ioacuten y luego se optimiza la energiacutea de colisioacuten
variaacutendola para cada analito hasta obtener la sentildeal de mayor intensidad para cada uno de los iones producto Por
uacuteltimo una vez optimizado el voltaje de cono y la energiacutea de colisioacuten se seleccionan las dos transiciones maacutes
intensas para llevar a cabo la cuantificacioacuten y cualificacioacuten de cada analito en modo MRM Este procedimiento se
realizoacute para la totalidad de los compuestos confirmando los datos obtenidos con los facilitados por la base de
datos Quanpedia que estaacute disponible en el software del equipo utilizado para algunos de los compuestos
considerados
Compuesto Tr (min) Ion precursor (mz Da)
Voltaje de cono (V)
Ion producto 1 (CEv)
cuantificacioacuten
Ion producto 2 (CEv)
cualificacioacuten
Relacioacuten IP2IP1
AME 325 2760 60 176 (35) 70 (50) 016
BEN 485 3261 26 148 (20) 91 (34) 067
BOS 387 3429 41 140 (20) 307 (20) 011
CAR 167 1921 33 160 (18) 132 (28) 014
CYP 311 2260 56 93 (33) 108 (25) 061
DIM 322 3881 40 301 (20) 165 (30) 057
FEH 386 3021 41 97 (22) 55 (38) 044
FEP 257 2742 55 147 (28) 86 (28) 093
FLU 401 3830 40 173 (20) 365 (15) 010
IMI 218 2561 34 209 (15) 175 (20) 091
IPR 358 3211 28 119 (16) 203 (10) 042
Tabla IV1 Tiempos de retencioacuten (Tr) relacioacuten de iones precursores (mz) voltaje de cono (V) energiacuteas de colisioacuten (CE) y relacioacuten de intensidades entre transiciones (IP2IP1)
29
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Compuesto Tr (min) Ion precursor (mz Da)
Voltaje de cono (V)
Ion producto 1 (CEv)
cuantificacioacuten
Ion producto 2 (CEv)
cualificacioacuten
Relacioacuten IP2IP1
MAN 392 4120 25 328 (16) 125 (35) 063
MET 283 2801 26 220 (13) 192 (17) 057
MYC 365 2891 34 70 (18) 125 (32) 029
PEN 417 2840 34 70 (16) 159 (34) 031
PYC 523 3881 31 194 (12) 163 (25) 066
PYM 266 2000 51 107 (24) 82 (24) 071
TEC 397 3080 40 70 (22) 125 (40) 007
TEF 473 3531 19 133 (20) 297 (8) 072
TBZ 182 2020 51 175 (25) 131 (30) 062
TME 203 2920 28 211 (12) 132 (22) 047
THI-M 257 3430 28 151 (46) 93 (19) 0001
TRI 319 2961 21 70 (10) 99 (15) 013
El dwell time para cada una de las transiciones se ajustoacute de manera automaacutetica por el software (MassLinx) con
objeto de obtener doce puntos espectrales por compuesto tomando un valor promedio de cuatro segundos como
ancho de pico a liacutenea de base
2 CARACTERIZACIOacuteN DEL PROCEDIMIENTO DE DETERMINACIOacuteN (UPLC-ESI-
MSMS)
Una vez optimizados los paraacutemetros que afectan a la separacioacuten cromatograacutefica (UPLC) y a la determinacioacuten por
espectrometriacutea de masas en taacutendem (MSMS) se lleva a cabo la evaluacioacuten de la repetibilidad de inyeccioacuten y
determinacioacuten en esas condiciones Se expresa por medio de la desviacioacuten estaacutendar relativa (RSD) paraacutemetro que
nos indica el grado de correlacioacuten que existe entre varias medidas del mismo patroacuten realizadas por el mismo
operador en el laboratorio y en el mismo equipo de medida a lo largo de un diacutea Para el estudio se realizan diez
inyecciones con volumen de 15 microL de dos patrones con distintos niveles de concentracioacuten 5 y 20 ngmL Los
datos de RSD (Tabla IV2) para las aacutereas de pico de los analitos se situacutean para el nivel de concentracioacuten 5 ngmL
en el rango 2-13 y en el nivel de concentracioacuten 20 ngmL en el rango 1-7
30
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten Tabla IV2 Desviacioacuten estaacutendar relativa (RSD) del aacuterea de pico (transicioacuten de cuantificacioacuten) para evaluar la repetivilidad del proceso de LC-MSMS
Compuesto RSD
5 ngmL
RSD
20 ngmL Compuesto
RSD
5 ngmL
RSD
20 ngmL
AME 5 2 MET 3 2
BEN 2 2 MYC 9 2
BOS 4 5 PEN 4 4
CAR 4 2 PYC 3 1
CYP 5 7 PYM 7 3
DIM 6 5 TEC 3 2
FEH 7 4 TEF 4 2
FEP 4 2 TBZ 2 1
FLU 5 3 TME 6 6
IMI 13 7 THI-M a 6
IPR 8 2 TRI 8 6
MAN 3 2
A continuacioacuten tambieacuten se evaluoacute la repetibilidad de los tiempos de retencioacuten (Tr) para diez inyecciones de
patrones a los dos niveles de concentracioacuten 5 y 20 ngmL situaacutendose las RSD para todos los compuestos en el
rango 01-03 En base a este dato la ventana de tiempo en la que se registran las transiciones de MRM de cada
compuesto se fijoacute en 05 min lo que es lo mismo 025 min alrededor del valor medio de su tiempo de retencioacuten
Por otro lado la linealidad del meacutetodo se estudioacute a nueve niveles de concentracioacuten diferentes comprendidos ente
los niveles 05 ngmL y 200 ngmL mediante la inyeccioacuten de disoluciones patroacuten de los distintos compuestos de
estudio Se realizoacute una evaluacioacuten sin y otra con patroacuten interno (IS) antildeadiendo una concentracioacuten fija de patrones
internos a nivel de 25 ngmL y pudimos observar que los resultados mejoran notablemente al realizar una
correccioacuten con el IS En la Tabla IV3 se muestran los coeficientes de determinacioacuten (R2) obtenidos al realizar la
correccioacuten mediante IS observando que para todos los compuestos excepto para THI-M y para TRI los
coeficientes de correlacioacuten son superiores a 0990 por lo que existe una respuesta lineal en el rango de
concentraciones que hemos estudiado
Aparte del estudio de la linealidad tambieacuten se han estudiado los liacutemites de cuantificacioacuten instrumentales del
meacutetodo (LOQs) Para ello los LOQs se evaluacutean como la miacutenima cantidad de analito que origina una sentildeal 10
veces superior a la desviacioacuten estaacutendar del ruido Los valores anteriores se estimaron a partir del patroacuten de
a no evaluado ya que se encuentra por debajo del liacutemite de cuantificacioacuten del meacutetodo
31
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
concentracioacuten maacutes baja que presenta un pico con una relacioacuten SN superior a 10 En la Tabla IV3 tambieacuten se
recogen estos LOQs en doacutende podemos ver que variacutean en el rango 01-1 ngmL excepto para THI-M que se
desviacutea a valores de 10 ngmL
Tabla IV3 Coeficientes de determinacioacuten (R2) y liacutemites de cuantificacioacuten instrumentales (LOQs) de los analitos para nueve
niveles de concentracioacuten de 05 a 200 ngmL
Compuesto Coeficiente de
correlacioacuten (R2)
LOQs (ngmL) Compuesto
Coeficiente de correlacioacuten
(R2)
LOQs (ngmL)
AME 09951 04 MET 09933 01
BEN 09949 01 MYC 09950 04
BOS 09979 02 PEN 09945 02
CAR 09923 02 PYC 09955 02
CYP 09878 02 PYM 09931 01
DIM 09938 07 TEC 09958 05
FEH 09959 05 TEF 09957 01
FEP 09931 01 TBZ 09942 02
FLU 09965 02 TME 09903 01
IMI 09979 05 THI-M 09580 100
IPR 09938 01 TRI 09867 07
MAN 09979 01
En la Figura IV1 y Figura IV2 se muestran dos ejemplo de curvas de calibrado para dos compuestos IMI y
MAN respectivamente
Figura IV1 Curva de calibrado y coeficiente de determinacioacuten de IMI para UPLC-ESI-MSMS
32
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Figura IV2 Curva de calibrado y coeficiente de determinacioacuten de MAN para UPLC-ESI-MSMS
3 ESTUDIO DEL MEacuteTODO SPE
La extraccioacuten de pesticidas se llevoacute a cabo mediante extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) en doacutende se realizaron
diversos estudios con diferentes condiciones para dar con las oacuteptimas En primer lugar se llevaron a cabo los
experimentos de retencioacuten y elucioacuten sobre dos tipos distintos de adsorbentes cartuchos OASIS HLB (200mg) y
cartuchos OASIS MAX (150 mg) como fases potenciales en las que llevar a cabo la extraccioacuten de manera
selectiva Los dos tipos de cartuchos son de fase reversa pero difieren entre siacute en el fundamento de retencioacuten de
los analitos En los cartuchos OASIS HLB (200 mg) formados por divinilbenceno-N-vinilpirrolidona (DVB-VP)
la retencioacuten de los diferentes analitos tiene lugar por interacciones π-π o de Van der Waals mientras que los
cartuchos OASIS MAX (150 mg) que se probaron como alternativa para mejorar la selectividad en la extraccioacuten
cuentan con un adsorbente polimeacuterico de modo mixto formado por divinilbenceno-N-vinilpirrolidona (DVB-VP)
funcionalizado con grupos amina cuaternaria siendo el fundamento de la extraccioacuten la combinacioacuten de las
propiedades adsorbentes del cartucho HLB con un mecanismo adicional de intercambio ioacutenico (anioacutenico) [27]
Algunos autores han empleado este mecanismo para mejorar la selectividad de la extraccioacuten de forma que en la
etapa de elucioacuten ciertos pigmentos del vino quedan fuertemente retenidos en el adsorbente a diferencia de lo que
ocurre con los adsorbentes de fase reversa [51]
Para llevar a cabo la eleccioacuten del tipo de adsorbente se realizaron pruebas con 10 mL de vino blanco y tinto
conectando en serie los dos tipos de cartuchos HLB (200 mg) y MAX (150 mg) a un segundo cartucho OASIS
HLB (60 mg) La elucioacuten de los analitos se hace de forma independiente para cada cartucho y se evaluacutea si los
analitos pasan del primer cartucho hacia el segundo cartucho es decir si se supera el volumen de corte o si por
33
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
otro lado se quedan retenidos en el primero y no eluyen hacia el segundo En estas pruebas de estudio
preliminares de preparacioacuten de la muestra no se ha incluido el CYP
En la Figura IV3 podemos ver la eficacia de la extraccioacuten para vino blanco y tinto que obtenemos empleando
cartuchos OASIS MAX (150 mg) conectados en serie con cartuchos OASIS HLB (60 mg) realizando la
extraccioacuten de tres fracciones de 2 mL cada una del cartucho OASIS MAX (150 mg) y una cuarta fraccioacuten de 2
mL del cartucho OASIS HLB (60 mg)
Por otro lado en la Figura IV4 podemos ver un graacutefico de columnas en el cual comparamos la eficacia de
extraccioacuten de los cartuchos OASIS HLB (200 mg) con dos disolventes de elucioacuten distintos En dicho graacutefica el
acroacutenimo de cada compuesto consta de dos barras cuyo significado es el siguiente la barra de la izquierda indica
la eficacia de la extraccioacuten empleando acetonitrilo (ACN) como disolvente de elucioacuten y la barra de la derecha
indica la eficacia de la extraccioacuten empleando la combinacioacuten MetanolAcetonitrilo (2080) (MeOHACN) como
disolvente de elucioacuten Para este adsorbente no se detectoacute ninguacuten compuesto en la extraccioacuten del segundo
cartuchos OASIS HLB (60 mg) empleando 2 mL de metanol
Figura IV3 Distribucioacuten de los compuestos en cada fraccioacuten obtenidas con cartuchos OASIS MAX (150 mg)
utilizando 10 mL de vino tinto y blanco sacando cuatro fracciones de 2 mL cada una con metanol como
disolvente de elucioacuten
34
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Figura IV4 Distribucioacuten de los compuestos en cada fraccioacuten obtenidas con cartuchos OASIS HLB (200 mg) utilizando 10
mL de vino tinto y blanco sacando 3 fracciones de 2 mL cada una con acetonitrilo (ACN) (columna de la izquierda) y una
combinacioacuten MetanolAcetonitrilo (2080) (MeOHACN) (columna de la derecha) como disolventes de elucioacuten
A la vista de los resultados reflejados en las graacuteficas podemos afirmar que cuando se utiliza el cartucho OASIS
HLB (200 mg) eluyendo con acetonitrilo o la combinacioacuten metanolacetonitrilo (2080) los extractos son limpios
y se eluyen la mayoriacutea de los compuestos en la primera fraccioacuten Pero utilizando acetonitrilo como disolvente de
elucioacuten se encuentran problemas en la extraccioacuten de CAR FEH y TBZ para los que es necesario emplear un
volumen mayor de elucioacuten o bien seleccionar otro disolvente de elucioacuten como es la combinacioacuten
metanolacetonitrilo
35
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Por otro lado los extractos en los cartuchos OASIS MAX (150 mg) son maacutes limpios incluso utilizando metanol en
la elucioacuten pero se detecta la presencia de CAR FEP TBZ y TME en el segundo cartucho OASIS HLB (60 mg)
significando la rotura del primer cartucho para dichos analitos considerando un volumen de 10 mL de vino Los
demaacutes compuestos se podriacutean recuperar cuantitativamente en la primera fraccioacuten sacada pero la peacuterdida de estos
compuestos inclina la eleccioacuten hacia los cartuchos OASIS HLB (200 mg) con metanolacetonitrilo (2080) como
disolvente de elucioacuten para continuar con el estudio
Una vez fijado el adsorbente y el volumen de elucioacuten se prueba la eficacia de la SPE independiente de los efectos
de matriz En la Tabla IV4 se muestran las recuperaciones de la SPE tomando 10 mL de vino blanco y tinto
con un nivel de adicioacuten de 15 ngmL sacando una sola fraccioacuten de 2 mL con la combinacioacuten
metanolacetonitrilo (2080) y n=3 reacuteplicas
Tabla IV4 Recuperaciones (R plusmn SD) de SPE para 10 mL de vino (blanco y tinto) con un nivel de adicioacuten de 15 ngmL y
n=3 reacuteplicas
Compuesto Vino Tinto
R plusmn SD
Vino Blanco
R plusmnSD Compuesto
Vino Tinto
R plusmn SD
Vino Blanco
R plusmn SD
AME 82 plusmn 7 100 plusmn 1 MET 92 plusmn 6 94 plusmn 3
BEN 89 plusmn 6 97 plusmn 3 MYC 90 plusmn 9 86 plusmn 4
BOS 95 plusmn 1 100 plusmn 2 PEN 84 plusmn 10 103 plusmn 3
CAR 91 plusmn 6 104 plusmn 6 PYC 86 plusmn 5 106 plusmn 1
CYP 81 plusmn 7 102 plusmn 3 PYM 87 plusmn 12 94 plusmn 3
DIM 97 plusmn 3 86 plusmn 4 TEC 83 plusmn 10 103 plusmn 1
FEH 89 plusmn 3 88 plusmn 3 TEF 84 plusmn 5 108 plusmn 4
FEP 91 plusmn 7 104 plusmn 3 TBZ 88 plusmn 7 92 plusmn 5
FLU 91 plusmn 2 97 plusmn 4 TME 101 plusmn 1 110 plusmn 13
IMI 117 plusmn 8 101 plusmn 11 THI-M 85 plusmn 9 110 plusmn 4
IPR 89 plusmn 7 112 plusmn 4 TRI 85 plusmn 10 110 plusmn 4
MAN 88 plusmn 2 87 plusmn 2
Algunos compuestos de la matriz en el vino pueden competir con los analitos durante el proceso de ionizacioacuten
que tiene lugar en la interfase entre UPLC-MSMS por lo que para la cuantificacioacuten del rendimiento de la
ionizacioacuten por electrospray (ESI) se estudian los efectos de matriz (EM) para vino blanco y tinto considerando
dos voluacutemenes de muestra distintos 2 y 10 mL y un volumen final del extracto de 2 mL En la Tabla IV5 se
36
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
exponen los valores para cada compuesto notando que al aumentar el volumen de muestra tambieacuten se aumentan
los efectos de matriz y eacutestos siempre son mayores en vino tinto Para el caacutelculo de estos efectos de matriz (EM)
se emplea la siguiente ecuacioacuten
Donde Am Ab y Ap representan el aacuterea de pico en la sentildeal medida del analito en el extracto de la muestra con
adicioacuten en el extracto de la muestra sin adicioacuten (o blanco) y en el patroacuten antildeadido respectivamente El nivel de
adicioacuten en extracto fue de 50 ngmL por compuesto
Tabla IV5 Efectos de matriz para vino blanco y tinto con un volumen inicial de 2 y 10 mL evaluados para un nivel de adicioacuten de 50 ngmL en extracto
Compuesto
Vino blanco Vino tinto
2 mL 10 mL 2mL 10 mL
EM () CV () EM () CV () EM () CV () EM () CV()
AME 93 3 95 2 99 3 101 7
BEN 99 1 93 2 101 3 100 6
BOS 97 5 98 1 108 2 96 0
CAR 62 2 50 3 58 2 55 6
CYP 94 3 91 1 97 2 95 7
DIM 105 2 95 3 100 3 108 3
FEH 100 4 102 4 105 4 94 3
FEP 95 3 88 2 96 2 92 7
FLU 98 2 93 2 106 1 101 2
IMI 84 4 46 3 48 10 18 8
IPR 99 3 92 3 105 1 100 7
MAN 100 1 94 3 109 4 107 2
MET 98 1 89 1 99 2 99 6
MYC 105 1 100 1 103 2 96 9
PEN 98 3 97 1 101 3 99 10
PYC 98 2 92 3 102 2 98 5
PYM 95 2 87 1 94 3 85 12
TEC 95 3 99 1 101 1 102 10
TEF 99 1 92 3 101 2 104 5
TBZ 45 0 40 5 43 2 30 7
TME 60 6 19 16 36 4 16 1
THI-M 107 2 109 2 103 1 96 9
TRI 97 3 118 4 104 5 117 10
37
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Al observar los resultados podemos ver que la mayoriacutea de los compuestos dan resultados de EM en torno al
100 lo que significa que no sufren una modificacioacuten importante en la eficacia de ionizacioacuten para las muestras
con respecto a los patrones Pero tambieacuten por el contrario podemos observar que algunos compuestos como
por ejemplo en el caso de CAR TBZ IMI y TME experimentan una gran supresioacuten de sentildeal es decir EM bajos
que se acentuacutean al aumentar el volumen de muestra La atenuacioacuten en la eficacia de variacioacuten para estos cuatro
compuestos no solo se ve incrementada con el volumen de muestra si no que ademaacutes es maacutes significativa para
vino tinto que para vino blanco En base a estos resultados aunque la eficacia de la SPE fue cuantitativa para
muestras de 10 mL se limitoacute el volumen de muestra a extraer a 2 mL
Las condiciones oacuteptimas de extraccioacuten se esquematizan en un resumen en la Figura IV5
Figura IV5 Condiciones optimizadas para la extraccioacuten de pesticidas en vino
38
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
4 CARACTERIZACIOacuteN DEL MEacuteTODO DE DETERMINACIOacuteN
Con las condiciones de extraccioacuten y determinacioacuten citadas anteriormente se llevaron a cabo pruebas de
recuperaciones absolutas de los compuestos a nivel de adicioacuten de 5 y 20 ngmL sobre las muestras Para cada
muestra y nivel de adicioacuten se realizaron tres reacuteplicas de las muestras con adicioacuten y los blancos aliacutecuotas de las
mismas muestras sin adicioacuten se procesaron en duplicado Los IS se antildeadieron a nivel de 25 ngmL y cada uno se
utiliza para corregir unos determinados compuestos CAR-d3 se emplea para CAR y TBZ el CYP-d5 para CYP y
PYM el IMID-d4 para IMI y TME y el MET13C6 para el resto de compuestos Los resultados para vino blanco
comprenden en el nivel de concentracioacuten 5 ngmL el rango entre 79-122 y en el nivel de concentracioacuten 20
ngmL el rango entre 84-109 Por otro lado en el caso del vino tinto las recuperaciones se encuentran para el
nivel de concentracioacuten 5 ngmL en el rango 67-112 y para el nivel de concentracioacuten 20 ngmL entre el rango
73-132 Los resultados obtenidos en las pruebas con vino blanco y vino tinto se muestran en la Tabla IV6
Los resultados son satisfactorios ya que la mayoriacutea de los compuestos se ajustan en todos los casos al rango de
recuperacioacuten entre 70-120 Para la realizacioacuten de estas pruebas se ha eliminado de los resultados el compuesto
THI-M debido a que las concentraciones utilizadas se encuentran en el liacutemite o por debajo del LOQ en los
experimentos con muestras adicionadas a 5 ngmL
Para calcular las recuperaciones (R) se recurrioacute a la siguiente ecuacioacuten
Donde Cm Cb y Cp son la concentracioacuten medida de analito en el extracto de la muestra con adicioacuten en el extracto
de la muestra sin adicioacuten (o blanco) y en el patroacuten antildeadido respectivamente
Tabla IV6 Recuperaciones (R) para vino tinto y vino blanco evaluadas para dos niveles de concentracioacuten 5 y 20 ngmL
Compuesto
Vino tinto Vino Blanco
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
AME 97 3 105 6 104 9 96 5
BEN 88 11 105 3 101 1 98 4
BOS 91 13 110 2 88 13 97 3
39
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Compuesto
Vino tinto Vino blanco
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
CAR 99 6 99 3 122 3 109 1
CYP 91 2 111 1 101 4 100 6
DIM 112 3 110 9 102 24 99 11
FEH 91 4 108 0 102 20 95 2
FEP 89 8 102 7 94 5 84 1
FLU 95 10 104 4 109 5 100 8
IMI 73 11 115 9 80 13 100 2
IPR 84 13 99 3 111 3 99 4
MAN 88 22 112 8 112 3 99 4
MET 99 3 106 5 106 3 98 2
MYC 84 9 106 13 88 17 86 3
PEN 84 9 102 5 84 8 90 5
PYC 96 6 105 4 100 2 95 4
PYM 90 12 112 14 106 4 97 1
TEC 89 8 101 6 98 12 94 1
TEF 93 10 102 5 107 2 97 3
TBZ 94 17 115 8 79 5 106 2
TME 67 2 101 7 84 18 90 11
THI-M ne - 74 7 ne - 89 24
TRI 88 12 97 6 102 6 92 2
ne No evaluado El nivel de adicioacuten es inferior al LOQ del meacutetodo para este compuesto
Para estudiar la reproducibilidad del meacutetodo analiacutetico global (correspondientes a los datos de preparacioacuten de
muestra y determinacioacuten) es decir la concordancia de varias medidas realizadas en diacuteas diferentes se procedioacute a la
extraccioacuten en las condiciones oacuteptimas tanto de vino blanco como tinto Las extracciones y determinaciones se
realizaron durante tres diacuteas consecutivos realizando tres reacuteplicas por vino y por diacutea con un nivel de adicioacuten en
muestra de 10 ngmL un blanco de muestra cada diacutea En la Tabla IV7 se muestran los resultados como
recuperaciones (R) en condiciones de reproducibilidad obtenidos para ambos tipos de vino dando valores entre
64-116 para muestras de vino blanco y valores situados entre 68-108 para muestras de vino tinto con la
excepcioacuten del TME para el que se ha obtenido un valor no aceptable en cuanto a la exactitud medida en
condiciones de reproducibilidad A la vista de los resultados obtenidos con estas pruebas se considera necesario el
empleo de IS adicionales para la mejora en la exactitud del meacutetodo para algunos compuestos por ejemplo el
TME
40
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Tabla IV7 Recuperaciones en condiciones de reproducibilidad (R plusmn SD) para vino blanco y tinto
Compuesto
Vino tinto Vino blanco
R
10 ngmL CV ()
R
10 ngmL CV ()
AME 90 5 101 13
BEN 96 5 102 7
BOS 97 6 100 8
CAR 97 3 94 5
CYP 103 3 105 12
DIM 104 7 106 8
FEH 90 16 83 15
FEP 91 5 90 4
FLU 103 7 102 6
IMI 99 14 101 14
IPR 91 5 100 13
MAN 108 5 108 13
MET 101 5 101 5
MYC 105 16 102 14
PEN 96 11 92 10
PYC 99 12 97 12
PYM 102 4 116 8
TEC 99 9 97 16
TEF 99 8 105 11
TBZ 68 4 84 5
TME 47 13 64 10
THI-M 107 11 104 16
TRI 95 14 103 4
En la Tabla IV8 se muestran los liacutemites de cuantificacioacuten (LOQs) del meacutetodo del meacutetodo de SPE-UPLC-ESI-
MSMS obtenidos para los diferentes pesticidas Los valores obtenidos son ideacutenticos a los LOQs instrumentales
excepto en el caso de aquellos compuestos para los que se observaronfuertes efectos de matriz (Tabla IV5) En
estos casos (CAR TBZ IMI y TME) los LOQs del meacutetodo se incrementan seguacuten la atenuacioacuten de sentildeal
observada
41
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Tabla IV8 Liacutemites de cuantificacioacuten LOQs (ngmL) del meacutetodo obtendos para cada compuesto
Compuesto LOQ (ngmL) Compuesto LOQ (ngmL)
AME 04 MET 01
BEN 01 MYC 04
BOS 02 PEN 02
CAR 03 PYC 02
CYP 02 PYM 01
DIM 07 TEC 05
FEH 05 TEF 01
FEP 01 TBZ 04
FLU 02 TME 02
IMI 06 THI-M 10
IPR 01 TRI 07
MAN 01
5 APLICACIOacuteN A MUESTRAS DE VINO COMERCIALES
Una vez optimizadas las condiciones del meacutetodo y estudiadas las caracteriacutesticas del meacutetodo desarrollado se aplicoacute
a la determinacioacuten de los compuestos de intereacutes estudiados en muestras de vino blanco y vino tinto comerciales
producidos en diferentes paiacuteses En la Tabla IV9 se muestra el paiacutes de origen de cada muestra comercial
identificadas con un coacutedigo alfanumeacuterico y antildeo de produccioacuten
42
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Tabla IV9 Coacutedigo asignado para los diferentes vinos comerciales blancos y tintos analizados Indicando el paiacutes de origen y
antildeo de produccioacuten
Coacutedigo Denominacioacuten de origen Antildeo de produccioacuten
bull Vinos Blancos
W1 Alemania 2014
W2 Espantildea 2012
W3 Espantildea 2016
W4 Portugal Desconocido
W5 Francia 2015
W6 Francia 2015
W7 Espantildea 2016
bull Vinos Tintos
R1 Espantildea 2015
R2 Sudaacutefrica 2015
R3 Chile 2015
R4 Francia 2015
R5 China Desconocido
R6 Espantildea 2016
R7 Australia 2014
R8 Francia 2013
R9 Francia 2015
A continuacioacuten en la Tabla IV10 y la Tabla IV11 se recogen los resultados obtenidos en el anaacutelisis de las
muestras comerciales Los datos obtenidos corresponden en todos los casos al uso de patrones de calibracioacuten
como teacutecnica de cuantificacioacuten
Tabla IV10 Concentracioacuten (ngmL) encontradas en las diferentes muestras de vino blanco comercial analizadas mediante
SPE-UPLC-MSMS n=2 reacuteplicas y al final el sumatorio de las concentraciones encontradas
Compuesto W1 W2 W3 W4 W5 W6 W7
AME 04 nd nd nd 41 nd nd
BEN nd nd 14 nd nd nd nd
BOS 84 102 520 54 197 nd nd
CAR nd 115 56 nd nd nd nd
CYP 08 59 112 nd nd 26 nd
43
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Compuesto W1 W2 W3 W4 W5 W6 W7
DIM 14 84 400 09 32 50 nd
FEH 85 809 639 15 187 nd nd
FLU 11 05 92 nd 77 32 nd
IMI nd 136 88 29 nd nd 69
IPR 30 749 1144 14 nd nd nd
MAN nd nd nd nd nd 30 nd
MET 04 273 494 63 nd nd 172
MYC 09 nd 35 nd nd nd nd
PYM 15 469 584 08 24 35 nd
TEC 11 nd 58 nd nd nd nd
TRI nd 67 61 nd nd nd nd
sumconcentracioacuten
(ngmL) 274 2868 4358 192 558 173 862
nd no detectado
Tabla IV11 Concentracioacuten (ngmL) encontradas en las diferentes muestras de vino tinto comercial analizadas mediante
SPE-UPLC-MSMS n= 2 reacuteplicas y al final el sumatorio de las concentraciones encontradas
Compuesto R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9
AME nd nd nd 30 nd nd nd nd 16
BEN nd nd nd 07 nd nd nd nd nd
BOS nd 55 21 196 nd nd nd 73 21
CAR nd nd 04 17 249 20 nd nd nd
CYP 34 08 02 22 nd 136 nd 85 nd
DIM nd 33 nd 52 233 46 nd 61 23
FEH nd nd nd 1070 nd 10 nd 1307 14
FLU nd nd nd 20 nd nd nd nd nd
IPR 16 nd nd 17 nd 22 nd nd nd
MAN nd nd nd 17 nd nd nd 20 nd
MET 126 nd nd 14 55 313 30 44 39
MYC nd nd nd 05 nd 32 nd nd nd
PYM 19 nd 03 185 49 281 nd 24 nd
TEC 25 06 39 29 nd nd nd 21 20
TEF nd 01 12 nd nd nd nd nd nd
sumconcentracioacuten
(ngmL) 220 48 81 1681 586 860 30 1635 133
nd no detectado 44
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
En los resultados de los anaacutelisis podemos observar que en ninguna de las muestras comerciales de vino blanco
aparecieron los siguientes compuestos FEP PEN PYC TEF TBZ THI-M y TME y en los vinos tintos
comerciales no aparece a ninguna concentracioacuten FEP IMI PEN PYC TBZ TME THI-M y TRI No se
detectaron para dichas muestras de vino a niveles superiores a los LOQs del meacutetodo propuesto
Cuando se detecta un compuesto positivo se compara el pico cromatograacutefico del compuesto con el de un patroacuten
verificando la coincidencia del tiempo de retencioacuten (maacutexima diferencia 01 min) y la relacioacuten entre transiciones
(maacutexima diferencia 30 ) En la Figura IV6 y la Figura IV7 se muestran los cromatogramas para el compuesto
CYP obtenido en condiciones oacuteptimas para la muestra de vino blanco W6 y en un patroacuten de 5 ngmL
respectivamente En este caso el intervalo de tolerancia para la relacioacuten de intensidad entre transiciones es
IP2IP1=061plusmn018
Figura IV6 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el CYP en la muestra W6 (26 ngmL) Transicioacuten
superior 226gt93 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 226gt108 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades IP2IP1= 066
Figura IV7 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el CYP en un patroacuten de 5 ngmL Transicioacuten
superior 226gt93 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 226gt108 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades IP2IP1=061plusmn018
45
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Otro ejemplo de compuesto positivo en abundantes muestras comerciales de estudio es el Metalaxyl positivo con
una concentracioacuten de 04 ngmL en el vino con referencia W1 (Figura IV8) y positivo con una concentracioacuten de
313 ngmL en el vino con referencia R6 (Figura IV9) Ambas se comparan con el cromatograma de un patroacuten
de Metalaxyl de 1 ngmL (Figura IV10) El grado de concordancia en los tiempos de retencioacuten y la relacioacuten de
intensidades entre transiciones es satisfactorio
Figura IV8 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el MET en la muestra W1 (04 ngmL) Transicioacuten
superior 2801gt2201 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 2801gt1921 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades
IP2IP1=056
Figura IV9 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el MET en la muestra R6 (313 ngmL) Transicioacuten
superior 2801gt2201 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 2801gt1921 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades IP2IP1=
056
46
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Figura IV10 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el MET en un patroacuten de 1 ngmL Transicioacuten
superior 2801gt2201 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 2801gt1921 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades
IP2IP1=057plusmn017
Es de destacar que aunque se detectaron bastantes pesticidas en las diferentes muestras de vino comerciales pero
en ninguacuten caso superaron el 10 de los LMRs permitidos en uvas tal y como se recomienda ya que todaviacutea no
existen LMRs para vino en la legislacioacuten vigente No obstante el nivel total de concentracioacuten (sumatorio de
concentraciones Tabla IV10 y Tabla VI11) es significativo para varias muestras tanto de vinos blancos (W2 y
W3) como tintos (R4 y R8)
47
Capiacutetulo V Conclusiones
CAPIacuteTULO V CONCLUSIONES
En este trabajo se ha estudiado un meacutetodo para la cuantificacioacuten de pesticidas concretamente veinte fungicidas y
tres insecticidas en vino blanco y tinto En la etapa de preparacioacuten de muestra se optimizoacute la extraccioacuten en fase
soacutelida (SPE) utilizando cartuchos OASIS HLB (200 mg) compuestos por divinilbenceno-N-vinilpirrolidona
(DVB-VP) como adsorbente Como teacutecnica de determinacioacuten se utilizoacute cromatografiacutea de liacutequidos con una
interfase de electroespray acoplada a espectrometriacutea de masas (UPLC-ESI-MSMS)
Las conclusiones generales obtenidas a partir de los resultados de este proyecto relativo a la determinacioacuten de
fitosanitarios en vino son
Ante los problemas de retencioacuten que presentan los cartuchos OASIS MAX (150 mg) para algunos
compuestos los cartuchos OASIS HLB (200 mg) junto con la combinacioacuten metanolacetonitrilo (2080)
como disolvente de elucioacuten son elegidos como mejor opcioacuten en la extraccioacuten en fase soacutelida de pesticidas
en muestras con matrices complejas como es el caso del vino Asiacute se consigue la retencioacuten selectiva de
componentes de la matriz y proporciona extractos con menor porcentaje de interferencias
El meacutetodo estudiado y optimizado se puede aplicar tanto a vinos blancos como a vinos tintos procesados
a partir de distintas variedades de uvas
Los liacutemites de cuantificacioacuten (LOQs) del estudio se situacutean la mayoriacutea por debajo de 10 ngmL excepto
en el caso de THI-M que asciende al valor de 20 ngmL El rango de respuesta lineal abarca hasta 200
ngmL y el tiempo de anaacutelisis ha sido de solo 10 minutos por muestra
En todas las muestras de vino (blancos y tintos) comerciales analizadas se han detectado la presencia de
varios pesticidas sin embargo todas las concentraciones encontradas se encuentran por debajo del 10
de los LMRs fijados en uvas tal y como recomienda la legislacioacuten por lo que no se considera
preocupante
48
Capiacutetulo V Conclusioacutens
CAPIacuteTULO V CONCLUSIOacuteNS
Neste traballo estudouse un meacutetodo para a cuantificacioacuten de pesticidas en particular vinte funxicidas e tres
insecticidas en vintildeo branco e maacuteis tinto No paso da preparacioacuten da mostra optimizouse a extraccioacuten en fase
soacutelida (SPE) empregando cartuchos OASIS HLB (200 mg) compostos por divinilbenceno-N-pirrolidona (DVB-
VP) como adsorbente Para a teacutecnica de determinacioacuten utilizouse cromatografiacutea de liacutequidos con unha interfase de
electroespray acoplada a espectrometriacutea de masas (UPLC-ESI-MSMS)
As conclusioacutens xerais a obtidas a partir dos resultados deste proxecto relativo aacute determinacioacuten de pesticidas en
vintildeo son
Ante os problemas de retencioacuten que mostraban os cartuchos OASIS MAX (150 mg) para alguacuten
compostos os cartuchos OASIS HLB (200 mg) en conxunto coa mistura metanolacetonitrilo (2080)
como disolvente de elucioacuten son elexidos como mellor opcioacuten na extraccioacuten en fase soacutelida de pesticidas
en mostras con matrices complexas como eacute o caso do vintildeo Asiacute eacute conseguida a retencioacuten selectiva de
componentes da matriz e proporciona extractos con menos porcentaxe de interferencias
O meacutetodo estudado e optimizado poacutedese aplicar tanto a vintildeos brancos coma tintos procesados a partir de
diferentes variedades de uvas
Os liacutemites de cuantificacioacuten do estudo (LOQs) son maacuteis baixos de 10 ngmL agaacutes no caso do THI-M
que ascende ao valor de 20 ngmL O rango de resposta lineal cobre ata 200 ngmL e o tempo de anaacutelise
foi de soacute 10 minuacutetos por mostra
En todas as mostras de vintildeo (brancos e tintos) comercial analizadas detectouse a presenza de varios
pesticidas maacuteis poreacuten todas as concentracioacutens atopadas son inferiores ao 10 dos LMR fixados en uvas
tal e como recomenda a lexislacioacuten polo que non se considera preocupante
49
Chapter V Conclusions
CHAPTER V CONCLUSIONS
In this work we have studied a method for the quantification of pesticides specifically twenty fungicides and
three insecticides in white and red wine In the sample preparation step the solid phase extraction was optimized
using cartridges OASIS HLB (200 mg) containing divinylbenzene-N-vinylpyrrolidone (DVB-VP) as adsorbent
As determination technique ultraperformance liquid chromatography was used with an electrospray interface
coupled to mass spectrometry (UPLC-ESI-MS7MS)
The general conclusions drawn from the results of this project concerning the determination of pesticides in wine
are
Due to the retention problems presented by the OASIS MAX sorbent (150 mg) for some compounds of
this project the cartridges OASIS HLB (200 mg) together with the methanolacetonitrile (2080) mixture
are chosen as the best option in the solid phase extraction of pesticides in samples with complex
matrices as is the case with the wine
The method studied and optimized can be applied to both white and red wines obtained from different
varieties of grapes
The limits of quantification (LOQs) were below 10 ngmL for most of the compounds except in the
case of THI-M with a LOQ of to 10 ngmL The linear response range covers up to 200 ngmL and the
analysis time was only 10 minutes per sample
In all commercial wine samples (white and red) analyzed the presence of several pesticides was
conformed however all the concentrations obtained are below 10 of the Maximum residue
levels(MRLs) fixed in grapes as recommended by legislation
50
VI Bibliografiacutea VI BIBLIOGRAFIacuteA [1] Ministerio de agricultura y pesca alimentacioacuten y medio ambiente mhttpwwwmapamagobesescalidad-y-evaluacion-ambientaltemasproductos-quimicosfitosanitarios (Acceso el diacutea 11052017) [2] httpwwwcricyteduarenciclopediaterminosProducFitohtm (Acceso el diacutea 11052017) [3] WERNER BALTES ldquoQuiacutemica de los alimentosrdquo Editorial Acribia SA 2007 Capiacutetulo 11 ldquoResiduos en los alimentosrdquo paacuteginas 206-217
[4] RLabrada JCCaseley CParker ldquoESTUDIO FAO PRODUCCIOacuteN Y PROTECCIOacuteN VEGETAL 120rdquo Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentacioacuten Roma 1996 ISSN 1014- Capiacutetulo 10 Herbicidas httpwwwfaoorgdocrepT1147St1147s00htmContents (Acceso el diacutea 12052017)
[5] Taberner Palou Andreu Cirujeda Ranzenberger Alicia Zaragoza Larios Carlos ldquoManejo de poblaciones de malezas resistentes a herbicidasrdquo (FAO Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura) 100 preguntas sobre resistencia PDF sacado de httpwwwfaoorg3a-a1422spdf (Acceso el diacutea 12052017) [6] BISSET Juan A Uso correcto de insecticidas control de la resistencia Revista Cubana de Medicina Tropical 2002 vol 54 no 3 p 202-219 [7] DEVINE Gregor J EZA Dominique Ogusuku Elena FURLONGMichael J Uso de insecticidas contexto y consecuencias ecoloacutegicas Revista peruana de medicina experimental y Salud Puacuteblica 2008 vol 25 no 1 p 74-100 [8] Ministerio de agricultura y ganaderiacutea (proteccioacuten agropecuaria servicio de diagnoacutestico fitosanitario) de costa Rica httpwwwmaggocrbibliotecavirtualH20-5054pdf (Acceso el diacutea 11052017) [9] GEPP V MONDINO P Control quiacutemico 2011 PDF obtenido de httpwwwpvfagroeduuyfitopatodocscursosfitopatoMaterialesGuiasC-QUIMICOpdf (Acceso el diacutea 772017) [10] ROSSLENBROICH Hans-Juergen STUEBLER Dietrich Botrytis cinereamdashhistory of chemical control and novel fungicides for its management Crop Protection 2000 vol 19 no 8 p 557-561 [11] Figura 11 httpwwwvitiviniculturanetbotritis-o-podredumbre-gris-botrytis-cinerea-pershtml (Acceso el diacutea 12052017) [12] CAMPBELL Paul BENDEK Carlos LATORRE Bernardo A Riesgo de oiacutedio (Erysiphe necator) de la vid en relacioacuten con el desarrollo de los racimos Ciencia e investigacioacuten agraria 2007 vol 34 no 1 p 5-11 [13] ldquoCoacutemo combatir el oiacutedio de la vidrdquo Jose Javier Peacuterez de Obanos Castillo PDF sacado de httpswwwnavarraesNRrdonlyres05E65D9B-D1A2-4EAD-9A63-AFF1D3215552135109Comocombatireloidiodelavidpdf (Acceso el diacutea 12052017) [14] Imagen 12 sacadas las 3 de httpwwwvitiviniculturanetoidio-de-la-vidhtml (Acceso el diacutea 12052017) [15] BARRIOS Gonccedilal REYES Joan Modelizacioacuten del Mildiu de la Vid 2004 httpwwwruralcatnetmigracio_resources617683_mildiusPDF (Acceso el diacutea 12052017) [16] Imaacutegenes sacadas de httpwwwvitiviniculturanetmildiu-de-la-vid-enfermedades-vinahtml (Acceso el diacutea 13052017) [17] HUQ Mainul MEISNER Craig DASGUPTA Susmita Health effects and pesticide perception as determinants of pesticide use evidence from Bangladesh httpagrisfaoorgagris-searchsearchdorecordID=US2012411738 (Acceso el diacutea 13052017)
51
IV Bibliografiacutea [18] BADII Mohammad H LANDEROS Jeroacutenimo Plaguicidas que afectan a la salud humana y la sustentabilidad CULCyT 2015 no 19 Revista vista en httpopenjournaluacjmxojsindexphpculcytarticleview454 (Acceso el diacutea 772017) [19] OLEA Nicolaacutes FERNAacuteNDEZ Mariana F Plaguicidas persistentes En Congreso Implementacioacuten del Convenio de Contaminantes Orgaacutenicos Persistentes Madrid 2001 p 26-27 [20] httpwwwfaoorgfao-who-codexalimentariusabout-codexes (Acceso el diacutea 14052017) [21] httpeceuropaeufoodplantpesticidesmax_residue_levels_en (Acceso el diacutea 14052017 [22] ORDONtildeEZ Juan A Cambero Rodriacuteguez MI Fernaacutendez Aacutelvarez L Garciacutea Sanz ML Garciacutea de Fernando Minguilloacuten GD de la Hoz Perales L Selgas Cortecero MD Tecnologiacutea de los alimentos Volumen 1 Componentes de los Alimentos y Procesos Siacutentesis Madrid 1998paacutegs 349-351 [23] CELA Rafael Casais Maria del Carmen Lorenzo Rosa Antonia Teacutecnicas de separacioacuten en quiacutemica analiacutetica Siacutentesis 2002 Capiacutetulo 11 Extraccioacuten y lixiviacioacuten por disolvente (paacutegs206-260) [24] CANTWELL Frederick F LOSIER Manon Liquidmdashliquid extraction Comprehensive Analytical Chemistry 2002 vol 37 p 297-340 [25] Imagen de LLE sacada de httpprocesosbiowikispacescomExtracciC3B3n+liquido-liquido (Acceso el diacutea 15052017) [26] HENNION Marie-Claire Solid-phase extraction method development sorbents and coupling with liquid chromatography Journal of Chromatography A 1999 vol 856 no 1 p 3-54 [27] CELA Rafael Casais Maria del Carmen Lorenzo Rosa Antonia Teacutecnicas de separacioacuten en quiacutemica analiacutetica Siacutentesis 2002 Capiacutetulo 16 Teacutecnicas de adsorcioacuten y absorcioacuten en la preparacioacuten de muestras Extraccioacuten y microextraccioacuten en fase soacutelida (paacutegs520-555) [28] Imagen spe sacada httptoxicocbblogspotcomes201310las-intoxicaciones-con-farmacoshtml (Acceso el diacutea 15052017) [29] Chaacutefer Pericaacutes Consuelo Acoplamiento microextraccioacuten en fase soacutelida-cromatografiacutea (2006) httprodericuveshandle1055014940 (Acceso el diacutea 16052017) [30] Imagen SPME httpwwwscieloorgcoscielophpscript=sci_arttextamppid=S0122-53832002000100005 (Acceso el diacutea 16052017) [31] MONTES GOYANES Rosa Mariacutea Avances en teacutecnicas de microextraccioacuten para la determinacioacuten de compuestos traza en muestras medioambientales y alimentarias Teacutesis doctoral Noviembre 2009 (Paacutegs 34-55) [32] LEHOTAY Steven J Ae Son Kyung KwonHyeyoung Koesukwiwat Urairat Fu Wusheng Mastovska Katerina Hoh Eunha Leepipatpiboon Natchanun Comparison of QuEChERS sample preparation methods for the analysis of pesticide residues in fruits and vegetables Journal of Chromatography A 2010 vol 1217 no 16 p 2548-2560 [33] Imagen QueChERS httpswwwresearchgatenetpublication279221361_QuEChERS_A_Sample_Preparation_for_Extraction_of_Carbaryl_from_Rat_Feces (Acceso el diacutea 16052017) [34] STASHENKO Elena E MARTIacuteNEZ Jairo Reneacute Preparacioacuten de la muestra un paso crucial para el anaacutelisis por GC-MS Uma publicaccedilatildeo trimestral do Instituto Internacional de Cromatografia (IIC) Ciecircncia Cromatograacutefica 2011 vol 3 no 1 [35] Imagen GC-MS httpsorgspectroscopyintblogspotcomes201411gas-chromatography-mass-spectrometry-gchtml (Acceso el diacutea 17052017) [36] httpwwwactlabscompageaspxmenu=65ampapp=221ampcat1=534amptp=2amplk=no (Acceso el diacutea 17052017)
52
IV Bibliografiacutea [37] Quintela O Cruz A Concheiro M De Castro A amp Loacutepez-Rivadulla M (2005) Metodologiacutea LC-MS Aspectos generales de la teacutecnica y sus aplicaciones en el campo de la toxicologiacutea Rev Toxicol 22 paacutegs7-14 [38] Imagen LC-MS httpsuploadwikimediaorgwikipediaenff9Liquid_chromatography_tandem_Mass_spectrometry_diagrampng (visto 18052017) [39] Vargas de la Cruz Celia Bertha Adaptacioacuten de la Metodologiacutea Analiacutetica para la determinacioacuten de residuos de plaguicidas en frutas nativas de exportacioacuten mediante Uplc-MsMs (2012) Tesis obtenida en http20062146130handlecybertesis2331 (Acceso el diacutea 772017) [40] ROMERO GONZAacuteLEZ Roberto Fernaacutendez Moreno Joseacute Luis Plaza Bolantildeos Patricia Garrido Frenich Antonia Martiacutenez Vidal Joseacute Luis Empleo de la espectrometriacutea de masas como herramienta para la determinacioacuten de toacutexicos en alimentos hacia la seguridad alimentaria Revista Espantildeola de salud puacuteblica 2007 vol 81 no 5 p 461-474 [41] PAYAacute Andrus Fundamento y Funciones de la Espectrometriacutea de Masas Universidad de Valencia Espantildea 2006 httpmuraluvescaloan (Acceso el diacutea 19052017) [42] Imagen MS sacada de httpsesslidesharenetMaYaTorrezespectrometria-demasas (Acceso el diacutea 21052017) [43] ECONOMOU Anastasios Botitsi Helen Antoniou Spyros Tsipi Despina Determination of multi-class pesticides in wines by solid-phase extraction and liquid chromatography-tandem mass spectrometry Journal of Chromatography A 2009 vol 1216 no 31 p 5856-5867 [44] FONTANA A R Rodriacuteguez I Ramil M Altamirano JC Cela R Liquid chromatography time-of-flight mass spectrometry following sorptive microextraction for the determination of fungicide residues in wine Analytical and bioanalytical chemistry 2011 vol 401 no 2 p 767-775 [45] PELAJIĆ Maja G Peček DM Pavlović DV Čepo Novel multiresidue method for determination of pesticides in red wine using gas chromatographyndashmass spectrometry and solid phase extraction Food chemistry 2016 vol 200 p 98-106 [46] Ignaz J Buerge Juumlrgen Krauss Rociacuteo Loacutepez-Cabeza Werner Siegfried Michael Stuumlssi Felix E Wettstein Thomas Poiger Stereoselective Metabolism of the Sterol Biosynthesis Inhibitor Fungicides Fenpropidin Fenpropimorph and Spiroxamine in Grapes Sugar Beets and Wheat Journal of Agricultural and Food Chemistry 2016 vol 64 no 26 p 5301-5309 [47] M Hu X Liu F Dong J Xu S Li H Xu Y Zheng Determination of ametoctradin residue in fruits and vegetables by modified quick easy cheap effective rugged and safe method using ultra-performance liquid chromatographytandem mass spectrometry Food chemistry 2015 vol 175 p 395-400 [48] WALORCZYK Stanisław DROŻDŻYŃSKI Dariusz GNUSOWSKI Bogusław Multiresidue determination of 160 pesticides in wines employing mixed-mode dispersive-solid phase extraction and gas chromatographyndashtandem mass spectrometry Talanta 2011 vol 85 no 4 p 1856-1870 [49] Tianyang Guo Pingping Fang Juanjuan Jiang Feng Zhan Wei Yong Jiahui Liu YiYang Dong Rapid screening and quantification of residual pesticides and illegal adulterants in red wine by direct analysis in real time mass spectrometry Journal of Chromatography A 2016 vol 1471 p 27-3 [50] GONZAacuteLEZ-RODRIacuteGUEZ R M CANCHO-GRANDE B SIMAL-GAacuteNDARA J Decay of fungicide residues during vinification of white grapes harvested after the application of some new active substances against downy mildew Food chemistry 2011 vol 125 no 2 p 549-560 [51] CARPINTEIRO I Ramil M Rodriacuteguez I Cela R Determination of fungicides in wine by mixed-mode solid phase extraction and liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry Journal of Chromatography A 2010 vol 1217 no 48 p 7484-7492
53
Capiacutetulo I Introduccioacuten
13 Toxicidad de los pesticidas
En los uacuteltimos antildeos el uso indiscriminado de pesticidas de siacutentesis en agricultura ha creado graves problemas de
salud y medioambientales ya que su uso debido al aumento de la poblacioacuten y por consiguiente de la actividad
agraria se ha incrementado considerablemente Durante las tres uacuteltimas deacutecadas una estimacioacuten dada por la
Organizacioacuten Mundial de la Salud y el Programa de las Naciones Unidas para el Medio Ambiente revela que
aproximadamente cerca de 20000 personas al antildeo mueren generalmente agricultores por exposicioacuten continuada
a alguno de estos toacutexicos En la mayoriacutea de los casos los agricultores utilizan los pesticidas de forma que las
cantidades se desviacutean significativamente de las recomendadas ya que asocian cantidades maacutes altas con mayor
efectividad y velocidad de accioacuten El mal uso de dichos toacutexicos se ve en los signos presentes en los ecosistemas
afectados pudiendo llegar a ser perjudiciales para la salud humana Estos riesgos que causan tanto en la salud
como en el medioambiente pueden ser reducidos o en su defecto evitados mediante la educacioacuten sobre este tipo
de toacutexicos con el fin de frenar su uso excesivo y descontrolado [17]
Desde el punto de vista medioambiental los fitosanitarios empleados en un cultivo pueden persistir en los
distintos medios tierra aire o agua y afectar tanto a ecosistemas terrestres como acuaacuteticos En los sistemas
terrestres los suelos son contaminados mediante la aplicacioacuten del toacutexico de forma directa o como deposicioacuten del
resultado de una suspensioacuten aeacuterea Eacutestos pueden persistir desde varios diacuteas hasta varios antildeos ya que el suelo
retiene y moviliza el toacutexico despueacutes de su emisioacuten Los que persisten maacutes tiempo en el medioambiente tienen una
mayor probabilidad de interaccionar con otros elementos del sistema y si su vida media es mayor a la frecuencia
con la que se aplica el pesticida tienden a acumularse tanto en el suelo como en las especies que habitan en eacutel Por
otro lado el agua es contaminada por pesticidas bien por aplicacioacuten directa por estar presentes en las
precipitaciones de la atmoacutesfera o bien por la movilidad que tienen desde el suelo Tanto los pesticidas solubles
como los insolubles interaccionan con los ecosistemas acuaacuteticos los hidrosolubles persisten maacutes tiempo
solubilizados en agua mientras que los otros se asocian a los sedimentos y se concentran en las especies que
habitan el medio acuaacutetico [18]
Como consecuencia de la amplia distribucioacuten de los toacutexicos en aire suelo y agua se produce una acumulacioacuten de
ellos en los elementos que contribuyen a la alimentacioacuten humana ya que su amplio uso hace que el contacto con
los plaguicidas por parte de personas y animales sea inevitable La contaminacioacuten de los alimentos se puede
presentar por aplicacioacuten directa de los pesticidas el uso de eacutestos durante el manejo transporte y almacenamiento
de los productos comestibles o por su acumulacioacuten en la cadena troacutefica Son bioacumulables en el organismo
debido a su caraacutecter lipofiacutelico lo que les confiere una vida media en los tejidos larga La exposicioacuten a pesticidas
persistentes no tiene la misma repercusioacuten en cada uno de los individuos expuestos sino que se considera criacutetica la
exposicioacuten durante la etapas embrionaria fetal y primeros antildeos de vida en doacutende se transmite de madres a hijos
mediante la gestacioacuten y la lactancia como resultado de la acumulacioacuten en el tejido graso de la madre [19]
9
Capiacutetulo I Introduccioacuten
14 Legislacioacuten
El aumento del uso de fitosanitarios en actividades relacionadas con la produccioacuten de alimentos para consumo
humano o animal tambieacuten desembocoacute en una preocupacioacuten social debido a su toxicidad y bioacumulacioacuten En
respuesta la Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura (FAO) en colaboracioacuten
con la Organizacioacuten Mundial de la Salud (OMS) pusieron en marcha un programa Codex Alimentarius cuyo
objetivo a traveacutes de sus normas y coacutedigos de praacutecticas alimentarias internacionales es garantizar la calidad e
inocuidad de los alimentos que estaacuten al alcance de cualquier persona Con estas normas internacionales los
consumidores pueden confiar en la calidad de los alimentos independientemente de su origen geograacutefico [20]
Todos los alimentos destinados al consumo humano o animal en la Unioacuten Europea estaacuten sujetos a un liacutemite
maacuteximo de residuos de plaguicidas para la proteccioacuten de la salud humana y animal Actualmente en lo referente a
legislacioacuten para el control de la cantidad del toacutexico en la uva estaacute vigente el Reglamento 3962005 del Parlamento
Europeo y del Consejo de 23 de febrero de 2005 referido a la regulacioacuten de los liacutemites maacuteximos de residuos de
plaguicidas en alimentos y piensos de origen vegetal y animal El liacutemite maacuteximo de residuos (LMR) se define co-
mo el nivel maacutes alto de un residuo de un pesticida que se tolera de manera legal sobre los alimentos o piensos
cuando se aplican correctamente Las cantidades de residuos que se encuentren deben ser lo maacutes bajas posible
para garantizar la seguridad en la alimentacioacuten de los consumidores Dichos liacutemites maacuteximos de residuos estaacuten
fijados por la Comisioacuten Europea pudieacutendose encontrar en su base de datos LMR [21]
A continuacioacuten en la Tabla I2 se resumen los LMRs de los compuestos de este estudio en uvas de vinificacioacuten
en unidades de mgkg de uva En el caso del vino no hay legislacioacuten en lo referente a estos pesticidas solamente
la recomendacioacuten de no superar el 10 del valor del LMR en uva
Compuesto LMRs (mgkg uva) Compuesto LMRs (mgkg uva)
AME 6 MET 1
BEN 03 MYC 1
BOS 5 PEN 02
CAR 05 PYC 2
CYP 3 PYM 5
DIM 3 TEC 1
FEH 15 TEF 3
FEP 001 TBZ 005
FLU 2 TME 04
IMI 1 THI-M 3
IPR 2 TRI 2
MAN 2
Tabla I2 Liacutemites maacuteximos de residuos permitidos para los compuestos estudiados en uvas
10
Capiacutetulo I Introduccioacuten
2 MEacuteTODOS DE PREPARACIOacuteN DE MUESTRA APLICADOS A MUESTRAS DE VINO
21 Extraccioacuten liacutequido-liacutequido (LLE)
Se entiende por extraccioacuten liacutequido-liacutequido al meacutetodo mediante el cual un analito de intereacutes se separa por el
contacto con otra fase en la cual tiene mayor afinidad de la matriz en la que se halle Los procesos de extraccioacuten
implican dos fases y requieren tres pasos sucesivos mezcla de materia prima y disolvente separacioacuten de las dos
fases despueacutes del contacto y eliminacioacuten del disolvente que contiene el analito [22]
La extraccioacuten liacutequido-liacutequido (LLE) se basa en la distribucioacuten
de un analito entre dos fases liacutequidas inmiscibles en las
cuales analito y matriz tienen solubilidades diferentes
Principalmente una de las fases es un medio acuoso en
general se trata de la muestra y la otra un disolvente
orgaacutenico La selectividad y eficacia de este meacutetodo vienen
determinadas por la eleccioacuten del disolvente y por los factores
que pueden afectar al proceso de equilibrio (pH adiccioacuten de
sales neutras en la fase acuosa para reducir la solubilidad del
analito etc) [23] Esta teacutecnica permite llevar a cabo extracciones para un rango muy amplio de analitos siendo
una de las maacutes antiguas para la preparacioacuten de muestras en el anaacutelisis cualitativo y cuantitativo Ofrece grandes
capacidades de muestreo lineal y cuenta con la ventaja de la cantidad de informacioacuten existente sobre este meacutetodo
[24]
22 Extraccioacuten en fase soacutelida (SPE)
En 1978 aparecieron los primeros cartuchos desechables para la extraccioacuten en fase soacutelida y actualmente casi 40
antildeos despueacutes la extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) es la teacutecnica de preparacioacuten de muestras maacutes empleada en los
laboratorios Es una teacutecnica de preparacioacuten y tratamiento de muestras que se basa en la retencioacuten en una fase
adsorbente del analito de intereacutes presente en una muestra liacutequida que pasa a traveacutes de ella Debido a la variedad de
formatos (discos cartuchos y jeringas) y tipos de adsorbentes (los maacutes comunes carboacuten activo aluacutemina siacutelica gel
silicato de magnesio siacutelices enlazadas y poliacutemeros como por ejemplo estinero-divinilbenceno) o la facilidad de
automatizacioacuten y acoplamiento con otras teacutecnicas como por ejemplo una conexioacuten directa con un sistema de
Figura I4 Fundamentos teoacutericos de la LLE [25]
11
Capiacutetulo I Introduccioacuten
cromatografiacutea este meacutetodo le fue ganando terreno a la LLE Otra ventaja muy importante de la SPE frente a la
LLE es la disminucioacuten en la cantidad de disolvente orgaacutenico empleada Cada vez se va innovando maacutes sobre esta
teacutecnica llegando a encontrarse fases adsorbentes formadas por poliacutemeros capaces de retener en un uacutenico
cartucho un amplio abanico de analitos lipofiacutelicos o hidrofoacutebicos aacutecidos baacutesicos o neutros [26]
El fundamento de esta extraccioacuten como se puede en la Figura I6
consiste en cuatro etapas acondicionamiento adiccioacuten de muestra
retencioacuten y elucioacuten de los analitos de intereacutes En primer lugar antes
de empezar la extraccioacuten se requiere una etapa de acondicionamiento
para preparar el adsorbente haciendo pasar un poco de disolvente
para asiacute interaccionar mejor con la muestra Luego se hace pasar la
muestra liacutequida por la fase soacutelida Idealmente el adsorbente retiene
los analitos selectivamente a medida que va pasando la muestra y la
matriz pasa sin ser retenida Por uacuteltimo los analitos se eluyen del
adsorbente con un disolvente con el que tenga mayor afinidad [27]
23 Teacutecnicas de microextraccioacuten
231 Microextraccioacuten en fase soacutelida (SPME)
En la microextraccioacuten en fase soacutelida (SPME) se utilizan fibras de siacutelice fundida revestidas con un poliacutemero en un
disentildeo en forma de jeringa para la extraccioacuten de los analitos de intereacutes El principio por el que se rige esta
extraccioacuten es el reparto del analito entre la matriz de la muestra y el revestimiento de la fibra mediante un proceso
no competitivo Se trata de un meacutetodo que cuenta con muchas ventajas ya que se elimina completamente el uso de
disolventes y aparte no son necesarios voluacutemenes de muestra grandes pero tambieacuten cuenta con algunas
desventajas ya que tanto la capacidad como la sensibilidad se ven limitadas [29]
En la figura I7 podemos ver las etapas de la extraccioacuten En un
vial cerrado con una caacutepsula y un seacuteptum tenemos la muestra
liacutequida o bien soacutelida que contenga los analitos de intereacutes
volaacutetiles Con la jeringa se perfora el seacuteptum y una vez dentro
se acciona el eacutembolo para la exposicioacuten de la fibra con los
analitos introducieacutendola en la muestra liacutequida o en su defecto
en el espacio de cabeza para la extraccioacuten de analitos volaacutetiles
de una muestra soacutelida Despueacutes de la extraccioacuten dentro del vial
Figura I6 Etapas de una SPE [28]
Figura I7 Etapas de una SPME [30]
12
Capiacutetulo I Introduccioacuten
la fibra se introduce de nuevo en la jeringa y se retira del vial [27]
232 Microextraccioacuten en fase liacutequida (LPME)
La microextraccioacuten en fase liacutequida se desarrolloacute como una alternativa a la LLE para la reduccioacuten en la cantidad de
disolventes orgaacutenicos siendo rentable tanto para el medioambiente como econoacutemicamente Entre las modalidades
maacutes populares de esta teacutecnica se encuentran microextraccioacuten con gota suspendida (SDME) y microextraccioacuten
liacutequido-liacutequido dispersiva (DLLME) En la SDME una gota de disolvente orgaacutenico es expuesta al espacio de
cabeza situado sobre una muestra en un vial dicha gota es suspendida del extremo de una microjeringa Por otro
lado la DLLME sobre una muestra acuosa se inyecta un pequentildeo volumen de una mezcla de disolventes en la
cual es dispersada formando una solucioacuten en la que se establece el equilibrio El disolvente de extraccioacuten debe
presentar una densidad inferior a la de la muestra para facilitar su recuperacioacuten normalmente despueacutes de
centrifugar el vial doacutende se realiza la extraccioacuten [31]
24 QuEChERS
La extraccioacuten QuEChERS de las palabras en ingleacutes Quick Easy Cheap Effective Rugged and Safe es un meacutetodo
de extraccioacuten que se desarrolloacute entre 2000 y 2002 para el anaacutelisis de pesticidas Como su nombre indica raacutepido
faacutecil barato eficaz robusto y seguro son las principales
caracteriacutesticas de esta preparacioacuten de muestra Se realiza en dos
etapas en primer lugar una extraccioacuten simple y una segunda fase
de purificacioacuten En la primera etapa tenemos el vial con la
muestra en el cual se antildeade un disolvente generalmente
acetonitrilo para la extraccioacuten de los analitos de intereacutes en
presencia de diferentes sales (en el meacutetodo original se utiliza
sulfato de magnesio y cloruro de sodio) para facilitar la separacioacuten
de las fases En la segunda parte se realiza la purificacioacuten de la
fraccioacuten del extracto orgaacutenico Para eso se lleva a cabo una
limpieza de los analitos eliminando el agua y los compuestos
presentes en la matriz de la muestra empleando un adsorbente PSA (amina primaria y secundaria) C18 carboacuten
negro grafitizado (GCB) o una combinacioacuten de eacutestas [32]
Figura I8 Etapas de QuEChERS [33]
13
Capiacutetulo I Introduccioacuten
3 METODOLOGIacuteA ANALIacuteTICA PARA LA DETERMINACIOacuteN DE PESTICIDAS
31 Meacutetodos de GC-MS (MSMS)
La combinacioacuten de cromatografiacutea de gases (GC) teacutecnica de separacioacuten con espectrometriacutea de masas (MS) como
sistema de deteccioacuten representa un potente meacutetodo para la identificacioacuten determinacioacuten y cuantificacioacuten de
analitos orgaacutenicos en concentraciones traza presentes en muestras complejas Esta teacutecnica de anaacutelisis cuenta con
muchas ventajas en sensibilidad multifuncionalidad buena reproducibilidad robustez asiacute como facilidad en el
manejo pero con una gran desventaja este meacutetodo no es apto para ser utilizado con todos los analitos sino que
se ve limitado a aquellos que sean termoestables y no se descompongan a temperaturas elevadas antes de ser
volatilizados La muestra es introducida a traveacutes del inyector en el cromatoacutegrafo de gases doacutende impulsada por
una corriente de gas inerte como fase moacutevil pasa a traveacutes de la columna que contiene la fase estacionaria en la
cual se separan los compuestos debido a una distribucioacuten de estos entre fase moacutevil-fase estacionaria Mediante
una interfase son introducidos para su deteccioacuten en el espectroacutemetro de masas que cuenta con una fuente de
iones analizador de masas y un detector [34]
La combinacioacuten de analizadores de masas en taacutendem (MSMS) como sistema de deteccioacuten en GC es una teacutecnica
altamente selectiva mejorando la sensibilidad y la relacioacuten sentildeal-ruido en los espectros experimentando una
mejora por lo que se logran unos liacutemites de deteccioacuten inferiores Esta teacutecnica GC-MSMS comprende maacutes
pasos despueacutes de la separacioacuten por cromatografiacutea se lleva a cabo la deteccioacuten con MSMS que consta de varias
etapas generacioacuten de iones en la fuente de ionizacioacuten seleccioacuten de los iones precursores de una determinada
masa disociacioacuten causada por colisioacuten con moleacuteculas de gas inerte de los iones precursores y por uacuteltimo el
anaacutelisis de los fragmentos en relacioacuten a su masacarga (mz) En el caso de que un espectro de MS no permita
confirmar la identidad de un determinado compuesto quiacutemico la obtencioacuten de su espectro de MSMS permite
mejorar la confianza en su identificacioacuten [36]
Figura I9 Acoplamiento GC-MS [35]
14
Capiacutetulo I Introduccioacuten
32 Meacutetodos LC-MS (MSMS)
La teacutecnica de LC-MS se desarrolloacute para minimizar las desventajas del acoplamiento GC-MS y asiacute resolver los
problemas que este uacuteltimo acarreaba con los analitos termolaacutebiles permitiendo el anaacutelisis de eacutestos sin tener que
realizar una etapa previa de derivatizacioacuten La interfase de unioacuten de cromatografiacutea liacutequida (LC) con espectrometriacutea
de masas (MS) acarrea una dificultad significativa siendo responsable de transformar los analitos que se
encontraban en la fase moacutevil liacutequida en iones en fase gas sin que se produzca su degradacioacuten teacutermica La
sensibilidad de las determinaciones por LC-MS va a depender de la interfase empleada Las principales interfases
empleadas actualmente son las ionizaciones a presioacuten atmosfeacuterica electrospray (ES) e ionizacioacuten quiacutemica a
presioacuten atmosfeacuterica (APCI) [37]
Con los antildeos la cromatografiacutea liacutequida se ha ido innovando y mediante la disminucioacuten del tamantildeo de partiacutecula en
la columna se fue mejorando la eficiencia asiacute como aumentando la selectividad y resolucioacuten del pico en el
cromatograma Para este nuevo sistema llamado UPLC Ultra-Performance Liquid Chromatography se desarrolloacute
una nueva instrumentacioacuten capaz de trabajar a altas presiones generando flujos mayores sin peacuterdidas de
resolucioacuten utilizando inyectores automaacuteticos maacutes raacutepidos y detectores con mayor velocidad de adquisicioacuten de
datos disminuyendo asiacute el tiempo de anaacutelisis [39]
33 Espectrometriacutea de masas
La espectrometriacutea de masas es el meacutetodo de deteccioacuten y cuantificacioacuten maacutes fiable a la hora de la determinacioacuten de
compuestos en matrices complejas (tales como alimentos) ya que otros detectores maacutes tradicionales como UV-
visible o fluorescencia cuentan con una gran incertidumbre en los resultados llegando incluso a ofrecer falsos
Figura I10 Acoplamiento LC-MS [38]
15
Capiacutetulo I Introduccioacuten
positivos o negativos Un espectrometro de masas cuenta con un dispositivo de introduccioacuten de muestra una
caacutemara de ionizacioacuten un sistema para la aceleracioacuten de los iones uno o varios analizadores de masas y un detector
[40]
El fundamento de la espectrometriacutea de masas se basa en la separacioacuten de iones en base a la relacioacuten masacarga
(mz) El proceso consta fundamentalmente de cuatro etapas La
primera es la ionizacioacuten de la muestra los iones formados se aceleran
debido a la accioacuten de un campo eleacutectrico variable separacioacuten de los
iones seguacuten su masacarga deteccioacuten de los iones y produccioacuten de la
sentildeal eleacutectrica El analizador de masas es el encargado de la separacioacuten
de los iones en funcioacuten a su mz entre los que maacutes destacan
analizador de masas cuadrupolar que dispersa simultaacuteneamente todos
los iones en funcioacuten de la relacioacuten mz analizador de masas de
tiempo de vuelo (TOF) consta de un tubo a alto vaciacuteo sobre el que no
actuacutea ninguacuten campo eleacutectrico al cual llegan todos los iones acelerados con la misma energiacutea cineacutetica y en el tubo
las velocidades variacutean seguacuten mz y analizador de trampa de iones en doacutende los iones gaseosos quedan aislados
durante largos periacuteodos de tiempo por la accioacuten del campo eleacutectrico [41]
4RESUMEN BIBLIOGRAacuteFICO DE LAS TEacuteCNICAS DE EXTRACCIOacuteN Y
DETERMINACIOacuteN DE PESTICIDAS EN VINO
En la bibliografiacutea se han descrito diversas teacutecnicas y diferentes combinaciones entre teacutecnicas de extraccioacuten y
distintas teacutecnicas de cuantificacioacuten e identificacioacuten para esos analitos Entre estas teacutecnicas los valores de los liacutemites
de cuantificacioacuten (LOQs) y las recuperaciones relativas pueden diferir en el resultado en un rango de valores asiacute
como el tiempo total empleado para el anaacutelisis y para la preparacioacuten de la muestra
Por lo general el meacutetodo de extraccioacuten de los analitos de intereacutes maacutes empleado es la extraccioacuten en fase soacutelida
(SPE) la cuaacutel le ha estado ganando terreno a la extraccioacuten liacutequido-liacutequido aunque tambieacuten se estaacute viendo cada vez
maacutes desplazada debido al creciente uso de la teacutecnica QuEChERS
Figura I11 Etapas de la espectrometriacutea de masas [42]
16
Capiacutetulo I Introduccioacuten
En el estudio de ECONOMOU et al [43] realizado en el antildeo 2009 en Grecia se empleoacute la extraccioacuten en fase
soacutelida con deteccioacuten en cromatografiacutea de liacutequidos acoplada a espectrometriacutea de masas en taacutendem (SPE-LC-ESI-
MSMS) Para la preparacioacuten de la muestra diluyeron 10 mL de vino (tanto blanco como tinto) a un volumen
final de 100 mL con agua ultrapura antes de la SPE Determinaron las recuperaciones de la extraccioacuten para dos
niveles de concentracioacuten 0010 y 0050 mgL realizando 8 medidas diarias durante 3 diacuteas consecutivos
encontraacutendose unos valores que variacutean dentro del rango 70-110 para todos los pesticidas en los dos niveles Para
la determinacioacuten y cuantificacioacuten de 46 pesticidas emplearon la teacutecnica de cromatografiacutea de liacutequidos con
espectrometriacutea de masas con un volumen de inyeccioacuten de 20 microL y un flujo de fase moacutevil de 02 mLmin
aclopada a espectrometriacutea de masas en taacutendem
Con la misma teacutecnica de extraccioacuten PELAJIĆ et al [45] durante el antildeo 2015 en Croacia llevaron a cabo la
determinacioacuten de 25 residuos de plaguicidas en vino tinto El meacutetodo que desarrollaron para dicha finalidad fue el
acoplamiento SPE-GC-MS Para la preparacioacuten de la muestra emplearon 10 mL de vino diluidos 11 con agua
ultrapura hasta un volumen final de 20 mL Calcularon las recuperaciones de la extraccioacuten y se encontroacute un rango
para todos los pesticidas en las muestras de 70-120 Para la determinacioacuten en cromatografiacutea de gases-
espectrometriacutea de masas se empleoacute un volumen de inyeccioacuten de 5 μL y un flujo de fase moacutevil de 10 mLmin
Mediante el acoplamiento de teacutecnicas SPE dispersiva-GC-MS WALORCZYK et al [48] en el antildeo 2011 en
Polonia llevaron a cabo la cuantificacioacuten de 160 pesticidas en diferentes clases de vino tinto rosado y blanco Con
10 g de vino y 10 mL de acetonitrilo se realizaron pruebas de recuperacioacuten en la fase de extraccioacuten para vino
tinto con los niveles de concentracioacuten 001 005 y 02 mgkg y para los vinos rosado y blanco con el nivel de
concentracioacuten 005mgkg y encontraron que a todos los niveles de concentracioacuten los valores de recuperacioacuten
rondan el rango 80-110 Para la teacutecnica cromatograacutefica se utilizoacute un volumen de inyeccioacuten de 5 microL
El acoplamiento LLE-SPE-LCDAD fue desarrollado por GONZAacuteLEZ-RODRIacuteGUEZ et al [50] en el antildeo
2010 en la provincia de Orense para la determinacioacuten de nuevos fungicidas propuestos para combatir el hongo
que provoca la enfermedad del mildium En la preparacioacuten de la muestra emplearon 15 mL de vino blanco para la
extraccioacuten en la cual fueron calculadas las recuperaciones relativas para dos niveles de concentracioacuten 005 y 05
mgkg en donde se establece un rango de entre 70-110 para todos los analitos Para la determinacioacuten mediante
cromatografiacutea de liacutequidos se empleoacute un volumen de inyeccioacuten de 2 μL y como meacutetodo de deteccioacuten utilizaron un
detector de diodos array
La microextraccioacuten sorptiva en fase soacutelida fue empleada en la publicacioacuten de FONTANA et al [44] junto con un
acoplamiento entre cromatografiacutea de liacutequidos y espectrometriacutea de masas para la determinacioacuten de 15 fungicidas
en vino realizada durante el 2010 en el noroeste de Espantildea Para la preparacioacuten de la muestra emplearon 10 mL
17
Capiacutetulo I Introduccioacuten
de vino diluiacutedos con el mismo volumen de agua ultrapura y un sorbente en forma de disco de silicona con un
volumen de 12 microL La recuperacioacuten de la extraccioacuten se calculoacute para vino tinto (Menciacutea) y vino blanco (Godello)
realizando tres replicas dentro de un mismo diacutea para los niveles de concentracioacuten 10 y 50 ngmL y nueve reacuteplicas
realizando el anaacutelisis en tres diacuteas consecutivos para el nivel de concentracioacuten de 25 ngmL y los resultados
obtenidos dan unos valores de recuperacioacuten dentro del rango 75-117 En el sistema LC-QTOF-MS el volumen
de inyeccioacuten fue de 15 microL
El otro meacutetodo de extraccioacuten mencionado anteriormente es QuEChERS estaacute en auge como meacutetodo de extracioacuten
de residuos de pesticidas en matrices como la del vino o la uva ya que incrementa la velocidad del anaacutelisis y reduce
el efecto de matriz BUERGE et al [46] seguido de una deteccioacuten mediante GC-MSMS realizaron una estapa
de extraccioacuten QuEChERS con alguna modificacioacuten acetato de sodio en lugar de cloruro soacutedico y acetato de etilo
en lugar de acetonitrilo utilizando 5 g de uva para la determinacioacuten de residuos de 4 pesticidas durante el antildeo
2016 Las recuperaciones de extraccioacuten resultaron ser valores entre 91-149 en uva a distintos niveles de
concentracioacuten 005 05 y 5 mgkg
Para la determinacioacuten de Ametoctradin HU et al [47] llevaron a cabo una extraccioacuten QuEChERS empleando 10
g de uva con deteccioacuten mediante el acoplamiento UPLC-MSMS utilizando un volumen de inyeccioacuten de 5 μL y
un flujo de fase moacutevil de 03 mLmin Las recuperaciones de la extraccioacuten se calcularon para tres niveles de
concentracioacuten 1 10 100 μgL de dos formas distintas en tres diacuteas consecutivos realizando 5 reacuteplicas al diacutea o en
dentro de un mismo diacutea realizando 15 reacuteplicas los resultados de todos los caacutelculos se encuentran dentro del rango
818-1001
Siguiendo con el mismo modo de extraccioacuten GUO et al [49] publicaron sus estudios para la determinacioacuten de
50 pesticidas y 12 adulterantes en vino tinto Para la extraccioacuten QuEChERS se utilizaron 10 mL de vino tinto con
10 mL de acetonitrilo y calcularon las recuperaciones para tres niveles de concentracioacuten 50 100 y 250 ngmL
encontraacutendose un rango de valores entre 75-120 El meacutetodo de deteccioacuten se llevoacute a cabo mediante un anaacutelisis
directo en tiempo real junto con espectrometriacutea de masas en tandem con un cuadrupolo (DART-MSMS) la
teacutecnica DART es un meacutetodo raacutepido para cribar y cuantificar los analitos de estudio que prescinde de la etapa de
separacioacuten cromatograacutefica
A continuacioacuten se recogen en la Tabla I3 los liacutemites de cuantificacioacuten (LOQs) de los analitos de intereacutes en este
trabajo caacutelculados por los diferentes meacutetodos encontrados en bibliografiacutea citados anteriormente en este apartado
18
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Tabla I3 LOQs de los analitos de intereacutes descritos para los distintos meacutetodos encontrados en la bibliografiacutea
Compuesto LOQs
Compuesto LOQs
V Blanco V Tinto Uva V Blanco V Tinto Uva
AME - - 0032μgkg[47] MET 86 μgL[43]
22 μgL[44]
89 μgL[43]
22 μgL[44]
5 μgL[45]
259 ngmL[49]
001mgkg[48]
BEN 02 μgL[44]
0001 mgL[50]
02 μgL[44]
001 μgL[45]
280ngmL[49]
005 mgkg[48] MYC 30 μgL[43]
08 μgL[44]
36 μgL[43]
10 μgL[44]
025 μgL[45]
331ngmL[49]
001 mgkg[48]
BOS 0065 mgL[50] 05 μgL[45]
1076 ngmL[49] 001 mgkg[48] PEN
56 μgL[43]
05 μgL[44]
49 μgL[43]
04 μgL[44]
220ngmL[49]
001 mgkg[48]
CAR - 386 ngmL[49] - PYC 0003mgL[50] 07 μgL[45] 001 mgkg[48]
CYP 15 μgL[43]
04 μgL[44]
0001 mgL[50]
22 μgL[43]
06 μgL[44]
312 ngmL[49]
001 mgkg[48] PYM 17 μgL[43] 22 μgL[43]
10 μgL[45] 001 mgkg[48]
DIM 18 μgL[43] 20 μgL[43] 001 mgkg[48] TEC 03 μgL[44]
03 μgL[44]
10 μgL[45]
160ngmL[49]
001 mgkg[48]
FEH 17 μgL[43] 22 μgL[43]
938 ngmL[49] 001 mgkg[48] TEF - 876ngmL[49] -
FEP - - 002mgkg[46] TBZ 15μgL [43] 29μgL[43] 001 mgkg[48]
FLU 005 μgL[45] TME - 25 μgL[45] 001 mgkg[48]
IMI 21 μgL[43] 22 μgL[43]
225 ngmL[49] - THI-M 92 μgL[43] 89 μgL[43] -
IPR 07 μgL[44] 07 μgL[44] 001 mgkg[48] TRI 10 μgL[44] 12 μgL[44] 001 mgkg[48]
MAN 0011 mgL[50] - -
5 DISTRIBUCIOacuteN DE PESTICIDAS EN VINOS COMERCIALES
En algunos de los meacutetodos descritos en el apartado anterior se procesaron vinos comerciales encontraacutendose
resultados positivos para muchos residuos de pesticidas y algunos hasta en gran concentracioacuten
ECONOMOU et al [43] mediante el meacutetodo LC-ESI-MSMS realizaron el anaacutelisis de 60 muestras de vino tinto
y blanco recogidos en supermercados locales en Grecia a lo largo de un antildeo El meacutetodo se habiacutea desarrollado
19
Capiacutetulo I Introduccioacuten
para la determinacioacuten de 46 pesticidas pero la mayoriacutea se encuentran con una concentracioacuten por debajo de
001mgL solo ocho plaguicidas se obtuvieron con resultados de concentracioacuten mayores Se muestran los
resultados en la Tabla I4 de los analitos de intereacutes en este estudio
Tabla I4 Nuacutemero de muestras positivas de distintos pesticidas en el anaacutelisis de 60 muestras de vino [43]
Compuesto Positivos con concentracioacuten entre 001-01
mgL
Positivos con concentracioacuten entre 01-1
mgL
PYM 2 (3) 2 (3)
MYC 2 (3) 0 (0)
CAR 11 (18) 7 (12)
THI-M 7 (12) 5 (8)
FEH 5 (8) 0 (0)
MET 1 (2) 0 (0)
Mediante el meacutetodo de microextraccioacuten en fase soacutelida-LC-TOF-MS FONTANA et al [44] aplicaron el
desarrollo del procedimiento a un total de 12 vinos joacutevenes elaborados en el 2010 y correspondientes a diferentes
denominaciones geograacuteficas del noroeste de Espantildea En la Tabla I5 se muestran los datos que han obtenido
Tabla I5 Determinacioacuten de fitosanitarios en vinos comerciales mediante Microextraccioacuten en fase soacutelida-LC-TOF-MS
Valores de concentracioacuten en ngmL [44]
Pesticidas
W 1
Albarintildeo
W5
Ribeiro
W6
Valdeorras
R1
Ribeira Sacra
R3
Ribeiro
R4
Valdeorras
MET 404plusmn06 223plusmn05 311plusmn007 25plusmn03 31plusmn03 74plusmn10
TRI nd nd 36plusmn06 nd nd ltLOQ
IPR 394plusmn03 324plusmn02 324plusmn02 071plusmn007 31plusmn02 28plusmn05
MYC nd nd nd ltLOQ 39plusmn02 nd
TEC 25plusmn01 nd nd nd nd nd
CYP 179plusmn08 ltLOQ ltLOQ 562plusmn002 083plusmn001 nd
BEN 042plusmn001 nd ltLOQ nd 032plusmn001 ltLOQ
ndNo detectados ltLOQ por debajo del liacutemite de cuantificacioacuten del meacutetodo los coacutedigos W y R corresponden respecti-vamente a los vinos blanco y tinto
20
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Por uacuteltimo PELAJIĆ et al [45] aplicaron su meacutetodo SPE dispersiva-GC-MS mediante el cual determinaron 25
residuos de plaguicidas en vino tinto a un total de 32 muestras de vino adquiridos en supermercados locales de
Croacia pero de diversos oriacutegenes de procedencia Los resultados que han obtenido se muestran en la Tabla I6
en doacutende un total de 15 plaguicidas han sido detectados y 7 de los cuales se encontraban en una alta
concentracioacuten
Tabla I6 Resultados de los vinos con positivos en pesticidas y sus concentraciones [45]
Vino Paiacutes Residuos de pesticidas (mgKg)
Tinto Francia DIM (0013) MET (0009) IPR (001)
Tinto Alemania BOS (0011)
Tinto Alemania IPR (0009)
Tinto Macedonia MET (0015)
Tinto Moldavia IPR (0008)
Tinto Polonia MET (004)
Tinto Rumania PYM (0058)
Tinto Espantildea TRI (0005) MET (0011)
Tinto Estados Unidos BOS (001)
Rosado Francia BOS (0005)
Blanco Chile TEC (0008)
Blanco Georgia MET (0057)
Blanco Alemania DIM (001) IPR (0054) PYM (0056)
Blanco Sudaacutefrica DIM (0011) IPR (0011)
21
Capiacutetulo II Objetivos y discusioacuten
CAPIacuteTULO II OBJETIVOS Y DISCUSIOacuteN
El objetivo principal que se persigue en este trabajo es el desarrollo de un meacutetodo analiacutetico raacutepido basado en la
extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) y deteccioacuten mediante cromatografiacutea de liacutequidos en la modalidad de UPLC
acoplada a la espectrometriacutea de masas en taacutendem (UPLC-MSMS) para la determinacioacuten multianalito de residuos
de fitosanitarios principalmente fungicidas aunque tambieacuten alguacuten insecticida en muestras de vino blanco y tinto
Para llevar a cabo la finalidad de lo dicho se consideran unos objetivos maacutes especiacuteficos
Minimizar la manipulacioacuten de la muestra para asiacute reducir la cantidad de disolventes y tiempo empleado
Optimizacioacuten de los factores que afectan en la extraccioacuten en la SPE tales como tipo y cantidad de
adsorbente volumen de eluyente etc
Estudio de las condiciones en UPLC-MSMS para una separacioacuten y cuantificacioacuten oacuteptimas
Caracterizacioacuten y validacioacuten del meacutetodo propuesto
Por uacuteltimo una vez cumplidos todos los objetivos anteriores y fijadas las condiciones oacuteptimas el meacutetodo
estudiado se aplica en el anaacutelisis de muestras de vino comercial (blanco y tinto) para determinar si se encuentran
residuos presentes asiacute como conocer en queacute concentracioacuten se encuentran los pesticidas objeto de este estudio
22
Capiacutetulo III Parte experimental
CAPIacuteTULO III PARTE EXPERIMENTAL
1 MATERIAL Y REACTIVOS
11 Material
Material de vidrio de uso comuacuten en el laboratorio vasos de precipitados matraces aforados etc
Micropipetas automaacuteticas de 20-200 microL 20-200 microL 100-1000 microL 1000-5000 microL Eppendorf
Puntas de plaacutestico para micropipetas
Encapsulador y desencapsulador
Soportes y pinzas
Viales de 15 mL transparentes para muestreador automaacutetico de cromatografiacutea (Sugelabor)
Caacutepsulas de aluminio con seacuteptum de Tefloacuten (Sugelabor) y tapones pre-slit para viales
Tubos y conectores de tefloacuten
Cartuchos de divinilbenceno-N-vinilpirrolidona 200 mg Oasis HLB Waters
Cartuchos de divinilbenceno-N-vinilpirrolidona funcionalizados con grupos amina cuaternaria 150 mg
Oasis MAX Waters
Cartuchos de divinilbenceno-N-vinilpirrolidona 60 mg Oasis HLB Waters
12 Reactivos y disolventes
Agua ultrapura Milli-Q
Aacutecido foacutermico (Sigma Aldrich) 95
Acetonitrilo (LichrosolvregMerck) Gradient grade for liquid chromatography
Metanol (LichrosolvregMerck) Gradient grade for liquid chromatography
Etanol (LichrosolvregMerck) Gradient grade for liquid chromatography
13 Patrones
Ametoctradin (AME) Dr Ehrenstrorfer 990
Benalaxyl (BEN) Pestanal Sigma- Aldrich 999
23
Capiacutetulo III Parte experimental
Boscalid (BOS) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Carbendazim (CAR) Pestanal Sigma- Aldrich 992
Cyprodinil (CYP) Pestanal Sigma- Aldrich 998
Dimethomorph (DIM) mezcla de isoacutemeros E + Z Pestanal Sigma- Aldrich 989
Fenhexamid (FEH) Pestanal Sigma- Aldrich 997
Fenpropidin (FEP) Dr Ehrenstrorfer 980
Fluopicolide (FLU) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Imidacloprid (IMI) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Iprovalicarb (IPR) mezcla de isoacutemeros Pestanal Sigma- Aldrich 985
Mandipropamid (MAN) Pestanal Sigma- Aldrich 991
Metalaxyl (MET) Pestanal Sigma- Aldrich 990
Myclobutanil (MYC) Pestanal Sigma- Aldrich 994
Penconazole (PEN) Pestanal Sigma- Aldrich 991
Pyraclostrobin (PYC) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Pyrimethanil (PYM) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Tebuconazol (TEC) Pestanal Sigma- Aldrich 996
Tebufenozide (TEF) Dr Ehrenstrorfer 988
Thiabendazole (TBZ) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Thiamethoxam (TME) Pestanal Sigma- Aldrich 996
Thiophanate-methyl (THI-M) Dr Ehrenstrofer 990
Triadimenol (TRI) Mezcla de diastereoisoacutemeros Pestanal Sigma- Aldrich 994
14 Patrones internos
Carbendazim-d3 (CAR-d3) Pestanal Sigma- Aldrich 998
Cyprodinil-d5 (CYP-d5) Pestanal Sigma- Aldrich
Imidacloprid-d4 (IMID-d4) Pestanal Sigma- Aldrich
Metalaxyl 13C6 (MET13C6) Pestanal Sigma-Aldrich 99
24
Capiacutetulo III Parte experimental
15 Gases
Nitroacutegeno 99999 como gas de colisioacuten en el espectroacutemetro de masas
Nitroacutegeno en los sistemas de concentracioacuten y secado por corriente de nitroacutegeno de los cartuchos SPE
2 INSTRUMENTACIOacuteN
Balanza analiacutetica de precisioacuten Sartorius
Granatario Sartorius
Bantildeo de ultrasonidos P-Selecta
Equipo de purificacioacuten de agua Millipore modelo Milli-Q gradient A-10ZMQSSVOT4
Estacioacuten de concentracioacuten por corriente de nitroacutegeno Mini-Vap Supelco
Sistema de secado de cartuchos de SPE por corriente de nitroacutegeno VisiDry Supelco
Sistema distribuidor de vaciacuteo Visiprep reg Supelco
Cromatoacutegrafo de liacutequidos de ultra-alta resolucioacuten Waters AcquityUPLC reg y espectroacutemetro de masas
Acquity TQD con analizador de triple quadrupolo (QqQ) equipado con una fuente de ionizacioacuten a
presioacuten atmosfeacuterica del tipo Z-spray (ESI)
3 PREPARACIOacuteN DE LAS DISOLUCIONES
Los patrones de pesticidas se prepararon individualmente a partir de los compuestos soacutelidos comerciales por
pesada excepto en el caso del fenpropidin (FEP) que se preparoacute a partir del compuesto liacutequido comercial Estos
compuestos soacutelidos se disolvieron en metanol y se obtuvieron unas disoluciones iniciales con concentraciones
recogidas en la Tabla III1
25
Capiacutetulo III Parte experimental
Tabla III1 Concentracioacuten de las disoluciones patroacuten stock
Compuesto Concentracioacuten (microgmL) Compuesto Concentracioacuten (microgmL)
AME 102201 MET 118912
BEN 138330 MYC 102017
BOS 99474 PEN 129791
CAR 17105 PYC 104581
CYP 131075 PYM 141386
DIM 103009 TEC 134729
FEH 99584 TEF 137769
FEP 100000 TBZ 105928
FLU 126859 TME 112283
IMI 101123 THI-M 124202
IPR 106739 TRI 118933
MAN 101021
4 LAVADO DEL MATERIAL
La limpieza del material de vidrio utilizado en el laboratorio se realizoacute utilizando jaboacuten y aclarando con agua de
grifo Luego en primer lugar se realiza un enjuague con agua Milli-Q finalmente un segundo enjuague con
acetona para eliminar posibles restos de compuestos orgaacutenicos y se deja secar sobre papel
Para la limpieza de los conectores de tefloacuten empleados en el proceso de SPE se introducen en un vaso de
precipitados con metanol y este en un bantildeo de ultrasonidos durante 10 minutos Al finalizar con el bantildeo de
ultrasonidos se realiza un enjuague con acetona y se pone a secar
5 EXTRACCIOacuteN DE MUESTRAS MEDIANTE SPE
El meacutetodo de extraccioacuten utilizado para la determinacioacuten de pesticidas fue la extraccioacuten en fase soacutelida (SPE)
mediante cartuchos Oasis HLB de 200 mg A continuacioacuten se describe el protocolo de extraccioacuten en las
condiciones oacuteptimas
26
Capiacutetulo III Parte experimental
1 Acondicionamiento del cartucho Oasis HLB de 200 mg con 2 mL de acetonitrilo seguidos de otros 2 mL de
vino sinteacutetico formado por la mezcla etanolagua MilliQ (1288)
2 Paso de la muestra 2 mL de vino diluiacutedos con 2 mL de agua MilliQ a traveacutes del cartucho por gravedad
3 Lavado del cartucho con 2 mL de agua MilliQ
4 Secado del cartucho durante 45 minutos en el VisiDry mediante el paso de una corriente de nitroacutegeno
5 Elucioacuten del cartucho con la mezcla metanolacetonitrilo en proporcioacuten 2080 hasta un volumen final de 2
mL
6 Anaacutelisis mediante cromatografiacutea liacutequida acoplada a espectrometriacutea de masas en taacutendem UPLC-MSMS
(volumen de inyeccioacuten 15 microL)
Representacioacuten esquematizada en la Figura III1
Figura III1 Extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) de las muestras de vino
27
Capiacutetulo III Parte experimental
6 CONDICIONES DE DETERMINACIOacuteN MEDIANTE UPLC-MSMS
En la Tabla III2 se indican las condiciones utlizadas en la determinacioacuten de los pesticidas de intereacutes mediante
LC-MSMS y en la Tabla III3 se muestra el gradiente de la fase moacutevil utilizado para la separacioacuten
cromatograacutefica
Tabla III2 Condiciones experimentales de determinacioacuten en LC-MSMS
UPLC Acquity UPLC-I-Class IVD System
bull Columna cromatograacutefica Zorbax Eclipse Plus C18 Rapid Resolution HD
Fase estacionaria C18
Dimensiones 21 x 50 mm
Tamantildeo de partiacutecula 18 microm
Temperatura del horno 40ordmC
bull Inyector
Volumen de inyeccioacuten 15 microL
bull Fase moacutevil
Flujo 04 mLmin
Fase acuosa (A) Agua MilliQ con 01 aacutecido foacutermico
Fase orgaacutenica (B) Acetonitrilo con 01 aacutecido foacutermico
MSMS WatersXevo TQD
Modo de ionizacioacuten ESI positivo
Voltaje del capilar 15 kV
Voltaje de cono 50 V
Temperatura de gas de secado (N2) 450ordmC
Flujo de gas de secado (N2) 1000 Lh
Modo de adquisicioacuten Centroide
Tabla III3 Gradiente de fase moacutevil utilizado en la separacioacuten cromatograacutefica (LC)
Tiempo min 0 13 28 64 75 76 10
A 98 50 50 0 0 98 98
B 2 50 50 100 100 2 2
28
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
CAPIacuteTULO IV RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
1 IDENTIFICACIOacuteN DE LOS COMPUESTOS
Para empezar el estudio en primer lugar se realizoacute la caracterizacioacuten de las condiciones de determinacioacuten de los
analitos en el modo Multiple Reaction Monitoring (MRM) mediante UPLC-ESI-MSMS Para llevarla a cabo se
tomaron patrones individuales de cada fitosanitario y mediante infusioacuten se estudiaron las posibles transiciones y
voltajes oacuteptimos para su determinacioacuten (Tabla IV1)
La ionizacioacuten por electrospray (ESI) se estudioacute tanto en modo positivo como en modo negativo encontraacutendose
que para todos los pesticidas de nuestro intereacutes se obteniacutea sentildeal en el modo positivo mientras el modo negativo
no presentaba respuesta significativa
A continuacioacuten se estudia el efecto del voltaje de cono en la respuesta del ioacuten molecular [M+H]+ aumentaacutendolo
hasta alcanzar el valor maacuteximo de la sentildeal correspondiente a dicho ioacuten y luego se optimiza la energiacutea de colisioacuten
variaacutendola para cada analito hasta obtener la sentildeal de mayor intensidad para cada uno de los iones producto Por
uacuteltimo una vez optimizado el voltaje de cono y la energiacutea de colisioacuten se seleccionan las dos transiciones maacutes
intensas para llevar a cabo la cuantificacioacuten y cualificacioacuten de cada analito en modo MRM Este procedimiento se
realizoacute para la totalidad de los compuestos confirmando los datos obtenidos con los facilitados por la base de
datos Quanpedia que estaacute disponible en el software del equipo utilizado para algunos de los compuestos
considerados
Compuesto Tr (min) Ion precursor (mz Da)
Voltaje de cono (V)
Ion producto 1 (CEv)
cuantificacioacuten
Ion producto 2 (CEv)
cualificacioacuten
Relacioacuten IP2IP1
AME 325 2760 60 176 (35) 70 (50) 016
BEN 485 3261 26 148 (20) 91 (34) 067
BOS 387 3429 41 140 (20) 307 (20) 011
CAR 167 1921 33 160 (18) 132 (28) 014
CYP 311 2260 56 93 (33) 108 (25) 061
DIM 322 3881 40 301 (20) 165 (30) 057
FEH 386 3021 41 97 (22) 55 (38) 044
FEP 257 2742 55 147 (28) 86 (28) 093
FLU 401 3830 40 173 (20) 365 (15) 010
IMI 218 2561 34 209 (15) 175 (20) 091
IPR 358 3211 28 119 (16) 203 (10) 042
Tabla IV1 Tiempos de retencioacuten (Tr) relacioacuten de iones precursores (mz) voltaje de cono (V) energiacuteas de colisioacuten (CE) y relacioacuten de intensidades entre transiciones (IP2IP1)
29
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Compuesto Tr (min) Ion precursor (mz Da)
Voltaje de cono (V)
Ion producto 1 (CEv)
cuantificacioacuten
Ion producto 2 (CEv)
cualificacioacuten
Relacioacuten IP2IP1
MAN 392 4120 25 328 (16) 125 (35) 063
MET 283 2801 26 220 (13) 192 (17) 057
MYC 365 2891 34 70 (18) 125 (32) 029
PEN 417 2840 34 70 (16) 159 (34) 031
PYC 523 3881 31 194 (12) 163 (25) 066
PYM 266 2000 51 107 (24) 82 (24) 071
TEC 397 3080 40 70 (22) 125 (40) 007
TEF 473 3531 19 133 (20) 297 (8) 072
TBZ 182 2020 51 175 (25) 131 (30) 062
TME 203 2920 28 211 (12) 132 (22) 047
THI-M 257 3430 28 151 (46) 93 (19) 0001
TRI 319 2961 21 70 (10) 99 (15) 013
El dwell time para cada una de las transiciones se ajustoacute de manera automaacutetica por el software (MassLinx) con
objeto de obtener doce puntos espectrales por compuesto tomando un valor promedio de cuatro segundos como
ancho de pico a liacutenea de base
2 CARACTERIZACIOacuteN DEL PROCEDIMIENTO DE DETERMINACIOacuteN (UPLC-ESI-
MSMS)
Una vez optimizados los paraacutemetros que afectan a la separacioacuten cromatograacutefica (UPLC) y a la determinacioacuten por
espectrometriacutea de masas en taacutendem (MSMS) se lleva a cabo la evaluacioacuten de la repetibilidad de inyeccioacuten y
determinacioacuten en esas condiciones Se expresa por medio de la desviacioacuten estaacutendar relativa (RSD) paraacutemetro que
nos indica el grado de correlacioacuten que existe entre varias medidas del mismo patroacuten realizadas por el mismo
operador en el laboratorio y en el mismo equipo de medida a lo largo de un diacutea Para el estudio se realizan diez
inyecciones con volumen de 15 microL de dos patrones con distintos niveles de concentracioacuten 5 y 20 ngmL Los
datos de RSD (Tabla IV2) para las aacutereas de pico de los analitos se situacutean para el nivel de concentracioacuten 5 ngmL
en el rango 2-13 y en el nivel de concentracioacuten 20 ngmL en el rango 1-7
30
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten Tabla IV2 Desviacioacuten estaacutendar relativa (RSD) del aacuterea de pico (transicioacuten de cuantificacioacuten) para evaluar la repetivilidad del proceso de LC-MSMS
Compuesto RSD
5 ngmL
RSD
20 ngmL Compuesto
RSD
5 ngmL
RSD
20 ngmL
AME 5 2 MET 3 2
BEN 2 2 MYC 9 2
BOS 4 5 PEN 4 4
CAR 4 2 PYC 3 1
CYP 5 7 PYM 7 3
DIM 6 5 TEC 3 2
FEH 7 4 TEF 4 2
FEP 4 2 TBZ 2 1
FLU 5 3 TME 6 6
IMI 13 7 THI-M a 6
IPR 8 2 TRI 8 6
MAN 3 2
A continuacioacuten tambieacuten se evaluoacute la repetibilidad de los tiempos de retencioacuten (Tr) para diez inyecciones de
patrones a los dos niveles de concentracioacuten 5 y 20 ngmL situaacutendose las RSD para todos los compuestos en el
rango 01-03 En base a este dato la ventana de tiempo en la que se registran las transiciones de MRM de cada
compuesto se fijoacute en 05 min lo que es lo mismo 025 min alrededor del valor medio de su tiempo de retencioacuten
Por otro lado la linealidad del meacutetodo se estudioacute a nueve niveles de concentracioacuten diferentes comprendidos ente
los niveles 05 ngmL y 200 ngmL mediante la inyeccioacuten de disoluciones patroacuten de los distintos compuestos de
estudio Se realizoacute una evaluacioacuten sin y otra con patroacuten interno (IS) antildeadiendo una concentracioacuten fija de patrones
internos a nivel de 25 ngmL y pudimos observar que los resultados mejoran notablemente al realizar una
correccioacuten con el IS En la Tabla IV3 se muestran los coeficientes de determinacioacuten (R2) obtenidos al realizar la
correccioacuten mediante IS observando que para todos los compuestos excepto para THI-M y para TRI los
coeficientes de correlacioacuten son superiores a 0990 por lo que existe una respuesta lineal en el rango de
concentraciones que hemos estudiado
Aparte del estudio de la linealidad tambieacuten se han estudiado los liacutemites de cuantificacioacuten instrumentales del
meacutetodo (LOQs) Para ello los LOQs se evaluacutean como la miacutenima cantidad de analito que origina una sentildeal 10
veces superior a la desviacioacuten estaacutendar del ruido Los valores anteriores se estimaron a partir del patroacuten de
a no evaluado ya que se encuentra por debajo del liacutemite de cuantificacioacuten del meacutetodo
31
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
concentracioacuten maacutes baja que presenta un pico con una relacioacuten SN superior a 10 En la Tabla IV3 tambieacuten se
recogen estos LOQs en doacutende podemos ver que variacutean en el rango 01-1 ngmL excepto para THI-M que se
desviacutea a valores de 10 ngmL
Tabla IV3 Coeficientes de determinacioacuten (R2) y liacutemites de cuantificacioacuten instrumentales (LOQs) de los analitos para nueve
niveles de concentracioacuten de 05 a 200 ngmL
Compuesto Coeficiente de
correlacioacuten (R2)
LOQs (ngmL) Compuesto
Coeficiente de correlacioacuten
(R2)
LOQs (ngmL)
AME 09951 04 MET 09933 01
BEN 09949 01 MYC 09950 04
BOS 09979 02 PEN 09945 02
CAR 09923 02 PYC 09955 02
CYP 09878 02 PYM 09931 01
DIM 09938 07 TEC 09958 05
FEH 09959 05 TEF 09957 01
FEP 09931 01 TBZ 09942 02
FLU 09965 02 TME 09903 01
IMI 09979 05 THI-M 09580 100
IPR 09938 01 TRI 09867 07
MAN 09979 01
En la Figura IV1 y Figura IV2 se muestran dos ejemplo de curvas de calibrado para dos compuestos IMI y
MAN respectivamente
Figura IV1 Curva de calibrado y coeficiente de determinacioacuten de IMI para UPLC-ESI-MSMS
32
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Figura IV2 Curva de calibrado y coeficiente de determinacioacuten de MAN para UPLC-ESI-MSMS
3 ESTUDIO DEL MEacuteTODO SPE
La extraccioacuten de pesticidas se llevoacute a cabo mediante extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) en doacutende se realizaron
diversos estudios con diferentes condiciones para dar con las oacuteptimas En primer lugar se llevaron a cabo los
experimentos de retencioacuten y elucioacuten sobre dos tipos distintos de adsorbentes cartuchos OASIS HLB (200mg) y
cartuchos OASIS MAX (150 mg) como fases potenciales en las que llevar a cabo la extraccioacuten de manera
selectiva Los dos tipos de cartuchos son de fase reversa pero difieren entre siacute en el fundamento de retencioacuten de
los analitos En los cartuchos OASIS HLB (200 mg) formados por divinilbenceno-N-vinilpirrolidona (DVB-VP)
la retencioacuten de los diferentes analitos tiene lugar por interacciones π-π o de Van der Waals mientras que los
cartuchos OASIS MAX (150 mg) que se probaron como alternativa para mejorar la selectividad en la extraccioacuten
cuentan con un adsorbente polimeacuterico de modo mixto formado por divinilbenceno-N-vinilpirrolidona (DVB-VP)
funcionalizado con grupos amina cuaternaria siendo el fundamento de la extraccioacuten la combinacioacuten de las
propiedades adsorbentes del cartucho HLB con un mecanismo adicional de intercambio ioacutenico (anioacutenico) [27]
Algunos autores han empleado este mecanismo para mejorar la selectividad de la extraccioacuten de forma que en la
etapa de elucioacuten ciertos pigmentos del vino quedan fuertemente retenidos en el adsorbente a diferencia de lo que
ocurre con los adsorbentes de fase reversa [51]
Para llevar a cabo la eleccioacuten del tipo de adsorbente se realizaron pruebas con 10 mL de vino blanco y tinto
conectando en serie los dos tipos de cartuchos HLB (200 mg) y MAX (150 mg) a un segundo cartucho OASIS
HLB (60 mg) La elucioacuten de los analitos se hace de forma independiente para cada cartucho y se evaluacutea si los
analitos pasan del primer cartucho hacia el segundo cartucho es decir si se supera el volumen de corte o si por
33
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
otro lado se quedan retenidos en el primero y no eluyen hacia el segundo En estas pruebas de estudio
preliminares de preparacioacuten de la muestra no se ha incluido el CYP
En la Figura IV3 podemos ver la eficacia de la extraccioacuten para vino blanco y tinto que obtenemos empleando
cartuchos OASIS MAX (150 mg) conectados en serie con cartuchos OASIS HLB (60 mg) realizando la
extraccioacuten de tres fracciones de 2 mL cada una del cartucho OASIS MAX (150 mg) y una cuarta fraccioacuten de 2
mL del cartucho OASIS HLB (60 mg)
Por otro lado en la Figura IV4 podemos ver un graacutefico de columnas en el cual comparamos la eficacia de
extraccioacuten de los cartuchos OASIS HLB (200 mg) con dos disolventes de elucioacuten distintos En dicho graacutefica el
acroacutenimo de cada compuesto consta de dos barras cuyo significado es el siguiente la barra de la izquierda indica
la eficacia de la extraccioacuten empleando acetonitrilo (ACN) como disolvente de elucioacuten y la barra de la derecha
indica la eficacia de la extraccioacuten empleando la combinacioacuten MetanolAcetonitrilo (2080) (MeOHACN) como
disolvente de elucioacuten Para este adsorbente no se detectoacute ninguacuten compuesto en la extraccioacuten del segundo
cartuchos OASIS HLB (60 mg) empleando 2 mL de metanol
Figura IV3 Distribucioacuten de los compuestos en cada fraccioacuten obtenidas con cartuchos OASIS MAX (150 mg)
utilizando 10 mL de vino tinto y blanco sacando cuatro fracciones de 2 mL cada una con metanol como
disolvente de elucioacuten
34
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Figura IV4 Distribucioacuten de los compuestos en cada fraccioacuten obtenidas con cartuchos OASIS HLB (200 mg) utilizando 10
mL de vino tinto y blanco sacando 3 fracciones de 2 mL cada una con acetonitrilo (ACN) (columna de la izquierda) y una
combinacioacuten MetanolAcetonitrilo (2080) (MeOHACN) (columna de la derecha) como disolventes de elucioacuten
A la vista de los resultados reflejados en las graacuteficas podemos afirmar que cuando se utiliza el cartucho OASIS
HLB (200 mg) eluyendo con acetonitrilo o la combinacioacuten metanolacetonitrilo (2080) los extractos son limpios
y se eluyen la mayoriacutea de los compuestos en la primera fraccioacuten Pero utilizando acetonitrilo como disolvente de
elucioacuten se encuentran problemas en la extraccioacuten de CAR FEH y TBZ para los que es necesario emplear un
volumen mayor de elucioacuten o bien seleccionar otro disolvente de elucioacuten como es la combinacioacuten
metanolacetonitrilo
35
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Por otro lado los extractos en los cartuchos OASIS MAX (150 mg) son maacutes limpios incluso utilizando metanol en
la elucioacuten pero se detecta la presencia de CAR FEP TBZ y TME en el segundo cartucho OASIS HLB (60 mg)
significando la rotura del primer cartucho para dichos analitos considerando un volumen de 10 mL de vino Los
demaacutes compuestos se podriacutean recuperar cuantitativamente en la primera fraccioacuten sacada pero la peacuterdida de estos
compuestos inclina la eleccioacuten hacia los cartuchos OASIS HLB (200 mg) con metanolacetonitrilo (2080) como
disolvente de elucioacuten para continuar con el estudio
Una vez fijado el adsorbente y el volumen de elucioacuten se prueba la eficacia de la SPE independiente de los efectos
de matriz En la Tabla IV4 se muestran las recuperaciones de la SPE tomando 10 mL de vino blanco y tinto
con un nivel de adicioacuten de 15 ngmL sacando una sola fraccioacuten de 2 mL con la combinacioacuten
metanolacetonitrilo (2080) y n=3 reacuteplicas
Tabla IV4 Recuperaciones (R plusmn SD) de SPE para 10 mL de vino (blanco y tinto) con un nivel de adicioacuten de 15 ngmL y
n=3 reacuteplicas
Compuesto Vino Tinto
R plusmn SD
Vino Blanco
R plusmnSD Compuesto
Vino Tinto
R plusmn SD
Vino Blanco
R plusmn SD
AME 82 plusmn 7 100 plusmn 1 MET 92 plusmn 6 94 plusmn 3
BEN 89 plusmn 6 97 plusmn 3 MYC 90 plusmn 9 86 plusmn 4
BOS 95 plusmn 1 100 plusmn 2 PEN 84 plusmn 10 103 plusmn 3
CAR 91 plusmn 6 104 plusmn 6 PYC 86 plusmn 5 106 plusmn 1
CYP 81 plusmn 7 102 plusmn 3 PYM 87 plusmn 12 94 plusmn 3
DIM 97 plusmn 3 86 plusmn 4 TEC 83 plusmn 10 103 plusmn 1
FEH 89 plusmn 3 88 plusmn 3 TEF 84 plusmn 5 108 plusmn 4
FEP 91 plusmn 7 104 plusmn 3 TBZ 88 plusmn 7 92 plusmn 5
FLU 91 plusmn 2 97 plusmn 4 TME 101 plusmn 1 110 plusmn 13
IMI 117 plusmn 8 101 plusmn 11 THI-M 85 plusmn 9 110 plusmn 4
IPR 89 plusmn 7 112 plusmn 4 TRI 85 plusmn 10 110 plusmn 4
MAN 88 plusmn 2 87 plusmn 2
Algunos compuestos de la matriz en el vino pueden competir con los analitos durante el proceso de ionizacioacuten
que tiene lugar en la interfase entre UPLC-MSMS por lo que para la cuantificacioacuten del rendimiento de la
ionizacioacuten por electrospray (ESI) se estudian los efectos de matriz (EM) para vino blanco y tinto considerando
dos voluacutemenes de muestra distintos 2 y 10 mL y un volumen final del extracto de 2 mL En la Tabla IV5 se
36
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
exponen los valores para cada compuesto notando que al aumentar el volumen de muestra tambieacuten se aumentan
los efectos de matriz y eacutestos siempre son mayores en vino tinto Para el caacutelculo de estos efectos de matriz (EM)
se emplea la siguiente ecuacioacuten
Donde Am Ab y Ap representan el aacuterea de pico en la sentildeal medida del analito en el extracto de la muestra con
adicioacuten en el extracto de la muestra sin adicioacuten (o blanco) y en el patroacuten antildeadido respectivamente El nivel de
adicioacuten en extracto fue de 50 ngmL por compuesto
Tabla IV5 Efectos de matriz para vino blanco y tinto con un volumen inicial de 2 y 10 mL evaluados para un nivel de adicioacuten de 50 ngmL en extracto
Compuesto
Vino blanco Vino tinto
2 mL 10 mL 2mL 10 mL
EM () CV () EM () CV () EM () CV () EM () CV()
AME 93 3 95 2 99 3 101 7
BEN 99 1 93 2 101 3 100 6
BOS 97 5 98 1 108 2 96 0
CAR 62 2 50 3 58 2 55 6
CYP 94 3 91 1 97 2 95 7
DIM 105 2 95 3 100 3 108 3
FEH 100 4 102 4 105 4 94 3
FEP 95 3 88 2 96 2 92 7
FLU 98 2 93 2 106 1 101 2
IMI 84 4 46 3 48 10 18 8
IPR 99 3 92 3 105 1 100 7
MAN 100 1 94 3 109 4 107 2
MET 98 1 89 1 99 2 99 6
MYC 105 1 100 1 103 2 96 9
PEN 98 3 97 1 101 3 99 10
PYC 98 2 92 3 102 2 98 5
PYM 95 2 87 1 94 3 85 12
TEC 95 3 99 1 101 1 102 10
TEF 99 1 92 3 101 2 104 5
TBZ 45 0 40 5 43 2 30 7
TME 60 6 19 16 36 4 16 1
THI-M 107 2 109 2 103 1 96 9
TRI 97 3 118 4 104 5 117 10
37
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Al observar los resultados podemos ver que la mayoriacutea de los compuestos dan resultados de EM en torno al
100 lo que significa que no sufren una modificacioacuten importante en la eficacia de ionizacioacuten para las muestras
con respecto a los patrones Pero tambieacuten por el contrario podemos observar que algunos compuestos como
por ejemplo en el caso de CAR TBZ IMI y TME experimentan una gran supresioacuten de sentildeal es decir EM bajos
que se acentuacutean al aumentar el volumen de muestra La atenuacioacuten en la eficacia de variacioacuten para estos cuatro
compuestos no solo se ve incrementada con el volumen de muestra si no que ademaacutes es maacutes significativa para
vino tinto que para vino blanco En base a estos resultados aunque la eficacia de la SPE fue cuantitativa para
muestras de 10 mL se limitoacute el volumen de muestra a extraer a 2 mL
Las condiciones oacuteptimas de extraccioacuten se esquematizan en un resumen en la Figura IV5
Figura IV5 Condiciones optimizadas para la extraccioacuten de pesticidas en vino
38
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
4 CARACTERIZACIOacuteN DEL MEacuteTODO DE DETERMINACIOacuteN
Con las condiciones de extraccioacuten y determinacioacuten citadas anteriormente se llevaron a cabo pruebas de
recuperaciones absolutas de los compuestos a nivel de adicioacuten de 5 y 20 ngmL sobre las muestras Para cada
muestra y nivel de adicioacuten se realizaron tres reacuteplicas de las muestras con adicioacuten y los blancos aliacutecuotas de las
mismas muestras sin adicioacuten se procesaron en duplicado Los IS se antildeadieron a nivel de 25 ngmL y cada uno se
utiliza para corregir unos determinados compuestos CAR-d3 se emplea para CAR y TBZ el CYP-d5 para CYP y
PYM el IMID-d4 para IMI y TME y el MET13C6 para el resto de compuestos Los resultados para vino blanco
comprenden en el nivel de concentracioacuten 5 ngmL el rango entre 79-122 y en el nivel de concentracioacuten 20
ngmL el rango entre 84-109 Por otro lado en el caso del vino tinto las recuperaciones se encuentran para el
nivel de concentracioacuten 5 ngmL en el rango 67-112 y para el nivel de concentracioacuten 20 ngmL entre el rango
73-132 Los resultados obtenidos en las pruebas con vino blanco y vino tinto se muestran en la Tabla IV6
Los resultados son satisfactorios ya que la mayoriacutea de los compuestos se ajustan en todos los casos al rango de
recuperacioacuten entre 70-120 Para la realizacioacuten de estas pruebas se ha eliminado de los resultados el compuesto
THI-M debido a que las concentraciones utilizadas se encuentran en el liacutemite o por debajo del LOQ en los
experimentos con muestras adicionadas a 5 ngmL
Para calcular las recuperaciones (R) se recurrioacute a la siguiente ecuacioacuten
Donde Cm Cb y Cp son la concentracioacuten medida de analito en el extracto de la muestra con adicioacuten en el extracto
de la muestra sin adicioacuten (o blanco) y en el patroacuten antildeadido respectivamente
Tabla IV6 Recuperaciones (R) para vino tinto y vino blanco evaluadas para dos niveles de concentracioacuten 5 y 20 ngmL
Compuesto
Vino tinto Vino Blanco
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
AME 97 3 105 6 104 9 96 5
BEN 88 11 105 3 101 1 98 4
BOS 91 13 110 2 88 13 97 3
39
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Compuesto
Vino tinto Vino blanco
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
CAR 99 6 99 3 122 3 109 1
CYP 91 2 111 1 101 4 100 6
DIM 112 3 110 9 102 24 99 11
FEH 91 4 108 0 102 20 95 2
FEP 89 8 102 7 94 5 84 1
FLU 95 10 104 4 109 5 100 8
IMI 73 11 115 9 80 13 100 2
IPR 84 13 99 3 111 3 99 4
MAN 88 22 112 8 112 3 99 4
MET 99 3 106 5 106 3 98 2
MYC 84 9 106 13 88 17 86 3
PEN 84 9 102 5 84 8 90 5
PYC 96 6 105 4 100 2 95 4
PYM 90 12 112 14 106 4 97 1
TEC 89 8 101 6 98 12 94 1
TEF 93 10 102 5 107 2 97 3
TBZ 94 17 115 8 79 5 106 2
TME 67 2 101 7 84 18 90 11
THI-M ne - 74 7 ne - 89 24
TRI 88 12 97 6 102 6 92 2
ne No evaluado El nivel de adicioacuten es inferior al LOQ del meacutetodo para este compuesto
Para estudiar la reproducibilidad del meacutetodo analiacutetico global (correspondientes a los datos de preparacioacuten de
muestra y determinacioacuten) es decir la concordancia de varias medidas realizadas en diacuteas diferentes se procedioacute a la
extraccioacuten en las condiciones oacuteptimas tanto de vino blanco como tinto Las extracciones y determinaciones se
realizaron durante tres diacuteas consecutivos realizando tres reacuteplicas por vino y por diacutea con un nivel de adicioacuten en
muestra de 10 ngmL un blanco de muestra cada diacutea En la Tabla IV7 se muestran los resultados como
recuperaciones (R) en condiciones de reproducibilidad obtenidos para ambos tipos de vino dando valores entre
64-116 para muestras de vino blanco y valores situados entre 68-108 para muestras de vino tinto con la
excepcioacuten del TME para el que se ha obtenido un valor no aceptable en cuanto a la exactitud medida en
condiciones de reproducibilidad A la vista de los resultados obtenidos con estas pruebas se considera necesario el
empleo de IS adicionales para la mejora en la exactitud del meacutetodo para algunos compuestos por ejemplo el
TME
40
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Tabla IV7 Recuperaciones en condiciones de reproducibilidad (R plusmn SD) para vino blanco y tinto
Compuesto
Vino tinto Vino blanco
R
10 ngmL CV ()
R
10 ngmL CV ()
AME 90 5 101 13
BEN 96 5 102 7
BOS 97 6 100 8
CAR 97 3 94 5
CYP 103 3 105 12
DIM 104 7 106 8
FEH 90 16 83 15
FEP 91 5 90 4
FLU 103 7 102 6
IMI 99 14 101 14
IPR 91 5 100 13
MAN 108 5 108 13
MET 101 5 101 5
MYC 105 16 102 14
PEN 96 11 92 10
PYC 99 12 97 12
PYM 102 4 116 8
TEC 99 9 97 16
TEF 99 8 105 11
TBZ 68 4 84 5
TME 47 13 64 10
THI-M 107 11 104 16
TRI 95 14 103 4
En la Tabla IV8 se muestran los liacutemites de cuantificacioacuten (LOQs) del meacutetodo del meacutetodo de SPE-UPLC-ESI-
MSMS obtenidos para los diferentes pesticidas Los valores obtenidos son ideacutenticos a los LOQs instrumentales
excepto en el caso de aquellos compuestos para los que se observaronfuertes efectos de matriz (Tabla IV5) En
estos casos (CAR TBZ IMI y TME) los LOQs del meacutetodo se incrementan seguacuten la atenuacioacuten de sentildeal
observada
41
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Tabla IV8 Liacutemites de cuantificacioacuten LOQs (ngmL) del meacutetodo obtendos para cada compuesto
Compuesto LOQ (ngmL) Compuesto LOQ (ngmL)
AME 04 MET 01
BEN 01 MYC 04
BOS 02 PEN 02
CAR 03 PYC 02
CYP 02 PYM 01
DIM 07 TEC 05
FEH 05 TEF 01
FEP 01 TBZ 04
FLU 02 TME 02
IMI 06 THI-M 10
IPR 01 TRI 07
MAN 01
5 APLICACIOacuteN A MUESTRAS DE VINO COMERCIALES
Una vez optimizadas las condiciones del meacutetodo y estudiadas las caracteriacutesticas del meacutetodo desarrollado se aplicoacute
a la determinacioacuten de los compuestos de intereacutes estudiados en muestras de vino blanco y vino tinto comerciales
producidos en diferentes paiacuteses En la Tabla IV9 se muestra el paiacutes de origen de cada muestra comercial
identificadas con un coacutedigo alfanumeacuterico y antildeo de produccioacuten
42
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Tabla IV9 Coacutedigo asignado para los diferentes vinos comerciales blancos y tintos analizados Indicando el paiacutes de origen y
antildeo de produccioacuten
Coacutedigo Denominacioacuten de origen Antildeo de produccioacuten
bull Vinos Blancos
W1 Alemania 2014
W2 Espantildea 2012
W3 Espantildea 2016
W4 Portugal Desconocido
W5 Francia 2015
W6 Francia 2015
W7 Espantildea 2016
bull Vinos Tintos
R1 Espantildea 2015
R2 Sudaacutefrica 2015
R3 Chile 2015
R4 Francia 2015
R5 China Desconocido
R6 Espantildea 2016
R7 Australia 2014
R8 Francia 2013
R9 Francia 2015
A continuacioacuten en la Tabla IV10 y la Tabla IV11 se recogen los resultados obtenidos en el anaacutelisis de las
muestras comerciales Los datos obtenidos corresponden en todos los casos al uso de patrones de calibracioacuten
como teacutecnica de cuantificacioacuten
Tabla IV10 Concentracioacuten (ngmL) encontradas en las diferentes muestras de vino blanco comercial analizadas mediante
SPE-UPLC-MSMS n=2 reacuteplicas y al final el sumatorio de las concentraciones encontradas
Compuesto W1 W2 W3 W4 W5 W6 W7
AME 04 nd nd nd 41 nd nd
BEN nd nd 14 nd nd nd nd
BOS 84 102 520 54 197 nd nd
CAR nd 115 56 nd nd nd nd
CYP 08 59 112 nd nd 26 nd
43
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Compuesto W1 W2 W3 W4 W5 W6 W7
DIM 14 84 400 09 32 50 nd
FEH 85 809 639 15 187 nd nd
FLU 11 05 92 nd 77 32 nd
IMI nd 136 88 29 nd nd 69
IPR 30 749 1144 14 nd nd nd
MAN nd nd nd nd nd 30 nd
MET 04 273 494 63 nd nd 172
MYC 09 nd 35 nd nd nd nd
PYM 15 469 584 08 24 35 nd
TEC 11 nd 58 nd nd nd nd
TRI nd 67 61 nd nd nd nd
sumconcentracioacuten
(ngmL) 274 2868 4358 192 558 173 862
nd no detectado
Tabla IV11 Concentracioacuten (ngmL) encontradas en las diferentes muestras de vino tinto comercial analizadas mediante
SPE-UPLC-MSMS n= 2 reacuteplicas y al final el sumatorio de las concentraciones encontradas
Compuesto R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9
AME nd nd nd 30 nd nd nd nd 16
BEN nd nd nd 07 nd nd nd nd nd
BOS nd 55 21 196 nd nd nd 73 21
CAR nd nd 04 17 249 20 nd nd nd
CYP 34 08 02 22 nd 136 nd 85 nd
DIM nd 33 nd 52 233 46 nd 61 23
FEH nd nd nd 1070 nd 10 nd 1307 14
FLU nd nd nd 20 nd nd nd nd nd
IPR 16 nd nd 17 nd 22 nd nd nd
MAN nd nd nd 17 nd nd nd 20 nd
MET 126 nd nd 14 55 313 30 44 39
MYC nd nd nd 05 nd 32 nd nd nd
PYM 19 nd 03 185 49 281 nd 24 nd
TEC 25 06 39 29 nd nd nd 21 20
TEF nd 01 12 nd nd nd nd nd nd
sumconcentracioacuten
(ngmL) 220 48 81 1681 586 860 30 1635 133
nd no detectado 44
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
En los resultados de los anaacutelisis podemos observar que en ninguna de las muestras comerciales de vino blanco
aparecieron los siguientes compuestos FEP PEN PYC TEF TBZ THI-M y TME y en los vinos tintos
comerciales no aparece a ninguna concentracioacuten FEP IMI PEN PYC TBZ TME THI-M y TRI No se
detectaron para dichas muestras de vino a niveles superiores a los LOQs del meacutetodo propuesto
Cuando se detecta un compuesto positivo se compara el pico cromatograacutefico del compuesto con el de un patroacuten
verificando la coincidencia del tiempo de retencioacuten (maacutexima diferencia 01 min) y la relacioacuten entre transiciones
(maacutexima diferencia 30 ) En la Figura IV6 y la Figura IV7 se muestran los cromatogramas para el compuesto
CYP obtenido en condiciones oacuteptimas para la muestra de vino blanco W6 y en un patroacuten de 5 ngmL
respectivamente En este caso el intervalo de tolerancia para la relacioacuten de intensidad entre transiciones es
IP2IP1=061plusmn018
Figura IV6 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el CYP en la muestra W6 (26 ngmL) Transicioacuten
superior 226gt93 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 226gt108 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades IP2IP1= 066
Figura IV7 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el CYP en un patroacuten de 5 ngmL Transicioacuten
superior 226gt93 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 226gt108 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades IP2IP1=061plusmn018
45
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Otro ejemplo de compuesto positivo en abundantes muestras comerciales de estudio es el Metalaxyl positivo con
una concentracioacuten de 04 ngmL en el vino con referencia W1 (Figura IV8) y positivo con una concentracioacuten de
313 ngmL en el vino con referencia R6 (Figura IV9) Ambas se comparan con el cromatograma de un patroacuten
de Metalaxyl de 1 ngmL (Figura IV10) El grado de concordancia en los tiempos de retencioacuten y la relacioacuten de
intensidades entre transiciones es satisfactorio
Figura IV8 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el MET en la muestra W1 (04 ngmL) Transicioacuten
superior 2801gt2201 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 2801gt1921 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades
IP2IP1=056
Figura IV9 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el MET en la muestra R6 (313 ngmL) Transicioacuten
superior 2801gt2201 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 2801gt1921 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades IP2IP1=
056
46
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Figura IV10 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el MET en un patroacuten de 1 ngmL Transicioacuten
superior 2801gt2201 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 2801gt1921 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades
IP2IP1=057plusmn017
Es de destacar que aunque se detectaron bastantes pesticidas en las diferentes muestras de vino comerciales pero
en ninguacuten caso superaron el 10 de los LMRs permitidos en uvas tal y como se recomienda ya que todaviacutea no
existen LMRs para vino en la legislacioacuten vigente No obstante el nivel total de concentracioacuten (sumatorio de
concentraciones Tabla IV10 y Tabla VI11) es significativo para varias muestras tanto de vinos blancos (W2 y
W3) como tintos (R4 y R8)
47
Capiacutetulo V Conclusiones
CAPIacuteTULO V CONCLUSIONES
En este trabajo se ha estudiado un meacutetodo para la cuantificacioacuten de pesticidas concretamente veinte fungicidas y
tres insecticidas en vino blanco y tinto En la etapa de preparacioacuten de muestra se optimizoacute la extraccioacuten en fase
soacutelida (SPE) utilizando cartuchos OASIS HLB (200 mg) compuestos por divinilbenceno-N-vinilpirrolidona
(DVB-VP) como adsorbente Como teacutecnica de determinacioacuten se utilizoacute cromatografiacutea de liacutequidos con una
interfase de electroespray acoplada a espectrometriacutea de masas (UPLC-ESI-MSMS)
Las conclusiones generales obtenidas a partir de los resultados de este proyecto relativo a la determinacioacuten de
fitosanitarios en vino son
Ante los problemas de retencioacuten que presentan los cartuchos OASIS MAX (150 mg) para algunos
compuestos los cartuchos OASIS HLB (200 mg) junto con la combinacioacuten metanolacetonitrilo (2080)
como disolvente de elucioacuten son elegidos como mejor opcioacuten en la extraccioacuten en fase soacutelida de pesticidas
en muestras con matrices complejas como es el caso del vino Asiacute se consigue la retencioacuten selectiva de
componentes de la matriz y proporciona extractos con menor porcentaje de interferencias
El meacutetodo estudiado y optimizado se puede aplicar tanto a vinos blancos como a vinos tintos procesados
a partir de distintas variedades de uvas
Los liacutemites de cuantificacioacuten (LOQs) del estudio se situacutean la mayoriacutea por debajo de 10 ngmL excepto
en el caso de THI-M que asciende al valor de 20 ngmL El rango de respuesta lineal abarca hasta 200
ngmL y el tiempo de anaacutelisis ha sido de solo 10 minutos por muestra
En todas las muestras de vino (blancos y tintos) comerciales analizadas se han detectado la presencia de
varios pesticidas sin embargo todas las concentraciones encontradas se encuentran por debajo del 10
de los LMRs fijados en uvas tal y como recomienda la legislacioacuten por lo que no se considera
preocupante
48
Capiacutetulo V Conclusioacutens
CAPIacuteTULO V CONCLUSIOacuteNS
Neste traballo estudouse un meacutetodo para a cuantificacioacuten de pesticidas en particular vinte funxicidas e tres
insecticidas en vintildeo branco e maacuteis tinto No paso da preparacioacuten da mostra optimizouse a extraccioacuten en fase
soacutelida (SPE) empregando cartuchos OASIS HLB (200 mg) compostos por divinilbenceno-N-pirrolidona (DVB-
VP) como adsorbente Para a teacutecnica de determinacioacuten utilizouse cromatografiacutea de liacutequidos con unha interfase de
electroespray acoplada a espectrometriacutea de masas (UPLC-ESI-MSMS)
As conclusioacutens xerais a obtidas a partir dos resultados deste proxecto relativo aacute determinacioacuten de pesticidas en
vintildeo son
Ante os problemas de retencioacuten que mostraban os cartuchos OASIS MAX (150 mg) para alguacuten
compostos os cartuchos OASIS HLB (200 mg) en conxunto coa mistura metanolacetonitrilo (2080)
como disolvente de elucioacuten son elexidos como mellor opcioacuten na extraccioacuten en fase soacutelida de pesticidas
en mostras con matrices complexas como eacute o caso do vintildeo Asiacute eacute conseguida a retencioacuten selectiva de
componentes da matriz e proporciona extractos con menos porcentaxe de interferencias
O meacutetodo estudado e optimizado poacutedese aplicar tanto a vintildeos brancos coma tintos procesados a partir de
diferentes variedades de uvas
Os liacutemites de cuantificacioacuten do estudo (LOQs) son maacuteis baixos de 10 ngmL agaacutes no caso do THI-M
que ascende ao valor de 20 ngmL O rango de resposta lineal cobre ata 200 ngmL e o tempo de anaacutelise
foi de soacute 10 minuacutetos por mostra
En todas as mostras de vintildeo (brancos e tintos) comercial analizadas detectouse a presenza de varios
pesticidas maacuteis poreacuten todas as concentracioacutens atopadas son inferiores ao 10 dos LMR fixados en uvas
tal e como recomenda a lexislacioacuten polo que non se considera preocupante
49
Chapter V Conclusions
CHAPTER V CONCLUSIONS
In this work we have studied a method for the quantification of pesticides specifically twenty fungicides and
three insecticides in white and red wine In the sample preparation step the solid phase extraction was optimized
using cartridges OASIS HLB (200 mg) containing divinylbenzene-N-vinylpyrrolidone (DVB-VP) as adsorbent
As determination technique ultraperformance liquid chromatography was used with an electrospray interface
coupled to mass spectrometry (UPLC-ESI-MS7MS)
The general conclusions drawn from the results of this project concerning the determination of pesticides in wine
are
Due to the retention problems presented by the OASIS MAX sorbent (150 mg) for some compounds of
this project the cartridges OASIS HLB (200 mg) together with the methanolacetonitrile (2080) mixture
are chosen as the best option in the solid phase extraction of pesticides in samples with complex
matrices as is the case with the wine
The method studied and optimized can be applied to both white and red wines obtained from different
varieties of grapes
The limits of quantification (LOQs) were below 10 ngmL for most of the compounds except in the
case of THI-M with a LOQ of to 10 ngmL The linear response range covers up to 200 ngmL and the
analysis time was only 10 minutes per sample
In all commercial wine samples (white and red) analyzed the presence of several pesticides was
conformed however all the concentrations obtained are below 10 of the Maximum residue
levels(MRLs) fixed in grapes as recommended by legislation
50
VI Bibliografiacutea VI BIBLIOGRAFIacuteA [1] Ministerio de agricultura y pesca alimentacioacuten y medio ambiente mhttpwwwmapamagobesescalidad-y-evaluacion-ambientaltemasproductos-quimicosfitosanitarios (Acceso el diacutea 11052017) [2] httpwwwcricyteduarenciclopediaterminosProducFitohtm (Acceso el diacutea 11052017) [3] WERNER BALTES ldquoQuiacutemica de los alimentosrdquo Editorial Acribia SA 2007 Capiacutetulo 11 ldquoResiduos en los alimentosrdquo paacuteginas 206-217
[4] RLabrada JCCaseley CParker ldquoESTUDIO FAO PRODUCCIOacuteN Y PROTECCIOacuteN VEGETAL 120rdquo Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentacioacuten Roma 1996 ISSN 1014- Capiacutetulo 10 Herbicidas httpwwwfaoorgdocrepT1147St1147s00htmContents (Acceso el diacutea 12052017)
[5] Taberner Palou Andreu Cirujeda Ranzenberger Alicia Zaragoza Larios Carlos ldquoManejo de poblaciones de malezas resistentes a herbicidasrdquo (FAO Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura) 100 preguntas sobre resistencia PDF sacado de httpwwwfaoorg3a-a1422spdf (Acceso el diacutea 12052017) [6] BISSET Juan A Uso correcto de insecticidas control de la resistencia Revista Cubana de Medicina Tropical 2002 vol 54 no 3 p 202-219 [7] DEVINE Gregor J EZA Dominique Ogusuku Elena FURLONGMichael J Uso de insecticidas contexto y consecuencias ecoloacutegicas Revista peruana de medicina experimental y Salud Puacuteblica 2008 vol 25 no 1 p 74-100 [8] Ministerio de agricultura y ganaderiacutea (proteccioacuten agropecuaria servicio de diagnoacutestico fitosanitario) de costa Rica httpwwwmaggocrbibliotecavirtualH20-5054pdf (Acceso el diacutea 11052017) [9] GEPP V MONDINO P Control quiacutemico 2011 PDF obtenido de httpwwwpvfagroeduuyfitopatodocscursosfitopatoMaterialesGuiasC-QUIMICOpdf (Acceso el diacutea 772017) [10] ROSSLENBROICH Hans-Juergen STUEBLER Dietrich Botrytis cinereamdashhistory of chemical control and novel fungicides for its management Crop Protection 2000 vol 19 no 8 p 557-561 [11] Figura 11 httpwwwvitiviniculturanetbotritis-o-podredumbre-gris-botrytis-cinerea-pershtml (Acceso el diacutea 12052017) [12] CAMPBELL Paul BENDEK Carlos LATORRE Bernardo A Riesgo de oiacutedio (Erysiphe necator) de la vid en relacioacuten con el desarrollo de los racimos Ciencia e investigacioacuten agraria 2007 vol 34 no 1 p 5-11 [13] ldquoCoacutemo combatir el oiacutedio de la vidrdquo Jose Javier Peacuterez de Obanos Castillo PDF sacado de httpswwwnavarraesNRrdonlyres05E65D9B-D1A2-4EAD-9A63-AFF1D3215552135109Comocombatireloidiodelavidpdf (Acceso el diacutea 12052017) [14] Imagen 12 sacadas las 3 de httpwwwvitiviniculturanetoidio-de-la-vidhtml (Acceso el diacutea 12052017) [15] BARRIOS Gonccedilal REYES Joan Modelizacioacuten del Mildiu de la Vid 2004 httpwwwruralcatnetmigracio_resources617683_mildiusPDF (Acceso el diacutea 12052017) [16] Imaacutegenes sacadas de httpwwwvitiviniculturanetmildiu-de-la-vid-enfermedades-vinahtml (Acceso el diacutea 13052017) [17] HUQ Mainul MEISNER Craig DASGUPTA Susmita Health effects and pesticide perception as determinants of pesticide use evidence from Bangladesh httpagrisfaoorgagris-searchsearchdorecordID=US2012411738 (Acceso el diacutea 13052017)
51
IV Bibliografiacutea [18] BADII Mohammad H LANDEROS Jeroacutenimo Plaguicidas que afectan a la salud humana y la sustentabilidad CULCyT 2015 no 19 Revista vista en httpopenjournaluacjmxojsindexphpculcytarticleview454 (Acceso el diacutea 772017) [19] OLEA Nicolaacutes FERNAacuteNDEZ Mariana F Plaguicidas persistentes En Congreso Implementacioacuten del Convenio de Contaminantes Orgaacutenicos Persistentes Madrid 2001 p 26-27 [20] httpwwwfaoorgfao-who-codexalimentariusabout-codexes (Acceso el diacutea 14052017) [21] httpeceuropaeufoodplantpesticidesmax_residue_levels_en (Acceso el diacutea 14052017 [22] ORDONtildeEZ Juan A Cambero Rodriacuteguez MI Fernaacutendez Aacutelvarez L Garciacutea Sanz ML Garciacutea de Fernando Minguilloacuten GD de la Hoz Perales L Selgas Cortecero MD Tecnologiacutea de los alimentos Volumen 1 Componentes de los Alimentos y Procesos Siacutentesis Madrid 1998paacutegs 349-351 [23] CELA Rafael Casais Maria del Carmen Lorenzo Rosa Antonia Teacutecnicas de separacioacuten en quiacutemica analiacutetica Siacutentesis 2002 Capiacutetulo 11 Extraccioacuten y lixiviacioacuten por disolvente (paacutegs206-260) [24] CANTWELL Frederick F LOSIER Manon Liquidmdashliquid extraction Comprehensive Analytical Chemistry 2002 vol 37 p 297-340 [25] Imagen de LLE sacada de httpprocesosbiowikispacescomExtracciC3B3n+liquido-liquido (Acceso el diacutea 15052017) [26] HENNION Marie-Claire Solid-phase extraction method development sorbents and coupling with liquid chromatography Journal of Chromatography A 1999 vol 856 no 1 p 3-54 [27] CELA Rafael Casais Maria del Carmen Lorenzo Rosa Antonia Teacutecnicas de separacioacuten en quiacutemica analiacutetica Siacutentesis 2002 Capiacutetulo 16 Teacutecnicas de adsorcioacuten y absorcioacuten en la preparacioacuten de muestras Extraccioacuten y microextraccioacuten en fase soacutelida (paacutegs520-555) [28] Imagen spe sacada httptoxicocbblogspotcomes201310las-intoxicaciones-con-farmacoshtml (Acceso el diacutea 15052017) [29] Chaacutefer Pericaacutes Consuelo Acoplamiento microextraccioacuten en fase soacutelida-cromatografiacutea (2006) httprodericuveshandle1055014940 (Acceso el diacutea 16052017) [30] Imagen SPME httpwwwscieloorgcoscielophpscript=sci_arttextamppid=S0122-53832002000100005 (Acceso el diacutea 16052017) [31] MONTES GOYANES Rosa Mariacutea Avances en teacutecnicas de microextraccioacuten para la determinacioacuten de compuestos traza en muestras medioambientales y alimentarias Teacutesis doctoral Noviembre 2009 (Paacutegs 34-55) [32] LEHOTAY Steven J Ae Son Kyung KwonHyeyoung Koesukwiwat Urairat Fu Wusheng Mastovska Katerina Hoh Eunha Leepipatpiboon Natchanun Comparison of QuEChERS sample preparation methods for the analysis of pesticide residues in fruits and vegetables Journal of Chromatography A 2010 vol 1217 no 16 p 2548-2560 [33] Imagen QueChERS httpswwwresearchgatenetpublication279221361_QuEChERS_A_Sample_Preparation_for_Extraction_of_Carbaryl_from_Rat_Feces (Acceso el diacutea 16052017) [34] STASHENKO Elena E MARTIacuteNEZ Jairo Reneacute Preparacioacuten de la muestra un paso crucial para el anaacutelisis por GC-MS Uma publicaccedilatildeo trimestral do Instituto Internacional de Cromatografia (IIC) Ciecircncia Cromatograacutefica 2011 vol 3 no 1 [35] Imagen GC-MS httpsorgspectroscopyintblogspotcomes201411gas-chromatography-mass-spectrometry-gchtml (Acceso el diacutea 17052017) [36] httpwwwactlabscompageaspxmenu=65ampapp=221ampcat1=534amptp=2amplk=no (Acceso el diacutea 17052017)
52
IV Bibliografiacutea [37] Quintela O Cruz A Concheiro M De Castro A amp Loacutepez-Rivadulla M (2005) Metodologiacutea LC-MS Aspectos generales de la teacutecnica y sus aplicaciones en el campo de la toxicologiacutea Rev Toxicol 22 paacutegs7-14 [38] Imagen LC-MS httpsuploadwikimediaorgwikipediaenff9Liquid_chromatography_tandem_Mass_spectrometry_diagrampng (visto 18052017) [39] Vargas de la Cruz Celia Bertha Adaptacioacuten de la Metodologiacutea Analiacutetica para la determinacioacuten de residuos de plaguicidas en frutas nativas de exportacioacuten mediante Uplc-MsMs (2012) Tesis obtenida en http20062146130handlecybertesis2331 (Acceso el diacutea 772017) [40] ROMERO GONZAacuteLEZ Roberto Fernaacutendez Moreno Joseacute Luis Plaza Bolantildeos Patricia Garrido Frenich Antonia Martiacutenez Vidal Joseacute Luis Empleo de la espectrometriacutea de masas como herramienta para la determinacioacuten de toacutexicos en alimentos hacia la seguridad alimentaria Revista Espantildeola de salud puacuteblica 2007 vol 81 no 5 p 461-474 [41] PAYAacute Andrus Fundamento y Funciones de la Espectrometriacutea de Masas Universidad de Valencia Espantildea 2006 httpmuraluvescaloan (Acceso el diacutea 19052017) [42] Imagen MS sacada de httpsesslidesharenetMaYaTorrezespectrometria-demasas (Acceso el diacutea 21052017) [43] ECONOMOU Anastasios Botitsi Helen Antoniou Spyros Tsipi Despina Determination of multi-class pesticides in wines by solid-phase extraction and liquid chromatography-tandem mass spectrometry Journal of Chromatography A 2009 vol 1216 no 31 p 5856-5867 [44] FONTANA A R Rodriacuteguez I Ramil M Altamirano JC Cela R Liquid chromatography time-of-flight mass spectrometry following sorptive microextraction for the determination of fungicide residues in wine Analytical and bioanalytical chemistry 2011 vol 401 no 2 p 767-775 [45] PELAJIĆ Maja G Peček DM Pavlović DV Čepo Novel multiresidue method for determination of pesticides in red wine using gas chromatographyndashmass spectrometry and solid phase extraction Food chemistry 2016 vol 200 p 98-106 [46] Ignaz J Buerge Juumlrgen Krauss Rociacuteo Loacutepez-Cabeza Werner Siegfried Michael Stuumlssi Felix E Wettstein Thomas Poiger Stereoselective Metabolism of the Sterol Biosynthesis Inhibitor Fungicides Fenpropidin Fenpropimorph and Spiroxamine in Grapes Sugar Beets and Wheat Journal of Agricultural and Food Chemistry 2016 vol 64 no 26 p 5301-5309 [47] M Hu X Liu F Dong J Xu S Li H Xu Y Zheng Determination of ametoctradin residue in fruits and vegetables by modified quick easy cheap effective rugged and safe method using ultra-performance liquid chromatographytandem mass spectrometry Food chemistry 2015 vol 175 p 395-400 [48] WALORCZYK Stanisław DROŻDŻYŃSKI Dariusz GNUSOWSKI Bogusław Multiresidue determination of 160 pesticides in wines employing mixed-mode dispersive-solid phase extraction and gas chromatographyndashtandem mass spectrometry Talanta 2011 vol 85 no 4 p 1856-1870 [49] Tianyang Guo Pingping Fang Juanjuan Jiang Feng Zhan Wei Yong Jiahui Liu YiYang Dong Rapid screening and quantification of residual pesticides and illegal adulterants in red wine by direct analysis in real time mass spectrometry Journal of Chromatography A 2016 vol 1471 p 27-3 [50] GONZAacuteLEZ-RODRIacuteGUEZ R M CANCHO-GRANDE B SIMAL-GAacuteNDARA J Decay of fungicide residues during vinification of white grapes harvested after the application of some new active substances against downy mildew Food chemistry 2011 vol 125 no 2 p 549-560 [51] CARPINTEIRO I Ramil M Rodriacuteguez I Cela R Determination of fungicides in wine by mixed-mode solid phase extraction and liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry Journal of Chromatography A 2010 vol 1217 no 48 p 7484-7492
53
Capiacutetulo I Introduccioacuten
14 Legislacioacuten
El aumento del uso de fitosanitarios en actividades relacionadas con la produccioacuten de alimentos para consumo
humano o animal tambieacuten desembocoacute en una preocupacioacuten social debido a su toxicidad y bioacumulacioacuten En
respuesta la Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura (FAO) en colaboracioacuten
con la Organizacioacuten Mundial de la Salud (OMS) pusieron en marcha un programa Codex Alimentarius cuyo
objetivo a traveacutes de sus normas y coacutedigos de praacutecticas alimentarias internacionales es garantizar la calidad e
inocuidad de los alimentos que estaacuten al alcance de cualquier persona Con estas normas internacionales los
consumidores pueden confiar en la calidad de los alimentos independientemente de su origen geograacutefico [20]
Todos los alimentos destinados al consumo humano o animal en la Unioacuten Europea estaacuten sujetos a un liacutemite
maacuteximo de residuos de plaguicidas para la proteccioacuten de la salud humana y animal Actualmente en lo referente a
legislacioacuten para el control de la cantidad del toacutexico en la uva estaacute vigente el Reglamento 3962005 del Parlamento
Europeo y del Consejo de 23 de febrero de 2005 referido a la regulacioacuten de los liacutemites maacuteximos de residuos de
plaguicidas en alimentos y piensos de origen vegetal y animal El liacutemite maacuteximo de residuos (LMR) se define co-
mo el nivel maacutes alto de un residuo de un pesticida que se tolera de manera legal sobre los alimentos o piensos
cuando se aplican correctamente Las cantidades de residuos que se encuentren deben ser lo maacutes bajas posible
para garantizar la seguridad en la alimentacioacuten de los consumidores Dichos liacutemites maacuteximos de residuos estaacuten
fijados por la Comisioacuten Europea pudieacutendose encontrar en su base de datos LMR [21]
A continuacioacuten en la Tabla I2 se resumen los LMRs de los compuestos de este estudio en uvas de vinificacioacuten
en unidades de mgkg de uva En el caso del vino no hay legislacioacuten en lo referente a estos pesticidas solamente
la recomendacioacuten de no superar el 10 del valor del LMR en uva
Compuesto LMRs (mgkg uva) Compuesto LMRs (mgkg uva)
AME 6 MET 1
BEN 03 MYC 1
BOS 5 PEN 02
CAR 05 PYC 2
CYP 3 PYM 5
DIM 3 TEC 1
FEH 15 TEF 3
FEP 001 TBZ 005
FLU 2 TME 04
IMI 1 THI-M 3
IPR 2 TRI 2
MAN 2
Tabla I2 Liacutemites maacuteximos de residuos permitidos para los compuestos estudiados en uvas
10
Capiacutetulo I Introduccioacuten
2 MEacuteTODOS DE PREPARACIOacuteN DE MUESTRA APLICADOS A MUESTRAS DE VINO
21 Extraccioacuten liacutequido-liacutequido (LLE)
Se entiende por extraccioacuten liacutequido-liacutequido al meacutetodo mediante el cual un analito de intereacutes se separa por el
contacto con otra fase en la cual tiene mayor afinidad de la matriz en la que se halle Los procesos de extraccioacuten
implican dos fases y requieren tres pasos sucesivos mezcla de materia prima y disolvente separacioacuten de las dos
fases despueacutes del contacto y eliminacioacuten del disolvente que contiene el analito [22]
La extraccioacuten liacutequido-liacutequido (LLE) se basa en la distribucioacuten
de un analito entre dos fases liacutequidas inmiscibles en las
cuales analito y matriz tienen solubilidades diferentes
Principalmente una de las fases es un medio acuoso en
general se trata de la muestra y la otra un disolvente
orgaacutenico La selectividad y eficacia de este meacutetodo vienen
determinadas por la eleccioacuten del disolvente y por los factores
que pueden afectar al proceso de equilibrio (pH adiccioacuten de
sales neutras en la fase acuosa para reducir la solubilidad del
analito etc) [23] Esta teacutecnica permite llevar a cabo extracciones para un rango muy amplio de analitos siendo
una de las maacutes antiguas para la preparacioacuten de muestras en el anaacutelisis cualitativo y cuantitativo Ofrece grandes
capacidades de muestreo lineal y cuenta con la ventaja de la cantidad de informacioacuten existente sobre este meacutetodo
[24]
22 Extraccioacuten en fase soacutelida (SPE)
En 1978 aparecieron los primeros cartuchos desechables para la extraccioacuten en fase soacutelida y actualmente casi 40
antildeos despueacutes la extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) es la teacutecnica de preparacioacuten de muestras maacutes empleada en los
laboratorios Es una teacutecnica de preparacioacuten y tratamiento de muestras que se basa en la retencioacuten en una fase
adsorbente del analito de intereacutes presente en una muestra liacutequida que pasa a traveacutes de ella Debido a la variedad de
formatos (discos cartuchos y jeringas) y tipos de adsorbentes (los maacutes comunes carboacuten activo aluacutemina siacutelica gel
silicato de magnesio siacutelices enlazadas y poliacutemeros como por ejemplo estinero-divinilbenceno) o la facilidad de
automatizacioacuten y acoplamiento con otras teacutecnicas como por ejemplo una conexioacuten directa con un sistema de
Figura I4 Fundamentos teoacutericos de la LLE [25]
11
Capiacutetulo I Introduccioacuten
cromatografiacutea este meacutetodo le fue ganando terreno a la LLE Otra ventaja muy importante de la SPE frente a la
LLE es la disminucioacuten en la cantidad de disolvente orgaacutenico empleada Cada vez se va innovando maacutes sobre esta
teacutecnica llegando a encontrarse fases adsorbentes formadas por poliacutemeros capaces de retener en un uacutenico
cartucho un amplio abanico de analitos lipofiacutelicos o hidrofoacutebicos aacutecidos baacutesicos o neutros [26]
El fundamento de esta extraccioacuten como se puede en la Figura I6
consiste en cuatro etapas acondicionamiento adiccioacuten de muestra
retencioacuten y elucioacuten de los analitos de intereacutes En primer lugar antes
de empezar la extraccioacuten se requiere una etapa de acondicionamiento
para preparar el adsorbente haciendo pasar un poco de disolvente
para asiacute interaccionar mejor con la muestra Luego se hace pasar la
muestra liacutequida por la fase soacutelida Idealmente el adsorbente retiene
los analitos selectivamente a medida que va pasando la muestra y la
matriz pasa sin ser retenida Por uacuteltimo los analitos se eluyen del
adsorbente con un disolvente con el que tenga mayor afinidad [27]
23 Teacutecnicas de microextraccioacuten
231 Microextraccioacuten en fase soacutelida (SPME)
En la microextraccioacuten en fase soacutelida (SPME) se utilizan fibras de siacutelice fundida revestidas con un poliacutemero en un
disentildeo en forma de jeringa para la extraccioacuten de los analitos de intereacutes El principio por el que se rige esta
extraccioacuten es el reparto del analito entre la matriz de la muestra y el revestimiento de la fibra mediante un proceso
no competitivo Se trata de un meacutetodo que cuenta con muchas ventajas ya que se elimina completamente el uso de
disolventes y aparte no son necesarios voluacutemenes de muestra grandes pero tambieacuten cuenta con algunas
desventajas ya que tanto la capacidad como la sensibilidad se ven limitadas [29]
En la figura I7 podemos ver las etapas de la extraccioacuten En un
vial cerrado con una caacutepsula y un seacuteptum tenemos la muestra
liacutequida o bien soacutelida que contenga los analitos de intereacutes
volaacutetiles Con la jeringa se perfora el seacuteptum y una vez dentro
se acciona el eacutembolo para la exposicioacuten de la fibra con los
analitos introducieacutendola en la muestra liacutequida o en su defecto
en el espacio de cabeza para la extraccioacuten de analitos volaacutetiles
de una muestra soacutelida Despueacutes de la extraccioacuten dentro del vial
Figura I6 Etapas de una SPE [28]
Figura I7 Etapas de una SPME [30]
12
Capiacutetulo I Introduccioacuten
la fibra se introduce de nuevo en la jeringa y se retira del vial [27]
232 Microextraccioacuten en fase liacutequida (LPME)
La microextraccioacuten en fase liacutequida se desarrolloacute como una alternativa a la LLE para la reduccioacuten en la cantidad de
disolventes orgaacutenicos siendo rentable tanto para el medioambiente como econoacutemicamente Entre las modalidades
maacutes populares de esta teacutecnica se encuentran microextraccioacuten con gota suspendida (SDME) y microextraccioacuten
liacutequido-liacutequido dispersiva (DLLME) En la SDME una gota de disolvente orgaacutenico es expuesta al espacio de
cabeza situado sobre una muestra en un vial dicha gota es suspendida del extremo de una microjeringa Por otro
lado la DLLME sobre una muestra acuosa se inyecta un pequentildeo volumen de una mezcla de disolventes en la
cual es dispersada formando una solucioacuten en la que se establece el equilibrio El disolvente de extraccioacuten debe
presentar una densidad inferior a la de la muestra para facilitar su recuperacioacuten normalmente despueacutes de
centrifugar el vial doacutende se realiza la extraccioacuten [31]
24 QuEChERS
La extraccioacuten QuEChERS de las palabras en ingleacutes Quick Easy Cheap Effective Rugged and Safe es un meacutetodo
de extraccioacuten que se desarrolloacute entre 2000 y 2002 para el anaacutelisis de pesticidas Como su nombre indica raacutepido
faacutecil barato eficaz robusto y seguro son las principales
caracteriacutesticas de esta preparacioacuten de muestra Se realiza en dos
etapas en primer lugar una extraccioacuten simple y una segunda fase
de purificacioacuten En la primera etapa tenemos el vial con la
muestra en el cual se antildeade un disolvente generalmente
acetonitrilo para la extraccioacuten de los analitos de intereacutes en
presencia de diferentes sales (en el meacutetodo original se utiliza
sulfato de magnesio y cloruro de sodio) para facilitar la separacioacuten
de las fases En la segunda parte se realiza la purificacioacuten de la
fraccioacuten del extracto orgaacutenico Para eso se lleva a cabo una
limpieza de los analitos eliminando el agua y los compuestos
presentes en la matriz de la muestra empleando un adsorbente PSA (amina primaria y secundaria) C18 carboacuten
negro grafitizado (GCB) o una combinacioacuten de eacutestas [32]
Figura I8 Etapas de QuEChERS [33]
13
Capiacutetulo I Introduccioacuten
3 METODOLOGIacuteA ANALIacuteTICA PARA LA DETERMINACIOacuteN DE PESTICIDAS
31 Meacutetodos de GC-MS (MSMS)
La combinacioacuten de cromatografiacutea de gases (GC) teacutecnica de separacioacuten con espectrometriacutea de masas (MS) como
sistema de deteccioacuten representa un potente meacutetodo para la identificacioacuten determinacioacuten y cuantificacioacuten de
analitos orgaacutenicos en concentraciones traza presentes en muestras complejas Esta teacutecnica de anaacutelisis cuenta con
muchas ventajas en sensibilidad multifuncionalidad buena reproducibilidad robustez asiacute como facilidad en el
manejo pero con una gran desventaja este meacutetodo no es apto para ser utilizado con todos los analitos sino que
se ve limitado a aquellos que sean termoestables y no se descompongan a temperaturas elevadas antes de ser
volatilizados La muestra es introducida a traveacutes del inyector en el cromatoacutegrafo de gases doacutende impulsada por
una corriente de gas inerte como fase moacutevil pasa a traveacutes de la columna que contiene la fase estacionaria en la
cual se separan los compuestos debido a una distribucioacuten de estos entre fase moacutevil-fase estacionaria Mediante
una interfase son introducidos para su deteccioacuten en el espectroacutemetro de masas que cuenta con una fuente de
iones analizador de masas y un detector [34]
La combinacioacuten de analizadores de masas en taacutendem (MSMS) como sistema de deteccioacuten en GC es una teacutecnica
altamente selectiva mejorando la sensibilidad y la relacioacuten sentildeal-ruido en los espectros experimentando una
mejora por lo que se logran unos liacutemites de deteccioacuten inferiores Esta teacutecnica GC-MSMS comprende maacutes
pasos despueacutes de la separacioacuten por cromatografiacutea se lleva a cabo la deteccioacuten con MSMS que consta de varias
etapas generacioacuten de iones en la fuente de ionizacioacuten seleccioacuten de los iones precursores de una determinada
masa disociacioacuten causada por colisioacuten con moleacuteculas de gas inerte de los iones precursores y por uacuteltimo el
anaacutelisis de los fragmentos en relacioacuten a su masacarga (mz) En el caso de que un espectro de MS no permita
confirmar la identidad de un determinado compuesto quiacutemico la obtencioacuten de su espectro de MSMS permite
mejorar la confianza en su identificacioacuten [36]
Figura I9 Acoplamiento GC-MS [35]
14
Capiacutetulo I Introduccioacuten
32 Meacutetodos LC-MS (MSMS)
La teacutecnica de LC-MS se desarrolloacute para minimizar las desventajas del acoplamiento GC-MS y asiacute resolver los
problemas que este uacuteltimo acarreaba con los analitos termolaacutebiles permitiendo el anaacutelisis de eacutestos sin tener que
realizar una etapa previa de derivatizacioacuten La interfase de unioacuten de cromatografiacutea liacutequida (LC) con espectrometriacutea
de masas (MS) acarrea una dificultad significativa siendo responsable de transformar los analitos que se
encontraban en la fase moacutevil liacutequida en iones en fase gas sin que se produzca su degradacioacuten teacutermica La
sensibilidad de las determinaciones por LC-MS va a depender de la interfase empleada Las principales interfases
empleadas actualmente son las ionizaciones a presioacuten atmosfeacuterica electrospray (ES) e ionizacioacuten quiacutemica a
presioacuten atmosfeacuterica (APCI) [37]
Con los antildeos la cromatografiacutea liacutequida se ha ido innovando y mediante la disminucioacuten del tamantildeo de partiacutecula en
la columna se fue mejorando la eficiencia asiacute como aumentando la selectividad y resolucioacuten del pico en el
cromatograma Para este nuevo sistema llamado UPLC Ultra-Performance Liquid Chromatography se desarrolloacute
una nueva instrumentacioacuten capaz de trabajar a altas presiones generando flujos mayores sin peacuterdidas de
resolucioacuten utilizando inyectores automaacuteticos maacutes raacutepidos y detectores con mayor velocidad de adquisicioacuten de
datos disminuyendo asiacute el tiempo de anaacutelisis [39]
33 Espectrometriacutea de masas
La espectrometriacutea de masas es el meacutetodo de deteccioacuten y cuantificacioacuten maacutes fiable a la hora de la determinacioacuten de
compuestos en matrices complejas (tales como alimentos) ya que otros detectores maacutes tradicionales como UV-
visible o fluorescencia cuentan con una gran incertidumbre en los resultados llegando incluso a ofrecer falsos
Figura I10 Acoplamiento LC-MS [38]
15
Capiacutetulo I Introduccioacuten
positivos o negativos Un espectrometro de masas cuenta con un dispositivo de introduccioacuten de muestra una
caacutemara de ionizacioacuten un sistema para la aceleracioacuten de los iones uno o varios analizadores de masas y un detector
[40]
El fundamento de la espectrometriacutea de masas se basa en la separacioacuten de iones en base a la relacioacuten masacarga
(mz) El proceso consta fundamentalmente de cuatro etapas La
primera es la ionizacioacuten de la muestra los iones formados se aceleran
debido a la accioacuten de un campo eleacutectrico variable separacioacuten de los
iones seguacuten su masacarga deteccioacuten de los iones y produccioacuten de la
sentildeal eleacutectrica El analizador de masas es el encargado de la separacioacuten
de los iones en funcioacuten a su mz entre los que maacutes destacan
analizador de masas cuadrupolar que dispersa simultaacuteneamente todos
los iones en funcioacuten de la relacioacuten mz analizador de masas de
tiempo de vuelo (TOF) consta de un tubo a alto vaciacuteo sobre el que no
actuacutea ninguacuten campo eleacutectrico al cual llegan todos los iones acelerados con la misma energiacutea cineacutetica y en el tubo
las velocidades variacutean seguacuten mz y analizador de trampa de iones en doacutende los iones gaseosos quedan aislados
durante largos periacuteodos de tiempo por la accioacuten del campo eleacutectrico [41]
4RESUMEN BIBLIOGRAacuteFICO DE LAS TEacuteCNICAS DE EXTRACCIOacuteN Y
DETERMINACIOacuteN DE PESTICIDAS EN VINO
En la bibliografiacutea se han descrito diversas teacutecnicas y diferentes combinaciones entre teacutecnicas de extraccioacuten y
distintas teacutecnicas de cuantificacioacuten e identificacioacuten para esos analitos Entre estas teacutecnicas los valores de los liacutemites
de cuantificacioacuten (LOQs) y las recuperaciones relativas pueden diferir en el resultado en un rango de valores asiacute
como el tiempo total empleado para el anaacutelisis y para la preparacioacuten de la muestra
Por lo general el meacutetodo de extraccioacuten de los analitos de intereacutes maacutes empleado es la extraccioacuten en fase soacutelida
(SPE) la cuaacutel le ha estado ganando terreno a la extraccioacuten liacutequido-liacutequido aunque tambieacuten se estaacute viendo cada vez
maacutes desplazada debido al creciente uso de la teacutecnica QuEChERS
Figura I11 Etapas de la espectrometriacutea de masas [42]
16
Capiacutetulo I Introduccioacuten
En el estudio de ECONOMOU et al [43] realizado en el antildeo 2009 en Grecia se empleoacute la extraccioacuten en fase
soacutelida con deteccioacuten en cromatografiacutea de liacutequidos acoplada a espectrometriacutea de masas en taacutendem (SPE-LC-ESI-
MSMS) Para la preparacioacuten de la muestra diluyeron 10 mL de vino (tanto blanco como tinto) a un volumen
final de 100 mL con agua ultrapura antes de la SPE Determinaron las recuperaciones de la extraccioacuten para dos
niveles de concentracioacuten 0010 y 0050 mgL realizando 8 medidas diarias durante 3 diacuteas consecutivos
encontraacutendose unos valores que variacutean dentro del rango 70-110 para todos los pesticidas en los dos niveles Para
la determinacioacuten y cuantificacioacuten de 46 pesticidas emplearon la teacutecnica de cromatografiacutea de liacutequidos con
espectrometriacutea de masas con un volumen de inyeccioacuten de 20 microL y un flujo de fase moacutevil de 02 mLmin
aclopada a espectrometriacutea de masas en taacutendem
Con la misma teacutecnica de extraccioacuten PELAJIĆ et al [45] durante el antildeo 2015 en Croacia llevaron a cabo la
determinacioacuten de 25 residuos de plaguicidas en vino tinto El meacutetodo que desarrollaron para dicha finalidad fue el
acoplamiento SPE-GC-MS Para la preparacioacuten de la muestra emplearon 10 mL de vino diluidos 11 con agua
ultrapura hasta un volumen final de 20 mL Calcularon las recuperaciones de la extraccioacuten y se encontroacute un rango
para todos los pesticidas en las muestras de 70-120 Para la determinacioacuten en cromatografiacutea de gases-
espectrometriacutea de masas se empleoacute un volumen de inyeccioacuten de 5 μL y un flujo de fase moacutevil de 10 mLmin
Mediante el acoplamiento de teacutecnicas SPE dispersiva-GC-MS WALORCZYK et al [48] en el antildeo 2011 en
Polonia llevaron a cabo la cuantificacioacuten de 160 pesticidas en diferentes clases de vino tinto rosado y blanco Con
10 g de vino y 10 mL de acetonitrilo se realizaron pruebas de recuperacioacuten en la fase de extraccioacuten para vino
tinto con los niveles de concentracioacuten 001 005 y 02 mgkg y para los vinos rosado y blanco con el nivel de
concentracioacuten 005mgkg y encontraron que a todos los niveles de concentracioacuten los valores de recuperacioacuten
rondan el rango 80-110 Para la teacutecnica cromatograacutefica se utilizoacute un volumen de inyeccioacuten de 5 microL
El acoplamiento LLE-SPE-LCDAD fue desarrollado por GONZAacuteLEZ-RODRIacuteGUEZ et al [50] en el antildeo
2010 en la provincia de Orense para la determinacioacuten de nuevos fungicidas propuestos para combatir el hongo
que provoca la enfermedad del mildium En la preparacioacuten de la muestra emplearon 15 mL de vino blanco para la
extraccioacuten en la cual fueron calculadas las recuperaciones relativas para dos niveles de concentracioacuten 005 y 05
mgkg en donde se establece un rango de entre 70-110 para todos los analitos Para la determinacioacuten mediante
cromatografiacutea de liacutequidos se empleoacute un volumen de inyeccioacuten de 2 μL y como meacutetodo de deteccioacuten utilizaron un
detector de diodos array
La microextraccioacuten sorptiva en fase soacutelida fue empleada en la publicacioacuten de FONTANA et al [44] junto con un
acoplamiento entre cromatografiacutea de liacutequidos y espectrometriacutea de masas para la determinacioacuten de 15 fungicidas
en vino realizada durante el 2010 en el noroeste de Espantildea Para la preparacioacuten de la muestra emplearon 10 mL
17
Capiacutetulo I Introduccioacuten
de vino diluiacutedos con el mismo volumen de agua ultrapura y un sorbente en forma de disco de silicona con un
volumen de 12 microL La recuperacioacuten de la extraccioacuten se calculoacute para vino tinto (Menciacutea) y vino blanco (Godello)
realizando tres replicas dentro de un mismo diacutea para los niveles de concentracioacuten 10 y 50 ngmL y nueve reacuteplicas
realizando el anaacutelisis en tres diacuteas consecutivos para el nivel de concentracioacuten de 25 ngmL y los resultados
obtenidos dan unos valores de recuperacioacuten dentro del rango 75-117 En el sistema LC-QTOF-MS el volumen
de inyeccioacuten fue de 15 microL
El otro meacutetodo de extraccioacuten mencionado anteriormente es QuEChERS estaacute en auge como meacutetodo de extracioacuten
de residuos de pesticidas en matrices como la del vino o la uva ya que incrementa la velocidad del anaacutelisis y reduce
el efecto de matriz BUERGE et al [46] seguido de una deteccioacuten mediante GC-MSMS realizaron una estapa
de extraccioacuten QuEChERS con alguna modificacioacuten acetato de sodio en lugar de cloruro soacutedico y acetato de etilo
en lugar de acetonitrilo utilizando 5 g de uva para la determinacioacuten de residuos de 4 pesticidas durante el antildeo
2016 Las recuperaciones de extraccioacuten resultaron ser valores entre 91-149 en uva a distintos niveles de
concentracioacuten 005 05 y 5 mgkg
Para la determinacioacuten de Ametoctradin HU et al [47] llevaron a cabo una extraccioacuten QuEChERS empleando 10
g de uva con deteccioacuten mediante el acoplamiento UPLC-MSMS utilizando un volumen de inyeccioacuten de 5 μL y
un flujo de fase moacutevil de 03 mLmin Las recuperaciones de la extraccioacuten se calcularon para tres niveles de
concentracioacuten 1 10 100 μgL de dos formas distintas en tres diacuteas consecutivos realizando 5 reacuteplicas al diacutea o en
dentro de un mismo diacutea realizando 15 reacuteplicas los resultados de todos los caacutelculos se encuentran dentro del rango
818-1001
Siguiendo con el mismo modo de extraccioacuten GUO et al [49] publicaron sus estudios para la determinacioacuten de
50 pesticidas y 12 adulterantes en vino tinto Para la extraccioacuten QuEChERS se utilizaron 10 mL de vino tinto con
10 mL de acetonitrilo y calcularon las recuperaciones para tres niveles de concentracioacuten 50 100 y 250 ngmL
encontraacutendose un rango de valores entre 75-120 El meacutetodo de deteccioacuten se llevoacute a cabo mediante un anaacutelisis
directo en tiempo real junto con espectrometriacutea de masas en tandem con un cuadrupolo (DART-MSMS) la
teacutecnica DART es un meacutetodo raacutepido para cribar y cuantificar los analitos de estudio que prescinde de la etapa de
separacioacuten cromatograacutefica
A continuacioacuten se recogen en la Tabla I3 los liacutemites de cuantificacioacuten (LOQs) de los analitos de intereacutes en este
trabajo caacutelculados por los diferentes meacutetodos encontrados en bibliografiacutea citados anteriormente en este apartado
18
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Tabla I3 LOQs de los analitos de intereacutes descritos para los distintos meacutetodos encontrados en la bibliografiacutea
Compuesto LOQs
Compuesto LOQs
V Blanco V Tinto Uva V Blanco V Tinto Uva
AME - - 0032μgkg[47] MET 86 μgL[43]
22 μgL[44]
89 μgL[43]
22 μgL[44]
5 μgL[45]
259 ngmL[49]
001mgkg[48]
BEN 02 μgL[44]
0001 mgL[50]
02 μgL[44]
001 μgL[45]
280ngmL[49]
005 mgkg[48] MYC 30 μgL[43]
08 μgL[44]
36 μgL[43]
10 μgL[44]
025 μgL[45]
331ngmL[49]
001 mgkg[48]
BOS 0065 mgL[50] 05 μgL[45]
1076 ngmL[49] 001 mgkg[48] PEN
56 μgL[43]
05 μgL[44]
49 μgL[43]
04 μgL[44]
220ngmL[49]
001 mgkg[48]
CAR - 386 ngmL[49] - PYC 0003mgL[50] 07 μgL[45] 001 mgkg[48]
CYP 15 μgL[43]
04 μgL[44]
0001 mgL[50]
22 μgL[43]
06 μgL[44]
312 ngmL[49]
001 mgkg[48] PYM 17 μgL[43] 22 μgL[43]
10 μgL[45] 001 mgkg[48]
DIM 18 μgL[43] 20 μgL[43] 001 mgkg[48] TEC 03 μgL[44]
03 μgL[44]
10 μgL[45]
160ngmL[49]
001 mgkg[48]
FEH 17 μgL[43] 22 μgL[43]
938 ngmL[49] 001 mgkg[48] TEF - 876ngmL[49] -
FEP - - 002mgkg[46] TBZ 15μgL [43] 29μgL[43] 001 mgkg[48]
FLU 005 μgL[45] TME - 25 μgL[45] 001 mgkg[48]
IMI 21 μgL[43] 22 μgL[43]
225 ngmL[49] - THI-M 92 μgL[43] 89 μgL[43] -
IPR 07 μgL[44] 07 μgL[44] 001 mgkg[48] TRI 10 μgL[44] 12 μgL[44] 001 mgkg[48]
MAN 0011 mgL[50] - -
5 DISTRIBUCIOacuteN DE PESTICIDAS EN VINOS COMERCIALES
En algunos de los meacutetodos descritos en el apartado anterior se procesaron vinos comerciales encontraacutendose
resultados positivos para muchos residuos de pesticidas y algunos hasta en gran concentracioacuten
ECONOMOU et al [43] mediante el meacutetodo LC-ESI-MSMS realizaron el anaacutelisis de 60 muestras de vino tinto
y blanco recogidos en supermercados locales en Grecia a lo largo de un antildeo El meacutetodo se habiacutea desarrollado
19
Capiacutetulo I Introduccioacuten
para la determinacioacuten de 46 pesticidas pero la mayoriacutea se encuentran con una concentracioacuten por debajo de
001mgL solo ocho plaguicidas se obtuvieron con resultados de concentracioacuten mayores Se muestran los
resultados en la Tabla I4 de los analitos de intereacutes en este estudio
Tabla I4 Nuacutemero de muestras positivas de distintos pesticidas en el anaacutelisis de 60 muestras de vino [43]
Compuesto Positivos con concentracioacuten entre 001-01
mgL
Positivos con concentracioacuten entre 01-1
mgL
PYM 2 (3) 2 (3)
MYC 2 (3) 0 (0)
CAR 11 (18) 7 (12)
THI-M 7 (12) 5 (8)
FEH 5 (8) 0 (0)
MET 1 (2) 0 (0)
Mediante el meacutetodo de microextraccioacuten en fase soacutelida-LC-TOF-MS FONTANA et al [44] aplicaron el
desarrollo del procedimiento a un total de 12 vinos joacutevenes elaborados en el 2010 y correspondientes a diferentes
denominaciones geograacuteficas del noroeste de Espantildea En la Tabla I5 se muestran los datos que han obtenido
Tabla I5 Determinacioacuten de fitosanitarios en vinos comerciales mediante Microextraccioacuten en fase soacutelida-LC-TOF-MS
Valores de concentracioacuten en ngmL [44]
Pesticidas
W 1
Albarintildeo
W5
Ribeiro
W6
Valdeorras
R1
Ribeira Sacra
R3
Ribeiro
R4
Valdeorras
MET 404plusmn06 223plusmn05 311plusmn007 25plusmn03 31plusmn03 74plusmn10
TRI nd nd 36plusmn06 nd nd ltLOQ
IPR 394plusmn03 324plusmn02 324plusmn02 071plusmn007 31plusmn02 28plusmn05
MYC nd nd nd ltLOQ 39plusmn02 nd
TEC 25plusmn01 nd nd nd nd nd
CYP 179plusmn08 ltLOQ ltLOQ 562plusmn002 083plusmn001 nd
BEN 042plusmn001 nd ltLOQ nd 032plusmn001 ltLOQ
ndNo detectados ltLOQ por debajo del liacutemite de cuantificacioacuten del meacutetodo los coacutedigos W y R corresponden respecti-vamente a los vinos blanco y tinto
20
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Por uacuteltimo PELAJIĆ et al [45] aplicaron su meacutetodo SPE dispersiva-GC-MS mediante el cual determinaron 25
residuos de plaguicidas en vino tinto a un total de 32 muestras de vino adquiridos en supermercados locales de
Croacia pero de diversos oriacutegenes de procedencia Los resultados que han obtenido se muestran en la Tabla I6
en doacutende un total de 15 plaguicidas han sido detectados y 7 de los cuales se encontraban en una alta
concentracioacuten
Tabla I6 Resultados de los vinos con positivos en pesticidas y sus concentraciones [45]
Vino Paiacutes Residuos de pesticidas (mgKg)
Tinto Francia DIM (0013) MET (0009) IPR (001)
Tinto Alemania BOS (0011)
Tinto Alemania IPR (0009)
Tinto Macedonia MET (0015)
Tinto Moldavia IPR (0008)
Tinto Polonia MET (004)
Tinto Rumania PYM (0058)
Tinto Espantildea TRI (0005) MET (0011)
Tinto Estados Unidos BOS (001)
Rosado Francia BOS (0005)
Blanco Chile TEC (0008)
Blanco Georgia MET (0057)
Blanco Alemania DIM (001) IPR (0054) PYM (0056)
Blanco Sudaacutefrica DIM (0011) IPR (0011)
21
Capiacutetulo II Objetivos y discusioacuten
CAPIacuteTULO II OBJETIVOS Y DISCUSIOacuteN
El objetivo principal que se persigue en este trabajo es el desarrollo de un meacutetodo analiacutetico raacutepido basado en la
extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) y deteccioacuten mediante cromatografiacutea de liacutequidos en la modalidad de UPLC
acoplada a la espectrometriacutea de masas en taacutendem (UPLC-MSMS) para la determinacioacuten multianalito de residuos
de fitosanitarios principalmente fungicidas aunque tambieacuten alguacuten insecticida en muestras de vino blanco y tinto
Para llevar a cabo la finalidad de lo dicho se consideran unos objetivos maacutes especiacuteficos
Minimizar la manipulacioacuten de la muestra para asiacute reducir la cantidad de disolventes y tiempo empleado
Optimizacioacuten de los factores que afectan en la extraccioacuten en la SPE tales como tipo y cantidad de
adsorbente volumen de eluyente etc
Estudio de las condiciones en UPLC-MSMS para una separacioacuten y cuantificacioacuten oacuteptimas
Caracterizacioacuten y validacioacuten del meacutetodo propuesto
Por uacuteltimo una vez cumplidos todos los objetivos anteriores y fijadas las condiciones oacuteptimas el meacutetodo
estudiado se aplica en el anaacutelisis de muestras de vino comercial (blanco y tinto) para determinar si se encuentran
residuos presentes asiacute como conocer en queacute concentracioacuten se encuentran los pesticidas objeto de este estudio
22
Capiacutetulo III Parte experimental
CAPIacuteTULO III PARTE EXPERIMENTAL
1 MATERIAL Y REACTIVOS
11 Material
Material de vidrio de uso comuacuten en el laboratorio vasos de precipitados matraces aforados etc
Micropipetas automaacuteticas de 20-200 microL 20-200 microL 100-1000 microL 1000-5000 microL Eppendorf
Puntas de plaacutestico para micropipetas
Encapsulador y desencapsulador
Soportes y pinzas
Viales de 15 mL transparentes para muestreador automaacutetico de cromatografiacutea (Sugelabor)
Caacutepsulas de aluminio con seacuteptum de Tefloacuten (Sugelabor) y tapones pre-slit para viales
Tubos y conectores de tefloacuten
Cartuchos de divinilbenceno-N-vinilpirrolidona 200 mg Oasis HLB Waters
Cartuchos de divinilbenceno-N-vinilpirrolidona funcionalizados con grupos amina cuaternaria 150 mg
Oasis MAX Waters
Cartuchos de divinilbenceno-N-vinilpirrolidona 60 mg Oasis HLB Waters
12 Reactivos y disolventes
Agua ultrapura Milli-Q
Aacutecido foacutermico (Sigma Aldrich) 95
Acetonitrilo (LichrosolvregMerck) Gradient grade for liquid chromatography
Metanol (LichrosolvregMerck) Gradient grade for liquid chromatography
Etanol (LichrosolvregMerck) Gradient grade for liquid chromatography
13 Patrones
Ametoctradin (AME) Dr Ehrenstrorfer 990
Benalaxyl (BEN) Pestanal Sigma- Aldrich 999
23
Capiacutetulo III Parte experimental
Boscalid (BOS) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Carbendazim (CAR) Pestanal Sigma- Aldrich 992
Cyprodinil (CYP) Pestanal Sigma- Aldrich 998
Dimethomorph (DIM) mezcla de isoacutemeros E + Z Pestanal Sigma- Aldrich 989
Fenhexamid (FEH) Pestanal Sigma- Aldrich 997
Fenpropidin (FEP) Dr Ehrenstrorfer 980
Fluopicolide (FLU) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Imidacloprid (IMI) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Iprovalicarb (IPR) mezcla de isoacutemeros Pestanal Sigma- Aldrich 985
Mandipropamid (MAN) Pestanal Sigma- Aldrich 991
Metalaxyl (MET) Pestanal Sigma- Aldrich 990
Myclobutanil (MYC) Pestanal Sigma- Aldrich 994
Penconazole (PEN) Pestanal Sigma- Aldrich 991
Pyraclostrobin (PYC) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Pyrimethanil (PYM) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Tebuconazol (TEC) Pestanal Sigma- Aldrich 996
Tebufenozide (TEF) Dr Ehrenstrorfer 988
Thiabendazole (TBZ) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Thiamethoxam (TME) Pestanal Sigma- Aldrich 996
Thiophanate-methyl (THI-M) Dr Ehrenstrofer 990
Triadimenol (TRI) Mezcla de diastereoisoacutemeros Pestanal Sigma- Aldrich 994
14 Patrones internos
Carbendazim-d3 (CAR-d3) Pestanal Sigma- Aldrich 998
Cyprodinil-d5 (CYP-d5) Pestanal Sigma- Aldrich
Imidacloprid-d4 (IMID-d4) Pestanal Sigma- Aldrich
Metalaxyl 13C6 (MET13C6) Pestanal Sigma-Aldrich 99
24
Capiacutetulo III Parte experimental
15 Gases
Nitroacutegeno 99999 como gas de colisioacuten en el espectroacutemetro de masas
Nitroacutegeno en los sistemas de concentracioacuten y secado por corriente de nitroacutegeno de los cartuchos SPE
2 INSTRUMENTACIOacuteN
Balanza analiacutetica de precisioacuten Sartorius
Granatario Sartorius
Bantildeo de ultrasonidos P-Selecta
Equipo de purificacioacuten de agua Millipore modelo Milli-Q gradient A-10ZMQSSVOT4
Estacioacuten de concentracioacuten por corriente de nitroacutegeno Mini-Vap Supelco
Sistema de secado de cartuchos de SPE por corriente de nitroacutegeno VisiDry Supelco
Sistema distribuidor de vaciacuteo Visiprep reg Supelco
Cromatoacutegrafo de liacutequidos de ultra-alta resolucioacuten Waters AcquityUPLC reg y espectroacutemetro de masas
Acquity TQD con analizador de triple quadrupolo (QqQ) equipado con una fuente de ionizacioacuten a
presioacuten atmosfeacuterica del tipo Z-spray (ESI)
3 PREPARACIOacuteN DE LAS DISOLUCIONES
Los patrones de pesticidas se prepararon individualmente a partir de los compuestos soacutelidos comerciales por
pesada excepto en el caso del fenpropidin (FEP) que se preparoacute a partir del compuesto liacutequido comercial Estos
compuestos soacutelidos se disolvieron en metanol y se obtuvieron unas disoluciones iniciales con concentraciones
recogidas en la Tabla III1
25
Capiacutetulo III Parte experimental
Tabla III1 Concentracioacuten de las disoluciones patroacuten stock
Compuesto Concentracioacuten (microgmL) Compuesto Concentracioacuten (microgmL)
AME 102201 MET 118912
BEN 138330 MYC 102017
BOS 99474 PEN 129791
CAR 17105 PYC 104581
CYP 131075 PYM 141386
DIM 103009 TEC 134729
FEH 99584 TEF 137769
FEP 100000 TBZ 105928
FLU 126859 TME 112283
IMI 101123 THI-M 124202
IPR 106739 TRI 118933
MAN 101021
4 LAVADO DEL MATERIAL
La limpieza del material de vidrio utilizado en el laboratorio se realizoacute utilizando jaboacuten y aclarando con agua de
grifo Luego en primer lugar se realiza un enjuague con agua Milli-Q finalmente un segundo enjuague con
acetona para eliminar posibles restos de compuestos orgaacutenicos y se deja secar sobre papel
Para la limpieza de los conectores de tefloacuten empleados en el proceso de SPE se introducen en un vaso de
precipitados con metanol y este en un bantildeo de ultrasonidos durante 10 minutos Al finalizar con el bantildeo de
ultrasonidos se realiza un enjuague con acetona y se pone a secar
5 EXTRACCIOacuteN DE MUESTRAS MEDIANTE SPE
El meacutetodo de extraccioacuten utilizado para la determinacioacuten de pesticidas fue la extraccioacuten en fase soacutelida (SPE)
mediante cartuchos Oasis HLB de 200 mg A continuacioacuten se describe el protocolo de extraccioacuten en las
condiciones oacuteptimas
26
Capiacutetulo III Parte experimental
1 Acondicionamiento del cartucho Oasis HLB de 200 mg con 2 mL de acetonitrilo seguidos de otros 2 mL de
vino sinteacutetico formado por la mezcla etanolagua MilliQ (1288)
2 Paso de la muestra 2 mL de vino diluiacutedos con 2 mL de agua MilliQ a traveacutes del cartucho por gravedad
3 Lavado del cartucho con 2 mL de agua MilliQ
4 Secado del cartucho durante 45 minutos en el VisiDry mediante el paso de una corriente de nitroacutegeno
5 Elucioacuten del cartucho con la mezcla metanolacetonitrilo en proporcioacuten 2080 hasta un volumen final de 2
mL
6 Anaacutelisis mediante cromatografiacutea liacutequida acoplada a espectrometriacutea de masas en taacutendem UPLC-MSMS
(volumen de inyeccioacuten 15 microL)
Representacioacuten esquematizada en la Figura III1
Figura III1 Extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) de las muestras de vino
27
Capiacutetulo III Parte experimental
6 CONDICIONES DE DETERMINACIOacuteN MEDIANTE UPLC-MSMS
En la Tabla III2 se indican las condiciones utlizadas en la determinacioacuten de los pesticidas de intereacutes mediante
LC-MSMS y en la Tabla III3 se muestra el gradiente de la fase moacutevil utilizado para la separacioacuten
cromatograacutefica
Tabla III2 Condiciones experimentales de determinacioacuten en LC-MSMS
UPLC Acquity UPLC-I-Class IVD System
bull Columna cromatograacutefica Zorbax Eclipse Plus C18 Rapid Resolution HD
Fase estacionaria C18
Dimensiones 21 x 50 mm
Tamantildeo de partiacutecula 18 microm
Temperatura del horno 40ordmC
bull Inyector
Volumen de inyeccioacuten 15 microL
bull Fase moacutevil
Flujo 04 mLmin
Fase acuosa (A) Agua MilliQ con 01 aacutecido foacutermico
Fase orgaacutenica (B) Acetonitrilo con 01 aacutecido foacutermico
MSMS WatersXevo TQD
Modo de ionizacioacuten ESI positivo
Voltaje del capilar 15 kV
Voltaje de cono 50 V
Temperatura de gas de secado (N2) 450ordmC
Flujo de gas de secado (N2) 1000 Lh
Modo de adquisicioacuten Centroide
Tabla III3 Gradiente de fase moacutevil utilizado en la separacioacuten cromatograacutefica (LC)
Tiempo min 0 13 28 64 75 76 10
A 98 50 50 0 0 98 98
B 2 50 50 100 100 2 2
28
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
CAPIacuteTULO IV RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
1 IDENTIFICACIOacuteN DE LOS COMPUESTOS
Para empezar el estudio en primer lugar se realizoacute la caracterizacioacuten de las condiciones de determinacioacuten de los
analitos en el modo Multiple Reaction Monitoring (MRM) mediante UPLC-ESI-MSMS Para llevarla a cabo se
tomaron patrones individuales de cada fitosanitario y mediante infusioacuten se estudiaron las posibles transiciones y
voltajes oacuteptimos para su determinacioacuten (Tabla IV1)
La ionizacioacuten por electrospray (ESI) se estudioacute tanto en modo positivo como en modo negativo encontraacutendose
que para todos los pesticidas de nuestro intereacutes se obteniacutea sentildeal en el modo positivo mientras el modo negativo
no presentaba respuesta significativa
A continuacioacuten se estudia el efecto del voltaje de cono en la respuesta del ioacuten molecular [M+H]+ aumentaacutendolo
hasta alcanzar el valor maacuteximo de la sentildeal correspondiente a dicho ioacuten y luego se optimiza la energiacutea de colisioacuten
variaacutendola para cada analito hasta obtener la sentildeal de mayor intensidad para cada uno de los iones producto Por
uacuteltimo una vez optimizado el voltaje de cono y la energiacutea de colisioacuten se seleccionan las dos transiciones maacutes
intensas para llevar a cabo la cuantificacioacuten y cualificacioacuten de cada analito en modo MRM Este procedimiento se
realizoacute para la totalidad de los compuestos confirmando los datos obtenidos con los facilitados por la base de
datos Quanpedia que estaacute disponible en el software del equipo utilizado para algunos de los compuestos
considerados
Compuesto Tr (min) Ion precursor (mz Da)
Voltaje de cono (V)
Ion producto 1 (CEv)
cuantificacioacuten
Ion producto 2 (CEv)
cualificacioacuten
Relacioacuten IP2IP1
AME 325 2760 60 176 (35) 70 (50) 016
BEN 485 3261 26 148 (20) 91 (34) 067
BOS 387 3429 41 140 (20) 307 (20) 011
CAR 167 1921 33 160 (18) 132 (28) 014
CYP 311 2260 56 93 (33) 108 (25) 061
DIM 322 3881 40 301 (20) 165 (30) 057
FEH 386 3021 41 97 (22) 55 (38) 044
FEP 257 2742 55 147 (28) 86 (28) 093
FLU 401 3830 40 173 (20) 365 (15) 010
IMI 218 2561 34 209 (15) 175 (20) 091
IPR 358 3211 28 119 (16) 203 (10) 042
Tabla IV1 Tiempos de retencioacuten (Tr) relacioacuten de iones precursores (mz) voltaje de cono (V) energiacuteas de colisioacuten (CE) y relacioacuten de intensidades entre transiciones (IP2IP1)
29
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Compuesto Tr (min) Ion precursor (mz Da)
Voltaje de cono (V)
Ion producto 1 (CEv)
cuantificacioacuten
Ion producto 2 (CEv)
cualificacioacuten
Relacioacuten IP2IP1
MAN 392 4120 25 328 (16) 125 (35) 063
MET 283 2801 26 220 (13) 192 (17) 057
MYC 365 2891 34 70 (18) 125 (32) 029
PEN 417 2840 34 70 (16) 159 (34) 031
PYC 523 3881 31 194 (12) 163 (25) 066
PYM 266 2000 51 107 (24) 82 (24) 071
TEC 397 3080 40 70 (22) 125 (40) 007
TEF 473 3531 19 133 (20) 297 (8) 072
TBZ 182 2020 51 175 (25) 131 (30) 062
TME 203 2920 28 211 (12) 132 (22) 047
THI-M 257 3430 28 151 (46) 93 (19) 0001
TRI 319 2961 21 70 (10) 99 (15) 013
El dwell time para cada una de las transiciones se ajustoacute de manera automaacutetica por el software (MassLinx) con
objeto de obtener doce puntos espectrales por compuesto tomando un valor promedio de cuatro segundos como
ancho de pico a liacutenea de base
2 CARACTERIZACIOacuteN DEL PROCEDIMIENTO DE DETERMINACIOacuteN (UPLC-ESI-
MSMS)
Una vez optimizados los paraacutemetros que afectan a la separacioacuten cromatograacutefica (UPLC) y a la determinacioacuten por
espectrometriacutea de masas en taacutendem (MSMS) se lleva a cabo la evaluacioacuten de la repetibilidad de inyeccioacuten y
determinacioacuten en esas condiciones Se expresa por medio de la desviacioacuten estaacutendar relativa (RSD) paraacutemetro que
nos indica el grado de correlacioacuten que existe entre varias medidas del mismo patroacuten realizadas por el mismo
operador en el laboratorio y en el mismo equipo de medida a lo largo de un diacutea Para el estudio se realizan diez
inyecciones con volumen de 15 microL de dos patrones con distintos niveles de concentracioacuten 5 y 20 ngmL Los
datos de RSD (Tabla IV2) para las aacutereas de pico de los analitos se situacutean para el nivel de concentracioacuten 5 ngmL
en el rango 2-13 y en el nivel de concentracioacuten 20 ngmL en el rango 1-7
30
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten Tabla IV2 Desviacioacuten estaacutendar relativa (RSD) del aacuterea de pico (transicioacuten de cuantificacioacuten) para evaluar la repetivilidad del proceso de LC-MSMS
Compuesto RSD
5 ngmL
RSD
20 ngmL Compuesto
RSD
5 ngmL
RSD
20 ngmL
AME 5 2 MET 3 2
BEN 2 2 MYC 9 2
BOS 4 5 PEN 4 4
CAR 4 2 PYC 3 1
CYP 5 7 PYM 7 3
DIM 6 5 TEC 3 2
FEH 7 4 TEF 4 2
FEP 4 2 TBZ 2 1
FLU 5 3 TME 6 6
IMI 13 7 THI-M a 6
IPR 8 2 TRI 8 6
MAN 3 2
A continuacioacuten tambieacuten se evaluoacute la repetibilidad de los tiempos de retencioacuten (Tr) para diez inyecciones de
patrones a los dos niveles de concentracioacuten 5 y 20 ngmL situaacutendose las RSD para todos los compuestos en el
rango 01-03 En base a este dato la ventana de tiempo en la que se registran las transiciones de MRM de cada
compuesto se fijoacute en 05 min lo que es lo mismo 025 min alrededor del valor medio de su tiempo de retencioacuten
Por otro lado la linealidad del meacutetodo se estudioacute a nueve niveles de concentracioacuten diferentes comprendidos ente
los niveles 05 ngmL y 200 ngmL mediante la inyeccioacuten de disoluciones patroacuten de los distintos compuestos de
estudio Se realizoacute una evaluacioacuten sin y otra con patroacuten interno (IS) antildeadiendo una concentracioacuten fija de patrones
internos a nivel de 25 ngmL y pudimos observar que los resultados mejoran notablemente al realizar una
correccioacuten con el IS En la Tabla IV3 se muestran los coeficientes de determinacioacuten (R2) obtenidos al realizar la
correccioacuten mediante IS observando que para todos los compuestos excepto para THI-M y para TRI los
coeficientes de correlacioacuten son superiores a 0990 por lo que existe una respuesta lineal en el rango de
concentraciones que hemos estudiado
Aparte del estudio de la linealidad tambieacuten se han estudiado los liacutemites de cuantificacioacuten instrumentales del
meacutetodo (LOQs) Para ello los LOQs se evaluacutean como la miacutenima cantidad de analito que origina una sentildeal 10
veces superior a la desviacioacuten estaacutendar del ruido Los valores anteriores se estimaron a partir del patroacuten de
a no evaluado ya que se encuentra por debajo del liacutemite de cuantificacioacuten del meacutetodo
31
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
concentracioacuten maacutes baja que presenta un pico con una relacioacuten SN superior a 10 En la Tabla IV3 tambieacuten se
recogen estos LOQs en doacutende podemos ver que variacutean en el rango 01-1 ngmL excepto para THI-M que se
desviacutea a valores de 10 ngmL
Tabla IV3 Coeficientes de determinacioacuten (R2) y liacutemites de cuantificacioacuten instrumentales (LOQs) de los analitos para nueve
niveles de concentracioacuten de 05 a 200 ngmL
Compuesto Coeficiente de
correlacioacuten (R2)
LOQs (ngmL) Compuesto
Coeficiente de correlacioacuten
(R2)
LOQs (ngmL)
AME 09951 04 MET 09933 01
BEN 09949 01 MYC 09950 04
BOS 09979 02 PEN 09945 02
CAR 09923 02 PYC 09955 02
CYP 09878 02 PYM 09931 01
DIM 09938 07 TEC 09958 05
FEH 09959 05 TEF 09957 01
FEP 09931 01 TBZ 09942 02
FLU 09965 02 TME 09903 01
IMI 09979 05 THI-M 09580 100
IPR 09938 01 TRI 09867 07
MAN 09979 01
En la Figura IV1 y Figura IV2 se muestran dos ejemplo de curvas de calibrado para dos compuestos IMI y
MAN respectivamente
Figura IV1 Curva de calibrado y coeficiente de determinacioacuten de IMI para UPLC-ESI-MSMS
32
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Figura IV2 Curva de calibrado y coeficiente de determinacioacuten de MAN para UPLC-ESI-MSMS
3 ESTUDIO DEL MEacuteTODO SPE
La extraccioacuten de pesticidas se llevoacute a cabo mediante extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) en doacutende se realizaron
diversos estudios con diferentes condiciones para dar con las oacuteptimas En primer lugar se llevaron a cabo los
experimentos de retencioacuten y elucioacuten sobre dos tipos distintos de adsorbentes cartuchos OASIS HLB (200mg) y
cartuchos OASIS MAX (150 mg) como fases potenciales en las que llevar a cabo la extraccioacuten de manera
selectiva Los dos tipos de cartuchos son de fase reversa pero difieren entre siacute en el fundamento de retencioacuten de
los analitos En los cartuchos OASIS HLB (200 mg) formados por divinilbenceno-N-vinilpirrolidona (DVB-VP)
la retencioacuten de los diferentes analitos tiene lugar por interacciones π-π o de Van der Waals mientras que los
cartuchos OASIS MAX (150 mg) que se probaron como alternativa para mejorar la selectividad en la extraccioacuten
cuentan con un adsorbente polimeacuterico de modo mixto formado por divinilbenceno-N-vinilpirrolidona (DVB-VP)
funcionalizado con grupos amina cuaternaria siendo el fundamento de la extraccioacuten la combinacioacuten de las
propiedades adsorbentes del cartucho HLB con un mecanismo adicional de intercambio ioacutenico (anioacutenico) [27]
Algunos autores han empleado este mecanismo para mejorar la selectividad de la extraccioacuten de forma que en la
etapa de elucioacuten ciertos pigmentos del vino quedan fuertemente retenidos en el adsorbente a diferencia de lo que
ocurre con los adsorbentes de fase reversa [51]
Para llevar a cabo la eleccioacuten del tipo de adsorbente se realizaron pruebas con 10 mL de vino blanco y tinto
conectando en serie los dos tipos de cartuchos HLB (200 mg) y MAX (150 mg) a un segundo cartucho OASIS
HLB (60 mg) La elucioacuten de los analitos se hace de forma independiente para cada cartucho y se evaluacutea si los
analitos pasan del primer cartucho hacia el segundo cartucho es decir si se supera el volumen de corte o si por
33
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
otro lado se quedan retenidos en el primero y no eluyen hacia el segundo En estas pruebas de estudio
preliminares de preparacioacuten de la muestra no se ha incluido el CYP
En la Figura IV3 podemos ver la eficacia de la extraccioacuten para vino blanco y tinto que obtenemos empleando
cartuchos OASIS MAX (150 mg) conectados en serie con cartuchos OASIS HLB (60 mg) realizando la
extraccioacuten de tres fracciones de 2 mL cada una del cartucho OASIS MAX (150 mg) y una cuarta fraccioacuten de 2
mL del cartucho OASIS HLB (60 mg)
Por otro lado en la Figura IV4 podemos ver un graacutefico de columnas en el cual comparamos la eficacia de
extraccioacuten de los cartuchos OASIS HLB (200 mg) con dos disolventes de elucioacuten distintos En dicho graacutefica el
acroacutenimo de cada compuesto consta de dos barras cuyo significado es el siguiente la barra de la izquierda indica
la eficacia de la extraccioacuten empleando acetonitrilo (ACN) como disolvente de elucioacuten y la barra de la derecha
indica la eficacia de la extraccioacuten empleando la combinacioacuten MetanolAcetonitrilo (2080) (MeOHACN) como
disolvente de elucioacuten Para este adsorbente no se detectoacute ninguacuten compuesto en la extraccioacuten del segundo
cartuchos OASIS HLB (60 mg) empleando 2 mL de metanol
Figura IV3 Distribucioacuten de los compuestos en cada fraccioacuten obtenidas con cartuchos OASIS MAX (150 mg)
utilizando 10 mL de vino tinto y blanco sacando cuatro fracciones de 2 mL cada una con metanol como
disolvente de elucioacuten
34
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Figura IV4 Distribucioacuten de los compuestos en cada fraccioacuten obtenidas con cartuchos OASIS HLB (200 mg) utilizando 10
mL de vino tinto y blanco sacando 3 fracciones de 2 mL cada una con acetonitrilo (ACN) (columna de la izquierda) y una
combinacioacuten MetanolAcetonitrilo (2080) (MeOHACN) (columna de la derecha) como disolventes de elucioacuten
A la vista de los resultados reflejados en las graacuteficas podemos afirmar que cuando se utiliza el cartucho OASIS
HLB (200 mg) eluyendo con acetonitrilo o la combinacioacuten metanolacetonitrilo (2080) los extractos son limpios
y se eluyen la mayoriacutea de los compuestos en la primera fraccioacuten Pero utilizando acetonitrilo como disolvente de
elucioacuten se encuentran problemas en la extraccioacuten de CAR FEH y TBZ para los que es necesario emplear un
volumen mayor de elucioacuten o bien seleccionar otro disolvente de elucioacuten como es la combinacioacuten
metanolacetonitrilo
35
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Por otro lado los extractos en los cartuchos OASIS MAX (150 mg) son maacutes limpios incluso utilizando metanol en
la elucioacuten pero se detecta la presencia de CAR FEP TBZ y TME en el segundo cartucho OASIS HLB (60 mg)
significando la rotura del primer cartucho para dichos analitos considerando un volumen de 10 mL de vino Los
demaacutes compuestos se podriacutean recuperar cuantitativamente en la primera fraccioacuten sacada pero la peacuterdida de estos
compuestos inclina la eleccioacuten hacia los cartuchos OASIS HLB (200 mg) con metanolacetonitrilo (2080) como
disolvente de elucioacuten para continuar con el estudio
Una vez fijado el adsorbente y el volumen de elucioacuten se prueba la eficacia de la SPE independiente de los efectos
de matriz En la Tabla IV4 se muestran las recuperaciones de la SPE tomando 10 mL de vino blanco y tinto
con un nivel de adicioacuten de 15 ngmL sacando una sola fraccioacuten de 2 mL con la combinacioacuten
metanolacetonitrilo (2080) y n=3 reacuteplicas
Tabla IV4 Recuperaciones (R plusmn SD) de SPE para 10 mL de vino (blanco y tinto) con un nivel de adicioacuten de 15 ngmL y
n=3 reacuteplicas
Compuesto Vino Tinto
R plusmn SD
Vino Blanco
R plusmnSD Compuesto
Vino Tinto
R plusmn SD
Vino Blanco
R plusmn SD
AME 82 plusmn 7 100 plusmn 1 MET 92 plusmn 6 94 plusmn 3
BEN 89 plusmn 6 97 plusmn 3 MYC 90 plusmn 9 86 plusmn 4
BOS 95 plusmn 1 100 plusmn 2 PEN 84 plusmn 10 103 plusmn 3
CAR 91 plusmn 6 104 plusmn 6 PYC 86 plusmn 5 106 plusmn 1
CYP 81 plusmn 7 102 plusmn 3 PYM 87 plusmn 12 94 plusmn 3
DIM 97 plusmn 3 86 plusmn 4 TEC 83 plusmn 10 103 plusmn 1
FEH 89 plusmn 3 88 plusmn 3 TEF 84 plusmn 5 108 plusmn 4
FEP 91 plusmn 7 104 plusmn 3 TBZ 88 plusmn 7 92 plusmn 5
FLU 91 plusmn 2 97 plusmn 4 TME 101 plusmn 1 110 plusmn 13
IMI 117 plusmn 8 101 plusmn 11 THI-M 85 plusmn 9 110 plusmn 4
IPR 89 plusmn 7 112 plusmn 4 TRI 85 plusmn 10 110 plusmn 4
MAN 88 plusmn 2 87 plusmn 2
Algunos compuestos de la matriz en el vino pueden competir con los analitos durante el proceso de ionizacioacuten
que tiene lugar en la interfase entre UPLC-MSMS por lo que para la cuantificacioacuten del rendimiento de la
ionizacioacuten por electrospray (ESI) se estudian los efectos de matriz (EM) para vino blanco y tinto considerando
dos voluacutemenes de muestra distintos 2 y 10 mL y un volumen final del extracto de 2 mL En la Tabla IV5 se
36
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
exponen los valores para cada compuesto notando que al aumentar el volumen de muestra tambieacuten se aumentan
los efectos de matriz y eacutestos siempre son mayores en vino tinto Para el caacutelculo de estos efectos de matriz (EM)
se emplea la siguiente ecuacioacuten
Donde Am Ab y Ap representan el aacuterea de pico en la sentildeal medida del analito en el extracto de la muestra con
adicioacuten en el extracto de la muestra sin adicioacuten (o blanco) y en el patroacuten antildeadido respectivamente El nivel de
adicioacuten en extracto fue de 50 ngmL por compuesto
Tabla IV5 Efectos de matriz para vino blanco y tinto con un volumen inicial de 2 y 10 mL evaluados para un nivel de adicioacuten de 50 ngmL en extracto
Compuesto
Vino blanco Vino tinto
2 mL 10 mL 2mL 10 mL
EM () CV () EM () CV () EM () CV () EM () CV()
AME 93 3 95 2 99 3 101 7
BEN 99 1 93 2 101 3 100 6
BOS 97 5 98 1 108 2 96 0
CAR 62 2 50 3 58 2 55 6
CYP 94 3 91 1 97 2 95 7
DIM 105 2 95 3 100 3 108 3
FEH 100 4 102 4 105 4 94 3
FEP 95 3 88 2 96 2 92 7
FLU 98 2 93 2 106 1 101 2
IMI 84 4 46 3 48 10 18 8
IPR 99 3 92 3 105 1 100 7
MAN 100 1 94 3 109 4 107 2
MET 98 1 89 1 99 2 99 6
MYC 105 1 100 1 103 2 96 9
PEN 98 3 97 1 101 3 99 10
PYC 98 2 92 3 102 2 98 5
PYM 95 2 87 1 94 3 85 12
TEC 95 3 99 1 101 1 102 10
TEF 99 1 92 3 101 2 104 5
TBZ 45 0 40 5 43 2 30 7
TME 60 6 19 16 36 4 16 1
THI-M 107 2 109 2 103 1 96 9
TRI 97 3 118 4 104 5 117 10
37
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Al observar los resultados podemos ver que la mayoriacutea de los compuestos dan resultados de EM en torno al
100 lo que significa que no sufren una modificacioacuten importante en la eficacia de ionizacioacuten para las muestras
con respecto a los patrones Pero tambieacuten por el contrario podemos observar que algunos compuestos como
por ejemplo en el caso de CAR TBZ IMI y TME experimentan una gran supresioacuten de sentildeal es decir EM bajos
que se acentuacutean al aumentar el volumen de muestra La atenuacioacuten en la eficacia de variacioacuten para estos cuatro
compuestos no solo se ve incrementada con el volumen de muestra si no que ademaacutes es maacutes significativa para
vino tinto que para vino blanco En base a estos resultados aunque la eficacia de la SPE fue cuantitativa para
muestras de 10 mL se limitoacute el volumen de muestra a extraer a 2 mL
Las condiciones oacuteptimas de extraccioacuten se esquematizan en un resumen en la Figura IV5
Figura IV5 Condiciones optimizadas para la extraccioacuten de pesticidas en vino
38
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
4 CARACTERIZACIOacuteN DEL MEacuteTODO DE DETERMINACIOacuteN
Con las condiciones de extraccioacuten y determinacioacuten citadas anteriormente se llevaron a cabo pruebas de
recuperaciones absolutas de los compuestos a nivel de adicioacuten de 5 y 20 ngmL sobre las muestras Para cada
muestra y nivel de adicioacuten se realizaron tres reacuteplicas de las muestras con adicioacuten y los blancos aliacutecuotas de las
mismas muestras sin adicioacuten se procesaron en duplicado Los IS se antildeadieron a nivel de 25 ngmL y cada uno se
utiliza para corregir unos determinados compuestos CAR-d3 se emplea para CAR y TBZ el CYP-d5 para CYP y
PYM el IMID-d4 para IMI y TME y el MET13C6 para el resto de compuestos Los resultados para vino blanco
comprenden en el nivel de concentracioacuten 5 ngmL el rango entre 79-122 y en el nivel de concentracioacuten 20
ngmL el rango entre 84-109 Por otro lado en el caso del vino tinto las recuperaciones se encuentran para el
nivel de concentracioacuten 5 ngmL en el rango 67-112 y para el nivel de concentracioacuten 20 ngmL entre el rango
73-132 Los resultados obtenidos en las pruebas con vino blanco y vino tinto se muestran en la Tabla IV6
Los resultados son satisfactorios ya que la mayoriacutea de los compuestos se ajustan en todos los casos al rango de
recuperacioacuten entre 70-120 Para la realizacioacuten de estas pruebas se ha eliminado de los resultados el compuesto
THI-M debido a que las concentraciones utilizadas se encuentran en el liacutemite o por debajo del LOQ en los
experimentos con muestras adicionadas a 5 ngmL
Para calcular las recuperaciones (R) se recurrioacute a la siguiente ecuacioacuten
Donde Cm Cb y Cp son la concentracioacuten medida de analito en el extracto de la muestra con adicioacuten en el extracto
de la muestra sin adicioacuten (o blanco) y en el patroacuten antildeadido respectivamente
Tabla IV6 Recuperaciones (R) para vino tinto y vino blanco evaluadas para dos niveles de concentracioacuten 5 y 20 ngmL
Compuesto
Vino tinto Vino Blanco
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
AME 97 3 105 6 104 9 96 5
BEN 88 11 105 3 101 1 98 4
BOS 91 13 110 2 88 13 97 3
39
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Compuesto
Vino tinto Vino blanco
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
CAR 99 6 99 3 122 3 109 1
CYP 91 2 111 1 101 4 100 6
DIM 112 3 110 9 102 24 99 11
FEH 91 4 108 0 102 20 95 2
FEP 89 8 102 7 94 5 84 1
FLU 95 10 104 4 109 5 100 8
IMI 73 11 115 9 80 13 100 2
IPR 84 13 99 3 111 3 99 4
MAN 88 22 112 8 112 3 99 4
MET 99 3 106 5 106 3 98 2
MYC 84 9 106 13 88 17 86 3
PEN 84 9 102 5 84 8 90 5
PYC 96 6 105 4 100 2 95 4
PYM 90 12 112 14 106 4 97 1
TEC 89 8 101 6 98 12 94 1
TEF 93 10 102 5 107 2 97 3
TBZ 94 17 115 8 79 5 106 2
TME 67 2 101 7 84 18 90 11
THI-M ne - 74 7 ne - 89 24
TRI 88 12 97 6 102 6 92 2
ne No evaluado El nivel de adicioacuten es inferior al LOQ del meacutetodo para este compuesto
Para estudiar la reproducibilidad del meacutetodo analiacutetico global (correspondientes a los datos de preparacioacuten de
muestra y determinacioacuten) es decir la concordancia de varias medidas realizadas en diacuteas diferentes se procedioacute a la
extraccioacuten en las condiciones oacuteptimas tanto de vino blanco como tinto Las extracciones y determinaciones se
realizaron durante tres diacuteas consecutivos realizando tres reacuteplicas por vino y por diacutea con un nivel de adicioacuten en
muestra de 10 ngmL un blanco de muestra cada diacutea En la Tabla IV7 se muestran los resultados como
recuperaciones (R) en condiciones de reproducibilidad obtenidos para ambos tipos de vino dando valores entre
64-116 para muestras de vino blanco y valores situados entre 68-108 para muestras de vino tinto con la
excepcioacuten del TME para el que se ha obtenido un valor no aceptable en cuanto a la exactitud medida en
condiciones de reproducibilidad A la vista de los resultados obtenidos con estas pruebas se considera necesario el
empleo de IS adicionales para la mejora en la exactitud del meacutetodo para algunos compuestos por ejemplo el
TME
40
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Tabla IV7 Recuperaciones en condiciones de reproducibilidad (R plusmn SD) para vino blanco y tinto
Compuesto
Vino tinto Vino blanco
R
10 ngmL CV ()
R
10 ngmL CV ()
AME 90 5 101 13
BEN 96 5 102 7
BOS 97 6 100 8
CAR 97 3 94 5
CYP 103 3 105 12
DIM 104 7 106 8
FEH 90 16 83 15
FEP 91 5 90 4
FLU 103 7 102 6
IMI 99 14 101 14
IPR 91 5 100 13
MAN 108 5 108 13
MET 101 5 101 5
MYC 105 16 102 14
PEN 96 11 92 10
PYC 99 12 97 12
PYM 102 4 116 8
TEC 99 9 97 16
TEF 99 8 105 11
TBZ 68 4 84 5
TME 47 13 64 10
THI-M 107 11 104 16
TRI 95 14 103 4
En la Tabla IV8 se muestran los liacutemites de cuantificacioacuten (LOQs) del meacutetodo del meacutetodo de SPE-UPLC-ESI-
MSMS obtenidos para los diferentes pesticidas Los valores obtenidos son ideacutenticos a los LOQs instrumentales
excepto en el caso de aquellos compuestos para los que se observaronfuertes efectos de matriz (Tabla IV5) En
estos casos (CAR TBZ IMI y TME) los LOQs del meacutetodo se incrementan seguacuten la atenuacioacuten de sentildeal
observada
41
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Tabla IV8 Liacutemites de cuantificacioacuten LOQs (ngmL) del meacutetodo obtendos para cada compuesto
Compuesto LOQ (ngmL) Compuesto LOQ (ngmL)
AME 04 MET 01
BEN 01 MYC 04
BOS 02 PEN 02
CAR 03 PYC 02
CYP 02 PYM 01
DIM 07 TEC 05
FEH 05 TEF 01
FEP 01 TBZ 04
FLU 02 TME 02
IMI 06 THI-M 10
IPR 01 TRI 07
MAN 01
5 APLICACIOacuteN A MUESTRAS DE VINO COMERCIALES
Una vez optimizadas las condiciones del meacutetodo y estudiadas las caracteriacutesticas del meacutetodo desarrollado se aplicoacute
a la determinacioacuten de los compuestos de intereacutes estudiados en muestras de vino blanco y vino tinto comerciales
producidos en diferentes paiacuteses En la Tabla IV9 se muestra el paiacutes de origen de cada muestra comercial
identificadas con un coacutedigo alfanumeacuterico y antildeo de produccioacuten
42
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Tabla IV9 Coacutedigo asignado para los diferentes vinos comerciales blancos y tintos analizados Indicando el paiacutes de origen y
antildeo de produccioacuten
Coacutedigo Denominacioacuten de origen Antildeo de produccioacuten
bull Vinos Blancos
W1 Alemania 2014
W2 Espantildea 2012
W3 Espantildea 2016
W4 Portugal Desconocido
W5 Francia 2015
W6 Francia 2015
W7 Espantildea 2016
bull Vinos Tintos
R1 Espantildea 2015
R2 Sudaacutefrica 2015
R3 Chile 2015
R4 Francia 2015
R5 China Desconocido
R6 Espantildea 2016
R7 Australia 2014
R8 Francia 2013
R9 Francia 2015
A continuacioacuten en la Tabla IV10 y la Tabla IV11 se recogen los resultados obtenidos en el anaacutelisis de las
muestras comerciales Los datos obtenidos corresponden en todos los casos al uso de patrones de calibracioacuten
como teacutecnica de cuantificacioacuten
Tabla IV10 Concentracioacuten (ngmL) encontradas en las diferentes muestras de vino blanco comercial analizadas mediante
SPE-UPLC-MSMS n=2 reacuteplicas y al final el sumatorio de las concentraciones encontradas
Compuesto W1 W2 W3 W4 W5 W6 W7
AME 04 nd nd nd 41 nd nd
BEN nd nd 14 nd nd nd nd
BOS 84 102 520 54 197 nd nd
CAR nd 115 56 nd nd nd nd
CYP 08 59 112 nd nd 26 nd
43
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Compuesto W1 W2 W3 W4 W5 W6 W7
DIM 14 84 400 09 32 50 nd
FEH 85 809 639 15 187 nd nd
FLU 11 05 92 nd 77 32 nd
IMI nd 136 88 29 nd nd 69
IPR 30 749 1144 14 nd nd nd
MAN nd nd nd nd nd 30 nd
MET 04 273 494 63 nd nd 172
MYC 09 nd 35 nd nd nd nd
PYM 15 469 584 08 24 35 nd
TEC 11 nd 58 nd nd nd nd
TRI nd 67 61 nd nd nd nd
sumconcentracioacuten
(ngmL) 274 2868 4358 192 558 173 862
nd no detectado
Tabla IV11 Concentracioacuten (ngmL) encontradas en las diferentes muestras de vino tinto comercial analizadas mediante
SPE-UPLC-MSMS n= 2 reacuteplicas y al final el sumatorio de las concentraciones encontradas
Compuesto R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9
AME nd nd nd 30 nd nd nd nd 16
BEN nd nd nd 07 nd nd nd nd nd
BOS nd 55 21 196 nd nd nd 73 21
CAR nd nd 04 17 249 20 nd nd nd
CYP 34 08 02 22 nd 136 nd 85 nd
DIM nd 33 nd 52 233 46 nd 61 23
FEH nd nd nd 1070 nd 10 nd 1307 14
FLU nd nd nd 20 nd nd nd nd nd
IPR 16 nd nd 17 nd 22 nd nd nd
MAN nd nd nd 17 nd nd nd 20 nd
MET 126 nd nd 14 55 313 30 44 39
MYC nd nd nd 05 nd 32 nd nd nd
PYM 19 nd 03 185 49 281 nd 24 nd
TEC 25 06 39 29 nd nd nd 21 20
TEF nd 01 12 nd nd nd nd nd nd
sumconcentracioacuten
(ngmL) 220 48 81 1681 586 860 30 1635 133
nd no detectado 44
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
En los resultados de los anaacutelisis podemos observar que en ninguna de las muestras comerciales de vino blanco
aparecieron los siguientes compuestos FEP PEN PYC TEF TBZ THI-M y TME y en los vinos tintos
comerciales no aparece a ninguna concentracioacuten FEP IMI PEN PYC TBZ TME THI-M y TRI No se
detectaron para dichas muestras de vino a niveles superiores a los LOQs del meacutetodo propuesto
Cuando se detecta un compuesto positivo se compara el pico cromatograacutefico del compuesto con el de un patroacuten
verificando la coincidencia del tiempo de retencioacuten (maacutexima diferencia 01 min) y la relacioacuten entre transiciones
(maacutexima diferencia 30 ) En la Figura IV6 y la Figura IV7 se muestran los cromatogramas para el compuesto
CYP obtenido en condiciones oacuteptimas para la muestra de vino blanco W6 y en un patroacuten de 5 ngmL
respectivamente En este caso el intervalo de tolerancia para la relacioacuten de intensidad entre transiciones es
IP2IP1=061plusmn018
Figura IV6 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el CYP en la muestra W6 (26 ngmL) Transicioacuten
superior 226gt93 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 226gt108 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades IP2IP1= 066
Figura IV7 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el CYP en un patroacuten de 5 ngmL Transicioacuten
superior 226gt93 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 226gt108 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades IP2IP1=061plusmn018
45
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Otro ejemplo de compuesto positivo en abundantes muestras comerciales de estudio es el Metalaxyl positivo con
una concentracioacuten de 04 ngmL en el vino con referencia W1 (Figura IV8) y positivo con una concentracioacuten de
313 ngmL en el vino con referencia R6 (Figura IV9) Ambas se comparan con el cromatograma de un patroacuten
de Metalaxyl de 1 ngmL (Figura IV10) El grado de concordancia en los tiempos de retencioacuten y la relacioacuten de
intensidades entre transiciones es satisfactorio
Figura IV8 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el MET en la muestra W1 (04 ngmL) Transicioacuten
superior 2801gt2201 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 2801gt1921 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades
IP2IP1=056
Figura IV9 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el MET en la muestra R6 (313 ngmL) Transicioacuten
superior 2801gt2201 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 2801gt1921 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades IP2IP1=
056
46
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Figura IV10 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el MET en un patroacuten de 1 ngmL Transicioacuten
superior 2801gt2201 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 2801gt1921 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades
IP2IP1=057plusmn017
Es de destacar que aunque se detectaron bastantes pesticidas en las diferentes muestras de vino comerciales pero
en ninguacuten caso superaron el 10 de los LMRs permitidos en uvas tal y como se recomienda ya que todaviacutea no
existen LMRs para vino en la legislacioacuten vigente No obstante el nivel total de concentracioacuten (sumatorio de
concentraciones Tabla IV10 y Tabla VI11) es significativo para varias muestras tanto de vinos blancos (W2 y
W3) como tintos (R4 y R8)
47
Capiacutetulo V Conclusiones
CAPIacuteTULO V CONCLUSIONES
En este trabajo se ha estudiado un meacutetodo para la cuantificacioacuten de pesticidas concretamente veinte fungicidas y
tres insecticidas en vino blanco y tinto En la etapa de preparacioacuten de muestra se optimizoacute la extraccioacuten en fase
soacutelida (SPE) utilizando cartuchos OASIS HLB (200 mg) compuestos por divinilbenceno-N-vinilpirrolidona
(DVB-VP) como adsorbente Como teacutecnica de determinacioacuten se utilizoacute cromatografiacutea de liacutequidos con una
interfase de electroespray acoplada a espectrometriacutea de masas (UPLC-ESI-MSMS)
Las conclusiones generales obtenidas a partir de los resultados de este proyecto relativo a la determinacioacuten de
fitosanitarios en vino son
Ante los problemas de retencioacuten que presentan los cartuchos OASIS MAX (150 mg) para algunos
compuestos los cartuchos OASIS HLB (200 mg) junto con la combinacioacuten metanolacetonitrilo (2080)
como disolvente de elucioacuten son elegidos como mejor opcioacuten en la extraccioacuten en fase soacutelida de pesticidas
en muestras con matrices complejas como es el caso del vino Asiacute se consigue la retencioacuten selectiva de
componentes de la matriz y proporciona extractos con menor porcentaje de interferencias
El meacutetodo estudiado y optimizado se puede aplicar tanto a vinos blancos como a vinos tintos procesados
a partir de distintas variedades de uvas
Los liacutemites de cuantificacioacuten (LOQs) del estudio se situacutean la mayoriacutea por debajo de 10 ngmL excepto
en el caso de THI-M que asciende al valor de 20 ngmL El rango de respuesta lineal abarca hasta 200
ngmL y el tiempo de anaacutelisis ha sido de solo 10 minutos por muestra
En todas las muestras de vino (blancos y tintos) comerciales analizadas se han detectado la presencia de
varios pesticidas sin embargo todas las concentraciones encontradas se encuentran por debajo del 10
de los LMRs fijados en uvas tal y como recomienda la legislacioacuten por lo que no se considera
preocupante
48
Capiacutetulo V Conclusioacutens
CAPIacuteTULO V CONCLUSIOacuteNS
Neste traballo estudouse un meacutetodo para a cuantificacioacuten de pesticidas en particular vinte funxicidas e tres
insecticidas en vintildeo branco e maacuteis tinto No paso da preparacioacuten da mostra optimizouse a extraccioacuten en fase
soacutelida (SPE) empregando cartuchos OASIS HLB (200 mg) compostos por divinilbenceno-N-pirrolidona (DVB-
VP) como adsorbente Para a teacutecnica de determinacioacuten utilizouse cromatografiacutea de liacutequidos con unha interfase de
electroespray acoplada a espectrometriacutea de masas (UPLC-ESI-MSMS)
As conclusioacutens xerais a obtidas a partir dos resultados deste proxecto relativo aacute determinacioacuten de pesticidas en
vintildeo son
Ante os problemas de retencioacuten que mostraban os cartuchos OASIS MAX (150 mg) para alguacuten
compostos os cartuchos OASIS HLB (200 mg) en conxunto coa mistura metanolacetonitrilo (2080)
como disolvente de elucioacuten son elexidos como mellor opcioacuten na extraccioacuten en fase soacutelida de pesticidas
en mostras con matrices complexas como eacute o caso do vintildeo Asiacute eacute conseguida a retencioacuten selectiva de
componentes da matriz e proporciona extractos con menos porcentaxe de interferencias
O meacutetodo estudado e optimizado poacutedese aplicar tanto a vintildeos brancos coma tintos procesados a partir de
diferentes variedades de uvas
Os liacutemites de cuantificacioacuten do estudo (LOQs) son maacuteis baixos de 10 ngmL agaacutes no caso do THI-M
que ascende ao valor de 20 ngmL O rango de resposta lineal cobre ata 200 ngmL e o tempo de anaacutelise
foi de soacute 10 minuacutetos por mostra
En todas as mostras de vintildeo (brancos e tintos) comercial analizadas detectouse a presenza de varios
pesticidas maacuteis poreacuten todas as concentracioacutens atopadas son inferiores ao 10 dos LMR fixados en uvas
tal e como recomenda a lexislacioacuten polo que non se considera preocupante
49
Chapter V Conclusions
CHAPTER V CONCLUSIONS
In this work we have studied a method for the quantification of pesticides specifically twenty fungicides and
three insecticides in white and red wine In the sample preparation step the solid phase extraction was optimized
using cartridges OASIS HLB (200 mg) containing divinylbenzene-N-vinylpyrrolidone (DVB-VP) as adsorbent
As determination technique ultraperformance liquid chromatography was used with an electrospray interface
coupled to mass spectrometry (UPLC-ESI-MS7MS)
The general conclusions drawn from the results of this project concerning the determination of pesticides in wine
are
Due to the retention problems presented by the OASIS MAX sorbent (150 mg) for some compounds of
this project the cartridges OASIS HLB (200 mg) together with the methanolacetonitrile (2080) mixture
are chosen as the best option in the solid phase extraction of pesticides in samples with complex
matrices as is the case with the wine
The method studied and optimized can be applied to both white and red wines obtained from different
varieties of grapes
The limits of quantification (LOQs) were below 10 ngmL for most of the compounds except in the
case of THI-M with a LOQ of to 10 ngmL The linear response range covers up to 200 ngmL and the
analysis time was only 10 minutes per sample
In all commercial wine samples (white and red) analyzed the presence of several pesticides was
conformed however all the concentrations obtained are below 10 of the Maximum residue
levels(MRLs) fixed in grapes as recommended by legislation
50
VI Bibliografiacutea VI BIBLIOGRAFIacuteA [1] Ministerio de agricultura y pesca alimentacioacuten y medio ambiente mhttpwwwmapamagobesescalidad-y-evaluacion-ambientaltemasproductos-quimicosfitosanitarios (Acceso el diacutea 11052017) [2] httpwwwcricyteduarenciclopediaterminosProducFitohtm (Acceso el diacutea 11052017) [3] WERNER BALTES ldquoQuiacutemica de los alimentosrdquo Editorial Acribia SA 2007 Capiacutetulo 11 ldquoResiduos en los alimentosrdquo paacuteginas 206-217
[4] RLabrada JCCaseley CParker ldquoESTUDIO FAO PRODUCCIOacuteN Y PROTECCIOacuteN VEGETAL 120rdquo Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentacioacuten Roma 1996 ISSN 1014- Capiacutetulo 10 Herbicidas httpwwwfaoorgdocrepT1147St1147s00htmContents (Acceso el diacutea 12052017)
[5] Taberner Palou Andreu Cirujeda Ranzenberger Alicia Zaragoza Larios Carlos ldquoManejo de poblaciones de malezas resistentes a herbicidasrdquo (FAO Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura) 100 preguntas sobre resistencia PDF sacado de httpwwwfaoorg3a-a1422spdf (Acceso el diacutea 12052017) [6] BISSET Juan A Uso correcto de insecticidas control de la resistencia Revista Cubana de Medicina Tropical 2002 vol 54 no 3 p 202-219 [7] DEVINE Gregor J EZA Dominique Ogusuku Elena FURLONGMichael J Uso de insecticidas contexto y consecuencias ecoloacutegicas Revista peruana de medicina experimental y Salud Puacuteblica 2008 vol 25 no 1 p 74-100 [8] Ministerio de agricultura y ganaderiacutea (proteccioacuten agropecuaria servicio de diagnoacutestico fitosanitario) de costa Rica httpwwwmaggocrbibliotecavirtualH20-5054pdf (Acceso el diacutea 11052017) [9] GEPP V MONDINO P Control quiacutemico 2011 PDF obtenido de httpwwwpvfagroeduuyfitopatodocscursosfitopatoMaterialesGuiasC-QUIMICOpdf (Acceso el diacutea 772017) [10] ROSSLENBROICH Hans-Juergen STUEBLER Dietrich Botrytis cinereamdashhistory of chemical control and novel fungicides for its management Crop Protection 2000 vol 19 no 8 p 557-561 [11] Figura 11 httpwwwvitiviniculturanetbotritis-o-podredumbre-gris-botrytis-cinerea-pershtml (Acceso el diacutea 12052017) [12] CAMPBELL Paul BENDEK Carlos LATORRE Bernardo A Riesgo de oiacutedio (Erysiphe necator) de la vid en relacioacuten con el desarrollo de los racimos Ciencia e investigacioacuten agraria 2007 vol 34 no 1 p 5-11 [13] ldquoCoacutemo combatir el oiacutedio de la vidrdquo Jose Javier Peacuterez de Obanos Castillo PDF sacado de httpswwwnavarraesNRrdonlyres05E65D9B-D1A2-4EAD-9A63-AFF1D3215552135109Comocombatireloidiodelavidpdf (Acceso el diacutea 12052017) [14] Imagen 12 sacadas las 3 de httpwwwvitiviniculturanetoidio-de-la-vidhtml (Acceso el diacutea 12052017) [15] BARRIOS Gonccedilal REYES Joan Modelizacioacuten del Mildiu de la Vid 2004 httpwwwruralcatnetmigracio_resources617683_mildiusPDF (Acceso el diacutea 12052017) [16] Imaacutegenes sacadas de httpwwwvitiviniculturanetmildiu-de-la-vid-enfermedades-vinahtml (Acceso el diacutea 13052017) [17] HUQ Mainul MEISNER Craig DASGUPTA Susmita Health effects and pesticide perception as determinants of pesticide use evidence from Bangladesh httpagrisfaoorgagris-searchsearchdorecordID=US2012411738 (Acceso el diacutea 13052017)
51
IV Bibliografiacutea [18] BADII Mohammad H LANDEROS Jeroacutenimo Plaguicidas que afectan a la salud humana y la sustentabilidad CULCyT 2015 no 19 Revista vista en httpopenjournaluacjmxojsindexphpculcytarticleview454 (Acceso el diacutea 772017) [19] OLEA Nicolaacutes FERNAacuteNDEZ Mariana F Plaguicidas persistentes En Congreso Implementacioacuten del Convenio de Contaminantes Orgaacutenicos Persistentes Madrid 2001 p 26-27 [20] httpwwwfaoorgfao-who-codexalimentariusabout-codexes (Acceso el diacutea 14052017) [21] httpeceuropaeufoodplantpesticidesmax_residue_levels_en (Acceso el diacutea 14052017 [22] ORDONtildeEZ Juan A Cambero Rodriacuteguez MI Fernaacutendez Aacutelvarez L Garciacutea Sanz ML Garciacutea de Fernando Minguilloacuten GD de la Hoz Perales L Selgas Cortecero MD Tecnologiacutea de los alimentos Volumen 1 Componentes de los Alimentos y Procesos Siacutentesis Madrid 1998paacutegs 349-351 [23] CELA Rafael Casais Maria del Carmen Lorenzo Rosa Antonia Teacutecnicas de separacioacuten en quiacutemica analiacutetica Siacutentesis 2002 Capiacutetulo 11 Extraccioacuten y lixiviacioacuten por disolvente (paacutegs206-260) [24] CANTWELL Frederick F LOSIER Manon Liquidmdashliquid extraction Comprehensive Analytical Chemistry 2002 vol 37 p 297-340 [25] Imagen de LLE sacada de httpprocesosbiowikispacescomExtracciC3B3n+liquido-liquido (Acceso el diacutea 15052017) [26] HENNION Marie-Claire Solid-phase extraction method development sorbents and coupling with liquid chromatography Journal of Chromatography A 1999 vol 856 no 1 p 3-54 [27] CELA Rafael Casais Maria del Carmen Lorenzo Rosa Antonia Teacutecnicas de separacioacuten en quiacutemica analiacutetica Siacutentesis 2002 Capiacutetulo 16 Teacutecnicas de adsorcioacuten y absorcioacuten en la preparacioacuten de muestras Extraccioacuten y microextraccioacuten en fase soacutelida (paacutegs520-555) [28] Imagen spe sacada httptoxicocbblogspotcomes201310las-intoxicaciones-con-farmacoshtml (Acceso el diacutea 15052017) [29] Chaacutefer Pericaacutes Consuelo Acoplamiento microextraccioacuten en fase soacutelida-cromatografiacutea (2006) httprodericuveshandle1055014940 (Acceso el diacutea 16052017) [30] Imagen SPME httpwwwscieloorgcoscielophpscript=sci_arttextamppid=S0122-53832002000100005 (Acceso el diacutea 16052017) [31] MONTES GOYANES Rosa Mariacutea Avances en teacutecnicas de microextraccioacuten para la determinacioacuten de compuestos traza en muestras medioambientales y alimentarias Teacutesis doctoral Noviembre 2009 (Paacutegs 34-55) [32] LEHOTAY Steven J Ae Son Kyung KwonHyeyoung Koesukwiwat Urairat Fu Wusheng Mastovska Katerina Hoh Eunha Leepipatpiboon Natchanun Comparison of QuEChERS sample preparation methods for the analysis of pesticide residues in fruits and vegetables Journal of Chromatography A 2010 vol 1217 no 16 p 2548-2560 [33] Imagen QueChERS httpswwwresearchgatenetpublication279221361_QuEChERS_A_Sample_Preparation_for_Extraction_of_Carbaryl_from_Rat_Feces (Acceso el diacutea 16052017) [34] STASHENKO Elena E MARTIacuteNEZ Jairo Reneacute Preparacioacuten de la muestra un paso crucial para el anaacutelisis por GC-MS Uma publicaccedilatildeo trimestral do Instituto Internacional de Cromatografia (IIC) Ciecircncia Cromatograacutefica 2011 vol 3 no 1 [35] Imagen GC-MS httpsorgspectroscopyintblogspotcomes201411gas-chromatography-mass-spectrometry-gchtml (Acceso el diacutea 17052017) [36] httpwwwactlabscompageaspxmenu=65ampapp=221ampcat1=534amptp=2amplk=no (Acceso el diacutea 17052017)
52
IV Bibliografiacutea [37] Quintela O Cruz A Concheiro M De Castro A amp Loacutepez-Rivadulla M (2005) Metodologiacutea LC-MS Aspectos generales de la teacutecnica y sus aplicaciones en el campo de la toxicologiacutea Rev Toxicol 22 paacutegs7-14 [38] Imagen LC-MS httpsuploadwikimediaorgwikipediaenff9Liquid_chromatography_tandem_Mass_spectrometry_diagrampng (visto 18052017) [39] Vargas de la Cruz Celia Bertha Adaptacioacuten de la Metodologiacutea Analiacutetica para la determinacioacuten de residuos de plaguicidas en frutas nativas de exportacioacuten mediante Uplc-MsMs (2012) Tesis obtenida en http20062146130handlecybertesis2331 (Acceso el diacutea 772017) [40] ROMERO GONZAacuteLEZ Roberto Fernaacutendez Moreno Joseacute Luis Plaza Bolantildeos Patricia Garrido Frenich Antonia Martiacutenez Vidal Joseacute Luis Empleo de la espectrometriacutea de masas como herramienta para la determinacioacuten de toacutexicos en alimentos hacia la seguridad alimentaria Revista Espantildeola de salud puacuteblica 2007 vol 81 no 5 p 461-474 [41] PAYAacute Andrus Fundamento y Funciones de la Espectrometriacutea de Masas Universidad de Valencia Espantildea 2006 httpmuraluvescaloan (Acceso el diacutea 19052017) [42] Imagen MS sacada de httpsesslidesharenetMaYaTorrezespectrometria-demasas (Acceso el diacutea 21052017) [43] ECONOMOU Anastasios Botitsi Helen Antoniou Spyros Tsipi Despina Determination of multi-class pesticides in wines by solid-phase extraction and liquid chromatography-tandem mass spectrometry Journal of Chromatography A 2009 vol 1216 no 31 p 5856-5867 [44] FONTANA A R Rodriacuteguez I Ramil M Altamirano JC Cela R Liquid chromatography time-of-flight mass spectrometry following sorptive microextraction for the determination of fungicide residues in wine Analytical and bioanalytical chemistry 2011 vol 401 no 2 p 767-775 [45] PELAJIĆ Maja G Peček DM Pavlović DV Čepo Novel multiresidue method for determination of pesticides in red wine using gas chromatographyndashmass spectrometry and solid phase extraction Food chemistry 2016 vol 200 p 98-106 [46] Ignaz J Buerge Juumlrgen Krauss Rociacuteo Loacutepez-Cabeza Werner Siegfried Michael Stuumlssi Felix E Wettstein Thomas Poiger Stereoselective Metabolism of the Sterol Biosynthesis Inhibitor Fungicides Fenpropidin Fenpropimorph and Spiroxamine in Grapes Sugar Beets and Wheat Journal of Agricultural and Food Chemistry 2016 vol 64 no 26 p 5301-5309 [47] M Hu X Liu F Dong J Xu S Li H Xu Y Zheng Determination of ametoctradin residue in fruits and vegetables by modified quick easy cheap effective rugged and safe method using ultra-performance liquid chromatographytandem mass spectrometry Food chemistry 2015 vol 175 p 395-400 [48] WALORCZYK Stanisław DROŻDŻYŃSKI Dariusz GNUSOWSKI Bogusław Multiresidue determination of 160 pesticides in wines employing mixed-mode dispersive-solid phase extraction and gas chromatographyndashtandem mass spectrometry Talanta 2011 vol 85 no 4 p 1856-1870 [49] Tianyang Guo Pingping Fang Juanjuan Jiang Feng Zhan Wei Yong Jiahui Liu YiYang Dong Rapid screening and quantification of residual pesticides and illegal adulterants in red wine by direct analysis in real time mass spectrometry Journal of Chromatography A 2016 vol 1471 p 27-3 [50] GONZAacuteLEZ-RODRIacuteGUEZ R M CANCHO-GRANDE B SIMAL-GAacuteNDARA J Decay of fungicide residues during vinification of white grapes harvested after the application of some new active substances against downy mildew Food chemistry 2011 vol 125 no 2 p 549-560 [51] CARPINTEIRO I Ramil M Rodriacuteguez I Cela R Determination of fungicides in wine by mixed-mode solid phase extraction and liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry Journal of Chromatography A 2010 vol 1217 no 48 p 7484-7492
53
Capiacutetulo I Introduccioacuten
2 MEacuteTODOS DE PREPARACIOacuteN DE MUESTRA APLICADOS A MUESTRAS DE VINO
21 Extraccioacuten liacutequido-liacutequido (LLE)
Se entiende por extraccioacuten liacutequido-liacutequido al meacutetodo mediante el cual un analito de intereacutes se separa por el
contacto con otra fase en la cual tiene mayor afinidad de la matriz en la que se halle Los procesos de extraccioacuten
implican dos fases y requieren tres pasos sucesivos mezcla de materia prima y disolvente separacioacuten de las dos
fases despueacutes del contacto y eliminacioacuten del disolvente que contiene el analito [22]
La extraccioacuten liacutequido-liacutequido (LLE) se basa en la distribucioacuten
de un analito entre dos fases liacutequidas inmiscibles en las
cuales analito y matriz tienen solubilidades diferentes
Principalmente una de las fases es un medio acuoso en
general se trata de la muestra y la otra un disolvente
orgaacutenico La selectividad y eficacia de este meacutetodo vienen
determinadas por la eleccioacuten del disolvente y por los factores
que pueden afectar al proceso de equilibrio (pH adiccioacuten de
sales neutras en la fase acuosa para reducir la solubilidad del
analito etc) [23] Esta teacutecnica permite llevar a cabo extracciones para un rango muy amplio de analitos siendo
una de las maacutes antiguas para la preparacioacuten de muestras en el anaacutelisis cualitativo y cuantitativo Ofrece grandes
capacidades de muestreo lineal y cuenta con la ventaja de la cantidad de informacioacuten existente sobre este meacutetodo
[24]
22 Extraccioacuten en fase soacutelida (SPE)
En 1978 aparecieron los primeros cartuchos desechables para la extraccioacuten en fase soacutelida y actualmente casi 40
antildeos despueacutes la extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) es la teacutecnica de preparacioacuten de muestras maacutes empleada en los
laboratorios Es una teacutecnica de preparacioacuten y tratamiento de muestras que se basa en la retencioacuten en una fase
adsorbente del analito de intereacutes presente en una muestra liacutequida que pasa a traveacutes de ella Debido a la variedad de
formatos (discos cartuchos y jeringas) y tipos de adsorbentes (los maacutes comunes carboacuten activo aluacutemina siacutelica gel
silicato de magnesio siacutelices enlazadas y poliacutemeros como por ejemplo estinero-divinilbenceno) o la facilidad de
automatizacioacuten y acoplamiento con otras teacutecnicas como por ejemplo una conexioacuten directa con un sistema de
Figura I4 Fundamentos teoacutericos de la LLE [25]
11
Capiacutetulo I Introduccioacuten
cromatografiacutea este meacutetodo le fue ganando terreno a la LLE Otra ventaja muy importante de la SPE frente a la
LLE es la disminucioacuten en la cantidad de disolvente orgaacutenico empleada Cada vez se va innovando maacutes sobre esta
teacutecnica llegando a encontrarse fases adsorbentes formadas por poliacutemeros capaces de retener en un uacutenico
cartucho un amplio abanico de analitos lipofiacutelicos o hidrofoacutebicos aacutecidos baacutesicos o neutros [26]
El fundamento de esta extraccioacuten como se puede en la Figura I6
consiste en cuatro etapas acondicionamiento adiccioacuten de muestra
retencioacuten y elucioacuten de los analitos de intereacutes En primer lugar antes
de empezar la extraccioacuten se requiere una etapa de acondicionamiento
para preparar el adsorbente haciendo pasar un poco de disolvente
para asiacute interaccionar mejor con la muestra Luego se hace pasar la
muestra liacutequida por la fase soacutelida Idealmente el adsorbente retiene
los analitos selectivamente a medida que va pasando la muestra y la
matriz pasa sin ser retenida Por uacuteltimo los analitos se eluyen del
adsorbente con un disolvente con el que tenga mayor afinidad [27]
23 Teacutecnicas de microextraccioacuten
231 Microextraccioacuten en fase soacutelida (SPME)
En la microextraccioacuten en fase soacutelida (SPME) se utilizan fibras de siacutelice fundida revestidas con un poliacutemero en un
disentildeo en forma de jeringa para la extraccioacuten de los analitos de intereacutes El principio por el que se rige esta
extraccioacuten es el reparto del analito entre la matriz de la muestra y el revestimiento de la fibra mediante un proceso
no competitivo Se trata de un meacutetodo que cuenta con muchas ventajas ya que se elimina completamente el uso de
disolventes y aparte no son necesarios voluacutemenes de muestra grandes pero tambieacuten cuenta con algunas
desventajas ya que tanto la capacidad como la sensibilidad se ven limitadas [29]
En la figura I7 podemos ver las etapas de la extraccioacuten En un
vial cerrado con una caacutepsula y un seacuteptum tenemos la muestra
liacutequida o bien soacutelida que contenga los analitos de intereacutes
volaacutetiles Con la jeringa se perfora el seacuteptum y una vez dentro
se acciona el eacutembolo para la exposicioacuten de la fibra con los
analitos introducieacutendola en la muestra liacutequida o en su defecto
en el espacio de cabeza para la extraccioacuten de analitos volaacutetiles
de una muestra soacutelida Despueacutes de la extraccioacuten dentro del vial
Figura I6 Etapas de una SPE [28]
Figura I7 Etapas de una SPME [30]
12
Capiacutetulo I Introduccioacuten
la fibra se introduce de nuevo en la jeringa y se retira del vial [27]
232 Microextraccioacuten en fase liacutequida (LPME)
La microextraccioacuten en fase liacutequida se desarrolloacute como una alternativa a la LLE para la reduccioacuten en la cantidad de
disolventes orgaacutenicos siendo rentable tanto para el medioambiente como econoacutemicamente Entre las modalidades
maacutes populares de esta teacutecnica se encuentran microextraccioacuten con gota suspendida (SDME) y microextraccioacuten
liacutequido-liacutequido dispersiva (DLLME) En la SDME una gota de disolvente orgaacutenico es expuesta al espacio de
cabeza situado sobre una muestra en un vial dicha gota es suspendida del extremo de una microjeringa Por otro
lado la DLLME sobre una muestra acuosa se inyecta un pequentildeo volumen de una mezcla de disolventes en la
cual es dispersada formando una solucioacuten en la que se establece el equilibrio El disolvente de extraccioacuten debe
presentar una densidad inferior a la de la muestra para facilitar su recuperacioacuten normalmente despueacutes de
centrifugar el vial doacutende se realiza la extraccioacuten [31]
24 QuEChERS
La extraccioacuten QuEChERS de las palabras en ingleacutes Quick Easy Cheap Effective Rugged and Safe es un meacutetodo
de extraccioacuten que se desarrolloacute entre 2000 y 2002 para el anaacutelisis de pesticidas Como su nombre indica raacutepido
faacutecil barato eficaz robusto y seguro son las principales
caracteriacutesticas de esta preparacioacuten de muestra Se realiza en dos
etapas en primer lugar una extraccioacuten simple y una segunda fase
de purificacioacuten En la primera etapa tenemos el vial con la
muestra en el cual se antildeade un disolvente generalmente
acetonitrilo para la extraccioacuten de los analitos de intereacutes en
presencia de diferentes sales (en el meacutetodo original se utiliza
sulfato de magnesio y cloruro de sodio) para facilitar la separacioacuten
de las fases En la segunda parte se realiza la purificacioacuten de la
fraccioacuten del extracto orgaacutenico Para eso se lleva a cabo una
limpieza de los analitos eliminando el agua y los compuestos
presentes en la matriz de la muestra empleando un adsorbente PSA (amina primaria y secundaria) C18 carboacuten
negro grafitizado (GCB) o una combinacioacuten de eacutestas [32]
Figura I8 Etapas de QuEChERS [33]
13
Capiacutetulo I Introduccioacuten
3 METODOLOGIacuteA ANALIacuteTICA PARA LA DETERMINACIOacuteN DE PESTICIDAS
31 Meacutetodos de GC-MS (MSMS)
La combinacioacuten de cromatografiacutea de gases (GC) teacutecnica de separacioacuten con espectrometriacutea de masas (MS) como
sistema de deteccioacuten representa un potente meacutetodo para la identificacioacuten determinacioacuten y cuantificacioacuten de
analitos orgaacutenicos en concentraciones traza presentes en muestras complejas Esta teacutecnica de anaacutelisis cuenta con
muchas ventajas en sensibilidad multifuncionalidad buena reproducibilidad robustez asiacute como facilidad en el
manejo pero con una gran desventaja este meacutetodo no es apto para ser utilizado con todos los analitos sino que
se ve limitado a aquellos que sean termoestables y no se descompongan a temperaturas elevadas antes de ser
volatilizados La muestra es introducida a traveacutes del inyector en el cromatoacutegrafo de gases doacutende impulsada por
una corriente de gas inerte como fase moacutevil pasa a traveacutes de la columna que contiene la fase estacionaria en la
cual se separan los compuestos debido a una distribucioacuten de estos entre fase moacutevil-fase estacionaria Mediante
una interfase son introducidos para su deteccioacuten en el espectroacutemetro de masas que cuenta con una fuente de
iones analizador de masas y un detector [34]
La combinacioacuten de analizadores de masas en taacutendem (MSMS) como sistema de deteccioacuten en GC es una teacutecnica
altamente selectiva mejorando la sensibilidad y la relacioacuten sentildeal-ruido en los espectros experimentando una
mejora por lo que se logran unos liacutemites de deteccioacuten inferiores Esta teacutecnica GC-MSMS comprende maacutes
pasos despueacutes de la separacioacuten por cromatografiacutea se lleva a cabo la deteccioacuten con MSMS que consta de varias
etapas generacioacuten de iones en la fuente de ionizacioacuten seleccioacuten de los iones precursores de una determinada
masa disociacioacuten causada por colisioacuten con moleacuteculas de gas inerte de los iones precursores y por uacuteltimo el
anaacutelisis de los fragmentos en relacioacuten a su masacarga (mz) En el caso de que un espectro de MS no permita
confirmar la identidad de un determinado compuesto quiacutemico la obtencioacuten de su espectro de MSMS permite
mejorar la confianza en su identificacioacuten [36]
Figura I9 Acoplamiento GC-MS [35]
14
Capiacutetulo I Introduccioacuten
32 Meacutetodos LC-MS (MSMS)
La teacutecnica de LC-MS se desarrolloacute para minimizar las desventajas del acoplamiento GC-MS y asiacute resolver los
problemas que este uacuteltimo acarreaba con los analitos termolaacutebiles permitiendo el anaacutelisis de eacutestos sin tener que
realizar una etapa previa de derivatizacioacuten La interfase de unioacuten de cromatografiacutea liacutequida (LC) con espectrometriacutea
de masas (MS) acarrea una dificultad significativa siendo responsable de transformar los analitos que se
encontraban en la fase moacutevil liacutequida en iones en fase gas sin que se produzca su degradacioacuten teacutermica La
sensibilidad de las determinaciones por LC-MS va a depender de la interfase empleada Las principales interfases
empleadas actualmente son las ionizaciones a presioacuten atmosfeacuterica electrospray (ES) e ionizacioacuten quiacutemica a
presioacuten atmosfeacuterica (APCI) [37]
Con los antildeos la cromatografiacutea liacutequida se ha ido innovando y mediante la disminucioacuten del tamantildeo de partiacutecula en
la columna se fue mejorando la eficiencia asiacute como aumentando la selectividad y resolucioacuten del pico en el
cromatograma Para este nuevo sistema llamado UPLC Ultra-Performance Liquid Chromatography se desarrolloacute
una nueva instrumentacioacuten capaz de trabajar a altas presiones generando flujos mayores sin peacuterdidas de
resolucioacuten utilizando inyectores automaacuteticos maacutes raacutepidos y detectores con mayor velocidad de adquisicioacuten de
datos disminuyendo asiacute el tiempo de anaacutelisis [39]
33 Espectrometriacutea de masas
La espectrometriacutea de masas es el meacutetodo de deteccioacuten y cuantificacioacuten maacutes fiable a la hora de la determinacioacuten de
compuestos en matrices complejas (tales como alimentos) ya que otros detectores maacutes tradicionales como UV-
visible o fluorescencia cuentan con una gran incertidumbre en los resultados llegando incluso a ofrecer falsos
Figura I10 Acoplamiento LC-MS [38]
15
Capiacutetulo I Introduccioacuten
positivos o negativos Un espectrometro de masas cuenta con un dispositivo de introduccioacuten de muestra una
caacutemara de ionizacioacuten un sistema para la aceleracioacuten de los iones uno o varios analizadores de masas y un detector
[40]
El fundamento de la espectrometriacutea de masas se basa en la separacioacuten de iones en base a la relacioacuten masacarga
(mz) El proceso consta fundamentalmente de cuatro etapas La
primera es la ionizacioacuten de la muestra los iones formados se aceleran
debido a la accioacuten de un campo eleacutectrico variable separacioacuten de los
iones seguacuten su masacarga deteccioacuten de los iones y produccioacuten de la
sentildeal eleacutectrica El analizador de masas es el encargado de la separacioacuten
de los iones en funcioacuten a su mz entre los que maacutes destacan
analizador de masas cuadrupolar que dispersa simultaacuteneamente todos
los iones en funcioacuten de la relacioacuten mz analizador de masas de
tiempo de vuelo (TOF) consta de un tubo a alto vaciacuteo sobre el que no
actuacutea ninguacuten campo eleacutectrico al cual llegan todos los iones acelerados con la misma energiacutea cineacutetica y en el tubo
las velocidades variacutean seguacuten mz y analizador de trampa de iones en doacutende los iones gaseosos quedan aislados
durante largos periacuteodos de tiempo por la accioacuten del campo eleacutectrico [41]
4RESUMEN BIBLIOGRAacuteFICO DE LAS TEacuteCNICAS DE EXTRACCIOacuteN Y
DETERMINACIOacuteN DE PESTICIDAS EN VINO
En la bibliografiacutea se han descrito diversas teacutecnicas y diferentes combinaciones entre teacutecnicas de extraccioacuten y
distintas teacutecnicas de cuantificacioacuten e identificacioacuten para esos analitos Entre estas teacutecnicas los valores de los liacutemites
de cuantificacioacuten (LOQs) y las recuperaciones relativas pueden diferir en el resultado en un rango de valores asiacute
como el tiempo total empleado para el anaacutelisis y para la preparacioacuten de la muestra
Por lo general el meacutetodo de extraccioacuten de los analitos de intereacutes maacutes empleado es la extraccioacuten en fase soacutelida
(SPE) la cuaacutel le ha estado ganando terreno a la extraccioacuten liacutequido-liacutequido aunque tambieacuten se estaacute viendo cada vez
maacutes desplazada debido al creciente uso de la teacutecnica QuEChERS
Figura I11 Etapas de la espectrometriacutea de masas [42]
16
Capiacutetulo I Introduccioacuten
En el estudio de ECONOMOU et al [43] realizado en el antildeo 2009 en Grecia se empleoacute la extraccioacuten en fase
soacutelida con deteccioacuten en cromatografiacutea de liacutequidos acoplada a espectrometriacutea de masas en taacutendem (SPE-LC-ESI-
MSMS) Para la preparacioacuten de la muestra diluyeron 10 mL de vino (tanto blanco como tinto) a un volumen
final de 100 mL con agua ultrapura antes de la SPE Determinaron las recuperaciones de la extraccioacuten para dos
niveles de concentracioacuten 0010 y 0050 mgL realizando 8 medidas diarias durante 3 diacuteas consecutivos
encontraacutendose unos valores que variacutean dentro del rango 70-110 para todos los pesticidas en los dos niveles Para
la determinacioacuten y cuantificacioacuten de 46 pesticidas emplearon la teacutecnica de cromatografiacutea de liacutequidos con
espectrometriacutea de masas con un volumen de inyeccioacuten de 20 microL y un flujo de fase moacutevil de 02 mLmin
aclopada a espectrometriacutea de masas en taacutendem
Con la misma teacutecnica de extraccioacuten PELAJIĆ et al [45] durante el antildeo 2015 en Croacia llevaron a cabo la
determinacioacuten de 25 residuos de plaguicidas en vino tinto El meacutetodo que desarrollaron para dicha finalidad fue el
acoplamiento SPE-GC-MS Para la preparacioacuten de la muestra emplearon 10 mL de vino diluidos 11 con agua
ultrapura hasta un volumen final de 20 mL Calcularon las recuperaciones de la extraccioacuten y se encontroacute un rango
para todos los pesticidas en las muestras de 70-120 Para la determinacioacuten en cromatografiacutea de gases-
espectrometriacutea de masas se empleoacute un volumen de inyeccioacuten de 5 μL y un flujo de fase moacutevil de 10 mLmin
Mediante el acoplamiento de teacutecnicas SPE dispersiva-GC-MS WALORCZYK et al [48] en el antildeo 2011 en
Polonia llevaron a cabo la cuantificacioacuten de 160 pesticidas en diferentes clases de vino tinto rosado y blanco Con
10 g de vino y 10 mL de acetonitrilo se realizaron pruebas de recuperacioacuten en la fase de extraccioacuten para vino
tinto con los niveles de concentracioacuten 001 005 y 02 mgkg y para los vinos rosado y blanco con el nivel de
concentracioacuten 005mgkg y encontraron que a todos los niveles de concentracioacuten los valores de recuperacioacuten
rondan el rango 80-110 Para la teacutecnica cromatograacutefica se utilizoacute un volumen de inyeccioacuten de 5 microL
El acoplamiento LLE-SPE-LCDAD fue desarrollado por GONZAacuteLEZ-RODRIacuteGUEZ et al [50] en el antildeo
2010 en la provincia de Orense para la determinacioacuten de nuevos fungicidas propuestos para combatir el hongo
que provoca la enfermedad del mildium En la preparacioacuten de la muestra emplearon 15 mL de vino blanco para la
extraccioacuten en la cual fueron calculadas las recuperaciones relativas para dos niveles de concentracioacuten 005 y 05
mgkg en donde se establece un rango de entre 70-110 para todos los analitos Para la determinacioacuten mediante
cromatografiacutea de liacutequidos se empleoacute un volumen de inyeccioacuten de 2 μL y como meacutetodo de deteccioacuten utilizaron un
detector de diodos array
La microextraccioacuten sorptiva en fase soacutelida fue empleada en la publicacioacuten de FONTANA et al [44] junto con un
acoplamiento entre cromatografiacutea de liacutequidos y espectrometriacutea de masas para la determinacioacuten de 15 fungicidas
en vino realizada durante el 2010 en el noroeste de Espantildea Para la preparacioacuten de la muestra emplearon 10 mL
17
Capiacutetulo I Introduccioacuten
de vino diluiacutedos con el mismo volumen de agua ultrapura y un sorbente en forma de disco de silicona con un
volumen de 12 microL La recuperacioacuten de la extraccioacuten se calculoacute para vino tinto (Menciacutea) y vino blanco (Godello)
realizando tres replicas dentro de un mismo diacutea para los niveles de concentracioacuten 10 y 50 ngmL y nueve reacuteplicas
realizando el anaacutelisis en tres diacuteas consecutivos para el nivel de concentracioacuten de 25 ngmL y los resultados
obtenidos dan unos valores de recuperacioacuten dentro del rango 75-117 En el sistema LC-QTOF-MS el volumen
de inyeccioacuten fue de 15 microL
El otro meacutetodo de extraccioacuten mencionado anteriormente es QuEChERS estaacute en auge como meacutetodo de extracioacuten
de residuos de pesticidas en matrices como la del vino o la uva ya que incrementa la velocidad del anaacutelisis y reduce
el efecto de matriz BUERGE et al [46] seguido de una deteccioacuten mediante GC-MSMS realizaron una estapa
de extraccioacuten QuEChERS con alguna modificacioacuten acetato de sodio en lugar de cloruro soacutedico y acetato de etilo
en lugar de acetonitrilo utilizando 5 g de uva para la determinacioacuten de residuos de 4 pesticidas durante el antildeo
2016 Las recuperaciones de extraccioacuten resultaron ser valores entre 91-149 en uva a distintos niveles de
concentracioacuten 005 05 y 5 mgkg
Para la determinacioacuten de Ametoctradin HU et al [47] llevaron a cabo una extraccioacuten QuEChERS empleando 10
g de uva con deteccioacuten mediante el acoplamiento UPLC-MSMS utilizando un volumen de inyeccioacuten de 5 μL y
un flujo de fase moacutevil de 03 mLmin Las recuperaciones de la extraccioacuten se calcularon para tres niveles de
concentracioacuten 1 10 100 μgL de dos formas distintas en tres diacuteas consecutivos realizando 5 reacuteplicas al diacutea o en
dentro de un mismo diacutea realizando 15 reacuteplicas los resultados de todos los caacutelculos se encuentran dentro del rango
818-1001
Siguiendo con el mismo modo de extraccioacuten GUO et al [49] publicaron sus estudios para la determinacioacuten de
50 pesticidas y 12 adulterantes en vino tinto Para la extraccioacuten QuEChERS se utilizaron 10 mL de vino tinto con
10 mL de acetonitrilo y calcularon las recuperaciones para tres niveles de concentracioacuten 50 100 y 250 ngmL
encontraacutendose un rango de valores entre 75-120 El meacutetodo de deteccioacuten se llevoacute a cabo mediante un anaacutelisis
directo en tiempo real junto con espectrometriacutea de masas en tandem con un cuadrupolo (DART-MSMS) la
teacutecnica DART es un meacutetodo raacutepido para cribar y cuantificar los analitos de estudio que prescinde de la etapa de
separacioacuten cromatograacutefica
A continuacioacuten se recogen en la Tabla I3 los liacutemites de cuantificacioacuten (LOQs) de los analitos de intereacutes en este
trabajo caacutelculados por los diferentes meacutetodos encontrados en bibliografiacutea citados anteriormente en este apartado
18
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Tabla I3 LOQs de los analitos de intereacutes descritos para los distintos meacutetodos encontrados en la bibliografiacutea
Compuesto LOQs
Compuesto LOQs
V Blanco V Tinto Uva V Blanco V Tinto Uva
AME - - 0032μgkg[47] MET 86 μgL[43]
22 μgL[44]
89 μgL[43]
22 μgL[44]
5 μgL[45]
259 ngmL[49]
001mgkg[48]
BEN 02 μgL[44]
0001 mgL[50]
02 μgL[44]
001 μgL[45]
280ngmL[49]
005 mgkg[48] MYC 30 μgL[43]
08 μgL[44]
36 μgL[43]
10 μgL[44]
025 μgL[45]
331ngmL[49]
001 mgkg[48]
BOS 0065 mgL[50] 05 μgL[45]
1076 ngmL[49] 001 mgkg[48] PEN
56 μgL[43]
05 μgL[44]
49 μgL[43]
04 μgL[44]
220ngmL[49]
001 mgkg[48]
CAR - 386 ngmL[49] - PYC 0003mgL[50] 07 μgL[45] 001 mgkg[48]
CYP 15 μgL[43]
04 μgL[44]
0001 mgL[50]
22 μgL[43]
06 μgL[44]
312 ngmL[49]
001 mgkg[48] PYM 17 μgL[43] 22 μgL[43]
10 μgL[45] 001 mgkg[48]
DIM 18 μgL[43] 20 μgL[43] 001 mgkg[48] TEC 03 μgL[44]
03 μgL[44]
10 μgL[45]
160ngmL[49]
001 mgkg[48]
FEH 17 μgL[43] 22 μgL[43]
938 ngmL[49] 001 mgkg[48] TEF - 876ngmL[49] -
FEP - - 002mgkg[46] TBZ 15μgL [43] 29μgL[43] 001 mgkg[48]
FLU 005 μgL[45] TME - 25 μgL[45] 001 mgkg[48]
IMI 21 μgL[43] 22 μgL[43]
225 ngmL[49] - THI-M 92 μgL[43] 89 μgL[43] -
IPR 07 μgL[44] 07 μgL[44] 001 mgkg[48] TRI 10 μgL[44] 12 μgL[44] 001 mgkg[48]
MAN 0011 mgL[50] - -
5 DISTRIBUCIOacuteN DE PESTICIDAS EN VINOS COMERCIALES
En algunos de los meacutetodos descritos en el apartado anterior se procesaron vinos comerciales encontraacutendose
resultados positivos para muchos residuos de pesticidas y algunos hasta en gran concentracioacuten
ECONOMOU et al [43] mediante el meacutetodo LC-ESI-MSMS realizaron el anaacutelisis de 60 muestras de vino tinto
y blanco recogidos en supermercados locales en Grecia a lo largo de un antildeo El meacutetodo se habiacutea desarrollado
19
Capiacutetulo I Introduccioacuten
para la determinacioacuten de 46 pesticidas pero la mayoriacutea se encuentran con una concentracioacuten por debajo de
001mgL solo ocho plaguicidas se obtuvieron con resultados de concentracioacuten mayores Se muestran los
resultados en la Tabla I4 de los analitos de intereacutes en este estudio
Tabla I4 Nuacutemero de muestras positivas de distintos pesticidas en el anaacutelisis de 60 muestras de vino [43]
Compuesto Positivos con concentracioacuten entre 001-01
mgL
Positivos con concentracioacuten entre 01-1
mgL
PYM 2 (3) 2 (3)
MYC 2 (3) 0 (0)
CAR 11 (18) 7 (12)
THI-M 7 (12) 5 (8)
FEH 5 (8) 0 (0)
MET 1 (2) 0 (0)
Mediante el meacutetodo de microextraccioacuten en fase soacutelida-LC-TOF-MS FONTANA et al [44] aplicaron el
desarrollo del procedimiento a un total de 12 vinos joacutevenes elaborados en el 2010 y correspondientes a diferentes
denominaciones geograacuteficas del noroeste de Espantildea En la Tabla I5 se muestran los datos que han obtenido
Tabla I5 Determinacioacuten de fitosanitarios en vinos comerciales mediante Microextraccioacuten en fase soacutelida-LC-TOF-MS
Valores de concentracioacuten en ngmL [44]
Pesticidas
W 1
Albarintildeo
W5
Ribeiro
W6
Valdeorras
R1
Ribeira Sacra
R3
Ribeiro
R4
Valdeorras
MET 404plusmn06 223plusmn05 311plusmn007 25plusmn03 31plusmn03 74plusmn10
TRI nd nd 36plusmn06 nd nd ltLOQ
IPR 394plusmn03 324plusmn02 324plusmn02 071plusmn007 31plusmn02 28plusmn05
MYC nd nd nd ltLOQ 39plusmn02 nd
TEC 25plusmn01 nd nd nd nd nd
CYP 179plusmn08 ltLOQ ltLOQ 562plusmn002 083plusmn001 nd
BEN 042plusmn001 nd ltLOQ nd 032plusmn001 ltLOQ
ndNo detectados ltLOQ por debajo del liacutemite de cuantificacioacuten del meacutetodo los coacutedigos W y R corresponden respecti-vamente a los vinos blanco y tinto
20
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Por uacuteltimo PELAJIĆ et al [45] aplicaron su meacutetodo SPE dispersiva-GC-MS mediante el cual determinaron 25
residuos de plaguicidas en vino tinto a un total de 32 muestras de vino adquiridos en supermercados locales de
Croacia pero de diversos oriacutegenes de procedencia Los resultados que han obtenido se muestran en la Tabla I6
en doacutende un total de 15 plaguicidas han sido detectados y 7 de los cuales se encontraban en una alta
concentracioacuten
Tabla I6 Resultados de los vinos con positivos en pesticidas y sus concentraciones [45]
Vino Paiacutes Residuos de pesticidas (mgKg)
Tinto Francia DIM (0013) MET (0009) IPR (001)
Tinto Alemania BOS (0011)
Tinto Alemania IPR (0009)
Tinto Macedonia MET (0015)
Tinto Moldavia IPR (0008)
Tinto Polonia MET (004)
Tinto Rumania PYM (0058)
Tinto Espantildea TRI (0005) MET (0011)
Tinto Estados Unidos BOS (001)
Rosado Francia BOS (0005)
Blanco Chile TEC (0008)
Blanco Georgia MET (0057)
Blanco Alemania DIM (001) IPR (0054) PYM (0056)
Blanco Sudaacutefrica DIM (0011) IPR (0011)
21
Capiacutetulo II Objetivos y discusioacuten
CAPIacuteTULO II OBJETIVOS Y DISCUSIOacuteN
El objetivo principal que se persigue en este trabajo es el desarrollo de un meacutetodo analiacutetico raacutepido basado en la
extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) y deteccioacuten mediante cromatografiacutea de liacutequidos en la modalidad de UPLC
acoplada a la espectrometriacutea de masas en taacutendem (UPLC-MSMS) para la determinacioacuten multianalito de residuos
de fitosanitarios principalmente fungicidas aunque tambieacuten alguacuten insecticida en muestras de vino blanco y tinto
Para llevar a cabo la finalidad de lo dicho se consideran unos objetivos maacutes especiacuteficos
Minimizar la manipulacioacuten de la muestra para asiacute reducir la cantidad de disolventes y tiempo empleado
Optimizacioacuten de los factores que afectan en la extraccioacuten en la SPE tales como tipo y cantidad de
adsorbente volumen de eluyente etc
Estudio de las condiciones en UPLC-MSMS para una separacioacuten y cuantificacioacuten oacuteptimas
Caracterizacioacuten y validacioacuten del meacutetodo propuesto
Por uacuteltimo una vez cumplidos todos los objetivos anteriores y fijadas las condiciones oacuteptimas el meacutetodo
estudiado se aplica en el anaacutelisis de muestras de vino comercial (blanco y tinto) para determinar si se encuentran
residuos presentes asiacute como conocer en queacute concentracioacuten se encuentran los pesticidas objeto de este estudio
22
Capiacutetulo III Parte experimental
CAPIacuteTULO III PARTE EXPERIMENTAL
1 MATERIAL Y REACTIVOS
11 Material
Material de vidrio de uso comuacuten en el laboratorio vasos de precipitados matraces aforados etc
Micropipetas automaacuteticas de 20-200 microL 20-200 microL 100-1000 microL 1000-5000 microL Eppendorf
Puntas de plaacutestico para micropipetas
Encapsulador y desencapsulador
Soportes y pinzas
Viales de 15 mL transparentes para muestreador automaacutetico de cromatografiacutea (Sugelabor)
Caacutepsulas de aluminio con seacuteptum de Tefloacuten (Sugelabor) y tapones pre-slit para viales
Tubos y conectores de tefloacuten
Cartuchos de divinilbenceno-N-vinilpirrolidona 200 mg Oasis HLB Waters
Cartuchos de divinilbenceno-N-vinilpirrolidona funcionalizados con grupos amina cuaternaria 150 mg
Oasis MAX Waters
Cartuchos de divinilbenceno-N-vinilpirrolidona 60 mg Oasis HLB Waters
12 Reactivos y disolventes
Agua ultrapura Milli-Q
Aacutecido foacutermico (Sigma Aldrich) 95
Acetonitrilo (LichrosolvregMerck) Gradient grade for liquid chromatography
Metanol (LichrosolvregMerck) Gradient grade for liquid chromatography
Etanol (LichrosolvregMerck) Gradient grade for liquid chromatography
13 Patrones
Ametoctradin (AME) Dr Ehrenstrorfer 990
Benalaxyl (BEN) Pestanal Sigma- Aldrich 999
23
Capiacutetulo III Parte experimental
Boscalid (BOS) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Carbendazim (CAR) Pestanal Sigma- Aldrich 992
Cyprodinil (CYP) Pestanal Sigma- Aldrich 998
Dimethomorph (DIM) mezcla de isoacutemeros E + Z Pestanal Sigma- Aldrich 989
Fenhexamid (FEH) Pestanal Sigma- Aldrich 997
Fenpropidin (FEP) Dr Ehrenstrorfer 980
Fluopicolide (FLU) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Imidacloprid (IMI) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Iprovalicarb (IPR) mezcla de isoacutemeros Pestanal Sigma- Aldrich 985
Mandipropamid (MAN) Pestanal Sigma- Aldrich 991
Metalaxyl (MET) Pestanal Sigma- Aldrich 990
Myclobutanil (MYC) Pestanal Sigma- Aldrich 994
Penconazole (PEN) Pestanal Sigma- Aldrich 991
Pyraclostrobin (PYC) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Pyrimethanil (PYM) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Tebuconazol (TEC) Pestanal Sigma- Aldrich 996
Tebufenozide (TEF) Dr Ehrenstrorfer 988
Thiabendazole (TBZ) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Thiamethoxam (TME) Pestanal Sigma- Aldrich 996
Thiophanate-methyl (THI-M) Dr Ehrenstrofer 990
Triadimenol (TRI) Mezcla de diastereoisoacutemeros Pestanal Sigma- Aldrich 994
14 Patrones internos
Carbendazim-d3 (CAR-d3) Pestanal Sigma- Aldrich 998
Cyprodinil-d5 (CYP-d5) Pestanal Sigma- Aldrich
Imidacloprid-d4 (IMID-d4) Pestanal Sigma- Aldrich
Metalaxyl 13C6 (MET13C6) Pestanal Sigma-Aldrich 99
24
Capiacutetulo III Parte experimental
15 Gases
Nitroacutegeno 99999 como gas de colisioacuten en el espectroacutemetro de masas
Nitroacutegeno en los sistemas de concentracioacuten y secado por corriente de nitroacutegeno de los cartuchos SPE
2 INSTRUMENTACIOacuteN
Balanza analiacutetica de precisioacuten Sartorius
Granatario Sartorius
Bantildeo de ultrasonidos P-Selecta
Equipo de purificacioacuten de agua Millipore modelo Milli-Q gradient A-10ZMQSSVOT4
Estacioacuten de concentracioacuten por corriente de nitroacutegeno Mini-Vap Supelco
Sistema de secado de cartuchos de SPE por corriente de nitroacutegeno VisiDry Supelco
Sistema distribuidor de vaciacuteo Visiprep reg Supelco
Cromatoacutegrafo de liacutequidos de ultra-alta resolucioacuten Waters AcquityUPLC reg y espectroacutemetro de masas
Acquity TQD con analizador de triple quadrupolo (QqQ) equipado con una fuente de ionizacioacuten a
presioacuten atmosfeacuterica del tipo Z-spray (ESI)
3 PREPARACIOacuteN DE LAS DISOLUCIONES
Los patrones de pesticidas se prepararon individualmente a partir de los compuestos soacutelidos comerciales por
pesada excepto en el caso del fenpropidin (FEP) que se preparoacute a partir del compuesto liacutequido comercial Estos
compuestos soacutelidos se disolvieron en metanol y se obtuvieron unas disoluciones iniciales con concentraciones
recogidas en la Tabla III1
25
Capiacutetulo III Parte experimental
Tabla III1 Concentracioacuten de las disoluciones patroacuten stock
Compuesto Concentracioacuten (microgmL) Compuesto Concentracioacuten (microgmL)
AME 102201 MET 118912
BEN 138330 MYC 102017
BOS 99474 PEN 129791
CAR 17105 PYC 104581
CYP 131075 PYM 141386
DIM 103009 TEC 134729
FEH 99584 TEF 137769
FEP 100000 TBZ 105928
FLU 126859 TME 112283
IMI 101123 THI-M 124202
IPR 106739 TRI 118933
MAN 101021
4 LAVADO DEL MATERIAL
La limpieza del material de vidrio utilizado en el laboratorio se realizoacute utilizando jaboacuten y aclarando con agua de
grifo Luego en primer lugar se realiza un enjuague con agua Milli-Q finalmente un segundo enjuague con
acetona para eliminar posibles restos de compuestos orgaacutenicos y se deja secar sobre papel
Para la limpieza de los conectores de tefloacuten empleados en el proceso de SPE se introducen en un vaso de
precipitados con metanol y este en un bantildeo de ultrasonidos durante 10 minutos Al finalizar con el bantildeo de
ultrasonidos se realiza un enjuague con acetona y se pone a secar
5 EXTRACCIOacuteN DE MUESTRAS MEDIANTE SPE
El meacutetodo de extraccioacuten utilizado para la determinacioacuten de pesticidas fue la extraccioacuten en fase soacutelida (SPE)
mediante cartuchos Oasis HLB de 200 mg A continuacioacuten se describe el protocolo de extraccioacuten en las
condiciones oacuteptimas
26
Capiacutetulo III Parte experimental
1 Acondicionamiento del cartucho Oasis HLB de 200 mg con 2 mL de acetonitrilo seguidos de otros 2 mL de
vino sinteacutetico formado por la mezcla etanolagua MilliQ (1288)
2 Paso de la muestra 2 mL de vino diluiacutedos con 2 mL de agua MilliQ a traveacutes del cartucho por gravedad
3 Lavado del cartucho con 2 mL de agua MilliQ
4 Secado del cartucho durante 45 minutos en el VisiDry mediante el paso de una corriente de nitroacutegeno
5 Elucioacuten del cartucho con la mezcla metanolacetonitrilo en proporcioacuten 2080 hasta un volumen final de 2
mL
6 Anaacutelisis mediante cromatografiacutea liacutequida acoplada a espectrometriacutea de masas en taacutendem UPLC-MSMS
(volumen de inyeccioacuten 15 microL)
Representacioacuten esquematizada en la Figura III1
Figura III1 Extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) de las muestras de vino
27
Capiacutetulo III Parte experimental
6 CONDICIONES DE DETERMINACIOacuteN MEDIANTE UPLC-MSMS
En la Tabla III2 se indican las condiciones utlizadas en la determinacioacuten de los pesticidas de intereacutes mediante
LC-MSMS y en la Tabla III3 se muestra el gradiente de la fase moacutevil utilizado para la separacioacuten
cromatograacutefica
Tabla III2 Condiciones experimentales de determinacioacuten en LC-MSMS
UPLC Acquity UPLC-I-Class IVD System
bull Columna cromatograacutefica Zorbax Eclipse Plus C18 Rapid Resolution HD
Fase estacionaria C18
Dimensiones 21 x 50 mm
Tamantildeo de partiacutecula 18 microm
Temperatura del horno 40ordmC
bull Inyector
Volumen de inyeccioacuten 15 microL
bull Fase moacutevil
Flujo 04 mLmin
Fase acuosa (A) Agua MilliQ con 01 aacutecido foacutermico
Fase orgaacutenica (B) Acetonitrilo con 01 aacutecido foacutermico
MSMS WatersXevo TQD
Modo de ionizacioacuten ESI positivo
Voltaje del capilar 15 kV
Voltaje de cono 50 V
Temperatura de gas de secado (N2) 450ordmC
Flujo de gas de secado (N2) 1000 Lh
Modo de adquisicioacuten Centroide
Tabla III3 Gradiente de fase moacutevil utilizado en la separacioacuten cromatograacutefica (LC)
Tiempo min 0 13 28 64 75 76 10
A 98 50 50 0 0 98 98
B 2 50 50 100 100 2 2
28
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
CAPIacuteTULO IV RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
1 IDENTIFICACIOacuteN DE LOS COMPUESTOS
Para empezar el estudio en primer lugar se realizoacute la caracterizacioacuten de las condiciones de determinacioacuten de los
analitos en el modo Multiple Reaction Monitoring (MRM) mediante UPLC-ESI-MSMS Para llevarla a cabo se
tomaron patrones individuales de cada fitosanitario y mediante infusioacuten se estudiaron las posibles transiciones y
voltajes oacuteptimos para su determinacioacuten (Tabla IV1)
La ionizacioacuten por electrospray (ESI) se estudioacute tanto en modo positivo como en modo negativo encontraacutendose
que para todos los pesticidas de nuestro intereacutes se obteniacutea sentildeal en el modo positivo mientras el modo negativo
no presentaba respuesta significativa
A continuacioacuten se estudia el efecto del voltaje de cono en la respuesta del ioacuten molecular [M+H]+ aumentaacutendolo
hasta alcanzar el valor maacuteximo de la sentildeal correspondiente a dicho ioacuten y luego se optimiza la energiacutea de colisioacuten
variaacutendola para cada analito hasta obtener la sentildeal de mayor intensidad para cada uno de los iones producto Por
uacuteltimo una vez optimizado el voltaje de cono y la energiacutea de colisioacuten se seleccionan las dos transiciones maacutes
intensas para llevar a cabo la cuantificacioacuten y cualificacioacuten de cada analito en modo MRM Este procedimiento se
realizoacute para la totalidad de los compuestos confirmando los datos obtenidos con los facilitados por la base de
datos Quanpedia que estaacute disponible en el software del equipo utilizado para algunos de los compuestos
considerados
Compuesto Tr (min) Ion precursor (mz Da)
Voltaje de cono (V)
Ion producto 1 (CEv)
cuantificacioacuten
Ion producto 2 (CEv)
cualificacioacuten
Relacioacuten IP2IP1
AME 325 2760 60 176 (35) 70 (50) 016
BEN 485 3261 26 148 (20) 91 (34) 067
BOS 387 3429 41 140 (20) 307 (20) 011
CAR 167 1921 33 160 (18) 132 (28) 014
CYP 311 2260 56 93 (33) 108 (25) 061
DIM 322 3881 40 301 (20) 165 (30) 057
FEH 386 3021 41 97 (22) 55 (38) 044
FEP 257 2742 55 147 (28) 86 (28) 093
FLU 401 3830 40 173 (20) 365 (15) 010
IMI 218 2561 34 209 (15) 175 (20) 091
IPR 358 3211 28 119 (16) 203 (10) 042
Tabla IV1 Tiempos de retencioacuten (Tr) relacioacuten de iones precursores (mz) voltaje de cono (V) energiacuteas de colisioacuten (CE) y relacioacuten de intensidades entre transiciones (IP2IP1)
29
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Compuesto Tr (min) Ion precursor (mz Da)
Voltaje de cono (V)
Ion producto 1 (CEv)
cuantificacioacuten
Ion producto 2 (CEv)
cualificacioacuten
Relacioacuten IP2IP1
MAN 392 4120 25 328 (16) 125 (35) 063
MET 283 2801 26 220 (13) 192 (17) 057
MYC 365 2891 34 70 (18) 125 (32) 029
PEN 417 2840 34 70 (16) 159 (34) 031
PYC 523 3881 31 194 (12) 163 (25) 066
PYM 266 2000 51 107 (24) 82 (24) 071
TEC 397 3080 40 70 (22) 125 (40) 007
TEF 473 3531 19 133 (20) 297 (8) 072
TBZ 182 2020 51 175 (25) 131 (30) 062
TME 203 2920 28 211 (12) 132 (22) 047
THI-M 257 3430 28 151 (46) 93 (19) 0001
TRI 319 2961 21 70 (10) 99 (15) 013
El dwell time para cada una de las transiciones se ajustoacute de manera automaacutetica por el software (MassLinx) con
objeto de obtener doce puntos espectrales por compuesto tomando un valor promedio de cuatro segundos como
ancho de pico a liacutenea de base
2 CARACTERIZACIOacuteN DEL PROCEDIMIENTO DE DETERMINACIOacuteN (UPLC-ESI-
MSMS)
Una vez optimizados los paraacutemetros que afectan a la separacioacuten cromatograacutefica (UPLC) y a la determinacioacuten por
espectrometriacutea de masas en taacutendem (MSMS) se lleva a cabo la evaluacioacuten de la repetibilidad de inyeccioacuten y
determinacioacuten en esas condiciones Se expresa por medio de la desviacioacuten estaacutendar relativa (RSD) paraacutemetro que
nos indica el grado de correlacioacuten que existe entre varias medidas del mismo patroacuten realizadas por el mismo
operador en el laboratorio y en el mismo equipo de medida a lo largo de un diacutea Para el estudio se realizan diez
inyecciones con volumen de 15 microL de dos patrones con distintos niveles de concentracioacuten 5 y 20 ngmL Los
datos de RSD (Tabla IV2) para las aacutereas de pico de los analitos se situacutean para el nivel de concentracioacuten 5 ngmL
en el rango 2-13 y en el nivel de concentracioacuten 20 ngmL en el rango 1-7
30
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten Tabla IV2 Desviacioacuten estaacutendar relativa (RSD) del aacuterea de pico (transicioacuten de cuantificacioacuten) para evaluar la repetivilidad del proceso de LC-MSMS
Compuesto RSD
5 ngmL
RSD
20 ngmL Compuesto
RSD
5 ngmL
RSD
20 ngmL
AME 5 2 MET 3 2
BEN 2 2 MYC 9 2
BOS 4 5 PEN 4 4
CAR 4 2 PYC 3 1
CYP 5 7 PYM 7 3
DIM 6 5 TEC 3 2
FEH 7 4 TEF 4 2
FEP 4 2 TBZ 2 1
FLU 5 3 TME 6 6
IMI 13 7 THI-M a 6
IPR 8 2 TRI 8 6
MAN 3 2
A continuacioacuten tambieacuten se evaluoacute la repetibilidad de los tiempos de retencioacuten (Tr) para diez inyecciones de
patrones a los dos niveles de concentracioacuten 5 y 20 ngmL situaacutendose las RSD para todos los compuestos en el
rango 01-03 En base a este dato la ventana de tiempo en la que se registran las transiciones de MRM de cada
compuesto se fijoacute en 05 min lo que es lo mismo 025 min alrededor del valor medio de su tiempo de retencioacuten
Por otro lado la linealidad del meacutetodo se estudioacute a nueve niveles de concentracioacuten diferentes comprendidos ente
los niveles 05 ngmL y 200 ngmL mediante la inyeccioacuten de disoluciones patroacuten de los distintos compuestos de
estudio Se realizoacute una evaluacioacuten sin y otra con patroacuten interno (IS) antildeadiendo una concentracioacuten fija de patrones
internos a nivel de 25 ngmL y pudimos observar que los resultados mejoran notablemente al realizar una
correccioacuten con el IS En la Tabla IV3 se muestran los coeficientes de determinacioacuten (R2) obtenidos al realizar la
correccioacuten mediante IS observando que para todos los compuestos excepto para THI-M y para TRI los
coeficientes de correlacioacuten son superiores a 0990 por lo que existe una respuesta lineal en el rango de
concentraciones que hemos estudiado
Aparte del estudio de la linealidad tambieacuten se han estudiado los liacutemites de cuantificacioacuten instrumentales del
meacutetodo (LOQs) Para ello los LOQs se evaluacutean como la miacutenima cantidad de analito que origina una sentildeal 10
veces superior a la desviacioacuten estaacutendar del ruido Los valores anteriores se estimaron a partir del patroacuten de
a no evaluado ya que se encuentra por debajo del liacutemite de cuantificacioacuten del meacutetodo
31
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
concentracioacuten maacutes baja que presenta un pico con una relacioacuten SN superior a 10 En la Tabla IV3 tambieacuten se
recogen estos LOQs en doacutende podemos ver que variacutean en el rango 01-1 ngmL excepto para THI-M que se
desviacutea a valores de 10 ngmL
Tabla IV3 Coeficientes de determinacioacuten (R2) y liacutemites de cuantificacioacuten instrumentales (LOQs) de los analitos para nueve
niveles de concentracioacuten de 05 a 200 ngmL
Compuesto Coeficiente de
correlacioacuten (R2)
LOQs (ngmL) Compuesto
Coeficiente de correlacioacuten
(R2)
LOQs (ngmL)
AME 09951 04 MET 09933 01
BEN 09949 01 MYC 09950 04
BOS 09979 02 PEN 09945 02
CAR 09923 02 PYC 09955 02
CYP 09878 02 PYM 09931 01
DIM 09938 07 TEC 09958 05
FEH 09959 05 TEF 09957 01
FEP 09931 01 TBZ 09942 02
FLU 09965 02 TME 09903 01
IMI 09979 05 THI-M 09580 100
IPR 09938 01 TRI 09867 07
MAN 09979 01
En la Figura IV1 y Figura IV2 se muestran dos ejemplo de curvas de calibrado para dos compuestos IMI y
MAN respectivamente
Figura IV1 Curva de calibrado y coeficiente de determinacioacuten de IMI para UPLC-ESI-MSMS
32
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Figura IV2 Curva de calibrado y coeficiente de determinacioacuten de MAN para UPLC-ESI-MSMS
3 ESTUDIO DEL MEacuteTODO SPE
La extraccioacuten de pesticidas se llevoacute a cabo mediante extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) en doacutende se realizaron
diversos estudios con diferentes condiciones para dar con las oacuteptimas En primer lugar se llevaron a cabo los
experimentos de retencioacuten y elucioacuten sobre dos tipos distintos de adsorbentes cartuchos OASIS HLB (200mg) y
cartuchos OASIS MAX (150 mg) como fases potenciales en las que llevar a cabo la extraccioacuten de manera
selectiva Los dos tipos de cartuchos son de fase reversa pero difieren entre siacute en el fundamento de retencioacuten de
los analitos En los cartuchos OASIS HLB (200 mg) formados por divinilbenceno-N-vinilpirrolidona (DVB-VP)
la retencioacuten de los diferentes analitos tiene lugar por interacciones π-π o de Van der Waals mientras que los
cartuchos OASIS MAX (150 mg) que se probaron como alternativa para mejorar la selectividad en la extraccioacuten
cuentan con un adsorbente polimeacuterico de modo mixto formado por divinilbenceno-N-vinilpirrolidona (DVB-VP)
funcionalizado con grupos amina cuaternaria siendo el fundamento de la extraccioacuten la combinacioacuten de las
propiedades adsorbentes del cartucho HLB con un mecanismo adicional de intercambio ioacutenico (anioacutenico) [27]
Algunos autores han empleado este mecanismo para mejorar la selectividad de la extraccioacuten de forma que en la
etapa de elucioacuten ciertos pigmentos del vino quedan fuertemente retenidos en el adsorbente a diferencia de lo que
ocurre con los adsorbentes de fase reversa [51]
Para llevar a cabo la eleccioacuten del tipo de adsorbente se realizaron pruebas con 10 mL de vino blanco y tinto
conectando en serie los dos tipos de cartuchos HLB (200 mg) y MAX (150 mg) a un segundo cartucho OASIS
HLB (60 mg) La elucioacuten de los analitos se hace de forma independiente para cada cartucho y se evaluacutea si los
analitos pasan del primer cartucho hacia el segundo cartucho es decir si se supera el volumen de corte o si por
33
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
otro lado se quedan retenidos en el primero y no eluyen hacia el segundo En estas pruebas de estudio
preliminares de preparacioacuten de la muestra no se ha incluido el CYP
En la Figura IV3 podemos ver la eficacia de la extraccioacuten para vino blanco y tinto que obtenemos empleando
cartuchos OASIS MAX (150 mg) conectados en serie con cartuchos OASIS HLB (60 mg) realizando la
extraccioacuten de tres fracciones de 2 mL cada una del cartucho OASIS MAX (150 mg) y una cuarta fraccioacuten de 2
mL del cartucho OASIS HLB (60 mg)
Por otro lado en la Figura IV4 podemos ver un graacutefico de columnas en el cual comparamos la eficacia de
extraccioacuten de los cartuchos OASIS HLB (200 mg) con dos disolventes de elucioacuten distintos En dicho graacutefica el
acroacutenimo de cada compuesto consta de dos barras cuyo significado es el siguiente la barra de la izquierda indica
la eficacia de la extraccioacuten empleando acetonitrilo (ACN) como disolvente de elucioacuten y la barra de la derecha
indica la eficacia de la extraccioacuten empleando la combinacioacuten MetanolAcetonitrilo (2080) (MeOHACN) como
disolvente de elucioacuten Para este adsorbente no se detectoacute ninguacuten compuesto en la extraccioacuten del segundo
cartuchos OASIS HLB (60 mg) empleando 2 mL de metanol
Figura IV3 Distribucioacuten de los compuestos en cada fraccioacuten obtenidas con cartuchos OASIS MAX (150 mg)
utilizando 10 mL de vino tinto y blanco sacando cuatro fracciones de 2 mL cada una con metanol como
disolvente de elucioacuten
34
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Figura IV4 Distribucioacuten de los compuestos en cada fraccioacuten obtenidas con cartuchos OASIS HLB (200 mg) utilizando 10
mL de vino tinto y blanco sacando 3 fracciones de 2 mL cada una con acetonitrilo (ACN) (columna de la izquierda) y una
combinacioacuten MetanolAcetonitrilo (2080) (MeOHACN) (columna de la derecha) como disolventes de elucioacuten
A la vista de los resultados reflejados en las graacuteficas podemos afirmar que cuando se utiliza el cartucho OASIS
HLB (200 mg) eluyendo con acetonitrilo o la combinacioacuten metanolacetonitrilo (2080) los extractos son limpios
y se eluyen la mayoriacutea de los compuestos en la primera fraccioacuten Pero utilizando acetonitrilo como disolvente de
elucioacuten se encuentran problemas en la extraccioacuten de CAR FEH y TBZ para los que es necesario emplear un
volumen mayor de elucioacuten o bien seleccionar otro disolvente de elucioacuten como es la combinacioacuten
metanolacetonitrilo
35
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Por otro lado los extractos en los cartuchos OASIS MAX (150 mg) son maacutes limpios incluso utilizando metanol en
la elucioacuten pero se detecta la presencia de CAR FEP TBZ y TME en el segundo cartucho OASIS HLB (60 mg)
significando la rotura del primer cartucho para dichos analitos considerando un volumen de 10 mL de vino Los
demaacutes compuestos se podriacutean recuperar cuantitativamente en la primera fraccioacuten sacada pero la peacuterdida de estos
compuestos inclina la eleccioacuten hacia los cartuchos OASIS HLB (200 mg) con metanolacetonitrilo (2080) como
disolvente de elucioacuten para continuar con el estudio
Una vez fijado el adsorbente y el volumen de elucioacuten se prueba la eficacia de la SPE independiente de los efectos
de matriz En la Tabla IV4 se muestran las recuperaciones de la SPE tomando 10 mL de vino blanco y tinto
con un nivel de adicioacuten de 15 ngmL sacando una sola fraccioacuten de 2 mL con la combinacioacuten
metanolacetonitrilo (2080) y n=3 reacuteplicas
Tabla IV4 Recuperaciones (R plusmn SD) de SPE para 10 mL de vino (blanco y tinto) con un nivel de adicioacuten de 15 ngmL y
n=3 reacuteplicas
Compuesto Vino Tinto
R plusmn SD
Vino Blanco
R plusmnSD Compuesto
Vino Tinto
R plusmn SD
Vino Blanco
R plusmn SD
AME 82 plusmn 7 100 plusmn 1 MET 92 plusmn 6 94 plusmn 3
BEN 89 plusmn 6 97 plusmn 3 MYC 90 plusmn 9 86 plusmn 4
BOS 95 plusmn 1 100 plusmn 2 PEN 84 plusmn 10 103 plusmn 3
CAR 91 plusmn 6 104 plusmn 6 PYC 86 plusmn 5 106 plusmn 1
CYP 81 plusmn 7 102 plusmn 3 PYM 87 plusmn 12 94 plusmn 3
DIM 97 plusmn 3 86 plusmn 4 TEC 83 plusmn 10 103 plusmn 1
FEH 89 plusmn 3 88 plusmn 3 TEF 84 plusmn 5 108 plusmn 4
FEP 91 plusmn 7 104 plusmn 3 TBZ 88 plusmn 7 92 plusmn 5
FLU 91 plusmn 2 97 plusmn 4 TME 101 plusmn 1 110 plusmn 13
IMI 117 plusmn 8 101 plusmn 11 THI-M 85 plusmn 9 110 plusmn 4
IPR 89 plusmn 7 112 plusmn 4 TRI 85 plusmn 10 110 plusmn 4
MAN 88 plusmn 2 87 plusmn 2
Algunos compuestos de la matriz en el vino pueden competir con los analitos durante el proceso de ionizacioacuten
que tiene lugar en la interfase entre UPLC-MSMS por lo que para la cuantificacioacuten del rendimiento de la
ionizacioacuten por electrospray (ESI) se estudian los efectos de matriz (EM) para vino blanco y tinto considerando
dos voluacutemenes de muestra distintos 2 y 10 mL y un volumen final del extracto de 2 mL En la Tabla IV5 se
36
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
exponen los valores para cada compuesto notando que al aumentar el volumen de muestra tambieacuten se aumentan
los efectos de matriz y eacutestos siempre son mayores en vino tinto Para el caacutelculo de estos efectos de matriz (EM)
se emplea la siguiente ecuacioacuten
Donde Am Ab y Ap representan el aacuterea de pico en la sentildeal medida del analito en el extracto de la muestra con
adicioacuten en el extracto de la muestra sin adicioacuten (o blanco) y en el patroacuten antildeadido respectivamente El nivel de
adicioacuten en extracto fue de 50 ngmL por compuesto
Tabla IV5 Efectos de matriz para vino blanco y tinto con un volumen inicial de 2 y 10 mL evaluados para un nivel de adicioacuten de 50 ngmL en extracto
Compuesto
Vino blanco Vino tinto
2 mL 10 mL 2mL 10 mL
EM () CV () EM () CV () EM () CV () EM () CV()
AME 93 3 95 2 99 3 101 7
BEN 99 1 93 2 101 3 100 6
BOS 97 5 98 1 108 2 96 0
CAR 62 2 50 3 58 2 55 6
CYP 94 3 91 1 97 2 95 7
DIM 105 2 95 3 100 3 108 3
FEH 100 4 102 4 105 4 94 3
FEP 95 3 88 2 96 2 92 7
FLU 98 2 93 2 106 1 101 2
IMI 84 4 46 3 48 10 18 8
IPR 99 3 92 3 105 1 100 7
MAN 100 1 94 3 109 4 107 2
MET 98 1 89 1 99 2 99 6
MYC 105 1 100 1 103 2 96 9
PEN 98 3 97 1 101 3 99 10
PYC 98 2 92 3 102 2 98 5
PYM 95 2 87 1 94 3 85 12
TEC 95 3 99 1 101 1 102 10
TEF 99 1 92 3 101 2 104 5
TBZ 45 0 40 5 43 2 30 7
TME 60 6 19 16 36 4 16 1
THI-M 107 2 109 2 103 1 96 9
TRI 97 3 118 4 104 5 117 10
37
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Al observar los resultados podemos ver que la mayoriacutea de los compuestos dan resultados de EM en torno al
100 lo que significa que no sufren una modificacioacuten importante en la eficacia de ionizacioacuten para las muestras
con respecto a los patrones Pero tambieacuten por el contrario podemos observar que algunos compuestos como
por ejemplo en el caso de CAR TBZ IMI y TME experimentan una gran supresioacuten de sentildeal es decir EM bajos
que se acentuacutean al aumentar el volumen de muestra La atenuacioacuten en la eficacia de variacioacuten para estos cuatro
compuestos no solo se ve incrementada con el volumen de muestra si no que ademaacutes es maacutes significativa para
vino tinto que para vino blanco En base a estos resultados aunque la eficacia de la SPE fue cuantitativa para
muestras de 10 mL se limitoacute el volumen de muestra a extraer a 2 mL
Las condiciones oacuteptimas de extraccioacuten se esquematizan en un resumen en la Figura IV5
Figura IV5 Condiciones optimizadas para la extraccioacuten de pesticidas en vino
38
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
4 CARACTERIZACIOacuteN DEL MEacuteTODO DE DETERMINACIOacuteN
Con las condiciones de extraccioacuten y determinacioacuten citadas anteriormente se llevaron a cabo pruebas de
recuperaciones absolutas de los compuestos a nivel de adicioacuten de 5 y 20 ngmL sobre las muestras Para cada
muestra y nivel de adicioacuten se realizaron tres reacuteplicas de las muestras con adicioacuten y los blancos aliacutecuotas de las
mismas muestras sin adicioacuten se procesaron en duplicado Los IS se antildeadieron a nivel de 25 ngmL y cada uno se
utiliza para corregir unos determinados compuestos CAR-d3 se emplea para CAR y TBZ el CYP-d5 para CYP y
PYM el IMID-d4 para IMI y TME y el MET13C6 para el resto de compuestos Los resultados para vino blanco
comprenden en el nivel de concentracioacuten 5 ngmL el rango entre 79-122 y en el nivel de concentracioacuten 20
ngmL el rango entre 84-109 Por otro lado en el caso del vino tinto las recuperaciones se encuentran para el
nivel de concentracioacuten 5 ngmL en el rango 67-112 y para el nivel de concentracioacuten 20 ngmL entre el rango
73-132 Los resultados obtenidos en las pruebas con vino blanco y vino tinto se muestran en la Tabla IV6
Los resultados son satisfactorios ya que la mayoriacutea de los compuestos se ajustan en todos los casos al rango de
recuperacioacuten entre 70-120 Para la realizacioacuten de estas pruebas se ha eliminado de los resultados el compuesto
THI-M debido a que las concentraciones utilizadas se encuentran en el liacutemite o por debajo del LOQ en los
experimentos con muestras adicionadas a 5 ngmL
Para calcular las recuperaciones (R) se recurrioacute a la siguiente ecuacioacuten
Donde Cm Cb y Cp son la concentracioacuten medida de analito en el extracto de la muestra con adicioacuten en el extracto
de la muestra sin adicioacuten (o blanco) y en el patroacuten antildeadido respectivamente
Tabla IV6 Recuperaciones (R) para vino tinto y vino blanco evaluadas para dos niveles de concentracioacuten 5 y 20 ngmL
Compuesto
Vino tinto Vino Blanco
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
AME 97 3 105 6 104 9 96 5
BEN 88 11 105 3 101 1 98 4
BOS 91 13 110 2 88 13 97 3
39
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Compuesto
Vino tinto Vino blanco
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
CAR 99 6 99 3 122 3 109 1
CYP 91 2 111 1 101 4 100 6
DIM 112 3 110 9 102 24 99 11
FEH 91 4 108 0 102 20 95 2
FEP 89 8 102 7 94 5 84 1
FLU 95 10 104 4 109 5 100 8
IMI 73 11 115 9 80 13 100 2
IPR 84 13 99 3 111 3 99 4
MAN 88 22 112 8 112 3 99 4
MET 99 3 106 5 106 3 98 2
MYC 84 9 106 13 88 17 86 3
PEN 84 9 102 5 84 8 90 5
PYC 96 6 105 4 100 2 95 4
PYM 90 12 112 14 106 4 97 1
TEC 89 8 101 6 98 12 94 1
TEF 93 10 102 5 107 2 97 3
TBZ 94 17 115 8 79 5 106 2
TME 67 2 101 7 84 18 90 11
THI-M ne - 74 7 ne - 89 24
TRI 88 12 97 6 102 6 92 2
ne No evaluado El nivel de adicioacuten es inferior al LOQ del meacutetodo para este compuesto
Para estudiar la reproducibilidad del meacutetodo analiacutetico global (correspondientes a los datos de preparacioacuten de
muestra y determinacioacuten) es decir la concordancia de varias medidas realizadas en diacuteas diferentes se procedioacute a la
extraccioacuten en las condiciones oacuteptimas tanto de vino blanco como tinto Las extracciones y determinaciones se
realizaron durante tres diacuteas consecutivos realizando tres reacuteplicas por vino y por diacutea con un nivel de adicioacuten en
muestra de 10 ngmL un blanco de muestra cada diacutea En la Tabla IV7 se muestran los resultados como
recuperaciones (R) en condiciones de reproducibilidad obtenidos para ambos tipos de vino dando valores entre
64-116 para muestras de vino blanco y valores situados entre 68-108 para muestras de vino tinto con la
excepcioacuten del TME para el que se ha obtenido un valor no aceptable en cuanto a la exactitud medida en
condiciones de reproducibilidad A la vista de los resultados obtenidos con estas pruebas se considera necesario el
empleo de IS adicionales para la mejora en la exactitud del meacutetodo para algunos compuestos por ejemplo el
TME
40
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Tabla IV7 Recuperaciones en condiciones de reproducibilidad (R plusmn SD) para vino blanco y tinto
Compuesto
Vino tinto Vino blanco
R
10 ngmL CV ()
R
10 ngmL CV ()
AME 90 5 101 13
BEN 96 5 102 7
BOS 97 6 100 8
CAR 97 3 94 5
CYP 103 3 105 12
DIM 104 7 106 8
FEH 90 16 83 15
FEP 91 5 90 4
FLU 103 7 102 6
IMI 99 14 101 14
IPR 91 5 100 13
MAN 108 5 108 13
MET 101 5 101 5
MYC 105 16 102 14
PEN 96 11 92 10
PYC 99 12 97 12
PYM 102 4 116 8
TEC 99 9 97 16
TEF 99 8 105 11
TBZ 68 4 84 5
TME 47 13 64 10
THI-M 107 11 104 16
TRI 95 14 103 4
En la Tabla IV8 se muestran los liacutemites de cuantificacioacuten (LOQs) del meacutetodo del meacutetodo de SPE-UPLC-ESI-
MSMS obtenidos para los diferentes pesticidas Los valores obtenidos son ideacutenticos a los LOQs instrumentales
excepto en el caso de aquellos compuestos para los que se observaronfuertes efectos de matriz (Tabla IV5) En
estos casos (CAR TBZ IMI y TME) los LOQs del meacutetodo se incrementan seguacuten la atenuacioacuten de sentildeal
observada
41
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Tabla IV8 Liacutemites de cuantificacioacuten LOQs (ngmL) del meacutetodo obtendos para cada compuesto
Compuesto LOQ (ngmL) Compuesto LOQ (ngmL)
AME 04 MET 01
BEN 01 MYC 04
BOS 02 PEN 02
CAR 03 PYC 02
CYP 02 PYM 01
DIM 07 TEC 05
FEH 05 TEF 01
FEP 01 TBZ 04
FLU 02 TME 02
IMI 06 THI-M 10
IPR 01 TRI 07
MAN 01
5 APLICACIOacuteN A MUESTRAS DE VINO COMERCIALES
Una vez optimizadas las condiciones del meacutetodo y estudiadas las caracteriacutesticas del meacutetodo desarrollado se aplicoacute
a la determinacioacuten de los compuestos de intereacutes estudiados en muestras de vino blanco y vino tinto comerciales
producidos en diferentes paiacuteses En la Tabla IV9 se muestra el paiacutes de origen de cada muestra comercial
identificadas con un coacutedigo alfanumeacuterico y antildeo de produccioacuten
42
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Tabla IV9 Coacutedigo asignado para los diferentes vinos comerciales blancos y tintos analizados Indicando el paiacutes de origen y
antildeo de produccioacuten
Coacutedigo Denominacioacuten de origen Antildeo de produccioacuten
bull Vinos Blancos
W1 Alemania 2014
W2 Espantildea 2012
W3 Espantildea 2016
W4 Portugal Desconocido
W5 Francia 2015
W6 Francia 2015
W7 Espantildea 2016
bull Vinos Tintos
R1 Espantildea 2015
R2 Sudaacutefrica 2015
R3 Chile 2015
R4 Francia 2015
R5 China Desconocido
R6 Espantildea 2016
R7 Australia 2014
R8 Francia 2013
R9 Francia 2015
A continuacioacuten en la Tabla IV10 y la Tabla IV11 se recogen los resultados obtenidos en el anaacutelisis de las
muestras comerciales Los datos obtenidos corresponden en todos los casos al uso de patrones de calibracioacuten
como teacutecnica de cuantificacioacuten
Tabla IV10 Concentracioacuten (ngmL) encontradas en las diferentes muestras de vino blanco comercial analizadas mediante
SPE-UPLC-MSMS n=2 reacuteplicas y al final el sumatorio de las concentraciones encontradas
Compuesto W1 W2 W3 W4 W5 W6 W7
AME 04 nd nd nd 41 nd nd
BEN nd nd 14 nd nd nd nd
BOS 84 102 520 54 197 nd nd
CAR nd 115 56 nd nd nd nd
CYP 08 59 112 nd nd 26 nd
43
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Compuesto W1 W2 W3 W4 W5 W6 W7
DIM 14 84 400 09 32 50 nd
FEH 85 809 639 15 187 nd nd
FLU 11 05 92 nd 77 32 nd
IMI nd 136 88 29 nd nd 69
IPR 30 749 1144 14 nd nd nd
MAN nd nd nd nd nd 30 nd
MET 04 273 494 63 nd nd 172
MYC 09 nd 35 nd nd nd nd
PYM 15 469 584 08 24 35 nd
TEC 11 nd 58 nd nd nd nd
TRI nd 67 61 nd nd nd nd
sumconcentracioacuten
(ngmL) 274 2868 4358 192 558 173 862
nd no detectado
Tabla IV11 Concentracioacuten (ngmL) encontradas en las diferentes muestras de vino tinto comercial analizadas mediante
SPE-UPLC-MSMS n= 2 reacuteplicas y al final el sumatorio de las concentraciones encontradas
Compuesto R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9
AME nd nd nd 30 nd nd nd nd 16
BEN nd nd nd 07 nd nd nd nd nd
BOS nd 55 21 196 nd nd nd 73 21
CAR nd nd 04 17 249 20 nd nd nd
CYP 34 08 02 22 nd 136 nd 85 nd
DIM nd 33 nd 52 233 46 nd 61 23
FEH nd nd nd 1070 nd 10 nd 1307 14
FLU nd nd nd 20 nd nd nd nd nd
IPR 16 nd nd 17 nd 22 nd nd nd
MAN nd nd nd 17 nd nd nd 20 nd
MET 126 nd nd 14 55 313 30 44 39
MYC nd nd nd 05 nd 32 nd nd nd
PYM 19 nd 03 185 49 281 nd 24 nd
TEC 25 06 39 29 nd nd nd 21 20
TEF nd 01 12 nd nd nd nd nd nd
sumconcentracioacuten
(ngmL) 220 48 81 1681 586 860 30 1635 133
nd no detectado 44
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
En los resultados de los anaacutelisis podemos observar que en ninguna de las muestras comerciales de vino blanco
aparecieron los siguientes compuestos FEP PEN PYC TEF TBZ THI-M y TME y en los vinos tintos
comerciales no aparece a ninguna concentracioacuten FEP IMI PEN PYC TBZ TME THI-M y TRI No se
detectaron para dichas muestras de vino a niveles superiores a los LOQs del meacutetodo propuesto
Cuando se detecta un compuesto positivo se compara el pico cromatograacutefico del compuesto con el de un patroacuten
verificando la coincidencia del tiempo de retencioacuten (maacutexima diferencia 01 min) y la relacioacuten entre transiciones
(maacutexima diferencia 30 ) En la Figura IV6 y la Figura IV7 se muestran los cromatogramas para el compuesto
CYP obtenido en condiciones oacuteptimas para la muestra de vino blanco W6 y en un patroacuten de 5 ngmL
respectivamente En este caso el intervalo de tolerancia para la relacioacuten de intensidad entre transiciones es
IP2IP1=061plusmn018
Figura IV6 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el CYP en la muestra W6 (26 ngmL) Transicioacuten
superior 226gt93 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 226gt108 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades IP2IP1= 066
Figura IV7 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el CYP en un patroacuten de 5 ngmL Transicioacuten
superior 226gt93 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 226gt108 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades IP2IP1=061plusmn018
45
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Otro ejemplo de compuesto positivo en abundantes muestras comerciales de estudio es el Metalaxyl positivo con
una concentracioacuten de 04 ngmL en el vino con referencia W1 (Figura IV8) y positivo con una concentracioacuten de
313 ngmL en el vino con referencia R6 (Figura IV9) Ambas se comparan con el cromatograma de un patroacuten
de Metalaxyl de 1 ngmL (Figura IV10) El grado de concordancia en los tiempos de retencioacuten y la relacioacuten de
intensidades entre transiciones es satisfactorio
Figura IV8 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el MET en la muestra W1 (04 ngmL) Transicioacuten
superior 2801gt2201 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 2801gt1921 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades
IP2IP1=056
Figura IV9 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el MET en la muestra R6 (313 ngmL) Transicioacuten
superior 2801gt2201 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 2801gt1921 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades IP2IP1=
056
46
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Figura IV10 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el MET en un patroacuten de 1 ngmL Transicioacuten
superior 2801gt2201 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 2801gt1921 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades
IP2IP1=057plusmn017
Es de destacar que aunque se detectaron bastantes pesticidas en las diferentes muestras de vino comerciales pero
en ninguacuten caso superaron el 10 de los LMRs permitidos en uvas tal y como se recomienda ya que todaviacutea no
existen LMRs para vino en la legislacioacuten vigente No obstante el nivel total de concentracioacuten (sumatorio de
concentraciones Tabla IV10 y Tabla VI11) es significativo para varias muestras tanto de vinos blancos (W2 y
W3) como tintos (R4 y R8)
47
Capiacutetulo V Conclusiones
CAPIacuteTULO V CONCLUSIONES
En este trabajo se ha estudiado un meacutetodo para la cuantificacioacuten de pesticidas concretamente veinte fungicidas y
tres insecticidas en vino blanco y tinto En la etapa de preparacioacuten de muestra se optimizoacute la extraccioacuten en fase
soacutelida (SPE) utilizando cartuchos OASIS HLB (200 mg) compuestos por divinilbenceno-N-vinilpirrolidona
(DVB-VP) como adsorbente Como teacutecnica de determinacioacuten se utilizoacute cromatografiacutea de liacutequidos con una
interfase de electroespray acoplada a espectrometriacutea de masas (UPLC-ESI-MSMS)
Las conclusiones generales obtenidas a partir de los resultados de este proyecto relativo a la determinacioacuten de
fitosanitarios en vino son
Ante los problemas de retencioacuten que presentan los cartuchos OASIS MAX (150 mg) para algunos
compuestos los cartuchos OASIS HLB (200 mg) junto con la combinacioacuten metanolacetonitrilo (2080)
como disolvente de elucioacuten son elegidos como mejor opcioacuten en la extraccioacuten en fase soacutelida de pesticidas
en muestras con matrices complejas como es el caso del vino Asiacute se consigue la retencioacuten selectiva de
componentes de la matriz y proporciona extractos con menor porcentaje de interferencias
El meacutetodo estudiado y optimizado se puede aplicar tanto a vinos blancos como a vinos tintos procesados
a partir de distintas variedades de uvas
Los liacutemites de cuantificacioacuten (LOQs) del estudio se situacutean la mayoriacutea por debajo de 10 ngmL excepto
en el caso de THI-M que asciende al valor de 20 ngmL El rango de respuesta lineal abarca hasta 200
ngmL y el tiempo de anaacutelisis ha sido de solo 10 minutos por muestra
En todas las muestras de vino (blancos y tintos) comerciales analizadas se han detectado la presencia de
varios pesticidas sin embargo todas las concentraciones encontradas se encuentran por debajo del 10
de los LMRs fijados en uvas tal y como recomienda la legislacioacuten por lo que no se considera
preocupante
48
Capiacutetulo V Conclusioacutens
CAPIacuteTULO V CONCLUSIOacuteNS
Neste traballo estudouse un meacutetodo para a cuantificacioacuten de pesticidas en particular vinte funxicidas e tres
insecticidas en vintildeo branco e maacuteis tinto No paso da preparacioacuten da mostra optimizouse a extraccioacuten en fase
soacutelida (SPE) empregando cartuchos OASIS HLB (200 mg) compostos por divinilbenceno-N-pirrolidona (DVB-
VP) como adsorbente Para a teacutecnica de determinacioacuten utilizouse cromatografiacutea de liacutequidos con unha interfase de
electroespray acoplada a espectrometriacutea de masas (UPLC-ESI-MSMS)
As conclusioacutens xerais a obtidas a partir dos resultados deste proxecto relativo aacute determinacioacuten de pesticidas en
vintildeo son
Ante os problemas de retencioacuten que mostraban os cartuchos OASIS MAX (150 mg) para alguacuten
compostos os cartuchos OASIS HLB (200 mg) en conxunto coa mistura metanolacetonitrilo (2080)
como disolvente de elucioacuten son elexidos como mellor opcioacuten na extraccioacuten en fase soacutelida de pesticidas
en mostras con matrices complexas como eacute o caso do vintildeo Asiacute eacute conseguida a retencioacuten selectiva de
componentes da matriz e proporciona extractos con menos porcentaxe de interferencias
O meacutetodo estudado e optimizado poacutedese aplicar tanto a vintildeos brancos coma tintos procesados a partir de
diferentes variedades de uvas
Os liacutemites de cuantificacioacuten do estudo (LOQs) son maacuteis baixos de 10 ngmL agaacutes no caso do THI-M
que ascende ao valor de 20 ngmL O rango de resposta lineal cobre ata 200 ngmL e o tempo de anaacutelise
foi de soacute 10 minuacutetos por mostra
En todas as mostras de vintildeo (brancos e tintos) comercial analizadas detectouse a presenza de varios
pesticidas maacuteis poreacuten todas as concentracioacutens atopadas son inferiores ao 10 dos LMR fixados en uvas
tal e como recomenda a lexislacioacuten polo que non se considera preocupante
49
Chapter V Conclusions
CHAPTER V CONCLUSIONS
In this work we have studied a method for the quantification of pesticides specifically twenty fungicides and
three insecticides in white and red wine In the sample preparation step the solid phase extraction was optimized
using cartridges OASIS HLB (200 mg) containing divinylbenzene-N-vinylpyrrolidone (DVB-VP) as adsorbent
As determination technique ultraperformance liquid chromatography was used with an electrospray interface
coupled to mass spectrometry (UPLC-ESI-MS7MS)
The general conclusions drawn from the results of this project concerning the determination of pesticides in wine
are
Due to the retention problems presented by the OASIS MAX sorbent (150 mg) for some compounds of
this project the cartridges OASIS HLB (200 mg) together with the methanolacetonitrile (2080) mixture
are chosen as the best option in the solid phase extraction of pesticides in samples with complex
matrices as is the case with the wine
The method studied and optimized can be applied to both white and red wines obtained from different
varieties of grapes
The limits of quantification (LOQs) were below 10 ngmL for most of the compounds except in the
case of THI-M with a LOQ of to 10 ngmL The linear response range covers up to 200 ngmL and the
analysis time was only 10 minutes per sample
In all commercial wine samples (white and red) analyzed the presence of several pesticides was
conformed however all the concentrations obtained are below 10 of the Maximum residue
levels(MRLs) fixed in grapes as recommended by legislation
50
VI Bibliografiacutea VI BIBLIOGRAFIacuteA [1] Ministerio de agricultura y pesca alimentacioacuten y medio ambiente mhttpwwwmapamagobesescalidad-y-evaluacion-ambientaltemasproductos-quimicosfitosanitarios (Acceso el diacutea 11052017) [2] httpwwwcricyteduarenciclopediaterminosProducFitohtm (Acceso el diacutea 11052017) [3] WERNER BALTES ldquoQuiacutemica de los alimentosrdquo Editorial Acribia SA 2007 Capiacutetulo 11 ldquoResiduos en los alimentosrdquo paacuteginas 206-217
[4] RLabrada JCCaseley CParker ldquoESTUDIO FAO PRODUCCIOacuteN Y PROTECCIOacuteN VEGETAL 120rdquo Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentacioacuten Roma 1996 ISSN 1014- Capiacutetulo 10 Herbicidas httpwwwfaoorgdocrepT1147St1147s00htmContents (Acceso el diacutea 12052017)
[5] Taberner Palou Andreu Cirujeda Ranzenberger Alicia Zaragoza Larios Carlos ldquoManejo de poblaciones de malezas resistentes a herbicidasrdquo (FAO Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura) 100 preguntas sobre resistencia PDF sacado de httpwwwfaoorg3a-a1422spdf (Acceso el diacutea 12052017) [6] BISSET Juan A Uso correcto de insecticidas control de la resistencia Revista Cubana de Medicina Tropical 2002 vol 54 no 3 p 202-219 [7] DEVINE Gregor J EZA Dominique Ogusuku Elena FURLONGMichael J Uso de insecticidas contexto y consecuencias ecoloacutegicas Revista peruana de medicina experimental y Salud Puacuteblica 2008 vol 25 no 1 p 74-100 [8] Ministerio de agricultura y ganaderiacutea (proteccioacuten agropecuaria servicio de diagnoacutestico fitosanitario) de costa Rica httpwwwmaggocrbibliotecavirtualH20-5054pdf (Acceso el diacutea 11052017) [9] GEPP V MONDINO P Control quiacutemico 2011 PDF obtenido de httpwwwpvfagroeduuyfitopatodocscursosfitopatoMaterialesGuiasC-QUIMICOpdf (Acceso el diacutea 772017) [10] ROSSLENBROICH Hans-Juergen STUEBLER Dietrich Botrytis cinereamdashhistory of chemical control and novel fungicides for its management Crop Protection 2000 vol 19 no 8 p 557-561 [11] Figura 11 httpwwwvitiviniculturanetbotritis-o-podredumbre-gris-botrytis-cinerea-pershtml (Acceso el diacutea 12052017) [12] CAMPBELL Paul BENDEK Carlos LATORRE Bernardo A Riesgo de oiacutedio (Erysiphe necator) de la vid en relacioacuten con el desarrollo de los racimos Ciencia e investigacioacuten agraria 2007 vol 34 no 1 p 5-11 [13] ldquoCoacutemo combatir el oiacutedio de la vidrdquo Jose Javier Peacuterez de Obanos Castillo PDF sacado de httpswwwnavarraesNRrdonlyres05E65D9B-D1A2-4EAD-9A63-AFF1D3215552135109Comocombatireloidiodelavidpdf (Acceso el diacutea 12052017) [14] Imagen 12 sacadas las 3 de httpwwwvitiviniculturanetoidio-de-la-vidhtml (Acceso el diacutea 12052017) [15] BARRIOS Gonccedilal REYES Joan Modelizacioacuten del Mildiu de la Vid 2004 httpwwwruralcatnetmigracio_resources617683_mildiusPDF (Acceso el diacutea 12052017) [16] Imaacutegenes sacadas de httpwwwvitiviniculturanetmildiu-de-la-vid-enfermedades-vinahtml (Acceso el diacutea 13052017) [17] HUQ Mainul MEISNER Craig DASGUPTA Susmita Health effects and pesticide perception as determinants of pesticide use evidence from Bangladesh httpagrisfaoorgagris-searchsearchdorecordID=US2012411738 (Acceso el diacutea 13052017)
51
IV Bibliografiacutea [18] BADII Mohammad H LANDEROS Jeroacutenimo Plaguicidas que afectan a la salud humana y la sustentabilidad CULCyT 2015 no 19 Revista vista en httpopenjournaluacjmxojsindexphpculcytarticleview454 (Acceso el diacutea 772017) [19] OLEA Nicolaacutes FERNAacuteNDEZ Mariana F Plaguicidas persistentes En Congreso Implementacioacuten del Convenio de Contaminantes Orgaacutenicos Persistentes Madrid 2001 p 26-27 [20] httpwwwfaoorgfao-who-codexalimentariusabout-codexes (Acceso el diacutea 14052017) [21] httpeceuropaeufoodplantpesticidesmax_residue_levels_en (Acceso el diacutea 14052017 [22] ORDONtildeEZ Juan A Cambero Rodriacuteguez MI Fernaacutendez Aacutelvarez L Garciacutea Sanz ML Garciacutea de Fernando Minguilloacuten GD de la Hoz Perales L Selgas Cortecero MD Tecnologiacutea de los alimentos Volumen 1 Componentes de los Alimentos y Procesos Siacutentesis Madrid 1998paacutegs 349-351 [23] CELA Rafael Casais Maria del Carmen Lorenzo Rosa Antonia Teacutecnicas de separacioacuten en quiacutemica analiacutetica Siacutentesis 2002 Capiacutetulo 11 Extraccioacuten y lixiviacioacuten por disolvente (paacutegs206-260) [24] CANTWELL Frederick F LOSIER Manon Liquidmdashliquid extraction Comprehensive Analytical Chemistry 2002 vol 37 p 297-340 [25] Imagen de LLE sacada de httpprocesosbiowikispacescomExtracciC3B3n+liquido-liquido (Acceso el diacutea 15052017) [26] HENNION Marie-Claire Solid-phase extraction method development sorbents and coupling with liquid chromatography Journal of Chromatography A 1999 vol 856 no 1 p 3-54 [27] CELA Rafael Casais Maria del Carmen Lorenzo Rosa Antonia Teacutecnicas de separacioacuten en quiacutemica analiacutetica Siacutentesis 2002 Capiacutetulo 16 Teacutecnicas de adsorcioacuten y absorcioacuten en la preparacioacuten de muestras Extraccioacuten y microextraccioacuten en fase soacutelida (paacutegs520-555) [28] Imagen spe sacada httptoxicocbblogspotcomes201310las-intoxicaciones-con-farmacoshtml (Acceso el diacutea 15052017) [29] Chaacutefer Pericaacutes Consuelo Acoplamiento microextraccioacuten en fase soacutelida-cromatografiacutea (2006) httprodericuveshandle1055014940 (Acceso el diacutea 16052017) [30] Imagen SPME httpwwwscieloorgcoscielophpscript=sci_arttextamppid=S0122-53832002000100005 (Acceso el diacutea 16052017) [31] MONTES GOYANES Rosa Mariacutea Avances en teacutecnicas de microextraccioacuten para la determinacioacuten de compuestos traza en muestras medioambientales y alimentarias Teacutesis doctoral Noviembre 2009 (Paacutegs 34-55) [32] LEHOTAY Steven J Ae Son Kyung KwonHyeyoung Koesukwiwat Urairat Fu Wusheng Mastovska Katerina Hoh Eunha Leepipatpiboon Natchanun Comparison of QuEChERS sample preparation methods for the analysis of pesticide residues in fruits and vegetables Journal of Chromatography A 2010 vol 1217 no 16 p 2548-2560 [33] Imagen QueChERS httpswwwresearchgatenetpublication279221361_QuEChERS_A_Sample_Preparation_for_Extraction_of_Carbaryl_from_Rat_Feces (Acceso el diacutea 16052017) [34] STASHENKO Elena E MARTIacuteNEZ Jairo Reneacute Preparacioacuten de la muestra un paso crucial para el anaacutelisis por GC-MS Uma publicaccedilatildeo trimestral do Instituto Internacional de Cromatografia (IIC) Ciecircncia Cromatograacutefica 2011 vol 3 no 1 [35] Imagen GC-MS httpsorgspectroscopyintblogspotcomes201411gas-chromatography-mass-spectrometry-gchtml (Acceso el diacutea 17052017) [36] httpwwwactlabscompageaspxmenu=65ampapp=221ampcat1=534amptp=2amplk=no (Acceso el diacutea 17052017)
52
IV Bibliografiacutea [37] Quintela O Cruz A Concheiro M De Castro A amp Loacutepez-Rivadulla M (2005) Metodologiacutea LC-MS Aspectos generales de la teacutecnica y sus aplicaciones en el campo de la toxicologiacutea Rev Toxicol 22 paacutegs7-14 [38] Imagen LC-MS httpsuploadwikimediaorgwikipediaenff9Liquid_chromatography_tandem_Mass_spectrometry_diagrampng (visto 18052017) [39] Vargas de la Cruz Celia Bertha Adaptacioacuten de la Metodologiacutea Analiacutetica para la determinacioacuten de residuos de plaguicidas en frutas nativas de exportacioacuten mediante Uplc-MsMs (2012) Tesis obtenida en http20062146130handlecybertesis2331 (Acceso el diacutea 772017) [40] ROMERO GONZAacuteLEZ Roberto Fernaacutendez Moreno Joseacute Luis Plaza Bolantildeos Patricia Garrido Frenich Antonia Martiacutenez Vidal Joseacute Luis Empleo de la espectrometriacutea de masas como herramienta para la determinacioacuten de toacutexicos en alimentos hacia la seguridad alimentaria Revista Espantildeola de salud puacuteblica 2007 vol 81 no 5 p 461-474 [41] PAYAacute Andrus Fundamento y Funciones de la Espectrometriacutea de Masas Universidad de Valencia Espantildea 2006 httpmuraluvescaloan (Acceso el diacutea 19052017) [42] Imagen MS sacada de httpsesslidesharenetMaYaTorrezespectrometria-demasas (Acceso el diacutea 21052017) [43] ECONOMOU Anastasios Botitsi Helen Antoniou Spyros Tsipi Despina Determination of multi-class pesticides in wines by solid-phase extraction and liquid chromatography-tandem mass spectrometry Journal of Chromatography A 2009 vol 1216 no 31 p 5856-5867 [44] FONTANA A R Rodriacuteguez I Ramil M Altamirano JC Cela R Liquid chromatography time-of-flight mass spectrometry following sorptive microextraction for the determination of fungicide residues in wine Analytical and bioanalytical chemistry 2011 vol 401 no 2 p 767-775 [45] PELAJIĆ Maja G Peček DM Pavlović DV Čepo Novel multiresidue method for determination of pesticides in red wine using gas chromatographyndashmass spectrometry and solid phase extraction Food chemistry 2016 vol 200 p 98-106 [46] Ignaz J Buerge Juumlrgen Krauss Rociacuteo Loacutepez-Cabeza Werner Siegfried Michael Stuumlssi Felix E Wettstein Thomas Poiger Stereoselective Metabolism of the Sterol Biosynthesis Inhibitor Fungicides Fenpropidin Fenpropimorph and Spiroxamine in Grapes Sugar Beets and Wheat Journal of Agricultural and Food Chemistry 2016 vol 64 no 26 p 5301-5309 [47] M Hu X Liu F Dong J Xu S Li H Xu Y Zheng Determination of ametoctradin residue in fruits and vegetables by modified quick easy cheap effective rugged and safe method using ultra-performance liquid chromatographytandem mass spectrometry Food chemistry 2015 vol 175 p 395-400 [48] WALORCZYK Stanisław DROŻDŻYŃSKI Dariusz GNUSOWSKI Bogusław Multiresidue determination of 160 pesticides in wines employing mixed-mode dispersive-solid phase extraction and gas chromatographyndashtandem mass spectrometry Talanta 2011 vol 85 no 4 p 1856-1870 [49] Tianyang Guo Pingping Fang Juanjuan Jiang Feng Zhan Wei Yong Jiahui Liu YiYang Dong Rapid screening and quantification of residual pesticides and illegal adulterants in red wine by direct analysis in real time mass spectrometry Journal of Chromatography A 2016 vol 1471 p 27-3 [50] GONZAacuteLEZ-RODRIacuteGUEZ R M CANCHO-GRANDE B SIMAL-GAacuteNDARA J Decay of fungicide residues during vinification of white grapes harvested after the application of some new active substances against downy mildew Food chemistry 2011 vol 125 no 2 p 549-560 [51] CARPINTEIRO I Ramil M Rodriacuteguez I Cela R Determination of fungicides in wine by mixed-mode solid phase extraction and liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry Journal of Chromatography A 2010 vol 1217 no 48 p 7484-7492
53
Capiacutetulo I Introduccioacuten
cromatografiacutea este meacutetodo le fue ganando terreno a la LLE Otra ventaja muy importante de la SPE frente a la
LLE es la disminucioacuten en la cantidad de disolvente orgaacutenico empleada Cada vez se va innovando maacutes sobre esta
teacutecnica llegando a encontrarse fases adsorbentes formadas por poliacutemeros capaces de retener en un uacutenico
cartucho un amplio abanico de analitos lipofiacutelicos o hidrofoacutebicos aacutecidos baacutesicos o neutros [26]
El fundamento de esta extraccioacuten como se puede en la Figura I6
consiste en cuatro etapas acondicionamiento adiccioacuten de muestra
retencioacuten y elucioacuten de los analitos de intereacutes En primer lugar antes
de empezar la extraccioacuten se requiere una etapa de acondicionamiento
para preparar el adsorbente haciendo pasar un poco de disolvente
para asiacute interaccionar mejor con la muestra Luego se hace pasar la
muestra liacutequida por la fase soacutelida Idealmente el adsorbente retiene
los analitos selectivamente a medida que va pasando la muestra y la
matriz pasa sin ser retenida Por uacuteltimo los analitos se eluyen del
adsorbente con un disolvente con el que tenga mayor afinidad [27]
23 Teacutecnicas de microextraccioacuten
231 Microextraccioacuten en fase soacutelida (SPME)
En la microextraccioacuten en fase soacutelida (SPME) se utilizan fibras de siacutelice fundida revestidas con un poliacutemero en un
disentildeo en forma de jeringa para la extraccioacuten de los analitos de intereacutes El principio por el que se rige esta
extraccioacuten es el reparto del analito entre la matriz de la muestra y el revestimiento de la fibra mediante un proceso
no competitivo Se trata de un meacutetodo que cuenta con muchas ventajas ya que se elimina completamente el uso de
disolventes y aparte no son necesarios voluacutemenes de muestra grandes pero tambieacuten cuenta con algunas
desventajas ya que tanto la capacidad como la sensibilidad se ven limitadas [29]
En la figura I7 podemos ver las etapas de la extraccioacuten En un
vial cerrado con una caacutepsula y un seacuteptum tenemos la muestra
liacutequida o bien soacutelida que contenga los analitos de intereacutes
volaacutetiles Con la jeringa se perfora el seacuteptum y una vez dentro
se acciona el eacutembolo para la exposicioacuten de la fibra con los
analitos introducieacutendola en la muestra liacutequida o en su defecto
en el espacio de cabeza para la extraccioacuten de analitos volaacutetiles
de una muestra soacutelida Despueacutes de la extraccioacuten dentro del vial
Figura I6 Etapas de una SPE [28]
Figura I7 Etapas de una SPME [30]
12
Capiacutetulo I Introduccioacuten
la fibra se introduce de nuevo en la jeringa y se retira del vial [27]
232 Microextraccioacuten en fase liacutequida (LPME)
La microextraccioacuten en fase liacutequida se desarrolloacute como una alternativa a la LLE para la reduccioacuten en la cantidad de
disolventes orgaacutenicos siendo rentable tanto para el medioambiente como econoacutemicamente Entre las modalidades
maacutes populares de esta teacutecnica se encuentran microextraccioacuten con gota suspendida (SDME) y microextraccioacuten
liacutequido-liacutequido dispersiva (DLLME) En la SDME una gota de disolvente orgaacutenico es expuesta al espacio de
cabeza situado sobre una muestra en un vial dicha gota es suspendida del extremo de una microjeringa Por otro
lado la DLLME sobre una muestra acuosa se inyecta un pequentildeo volumen de una mezcla de disolventes en la
cual es dispersada formando una solucioacuten en la que se establece el equilibrio El disolvente de extraccioacuten debe
presentar una densidad inferior a la de la muestra para facilitar su recuperacioacuten normalmente despueacutes de
centrifugar el vial doacutende se realiza la extraccioacuten [31]
24 QuEChERS
La extraccioacuten QuEChERS de las palabras en ingleacutes Quick Easy Cheap Effective Rugged and Safe es un meacutetodo
de extraccioacuten que se desarrolloacute entre 2000 y 2002 para el anaacutelisis de pesticidas Como su nombre indica raacutepido
faacutecil barato eficaz robusto y seguro son las principales
caracteriacutesticas de esta preparacioacuten de muestra Se realiza en dos
etapas en primer lugar una extraccioacuten simple y una segunda fase
de purificacioacuten En la primera etapa tenemos el vial con la
muestra en el cual se antildeade un disolvente generalmente
acetonitrilo para la extraccioacuten de los analitos de intereacutes en
presencia de diferentes sales (en el meacutetodo original se utiliza
sulfato de magnesio y cloruro de sodio) para facilitar la separacioacuten
de las fases En la segunda parte se realiza la purificacioacuten de la
fraccioacuten del extracto orgaacutenico Para eso se lleva a cabo una
limpieza de los analitos eliminando el agua y los compuestos
presentes en la matriz de la muestra empleando un adsorbente PSA (amina primaria y secundaria) C18 carboacuten
negro grafitizado (GCB) o una combinacioacuten de eacutestas [32]
Figura I8 Etapas de QuEChERS [33]
13
Capiacutetulo I Introduccioacuten
3 METODOLOGIacuteA ANALIacuteTICA PARA LA DETERMINACIOacuteN DE PESTICIDAS
31 Meacutetodos de GC-MS (MSMS)
La combinacioacuten de cromatografiacutea de gases (GC) teacutecnica de separacioacuten con espectrometriacutea de masas (MS) como
sistema de deteccioacuten representa un potente meacutetodo para la identificacioacuten determinacioacuten y cuantificacioacuten de
analitos orgaacutenicos en concentraciones traza presentes en muestras complejas Esta teacutecnica de anaacutelisis cuenta con
muchas ventajas en sensibilidad multifuncionalidad buena reproducibilidad robustez asiacute como facilidad en el
manejo pero con una gran desventaja este meacutetodo no es apto para ser utilizado con todos los analitos sino que
se ve limitado a aquellos que sean termoestables y no se descompongan a temperaturas elevadas antes de ser
volatilizados La muestra es introducida a traveacutes del inyector en el cromatoacutegrafo de gases doacutende impulsada por
una corriente de gas inerte como fase moacutevil pasa a traveacutes de la columna que contiene la fase estacionaria en la
cual se separan los compuestos debido a una distribucioacuten de estos entre fase moacutevil-fase estacionaria Mediante
una interfase son introducidos para su deteccioacuten en el espectroacutemetro de masas que cuenta con una fuente de
iones analizador de masas y un detector [34]
La combinacioacuten de analizadores de masas en taacutendem (MSMS) como sistema de deteccioacuten en GC es una teacutecnica
altamente selectiva mejorando la sensibilidad y la relacioacuten sentildeal-ruido en los espectros experimentando una
mejora por lo que se logran unos liacutemites de deteccioacuten inferiores Esta teacutecnica GC-MSMS comprende maacutes
pasos despueacutes de la separacioacuten por cromatografiacutea se lleva a cabo la deteccioacuten con MSMS que consta de varias
etapas generacioacuten de iones en la fuente de ionizacioacuten seleccioacuten de los iones precursores de una determinada
masa disociacioacuten causada por colisioacuten con moleacuteculas de gas inerte de los iones precursores y por uacuteltimo el
anaacutelisis de los fragmentos en relacioacuten a su masacarga (mz) En el caso de que un espectro de MS no permita
confirmar la identidad de un determinado compuesto quiacutemico la obtencioacuten de su espectro de MSMS permite
mejorar la confianza en su identificacioacuten [36]
Figura I9 Acoplamiento GC-MS [35]
14
Capiacutetulo I Introduccioacuten
32 Meacutetodos LC-MS (MSMS)
La teacutecnica de LC-MS se desarrolloacute para minimizar las desventajas del acoplamiento GC-MS y asiacute resolver los
problemas que este uacuteltimo acarreaba con los analitos termolaacutebiles permitiendo el anaacutelisis de eacutestos sin tener que
realizar una etapa previa de derivatizacioacuten La interfase de unioacuten de cromatografiacutea liacutequida (LC) con espectrometriacutea
de masas (MS) acarrea una dificultad significativa siendo responsable de transformar los analitos que se
encontraban en la fase moacutevil liacutequida en iones en fase gas sin que se produzca su degradacioacuten teacutermica La
sensibilidad de las determinaciones por LC-MS va a depender de la interfase empleada Las principales interfases
empleadas actualmente son las ionizaciones a presioacuten atmosfeacuterica electrospray (ES) e ionizacioacuten quiacutemica a
presioacuten atmosfeacuterica (APCI) [37]
Con los antildeos la cromatografiacutea liacutequida se ha ido innovando y mediante la disminucioacuten del tamantildeo de partiacutecula en
la columna se fue mejorando la eficiencia asiacute como aumentando la selectividad y resolucioacuten del pico en el
cromatograma Para este nuevo sistema llamado UPLC Ultra-Performance Liquid Chromatography se desarrolloacute
una nueva instrumentacioacuten capaz de trabajar a altas presiones generando flujos mayores sin peacuterdidas de
resolucioacuten utilizando inyectores automaacuteticos maacutes raacutepidos y detectores con mayor velocidad de adquisicioacuten de
datos disminuyendo asiacute el tiempo de anaacutelisis [39]
33 Espectrometriacutea de masas
La espectrometriacutea de masas es el meacutetodo de deteccioacuten y cuantificacioacuten maacutes fiable a la hora de la determinacioacuten de
compuestos en matrices complejas (tales como alimentos) ya que otros detectores maacutes tradicionales como UV-
visible o fluorescencia cuentan con una gran incertidumbre en los resultados llegando incluso a ofrecer falsos
Figura I10 Acoplamiento LC-MS [38]
15
Capiacutetulo I Introduccioacuten
positivos o negativos Un espectrometro de masas cuenta con un dispositivo de introduccioacuten de muestra una
caacutemara de ionizacioacuten un sistema para la aceleracioacuten de los iones uno o varios analizadores de masas y un detector
[40]
El fundamento de la espectrometriacutea de masas se basa en la separacioacuten de iones en base a la relacioacuten masacarga
(mz) El proceso consta fundamentalmente de cuatro etapas La
primera es la ionizacioacuten de la muestra los iones formados se aceleran
debido a la accioacuten de un campo eleacutectrico variable separacioacuten de los
iones seguacuten su masacarga deteccioacuten de los iones y produccioacuten de la
sentildeal eleacutectrica El analizador de masas es el encargado de la separacioacuten
de los iones en funcioacuten a su mz entre los que maacutes destacan
analizador de masas cuadrupolar que dispersa simultaacuteneamente todos
los iones en funcioacuten de la relacioacuten mz analizador de masas de
tiempo de vuelo (TOF) consta de un tubo a alto vaciacuteo sobre el que no
actuacutea ninguacuten campo eleacutectrico al cual llegan todos los iones acelerados con la misma energiacutea cineacutetica y en el tubo
las velocidades variacutean seguacuten mz y analizador de trampa de iones en doacutende los iones gaseosos quedan aislados
durante largos periacuteodos de tiempo por la accioacuten del campo eleacutectrico [41]
4RESUMEN BIBLIOGRAacuteFICO DE LAS TEacuteCNICAS DE EXTRACCIOacuteN Y
DETERMINACIOacuteN DE PESTICIDAS EN VINO
En la bibliografiacutea se han descrito diversas teacutecnicas y diferentes combinaciones entre teacutecnicas de extraccioacuten y
distintas teacutecnicas de cuantificacioacuten e identificacioacuten para esos analitos Entre estas teacutecnicas los valores de los liacutemites
de cuantificacioacuten (LOQs) y las recuperaciones relativas pueden diferir en el resultado en un rango de valores asiacute
como el tiempo total empleado para el anaacutelisis y para la preparacioacuten de la muestra
Por lo general el meacutetodo de extraccioacuten de los analitos de intereacutes maacutes empleado es la extraccioacuten en fase soacutelida
(SPE) la cuaacutel le ha estado ganando terreno a la extraccioacuten liacutequido-liacutequido aunque tambieacuten se estaacute viendo cada vez
maacutes desplazada debido al creciente uso de la teacutecnica QuEChERS
Figura I11 Etapas de la espectrometriacutea de masas [42]
16
Capiacutetulo I Introduccioacuten
En el estudio de ECONOMOU et al [43] realizado en el antildeo 2009 en Grecia se empleoacute la extraccioacuten en fase
soacutelida con deteccioacuten en cromatografiacutea de liacutequidos acoplada a espectrometriacutea de masas en taacutendem (SPE-LC-ESI-
MSMS) Para la preparacioacuten de la muestra diluyeron 10 mL de vino (tanto blanco como tinto) a un volumen
final de 100 mL con agua ultrapura antes de la SPE Determinaron las recuperaciones de la extraccioacuten para dos
niveles de concentracioacuten 0010 y 0050 mgL realizando 8 medidas diarias durante 3 diacuteas consecutivos
encontraacutendose unos valores que variacutean dentro del rango 70-110 para todos los pesticidas en los dos niveles Para
la determinacioacuten y cuantificacioacuten de 46 pesticidas emplearon la teacutecnica de cromatografiacutea de liacutequidos con
espectrometriacutea de masas con un volumen de inyeccioacuten de 20 microL y un flujo de fase moacutevil de 02 mLmin
aclopada a espectrometriacutea de masas en taacutendem
Con la misma teacutecnica de extraccioacuten PELAJIĆ et al [45] durante el antildeo 2015 en Croacia llevaron a cabo la
determinacioacuten de 25 residuos de plaguicidas en vino tinto El meacutetodo que desarrollaron para dicha finalidad fue el
acoplamiento SPE-GC-MS Para la preparacioacuten de la muestra emplearon 10 mL de vino diluidos 11 con agua
ultrapura hasta un volumen final de 20 mL Calcularon las recuperaciones de la extraccioacuten y se encontroacute un rango
para todos los pesticidas en las muestras de 70-120 Para la determinacioacuten en cromatografiacutea de gases-
espectrometriacutea de masas se empleoacute un volumen de inyeccioacuten de 5 μL y un flujo de fase moacutevil de 10 mLmin
Mediante el acoplamiento de teacutecnicas SPE dispersiva-GC-MS WALORCZYK et al [48] en el antildeo 2011 en
Polonia llevaron a cabo la cuantificacioacuten de 160 pesticidas en diferentes clases de vino tinto rosado y blanco Con
10 g de vino y 10 mL de acetonitrilo se realizaron pruebas de recuperacioacuten en la fase de extraccioacuten para vino
tinto con los niveles de concentracioacuten 001 005 y 02 mgkg y para los vinos rosado y blanco con el nivel de
concentracioacuten 005mgkg y encontraron que a todos los niveles de concentracioacuten los valores de recuperacioacuten
rondan el rango 80-110 Para la teacutecnica cromatograacutefica se utilizoacute un volumen de inyeccioacuten de 5 microL
El acoplamiento LLE-SPE-LCDAD fue desarrollado por GONZAacuteLEZ-RODRIacuteGUEZ et al [50] en el antildeo
2010 en la provincia de Orense para la determinacioacuten de nuevos fungicidas propuestos para combatir el hongo
que provoca la enfermedad del mildium En la preparacioacuten de la muestra emplearon 15 mL de vino blanco para la
extraccioacuten en la cual fueron calculadas las recuperaciones relativas para dos niveles de concentracioacuten 005 y 05
mgkg en donde se establece un rango de entre 70-110 para todos los analitos Para la determinacioacuten mediante
cromatografiacutea de liacutequidos se empleoacute un volumen de inyeccioacuten de 2 μL y como meacutetodo de deteccioacuten utilizaron un
detector de diodos array
La microextraccioacuten sorptiva en fase soacutelida fue empleada en la publicacioacuten de FONTANA et al [44] junto con un
acoplamiento entre cromatografiacutea de liacutequidos y espectrometriacutea de masas para la determinacioacuten de 15 fungicidas
en vino realizada durante el 2010 en el noroeste de Espantildea Para la preparacioacuten de la muestra emplearon 10 mL
17
Capiacutetulo I Introduccioacuten
de vino diluiacutedos con el mismo volumen de agua ultrapura y un sorbente en forma de disco de silicona con un
volumen de 12 microL La recuperacioacuten de la extraccioacuten se calculoacute para vino tinto (Menciacutea) y vino blanco (Godello)
realizando tres replicas dentro de un mismo diacutea para los niveles de concentracioacuten 10 y 50 ngmL y nueve reacuteplicas
realizando el anaacutelisis en tres diacuteas consecutivos para el nivel de concentracioacuten de 25 ngmL y los resultados
obtenidos dan unos valores de recuperacioacuten dentro del rango 75-117 En el sistema LC-QTOF-MS el volumen
de inyeccioacuten fue de 15 microL
El otro meacutetodo de extraccioacuten mencionado anteriormente es QuEChERS estaacute en auge como meacutetodo de extracioacuten
de residuos de pesticidas en matrices como la del vino o la uva ya que incrementa la velocidad del anaacutelisis y reduce
el efecto de matriz BUERGE et al [46] seguido de una deteccioacuten mediante GC-MSMS realizaron una estapa
de extraccioacuten QuEChERS con alguna modificacioacuten acetato de sodio en lugar de cloruro soacutedico y acetato de etilo
en lugar de acetonitrilo utilizando 5 g de uva para la determinacioacuten de residuos de 4 pesticidas durante el antildeo
2016 Las recuperaciones de extraccioacuten resultaron ser valores entre 91-149 en uva a distintos niveles de
concentracioacuten 005 05 y 5 mgkg
Para la determinacioacuten de Ametoctradin HU et al [47] llevaron a cabo una extraccioacuten QuEChERS empleando 10
g de uva con deteccioacuten mediante el acoplamiento UPLC-MSMS utilizando un volumen de inyeccioacuten de 5 μL y
un flujo de fase moacutevil de 03 mLmin Las recuperaciones de la extraccioacuten se calcularon para tres niveles de
concentracioacuten 1 10 100 μgL de dos formas distintas en tres diacuteas consecutivos realizando 5 reacuteplicas al diacutea o en
dentro de un mismo diacutea realizando 15 reacuteplicas los resultados de todos los caacutelculos se encuentran dentro del rango
818-1001
Siguiendo con el mismo modo de extraccioacuten GUO et al [49] publicaron sus estudios para la determinacioacuten de
50 pesticidas y 12 adulterantes en vino tinto Para la extraccioacuten QuEChERS se utilizaron 10 mL de vino tinto con
10 mL de acetonitrilo y calcularon las recuperaciones para tres niveles de concentracioacuten 50 100 y 250 ngmL
encontraacutendose un rango de valores entre 75-120 El meacutetodo de deteccioacuten se llevoacute a cabo mediante un anaacutelisis
directo en tiempo real junto con espectrometriacutea de masas en tandem con un cuadrupolo (DART-MSMS) la
teacutecnica DART es un meacutetodo raacutepido para cribar y cuantificar los analitos de estudio que prescinde de la etapa de
separacioacuten cromatograacutefica
A continuacioacuten se recogen en la Tabla I3 los liacutemites de cuantificacioacuten (LOQs) de los analitos de intereacutes en este
trabajo caacutelculados por los diferentes meacutetodos encontrados en bibliografiacutea citados anteriormente en este apartado
18
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Tabla I3 LOQs de los analitos de intereacutes descritos para los distintos meacutetodos encontrados en la bibliografiacutea
Compuesto LOQs
Compuesto LOQs
V Blanco V Tinto Uva V Blanco V Tinto Uva
AME - - 0032μgkg[47] MET 86 μgL[43]
22 μgL[44]
89 μgL[43]
22 μgL[44]
5 μgL[45]
259 ngmL[49]
001mgkg[48]
BEN 02 μgL[44]
0001 mgL[50]
02 μgL[44]
001 μgL[45]
280ngmL[49]
005 mgkg[48] MYC 30 μgL[43]
08 μgL[44]
36 μgL[43]
10 μgL[44]
025 μgL[45]
331ngmL[49]
001 mgkg[48]
BOS 0065 mgL[50] 05 μgL[45]
1076 ngmL[49] 001 mgkg[48] PEN
56 μgL[43]
05 μgL[44]
49 μgL[43]
04 μgL[44]
220ngmL[49]
001 mgkg[48]
CAR - 386 ngmL[49] - PYC 0003mgL[50] 07 μgL[45] 001 mgkg[48]
CYP 15 μgL[43]
04 μgL[44]
0001 mgL[50]
22 μgL[43]
06 μgL[44]
312 ngmL[49]
001 mgkg[48] PYM 17 μgL[43] 22 μgL[43]
10 μgL[45] 001 mgkg[48]
DIM 18 μgL[43] 20 μgL[43] 001 mgkg[48] TEC 03 μgL[44]
03 μgL[44]
10 μgL[45]
160ngmL[49]
001 mgkg[48]
FEH 17 μgL[43] 22 μgL[43]
938 ngmL[49] 001 mgkg[48] TEF - 876ngmL[49] -
FEP - - 002mgkg[46] TBZ 15μgL [43] 29μgL[43] 001 mgkg[48]
FLU 005 μgL[45] TME - 25 μgL[45] 001 mgkg[48]
IMI 21 μgL[43] 22 μgL[43]
225 ngmL[49] - THI-M 92 μgL[43] 89 μgL[43] -
IPR 07 μgL[44] 07 μgL[44] 001 mgkg[48] TRI 10 μgL[44] 12 μgL[44] 001 mgkg[48]
MAN 0011 mgL[50] - -
5 DISTRIBUCIOacuteN DE PESTICIDAS EN VINOS COMERCIALES
En algunos de los meacutetodos descritos en el apartado anterior se procesaron vinos comerciales encontraacutendose
resultados positivos para muchos residuos de pesticidas y algunos hasta en gran concentracioacuten
ECONOMOU et al [43] mediante el meacutetodo LC-ESI-MSMS realizaron el anaacutelisis de 60 muestras de vino tinto
y blanco recogidos en supermercados locales en Grecia a lo largo de un antildeo El meacutetodo se habiacutea desarrollado
19
Capiacutetulo I Introduccioacuten
para la determinacioacuten de 46 pesticidas pero la mayoriacutea se encuentran con una concentracioacuten por debajo de
001mgL solo ocho plaguicidas se obtuvieron con resultados de concentracioacuten mayores Se muestran los
resultados en la Tabla I4 de los analitos de intereacutes en este estudio
Tabla I4 Nuacutemero de muestras positivas de distintos pesticidas en el anaacutelisis de 60 muestras de vino [43]
Compuesto Positivos con concentracioacuten entre 001-01
mgL
Positivos con concentracioacuten entre 01-1
mgL
PYM 2 (3) 2 (3)
MYC 2 (3) 0 (0)
CAR 11 (18) 7 (12)
THI-M 7 (12) 5 (8)
FEH 5 (8) 0 (0)
MET 1 (2) 0 (0)
Mediante el meacutetodo de microextraccioacuten en fase soacutelida-LC-TOF-MS FONTANA et al [44] aplicaron el
desarrollo del procedimiento a un total de 12 vinos joacutevenes elaborados en el 2010 y correspondientes a diferentes
denominaciones geograacuteficas del noroeste de Espantildea En la Tabla I5 se muestran los datos que han obtenido
Tabla I5 Determinacioacuten de fitosanitarios en vinos comerciales mediante Microextraccioacuten en fase soacutelida-LC-TOF-MS
Valores de concentracioacuten en ngmL [44]
Pesticidas
W 1
Albarintildeo
W5
Ribeiro
W6
Valdeorras
R1
Ribeira Sacra
R3
Ribeiro
R4
Valdeorras
MET 404plusmn06 223plusmn05 311plusmn007 25plusmn03 31plusmn03 74plusmn10
TRI nd nd 36plusmn06 nd nd ltLOQ
IPR 394plusmn03 324plusmn02 324plusmn02 071plusmn007 31plusmn02 28plusmn05
MYC nd nd nd ltLOQ 39plusmn02 nd
TEC 25plusmn01 nd nd nd nd nd
CYP 179plusmn08 ltLOQ ltLOQ 562plusmn002 083plusmn001 nd
BEN 042plusmn001 nd ltLOQ nd 032plusmn001 ltLOQ
ndNo detectados ltLOQ por debajo del liacutemite de cuantificacioacuten del meacutetodo los coacutedigos W y R corresponden respecti-vamente a los vinos blanco y tinto
20
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Por uacuteltimo PELAJIĆ et al [45] aplicaron su meacutetodo SPE dispersiva-GC-MS mediante el cual determinaron 25
residuos de plaguicidas en vino tinto a un total de 32 muestras de vino adquiridos en supermercados locales de
Croacia pero de diversos oriacutegenes de procedencia Los resultados que han obtenido se muestran en la Tabla I6
en doacutende un total de 15 plaguicidas han sido detectados y 7 de los cuales se encontraban en una alta
concentracioacuten
Tabla I6 Resultados de los vinos con positivos en pesticidas y sus concentraciones [45]
Vino Paiacutes Residuos de pesticidas (mgKg)
Tinto Francia DIM (0013) MET (0009) IPR (001)
Tinto Alemania BOS (0011)
Tinto Alemania IPR (0009)
Tinto Macedonia MET (0015)
Tinto Moldavia IPR (0008)
Tinto Polonia MET (004)
Tinto Rumania PYM (0058)
Tinto Espantildea TRI (0005) MET (0011)
Tinto Estados Unidos BOS (001)
Rosado Francia BOS (0005)
Blanco Chile TEC (0008)
Blanco Georgia MET (0057)
Blanco Alemania DIM (001) IPR (0054) PYM (0056)
Blanco Sudaacutefrica DIM (0011) IPR (0011)
21
Capiacutetulo II Objetivos y discusioacuten
CAPIacuteTULO II OBJETIVOS Y DISCUSIOacuteN
El objetivo principal que se persigue en este trabajo es el desarrollo de un meacutetodo analiacutetico raacutepido basado en la
extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) y deteccioacuten mediante cromatografiacutea de liacutequidos en la modalidad de UPLC
acoplada a la espectrometriacutea de masas en taacutendem (UPLC-MSMS) para la determinacioacuten multianalito de residuos
de fitosanitarios principalmente fungicidas aunque tambieacuten alguacuten insecticida en muestras de vino blanco y tinto
Para llevar a cabo la finalidad de lo dicho se consideran unos objetivos maacutes especiacuteficos
Minimizar la manipulacioacuten de la muestra para asiacute reducir la cantidad de disolventes y tiempo empleado
Optimizacioacuten de los factores que afectan en la extraccioacuten en la SPE tales como tipo y cantidad de
adsorbente volumen de eluyente etc
Estudio de las condiciones en UPLC-MSMS para una separacioacuten y cuantificacioacuten oacuteptimas
Caracterizacioacuten y validacioacuten del meacutetodo propuesto
Por uacuteltimo una vez cumplidos todos los objetivos anteriores y fijadas las condiciones oacuteptimas el meacutetodo
estudiado se aplica en el anaacutelisis de muestras de vino comercial (blanco y tinto) para determinar si se encuentran
residuos presentes asiacute como conocer en queacute concentracioacuten se encuentran los pesticidas objeto de este estudio
22
Capiacutetulo III Parte experimental
CAPIacuteTULO III PARTE EXPERIMENTAL
1 MATERIAL Y REACTIVOS
11 Material
Material de vidrio de uso comuacuten en el laboratorio vasos de precipitados matraces aforados etc
Micropipetas automaacuteticas de 20-200 microL 20-200 microL 100-1000 microL 1000-5000 microL Eppendorf
Puntas de plaacutestico para micropipetas
Encapsulador y desencapsulador
Soportes y pinzas
Viales de 15 mL transparentes para muestreador automaacutetico de cromatografiacutea (Sugelabor)
Caacutepsulas de aluminio con seacuteptum de Tefloacuten (Sugelabor) y tapones pre-slit para viales
Tubos y conectores de tefloacuten
Cartuchos de divinilbenceno-N-vinilpirrolidona 200 mg Oasis HLB Waters
Cartuchos de divinilbenceno-N-vinilpirrolidona funcionalizados con grupos amina cuaternaria 150 mg
Oasis MAX Waters
Cartuchos de divinilbenceno-N-vinilpirrolidona 60 mg Oasis HLB Waters
12 Reactivos y disolventes
Agua ultrapura Milli-Q
Aacutecido foacutermico (Sigma Aldrich) 95
Acetonitrilo (LichrosolvregMerck) Gradient grade for liquid chromatography
Metanol (LichrosolvregMerck) Gradient grade for liquid chromatography
Etanol (LichrosolvregMerck) Gradient grade for liquid chromatography
13 Patrones
Ametoctradin (AME) Dr Ehrenstrorfer 990
Benalaxyl (BEN) Pestanal Sigma- Aldrich 999
23
Capiacutetulo III Parte experimental
Boscalid (BOS) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Carbendazim (CAR) Pestanal Sigma- Aldrich 992
Cyprodinil (CYP) Pestanal Sigma- Aldrich 998
Dimethomorph (DIM) mezcla de isoacutemeros E + Z Pestanal Sigma- Aldrich 989
Fenhexamid (FEH) Pestanal Sigma- Aldrich 997
Fenpropidin (FEP) Dr Ehrenstrorfer 980
Fluopicolide (FLU) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Imidacloprid (IMI) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Iprovalicarb (IPR) mezcla de isoacutemeros Pestanal Sigma- Aldrich 985
Mandipropamid (MAN) Pestanal Sigma- Aldrich 991
Metalaxyl (MET) Pestanal Sigma- Aldrich 990
Myclobutanil (MYC) Pestanal Sigma- Aldrich 994
Penconazole (PEN) Pestanal Sigma- Aldrich 991
Pyraclostrobin (PYC) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Pyrimethanil (PYM) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Tebuconazol (TEC) Pestanal Sigma- Aldrich 996
Tebufenozide (TEF) Dr Ehrenstrorfer 988
Thiabendazole (TBZ) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Thiamethoxam (TME) Pestanal Sigma- Aldrich 996
Thiophanate-methyl (THI-M) Dr Ehrenstrofer 990
Triadimenol (TRI) Mezcla de diastereoisoacutemeros Pestanal Sigma- Aldrich 994
14 Patrones internos
Carbendazim-d3 (CAR-d3) Pestanal Sigma- Aldrich 998
Cyprodinil-d5 (CYP-d5) Pestanal Sigma- Aldrich
Imidacloprid-d4 (IMID-d4) Pestanal Sigma- Aldrich
Metalaxyl 13C6 (MET13C6) Pestanal Sigma-Aldrich 99
24
Capiacutetulo III Parte experimental
15 Gases
Nitroacutegeno 99999 como gas de colisioacuten en el espectroacutemetro de masas
Nitroacutegeno en los sistemas de concentracioacuten y secado por corriente de nitroacutegeno de los cartuchos SPE
2 INSTRUMENTACIOacuteN
Balanza analiacutetica de precisioacuten Sartorius
Granatario Sartorius
Bantildeo de ultrasonidos P-Selecta
Equipo de purificacioacuten de agua Millipore modelo Milli-Q gradient A-10ZMQSSVOT4
Estacioacuten de concentracioacuten por corriente de nitroacutegeno Mini-Vap Supelco
Sistema de secado de cartuchos de SPE por corriente de nitroacutegeno VisiDry Supelco
Sistema distribuidor de vaciacuteo Visiprep reg Supelco
Cromatoacutegrafo de liacutequidos de ultra-alta resolucioacuten Waters AcquityUPLC reg y espectroacutemetro de masas
Acquity TQD con analizador de triple quadrupolo (QqQ) equipado con una fuente de ionizacioacuten a
presioacuten atmosfeacuterica del tipo Z-spray (ESI)
3 PREPARACIOacuteN DE LAS DISOLUCIONES
Los patrones de pesticidas se prepararon individualmente a partir de los compuestos soacutelidos comerciales por
pesada excepto en el caso del fenpropidin (FEP) que se preparoacute a partir del compuesto liacutequido comercial Estos
compuestos soacutelidos se disolvieron en metanol y se obtuvieron unas disoluciones iniciales con concentraciones
recogidas en la Tabla III1
25
Capiacutetulo III Parte experimental
Tabla III1 Concentracioacuten de las disoluciones patroacuten stock
Compuesto Concentracioacuten (microgmL) Compuesto Concentracioacuten (microgmL)
AME 102201 MET 118912
BEN 138330 MYC 102017
BOS 99474 PEN 129791
CAR 17105 PYC 104581
CYP 131075 PYM 141386
DIM 103009 TEC 134729
FEH 99584 TEF 137769
FEP 100000 TBZ 105928
FLU 126859 TME 112283
IMI 101123 THI-M 124202
IPR 106739 TRI 118933
MAN 101021
4 LAVADO DEL MATERIAL
La limpieza del material de vidrio utilizado en el laboratorio se realizoacute utilizando jaboacuten y aclarando con agua de
grifo Luego en primer lugar se realiza un enjuague con agua Milli-Q finalmente un segundo enjuague con
acetona para eliminar posibles restos de compuestos orgaacutenicos y se deja secar sobre papel
Para la limpieza de los conectores de tefloacuten empleados en el proceso de SPE se introducen en un vaso de
precipitados con metanol y este en un bantildeo de ultrasonidos durante 10 minutos Al finalizar con el bantildeo de
ultrasonidos se realiza un enjuague con acetona y se pone a secar
5 EXTRACCIOacuteN DE MUESTRAS MEDIANTE SPE
El meacutetodo de extraccioacuten utilizado para la determinacioacuten de pesticidas fue la extraccioacuten en fase soacutelida (SPE)
mediante cartuchos Oasis HLB de 200 mg A continuacioacuten se describe el protocolo de extraccioacuten en las
condiciones oacuteptimas
26
Capiacutetulo III Parte experimental
1 Acondicionamiento del cartucho Oasis HLB de 200 mg con 2 mL de acetonitrilo seguidos de otros 2 mL de
vino sinteacutetico formado por la mezcla etanolagua MilliQ (1288)
2 Paso de la muestra 2 mL de vino diluiacutedos con 2 mL de agua MilliQ a traveacutes del cartucho por gravedad
3 Lavado del cartucho con 2 mL de agua MilliQ
4 Secado del cartucho durante 45 minutos en el VisiDry mediante el paso de una corriente de nitroacutegeno
5 Elucioacuten del cartucho con la mezcla metanolacetonitrilo en proporcioacuten 2080 hasta un volumen final de 2
mL
6 Anaacutelisis mediante cromatografiacutea liacutequida acoplada a espectrometriacutea de masas en taacutendem UPLC-MSMS
(volumen de inyeccioacuten 15 microL)
Representacioacuten esquematizada en la Figura III1
Figura III1 Extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) de las muestras de vino
27
Capiacutetulo III Parte experimental
6 CONDICIONES DE DETERMINACIOacuteN MEDIANTE UPLC-MSMS
En la Tabla III2 se indican las condiciones utlizadas en la determinacioacuten de los pesticidas de intereacutes mediante
LC-MSMS y en la Tabla III3 se muestra el gradiente de la fase moacutevil utilizado para la separacioacuten
cromatograacutefica
Tabla III2 Condiciones experimentales de determinacioacuten en LC-MSMS
UPLC Acquity UPLC-I-Class IVD System
bull Columna cromatograacutefica Zorbax Eclipse Plus C18 Rapid Resolution HD
Fase estacionaria C18
Dimensiones 21 x 50 mm
Tamantildeo de partiacutecula 18 microm
Temperatura del horno 40ordmC
bull Inyector
Volumen de inyeccioacuten 15 microL
bull Fase moacutevil
Flujo 04 mLmin
Fase acuosa (A) Agua MilliQ con 01 aacutecido foacutermico
Fase orgaacutenica (B) Acetonitrilo con 01 aacutecido foacutermico
MSMS WatersXevo TQD
Modo de ionizacioacuten ESI positivo
Voltaje del capilar 15 kV
Voltaje de cono 50 V
Temperatura de gas de secado (N2) 450ordmC
Flujo de gas de secado (N2) 1000 Lh
Modo de adquisicioacuten Centroide
Tabla III3 Gradiente de fase moacutevil utilizado en la separacioacuten cromatograacutefica (LC)
Tiempo min 0 13 28 64 75 76 10
A 98 50 50 0 0 98 98
B 2 50 50 100 100 2 2
28
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
CAPIacuteTULO IV RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
1 IDENTIFICACIOacuteN DE LOS COMPUESTOS
Para empezar el estudio en primer lugar se realizoacute la caracterizacioacuten de las condiciones de determinacioacuten de los
analitos en el modo Multiple Reaction Monitoring (MRM) mediante UPLC-ESI-MSMS Para llevarla a cabo se
tomaron patrones individuales de cada fitosanitario y mediante infusioacuten se estudiaron las posibles transiciones y
voltajes oacuteptimos para su determinacioacuten (Tabla IV1)
La ionizacioacuten por electrospray (ESI) se estudioacute tanto en modo positivo como en modo negativo encontraacutendose
que para todos los pesticidas de nuestro intereacutes se obteniacutea sentildeal en el modo positivo mientras el modo negativo
no presentaba respuesta significativa
A continuacioacuten se estudia el efecto del voltaje de cono en la respuesta del ioacuten molecular [M+H]+ aumentaacutendolo
hasta alcanzar el valor maacuteximo de la sentildeal correspondiente a dicho ioacuten y luego se optimiza la energiacutea de colisioacuten
variaacutendola para cada analito hasta obtener la sentildeal de mayor intensidad para cada uno de los iones producto Por
uacuteltimo una vez optimizado el voltaje de cono y la energiacutea de colisioacuten se seleccionan las dos transiciones maacutes
intensas para llevar a cabo la cuantificacioacuten y cualificacioacuten de cada analito en modo MRM Este procedimiento se
realizoacute para la totalidad de los compuestos confirmando los datos obtenidos con los facilitados por la base de
datos Quanpedia que estaacute disponible en el software del equipo utilizado para algunos de los compuestos
considerados
Compuesto Tr (min) Ion precursor (mz Da)
Voltaje de cono (V)
Ion producto 1 (CEv)
cuantificacioacuten
Ion producto 2 (CEv)
cualificacioacuten
Relacioacuten IP2IP1
AME 325 2760 60 176 (35) 70 (50) 016
BEN 485 3261 26 148 (20) 91 (34) 067
BOS 387 3429 41 140 (20) 307 (20) 011
CAR 167 1921 33 160 (18) 132 (28) 014
CYP 311 2260 56 93 (33) 108 (25) 061
DIM 322 3881 40 301 (20) 165 (30) 057
FEH 386 3021 41 97 (22) 55 (38) 044
FEP 257 2742 55 147 (28) 86 (28) 093
FLU 401 3830 40 173 (20) 365 (15) 010
IMI 218 2561 34 209 (15) 175 (20) 091
IPR 358 3211 28 119 (16) 203 (10) 042
Tabla IV1 Tiempos de retencioacuten (Tr) relacioacuten de iones precursores (mz) voltaje de cono (V) energiacuteas de colisioacuten (CE) y relacioacuten de intensidades entre transiciones (IP2IP1)
29
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Compuesto Tr (min) Ion precursor (mz Da)
Voltaje de cono (V)
Ion producto 1 (CEv)
cuantificacioacuten
Ion producto 2 (CEv)
cualificacioacuten
Relacioacuten IP2IP1
MAN 392 4120 25 328 (16) 125 (35) 063
MET 283 2801 26 220 (13) 192 (17) 057
MYC 365 2891 34 70 (18) 125 (32) 029
PEN 417 2840 34 70 (16) 159 (34) 031
PYC 523 3881 31 194 (12) 163 (25) 066
PYM 266 2000 51 107 (24) 82 (24) 071
TEC 397 3080 40 70 (22) 125 (40) 007
TEF 473 3531 19 133 (20) 297 (8) 072
TBZ 182 2020 51 175 (25) 131 (30) 062
TME 203 2920 28 211 (12) 132 (22) 047
THI-M 257 3430 28 151 (46) 93 (19) 0001
TRI 319 2961 21 70 (10) 99 (15) 013
El dwell time para cada una de las transiciones se ajustoacute de manera automaacutetica por el software (MassLinx) con
objeto de obtener doce puntos espectrales por compuesto tomando un valor promedio de cuatro segundos como
ancho de pico a liacutenea de base
2 CARACTERIZACIOacuteN DEL PROCEDIMIENTO DE DETERMINACIOacuteN (UPLC-ESI-
MSMS)
Una vez optimizados los paraacutemetros que afectan a la separacioacuten cromatograacutefica (UPLC) y a la determinacioacuten por
espectrometriacutea de masas en taacutendem (MSMS) se lleva a cabo la evaluacioacuten de la repetibilidad de inyeccioacuten y
determinacioacuten en esas condiciones Se expresa por medio de la desviacioacuten estaacutendar relativa (RSD) paraacutemetro que
nos indica el grado de correlacioacuten que existe entre varias medidas del mismo patroacuten realizadas por el mismo
operador en el laboratorio y en el mismo equipo de medida a lo largo de un diacutea Para el estudio se realizan diez
inyecciones con volumen de 15 microL de dos patrones con distintos niveles de concentracioacuten 5 y 20 ngmL Los
datos de RSD (Tabla IV2) para las aacutereas de pico de los analitos se situacutean para el nivel de concentracioacuten 5 ngmL
en el rango 2-13 y en el nivel de concentracioacuten 20 ngmL en el rango 1-7
30
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten Tabla IV2 Desviacioacuten estaacutendar relativa (RSD) del aacuterea de pico (transicioacuten de cuantificacioacuten) para evaluar la repetivilidad del proceso de LC-MSMS
Compuesto RSD
5 ngmL
RSD
20 ngmL Compuesto
RSD
5 ngmL
RSD
20 ngmL
AME 5 2 MET 3 2
BEN 2 2 MYC 9 2
BOS 4 5 PEN 4 4
CAR 4 2 PYC 3 1
CYP 5 7 PYM 7 3
DIM 6 5 TEC 3 2
FEH 7 4 TEF 4 2
FEP 4 2 TBZ 2 1
FLU 5 3 TME 6 6
IMI 13 7 THI-M a 6
IPR 8 2 TRI 8 6
MAN 3 2
A continuacioacuten tambieacuten se evaluoacute la repetibilidad de los tiempos de retencioacuten (Tr) para diez inyecciones de
patrones a los dos niveles de concentracioacuten 5 y 20 ngmL situaacutendose las RSD para todos los compuestos en el
rango 01-03 En base a este dato la ventana de tiempo en la que se registran las transiciones de MRM de cada
compuesto se fijoacute en 05 min lo que es lo mismo 025 min alrededor del valor medio de su tiempo de retencioacuten
Por otro lado la linealidad del meacutetodo se estudioacute a nueve niveles de concentracioacuten diferentes comprendidos ente
los niveles 05 ngmL y 200 ngmL mediante la inyeccioacuten de disoluciones patroacuten de los distintos compuestos de
estudio Se realizoacute una evaluacioacuten sin y otra con patroacuten interno (IS) antildeadiendo una concentracioacuten fija de patrones
internos a nivel de 25 ngmL y pudimos observar que los resultados mejoran notablemente al realizar una
correccioacuten con el IS En la Tabla IV3 se muestran los coeficientes de determinacioacuten (R2) obtenidos al realizar la
correccioacuten mediante IS observando que para todos los compuestos excepto para THI-M y para TRI los
coeficientes de correlacioacuten son superiores a 0990 por lo que existe una respuesta lineal en el rango de
concentraciones que hemos estudiado
Aparte del estudio de la linealidad tambieacuten se han estudiado los liacutemites de cuantificacioacuten instrumentales del
meacutetodo (LOQs) Para ello los LOQs se evaluacutean como la miacutenima cantidad de analito que origina una sentildeal 10
veces superior a la desviacioacuten estaacutendar del ruido Los valores anteriores se estimaron a partir del patroacuten de
a no evaluado ya que se encuentra por debajo del liacutemite de cuantificacioacuten del meacutetodo
31
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
concentracioacuten maacutes baja que presenta un pico con una relacioacuten SN superior a 10 En la Tabla IV3 tambieacuten se
recogen estos LOQs en doacutende podemos ver que variacutean en el rango 01-1 ngmL excepto para THI-M que se
desviacutea a valores de 10 ngmL
Tabla IV3 Coeficientes de determinacioacuten (R2) y liacutemites de cuantificacioacuten instrumentales (LOQs) de los analitos para nueve
niveles de concentracioacuten de 05 a 200 ngmL
Compuesto Coeficiente de
correlacioacuten (R2)
LOQs (ngmL) Compuesto
Coeficiente de correlacioacuten
(R2)
LOQs (ngmL)
AME 09951 04 MET 09933 01
BEN 09949 01 MYC 09950 04
BOS 09979 02 PEN 09945 02
CAR 09923 02 PYC 09955 02
CYP 09878 02 PYM 09931 01
DIM 09938 07 TEC 09958 05
FEH 09959 05 TEF 09957 01
FEP 09931 01 TBZ 09942 02
FLU 09965 02 TME 09903 01
IMI 09979 05 THI-M 09580 100
IPR 09938 01 TRI 09867 07
MAN 09979 01
En la Figura IV1 y Figura IV2 se muestran dos ejemplo de curvas de calibrado para dos compuestos IMI y
MAN respectivamente
Figura IV1 Curva de calibrado y coeficiente de determinacioacuten de IMI para UPLC-ESI-MSMS
32
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Figura IV2 Curva de calibrado y coeficiente de determinacioacuten de MAN para UPLC-ESI-MSMS
3 ESTUDIO DEL MEacuteTODO SPE
La extraccioacuten de pesticidas se llevoacute a cabo mediante extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) en doacutende se realizaron
diversos estudios con diferentes condiciones para dar con las oacuteptimas En primer lugar se llevaron a cabo los
experimentos de retencioacuten y elucioacuten sobre dos tipos distintos de adsorbentes cartuchos OASIS HLB (200mg) y
cartuchos OASIS MAX (150 mg) como fases potenciales en las que llevar a cabo la extraccioacuten de manera
selectiva Los dos tipos de cartuchos son de fase reversa pero difieren entre siacute en el fundamento de retencioacuten de
los analitos En los cartuchos OASIS HLB (200 mg) formados por divinilbenceno-N-vinilpirrolidona (DVB-VP)
la retencioacuten de los diferentes analitos tiene lugar por interacciones π-π o de Van der Waals mientras que los
cartuchos OASIS MAX (150 mg) que se probaron como alternativa para mejorar la selectividad en la extraccioacuten
cuentan con un adsorbente polimeacuterico de modo mixto formado por divinilbenceno-N-vinilpirrolidona (DVB-VP)
funcionalizado con grupos amina cuaternaria siendo el fundamento de la extraccioacuten la combinacioacuten de las
propiedades adsorbentes del cartucho HLB con un mecanismo adicional de intercambio ioacutenico (anioacutenico) [27]
Algunos autores han empleado este mecanismo para mejorar la selectividad de la extraccioacuten de forma que en la
etapa de elucioacuten ciertos pigmentos del vino quedan fuertemente retenidos en el adsorbente a diferencia de lo que
ocurre con los adsorbentes de fase reversa [51]
Para llevar a cabo la eleccioacuten del tipo de adsorbente se realizaron pruebas con 10 mL de vino blanco y tinto
conectando en serie los dos tipos de cartuchos HLB (200 mg) y MAX (150 mg) a un segundo cartucho OASIS
HLB (60 mg) La elucioacuten de los analitos se hace de forma independiente para cada cartucho y se evaluacutea si los
analitos pasan del primer cartucho hacia el segundo cartucho es decir si se supera el volumen de corte o si por
33
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
otro lado se quedan retenidos en el primero y no eluyen hacia el segundo En estas pruebas de estudio
preliminares de preparacioacuten de la muestra no se ha incluido el CYP
En la Figura IV3 podemos ver la eficacia de la extraccioacuten para vino blanco y tinto que obtenemos empleando
cartuchos OASIS MAX (150 mg) conectados en serie con cartuchos OASIS HLB (60 mg) realizando la
extraccioacuten de tres fracciones de 2 mL cada una del cartucho OASIS MAX (150 mg) y una cuarta fraccioacuten de 2
mL del cartucho OASIS HLB (60 mg)
Por otro lado en la Figura IV4 podemos ver un graacutefico de columnas en el cual comparamos la eficacia de
extraccioacuten de los cartuchos OASIS HLB (200 mg) con dos disolventes de elucioacuten distintos En dicho graacutefica el
acroacutenimo de cada compuesto consta de dos barras cuyo significado es el siguiente la barra de la izquierda indica
la eficacia de la extraccioacuten empleando acetonitrilo (ACN) como disolvente de elucioacuten y la barra de la derecha
indica la eficacia de la extraccioacuten empleando la combinacioacuten MetanolAcetonitrilo (2080) (MeOHACN) como
disolvente de elucioacuten Para este adsorbente no se detectoacute ninguacuten compuesto en la extraccioacuten del segundo
cartuchos OASIS HLB (60 mg) empleando 2 mL de metanol
Figura IV3 Distribucioacuten de los compuestos en cada fraccioacuten obtenidas con cartuchos OASIS MAX (150 mg)
utilizando 10 mL de vino tinto y blanco sacando cuatro fracciones de 2 mL cada una con metanol como
disolvente de elucioacuten
34
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Figura IV4 Distribucioacuten de los compuestos en cada fraccioacuten obtenidas con cartuchos OASIS HLB (200 mg) utilizando 10
mL de vino tinto y blanco sacando 3 fracciones de 2 mL cada una con acetonitrilo (ACN) (columna de la izquierda) y una
combinacioacuten MetanolAcetonitrilo (2080) (MeOHACN) (columna de la derecha) como disolventes de elucioacuten
A la vista de los resultados reflejados en las graacuteficas podemos afirmar que cuando se utiliza el cartucho OASIS
HLB (200 mg) eluyendo con acetonitrilo o la combinacioacuten metanolacetonitrilo (2080) los extractos son limpios
y se eluyen la mayoriacutea de los compuestos en la primera fraccioacuten Pero utilizando acetonitrilo como disolvente de
elucioacuten se encuentran problemas en la extraccioacuten de CAR FEH y TBZ para los que es necesario emplear un
volumen mayor de elucioacuten o bien seleccionar otro disolvente de elucioacuten como es la combinacioacuten
metanolacetonitrilo
35
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Por otro lado los extractos en los cartuchos OASIS MAX (150 mg) son maacutes limpios incluso utilizando metanol en
la elucioacuten pero se detecta la presencia de CAR FEP TBZ y TME en el segundo cartucho OASIS HLB (60 mg)
significando la rotura del primer cartucho para dichos analitos considerando un volumen de 10 mL de vino Los
demaacutes compuestos se podriacutean recuperar cuantitativamente en la primera fraccioacuten sacada pero la peacuterdida de estos
compuestos inclina la eleccioacuten hacia los cartuchos OASIS HLB (200 mg) con metanolacetonitrilo (2080) como
disolvente de elucioacuten para continuar con el estudio
Una vez fijado el adsorbente y el volumen de elucioacuten se prueba la eficacia de la SPE independiente de los efectos
de matriz En la Tabla IV4 se muestran las recuperaciones de la SPE tomando 10 mL de vino blanco y tinto
con un nivel de adicioacuten de 15 ngmL sacando una sola fraccioacuten de 2 mL con la combinacioacuten
metanolacetonitrilo (2080) y n=3 reacuteplicas
Tabla IV4 Recuperaciones (R plusmn SD) de SPE para 10 mL de vino (blanco y tinto) con un nivel de adicioacuten de 15 ngmL y
n=3 reacuteplicas
Compuesto Vino Tinto
R plusmn SD
Vino Blanco
R plusmnSD Compuesto
Vino Tinto
R plusmn SD
Vino Blanco
R plusmn SD
AME 82 plusmn 7 100 plusmn 1 MET 92 plusmn 6 94 plusmn 3
BEN 89 plusmn 6 97 plusmn 3 MYC 90 plusmn 9 86 plusmn 4
BOS 95 plusmn 1 100 plusmn 2 PEN 84 plusmn 10 103 plusmn 3
CAR 91 plusmn 6 104 plusmn 6 PYC 86 plusmn 5 106 plusmn 1
CYP 81 plusmn 7 102 plusmn 3 PYM 87 plusmn 12 94 plusmn 3
DIM 97 plusmn 3 86 plusmn 4 TEC 83 plusmn 10 103 plusmn 1
FEH 89 plusmn 3 88 plusmn 3 TEF 84 plusmn 5 108 plusmn 4
FEP 91 plusmn 7 104 plusmn 3 TBZ 88 plusmn 7 92 plusmn 5
FLU 91 plusmn 2 97 plusmn 4 TME 101 plusmn 1 110 plusmn 13
IMI 117 plusmn 8 101 plusmn 11 THI-M 85 plusmn 9 110 plusmn 4
IPR 89 plusmn 7 112 plusmn 4 TRI 85 plusmn 10 110 plusmn 4
MAN 88 plusmn 2 87 plusmn 2
Algunos compuestos de la matriz en el vino pueden competir con los analitos durante el proceso de ionizacioacuten
que tiene lugar en la interfase entre UPLC-MSMS por lo que para la cuantificacioacuten del rendimiento de la
ionizacioacuten por electrospray (ESI) se estudian los efectos de matriz (EM) para vino blanco y tinto considerando
dos voluacutemenes de muestra distintos 2 y 10 mL y un volumen final del extracto de 2 mL En la Tabla IV5 se
36
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
exponen los valores para cada compuesto notando que al aumentar el volumen de muestra tambieacuten se aumentan
los efectos de matriz y eacutestos siempre son mayores en vino tinto Para el caacutelculo de estos efectos de matriz (EM)
se emplea la siguiente ecuacioacuten
Donde Am Ab y Ap representan el aacuterea de pico en la sentildeal medida del analito en el extracto de la muestra con
adicioacuten en el extracto de la muestra sin adicioacuten (o blanco) y en el patroacuten antildeadido respectivamente El nivel de
adicioacuten en extracto fue de 50 ngmL por compuesto
Tabla IV5 Efectos de matriz para vino blanco y tinto con un volumen inicial de 2 y 10 mL evaluados para un nivel de adicioacuten de 50 ngmL en extracto
Compuesto
Vino blanco Vino tinto
2 mL 10 mL 2mL 10 mL
EM () CV () EM () CV () EM () CV () EM () CV()
AME 93 3 95 2 99 3 101 7
BEN 99 1 93 2 101 3 100 6
BOS 97 5 98 1 108 2 96 0
CAR 62 2 50 3 58 2 55 6
CYP 94 3 91 1 97 2 95 7
DIM 105 2 95 3 100 3 108 3
FEH 100 4 102 4 105 4 94 3
FEP 95 3 88 2 96 2 92 7
FLU 98 2 93 2 106 1 101 2
IMI 84 4 46 3 48 10 18 8
IPR 99 3 92 3 105 1 100 7
MAN 100 1 94 3 109 4 107 2
MET 98 1 89 1 99 2 99 6
MYC 105 1 100 1 103 2 96 9
PEN 98 3 97 1 101 3 99 10
PYC 98 2 92 3 102 2 98 5
PYM 95 2 87 1 94 3 85 12
TEC 95 3 99 1 101 1 102 10
TEF 99 1 92 3 101 2 104 5
TBZ 45 0 40 5 43 2 30 7
TME 60 6 19 16 36 4 16 1
THI-M 107 2 109 2 103 1 96 9
TRI 97 3 118 4 104 5 117 10
37
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Al observar los resultados podemos ver que la mayoriacutea de los compuestos dan resultados de EM en torno al
100 lo que significa que no sufren una modificacioacuten importante en la eficacia de ionizacioacuten para las muestras
con respecto a los patrones Pero tambieacuten por el contrario podemos observar que algunos compuestos como
por ejemplo en el caso de CAR TBZ IMI y TME experimentan una gran supresioacuten de sentildeal es decir EM bajos
que se acentuacutean al aumentar el volumen de muestra La atenuacioacuten en la eficacia de variacioacuten para estos cuatro
compuestos no solo se ve incrementada con el volumen de muestra si no que ademaacutes es maacutes significativa para
vino tinto que para vino blanco En base a estos resultados aunque la eficacia de la SPE fue cuantitativa para
muestras de 10 mL se limitoacute el volumen de muestra a extraer a 2 mL
Las condiciones oacuteptimas de extraccioacuten se esquematizan en un resumen en la Figura IV5
Figura IV5 Condiciones optimizadas para la extraccioacuten de pesticidas en vino
38
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
4 CARACTERIZACIOacuteN DEL MEacuteTODO DE DETERMINACIOacuteN
Con las condiciones de extraccioacuten y determinacioacuten citadas anteriormente se llevaron a cabo pruebas de
recuperaciones absolutas de los compuestos a nivel de adicioacuten de 5 y 20 ngmL sobre las muestras Para cada
muestra y nivel de adicioacuten se realizaron tres reacuteplicas de las muestras con adicioacuten y los blancos aliacutecuotas de las
mismas muestras sin adicioacuten se procesaron en duplicado Los IS se antildeadieron a nivel de 25 ngmL y cada uno se
utiliza para corregir unos determinados compuestos CAR-d3 se emplea para CAR y TBZ el CYP-d5 para CYP y
PYM el IMID-d4 para IMI y TME y el MET13C6 para el resto de compuestos Los resultados para vino blanco
comprenden en el nivel de concentracioacuten 5 ngmL el rango entre 79-122 y en el nivel de concentracioacuten 20
ngmL el rango entre 84-109 Por otro lado en el caso del vino tinto las recuperaciones se encuentran para el
nivel de concentracioacuten 5 ngmL en el rango 67-112 y para el nivel de concentracioacuten 20 ngmL entre el rango
73-132 Los resultados obtenidos en las pruebas con vino blanco y vino tinto se muestran en la Tabla IV6
Los resultados son satisfactorios ya que la mayoriacutea de los compuestos se ajustan en todos los casos al rango de
recuperacioacuten entre 70-120 Para la realizacioacuten de estas pruebas se ha eliminado de los resultados el compuesto
THI-M debido a que las concentraciones utilizadas se encuentran en el liacutemite o por debajo del LOQ en los
experimentos con muestras adicionadas a 5 ngmL
Para calcular las recuperaciones (R) se recurrioacute a la siguiente ecuacioacuten
Donde Cm Cb y Cp son la concentracioacuten medida de analito en el extracto de la muestra con adicioacuten en el extracto
de la muestra sin adicioacuten (o blanco) y en el patroacuten antildeadido respectivamente
Tabla IV6 Recuperaciones (R) para vino tinto y vino blanco evaluadas para dos niveles de concentracioacuten 5 y 20 ngmL
Compuesto
Vino tinto Vino Blanco
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
AME 97 3 105 6 104 9 96 5
BEN 88 11 105 3 101 1 98 4
BOS 91 13 110 2 88 13 97 3
39
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Compuesto
Vino tinto Vino blanco
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
CAR 99 6 99 3 122 3 109 1
CYP 91 2 111 1 101 4 100 6
DIM 112 3 110 9 102 24 99 11
FEH 91 4 108 0 102 20 95 2
FEP 89 8 102 7 94 5 84 1
FLU 95 10 104 4 109 5 100 8
IMI 73 11 115 9 80 13 100 2
IPR 84 13 99 3 111 3 99 4
MAN 88 22 112 8 112 3 99 4
MET 99 3 106 5 106 3 98 2
MYC 84 9 106 13 88 17 86 3
PEN 84 9 102 5 84 8 90 5
PYC 96 6 105 4 100 2 95 4
PYM 90 12 112 14 106 4 97 1
TEC 89 8 101 6 98 12 94 1
TEF 93 10 102 5 107 2 97 3
TBZ 94 17 115 8 79 5 106 2
TME 67 2 101 7 84 18 90 11
THI-M ne - 74 7 ne - 89 24
TRI 88 12 97 6 102 6 92 2
ne No evaluado El nivel de adicioacuten es inferior al LOQ del meacutetodo para este compuesto
Para estudiar la reproducibilidad del meacutetodo analiacutetico global (correspondientes a los datos de preparacioacuten de
muestra y determinacioacuten) es decir la concordancia de varias medidas realizadas en diacuteas diferentes se procedioacute a la
extraccioacuten en las condiciones oacuteptimas tanto de vino blanco como tinto Las extracciones y determinaciones se
realizaron durante tres diacuteas consecutivos realizando tres reacuteplicas por vino y por diacutea con un nivel de adicioacuten en
muestra de 10 ngmL un blanco de muestra cada diacutea En la Tabla IV7 se muestran los resultados como
recuperaciones (R) en condiciones de reproducibilidad obtenidos para ambos tipos de vino dando valores entre
64-116 para muestras de vino blanco y valores situados entre 68-108 para muestras de vino tinto con la
excepcioacuten del TME para el que se ha obtenido un valor no aceptable en cuanto a la exactitud medida en
condiciones de reproducibilidad A la vista de los resultados obtenidos con estas pruebas se considera necesario el
empleo de IS adicionales para la mejora en la exactitud del meacutetodo para algunos compuestos por ejemplo el
TME
40
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Tabla IV7 Recuperaciones en condiciones de reproducibilidad (R plusmn SD) para vino blanco y tinto
Compuesto
Vino tinto Vino blanco
R
10 ngmL CV ()
R
10 ngmL CV ()
AME 90 5 101 13
BEN 96 5 102 7
BOS 97 6 100 8
CAR 97 3 94 5
CYP 103 3 105 12
DIM 104 7 106 8
FEH 90 16 83 15
FEP 91 5 90 4
FLU 103 7 102 6
IMI 99 14 101 14
IPR 91 5 100 13
MAN 108 5 108 13
MET 101 5 101 5
MYC 105 16 102 14
PEN 96 11 92 10
PYC 99 12 97 12
PYM 102 4 116 8
TEC 99 9 97 16
TEF 99 8 105 11
TBZ 68 4 84 5
TME 47 13 64 10
THI-M 107 11 104 16
TRI 95 14 103 4
En la Tabla IV8 se muestran los liacutemites de cuantificacioacuten (LOQs) del meacutetodo del meacutetodo de SPE-UPLC-ESI-
MSMS obtenidos para los diferentes pesticidas Los valores obtenidos son ideacutenticos a los LOQs instrumentales
excepto en el caso de aquellos compuestos para los que se observaronfuertes efectos de matriz (Tabla IV5) En
estos casos (CAR TBZ IMI y TME) los LOQs del meacutetodo se incrementan seguacuten la atenuacioacuten de sentildeal
observada
41
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Tabla IV8 Liacutemites de cuantificacioacuten LOQs (ngmL) del meacutetodo obtendos para cada compuesto
Compuesto LOQ (ngmL) Compuesto LOQ (ngmL)
AME 04 MET 01
BEN 01 MYC 04
BOS 02 PEN 02
CAR 03 PYC 02
CYP 02 PYM 01
DIM 07 TEC 05
FEH 05 TEF 01
FEP 01 TBZ 04
FLU 02 TME 02
IMI 06 THI-M 10
IPR 01 TRI 07
MAN 01
5 APLICACIOacuteN A MUESTRAS DE VINO COMERCIALES
Una vez optimizadas las condiciones del meacutetodo y estudiadas las caracteriacutesticas del meacutetodo desarrollado se aplicoacute
a la determinacioacuten de los compuestos de intereacutes estudiados en muestras de vino blanco y vino tinto comerciales
producidos en diferentes paiacuteses En la Tabla IV9 se muestra el paiacutes de origen de cada muestra comercial
identificadas con un coacutedigo alfanumeacuterico y antildeo de produccioacuten
42
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Tabla IV9 Coacutedigo asignado para los diferentes vinos comerciales blancos y tintos analizados Indicando el paiacutes de origen y
antildeo de produccioacuten
Coacutedigo Denominacioacuten de origen Antildeo de produccioacuten
bull Vinos Blancos
W1 Alemania 2014
W2 Espantildea 2012
W3 Espantildea 2016
W4 Portugal Desconocido
W5 Francia 2015
W6 Francia 2015
W7 Espantildea 2016
bull Vinos Tintos
R1 Espantildea 2015
R2 Sudaacutefrica 2015
R3 Chile 2015
R4 Francia 2015
R5 China Desconocido
R6 Espantildea 2016
R7 Australia 2014
R8 Francia 2013
R9 Francia 2015
A continuacioacuten en la Tabla IV10 y la Tabla IV11 se recogen los resultados obtenidos en el anaacutelisis de las
muestras comerciales Los datos obtenidos corresponden en todos los casos al uso de patrones de calibracioacuten
como teacutecnica de cuantificacioacuten
Tabla IV10 Concentracioacuten (ngmL) encontradas en las diferentes muestras de vino blanco comercial analizadas mediante
SPE-UPLC-MSMS n=2 reacuteplicas y al final el sumatorio de las concentraciones encontradas
Compuesto W1 W2 W3 W4 W5 W6 W7
AME 04 nd nd nd 41 nd nd
BEN nd nd 14 nd nd nd nd
BOS 84 102 520 54 197 nd nd
CAR nd 115 56 nd nd nd nd
CYP 08 59 112 nd nd 26 nd
43
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Compuesto W1 W2 W3 W4 W5 W6 W7
DIM 14 84 400 09 32 50 nd
FEH 85 809 639 15 187 nd nd
FLU 11 05 92 nd 77 32 nd
IMI nd 136 88 29 nd nd 69
IPR 30 749 1144 14 nd nd nd
MAN nd nd nd nd nd 30 nd
MET 04 273 494 63 nd nd 172
MYC 09 nd 35 nd nd nd nd
PYM 15 469 584 08 24 35 nd
TEC 11 nd 58 nd nd nd nd
TRI nd 67 61 nd nd nd nd
sumconcentracioacuten
(ngmL) 274 2868 4358 192 558 173 862
nd no detectado
Tabla IV11 Concentracioacuten (ngmL) encontradas en las diferentes muestras de vino tinto comercial analizadas mediante
SPE-UPLC-MSMS n= 2 reacuteplicas y al final el sumatorio de las concentraciones encontradas
Compuesto R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9
AME nd nd nd 30 nd nd nd nd 16
BEN nd nd nd 07 nd nd nd nd nd
BOS nd 55 21 196 nd nd nd 73 21
CAR nd nd 04 17 249 20 nd nd nd
CYP 34 08 02 22 nd 136 nd 85 nd
DIM nd 33 nd 52 233 46 nd 61 23
FEH nd nd nd 1070 nd 10 nd 1307 14
FLU nd nd nd 20 nd nd nd nd nd
IPR 16 nd nd 17 nd 22 nd nd nd
MAN nd nd nd 17 nd nd nd 20 nd
MET 126 nd nd 14 55 313 30 44 39
MYC nd nd nd 05 nd 32 nd nd nd
PYM 19 nd 03 185 49 281 nd 24 nd
TEC 25 06 39 29 nd nd nd 21 20
TEF nd 01 12 nd nd nd nd nd nd
sumconcentracioacuten
(ngmL) 220 48 81 1681 586 860 30 1635 133
nd no detectado 44
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
En los resultados de los anaacutelisis podemos observar que en ninguna de las muestras comerciales de vino blanco
aparecieron los siguientes compuestos FEP PEN PYC TEF TBZ THI-M y TME y en los vinos tintos
comerciales no aparece a ninguna concentracioacuten FEP IMI PEN PYC TBZ TME THI-M y TRI No se
detectaron para dichas muestras de vino a niveles superiores a los LOQs del meacutetodo propuesto
Cuando se detecta un compuesto positivo se compara el pico cromatograacutefico del compuesto con el de un patroacuten
verificando la coincidencia del tiempo de retencioacuten (maacutexima diferencia 01 min) y la relacioacuten entre transiciones
(maacutexima diferencia 30 ) En la Figura IV6 y la Figura IV7 se muestran los cromatogramas para el compuesto
CYP obtenido en condiciones oacuteptimas para la muestra de vino blanco W6 y en un patroacuten de 5 ngmL
respectivamente En este caso el intervalo de tolerancia para la relacioacuten de intensidad entre transiciones es
IP2IP1=061plusmn018
Figura IV6 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el CYP en la muestra W6 (26 ngmL) Transicioacuten
superior 226gt93 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 226gt108 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades IP2IP1= 066
Figura IV7 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el CYP en un patroacuten de 5 ngmL Transicioacuten
superior 226gt93 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 226gt108 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades IP2IP1=061plusmn018
45
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Otro ejemplo de compuesto positivo en abundantes muestras comerciales de estudio es el Metalaxyl positivo con
una concentracioacuten de 04 ngmL en el vino con referencia W1 (Figura IV8) y positivo con una concentracioacuten de
313 ngmL en el vino con referencia R6 (Figura IV9) Ambas se comparan con el cromatograma de un patroacuten
de Metalaxyl de 1 ngmL (Figura IV10) El grado de concordancia en los tiempos de retencioacuten y la relacioacuten de
intensidades entre transiciones es satisfactorio
Figura IV8 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el MET en la muestra W1 (04 ngmL) Transicioacuten
superior 2801gt2201 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 2801gt1921 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades
IP2IP1=056
Figura IV9 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el MET en la muestra R6 (313 ngmL) Transicioacuten
superior 2801gt2201 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 2801gt1921 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades IP2IP1=
056
46
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Figura IV10 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el MET en un patroacuten de 1 ngmL Transicioacuten
superior 2801gt2201 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 2801gt1921 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades
IP2IP1=057plusmn017
Es de destacar que aunque se detectaron bastantes pesticidas en las diferentes muestras de vino comerciales pero
en ninguacuten caso superaron el 10 de los LMRs permitidos en uvas tal y como se recomienda ya que todaviacutea no
existen LMRs para vino en la legislacioacuten vigente No obstante el nivel total de concentracioacuten (sumatorio de
concentraciones Tabla IV10 y Tabla VI11) es significativo para varias muestras tanto de vinos blancos (W2 y
W3) como tintos (R4 y R8)
47
Capiacutetulo V Conclusiones
CAPIacuteTULO V CONCLUSIONES
En este trabajo se ha estudiado un meacutetodo para la cuantificacioacuten de pesticidas concretamente veinte fungicidas y
tres insecticidas en vino blanco y tinto En la etapa de preparacioacuten de muestra se optimizoacute la extraccioacuten en fase
soacutelida (SPE) utilizando cartuchos OASIS HLB (200 mg) compuestos por divinilbenceno-N-vinilpirrolidona
(DVB-VP) como adsorbente Como teacutecnica de determinacioacuten se utilizoacute cromatografiacutea de liacutequidos con una
interfase de electroespray acoplada a espectrometriacutea de masas (UPLC-ESI-MSMS)
Las conclusiones generales obtenidas a partir de los resultados de este proyecto relativo a la determinacioacuten de
fitosanitarios en vino son
Ante los problemas de retencioacuten que presentan los cartuchos OASIS MAX (150 mg) para algunos
compuestos los cartuchos OASIS HLB (200 mg) junto con la combinacioacuten metanolacetonitrilo (2080)
como disolvente de elucioacuten son elegidos como mejor opcioacuten en la extraccioacuten en fase soacutelida de pesticidas
en muestras con matrices complejas como es el caso del vino Asiacute se consigue la retencioacuten selectiva de
componentes de la matriz y proporciona extractos con menor porcentaje de interferencias
El meacutetodo estudiado y optimizado se puede aplicar tanto a vinos blancos como a vinos tintos procesados
a partir de distintas variedades de uvas
Los liacutemites de cuantificacioacuten (LOQs) del estudio se situacutean la mayoriacutea por debajo de 10 ngmL excepto
en el caso de THI-M que asciende al valor de 20 ngmL El rango de respuesta lineal abarca hasta 200
ngmL y el tiempo de anaacutelisis ha sido de solo 10 minutos por muestra
En todas las muestras de vino (blancos y tintos) comerciales analizadas se han detectado la presencia de
varios pesticidas sin embargo todas las concentraciones encontradas se encuentran por debajo del 10
de los LMRs fijados en uvas tal y como recomienda la legislacioacuten por lo que no se considera
preocupante
48
Capiacutetulo V Conclusioacutens
CAPIacuteTULO V CONCLUSIOacuteNS
Neste traballo estudouse un meacutetodo para a cuantificacioacuten de pesticidas en particular vinte funxicidas e tres
insecticidas en vintildeo branco e maacuteis tinto No paso da preparacioacuten da mostra optimizouse a extraccioacuten en fase
soacutelida (SPE) empregando cartuchos OASIS HLB (200 mg) compostos por divinilbenceno-N-pirrolidona (DVB-
VP) como adsorbente Para a teacutecnica de determinacioacuten utilizouse cromatografiacutea de liacutequidos con unha interfase de
electroespray acoplada a espectrometriacutea de masas (UPLC-ESI-MSMS)
As conclusioacutens xerais a obtidas a partir dos resultados deste proxecto relativo aacute determinacioacuten de pesticidas en
vintildeo son
Ante os problemas de retencioacuten que mostraban os cartuchos OASIS MAX (150 mg) para alguacuten
compostos os cartuchos OASIS HLB (200 mg) en conxunto coa mistura metanolacetonitrilo (2080)
como disolvente de elucioacuten son elexidos como mellor opcioacuten na extraccioacuten en fase soacutelida de pesticidas
en mostras con matrices complexas como eacute o caso do vintildeo Asiacute eacute conseguida a retencioacuten selectiva de
componentes da matriz e proporciona extractos con menos porcentaxe de interferencias
O meacutetodo estudado e optimizado poacutedese aplicar tanto a vintildeos brancos coma tintos procesados a partir de
diferentes variedades de uvas
Os liacutemites de cuantificacioacuten do estudo (LOQs) son maacuteis baixos de 10 ngmL agaacutes no caso do THI-M
que ascende ao valor de 20 ngmL O rango de resposta lineal cobre ata 200 ngmL e o tempo de anaacutelise
foi de soacute 10 minuacutetos por mostra
En todas as mostras de vintildeo (brancos e tintos) comercial analizadas detectouse a presenza de varios
pesticidas maacuteis poreacuten todas as concentracioacutens atopadas son inferiores ao 10 dos LMR fixados en uvas
tal e como recomenda a lexislacioacuten polo que non se considera preocupante
49
Chapter V Conclusions
CHAPTER V CONCLUSIONS
In this work we have studied a method for the quantification of pesticides specifically twenty fungicides and
three insecticides in white and red wine In the sample preparation step the solid phase extraction was optimized
using cartridges OASIS HLB (200 mg) containing divinylbenzene-N-vinylpyrrolidone (DVB-VP) as adsorbent
As determination technique ultraperformance liquid chromatography was used with an electrospray interface
coupled to mass spectrometry (UPLC-ESI-MS7MS)
The general conclusions drawn from the results of this project concerning the determination of pesticides in wine
are
Due to the retention problems presented by the OASIS MAX sorbent (150 mg) for some compounds of
this project the cartridges OASIS HLB (200 mg) together with the methanolacetonitrile (2080) mixture
are chosen as the best option in the solid phase extraction of pesticides in samples with complex
matrices as is the case with the wine
The method studied and optimized can be applied to both white and red wines obtained from different
varieties of grapes
The limits of quantification (LOQs) were below 10 ngmL for most of the compounds except in the
case of THI-M with a LOQ of to 10 ngmL The linear response range covers up to 200 ngmL and the
analysis time was only 10 minutes per sample
In all commercial wine samples (white and red) analyzed the presence of several pesticides was
conformed however all the concentrations obtained are below 10 of the Maximum residue
levels(MRLs) fixed in grapes as recommended by legislation
50
VI Bibliografiacutea VI BIBLIOGRAFIacuteA [1] Ministerio de agricultura y pesca alimentacioacuten y medio ambiente mhttpwwwmapamagobesescalidad-y-evaluacion-ambientaltemasproductos-quimicosfitosanitarios (Acceso el diacutea 11052017) [2] httpwwwcricyteduarenciclopediaterminosProducFitohtm (Acceso el diacutea 11052017) [3] WERNER BALTES ldquoQuiacutemica de los alimentosrdquo Editorial Acribia SA 2007 Capiacutetulo 11 ldquoResiduos en los alimentosrdquo paacuteginas 206-217
[4] RLabrada JCCaseley CParker ldquoESTUDIO FAO PRODUCCIOacuteN Y PROTECCIOacuteN VEGETAL 120rdquo Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentacioacuten Roma 1996 ISSN 1014- Capiacutetulo 10 Herbicidas httpwwwfaoorgdocrepT1147St1147s00htmContents (Acceso el diacutea 12052017)
[5] Taberner Palou Andreu Cirujeda Ranzenberger Alicia Zaragoza Larios Carlos ldquoManejo de poblaciones de malezas resistentes a herbicidasrdquo (FAO Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura) 100 preguntas sobre resistencia PDF sacado de httpwwwfaoorg3a-a1422spdf (Acceso el diacutea 12052017) [6] BISSET Juan A Uso correcto de insecticidas control de la resistencia Revista Cubana de Medicina Tropical 2002 vol 54 no 3 p 202-219 [7] DEVINE Gregor J EZA Dominique Ogusuku Elena FURLONGMichael J Uso de insecticidas contexto y consecuencias ecoloacutegicas Revista peruana de medicina experimental y Salud Puacuteblica 2008 vol 25 no 1 p 74-100 [8] Ministerio de agricultura y ganaderiacutea (proteccioacuten agropecuaria servicio de diagnoacutestico fitosanitario) de costa Rica httpwwwmaggocrbibliotecavirtualH20-5054pdf (Acceso el diacutea 11052017) [9] GEPP V MONDINO P Control quiacutemico 2011 PDF obtenido de httpwwwpvfagroeduuyfitopatodocscursosfitopatoMaterialesGuiasC-QUIMICOpdf (Acceso el diacutea 772017) [10] ROSSLENBROICH Hans-Juergen STUEBLER Dietrich Botrytis cinereamdashhistory of chemical control and novel fungicides for its management Crop Protection 2000 vol 19 no 8 p 557-561 [11] Figura 11 httpwwwvitiviniculturanetbotritis-o-podredumbre-gris-botrytis-cinerea-pershtml (Acceso el diacutea 12052017) [12] CAMPBELL Paul BENDEK Carlos LATORRE Bernardo A Riesgo de oiacutedio (Erysiphe necator) de la vid en relacioacuten con el desarrollo de los racimos Ciencia e investigacioacuten agraria 2007 vol 34 no 1 p 5-11 [13] ldquoCoacutemo combatir el oiacutedio de la vidrdquo Jose Javier Peacuterez de Obanos Castillo PDF sacado de httpswwwnavarraesNRrdonlyres05E65D9B-D1A2-4EAD-9A63-AFF1D3215552135109Comocombatireloidiodelavidpdf (Acceso el diacutea 12052017) [14] Imagen 12 sacadas las 3 de httpwwwvitiviniculturanetoidio-de-la-vidhtml (Acceso el diacutea 12052017) [15] BARRIOS Gonccedilal REYES Joan Modelizacioacuten del Mildiu de la Vid 2004 httpwwwruralcatnetmigracio_resources617683_mildiusPDF (Acceso el diacutea 12052017) [16] Imaacutegenes sacadas de httpwwwvitiviniculturanetmildiu-de-la-vid-enfermedades-vinahtml (Acceso el diacutea 13052017) [17] HUQ Mainul MEISNER Craig DASGUPTA Susmita Health effects and pesticide perception as determinants of pesticide use evidence from Bangladesh httpagrisfaoorgagris-searchsearchdorecordID=US2012411738 (Acceso el diacutea 13052017)
51
IV Bibliografiacutea [18] BADII Mohammad H LANDEROS Jeroacutenimo Plaguicidas que afectan a la salud humana y la sustentabilidad CULCyT 2015 no 19 Revista vista en httpopenjournaluacjmxojsindexphpculcytarticleview454 (Acceso el diacutea 772017) [19] OLEA Nicolaacutes FERNAacuteNDEZ Mariana F Plaguicidas persistentes En Congreso Implementacioacuten del Convenio de Contaminantes Orgaacutenicos Persistentes Madrid 2001 p 26-27 [20] httpwwwfaoorgfao-who-codexalimentariusabout-codexes (Acceso el diacutea 14052017) [21] httpeceuropaeufoodplantpesticidesmax_residue_levels_en (Acceso el diacutea 14052017 [22] ORDONtildeEZ Juan A Cambero Rodriacuteguez MI Fernaacutendez Aacutelvarez L Garciacutea Sanz ML Garciacutea de Fernando Minguilloacuten GD de la Hoz Perales L Selgas Cortecero MD Tecnologiacutea de los alimentos Volumen 1 Componentes de los Alimentos y Procesos Siacutentesis Madrid 1998paacutegs 349-351 [23] CELA Rafael Casais Maria del Carmen Lorenzo Rosa Antonia Teacutecnicas de separacioacuten en quiacutemica analiacutetica Siacutentesis 2002 Capiacutetulo 11 Extraccioacuten y lixiviacioacuten por disolvente (paacutegs206-260) [24] CANTWELL Frederick F LOSIER Manon Liquidmdashliquid extraction Comprehensive Analytical Chemistry 2002 vol 37 p 297-340 [25] Imagen de LLE sacada de httpprocesosbiowikispacescomExtracciC3B3n+liquido-liquido (Acceso el diacutea 15052017) [26] HENNION Marie-Claire Solid-phase extraction method development sorbents and coupling with liquid chromatography Journal of Chromatography A 1999 vol 856 no 1 p 3-54 [27] CELA Rafael Casais Maria del Carmen Lorenzo Rosa Antonia Teacutecnicas de separacioacuten en quiacutemica analiacutetica Siacutentesis 2002 Capiacutetulo 16 Teacutecnicas de adsorcioacuten y absorcioacuten en la preparacioacuten de muestras Extraccioacuten y microextraccioacuten en fase soacutelida (paacutegs520-555) [28] Imagen spe sacada httptoxicocbblogspotcomes201310las-intoxicaciones-con-farmacoshtml (Acceso el diacutea 15052017) [29] Chaacutefer Pericaacutes Consuelo Acoplamiento microextraccioacuten en fase soacutelida-cromatografiacutea (2006) httprodericuveshandle1055014940 (Acceso el diacutea 16052017) [30] Imagen SPME httpwwwscieloorgcoscielophpscript=sci_arttextamppid=S0122-53832002000100005 (Acceso el diacutea 16052017) [31] MONTES GOYANES Rosa Mariacutea Avances en teacutecnicas de microextraccioacuten para la determinacioacuten de compuestos traza en muestras medioambientales y alimentarias Teacutesis doctoral Noviembre 2009 (Paacutegs 34-55) [32] LEHOTAY Steven J Ae Son Kyung KwonHyeyoung Koesukwiwat Urairat Fu Wusheng Mastovska Katerina Hoh Eunha Leepipatpiboon Natchanun Comparison of QuEChERS sample preparation methods for the analysis of pesticide residues in fruits and vegetables Journal of Chromatography A 2010 vol 1217 no 16 p 2548-2560 [33] Imagen QueChERS httpswwwresearchgatenetpublication279221361_QuEChERS_A_Sample_Preparation_for_Extraction_of_Carbaryl_from_Rat_Feces (Acceso el diacutea 16052017) [34] STASHENKO Elena E MARTIacuteNEZ Jairo Reneacute Preparacioacuten de la muestra un paso crucial para el anaacutelisis por GC-MS Uma publicaccedilatildeo trimestral do Instituto Internacional de Cromatografia (IIC) Ciecircncia Cromatograacutefica 2011 vol 3 no 1 [35] Imagen GC-MS httpsorgspectroscopyintblogspotcomes201411gas-chromatography-mass-spectrometry-gchtml (Acceso el diacutea 17052017) [36] httpwwwactlabscompageaspxmenu=65ampapp=221ampcat1=534amptp=2amplk=no (Acceso el diacutea 17052017)
52
IV Bibliografiacutea [37] Quintela O Cruz A Concheiro M De Castro A amp Loacutepez-Rivadulla M (2005) Metodologiacutea LC-MS Aspectos generales de la teacutecnica y sus aplicaciones en el campo de la toxicologiacutea Rev Toxicol 22 paacutegs7-14 [38] Imagen LC-MS httpsuploadwikimediaorgwikipediaenff9Liquid_chromatography_tandem_Mass_spectrometry_diagrampng (visto 18052017) [39] Vargas de la Cruz Celia Bertha Adaptacioacuten de la Metodologiacutea Analiacutetica para la determinacioacuten de residuos de plaguicidas en frutas nativas de exportacioacuten mediante Uplc-MsMs (2012) Tesis obtenida en http20062146130handlecybertesis2331 (Acceso el diacutea 772017) [40] ROMERO GONZAacuteLEZ Roberto Fernaacutendez Moreno Joseacute Luis Plaza Bolantildeos Patricia Garrido Frenich Antonia Martiacutenez Vidal Joseacute Luis Empleo de la espectrometriacutea de masas como herramienta para la determinacioacuten de toacutexicos en alimentos hacia la seguridad alimentaria Revista Espantildeola de salud puacuteblica 2007 vol 81 no 5 p 461-474 [41] PAYAacute Andrus Fundamento y Funciones de la Espectrometriacutea de Masas Universidad de Valencia Espantildea 2006 httpmuraluvescaloan (Acceso el diacutea 19052017) [42] Imagen MS sacada de httpsesslidesharenetMaYaTorrezespectrometria-demasas (Acceso el diacutea 21052017) [43] ECONOMOU Anastasios Botitsi Helen Antoniou Spyros Tsipi Despina Determination of multi-class pesticides in wines by solid-phase extraction and liquid chromatography-tandem mass spectrometry Journal of Chromatography A 2009 vol 1216 no 31 p 5856-5867 [44] FONTANA A R Rodriacuteguez I Ramil M Altamirano JC Cela R Liquid chromatography time-of-flight mass spectrometry following sorptive microextraction for the determination of fungicide residues in wine Analytical and bioanalytical chemistry 2011 vol 401 no 2 p 767-775 [45] PELAJIĆ Maja G Peček DM Pavlović DV Čepo Novel multiresidue method for determination of pesticides in red wine using gas chromatographyndashmass spectrometry and solid phase extraction Food chemistry 2016 vol 200 p 98-106 [46] Ignaz J Buerge Juumlrgen Krauss Rociacuteo Loacutepez-Cabeza Werner Siegfried Michael Stuumlssi Felix E Wettstein Thomas Poiger Stereoselective Metabolism of the Sterol Biosynthesis Inhibitor Fungicides Fenpropidin Fenpropimorph and Spiroxamine in Grapes Sugar Beets and Wheat Journal of Agricultural and Food Chemistry 2016 vol 64 no 26 p 5301-5309 [47] M Hu X Liu F Dong J Xu S Li H Xu Y Zheng Determination of ametoctradin residue in fruits and vegetables by modified quick easy cheap effective rugged and safe method using ultra-performance liquid chromatographytandem mass spectrometry Food chemistry 2015 vol 175 p 395-400 [48] WALORCZYK Stanisław DROŻDŻYŃSKI Dariusz GNUSOWSKI Bogusław Multiresidue determination of 160 pesticides in wines employing mixed-mode dispersive-solid phase extraction and gas chromatographyndashtandem mass spectrometry Talanta 2011 vol 85 no 4 p 1856-1870 [49] Tianyang Guo Pingping Fang Juanjuan Jiang Feng Zhan Wei Yong Jiahui Liu YiYang Dong Rapid screening and quantification of residual pesticides and illegal adulterants in red wine by direct analysis in real time mass spectrometry Journal of Chromatography A 2016 vol 1471 p 27-3 [50] GONZAacuteLEZ-RODRIacuteGUEZ R M CANCHO-GRANDE B SIMAL-GAacuteNDARA J Decay of fungicide residues during vinification of white grapes harvested after the application of some new active substances against downy mildew Food chemistry 2011 vol 125 no 2 p 549-560 [51] CARPINTEIRO I Ramil M Rodriacuteguez I Cela R Determination of fungicides in wine by mixed-mode solid phase extraction and liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry Journal of Chromatography A 2010 vol 1217 no 48 p 7484-7492
53
Capiacutetulo I Introduccioacuten
la fibra se introduce de nuevo en la jeringa y se retira del vial [27]
232 Microextraccioacuten en fase liacutequida (LPME)
La microextraccioacuten en fase liacutequida se desarrolloacute como una alternativa a la LLE para la reduccioacuten en la cantidad de
disolventes orgaacutenicos siendo rentable tanto para el medioambiente como econoacutemicamente Entre las modalidades
maacutes populares de esta teacutecnica se encuentran microextraccioacuten con gota suspendida (SDME) y microextraccioacuten
liacutequido-liacutequido dispersiva (DLLME) En la SDME una gota de disolvente orgaacutenico es expuesta al espacio de
cabeza situado sobre una muestra en un vial dicha gota es suspendida del extremo de una microjeringa Por otro
lado la DLLME sobre una muestra acuosa se inyecta un pequentildeo volumen de una mezcla de disolventes en la
cual es dispersada formando una solucioacuten en la que se establece el equilibrio El disolvente de extraccioacuten debe
presentar una densidad inferior a la de la muestra para facilitar su recuperacioacuten normalmente despueacutes de
centrifugar el vial doacutende se realiza la extraccioacuten [31]
24 QuEChERS
La extraccioacuten QuEChERS de las palabras en ingleacutes Quick Easy Cheap Effective Rugged and Safe es un meacutetodo
de extraccioacuten que se desarrolloacute entre 2000 y 2002 para el anaacutelisis de pesticidas Como su nombre indica raacutepido
faacutecil barato eficaz robusto y seguro son las principales
caracteriacutesticas de esta preparacioacuten de muestra Se realiza en dos
etapas en primer lugar una extraccioacuten simple y una segunda fase
de purificacioacuten En la primera etapa tenemos el vial con la
muestra en el cual se antildeade un disolvente generalmente
acetonitrilo para la extraccioacuten de los analitos de intereacutes en
presencia de diferentes sales (en el meacutetodo original se utiliza
sulfato de magnesio y cloruro de sodio) para facilitar la separacioacuten
de las fases En la segunda parte se realiza la purificacioacuten de la
fraccioacuten del extracto orgaacutenico Para eso se lleva a cabo una
limpieza de los analitos eliminando el agua y los compuestos
presentes en la matriz de la muestra empleando un adsorbente PSA (amina primaria y secundaria) C18 carboacuten
negro grafitizado (GCB) o una combinacioacuten de eacutestas [32]
Figura I8 Etapas de QuEChERS [33]
13
Capiacutetulo I Introduccioacuten
3 METODOLOGIacuteA ANALIacuteTICA PARA LA DETERMINACIOacuteN DE PESTICIDAS
31 Meacutetodos de GC-MS (MSMS)
La combinacioacuten de cromatografiacutea de gases (GC) teacutecnica de separacioacuten con espectrometriacutea de masas (MS) como
sistema de deteccioacuten representa un potente meacutetodo para la identificacioacuten determinacioacuten y cuantificacioacuten de
analitos orgaacutenicos en concentraciones traza presentes en muestras complejas Esta teacutecnica de anaacutelisis cuenta con
muchas ventajas en sensibilidad multifuncionalidad buena reproducibilidad robustez asiacute como facilidad en el
manejo pero con una gran desventaja este meacutetodo no es apto para ser utilizado con todos los analitos sino que
se ve limitado a aquellos que sean termoestables y no se descompongan a temperaturas elevadas antes de ser
volatilizados La muestra es introducida a traveacutes del inyector en el cromatoacutegrafo de gases doacutende impulsada por
una corriente de gas inerte como fase moacutevil pasa a traveacutes de la columna que contiene la fase estacionaria en la
cual se separan los compuestos debido a una distribucioacuten de estos entre fase moacutevil-fase estacionaria Mediante
una interfase son introducidos para su deteccioacuten en el espectroacutemetro de masas que cuenta con una fuente de
iones analizador de masas y un detector [34]
La combinacioacuten de analizadores de masas en taacutendem (MSMS) como sistema de deteccioacuten en GC es una teacutecnica
altamente selectiva mejorando la sensibilidad y la relacioacuten sentildeal-ruido en los espectros experimentando una
mejora por lo que se logran unos liacutemites de deteccioacuten inferiores Esta teacutecnica GC-MSMS comprende maacutes
pasos despueacutes de la separacioacuten por cromatografiacutea se lleva a cabo la deteccioacuten con MSMS que consta de varias
etapas generacioacuten de iones en la fuente de ionizacioacuten seleccioacuten de los iones precursores de una determinada
masa disociacioacuten causada por colisioacuten con moleacuteculas de gas inerte de los iones precursores y por uacuteltimo el
anaacutelisis de los fragmentos en relacioacuten a su masacarga (mz) En el caso de que un espectro de MS no permita
confirmar la identidad de un determinado compuesto quiacutemico la obtencioacuten de su espectro de MSMS permite
mejorar la confianza en su identificacioacuten [36]
Figura I9 Acoplamiento GC-MS [35]
14
Capiacutetulo I Introduccioacuten
32 Meacutetodos LC-MS (MSMS)
La teacutecnica de LC-MS se desarrolloacute para minimizar las desventajas del acoplamiento GC-MS y asiacute resolver los
problemas que este uacuteltimo acarreaba con los analitos termolaacutebiles permitiendo el anaacutelisis de eacutestos sin tener que
realizar una etapa previa de derivatizacioacuten La interfase de unioacuten de cromatografiacutea liacutequida (LC) con espectrometriacutea
de masas (MS) acarrea una dificultad significativa siendo responsable de transformar los analitos que se
encontraban en la fase moacutevil liacutequida en iones en fase gas sin que se produzca su degradacioacuten teacutermica La
sensibilidad de las determinaciones por LC-MS va a depender de la interfase empleada Las principales interfases
empleadas actualmente son las ionizaciones a presioacuten atmosfeacuterica electrospray (ES) e ionizacioacuten quiacutemica a
presioacuten atmosfeacuterica (APCI) [37]
Con los antildeos la cromatografiacutea liacutequida se ha ido innovando y mediante la disminucioacuten del tamantildeo de partiacutecula en
la columna se fue mejorando la eficiencia asiacute como aumentando la selectividad y resolucioacuten del pico en el
cromatograma Para este nuevo sistema llamado UPLC Ultra-Performance Liquid Chromatography se desarrolloacute
una nueva instrumentacioacuten capaz de trabajar a altas presiones generando flujos mayores sin peacuterdidas de
resolucioacuten utilizando inyectores automaacuteticos maacutes raacutepidos y detectores con mayor velocidad de adquisicioacuten de
datos disminuyendo asiacute el tiempo de anaacutelisis [39]
33 Espectrometriacutea de masas
La espectrometriacutea de masas es el meacutetodo de deteccioacuten y cuantificacioacuten maacutes fiable a la hora de la determinacioacuten de
compuestos en matrices complejas (tales como alimentos) ya que otros detectores maacutes tradicionales como UV-
visible o fluorescencia cuentan con una gran incertidumbre en los resultados llegando incluso a ofrecer falsos
Figura I10 Acoplamiento LC-MS [38]
15
Capiacutetulo I Introduccioacuten
positivos o negativos Un espectrometro de masas cuenta con un dispositivo de introduccioacuten de muestra una
caacutemara de ionizacioacuten un sistema para la aceleracioacuten de los iones uno o varios analizadores de masas y un detector
[40]
El fundamento de la espectrometriacutea de masas se basa en la separacioacuten de iones en base a la relacioacuten masacarga
(mz) El proceso consta fundamentalmente de cuatro etapas La
primera es la ionizacioacuten de la muestra los iones formados se aceleran
debido a la accioacuten de un campo eleacutectrico variable separacioacuten de los
iones seguacuten su masacarga deteccioacuten de los iones y produccioacuten de la
sentildeal eleacutectrica El analizador de masas es el encargado de la separacioacuten
de los iones en funcioacuten a su mz entre los que maacutes destacan
analizador de masas cuadrupolar que dispersa simultaacuteneamente todos
los iones en funcioacuten de la relacioacuten mz analizador de masas de
tiempo de vuelo (TOF) consta de un tubo a alto vaciacuteo sobre el que no
actuacutea ninguacuten campo eleacutectrico al cual llegan todos los iones acelerados con la misma energiacutea cineacutetica y en el tubo
las velocidades variacutean seguacuten mz y analizador de trampa de iones en doacutende los iones gaseosos quedan aislados
durante largos periacuteodos de tiempo por la accioacuten del campo eleacutectrico [41]
4RESUMEN BIBLIOGRAacuteFICO DE LAS TEacuteCNICAS DE EXTRACCIOacuteN Y
DETERMINACIOacuteN DE PESTICIDAS EN VINO
En la bibliografiacutea se han descrito diversas teacutecnicas y diferentes combinaciones entre teacutecnicas de extraccioacuten y
distintas teacutecnicas de cuantificacioacuten e identificacioacuten para esos analitos Entre estas teacutecnicas los valores de los liacutemites
de cuantificacioacuten (LOQs) y las recuperaciones relativas pueden diferir en el resultado en un rango de valores asiacute
como el tiempo total empleado para el anaacutelisis y para la preparacioacuten de la muestra
Por lo general el meacutetodo de extraccioacuten de los analitos de intereacutes maacutes empleado es la extraccioacuten en fase soacutelida
(SPE) la cuaacutel le ha estado ganando terreno a la extraccioacuten liacutequido-liacutequido aunque tambieacuten se estaacute viendo cada vez
maacutes desplazada debido al creciente uso de la teacutecnica QuEChERS
Figura I11 Etapas de la espectrometriacutea de masas [42]
16
Capiacutetulo I Introduccioacuten
En el estudio de ECONOMOU et al [43] realizado en el antildeo 2009 en Grecia se empleoacute la extraccioacuten en fase
soacutelida con deteccioacuten en cromatografiacutea de liacutequidos acoplada a espectrometriacutea de masas en taacutendem (SPE-LC-ESI-
MSMS) Para la preparacioacuten de la muestra diluyeron 10 mL de vino (tanto blanco como tinto) a un volumen
final de 100 mL con agua ultrapura antes de la SPE Determinaron las recuperaciones de la extraccioacuten para dos
niveles de concentracioacuten 0010 y 0050 mgL realizando 8 medidas diarias durante 3 diacuteas consecutivos
encontraacutendose unos valores que variacutean dentro del rango 70-110 para todos los pesticidas en los dos niveles Para
la determinacioacuten y cuantificacioacuten de 46 pesticidas emplearon la teacutecnica de cromatografiacutea de liacutequidos con
espectrometriacutea de masas con un volumen de inyeccioacuten de 20 microL y un flujo de fase moacutevil de 02 mLmin
aclopada a espectrometriacutea de masas en taacutendem
Con la misma teacutecnica de extraccioacuten PELAJIĆ et al [45] durante el antildeo 2015 en Croacia llevaron a cabo la
determinacioacuten de 25 residuos de plaguicidas en vino tinto El meacutetodo que desarrollaron para dicha finalidad fue el
acoplamiento SPE-GC-MS Para la preparacioacuten de la muestra emplearon 10 mL de vino diluidos 11 con agua
ultrapura hasta un volumen final de 20 mL Calcularon las recuperaciones de la extraccioacuten y se encontroacute un rango
para todos los pesticidas en las muestras de 70-120 Para la determinacioacuten en cromatografiacutea de gases-
espectrometriacutea de masas se empleoacute un volumen de inyeccioacuten de 5 μL y un flujo de fase moacutevil de 10 mLmin
Mediante el acoplamiento de teacutecnicas SPE dispersiva-GC-MS WALORCZYK et al [48] en el antildeo 2011 en
Polonia llevaron a cabo la cuantificacioacuten de 160 pesticidas en diferentes clases de vino tinto rosado y blanco Con
10 g de vino y 10 mL de acetonitrilo se realizaron pruebas de recuperacioacuten en la fase de extraccioacuten para vino
tinto con los niveles de concentracioacuten 001 005 y 02 mgkg y para los vinos rosado y blanco con el nivel de
concentracioacuten 005mgkg y encontraron que a todos los niveles de concentracioacuten los valores de recuperacioacuten
rondan el rango 80-110 Para la teacutecnica cromatograacutefica se utilizoacute un volumen de inyeccioacuten de 5 microL
El acoplamiento LLE-SPE-LCDAD fue desarrollado por GONZAacuteLEZ-RODRIacuteGUEZ et al [50] en el antildeo
2010 en la provincia de Orense para la determinacioacuten de nuevos fungicidas propuestos para combatir el hongo
que provoca la enfermedad del mildium En la preparacioacuten de la muestra emplearon 15 mL de vino blanco para la
extraccioacuten en la cual fueron calculadas las recuperaciones relativas para dos niveles de concentracioacuten 005 y 05
mgkg en donde se establece un rango de entre 70-110 para todos los analitos Para la determinacioacuten mediante
cromatografiacutea de liacutequidos se empleoacute un volumen de inyeccioacuten de 2 μL y como meacutetodo de deteccioacuten utilizaron un
detector de diodos array
La microextraccioacuten sorptiva en fase soacutelida fue empleada en la publicacioacuten de FONTANA et al [44] junto con un
acoplamiento entre cromatografiacutea de liacutequidos y espectrometriacutea de masas para la determinacioacuten de 15 fungicidas
en vino realizada durante el 2010 en el noroeste de Espantildea Para la preparacioacuten de la muestra emplearon 10 mL
17
Capiacutetulo I Introduccioacuten
de vino diluiacutedos con el mismo volumen de agua ultrapura y un sorbente en forma de disco de silicona con un
volumen de 12 microL La recuperacioacuten de la extraccioacuten se calculoacute para vino tinto (Menciacutea) y vino blanco (Godello)
realizando tres replicas dentro de un mismo diacutea para los niveles de concentracioacuten 10 y 50 ngmL y nueve reacuteplicas
realizando el anaacutelisis en tres diacuteas consecutivos para el nivel de concentracioacuten de 25 ngmL y los resultados
obtenidos dan unos valores de recuperacioacuten dentro del rango 75-117 En el sistema LC-QTOF-MS el volumen
de inyeccioacuten fue de 15 microL
El otro meacutetodo de extraccioacuten mencionado anteriormente es QuEChERS estaacute en auge como meacutetodo de extracioacuten
de residuos de pesticidas en matrices como la del vino o la uva ya que incrementa la velocidad del anaacutelisis y reduce
el efecto de matriz BUERGE et al [46] seguido de una deteccioacuten mediante GC-MSMS realizaron una estapa
de extraccioacuten QuEChERS con alguna modificacioacuten acetato de sodio en lugar de cloruro soacutedico y acetato de etilo
en lugar de acetonitrilo utilizando 5 g de uva para la determinacioacuten de residuos de 4 pesticidas durante el antildeo
2016 Las recuperaciones de extraccioacuten resultaron ser valores entre 91-149 en uva a distintos niveles de
concentracioacuten 005 05 y 5 mgkg
Para la determinacioacuten de Ametoctradin HU et al [47] llevaron a cabo una extraccioacuten QuEChERS empleando 10
g de uva con deteccioacuten mediante el acoplamiento UPLC-MSMS utilizando un volumen de inyeccioacuten de 5 μL y
un flujo de fase moacutevil de 03 mLmin Las recuperaciones de la extraccioacuten se calcularon para tres niveles de
concentracioacuten 1 10 100 μgL de dos formas distintas en tres diacuteas consecutivos realizando 5 reacuteplicas al diacutea o en
dentro de un mismo diacutea realizando 15 reacuteplicas los resultados de todos los caacutelculos se encuentran dentro del rango
818-1001
Siguiendo con el mismo modo de extraccioacuten GUO et al [49] publicaron sus estudios para la determinacioacuten de
50 pesticidas y 12 adulterantes en vino tinto Para la extraccioacuten QuEChERS se utilizaron 10 mL de vino tinto con
10 mL de acetonitrilo y calcularon las recuperaciones para tres niveles de concentracioacuten 50 100 y 250 ngmL
encontraacutendose un rango de valores entre 75-120 El meacutetodo de deteccioacuten se llevoacute a cabo mediante un anaacutelisis
directo en tiempo real junto con espectrometriacutea de masas en tandem con un cuadrupolo (DART-MSMS) la
teacutecnica DART es un meacutetodo raacutepido para cribar y cuantificar los analitos de estudio que prescinde de la etapa de
separacioacuten cromatograacutefica
A continuacioacuten se recogen en la Tabla I3 los liacutemites de cuantificacioacuten (LOQs) de los analitos de intereacutes en este
trabajo caacutelculados por los diferentes meacutetodos encontrados en bibliografiacutea citados anteriormente en este apartado
18
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Tabla I3 LOQs de los analitos de intereacutes descritos para los distintos meacutetodos encontrados en la bibliografiacutea
Compuesto LOQs
Compuesto LOQs
V Blanco V Tinto Uva V Blanco V Tinto Uva
AME - - 0032μgkg[47] MET 86 μgL[43]
22 μgL[44]
89 μgL[43]
22 μgL[44]
5 μgL[45]
259 ngmL[49]
001mgkg[48]
BEN 02 μgL[44]
0001 mgL[50]
02 μgL[44]
001 μgL[45]
280ngmL[49]
005 mgkg[48] MYC 30 μgL[43]
08 μgL[44]
36 μgL[43]
10 μgL[44]
025 μgL[45]
331ngmL[49]
001 mgkg[48]
BOS 0065 mgL[50] 05 μgL[45]
1076 ngmL[49] 001 mgkg[48] PEN
56 μgL[43]
05 μgL[44]
49 μgL[43]
04 μgL[44]
220ngmL[49]
001 mgkg[48]
CAR - 386 ngmL[49] - PYC 0003mgL[50] 07 μgL[45] 001 mgkg[48]
CYP 15 μgL[43]
04 μgL[44]
0001 mgL[50]
22 μgL[43]
06 μgL[44]
312 ngmL[49]
001 mgkg[48] PYM 17 μgL[43] 22 μgL[43]
10 μgL[45] 001 mgkg[48]
DIM 18 μgL[43] 20 μgL[43] 001 mgkg[48] TEC 03 μgL[44]
03 μgL[44]
10 μgL[45]
160ngmL[49]
001 mgkg[48]
FEH 17 μgL[43] 22 μgL[43]
938 ngmL[49] 001 mgkg[48] TEF - 876ngmL[49] -
FEP - - 002mgkg[46] TBZ 15μgL [43] 29μgL[43] 001 mgkg[48]
FLU 005 μgL[45] TME - 25 μgL[45] 001 mgkg[48]
IMI 21 μgL[43] 22 μgL[43]
225 ngmL[49] - THI-M 92 μgL[43] 89 μgL[43] -
IPR 07 μgL[44] 07 μgL[44] 001 mgkg[48] TRI 10 μgL[44] 12 μgL[44] 001 mgkg[48]
MAN 0011 mgL[50] - -
5 DISTRIBUCIOacuteN DE PESTICIDAS EN VINOS COMERCIALES
En algunos de los meacutetodos descritos en el apartado anterior se procesaron vinos comerciales encontraacutendose
resultados positivos para muchos residuos de pesticidas y algunos hasta en gran concentracioacuten
ECONOMOU et al [43] mediante el meacutetodo LC-ESI-MSMS realizaron el anaacutelisis de 60 muestras de vino tinto
y blanco recogidos en supermercados locales en Grecia a lo largo de un antildeo El meacutetodo se habiacutea desarrollado
19
Capiacutetulo I Introduccioacuten
para la determinacioacuten de 46 pesticidas pero la mayoriacutea se encuentran con una concentracioacuten por debajo de
001mgL solo ocho plaguicidas se obtuvieron con resultados de concentracioacuten mayores Se muestran los
resultados en la Tabla I4 de los analitos de intereacutes en este estudio
Tabla I4 Nuacutemero de muestras positivas de distintos pesticidas en el anaacutelisis de 60 muestras de vino [43]
Compuesto Positivos con concentracioacuten entre 001-01
mgL
Positivos con concentracioacuten entre 01-1
mgL
PYM 2 (3) 2 (3)
MYC 2 (3) 0 (0)
CAR 11 (18) 7 (12)
THI-M 7 (12) 5 (8)
FEH 5 (8) 0 (0)
MET 1 (2) 0 (0)
Mediante el meacutetodo de microextraccioacuten en fase soacutelida-LC-TOF-MS FONTANA et al [44] aplicaron el
desarrollo del procedimiento a un total de 12 vinos joacutevenes elaborados en el 2010 y correspondientes a diferentes
denominaciones geograacuteficas del noroeste de Espantildea En la Tabla I5 se muestran los datos que han obtenido
Tabla I5 Determinacioacuten de fitosanitarios en vinos comerciales mediante Microextraccioacuten en fase soacutelida-LC-TOF-MS
Valores de concentracioacuten en ngmL [44]
Pesticidas
W 1
Albarintildeo
W5
Ribeiro
W6
Valdeorras
R1
Ribeira Sacra
R3
Ribeiro
R4
Valdeorras
MET 404plusmn06 223plusmn05 311plusmn007 25plusmn03 31plusmn03 74plusmn10
TRI nd nd 36plusmn06 nd nd ltLOQ
IPR 394plusmn03 324plusmn02 324plusmn02 071plusmn007 31plusmn02 28plusmn05
MYC nd nd nd ltLOQ 39plusmn02 nd
TEC 25plusmn01 nd nd nd nd nd
CYP 179plusmn08 ltLOQ ltLOQ 562plusmn002 083plusmn001 nd
BEN 042plusmn001 nd ltLOQ nd 032plusmn001 ltLOQ
ndNo detectados ltLOQ por debajo del liacutemite de cuantificacioacuten del meacutetodo los coacutedigos W y R corresponden respecti-vamente a los vinos blanco y tinto
20
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Por uacuteltimo PELAJIĆ et al [45] aplicaron su meacutetodo SPE dispersiva-GC-MS mediante el cual determinaron 25
residuos de plaguicidas en vino tinto a un total de 32 muestras de vino adquiridos en supermercados locales de
Croacia pero de diversos oriacutegenes de procedencia Los resultados que han obtenido se muestran en la Tabla I6
en doacutende un total de 15 plaguicidas han sido detectados y 7 de los cuales se encontraban en una alta
concentracioacuten
Tabla I6 Resultados de los vinos con positivos en pesticidas y sus concentraciones [45]
Vino Paiacutes Residuos de pesticidas (mgKg)
Tinto Francia DIM (0013) MET (0009) IPR (001)
Tinto Alemania BOS (0011)
Tinto Alemania IPR (0009)
Tinto Macedonia MET (0015)
Tinto Moldavia IPR (0008)
Tinto Polonia MET (004)
Tinto Rumania PYM (0058)
Tinto Espantildea TRI (0005) MET (0011)
Tinto Estados Unidos BOS (001)
Rosado Francia BOS (0005)
Blanco Chile TEC (0008)
Blanco Georgia MET (0057)
Blanco Alemania DIM (001) IPR (0054) PYM (0056)
Blanco Sudaacutefrica DIM (0011) IPR (0011)
21
Capiacutetulo II Objetivos y discusioacuten
CAPIacuteTULO II OBJETIVOS Y DISCUSIOacuteN
El objetivo principal que se persigue en este trabajo es el desarrollo de un meacutetodo analiacutetico raacutepido basado en la
extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) y deteccioacuten mediante cromatografiacutea de liacutequidos en la modalidad de UPLC
acoplada a la espectrometriacutea de masas en taacutendem (UPLC-MSMS) para la determinacioacuten multianalito de residuos
de fitosanitarios principalmente fungicidas aunque tambieacuten alguacuten insecticida en muestras de vino blanco y tinto
Para llevar a cabo la finalidad de lo dicho se consideran unos objetivos maacutes especiacuteficos
Minimizar la manipulacioacuten de la muestra para asiacute reducir la cantidad de disolventes y tiempo empleado
Optimizacioacuten de los factores que afectan en la extraccioacuten en la SPE tales como tipo y cantidad de
adsorbente volumen de eluyente etc
Estudio de las condiciones en UPLC-MSMS para una separacioacuten y cuantificacioacuten oacuteptimas
Caracterizacioacuten y validacioacuten del meacutetodo propuesto
Por uacuteltimo una vez cumplidos todos los objetivos anteriores y fijadas las condiciones oacuteptimas el meacutetodo
estudiado se aplica en el anaacutelisis de muestras de vino comercial (blanco y tinto) para determinar si se encuentran
residuos presentes asiacute como conocer en queacute concentracioacuten se encuentran los pesticidas objeto de este estudio
22
Capiacutetulo III Parte experimental
CAPIacuteTULO III PARTE EXPERIMENTAL
1 MATERIAL Y REACTIVOS
11 Material
Material de vidrio de uso comuacuten en el laboratorio vasos de precipitados matraces aforados etc
Micropipetas automaacuteticas de 20-200 microL 20-200 microL 100-1000 microL 1000-5000 microL Eppendorf
Puntas de plaacutestico para micropipetas
Encapsulador y desencapsulador
Soportes y pinzas
Viales de 15 mL transparentes para muestreador automaacutetico de cromatografiacutea (Sugelabor)
Caacutepsulas de aluminio con seacuteptum de Tefloacuten (Sugelabor) y tapones pre-slit para viales
Tubos y conectores de tefloacuten
Cartuchos de divinilbenceno-N-vinilpirrolidona 200 mg Oasis HLB Waters
Cartuchos de divinilbenceno-N-vinilpirrolidona funcionalizados con grupos amina cuaternaria 150 mg
Oasis MAX Waters
Cartuchos de divinilbenceno-N-vinilpirrolidona 60 mg Oasis HLB Waters
12 Reactivos y disolventes
Agua ultrapura Milli-Q
Aacutecido foacutermico (Sigma Aldrich) 95
Acetonitrilo (LichrosolvregMerck) Gradient grade for liquid chromatography
Metanol (LichrosolvregMerck) Gradient grade for liquid chromatography
Etanol (LichrosolvregMerck) Gradient grade for liquid chromatography
13 Patrones
Ametoctradin (AME) Dr Ehrenstrorfer 990
Benalaxyl (BEN) Pestanal Sigma- Aldrich 999
23
Capiacutetulo III Parte experimental
Boscalid (BOS) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Carbendazim (CAR) Pestanal Sigma- Aldrich 992
Cyprodinil (CYP) Pestanal Sigma- Aldrich 998
Dimethomorph (DIM) mezcla de isoacutemeros E + Z Pestanal Sigma- Aldrich 989
Fenhexamid (FEH) Pestanal Sigma- Aldrich 997
Fenpropidin (FEP) Dr Ehrenstrorfer 980
Fluopicolide (FLU) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Imidacloprid (IMI) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Iprovalicarb (IPR) mezcla de isoacutemeros Pestanal Sigma- Aldrich 985
Mandipropamid (MAN) Pestanal Sigma- Aldrich 991
Metalaxyl (MET) Pestanal Sigma- Aldrich 990
Myclobutanil (MYC) Pestanal Sigma- Aldrich 994
Penconazole (PEN) Pestanal Sigma- Aldrich 991
Pyraclostrobin (PYC) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Pyrimethanil (PYM) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Tebuconazol (TEC) Pestanal Sigma- Aldrich 996
Tebufenozide (TEF) Dr Ehrenstrorfer 988
Thiabendazole (TBZ) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Thiamethoxam (TME) Pestanal Sigma- Aldrich 996
Thiophanate-methyl (THI-M) Dr Ehrenstrofer 990
Triadimenol (TRI) Mezcla de diastereoisoacutemeros Pestanal Sigma- Aldrich 994
14 Patrones internos
Carbendazim-d3 (CAR-d3) Pestanal Sigma- Aldrich 998
Cyprodinil-d5 (CYP-d5) Pestanal Sigma- Aldrich
Imidacloprid-d4 (IMID-d4) Pestanal Sigma- Aldrich
Metalaxyl 13C6 (MET13C6) Pestanal Sigma-Aldrich 99
24
Capiacutetulo III Parte experimental
15 Gases
Nitroacutegeno 99999 como gas de colisioacuten en el espectroacutemetro de masas
Nitroacutegeno en los sistemas de concentracioacuten y secado por corriente de nitroacutegeno de los cartuchos SPE
2 INSTRUMENTACIOacuteN
Balanza analiacutetica de precisioacuten Sartorius
Granatario Sartorius
Bantildeo de ultrasonidos P-Selecta
Equipo de purificacioacuten de agua Millipore modelo Milli-Q gradient A-10ZMQSSVOT4
Estacioacuten de concentracioacuten por corriente de nitroacutegeno Mini-Vap Supelco
Sistema de secado de cartuchos de SPE por corriente de nitroacutegeno VisiDry Supelco
Sistema distribuidor de vaciacuteo Visiprep reg Supelco
Cromatoacutegrafo de liacutequidos de ultra-alta resolucioacuten Waters AcquityUPLC reg y espectroacutemetro de masas
Acquity TQD con analizador de triple quadrupolo (QqQ) equipado con una fuente de ionizacioacuten a
presioacuten atmosfeacuterica del tipo Z-spray (ESI)
3 PREPARACIOacuteN DE LAS DISOLUCIONES
Los patrones de pesticidas se prepararon individualmente a partir de los compuestos soacutelidos comerciales por
pesada excepto en el caso del fenpropidin (FEP) que se preparoacute a partir del compuesto liacutequido comercial Estos
compuestos soacutelidos se disolvieron en metanol y se obtuvieron unas disoluciones iniciales con concentraciones
recogidas en la Tabla III1
25
Capiacutetulo III Parte experimental
Tabla III1 Concentracioacuten de las disoluciones patroacuten stock
Compuesto Concentracioacuten (microgmL) Compuesto Concentracioacuten (microgmL)
AME 102201 MET 118912
BEN 138330 MYC 102017
BOS 99474 PEN 129791
CAR 17105 PYC 104581
CYP 131075 PYM 141386
DIM 103009 TEC 134729
FEH 99584 TEF 137769
FEP 100000 TBZ 105928
FLU 126859 TME 112283
IMI 101123 THI-M 124202
IPR 106739 TRI 118933
MAN 101021
4 LAVADO DEL MATERIAL
La limpieza del material de vidrio utilizado en el laboratorio se realizoacute utilizando jaboacuten y aclarando con agua de
grifo Luego en primer lugar se realiza un enjuague con agua Milli-Q finalmente un segundo enjuague con
acetona para eliminar posibles restos de compuestos orgaacutenicos y se deja secar sobre papel
Para la limpieza de los conectores de tefloacuten empleados en el proceso de SPE se introducen en un vaso de
precipitados con metanol y este en un bantildeo de ultrasonidos durante 10 minutos Al finalizar con el bantildeo de
ultrasonidos se realiza un enjuague con acetona y se pone a secar
5 EXTRACCIOacuteN DE MUESTRAS MEDIANTE SPE
El meacutetodo de extraccioacuten utilizado para la determinacioacuten de pesticidas fue la extraccioacuten en fase soacutelida (SPE)
mediante cartuchos Oasis HLB de 200 mg A continuacioacuten se describe el protocolo de extraccioacuten en las
condiciones oacuteptimas
26
Capiacutetulo III Parte experimental
1 Acondicionamiento del cartucho Oasis HLB de 200 mg con 2 mL de acetonitrilo seguidos de otros 2 mL de
vino sinteacutetico formado por la mezcla etanolagua MilliQ (1288)
2 Paso de la muestra 2 mL de vino diluiacutedos con 2 mL de agua MilliQ a traveacutes del cartucho por gravedad
3 Lavado del cartucho con 2 mL de agua MilliQ
4 Secado del cartucho durante 45 minutos en el VisiDry mediante el paso de una corriente de nitroacutegeno
5 Elucioacuten del cartucho con la mezcla metanolacetonitrilo en proporcioacuten 2080 hasta un volumen final de 2
mL
6 Anaacutelisis mediante cromatografiacutea liacutequida acoplada a espectrometriacutea de masas en taacutendem UPLC-MSMS
(volumen de inyeccioacuten 15 microL)
Representacioacuten esquematizada en la Figura III1
Figura III1 Extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) de las muestras de vino
27
Capiacutetulo III Parte experimental
6 CONDICIONES DE DETERMINACIOacuteN MEDIANTE UPLC-MSMS
En la Tabla III2 se indican las condiciones utlizadas en la determinacioacuten de los pesticidas de intereacutes mediante
LC-MSMS y en la Tabla III3 se muestra el gradiente de la fase moacutevil utilizado para la separacioacuten
cromatograacutefica
Tabla III2 Condiciones experimentales de determinacioacuten en LC-MSMS
UPLC Acquity UPLC-I-Class IVD System
bull Columna cromatograacutefica Zorbax Eclipse Plus C18 Rapid Resolution HD
Fase estacionaria C18
Dimensiones 21 x 50 mm
Tamantildeo de partiacutecula 18 microm
Temperatura del horno 40ordmC
bull Inyector
Volumen de inyeccioacuten 15 microL
bull Fase moacutevil
Flujo 04 mLmin
Fase acuosa (A) Agua MilliQ con 01 aacutecido foacutermico
Fase orgaacutenica (B) Acetonitrilo con 01 aacutecido foacutermico
MSMS WatersXevo TQD
Modo de ionizacioacuten ESI positivo
Voltaje del capilar 15 kV
Voltaje de cono 50 V
Temperatura de gas de secado (N2) 450ordmC
Flujo de gas de secado (N2) 1000 Lh
Modo de adquisicioacuten Centroide
Tabla III3 Gradiente de fase moacutevil utilizado en la separacioacuten cromatograacutefica (LC)
Tiempo min 0 13 28 64 75 76 10
A 98 50 50 0 0 98 98
B 2 50 50 100 100 2 2
28
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
CAPIacuteTULO IV RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
1 IDENTIFICACIOacuteN DE LOS COMPUESTOS
Para empezar el estudio en primer lugar se realizoacute la caracterizacioacuten de las condiciones de determinacioacuten de los
analitos en el modo Multiple Reaction Monitoring (MRM) mediante UPLC-ESI-MSMS Para llevarla a cabo se
tomaron patrones individuales de cada fitosanitario y mediante infusioacuten se estudiaron las posibles transiciones y
voltajes oacuteptimos para su determinacioacuten (Tabla IV1)
La ionizacioacuten por electrospray (ESI) se estudioacute tanto en modo positivo como en modo negativo encontraacutendose
que para todos los pesticidas de nuestro intereacutes se obteniacutea sentildeal en el modo positivo mientras el modo negativo
no presentaba respuesta significativa
A continuacioacuten se estudia el efecto del voltaje de cono en la respuesta del ioacuten molecular [M+H]+ aumentaacutendolo
hasta alcanzar el valor maacuteximo de la sentildeal correspondiente a dicho ioacuten y luego se optimiza la energiacutea de colisioacuten
variaacutendola para cada analito hasta obtener la sentildeal de mayor intensidad para cada uno de los iones producto Por
uacuteltimo una vez optimizado el voltaje de cono y la energiacutea de colisioacuten se seleccionan las dos transiciones maacutes
intensas para llevar a cabo la cuantificacioacuten y cualificacioacuten de cada analito en modo MRM Este procedimiento se
realizoacute para la totalidad de los compuestos confirmando los datos obtenidos con los facilitados por la base de
datos Quanpedia que estaacute disponible en el software del equipo utilizado para algunos de los compuestos
considerados
Compuesto Tr (min) Ion precursor (mz Da)
Voltaje de cono (V)
Ion producto 1 (CEv)
cuantificacioacuten
Ion producto 2 (CEv)
cualificacioacuten
Relacioacuten IP2IP1
AME 325 2760 60 176 (35) 70 (50) 016
BEN 485 3261 26 148 (20) 91 (34) 067
BOS 387 3429 41 140 (20) 307 (20) 011
CAR 167 1921 33 160 (18) 132 (28) 014
CYP 311 2260 56 93 (33) 108 (25) 061
DIM 322 3881 40 301 (20) 165 (30) 057
FEH 386 3021 41 97 (22) 55 (38) 044
FEP 257 2742 55 147 (28) 86 (28) 093
FLU 401 3830 40 173 (20) 365 (15) 010
IMI 218 2561 34 209 (15) 175 (20) 091
IPR 358 3211 28 119 (16) 203 (10) 042
Tabla IV1 Tiempos de retencioacuten (Tr) relacioacuten de iones precursores (mz) voltaje de cono (V) energiacuteas de colisioacuten (CE) y relacioacuten de intensidades entre transiciones (IP2IP1)
29
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Compuesto Tr (min) Ion precursor (mz Da)
Voltaje de cono (V)
Ion producto 1 (CEv)
cuantificacioacuten
Ion producto 2 (CEv)
cualificacioacuten
Relacioacuten IP2IP1
MAN 392 4120 25 328 (16) 125 (35) 063
MET 283 2801 26 220 (13) 192 (17) 057
MYC 365 2891 34 70 (18) 125 (32) 029
PEN 417 2840 34 70 (16) 159 (34) 031
PYC 523 3881 31 194 (12) 163 (25) 066
PYM 266 2000 51 107 (24) 82 (24) 071
TEC 397 3080 40 70 (22) 125 (40) 007
TEF 473 3531 19 133 (20) 297 (8) 072
TBZ 182 2020 51 175 (25) 131 (30) 062
TME 203 2920 28 211 (12) 132 (22) 047
THI-M 257 3430 28 151 (46) 93 (19) 0001
TRI 319 2961 21 70 (10) 99 (15) 013
El dwell time para cada una de las transiciones se ajustoacute de manera automaacutetica por el software (MassLinx) con
objeto de obtener doce puntos espectrales por compuesto tomando un valor promedio de cuatro segundos como
ancho de pico a liacutenea de base
2 CARACTERIZACIOacuteN DEL PROCEDIMIENTO DE DETERMINACIOacuteN (UPLC-ESI-
MSMS)
Una vez optimizados los paraacutemetros que afectan a la separacioacuten cromatograacutefica (UPLC) y a la determinacioacuten por
espectrometriacutea de masas en taacutendem (MSMS) se lleva a cabo la evaluacioacuten de la repetibilidad de inyeccioacuten y
determinacioacuten en esas condiciones Se expresa por medio de la desviacioacuten estaacutendar relativa (RSD) paraacutemetro que
nos indica el grado de correlacioacuten que existe entre varias medidas del mismo patroacuten realizadas por el mismo
operador en el laboratorio y en el mismo equipo de medida a lo largo de un diacutea Para el estudio se realizan diez
inyecciones con volumen de 15 microL de dos patrones con distintos niveles de concentracioacuten 5 y 20 ngmL Los
datos de RSD (Tabla IV2) para las aacutereas de pico de los analitos se situacutean para el nivel de concentracioacuten 5 ngmL
en el rango 2-13 y en el nivel de concentracioacuten 20 ngmL en el rango 1-7
30
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten Tabla IV2 Desviacioacuten estaacutendar relativa (RSD) del aacuterea de pico (transicioacuten de cuantificacioacuten) para evaluar la repetivilidad del proceso de LC-MSMS
Compuesto RSD
5 ngmL
RSD
20 ngmL Compuesto
RSD
5 ngmL
RSD
20 ngmL
AME 5 2 MET 3 2
BEN 2 2 MYC 9 2
BOS 4 5 PEN 4 4
CAR 4 2 PYC 3 1
CYP 5 7 PYM 7 3
DIM 6 5 TEC 3 2
FEH 7 4 TEF 4 2
FEP 4 2 TBZ 2 1
FLU 5 3 TME 6 6
IMI 13 7 THI-M a 6
IPR 8 2 TRI 8 6
MAN 3 2
A continuacioacuten tambieacuten se evaluoacute la repetibilidad de los tiempos de retencioacuten (Tr) para diez inyecciones de
patrones a los dos niveles de concentracioacuten 5 y 20 ngmL situaacutendose las RSD para todos los compuestos en el
rango 01-03 En base a este dato la ventana de tiempo en la que se registran las transiciones de MRM de cada
compuesto se fijoacute en 05 min lo que es lo mismo 025 min alrededor del valor medio de su tiempo de retencioacuten
Por otro lado la linealidad del meacutetodo se estudioacute a nueve niveles de concentracioacuten diferentes comprendidos ente
los niveles 05 ngmL y 200 ngmL mediante la inyeccioacuten de disoluciones patroacuten de los distintos compuestos de
estudio Se realizoacute una evaluacioacuten sin y otra con patroacuten interno (IS) antildeadiendo una concentracioacuten fija de patrones
internos a nivel de 25 ngmL y pudimos observar que los resultados mejoran notablemente al realizar una
correccioacuten con el IS En la Tabla IV3 se muestran los coeficientes de determinacioacuten (R2) obtenidos al realizar la
correccioacuten mediante IS observando que para todos los compuestos excepto para THI-M y para TRI los
coeficientes de correlacioacuten son superiores a 0990 por lo que existe una respuesta lineal en el rango de
concentraciones que hemos estudiado
Aparte del estudio de la linealidad tambieacuten se han estudiado los liacutemites de cuantificacioacuten instrumentales del
meacutetodo (LOQs) Para ello los LOQs se evaluacutean como la miacutenima cantidad de analito que origina una sentildeal 10
veces superior a la desviacioacuten estaacutendar del ruido Los valores anteriores se estimaron a partir del patroacuten de
a no evaluado ya que se encuentra por debajo del liacutemite de cuantificacioacuten del meacutetodo
31
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
concentracioacuten maacutes baja que presenta un pico con una relacioacuten SN superior a 10 En la Tabla IV3 tambieacuten se
recogen estos LOQs en doacutende podemos ver que variacutean en el rango 01-1 ngmL excepto para THI-M que se
desviacutea a valores de 10 ngmL
Tabla IV3 Coeficientes de determinacioacuten (R2) y liacutemites de cuantificacioacuten instrumentales (LOQs) de los analitos para nueve
niveles de concentracioacuten de 05 a 200 ngmL
Compuesto Coeficiente de
correlacioacuten (R2)
LOQs (ngmL) Compuesto
Coeficiente de correlacioacuten
(R2)
LOQs (ngmL)
AME 09951 04 MET 09933 01
BEN 09949 01 MYC 09950 04
BOS 09979 02 PEN 09945 02
CAR 09923 02 PYC 09955 02
CYP 09878 02 PYM 09931 01
DIM 09938 07 TEC 09958 05
FEH 09959 05 TEF 09957 01
FEP 09931 01 TBZ 09942 02
FLU 09965 02 TME 09903 01
IMI 09979 05 THI-M 09580 100
IPR 09938 01 TRI 09867 07
MAN 09979 01
En la Figura IV1 y Figura IV2 se muestran dos ejemplo de curvas de calibrado para dos compuestos IMI y
MAN respectivamente
Figura IV1 Curva de calibrado y coeficiente de determinacioacuten de IMI para UPLC-ESI-MSMS
32
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Figura IV2 Curva de calibrado y coeficiente de determinacioacuten de MAN para UPLC-ESI-MSMS
3 ESTUDIO DEL MEacuteTODO SPE
La extraccioacuten de pesticidas se llevoacute a cabo mediante extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) en doacutende se realizaron
diversos estudios con diferentes condiciones para dar con las oacuteptimas En primer lugar se llevaron a cabo los
experimentos de retencioacuten y elucioacuten sobre dos tipos distintos de adsorbentes cartuchos OASIS HLB (200mg) y
cartuchos OASIS MAX (150 mg) como fases potenciales en las que llevar a cabo la extraccioacuten de manera
selectiva Los dos tipos de cartuchos son de fase reversa pero difieren entre siacute en el fundamento de retencioacuten de
los analitos En los cartuchos OASIS HLB (200 mg) formados por divinilbenceno-N-vinilpirrolidona (DVB-VP)
la retencioacuten de los diferentes analitos tiene lugar por interacciones π-π o de Van der Waals mientras que los
cartuchos OASIS MAX (150 mg) que se probaron como alternativa para mejorar la selectividad en la extraccioacuten
cuentan con un adsorbente polimeacuterico de modo mixto formado por divinilbenceno-N-vinilpirrolidona (DVB-VP)
funcionalizado con grupos amina cuaternaria siendo el fundamento de la extraccioacuten la combinacioacuten de las
propiedades adsorbentes del cartucho HLB con un mecanismo adicional de intercambio ioacutenico (anioacutenico) [27]
Algunos autores han empleado este mecanismo para mejorar la selectividad de la extraccioacuten de forma que en la
etapa de elucioacuten ciertos pigmentos del vino quedan fuertemente retenidos en el adsorbente a diferencia de lo que
ocurre con los adsorbentes de fase reversa [51]
Para llevar a cabo la eleccioacuten del tipo de adsorbente se realizaron pruebas con 10 mL de vino blanco y tinto
conectando en serie los dos tipos de cartuchos HLB (200 mg) y MAX (150 mg) a un segundo cartucho OASIS
HLB (60 mg) La elucioacuten de los analitos se hace de forma independiente para cada cartucho y se evaluacutea si los
analitos pasan del primer cartucho hacia el segundo cartucho es decir si se supera el volumen de corte o si por
33
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
otro lado se quedan retenidos en el primero y no eluyen hacia el segundo En estas pruebas de estudio
preliminares de preparacioacuten de la muestra no se ha incluido el CYP
En la Figura IV3 podemos ver la eficacia de la extraccioacuten para vino blanco y tinto que obtenemos empleando
cartuchos OASIS MAX (150 mg) conectados en serie con cartuchos OASIS HLB (60 mg) realizando la
extraccioacuten de tres fracciones de 2 mL cada una del cartucho OASIS MAX (150 mg) y una cuarta fraccioacuten de 2
mL del cartucho OASIS HLB (60 mg)
Por otro lado en la Figura IV4 podemos ver un graacutefico de columnas en el cual comparamos la eficacia de
extraccioacuten de los cartuchos OASIS HLB (200 mg) con dos disolventes de elucioacuten distintos En dicho graacutefica el
acroacutenimo de cada compuesto consta de dos barras cuyo significado es el siguiente la barra de la izquierda indica
la eficacia de la extraccioacuten empleando acetonitrilo (ACN) como disolvente de elucioacuten y la barra de la derecha
indica la eficacia de la extraccioacuten empleando la combinacioacuten MetanolAcetonitrilo (2080) (MeOHACN) como
disolvente de elucioacuten Para este adsorbente no se detectoacute ninguacuten compuesto en la extraccioacuten del segundo
cartuchos OASIS HLB (60 mg) empleando 2 mL de metanol
Figura IV3 Distribucioacuten de los compuestos en cada fraccioacuten obtenidas con cartuchos OASIS MAX (150 mg)
utilizando 10 mL de vino tinto y blanco sacando cuatro fracciones de 2 mL cada una con metanol como
disolvente de elucioacuten
34
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Figura IV4 Distribucioacuten de los compuestos en cada fraccioacuten obtenidas con cartuchos OASIS HLB (200 mg) utilizando 10
mL de vino tinto y blanco sacando 3 fracciones de 2 mL cada una con acetonitrilo (ACN) (columna de la izquierda) y una
combinacioacuten MetanolAcetonitrilo (2080) (MeOHACN) (columna de la derecha) como disolventes de elucioacuten
A la vista de los resultados reflejados en las graacuteficas podemos afirmar que cuando se utiliza el cartucho OASIS
HLB (200 mg) eluyendo con acetonitrilo o la combinacioacuten metanolacetonitrilo (2080) los extractos son limpios
y se eluyen la mayoriacutea de los compuestos en la primera fraccioacuten Pero utilizando acetonitrilo como disolvente de
elucioacuten se encuentran problemas en la extraccioacuten de CAR FEH y TBZ para los que es necesario emplear un
volumen mayor de elucioacuten o bien seleccionar otro disolvente de elucioacuten como es la combinacioacuten
metanolacetonitrilo
35
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Por otro lado los extractos en los cartuchos OASIS MAX (150 mg) son maacutes limpios incluso utilizando metanol en
la elucioacuten pero se detecta la presencia de CAR FEP TBZ y TME en el segundo cartucho OASIS HLB (60 mg)
significando la rotura del primer cartucho para dichos analitos considerando un volumen de 10 mL de vino Los
demaacutes compuestos se podriacutean recuperar cuantitativamente en la primera fraccioacuten sacada pero la peacuterdida de estos
compuestos inclina la eleccioacuten hacia los cartuchos OASIS HLB (200 mg) con metanolacetonitrilo (2080) como
disolvente de elucioacuten para continuar con el estudio
Una vez fijado el adsorbente y el volumen de elucioacuten se prueba la eficacia de la SPE independiente de los efectos
de matriz En la Tabla IV4 se muestran las recuperaciones de la SPE tomando 10 mL de vino blanco y tinto
con un nivel de adicioacuten de 15 ngmL sacando una sola fraccioacuten de 2 mL con la combinacioacuten
metanolacetonitrilo (2080) y n=3 reacuteplicas
Tabla IV4 Recuperaciones (R plusmn SD) de SPE para 10 mL de vino (blanco y tinto) con un nivel de adicioacuten de 15 ngmL y
n=3 reacuteplicas
Compuesto Vino Tinto
R plusmn SD
Vino Blanco
R plusmnSD Compuesto
Vino Tinto
R plusmn SD
Vino Blanco
R plusmn SD
AME 82 plusmn 7 100 plusmn 1 MET 92 plusmn 6 94 plusmn 3
BEN 89 plusmn 6 97 plusmn 3 MYC 90 plusmn 9 86 plusmn 4
BOS 95 plusmn 1 100 plusmn 2 PEN 84 plusmn 10 103 plusmn 3
CAR 91 plusmn 6 104 plusmn 6 PYC 86 plusmn 5 106 plusmn 1
CYP 81 plusmn 7 102 plusmn 3 PYM 87 plusmn 12 94 plusmn 3
DIM 97 plusmn 3 86 plusmn 4 TEC 83 plusmn 10 103 plusmn 1
FEH 89 plusmn 3 88 plusmn 3 TEF 84 plusmn 5 108 plusmn 4
FEP 91 plusmn 7 104 plusmn 3 TBZ 88 plusmn 7 92 plusmn 5
FLU 91 plusmn 2 97 plusmn 4 TME 101 plusmn 1 110 plusmn 13
IMI 117 plusmn 8 101 plusmn 11 THI-M 85 plusmn 9 110 plusmn 4
IPR 89 plusmn 7 112 plusmn 4 TRI 85 plusmn 10 110 plusmn 4
MAN 88 plusmn 2 87 plusmn 2
Algunos compuestos de la matriz en el vino pueden competir con los analitos durante el proceso de ionizacioacuten
que tiene lugar en la interfase entre UPLC-MSMS por lo que para la cuantificacioacuten del rendimiento de la
ionizacioacuten por electrospray (ESI) se estudian los efectos de matriz (EM) para vino blanco y tinto considerando
dos voluacutemenes de muestra distintos 2 y 10 mL y un volumen final del extracto de 2 mL En la Tabla IV5 se
36
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
exponen los valores para cada compuesto notando que al aumentar el volumen de muestra tambieacuten se aumentan
los efectos de matriz y eacutestos siempre son mayores en vino tinto Para el caacutelculo de estos efectos de matriz (EM)
se emplea la siguiente ecuacioacuten
Donde Am Ab y Ap representan el aacuterea de pico en la sentildeal medida del analito en el extracto de la muestra con
adicioacuten en el extracto de la muestra sin adicioacuten (o blanco) y en el patroacuten antildeadido respectivamente El nivel de
adicioacuten en extracto fue de 50 ngmL por compuesto
Tabla IV5 Efectos de matriz para vino blanco y tinto con un volumen inicial de 2 y 10 mL evaluados para un nivel de adicioacuten de 50 ngmL en extracto
Compuesto
Vino blanco Vino tinto
2 mL 10 mL 2mL 10 mL
EM () CV () EM () CV () EM () CV () EM () CV()
AME 93 3 95 2 99 3 101 7
BEN 99 1 93 2 101 3 100 6
BOS 97 5 98 1 108 2 96 0
CAR 62 2 50 3 58 2 55 6
CYP 94 3 91 1 97 2 95 7
DIM 105 2 95 3 100 3 108 3
FEH 100 4 102 4 105 4 94 3
FEP 95 3 88 2 96 2 92 7
FLU 98 2 93 2 106 1 101 2
IMI 84 4 46 3 48 10 18 8
IPR 99 3 92 3 105 1 100 7
MAN 100 1 94 3 109 4 107 2
MET 98 1 89 1 99 2 99 6
MYC 105 1 100 1 103 2 96 9
PEN 98 3 97 1 101 3 99 10
PYC 98 2 92 3 102 2 98 5
PYM 95 2 87 1 94 3 85 12
TEC 95 3 99 1 101 1 102 10
TEF 99 1 92 3 101 2 104 5
TBZ 45 0 40 5 43 2 30 7
TME 60 6 19 16 36 4 16 1
THI-M 107 2 109 2 103 1 96 9
TRI 97 3 118 4 104 5 117 10
37
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Al observar los resultados podemos ver que la mayoriacutea de los compuestos dan resultados de EM en torno al
100 lo que significa que no sufren una modificacioacuten importante en la eficacia de ionizacioacuten para las muestras
con respecto a los patrones Pero tambieacuten por el contrario podemos observar que algunos compuestos como
por ejemplo en el caso de CAR TBZ IMI y TME experimentan una gran supresioacuten de sentildeal es decir EM bajos
que se acentuacutean al aumentar el volumen de muestra La atenuacioacuten en la eficacia de variacioacuten para estos cuatro
compuestos no solo se ve incrementada con el volumen de muestra si no que ademaacutes es maacutes significativa para
vino tinto que para vino blanco En base a estos resultados aunque la eficacia de la SPE fue cuantitativa para
muestras de 10 mL se limitoacute el volumen de muestra a extraer a 2 mL
Las condiciones oacuteptimas de extraccioacuten se esquematizan en un resumen en la Figura IV5
Figura IV5 Condiciones optimizadas para la extraccioacuten de pesticidas en vino
38
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
4 CARACTERIZACIOacuteN DEL MEacuteTODO DE DETERMINACIOacuteN
Con las condiciones de extraccioacuten y determinacioacuten citadas anteriormente se llevaron a cabo pruebas de
recuperaciones absolutas de los compuestos a nivel de adicioacuten de 5 y 20 ngmL sobre las muestras Para cada
muestra y nivel de adicioacuten se realizaron tres reacuteplicas de las muestras con adicioacuten y los blancos aliacutecuotas de las
mismas muestras sin adicioacuten se procesaron en duplicado Los IS se antildeadieron a nivel de 25 ngmL y cada uno se
utiliza para corregir unos determinados compuestos CAR-d3 se emplea para CAR y TBZ el CYP-d5 para CYP y
PYM el IMID-d4 para IMI y TME y el MET13C6 para el resto de compuestos Los resultados para vino blanco
comprenden en el nivel de concentracioacuten 5 ngmL el rango entre 79-122 y en el nivel de concentracioacuten 20
ngmL el rango entre 84-109 Por otro lado en el caso del vino tinto las recuperaciones se encuentran para el
nivel de concentracioacuten 5 ngmL en el rango 67-112 y para el nivel de concentracioacuten 20 ngmL entre el rango
73-132 Los resultados obtenidos en las pruebas con vino blanco y vino tinto se muestran en la Tabla IV6
Los resultados son satisfactorios ya que la mayoriacutea de los compuestos se ajustan en todos los casos al rango de
recuperacioacuten entre 70-120 Para la realizacioacuten de estas pruebas se ha eliminado de los resultados el compuesto
THI-M debido a que las concentraciones utilizadas se encuentran en el liacutemite o por debajo del LOQ en los
experimentos con muestras adicionadas a 5 ngmL
Para calcular las recuperaciones (R) se recurrioacute a la siguiente ecuacioacuten
Donde Cm Cb y Cp son la concentracioacuten medida de analito en el extracto de la muestra con adicioacuten en el extracto
de la muestra sin adicioacuten (o blanco) y en el patroacuten antildeadido respectivamente
Tabla IV6 Recuperaciones (R) para vino tinto y vino blanco evaluadas para dos niveles de concentracioacuten 5 y 20 ngmL
Compuesto
Vino tinto Vino Blanco
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
AME 97 3 105 6 104 9 96 5
BEN 88 11 105 3 101 1 98 4
BOS 91 13 110 2 88 13 97 3
39
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Compuesto
Vino tinto Vino blanco
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
CAR 99 6 99 3 122 3 109 1
CYP 91 2 111 1 101 4 100 6
DIM 112 3 110 9 102 24 99 11
FEH 91 4 108 0 102 20 95 2
FEP 89 8 102 7 94 5 84 1
FLU 95 10 104 4 109 5 100 8
IMI 73 11 115 9 80 13 100 2
IPR 84 13 99 3 111 3 99 4
MAN 88 22 112 8 112 3 99 4
MET 99 3 106 5 106 3 98 2
MYC 84 9 106 13 88 17 86 3
PEN 84 9 102 5 84 8 90 5
PYC 96 6 105 4 100 2 95 4
PYM 90 12 112 14 106 4 97 1
TEC 89 8 101 6 98 12 94 1
TEF 93 10 102 5 107 2 97 3
TBZ 94 17 115 8 79 5 106 2
TME 67 2 101 7 84 18 90 11
THI-M ne - 74 7 ne - 89 24
TRI 88 12 97 6 102 6 92 2
ne No evaluado El nivel de adicioacuten es inferior al LOQ del meacutetodo para este compuesto
Para estudiar la reproducibilidad del meacutetodo analiacutetico global (correspondientes a los datos de preparacioacuten de
muestra y determinacioacuten) es decir la concordancia de varias medidas realizadas en diacuteas diferentes se procedioacute a la
extraccioacuten en las condiciones oacuteptimas tanto de vino blanco como tinto Las extracciones y determinaciones se
realizaron durante tres diacuteas consecutivos realizando tres reacuteplicas por vino y por diacutea con un nivel de adicioacuten en
muestra de 10 ngmL un blanco de muestra cada diacutea En la Tabla IV7 se muestran los resultados como
recuperaciones (R) en condiciones de reproducibilidad obtenidos para ambos tipos de vino dando valores entre
64-116 para muestras de vino blanco y valores situados entre 68-108 para muestras de vino tinto con la
excepcioacuten del TME para el que se ha obtenido un valor no aceptable en cuanto a la exactitud medida en
condiciones de reproducibilidad A la vista de los resultados obtenidos con estas pruebas se considera necesario el
empleo de IS adicionales para la mejora en la exactitud del meacutetodo para algunos compuestos por ejemplo el
TME
40
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Tabla IV7 Recuperaciones en condiciones de reproducibilidad (R plusmn SD) para vino blanco y tinto
Compuesto
Vino tinto Vino blanco
R
10 ngmL CV ()
R
10 ngmL CV ()
AME 90 5 101 13
BEN 96 5 102 7
BOS 97 6 100 8
CAR 97 3 94 5
CYP 103 3 105 12
DIM 104 7 106 8
FEH 90 16 83 15
FEP 91 5 90 4
FLU 103 7 102 6
IMI 99 14 101 14
IPR 91 5 100 13
MAN 108 5 108 13
MET 101 5 101 5
MYC 105 16 102 14
PEN 96 11 92 10
PYC 99 12 97 12
PYM 102 4 116 8
TEC 99 9 97 16
TEF 99 8 105 11
TBZ 68 4 84 5
TME 47 13 64 10
THI-M 107 11 104 16
TRI 95 14 103 4
En la Tabla IV8 se muestran los liacutemites de cuantificacioacuten (LOQs) del meacutetodo del meacutetodo de SPE-UPLC-ESI-
MSMS obtenidos para los diferentes pesticidas Los valores obtenidos son ideacutenticos a los LOQs instrumentales
excepto en el caso de aquellos compuestos para los que se observaronfuertes efectos de matriz (Tabla IV5) En
estos casos (CAR TBZ IMI y TME) los LOQs del meacutetodo se incrementan seguacuten la atenuacioacuten de sentildeal
observada
41
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Tabla IV8 Liacutemites de cuantificacioacuten LOQs (ngmL) del meacutetodo obtendos para cada compuesto
Compuesto LOQ (ngmL) Compuesto LOQ (ngmL)
AME 04 MET 01
BEN 01 MYC 04
BOS 02 PEN 02
CAR 03 PYC 02
CYP 02 PYM 01
DIM 07 TEC 05
FEH 05 TEF 01
FEP 01 TBZ 04
FLU 02 TME 02
IMI 06 THI-M 10
IPR 01 TRI 07
MAN 01
5 APLICACIOacuteN A MUESTRAS DE VINO COMERCIALES
Una vez optimizadas las condiciones del meacutetodo y estudiadas las caracteriacutesticas del meacutetodo desarrollado se aplicoacute
a la determinacioacuten de los compuestos de intereacutes estudiados en muestras de vino blanco y vino tinto comerciales
producidos en diferentes paiacuteses En la Tabla IV9 se muestra el paiacutes de origen de cada muestra comercial
identificadas con un coacutedigo alfanumeacuterico y antildeo de produccioacuten
42
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Tabla IV9 Coacutedigo asignado para los diferentes vinos comerciales blancos y tintos analizados Indicando el paiacutes de origen y
antildeo de produccioacuten
Coacutedigo Denominacioacuten de origen Antildeo de produccioacuten
bull Vinos Blancos
W1 Alemania 2014
W2 Espantildea 2012
W3 Espantildea 2016
W4 Portugal Desconocido
W5 Francia 2015
W6 Francia 2015
W7 Espantildea 2016
bull Vinos Tintos
R1 Espantildea 2015
R2 Sudaacutefrica 2015
R3 Chile 2015
R4 Francia 2015
R5 China Desconocido
R6 Espantildea 2016
R7 Australia 2014
R8 Francia 2013
R9 Francia 2015
A continuacioacuten en la Tabla IV10 y la Tabla IV11 se recogen los resultados obtenidos en el anaacutelisis de las
muestras comerciales Los datos obtenidos corresponden en todos los casos al uso de patrones de calibracioacuten
como teacutecnica de cuantificacioacuten
Tabla IV10 Concentracioacuten (ngmL) encontradas en las diferentes muestras de vino blanco comercial analizadas mediante
SPE-UPLC-MSMS n=2 reacuteplicas y al final el sumatorio de las concentraciones encontradas
Compuesto W1 W2 W3 W4 W5 W6 W7
AME 04 nd nd nd 41 nd nd
BEN nd nd 14 nd nd nd nd
BOS 84 102 520 54 197 nd nd
CAR nd 115 56 nd nd nd nd
CYP 08 59 112 nd nd 26 nd
43
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Compuesto W1 W2 W3 W4 W5 W6 W7
DIM 14 84 400 09 32 50 nd
FEH 85 809 639 15 187 nd nd
FLU 11 05 92 nd 77 32 nd
IMI nd 136 88 29 nd nd 69
IPR 30 749 1144 14 nd nd nd
MAN nd nd nd nd nd 30 nd
MET 04 273 494 63 nd nd 172
MYC 09 nd 35 nd nd nd nd
PYM 15 469 584 08 24 35 nd
TEC 11 nd 58 nd nd nd nd
TRI nd 67 61 nd nd nd nd
sumconcentracioacuten
(ngmL) 274 2868 4358 192 558 173 862
nd no detectado
Tabla IV11 Concentracioacuten (ngmL) encontradas en las diferentes muestras de vino tinto comercial analizadas mediante
SPE-UPLC-MSMS n= 2 reacuteplicas y al final el sumatorio de las concentraciones encontradas
Compuesto R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9
AME nd nd nd 30 nd nd nd nd 16
BEN nd nd nd 07 nd nd nd nd nd
BOS nd 55 21 196 nd nd nd 73 21
CAR nd nd 04 17 249 20 nd nd nd
CYP 34 08 02 22 nd 136 nd 85 nd
DIM nd 33 nd 52 233 46 nd 61 23
FEH nd nd nd 1070 nd 10 nd 1307 14
FLU nd nd nd 20 nd nd nd nd nd
IPR 16 nd nd 17 nd 22 nd nd nd
MAN nd nd nd 17 nd nd nd 20 nd
MET 126 nd nd 14 55 313 30 44 39
MYC nd nd nd 05 nd 32 nd nd nd
PYM 19 nd 03 185 49 281 nd 24 nd
TEC 25 06 39 29 nd nd nd 21 20
TEF nd 01 12 nd nd nd nd nd nd
sumconcentracioacuten
(ngmL) 220 48 81 1681 586 860 30 1635 133
nd no detectado 44
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
En los resultados de los anaacutelisis podemos observar que en ninguna de las muestras comerciales de vino blanco
aparecieron los siguientes compuestos FEP PEN PYC TEF TBZ THI-M y TME y en los vinos tintos
comerciales no aparece a ninguna concentracioacuten FEP IMI PEN PYC TBZ TME THI-M y TRI No se
detectaron para dichas muestras de vino a niveles superiores a los LOQs del meacutetodo propuesto
Cuando se detecta un compuesto positivo se compara el pico cromatograacutefico del compuesto con el de un patroacuten
verificando la coincidencia del tiempo de retencioacuten (maacutexima diferencia 01 min) y la relacioacuten entre transiciones
(maacutexima diferencia 30 ) En la Figura IV6 y la Figura IV7 se muestran los cromatogramas para el compuesto
CYP obtenido en condiciones oacuteptimas para la muestra de vino blanco W6 y en un patroacuten de 5 ngmL
respectivamente En este caso el intervalo de tolerancia para la relacioacuten de intensidad entre transiciones es
IP2IP1=061plusmn018
Figura IV6 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el CYP en la muestra W6 (26 ngmL) Transicioacuten
superior 226gt93 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 226gt108 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades IP2IP1= 066
Figura IV7 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el CYP en un patroacuten de 5 ngmL Transicioacuten
superior 226gt93 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 226gt108 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades IP2IP1=061plusmn018
45
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Otro ejemplo de compuesto positivo en abundantes muestras comerciales de estudio es el Metalaxyl positivo con
una concentracioacuten de 04 ngmL en el vino con referencia W1 (Figura IV8) y positivo con una concentracioacuten de
313 ngmL en el vino con referencia R6 (Figura IV9) Ambas se comparan con el cromatograma de un patroacuten
de Metalaxyl de 1 ngmL (Figura IV10) El grado de concordancia en los tiempos de retencioacuten y la relacioacuten de
intensidades entre transiciones es satisfactorio
Figura IV8 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el MET en la muestra W1 (04 ngmL) Transicioacuten
superior 2801gt2201 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 2801gt1921 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades
IP2IP1=056
Figura IV9 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el MET en la muestra R6 (313 ngmL) Transicioacuten
superior 2801gt2201 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 2801gt1921 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades IP2IP1=
056
46
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Figura IV10 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el MET en un patroacuten de 1 ngmL Transicioacuten
superior 2801gt2201 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 2801gt1921 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades
IP2IP1=057plusmn017
Es de destacar que aunque se detectaron bastantes pesticidas en las diferentes muestras de vino comerciales pero
en ninguacuten caso superaron el 10 de los LMRs permitidos en uvas tal y como se recomienda ya que todaviacutea no
existen LMRs para vino en la legislacioacuten vigente No obstante el nivel total de concentracioacuten (sumatorio de
concentraciones Tabla IV10 y Tabla VI11) es significativo para varias muestras tanto de vinos blancos (W2 y
W3) como tintos (R4 y R8)
47
Capiacutetulo V Conclusiones
CAPIacuteTULO V CONCLUSIONES
En este trabajo se ha estudiado un meacutetodo para la cuantificacioacuten de pesticidas concretamente veinte fungicidas y
tres insecticidas en vino blanco y tinto En la etapa de preparacioacuten de muestra se optimizoacute la extraccioacuten en fase
soacutelida (SPE) utilizando cartuchos OASIS HLB (200 mg) compuestos por divinilbenceno-N-vinilpirrolidona
(DVB-VP) como adsorbente Como teacutecnica de determinacioacuten se utilizoacute cromatografiacutea de liacutequidos con una
interfase de electroespray acoplada a espectrometriacutea de masas (UPLC-ESI-MSMS)
Las conclusiones generales obtenidas a partir de los resultados de este proyecto relativo a la determinacioacuten de
fitosanitarios en vino son
Ante los problemas de retencioacuten que presentan los cartuchos OASIS MAX (150 mg) para algunos
compuestos los cartuchos OASIS HLB (200 mg) junto con la combinacioacuten metanolacetonitrilo (2080)
como disolvente de elucioacuten son elegidos como mejor opcioacuten en la extraccioacuten en fase soacutelida de pesticidas
en muestras con matrices complejas como es el caso del vino Asiacute se consigue la retencioacuten selectiva de
componentes de la matriz y proporciona extractos con menor porcentaje de interferencias
El meacutetodo estudiado y optimizado se puede aplicar tanto a vinos blancos como a vinos tintos procesados
a partir de distintas variedades de uvas
Los liacutemites de cuantificacioacuten (LOQs) del estudio se situacutean la mayoriacutea por debajo de 10 ngmL excepto
en el caso de THI-M que asciende al valor de 20 ngmL El rango de respuesta lineal abarca hasta 200
ngmL y el tiempo de anaacutelisis ha sido de solo 10 minutos por muestra
En todas las muestras de vino (blancos y tintos) comerciales analizadas se han detectado la presencia de
varios pesticidas sin embargo todas las concentraciones encontradas se encuentran por debajo del 10
de los LMRs fijados en uvas tal y como recomienda la legislacioacuten por lo que no se considera
preocupante
48
Capiacutetulo V Conclusioacutens
CAPIacuteTULO V CONCLUSIOacuteNS
Neste traballo estudouse un meacutetodo para a cuantificacioacuten de pesticidas en particular vinte funxicidas e tres
insecticidas en vintildeo branco e maacuteis tinto No paso da preparacioacuten da mostra optimizouse a extraccioacuten en fase
soacutelida (SPE) empregando cartuchos OASIS HLB (200 mg) compostos por divinilbenceno-N-pirrolidona (DVB-
VP) como adsorbente Para a teacutecnica de determinacioacuten utilizouse cromatografiacutea de liacutequidos con unha interfase de
electroespray acoplada a espectrometriacutea de masas (UPLC-ESI-MSMS)
As conclusioacutens xerais a obtidas a partir dos resultados deste proxecto relativo aacute determinacioacuten de pesticidas en
vintildeo son
Ante os problemas de retencioacuten que mostraban os cartuchos OASIS MAX (150 mg) para alguacuten
compostos os cartuchos OASIS HLB (200 mg) en conxunto coa mistura metanolacetonitrilo (2080)
como disolvente de elucioacuten son elexidos como mellor opcioacuten na extraccioacuten en fase soacutelida de pesticidas
en mostras con matrices complexas como eacute o caso do vintildeo Asiacute eacute conseguida a retencioacuten selectiva de
componentes da matriz e proporciona extractos con menos porcentaxe de interferencias
O meacutetodo estudado e optimizado poacutedese aplicar tanto a vintildeos brancos coma tintos procesados a partir de
diferentes variedades de uvas
Os liacutemites de cuantificacioacuten do estudo (LOQs) son maacuteis baixos de 10 ngmL agaacutes no caso do THI-M
que ascende ao valor de 20 ngmL O rango de resposta lineal cobre ata 200 ngmL e o tempo de anaacutelise
foi de soacute 10 minuacutetos por mostra
En todas as mostras de vintildeo (brancos e tintos) comercial analizadas detectouse a presenza de varios
pesticidas maacuteis poreacuten todas as concentracioacutens atopadas son inferiores ao 10 dos LMR fixados en uvas
tal e como recomenda a lexislacioacuten polo que non se considera preocupante
49
Chapter V Conclusions
CHAPTER V CONCLUSIONS
In this work we have studied a method for the quantification of pesticides specifically twenty fungicides and
three insecticides in white and red wine In the sample preparation step the solid phase extraction was optimized
using cartridges OASIS HLB (200 mg) containing divinylbenzene-N-vinylpyrrolidone (DVB-VP) as adsorbent
As determination technique ultraperformance liquid chromatography was used with an electrospray interface
coupled to mass spectrometry (UPLC-ESI-MS7MS)
The general conclusions drawn from the results of this project concerning the determination of pesticides in wine
are
Due to the retention problems presented by the OASIS MAX sorbent (150 mg) for some compounds of
this project the cartridges OASIS HLB (200 mg) together with the methanolacetonitrile (2080) mixture
are chosen as the best option in the solid phase extraction of pesticides in samples with complex
matrices as is the case with the wine
The method studied and optimized can be applied to both white and red wines obtained from different
varieties of grapes
The limits of quantification (LOQs) were below 10 ngmL for most of the compounds except in the
case of THI-M with a LOQ of to 10 ngmL The linear response range covers up to 200 ngmL and the
analysis time was only 10 minutes per sample
In all commercial wine samples (white and red) analyzed the presence of several pesticides was
conformed however all the concentrations obtained are below 10 of the Maximum residue
levels(MRLs) fixed in grapes as recommended by legislation
50
VI Bibliografiacutea VI BIBLIOGRAFIacuteA [1] Ministerio de agricultura y pesca alimentacioacuten y medio ambiente mhttpwwwmapamagobesescalidad-y-evaluacion-ambientaltemasproductos-quimicosfitosanitarios (Acceso el diacutea 11052017) [2] httpwwwcricyteduarenciclopediaterminosProducFitohtm (Acceso el diacutea 11052017) [3] WERNER BALTES ldquoQuiacutemica de los alimentosrdquo Editorial Acribia SA 2007 Capiacutetulo 11 ldquoResiduos en los alimentosrdquo paacuteginas 206-217
[4] RLabrada JCCaseley CParker ldquoESTUDIO FAO PRODUCCIOacuteN Y PROTECCIOacuteN VEGETAL 120rdquo Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentacioacuten Roma 1996 ISSN 1014- Capiacutetulo 10 Herbicidas httpwwwfaoorgdocrepT1147St1147s00htmContents (Acceso el diacutea 12052017)
[5] Taberner Palou Andreu Cirujeda Ranzenberger Alicia Zaragoza Larios Carlos ldquoManejo de poblaciones de malezas resistentes a herbicidasrdquo (FAO Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura) 100 preguntas sobre resistencia PDF sacado de httpwwwfaoorg3a-a1422spdf (Acceso el diacutea 12052017) [6] BISSET Juan A Uso correcto de insecticidas control de la resistencia Revista Cubana de Medicina Tropical 2002 vol 54 no 3 p 202-219 [7] DEVINE Gregor J EZA Dominique Ogusuku Elena FURLONGMichael J Uso de insecticidas contexto y consecuencias ecoloacutegicas Revista peruana de medicina experimental y Salud Puacuteblica 2008 vol 25 no 1 p 74-100 [8] Ministerio de agricultura y ganaderiacutea (proteccioacuten agropecuaria servicio de diagnoacutestico fitosanitario) de costa Rica httpwwwmaggocrbibliotecavirtualH20-5054pdf (Acceso el diacutea 11052017) [9] GEPP V MONDINO P Control quiacutemico 2011 PDF obtenido de httpwwwpvfagroeduuyfitopatodocscursosfitopatoMaterialesGuiasC-QUIMICOpdf (Acceso el diacutea 772017) [10] ROSSLENBROICH Hans-Juergen STUEBLER Dietrich Botrytis cinereamdashhistory of chemical control and novel fungicides for its management Crop Protection 2000 vol 19 no 8 p 557-561 [11] Figura 11 httpwwwvitiviniculturanetbotritis-o-podredumbre-gris-botrytis-cinerea-pershtml (Acceso el diacutea 12052017) [12] CAMPBELL Paul BENDEK Carlos LATORRE Bernardo A Riesgo de oiacutedio (Erysiphe necator) de la vid en relacioacuten con el desarrollo de los racimos Ciencia e investigacioacuten agraria 2007 vol 34 no 1 p 5-11 [13] ldquoCoacutemo combatir el oiacutedio de la vidrdquo Jose Javier Peacuterez de Obanos Castillo PDF sacado de httpswwwnavarraesNRrdonlyres05E65D9B-D1A2-4EAD-9A63-AFF1D3215552135109Comocombatireloidiodelavidpdf (Acceso el diacutea 12052017) [14] Imagen 12 sacadas las 3 de httpwwwvitiviniculturanetoidio-de-la-vidhtml (Acceso el diacutea 12052017) [15] BARRIOS Gonccedilal REYES Joan Modelizacioacuten del Mildiu de la Vid 2004 httpwwwruralcatnetmigracio_resources617683_mildiusPDF (Acceso el diacutea 12052017) [16] Imaacutegenes sacadas de httpwwwvitiviniculturanetmildiu-de-la-vid-enfermedades-vinahtml (Acceso el diacutea 13052017) [17] HUQ Mainul MEISNER Craig DASGUPTA Susmita Health effects and pesticide perception as determinants of pesticide use evidence from Bangladesh httpagrisfaoorgagris-searchsearchdorecordID=US2012411738 (Acceso el diacutea 13052017)
51
IV Bibliografiacutea [18] BADII Mohammad H LANDEROS Jeroacutenimo Plaguicidas que afectan a la salud humana y la sustentabilidad CULCyT 2015 no 19 Revista vista en httpopenjournaluacjmxojsindexphpculcytarticleview454 (Acceso el diacutea 772017) [19] OLEA Nicolaacutes FERNAacuteNDEZ Mariana F Plaguicidas persistentes En Congreso Implementacioacuten del Convenio de Contaminantes Orgaacutenicos Persistentes Madrid 2001 p 26-27 [20] httpwwwfaoorgfao-who-codexalimentariusabout-codexes (Acceso el diacutea 14052017) [21] httpeceuropaeufoodplantpesticidesmax_residue_levels_en (Acceso el diacutea 14052017 [22] ORDONtildeEZ Juan A Cambero Rodriacuteguez MI Fernaacutendez Aacutelvarez L Garciacutea Sanz ML Garciacutea de Fernando Minguilloacuten GD de la Hoz Perales L Selgas Cortecero MD Tecnologiacutea de los alimentos Volumen 1 Componentes de los Alimentos y Procesos Siacutentesis Madrid 1998paacutegs 349-351 [23] CELA Rafael Casais Maria del Carmen Lorenzo Rosa Antonia Teacutecnicas de separacioacuten en quiacutemica analiacutetica Siacutentesis 2002 Capiacutetulo 11 Extraccioacuten y lixiviacioacuten por disolvente (paacutegs206-260) [24] CANTWELL Frederick F LOSIER Manon Liquidmdashliquid extraction Comprehensive Analytical Chemistry 2002 vol 37 p 297-340 [25] Imagen de LLE sacada de httpprocesosbiowikispacescomExtracciC3B3n+liquido-liquido (Acceso el diacutea 15052017) [26] HENNION Marie-Claire Solid-phase extraction method development sorbents and coupling with liquid chromatography Journal of Chromatography A 1999 vol 856 no 1 p 3-54 [27] CELA Rafael Casais Maria del Carmen Lorenzo Rosa Antonia Teacutecnicas de separacioacuten en quiacutemica analiacutetica Siacutentesis 2002 Capiacutetulo 16 Teacutecnicas de adsorcioacuten y absorcioacuten en la preparacioacuten de muestras Extraccioacuten y microextraccioacuten en fase soacutelida (paacutegs520-555) [28] Imagen spe sacada httptoxicocbblogspotcomes201310las-intoxicaciones-con-farmacoshtml (Acceso el diacutea 15052017) [29] Chaacutefer Pericaacutes Consuelo Acoplamiento microextraccioacuten en fase soacutelida-cromatografiacutea (2006) httprodericuveshandle1055014940 (Acceso el diacutea 16052017) [30] Imagen SPME httpwwwscieloorgcoscielophpscript=sci_arttextamppid=S0122-53832002000100005 (Acceso el diacutea 16052017) [31] MONTES GOYANES Rosa Mariacutea Avances en teacutecnicas de microextraccioacuten para la determinacioacuten de compuestos traza en muestras medioambientales y alimentarias Teacutesis doctoral Noviembre 2009 (Paacutegs 34-55) [32] LEHOTAY Steven J Ae Son Kyung KwonHyeyoung Koesukwiwat Urairat Fu Wusheng Mastovska Katerina Hoh Eunha Leepipatpiboon Natchanun Comparison of QuEChERS sample preparation methods for the analysis of pesticide residues in fruits and vegetables Journal of Chromatography A 2010 vol 1217 no 16 p 2548-2560 [33] Imagen QueChERS httpswwwresearchgatenetpublication279221361_QuEChERS_A_Sample_Preparation_for_Extraction_of_Carbaryl_from_Rat_Feces (Acceso el diacutea 16052017) [34] STASHENKO Elena E MARTIacuteNEZ Jairo Reneacute Preparacioacuten de la muestra un paso crucial para el anaacutelisis por GC-MS Uma publicaccedilatildeo trimestral do Instituto Internacional de Cromatografia (IIC) Ciecircncia Cromatograacutefica 2011 vol 3 no 1 [35] Imagen GC-MS httpsorgspectroscopyintblogspotcomes201411gas-chromatography-mass-spectrometry-gchtml (Acceso el diacutea 17052017) [36] httpwwwactlabscompageaspxmenu=65ampapp=221ampcat1=534amptp=2amplk=no (Acceso el diacutea 17052017)
52
IV Bibliografiacutea [37] Quintela O Cruz A Concheiro M De Castro A amp Loacutepez-Rivadulla M (2005) Metodologiacutea LC-MS Aspectos generales de la teacutecnica y sus aplicaciones en el campo de la toxicologiacutea Rev Toxicol 22 paacutegs7-14 [38] Imagen LC-MS httpsuploadwikimediaorgwikipediaenff9Liquid_chromatography_tandem_Mass_spectrometry_diagrampng (visto 18052017) [39] Vargas de la Cruz Celia Bertha Adaptacioacuten de la Metodologiacutea Analiacutetica para la determinacioacuten de residuos de plaguicidas en frutas nativas de exportacioacuten mediante Uplc-MsMs (2012) Tesis obtenida en http20062146130handlecybertesis2331 (Acceso el diacutea 772017) [40] ROMERO GONZAacuteLEZ Roberto Fernaacutendez Moreno Joseacute Luis Plaza Bolantildeos Patricia Garrido Frenich Antonia Martiacutenez Vidal Joseacute Luis Empleo de la espectrometriacutea de masas como herramienta para la determinacioacuten de toacutexicos en alimentos hacia la seguridad alimentaria Revista Espantildeola de salud puacuteblica 2007 vol 81 no 5 p 461-474 [41] PAYAacute Andrus Fundamento y Funciones de la Espectrometriacutea de Masas Universidad de Valencia Espantildea 2006 httpmuraluvescaloan (Acceso el diacutea 19052017) [42] Imagen MS sacada de httpsesslidesharenetMaYaTorrezespectrometria-demasas (Acceso el diacutea 21052017) [43] ECONOMOU Anastasios Botitsi Helen Antoniou Spyros Tsipi Despina Determination of multi-class pesticides in wines by solid-phase extraction and liquid chromatography-tandem mass spectrometry Journal of Chromatography A 2009 vol 1216 no 31 p 5856-5867 [44] FONTANA A R Rodriacuteguez I Ramil M Altamirano JC Cela R Liquid chromatography time-of-flight mass spectrometry following sorptive microextraction for the determination of fungicide residues in wine Analytical and bioanalytical chemistry 2011 vol 401 no 2 p 767-775 [45] PELAJIĆ Maja G Peček DM Pavlović DV Čepo Novel multiresidue method for determination of pesticides in red wine using gas chromatographyndashmass spectrometry and solid phase extraction Food chemistry 2016 vol 200 p 98-106 [46] Ignaz J Buerge Juumlrgen Krauss Rociacuteo Loacutepez-Cabeza Werner Siegfried Michael Stuumlssi Felix E Wettstein Thomas Poiger Stereoselective Metabolism of the Sterol Biosynthesis Inhibitor Fungicides Fenpropidin Fenpropimorph and Spiroxamine in Grapes Sugar Beets and Wheat Journal of Agricultural and Food Chemistry 2016 vol 64 no 26 p 5301-5309 [47] M Hu X Liu F Dong J Xu S Li H Xu Y Zheng Determination of ametoctradin residue in fruits and vegetables by modified quick easy cheap effective rugged and safe method using ultra-performance liquid chromatographytandem mass spectrometry Food chemistry 2015 vol 175 p 395-400 [48] WALORCZYK Stanisław DROŻDŻYŃSKI Dariusz GNUSOWSKI Bogusław Multiresidue determination of 160 pesticides in wines employing mixed-mode dispersive-solid phase extraction and gas chromatographyndashtandem mass spectrometry Talanta 2011 vol 85 no 4 p 1856-1870 [49] Tianyang Guo Pingping Fang Juanjuan Jiang Feng Zhan Wei Yong Jiahui Liu YiYang Dong Rapid screening and quantification of residual pesticides and illegal adulterants in red wine by direct analysis in real time mass spectrometry Journal of Chromatography A 2016 vol 1471 p 27-3 [50] GONZAacuteLEZ-RODRIacuteGUEZ R M CANCHO-GRANDE B SIMAL-GAacuteNDARA J Decay of fungicide residues during vinification of white grapes harvested after the application of some new active substances against downy mildew Food chemistry 2011 vol 125 no 2 p 549-560 [51] CARPINTEIRO I Ramil M Rodriacuteguez I Cela R Determination of fungicides in wine by mixed-mode solid phase extraction and liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry Journal of Chromatography A 2010 vol 1217 no 48 p 7484-7492
53
Capiacutetulo I Introduccioacuten
3 METODOLOGIacuteA ANALIacuteTICA PARA LA DETERMINACIOacuteN DE PESTICIDAS
31 Meacutetodos de GC-MS (MSMS)
La combinacioacuten de cromatografiacutea de gases (GC) teacutecnica de separacioacuten con espectrometriacutea de masas (MS) como
sistema de deteccioacuten representa un potente meacutetodo para la identificacioacuten determinacioacuten y cuantificacioacuten de
analitos orgaacutenicos en concentraciones traza presentes en muestras complejas Esta teacutecnica de anaacutelisis cuenta con
muchas ventajas en sensibilidad multifuncionalidad buena reproducibilidad robustez asiacute como facilidad en el
manejo pero con una gran desventaja este meacutetodo no es apto para ser utilizado con todos los analitos sino que
se ve limitado a aquellos que sean termoestables y no se descompongan a temperaturas elevadas antes de ser
volatilizados La muestra es introducida a traveacutes del inyector en el cromatoacutegrafo de gases doacutende impulsada por
una corriente de gas inerte como fase moacutevil pasa a traveacutes de la columna que contiene la fase estacionaria en la
cual se separan los compuestos debido a una distribucioacuten de estos entre fase moacutevil-fase estacionaria Mediante
una interfase son introducidos para su deteccioacuten en el espectroacutemetro de masas que cuenta con una fuente de
iones analizador de masas y un detector [34]
La combinacioacuten de analizadores de masas en taacutendem (MSMS) como sistema de deteccioacuten en GC es una teacutecnica
altamente selectiva mejorando la sensibilidad y la relacioacuten sentildeal-ruido en los espectros experimentando una
mejora por lo que se logran unos liacutemites de deteccioacuten inferiores Esta teacutecnica GC-MSMS comprende maacutes
pasos despueacutes de la separacioacuten por cromatografiacutea se lleva a cabo la deteccioacuten con MSMS que consta de varias
etapas generacioacuten de iones en la fuente de ionizacioacuten seleccioacuten de los iones precursores de una determinada
masa disociacioacuten causada por colisioacuten con moleacuteculas de gas inerte de los iones precursores y por uacuteltimo el
anaacutelisis de los fragmentos en relacioacuten a su masacarga (mz) En el caso de que un espectro de MS no permita
confirmar la identidad de un determinado compuesto quiacutemico la obtencioacuten de su espectro de MSMS permite
mejorar la confianza en su identificacioacuten [36]
Figura I9 Acoplamiento GC-MS [35]
14
Capiacutetulo I Introduccioacuten
32 Meacutetodos LC-MS (MSMS)
La teacutecnica de LC-MS se desarrolloacute para minimizar las desventajas del acoplamiento GC-MS y asiacute resolver los
problemas que este uacuteltimo acarreaba con los analitos termolaacutebiles permitiendo el anaacutelisis de eacutestos sin tener que
realizar una etapa previa de derivatizacioacuten La interfase de unioacuten de cromatografiacutea liacutequida (LC) con espectrometriacutea
de masas (MS) acarrea una dificultad significativa siendo responsable de transformar los analitos que se
encontraban en la fase moacutevil liacutequida en iones en fase gas sin que se produzca su degradacioacuten teacutermica La
sensibilidad de las determinaciones por LC-MS va a depender de la interfase empleada Las principales interfases
empleadas actualmente son las ionizaciones a presioacuten atmosfeacuterica electrospray (ES) e ionizacioacuten quiacutemica a
presioacuten atmosfeacuterica (APCI) [37]
Con los antildeos la cromatografiacutea liacutequida se ha ido innovando y mediante la disminucioacuten del tamantildeo de partiacutecula en
la columna se fue mejorando la eficiencia asiacute como aumentando la selectividad y resolucioacuten del pico en el
cromatograma Para este nuevo sistema llamado UPLC Ultra-Performance Liquid Chromatography se desarrolloacute
una nueva instrumentacioacuten capaz de trabajar a altas presiones generando flujos mayores sin peacuterdidas de
resolucioacuten utilizando inyectores automaacuteticos maacutes raacutepidos y detectores con mayor velocidad de adquisicioacuten de
datos disminuyendo asiacute el tiempo de anaacutelisis [39]
33 Espectrometriacutea de masas
La espectrometriacutea de masas es el meacutetodo de deteccioacuten y cuantificacioacuten maacutes fiable a la hora de la determinacioacuten de
compuestos en matrices complejas (tales como alimentos) ya que otros detectores maacutes tradicionales como UV-
visible o fluorescencia cuentan con una gran incertidumbre en los resultados llegando incluso a ofrecer falsos
Figura I10 Acoplamiento LC-MS [38]
15
Capiacutetulo I Introduccioacuten
positivos o negativos Un espectrometro de masas cuenta con un dispositivo de introduccioacuten de muestra una
caacutemara de ionizacioacuten un sistema para la aceleracioacuten de los iones uno o varios analizadores de masas y un detector
[40]
El fundamento de la espectrometriacutea de masas se basa en la separacioacuten de iones en base a la relacioacuten masacarga
(mz) El proceso consta fundamentalmente de cuatro etapas La
primera es la ionizacioacuten de la muestra los iones formados se aceleran
debido a la accioacuten de un campo eleacutectrico variable separacioacuten de los
iones seguacuten su masacarga deteccioacuten de los iones y produccioacuten de la
sentildeal eleacutectrica El analizador de masas es el encargado de la separacioacuten
de los iones en funcioacuten a su mz entre los que maacutes destacan
analizador de masas cuadrupolar que dispersa simultaacuteneamente todos
los iones en funcioacuten de la relacioacuten mz analizador de masas de
tiempo de vuelo (TOF) consta de un tubo a alto vaciacuteo sobre el que no
actuacutea ninguacuten campo eleacutectrico al cual llegan todos los iones acelerados con la misma energiacutea cineacutetica y en el tubo
las velocidades variacutean seguacuten mz y analizador de trampa de iones en doacutende los iones gaseosos quedan aislados
durante largos periacuteodos de tiempo por la accioacuten del campo eleacutectrico [41]
4RESUMEN BIBLIOGRAacuteFICO DE LAS TEacuteCNICAS DE EXTRACCIOacuteN Y
DETERMINACIOacuteN DE PESTICIDAS EN VINO
En la bibliografiacutea se han descrito diversas teacutecnicas y diferentes combinaciones entre teacutecnicas de extraccioacuten y
distintas teacutecnicas de cuantificacioacuten e identificacioacuten para esos analitos Entre estas teacutecnicas los valores de los liacutemites
de cuantificacioacuten (LOQs) y las recuperaciones relativas pueden diferir en el resultado en un rango de valores asiacute
como el tiempo total empleado para el anaacutelisis y para la preparacioacuten de la muestra
Por lo general el meacutetodo de extraccioacuten de los analitos de intereacutes maacutes empleado es la extraccioacuten en fase soacutelida
(SPE) la cuaacutel le ha estado ganando terreno a la extraccioacuten liacutequido-liacutequido aunque tambieacuten se estaacute viendo cada vez
maacutes desplazada debido al creciente uso de la teacutecnica QuEChERS
Figura I11 Etapas de la espectrometriacutea de masas [42]
16
Capiacutetulo I Introduccioacuten
En el estudio de ECONOMOU et al [43] realizado en el antildeo 2009 en Grecia se empleoacute la extraccioacuten en fase
soacutelida con deteccioacuten en cromatografiacutea de liacutequidos acoplada a espectrometriacutea de masas en taacutendem (SPE-LC-ESI-
MSMS) Para la preparacioacuten de la muestra diluyeron 10 mL de vino (tanto blanco como tinto) a un volumen
final de 100 mL con agua ultrapura antes de la SPE Determinaron las recuperaciones de la extraccioacuten para dos
niveles de concentracioacuten 0010 y 0050 mgL realizando 8 medidas diarias durante 3 diacuteas consecutivos
encontraacutendose unos valores que variacutean dentro del rango 70-110 para todos los pesticidas en los dos niveles Para
la determinacioacuten y cuantificacioacuten de 46 pesticidas emplearon la teacutecnica de cromatografiacutea de liacutequidos con
espectrometriacutea de masas con un volumen de inyeccioacuten de 20 microL y un flujo de fase moacutevil de 02 mLmin
aclopada a espectrometriacutea de masas en taacutendem
Con la misma teacutecnica de extraccioacuten PELAJIĆ et al [45] durante el antildeo 2015 en Croacia llevaron a cabo la
determinacioacuten de 25 residuos de plaguicidas en vino tinto El meacutetodo que desarrollaron para dicha finalidad fue el
acoplamiento SPE-GC-MS Para la preparacioacuten de la muestra emplearon 10 mL de vino diluidos 11 con agua
ultrapura hasta un volumen final de 20 mL Calcularon las recuperaciones de la extraccioacuten y se encontroacute un rango
para todos los pesticidas en las muestras de 70-120 Para la determinacioacuten en cromatografiacutea de gases-
espectrometriacutea de masas se empleoacute un volumen de inyeccioacuten de 5 μL y un flujo de fase moacutevil de 10 mLmin
Mediante el acoplamiento de teacutecnicas SPE dispersiva-GC-MS WALORCZYK et al [48] en el antildeo 2011 en
Polonia llevaron a cabo la cuantificacioacuten de 160 pesticidas en diferentes clases de vino tinto rosado y blanco Con
10 g de vino y 10 mL de acetonitrilo se realizaron pruebas de recuperacioacuten en la fase de extraccioacuten para vino
tinto con los niveles de concentracioacuten 001 005 y 02 mgkg y para los vinos rosado y blanco con el nivel de
concentracioacuten 005mgkg y encontraron que a todos los niveles de concentracioacuten los valores de recuperacioacuten
rondan el rango 80-110 Para la teacutecnica cromatograacutefica se utilizoacute un volumen de inyeccioacuten de 5 microL
El acoplamiento LLE-SPE-LCDAD fue desarrollado por GONZAacuteLEZ-RODRIacuteGUEZ et al [50] en el antildeo
2010 en la provincia de Orense para la determinacioacuten de nuevos fungicidas propuestos para combatir el hongo
que provoca la enfermedad del mildium En la preparacioacuten de la muestra emplearon 15 mL de vino blanco para la
extraccioacuten en la cual fueron calculadas las recuperaciones relativas para dos niveles de concentracioacuten 005 y 05
mgkg en donde se establece un rango de entre 70-110 para todos los analitos Para la determinacioacuten mediante
cromatografiacutea de liacutequidos se empleoacute un volumen de inyeccioacuten de 2 μL y como meacutetodo de deteccioacuten utilizaron un
detector de diodos array
La microextraccioacuten sorptiva en fase soacutelida fue empleada en la publicacioacuten de FONTANA et al [44] junto con un
acoplamiento entre cromatografiacutea de liacutequidos y espectrometriacutea de masas para la determinacioacuten de 15 fungicidas
en vino realizada durante el 2010 en el noroeste de Espantildea Para la preparacioacuten de la muestra emplearon 10 mL
17
Capiacutetulo I Introduccioacuten
de vino diluiacutedos con el mismo volumen de agua ultrapura y un sorbente en forma de disco de silicona con un
volumen de 12 microL La recuperacioacuten de la extraccioacuten se calculoacute para vino tinto (Menciacutea) y vino blanco (Godello)
realizando tres replicas dentro de un mismo diacutea para los niveles de concentracioacuten 10 y 50 ngmL y nueve reacuteplicas
realizando el anaacutelisis en tres diacuteas consecutivos para el nivel de concentracioacuten de 25 ngmL y los resultados
obtenidos dan unos valores de recuperacioacuten dentro del rango 75-117 En el sistema LC-QTOF-MS el volumen
de inyeccioacuten fue de 15 microL
El otro meacutetodo de extraccioacuten mencionado anteriormente es QuEChERS estaacute en auge como meacutetodo de extracioacuten
de residuos de pesticidas en matrices como la del vino o la uva ya que incrementa la velocidad del anaacutelisis y reduce
el efecto de matriz BUERGE et al [46] seguido de una deteccioacuten mediante GC-MSMS realizaron una estapa
de extraccioacuten QuEChERS con alguna modificacioacuten acetato de sodio en lugar de cloruro soacutedico y acetato de etilo
en lugar de acetonitrilo utilizando 5 g de uva para la determinacioacuten de residuos de 4 pesticidas durante el antildeo
2016 Las recuperaciones de extraccioacuten resultaron ser valores entre 91-149 en uva a distintos niveles de
concentracioacuten 005 05 y 5 mgkg
Para la determinacioacuten de Ametoctradin HU et al [47] llevaron a cabo una extraccioacuten QuEChERS empleando 10
g de uva con deteccioacuten mediante el acoplamiento UPLC-MSMS utilizando un volumen de inyeccioacuten de 5 μL y
un flujo de fase moacutevil de 03 mLmin Las recuperaciones de la extraccioacuten se calcularon para tres niveles de
concentracioacuten 1 10 100 μgL de dos formas distintas en tres diacuteas consecutivos realizando 5 reacuteplicas al diacutea o en
dentro de un mismo diacutea realizando 15 reacuteplicas los resultados de todos los caacutelculos se encuentran dentro del rango
818-1001
Siguiendo con el mismo modo de extraccioacuten GUO et al [49] publicaron sus estudios para la determinacioacuten de
50 pesticidas y 12 adulterantes en vino tinto Para la extraccioacuten QuEChERS se utilizaron 10 mL de vino tinto con
10 mL de acetonitrilo y calcularon las recuperaciones para tres niveles de concentracioacuten 50 100 y 250 ngmL
encontraacutendose un rango de valores entre 75-120 El meacutetodo de deteccioacuten se llevoacute a cabo mediante un anaacutelisis
directo en tiempo real junto con espectrometriacutea de masas en tandem con un cuadrupolo (DART-MSMS) la
teacutecnica DART es un meacutetodo raacutepido para cribar y cuantificar los analitos de estudio que prescinde de la etapa de
separacioacuten cromatograacutefica
A continuacioacuten se recogen en la Tabla I3 los liacutemites de cuantificacioacuten (LOQs) de los analitos de intereacutes en este
trabajo caacutelculados por los diferentes meacutetodos encontrados en bibliografiacutea citados anteriormente en este apartado
18
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Tabla I3 LOQs de los analitos de intereacutes descritos para los distintos meacutetodos encontrados en la bibliografiacutea
Compuesto LOQs
Compuesto LOQs
V Blanco V Tinto Uva V Blanco V Tinto Uva
AME - - 0032μgkg[47] MET 86 μgL[43]
22 μgL[44]
89 μgL[43]
22 μgL[44]
5 μgL[45]
259 ngmL[49]
001mgkg[48]
BEN 02 μgL[44]
0001 mgL[50]
02 μgL[44]
001 μgL[45]
280ngmL[49]
005 mgkg[48] MYC 30 μgL[43]
08 μgL[44]
36 μgL[43]
10 μgL[44]
025 μgL[45]
331ngmL[49]
001 mgkg[48]
BOS 0065 mgL[50] 05 μgL[45]
1076 ngmL[49] 001 mgkg[48] PEN
56 μgL[43]
05 μgL[44]
49 μgL[43]
04 μgL[44]
220ngmL[49]
001 mgkg[48]
CAR - 386 ngmL[49] - PYC 0003mgL[50] 07 μgL[45] 001 mgkg[48]
CYP 15 μgL[43]
04 μgL[44]
0001 mgL[50]
22 μgL[43]
06 μgL[44]
312 ngmL[49]
001 mgkg[48] PYM 17 μgL[43] 22 μgL[43]
10 μgL[45] 001 mgkg[48]
DIM 18 μgL[43] 20 μgL[43] 001 mgkg[48] TEC 03 μgL[44]
03 μgL[44]
10 μgL[45]
160ngmL[49]
001 mgkg[48]
FEH 17 μgL[43] 22 μgL[43]
938 ngmL[49] 001 mgkg[48] TEF - 876ngmL[49] -
FEP - - 002mgkg[46] TBZ 15μgL [43] 29μgL[43] 001 mgkg[48]
FLU 005 μgL[45] TME - 25 μgL[45] 001 mgkg[48]
IMI 21 μgL[43] 22 μgL[43]
225 ngmL[49] - THI-M 92 μgL[43] 89 μgL[43] -
IPR 07 μgL[44] 07 μgL[44] 001 mgkg[48] TRI 10 μgL[44] 12 μgL[44] 001 mgkg[48]
MAN 0011 mgL[50] - -
5 DISTRIBUCIOacuteN DE PESTICIDAS EN VINOS COMERCIALES
En algunos de los meacutetodos descritos en el apartado anterior se procesaron vinos comerciales encontraacutendose
resultados positivos para muchos residuos de pesticidas y algunos hasta en gran concentracioacuten
ECONOMOU et al [43] mediante el meacutetodo LC-ESI-MSMS realizaron el anaacutelisis de 60 muestras de vino tinto
y blanco recogidos en supermercados locales en Grecia a lo largo de un antildeo El meacutetodo se habiacutea desarrollado
19
Capiacutetulo I Introduccioacuten
para la determinacioacuten de 46 pesticidas pero la mayoriacutea se encuentran con una concentracioacuten por debajo de
001mgL solo ocho plaguicidas se obtuvieron con resultados de concentracioacuten mayores Se muestran los
resultados en la Tabla I4 de los analitos de intereacutes en este estudio
Tabla I4 Nuacutemero de muestras positivas de distintos pesticidas en el anaacutelisis de 60 muestras de vino [43]
Compuesto Positivos con concentracioacuten entre 001-01
mgL
Positivos con concentracioacuten entre 01-1
mgL
PYM 2 (3) 2 (3)
MYC 2 (3) 0 (0)
CAR 11 (18) 7 (12)
THI-M 7 (12) 5 (8)
FEH 5 (8) 0 (0)
MET 1 (2) 0 (0)
Mediante el meacutetodo de microextraccioacuten en fase soacutelida-LC-TOF-MS FONTANA et al [44] aplicaron el
desarrollo del procedimiento a un total de 12 vinos joacutevenes elaborados en el 2010 y correspondientes a diferentes
denominaciones geograacuteficas del noroeste de Espantildea En la Tabla I5 se muestran los datos que han obtenido
Tabla I5 Determinacioacuten de fitosanitarios en vinos comerciales mediante Microextraccioacuten en fase soacutelida-LC-TOF-MS
Valores de concentracioacuten en ngmL [44]
Pesticidas
W 1
Albarintildeo
W5
Ribeiro
W6
Valdeorras
R1
Ribeira Sacra
R3
Ribeiro
R4
Valdeorras
MET 404plusmn06 223plusmn05 311plusmn007 25plusmn03 31plusmn03 74plusmn10
TRI nd nd 36plusmn06 nd nd ltLOQ
IPR 394plusmn03 324plusmn02 324plusmn02 071plusmn007 31plusmn02 28plusmn05
MYC nd nd nd ltLOQ 39plusmn02 nd
TEC 25plusmn01 nd nd nd nd nd
CYP 179plusmn08 ltLOQ ltLOQ 562plusmn002 083plusmn001 nd
BEN 042plusmn001 nd ltLOQ nd 032plusmn001 ltLOQ
ndNo detectados ltLOQ por debajo del liacutemite de cuantificacioacuten del meacutetodo los coacutedigos W y R corresponden respecti-vamente a los vinos blanco y tinto
20
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Por uacuteltimo PELAJIĆ et al [45] aplicaron su meacutetodo SPE dispersiva-GC-MS mediante el cual determinaron 25
residuos de plaguicidas en vino tinto a un total de 32 muestras de vino adquiridos en supermercados locales de
Croacia pero de diversos oriacutegenes de procedencia Los resultados que han obtenido se muestran en la Tabla I6
en doacutende un total de 15 plaguicidas han sido detectados y 7 de los cuales se encontraban en una alta
concentracioacuten
Tabla I6 Resultados de los vinos con positivos en pesticidas y sus concentraciones [45]
Vino Paiacutes Residuos de pesticidas (mgKg)
Tinto Francia DIM (0013) MET (0009) IPR (001)
Tinto Alemania BOS (0011)
Tinto Alemania IPR (0009)
Tinto Macedonia MET (0015)
Tinto Moldavia IPR (0008)
Tinto Polonia MET (004)
Tinto Rumania PYM (0058)
Tinto Espantildea TRI (0005) MET (0011)
Tinto Estados Unidos BOS (001)
Rosado Francia BOS (0005)
Blanco Chile TEC (0008)
Blanco Georgia MET (0057)
Blanco Alemania DIM (001) IPR (0054) PYM (0056)
Blanco Sudaacutefrica DIM (0011) IPR (0011)
21
Capiacutetulo II Objetivos y discusioacuten
CAPIacuteTULO II OBJETIVOS Y DISCUSIOacuteN
El objetivo principal que se persigue en este trabajo es el desarrollo de un meacutetodo analiacutetico raacutepido basado en la
extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) y deteccioacuten mediante cromatografiacutea de liacutequidos en la modalidad de UPLC
acoplada a la espectrometriacutea de masas en taacutendem (UPLC-MSMS) para la determinacioacuten multianalito de residuos
de fitosanitarios principalmente fungicidas aunque tambieacuten alguacuten insecticida en muestras de vino blanco y tinto
Para llevar a cabo la finalidad de lo dicho se consideran unos objetivos maacutes especiacuteficos
Minimizar la manipulacioacuten de la muestra para asiacute reducir la cantidad de disolventes y tiempo empleado
Optimizacioacuten de los factores que afectan en la extraccioacuten en la SPE tales como tipo y cantidad de
adsorbente volumen de eluyente etc
Estudio de las condiciones en UPLC-MSMS para una separacioacuten y cuantificacioacuten oacuteptimas
Caracterizacioacuten y validacioacuten del meacutetodo propuesto
Por uacuteltimo una vez cumplidos todos los objetivos anteriores y fijadas las condiciones oacuteptimas el meacutetodo
estudiado se aplica en el anaacutelisis de muestras de vino comercial (blanco y tinto) para determinar si se encuentran
residuos presentes asiacute como conocer en queacute concentracioacuten se encuentran los pesticidas objeto de este estudio
22
Capiacutetulo III Parte experimental
CAPIacuteTULO III PARTE EXPERIMENTAL
1 MATERIAL Y REACTIVOS
11 Material
Material de vidrio de uso comuacuten en el laboratorio vasos de precipitados matraces aforados etc
Micropipetas automaacuteticas de 20-200 microL 20-200 microL 100-1000 microL 1000-5000 microL Eppendorf
Puntas de plaacutestico para micropipetas
Encapsulador y desencapsulador
Soportes y pinzas
Viales de 15 mL transparentes para muestreador automaacutetico de cromatografiacutea (Sugelabor)
Caacutepsulas de aluminio con seacuteptum de Tefloacuten (Sugelabor) y tapones pre-slit para viales
Tubos y conectores de tefloacuten
Cartuchos de divinilbenceno-N-vinilpirrolidona 200 mg Oasis HLB Waters
Cartuchos de divinilbenceno-N-vinilpirrolidona funcionalizados con grupos amina cuaternaria 150 mg
Oasis MAX Waters
Cartuchos de divinilbenceno-N-vinilpirrolidona 60 mg Oasis HLB Waters
12 Reactivos y disolventes
Agua ultrapura Milli-Q
Aacutecido foacutermico (Sigma Aldrich) 95
Acetonitrilo (LichrosolvregMerck) Gradient grade for liquid chromatography
Metanol (LichrosolvregMerck) Gradient grade for liquid chromatography
Etanol (LichrosolvregMerck) Gradient grade for liquid chromatography
13 Patrones
Ametoctradin (AME) Dr Ehrenstrorfer 990
Benalaxyl (BEN) Pestanal Sigma- Aldrich 999
23
Capiacutetulo III Parte experimental
Boscalid (BOS) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Carbendazim (CAR) Pestanal Sigma- Aldrich 992
Cyprodinil (CYP) Pestanal Sigma- Aldrich 998
Dimethomorph (DIM) mezcla de isoacutemeros E + Z Pestanal Sigma- Aldrich 989
Fenhexamid (FEH) Pestanal Sigma- Aldrich 997
Fenpropidin (FEP) Dr Ehrenstrorfer 980
Fluopicolide (FLU) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Imidacloprid (IMI) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Iprovalicarb (IPR) mezcla de isoacutemeros Pestanal Sigma- Aldrich 985
Mandipropamid (MAN) Pestanal Sigma- Aldrich 991
Metalaxyl (MET) Pestanal Sigma- Aldrich 990
Myclobutanil (MYC) Pestanal Sigma- Aldrich 994
Penconazole (PEN) Pestanal Sigma- Aldrich 991
Pyraclostrobin (PYC) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Pyrimethanil (PYM) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Tebuconazol (TEC) Pestanal Sigma- Aldrich 996
Tebufenozide (TEF) Dr Ehrenstrorfer 988
Thiabendazole (TBZ) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Thiamethoxam (TME) Pestanal Sigma- Aldrich 996
Thiophanate-methyl (THI-M) Dr Ehrenstrofer 990
Triadimenol (TRI) Mezcla de diastereoisoacutemeros Pestanal Sigma- Aldrich 994
14 Patrones internos
Carbendazim-d3 (CAR-d3) Pestanal Sigma- Aldrich 998
Cyprodinil-d5 (CYP-d5) Pestanal Sigma- Aldrich
Imidacloprid-d4 (IMID-d4) Pestanal Sigma- Aldrich
Metalaxyl 13C6 (MET13C6) Pestanal Sigma-Aldrich 99
24
Capiacutetulo III Parte experimental
15 Gases
Nitroacutegeno 99999 como gas de colisioacuten en el espectroacutemetro de masas
Nitroacutegeno en los sistemas de concentracioacuten y secado por corriente de nitroacutegeno de los cartuchos SPE
2 INSTRUMENTACIOacuteN
Balanza analiacutetica de precisioacuten Sartorius
Granatario Sartorius
Bantildeo de ultrasonidos P-Selecta
Equipo de purificacioacuten de agua Millipore modelo Milli-Q gradient A-10ZMQSSVOT4
Estacioacuten de concentracioacuten por corriente de nitroacutegeno Mini-Vap Supelco
Sistema de secado de cartuchos de SPE por corriente de nitroacutegeno VisiDry Supelco
Sistema distribuidor de vaciacuteo Visiprep reg Supelco
Cromatoacutegrafo de liacutequidos de ultra-alta resolucioacuten Waters AcquityUPLC reg y espectroacutemetro de masas
Acquity TQD con analizador de triple quadrupolo (QqQ) equipado con una fuente de ionizacioacuten a
presioacuten atmosfeacuterica del tipo Z-spray (ESI)
3 PREPARACIOacuteN DE LAS DISOLUCIONES
Los patrones de pesticidas se prepararon individualmente a partir de los compuestos soacutelidos comerciales por
pesada excepto en el caso del fenpropidin (FEP) que se preparoacute a partir del compuesto liacutequido comercial Estos
compuestos soacutelidos se disolvieron en metanol y se obtuvieron unas disoluciones iniciales con concentraciones
recogidas en la Tabla III1
25
Capiacutetulo III Parte experimental
Tabla III1 Concentracioacuten de las disoluciones patroacuten stock
Compuesto Concentracioacuten (microgmL) Compuesto Concentracioacuten (microgmL)
AME 102201 MET 118912
BEN 138330 MYC 102017
BOS 99474 PEN 129791
CAR 17105 PYC 104581
CYP 131075 PYM 141386
DIM 103009 TEC 134729
FEH 99584 TEF 137769
FEP 100000 TBZ 105928
FLU 126859 TME 112283
IMI 101123 THI-M 124202
IPR 106739 TRI 118933
MAN 101021
4 LAVADO DEL MATERIAL
La limpieza del material de vidrio utilizado en el laboratorio se realizoacute utilizando jaboacuten y aclarando con agua de
grifo Luego en primer lugar se realiza un enjuague con agua Milli-Q finalmente un segundo enjuague con
acetona para eliminar posibles restos de compuestos orgaacutenicos y se deja secar sobre papel
Para la limpieza de los conectores de tefloacuten empleados en el proceso de SPE se introducen en un vaso de
precipitados con metanol y este en un bantildeo de ultrasonidos durante 10 minutos Al finalizar con el bantildeo de
ultrasonidos se realiza un enjuague con acetona y se pone a secar
5 EXTRACCIOacuteN DE MUESTRAS MEDIANTE SPE
El meacutetodo de extraccioacuten utilizado para la determinacioacuten de pesticidas fue la extraccioacuten en fase soacutelida (SPE)
mediante cartuchos Oasis HLB de 200 mg A continuacioacuten se describe el protocolo de extraccioacuten en las
condiciones oacuteptimas
26
Capiacutetulo III Parte experimental
1 Acondicionamiento del cartucho Oasis HLB de 200 mg con 2 mL de acetonitrilo seguidos de otros 2 mL de
vino sinteacutetico formado por la mezcla etanolagua MilliQ (1288)
2 Paso de la muestra 2 mL de vino diluiacutedos con 2 mL de agua MilliQ a traveacutes del cartucho por gravedad
3 Lavado del cartucho con 2 mL de agua MilliQ
4 Secado del cartucho durante 45 minutos en el VisiDry mediante el paso de una corriente de nitroacutegeno
5 Elucioacuten del cartucho con la mezcla metanolacetonitrilo en proporcioacuten 2080 hasta un volumen final de 2
mL
6 Anaacutelisis mediante cromatografiacutea liacutequida acoplada a espectrometriacutea de masas en taacutendem UPLC-MSMS
(volumen de inyeccioacuten 15 microL)
Representacioacuten esquematizada en la Figura III1
Figura III1 Extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) de las muestras de vino
27
Capiacutetulo III Parte experimental
6 CONDICIONES DE DETERMINACIOacuteN MEDIANTE UPLC-MSMS
En la Tabla III2 se indican las condiciones utlizadas en la determinacioacuten de los pesticidas de intereacutes mediante
LC-MSMS y en la Tabla III3 se muestra el gradiente de la fase moacutevil utilizado para la separacioacuten
cromatograacutefica
Tabla III2 Condiciones experimentales de determinacioacuten en LC-MSMS
UPLC Acquity UPLC-I-Class IVD System
bull Columna cromatograacutefica Zorbax Eclipse Plus C18 Rapid Resolution HD
Fase estacionaria C18
Dimensiones 21 x 50 mm
Tamantildeo de partiacutecula 18 microm
Temperatura del horno 40ordmC
bull Inyector
Volumen de inyeccioacuten 15 microL
bull Fase moacutevil
Flujo 04 mLmin
Fase acuosa (A) Agua MilliQ con 01 aacutecido foacutermico
Fase orgaacutenica (B) Acetonitrilo con 01 aacutecido foacutermico
MSMS WatersXevo TQD
Modo de ionizacioacuten ESI positivo
Voltaje del capilar 15 kV
Voltaje de cono 50 V
Temperatura de gas de secado (N2) 450ordmC
Flujo de gas de secado (N2) 1000 Lh
Modo de adquisicioacuten Centroide
Tabla III3 Gradiente de fase moacutevil utilizado en la separacioacuten cromatograacutefica (LC)
Tiempo min 0 13 28 64 75 76 10
A 98 50 50 0 0 98 98
B 2 50 50 100 100 2 2
28
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
CAPIacuteTULO IV RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
1 IDENTIFICACIOacuteN DE LOS COMPUESTOS
Para empezar el estudio en primer lugar se realizoacute la caracterizacioacuten de las condiciones de determinacioacuten de los
analitos en el modo Multiple Reaction Monitoring (MRM) mediante UPLC-ESI-MSMS Para llevarla a cabo se
tomaron patrones individuales de cada fitosanitario y mediante infusioacuten se estudiaron las posibles transiciones y
voltajes oacuteptimos para su determinacioacuten (Tabla IV1)
La ionizacioacuten por electrospray (ESI) se estudioacute tanto en modo positivo como en modo negativo encontraacutendose
que para todos los pesticidas de nuestro intereacutes se obteniacutea sentildeal en el modo positivo mientras el modo negativo
no presentaba respuesta significativa
A continuacioacuten se estudia el efecto del voltaje de cono en la respuesta del ioacuten molecular [M+H]+ aumentaacutendolo
hasta alcanzar el valor maacuteximo de la sentildeal correspondiente a dicho ioacuten y luego se optimiza la energiacutea de colisioacuten
variaacutendola para cada analito hasta obtener la sentildeal de mayor intensidad para cada uno de los iones producto Por
uacuteltimo una vez optimizado el voltaje de cono y la energiacutea de colisioacuten se seleccionan las dos transiciones maacutes
intensas para llevar a cabo la cuantificacioacuten y cualificacioacuten de cada analito en modo MRM Este procedimiento se
realizoacute para la totalidad de los compuestos confirmando los datos obtenidos con los facilitados por la base de
datos Quanpedia que estaacute disponible en el software del equipo utilizado para algunos de los compuestos
considerados
Compuesto Tr (min) Ion precursor (mz Da)
Voltaje de cono (V)
Ion producto 1 (CEv)
cuantificacioacuten
Ion producto 2 (CEv)
cualificacioacuten
Relacioacuten IP2IP1
AME 325 2760 60 176 (35) 70 (50) 016
BEN 485 3261 26 148 (20) 91 (34) 067
BOS 387 3429 41 140 (20) 307 (20) 011
CAR 167 1921 33 160 (18) 132 (28) 014
CYP 311 2260 56 93 (33) 108 (25) 061
DIM 322 3881 40 301 (20) 165 (30) 057
FEH 386 3021 41 97 (22) 55 (38) 044
FEP 257 2742 55 147 (28) 86 (28) 093
FLU 401 3830 40 173 (20) 365 (15) 010
IMI 218 2561 34 209 (15) 175 (20) 091
IPR 358 3211 28 119 (16) 203 (10) 042
Tabla IV1 Tiempos de retencioacuten (Tr) relacioacuten de iones precursores (mz) voltaje de cono (V) energiacuteas de colisioacuten (CE) y relacioacuten de intensidades entre transiciones (IP2IP1)
29
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Compuesto Tr (min) Ion precursor (mz Da)
Voltaje de cono (V)
Ion producto 1 (CEv)
cuantificacioacuten
Ion producto 2 (CEv)
cualificacioacuten
Relacioacuten IP2IP1
MAN 392 4120 25 328 (16) 125 (35) 063
MET 283 2801 26 220 (13) 192 (17) 057
MYC 365 2891 34 70 (18) 125 (32) 029
PEN 417 2840 34 70 (16) 159 (34) 031
PYC 523 3881 31 194 (12) 163 (25) 066
PYM 266 2000 51 107 (24) 82 (24) 071
TEC 397 3080 40 70 (22) 125 (40) 007
TEF 473 3531 19 133 (20) 297 (8) 072
TBZ 182 2020 51 175 (25) 131 (30) 062
TME 203 2920 28 211 (12) 132 (22) 047
THI-M 257 3430 28 151 (46) 93 (19) 0001
TRI 319 2961 21 70 (10) 99 (15) 013
El dwell time para cada una de las transiciones se ajustoacute de manera automaacutetica por el software (MassLinx) con
objeto de obtener doce puntos espectrales por compuesto tomando un valor promedio de cuatro segundos como
ancho de pico a liacutenea de base
2 CARACTERIZACIOacuteN DEL PROCEDIMIENTO DE DETERMINACIOacuteN (UPLC-ESI-
MSMS)
Una vez optimizados los paraacutemetros que afectan a la separacioacuten cromatograacutefica (UPLC) y a la determinacioacuten por
espectrometriacutea de masas en taacutendem (MSMS) se lleva a cabo la evaluacioacuten de la repetibilidad de inyeccioacuten y
determinacioacuten en esas condiciones Se expresa por medio de la desviacioacuten estaacutendar relativa (RSD) paraacutemetro que
nos indica el grado de correlacioacuten que existe entre varias medidas del mismo patroacuten realizadas por el mismo
operador en el laboratorio y en el mismo equipo de medida a lo largo de un diacutea Para el estudio se realizan diez
inyecciones con volumen de 15 microL de dos patrones con distintos niveles de concentracioacuten 5 y 20 ngmL Los
datos de RSD (Tabla IV2) para las aacutereas de pico de los analitos se situacutean para el nivel de concentracioacuten 5 ngmL
en el rango 2-13 y en el nivel de concentracioacuten 20 ngmL en el rango 1-7
30
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten Tabla IV2 Desviacioacuten estaacutendar relativa (RSD) del aacuterea de pico (transicioacuten de cuantificacioacuten) para evaluar la repetivilidad del proceso de LC-MSMS
Compuesto RSD
5 ngmL
RSD
20 ngmL Compuesto
RSD
5 ngmL
RSD
20 ngmL
AME 5 2 MET 3 2
BEN 2 2 MYC 9 2
BOS 4 5 PEN 4 4
CAR 4 2 PYC 3 1
CYP 5 7 PYM 7 3
DIM 6 5 TEC 3 2
FEH 7 4 TEF 4 2
FEP 4 2 TBZ 2 1
FLU 5 3 TME 6 6
IMI 13 7 THI-M a 6
IPR 8 2 TRI 8 6
MAN 3 2
A continuacioacuten tambieacuten se evaluoacute la repetibilidad de los tiempos de retencioacuten (Tr) para diez inyecciones de
patrones a los dos niveles de concentracioacuten 5 y 20 ngmL situaacutendose las RSD para todos los compuestos en el
rango 01-03 En base a este dato la ventana de tiempo en la que se registran las transiciones de MRM de cada
compuesto se fijoacute en 05 min lo que es lo mismo 025 min alrededor del valor medio de su tiempo de retencioacuten
Por otro lado la linealidad del meacutetodo se estudioacute a nueve niveles de concentracioacuten diferentes comprendidos ente
los niveles 05 ngmL y 200 ngmL mediante la inyeccioacuten de disoluciones patroacuten de los distintos compuestos de
estudio Se realizoacute una evaluacioacuten sin y otra con patroacuten interno (IS) antildeadiendo una concentracioacuten fija de patrones
internos a nivel de 25 ngmL y pudimos observar que los resultados mejoran notablemente al realizar una
correccioacuten con el IS En la Tabla IV3 se muestran los coeficientes de determinacioacuten (R2) obtenidos al realizar la
correccioacuten mediante IS observando que para todos los compuestos excepto para THI-M y para TRI los
coeficientes de correlacioacuten son superiores a 0990 por lo que existe una respuesta lineal en el rango de
concentraciones que hemos estudiado
Aparte del estudio de la linealidad tambieacuten se han estudiado los liacutemites de cuantificacioacuten instrumentales del
meacutetodo (LOQs) Para ello los LOQs se evaluacutean como la miacutenima cantidad de analito que origina una sentildeal 10
veces superior a la desviacioacuten estaacutendar del ruido Los valores anteriores se estimaron a partir del patroacuten de
a no evaluado ya que se encuentra por debajo del liacutemite de cuantificacioacuten del meacutetodo
31
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
concentracioacuten maacutes baja que presenta un pico con una relacioacuten SN superior a 10 En la Tabla IV3 tambieacuten se
recogen estos LOQs en doacutende podemos ver que variacutean en el rango 01-1 ngmL excepto para THI-M que se
desviacutea a valores de 10 ngmL
Tabla IV3 Coeficientes de determinacioacuten (R2) y liacutemites de cuantificacioacuten instrumentales (LOQs) de los analitos para nueve
niveles de concentracioacuten de 05 a 200 ngmL
Compuesto Coeficiente de
correlacioacuten (R2)
LOQs (ngmL) Compuesto
Coeficiente de correlacioacuten
(R2)
LOQs (ngmL)
AME 09951 04 MET 09933 01
BEN 09949 01 MYC 09950 04
BOS 09979 02 PEN 09945 02
CAR 09923 02 PYC 09955 02
CYP 09878 02 PYM 09931 01
DIM 09938 07 TEC 09958 05
FEH 09959 05 TEF 09957 01
FEP 09931 01 TBZ 09942 02
FLU 09965 02 TME 09903 01
IMI 09979 05 THI-M 09580 100
IPR 09938 01 TRI 09867 07
MAN 09979 01
En la Figura IV1 y Figura IV2 se muestran dos ejemplo de curvas de calibrado para dos compuestos IMI y
MAN respectivamente
Figura IV1 Curva de calibrado y coeficiente de determinacioacuten de IMI para UPLC-ESI-MSMS
32
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Figura IV2 Curva de calibrado y coeficiente de determinacioacuten de MAN para UPLC-ESI-MSMS
3 ESTUDIO DEL MEacuteTODO SPE
La extraccioacuten de pesticidas se llevoacute a cabo mediante extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) en doacutende se realizaron
diversos estudios con diferentes condiciones para dar con las oacuteptimas En primer lugar se llevaron a cabo los
experimentos de retencioacuten y elucioacuten sobre dos tipos distintos de adsorbentes cartuchos OASIS HLB (200mg) y
cartuchos OASIS MAX (150 mg) como fases potenciales en las que llevar a cabo la extraccioacuten de manera
selectiva Los dos tipos de cartuchos son de fase reversa pero difieren entre siacute en el fundamento de retencioacuten de
los analitos En los cartuchos OASIS HLB (200 mg) formados por divinilbenceno-N-vinilpirrolidona (DVB-VP)
la retencioacuten de los diferentes analitos tiene lugar por interacciones π-π o de Van der Waals mientras que los
cartuchos OASIS MAX (150 mg) que se probaron como alternativa para mejorar la selectividad en la extraccioacuten
cuentan con un adsorbente polimeacuterico de modo mixto formado por divinilbenceno-N-vinilpirrolidona (DVB-VP)
funcionalizado con grupos amina cuaternaria siendo el fundamento de la extraccioacuten la combinacioacuten de las
propiedades adsorbentes del cartucho HLB con un mecanismo adicional de intercambio ioacutenico (anioacutenico) [27]
Algunos autores han empleado este mecanismo para mejorar la selectividad de la extraccioacuten de forma que en la
etapa de elucioacuten ciertos pigmentos del vino quedan fuertemente retenidos en el adsorbente a diferencia de lo que
ocurre con los adsorbentes de fase reversa [51]
Para llevar a cabo la eleccioacuten del tipo de adsorbente se realizaron pruebas con 10 mL de vino blanco y tinto
conectando en serie los dos tipos de cartuchos HLB (200 mg) y MAX (150 mg) a un segundo cartucho OASIS
HLB (60 mg) La elucioacuten de los analitos se hace de forma independiente para cada cartucho y se evaluacutea si los
analitos pasan del primer cartucho hacia el segundo cartucho es decir si se supera el volumen de corte o si por
33
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
otro lado se quedan retenidos en el primero y no eluyen hacia el segundo En estas pruebas de estudio
preliminares de preparacioacuten de la muestra no se ha incluido el CYP
En la Figura IV3 podemos ver la eficacia de la extraccioacuten para vino blanco y tinto que obtenemos empleando
cartuchos OASIS MAX (150 mg) conectados en serie con cartuchos OASIS HLB (60 mg) realizando la
extraccioacuten de tres fracciones de 2 mL cada una del cartucho OASIS MAX (150 mg) y una cuarta fraccioacuten de 2
mL del cartucho OASIS HLB (60 mg)
Por otro lado en la Figura IV4 podemos ver un graacutefico de columnas en el cual comparamos la eficacia de
extraccioacuten de los cartuchos OASIS HLB (200 mg) con dos disolventes de elucioacuten distintos En dicho graacutefica el
acroacutenimo de cada compuesto consta de dos barras cuyo significado es el siguiente la barra de la izquierda indica
la eficacia de la extraccioacuten empleando acetonitrilo (ACN) como disolvente de elucioacuten y la barra de la derecha
indica la eficacia de la extraccioacuten empleando la combinacioacuten MetanolAcetonitrilo (2080) (MeOHACN) como
disolvente de elucioacuten Para este adsorbente no se detectoacute ninguacuten compuesto en la extraccioacuten del segundo
cartuchos OASIS HLB (60 mg) empleando 2 mL de metanol
Figura IV3 Distribucioacuten de los compuestos en cada fraccioacuten obtenidas con cartuchos OASIS MAX (150 mg)
utilizando 10 mL de vino tinto y blanco sacando cuatro fracciones de 2 mL cada una con metanol como
disolvente de elucioacuten
34
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Figura IV4 Distribucioacuten de los compuestos en cada fraccioacuten obtenidas con cartuchos OASIS HLB (200 mg) utilizando 10
mL de vino tinto y blanco sacando 3 fracciones de 2 mL cada una con acetonitrilo (ACN) (columna de la izquierda) y una
combinacioacuten MetanolAcetonitrilo (2080) (MeOHACN) (columna de la derecha) como disolventes de elucioacuten
A la vista de los resultados reflejados en las graacuteficas podemos afirmar que cuando se utiliza el cartucho OASIS
HLB (200 mg) eluyendo con acetonitrilo o la combinacioacuten metanolacetonitrilo (2080) los extractos son limpios
y se eluyen la mayoriacutea de los compuestos en la primera fraccioacuten Pero utilizando acetonitrilo como disolvente de
elucioacuten se encuentran problemas en la extraccioacuten de CAR FEH y TBZ para los que es necesario emplear un
volumen mayor de elucioacuten o bien seleccionar otro disolvente de elucioacuten como es la combinacioacuten
metanolacetonitrilo
35
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Por otro lado los extractos en los cartuchos OASIS MAX (150 mg) son maacutes limpios incluso utilizando metanol en
la elucioacuten pero se detecta la presencia de CAR FEP TBZ y TME en el segundo cartucho OASIS HLB (60 mg)
significando la rotura del primer cartucho para dichos analitos considerando un volumen de 10 mL de vino Los
demaacutes compuestos se podriacutean recuperar cuantitativamente en la primera fraccioacuten sacada pero la peacuterdida de estos
compuestos inclina la eleccioacuten hacia los cartuchos OASIS HLB (200 mg) con metanolacetonitrilo (2080) como
disolvente de elucioacuten para continuar con el estudio
Una vez fijado el adsorbente y el volumen de elucioacuten se prueba la eficacia de la SPE independiente de los efectos
de matriz En la Tabla IV4 se muestran las recuperaciones de la SPE tomando 10 mL de vino blanco y tinto
con un nivel de adicioacuten de 15 ngmL sacando una sola fraccioacuten de 2 mL con la combinacioacuten
metanolacetonitrilo (2080) y n=3 reacuteplicas
Tabla IV4 Recuperaciones (R plusmn SD) de SPE para 10 mL de vino (blanco y tinto) con un nivel de adicioacuten de 15 ngmL y
n=3 reacuteplicas
Compuesto Vino Tinto
R plusmn SD
Vino Blanco
R plusmnSD Compuesto
Vino Tinto
R plusmn SD
Vino Blanco
R plusmn SD
AME 82 plusmn 7 100 plusmn 1 MET 92 plusmn 6 94 plusmn 3
BEN 89 plusmn 6 97 plusmn 3 MYC 90 plusmn 9 86 plusmn 4
BOS 95 plusmn 1 100 plusmn 2 PEN 84 plusmn 10 103 plusmn 3
CAR 91 plusmn 6 104 plusmn 6 PYC 86 plusmn 5 106 plusmn 1
CYP 81 plusmn 7 102 plusmn 3 PYM 87 plusmn 12 94 plusmn 3
DIM 97 plusmn 3 86 plusmn 4 TEC 83 plusmn 10 103 plusmn 1
FEH 89 plusmn 3 88 plusmn 3 TEF 84 plusmn 5 108 plusmn 4
FEP 91 plusmn 7 104 plusmn 3 TBZ 88 plusmn 7 92 plusmn 5
FLU 91 plusmn 2 97 plusmn 4 TME 101 plusmn 1 110 plusmn 13
IMI 117 plusmn 8 101 plusmn 11 THI-M 85 plusmn 9 110 plusmn 4
IPR 89 plusmn 7 112 plusmn 4 TRI 85 plusmn 10 110 plusmn 4
MAN 88 plusmn 2 87 plusmn 2
Algunos compuestos de la matriz en el vino pueden competir con los analitos durante el proceso de ionizacioacuten
que tiene lugar en la interfase entre UPLC-MSMS por lo que para la cuantificacioacuten del rendimiento de la
ionizacioacuten por electrospray (ESI) se estudian los efectos de matriz (EM) para vino blanco y tinto considerando
dos voluacutemenes de muestra distintos 2 y 10 mL y un volumen final del extracto de 2 mL En la Tabla IV5 se
36
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
exponen los valores para cada compuesto notando que al aumentar el volumen de muestra tambieacuten se aumentan
los efectos de matriz y eacutestos siempre son mayores en vino tinto Para el caacutelculo de estos efectos de matriz (EM)
se emplea la siguiente ecuacioacuten
Donde Am Ab y Ap representan el aacuterea de pico en la sentildeal medida del analito en el extracto de la muestra con
adicioacuten en el extracto de la muestra sin adicioacuten (o blanco) y en el patroacuten antildeadido respectivamente El nivel de
adicioacuten en extracto fue de 50 ngmL por compuesto
Tabla IV5 Efectos de matriz para vino blanco y tinto con un volumen inicial de 2 y 10 mL evaluados para un nivel de adicioacuten de 50 ngmL en extracto
Compuesto
Vino blanco Vino tinto
2 mL 10 mL 2mL 10 mL
EM () CV () EM () CV () EM () CV () EM () CV()
AME 93 3 95 2 99 3 101 7
BEN 99 1 93 2 101 3 100 6
BOS 97 5 98 1 108 2 96 0
CAR 62 2 50 3 58 2 55 6
CYP 94 3 91 1 97 2 95 7
DIM 105 2 95 3 100 3 108 3
FEH 100 4 102 4 105 4 94 3
FEP 95 3 88 2 96 2 92 7
FLU 98 2 93 2 106 1 101 2
IMI 84 4 46 3 48 10 18 8
IPR 99 3 92 3 105 1 100 7
MAN 100 1 94 3 109 4 107 2
MET 98 1 89 1 99 2 99 6
MYC 105 1 100 1 103 2 96 9
PEN 98 3 97 1 101 3 99 10
PYC 98 2 92 3 102 2 98 5
PYM 95 2 87 1 94 3 85 12
TEC 95 3 99 1 101 1 102 10
TEF 99 1 92 3 101 2 104 5
TBZ 45 0 40 5 43 2 30 7
TME 60 6 19 16 36 4 16 1
THI-M 107 2 109 2 103 1 96 9
TRI 97 3 118 4 104 5 117 10
37
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Al observar los resultados podemos ver que la mayoriacutea de los compuestos dan resultados de EM en torno al
100 lo que significa que no sufren una modificacioacuten importante en la eficacia de ionizacioacuten para las muestras
con respecto a los patrones Pero tambieacuten por el contrario podemos observar que algunos compuestos como
por ejemplo en el caso de CAR TBZ IMI y TME experimentan una gran supresioacuten de sentildeal es decir EM bajos
que se acentuacutean al aumentar el volumen de muestra La atenuacioacuten en la eficacia de variacioacuten para estos cuatro
compuestos no solo se ve incrementada con el volumen de muestra si no que ademaacutes es maacutes significativa para
vino tinto que para vino blanco En base a estos resultados aunque la eficacia de la SPE fue cuantitativa para
muestras de 10 mL se limitoacute el volumen de muestra a extraer a 2 mL
Las condiciones oacuteptimas de extraccioacuten se esquematizan en un resumen en la Figura IV5
Figura IV5 Condiciones optimizadas para la extraccioacuten de pesticidas en vino
38
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
4 CARACTERIZACIOacuteN DEL MEacuteTODO DE DETERMINACIOacuteN
Con las condiciones de extraccioacuten y determinacioacuten citadas anteriormente se llevaron a cabo pruebas de
recuperaciones absolutas de los compuestos a nivel de adicioacuten de 5 y 20 ngmL sobre las muestras Para cada
muestra y nivel de adicioacuten se realizaron tres reacuteplicas de las muestras con adicioacuten y los blancos aliacutecuotas de las
mismas muestras sin adicioacuten se procesaron en duplicado Los IS se antildeadieron a nivel de 25 ngmL y cada uno se
utiliza para corregir unos determinados compuestos CAR-d3 se emplea para CAR y TBZ el CYP-d5 para CYP y
PYM el IMID-d4 para IMI y TME y el MET13C6 para el resto de compuestos Los resultados para vino blanco
comprenden en el nivel de concentracioacuten 5 ngmL el rango entre 79-122 y en el nivel de concentracioacuten 20
ngmL el rango entre 84-109 Por otro lado en el caso del vino tinto las recuperaciones se encuentran para el
nivel de concentracioacuten 5 ngmL en el rango 67-112 y para el nivel de concentracioacuten 20 ngmL entre el rango
73-132 Los resultados obtenidos en las pruebas con vino blanco y vino tinto se muestran en la Tabla IV6
Los resultados son satisfactorios ya que la mayoriacutea de los compuestos se ajustan en todos los casos al rango de
recuperacioacuten entre 70-120 Para la realizacioacuten de estas pruebas se ha eliminado de los resultados el compuesto
THI-M debido a que las concentraciones utilizadas se encuentran en el liacutemite o por debajo del LOQ en los
experimentos con muestras adicionadas a 5 ngmL
Para calcular las recuperaciones (R) se recurrioacute a la siguiente ecuacioacuten
Donde Cm Cb y Cp son la concentracioacuten medida de analito en el extracto de la muestra con adicioacuten en el extracto
de la muestra sin adicioacuten (o blanco) y en el patroacuten antildeadido respectivamente
Tabla IV6 Recuperaciones (R) para vino tinto y vino blanco evaluadas para dos niveles de concentracioacuten 5 y 20 ngmL
Compuesto
Vino tinto Vino Blanco
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
AME 97 3 105 6 104 9 96 5
BEN 88 11 105 3 101 1 98 4
BOS 91 13 110 2 88 13 97 3
39
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Compuesto
Vino tinto Vino blanco
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
CAR 99 6 99 3 122 3 109 1
CYP 91 2 111 1 101 4 100 6
DIM 112 3 110 9 102 24 99 11
FEH 91 4 108 0 102 20 95 2
FEP 89 8 102 7 94 5 84 1
FLU 95 10 104 4 109 5 100 8
IMI 73 11 115 9 80 13 100 2
IPR 84 13 99 3 111 3 99 4
MAN 88 22 112 8 112 3 99 4
MET 99 3 106 5 106 3 98 2
MYC 84 9 106 13 88 17 86 3
PEN 84 9 102 5 84 8 90 5
PYC 96 6 105 4 100 2 95 4
PYM 90 12 112 14 106 4 97 1
TEC 89 8 101 6 98 12 94 1
TEF 93 10 102 5 107 2 97 3
TBZ 94 17 115 8 79 5 106 2
TME 67 2 101 7 84 18 90 11
THI-M ne - 74 7 ne - 89 24
TRI 88 12 97 6 102 6 92 2
ne No evaluado El nivel de adicioacuten es inferior al LOQ del meacutetodo para este compuesto
Para estudiar la reproducibilidad del meacutetodo analiacutetico global (correspondientes a los datos de preparacioacuten de
muestra y determinacioacuten) es decir la concordancia de varias medidas realizadas en diacuteas diferentes se procedioacute a la
extraccioacuten en las condiciones oacuteptimas tanto de vino blanco como tinto Las extracciones y determinaciones se
realizaron durante tres diacuteas consecutivos realizando tres reacuteplicas por vino y por diacutea con un nivel de adicioacuten en
muestra de 10 ngmL un blanco de muestra cada diacutea En la Tabla IV7 se muestran los resultados como
recuperaciones (R) en condiciones de reproducibilidad obtenidos para ambos tipos de vino dando valores entre
64-116 para muestras de vino blanco y valores situados entre 68-108 para muestras de vino tinto con la
excepcioacuten del TME para el que se ha obtenido un valor no aceptable en cuanto a la exactitud medida en
condiciones de reproducibilidad A la vista de los resultados obtenidos con estas pruebas se considera necesario el
empleo de IS adicionales para la mejora en la exactitud del meacutetodo para algunos compuestos por ejemplo el
TME
40
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Tabla IV7 Recuperaciones en condiciones de reproducibilidad (R plusmn SD) para vino blanco y tinto
Compuesto
Vino tinto Vino blanco
R
10 ngmL CV ()
R
10 ngmL CV ()
AME 90 5 101 13
BEN 96 5 102 7
BOS 97 6 100 8
CAR 97 3 94 5
CYP 103 3 105 12
DIM 104 7 106 8
FEH 90 16 83 15
FEP 91 5 90 4
FLU 103 7 102 6
IMI 99 14 101 14
IPR 91 5 100 13
MAN 108 5 108 13
MET 101 5 101 5
MYC 105 16 102 14
PEN 96 11 92 10
PYC 99 12 97 12
PYM 102 4 116 8
TEC 99 9 97 16
TEF 99 8 105 11
TBZ 68 4 84 5
TME 47 13 64 10
THI-M 107 11 104 16
TRI 95 14 103 4
En la Tabla IV8 se muestran los liacutemites de cuantificacioacuten (LOQs) del meacutetodo del meacutetodo de SPE-UPLC-ESI-
MSMS obtenidos para los diferentes pesticidas Los valores obtenidos son ideacutenticos a los LOQs instrumentales
excepto en el caso de aquellos compuestos para los que se observaronfuertes efectos de matriz (Tabla IV5) En
estos casos (CAR TBZ IMI y TME) los LOQs del meacutetodo se incrementan seguacuten la atenuacioacuten de sentildeal
observada
41
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Tabla IV8 Liacutemites de cuantificacioacuten LOQs (ngmL) del meacutetodo obtendos para cada compuesto
Compuesto LOQ (ngmL) Compuesto LOQ (ngmL)
AME 04 MET 01
BEN 01 MYC 04
BOS 02 PEN 02
CAR 03 PYC 02
CYP 02 PYM 01
DIM 07 TEC 05
FEH 05 TEF 01
FEP 01 TBZ 04
FLU 02 TME 02
IMI 06 THI-M 10
IPR 01 TRI 07
MAN 01
5 APLICACIOacuteN A MUESTRAS DE VINO COMERCIALES
Una vez optimizadas las condiciones del meacutetodo y estudiadas las caracteriacutesticas del meacutetodo desarrollado se aplicoacute
a la determinacioacuten de los compuestos de intereacutes estudiados en muestras de vino blanco y vino tinto comerciales
producidos en diferentes paiacuteses En la Tabla IV9 se muestra el paiacutes de origen de cada muestra comercial
identificadas con un coacutedigo alfanumeacuterico y antildeo de produccioacuten
42
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Tabla IV9 Coacutedigo asignado para los diferentes vinos comerciales blancos y tintos analizados Indicando el paiacutes de origen y
antildeo de produccioacuten
Coacutedigo Denominacioacuten de origen Antildeo de produccioacuten
bull Vinos Blancos
W1 Alemania 2014
W2 Espantildea 2012
W3 Espantildea 2016
W4 Portugal Desconocido
W5 Francia 2015
W6 Francia 2015
W7 Espantildea 2016
bull Vinos Tintos
R1 Espantildea 2015
R2 Sudaacutefrica 2015
R3 Chile 2015
R4 Francia 2015
R5 China Desconocido
R6 Espantildea 2016
R7 Australia 2014
R8 Francia 2013
R9 Francia 2015
A continuacioacuten en la Tabla IV10 y la Tabla IV11 se recogen los resultados obtenidos en el anaacutelisis de las
muestras comerciales Los datos obtenidos corresponden en todos los casos al uso de patrones de calibracioacuten
como teacutecnica de cuantificacioacuten
Tabla IV10 Concentracioacuten (ngmL) encontradas en las diferentes muestras de vino blanco comercial analizadas mediante
SPE-UPLC-MSMS n=2 reacuteplicas y al final el sumatorio de las concentraciones encontradas
Compuesto W1 W2 W3 W4 W5 W6 W7
AME 04 nd nd nd 41 nd nd
BEN nd nd 14 nd nd nd nd
BOS 84 102 520 54 197 nd nd
CAR nd 115 56 nd nd nd nd
CYP 08 59 112 nd nd 26 nd
43
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Compuesto W1 W2 W3 W4 W5 W6 W7
DIM 14 84 400 09 32 50 nd
FEH 85 809 639 15 187 nd nd
FLU 11 05 92 nd 77 32 nd
IMI nd 136 88 29 nd nd 69
IPR 30 749 1144 14 nd nd nd
MAN nd nd nd nd nd 30 nd
MET 04 273 494 63 nd nd 172
MYC 09 nd 35 nd nd nd nd
PYM 15 469 584 08 24 35 nd
TEC 11 nd 58 nd nd nd nd
TRI nd 67 61 nd nd nd nd
sumconcentracioacuten
(ngmL) 274 2868 4358 192 558 173 862
nd no detectado
Tabla IV11 Concentracioacuten (ngmL) encontradas en las diferentes muestras de vino tinto comercial analizadas mediante
SPE-UPLC-MSMS n= 2 reacuteplicas y al final el sumatorio de las concentraciones encontradas
Compuesto R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9
AME nd nd nd 30 nd nd nd nd 16
BEN nd nd nd 07 nd nd nd nd nd
BOS nd 55 21 196 nd nd nd 73 21
CAR nd nd 04 17 249 20 nd nd nd
CYP 34 08 02 22 nd 136 nd 85 nd
DIM nd 33 nd 52 233 46 nd 61 23
FEH nd nd nd 1070 nd 10 nd 1307 14
FLU nd nd nd 20 nd nd nd nd nd
IPR 16 nd nd 17 nd 22 nd nd nd
MAN nd nd nd 17 nd nd nd 20 nd
MET 126 nd nd 14 55 313 30 44 39
MYC nd nd nd 05 nd 32 nd nd nd
PYM 19 nd 03 185 49 281 nd 24 nd
TEC 25 06 39 29 nd nd nd 21 20
TEF nd 01 12 nd nd nd nd nd nd
sumconcentracioacuten
(ngmL) 220 48 81 1681 586 860 30 1635 133
nd no detectado 44
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
En los resultados de los anaacutelisis podemos observar que en ninguna de las muestras comerciales de vino blanco
aparecieron los siguientes compuestos FEP PEN PYC TEF TBZ THI-M y TME y en los vinos tintos
comerciales no aparece a ninguna concentracioacuten FEP IMI PEN PYC TBZ TME THI-M y TRI No se
detectaron para dichas muestras de vino a niveles superiores a los LOQs del meacutetodo propuesto
Cuando se detecta un compuesto positivo se compara el pico cromatograacutefico del compuesto con el de un patroacuten
verificando la coincidencia del tiempo de retencioacuten (maacutexima diferencia 01 min) y la relacioacuten entre transiciones
(maacutexima diferencia 30 ) En la Figura IV6 y la Figura IV7 se muestran los cromatogramas para el compuesto
CYP obtenido en condiciones oacuteptimas para la muestra de vino blanco W6 y en un patroacuten de 5 ngmL
respectivamente En este caso el intervalo de tolerancia para la relacioacuten de intensidad entre transiciones es
IP2IP1=061plusmn018
Figura IV6 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el CYP en la muestra W6 (26 ngmL) Transicioacuten
superior 226gt93 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 226gt108 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades IP2IP1= 066
Figura IV7 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el CYP en un patroacuten de 5 ngmL Transicioacuten
superior 226gt93 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 226gt108 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades IP2IP1=061plusmn018
45
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Otro ejemplo de compuesto positivo en abundantes muestras comerciales de estudio es el Metalaxyl positivo con
una concentracioacuten de 04 ngmL en el vino con referencia W1 (Figura IV8) y positivo con una concentracioacuten de
313 ngmL en el vino con referencia R6 (Figura IV9) Ambas se comparan con el cromatograma de un patroacuten
de Metalaxyl de 1 ngmL (Figura IV10) El grado de concordancia en los tiempos de retencioacuten y la relacioacuten de
intensidades entre transiciones es satisfactorio
Figura IV8 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el MET en la muestra W1 (04 ngmL) Transicioacuten
superior 2801gt2201 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 2801gt1921 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades
IP2IP1=056
Figura IV9 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el MET en la muestra R6 (313 ngmL) Transicioacuten
superior 2801gt2201 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 2801gt1921 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades IP2IP1=
056
46
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Figura IV10 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el MET en un patroacuten de 1 ngmL Transicioacuten
superior 2801gt2201 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 2801gt1921 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades
IP2IP1=057plusmn017
Es de destacar que aunque se detectaron bastantes pesticidas en las diferentes muestras de vino comerciales pero
en ninguacuten caso superaron el 10 de los LMRs permitidos en uvas tal y como se recomienda ya que todaviacutea no
existen LMRs para vino en la legislacioacuten vigente No obstante el nivel total de concentracioacuten (sumatorio de
concentraciones Tabla IV10 y Tabla VI11) es significativo para varias muestras tanto de vinos blancos (W2 y
W3) como tintos (R4 y R8)
47
Capiacutetulo V Conclusiones
CAPIacuteTULO V CONCLUSIONES
En este trabajo se ha estudiado un meacutetodo para la cuantificacioacuten de pesticidas concretamente veinte fungicidas y
tres insecticidas en vino blanco y tinto En la etapa de preparacioacuten de muestra se optimizoacute la extraccioacuten en fase
soacutelida (SPE) utilizando cartuchos OASIS HLB (200 mg) compuestos por divinilbenceno-N-vinilpirrolidona
(DVB-VP) como adsorbente Como teacutecnica de determinacioacuten se utilizoacute cromatografiacutea de liacutequidos con una
interfase de electroespray acoplada a espectrometriacutea de masas (UPLC-ESI-MSMS)
Las conclusiones generales obtenidas a partir de los resultados de este proyecto relativo a la determinacioacuten de
fitosanitarios en vino son
Ante los problemas de retencioacuten que presentan los cartuchos OASIS MAX (150 mg) para algunos
compuestos los cartuchos OASIS HLB (200 mg) junto con la combinacioacuten metanolacetonitrilo (2080)
como disolvente de elucioacuten son elegidos como mejor opcioacuten en la extraccioacuten en fase soacutelida de pesticidas
en muestras con matrices complejas como es el caso del vino Asiacute se consigue la retencioacuten selectiva de
componentes de la matriz y proporciona extractos con menor porcentaje de interferencias
El meacutetodo estudiado y optimizado se puede aplicar tanto a vinos blancos como a vinos tintos procesados
a partir de distintas variedades de uvas
Los liacutemites de cuantificacioacuten (LOQs) del estudio se situacutean la mayoriacutea por debajo de 10 ngmL excepto
en el caso de THI-M que asciende al valor de 20 ngmL El rango de respuesta lineal abarca hasta 200
ngmL y el tiempo de anaacutelisis ha sido de solo 10 minutos por muestra
En todas las muestras de vino (blancos y tintos) comerciales analizadas se han detectado la presencia de
varios pesticidas sin embargo todas las concentraciones encontradas se encuentran por debajo del 10
de los LMRs fijados en uvas tal y como recomienda la legislacioacuten por lo que no se considera
preocupante
48
Capiacutetulo V Conclusioacutens
CAPIacuteTULO V CONCLUSIOacuteNS
Neste traballo estudouse un meacutetodo para a cuantificacioacuten de pesticidas en particular vinte funxicidas e tres
insecticidas en vintildeo branco e maacuteis tinto No paso da preparacioacuten da mostra optimizouse a extraccioacuten en fase
soacutelida (SPE) empregando cartuchos OASIS HLB (200 mg) compostos por divinilbenceno-N-pirrolidona (DVB-
VP) como adsorbente Para a teacutecnica de determinacioacuten utilizouse cromatografiacutea de liacutequidos con unha interfase de
electroespray acoplada a espectrometriacutea de masas (UPLC-ESI-MSMS)
As conclusioacutens xerais a obtidas a partir dos resultados deste proxecto relativo aacute determinacioacuten de pesticidas en
vintildeo son
Ante os problemas de retencioacuten que mostraban os cartuchos OASIS MAX (150 mg) para alguacuten
compostos os cartuchos OASIS HLB (200 mg) en conxunto coa mistura metanolacetonitrilo (2080)
como disolvente de elucioacuten son elexidos como mellor opcioacuten na extraccioacuten en fase soacutelida de pesticidas
en mostras con matrices complexas como eacute o caso do vintildeo Asiacute eacute conseguida a retencioacuten selectiva de
componentes da matriz e proporciona extractos con menos porcentaxe de interferencias
O meacutetodo estudado e optimizado poacutedese aplicar tanto a vintildeos brancos coma tintos procesados a partir de
diferentes variedades de uvas
Os liacutemites de cuantificacioacuten do estudo (LOQs) son maacuteis baixos de 10 ngmL agaacutes no caso do THI-M
que ascende ao valor de 20 ngmL O rango de resposta lineal cobre ata 200 ngmL e o tempo de anaacutelise
foi de soacute 10 minuacutetos por mostra
En todas as mostras de vintildeo (brancos e tintos) comercial analizadas detectouse a presenza de varios
pesticidas maacuteis poreacuten todas as concentracioacutens atopadas son inferiores ao 10 dos LMR fixados en uvas
tal e como recomenda a lexislacioacuten polo que non se considera preocupante
49
Chapter V Conclusions
CHAPTER V CONCLUSIONS
In this work we have studied a method for the quantification of pesticides specifically twenty fungicides and
three insecticides in white and red wine In the sample preparation step the solid phase extraction was optimized
using cartridges OASIS HLB (200 mg) containing divinylbenzene-N-vinylpyrrolidone (DVB-VP) as adsorbent
As determination technique ultraperformance liquid chromatography was used with an electrospray interface
coupled to mass spectrometry (UPLC-ESI-MS7MS)
The general conclusions drawn from the results of this project concerning the determination of pesticides in wine
are
Due to the retention problems presented by the OASIS MAX sorbent (150 mg) for some compounds of
this project the cartridges OASIS HLB (200 mg) together with the methanolacetonitrile (2080) mixture
are chosen as the best option in the solid phase extraction of pesticides in samples with complex
matrices as is the case with the wine
The method studied and optimized can be applied to both white and red wines obtained from different
varieties of grapes
The limits of quantification (LOQs) were below 10 ngmL for most of the compounds except in the
case of THI-M with a LOQ of to 10 ngmL The linear response range covers up to 200 ngmL and the
analysis time was only 10 minutes per sample
In all commercial wine samples (white and red) analyzed the presence of several pesticides was
conformed however all the concentrations obtained are below 10 of the Maximum residue
levels(MRLs) fixed in grapes as recommended by legislation
50
VI Bibliografiacutea VI BIBLIOGRAFIacuteA [1] Ministerio de agricultura y pesca alimentacioacuten y medio ambiente mhttpwwwmapamagobesescalidad-y-evaluacion-ambientaltemasproductos-quimicosfitosanitarios (Acceso el diacutea 11052017) [2] httpwwwcricyteduarenciclopediaterminosProducFitohtm (Acceso el diacutea 11052017) [3] WERNER BALTES ldquoQuiacutemica de los alimentosrdquo Editorial Acribia SA 2007 Capiacutetulo 11 ldquoResiduos en los alimentosrdquo paacuteginas 206-217
[4] RLabrada JCCaseley CParker ldquoESTUDIO FAO PRODUCCIOacuteN Y PROTECCIOacuteN VEGETAL 120rdquo Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentacioacuten Roma 1996 ISSN 1014- Capiacutetulo 10 Herbicidas httpwwwfaoorgdocrepT1147St1147s00htmContents (Acceso el diacutea 12052017)
[5] Taberner Palou Andreu Cirujeda Ranzenberger Alicia Zaragoza Larios Carlos ldquoManejo de poblaciones de malezas resistentes a herbicidasrdquo (FAO Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura) 100 preguntas sobre resistencia PDF sacado de httpwwwfaoorg3a-a1422spdf (Acceso el diacutea 12052017) [6] BISSET Juan A Uso correcto de insecticidas control de la resistencia Revista Cubana de Medicina Tropical 2002 vol 54 no 3 p 202-219 [7] DEVINE Gregor J EZA Dominique Ogusuku Elena FURLONGMichael J Uso de insecticidas contexto y consecuencias ecoloacutegicas Revista peruana de medicina experimental y Salud Puacuteblica 2008 vol 25 no 1 p 74-100 [8] Ministerio de agricultura y ganaderiacutea (proteccioacuten agropecuaria servicio de diagnoacutestico fitosanitario) de costa Rica httpwwwmaggocrbibliotecavirtualH20-5054pdf (Acceso el diacutea 11052017) [9] GEPP V MONDINO P Control quiacutemico 2011 PDF obtenido de httpwwwpvfagroeduuyfitopatodocscursosfitopatoMaterialesGuiasC-QUIMICOpdf (Acceso el diacutea 772017) [10] ROSSLENBROICH Hans-Juergen STUEBLER Dietrich Botrytis cinereamdashhistory of chemical control and novel fungicides for its management Crop Protection 2000 vol 19 no 8 p 557-561 [11] Figura 11 httpwwwvitiviniculturanetbotritis-o-podredumbre-gris-botrytis-cinerea-pershtml (Acceso el diacutea 12052017) [12] CAMPBELL Paul BENDEK Carlos LATORRE Bernardo A Riesgo de oiacutedio (Erysiphe necator) de la vid en relacioacuten con el desarrollo de los racimos Ciencia e investigacioacuten agraria 2007 vol 34 no 1 p 5-11 [13] ldquoCoacutemo combatir el oiacutedio de la vidrdquo Jose Javier Peacuterez de Obanos Castillo PDF sacado de httpswwwnavarraesNRrdonlyres05E65D9B-D1A2-4EAD-9A63-AFF1D3215552135109Comocombatireloidiodelavidpdf (Acceso el diacutea 12052017) [14] Imagen 12 sacadas las 3 de httpwwwvitiviniculturanetoidio-de-la-vidhtml (Acceso el diacutea 12052017) [15] BARRIOS Gonccedilal REYES Joan Modelizacioacuten del Mildiu de la Vid 2004 httpwwwruralcatnetmigracio_resources617683_mildiusPDF (Acceso el diacutea 12052017) [16] Imaacutegenes sacadas de httpwwwvitiviniculturanetmildiu-de-la-vid-enfermedades-vinahtml (Acceso el diacutea 13052017) [17] HUQ Mainul MEISNER Craig DASGUPTA Susmita Health effects and pesticide perception as determinants of pesticide use evidence from Bangladesh httpagrisfaoorgagris-searchsearchdorecordID=US2012411738 (Acceso el diacutea 13052017)
51
IV Bibliografiacutea [18] BADII Mohammad H LANDEROS Jeroacutenimo Plaguicidas que afectan a la salud humana y la sustentabilidad CULCyT 2015 no 19 Revista vista en httpopenjournaluacjmxojsindexphpculcytarticleview454 (Acceso el diacutea 772017) [19] OLEA Nicolaacutes FERNAacuteNDEZ Mariana F Plaguicidas persistentes En Congreso Implementacioacuten del Convenio de Contaminantes Orgaacutenicos Persistentes Madrid 2001 p 26-27 [20] httpwwwfaoorgfao-who-codexalimentariusabout-codexes (Acceso el diacutea 14052017) [21] httpeceuropaeufoodplantpesticidesmax_residue_levels_en (Acceso el diacutea 14052017 [22] ORDONtildeEZ Juan A Cambero Rodriacuteguez MI Fernaacutendez Aacutelvarez L Garciacutea Sanz ML Garciacutea de Fernando Minguilloacuten GD de la Hoz Perales L Selgas Cortecero MD Tecnologiacutea de los alimentos Volumen 1 Componentes de los Alimentos y Procesos Siacutentesis Madrid 1998paacutegs 349-351 [23] CELA Rafael Casais Maria del Carmen Lorenzo Rosa Antonia Teacutecnicas de separacioacuten en quiacutemica analiacutetica Siacutentesis 2002 Capiacutetulo 11 Extraccioacuten y lixiviacioacuten por disolvente (paacutegs206-260) [24] CANTWELL Frederick F LOSIER Manon Liquidmdashliquid extraction Comprehensive Analytical Chemistry 2002 vol 37 p 297-340 [25] Imagen de LLE sacada de httpprocesosbiowikispacescomExtracciC3B3n+liquido-liquido (Acceso el diacutea 15052017) [26] HENNION Marie-Claire Solid-phase extraction method development sorbents and coupling with liquid chromatography Journal of Chromatography A 1999 vol 856 no 1 p 3-54 [27] CELA Rafael Casais Maria del Carmen Lorenzo Rosa Antonia Teacutecnicas de separacioacuten en quiacutemica analiacutetica Siacutentesis 2002 Capiacutetulo 16 Teacutecnicas de adsorcioacuten y absorcioacuten en la preparacioacuten de muestras Extraccioacuten y microextraccioacuten en fase soacutelida (paacutegs520-555) [28] Imagen spe sacada httptoxicocbblogspotcomes201310las-intoxicaciones-con-farmacoshtml (Acceso el diacutea 15052017) [29] Chaacutefer Pericaacutes Consuelo Acoplamiento microextraccioacuten en fase soacutelida-cromatografiacutea (2006) httprodericuveshandle1055014940 (Acceso el diacutea 16052017) [30] Imagen SPME httpwwwscieloorgcoscielophpscript=sci_arttextamppid=S0122-53832002000100005 (Acceso el diacutea 16052017) [31] MONTES GOYANES Rosa Mariacutea Avances en teacutecnicas de microextraccioacuten para la determinacioacuten de compuestos traza en muestras medioambientales y alimentarias Teacutesis doctoral Noviembre 2009 (Paacutegs 34-55) [32] LEHOTAY Steven J Ae Son Kyung KwonHyeyoung Koesukwiwat Urairat Fu Wusheng Mastovska Katerina Hoh Eunha Leepipatpiboon Natchanun Comparison of QuEChERS sample preparation methods for the analysis of pesticide residues in fruits and vegetables Journal of Chromatography A 2010 vol 1217 no 16 p 2548-2560 [33] Imagen QueChERS httpswwwresearchgatenetpublication279221361_QuEChERS_A_Sample_Preparation_for_Extraction_of_Carbaryl_from_Rat_Feces (Acceso el diacutea 16052017) [34] STASHENKO Elena E MARTIacuteNEZ Jairo Reneacute Preparacioacuten de la muestra un paso crucial para el anaacutelisis por GC-MS Uma publicaccedilatildeo trimestral do Instituto Internacional de Cromatografia (IIC) Ciecircncia Cromatograacutefica 2011 vol 3 no 1 [35] Imagen GC-MS httpsorgspectroscopyintblogspotcomes201411gas-chromatography-mass-spectrometry-gchtml (Acceso el diacutea 17052017) [36] httpwwwactlabscompageaspxmenu=65ampapp=221ampcat1=534amptp=2amplk=no (Acceso el diacutea 17052017)
52
IV Bibliografiacutea [37] Quintela O Cruz A Concheiro M De Castro A amp Loacutepez-Rivadulla M (2005) Metodologiacutea LC-MS Aspectos generales de la teacutecnica y sus aplicaciones en el campo de la toxicologiacutea Rev Toxicol 22 paacutegs7-14 [38] Imagen LC-MS httpsuploadwikimediaorgwikipediaenff9Liquid_chromatography_tandem_Mass_spectrometry_diagrampng (visto 18052017) [39] Vargas de la Cruz Celia Bertha Adaptacioacuten de la Metodologiacutea Analiacutetica para la determinacioacuten de residuos de plaguicidas en frutas nativas de exportacioacuten mediante Uplc-MsMs (2012) Tesis obtenida en http20062146130handlecybertesis2331 (Acceso el diacutea 772017) [40] ROMERO GONZAacuteLEZ Roberto Fernaacutendez Moreno Joseacute Luis Plaza Bolantildeos Patricia Garrido Frenich Antonia Martiacutenez Vidal Joseacute Luis Empleo de la espectrometriacutea de masas como herramienta para la determinacioacuten de toacutexicos en alimentos hacia la seguridad alimentaria Revista Espantildeola de salud puacuteblica 2007 vol 81 no 5 p 461-474 [41] PAYAacute Andrus Fundamento y Funciones de la Espectrometriacutea de Masas Universidad de Valencia Espantildea 2006 httpmuraluvescaloan (Acceso el diacutea 19052017) [42] Imagen MS sacada de httpsesslidesharenetMaYaTorrezespectrometria-demasas (Acceso el diacutea 21052017) [43] ECONOMOU Anastasios Botitsi Helen Antoniou Spyros Tsipi Despina Determination of multi-class pesticides in wines by solid-phase extraction and liquid chromatography-tandem mass spectrometry Journal of Chromatography A 2009 vol 1216 no 31 p 5856-5867 [44] FONTANA A R Rodriacuteguez I Ramil M Altamirano JC Cela R Liquid chromatography time-of-flight mass spectrometry following sorptive microextraction for the determination of fungicide residues in wine Analytical and bioanalytical chemistry 2011 vol 401 no 2 p 767-775 [45] PELAJIĆ Maja G Peček DM Pavlović DV Čepo Novel multiresidue method for determination of pesticides in red wine using gas chromatographyndashmass spectrometry and solid phase extraction Food chemistry 2016 vol 200 p 98-106 [46] Ignaz J Buerge Juumlrgen Krauss Rociacuteo Loacutepez-Cabeza Werner Siegfried Michael Stuumlssi Felix E Wettstein Thomas Poiger Stereoselective Metabolism of the Sterol Biosynthesis Inhibitor Fungicides Fenpropidin Fenpropimorph and Spiroxamine in Grapes Sugar Beets and Wheat Journal of Agricultural and Food Chemistry 2016 vol 64 no 26 p 5301-5309 [47] M Hu X Liu F Dong J Xu S Li H Xu Y Zheng Determination of ametoctradin residue in fruits and vegetables by modified quick easy cheap effective rugged and safe method using ultra-performance liquid chromatographytandem mass spectrometry Food chemistry 2015 vol 175 p 395-400 [48] WALORCZYK Stanisław DROŻDŻYŃSKI Dariusz GNUSOWSKI Bogusław Multiresidue determination of 160 pesticides in wines employing mixed-mode dispersive-solid phase extraction and gas chromatographyndashtandem mass spectrometry Talanta 2011 vol 85 no 4 p 1856-1870 [49] Tianyang Guo Pingping Fang Juanjuan Jiang Feng Zhan Wei Yong Jiahui Liu YiYang Dong Rapid screening and quantification of residual pesticides and illegal adulterants in red wine by direct analysis in real time mass spectrometry Journal of Chromatography A 2016 vol 1471 p 27-3 [50] GONZAacuteLEZ-RODRIacuteGUEZ R M CANCHO-GRANDE B SIMAL-GAacuteNDARA J Decay of fungicide residues during vinification of white grapes harvested after the application of some new active substances against downy mildew Food chemistry 2011 vol 125 no 2 p 549-560 [51] CARPINTEIRO I Ramil M Rodriacuteguez I Cela R Determination of fungicides in wine by mixed-mode solid phase extraction and liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry Journal of Chromatography A 2010 vol 1217 no 48 p 7484-7492
53
Capiacutetulo I Introduccioacuten
32 Meacutetodos LC-MS (MSMS)
La teacutecnica de LC-MS se desarrolloacute para minimizar las desventajas del acoplamiento GC-MS y asiacute resolver los
problemas que este uacuteltimo acarreaba con los analitos termolaacutebiles permitiendo el anaacutelisis de eacutestos sin tener que
realizar una etapa previa de derivatizacioacuten La interfase de unioacuten de cromatografiacutea liacutequida (LC) con espectrometriacutea
de masas (MS) acarrea una dificultad significativa siendo responsable de transformar los analitos que se
encontraban en la fase moacutevil liacutequida en iones en fase gas sin que se produzca su degradacioacuten teacutermica La
sensibilidad de las determinaciones por LC-MS va a depender de la interfase empleada Las principales interfases
empleadas actualmente son las ionizaciones a presioacuten atmosfeacuterica electrospray (ES) e ionizacioacuten quiacutemica a
presioacuten atmosfeacuterica (APCI) [37]
Con los antildeos la cromatografiacutea liacutequida se ha ido innovando y mediante la disminucioacuten del tamantildeo de partiacutecula en
la columna se fue mejorando la eficiencia asiacute como aumentando la selectividad y resolucioacuten del pico en el
cromatograma Para este nuevo sistema llamado UPLC Ultra-Performance Liquid Chromatography se desarrolloacute
una nueva instrumentacioacuten capaz de trabajar a altas presiones generando flujos mayores sin peacuterdidas de
resolucioacuten utilizando inyectores automaacuteticos maacutes raacutepidos y detectores con mayor velocidad de adquisicioacuten de
datos disminuyendo asiacute el tiempo de anaacutelisis [39]
33 Espectrometriacutea de masas
La espectrometriacutea de masas es el meacutetodo de deteccioacuten y cuantificacioacuten maacutes fiable a la hora de la determinacioacuten de
compuestos en matrices complejas (tales como alimentos) ya que otros detectores maacutes tradicionales como UV-
visible o fluorescencia cuentan con una gran incertidumbre en los resultados llegando incluso a ofrecer falsos
Figura I10 Acoplamiento LC-MS [38]
15
Capiacutetulo I Introduccioacuten
positivos o negativos Un espectrometro de masas cuenta con un dispositivo de introduccioacuten de muestra una
caacutemara de ionizacioacuten un sistema para la aceleracioacuten de los iones uno o varios analizadores de masas y un detector
[40]
El fundamento de la espectrometriacutea de masas se basa en la separacioacuten de iones en base a la relacioacuten masacarga
(mz) El proceso consta fundamentalmente de cuatro etapas La
primera es la ionizacioacuten de la muestra los iones formados se aceleran
debido a la accioacuten de un campo eleacutectrico variable separacioacuten de los
iones seguacuten su masacarga deteccioacuten de los iones y produccioacuten de la
sentildeal eleacutectrica El analizador de masas es el encargado de la separacioacuten
de los iones en funcioacuten a su mz entre los que maacutes destacan
analizador de masas cuadrupolar que dispersa simultaacuteneamente todos
los iones en funcioacuten de la relacioacuten mz analizador de masas de
tiempo de vuelo (TOF) consta de un tubo a alto vaciacuteo sobre el que no
actuacutea ninguacuten campo eleacutectrico al cual llegan todos los iones acelerados con la misma energiacutea cineacutetica y en el tubo
las velocidades variacutean seguacuten mz y analizador de trampa de iones en doacutende los iones gaseosos quedan aislados
durante largos periacuteodos de tiempo por la accioacuten del campo eleacutectrico [41]
4RESUMEN BIBLIOGRAacuteFICO DE LAS TEacuteCNICAS DE EXTRACCIOacuteN Y
DETERMINACIOacuteN DE PESTICIDAS EN VINO
En la bibliografiacutea se han descrito diversas teacutecnicas y diferentes combinaciones entre teacutecnicas de extraccioacuten y
distintas teacutecnicas de cuantificacioacuten e identificacioacuten para esos analitos Entre estas teacutecnicas los valores de los liacutemites
de cuantificacioacuten (LOQs) y las recuperaciones relativas pueden diferir en el resultado en un rango de valores asiacute
como el tiempo total empleado para el anaacutelisis y para la preparacioacuten de la muestra
Por lo general el meacutetodo de extraccioacuten de los analitos de intereacutes maacutes empleado es la extraccioacuten en fase soacutelida
(SPE) la cuaacutel le ha estado ganando terreno a la extraccioacuten liacutequido-liacutequido aunque tambieacuten se estaacute viendo cada vez
maacutes desplazada debido al creciente uso de la teacutecnica QuEChERS
Figura I11 Etapas de la espectrometriacutea de masas [42]
16
Capiacutetulo I Introduccioacuten
En el estudio de ECONOMOU et al [43] realizado en el antildeo 2009 en Grecia se empleoacute la extraccioacuten en fase
soacutelida con deteccioacuten en cromatografiacutea de liacutequidos acoplada a espectrometriacutea de masas en taacutendem (SPE-LC-ESI-
MSMS) Para la preparacioacuten de la muestra diluyeron 10 mL de vino (tanto blanco como tinto) a un volumen
final de 100 mL con agua ultrapura antes de la SPE Determinaron las recuperaciones de la extraccioacuten para dos
niveles de concentracioacuten 0010 y 0050 mgL realizando 8 medidas diarias durante 3 diacuteas consecutivos
encontraacutendose unos valores que variacutean dentro del rango 70-110 para todos los pesticidas en los dos niveles Para
la determinacioacuten y cuantificacioacuten de 46 pesticidas emplearon la teacutecnica de cromatografiacutea de liacutequidos con
espectrometriacutea de masas con un volumen de inyeccioacuten de 20 microL y un flujo de fase moacutevil de 02 mLmin
aclopada a espectrometriacutea de masas en taacutendem
Con la misma teacutecnica de extraccioacuten PELAJIĆ et al [45] durante el antildeo 2015 en Croacia llevaron a cabo la
determinacioacuten de 25 residuos de plaguicidas en vino tinto El meacutetodo que desarrollaron para dicha finalidad fue el
acoplamiento SPE-GC-MS Para la preparacioacuten de la muestra emplearon 10 mL de vino diluidos 11 con agua
ultrapura hasta un volumen final de 20 mL Calcularon las recuperaciones de la extraccioacuten y se encontroacute un rango
para todos los pesticidas en las muestras de 70-120 Para la determinacioacuten en cromatografiacutea de gases-
espectrometriacutea de masas se empleoacute un volumen de inyeccioacuten de 5 μL y un flujo de fase moacutevil de 10 mLmin
Mediante el acoplamiento de teacutecnicas SPE dispersiva-GC-MS WALORCZYK et al [48] en el antildeo 2011 en
Polonia llevaron a cabo la cuantificacioacuten de 160 pesticidas en diferentes clases de vino tinto rosado y blanco Con
10 g de vino y 10 mL de acetonitrilo se realizaron pruebas de recuperacioacuten en la fase de extraccioacuten para vino
tinto con los niveles de concentracioacuten 001 005 y 02 mgkg y para los vinos rosado y blanco con el nivel de
concentracioacuten 005mgkg y encontraron que a todos los niveles de concentracioacuten los valores de recuperacioacuten
rondan el rango 80-110 Para la teacutecnica cromatograacutefica se utilizoacute un volumen de inyeccioacuten de 5 microL
El acoplamiento LLE-SPE-LCDAD fue desarrollado por GONZAacuteLEZ-RODRIacuteGUEZ et al [50] en el antildeo
2010 en la provincia de Orense para la determinacioacuten de nuevos fungicidas propuestos para combatir el hongo
que provoca la enfermedad del mildium En la preparacioacuten de la muestra emplearon 15 mL de vino blanco para la
extraccioacuten en la cual fueron calculadas las recuperaciones relativas para dos niveles de concentracioacuten 005 y 05
mgkg en donde se establece un rango de entre 70-110 para todos los analitos Para la determinacioacuten mediante
cromatografiacutea de liacutequidos se empleoacute un volumen de inyeccioacuten de 2 μL y como meacutetodo de deteccioacuten utilizaron un
detector de diodos array
La microextraccioacuten sorptiva en fase soacutelida fue empleada en la publicacioacuten de FONTANA et al [44] junto con un
acoplamiento entre cromatografiacutea de liacutequidos y espectrometriacutea de masas para la determinacioacuten de 15 fungicidas
en vino realizada durante el 2010 en el noroeste de Espantildea Para la preparacioacuten de la muestra emplearon 10 mL
17
Capiacutetulo I Introduccioacuten
de vino diluiacutedos con el mismo volumen de agua ultrapura y un sorbente en forma de disco de silicona con un
volumen de 12 microL La recuperacioacuten de la extraccioacuten se calculoacute para vino tinto (Menciacutea) y vino blanco (Godello)
realizando tres replicas dentro de un mismo diacutea para los niveles de concentracioacuten 10 y 50 ngmL y nueve reacuteplicas
realizando el anaacutelisis en tres diacuteas consecutivos para el nivel de concentracioacuten de 25 ngmL y los resultados
obtenidos dan unos valores de recuperacioacuten dentro del rango 75-117 En el sistema LC-QTOF-MS el volumen
de inyeccioacuten fue de 15 microL
El otro meacutetodo de extraccioacuten mencionado anteriormente es QuEChERS estaacute en auge como meacutetodo de extracioacuten
de residuos de pesticidas en matrices como la del vino o la uva ya que incrementa la velocidad del anaacutelisis y reduce
el efecto de matriz BUERGE et al [46] seguido de una deteccioacuten mediante GC-MSMS realizaron una estapa
de extraccioacuten QuEChERS con alguna modificacioacuten acetato de sodio en lugar de cloruro soacutedico y acetato de etilo
en lugar de acetonitrilo utilizando 5 g de uva para la determinacioacuten de residuos de 4 pesticidas durante el antildeo
2016 Las recuperaciones de extraccioacuten resultaron ser valores entre 91-149 en uva a distintos niveles de
concentracioacuten 005 05 y 5 mgkg
Para la determinacioacuten de Ametoctradin HU et al [47] llevaron a cabo una extraccioacuten QuEChERS empleando 10
g de uva con deteccioacuten mediante el acoplamiento UPLC-MSMS utilizando un volumen de inyeccioacuten de 5 μL y
un flujo de fase moacutevil de 03 mLmin Las recuperaciones de la extraccioacuten se calcularon para tres niveles de
concentracioacuten 1 10 100 μgL de dos formas distintas en tres diacuteas consecutivos realizando 5 reacuteplicas al diacutea o en
dentro de un mismo diacutea realizando 15 reacuteplicas los resultados de todos los caacutelculos se encuentran dentro del rango
818-1001
Siguiendo con el mismo modo de extraccioacuten GUO et al [49] publicaron sus estudios para la determinacioacuten de
50 pesticidas y 12 adulterantes en vino tinto Para la extraccioacuten QuEChERS se utilizaron 10 mL de vino tinto con
10 mL de acetonitrilo y calcularon las recuperaciones para tres niveles de concentracioacuten 50 100 y 250 ngmL
encontraacutendose un rango de valores entre 75-120 El meacutetodo de deteccioacuten se llevoacute a cabo mediante un anaacutelisis
directo en tiempo real junto con espectrometriacutea de masas en tandem con un cuadrupolo (DART-MSMS) la
teacutecnica DART es un meacutetodo raacutepido para cribar y cuantificar los analitos de estudio que prescinde de la etapa de
separacioacuten cromatograacutefica
A continuacioacuten se recogen en la Tabla I3 los liacutemites de cuantificacioacuten (LOQs) de los analitos de intereacutes en este
trabajo caacutelculados por los diferentes meacutetodos encontrados en bibliografiacutea citados anteriormente en este apartado
18
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Tabla I3 LOQs de los analitos de intereacutes descritos para los distintos meacutetodos encontrados en la bibliografiacutea
Compuesto LOQs
Compuesto LOQs
V Blanco V Tinto Uva V Blanco V Tinto Uva
AME - - 0032μgkg[47] MET 86 μgL[43]
22 μgL[44]
89 μgL[43]
22 μgL[44]
5 μgL[45]
259 ngmL[49]
001mgkg[48]
BEN 02 μgL[44]
0001 mgL[50]
02 μgL[44]
001 μgL[45]
280ngmL[49]
005 mgkg[48] MYC 30 μgL[43]
08 μgL[44]
36 μgL[43]
10 μgL[44]
025 μgL[45]
331ngmL[49]
001 mgkg[48]
BOS 0065 mgL[50] 05 μgL[45]
1076 ngmL[49] 001 mgkg[48] PEN
56 μgL[43]
05 μgL[44]
49 μgL[43]
04 μgL[44]
220ngmL[49]
001 mgkg[48]
CAR - 386 ngmL[49] - PYC 0003mgL[50] 07 μgL[45] 001 mgkg[48]
CYP 15 μgL[43]
04 μgL[44]
0001 mgL[50]
22 μgL[43]
06 μgL[44]
312 ngmL[49]
001 mgkg[48] PYM 17 μgL[43] 22 μgL[43]
10 μgL[45] 001 mgkg[48]
DIM 18 μgL[43] 20 μgL[43] 001 mgkg[48] TEC 03 μgL[44]
03 μgL[44]
10 μgL[45]
160ngmL[49]
001 mgkg[48]
FEH 17 μgL[43] 22 μgL[43]
938 ngmL[49] 001 mgkg[48] TEF - 876ngmL[49] -
FEP - - 002mgkg[46] TBZ 15μgL [43] 29μgL[43] 001 mgkg[48]
FLU 005 μgL[45] TME - 25 μgL[45] 001 mgkg[48]
IMI 21 μgL[43] 22 μgL[43]
225 ngmL[49] - THI-M 92 μgL[43] 89 μgL[43] -
IPR 07 μgL[44] 07 μgL[44] 001 mgkg[48] TRI 10 μgL[44] 12 μgL[44] 001 mgkg[48]
MAN 0011 mgL[50] - -
5 DISTRIBUCIOacuteN DE PESTICIDAS EN VINOS COMERCIALES
En algunos de los meacutetodos descritos en el apartado anterior se procesaron vinos comerciales encontraacutendose
resultados positivos para muchos residuos de pesticidas y algunos hasta en gran concentracioacuten
ECONOMOU et al [43] mediante el meacutetodo LC-ESI-MSMS realizaron el anaacutelisis de 60 muestras de vino tinto
y blanco recogidos en supermercados locales en Grecia a lo largo de un antildeo El meacutetodo se habiacutea desarrollado
19
Capiacutetulo I Introduccioacuten
para la determinacioacuten de 46 pesticidas pero la mayoriacutea se encuentran con una concentracioacuten por debajo de
001mgL solo ocho plaguicidas se obtuvieron con resultados de concentracioacuten mayores Se muestran los
resultados en la Tabla I4 de los analitos de intereacutes en este estudio
Tabla I4 Nuacutemero de muestras positivas de distintos pesticidas en el anaacutelisis de 60 muestras de vino [43]
Compuesto Positivos con concentracioacuten entre 001-01
mgL
Positivos con concentracioacuten entre 01-1
mgL
PYM 2 (3) 2 (3)
MYC 2 (3) 0 (0)
CAR 11 (18) 7 (12)
THI-M 7 (12) 5 (8)
FEH 5 (8) 0 (0)
MET 1 (2) 0 (0)
Mediante el meacutetodo de microextraccioacuten en fase soacutelida-LC-TOF-MS FONTANA et al [44] aplicaron el
desarrollo del procedimiento a un total de 12 vinos joacutevenes elaborados en el 2010 y correspondientes a diferentes
denominaciones geograacuteficas del noroeste de Espantildea En la Tabla I5 se muestran los datos que han obtenido
Tabla I5 Determinacioacuten de fitosanitarios en vinos comerciales mediante Microextraccioacuten en fase soacutelida-LC-TOF-MS
Valores de concentracioacuten en ngmL [44]
Pesticidas
W 1
Albarintildeo
W5
Ribeiro
W6
Valdeorras
R1
Ribeira Sacra
R3
Ribeiro
R4
Valdeorras
MET 404plusmn06 223plusmn05 311plusmn007 25plusmn03 31plusmn03 74plusmn10
TRI nd nd 36plusmn06 nd nd ltLOQ
IPR 394plusmn03 324plusmn02 324plusmn02 071plusmn007 31plusmn02 28plusmn05
MYC nd nd nd ltLOQ 39plusmn02 nd
TEC 25plusmn01 nd nd nd nd nd
CYP 179plusmn08 ltLOQ ltLOQ 562plusmn002 083plusmn001 nd
BEN 042plusmn001 nd ltLOQ nd 032plusmn001 ltLOQ
ndNo detectados ltLOQ por debajo del liacutemite de cuantificacioacuten del meacutetodo los coacutedigos W y R corresponden respecti-vamente a los vinos blanco y tinto
20
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Por uacuteltimo PELAJIĆ et al [45] aplicaron su meacutetodo SPE dispersiva-GC-MS mediante el cual determinaron 25
residuos de plaguicidas en vino tinto a un total de 32 muestras de vino adquiridos en supermercados locales de
Croacia pero de diversos oriacutegenes de procedencia Los resultados que han obtenido se muestran en la Tabla I6
en doacutende un total de 15 plaguicidas han sido detectados y 7 de los cuales se encontraban en una alta
concentracioacuten
Tabla I6 Resultados de los vinos con positivos en pesticidas y sus concentraciones [45]
Vino Paiacutes Residuos de pesticidas (mgKg)
Tinto Francia DIM (0013) MET (0009) IPR (001)
Tinto Alemania BOS (0011)
Tinto Alemania IPR (0009)
Tinto Macedonia MET (0015)
Tinto Moldavia IPR (0008)
Tinto Polonia MET (004)
Tinto Rumania PYM (0058)
Tinto Espantildea TRI (0005) MET (0011)
Tinto Estados Unidos BOS (001)
Rosado Francia BOS (0005)
Blanco Chile TEC (0008)
Blanco Georgia MET (0057)
Blanco Alemania DIM (001) IPR (0054) PYM (0056)
Blanco Sudaacutefrica DIM (0011) IPR (0011)
21
Capiacutetulo II Objetivos y discusioacuten
CAPIacuteTULO II OBJETIVOS Y DISCUSIOacuteN
El objetivo principal que se persigue en este trabajo es el desarrollo de un meacutetodo analiacutetico raacutepido basado en la
extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) y deteccioacuten mediante cromatografiacutea de liacutequidos en la modalidad de UPLC
acoplada a la espectrometriacutea de masas en taacutendem (UPLC-MSMS) para la determinacioacuten multianalito de residuos
de fitosanitarios principalmente fungicidas aunque tambieacuten alguacuten insecticida en muestras de vino blanco y tinto
Para llevar a cabo la finalidad de lo dicho se consideran unos objetivos maacutes especiacuteficos
Minimizar la manipulacioacuten de la muestra para asiacute reducir la cantidad de disolventes y tiempo empleado
Optimizacioacuten de los factores que afectan en la extraccioacuten en la SPE tales como tipo y cantidad de
adsorbente volumen de eluyente etc
Estudio de las condiciones en UPLC-MSMS para una separacioacuten y cuantificacioacuten oacuteptimas
Caracterizacioacuten y validacioacuten del meacutetodo propuesto
Por uacuteltimo una vez cumplidos todos los objetivos anteriores y fijadas las condiciones oacuteptimas el meacutetodo
estudiado se aplica en el anaacutelisis de muestras de vino comercial (blanco y tinto) para determinar si se encuentran
residuos presentes asiacute como conocer en queacute concentracioacuten se encuentran los pesticidas objeto de este estudio
22
Capiacutetulo III Parte experimental
CAPIacuteTULO III PARTE EXPERIMENTAL
1 MATERIAL Y REACTIVOS
11 Material
Material de vidrio de uso comuacuten en el laboratorio vasos de precipitados matraces aforados etc
Micropipetas automaacuteticas de 20-200 microL 20-200 microL 100-1000 microL 1000-5000 microL Eppendorf
Puntas de plaacutestico para micropipetas
Encapsulador y desencapsulador
Soportes y pinzas
Viales de 15 mL transparentes para muestreador automaacutetico de cromatografiacutea (Sugelabor)
Caacutepsulas de aluminio con seacuteptum de Tefloacuten (Sugelabor) y tapones pre-slit para viales
Tubos y conectores de tefloacuten
Cartuchos de divinilbenceno-N-vinilpirrolidona 200 mg Oasis HLB Waters
Cartuchos de divinilbenceno-N-vinilpirrolidona funcionalizados con grupos amina cuaternaria 150 mg
Oasis MAX Waters
Cartuchos de divinilbenceno-N-vinilpirrolidona 60 mg Oasis HLB Waters
12 Reactivos y disolventes
Agua ultrapura Milli-Q
Aacutecido foacutermico (Sigma Aldrich) 95
Acetonitrilo (LichrosolvregMerck) Gradient grade for liquid chromatography
Metanol (LichrosolvregMerck) Gradient grade for liquid chromatography
Etanol (LichrosolvregMerck) Gradient grade for liquid chromatography
13 Patrones
Ametoctradin (AME) Dr Ehrenstrorfer 990
Benalaxyl (BEN) Pestanal Sigma- Aldrich 999
23
Capiacutetulo III Parte experimental
Boscalid (BOS) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Carbendazim (CAR) Pestanal Sigma- Aldrich 992
Cyprodinil (CYP) Pestanal Sigma- Aldrich 998
Dimethomorph (DIM) mezcla de isoacutemeros E + Z Pestanal Sigma- Aldrich 989
Fenhexamid (FEH) Pestanal Sigma- Aldrich 997
Fenpropidin (FEP) Dr Ehrenstrorfer 980
Fluopicolide (FLU) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Imidacloprid (IMI) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Iprovalicarb (IPR) mezcla de isoacutemeros Pestanal Sigma- Aldrich 985
Mandipropamid (MAN) Pestanal Sigma- Aldrich 991
Metalaxyl (MET) Pestanal Sigma- Aldrich 990
Myclobutanil (MYC) Pestanal Sigma- Aldrich 994
Penconazole (PEN) Pestanal Sigma- Aldrich 991
Pyraclostrobin (PYC) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Pyrimethanil (PYM) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Tebuconazol (TEC) Pestanal Sigma- Aldrich 996
Tebufenozide (TEF) Dr Ehrenstrorfer 988
Thiabendazole (TBZ) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Thiamethoxam (TME) Pestanal Sigma- Aldrich 996
Thiophanate-methyl (THI-M) Dr Ehrenstrofer 990
Triadimenol (TRI) Mezcla de diastereoisoacutemeros Pestanal Sigma- Aldrich 994
14 Patrones internos
Carbendazim-d3 (CAR-d3) Pestanal Sigma- Aldrich 998
Cyprodinil-d5 (CYP-d5) Pestanal Sigma- Aldrich
Imidacloprid-d4 (IMID-d4) Pestanal Sigma- Aldrich
Metalaxyl 13C6 (MET13C6) Pestanal Sigma-Aldrich 99
24
Capiacutetulo III Parte experimental
15 Gases
Nitroacutegeno 99999 como gas de colisioacuten en el espectroacutemetro de masas
Nitroacutegeno en los sistemas de concentracioacuten y secado por corriente de nitroacutegeno de los cartuchos SPE
2 INSTRUMENTACIOacuteN
Balanza analiacutetica de precisioacuten Sartorius
Granatario Sartorius
Bantildeo de ultrasonidos P-Selecta
Equipo de purificacioacuten de agua Millipore modelo Milli-Q gradient A-10ZMQSSVOT4
Estacioacuten de concentracioacuten por corriente de nitroacutegeno Mini-Vap Supelco
Sistema de secado de cartuchos de SPE por corriente de nitroacutegeno VisiDry Supelco
Sistema distribuidor de vaciacuteo Visiprep reg Supelco
Cromatoacutegrafo de liacutequidos de ultra-alta resolucioacuten Waters AcquityUPLC reg y espectroacutemetro de masas
Acquity TQD con analizador de triple quadrupolo (QqQ) equipado con una fuente de ionizacioacuten a
presioacuten atmosfeacuterica del tipo Z-spray (ESI)
3 PREPARACIOacuteN DE LAS DISOLUCIONES
Los patrones de pesticidas se prepararon individualmente a partir de los compuestos soacutelidos comerciales por
pesada excepto en el caso del fenpropidin (FEP) que se preparoacute a partir del compuesto liacutequido comercial Estos
compuestos soacutelidos se disolvieron en metanol y se obtuvieron unas disoluciones iniciales con concentraciones
recogidas en la Tabla III1
25
Capiacutetulo III Parte experimental
Tabla III1 Concentracioacuten de las disoluciones patroacuten stock
Compuesto Concentracioacuten (microgmL) Compuesto Concentracioacuten (microgmL)
AME 102201 MET 118912
BEN 138330 MYC 102017
BOS 99474 PEN 129791
CAR 17105 PYC 104581
CYP 131075 PYM 141386
DIM 103009 TEC 134729
FEH 99584 TEF 137769
FEP 100000 TBZ 105928
FLU 126859 TME 112283
IMI 101123 THI-M 124202
IPR 106739 TRI 118933
MAN 101021
4 LAVADO DEL MATERIAL
La limpieza del material de vidrio utilizado en el laboratorio se realizoacute utilizando jaboacuten y aclarando con agua de
grifo Luego en primer lugar se realiza un enjuague con agua Milli-Q finalmente un segundo enjuague con
acetona para eliminar posibles restos de compuestos orgaacutenicos y se deja secar sobre papel
Para la limpieza de los conectores de tefloacuten empleados en el proceso de SPE se introducen en un vaso de
precipitados con metanol y este en un bantildeo de ultrasonidos durante 10 minutos Al finalizar con el bantildeo de
ultrasonidos se realiza un enjuague con acetona y se pone a secar
5 EXTRACCIOacuteN DE MUESTRAS MEDIANTE SPE
El meacutetodo de extraccioacuten utilizado para la determinacioacuten de pesticidas fue la extraccioacuten en fase soacutelida (SPE)
mediante cartuchos Oasis HLB de 200 mg A continuacioacuten se describe el protocolo de extraccioacuten en las
condiciones oacuteptimas
26
Capiacutetulo III Parte experimental
1 Acondicionamiento del cartucho Oasis HLB de 200 mg con 2 mL de acetonitrilo seguidos de otros 2 mL de
vino sinteacutetico formado por la mezcla etanolagua MilliQ (1288)
2 Paso de la muestra 2 mL de vino diluiacutedos con 2 mL de agua MilliQ a traveacutes del cartucho por gravedad
3 Lavado del cartucho con 2 mL de agua MilliQ
4 Secado del cartucho durante 45 minutos en el VisiDry mediante el paso de una corriente de nitroacutegeno
5 Elucioacuten del cartucho con la mezcla metanolacetonitrilo en proporcioacuten 2080 hasta un volumen final de 2
mL
6 Anaacutelisis mediante cromatografiacutea liacutequida acoplada a espectrometriacutea de masas en taacutendem UPLC-MSMS
(volumen de inyeccioacuten 15 microL)
Representacioacuten esquematizada en la Figura III1
Figura III1 Extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) de las muestras de vino
27
Capiacutetulo III Parte experimental
6 CONDICIONES DE DETERMINACIOacuteN MEDIANTE UPLC-MSMS
En la Tabla III2 se indican las condiciones utlizadas en la determinacioacuten de los pesticidas de intereacutes mediante
LC-MSMS y en la Tabla III3 se muestra el gradiente de la fase moacutevil utilizado para la separacioacuten
cromatograacutefica
Tabla III2 Condiciones experimentales de determinacioacuten en LC-MSMS
UPLC Acquity UPLC-I-Class IVD System
bull Columna cromatograacutefica Zorbax Eclipse Plus C18 Rapid Resolution HD
Fase estacionaria C18
Dimensiones 21 x 50 mm
Tamantildeo de partiacutecula 18 microm
Temperatura del horno 40ordmC
bull Inyector
Volumen de inyeccioacuten 15 microL
bull Fase moacutevil
Flujo 04 mLmin
Fase acuosa (A) Agua MilliQ con 01 aacutecido foacutermico
Fase orgaacutenica (B) Acetonitrilo con 01 aacutecido foacutermico
MSMS WatersXevo TQD
Modo de ionizacioacuten ESI positivo
Voltaje del capilar 15 kV
Voltaje de cono 50 V
Temperatura de gas de secado (N2) 450ordmC
Flujo de gas de secado (N2) 1000 Lh
Modo de adquisicioacuten Centroide
Tabla III3 Gradiente de fase moacutevil utilizado en la separacioacuten cromatograacutefica (LC)
Tiempo min 0 13 28 64 75 76 10
A 98 50 50 0 0 98 98
B 2 50 50 100 100 2 2
28
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
CAPIacuteTULO IV RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
1 IDENTIFICACIOacuteN DE LOS COMPUESTOS
Para empezar el estudio en primer lugar se realizoacute la caracterizacioacuten de las condiciones de determinacioacuten de los
analitos en el modo Multiple Reaction Monitoring (MRM) mediante UPLC-ESI-MSMS Para llevarla a cabo se
tomaron patrones individuales de cada fitosanitario y mediante infusioacuten se estudiaron las posibles transiciones y
voltajes oacuteptimos para su determinacioacuten (Tabla IV1)
La ionizacioacuten por electrospray (ESI) se estudioacute tanto en modo positivo como en modo negativo encontraacutendose
que para todos los pesticidas de nuestro intereacutes se obteniacutea sentildeal en el modo positivo mientras el modo negativo
no presentaba respuesta significativa
A continuacioacuten se estudia el efecto del voltaje de cono en la respuesta del ioacuten molecular [M+H]+ aumentaacutendolo
hasta alcanzar el valor maacuteximo de la sentildeal correspondiente a dicho ioacuten y luego se optimiza la energiacutea de colisioacuten
variaacutendola para cada analito hasta obtener la sentildeal de mayor intensidad para cada uno de los iones producto Por
uacuteltimo una vez optimizado el voltaje de cono y la energiacutea de colisioacuten se seleccionan las dos transiciones maacutes
intensas para llevar a cabo la cuantificacioacuten y cualificacioacuten de cada analito en modo MRM Este procedimiento se
realizoacute para la totalidad de los compuestos confirmando los datos obtenidos con los facilitados por la base de
datos Quanpedia que estaacute disponible en el software del equipo utilizado para algunos de los compuestos
considerados
Compuesto Tr (min) Ion precursor (mz Da)
Voltaje de cono (V)
Ion producto 1 (CEv)
cuantificacioacuten
Ion producto 2 (CEv)
cualificacioacuten
Relacioacuten IP2IP1
AME 325 2760 60 176 (35) 70 (50) 016
BEN 485 3261 26 148 (20) 91 (34) 067
BOS 387 3429 41 140 (20) 307 (20) 011
CAR 167 1921 33 160 (18) 132 (28) 014
CYP 311 2260 56 93 (33) 108 (25) 061
DIM 322 3881 40 301 (20) 165 (30) 057
FEH 386 3021 41 97 (22) 55 (38) 044
FEP 257 2742 55 147 (28) 86 (28) 093
FLU 401 3830 40 173 (20) 365 (15) 010
IMI 218 2561 34 209 (15) 175 (20) 091
IPR 358 3211 28 119 (16) 203 (10) 042
Tabla IV1 Tiempos de retencioacuten (Tr) relacioacuten de iones precursores (mz) voltaje de cono (V) energiacuteas de colisioacuten (CE) y relacioacuten de intensidades entre transiciones (IP2IP1)
29
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Compuesto Tr (min) Ion precursor (mz Da)
Voltaje de cono (V)
Ion producto 1 (CEv)
cuantificacioacuten
Ion producto 2 (CEv)
cualificacioacuten
Relacioacuten IP2IP1
MAN 392 4120 25 328 (16) 125 (35) 063
MET 283 2801 26 220 (13) 192 (17) 057
MYC 365 2891 34 70 (18) 125 (32) 029
PEN 417 2840 34 70 (16) 159 (34) 031
PYC 523 3881 31 194 (12) 163 (25) 066
PYM 266 2000 51 107 (24) 82 (24) 071
TEC 397 3080 40 70 (22) 125 (40) 007
TEF 473 3531 19 133 (20) 297 (8) 072
TBZ 182 2020 51 175 (25) 131 (30) 062
TME 203 2920 28 211 (12) 132 (22) 047
THI-M 257 3430 28 151 (46) 93 (19) 0001
TRI 319 2961 21 70 (10) 99 (15) 013
El dwell time para cada una de las transiciones se ajustoacute de manera automaacutetica por el software (MassLinx) con
objeto de obtener doce puntos espectrales por compuesto tomando un valor promedio de cuatro segundos como
ancho de pico a liacutenea de base
2 CARACTERIZACIOacuteN DEL PROCEDIMIENTO DE DETERMINACIOacuteN (UPLC-ESI-
MSMS)
Una vez optimizados los paraacutemetros que afectan a la separacioacuten cromatograacutefica (UPLC) y a la determinacioacuten por
espectrometriacutea de masas en taacutendem (MSMS) se lleva a cabo la evaluacioacuten de la repetibilidad de inyeccioacuten y
determinacioacuten en esas condiciones Se expresa por medio de la desviacioacuten estaacutendar relativa (RSD) paraacutemetro que
nos indica el grado de correlacioacuten que existe entre varias medidas del mismo patroacuten realizadas por el mismo
operador en el laboratorio y en el mismo equipo de medida a lo largo de un diacutea Para el estudio se realizan diez
inyecciones con volumen de 15 microL de dos patrones con distintos niveles de concentracioacuten 5 y 20 ngmL Los
datos de RSD (Tabla IV2) para las aacutereas de pico de los analitos se situacutean para el nivel de concentracioacuten 5 ngmL
en el rango 2-13 y en el nivel de concentracioacuten 20 ngmL en el rango 1-7
30
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten Tabla IV2 Desviacioacuten estaacutendar relativa (RSD) del aacuterea de pico (transicioacuten de cuantificacioacuten) para evaluar la repetivilidad del proceso de LC-MSMS
Compuesto RSD
5 ngmL
RSD
20 ngmL Compuesto
RSD
5 ngmL
RSD
20 ngmL
AME 5 2 MET 3 2
BEN 2 2 MYC 9 2
BOS 4 5 PEN 4 4
CAR 4 2 PYC 3 1
CYP 5 7 PYM 7 3
DIM 6 5 TEC 3 2
FEH 7 4 TEF 4 2
FEP 4 2 TBZ 2 1
FLU 5 3 TME 6 6
IMI 13 7 THI-M a 6
IPR 8 2 TRI 8 6
MAN 3 2
A continuacioacuten tambieacuten se evaluoacute la repetibilidad de los tiempos de retencioacuten (Tr) para diez inyecciones de
patrones a los dos niveles de concentracioacuten 5 y 20 ngmL situaacutendose las RSD para todos los compuestos en el
rango 01-03 En base a este dato la ventana de tiempo en la que se registran las transiciones de MRM de cada
compuesto se fijoacute en 05 min lo que es lo mismo 025 min alrededor del valor medio de su tiempo de retencioacuten
Por otro lado la linealidad del meacutetodo se estudioacute a nueve niveles de concentracioacuten diferentes comprendidos ente
los niveles 05 ngmL y 200 ngmL mediante la inyeccioacuten de disoluciones patroacuten de los distintos compuestos de
estudio Se realizoacute una evaluacioacuten sin y otra con patroacuten interno (IS) antildeadiendo una concentracioacuten fija de patrones
internos a nivel de 25 ngmL y pudimos observar que los resultados mejoran notablemente al realizar una
correccioacuten con el IS En la Tabla IV3 se muestran los coeficientes de determinacioacuten (R2) obtenidos al realizar la
correccioacuten mediante IS observando que para todos los compuestos excepto para THI-M y para TRI los
coeficientes de correlacioacuten son superiores a 0990 por lo que existe una respuesta lineal en el rango de
concentraciones que hemos estudiado
Aparte del estudio de la linealidad tambieacuten se han estudiado los liacutemites de cuantificacioacuten instrumentales del
meacutetodo (LOQs) Para ello los LOQs se evaluacutean como la miacutenima cantidad de analito que origina una sentildeal 10
veces superior a la desviacioacuten estaacutendar del ruido Los valores anteriores se estimaron a partir del patroacuten de
a no evaluado ya que se encuentra por debajo del liacutemite de cuantificacioacuten del meacutetodo
31
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
concentracioacuten maacutes baja que presenta un pico con una relacioacuten SN superior a 10 En la Tabla IV3 tambieacuten se
recogen estos LOQs en doacutende podemos ver que variacutean en el rango 01-1 ngmL excepto para THI-M que se
desviacutea a valores de 10 ngmL
Tabla IV3 Coeficientes de determinacioacuten (R2) y liacutemites de cuantificacioacuten instrumentales (LOQs) de los analitos para nueve
niveles de concentracioacuten de 05 a 200 ngmL
Compuesto Coeficiente de
correlacioacuten (R2)
LOQs (ngmL) Compuesto
Coeficiente de correlacioacuten
(R2)
LOQs (ngmL)
AME 09951 04 MET 09933 01
BEN 09949 01 MYC 09950 04
BOS 09979 02 PEN 09945 02
CAR 09923 02 PYC 09955 02
CYP 09878 02 PYM 09931 01
DIM 09938 07 TEC 09958 05
FEH 09959 05 TEF 09957 01
FEP 09931 01 TBZ 09942 02
FLU 09965 02 TME 09903 01
IMI 09979 05 THI-M 09580 100
IPR 09938 01 TRI 09867 07
MAN 09979 01
En la Figura IV1 y Figura IV2 se muestran dos ejemplo de curvas de calibrado para dos compuestos IMI y
MAN respectivamente
Figura IV1 Curva de calibrado y coeficiente de determinacioacuten de IMI para UPLC-ESI-MSMS
32
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Figura IV2 Curva de calibrado y coeficiente de determinacioacuten de MAN para UPLC-ESI-MSMS
3 ESTUDIO DEL MEacuteTODO SPE
La extraccioacuten de pesticidas se llevoacute a cabo mediante extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) en doacutende se realizaron
diversos estudios con diferentes condiciones para dar con las oacuteptimas En primer lugar se llevaron a cabo los
experimentos de retencioacuten y elucioacuten sobre dos tipos distintos de adsorbentes cartuchos OASIS HLB (200mg) y
cartuchos OASIS MAX (150 mg) como fases potenciales en las que llevar a cabo la extraccioacuten de manera
selectiva Los dos tipos de cartuchos son de fase reversa pero difieren entre siacute en el fundamento de retencioacuten de
los analitos En los cartuchos OASIS HLB (200 mg) formados por divinilbenceno-N-vinilpirrolidona (DVB-VP)
la retencioacuten de los diferentes analitos tiene lugar por interacciones π-π o de Van der Waals mientras que los
cartuchos OASIS MAX (150 mg) que se probaron como alternativa para mejorar la selectividad en la extraccioacuten
cuentan con un adsorbente polimeacuterico de modo mixto formado por divinilbenceno-N-vinilpirrolidona (DVB-VP)
funcionalizado con grupos amina cuaternaria siendo el fundamento de la extraccioacuten la combinacioacuten de las
propiedades adsorbentes del cartucho HLB con un mecanismo adicional de intercambio ioacutenico (anioacutenico) [27]
Algunos autores han empleado este mecanismo para mejorar la selectividad de la extraccioacuten de forma que en la
etapa de elucioacuten ciertos pigmentos del vino quedan fuertemente retenidos en el adsorbente a diferencia de lo que
ocurre con los adsorbentes de fase reversa [51]
Para llevar a cabo la eleccioacuten del tipo de adsorbente se realizaron pruebas con 10 mL de vino blanco y tinto
conectando en serie los dos tipos de cartuchos HLB (200 mg) y MAX (150 mg) a un segundo cartucho OASIS
HLB (60 mg) La elucioacuten de los analitos se hace de forma independiente para cada cartucho y se evaluacutea si los
analitos pasan del primer cartucho hacia el segundo cartucho es decir si se supera el volumen de corte o si por
33
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
otro lado se quedan retenidos en el primero y no eluyen hacia el segundo En estas pruebas de estudio
preliminares de preparacioacuten de la muestra no se ha incluido el CYP
En la Figura IV3 podemos ver la eficacia de la extraccioacuten para vino blanco y tinto que obtenemos empleando
cartuchos OASIS MAX (150 mg) conectados en serie con cartuchos OASIS HLB (60 mg) realizando la
extraccioacuten de tres fracciones de 2 mL cada una del cartucho OASIS MAX (150 mg) y una cuarta fraccioacuten de 2
mL del cartucho OASIS HLB (60 mg)
Por otro lado en la Figura IV4 podemos ver un graacutefico de columnas en el cual comparamos la eficacia de
extraccioacuten de los cartuchos OASIS HLB (200 mg) con dos disolventes de elucioacuten distintos En dicho graacutefica el
acroacutenimo de cada compuesto consta de dos barras cuyo significado es el siguiente la barra de la izquierda indica
la eficacia de la extraccioacuten empleando acetonitrilo (ACN) como disolvente de elucioacuten y la barra de la derecha
indica la eficacia de la extraccioacuten empleando la combinacioacuten MetanolAcetonitrilo (2080) (MeOHACN) como
disolvente de elucioacuten Para este adsorbente no se detectoacute ninguacuten compuesto en la extraccioacuten del segundo
cartuchos OASIS HLB (60 mg) empleando 2 mL de metanol
Figura IV3 Distribucioacuten de los compuestos en cada fraccioacuten obtenidas con cartuchos OASIS MAX (150 mg)
utilizando 10 mL de vino tinto y blanco sacando cuatro fracciones de 2 mL cada una con metanol como
disolvente de elucioacuten
34
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Figura IV4 Distribucioacuten de los compuestos en cada fraccioacuten obtenidas con cartuchos OASIS HLB (200 mg) utilizando 10
mL de vino tinto y blanco sacando 3 fracciones de 2 mL cada una con acetonitrilo (ACN) (columna de la izquierda) y una
combinacioacuten MetanolAcetonitrilo (2080) (MeOHACN) (columna de la derecha) como disolventes de elucioacuten
A la vista de los resultados reflejados en las graacuteficas podemos afirmar que cuando se utiliza el cartucho OASIS
HLB (200 mg) eluyendo con acetonitrilo o la combinacioacuten metanolacetonitrilo (2080) los extractos son limpios
y se eluyen la mayoriacutea de los compuestos en la primera fraccioacuten Pero utilizando acetonitrilo como disolvente de
elucioacuten se encuentran problemas en la extraccioacuten de CAR FEH y TBZ para los que es necesario emplear un
volumen mayor de elucioacuten o bien seleccionar otro disolvente de elucioacuten como es la combinacioacuten
metanolacetonitrilo
35
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Por otro lado los extractos en los cartuchos OASIS MAX (150 mg) son maacutes limpios incluso utilizando metanol en
la elucioacuten pero se detecta la presencia de CAR FEP TBZ y TME en el segundo cartucho OASIS HLB (60 mg)
significando la rotura del primer cartucho para dichos analitos considerando un volumen de 10 mL de vino Los
demaacutes compuestos se podriacutean recuperar cuantitativamente en la primera fraccioacuten sacada pero la peacuterdida de estos
compuestos inclina la eleccioacuten hacia los cartuchos OASIS HLB (200 mg) con metanolacetonitrilo (2080) como
disolvente de elucioacuten para continuar con el estudio
Una vez fijado el adsorbente y el volumen de elucioacuten se prueba la eficacia de la SPE independiente de los efectos
de matriz En la Tabla IV4 se muestran las recuperaciones de la SPE tomando 10 mL de vino blanco y tinto
con un nivel de adicioacuten de 15 ngmL sacando una sola fraccioacuten de 2 mL con la combinacioacuten
metanolacetonitrilo (2080) y n=3 reacuteplicas
Tabla IV4 Recuperaciones (R plusmn SD) de SPE para 10 mL de vino (blanco y tinto) con un nivel de adicioacuten de 15 ngmL y
n=3 reacuteplicas
Compuesto Vino Tinto
R plusmn SD
Vino Blanco
R plusmnSD Compuesto
Vino Tinto
R plusmn SD
Vino Blanco
R plusmn SD
AME 82 plusmn 7 100 plusmn 1 MET 92 plusmn 6 94 plusmn 3
BEN 89 plusmn 6 97 plusmn 3 MYC 90 plusmn 9 86 plusmn 4
BOS 95 plusmn 1 100 plusmn 2 PEN 84 plusmn 10 103 plusmn 3
CAR 91 plusmn 6 104 plusmn 6 PYC 86 plusmn 5 106 plusmn 1
CYP 81 plusmn 7 102 plusmn 3 PYM 87 plusmn 12 94 plusmn 3
DIM 97 plusmn 3 86 plusmn 4 TEC 83 plusmn 10 103 plusmn 1
FEH 89 plusmn 3 88 plusmn 3 TEF 84 plusmn 5 108 plusmn 4
FEP 91 plusmn 7 104 plusmn 3 TBZ 88 plusmn 7 92 plusmn 5
FLU 91 plusmn 2 97 plusmn 4 TME 101 plusmn 1 110 plusmn 13
IMI 117 plusmn 8 101 plusmn 11 THI-M 85 plusmn 9 110 plusmn 4
IPR 89 plusmn 7 112 plusmn 4 TRI 85 plusmn 10 110 plusmn 4
MAN 88 plusmn 2 87 plusmn 2
Algunos compuestos de la matriz en el vino pueden competir con los analitos durante el proceso de ionizacioacuten
que tiene lugar en la interfase entre UPLC-MSMS por lo que para la cuantificacioacuten del rendimiento de la
ionizacioacuten por electrospray (ESI) se estudian los efectos de matriz (EM) para vino blanco y tinto considerando
dos voluacutemenes de muestra distintos 2 y 10 mL y un volumen final del extracto de 2 mL En la Tabla IV5 se
36
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
exponen los valores para cada compuesto notando que al aumentar el volumen de muestra tambieacuten se aumentan
los efectos de matriz y eacutestos siempre son mayores en vino tinto Para el caacutelculo de estos efectos de matriz (EM)
se emplea la siguiente ecuacioacuten
Donde Am Ab y Ap representan el aacuterea de pico en la sentildeal medida del analito en el extracto de la muestra con
adicioacuten en el extracto de la muestra sin adicioacuten (o blanco) y en el patroacuten antildeadido respectivamente El nivel de
adicioacuten en extracto fue de 50 ngmL por compuesto
Tabla IV5 Efectos de matriz para vino blanco y tinto con un volumen inicial de 2 y 10 mL evaluados para un nivel de adicioacuten de 50 ngmL en extracto
Compuesto
Vino blanco Vino tinto
2 mL 10 mL 2mL 10 mL
EM () CV () EM () CV () EM () CV () EM () CV()
AME 93 3 95 2 99 3 101 7
BEN 99 1 93 2 101 3 100 6
BOS 97 5 98 1 108 2 96 0
CAR 62 2 50 3 58 2 55 6
CYP 94 3 91 1 97 2 95 7
DIM 105 2 95 3 100 3 108 3
FEH 100 4 102 4 105 4 94 3
FEP 95 3 88 2 96 2 92 7
FLU 98 2 93 2 106 1 101 2
IMI 84 4 46 3 48 10 18 8
IPR 99 3 92 3 105 1 100 7
MAN 100 1 94 3 109 4 107 2
MET 98 1 89 1 99 2 99 6
MYC 105 1 100 1 103 2 96 9
PEN 98 3 97 1 101 3 99 10
PYC 98 2 92 3 102 2 98 5
PYM 95 2 87 1 94 3 85 12
TEC 95 3 99 1 101 1 102 10
TEF 99 1 92 3 101 2 104 5
TBZ 45 0 40 5 43 2 30 7
TME 60 6 19 16 36 4 16 1
THI-M 107 2 109 2 103 1 96 9
TRI 97 3 118 4 104 5 117 10
37
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Al observar los resultados podemos ver que la mayoriacutea de los compuestos dan resultados de EM en torno al
100 lo que significa que no sufren una modificacioacuten importante en la eficacia de ionizacioacuten para las muestras
con respecto a los patrones Pero tambieacuten por el contrario podemos observar que algunos compuestos como
por ejemplo en el caso de CAR TBZ IMI y TME experimentan una gran supresioacuten de sentildeal es decir EM bajos
que se acentuacutean al aumentar el volumen de muestra La atenuacioacuten en la eficacia de variacioacuten para estos cuatro
compuestos no solo se ve incrementada con el volumen de muestra si no que ademaacutes es maacutes significativa para
vino tinto que para vino blanco En base a estos resultados aunque la eficacia de la SPE fue cuantitativa para
muestras de 10 mL se limitoacute el volumen de muestra a extraer a 2 mL
Las condiciones oacuteptimas de extraccioacuten se esquematizan en un resumen en la Figura IV5
Figura IV5 Condiciones optimizadas para la extraccioacuten de pesticidas en vino
38
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
4 CARACTERIZACIOacuteN DEL MEacuteTODO DE DETERMINACIOacuteN
Con las condiciones de extraccioacuten y determinacioacuten citadas anteriormente se llevaron a cabo pruebas de
recuperaciones absolutas de los compuestos a nivel de adicioacuten de 5 y 20 ngmL sobre las muestras Para cada
muestra y nivel de adicioacuten se realizaron tres reacuteplicas de las muestras con adicioacuten y los blancos aliacutecuotas de las
mismas muestras sin adicioacuten se procesaron en duplicado Los IS se antildeadieron a nivel de 25 ngmL y cada uno se
utiliza para corregir unos determinados compuestos CAR-d3 se emplea para CAR y TBZ el CYP-d5 para CYP y
PYM el IMID-d4 para IMI y TME y el MET13C6 para el resto de compuestos Los resultados para vino blanco
comprenden en el nivel de concentracioacuten 5 ngmL el rango entre 79-122 y en el nivel de concentracioacuten 20
ngmL el rango entre 84-109 Por otro lado en el caso del vino tinto las recuperaciones se encuentran para el
nivel de concentracioacuten 5 ngmL en el rango 67-112 y para el nivel de concentracioacuten 20 ngmL entre el rango
73-132 Los resultados obtenidos en las pruebas con vino blanco y vino tinto se muestran en la Tabla IV6
Los resultados son satisfactorios ya que la mayoriacutea de los compuestos se ajustan en todos los casos al rango de
recuperacioacuten entre 70-120 Para la realizacioacuten de estas pruebas se ha eliminado de los resultados el compuesto
THI-M debido a que las concentraciones utilizadas se encuentran en el liacutemite o por debajo del LOQ en los
experimentos con muestras adicionadas a 5 ngmL
Para calcular las recuperaciones (R) se recurrioacute a la siguiente ecuacioacuten
Donde Cm Cb y Cp son la concentracioacuten medida de analito en el extracto de la muestra con adicioacuten en el extracto
de la muestra sin adicioacuten (o blanco) y en el patroacuten antildeadido respectivamente
Tabla IV6 Recuperaciones (R) para vino tinto y vino blanco evaluadas para dos niveles de concentracioacuten 5 y 20 ngmL
Compuesto
Vino tinto Vino Blanco
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
AME 97 3 105 6 104 9 96 5
BEN 88 11 105 3 101 1 98 4
BOS 91 13 110 2 88 13 97 3
39
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Compuesto
Vino tinto Vino blanco
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
CAR 99 6 99 3 122 3 109 1
CYP 91 2 111 1 101 4 100 6
DIM 112 3 110 9 102 24 99 11
FEH 91 4 108 0 102 20 95 2
FEP 89 8 102 7 94 5 84 1
FLU 95 10 104 4 109 5 100 8
IMI 73 11 115 9 80 13 100 2
IPR 84 13 99 3 111 3 99 4
MAN 88 22 112 8 112 3 99 4
MET 99 3 106 5 106 3 98 2
MYC 84 9 106 13 88 17 86 3
PEN 84 9 102 5 84 8 90 5
PYC 96 6 105 4 100 2 95 4
PYM 90 12 112 14 106 4 97 1
TEC 89 8 101 6 98 12 94 1
TEF 93 10 102 5 107 2 97 3
TBZ 94 17 115 8 79 5 106 2
TME 67 2 101 7 84 18 90 11
THI-M ne - 74 7 ne - 89 24
TRI 88 12 97 6 102 6 92 2
ne No evaluado El nivel de adicioacuten es inferior al LOQ del meacutetodo para este compuesto
Para estudiar la reproducibilidad del meacutetodo analiacutetico global (correspondientes a los datos de preparacioacuten de
muestra y determinacioacuten) es decir la concordancia de varias medidas realizadas en diacuteas diferentes se procedioacute a la
extraccioacuten en las condiciones oacuteptimas tanto de vino blanco como tinto Las extracciones y determinaciones se
realizaron durante tres diacuteas consecutivos realizando tres reacuteplicas por vino y por diacutea con un nivel de adicioacuten en
muestra de 10 ngmL un blanco de muestra cada diacutea En la Tabla IV7 se muestran los resultados como
recuperaciones (R) en condiciones de reproducibilidad obtenidos para ambos tipos de vino dando valores entre
64-116 para muestras de vino blanco y valores situados entre 68-108 para muestras de vino tinto con la
excepcioacuten del TME para el que se ha obtenido un valor no aceptable en cuanto a la exactitud medida en
condiciones de reproducibilidad A la vista de los resultados obtenidos con estas pruebas se considera necesario el
empleo de IS adicionales para la mejora en la exactitud del meacutetodo para algunos compuestos por ejemplo el
TME
40
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Tabla IV7 Recuperaciones en condiciones de reproducibilidad (R plusmn SD) para vino blanco y tinto
Compuesto
Vino tinto Vino blanco
R
10 ngmL CV ()
R
10 ngmL CV ()
AME 90 5 101 13
BEN 96 5 102 7
BOS 97 6 100 8
CAR 97 3 94 5
CYP 103 3 105 12
DIM 104 7 106 8
FEH 90 16 83 15
FEP 91 5 90 4
FLU 103 7 102 6
IMI 99 14 101 14
IPR 91 5 100 13
MAN 108 5 108 13
MET 101 5 101 5
MYC 105 16 102 14
PEN 96 11 92 10
PYC 99 12 97 12
PYM 102 4 116 8
TEC 99 9 97 16
TEF 99 8 105 11
TBZ 68 4 84 5
TME 47 13 64 10
THI-M 107 11 104 16
TRI 95 14 103 4
En la Tabla IV8 se muestran los liacutemites de cuantificacioacuten (LOQs) del meacutetodo del meacutetodo de SPE-UPLC-ESI-
MSMS obtenidos para los diferentes pesticidas Los valores obtenidos son ideacutenticos a los LOQs instrumentales
excepto en el caso de aquellos compuestos para los que se observaronfuertes efectos de matriz (Tabla IV5) En
estos casos (CAR TBZ IMI y TME) los LOQs del meacutetodo se incrementan seguacuten la atenuacioacuten de sentildeal
observada
41
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Tabla IV8 Liacutemites de cuantificacioacuten LOQs (ngmL) del meacutetodo obtendos para cada compuesto
Compuesto LOQ (ngmL) Compuesto LOQ (ngmL)
AME 04 MET 01
BEN 01 MYC 04
BOS 02 PEN 02
CAR 03 PYC 02
CYP 02 PYM 01
DIM 07 TEC 05
FEH 05 TEF 01
FEP 01 TBZ 04
FLU 02 TME 02
IMI 06 THI-M 10
IPR 01 TRI 07
MAN 01
5 APLICACIOacuteN A MUESTRAS DE VINO COMERCIALES
Una vez optimizadas las condiciones del meacutetodo y estudiadas las caracteriacutesticas del meacutetodo desarrollado se aplicoacute
a la determinacioacuten de los compuestos de intereacutes estudiados en muestras de vino blanco y vino tinto comerciales
producidos en diferentes paiacuteses En la Tabla IV9 se muestra el paiacutes de origen de cada muestra comercial
identificadas con un coacutedigo alfanumeacuterico y antildeo de produccioacuten
42
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Tabla IV9 Coacutedigo asignado para los diferentes vinos comerciales blancos y tintos analizados Indicando el paiacutes de origen y
antildeo de produccioacuten
Coacutedigo Denominacioacuten de origen Antildeo de produccioacuten
bull Vinos Blancos
W1 Alemania 2014
W2 Espantildea 2012
W3 Espantildea 2016
W4 Portugal Desconocido
W5 Francia 2015
W6 Francia 2015
W7 Espantildea 2016
bull Vinos Tintos
R1 Espantildea 2015
R2 Sudaacutefrica 2015
R3 Chile 2015
R4 Francia 2015
R5 China Desconocido
R6 Espantildea 2016
R7 Australia 2014
R8 Francia 2013
R9 Francia 2015
A continuacioacuten en la Tabla IV10 y la Tabla IV11 se recogen los resultados obtenidos en el anaacutelisis de las
muestras comerciales Los datos obtenidos corresponden en todos los casos al uso de patrones de calibracioacuten
como teacutecnica de cuantificacioacuten
Tabla IV10 Concentracioacuten (ngmL) encontradas en las diferentes muestras de vino blanco comercial analizadas mediante
SPE-UPLC-MSMS n=2 reacuteplicas y al final el sumatorio de las concentraciones encontradas
Compuesto W1 W2 W3 W4 W5 W6 W7
AME 04 nd nd nd 41 nd nd
BEN nd nd 14 nd nd nd nd
BOS 84 102 520 54 197 nd nd
CAR nd 115 56 nd nd nd nd
CYP 08 59 112 nd nd 26 nd
43
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Compuesto W1 W2 W3 W4 W5 W6 W7
DIM 14 84 400 09 32 50 nd
FEH 85 809 639 15 187 nd nd
FLU 11 05 92 nd 77 32 nd
IMI nd 136 88 29 nd nd 69
IPR 30 749 1144 14 nd nd nd
MAN nd nd nd nd nd 30 nd
MET 04 273 494 63 nd nd 172
MYC 09 nd 35 nd nd nd nd
PYM 15 469 584 08 24 35 nd
TEC 11 nd 58 nd nd nd nd
TRI nd 67 61 nd nd nd nd
sumconcentracioacuten
(ngmL) 274 2868 4358 192 558 173 862
nd no detectado
Tabla IV11 Concentracioacuten (ngmL) encontradas en las diferentes muestras de vino tinto comercial analizadas mediante
SPE-UPLC-MSMS n= 2 reacuteplicas y al final el sumatorio de las concentraciones encontradas
Compuesto R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9
AME nd nd nd 30 nd nd nd nd 16
BEN nd nd nd 07 nd nd nd nd nd
BOS nd 55 21 196 nd nd nd 73 21
CAR nd nd 04 17 249 20 nd nd nd
CYP 34 08 02 22 nd 136 nd 85 nd
DIM nd 33 nd 52 233 46 nd 61 23
FEH nd nd nd 1070 nd 10 nd 1307 14
FLU nd nd nd 20 nd nd nd nd nd
IPR 16 nd nd 17 nd 22 nd nd nd
MAN nd nd nd 17 nd nd nd 20 nd
MET 126 nd nd 14 55 313 30 44 39
MYC nd nd nd 05 nd 32 nd nd nd
PYM 19 nd 03 185 49 281 nd 24 nd
TEC 25 06 39 29 nd nd nd 21 20
TEF nd 01 12 nd nd nd nd nd nd
sumconcentracioacuten
(ngmL) 220 48 81 1681 586 860 30 1635 133
nd no detectado 44
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
En los resultados de los anaacutelisis podemos observar que en ninguna de las muestras comerciales de vino blanco
aparecieron los siguientes compuestos FEP PEN PYC TEF TBZ THI-M y TME y en los vinos tintos
comerciales no aparece a ninguna concentracioacuten FEP IMI PEN PYC TBZ TME THI-M y TRI No se
detectaron para dichas muestras de vino a niveles superiores a los LOQs del meacutetodo propuesto
Cuando se detecta un compuesto positivo se compara el pico cromatograacutefico del compuesto con el de un patroacuten
verificando la coincidencia del tiempo de retencioacuten (maacutexima diferencia 01 min) y la relacioacuten entre transiciones
(maacutexima diferencia 30 ) En la Figura IV6 y la Figura IV7 se muestran los cromatogramas para el compuesto
CYP obtenido en condiciones oacuteptimas para la muestra de vino blanco W6 y en un patroacuten de 5 ngmL
respectivamente En este caso el intervalo de tolerancia para la relacioacuten de intensidad entre transiciones es
IP2IP1=061plusmn018
Figura IV6 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el CYP en la muestra W6 (26 ngmL) Transicioacuten
superior 226gt93 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 226gt108 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades IP2IP1= 066
Figura IV7 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el CYP en un patroacuten de 5 ngmL Transicioacuten
superior 226gt93 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 226gt108 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades IP2IP1=061plusmn018
45
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Otro ejemplo de compuesto positivo en abundantes muestras comerciales de estudio es el Metalaxyl positivo con
una concentracioacuten de 04 ngmL en el vino con referencia W1 (Figura IV8) y positivo con una concentracioacuten de
313 ngmL en el vino con referencia R6 (Figura IV9) Ambas se comparan con el cromatograma de un patroacuten
de Metalaxyl de 1 ngmL (Figura IV10) El grado de concordancia en los tiempos de retencioacuten y la relacioacuten de
intensidades entre transiciones es satisfactorio
Figura IV8 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el MET en la muestra W1 (04 ngmL) Transicioacuten
superior 2801gt2201 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 2801gt1921 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades
IP2IP1=056
Figura IV9 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el MET en la muestra R6 (313 ngmL) Transicioacuten
superior 2801gt2201 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 2801gt1921 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades IP2IP1=
056
46
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Figura IV10 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el MET en un patroacuten de 1 ngmL Transicioacuten
superior 2801gt2201 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 2801gt1921 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades
IP2IP1=057plusmn017
Es de destacar que aunque se detectaron bastantes pesticidas en las diferentes muestras de vino comerciales pero
en ninguacuten caso superaron el 10 de los LMRs permitidos en uvas tal y como se recomienda ya que todaviacutea no
existen LMRs para vino en la legislacioacuten vigente No obstante el nivel total de concentracioacuten (sumatorio de
concentraciones Tabla IV10 y Tabla VI11) es significativo para varias muestras tanto de vinos blancos (W2 y
W3) como tintos (R4 y R8)
47
Capiacutetulo V Conclusiones
CAPIacuteTULO V CONCLUSIONES
En este trabajo se ha estudiado un meacutetodo para la cuantificacioacuten de pesticidas concretamente veinte fungicidas y
tres insecticidas en vino blanco y tinto En la etapa de preparacioacuten de muestra se optimizoacute la extraccioacuten en fase
soacutelida (SPE) utilizando cartuchos OASIS HLB (200 mg) compuestos por divinilbenceno-N-vinilpirrolidona
(DVB-VP) como adsorbente Como teacutecnica de determinacioacuten se utilizoacute cromatografiacutea de liacutequidos con una
interfase de electroespray acoplada a espectrometriacutea de masas (UPLC-ESI-MSMS)
Las conclusiones generales obtenidas a partir de los resultados de este proyecto relativo a la determinacioacuten de
fitosanitarios en vino son
Ante los problemas de retencioacuten que presentan los cartuchos OASIS MAX (150 mg) para algunos
compuestos los cartuchos OASIS HLB (200 mg) junto con la combinacioacuten metanolacetonitrilo (2080)
como disolvente de elucioacuten son elegidos como mejor opcioacuten en la extraccioacuten en fase soacutelida de pesticidas
en muestras con matrices complejas como es el caso del vino Asiacute se consigue la retencioacuten selectiva de
componentes de la matriz y proporciona extractos con menor porcentaje de interferencias
El meacutetodo estudiado y optimizado se puede aplicar tanto a vinos blancos como a vinos tintos procesados
a partir de distintas variedades de uvas
Los liacutemites de cuantificacioacuten (LOQs) del estudio se situacutean la mayoriacutea por debajo de 10 ngmL excepto
en el caso de THI-M que asciende al valor de 20 ngmL El rango de respuesta lineal abarca hasta 200
ngmL y el tiempo de anaacutelisis ha sido de solo 10 minutos por muestra
En todas las muestras de vino (blancos y tintos) comerciales analizadas se han detectado la presencia de
varios pesticidas sin embargo todas las concentraciones encontradas se encuentran por debajo del 10
de los LMRs fijados en uvas tal y como recomienda la legislacioacuten por lo que no se considera
preocupante
48
Capiacutetulo V Conclusioacutens
CAPIacuteTULO V CONCLUSIOacuteNS
Neste traballo estudouse un meacutetodo para a cuantificacioacuten de pesticidas en particular vinte funxicidas e tres
insecticidas en vintildeo branco e maacuteis tinto No paso da preparacioacuten da mostra optimizouse a extraccioacuten en fase
soacutelida (SPE) empregando cartuchos OASIS HLB (200 mg) compostos por divinilbenceno-N-pirrolidona (DVB-
VP) como adsorbente Para a teacutecnica de determinacioacuten utilizouse cromatografiacutea de liacutequidos con unha interfase de
electroespray acoplada a espectrometriacutea de masas (UPLC-ESI-MSMS)
As conclusioacutens xerais a obtidas a partir dos resultados deste proxecto relativo aacute determinacioacuten de pesticidas en
vintildeo son
Ante os problemas de retencioacuten que mostraban os cartuchos OASIS MAX (150 mg) para alguacuten
compostos os cartuchos OASIS HLB (200 mg) en conxunto coa mistura metanolacetonitrilo (2080)
como disolvente de elucioacuten son elexidos como mellor opcioacuten na extraccioacuten en fase soacutelida de pesticidas
en mostras con matrices complexas como eacute o caso do vintildeo Asiacute eacute conseguida a retencioacuten selectiva de
componentes da matriz e proporciona extractos con menos porcentaxe de interferencias
O meacutetodo estudado e optimizado poacutedese aplicar tanto a vintildeos brancos coma tintos procesados a partir de
diferentes variedades de uvas
Os liacutemites de cuantificacioacuten do estudo (LOQs) son maacuteis baixos de 10 ngmL agaacutes no caso do THI-M
que ascende ao valor de 20 ngmL O rango de resposta lineal cobre ata 200 ngmL e o tempo de anaacutelise
foi de soacute 10 minuacutetos por mostra
En todas as mostras de vintildeo (brancos e tintos) comercial analizadas detectouse a presenza de varios
pesticidas maacuteis poreacuten todas as concentracioacutens atopadas son inferiores ao 10 dos LMR fixados en uvas
tal e como recomenda a lexislacioacuten polo que non se considera preocupante
49
Chapter V Conclusions
CHAPTER V CONCLUSIONS
In this work we have studied a method for the quantification of pesticides specifically twenty fungicides and
three insecticides in white and red wine In the sample preparation step the solid phase extraction was optimized
using cartridges OASIS HLB (200 mg) containing divinylbenzene-N-vinylpyrrolidone (DVB-VP) as adsorbent
As determination technique ultraperformance liquid chromatography was used with an electrospray interface
coupled to mass spectrometry (UPLC-ESI-MS7MS)
The general conclusions drawn from the results of this project concerning the determination of pesticides in wine
are
Due to the retention problems presented by the OASIS MAX sorbent (150 mg) for some compounds of
this project the cartridges OASIS HLB (200 mg) together with the methanolacetonitrile (2080) mixture
are chosen as the best option in the solid phase extraction of pesticides in samples with complex
matrices as is the case with the wine
The method studied and optimized can be applied to both white and red wines obtained from different
varieties of grapes
The limits of quantification (LOQs) were below 10 ngmL for most of the compounds except in the
case of THI-M with a LOQ of to 10 ngmL The linear response range covers up to 200 ngmL and the
analysis time was only 10 minutes per sample
In all commercial wine samples (white and red) analyzed the presence of several pesticides was
conformed however all the concentrations obtained are below 10 of the Maximum residue
levels(MRLs) fixed in grapes as recommended by legislation
50
VI Bibliografiacutea VI BIBLIOGRAFIacuteA [1] Ministerio de agricultura y pesca alimentacioacuten y medio ambiente mhttpwwwmapamagobesescalidad-y-evaluacion-ambientaltemasproductos-quimicosfitosanitarios (Acceso el diacutea 11052017) [2] httpwwwcricyteduarenciclopediaterminosProducFitohtm (Acceso el diacutea 11052017) [3] WERNER BALTES ldquoQuiacutemica de los alimentosrdquo Editorial Acribia SA 2007 Capiacutetulo 11 ldquoResiduos en los alimentosrdquo paacuteginas 206-217
[4] RLabrada JCCaseley CParker ldquoESTUDIO FAO PRODUCCIOacuteN Y PROTECCIOacuteN VEGETAL 120rdquo Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentacioacuten Roma 1996 ISSN 1014- Capiacutetulo 10 Herbicidas httpwwwfaoorgdocrepT1147St1147s00htmContents (Acceso el diacutea 12052017)
[5] Taberner Palou Andreu Cirujeda Ranzenberger Alicia Zaragoza Larios Carlos ldquoManejo de poblaciones de malezas resistentes a herbicidasrdquo (FAO Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura) 100 preguntas sobre resistencia PDF sacado de httpwwwfaoorg3a-a1422spdf (Acceso el diacutea 12052017) [6] BISSET Juan A Uso correcto de insecticidas control de la resistencia Revista Cubana de Medicina Tropical 2002 vol 54 no 3 p 202-219 [7] DEVINE Gregor J EZA Dominique Ogusuku Elena FURLONGMichael J Uso de insecticidas contexto y consecuencias ecoloacutegicas Revista peruana de medicina experimental y Salud Puacuteblica 2008 vol 25 no 1 p 74-100 [8] Ministerio de agricultura y ganaderiacutea (proteccioacuten agropecuaria servicio de diagnoacutestico fitosanitario) de costa Rica httpwwwmaggocrbibliotecavirtualH20-5054pdf (Acceso el diacutea 11052017) [9] GEPP V MONDINO P Control quiacutemico 2011 PDF obtenido de httpwwwpvfagroeduuyfitopatodocscursosfitopatoMaterialesGuiasC-QUIMICOpdf (Acceso el diacutea 772017) [10] ROSSLENBROICH Hans-Juergen STUEBLER Dietrich Botrytis cinereamdashhistory of chemical control and novel fungicides for its management Crop Protection 2000 vol 19 no 8 p 557-561 [11] Figura 11 httpwwwvitiviniculturanetbotritis-o-podredumbre-gris-botrytis-cinerea-pershtml (Acceso el diacutea 12052017) [12] CAMPBELL Paul BENDEK Carlos LATORRE Bernardo A Riesgo de oiacutedio (Erysiphe necator) de la vid en relacioacuten con el desarrollo de los racimos Ciencia e investigacioacuten agraria 2007 vol 34 no 1 p 5-11 [13] ldquoCoacutemo combatir el oiacutedio de la vidrdquo Jose Javier Peacuterez de Obanos Castillo PDF sacado de httpswwwnavarraesNRrdonlyres05E65D9B-D1A2-4EAD-9A63-AFF1D3215552135109Comocombatireloidiodelavidpdf (Acceso el diacutea 12052017) [14] Imagen 12 sacadas las 3 de httpwwwvitiviniculturanetoidio-de-la-vidhtml (Acceso el diacutea 12052017) [15] BARRIOS Gonccedilal REYES Joan Modelizacioacuten del Mildiu de la Vid 2004 httpwwwruralcatnetmigracio_resources617683_mildiusPDF (Acceso el diacutea 12052017) [16] Imaacutegenes sacadas de httpwwwvitiviniculturanetmildiu-de-la-vid-enfermedades-vinahtml (Acceso el diacutea 13052017) [17] HUQ Mainul MEISNER Craig DASGUPTA Susmita Health effects and pesticide perception as determinants of pesticide use evidence from Bangladesh httpagrisfaoorgagris-searchsearchdorecordID=US2012411738 (Acceso el diacutea 13052017)
51
IV Bibliografiacutea [18] BADII Mohammad H LANDEROS Jeroacutenimo Plaguicidas que afectan a la salud humana y la sustentabilidad CULCyT 2015 no 19 Revista vista en httpopenjournaluacjmxojsindexphpculcytarticleview454 (Acceso el diacutea 772017) [19] OLEA Nicolaacutes FERNAacuteNDEZ Mariana F Plaguicidas persistentes En Congreso Implementacioacuten del Convenio de Contaminantes Orgaacutenicos Persistentes Madrid 2001 p 26-27 [20] httpwwwfaoorgfao-who-codexalimentariusabout-codexes (Acceso el diacutea 14052017) [21] httpeceuropaeufoodplantpesticidesmax_residue_levels_en (Acceso el diacutea 14052017 [22] ORDONtildeEZ Juan A Cambero Rodriacuteguez MI Fernaacutendez Aacutelvarez L Garciacutea Sanz ML Garciacutea de Fernando Minguilloacuten GD de la Hoz Perales L Selgas Cortecero MD Tecnologiacutea de los alimentos Volumen 1 Componentes de los Alimentos y Procesos Siacutentesis Madrid 1998paacutegs 349-351 [23] CELA Rafael Casais Maria del Carmen Lorenzo Rosa Antonia Teacutecnicas de separacioacuten en quiacutemica analiacutetica Siacutentesis 2002 Capiacutetulo 11 Extraccioacuten y lixiviacioacuten por disolvente (paacutegs206-260) [24] CANTWELL Frederick F LOSIER Manon Liquidmdashliquid extraction Comprehensive Analytical Chemistry 2002 vol 37 p 297-340 [25] Imagen de LLE sacada de httpprocesosbiowikispacescomExtracciC3B3n+liquido-liquido (Acceso el diacutea 15052017) [26] HENNION Marie-Claire Solid-phase extraction method development sorbents and coupling with liquid chromatography Journal of Chromatography A 1999 vol 856 no 1 p 3-54 [27] CELA Rafael Casais Maria del Carmen Lorenzo Rosa Antonia Teacutecnicas de separacioacuten en quiacutemica analiacutetica Siacutentesis 2002 Capiacutetulo 16 Teacutecnicas de adsorcioacuten y absorcioacuten en la preparacioacuten de muestras Extraccioacuten y microextraccioacuten en fase soacutelida (paacutegs520-555) [28] Imagen spe sacada httptoxicocbblogspotcomes201310las-intoxicaciones-con-farmacoshtml (Acceso el diacutea 15052017) [29] Chaacutefer Pericaacutes Consuelo Acoplamiento microextraccioacuten en fase soacutelida-cromatografiacutea (2006) httprodericuveshandle1055014940 (Acceso el diacutea 16052017) [30] Imagen SPME httpwwwscieloorgcoscielophpscript=sci_arttextamppid=S0122-53832002000100005 (Acceso el diacutea 16052017) [31] MONTES GOYANES Rosa Mariacutea Avances en teacutecnicas de microextraccioacuten para la determinacioacuten de compuestos traza en muestras medioambientales y alimentarias Teacutesis doctoral Noviembre 2009 (Paacutegs 34-55) [32] LEHOTAY Steven J Ae Son Kyung KwonHyeyoung Koesukwiwat Urairat Fu Wusheng Mastovska Katerina Hoh Eunha Leepipatpiboon Natchanun Comparison of QuEChERS sample preparation methods for the analysis of pesticide residues in fruits and vegetables Journal of Chromatography A 2010 vol 1217 no 16 p 2548-2560 [33] Imagen QueChERS httpswwwresearchgatenetpublication279221361_QuEChERS_A_Sample_Preparation_for_Extraction_of_Carbaryl_from_Rat_Feces (Acceso el diacutea 16052017) [34] STASHENKO Elena E MARTIacuteNEZ Jairo Reneacute Preparacioacuten de la muestra un paso crucial para el anaacutelisis por GC-MS Uma publicaccedilatildeo trimestral do Instituto Internacional de Cromatografia (IIC) Ciecircncia Cromatograacutefica 2011 vol 3 no 1 [35] Imagen GC-MS httpsorgspectroscopyintblogspotcomes201411gas-chromatography-mass-spectrometry-gchtml (Acceso el diacutea 17052017) [36] httpwwwactlabscompageaspxmenu=65ampapp=221ampcat1=534amptp=2amplk=no (Acceso el diacutea 17052017)
52
IV Bibliografiacutea [37] Quintela O Cruz A Concheiro M De Castro A amp Loacutepez-Rivadulla M (2005) Metodologiacutea LC-MS Aspectos generales de la teacutecnica y sus aplicaciones en el campo de la toxicologiacutea Rev Toxicol 22 paacutegs7-14 [38] Imagen LC-MS httpsuploadwikimediaorgwikipediaenff9Liquid_chromatography_tandem_Mass_spectrometry_diagrampng (visto 18052017) [39] Vargas de la Cruz Celia Bertha Adaptacioacuten de la Metodologiacutea Analiacutetica para la determinacioacuten de residuos de plaguicidas en frutas nativas de exportacioacuten mediante Uplc-MsMs (2012) Tesis obtenida en http20062146130handlecybertesis2331 (Acceso el diacutea 772017) [40] ROMERO GONZAacuteLEZ Roberto Fernaacutendez Moreno Joseacute Luis Plaza Bolantildeos Patricia Garrido Frenich Antonia Martiacutenez Vidal Joseacute Luis Empleo de la espectrometriacutea de masas como herramienta para la determinacioacuten de toacutexicos en alimentos hacia la seguridad alimentaria Revista Espantildeola de salud puacuteblica 2007 vol 81 no 5 p 461-474 [41] PAYAacute Andrus Fundamento y Funciones de la Espectrometriacutea de Masas Universidad de Valencia Espantildea 2006 httpmuraluvescaloan (Acceso el diacutea 19052017) [42] Imagen MS sacada de httpsesslidesharenetMaYaTorrezespectrometria-demasas (Acceso el diacutea 21052017) [43] ECONOMOU Anastasios Botitsi Helen Antoniou Spyros Tsipi Despina Determination of multi-class pesticides in wines by solid-phase extraction and liquid chromatography-tandem mass spectrometry Journal of Chromatography A 2009 vol 1216 no 31 p 5856-5867 [44] FONTANA A R Rodriacuteguez I Ramil M Altamirano JC Cela R Liquid chromatography time-of-flight mass spectrometry following sorptive microextraction for the determination of fungicide residues in wine Analytical and bioanalytical chemistry 2011 vol 401 no 2 p 767-775 [45] PELAJIĆ Maja G Peček DM Pavlović DV Čepo Novel multiresidue method for determination of pesticides in red wine using gas chromatographyndashmass spectrometry and solid phase extraction Food chemistry 2016 vol 200 p 98-106 [46] Ignaz J Buerge Juumlrgen Krauss Rociacuteo Loacutepez-Cabeza Werner Siegfried Michael Stuumlssi Felix E Wettstein Thomas Poiger Stereoselective Metabolism of the Sterol Biosynthesis Inhibitor Fungicides Fenpropidin Fenpropimorph and Spiroxamine in Grapes Sugar Beets and Wheat Journal of Agricultural and Food Chemistry 2016 vol 64 no 26 p 5301-5309 [47] M Hu X Liu F Dong J Xu S Li H Xu Y Zheng Determination of ametoctradin residue in fruits and vegetables by modified quick easy cheap effective rugged and safe method using ultra-performance liquid chromatographytandem mass spectrometry Food chemistry 2015 vol 175 p 395-400 [48] WALORCZYK Stanisław DROŻDŻYŃSKI Dariusz GNUSOWSKI Bogusław Multiresidue determination of 160 pesticides in wines employing mixed-mode dispersive-solid phase extraction and gas chromatographyndashtandem mass spectrometry Talanta 2011 vol 85 no 4 p 1856-1870 [49] Tianyang Guo Pingping Fang Juanjuan Jiang Feng Zhan Wei Yong Jiahui Liu YiYang Dong Rapid screening and quantification of residual pesticides and illegal adulterants in red wine by direct analysis in real time mass spectrometry Journal of Chromatography A 2016 vol 1471 p 27-3 [50] GONZAacuteLEZ-RODRIacuteGUEZ R M CANCHO-GRANDE B SIMAL-GAacuteNDARA J Decay of fungicide residues during vinification of white grapes harvested after the application of some new active substances against downy mildew Food chemistry 2011 vol 125 no 2 p 549-560 [51] CARPINTEIRO I Ramil M Rodriacuteguez I Cela R Determination of fungicides in wine by mixed-mode solid phase extraction and liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry Journal of Chromatography A 2010 vol 1217 no 48 p 7484-7492
53
Capiacutetulo I Introduccioacuten
positivos o negativos Un espectrometro de masas cuenta con un dispositivo de introduccioacuten de muestra una
caacutemara de ionizacioacuten un sistema para la aceleracioacuten de los iones uno o varios analizadores de masas y un detector
[40]
El fundamento de la espectrometriacutea de masas se basa en la separacioacuten de iones en base a la relacioacuten masacarga
(mz) El proceso consta fundamentalmente de cuatro etapas La
primera es la ionizacioacuten de la muestra los iones formados se aceleran
debido a la accioacuten de un campo eleacutectrico variable separacioacuten de los
iones seguacuten su masacarga deteccioacuten de los iones y produccioacuten de la
sentildeal eleacutectrica El analizador de masas es el encargado de la separacioacuten
de los iones en funcioacuten a su mz entre los que maacutes destacan
analizador de masas cuadrupolar que dispersa simultaacuteneamente todos
los iones en funcioacuten de la relacioacuten mz analizador de masas de
tiempo de vuelo (TOF) consta de un tubo a alto vaciacuteo sobre el que no
actuacutea ninguacuten campo eleacutectrico al cual llegan todos los iones acelerados con la misma energiacutea cineacutetica y en el tubo
las velocidades variacutean seguacuten mz y analizador de trampa de iones en doacutende los iones gaseosos quedan aislados
durante largos periacuteodos de tiempo por la accioacuten del campo eleacutectrico [41]
4RESUMEN BIBLIOGRAacuteFICO DE LAS TEacuteCNICAS DE EXTRACCIOacuteN Y
DETERMINACIOacuteN DE PESTICIDAS EN VINO
En la bibliografiacutea se han descrito diversas teacutecnicas y diferentes combinaciones entre teacutecnicas de extraccioacuten y
distintas teacutecnicas de cuantificacioacuten e identificacioacuten para esos analitos Entre estas teacutecnicas los valores de los liacutemites
de cuantificacioacuten (LOQs) y las recuperaciones relativas pueden diferir en el resultado en un rango de valores asiacute
como el tiempo total empleado para el anaacutelisis y para la preparacioacuten de la muestra
Por lo general el meacutetodo de extraccioacuten de los analitos de intereacutes maacutes empleado es la extraccioacuten en fase soacutelida
(SPE) la cuaacutel le ha estado ganando terreno a la extraccioacuten liacutequido-liacutequido aunque tambieacuten se estaacute viendo cada vez
maacutes desplazada debido al creciente uso de la teacutecnica QuEChERS
Figura I11 Etapas de la espectrometriacutea de masas [42]
16
Capiacutetulo I Introduccioacuten
En el estudio de ECONOMOU et al [43] realizado en el antildeo 2009 en Grecia se empleoacute la extraccioacuten en fase
soacutelida con deteccioacuten en cromatografiacutea de liacutequidos acoplada a espectrometriacutea de masas en taacutendem (SPE-LC-ESI-
MSMS) Para la preparacioacuten de la muestra diluyeron 10 mL de vino (tanto blanco como tinto) a un volumen
final de 100 mL con agua ultrapura antes de la SPE Determinaron las recuperaciones de la extraccioacuten para dos
niveles de concentracioacuten 0010 y 0050 mgL realizando 8 medidas diarias durante 3 diacuteas consecutivos
encontraacutendose unos valores que variacutean dentro del rango 70-110 para todos los pesticidas en los dos niveles Para
la determinacioacuten y cuantificacioacuten de 46 pesticidas emplearon la teacutecnica de cromatografiacutea de liacutequidos con
espectrometriacutea de masas con un volumen de inyeccioacuten de 20 microL y un flujo de fase moacutevil de 02 mLmin
aclopada a espectrometriacutea de masas en taacutendem
Con la misma teacutecnica de extraccioacuten PELAJIĆ et al [45] durante el antildeo 2015 en Croacia llevaron a cabo la
determinacioacuten de 25 residuos de plaguicidas en vino tinto El meacutetodo que desarrollaron para dicha finalidad fue el
acoplamiento SPE-GC-MS Para la preparacioacuten de la muestra emplearon 10 mL de vino diluidos 11 con agua
ultrapura hasta un volumen final de 20 mL Calcularon las recuperaciones de la extraccioacuten y se encontroacute un rango
para todos los pesticidas en las muestras de 70-120 Para la determinacioacuten en cromatografiacutea de gases-
espectrometriacutea de masas se empleoacute un volumen de inyeccioacuten de 5 μL y un flujo de fase moacutevil de 10 mLmin
Mediante el acoplamiento de teacutecnicas SPE dispersiva-GC-MS WALORCZYK et al [48] en el antildeo 2011 en
Polonia llevaron a cabo la cuantificacioacuten de 160 pesticidas en diferentes clases de vino tinto rosado y blanco Con
10 g de vino y 10 mL de acetonitrilo se realizaron pruebas de recuperacioacuten en la fase de extraccioacuten para vino
tinto con los niveles de concentracioacuten 001 005 y 02 mgkg y para los vinos rosado y blanco con el nivel de
concentracioacuten 005mgkg y encontraron que a todos los niveles de concentracioacuten los valores de recuperacioacuten
rondan el rango 80-110 Para la teacutecnica cromatograacutefica se utilizoacute un volumen de inyeccioacuten de 5 microL
El acoplamiento LLE-SPE-LCDAD fue desarrollado por GONZAacuteLEZ-RODRIacuteGUEZ et al [50] en el antildeo
2010 en la provincia de Orense para la determinacioacuten de nuevos fungicidas propuestos para combatir el hongo
que provoca la enfermedad del mildium En la preparacioacuten de la muestra emplearon 15 mL de vino blanco para la
extraccioacuten en la cual fueron calculadas las recuperaciones relativas para dos niveles de concentracioacuten 005 y 05
mgkg en donde se establece un rango de entre 70-110 para todos los analitos Para la determinacioacuten mediante
cromatografiacutea de liacutequidos se empleoacute un volumen de inyeccioacuten de 2 μL y como meacutetodo de deteccioacuten utilizaron un
detector de diodos array
La microextraccioacuten sorptiva en fase soacutelida fue empleada en la publicacioacuten de FONTANA et al [44] junto con un
acoplamiento entre cromatografiacutea de liacutequidos y espectrometriacutea de masas para la determinacioacuten de 15 fungicidas
en vino realizada durante el 2010 en el noroeste de Espantildea Para la preparacioacuten de la muestra emplearon 10 mL
17
Capiacutetulo I Introduccioacuten
de vino diluiacutedos con el mismo volumen de agua ultrapura y un sorbente en forma de disco de silicona con un
volumen de 12 microL La recuperacioacuten de la extraccioacuten se calculoacute para vino tinto (Menciacutea) y vino blanco (Godello)
realizando tres replicas dentro de un mismo diacutea para los niveles de concentracioacuten 10 y 50 ngmL y nueve reacuteplicas
realizando el anaacutelisis en tres diacuteas consecutivos para el nivel de concentracioacuten de 25 ngmL y los resultados
obtenidos dan unos valores de recuperacioacuten dentro del rango 75-117 En el sistema LC-QTOF-MS el volumen
de inyeccioacuten fue de 15 microL
El otro meacutetodo de extraccioacuten mencionado anteriormente es QuEChERS estaacute en auge como meacutetodo de extracioacuten
de residuos de pesticidas en matrices como la del vino o la uva ya que incrementa la velocidad del anaacutelisis y reduce
el efecto de matriz BUERGE et al [46] seguido de una deteccioacuten mediante GC-MSMS realizaron una estapa
de extraccioacuten QuEChERS con alguna modificacioacuten acetato de sodio en lugar de cloruro soacutedico y acetato de etilo
en lugar de acetonitrilo utilizando 5 g de uva para la determinacioacuten de residuos de 4 pesticidas durante el antildeo
2016 Las recuperaciones de extraccioacuten resultaron ser valores entre 91-149 en uva a distintos niveles de
concentracioacuten 005 05 y 5 mgkg
Para la determinacioacuten de Ametoctradin HU et al [47] llevaron a cabo una extraccioacuten QuEChERS empleando 10
g de uva con deteccioacuten mediante el acoplamiento UPLC-MSMS utilizando un volumen de inyeccioacuten de 5 μL y
un flujo de fase moacutevil de 03 mLmin Las recuperaciones de la extraccioacuten se calcularon para tres niveles de
concentracioacuten 1 10 100 μgL de dos formas distintas en tres diacuteas consecutivos realizando 5 reacuteplicas al diacutea o en
dentro de un mismo diacutea realizando 15 reacuteplicas los resultados de todos los caacutelculos se encuentran dentro del rango
818-1001
Siguiendo con el mismo modo de extraccioacuten GUO et al [49] publicaron sus estudios para la determinacioacuten de
50 pesticidas y 12 adulterantes en vino tinto Para la extraccioacuten QuEChERS se utilizaron 10 mL de vino tinto con
10 mL de acetonitrilo y calcularon las recuperaciones para tres niveles de concentracioacuten 50 100 y 250 ngmL
encontraacutendose un rango de valores entre 75-120 El meacutetodo de deteccioacuten se llevoacute a cabo mediante un anaacutelisis
directo en tiempo real junto con espectrometriacutea de masas en tandem con un cuadrupolo (DART-MSMS) la
teacutecnica DART es un meacutetodo raacutepido para cribar y cuantificar los analitos de estudio que prescinde de la etapa de
separacioacuten cromatograacutefica
A continuacioacuten se recogen en la Tabla I3 los liacutemites de cuantificacioacuten (LOQs) de los analitos de intereacutes en este
trabajo caacutelculados por los diferentes meacutetodos encontrados en bibliografiacutea citados anteriormente en este apartado
18
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Tabla I3 LOQs de los analitos de intereacutes descritos para los distintos meacutetodos encontrados en la bibliografiacutea
Compuesto LOQs
Compuesto LOQs
V Blanco V Tinto Uva V Blanco V Tinto Uva
AME - - 0032μgkg[47] MET 86 μgL[43]
22 μgL[44]
89 μgL[43]
22 μgL[44]
5 μgL[45]
259 ngmL[49]
001mgkg[48]
BEN 02 μgL[44]
0001 mgL[50]
02 μgL[44]
001 μgL[45]
280ngmL[49]
005 mgkg[48] MYC 30 μgL[43]
08 μgL[44]
36 μgL[43]
10 μgL[44]
025 μgL[45]
331ngmL[49]
001 mgkg[48]
BOS 0065 mgL[50] 05 μgL[45]
1076 ngmL[49] 001 mgkg[48] PEN
56 μgL[43]
05 μgL[44]
49 μgL[43]
04 μgL[44]
220ngmL[49]
001 mgkg[48]
CAR - 386 ngmL[49] - PYC 0003mgL[50] 07 μgL[45] 001 mgkg[48]
CYP 15 μgL[43]
04 μgL[44]
0001 mgL[50]
22 μgL[43]
06 μgL[44]
312 ngmL[49]
001 mgkg[48] PYM 17 μgL[43] 22 μgL[43]
10 μgL[45] 001 mgkg[48]
DIM 18 μgL[43] 20 μgL[43] 001 mgkg[48] TEC 03 μgL[44]
03 μgL[44]
10 μgL[45]
160ngmL[49]
001 mgkg[48]
FEH 17 μgL[43] 22 μgL[43]
938 ngmL[49] 001 mgkg[48] TEF - 876ngmL[49] -
FEP - - 002mgkg[46] TBZ 15μgL [43] 29μgL[43] 001 mgkg[48]
FLU 005 μgL[45] TME - 25 μgL[45] 001 mgkg[48]
IMI 21 μgL[43] 22 μgL[43]
225 ngmL[49] - THI-M 92 μgL[43] 89 μgL[43] -
IPR 07 μgL[44] 07 μgL[44] 001 mgkg[48] TRI 10 μgL[44] 12 μgL[44] 001 mgkg[48]
MAN 0011 mgL[50] - -
5 DISTRIBUCIOacuteN DE PESTICIDAS EN VINOS COMERCIALES
En algunos de los meacutetodos descritos en el apartado anterior se procesaron vinos comerciales encontraacutendose
resultados positivos para muchos residuos de pesticidas y algunos hasta en gran concentracioacuten
ECONOMOU et al [43] mediante el meacutetodo LC-ESI-MSMS realizaron el anaacutelisis de 60 muestras de vino tinto
y blanco recogidos en supermercados locales en Grecia a lo largo de un antildeo El meacutetodo se habiacutea desarrollado
19
Capiacutetulo I Introduccioacuten
para la determinacioacuten de 46 pesticidas pero la mayoriacutea se encuentran con una concentracioacuten por debajo de
001mgL solo ocho plaguicidas se obtuvieron con resultados de concentracioacuten mayores Se muestran los
resultados en la Tabla I4 de los analitos de intereacutes en este estudio
Tabla I4 Nuacutemero de muestras positivas de distintos pesticidas en el anaacutelisis de 60 muestras de vino [43]
Compuesto Positivos con concentracioacuten entre 001-01
mgL
Positivos con concentracioacuten entre 01-1
mgL
PYM 2 (3) 2 (3)
MYC 2 (3) 0 (0)
CAR 11 (18) 7 (12)
THI-M 7 (12) 5 (8)
FEH 5 (8) 0 (0)
MET 1 (2) 0 (0)
Mediante el meacutetodo de microextraccioacuten en fase soacutelida-LC-TOF-MS FONTANA et al [44] aplicaron el
desarrollo del procedimiento a un total de 12 vinos joacutevenes elaborados en el 2010 y correspondientes a diferentes
denominaciones geograacuteficas del noroeste de Espantildea En la Tabla I5 se muestran los datos que han obtenido
Tabla I5 Determinacioacuten de fitosanitarios en vinos comerciales mediante Microextraccioacuten en fase soacutelida-LC-TOF-MS
Valores de concentracioacuten en ngmL [44]
Pesticidas
W 1
Albarintildeo
W5
Ribeiro
W6
Valdeorras
R1
Ribeira Sacra
R3
Ribeiro
R4
Valdeorras
MET 404plusmn06 223plusmn05 311plusmn007 25plusmn03 31plusmn03 74plusmn10
TRI nd nd 36plusmn06 nd nd ltLOQ
IPR 394plusmn03 324plusmn02 324plusmn02 071plusmn007 31plusmn02 28plusmn05
MYC nd nd nd ltLOQ 39plusmn02 nd
TEC 25plusmn01 nd nd nd nd nd
CYP 179plusmn08 ltLOQ ltLOQ 562plusmn002 083plusmn001 nd
BEN 042plusmn001 nd ltLOQ nd 032plusmn001 ltLOQ
ndNo detectados ltLOQ por debajo del liacutemite de cuantificacioacuten del meacutetodo los coacutedigos W y R corresponden respecti-vamente a los vinos blanco y tinto
20
Capiacutetulo I Introduccioacuten
Por uacuteltimo PELAJIĆ et al [45] aplicaron su meacutetodo SPE dispersiva-GC-MS mediante el cual determinaron 25
residuos de plaguicidas en vino tinto a un total de 32 muestras de vino adquiridos en supermercados locales de
Croacia pero de diversos oriacutegenes de procedencia Los resultados que han obtenido se muestran en la Tabla I6
en doacutende un total de 15 plaguicidas han sido detectados y 7 de los cuales se encontraban en una alta
concentracioacuten
Tabla I6 Resultados de los vinos con positivos en pesticidas y sus concentraciones [45]
Vino Paiacutes Residuos de pesticidas (mgKg)
Tinto Francia DIM (0013) MET (0009) IPR (001)
Tinto Alemania BOS (0011)
Tinto Alemania IPR (0009)
Tinto Macedonia MET (0015)
Tinto Moldavia IPR (0008)
Tinto Polonia MET (004)
Tinto Rumania PYM (0058)
Tinto Espantildea TRI (0005) MET (0011)
Tinto Estados Unidos BOS (001)
Rosado Francia BOS (0005)
Blanco Chile TEC (0008)
Blanco Georgia MET (0057)
Blanco Alemania DIM (001) IPR (0054) PYM (0056)
Blanco Sudaacutefrica DIM (0011) IPR (0011)
21
Capiacutetulo II Objetivos y discusioacuten
CAPIacuteTULO II OBJETIVOS Y DISCUSIOacuteN
El objetivo principal que se persigue en este trabajo es el desarrollo de un meacutetodo analiacutetico raacutepido basado en la
extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) y deteccioacuten mediante cromatografiacutea de liacutequidos en la modalidad de UPLC
acoplada a la espectrometriacutea de masas en taacutendem (UPLC-MSMS) para la determinacioacuten multianalito de residuos
de fitosanitarios principalmente fungicidas aunque tambieacuten alguacuten insecticida en muestras de vino blanco y tinto
Para llevar a cabo la finalidad de lo dicho se consideran unos objetivos maacutes especiacuteficos
Minimizar la manipulacioacuten de la muestra para asiacute reducir la cantidad de disolventes y tiempo empleado
Optimizacioacuten de los factores que afectan en la extraccioacuten en la SPE tales como tipo y cantidad de
adsorbente volumen de eluyente etc
Estudio de las condiciones en UPLC-MSMS para una separacioacuten y cuantificacioacuten oacuteptimas
Caracterizacioacuten y validacioacuten del meacutetodo propuesto
Por uacuteltimo una vez cumplidos todos los objetivos anteriores y fijadas las condiciones oacuteptimas el meacutetodo
estudiado se aplica en el anaacutelisis de muestras de vino comercial (blanco y tinto) para determinar si se encuentran
residuos presentes asiacute como conocer en queacute concentracioacuten se encuentran los pesticidas objeto de este estudio
22
Capiacutetulo III Parte experimental
CAPIacuteTULO III PARTE EXPERIMENTAL
1 MATERIAL Y REACTIVOS
11 Material
Material de vidrio de uso comuacuten en el laboratorio vasos de precipitados matraces aforados etc
Micropipetas automaacuteticas de 20-200 microL 20-200 microL 100-1000 microL 1000-5000 microL Eppendorf
Puntas de plaacutestico para micropipetas
Encapsulador y desencapsulador
Soportes y pinzas
Viales de 15 mL transparentes para muestreador automaacutetico de cromatografiacutea (Sugelabor)
Caacutepsulas de aluminio con seacuteptum de Tefloacuten (Sugelabor) y tapones pre-slit para viales
Tubos y conectores de tefloacuten
Cartuchos de divinilbenceno-N-vinilpirrolidona 200 mg Oasis HLB Waters
Cartuchos de divinilbenceno-N-vinilpirrolidona funcionalizados con grupos amina cuaternaria 150 mg
Oasis MAX Waters
Cartuchos de divinilbenceno-N-vinilpirrolidona 60 mg Oasis HLB Waters
12 Reactivos y disolventes
Agua ultrapura Milli-Q
Aacutecido foacutermico (Sigma Aldrich) 95
Acetonitrilo (LichrosolvregMerck) Gradient grade for liquid chromatography
Metanol (LichrosolvregMerck) Gradient grade for liquid chromatography
Etanol (LichrosolvregMerck) Gradient grade for liquid chromatography
13 Patrones
Ametoctradin (AME) Dr Ehrenstrorfer 990
Benalaxyl (BEN) Pestanal Sigma- Aldrich 999
23
Capiacutetulo III Parte experimental
Boscalid (BOS) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Carbendazim (CAR) Pestanal Sigma- Aldrich 992
Cyprodinil (CYP) Pestanal Sigma- Aldrich 998
Dimethomorph (DIM) mezcla de isoacutemeros E + Z Pestanal Sigma- Aldrich 989
Fenhexamid (FEH) Pestanal Sigma- Aldrich 997
Fenpropidin (FEP) Dr Ehrenstrorfer 980
Fluopicolide (FLU) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Imidacloprid (IMI) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Iprovalicarb (IPR) mezcla de isoacutemeros Pestanal Sigma- Aldrich 985
Mandipropamid (MAN) Pestanal Sigma- Aldrich 991
Metalaxyl (MET) Pestanal Sigma- Aldrich 990
Myclobutanil (MYC) Pestanal Sigma- Aldrich 994
Penconazole (PEN) Pestanal Sigma- Aldrich 991
Pyraclostrobin (PYC) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Pyrimethanil (PYM) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Tebuconazol (TEC) Pestanal Sigma- Aldrich 996
Tebufenozide (TEF) Dr Ehrenstrorfer 988
Thiabendazole (TBZ) Pestanal Sigma- Aldrich 999
Thiamethoxam (TME) Pestanal Sigma- Aldrich 996
Thiophanate-methyl (THI-M) Dr Ehrenstrofer 990
Triadimenol (TRI) Mezcla de diastereoisoacutemeros Pestanal Sigma- Aldrich 994
14 Patrones internos
Carbendazim-d3 (CAR-d3) Pestanal Sigma- Aldrich 998
Cyprodinil-d5 (CYP-d5) Pestanal Sigma- Aldrich
Imidacloprid-d4 (IMID-d4) Pestanal Sigma- Aldrich
Metalaxyl 13C6 (MET13C6) Pestanal Sigma-Aldrich 99
24
Capiacutetulo III Parte experimental
15 Gases
Nitroacutegeno 99999 como gas de colisioacuten en el espectroacutemetro de masas
Nitroacutegeno en los sistemas de concentracioacuten y secado por corriente de nitroacutegeno de los cartuchos SPE
2 INSTRUMENTACIOacuteN
Balanza analiacutetica de precisioacuten Sartorius
Granatario Sartorius
Bantildeo de ultrasonidos P-Selecta
Equipo de purificacioacuten de agua Millipore modelo Milli-Q gradient A-10ZMQSSVOT4
Estacioacuten de concentracioacuten por corriente de nitroacutegeno Mini-Vap Supelco
Sistema de secado de cartuchos de SPE por corriente de nitroacutegeno VisiDry Supelco
Sistema distribuidor de vaciacuteo Visiprep reg Supelco
Cromatoacutegrafo de liacutequidos de ultra-alta resolucioacuten Waters AcquityUPLC reg y espectroacutemetro de masas
Acquity TQD con analizador de triple quadrupolo (QqQ) equipado con una fuente de ionizacioacuten a
presioacuten atmosfeacuterica del tipo Z-spray (ESI)
3 PREPARACIOacuteN DE LAS DISOLUCIONES
Los patrones de pesticidas se prepararon individualmente a partir de los compuestos soacutelidos comerciales por
pesada excepto en el caso del fenpropidin (FEP) que se preparoacute a partir del compuesto liacutequido comercial Estos
compuestos soacutelidos se disolvieron en metanol y se obtuvieron unas disoluciones iniciales con concentraciones
recogidas en la Tabla III1
25
Capiacutetulo III Parte experimental
Tabla III1 Concentracioacuten de las disoluciones patroacuten stock
Compuesto Concentracioacuten (microgmL) Compuesto Concentracioacuten (microgmL)
AME 102201 MET 118912
BEN 138330 MYC 102017
BOS 99474 PEN 129791
CAR 17105 PYC 104581
CYP 131075 PYM 141386
DIM 103009 TEC 134729
FEH 99584 TEF 137769
FEP 100000 TBZ 105928
FLU 126859 TME 112283
IMI 101123 THI-M 124202
IPR 106739 TRI 118933
MAN 101021
4 LAVADO DEL MATERIAL
La limpieza del material de vidrio utilizado en el laboratorio se realizoacute utilizando jaboacuten y aclarando con agua de
grifo Luego en primer lugar se realiza un enjuague con agua Milli-Q finalmente un segundo enjuague con
acetona para eliminar posibles restos de compuestos orgaacutenicos y se deja secar sobre papel
Para la limpieza de los conectores de tefloacuten empleados en el proceso de SPE se introducen en un vaso de
precipitados con metanol y este en un bantildeo de ultrasonidos durante 10 minutos Al finalizar con el bantildeo de
ultrasonidos se realiza un enjuague con acetona y se pone a secar
5 EXTRACCIOacuteN DE MUESTRAS MEDIANTE SPE
El meacutetodo de extraccioacuten utilizado para la determinacioacuten de pesticidas fue la extraccioacuten en fase soacutelida (SPE)
mediante cartuchos Oasis HLB de 200 mg A continuacioacuten se describe el protocolo de extraccioacuten en las
condiciones oacuteptimas
26
Capiacutetulo III Parte experimental
1 Acondicionamiento del cartucho Oasis HLB de 200 mg con 2 mL de acetonitrilo seguidos de otros 2 mL de
vino sinteacutetico formado por la mezcla etanolagua MilliQ (1288)
2 Paso de la muestra 2 mL de vino diluiacutedos con 2 mL de agua MilliQ a traveacutes del cartucho por gravedad
3 Lavado del cartucho con 2 mL de agua MilliQ
4 Secado del cartucho durante 45 minutos en el VisiDry mediante el paso de una corriente de nitroacutegeno
5 Elucioacuten del cartucho con la mezcla metanolacetonitrilo en proporcioacuten 2080 hasta un volumen final de 2
mL
6 Anaacutelisis mediante cromatografiacutea liacutequida acoplada a espectrometriacutea de masas en taacutendem UPLC-MSMS
(volumen de inyeccioacuten 15 microL)
Representacioacuten esquematizada en la Figura III1
Figura III1 Extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) de las muestras de vino
27
Capiacutetulo III Parte experimental
6 CONDICIONES DE DETERMINACIOacuteN MEDIANTE UPLC-MSMS
En la Tabla III2 se indican las condiciones utlizadas en la determinacioacuten de los pesticidas de intereacutes mediante
LC-MSMS y en la Tabla III3 se muestra el gradiente de la fase moacutevil utilizado para la separacioacuten
cromatograacutefica
Tabla III2 Condiciones experimentales de determinacioacuten en LC-MSMS
UPLC Acquity UPLC-I-Class IVD System
bull Columna cromatograacutefica Zorbax Eclipse Plus C18 Rapid Resolution HD
Fase estacionaria C18
Dimensiones 21 x 50 mm
Tamantildeo de partiacutecula 18 microm
Temperatura del horno 40ordmC
bull Inyector
Volumen de inyeccioacuten 15 microL
bull Fase moacutevil
Flujo 04 mLmin
Fase acuosa (A) Agua MilliQ con 01 aacutecido foacutermico
Fase orgaacutenica (B) Acetonitrilo con 01 aacutecido foacutermico
MSMS WatersXevo TQD
Modo de ionizacioacuten ESI positivo
Voltaje del capilar 15 kV
Voltaje de cono 50 V
Temperatura de gas de secado (N2) 450ordmC
Flujo de gas de secado (N2) 1000 Lh
Modo de adquisicioacuten Centroide
Tabla III3 Gradiente de fase moacutevil utilizado en la separacioacuten cromatograacutefica (LC)
Tiempo min 0 13 28 64 75 76 10
A 98 50 50 0 0 98 98
B 2 50 50 100 100 2 2
28
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
CAPIacuteTULO IV RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
1 IDENTIFICACIOacuteN DE LOS COMPUESTOS
Para empezar el estudio en primer lugar se realizoacute la caracterizacioacuten de las condiciones de determinacioacuten de los
analitos en el modo Multiple Reaction Monitoring (MRM) mediante UPLC-ESI-MSMS Para llevarla a cabo se
tomaron patrones individuales de cada fitosanitario y mediante infusioacuten se estudiaron las posibles transiciones y
voltajes oacuteptimos para su determinacioacuten (Tabla IV1)
La ionizacioacuten por electrospray (ESI) se estudioacute tanto en modo positivo como en modo negativo encontraacutendose
que para todos los pesticidas de nuestro intereacutes se obteniacutea sentildeal en el modo positivo mientras el modo negativo
no presentaba respuesta significativa
A continuacioacuten se estudia el efecto del voltaje de cono en la respuesta del ioacuten molecular [M+H]+ aumentaacutendolo
hasta alcanzar el valor maacuteximo de la sentildeal correspondiente a dicho ioacuten y luego se optimiza la energiacutea de colisioacuten
variaacutendola para cada analito hasta obtener la sentildeal de mayor intensidad para cada uno de los iones producto Por
uacuteltimo una vez optimizado el voltaje de cono y la energiacutea de colisioacuten se seleccionan las dos transiciones maacutes
intensas para llevar a cabo la cuantificacioacuten y cualificacioacuten de cada analito en modo MRM Este procedimiento se
realizoacute para la totalidad de los compuestos confirmando los datos obtenidos con los facilitados por la base de
datos Quanpedia que estaacute disponible en el software del equipo utilizado para algunos de los compuestos
considerados
Compuesto Tr (min) Ion precursor (mz Da)
Voltaje de cono (V)
Ion producto 1 (CEv)
cuantificacioacuten
Ion producto 2 (CEv)
cualificacioacuten
Relacioacuten IP2IP1
AME 325 2760 60 176 (35) 70 (50) 016
BEN 485 3261 26 148 (20) 91 (34) 067
BOS 387 3429 41 140 (20) 307 (20) 011
CAR 167 1921 33 160 (18) 132 (28) 014
CYP 311 2260 56 93 (33) 108 (25) 061
DIM 322 3881 40 301 (20) 165 (30) 057
FEH 386 3021 41 97 (22) 55 (38) 044
FEP 257 2742 55 147 (28) 86 (28) 093
FLU 401 3830 40 173 (20) 365 (15) 010
IMI 218 2561 34 209 (15) 175 (20) 091
IPR 358 3211 28 119 (16) 203 (10) 042
Tabla IV1 Tiempos de retencioacuten (Tr) relacioacuten de iones precursores (mz) voltaje de cono (V) energiacuteas de colisioacuten (CE) y relacioacuten de intensidades entre transiciones (IP2IP1)
29
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Compuesto Tr (min) Ion precursor (mz Da)
Voltaje de cono (V)
Ion producto 1 (CEv)
cuantificacioacuten
Ion producto 2 (CEv)
cualificacioacuten
Relacioacuten IP2IP1
MAN 392 4120 25 328 (16) 125 (35) 063
MET 283 2801 26 220 (13) 192 (17) 057
MYC 365 2891 34 70 (18) 125 (32) 029
PEN 417 2840 34 70 (16) 159 (34) 031
PYC 523 3881 31 194 (12) 163 (25) 066
PYM 266 2000 51 107 (24) 82 (24) 071
TEC 397 3080 40 70 (22) 125 (40) 007
TEF 473 3531 19 133 (20) 297 (8) 072
TBZ 182 2020 51 175 (25) 131 (30) 062
TME 203 2920 28 211 (12) 132 (22) 047
THI-M 257 3430 28 151 (46) 93 (19) 0001
TRI 319 2961 21 70 (10) 99 (15) 013
El dwell time para cada una de las transiciones se ajustoacute de manera automaacutetica por el software (MassLinx) con
objeto de obtener doce puntos espectrales por compuesto tomando un valor promedio de cuatro segundos como
ancho de pico a liacutenea de base
2 CARACTERIZACIOacuteN DEL PROCEDIMIENTO DE DETERMINACIOacuteN (UPLC-ESI-
MSMS)
Una vez optimizados los paraacutemetros que afectan a la separacioacuten cromatograacutefica (UPLC) y a la determinacioacuten por
espectrometriacutea de masas en taacutendem (MSMS) se lleva a cabo la evaluacioacuten de la repetibilidad de inyeccioacuten y
determinacioacuten en esas condiciones Se expresa por medio de la desviacioacuten estaacutendar relativa (RSD) paraacutemetro que
nos indica el grado de correlacioacuten que existe entre varias medidas del mismo patroacuten realizadas por el mismo
operador en el laboratorio y en el mismo equipo de medida a lo largo de un diacutea Para el estudio se realizan diez
inyecciones con volumen de 15 microL de dos patrones con distintos niveles de concentracioacuten 5 y 20 ngmL Los
datos de RSD (Tabla IV2) para las aacutereas de pico de los analitos se situacutean para el nivel de concentracioacuten 5 ngmL
en el rango 2-13 y en el nivel de concentracioacuten 20 ngmL en el rango 1-7
30
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten Tabla IV2 Desviacioacuten estaacutendar relativa (RSD) del aacuterea de pico (transicioacuten de cuantificacioacuten) para evaluar la repetivilidad del proceso de LC-MSMS
Compuesto RSD
5 ngmL
RSD
20 ngmL Compuesto
RSD
5 ngmL
RSD
20 ngmL
AME 5 2 MET 3 2
BEN 2 2 MYC 9 2
BOS 4 5 PEN 4 4
CAR 4 2 PYC 3 1
CYP 5 7 PYM 7 3
DIM 6 5 TEC 3 2
FEH 7 4 TEF 4 2
FEP 4 2 TBZ 2 1
FLU 5 3 TME 6 6
IMI 13 7 THI-M a 6
IPR 8 2 TRI 8 6
MAN 3 2
A continuacioacuten tambieacuten se evaluoacute la repetibilidad de los tiempos de retencioacuten (Tr) para diez inyecciones de
patrones a los dos niveles de concentracioacuten 5 y 20 ngmL situaacutendose las RSD para todos los compuestos en el
rango 01-03 En base a este dato la ventana de tiempo en la que se registran las transiciones de MRM de cada
compuesto se fijoacute en 05 min lo que es lo mismo 025 min alrededor del valor medio de su tiempo de retencioacuten
Por otro lado la linealidad del meacutetodo se estudioacute a nueve niveles de concentracioacuten diferentes comprendidos ente
los niveles 05 ngmL y 200 ngmL mediante la inyeccioacuten de disoluciones patroacuten de los distintos compuestos de
estudio Se realizoacute una evaluacioacuten sin y otra con patroacuten interno (IS) antildeadiendo una concentracioacuten fija de patrones
internos a nivel de 25 ngmL y pudimos observar que los resultados mejoran notablemente al realizar una
correccioacuten con el IS En la Tabla IV3 se muestran los coeficientes de determinacioacuten (R2) obtenidos al realizar la
correccioacuten mediante IS observando que para todos los compuestos excepto para THI-M y para TRI los
coeficientes de correlacioacuten son superiores a 0990 por lo que existe una respuesta lineal en el rango de
concentraciones que hemos estudiado
Aparte del estudio de la linealidad tambieacuten se han estudiado los liacutemites de cuantificacioacuten instrumentales del
meacutetodo (LOQs) Para ello los LOQs se evaluacutean como la miacutenima cantidad de analito que origina una sentildeal 10
veces superior a la desviacioacuten estaacutendar del ruido Los valores anteriores se estimaron a partir del patroacuten de
a no evaluado ya que se encuentra por debajo del liacutemite de cuantificacioacuten del meacutetodo
31
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
concentracioacuten maacutes baja que presenta un pico con una relacioacuten SN superior a 10 En la Tabla IV3 tambieacuten se
recogen estos LOQs en doacutende podemos ver que variacutean en el rango 01-1 ngmL excepto para THI-M que se
desviacutea a valores de 10 ngmL
Tabla IV3 Coeficientes de determinacioacuten (R2) y liacutemites de cuantificacioacuten instrumentales (LOQs) de los analitos para nueve
niveles de concentracioacuten de 05 a 200 ngmL
Compuesto Coeficiente de
correlacioacuten (R2)
LOQs (ngmL) Compuesto
Coeficiente de correlacioacuten
(R2)
LOQs (ngmL)
AME 09951 04 MET 09933 01
BEN 09949 01 MYC 09950 04
BOS 09979 02 PEN 09945 02
CAR 09923 02 PYC 09955 02
CYP 09878 02 PYM 09931 01
DIM 09938 07 TEC 09958 05
FEH 09959 05 TEF 09957 01
FEP 09931 01 TBZ 09942 02
FLU 09965 02 TME 09903 01
IMI 09979 05 THI-M 09580 100
IPR 09938 01 TRI 09867 07
MAN 09979 01
En la Figura IV1 y Figura IV2 se muestran dos ejemplo de curvas de calibrado para dos compuestos IMI y
MAN respectivamente
Figura IV1 Curva de calibrado y coeficiente de determinacioacuten de IMI para UPLC-ESI-MSMS
32
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Figura IV2 Curva de calibrado y coeficiente de determinacioacuten de MAN para UPLC-ESI-MSMS
3 ESTUDIO DEL MEacuteTODO SPE
La extraccioacuten de pesticidas se llevoacute a cabo mediante extraccioacuten en fase soacutelida (SPE) en doacutende se realizaron
diversos estudios con diferentes condiciones para dar con las oacuteptimas En primer lugar se llevaron a cabo los
experimentos de retencioacuten y elucioacuten sobre dos tipos distintos de adsorbentes cartuchos OASIS HLB (200mg) y
cartuchos OASIS MAX (150 mg) como fases potenciales en las que llevar a cabo la extraccioacuten de manera
selectiva Los dos tipos de cartuchos son de fase reversa pero difieren entre siacute en el fundamento de retencioacuten de
los analitos En los cartuchos OASIS HLB (200 mg) formados por divinilbenceno-N-vinilpirrolidona (DVB-VP)
la retencioacuten de los diferentes analitos tiene lugar por interacciones π-π o de Van der Waals mientras que los
cartuchos OASIS MAX (150 mg) que se probaron como alternativa para mejorar la selectividad en la extraccioacuten
cuentan con un adsorbente polimeacuterico de modo mixto formado por divinilbenceno-N-vinilpirrolidona (DVB-VP)
funcionalizado con grupos amina cuaternaria siendo el fundamento de la extraccioacuten la combinacioacuten de las
propiedades adsorbentes del cartucho HLB con un mecanismo adicional de intercambio ioacutenico (anioacutenico) [27]
Algunos autores han empleado este mecanismo para mejorar la selectividad de la extraccioacuten de forma que en la
etapa de elucioacuten ciertos pigmentos del vino quedan fuertemente retenidos en el adsorbente a diferencia de lo que
ocurre con los adsorbentes de fase reversa [51]
Para llevar a cabo la eleccioacuten del tipo de adsorbente se realizaron pruebas con 10 mL de vino blanco y tinto
conectando en serie los dos tipos de cartuchos HLB (200 mg) y MAX (150 mg) a un segundo cartucho OASIS
HLB (60 mg) La elucioacuten de los analitos se hace de forma independiente para cada cartucho y se evaluacutea si los
analitos pasan del primer cartucho hacia el segundo cartucho es decir si se supera el volumen de corte o si por
33
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
otro lado se quedan retenidos en el primero y no eluyen hacia el segundo En estas pruebas de estudio
preliminares de preparacioacuten de la muestra no se ha incluido el CYP
En la Figura IV3 podemos ver la eficacia de la extraccioacuten para vino blanco y tinto que obtenemos empleando
cartuchos OASIS MAX (150 mg) conectados en serie con cartuchos OASIS HLB (60 mg) realizando la
extraccioacuten de tres fracciones de 2 mL cada una del cartucho OASIS MAX (150 mg) y una cuarta fraccioacuten de 2
mL del cartucho OASIS HLB (60 mg)
Por otro lado en la Figura IV4 podemos ver un graacutefico de columnas en el cual comparamos la eficacia de
extraccioacuten de los cartuchos OASIS HLB (200 mg) con dos disolventes de elucioacuten distintos En dicho graacutefica el
acroacutenimo de cada compuesto consta de dos barras cuyo significado es el siguiente la barra de la izquierda indica
la eficacia de la extraccioacuten empleando acetonitrilo (ACN) como disolvente de elucioacuten y la barra de la derecha
indica la eficacia de la extraccioacuten empleando la combinacioacuten MetanolAcetonitrilo (2080) (MeOHACN) como
disolvente de elucioacuten Para este adsorbente no se detectoacute ninguacuten compuesto en la extraccioacuten del segundo
cartuchos OASIS HLB (60 mg) empleando 2 mL de metanol
Figura IV3 Distribucioacuten de los compuestos en cada fraccioacuten obtenidas con cartuchos OASIS MAX (150 mg)
utilizando 10 mL de vino tinto y blanco sacando cuatro fracciones de 2 mL cada una con metanol como
disolvente de elucioacuten
34
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Figura IV4 Distribucioacuten de los compuestos en cada fraccioacuten obtenidas con cartuchos OASIS HLB (200 mg) utilizando 10
mL de vino tinto y blanco sacando 3 fracciones de 2 mL cada una con acetonitrilo (ACN) (columna de la izquierda) y una
combinacioacuten MetanolAcetonitrilo (2080) (MeOHACN) (columna de la derecha) como disolventes de elucioacuten
A la vista de los resultados reflejados en las graacuteficas podemos afirmar que cuando se utiliza el cartucho OASIS
HLB (200 mg) eluyendo con acetonitrilo o la combinacioacuten metanolacetonitrilo (2080) los extractos son limpios
y se eluyen la mayoriacutea de los compuestos en la primera fraccioacuten Pero utilizando acetonitrilo como disolvente de
elucioacuten se encuentran problemas en la extraccioacuten de CAR FEH y TBZ para los que es necesario emplear un
volumen mayor de elucioacuten o bien seleccionar otro disolvente de elucioacuten como es la combinacioacuten
metanolacetonitrilo
35
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Por otro lado los extractos en los cartuchos OASIS MAX (150 mg) son maacutes limpios incluso utilizando metanol en
la elucioacuten pero se detecta la presencia de CAR FEP TBZ y TME en el segundo cartucho OASIS HLB (60 mg)
significando la rotura del primer cartucho para dichos analitos considerando un volumen de 10 mL de vino Los
demaacutes compuestos se podriacutean recuperar cuantitativamente en la primera fraccioacuten sacada pero la peacuterdida de estos
compuestos inclina la eleccioacuten hacia los cartuchos OASIS HLB (200 mg) con metanolacetonitrilo (2080) como
disolvente de elucioacuten para continuar con el estudio
Una vez fijado el adsorbente y el volumen de elucioacuten se prueba la eficacia de la SPE independiente de los efectos
de matriz En la Tabla IV4 se muestran las recuperaciones de la SPE tomando 10 mL de vino blanco y tinto
con un nivel de adicioacuten de 15 ngmL sacando una sola fraccioacuten de 2 mL con la combinacioacuten
metanolacetonitrilo (2080) y n=3 reacuteplicas
Tabla IV4 Recuperaciones (R plusmn SD) de SPE para 10 mL de vino (blanco y tinto) con un nivel de adicioacuten de 15 ngmL y
n=3 reacuteplicas
Compuesto Vino Tinto
R plusmn SD
Vino Blanco
R plusmnSD Compuesto
Vino Tinto
R plusmn SD
Vino Blanco
R plusmn SD
AME 82 plusmn 7 100 plusmn 1 MET 92 plusmn 6 94 plusmn 3
BEN 89 plusmn 6 97 plusmn 3 MYC 90 plusmn 9 86 plusmn 4
BOS 95 plusmn 1 100 plusmn 2 PEN 84 plusmn 10 103 plusmn 3
CAR 91 plusmn 6 104 plusmn 6 PYC 86 plusmn 5 106 plusmn 1
CYP 81 plusmn 7 102 plusmn 3 PYM 87 plusmn 12 94 plusmn 3
DIM 97 plusmn 3 86 plusmn 4 TEC 83 plusmn 10 103 plusmn 1
FEH 89 plusmn 3 88 plusmn 3 TEF 84 plusmn 5 108 plusmn 4
FEP 91 plusmn 7 104 plusmn 3 TBZ 88 plusmn 7 92 plusmn 5
FLU 91 plusmn 2 97 plusmn 4 TME 101 plusmn 1 110 plusmn 13
IMI 117 plusmn 8 101 plusmn 11 THI-M 85 plusmn 9 110 plusmn 4
IPR 89 plusmn 7 112 plusmn 4 TRI 85 plusmn 10 110 plusmn 4
MAN 88 plusmn 2 87 plusmn 2
Algunos compuestos de la matriz en el vino pueden competir con los analitos durante el proceso de ionizacioacuten
que tiene lugar en la interfase entre UPLC-MSMS por lo que para la cuantificacioacuten del rendimiento de la
ionizacioacuten por electrospray (ESI) se estudian los efectos de matriz (EM) para vino blanco y tinto considerando
dos voluacutemenes de muestra distintos 2 y 10 mL y un volumen final del extracto de 2 mL En la Tabla IV5 se
36
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
exponen los valores para cada compuesto notando que al aumentar el volumen de muestra tambieacuten se aumentan
los efectos de matriz y eacutestos siempre son mayores en vino tinto Para el caacutelculo de estos efectos de matriz (EM)
se emplea la siguiente ecuacioacuten
Donde Am Ab y Ap representan el aacuterea de pico en la sentildeal medida del analito en el extracto de la muestra con
adicioacuten en el extracto de la muestra sin adicioacuten (o blanco) y en el patroacuten antildeadido respectivamente El nivel de
adicioacuten en extracto fue de 50 ngmL por compuesto
Tabla IV5 Efectos de matriz para vino blanco y tinto con un volumen inicial de 2 y 10 mL evaluados para un nivel de adicioacuten de 50 ngmL en extracto
Compuesto
Vino blanco Vino tinto
2 mL 10 mL 2mL 10 mL
EM () CV () EM () CV () EM () CV () EM () CV()
AME 93 3 95 2 99 3 101 7
BEN 99 1 93 2 101 3 100 6
BOS 97 5 98 1 108 2 96 0
CAR 62 2 50 3 58 2 55 6
CYP 94 3 91 1 97 2 95 7
DIM 105 2 95 3 100 3 108 3
FEH 100 4 102 4 105 4 94 3
FEP 95 3 88 2 96 2 92 7
FLU 98 2 93 2 106 1 101 2
IMI 84 4 46 3 48 10 18 8
IPR 99 3 92 3 105 1 100 7
MAN 100 1 94 3 109 4 107 2
MET 98 1 89 1 99 2 99 6
MYC 105 1 100 1 103 2 96 9
PEN 98 3 97 1 101 3 99 10
PYC 98 2 92 3 102 2 98 5
PYM 95 2 87 1 94 3 85 12
TEC 95 3 99 1 101 1 102 10
TEF 99 1 92 3 101 2 104 5
TBZ 45 0 40 5 43 2 30 7
TME 60 6 19 16 36 4 16 1
THI-M 107 2 109 2 103 1 96 9
TRI 97 3 118 4 104 5 117 10
37
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Al observar los resultados podemos ver que la mayoriacutea de los compuestos dan resultados de EM en torno al
100 lo que significa que no sufren una modificacioacuten importante en la eficacia de ionizacioacuten para las muestras
con respecto a los patrones Pero tambieacuten por el contrario podemos observar que algunos compuestos como
por ejemplo en el caso de CAR TBZ IMI y TME experimentan una gran supresioacuten de sentildeal es decir EM bajos
que se acentuacutean al aumentar el volumen de muestra La atenuacioacuten en la eficacia de variacioacuten para estos cuatro
compuestos no solo se ve incrementada con el volumen de muestra si no que ademaacutes es maacutes significativa para
vino tinto que para vino blanco En base a estos resultados aunque la eficacia de la SPE fue cuantitativa para
muestras de 10 mL se limitoacute el volumen de muestra a extraer a 2 mL
Las condiciones oacuteptimas de extraccioacuten se esquematizan en un resumen en la Figura IV5
Figura IV5 Condiciones optimizadas para la extraccioacuten de pesticidas en vino
38
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
4 CARACTERIZACIOacuteN DEL MEacuteTODO DE DETERMINACIOacuteN
Con las condiciones de extraccioacuten y determinacioacuten citadas anteriormente se llevaron a cabo pruebas de
recuperaciones absolutas de los compuestos a nivel de adicioacuten de 5 y 20 ngmL sobre las muestras Para cada
muestra y nivel de adicioacuten se realizaron tres reacuteplicas de las muestras con adicioacuten y los blancos aliacutecuotas de las
mismas muestras sin adicioacuten se procesaron en duplicado Los IS se antildeadieron a nivel de 25 ngmL y cada uno se
utiliza para corregir unos determinados compuestos CAR-d3 se emplea para CAR y TBZ el CYP-d5 para CYP y
PYM el IMID-d4 para IMI y TME y el MET13C6 para el resto de compuestos Los resultados para vino blanco
comprenden en el nivel de concentracioacuten 5 ngmL el rango entre 79-122 y en el nivel de concentracioacuten 20
ngmL el rango entre 84-109 Por otro lado en el caso del vino tinto las recuperaciones se encuentran para el
nivel de concentracioacuten 5 ngmL en el rango 67-112 y para el nivel de concentracioacuten 20 ngmL entre el rango
73-132 Los resultados obtenidos en las pruebas con vino blanco y vino tinto se muestran en la Tabla IV6
Los resultados son satisfactorios ya que la mayoriacutea de los compuestos se ajustan en todos los casos al rango de
recuperacioacuten entre 70-120 Para la realizacioacuten de estas pruebas se ha eliminado de los resultados el compuesto
THI-M debido a que las concentraciones utilizadas se encuentran en el liacutemite o por debajo del LOQ en los
experimentos con muestras adicionadas a 5 ngmL
Para calcular las recuperaciones (R) se recurrioacute a la siguiente ecuacioacuten
Donde Cm Cb y Cp son la concentracioacuten medida de analito en el extracto de la muestra con adicioacuten en el extracto
de la muestra sin adicioacuten (o blanco) y en el patroacuten antildeadido respectivamente
Tabla IV6 Recuperaciones (R) para vino tinto y vino blanco evaluadas para dos niveles de concentracioacuten 5 y 20 ngmL
Compuesto
Vino tinto Vino Blanco
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
AME 97 3 105 6 104 9 96 5
BEN 88 11 105 3 101 1 98 4
BOS 91 13 110 2 88 13 97 3
39
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Compuesto
Vino tinto Vino blanco
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
R
5 ngmL CV ()
R
20 ngmL CV ()
CAR 99 6 99 3 122 3 109 1
CYP 91 2 111 1 101 4 100 6
DIM 112 3 110 9 102 24 99 11
FEH 91 4 108 0 102 20 95 2
FEP 89 8 102 7 94 5 84 1
FLU 95 10 104 4 109 5 100 8
IMI 73 11 115 9 80 13 100 2
IPR 84 13 99 3 111 3 99 4
MAN 88 22 112 8 112 3 99 4
MET 99 3 106 5 106 3 98 2
MYC 84 9 106 13 88 17 86 3
PEN 84 9 102 5 84 8 90 5
PYC 96 6 105 4 100 2 95 4
PYM 90 12 112 14 106 4 97 1
TEC 89 8 101 6 98 12 94 1
TEF 93 10 102 5 107 2 97 3
TBZ 94 17 115 8 79 5 106 2
TME 67 2 101 7 84 18 90 11
THI-M ne - 74 7 ne - 89 24
TRI 88 12 97 6 102 6 92 2
ne No evaluado El nivel de adicioacuten es inferior al LOQ del meacutetodo para este compuesto
Para estudiar la reproducibilidad del meacutetodo analiacutetico global (correspondientes a los datos de preparacioacuten de
muestra y determinacioacuten) es decir la concordancia de varias medidas realizadas en diacuteas diferentes se procedioacute a la
extraccioacuten en las condiciones oacuteptimas tanto de vino blanco como tinto Las extracciones y determinaciones se
realizaron durante tres diacuteas consecutivos realizando tres reacuteplicas por vino y por diacutea con un nivel de adicioacuten en
muestra de 10 ngmL un blanco de muestra cada diacutea En la Tabla IV7 se muestran los resultados como
recuperaciones (R) en condiciones de reproducibilidad obtenidos para ambos tipos de vino dando valores entre
64-116 para muestras de vino blanco y valores situados entre 68-108 para muestras de vino tinto con la
excepcioacuten del TME para el que se ha obtenido un valor no aceptable en cuanto a la exactitud medida en
condiciones de reproducibilidad A la vista de los resultados obtenidos con estas pruebas se considera necesario el
empleo de IS adicionales para la mejora en la exactitud del meacutetodo para algunos compuestos por ejemplo el
TME
40
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Tabla IV7 Recuperaciones en condiciones de reproducibilidad (R plusmn SD) para vino blanco y tinto
Compuesto
Vino tinto Vino blanco
R
10 ngmL CV ()
R
10 ngmL CV ()
AME 90 5 101 13
BEN 96 5 102 7
BOS 97 6 100 8
CAR 97 3 94 5
CYP 103 3 105 12
DIM 104 7 106 8
FEH 90 16 83 15
FEP 91 5 90 4
FLU 103 7 102 6
IMI 99 14 101 14
IPR 91 5 100 13
MAN 108 5 108 13
MET 101 5 101 5
MYC 105 16 102 14
PEN 96 11 92 10
PYC 99 12 97 12
PYM 102 4 116 8
TEC 99 9 97 16
TEF 99 8 105 11
TBZ 68 4 84 5
TME 47 13 64 10
THI-M 107 11 104 16
TRI 95 14 103 4
En la Tabla IV8 se muestran los liacutemites de cuantificacioacuten (LOQs) del meacutetodo del meacutetodo de SPE-UPLC-ESI-
MSMS obtenidos para los diferentes pesticidas Los valores obtenidos son ideacutenticos a los LOQs instrumentales
excepto en el caso de aquellos compuestos para los que se observaronfuertes efectos de matriz (Tabla IV5) En
estos casos (CAR TBZ IMI y TME) los LOQs del meacutetodo se incrementan seguacuten la atenuacioacuten de sentildeal
observada
41
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Tabla IV8 Liacutemites de cuantificacioacuten LOQs (ngmL) del meacutetodo obtendos para cada compuesto
Compuesto LOQ (ngmL) Compuesto LOQ (ngmL)
AME 04 MET 01
BEN 01 MYC 04
BOS 02 PEN 02
CAR 03 PYC 02
CYP 02 PYM 01
DIM 07 TEC 05
FEH 05 TEF 01
FEP 01 TBZ 04
FLU 02 TME 02
IMI 06 THI-M 10
IPR 01 TRI 07
MAN 01
5 APLICACIOacuteN A MUESTRAS DE VINO COMERCIALES
Una vez optimizadas las condiciones del meacutetodo y estudiadas las caracteriacutesticas del meacutetodo desarrollado se aplicoacute
a la determinacioacuten de los compuestos de intereacutes estudiados en muestras de vino blanco y vino tinto comerciales
producidos en diferentes paiacuteses En la Tabla IV9 se muestra el paiacutes de origen de cada muestra comercial
identificadas con un coacutedigo alfanumeacuterico y antildeo de produccioacuten
42
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Tabla IV9 Coacutedigo asignado para los diferentes vinos comerciales blancos y tintos analizados Indicando el paiacutes de origen y
antildeo de produccioacuten
Coacutedigo Denominacioacuten de origen Antildeo de produccioacuten
bull Vinos Blancos
W1 Alemania 2014
W2 Espantildea 2012
W3 Espantildea 2016
W4 Portugal Desconocido
W5 Francia 2015
W6 Francia 2015
W7 Espantildea 2016
bull Vinos Tintos
R1 Espantildea 2015
R2 Sudaacutefrica 2015
R3 Chile 2015
R4 Francia 2015
R5 China Desconocido
R6 Espantildea 2016
R7 Australia 2014
R8 Francia 2013
R9 Francia 2015
A continuacioacuten en la Tabla IV10 y la Tabla IV11 se recogen los resultados obtenidos en el anaacutelisis de las
muestras comerciales Los datos obtenidos corresponden en todos los casos al uso de patrones de calibracioacuten
como teacutecnica de cuantificacioacuten
Tabla IV10 Concentracioacuten (ngmL) encontradas en las diferentes muestras de vino blanco comercial analizadas mediante
SPE-UPLC-MSMS n=2 reacuteplicas y al final el sumatorio de las concentraciones encontradas
Compuesto W1 W2 W3 W4 W5 W6 W7
AME 04 nd nd nd 41 nd nd
BEN nd nd 14 nd nd nd nd
BOS 84 102 520 54 197 nd nd
CAR nd 115 56 nd nd nd nd
CYP 08 59 112 nd nd 26 nd
43
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Compuesto W1 W2 W3 W4 W5 W6 W7
DIM 14 84 400 09 32 50 nd
FEH 85 809 639 15 187 nd nd
FLU 11 05 92 nd 77 32 nd
IMI nd 136 88 29 nd nd 69
IPR 30 749 1144 14 nd nd nd
MAN nd nd nd nd nd 30 nd
MET 04 273 494 63 nd nd 172
MYC 09 nd 35 nd nd nd nd
PYM 15 469 584 08 24 35 nd
TEC 11 nd 58 nd nd nd nd
TRI nd 67 61 nd nd nd nd
sumconcentracioacuten
(ngmL) 274 2868 4358 192 558 173 862
nd no detectado
Tabla IV11 Concentracioacuten (ngmL) encontradas en las diferentes muestras de vino tinto comercial analizadas mediante
SPE-UPLC-MSMS n= 2 reacuteplicas y al final el sumatorio de las concentraciones encontradas
Compuesto R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9
AME nd nd nd 30 nd nd nd nd 16
BEN nd nd nd 07 nd nd nd nd nd
BOS nd 55 21 196 nd nd nd 73 21
CAR nd nd 04 17 249 20 nd nd nd
CYP 34 08 02 22 nd 136 nd 85 nd
DIM nd 33 nd 52 233 46 nd 61 23
FEH nd nd nd 1070 nd 10 nd 1307 14
FLU nd nd nd 20 nd nd nd nd nd
IPR 16 nd nd 17 nd 22 nd nd nd
MAN nd nd nd 17 nd nd nd 20 nd
MET 126 nd nd 14 55 313 30 44 39
MYC nd nd nd 05 nd 32 nd nd nd
PYM 19 nd 03 185 49 281 nd 24 nd
TEC 25 06 39 29 nd nd nd 21 20
TEF nd 01 12 nd nd nd nd nd nd
sumconcentracioacuten
(ngmL) 220 48 81 1681 586 860 30 1635 133
nd no detectado 44
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
En los resultados de los anaacutelisis podemos observar que en ninguna de las muestras comerciales de vino blanco
aparecieron los siguientes compuestos FEP PEN PYC TEF TBZ THI-M y TME y en los vinos tintos
comerciales no aparece a ninguna concentracioacuten FEP IMI PEN PYC TBZ TME THI-M y TRI No se
detectaron para dichas muestras de vino a niveles superiores a los LOQs del meacutetodo propuesto
Cuando se detecta un compuesto positivo se compara el pico cromatograacutefico del compuesto con el de un patroacuten
verificando la coincidencia del tiempo de retencioacuten (maacutexima diferencia 01 min) y la relacioacuten entre transiciones
(maacutexima diferencia 30 ) En la Figura IV6 y la Figura IV7 se muestran los cromatogramas para el compuesto
CYP obtenido en condiciones oacuteptimas para la muestra de vino blanco W6 y en un patroacuten de 5 ngmL
respectivamente En este caso el intervalo de tolerancia para la relacioacuten de intensidad entre transiciones es
IP2IP1=061plusmn018
Figura IV6 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el CYP en la muestra W6 (26 ngmL) Transicioacuten
superior 226gt93 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 226gt108 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades IP2IP1= 066
Figura IV7 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el CYP en un patroacuten de 5 ngmL Transicioacuten
superior 226gt93 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 226gt108 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades IP2IP1=061plusmn018
45
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Otro ejemplo de compuesto positivo en abundantes muestras comerciales de estudio es el Metalaxyl positivo con
una concentracioacuten de 04 ngmL en el vino con referencia W1 (Figura IV8) y positivo con una concentracioacuten de
313 ngmL en el vino con referencia R6 (Figura IV9) Ambas se comparan con el cromatograma de un patroacuten
de Metalaxyl de 1 ngmL (Figura IV10) El grado de concordancia en los tiempos de retencioacuten y la relacioacuten de
intensidades entre transiciones es satisfactorio
Figura IV8 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el MET en la muestra W1 (04 ngmL) Transicioacuten
superior 2801gt2201 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 2801gt1921 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades
IP2IP1=056
Figura IV9 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el MET en la muestra R6 (313 ngmL) Transicioacuten
superior 2801gt2201 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 2801gt1921 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades IP2IP1=
056
46
Capiacutetulo IV Resultados y discusioacuten
Figura IV10 Cromatograma correspondiente a las dos transiciones para el MET en un patroacuten de 1 ngmL Transicioacuten
superior 2801gt2201 (cuantificacioacuten) y transicioacuten inferior 2801gt1921 (cualificacioacuten) Relacioacuten de intensidades
IP2IP1=057plusmn017
Es de destacar que aunque se detectaron bastantes pesticidas en las diferentes muestras de vino comerciales pero
en ninguacuten caso superaron el 10 de los LMRs permitidos en uvas tal y como se recomienda ya que todaviacutea no
existen LMRs para vino en la legislacioacuten vigente No obstante el nivel total de concentracioacuten (sumatorio de
concentraciones Tabla IV10 y Tabla VI11) es significativo para varias muestras tanto de vinos blancos (W2 y
W3) como tintos (R4 y R8)
47
Capiacutetulo V Conclusiones
CAPIacuteTULO V CONCLUSIONES
En este trabajo se ha estudiado un meacutetodo para la cuantificacioacuten de pesticidas concretamente veinte fungicidas y
tres insecticidas en vino blanco y tinto En la etapa de preparacioacuten de muestra se optimizoacute la extraccioacuten en fase
soacutelida (SPE) utilizando cartuchos OASIS HLB (200 mg) compuestos por divinilbenceno-N-vinilpirrolidona
(DVB-VP) como adsorbente Como teacutecnica de determinacioacuten se utilizoacute cromatografiacutea de liacutequidos con una
interfase de electroespray acoplada a espectrometriacutea de masas (UPLC-ESI-MSMS)
Las conclusiones generales obtenidas a partir de los resultados de este proyecto relativo a la determinacioacuten de
fitosanitarios en vino son
Ante los problemas de retencioacuten que presentan los cartuchos OASIS MAX (150 mg) para algunos
compuestos los cartuchos OASIS HLB (200 mg) junto con la combinacioacuten metanolacetonitrilo (2080)
como disolvente de elucioacuten son elegidos como mejor opcioacuten en la extraccioacuten en fase soacutelida de pesticidas
en muestras con matrices complejas como es el caso del vino Asiacute se consigue la retencioacuten selectiva de
componentes de la matriz y proporciona extractos con menor porcentaje de interferencias
El meacutetodo estudiado y optimizado se puede aplicar tanto a vinos blancos como a vinos tintos procesados
a partir de distintas variedades de uvas
Los liacutemites de cuantificacioacuten (LOQs) del estudio se situacutean la mayoriacutea por debajo de 10 ngmL excepto
en el caso de THI-M que asciende al valor de 20 ngmL El rango de respuesta lineal abarca hasta 200
ngmL y el tiempo de anaacutelisis ha sido de solo 10 minutos por muestra
En todas las muestras de vino (blancos y tintos) comerciales analizadas se han detectado la presencia de
varios pesticidas sin embargo todas las concentraciones encontradas se encuentran por debajo del 10
de los LMRs fijados en uvas tal y como recomienda la legislacioacuten por lo que no se considera
preocupante
48
Capiacutetulo V Conclusioacutens
CAPIacuteTULO V CONCLUSIOacuteNS
Neste traballo estudouse un meacutetodo para a cuantificacioacuten de pesticidas en particular vinte funxicidas e tres
insecticidas en vintildeo branco e maacuteis tinto No paso da preparacioacuten da mostra optimizouse a extraccioacuten en fase
soacutelida (SPE) empregando cartuchos OASIS HLB (200 mg) compostos por divinilbenceno-N-pirrolidona (DVB-
VP) como adsorbente Para a teacutecnica de determinacioacuten utilizouse cromatografiacutea de liacutequidos con unha interfase de
electroespray acoplada a espectrometriacutea de masas (UPLC-ESI-MSMS)
As conclusioacutens xerais a obtidas a partir dos resultados deste proxecto relativo aacute determinacioacuten de pesticidas en
vintildeo son
Ante os problemas de retencioacuten que mostraban os cartuchos OASIS MAX (150 mg) para alguacuten
compostos os cartuchos OASIS HLB (200 mg) en conxunto coa mistura metanolacetonitrilo (2080)
como disolvente de elucioacuten son elexidos como mellor opcioacuten na extraccioacuten en fase soacutelida de pesticidas
en mostras con matrices complexas como eacute o caso do vintildeo Asiacute eacute conseguida a retencioacuten selectiva de
componentes da matriz e proporciona extractos con menos porcentaxe de interferencias
O meacutetodo estudado e optimizado poacutedese aplicar tanto a vintildeos brancos coma tintos procesados a partir de
diferentes variedades de uvas
Os liacutemites de cuantificacioacuten do estudo (LOQs) son maacuteis baixos de 10 ngmL agaacutes no caso do THI-M
que ascende ao valor de 20 ngmL O rango de resposta lineal cobre ata 200 ngmL e o tempo de anaacutelise
foi de soacute 10 minuacutetos por mostra
En todas as mostras de vintildeo (brancos e tintos) comercial analizadas detectouse a presenza de varios
pesticidas maacuteis poreacuten todas as concentracioacutens atopadas son inferiores ao 10 dos LMR fixados en uvas
tal e como recomenda a lexislacioacuten polo que non se considera preocupante
49
Chapter V Conclusions
CHAPTER V CONCLUSIONS
In this work we have studied a method for the quantification of pesticides specifically twenty fungicides and
three insecticides in white and red wine In the sample preparation step the solid phase extraction was optimized
using cartridges OASIS HLB (200 mg) containing divinylbenzene-N-vinylpyrrolidone (DVB-VP) as adsorbent
As determination technique ultraperformance liquid chromatography was used with an electrospray interface
coupled to mass spectrometry (UPLC-ESI-MS7MS)
The general conclusions drawn from the results of this project concerning the determination of pesticides in wine
are
Due to the retention problems presented by the OASIS MAX sorbent (150 mg) for some compounds of
this project the cartridges OASIS HLB (200 mg) together with the methanolacetonitrile (2080) mixture
are chosen as the best option in the solid phase extraction of pesticides in samples with complex
matrices as is the case with the wine
The method studied and optimized can be applied to both white and red wines obtained from different
varieties of grapes
The limits of quantification (LOQs) were below 10 ngmL for most of the compounds except in the
case of THI-M with a LOQ of to 10 ngmL The linear response range covers up to 200 ngmL and the
analysis time was only 10 minutes per sample
In all commercial wine samples (white and red) analyzed the presence of several pesticides was
conformed however all the concentrations obtained are below 10 of the Maximum residue
levels(MRLs) fixed in grapes as recommended by legislation
50
VI Bibliografiacutea VI BIBLIOGRAFIacuteA [1] Ministerio de agricultura y pesca alimentacioacuten y medio ambiente mhttpwwwmapamagobesescalidad-y-evaluacion-ambientaltemasproductos-quimicosfitosanitarios (Acceso el diacutea 11052017) [2] httpwwwcricyteduarenciclopediaterminosProducFitohtm (Acceso el diacutea 11052017) [3] WERNER BALTES ldquoQuiacutemica de los alimentosrdquo Editorial Acribia SA 2007 Capiacutetulo 11 ldquoResiduos en los alimentosrdquo paacuteginas 206-217
[4] RLabrada JCCaseley CParker ldquoESTUDIO FAO PRODUCCIOacuteN Y PROTECCIOacuteN VEGETAL 120rdquo Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentacioacuten Roma 1996 ISSN 1014- Capiacutetulo 10 Herbicidas httpwwwfaoorgdocrepT1147St1147s00htmContents (Acceso el diacutea 12052017)
[5] Taberner Palou Andreu Cirujeda Ranzenberger Alicia Zaragoza Larios Carlos ldquoManejo de poblaciones de malezas resistentes a herbicidasrdquo (FAO Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura) 100 preguntas sobre resistencia PDF sacado de httpwwwfaoorg3a-a1422spdf (Acceso el diacutea 12052017) [6] BISSET Juan A Uso correcto de insecticidas control de la resistencia Revista Cubana de Medicina Tropical 2002 vol 54 no 3 p 202-219 [7] DEVINE Gregor J EZA Dominique Ogusuku Elena FURLONGMichael J Uso de insecticidas contexto y consecuencias ecoloacutegicas Revista peruana de medicina experimental y Salud Puacuteblica 2008 vol 25 no 1 p 74-100 [8] Ministerio de agricultura y ganaderiacutea (proteccioacuten agropecuaria servicio de diagnoacutestico fitosanitario) de costa Rica httpwwwmaggocrbibliotecavirtualH20-5054pdf (Acceso el diacutea 11052017) [9] GEPP V MONDINO P Control quiacutemico 2011 PDF obtenido de httpwwwpvfagroeduuyfitopatodocscursosfitopatoMaterialesGuiasC-QUIMICOpdf (Acceso el diacutea 772017) [10] ROSSLENBROICH Hans-Juergen STUEBLER Dietrich Botrytis cinereamdashhistory of chemical control and novel fungicides for its management Crop Protection 2000 vol 19 no 8 p 557-561 [11] Figura 11 httpwwwvitiviniculturanetbotritis-o-podredumbre-gris-botrytis-cinerea-pershtml (Acceso el diacutea 12052017) [12] CAMPBELL Paul BENDEK Carlos LATORRE Bernardo A Riesgo de oiacutedio (Erysiphe necator) de la vid en relacioacuten con el desarrollo de los racimos Ciencia e investigacioacuten agraria 2007 vol 34 no 1 p 5-11 [13] ldquoCoacutemo combatir el oiacutedio de la vidrdquo Jose Javier Peacuterez de Obanos Castillo PDF sacado de httpswwwnavarraesNRrdonlyres05E65D9B-D1A2-4EAD-9A63-AFF1D3215552135109Comocombatireloidiodelavidpdf (Acceso el diacutea 12052017) [14] Imagen 12 sacadas las 3 de httpwwwvitiviniculturanetoidio-de-la-vidhtml (Acceso el diacutea 12052017) [15] BARRIOS Gonccedilal REYES Joan Modelizacioacuten del Mildiu de la Vid 2004 httpwwwruralcatnetmigracio_resources617683_mildiusPDF (Acceso el diacutea 12052017) [16] Imaacutegenes sacadas de httpwwwvitiviniculturanetmildiu-de-la-vid-enfermedades-vinahtml (Acceso el diacutea 13052017) [17] HUQ Mainul MEISNER Craig DASGUPTA Susmita Health effects and pesticide perception as determinants of pesticide use evidence from Bangladesh httpagrisfaoorgagris-searchsearchdorecordID=US2012411738 (Acceso el diacutea 13052017)
51
IV Bibliografiacutea [18] BADII Mohammad H LANDEROS Jeroacutenimo Plaguicidas que afectan a la salud humana y la sustentabilidad CULCyT 2015 no 19 Revista vista en httpopenjournaluacjmxojsindexphpculcytarticleview454 (Acceso el diacutea 772017) [19] OLEA Nicolaacutes FERNAacuteNDEZ Mariana F Plaguicidas persistentes En Congreso Implementacioacuten del Convenio de Contaminantes Orgaacutenicos Persistentes Madrid 2001 p 26-27 [20] httpwwwfaoorgfao-who-codexalimentariusabout-codexes (Acceso el diacutea 14052017) [21] httpeceuropaeufoodplantpesticidesmax_residue_levels_en (Acceso el diacutea 14052017 [22] ORDONtildeEZ Juan A Cambero Rodriacuteguez MI Fernaacutendez Aacutelvarez L Garciacutea Sanz ML Garciacutea de Fernando Minguilloacuten GD de la Hoz Perales L Selgas Cortecero MD Tecnologiacutea de los alimentos Volumen 1 Componentes de los Alimentos y Procesos Siacutentesis Madrid 1998paacutegs 349-351 [23] CELA Rafael Casais Maria del Carmen Lorenzo Rosa Antonia Teacutecnicas de separacioacuten en quiacutemica analiacutetica Siacutentesis 2002 Capiacutetulo 11 Extraccioacuten y lixiviacioacuten por disolvente (paacutegs206-260) [24] CANTWELL Frederick F LOSIER Manon Liquidmdashliquid extraction Comprehensive Analytical Chemistry 2002 vol 37 p 297-340 [25] Imagen de LLE sacada de httpprocesosbiowikispacescomExtracciC3B3n+liquido-liquido (Acceso el diacutea 15052017) [26] HENNION Marie-Claire Solid-phase extraction method development sorbents and coupling with liquid chromatography Journal of Chromatography A 1999 vol 856 no 1 p 3-54 [27] CELA Rafael Casais Maria del Carmen Lorenzo Rosa Antonia Teacutecnicas de separacioacuten en quiacutemica analiacutetica Siacutentesis 2002 Capiacutetulo 16 Teacutecnicas de adsorcioacuten y absorcioacuten en la preparacioacuten de muestras Extraccioacuten y microextraccioacuten en fase soacutelida (paacutegs520-555) [28] Imagen spe sacada httptoxicocbblogspotcomes201310las-intoxicaciones-con-farmacoshtml (Acceso el diacutea 15052017) [29] Chaacutefer Pericaacutes Consuelo Acoplamiento microextraccioacuten en fase soacutelida-cromatografiacutea (2006) httprodericuveshandle1055014940 (Acceso el diacutea 16052017) [30] Imagen SPME httpwwwscieloorgcoscielophpscript=sci_arttextamppid=S0122-53832002000100005 (Acceso el diacutea 16052017) [31] MONTES GOYANES Rosa Mariacutea Avances en teacutecnicas de microextraccioacuten para la determinacioacuten de compuestos traza en muestras medioambientales y alimentarias Teacutesis doctoral Noviembre 2009 (Paacutegs 34-55) [32] LEHOTAY Steven J Ae Son Kyung KwonHyeyoung Koesukwiwat Urairat Fu Wusheng Mastovska Katerina Hoh Eunha Leepipatpiboon Natchanun Comparison of QuEChERS sample preparation methods for the analysis of pesticide residues in fruits and vegetables Journal of Chromatography A 2010 vol 1217 no 16 p 2548-2560 [33] Imagen QueChERS httpswwwresearchgatenetpublication279221361_QuEChERS_A_Sample_Preparation_for_Extraction_of_Carbaryl_from_Rat_Feces (Acceso el diacutea 16052017) [34] STASHENKO Elena E MARTIacuteNEZ Jairo Reneacute Preparacioacuten de la muestra un paso crucial para el anaacutelisis por GC-MS Uma publicaccedilatildeo trimestral do Instituto Internacional de Cromatografia (IIC) Ciecircncia Cromatograacutefica 2011 vol 3 no 1 [35] Imagen GC-MS httpsorgspectroscopyintblogspotcomes201411gas-chromatography-mass-spectrometry-gchtml (Acceso el diacutea 17052017) [36] httpwwwactlabscompageaspxmenu=65ampapp=221ampcat1=534amptp=2amplk=no (Acceso el diacutea 17052017)
52
IV Bibliografiacutea [37] Quintela O Cruz A Concheiro M De Castro A amp Loacutepez-Rivadulla M (2005) Metodologiacutea LC-MS Aspectos generales de la teacutecnica y sus aplicaciones en el campo de la toxicologiacutea Rev Toxicol 22 paacutegs7-14 [38] Imagen LC-MS httpsuploadwikimediaorgwikipediaenff9Liquid_chromatography_tandem_Mass_spectrometry_diagrampng (visto 18052017) [39] Vargas de la Cruz Celia Bertha Adaptacioacuten de la Metodologiacutea Analiacutetica para la determinacioacuten de residuos de plaguicidas en frutas nativas de exportacioacuten mediante Uplc-MsMs (2012) Tesis obtenida en http20062146130handlecybertesis2331 (Acceso el diacutea 772017) [40] ROMERO GONZAacuteLEZ Roberto Fernaacutendez Moreno Joseacute Luis Plaza Bolantildeos Patricia Garrido Frenich Antonia Martiacutenez Vidal Joseacute Luis Empleo de la espectrometriacutea de masas como herramienta para la determinacioacuten de toacutexicos en alimentos hacia la seguridad alimentaria Revista Espantildeola de salud puacuteblica 2007 vol 81 no 5 p 461-474 [41] PAYAacute Andrus Fundamento y Funciones de la Espectrometriacutea de Masas Universidad de Valencia Espantildea 2006 httpmuraluvescaloan (Acceso el diacutea 19052017) [42] Imagen MS sacada de httpsesslidesharenetMaYaTorrezespectrometria-demasas (Acceso el diacutea 21052017) [43] ECONOMOU Anastasios Botitsi Helen Antoniou Spyros Tsipi Despina Determination of multi-class pesticides in wines by solid-phase extraction and liquid chromatography-tandem mass spectrometry Journal of Chromatography A 2009 vol 1216 no 31 p 5856-5867 [44] FONTANA A R Rodriacuteguez I Ramil M Altamirano JC Cela R Liquid chromatography time-of-flight mass spectrometry following sorptive microextraction for the determination of fungicide residues in wine Analytical and bioanalytical chemistry 2011 vol 401 no 2 p 767-775 [45] PELAJIĆ Maja G Peček DM Pavlović DV Čepo Novel multiresidue method for determination of pesticides in red wine using gas chromatographyndashmass spectrometry and solid phase extraction Food chemistry 2016 vol 200 p 98-106 [46] Ignaz J Buerge Juumlrgen Krauss Rociacuteo Loacutepez-Cabeza Werner Siegfried Michael Stuumlssi Felix E Wettstein Thomas Poiger Stereoselective Metabolism of the Sterol Biosynthesis Inhibitor Fungicides Fenpropidin Fenpropimorph and Spiroxamine in Grapes Sugar Beets and Wheat Journal of Agricultural and Food Chemistry 2016 vol 64 no 26 p 5301-5309 [47] M Hu X Liu F Dong J Xu S Li H Xu Y Zheng Determination of ametoctradin residue in fruits and vegetables by modified quick easy cheap effective rugged and safe method using ultra-performance liquid chromatographytandem mass spectrometry Food chemistry 2015 vol 175 p 395-400 [48] WALORCZYK Stanisław DROŻDŻYŃSKI Dariusz GNUSOWSKI Bogusław Multiresidue determination of 160 pesticides in wines employing mixed-mode dispersive-solid phase extraction and gas chromatographyndashtandem mass spectrometry Talanta 2011 vol 85 no 4 p 1856-1870 [49] Tianyang Guo Pingping Fang Juanjuan Jiang Feng Zhan Wei Yong Jiahui Liu YiYang Dong Rapid screening and quantification of residual pesticides and illegal adulterants in red wine by direct analysis in real time mass spectrometry Journal of Chromatography A 2016 vol 1471 p 27-3 [50] GONZAacuteLEZ-RODRIacuteGUEZ R M CANCHO-GRANDE B SIMAL-GAacuteNDARA J Decay of fungicide residues during vinification of white grapes harvested after the application of some new active substances against downy mildew Food chemistry 2011 vol 125 no 2 p 549-560 [51] CARPINTEIRO I Ramil M Rodriacuteguez I Cela R Determination of fungicides in wine by mixed-mode solid phase extraction and liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry Journal of Chromatography A 2010 vol 1217 no 48 p 7484-7492
53